CELEX: 32017R0735
Language: lt
Date: 2017-02-14 00:00:00
Title: 2017 m. vasario 14 d. Komisijos reglamentas (ES) 2017/735, kuriuo, derinant prie technikos pažangos, iš dalies keičiamas Reglamento (EB) Nr. 440/2008, nustatančio bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), priedas (Tekstas svarbus EEE. )

28.4.2017   
               
               
                  LT
               
               
                  Europos Sąjungos oficialusis leidinys
               
               
                  L 112/1
               
            KOMISIJOS REGLAMENTAS (ES) 2017/735
      2017 m. vasario 14 d.
      kuriuo, derinant prie technikos pažangos, iš dalies keičiamas Reglamento (EB) Nr. 440/2008, nustatančio bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), priedas
      (Tekstas svarbus EEE)
      EUROPOS KOMISIJA,
      atsižvelgdama į Sutartį dėl Europos Sąjungos veikimo,
      atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantį Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantį Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantį Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB, (1) ypač į jo 13 straipsnio 2 dalį,
      kadangi:
      
                  (1)
               
               
                  Komisijos reglamente (EB) Nr. 440/2008 (2) pateikti bandymų metodai, skirti cheminių medžiagų fizikinėms ir cheminėms savybėms, toksiškumui ir ekotoksiškumui nustatyti ir taikytini pagal Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006;
               
            
                  (2)
               
               
                  Reglamentą (EB) Nr. 440/2008 būtina atnaujinti, kad į jį būtų įtraukti Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (EBPO) neseniai patvirtinti nauji ir atnaujinti bandymų metodai, siekiant atsižvelgti į techninę pažangą ir sumažinti bandymams naudojamų gyvūnų skaičių pagal Europos Parlamento ir Tarybos direktyvą 2010/63/ES (3). Dėl šio projekto konsultuotasi su suinteresuotaisiais subjektais;
               
            
                  (3)
               
               
                  šį pritaikymą prie techninės pažangos sudaro dvidešimt bandymų metodų: vienas naujas fizikinių ir cheminių savybių nustatymo metodas, penki nauji ir vienas atnaujintas ekotoksiškumo vertinimo bandymo metodas, du atnaujinti išlikimo ir elgesio aplinkoje bandymo metodai bei keturi nauji ir septyni atnaujinti poveikio žmonių sveikatai nustatymo metodai;
               
            
                  (4)
               
               
                  EBPO reguliariai peržiūri savo bandymų gaires, siekdama nustatyti tas, kurios jau moksliškai atgyveno. Atliekant šį derinimą su technikos pažanga, pašalinami šeši bandymo metodai, kurių atitinkamos EBPO bandymų gairės yra panaikintos;
               
            
                  (5)
               
               
                  todėl Reglamentą (EB) Nr. 440/2008 reikėtų atitinkamai iš dalies pakeisti;
               
            
                  (6)
               
               
                  šiame reglamente numatytos priemonės atitinka pagal Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 133 straipsnį įsteigto komiteto nuomonę,
               
            PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:
      1 straipsnis
      Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas pagal šio reglamento priedą.
      2 straipsnis
      Šis reglamentas įsigalioja dvidešimtą dieną po jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.
      
         Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.
         Priimta Briuselyje 2017 m. vasario 14 d.
         
            
               Komisijos vardu
            
            
               Pirmininkas
            
            Jean-Claude JUNCKER
         
      
      
         (1)  OL L 396, 2006 12 30, p. 1.
      
         (2)  2008 m. gegužės 30 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 440/2008, nustatantis bandymo metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (OL L 142, 2008 5 31, p. 1).
      
         (3)  2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos (OL L 276, 2010 10 20, p. 33).
      
         PRIEDAS
         Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas taip:
         
                     1)
                  
                  
                     A dalis papildoma šiuo skyriumi:
                     „A.25   DISOCIACIJOS VANDENYJE KONSTANTOS (TITRAVIMO METODAS. SPEKTROFOTOMETRINIS METODAS. KONDUKTOMETRINIS METODAS)
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 112 (1981 m.).
                     
                        Būtinos sąlygos
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Tinkamas analizės metodas
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Tirpumas vandenyje
                              
                           
                        Nurodomoji informacija
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Struktūrinė formulė
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Elektrinis laidis taikant konduktometrinį metodą
                              
                           
                        Tikslinamieji pareiškimai
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Visus bandymo metodus galima atlikti naudojant grynas ar techninio grynumo medžiagas. Reikėtų atsižvelgti į galimą priemaišų poveikį rezultatams.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Titravimo metodas netinka mažai tirpioms medžiagoms (žr. toliau Bandymo tirpalai).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Spektrofotometrinis metodas tinka tik toms medžiagoms, kurių disocijuotos ir nedisocijuotos formų UV/VIS absorbcijos spektrai žymiai skiriasi. Šis metodas taip pat gali tikti mažai tirpioms medžiagoms ir vykstant ne rūgštinei / bazinei disociacijai, pvz., susidarant kompleksams.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Jei galioja Onzagerio lygtis, galima taikyti konduktometrinį metodą, netgi esant gana mažai koncentracijai ir netgi nesant rūgštinės / bazinės pusiausvyros.
                              
                           
                        Tipiniai dokumentai
                     
                     Šis bandymo metodas pagrįstas metodais, pateiktais skirsnyje Literatūra išvardytose nuorodose ir EPA priešgamybinio pranešimo preliminariniame vadovo projekte, 1978 m. rugpjūčio 18 d.
                     METODAS. BANDYMO ĮVADAS, TIKSLAS, TAIKYMO SRITIS, SVARBA, TAIKYMAS IR RIBOS
                     Cheminės medžiagos disociacija vandenyje yra svarbi vertinant jos poveikį aplinkai. Ji daro įtaką medžiagos formai, kuri savo ruožtu lemia jos elgseną ir transportavimą. Ji gali veikti cheminės medžiagos adsorbciją dirvožemyje ir nuosėdose bei jos absorbciją į biologines ląsteles.
                     
                        Apibrėžtys ir vienetai
                     
                     
                        Disociacija yra grįžtamasis skilimas į dvi ar daugiau cheminių dalelių, kurios gali būti joninės. Procesas paprastai žymimas taip:
                     
                        RX ⇌ R
                        ++ X
                        –
                     
                     reakciją apibūdinanti koncentracijos pusiausvyros konstanta yra:
                     
                        
                     pavyzdžiui, konkrečiu atveju, kai R yra vandenilis (medžiaga yra rūgštis), konstanta yra
                     
                        
                     arba
                     
                        
                     
                        Etaloninės medžiagos
                     
                     Šias etalonines medžiagas nebūtina naudoti kiekvienu atveju, kai tiriama nauja cheminė medžiaga. Jos pirmiausia pateiktos tam, kad retkarčiais būtų galima atlikti metodo kalibravimą ir būtų galimybė palyginti rezultatus, jei taikomas kitas metodas.
                     
                                  
                              
                              
                                 pKa
                                     (1)
                                 
                              
                              
                                 Temp. °C
                              
                           
                                 p-nitrofenolis
                              
                              
                                 7,15
                              
                              
                                 25 (1)
                                 
                              
                           
                                 Benzenkarboksirūgštis
                              
                              
                                 4,12
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 p-chloranilinas
                              
                              
                                 3,93
                              
                              
                                 20
                              
                           Būtų naudinga turėti kelias pK vertes turinčią cheminę medžiagą, kaip toliau nurodyta skirsnyje Bandymo metodo principas. Tokia medžiaga galėtų būti:
                     
                                 Citrinų rūgštis
                              
                              
                                 pKa (8)
                              
                              
                                 Temperatūra °C
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1) 3,14
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2) 4,77
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3) 6,39
                              
                              
                                 20
                              
                           
                        Bandymo metodo principas
                     
                     Aprašytas cheminis procesas paprastai tik šiek tiek priklauso nuo temperatūros aplinkai būdingame temperatūros intervale. Reikia išmatuoti cheminės medžiagos disocijavusios ir nedisocijavusios formų koncentraciją, kad būtų galima nustatyti disociacijos konstantą. Žinant Apibrėžčių ir vienetų skyriuje nurodytos disociacijos reakcijos stechiometriją, galima nustatyti atitinkamą konstantą. Šiame bandymo metode aprašytu konkrečiu atveju cheminė medžiaga elgiasi kaip rūgštis ar bazė, todėl patogiausias nustatymo būdas – jonizuotos ir nejonizuotos formų santykinės koncentracijos ir tirpalo pH nustatymas. Santykis tarp šių pKa lygties narių pateiktas pirmiau Apibrėžčių ir vienetų skirsnyje. Kai kurios cheminės medžiagos turi daugiau kaip vieną disociacijos konstantą ir galima sukurti panašias lygtis. Kai kurie iš čia aprašytų metodų taip pat tinka vykstant nerūgštinei / bazinei disociacijai.
                     
                        Kokybės kriterijai
                     
                     
                        Pakartojamumas
                     
                     Reikėtų atlikti kartotinį disociacijos konstantos nustatymą (ne mažiau kaip tris kartus) ± 0,1 log vienetų tikslumu.
                     BANDYMO PROCEDŪRŲ APRAŠYMAS
                     Yra du pagrindiniai pKa. nustatymo būdai. Taikant vieną, žinomas cheminės medžiagos kiekis titruojamas etaloniniu rūgšties arba bazės tirpalu; pagal kitą nustatoma jonizuotos ir nejonizuotos formų santykinė koncentracija ir jų priklausomybė nuo pH.
                     
                        Parengiamieji darbai
                     
                     Šiais principais pagrįsti metodai gali būti klasifikuojami kaip titravimo, spektrofotometrinės ir konduktometrinės procedūros.
                     
                        Bandymo tirpalai
                     
                     Taikant titravimo ir konduktometrinį metodą, cheminė medžiaga turėtų būti ištirpinta distiliuotame vandenyje. Taikant spektrofotometrinį ir kitus metodus, naudojami buferiniai tirpalai. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija neturėtų būti didesnė nei 0,01 mol/l arba viena antroji soties koncentracijos, jei ši mažesnė, o tirpalams ruošti turėtų būti naudojama gryniausia turima medžiagos forma. Jei medžiagos tirpumas vidutinis, ją galima ištirpinti mažame tūryje su vandeniu maišaus tirpiklio prieš padidinant iki pirmiau nurodytų koncentracijos verčių.
                     Tirpalus reikėtų tikrinti dėl emulsijos susidarymo naudojant Tindalio šviesos pluoštą, ypač jei buvo naudojamas kitas tirpiklis tirpumui padidinti. Jei naudojami buferiniai tirpalai, jų koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 0,05 mol/l.
                     
                        Bandymo sąlygos
                     
                     
                        Temperatūra
                     
                     Temperatūra turėtų būti kontroliuojama bent ± 1°C tikslumu. Nustatymą pageidautina atlikti 20 °C temperatūroje.
                     Jei yra įtarimų dėl reikšmingos priklausomybės nuo temperatūros, nustatymą reikėtų atlikti esant mažiausiai dar dviem temperatūros vertėms. Šiuo atveju temperatūros intervalai turėtų būti 10 °C, o temperatūra kontroliuojama ± 0,1 °C tikslumu.
                     
                        Analizės
                     
                     Dėl metodo bus sprendžiama atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos tipą. Jis turi būti pakankamai jautrus, kad būtų galima nustatyti skirtingas daleles esant kiekvienai bandymo tirpalo koncentracijai.
                     
                        Bandymo eiga
                     
                     
                        Titravimo metodas
                     
                     Bandymo tirpalas matuojamas titruojant reikiamu etaloniniu bazės ar rūgšties tirpalu ir matuojant pH po kiekvieno titranto pridėjimo. Iki ekvivalentinio taško titrantą reikėtų įpilti ne mažiau kaip per 10 kartų. Jei pusiausvyra pasiekiama pakankamai greitai, galima naudoti savirašį potenciometrą. Taikant šį metodą nebūtina tiksliai žinoti suminį medžiagos kiekį ir jos koncentraciją. Turi būti imtasi priemonių anglies dioksidui pašalinti. Daugiau informacijos apie procedūrą, atsargumo priemones ir skaičiavimą pateikta tipinių bandymų aprašymuose, pvz., (1), (2), (3), (4) nuorodos.
                     
                        Spektrofotometrinis metodas
                     
                     Nustatomas bangos ilgis, kuriam esant cheminės medžiagos jonizuotos ir nejonizuotos formų ekstinkcijos koeficientai žymiai skiriasi. Gaunamas pastovios koncentracijos tirpalų UV/VIS absorbcijos spektras, esant pH vertei, kai medžiaga yra iš esmės nejonizuota ir visiškai jonizuota bei kelioms tarpinėms pH vertėms. Tai galima atlikti nedidelius koncentruotos rūgšties (bazės) kiekius dedant į palyginti didelį cheminės medžiagos daugiakomponenčio buferinio tirpalo tūrį, iš pradžių esant didelei (mažai) pH vertei (nuor. 5), arba pridedant vienodus cheminės medžiagos pradinio tirpalo, pvz., vandenyje, metanolyje, tūrius į pastovius tūrius įvairių buferinių tirpalų, apimančių reikiamą pH intervalą. Pagal pH ir optinio tankio vertes, esant pasirinktam bangos ilgiui, apskaičiuojamas pakankamas pKa verčių skaičius, naudojant duomenis, gautus bent penkioms pH vertėms, kai cheminė medžiaga yra ne mažiau kaip 10 procentų ir mažiau kaip 90 procentų jonizuota. Papildomi bandymų duomenys ir skaičiavimo metodas pateikti (1) nuorodoje.
                     
                        Konduktometrinis metodas
                     
                     Naudojant žinomos mažos konstantos celę, matuojamas maždaug 0,1 mol/l cheminės medžiagos tirpalo laidžiui matuoti skirtame vandenyje laidis. Taip pat matuojamos kelių šio tirpalo tiksliai praskiestų tirpalų laidžio vertės. Kiekvieną kartą koncentracija mažinama pusiau, o tirpalų serija turi aprėpti bent vieną koncentracijos dydžių eilę. Ribinis laidis esant begaliniam praskiedimui nustatomas atliekant panašų bandymą su Na druska ir ekstrapoliuojant. Taikant Onzagerio lygtį, pagal kiekvieno tirpalo laidį galima apskaičiuoti disociacijos laipsnį, taigi taikant Ostvaldo praskiedimo dėsnį galima apskaičiuoti disociacijos konstantą kaip K = α2C/(1 – α), kai C yra koncentracija moliais litre, o α – disociacijos laipsnis. Turi būti imtasi priemonių CO2 pašalinti. Daugiau informacijos apie bandymo duomenis ir skaičiavimą pateikta tipinių bandymų aprašymuose ir (1), (6) bei (7) nuorodose.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     
                        Titravimo metodas
                     
                     pKa apskaičiuojamas 10 matavimo taškų titravimo kreivėje. Apskaičiuojamas tokių pKa verčių vidurkis ir standartinis nuokrypis. Reikėtų įtraukti pH priklausomybės nuo etaloninio bazės ar rūgšties tirpalo tūrio grafiką ir duomenis lentelių pavidalu.
                     
                        Spektrofotometriniai metodai
                     
                     Į lenteles įrašomos kiekvienam spektrui gautos optinio tankio ir pH vertės. Pagal tarpinius spektrinių duomenų taškus apskaičiuojamos ne mažiau kaip penkios pKa vertės, taip pat apskaičiuojamas šių rezultatų vidurkis ir standartinis nuokrypis.
                     
                        Konduktometrinis metodas
                     
                     Ekvivalentinis laidis Λ apskaičiuojamas kiekvienai rūgšties koncentracijai ir kiekvienai mišinio, sudaryto iš vieno ekvivalento rūgšties ir 0,98 ekvivalento karbonato neturinčio natrio hidroksido, koncentracijai. Rūgšties perteklius imamas tam, kad nebūtų OH– pertekliaus dėl hidrolizės. Gaunamas 1/Λ kaip √C funkcijos grafikas, o druskos Λo gali būti nustatytas atliekant ekstrapoliavimą į nulinę koncentraciją.
                     Rūgšties Λo gali būti apskaičiuotas, naudojant literatūroje pateiktas H+ ir Na+ vertes. Kiekvienos koncentracijos pKa gali būti apskaičiuota pagal α = Λi /Λo ir Ka = α2C/(1 – α). Tikslesnės Ka vertės gali būti gautos darant judrumo ir aktyvumo pataisas. Reikėtų apskaičiuoti pKa verčių vidurkį ir standartinius nuokrypius.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Reikėtų pateikti visus neapdorotus duomenis, apskaičiuotas pKa vertes kartu su skaičiavimo metodu (pageidautina lentelės pavidalu, koks siūlomas nuor. 1), taip pat pirmiau aprašytus statistinius parametrus. Jei taikomi titravimo metodai, reikėtų pateikti titrantų standartizavimo duomenis.
                     Jei taikomas spektrofotometrinis metodas, reikėtų pateikti visus spektrus. Jei taikomas konduktometrinis metodas, ataskaitoje reikėtų pateikti celės konstantos nustatymo duomenis. Reikėtų pateikti informaciją apie naudojamą įrangą, analizės metodus ir visų naudotų buferinių tirpalų tipą.
                     Reikėtų pateikti bandymo temperatūros vertę (-es).
                     LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (žr. pirmiau).
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 
                                    Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).“
                              
                           
               
                     2)
                  
                  
                     B dalies B.5 skyrius pakeičiamas taip:
                     „B.5   ŪMUS AKIŲ DIRGINIMAS IR (ARBA) ĖSDINIMAS
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 405 (2012). EBPO cheminėms medžiagoms bandyti skirtos bandymų gairės periodiškai peržiūrimos, siekiant, kad jose būtų atsižvelgta į geriausius turimus mokslinius duomenis. Anksčiau peržiūrint šias gaires, ypatingas dėmesys buvo kreipiamas į galimus pagerinimo būdus, įvertinant visą turimą informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kad būtų išvengta nebūtinų bandymų su laboratoriniais gyvūnais ir taip būtų sprendžiamos jų gerovės problemos. Į TG 405 (priimtas 1981 m. ir atnaujintas 1987, 2002 ir 2012 m.) įtraukta rekomendacija, kad prieš atliekant aprašytą ūmaus akių dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymą, reikėtų atlikti esamų atitinkamų duomenų įrodomosios vertės analizę (1). Jei duomenų nepakanka, rekomenduojama jų gauti atliekant nuosekliuosius bandymus (2)(3). Bandymų strategiją, pateiktą kaip šio bandymų metodo priedėlis, sudaro patvirtinti ir priimti in vitro bandymai. Reglamento (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) (2) taikymo tikslu kompleksinių bandymų strategija taip pat įtraukta į atitinkamą ECHA rekomendaciją (21). Bandymus su gyvūnais reikėtų atlikti tik tais atvejais, kai nustatoma, kad jie yra būtini, išnagrinėjus turimus alternatyvius metodus, ir taikyti tik tuos metodus, kurie nustatyti kaip tinkami. Tuo metu, kai buvo rengiamas šio atnaujinto bandymo metodo projektas, pagal kai kurias reglamentavimo sistemas vis dar buvo būtina arba reikalaujama taikyti šį metodą.
                     Vėliausiame atnaujinime daugiausia dėmesio skiriama analgetikų ir anestetikų naudojimui, nedarant įtakos pagrindinei bandymų gairių koncepcijai ir struktūrai. ICCVAM (3) ir tarptautinė mokslinė nepriklausomų ekspertų grupė peržiūrėjo vietinių anestetikų ir sisteminių analgetikų įprastinio naudojimo naudą bei apribojimus ir humaniško poveikio vertinamąsias baigtis, atliekant in vivo akių dirginimo saugos bandymus (12). Peržiūros išvada yra ta, kad, naudojant vietinius anestetikus ir sisteminius analgetikus, dažniausiai arba visiškai būtų galima išvengti skausmo ir kančių, nedarant įtakos bandymo rezultatui, ir rekomenduojama, kad šios medžiagos būtų visuomet naudojamos. Šiame bandymo metode atsižvelgta į šią peržiūrą. Atliekant ūmaus akių dirginimo ir ėsdinimo in vivo bandymus, įprastai reikėtų naudoti vietinius anestetikus, sisteminius analgetikus ir humaniško poveikio vertinamąsias baigtis. Jų naudojimo išimtys turėtų būti pagrįstos. Šiame metodo aprašyme nurodyti patobulinimai iš esmės sumažins gyvūnų skausmą ir kančias arba jų bus išvengta atliekant daugelį bandymų, kai vis dar yra būtinas in vivo akių saugos bandymas.
                     Subalansuotą prevencinį skausmo valdymą turėtų sudaryti (i) įprastinis išankstinis apdorojimas vietiniu anestetiku (pvz., proparakainu ar tetrakainu) ir sisteminiu analgetiku (pvz., buprenorfinu), (ii) įprastinio paskesnio nuskausminimo sisteminiais analgetikais (pvz., buprenorfinu ir meloksikamu) planas, (iii) planinis gyvūnų stebėjimas, monitoringas ir registravimas dėl klinikinių skausmo ir (arba) kančių požymių ir (iv) planinis visų akių pažeidimo tipų, rimtumo ir eigos stebėjimas, monitoringas ir registravimas. Papildoma informacija pateikta toliau aprašytose atnaujintose procedūrose. Po veikimo bandomąja chemine medžiaga nereikėtų naudoti papildomų vietinių anestetikų ar analgetikų, kad būtų išvengta tyrimo trukdžių. Analgetikų su priešuždegiminiu veikimu (pvz., meloksikamo) nereikėtų naudoti kaip vietinių analgetikų, o sisteminio naudojimo dozės neturėtų trukdyti akių poveikiui.
                     Apibrėžtys aprašytos bandymo metodo priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI
                     Siekiant užtikrinti duomenų mokslinį patikimumą ir gyvūnų gerovę, in vivo bandymai neturėtų būti numatomi tol, kol atliekant duomenų įrodomosios vertės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apibūdinantys galimą cheminės medžiagos ėsdinamąjį ar dirginamąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudaro turimų tyrimų su žmonėmis ir (arba) laboratoriniais gyvūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti apie vieną arba kelias medžiagas, turinčias giminingą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys cheminės medžiagos stiprias rūgštines arba šarmines savybes (4)(5), be to, patvirtintų ir priimtų in vitro arba ex vivo odos ėsdinimo ir dirginimo bandymų rezultatai (6) (13) (14) (15) (16) (17). Tyrimai gali būti daromi prieš duomenų įrodomosios vertės analizę arba kaip jos rezultatas.
                     Tokia tam tikrų cheminių medžiagų analizė gali parodyti, kad reikia atlikti cheminės medžiagos akių ėsdinimo ar dirginimo gebos in vivo tyrimus. Visais šiais atvejais prieš svarstant in vivo akių bandymo atlikimą, pageidautina prieš tai atlikti cheminės medžiagos in vitro ir (arba) odos ėsdinimo in vivo padarinių tyrimą ir ją įvertinti taikant B.4 bandymų metodo (7) nuosekliųjų bandymų strategiją arba kompleksinių bandymų strategiją, aprašytą ECHA rekomendacijoje (21).
                     Nuosekliųjų bandymų strategija, kurią sudaro patvirtintų in vitro ar ex vivo akių ėsdinimo ar dirginimo bandymų atlikimas, yra įtraukta į šį bandymo metodą kaip priedėlis ir, dėl REACH, į ECHA rekomendaciją (21). Prieš pradedant in vivo bandymus, rekomenduojama laikytis šios bandymų strategijos. Naujoms cheminėms medžiagoms rekomenduojamas nuosekliųjų bandymų metodas, siekiant gauti moksliškai pagrįstus cheminės medžiagos ėsdinimo ar dirginimo duomenis. Esamoms cheminėms medžiagoms, apie kurių odos ir akių ėsdinimo ar dirginimo savybes duomenų nepakanka, ši strategija gali būti taikoma trūkstamiems duomenims gauti. Kitokios bandymo strategijos arba procedūros taikymas arba sprendimas netaikyti nuosekliųjų bandymų metodo turėtų būti pagrįstas.
                     
                        IN VIVO BANDYMO METODO PRINCIPAS
                     Po parengtinio apdorojimo sisteminiu analgetiku ir suleidus atitinkamo vietinio anestetiko, viena iš bandymo gyvūno akių veikiama vienkartine bandomosios cheminės medžiagos doze, neapdorota akis naudojama kaip kontrolinė. Akių dirginimo ir (arba) ėsdinimo geba nustatoma tam tikrais laiko tarpais balais įvertinant junginės, ragenos ir rainelės pažeidimus. Be to, siekiant išsamiai įvertinti poveikį, aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas sisteminis poveikis. Tyrimo trukmė turi būti pakankama, kad būtų galima įvertinti, ar poveikis yra grįžtamas ar negrįžtamas.
                     Gyvūnai, kuriems bet kurioje bandymo stadijoje pasireiškia stiprus skausmas, kančios arba pažeidimai, atitinkantys šiame bandymų metode aprašytas humaniško poveikio vertinamąsias baigtis (žr. 26 pastraipą), turi būti humaniškai numarinami, o cheminė medžiaga atitinkamai įvertinta. Sprendimo dėl gaištančių ir stipriai kenčiančių gyvūnų humaniško numarinimo priėmimo kriterijai yra nagrinėjami EBPO rekomendaciniame dokumente (8).
                     
                        IN VIVO BANDYMO METODO PARENGIAMIEJI DARBAI
                     
                        Rūšių parinkimas
                     
                     Tinkamiausias laboratorinis gyvūnas – baltasis triušis; naudojami sveiki, jauni suaugę triušiai. Kitų rūšių ar veislių naudojimas turi būti pagrįstas.
                     
                        Gyvūnų paruošimas
                     
                     Abi kiekvieno bandymui numatyto gyvūno akys turėtų būti patikrintos per 24 h iki bandymo pradžios. Gyvūnai, kuriems nustatomas akių dirginimas, akių defektai arba prieš tai buvęs ragenos pažeidimas, neturėtų būti naudojami.
                     
                        Laikymo ir šėrimo sąlygos
                     
                     Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bandymo triušiai, temperatūra turėtų būti 20 °C (± 3 °C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų siekti, kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Reikėtų vengti per didelio šviesos stiprio. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.
                     BANDYMO PROCEDŪRA
                     
                        Vietinių anestetikų ir sisteminių analgetikų naudojimas
                     
                     Rekomenduojamos šios procedūros, kad atliekant saugos akims bandymo procedūras būtų išvengta skausmo ir kančių arba jos būtų kiek įmanoma mažesnės. Jas galima pakeisti alternatyviomis procedūromis, jei būtų nustatyta, kad jos vienodai arba labiau padeda išvengti skausmo ir kančių.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Šešiasdešimt minučių iki veikimo chemine medžiaga (TCA) pradžios daroma buprenorfino 0,01 mg/kg poodinė injekcija, kad būtų užtikrintas gydomasis sisteminio nuskausminimo lygis. Neturima duomenų arba nėra tikėtina, kad sisteminio poveikio buprenorfinas ir kiti panašūs opiatiniai analgetikai pakeistų akių atsakus (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Prieš penkias minutes iki TCA į kiekvieną akį įlašinama vienas arba du lašai vietinio akių anestetiko (pvz., 0,5 % proparakaino hidrochlorido arba 0,5 % tetrakaino hidrochlorido). Siekiant išvengti galimų tyrimo trikdžių, rekomenduojamas vietinis anestetikas, kuris neturi konservantų. Kiekvieno gyvūno akis, kuri nėra apdorojama chemine medžiaga, bet apdorojama vietiniu anestetiku, naudojama kontrolei. Jei numanoma, kad cheminė medžiaga gali sukelti stiprų skausmą ir kančias, jos nereikėtų bandyti in vivo. Tačiau, jei yra abejonių arba bandymas yra būtinas, reikėtų svarstyti klausimą dėl papildomo vietinio anestetiko naudojimo 5 min intervalais prieš TCA. Naudotojai turėtų suvokti, kad daugkartinis vietinio anestetiko naudojimas galėtų šiek tiek padidinti chemiškai sukeltų pažeidimų rimtumą ir (arba) jų išnykimo trukmę.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Praėjus aštuonioms valandoms po TCA, daroma buprenorfino 0,01 mg/kg ir meloksikamo 0,5 mg/kg poodinė injekcija, kad būtų užtikrintas nuolatinis gydomasis sisteminio nuskausminimo lygis. Nors nėra duomenų, kurie rodytų meloksikamo priešuždegiminį poveikį akims, kai jis suleidžiamas po oda vieną kartą per dieną, meloksikamo nereikėtų naudoti anksčiau nei 8 h po TCA, kad būtų išvengta visų galimų tyrimo trukdžių (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Po pirmojo nuskausminimo, daromo praėjus 8 h po TCA, kas 12 h po oda reikėtų leisti 0,01 mg/kg buprenorfino ir kartu su juo kas 24 h – 0,5 mg/kg meloksikamo, kol išnyksta akių pažeidimai ir nelieka klinikinių skausmo bei kančių požymių. Galima svarstyti ilgesnės veikimo trukmės preparatų naudojimą, kurie sumažintų analgetikų dozavimo dažnumą.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Reikėtų atlikti „pagalbinį“ nuskausminimą nedelsiant po TCA, jei prevencinio nuskausminimo analgetikais ir vietinės anestezijos nepakanka. Jei tyrimo metu matyti, kad gyvūnas patiria skausmą ir kančias, vietoj poodinės 0,01 mg/kg injekcijos kas 12 h reikėtų nedelsiant po oda suleisti 0,03 mg/kg buprenorfino „pagalbinę“ dozę ir, jei būtina, tai kartoti kas 8 h. Poodinę meloksikamo 0,5 mg/kg injekciją reikėtų atlikti kas 24 h kartu su „pagalbine“ buprenorfino doze, bet ne anksčiau kaip bent praėjus 8 h po TCA.
                              
                           
                        Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas
                     
                     Bandomoji cheminė medžiaga dedama į kiekvieno gyvūno vienos akies junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatinį voką nuo akies obuolio. Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad medžiaga neištekėtų. Kita neapdorota akis naudojama kontrolei.
                     
                        Drėkinimas
                     
                     Įdėjus bandomosios cheminės medžiagos, bandymo gyvūno akių nereikėtų plauti mažiausiai 24 h, išskyrus kietąsias medžiagas (žr. 18 pastraipą) ir jei iš karto pasireiškia ėsdinimo arba dirginimo poveikis. Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti.
                     Nerekomenduojama naudoti pagalbinės gyvūnų grupės plovimo įtakai tirti, išskyrus atvejus, kai tai yra moksliškai pagrįsta. Prireikus pagalbinės grupės, reikėtų naudoti du triušius. Plovimo sąlygos turėtų būti išsamiai dokumentuotos, pvz., plovimo laikas; plovimo tirpalo sudėtis ir temperatūra; plovimo trukmė, tirpalo tūris ir srautas.
                     
                        Dozės dydis
                     
                     (1)   Skysčių bandymas
                     
                     Bandant skysčius, naudojama 0,1 ml dozė. Nereikėtų naudoti purškiklio cheminei medžiagai tiesiai į akį įlašinti. Prieš įlašinant 0,1 ml į akį, skystasis purškiklis išpurškiamas į indą ir surenkamas.
                     (2)   Kietųjų medžiagų bandymas
                     
                     Bandant kietąsias, pastos ir dalelių pavidalo chemines medžiagas, naudojamos medžiagos tūris turėtų būti 0,1 ml arba masė – ne didesnė kaip 100 mg. Bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti sumalta į smulkias dulkes. Kietosios medžiagos tūrį reikėtų matuoti ją švelniai sutankinus, pvz., tapšnojant matavimo indą. Jei stebint pirmą kartą, praėjus 1 h po akies apdorojimo, kieta bandomoji cheminė medžiaga nepasišalino iš bandymo gyvūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, akį galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu.
                     (3)   Aerozolių bandymas
                     
                     Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiamąsias medžiagas ir aerozolius iš pradžių surinkti į indą. Viena išimtis taikoma slėginiuose aerozolių purkštuvuose esančioms cheminėms medžiagoms, kurių negalima surinkti dėl garavimo. Tokiais atvejais akis laikoma atverta ir bandomoji cheminė medžiaga maždaug vieną sekundę purškiama tiesiai į akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali skirtis, atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio slėgį. Reikia imtis atsargumo priemonių nepažeisti akies veikiant purškimo slėgiui. Atitinkamais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto jėga tikimybę.
                     Aerozolio dozės įvertį būtų galima gauti modeliuojant bandymą taip: cheminė medžiaga purškiama ant sveriamojo popieriaus pro triušio akies dydžio angą, esančia tiesiai prieš popierių. Popieriaus masės padidėjimas naudojamas apytikriam į akį įpurkšto kiekio įvertinimui. Lakiųjų cheminių medžiagų dozė gali būti įvertinta pasveriant indą su chemine medžiaga prieš įpurškimą ir po jo.
                     
                        Pradinis bandymas (akies dirginimo ar ėsdinimo bandymas in vivo su vienu gyvūnu)
                     
                     Griežtai rekomenduojama atlikti in vivo bandymą iš pradžių su vienu gyvūnu (žr. šio bandymo priedėlį Nuosekliųjų bandymų strategija akių dirginimui ir ėsdinimui nustatyti). Stebėjimai turėtų padėti nustatyti rimtumą ir grįžtamumą prieš atliekant patvirtinamąjį bandymą su antruoju gyvūnu.
                     Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašytąją procedūrą cheminė medžiaga yra akis ėsdinanti arba stipriai jas dirginanti, kitų akies dirginimo bandymų nereikėtų atlikti.
                     
                        Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su papildomais gyvūnais)
                     
                     Jei atliekant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis nestebimas, dirginamąjį poveikį arba neigiamą atsaką reikėtų patvirtinti naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyvūnus. Jei atliekant pradinį bandymą ėsdinantis poveikis stebimas, patvirtinamąjį bandymą rekomenduojama atlikti nuosekliuoju būdu su vienu gyvūnu, o ne veikiant abu papildomus gyvūnus vienu metu. Jei antrajam gyvūnui pasireiškia ėsdinamasis arba stiprus dirginamasis poveikis, bandymas nutraukiamas. Jei antrajam gyvūnui gautų rezultatų pakanka klasifikavimui nustatyti, kiti papildomi bandymai neatliekami.
                     
                        Stebėjimo periodas
                     
                     Stebėjimo laikotarpio trukmės turėtų pakakti stebimo poveikio dydžiui ir grįžtamumui visiškai įvertinti. Tačiau bandymą reikėtų baigti bet kuriuo momentu, kai tik gyvūnui pasireiškia stipraus skausmo arba kančios požymiai (8). Poveikio grįžtamumui nustatyti gyvūnai paprastai stebimi 21 parą po bandomosios cheminės medžiagos davimo. Jei grįžtamumas pastebimas anksčiau nei 21 parą, bandymas nutraukiamas tuo momentu.
                     
                        Klinikiniai stebėjimai ir akių reakcijos įvertinimas balais
                     
                     Reikėtų išsamiai įvertinti, ar akys pažeistos ar ne, praėjus vienai valandai po TCA, vėliau įvertinant ne rečiau kaip kasdien. Pirmąsias 3 paras gyvūnus reikėtų įvertinti kelis kartus per dieną, siekiant užtikrinti, kad sprendimai dėl nutraukimo būtų priimti laiku. Bandymo gyvūnai turėtų būti įprastiniu būdu įvertinami visą tyrimo trukmę skausmo ir (arba) kančių klinikiniams požymiams (pvz., kartotinio akies lietimo letena arba trynimo, per dažno mirkčiojimo, per didelio ašarojimo) (9) (10) (11) nustatyti ne rečiau kaip du kartus per dieną, esant ne mažesniam kaip 6 h intervalui tarp stebėjimų, arba dažniau, jei būtina. Tai yra būtina siekiant (i) tinkamai įvertinti gyvūnus dėl skausmo ir kančių požymių buvimo, kad būtų priimti pagrįsti sprendimai, ar reikia padidinti analgetikų dozes, ir (ii) įvertinti gyvūnus dėl nustatytų humaniško poveikio vertinamųjų baigčių buvimo, kad būtų galima priimti pagrįstus sprendimus, ar reikia humaniškai numarinti gyvūnus, ir užtikrinti, kad tokie sprendimai būtų priimti laiku. Paprastai reikėtų dažyti fluoresceinu ir naudoti biologinį mikroskopą su plyšine lempa, jei manoma, kad to reikia (pvz., žaizdos gyliui įvertinti, esant ragenos išopėjimui) kaip priemonės akių pažaidai aptikti bei išmatuoti ir įvertinti, ar pasiekti humaniško numarinimo vertinamųjų baigčių kriterijai. Galima kaupti stebimų pažeidimų skaitmenines nuotraukas, kurios būtų naudojamos palyginimui ir kaip nuolatinis akių pažaidų laipsnio registravimas. Gyvūnai turėtų būti bandomi ne ilgiau nei būtina galutinei informacijai gauti. Gyvūnai, kuriems pasireiškia stiprus skausmas arba kančia, turi būti iš karto humaniškai numarinti, o cheminė medžiaga atitinkamai įvertinta.
                     Turėtų būti humaniškai numarinami gyvūnai, kuriems po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai (žr. 1 lentelę dėl pažeidimo balų aprašymo): ragenos pradūrimas arba didelės ragenos opos, įskaitant stafilomą; kraujo atsiradimas priekinėje akies kameroje; 4 balų ragenos drumstumas; šviesos reflekso nebuvimas (2 balų rainelės atsakas) ilgiau kaip 72h; junginės membranos opos; junginės arba mirksimosios membranos nekrozė, arba nekrozinio audinio lupimasis. Numarinti reikia todėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negrįžtami. Be to, rekomenduojama toliau nurodytus akių pažeidimus naudoti kaip humaniško poveikio vertinamąsias baigtis tyrimui užbaigti anksčiau nei 21 paros stebėjimo laikotarpiu. Sunkių dirginimo ar ėsdinimo sužeidimų ir sužeidimų, kurie, kaip manoma, nebūtų visiškai grįžtami baigiantis 21 paros stebėjimo periodui, numatomaisiais pažeidimais laikomi šie: didelis žaizdos gylis (pvz., ragenos opa išplinta giliau nei paviršiniai ragenos medžiagos sluoksniai), ragenos krašto suirimas > 50 % (rodo junginės audinio blukimas), ir stipri akių infekcija (pūlių išsiskyrimas). Ragenos paviršiaus vaskuliarizacijos (t. y. panuso), nudažyto fluoresceinu ploto nemažėjimo per kasdieniniam vertinimui nustatytą trukmę ir (arba) reepitelizacijos nebuvimo, praėjus 5 paroms nuo cheminės medžiagos įterpimo, derinys taip pat galėtų būti laikomas potencialiai naudingu kriterijumi priimant klinikinį sprendimą dėl pirmalaikio tyrimo nutraukimo. Tačiau vien tik šių duomenų nepakanka pirmalaikiam tyrimo nutraukimui pagrįsti. Nustačius stiprų poveikį akims, reikėtų pasikonsultuoti su gydančiuoju arba kvalifikuotu laboratorijos veterinaru arba su klinikinius pažeidimus nustatyti apmokytu personalu, kad būtų galima nustatyti, ar šių poveikių derinys pateisina pirmalaikį tyrimo nutraukimą. Turėtų būti gauti akių (junginės, ragenos ir rainelės) pažeidimai balais ir užrašyti praėjus 1, 24, 48 ir 72 h po bandomosios cheminės medžiagos uždėjimo (1 lentelė). Jei gyvūnų akių pažeidimų neatsiranda, bandymas gali būti baigtas ne anksčiau kaip 3 paros po įlašinimo. Gyvūnus su nedideliais pažeidimais reikėtų stebėti tol, kol tie pažeidimai pranyksta, arba 21 parą, kai tyrimas baigiamas. Stebėjimai turi būti atliekami ir registruojami ne rečiau kaip po 1 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 parų, 14 parų ir 21 paros, kad būtų galima nustatyti pažeidimų būseną ir jų grįžtamumą ar negrįžtamumą. Prireikus stebima dažniau, kad būtų galima nustatyti, ar bandymų gyvūną reikėtų numarinti iš humaniškų paskatų ar pašalinti iš tyrimo dėl neigiamų rezultatų.
                     Akių pažeidimų vertinimo balai (1 lentelė) turėtų būti užrašomi kiekvieno tikrinimo metu. Taip pat reikėtų pranešti apie visus kitus akių pažeidimus (pvz., panusą, dėmių atsiradimą, priekinės kameros pokyčius) arba neigiamą sisteminį poveikį.
                     Reakcijos tikrinimą galima palengvinti naudojant binokulinę lupą, rankinę plyšinę lempą, biologinį mikroskopą arba kitokį tinkamą įtaisą. Užrašius 24 h stebėjimus, akys gali būti toliau tiriamos naudojant fluoresceiną.
                     Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. Siekiant labiau suderinti akių reakcijos įvertinimą balais ir padėti bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina stebėjimus, juos vykdantis personalas turi būti atitinkamai išmokytas taikyti įvertinimo balais sistemą.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų įvertinimas
                     
                     Akių dirginimo balus reikėtų įvertinti atsižvelgiant į pažeidimų tipą ir rimtumą bei į poveikio grįžtamumą arba negrįžtamumą. Atskiri balai nėra cheminės medžiagos dirginamųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar įvertinamas kitas bandomosios cheminės medžiagos poveikis. Į šiuos atskirai gautus balus reikėtų žiūrėti kaip į palyginamąsias vertes, reikšmingas tik tais atvejais, kai jas patvirtina išsamus visų kitų stebėjimų aprašymas ir įvertinimas.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    in vivo bandymų pagrindimas: jau turimų bandymų duomenų įrodomosios vertės analizė, įskaitant nuosekliųjų bandymų strategijos taikymo rezultatus:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ankstesnių bandymų atitinkamų duomenų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             duomenys, gauti kiekviename bandymų strategijos etape;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             atliktų in vitro bandymų aprašymas, įskaitant išsamią informaciją apie procedūras, rezultatus, gautus tiriant bandomąsias ar etalonines chemines medžiagas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             atlikto in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo tyrimo aprašymas, įskaitant gautus rezultatus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             duomenų įrodomosios vertės analizė in vivo tyrimui atlikti.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikavimo duomenys (pvz., cheminis pavadinimas ir CAS numeris, jei yra, grynumas, žinomos priemaišos, kilmė, partijos numeris);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fizikinė būsena ir fizikinės cheminės savybės (pvz., pH, lakumas, tirpumas, stabilumas, reagavimas su vandeniu),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei tai mišinys, reikėtų nurodyti komponentus, įskaitant sudedamųjų medžiagų identifikavimo duomenis (pvz., cheminį pavadinimą ir CAS numerį, jei yra), ir jų koncentraciją;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudojama dozė.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nešiklis:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikavimo duomenys, koncentracija (jei tinka), naudojamas tūris;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nešiklio pasirinkimo pagrindimas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo gyvūnai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             naudota rūšis ar veislė, kitų nei baltųjų triušių naudojimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno gyvūno amžius tyrimo pradžioje;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienos lyties gyvūnų skaičius bandymo ir kontrolinėje (jei reikia) grupėje;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             atskirų gyvūnų masė bandymo pradžioje ir pabaigoje;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų kilmė, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Anestetikai ir analgetikai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             dozės ir laikas, kuriuo buvo duodami vietiniai anestetikai ir sisteminiai analgetikai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei naudojamas vietinis anestetikas, jo identifikavimo duomenys, grynumas, tipas ir galima sąveika su bandomąja chemine medžiaga.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             metodo, taikyto dirginimui kiekvienu stebėjimo momentu įvertinti balais (pvz., rankinė plyšinė lempa, biologinis mikroskopas, fluoresceinas), aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno gyvūno dirginimo ar ėsdinimo atsako duomenų, gautų kiekvienu stebėjimo momentu iki gyvūno pašalinimo iš bandymo, lentelės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stebimo dirginimo arba ėsdinimo tipo ir laipsnio pasakojamasis aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų kitų akies pažeidimų aprašymas (pvz., vaskuliarizacija, panuso susidarymas, sąaugų, dėmių atsiradimas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vietinių ir sisteminių su akimis nesusijusių neigiamų padarinių aprašymas, skausmo ir kančių klinikinių požymių įrašai, skaitmeninės nuotraukos ir histopatologiniai duomenys, jei yra.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas.
                                 
                              
                           
                        Rezultatų aiškinimas
                     
                     Su laboratoriniais gyvūnais atliktų akių dirginimo tyrimų rezultatų ekstrapoliavimas žmonėms tinka tik tam tikru mastu. Daugeliu atvejų baltieji triušiai yra jautresni akis dirginančioms arba ėsdinančioms medžiagoms nei žmonės.
                     Aiškinant rezultatus turi būti stengiamasi neįtraukti antrinės infekcijos sukelto dirginimo.
                     LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410 – 429.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159 – 164.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483 – 524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Šio priedo B.4 skyrius, Ūmus toksiškumas. Odos dirginimas ar ėsdinimas.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.
                                 http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Šio priedo B.40 skyrius, Odos suardymas in vitro. Odos sluoksnio elektrinės varžos (OSEV) bandymas.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Šio priedo B.40bis skyrius, Odos suardymas in vitro. Žmogaus odos modelio bandymas.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Šio priedo B.47 skyrius Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Šio priedo B.48 skyrius Atskirtų viščiukų akių bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006. (OL L 353, 2008 12 31, p. 1).
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.
                                 http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
                              
                           
                        1 lentelė
                     
                     
                        Akių pažeidimo vertinimo balais skalė
                     
                     
                                 Ragena
                              
                              
                                 Balas
                              
                           
                                 Drumstumas: tankumo laipsnis (duomenys imami iš tankiausios srities) (*1)
                                 
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Opėjimo arba drumstumo nėra
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Taškinės arba pasklidosios drumstumo sritys (kitokios nei nedidelis normalaus blizgesio išblukimas); rainelės elementai aiškiai matomi
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Lengvai įžiūrima pusskaidrė sritis; rainelės elementai šiek tiek neryškūs
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Perlamutrinė sritis; rainelės elementai nematomi; vyzdžio dydis vos įžiūrimas
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Ragena matinė, dėl drumstumo rainelės nesimato
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Didžiausias įmanomas balas: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Rainelė
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normali
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Labai pagilėjusios raukšlės, kongestija, pabrinkimas, vidutiniška junginės apie rageną hiperemija; arba paburkimas; rainelė vis dar reaguoja į šviesą (vangi reakcija laikoma poveikiu)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Kraujavimas, stiprus suirimas arba nėra reakcijos į šviesą
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Didžiausias įmanomas balas: 2
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Junginė
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Raudonumas (taikoma voko ir obuolio junginei, išskyrus rageną ir rainelę)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normalus
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Kai kurie kraujo indai hiperemiški (paburkę)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Pasklidasis, tamsiai raudonos spalvos; atskiri indai sunkiai įžiūrimi
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Pasklidasis, jautienos raudonumo spalvos
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Didžiausias įmanomas balas: 3
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Chemozė
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Paburkimas (taikoma vokams ir (arba) niktitacinėms membranoms)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normali
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Šiek tiek didesnis nei normalus pabrinkimas
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Akivaizdus pabrinkimas, vokai iš dalies išvirtę
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Pabrinkimas, pusiau užmerkti vokai
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Pabrinkimas, daugiau nei pusiau užmerkti vokai
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Didžiausias įmanomas balas: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              
                                 Rūgšties ar šarmo atsarga –
                            jei preparatai rūgštiniai, natrio hidroksido/100 g preparato kiekis (g), kurio reikia nurodytai pH vertei gauti. Jei preparatai šarminiai, natrio hidroksido kiekis (g), ekvivalentiškas sieros rūgšties/100 g preparato kiekiui (g), kurio reikia nurodytai pH vertei gauti (Young et al. 1988).
                        
                           
                              
                                 Cheminė medžiaga –
                            medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              
                                 Nedirginančios cheminės medžiagos –
                            medžiagos, kurios neklasifikuojamos kaip JAV aplinkos apsaugos agentūros (AAA) I, II ar III kategorijos; GHS 1, 2, 2A ar 2B kategorijos arba ES 1 ar 2 kategorijos akis dirginančios medžiagos (17) (18) (19).
                        
                           
                              
                                 Akis ėsdinančios cheminės medžiagos –
                            a) cheminės medžiagos, kurios sukelia negrįžtamąjį akies audinio pažeidimą; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip GHS 1 kategorijos, ar AAA I kategorijos akis dirginančios medžiagos arba ES 1 kategorijos (17) (18) (19).
                        
                           
                              
                                 Akis dirginančios cheminės medžiagos –
                            a) cheminės medžiagos, kurios sukelia grįžtamuosius akies pokyčius; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip AAA II ar III kategorijos; GHS 2, 2A ar 2B kategorijos arba ES 2 kategorijos akis dirginančios medžiagos (17) (18) (19).
                        
                           
                              
                                 Akis stipriai dirginančios medžiagos –
                              
                            a) cheminės medžiagos, sukeliančios akies audinių pažeidimą, kuris neišnyksta per 21 parą nuo įterpimo, arba sukeliančios smarkų fizinį regėjimo pablogėjimą; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip GHS 1 kategorijos, AAA I kategorijos arba ES 1 kategorijos akis dirginančios medžiagos (17) (18) (19).
                        
                           
                              
                                 Bandomoji cheminė medžiaga –
                            taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              
                                 Nuosekliųjų bandymų metodas –
                            pakopomis atliekamų bandymų strategija, kai tam tikra eilės tvarka nagrinėjama visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, kiekvienoje pakopoje taikant įrodomosios vertės analizės procesą, siekiant nustatyti, ar yra pakankamai duomenų sprendimui dėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš pereinant prie kitos pakopos. Jei bandomajai cheminei medžiagai dirginamąją gebą galima priskirti atsižvelgiant į turimą informaciją, papildomų bandymų atlikti nereikia. Jei atsižvelgiant į turimą informaciją, bandomajai cheminei medžiagai dirginamosios gebos priskirti neįmanoma, taikoma nuosekliųjų bandymų su gyvūnais procedūra tol, kol galima gauti nedviprasmį klasifikavimą.
                        
                           
                              
                                 Įrodomosios vertės analizė (procesas):
                              
                            Sukauptos informacijos privalumų ir trūkumų naudojimas, kad būtų galima pagrįsti išvadą, kuri, atsižvelgiant į pavienius duomenis, gali nebūti akivaizdi.
                     
                     
                        B.5 BANDYMŲ METODO PRIEDĖLIS
                         (4)
                     
                     NUOSEKLIŲJŲ BANDYMŲ STRATEGIJA AKIŲ DIRGINIMUI IR ĖSDINIMUI NUSTATYTI
                     
                        Bendrieji aspektai
                     
                     Siekiant gauti nuodugnių mokslinių rezultatų ir rūpinantis gyvūnų gerove, svarbu be reikalo nenaudoti gyvūnų ir kiek įmanoma mažinti visus bandymus, kurie gyvūnams gali sukelti stiprius atsakus. Visa informacija apie cheminę medžiagą dėl jos galimo ėsdinamojo ar dirginamojo poveikio odai turėtų būti įvertinta prieš sprendžiant dėl in vivo bandymų. Jei jau yra pakankamai duomenų galimam bandomosios cheminės medžiagos ėsdinamajam arba dirginamajam odos poveikiui klasifikuoti, su laboratoriniais gyvūnais bandymų atlikti nereikia. Taigi, taikant duomenų įrodomosios vertės analizę ir nuosekliųjų bandymų strategiją, iki minimumo sumažėja būtinybė atlikti in vivo bandymus, ypač jei tikėtina, kad cheminė medžiaga gali sukelti stiprias reakcijas.
                     Turimai informacijai apie cheminių medžiagų dirginamąjį ir ėsdinamąjį poveikį akims įvertinti rekomenduojama taikyti duomenų įrodomosios vertės analizę, kuri leistų spręsti, ar tokio poveikio galimybei apibūdinti reikia atlikti papildomus tyrimus, išskyrus in vivo akių tyrimus. Jei reikia papildomų tyrimų, atitinkamiems eksperimentiniams duomenims gauti, rekomenduojama taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Jei nėra medžiagų bandymo duomenų jų ėsdinamajam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reikėtų taikyti nuosekliųjų bandymų strategiją. Šiame priedėlyje aprašyta pradinių bandymų strategija sukurta EBPO praktiniame seminare (1). Vėliau ji buvo patvirtinta bei išplėsta kaip integruota darnioji pavojų dėl cheminių medžiagų poveikio žmonių sveikatai ir aplinkai klasifikavimo sistema, 1998 m. lapkričio mėn. priimta 28-ame jungtiniame cheminių medžiagų komiteto ir cheminių medžiagų darbo grupės posėdyje (2) ir 2011 m. atnaujinta EBPO ekspertų grupės.
                     Nors ši bandymų strategija nėra sudėtinė B.5 bandymo metodo dalis, ji yra rekomenduojamas akių dirginimo ar ėsdinimo savybių nustatymo būdas. Šis būdas atitinka geriausią praktiką ir yra akių dirginimo ar ėsdinimo in vivo bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos in vivo bandymų rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reikėtų atkreipti dėmesį prieš pradedant tokį bandymą. Nuosekliųjų bandymų strategijoje siūlomas duomenų įrodomosios vertės analizės būdas, kuris leistų įvertinti turimus duomenis apie bandomųjų cheminių medžiagų akių dirginimo ar ėsdinimo savybes, kad būtų galima nuosekliai gauti reikiamų duomenų apie chemines medžiagas, kurias reikia papildomai ištirti arba kurios nebuvo tirtos. Taikant strategiją iš pradžių atliekami patvirtinti ir priimti in vitro ar ex vivo bandymai ir tada TM B.4 tyrimai specifinėmis aplinkybėmis (3) (4).
                     
                        Nuosekliųjų bandymų strategijos aprašymas
                     
                     Siekiant nustatyti in vivo akių bandymų reikalingumą, prieš atliekant bandymus, kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), reikėtų įvertinti visą turimą informaciją. Nors reikšmingos informacijos galima būtų gauti vertinant atskirus parametrus (pvz., ribines pH vertes), turėtų būti nagrinėjama visa turima informacija. Priimant įrodomosios vertės analizės sprendimą, turėtų būti įvertinti visi atitinkami duomenys apie konkrečios cheminės medžiagos ir jos struktūrinių analogų poveikį, ir turėtų būti pateiktas sprendimo priėmimo pagrindimas. Didžiausias dėmesys turėtų būti kreipiamas į turimus duomenis apie cheminę medžiagą, gautus tiriant žmones ir gyvūnus, o vėliau tirti in vitro arba ex vivo bandymų rezultatus. Ėsdinančiųjų medžiagų in vivo tyrimų reikėtų kiek įmanoma vengti. Toliau pateikiami bandymų strategijos veiksniai.
                     
                                  
                              
                              
                                 Turimų duomenų, gautų tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenų, gautų taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, įvertinimas (1 pakopa).
                                 Iš pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profesinių susirgimų tyrimai ir bylų ataskaitos, ir (arba) bandymų su gyvūnais atliekant akių tyrimus duomenys, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, nes jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu akims. Toliau reikėtų įvertinti turimus odos ėsdinimo ar dirginimo duomenis, gautus atliekant tyrimus su žmonėmis ir (arba) gyvūnais, ir (arba) in vitro tyrimų duomenis, gautus taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus. Cheminės medžiagos, kurios yra žinomos kaip ėsdinančios arba stipriai dirginančios akis, neturėtų būti lašinamos į gyvūnų akis, be to, nereikėtų lašinti medžiagų, kurios ėsdina arba stipriai dirgina odą; tokios cheminės medžiagos taip pat turėtų būti laikomos ėsdinančiomis ir (arba) dirginančiomis akis. Cheminės medžiagos, apie kurias iš ankstesnių akių tyrimų turima pakankamai duomenų, kad jos nėra ėsdinančios arba dirginančios, irgi neturėtų būti bandomos atliekant in vivo akių tyrimus.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Struktūros ir aktyvumo ryšių (SAR) analizė (2 pakopa).
                                 
                                 Reikėtų atsižvelgti į giminingą struktūrą turinčių cheminių medžiagų bandymo rezultatus, jei tokių yra. Kai tiriant žmones ir (arba) gyvūnus gautų duomenų apie giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius pakanka norint įrodyti jų gebą ėsdinti ar dirginti akis, galima daryti prielaidą, kad bandomosios cheminės medžiagos atsakas bus toks pats. Tokiais atvejais cheminės medžiagos galbūt nebūtina bandyti. Neigiami duomenys, gauti tiriant giminingos struktūros medžiagas arba tokių medžiagų mišinius, nėra pakankamas įrodymas, kad cheminė medžiaga nėra ėsdinanti ar dirginanti pagal nuosekliųjų bandymų strategiją. Gebą ėsdinti ir dirginti odą bei akis reikėtų nustatyti taikant patvirtintus ir priimtus SAR metodus.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Fizikinės cheminės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa).
                                 
                                 Cheminės medžiagos, kurių pH vertės yra ribinės, pvz., ≤ 2,0 ar ≥ 11,5, gali turėti stiprų vietinį poveikį. Jei ribinė pH vertė yra pagrindinė savybė, pagal kurią cheminė medžiaga identifikuojama kaip akis ėsdinanti ar dirginanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsargą (buferinę talpą) (5)(6)(7). Jei buferinė talpa leidžia manyti, kad cheminė medžiaga gali nebūti akis ėsdinanti (t. y. ribinės pH vertės cheminės medžiagos su maža rūgšties ar šarmo atsarga), reikėtų atlikti papildomus bandymus šiai prielaidai pagrįsti, pageidautina, taikant patvirtintą ir priimtą in vitro ar ex vivo bandymą (žr. 10 pastraipą).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kitos turimos informacijos nagrinėjimas (4 pakopa).
                                 
                                 Šioje stadijoje įvertinama visa turima informacija apie sisteminį toksiškumą per odą. Taip pat reikėtų atsižvelgti į ūmų bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą per odą. Jei įrodyta, kad bandomoji cheminė medžiaga yra stipriai toksiška per odą, galbūt nebūtina bandyti jos poveikio akims. Nors nebūtinai turi būti ryšys tarp ūmaus toksiškumo per odą ir akių dirginimo ar ėsdinimo, galima daryti prielaidą, kad cheminei medžiagai esant stipriai toksiškai per odą, ji taip pat bus stipriai toksiška jos įlašinus į akis. Į tokius duomenis taip pat reikėtų atsižvelgti tarp 2 ir 3 pakopų.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Odos ėsdinimo chemine medžiaga vertinimas, jei to taip pat reikia reglamentavimo tikslais (5 pakopa).
                                 
                                 Odos ėsdinimo ir stipraus dirginimo potencialą iš pradžių reikėtų įvertinti taikant B.4 metodą (4) ir pridedamą priedėlį (8), įskaitant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus odos ėsdinimo in vitro bandymo metodus (9) (10) (11). Jei įrodoma, kad cheminė medžiaga yra odą ėsdinanti ar stipriai dirginanti, ją taip pat galima laikyti akis ėsdinančia arba stipriai dirginančia medžiaga. Todėl tolesnių bandymų neprireiktų. Jei cheminė medžiaga nėra ėsdinanti arba stipriai dirginanti odą, reikėtų atlikti in vitro ar ex vivo akių bandymą.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    
                                       In vitro
                                    
                                    ar
                                    
                                       ex vivo
                                    
                                    bandymų rezultatai (6 pakopa).
                                 
                                 Jei atliekant patvirtintą ir tarptautiniu mastu priimtą in vitro ar ex vivo bandymą (12)(13), specialiai skirtą akių ėsdinimui ar dirginimui įvertinti, buvo įrodytos cheminių medžiagų ėsdinamosios arba stipriai dirginančios savybės, jų nereikia bandyti su gyvūnais. Galima daryti prielaidą, kad tokios cheminės medžiagos turės panašų stiprų poveikį in vivo. Jei patvirtintų ir priimtų in vitro ar ex vivo bandymų nėra, 5 ir 6 pakopas reikėtų praleisti ir iš karto pereiti prie 7 pakopos.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymas su triušiais
                                    
                                       in vivo
                                    
                                    (7 ir 8 pakopos).
                                 
                                 
                                    In vivo akių bandymą reikėtų pradėti atliekant pradinį bandymą su vienu gyvūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad cheminė medžiaga yra stipriai dirginanti ar ėsdinanti akis, toliau bandyti nereikėtų. Jei atliekant šį bandymą ėsdinamasis ar stiprus dirginamasis poveikis nestebimas, atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant du papildomus gyvūnus. Atsižvelgiant į patvirtinamojo bandymo rezultatus, gali prireikti papildomų bandymų (žr. B.5 bandymų metodą).
                              
                           
                        AKIŲ DIRGINIMO AR ĖSDINIMO BANDYMO IR ĮVERTINIMO STRATEGIJA
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Veiksmas
                                 
                              
                              
                                 
                                    Rezultatas
                                 
                              
                              
                                 
                                    Išvada
                                 
                              
                           
                                 
                                    1
                                 
                              
                              
                                 Yra duomenys, gauti tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, kurie rodo poveikį akims
                              
                              
                                 Sunkus akių pažeidimas
                              
                              
                                 Apikalinė vertinamoji baigtis; laikyti ėsdinančia akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 Dirgina akis
                              
                              
                                 Apikalinė vertinamoji baigtis; laikyti dirginančia akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 Akių neėsdina ir nedirgina
                              
                              
                                 Apikalinė vertinamoji baigtis; laikoma, kad akių neėsdina ir nedirgina. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 Yra duomenys, gauti tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, kurie rodo ėsdinantį poveikį odai
                              
                              
                                 Ėsdina odą
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 Yra duomenys, gauti tiriant žmones ir (arba) gyvūnus, ir (arba) in vitro duomenys, gauti taikant patvirtintus ir tarptautiniu mastu priimtus metodus, kurie rodo stiprų dirginantį poveikį odai
                              
                              
                                 Stipriai dirgina odą
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad dirgina akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Informacijos nėra arba turima informacija neįtikinanti
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2
                                 
                              
                              
                                 Įvertinami SAR dėl akių ėsdinimo ar dirginimo
                              
                              
                                 Prognozuojamas stiprus akių pažeidimas
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 Numanomas akių dirginimas
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad dirgina akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 Atsižvelgiama į SAR dėl odos ėsdinimo
                              
                              
                                 Numanomas odos ėsdinimas
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Neįmanoma pateikti prognozių arba jos neįtikinančios ar neigiamos
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    3
                                 
                              
                              
                                 Matuojama pH vertė (jei tinka, buferinė talpa)
                              
                              
                                 pH ≤ 2 ar ≥ 11,5 (ir didelė buferinė talpa, jei tinka)
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad ėsdina akis. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2 < pH < 11,5 arba pH ≤ 2,0 ar ≥ 11,5 turint mažą buferinę talpą ar jos neturint, jei tinka
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    4
                                 
                              
                              
                                 Atsižvelgiama į turimus sisteminio toksiškumo, veikiant per odą, duomenis
                              
                              
                                 Labai toksiška, esant koncentracijai, kuri būtų bandant akyje.
                              
                              
                                 Cheminė medžiaga būtų per daug toksiška, kad būtų galima bandyti. Bandyti nereikia.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Tokios informacijos nėra arba cheminė medžiaga nėra labai toksiška
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    5
                                 
                              
                              
                                 Bandant įvertinama odos ėsdinimo geba pagal šio priedo B.4 skyriaus bandymų strategiją, jei to taip pat reikia reglamentavimo tikslais
                              
                              
                                 Ėsdina arba stipriai dirgina
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad dirgina akis. Daugiau bandyti nereikia
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Cheminė medžiaga odos neėsdina arba stipriai nedirgina
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    6
                                 
                              
                              
                                 Atliekamas (-i) patvirtintas (-i) ir priimtas (-i) in vitro ar ex vivo akių bandymas (-ai)
                              
                              
                                 Ėsdina ar stipriai dirgina
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad ėsdina arba stipriai dirgina akis, jei atliekamą bandymą galima taikyti ėsdinančioms ar stipriai dirginančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti, o cheminė medžiaga patenka į bandymo taikymo sritį. Daugiau bandyti nereikia
                              
                           
                                 Dirgina
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad dirgina akis, jei atliekamą (-us) bandymą (-us) galima taikyti ėsdinančioms, stipriai dirginančioms ir dirginančioms medžiagoms tinkamai identifikuoti, o cheminė medžiaga patenka į bandymo (-ų) taikymo sritį. Daugiau bandyti nereikia
                              
                           
                                 Nedirgina
                              
                              
                                 Daroma prielaida, kad nedirgina akių, jei atliekamą (-us) bandymą (-us) galima taikyti nedirginančioms cheminėms medžiagoms tinkamai identifikuoti, tinkamai atskirti nuo akis dirginančių, stipriai dirginančių ar ėsdinančių cheminių medžiagų, o cheminė medžiaga patenka į bandymo taikymo sritį. Daugiau bandyti nereikia
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Patvirtinto (-ų) ir priimto (-ų) in vitro ar ex vivo akių bandymo (-ų) negalima taikyti išvadai padaryti
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    7
                                 
                              
                              
                                 Atliekamas pradinis in vivo triušio akių bandymas, naudojant vieną gyvūną
                              
                              
                                 Sunkus akių pažeidimas
                              
                              
                                 Laikoma, kad ėsdina akis. Daugiau bandyti nereikia
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Nėra stipraus pažeidimo arba jokio atsako
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    8
                                 
                              
                              
                                 Atliekamas patvirtinamasis bandymas, naudojant vieną arba du papildomus gyvūnus
                              
                              
                                 Ėsdina ar dirgina
                              
                              
                                 Laikoma, kad ėsdina ar dirgina akis. Daugiau bandyti nereikia.
                              
                           
                                 Neėsdina ar nedirgina
                              
                              
                                 Laikoma, kad akių neėsdina ir nedirgina. Daugiau bandyti nereikia
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Šio priedo B.4 skyrius Ūmus toksiškumas. Odos dirginimas ar ėsdinimas.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483 – 524.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Šio priedo B.4 skyriaus priedėlis. Nuosekliųjų bandymų strategija odos dirginimui ir ėsdinimui nustatyti.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Šio priedo B.40 skyrius. Odos suardymas in vitro. Odos sluoksnio elektrinės varžos (OSEV) bandymas.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Šio priedo B.40bis skyrius. Odos ėsdinimas in vitro. Žmogaus odos modelio bandymas.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Šio priedo B.47 skyrius. Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2009b), Šio priedo B.48 skyrius. Atskirtų viščiukų akių bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo.“
                              
                           
               
                     3)
                  
                  
                     B dalies B.10 skyrius pakeičiamas taip:
                     „B.10   Žinduolių chromosomų aberacijų in vitro bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 473 (2016). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).
                     Chromosomų aberacijų tyrimo in vitro tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijas (2) (3) (4). Struktūrinės aberacijos gali būti 2 tipų: chromosominės ar chromatidinės. Atliekant chromosomų aberacijų tyrimus in vitro galėtų atsirasti poliploidija (įskaitant endoreduplikaciją). Nors aneugeninės cheminės medžiagos gali sukelti poliploidiją, pati poliploidija nerodo aneugeninio potencialo ir gali tiesiog rodyti ląstelių ciklo sutrikimą arba citotoksiškumą (5). Šis bandymas nenumatytas aneuploidijai matuoti. Aneuploidijai aptikti būtų galima rekomenduoti in vitro mikrobranduolių bandymą (6).
                     Tiriant chromosomų aberacijas in vitro, galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų arba žmogaus ar graužikų kilmės pirminių ląstelių kultūras. Naudojamas ląsteles reikėtų pasirinkti pagal jų gebėjimą augti kultūroje, kariotipo stabilumą (įskaitant chromosomų skaičių) ir chromosomų aberacijų spontaninį dažnumą. Atsižvelgiant į šiuo metu turimus duomenis, neįmanoma pateikti patikimų rekomendacijų, bet svarbu patarti, kad, įvertinant cheminius pavojus, reikėtų atsižvelgti į bandymams pasirinktų ląstelių p53 būseną, genetinį (kariotipo) stabilumą, DNR atkūrimo gebą ir kilmę (graužikų, palyginti su žmogaus). Todėl šio bandymo metodo naudotojai raginami atsižvelgti į šių ir kitų ląstelių charakteristikų įtaką ląstelių linijos savybėms aptinkant chromosomų aberacijų atsiradimą, nes šios srities žinių visą laiką daugėja.
                     Vartojamų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                     Bandymus atliekant in vitro paprastai reikia naudoti egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį, išskyrus atvejus, kai ląstelės yra metaboliškai pajėgios bandomųjų cheminių medžiagų atžvilgiu. Egzogeninė metabolinio aktyvinimo sistema nevisiškai atkartoja in vivo sąlygas. Reikėtų stengtis išvengti sąlygų, kurioms esant būtų gauti dirbtinai teigiami rezultatai, t. y. chromosomos būtų pažeistos ne dėl tiesioginės sąveikos tarp bandomųjų cheminių medžiagų ir chromosomų; tokias sąlygas sudaro pH ar osmolialumo pokyčiai (8) (9) (10), sąveika su terpės komponentais (11) (12) ar per didelis citotoksiškumo lygis (13) (14) (15) (16).
                     Šis bandymas naudojamas aptikti chromosomų aberacijas, kurios gali atsirasti dėl klastogeninio poveikio reiškinių. Chromosomų aberacijos atsiradimo analizė turėtų būti atliekama naudojant metafazės ląsteles. Todėl svarbu, kad įvyktų apdorotos ir neapdorotos kultūrų ląstelių mitozė. Pramoninėms nanomedžiagoms gali prireikti tam tikro šio bandymų metodo pakeitimų, kurie šiame bandymų metode neaprašyti.
                     Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     Žmogaus arba kitų žinduolių kilmės ląstelių kultūros veikiamos bandomąja chemine medžiaga naudojant egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį ar jo nenaudojant, jei naudojamos reikiamą metabolinę gebą turinčios ląstelės (žr. 13 pastraipą). Tam tikrais iš anksto nustatytais tarpais nuo ląstelių kultūrų veikimo bandomąja chemine medžiaga pradžios ląstelės apdorojamos metafazę stabdančia chemine medžiaga (pvz., kolcemidu arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafazės ląstelės tiriamos mikroskopu, kad būtų nustatytos chromatidinės ir chromosominės aberacijos.
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Parengiamieji darbai
                     
                     
                        Ląstelės
                     
                     Galima naudoti įvairias ląstelių linijas (pvz., kiniškojo žiurkėno kiaušidžių (CHO), kiniškojo žiurkėno plaučių V79, kiniškojo žiurkėno plaučių (CHL)/IU, TK6 ląsteles) arba pirmines ląstelių kultūras, įskaitant žmogaus ar kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitus (7). Naudojamų ląstelių linijų pasirinkimą reikėtų moksliškai pagrįsti. Naudojant pirmines ląsteles, dėl gyvūnų gerovės priežasčių reikėtų atsižvelgti į galimybę naudoti, jei įmanoma, žmogiškos kilmės pirmines ląsteles, ir ėminius imti atsižvelgiant į žmonių etikos principus ir taisykles. Žmogaus periferinio kraujo limfocitus reikėtų gauti iš jaunų (maždaug 18–35 metų amžiaus), nerūkančių žmonių, kurie nesirgtų ar kurie nebūtų neseniai paveikti genotoksiniais agentais (pvz., cheminėmis medžiagomis, jonizuojančiąja spinduliuote) tokiu mastu, kad tai padidintų chromosomų aberacijų foninį dažnumą. Tai užtikrintų, kad chromosomų aberacijų foninis dažnumas būtų mažas ir pastovus. Chromosomų aberacijų dažnumo atskaitos vertė didėja senstant ir ši tendencija labiau pasireiškia moterims nei vyrams (17) (18). Jei naudojamos ląstelės paimamos daugiau kaip iš vieno donoro, turėtų būti nurodytas donorų skaičius. Būtina įrodyti, kad ląstelės dalijosi nuo ląstelių ėminio apdorojimo bandomąja chemine medžiaga pradžios. Ląstelių kultūros laikomos eksponentinio ląstelių augimo fazėje (ląstelių linijos) arba stimuliuojamos dalytis (pirminės limfocitų kultūros), kad ląstelės būtų veikiamos skirtingose ląstelės ciklo stadijose, nes ląstelių stadijų jautris bandomosioms cheminėms medžiagoms gali būti nežinomas. Pirminės ląstelės, kurias reikia stimuliuoti mitogeniniais agentais, kad jos pradėtų dalytis, paprastai daugiau nesinchronizuojamos jas veikiant bandomąja chemine medžiaga (pvz., žmogaus limfocitai po 48 h mitogeninio stimuliavimo). Naudoti sinchronizuotas ląsteles apdorojimo metu nerekomenduojama, bet gali būti priimtina, jei būtų pagrįsta.
                     
                        Terpės ir kultūros sąlygos
                     
                     Prižiūrimoms kultūroms reikėtų naudoti reikiamą kultūros terpę ir inkubavimo sąlygas (kultūros indus, drėkinamąją 5 % CO2 atmosferą, jei tinka, inkubavimo temperatūrą – 37 °C). Ląstelių linijos turėtų būti reguliariai tikrinamos, ar nesikeičia modalinis chromosomų skaičius ir nėra mikoplazmos užkrato (7) (19), o užkrėstos arba pakitusio modalinio chromosomų skaičiaus ląstelės neturėtų būti naudojamos. Turėtų būti nustatyta bandymo laboratorijoje naudojamų ląstelių linijų ar pirminių kultūrų normalaus ląstelių ciklo trukmė ir ji turėtų atitikti paskelbtas ląstelių charakteristikas (20).
                     
                        Kultūrų paruošimas
                     
                     Ląstelių linijos: ląstelės yra dauginamos iš kamieninių kultūrų, sėjamos kultūros terpėje tokiu tankiu, kad ląstelių suspensijos ar monosluoksniai visą laiką iki pat surinkimo momento augtų eksponentiškai (pvz., reikėtų vengti monosluoksniuose augančių ląstelių susiliejimo).
                     Limfocitai: viso kraujo ėminys, apdorotas antikoaguliantu (pvz., heparinu), ar iš to kraujo atskirti limfocitai auginami (pvz., žmogaus limfocitai – 48 h) esant mitogeno (pvz., žmogaus limfocitams – fitohemagliutinino (PHA)), kad ląstelės pradėtų dalytis prieš jas paveikiant bandomąja chemine medžiaga.
                     
                        Metabolinis aktyvinimas
                     
                     Kai naudojamos nepakankamos endogeninės metabolinės gebos ląstelės, reikėtų naudoti egzogenines metabolizavimo sistemas. Jei nebūtų pagrįsta kita sistema, dažniausiai kaip numatytoji rekomenduojama sistema yra kofaktoriumi papildyta pomitochondrinė frakcija (S9), ruošiama iš graužikų (paprastai žiurkių) kepenų, apdorotų fermentų aktyvumą skatinančiais agentais, pvz,. Aroclor 1254 (21) (22) (23) ar fenobarbitalio ir β-naftoflavono derinys (24) (25) (26) (27) (28) (29). Pastarasis derinys neprieštarauja Stokholmo konvencijai dėl patvariųjų organinių teršalų (30) ir pasirodė esąs toks pat veiksmingas kaip Aroclor 1254 mišrių funkcijų oksidazėms skatinti (24) (25) (26) (28). S9 frakcija paprastai naudojama nuo 1 % iki 2 % (tūrio) koncentracijos, bet galutinio bandymo terpėje gali būti padidinta iki 10 % (tūrio). Apdorojant reikėtų vengti naudoti produktus, kurie mažina mitozinį indeksą, ypač su kalciu kompleksus sudarančius produktus (31). Naudojamos egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos ar metabolizmo skatinimo priemonės tipo ir koncentracijos pasirinkimui įtakos gali turėti bandomų cheminių medžiagų klasė.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas
                     
                     Prieš apdorojant ląsteles, kietąsias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ir, jei reikia, praskiesti (žr. 23 pastraipą). Skystąsias chemines medžiagas galima dėti tiesiogiai į bandymo sistemą ir (arba) praskiesti prieš apdorojant bandymo sistemą. Dujos ar lakiosios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos atitinkamai pakeitus standartinius protokolus, pvz., apdorojimas sandariuose kultūros induose (32) (33) (34). Bandomųjų cheminių medžiagų preparatus reikėtų ruošti prieš pat apdorojimą, išskyrus atvejus, kai stabilumo duomenys rodo galimybę laikyti.
                     
                        Bandymo sąlygos
                     
                     
                        Tirpikliai
                     
                     Tirpiklį reikėtų pasirinkti taip, kad būtų optimizuotas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas, bet nebūtų daroma neigiama įtaka tyrimo eigai, pvz., kistų ląstelių augimas, būtų paveiktas bandomosios cheminės medžiagos vientisumas, vyktų reakcija su kultūros indais, būtų pakenkta metabolinio aktyvinimo sistemai. Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti vandeninį tirpiklį (ar kultūros terpę). Gerai ištirti tirpikliai yra, pvz., vanduo ar dimetilsulfoksidas. Paprastai organinio tirpiklio koncentracija galutinio apdorojimo terpėje neturėtų būti didesnė kaip 1 % (tūrio), o vandeninių tirpiklių (natrio chlorido tirpalo ar vandens) – 10 % (tūrio). Jei naudojami tinkamai neištirti tirpikliai (pvz., etanolis ar acetonas), jų naudojimas turėtų būti pagrįstas duomenimis, rodančiais, kad tirpiklis yra suderinamas su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis bei bandymo sistema ir kad naudojama koncentracija nesukelia genetinio toksiškumo. Jei tokių patvirtinančių duomenų nebūtų, svarbu įtraukti neapdorotus kontrolinius ėminius (žr. 1 priedėlį), kurie įrodytų, kad pasirinktas tirpiklis nesukelia žalingo arba klastogeninio poveikio.
                     
                        Ląstelių proliferacijos bei citotoksiškumo matavimas ir apdorojimo koncentracijos verčių parinkimas
                     
                     Nustatant didžiausią bandymui naudojamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją reikėtų vengti koncentracijos, galinčios sukelti dirbtinį teigiamą atsaką, pvz., kuri sukeltų per didelį citotoksiškumą (žr. 22 pastraipą), nuosėdų kultūros terpėje (žr. 23 pastraipą) ar žymius pH arba osmolialumo pokyčius (žr. 5 pastraipą). Jei bandomosios cheminės medžiagos pridėjimo metu žymiai pakinta terpės pH vertė, ją būtų galima reguliuoti buferuojant galutinio apdorojimo terpę, kad būtų išvengta dirbtinių teigiamų rezultatų ir būtų užtikrintos tinkamos kultūros sąlygos.
                     Ląstelių proliferacija matuojama siekiant įsitikinti, ar bandymo metu pakankamas apdorotų ląstelių skaičius pasiekė mitozę ir ar apdorojama esant reikiamam citotoksiškumo lygiui (žr. 18 ir 22 pastraipas). Citotoksiškumą reikėtų nustatyti pagrindinio bandymo metu pagal atitinkamus ląstelių žūties ir augimo rodiklius, esant ir nesant metaboliniam aktyvinimui. Nors citotoksiškumo įvertinimas atliekant pradinį bandymą gali būti naudingas pagrindinio bandymo koncentracijos vertėms geriau apibrėžti, pradinis bandymas nėra privalomas. Jei jis būtų atliekamas, jis neturėtų pakeisti citotoksiškumo matavimo atliekant pagrindinį bandymą.
                     Santykinis populiacijos padvigubėjimas (RPD) ar santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (RICC) yra tinkami metodai citotoksiškumui įvertinti atliekant citogenetinius bandymus (13) (15) (35) (36) (55) (formules žr. 2priedėlyje). Jei apdorojimas yra ilgalaikis, o ėminių ėmimo laikas nuo apdorojimo pradžios yra daugiau kaip 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (t. y. iš viso yra daugiau kaip 3 kartus ilgesnis nei ląstelių ciklo trukmė), citotoksiškumo įvertis taikant RPD galėtų būti per mažas (37). Šiomis aplinkybėmis geresnis matas galėtų būti RICC arba naudingas įvertis galėtų būti ir RPD, citotoksiškumą įvertinant praėjus laikui, kuris būtų 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.
                     Jei kaip pirminė kultūra naudojami limfocitai, kurių citotoksinio ar citostatinio poveikio matas yra mitozinis indeksas (MI), jam įtaką daro matavimo laikas po apdorojimo, naudojamas mitogenas ir galimas ląstelių ciklo nutrūkimas. Tačiau MI yra priimtinas, nes kiti citotoksiškumo matavimai gali būti sudėtingi ir praktiškai neįmanomi bei gali netikti stimuliuojant PHA augančiai limfocitų tikslinei populiacijai.
                     Nors rekomenduojami ląstelių linijų citotoksiškumo parametrai yra RICC ir RPD, o pirminės limfocitų kultūros – MI, kiti rodikliai (pvz., ląstelių vientisumas, apoptozė, nekrozė, ląstelių ciklas) galėtų suteikti naudingos papildomos informacijos.
                     Reikėtų įvertinti ne mažiau kaip tris bandymo koncentracijos vertes (neįskaitant tirpiklio ir teigiamų kontrolinių ėminių), kurios atitinka priimtinumo kriterijus (reikiamas citotoksiškumas, ląstelių skaičius ir kt.). Neatsižvelgiant į ląstelių tipą (ląstelių linijos ar pirminės limfocitų kultūros), galima naudoti kiekvienos bandymo koncentracijos kartotines ar pavienes apdorotas kultūras. Nors patariama naudoti kartotines kultūras, pavienės kultūros taip pat priimtinos, jei vertinamas vienodas suminis pavienės ar kartotinės kultūros ląstelių skaičius. Naudoti pavienę kultūrą ypač tinka, kai vertinamos daugiau kaip 3 koncentracijos vertės (žr. 31 pastraipą). Nepriklausomoms kartotinėms kultūroms gauti tam tikros koncentracijos rezultatai gali būti sutelkti bendrai duomenų analizei (38). Jei bandomoji cheminė medžiaga rodo mažą citotoksiškumą arba jo visai nėra, paprastai tiktų maždaug nuo 2 iki 3 kartų besiskiriančios koncentracijos intervalai. Jei citotoksiškumas nustatomas, pasirinktos koncentracijos vertės turėtų aprėpti intervalą nuo koncentracijos, kuriai esant citotoksiškumas pasireiškia, kaip aprašyta 22 pastraipoje, įtraukiant koncentracijos vertes, kurioms esant gaunamas vidutinis citotoksiškumas ar jo visai nėra. Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijos atsako kreivės kyla staigiai, todėl norint gauti mažo arba vidutinio citotoksiškumo duomenis arba išsamiai ištirti dozės ir atsako santykį, būtina naudoti arčiau išdėstytas ir (arba) daugiau kaip tris koncentracijos vertes (pavienių ar kartotinių kultūrų), ypač tomis aplinkybėmis, kai reikia atlikti kartotinį bandymą (žr. 47 pastraipą).
                     Jei maksimali koncentracija pagrįsta citotoksiškumu, didžiausiai koncentracijai reikėtų pasiekti 55 ± 5 % citotoksiškumą, taikant rekomenduotus citotoksiškumo parametrus (t. y. ląstelių linijų RICC bei RPD sumažėjimą ir pirminių limfocitų kultūrų MI sumažėjimą iki 45 ± 5 % vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio). Reikėtų atsargiai aiškinti teigiamus rezultatus, kurie būtų gauti tik viršutiniam šio 55 ± 5 % citotoksiškumo intervalo galui (13).
                     Jei mažai tirpios bandomosios cheminės medžiagos nėra citotoksiškos, kai koncentracija yra mažesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, paveikimo bandomąja chemine medžiaga pabaigoje, esant didžiausiai analizuojamai koncentracijai, turėtų atsirasti drumstumas arba nuosėdos, matomos plika akimi arba per inversinį mikroskopą. Netgi jei citotoksiškumas pasireiškia, kai koncentracija yra didesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, patartina bandyti tik esant vienai drumstumą ar matomas nuosėdas sukeliančiai koncentracijai, nes nuosėdos gali daryti dirbtinį poveikį. Esant koncentracijai, kurioje susidaro nuosėdos, reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad nuosėdos netrukdytų atlikti bandymą (pvz., dažymą ar įvertinimą). Gali padėti tirpumo nustatymas kultūros terpėje prieš atliekant bandymą.
                     Jei nuosėdų ar ribinio citotoksiškumo nestebima, didžiausia bandymo koncentracija turėtų atitikti 10 mmol/l, 2 mg/ml ar 2 μl/ml, pasirenkant mažiausią (39) (40) (41). Jei bandomoji cheminė medžiaga yra neapibrėžtos sudėties, pvz., nežinomos ar kintamos sudėties medžiaga, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinė medžiaga (UVCB) (42), iš aplinkos ekstrahuojamas ėminys ir kt., nesant pakankamam citotoksiškumui, gali prireikti didesnės didžiausios koncentracijos (pvz., 5 mg/ml), kad būtų didesnė kiekvieno iš komponentų koncentracija. Reikėtų pažymėti, kad žmonėms skirtiems vaistiniams preparatams šie reikalavimai gali būti skirtingi (43).
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     Kiekvieną kartą surenkant kultūrą, reikėtų įtraukti vienalaikius neigiamus kontrolinius ėminius (žr. 15 pastraipą), sudarytus vien tik iš tirpiklio apdorojimo terpėje ir apdorotus taip pat, kaip apdorojamos kultūros.
                     Vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai yra būtini siekiant įrodyti laboratorijos gebėjimą naudojamo bandymų protokolo sąlygomis identifikuoti klastogenus ir egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą, jei tinka. Teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai pateikiami toliau 1 lentelėje. Galima naudoti alternatyvias teigiamas kontrolines chemines medžiagas, jei tai būtų pagrįsta. Kadangi žinduolių ląstelių genetinio toksiškumo in vitro bandymai yra pakankamai standartizuoti, teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas gali apsiriboti klastogenais, kuriems būtinas metabolinis aktyvinimas. Jei jis atliekamas vienu metu su neaktyvinto ėminio bandymu naudojant vienodą apdorojimo trukmę, šis vienas teigiamos kontrolės atsakas įrodys metabolinio aktyvinimo sistemos aktyvumą ir bandymo sistemos jautrį. Tačiau ilgalaikiam apdorojimui (be S9) reikėtų turėti savo teigiamą kontrolinį ėminį, nes apdorojimo trukmė skirsis nuo metabolinį aktyvinimą naudojančio bandymo trukmės. Kiekvienas teigiamas kontrolinis ėminys turėtų būti naudojamas vienos arba kelių koncentracijos verčių, kurioms esant būtų galima tikėtis gauti atkuriamą ir aptinkamą didesnį nei fonas atsaką, kad būtų galima įrodyti bandymo sistemos jautrį (t. y. poveikis yra aiškus, bet tyrėjui ne iš karto atskleidžiama užkoduotų objektinių stiklelių tapatybė), ir atsako neturėtų sutrikdyti citotoksiškumas, kuris viršytų bandymo metodui nustatytas ribas.
                     
                        1 lentelė.
                     
                     
                        Etaloninės cheminės medžiagos, rekomenduojamos laboratorijos kvalifikacijai vertinti ir teigiamiems kontroliniams ėminiams pasirinkti.
                     
                     
                                 Kategorija
                              
                              
                                 Cheminė medžiaga
                              
                              
                                 CAS Nr.
                              
                           1.   Klastogenai, aktyvūs be metabolinio aktyvinimo
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Metilmetansulfonatas
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Mitomicinas C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-nitrochinolin-N-oksidas
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Citozino arabinozidas
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           2.   Klastogenai, kuriems reikia metabolinio aktyvinimo
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Benz(a)pirenas
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ciklofosfamidas
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           PROCEDŪRA
                     
                        Paveikimas bandomąja chemine medžiaga
                     
                     Proliferuojančios ląstelės veikiamos bandomąja chemine medžiaga esant metabolinio aktyvinimo sistemai arba jos nesant.
                     
                        Kultūrų surinkimo laikas
                     
                     Siekiant atlikti išsamų įvertinimą, kurio prireiktų neigiamam rezultatui patvirtinti, visos šios trys Bandymo sąlygos turėtų būti įgyvendintos, taikant trumpalaikį apdorojimą su metaboliniu aktyvinimu ir be jo bei ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo (žr. 43, 44 ir 45 pastraipas):
                     
                                 —
                              
                              
                                 ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga be metabolinio aktyvinimo 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (18),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga esant metaboliniam aktyvinimui 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (18),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ląstelės turėtų būti nepertraukiamai veikiamos be metabolinio aktyvinimo ir surenkamos praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė. Tam tikras chemines medžiagas (pvz., nukleozidų analogus) galima aptikti lengviau, jei apdorojimo ar surinkimo laikas yra daugiau kaip 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (24).
                              
                           Jei esant kuriai nors vienai iš pirmiau nurodytų bandymo sąlygų gaunamas teigiamas atsakas, gali būti nebūtina tirti kurią nors kitą apdorojimo schemą.
                     
                        Chromosomų paruošimas
                     
                     Paprastai likus 1–3 h iki surinkimo ląstelių kultūros yra veikiamos kolcemidu ar kolchicinu. Kiekviena ląstelių kultūra surenkama ir atskirai apdorojama chromosomoms paruošti. Ruošiant chromosomas ląstelės apdorojamos hipotoniniu tirpalu, fiksuojamos ir dažomos. 3–6 h trukmės apdorojimo pabaigoje monosluoksniuose gali būti mitozinių ląstelių (atpažįstamų iš apvalios formos ir atsiskyrimo nuo paviršiaus). Kadangi šios mitozinės ląstelės lengvai atsiskiria, jos gali būti prarastos šalinant terpę su bandomąja chemine medžiaga. Jei yra įrodymų dėl esminio mitozinių ląstelių skaičiaus padidėjimo palyginti su kontroliniais ėminiais, rodančio galimą ląstelių sulaikymą mitozės etape, ląsteles reikėtų surinkti centrifugavimu ir grąžinti į kultūras, kad surinkimo metu nebūtų prarastos mitozės etapo ląstelės, kurioms kyla chromosomų aberacijos rizika.
                     
                        Analizė
                     
                     Prieš atliekant chromosomų aberacijų mikroskopinę analizę, visi objektiniai stikleliai turėtų būti nepriklausomai užkoduoti, įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių stiklelius. Kadangi fiksavimo metu dalis metafazės ląstelių praranda chromosomas, todėl suskaičiuotos ląstelės turės tam tikrą skaičių centromerų, lygų modaliniam skaičiui ± 2.
                     Ne mažiau kaip 300 gerai matomų metafazių turėtų būti suskaičiuotos kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam ėminiui, norint padaryti išvadą, kad bandomoji cheminė medžiaga yra aiškiai neigiama (žr. 45 pastraipą). 300 ląstelių turėtų būti vienodai paskirstytos tarp kartotinių ėminių, jei naudojami kartotiniai kultūrų ėminiai. Kai vienai koncentracijai naudojama pavienė kultūra (žr. 21 pastraipą), šioje pavienėje kultūroje turėtų būti suskaičiuota ne mažiau kaip 300 gerai matomų metafazių. 300 ląstelių skaičiaus pranašumas – padidėja bandymo statistinė galia, be to, retai būtų stebimos nulinės vertės (manoma, kad jos sudarytų tik 5 %) (44). Skaičiuojamų metafazių skaičių galima sumažinti, kai stebimas didelis ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius ir bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama.
                     Reikėtų skaičiuoti ląsteles su chromosomų struktūrine (-ėmis) aberacija (-omis), įskaitant plyšius ir jų neįskaitant. Trūkiai ir plyšiai apibrėžti 1 priedėlyje pagal (45) (46). Chromatidinė ir chromosominė aberacijos turėtų būti registruojamos atskirai ir klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus). Laboratorijoje taikomos procedūros turėtų užtikrinti, kad chromosomų aberacijų analizę atlieka tinkamai apmokyti skaičiuotojai ir, jei reikia, ją peržiūrėtų ekspertai.
                     Nors tyrimo tikslas yra nustatyti chromosomų struktūrines aberacijas, svarbu registruoti poliploidijos bei endoduplikacijos dažnumą, kai šie įvykiai yra matomi (žr. 2 pastraipą).
                     
                        Laboratorijos kvalifikacija
                     
                     Siekdama įgyti pakankamos bandymo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams tyrimams, laboratorija turėtų būti atlikusi etaloninių teigiamų cheminių medžiagų bandymų seriją, joms veikiant pagal skirtingus mechanizmus ir su įvairiais neigiamais kontroliniais ėminiais (naudojant įvairius tirpiklius ir nešiklius). Šių teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių atsakas turėtų atitikti literatūros duomenis. Tai netaikoma patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 37 pastraipoje.
                     Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų rinkinį (žr. 26 pastraipos 1 lentelę) reikėtų tirti atliekant trumpalaikį ir ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo, taip pat trumpalaikį apdorojimą esant metaboliniam aktyvinimui, kad būtų galima įrodyti kvalifikaciją aptikti klastogenines chemines medžiagas ir nustatyti metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą. Pasirinktų cheminių medžiagų koncentracijos verčių intervalas turėtų būti pasirinktas taip, kad, siekiant įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, būtų gautas atkuriamas ir su koncentracija susijęs padidėjimas palyginti su fonu.
                     
                        Istorinių kontrolinių ėminių duomenys
                     
                     Laboratorija turėtų nustatyti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 istorinių neigiamų kontrolinių ėminių (neapdorotų, tirpiklio) intervalą ir pasiskirstymą.
                              
                           Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas (44) (47). Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę iš pradžių turėtų sudaryti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei tokių palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (48)), kad galėtų nustatyti savo teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje (44). Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (47).
                     Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų suderinamumą su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Esant didesnėms neatitiktims, turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė.
                     Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti pavienės kultūros ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius arba kartotinių kultūrų skaičių suma, kaip aprašyta 21 pastraipoje. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas (44) (47). Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 37 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų pateikimas
                     
                     Turėtų būti gautas ląstelių, turinčių struktūrines chromosomų aberacijas, įvertis procentais. Bandymo ir kontrolinių ėminių kultūrų chromatidinė ir chromosominė aberacijos, klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus), turėtų būti registruojamos atskirai, nurodant jų skaičių ir dažnumą. Plyšiai registruojami ir pateikiami ataskaitoje atskirai, bet neįtraukiami į suminį aberacijų buvimo dažnumą. Ataskaitoje pateikiama poliploidinių ir (arba) endoreduplikuotų ląstelių, kai matomos, procentinė dalis.
                     Turėtų būti registruojami vienalaikiai visų apdorotų, neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių citotoksiškumo duomenys, gauti atliekant pagrindinį (-ius) aberacijos bandymą (-us).
                     Turėtų būti pateikti atskiri kiekvienos kultūros duomenys. Be to, visi duomenys turi būti suvesti į lenteles.
                     
                        Priimtinumo kriterijai
                     
                     Bandymo priimtinumas pagrįstas šiais kriterijais:
                     
                                 —
                              
                              
                                 vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys laikomas tinkamu įtraukti į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę, kaip aprašyta 39 pastraipoje;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai (žr. 26 pastraipą) turėtų sukelti atsakus, kurie yra suderinami su rastais istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 turėtų atitikti ląstelių proliferacijos tirpiklio kontroliniame ėminyje kriterijus (17 ir 18 pastraipos);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bandoma esant visoms trims Bandymo sąlygoms, nebent vienai iš jų gaunami teigiami rezultatai (žr. 28 pastraipą);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analizuojamas pakankamas ląstelių ir koncentracijos verčių skaičius (31 ir 21 pastraipa).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 didžiausios koncentracijos pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 22, 23 ir 24 pastraipose.
                              
                           
                        Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas
                     
                     Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei, esant kuriai nors ištirtai bandymo sąlygai (žr. 28 pastraipą):
                     
                                 a)
                              
                              
                                 bent vienai bandymo koncentracijai gaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 padidėjimas yra susijęs su doze, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 39 pastraipą).
                              
                           Atitinkant visus šiuos kriterijus, laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga gali sukelti šios bandymų sistemos žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijas. Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (49) (50) (51).
                     Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis (žr. 28 pastraipą):
                     
                                 a)
                              
                              
                                 jokiai bandymo koncentracijai negaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 nėra su koncentracija susijusio padidėjimo, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 39 pastraipą).
                              
                           Tada laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga negali sukelti šios bandymų sistemos žinduolių ląstelių kultūros chromosomų aberacijų.
                     Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.
                     Jei atsakas nėra aiškiai neigiamas ar aiškiai teigiamas, kaip apibūdinta pirmiau, arba, siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą, duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus tyrimus. Galėtų būti naudingas papildomų ląstelių skaičiavimas (jei tinka) arba kartotinis bandymas galbūt modifikuotomis bandymo sąlygomis (pvz., tarpai tarp koncentracijos verčių, kitos metabolinio aktyvinimo sąlygos (t. y. S9 koncentracija ar S9 kilmė)).
                     Retais atvejais, kai netgi atlikus papildomus tyrimus, gautų duomenų rinkinio nepakaks padaryti išvadą, ar rezultatai yra teigiami ar neigiami, bus priimtas sprendimas, kad cheminės medžiagos atsakas yra dviprasmis.
                     Poliploidinių ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji cheminė medžiaga gali slopinti mitozinius procesus ir sukelti kiekybines chromosomų aberacijas (52). Ląstelių su endoreduplikuotomis chromosomomis skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomosios cheminės medžiagos gali slopinti ląstelių ciklo eigą (53) (54) (žr. 2 pastraipą). Todėl poliploidinių ląstelių ir ląstelių su endoreduplikuotomis chromosomomis dažnumas turėtų būti registruojamas atskirai.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             šaltinis, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pačios bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje ir stabilumas, jei yra žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pH, osmolialumo ir nuosėdų matavimas kultūros terpėje, į kurią bandomoji cheminė medžiaga buvo pridėta, jei reikia.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vienkomponentė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų identifikavimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminį pavadinimą (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tirpiklis:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             tirpiklio pasirinkimo pagrindimas,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taip pat reikėtų nurodyti tirpiklio galutinėje kultūros terpėje procentinę dalį.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ląstelės
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių tipas ir šaltinis,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudojamo tipo ląstelių kariotipo ypatybės ir tinkamumas,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ar nėra mikoplazmos, jei naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informacija apie ląstelių ciklo trukmę, dvigubėjimo trukmę ar proliferacijos indeksą, jei naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kraujo donorų lytis, amžius ir visa tinkama informacija apie donorą, visas kraujas ar atskirti limfocitai, naudotas mitogenas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių sėjimų skaičius, jei žinomas, kai naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių kultūros priežiūros metodai, jei naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             modalinis chromosomų skaičius, jei naudojamos ląstelių linijos.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             metafazę stabdančios cheminės medžiagos pavadinimas, koncentracija ir ląstelių veikimo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, išreikšta kaip galutinė koncentracija kultūros terpėje (pvz., μg ar mg/ml ar mmol/l kultūros terpės).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentracijos verčių ir kultūrų skaičiaus pasirinkimo pagrindimas, įskaitant, pvz., citotoksiškumo duomenis ir tirpumo apribojimus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             terpių sudėtis, CO2 koncentracija, jei tinka, drėgmės lygis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tirpiklio ir bandomosios cheminės medžiagos, pridėtos į kultūros terpę, koncentracija (ir (arba) tūris);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubavimo temperatūra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubavimo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             apdorojimo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             surinkimo laikas po apdorojimo,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių tankis sėjimo metu, jei tinka,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metabolinio aktyvinimo sistemos tipas ir sudėtis (S9 šaltinis, S9 mišinio paruošimo metodas, S9 mišinio ir S9 galutinėje kultūros terpėje koncentracija ar tūris, S9 kokybės kontrolės ėminiai);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teigiamos ir neigiamos kontrolinės cheminės medžiagos, galutinės koncentracijos vertės esant kiekvienai apdorojimo sąlygai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             objektinių stiklelių ruošimo metodai ir taikytas dažymo būdas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tyrimų priimtinumo kriterijai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberacijų įvertinimo kriterijai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ištirtų metafazių skaičius,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             citotoksiškumo matavimo metodai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visa papildoma informacija, susijusi su citotoksiškumu ir taikomu metodu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tyrimo vertinimo kaip teigiamo, neigiamo ar dviprasmio kriterijai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pH, osmolialumo ir nusėdimo nustatymo metodai.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienos kultūros apdototų ląstelių skaičius ir surinktų ląstelių skaičius, kai naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             citotoksišumo matavimai, pvz., RPD, RICC, MI, kiti stebėjimai, jei yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informacija apie ląstelių ciklo trukmę, dvigubėjimo trukmę arba proliferacijos indeksą, jei naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nusėdimo požymiai ir nustatymo laikas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberacijų, įskaitant plyšius, apibūdinimas,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             įvertintų ląstelių skaičius, ląstelių su chromosomų aberacijomis skaičius ir chromosomų aberacijų tipas, pateikiamas atskirai kiekvienai apdorotai ir kontrolinei kultūrai, įtraukiant ir neįtraukiant plyšių;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ploidiškumo pokyčiai (atskirai nurodomos poliploidinės ląstelės ir ląstelės su endoreduplikuotomis chromosomomis), jei matomi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentracijos ir atsako priklausomybė, jei įmanoma,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vienalaikio neigiamo (tirpiklio) ir teigiamo kontrolinio ėminio duomenys (koncentracijos vertės ir tirpikliai);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             istorinių neigiamų (tirpiklio) ir teigiamų kontrolinių ėminių duomenys, intervalai, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai bei skirstinio 95 % kontrolinės ribos, taip pat duomenų skaičius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             statistinės analizės duomenys, p vertės, jei yra.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvados.
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens“, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), „The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture“ in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Muehlbauer, P.A. et al. (2008), Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318-327.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Šio priedo B.49 skyrius. In Vitro žinduolių ląstelės mikrobranduolio bandymas.
                                 
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, pp. 147-204.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439-452.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191-201.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, pp. 1–256.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305-309.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95-106.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261-287.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, pp.163-167.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347-363.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83-90.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277-290.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175-177.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241-261.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 UNEP (2001), Stokholmo konvencija dėl patvariųjų organinių teršalų, Jungtinių Tautų aplinkos programa (UNEP). Pateikiama adresu http://www.pops.int/.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77-83.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, pp. 86-87.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. Available upon request.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, pp. 32-56.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Disponible à l'adresse: https://federalregister.gov/a/2012-13774.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS)“, Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1990), „Metaphase chromosome aberration assays in vitro“, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29-46.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403-413.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362-1364
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139-149.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Aneuploidija
                           – vienos arba daugiau kaip vienos chromosomų, bet ne viso (-ų) jų rinkinio (-ų) (poliploidija) nukrypimas nuo normalaus diploidinio (arba haploidinio) chromosomų skaičiaus.
                        
                           
                              Apoptozė
                           – užprogramuota ląstelių žūtis, kuriai būdinga serija etapų, per kuriuos ląstelės suyra į membrana apsuptas daleles, kurios vėliau pašalinamos fagocitoze arba numetimo būdu.
                        
                           
                              Ląstelių proliferacija
                           – ląstelių skaičiaus didėjimas dėl mitozinio jų dalijimosi.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Chromatidžių trūkis
                           – atskiros chromatidės nevientisumas, kai yra aiškus vienos iš chromatidžių nesutapimas.
                        
                           
                              Chromatidinis plyšys
                           – nedažoma (achromatinė) vienos chromatidės sritis, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.
                        
                           
                              Chromatidinė aberacija
                           – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip vienos iš chromatidžių trūkis arba kaip chromatidžių trūkis ir susijungimas.
                        
                           
                              Chromosominė aberacija
                           – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip abiejų chromatidžių trūkis arba kaip trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.
                        
                           
                              Klastogenas
                           – сheminė medžiaga, kuris sukelia ląstelių arba eukariotinių organizmų populiacijų struktūrines chromosomų aberacijas.
                        
                           
                              Koncentracijos vertės
                           – bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos kultūros terpėje galutinės vertės.
                        
                           
                              Citotoksiškumas
                           – jei šio bandymo metodo tyrimams naudojamos ląstelių linijos, citotoksiškumas nustatomas kaip apdorotų ląstelių santykinio populiacijos padvigubėjimo (RPD) sumažėjimas ar santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (RICC) palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 17 pastraipą ir 2 priedėlį). Jei šio bandymo metodo tyrimams naudojamos pirminės limfocitų kultūros, citotoksiškumas nustatomas kaip apdorotų ląstelių mitozinio indekso (MI) sumažėjimas palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 18 pastraipą ir 2 priedėlį).
                        
                           
                              Endoreduplikacija
                           – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 … chromatidžių.
                        
                           
                              Genotoksinis
                           – bendrasis terminas, kuriuo išreiškiamas visų tipų DNR arba chromosomų pažeidimas, įskaitant trūkius, delecijas, aduktus, nukleotidų modifikacijas ir ryšius, pergrupavimus, genų mutacijas, chromosomų aberacijas ir aneuploidiją. Ne visų tipų genotoksiniai poveikiai sukelia mutacijas ar pastovų chromosomų pažeidimą.
                        
                           
                              Mitozinis indeksas (MI)
                           – metafazės ląstelių skaičiaus ir ląstelių populiacijos stebimų ląstelių suminio skaičiaus dalmuo, kuris rodo tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.
                        
                           
                              Mitozė
                           – ląstelės branduolio dalijimasis, paprastai į profazę, prometafazę, metafazę, anafazę ir telofazę.
                        
                           
                              Mutageninis
                           – sukeliantis paveldimą DNR bazinės poros sekos (-ų) pokytį genuose arba chromosomų struktūroje (chromosomų aberacijas).
                        
                           
                              Kiekybinė aberacija
                           – chromosomų skaičiaus pokytis palyginti su naudojamų ląstelių būdingu normaliu chromosomų skaičiumi.
                        
                           
                              Poliploidija
                           – kiekybinės chromosomų aberacijos ląstelėse arba organizmuose, apimančios visą (-us) chromosomų rinkinį (-us), skirtingai nei atskirą (-as) chromosomą (-as) (aneuploidija).
                        
                           
                              p53 būsena
                           – p53 baltymo dalyvavimas reguliuojant ląstelių ciklą, apoptozę ir DNR atkūrimą. Ląstelės, kurioms trūksta funkcinio p53 baltymo ir negali sustabdyti ląstelių ciklo arba pašalinti pažeistų ląstelių per apoptozę arba kitais mechanizmais (pvz., DNR atkūrimo skatinimą), susijusiais su p53 funkcijomis atsakant į DNR pažaidą, teoriškai turėtų būti labiau linkusios genų mutacijai ar chromosomų aberacijoms.
                        
                           
                              Santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (angl. RICC)– ląstelių skaičiaus padidėjimas chemine medžiaga veikiamose kultūrose, palyginti su padidėjimu neapdorotose kultūrose, santykį išreiškiant procentine dalimi.
                        
                           
                              Santykinis populiacijos padvigubėjimas (angl. RPD)– populiacijos padvigubėjimų skaičiaus padidėjimas chemine medžiaga veikiamose kultūrose, palyginti su neapdorotomis kultūromis, santykį išreiškiant procentine dalimi.
                        
                           
                              S9 kepenų frakcija
                           – skystis virš kepenų homogenato, gautas po centrifugavimo esant 9 000 g, t. y. žalių kepenų ekstraktas.
                        
                           
                              S9 mišinys
                           – S9 kepenų frakcijos ir fermentų metaboliniam aktyvumui būtinų kofaktorių mišinys.
                        
                           
                              Tirpiklio kontrolinis ėminys
                           – bendras terminas, apibūdinantis kontrolines kultūras, į kurias dedama vien tik tirpiklio, naudoto bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti.
                        
                           
                              Struktūrinė aberacija
                           – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti dalijimosi ciklo metafazės ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Neapdorotieji kontroliniai ėminiai
                           – kultūros, kurios neapdorojamos (t. y. nededama bandomosios cheminės medžiagos ar tirpiklio), bet yra tiriamos vienu metu su kultūromis, į kurias dedama bandomoji cheminė medžiaga.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           CITOTOKSIŠKUMO VERTINIMO FORMULĖS
                        
                        
                           Mitozinis indeksas (MI):
                        
                        
                           
                        Rekomenduojama naudoti santykinį ląstelių skaičiaus padidėjimą (RICC) ar santykinį populiacijos padvigubėjimą (RPD), nes abiem atvejais atsižvelgiama į padalytų ląstelių populiacijos dalį.
                        
                           
                        
                           
                        čia:
                        
                           Populiacijos padvigubėjimas = [log (ląstelių skaičius po apdorojimo ÷ pradinis ląstelių skaičius)] ÷ log 2
                        Pvz., 53 % RICC ar RPD rodo 47 % citotoksiškumą ar citostazę, o 55 % citotoksiškumas ar citostazė matuojant MI reiškia, kad faktinis MI yra 45 % kontrolinio ėminio.
                        
                        Visais atvejais reikėtų išmatuoti ląstelių skaičių prieš apdorojimą ir apdorojamose bei neigiamų kontrolinių ėminių kultūrose jis turėtų būti vienodas.
                        Nors praeityje kaip citotoksiškumo parametras buvo naudojamas RCC (t. y. apdorotų kultūrų ląstelių skaičius/ kontrolinių kultūrų ląstelių skaičius), jis daugiau nerekomenduojamas, nes gali būti gautas per mažas citotoksiškumo įvertis.
                        Neigiamų kontrolinių kultūrų populiacijos padvigubėjimas turėtų būti suderinamas su reikalavimu imti ląstelių ėminius nuo apdorojimo praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, o mitozinis indeksas turėtų būti gana didelis, kad būtų gautas pakankamas mitozės etapo ląstelių skaičius ir būtų galima patikimai apskaičiuoti 50 % sumažėjimą.
                     “
               
                     4)
                  
                  
                     B dalies B.11 skyrius pakeičiamas taip:
                     „B.11   Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijų bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 475 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).
                     Žinduolių kaulų čiulpų chromosomų aberacijų bandymas in vivo ypač tinka genotoksiškumui vertinti, nes, nors skirtingų gyvūnų rūšių chromosomos gali skirtis, in vivo metabolizmo veiksniai, farmakokinetika ir DNR atkūrimo procesai yra aktyvūs ir prisideda prie atsakų. Tyrimas in vivo taip pat naudingas toliau tiriant in vitro sistemoje nustatytą genotoksiškumą.
                     Žinduolių chromosomų aberacijų tyrimas in vivo naudojamas nustatant struktūrines chromosomų aberacijas, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia žinduolių, paprastai graužikų, kaulų čiulpų ląstelėse (2) (3) (4) (5). Struktūrinės chromosomų aberacijos gali būti dviejų tipų – chromosominės arba chromatidinės. Nors dauguma genotoksinių cheminių medžiagų sukeltų aberacijų yra chromatidinės, tačiau pasitaiko ir chromosominių aberacijų. Chromosomų pažeidimas ir su juo susiję reiškiniai yra daugumos genetiškai paveldimų žmonių ligų priežastis ir yra esminių įrodymų, kad, kai šie pažeidimai ir susiję reiškiniai sukelia onkogenų bei navikų supresorinių genų pokyčius, jie prisideda prie žmonių ir bandymų sistemų vėžio atsiradimo. Atliekant chromosomų aberacijų tyrimus in vivo galėtų atsirasti poliploidija (įskaitant endoreduplikaciją). Tačiau pati padidėjusi poliploidija nerodo aneugeninio potencialo ir ji tiesiog gali rodyti ląstelių ciklo sutrikimą ar citotoksiškumą. Šis bandymas nenumatytas aneuploidijai matuoti. Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių bandymas in vivo (šio priedo B.12 skyrius) arba žinduolių ląstelių mikrobranduolių bandymas in vitro (šio priedo B.49 skyrius) būtų in vivo ir in vitro bandymai, rekomenduojami aneuploidijai aptikti.
                     Vartojamų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI
                     Šiam bandymui atlikti paprastai naudojami graužikai, bet kai kuriais atvejais gali tikti kitos rūšys, jei jų naudojimas būtų moksliškai pagrįstas. Šio bandymo tikslinis audinys yra kaulų čiulpai, kadangi jis yra gausiai vaskuliarizuotas audinys ir turi sparčiai besidauginančių ląstelių, kurias galima atskirti ir apdoroti, populiaciją. Kitų nei žiurkės ar pelės rūšių naudojimas turėtų būti moksliškai pagrįstas ataskaitoje. Jei naudojamos kitos nei graužikai rūšys, rekomenduojama kaulų čiulpų chromosomų aberacijos matavimą įtraukti į kitą tinkamą toksiškumo bandymą.
                     Jei yra duomenų, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) ar jos arba jų metabolitas (-ai) nepasieks tikslinio audinio, jis gali būti netinkamas naudoti šiame bandyme.
                     Prieš šiuo bandymų metodu bandant mišinį, siekiant gauti duomenų numatomo reglamentavimo tikslais, reikėtų apsvarstyti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus, ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.
                     BANDYMŲ METODO PRINCIPAS
                     Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga tinkamu veikimo būdu ir reikiamu momentu po paveikimo humaniškai numarinami. Prieš numarinant gyvūnai paveikiami agentu, stabdančiu metafazę (pvz., kolchicinu ar kolcemidu). Tada iš kaulų čiulpų ląstelių ruošiami chromosomų preparatai, jie dažomi, ir metafazės ląstelės tiriamos mikroskopu chromosomų aberacijoms nustatyti.
                     LABORATORIJOS KVALIFIKACIJOS TIKRINIMAS
                     
                        Kvalifikacijos tyrimai
                     
                     Siekdama įgyti pakankamos tyrimo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams bandymams, laboratorija turėtų įrodyti gebėjimą atkurti paskelbtų duomenų (pvz., (6)) tikėtinus chromosomų aberacijų dažnumo rezultatus, naudodama ne mažiau kaip dvi teigiamas kontrolines chemines medžiagas (įskaitant mažos dozės teigiamų kontrolinių ėminių sukeltus silpnus atsakus), pvz., išvardytas 1 lentelėje, ir suderinamų tirpiklių ir (arba) nešiklių kontrolinius ėminius (žr. 22 pastraipą). Atliekant šiuos bandymus, reikėtų naudoti dozes, kurioms esant tiriamajame audinyje (kaulų čiulpuose) gaunami atkuriami ir su doze susiję padidėjimai, ir įrodyti bandymų sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, pasitelkiant laboratorijoje taikomą vertinimo metodą. Šis reikalavimas netaikomas patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. toms, kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 10–14 pastraipose.
                     
                        Istorinių kontrolinių ėminių duomenys
                     
                     Atlikdama kvalifikacijos tyrimus, laboratorija turėtų nustatyti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 istorinių neigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą.
                              
                           Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Istorinių kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas. Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė turėtų būti statistiškai patikima, kad būtų užtikrintas laboratorijos gebėjimas vertinti savo neigiamų kontrolinių ėminių duomenų pasiskirstymą. Literatūroje daroma prielaida, kad gali prireikti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (7)), kad galėtų nustatyti savo duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje. Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (8).
                     Jei, atliekant 9 skirsnyje aprašytus kvalifikacijos tyrimus, laboratorijai nepakanka bandymų skaičiaus statistiškai patikimam neigiamų kontrolių ėminių skirstiniui gauti (žr. 11 pastraipą), priimtina skirstinį papildyti atliekant pirmuosius įprastinius bandymus. Taikant šį būdą, reikėtų laikytis literatūroje nurodytų rekomendacijų (8), o atliekant šiuos bandymus gauti neigiamų kontrolinių ėminių rezultatai turėtų būti suderinami su paskelbtais neigiamų kontrolinių ėminių duomenimis.
                     Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų poveikį gaunamiems duomenims, kurie turi likti suderinami su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Tik esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė, jei, atsižvelgiant į ekspertų nuomonę, nustatoma, kad ji skiriasi nuo ankstesnio skirstinio (žr. 11 pastraipą). Atkūrimo metu atliekamam bandymui gali neprireikti visos neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės, jei laboratorija gali įrodyti, kad vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių vertės ir toliau yra suderinamos su ankstesne duomenų baze arba su atitinkamais paskelbtais duomenimis.
                     Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti kiekvieno gyvūno struktūrinės chromosomų aberacijos dažnumas (išskyrus plyšius). Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas. Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei jie nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema yra „valdoma“ (žr. 11 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Parengiamieji darbai
                     
                     
                        Gyvūnų rūšies parinkimas
                     
                     Reikėtų tirti dažniausiai naudojamas sveikų jaunų suaugusių gyvūnų laboratorines veisles. Paprastai naudojamos žiurkės, nors taip pat gali tikti pelės. Galima naudoti kitas tinkamas žinduolių rūšis, jei ataskaitoje tai būtų moksliškai pagrįsta.
                     
                        Gyvūnų laikymo ir šėrimo sąlygos
                     
                     Temperatūra graužikų patalpoje turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors geriausia būtų užtikrinti 50–60 % drėgmę, ji neturėtų būti mažesnė kaip 40 % ir būtų gerai, jei ji nebūtų didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos valymo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė užtikrinti tinkamą bandomosios cheminės medžiagos sumaišymą su pašaru, kai ji duodama tokiu būdu. Jei nesitikima agresyvaus elgesio, graužikus reikėtų laikyti nedidelėmis vienos lyties vienodai apdorojamomis grupėmis (ne daugiau kaip po penkis viename narvelyje), pageidautina narveliuose su kietomis grindimis ir esant atitinkamai pagerintai aplinkai. Tik moksliškai pagrįstais atvejais gyvūnus galima laikyti atskirai.
                     
                        Gyvūnų paruošimas
                     
                     Paprastai naudojami sveiki, jauni suaugę gyvūnai (geriausias graužikų amžius apdorojimo pradžioje yra 6–10 savaičių, nors leidžiama naudoti šiek tiek vyresnius gyvūnus), kurie atsitiktinai paskirstomi į kontrolines ir apdorojamas grupes. Kiekvienas gyvūnas humanišku minimaliai invaziniu būdu paženklinamas unikaliu ženklu (pvz., žieduojant, kabinant etiketę, naudojant mikrolustą ar biometrinį identifikavimą, bet ne ausų ar pėdų spaustukus) ir aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis ne trumpiau kaip 5 paras. Narvelius reikėtų įrengti taip, kad jų išdėstymo poveikis būtų minimalus. Reikėtų vengti teigiamo kontrolinio ėminio ir bandomosios cheminės medžiagos kryžminės taršos. Tyrimo pradžioje gyvūnų masės skirtumas turėtų būti minimalus ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties vidutinės gyvūno masės.
                     
                        Dozių ruošimas
                     
                     Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas prieš dozuojant gyvūnams reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose, paruošti jų suspensiją arba įmaišyti į pašarą ar geriamąjį vandenį. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dozuoti tiesiogiai arba prieš tai praskiesti. Jei bandomoji cheminė medžiaga patenka per kvėpavimo takus, ją, atsižvelgiant į jos fizikines ir chemines savybes, galima duoti dujų, garų arba kietojo ar skystojo aerozolio pavidalu. Reikėtų naudoti tik iš naujo paruoštus bandomosios cheminės medžiagos preparatus, nebent stabilumo duomenys rodo, kad laikymas priimtinas ir yra apibrėžtos tinkamos laikymo sąlygos.
                     
                        Tirpiklis ir (arba) nešiklis
                     
                     Neturėtų būti tirpiklio ar nešiklio toksinio poveikio, esant naudojamiems dozių dydžiams, ir neturėtų kilti įtarimų, kad galėtų vykti jų cheminė reakcija su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis. Jei naudojami kiti nei gerai žinomi tirpikliai ar nešikliai, juos galima įtraukti tik pateikus suderinamumą rodančius etaloninius duomenis. Rekomenduojama visuomet iš pradžių atsižvelgti į galimybę naudoti vandeninį tirpiklį arba nešiklį. Dažniausiai naudojamų suderinamų tirpiklių ar nešiklių pavyzdžiai yra vanduo, fiziologinis tirpalas, metilceliuliozės tirpalas, karboksimetilceliuliozės natrio druskos tirpalas, alyvuogių ir kukurūzų aliejus. Jei nėra istorinių arba paskelbtų kontrolinių duomenų, kurie rodo, kad pasirinktas netipinis tirpiklis ar nešiklis nesukelia struktūrinių aberacijų ar kitokio žalingo poveikio, reikėtų atlikti pradinį tyrimą tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio priimtinumui nustatyti.
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     
                        Teigiami kontroliniai ėminiai
                     
                     Paprastai į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti grupę gyvūnų, apdorotų teigiama kontroline chemine medžiaga. To galima atsisakyti, jei bandymų laboratorija įrodė kvalifikaciją atlikti bandymą ir nustatė istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą. Jei vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių grupė neįtraukiama, į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti vertinimo kontrolinius ėminius (fiksuotus ir nedažytus objektinius stiklelius). Juos galima gauti į tyrimo vertinimą įtraukiant atitinkamus etaloninius ėminius, kurie būtų gauti bandymų laboratorijoje periodiškai (pvz., kas 6–18 mėnesių) atliekant atskirą teigiamo kontrolinio ėminio bandymą, pvz., kvalifikacijos tyrimo metu ir reguliariai vėliau, jei būtina, ir tuos ėminius laikyti.
                     Teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos turėtų patikimai sukelti ląstelių su struktūrinėmis chromosomų aberacijomis aiškų dažnumo padidėjimą, palyginti su savaiminiu lygiu. Reikėtų pasirinkti tokias teigiamų kontrolinių ėminių dozes, kad poveikis būtų ryškus, bet skaičiuotojui ne iškarto atsiskleistų užkoduotų ėminių tapatybė. Teigiamą kontrolinę cheminę medžiagą galima duoti kitu nei bandomoji cheminė medžiaga būdu, taikant skirtingą apdorojimo planą ir ėminius imant tik vienu laiko momentu. Be to, jei tinka, galima atsižvelgti į tos pačios cheminės klasės teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų naudojimą. Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.
                     
                        1 lentelė
                     
                     
                        Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai
                     
                     
                                 Cheminė medžiaga
                              
                              
                                 CAS Nr.
                              
                           
                                 Etilmetansulfonatas
                              
                              
                                 62-50-0
                              
                           
                                 Metilmetansulfonatas
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                 Etilnitrozokarbamidas
                              
                              
                                 759-73-9
                              
                           
                                 Mitomicinas C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                 Ciklofosfamidas (monohidratas)
                              
                              
                                 50-18-0 (6055-19-2)
                              
                           
                                 Trietilenmelaminas
                              
                              
                                 51-18-3
                              
                           
                        Neigiami kontroliniai ėminiai
                     
                     Neigiamos kontrolinės grupės gyvūnus reikėtų įtraukti kiekvieną kartą imant ėminį ir su jais elgtis kaip su apdorojama grupe, išskyrus tai, kad gyvūnai nepaveikiami bandomąja chemine medžiaga. Jei bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas tirpiklis ar nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti šio tirpiklio ar nešiklio. Tačiau jei kiekvienam ėminių ėmimo laikui bandymų laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys rodo pastovų kintamumą tarp gyvūnų ir ląstelių su struktūrinėmis aberacijomis dažnumą, gali pakakti paimti tik vieną neigiamą kontrolinį ėminį. Jei imamas tik vienas neigiamas kontrolinis ėminys, jis turėtų būti imamas pirmą kartą imant atliekamo tyrimo ėminį.
                     PROCEDŪRA
                     
                        Gyvūnų skaičius ir lytis
                     
                     Apskritai, vyriškos ir moteriškos lyties gyvūnų mikrobranduolių atsakas yra panašus (9) ir tikėtina, kad taip atsitiks tiriant struktūrines chromosomų aberacijas, todėl daugumą tyrimų būtų galima atlikti su bet kurios lyties gyvūnais. Jei duomenys rodytų esminius skirtumus tarp patinų ir patelių (pvz., sisteminio toksiškumo, metabolizmo, biologinio įsisavinamumo, toksiškumo kaulų čiulpams ir kt. skirtumus, įskaitant, pvz., intervalo nustatymo tyrimą), tai paskatintų naudoti abiejų lyčių gyvūnus. Šiuo atveju galbūt reikėtų atlikti tyrimą su abiejų lyčių gyvūnais, pvz., kaip kartotinės dozės toksiškumo tyrimo dalį. Jei naudojamos abi lytys, galbūt tiktų taikyti faktorinės analizės schemą. Išsami informacija, kaip analizuoti duomenis taikant šią schemą, pateikta 2 priedėlyje.
                     Reikėtų nustatyti grupių dydį tyrimo pradžioje, turint tikslą vienai grupei gauti ne mažiau kaip 5 analizei tinkamus vienos lyties gyvūnus arba kiekvienos lyties gyvūnus, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Jei cheminių medžiagų poveikis žmonėms gali priklausyti nuo lyties, pvz., kai kurių vaistų atveju, bandymas turėtų būti atliekamas su atitinkamos lyties gyvūnais. Atliekant kaulų čiulpų tyrimą, kai trijų dozių grupių ir vienos vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio grupės ėminiai imami du kartus, ir dar yra teigiamo kontrolinio ėminio grupė (kiekvieną grupę sudaro penki vienos lyties gyvūnai), rekomenduojamas tipinis maksimalus gyvūnų poreikis būtų 45 gyvūnai.
                     
                        Dozių dydžiai
                     
                     Jei atliekamas parengiamasis intervalo nustatymo tyrimas, nes nėra tinkamų duomenų, kurie padėtų pasirinkti dozę, jį reikėtų atlikti toje pačioje laboratorijoje, naudojant pagrindiniam tyrimui naudoti numatytą rūšį, veislę, lytį ir apdorojimo schemą (10). Tyrimo tikslas – nustatyti didžiausią toleruojamą dozę (MTD), apibrėžiamą kaip didžiausia dozė, kuri būtų toleruojama nesant tyrimą ribojančio toksiškumo požymių, susijusių su tyrimo laikotarpio trukme (pvz., sukeliant kūno masės sumažėjimą arba hematopoetinės sistemos citotoksiškumą, bet ne žūtį ar skausmo, kančių ar išsekimo požymius, dėl kurių gyvūną reikėtų humaniškai numarinti (11)).
                     Didžiausią dozę taip pat būtų galima apibrėžti kaip dozę, kuri būtų tam tikras toksiškumo kaulų čiulpams rodiklis.
                     Cheminės medžiagos, kurios rodo toksikokinetinių savybių prisotinimą arba po ilgalaikio veikimo sukelia detoksifikavimo procesus, galinčius mažinti poveikį, gali būti dozės nustatymo kriterijų išimtys ir turėtų būti įvertinamos kiekvienu atveju atskirai.
                     Siekiant gauti informacijos apie dozės ir atsako priklausomybę, į išsamų tyrimą reikėtų įtraukti neigiamo kontrolinio ėminio grupę ir ne mažiau kaip tris dozes, kurių dydžio skirtumo faktorius būtų 2, bet ne didesnis kaip 4. Jei cheminė medžiaga nerodo toksiškumo atliekant intervalo nustatymo tyrimą arba atsižvelgiant į turimus duomenis, didžiausia vienkartinio davimo dozė turėtų būti 2 000 mg/kg kūno masės. Tačiau jei bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, didžiausia duodama dozė turėtų būti MTD, o naudojami dozių dydžiai turėtų aprėpti intervalą nuo didžiausios dozės iki mažo toksiškumo arba visiškai jo nesukeliančios dozės. Kai toksiškumas tiksliniam audiniui (kaulų čiulpams) stebimas visiems bandomiems dozės dydžiams, patartina toliau tirti netoksines dozes. Tyrimams, kurių tikslas būtų išsamiau apibūdinti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją, gali prireikti papildomų dozių grupių. Tam tikrų tipų bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., vaistų žmonėms), kurioms taikomi specifiniai reikalavimai, šios ribos gali skirtis.
                     
                        Ribinis bandymas
                     
                     Jei dozės intervalo nustatymo bandymai arba esami susijusių gyvūnų veislių duomenys rodo, kad apdorojimo režimu bent ribinė dozė (aprašyta toliau) nesukelia jokio toksinio poveikio (įskaitant tai, kad nėra kaulų čiulpų proliferacijos slopinimo ar kitų citotoksiškumo tiksliniam audiniui požymių) ir, jei atsižvelgiant in vitro genotoksiškumo tyrimus arba į giminingos struktūros cheminėms medžiagoms gautus duomenis, genotoksiškumo nereikėtų tikėtis, visas bandymas naudojant trijų dydžių dozes gali būti nebūtinas, jei būtų įrodyta, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pasiekia tikslinį audinį (kaulų čiulpus). Tokiais atvejais gali pakakti vienos ribinio dydžio dozės. Jei davimo laikotarpis > 14 parų, ribinė dozė yra 1 000 mg/kg kūno masės per parą. Jei davimo laikotarpis – 14 parų arba trumpesnis, ribinė dozė yra 2 000 mg/kg kūno masės per parą.
                     
                        Dozių davimas
                     
                     Rengiant bandymo schemą, reikėtų atsižvelgti į numatomą poveikio žmogui būdą. Todėl galima pasirinkti pagrįstus veikimo būdus, pvz., duoti su pašaru, geriamuoju vandeniu, atlikti vietinę poodinę arba intraveninę injekciją, duoti per burną (per zondą), kvėpavimo takus, intubacinį vamzdelį ar implantuoti. Visais atvejais turėtų būti pasirinktas būdas, kuris užtikrintų reikiamą tikslinio (-ių) audinio (-ių) veikimą. Injekcija į pilvo ertmę paprastai nerekomenduojama, nes tai nėra numatytas poveikio žmogui būdas ir jį reikėtų naudoti, tik jei būtų specialiai moksliškai pagrįstas. Jei bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į pašarą ar į geriamąjį vandenį, ypač vienkartinio dozavimo atveju reikėtų imtis priemonių, kad laiko tarpas nuo maisto bei vandens vartojimo iki ėminių ėmimo būtų pakankamas poveikiui aptikti (žr. 33–34 pastraipas). Skysčio, kurį galima duoti per zondą arba įšvirkšti per vieną kartą, maksimalus tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti ne daugiau kaip po 2 ml/100 g kūno masės. Didesnio nei šis tūrio naudojimą reikėtų pagrįsti. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukeltų sunkesnį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kuo mažesnis reguliuojant koncentraciją, kad būtų užtikrintas visų dydžių dozių tūrio pastovumas kūno masės atžvilgiu.
                     
                        Apdorojimo planas
                     
                     Paprastai bandomosios cheminės medžiagos duodamos per vieną kartą, bet, siekiant palengvinti didelių tūrių davimą, dozę galima padalyti (t. y. per vieną dieną apdoroti du arba daugiau kartų, tarp apdorojimų esant ne ilgesniam kaip 2–3 h tarpui). Šiomis aplinkybėmis arba tais atvejais, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama ją įkvepiant, ėminių ėmimo tvarkaraštį reikėtų sudaryti atsižvelgiant į paskutinės dozės davimo arba veikimo pabaigos laiką.
                     Turima mažai duomenų apie kartotinės dozės protokolo tinkamumą šiam bandymui. Tačiau jei šį bandymą norima sujungti su kartotinės dozės toksiškumo bandymu, reikėtų imtis priemonių išvengti mitozinių ląstelių su pažeistomis chromosomomis nuostolių, kurių gali būti esant toksinėms dozėms. Toks sujungimas yra priimtinas, kai didžiausia dozė yra lygi ribinei dozei arba didesnė (žr. 29 pastraipą) ir dozės grupei duodama ribinė dozė visą apdorojimo laikotarpio trukmę. Į mikrobranduolių bandymą (B.12 bandymų metodas) galima žiūrėti kaip į geriausią chromosomų aberacijų bandymą in vivo, kai siekiama jungti su kitais tyrimais.
                     Kaulų čiulpų ėminiai turėtų būti imami atskirai du kartus po vienkartinio apdorojimo. Graužikų pirmasis ėminių ėmimo intervalas turėtų būti laikas, kuris yra būtinas, kad galėtų baigtis laikotarpis, 1,5 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (pastaroji paprastai yra 12–18 h po apdorojimo laikotarpio). Kadangi bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) sugertis ir metabolizmas, taip pat medžiagos (-ų) įtaka ląstelių ciklo kinetikai gali paveikti optimalų chromosomų aberacijos aptikimo laiką, rekomenduojama antrąjį ėminį paimti praėjus 24 h nuo pirmojo ėminio paėmimo. Imant ėminį pirmą kartą, visos dozių grupės turėtų būti apdorotos ir ėminiai paimti analizei, tačiau, imant ėminį kitą (-us) kartą (-us), duoti reikia tik didžiausią dozę. Jei moksliškai yra pagrįstos daugiau kaip vienos paros dozės davimo schemos, paprastai ėminius reikėtų imti vieną kartą, po galutinio apdorojimo praėjus laikui, maždaug 1,5 ilgesniam nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.
                     Po apdorojimo ir prieš ėminių surinkimą gyvūnams suleidžiama injekcija į pilvo ertmę su metafazę stabdančios medžiagos (pvz., kolchicino ar kolcemido) reikiama doze, ir ėminiai surenkami po reikiamo laiko tarpo. Pelėms šis laiko tarpas prieš surinkimą yra maždaug 3–5 h, žiurkėms – 2–5 h. Ląstelės surenkamos iš kaulų čiulpų, brinkinamos, fiksuojamos, dažomos ir analizuojamos chromosomų aberacijoms nustatyti (12).
                     
                        Stebėjimai
                     
                     Reikėtų atlikti bendruosius bandymo gyvūnų klinikinius stebėjimus ir bent kartą per dieną registruoti klinikinius požymius, pageidautina kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Mažiausiai du kartus per dieną dozavimo laikotarpiu visus gyvūnus reikėtų apžiūrėti siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius. Visi gyvūnai turėtų būti sveriami tyrimo pradžioje, bent kartą per savaitę kartotinės dozės tyrimų metu ir numarinant. Jei tyrimai atliekami ne trumpiau kaip vieną savaitę, bent kartą per savaitę reikėtų matuoti pašaro suvartojimą. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiekį reikėtų išmatuoti kaskart, kai vanduo keičiamas, ir bent kartą per savaitę. Gyvūnus, kuriems pasireiškia nemirtini pernelyg didelio toksiškumo požymiai, reikėtų humaniškai numarinti dar nesibaigus bandymo laikotarpiui (11).
                     
                        Tikslinio audinio veikimas
                     
                     Reikiamu laiku vieną ar kelis kartus reikėtų paimti kraujo ėminį bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijai plazmoje nustatyti, siekiant įsitikinti, ar kaulų čiulpai buvo paveikti, jei reikalaujama ir jei nėra kitų poveikio duomenų (žr. 44 pastraipą).
                     
                        Kaulų čiulpų ir chromosomų preparatai
                     
                     Iš karto po humaniško numarinimo gaunamos kaulų čiulpų ląstelės iš gyvūnų šlaunikaulių ar blauzdikaulių, veikiamos hipotoniniu tirpalu ir fiksuojamos. Metafazės ląstelės paskleidžiamos ant objektinių stiklelių ir dažomos nustatytais būdais (žr. (3) (12)).
                     
                        Analizė
                     
                     Visi objektiniai stikleliai, įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių, prieš analizę turėtų būti atskirai koduojami ir randomizuojami, kad skaičiuotojas nežinotų apdorojimo sąlygų.
                     Reikėtų nustatyti mitozinį indeksą kaip citotoksiškumo matą, įvertinant citotoksiškumą mažiausiai 1 000 ląstelių vienam gyvūnui, jį nustatant visiems apdorotiems gyvūnams (įskaitant teigiamus kontrolinius ėminius), neapdorotiems gyvūnams arba tirpiklio ar nešiklio neigiamų kontrolinių ėminių gyvūnams.
                     Reikėtų ištirti ne mažiau kaip 200 metafazės kiekvieno gyvūno ląstelių, kad būtų nustatytos struktūrinės chromosomų aberacijos, įtraukiant ir neįtraukiant plyšių (6). Tačiau jei istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė rodo, kad bandymo laboratorijos vidutinis foninis struktūrinių chromosomų aberacijų dažnumas yra < 1 %, reikėtų atsižvelgti į galimybę skaičiuoti papildomas ląsteles. Chromatidinė ir chromosominė aberacijos turėtų būti registruojamos atskirai ir klasifikuojamos pagal potipius (trūkius, mainus). Laboratorijoje taikomos procedūros turėtų užtikrinti, kad chromosomų aberacijų analizę atlieka tinkamai apmokyti skaičiuotojai ir, jei reikia, ją peržiūrėtų ekspertai. Atsižvelgiant į tai, kad objektinių stiklelių ruošimo procedūrų dažnas rezultatas dėl gautų chromosomų nuostolių pakeičia metafazės ląstelių dalį, skaičiuojamų ląstelių centromerų skaičius turėtų būti ne mažesnis kaip 2n ± 2, kai n yra tos rūšies haploidinis chromosomų skaičius.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     Kiekvieno gyvūno bandymų rezultatai turėtų būti pateikiami lentelėse. Reikėtų įvertinti kiekvieno gyvūno mitozinį indeksą, suskaičiuotų metafazės ląstelių skaičių, aberacijų vienai metafazės ląstelei skaičių ir ląstelių su strūktūrine (-ėmis) chromosomų aberacija (-omis) procentinę dalį. Turėtų būti išvardyti apdorotų ir kontrolinių grupių gyvūnų skirtingi struktūrinių chromosomų aberacijų tipai, nurodant jų skaičių bei dažnumą. Plyšiai, taip pat poliploidinės ląstelės ir ląstelės su endoreduplikuotomis chromosomomis yra registruojamos atskirai. Plyšių dažnumas pateikiamas ataskaitoje, bet paprastai neįtraukiamas į suminio struktūrinių aberacijų dažnumo analizę. Jei nėra atsako skirtumo dėl lyties įrodymų, atliekant statistinę analizę duomenis galima apjungti. Ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti toksiškumo gyvūnams ir klinikinių požymių duomenis.
                     
                        Priimtinumo kriterijai
                     
                     Apie bandymo priimtinumą sprendžiama pagal šiuos kriterijus:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys laikomas tinkamu įtraukti į laboratorijos istorinių kontrolinių duomenų bazę (žr. 11–14 pastraipas);
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai arba skaičiavimo kontroliniai ėminiai turėtų sukelti atsakus, kurie būtų suderinami su rastais istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 20–21 pastraipą);
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 atlikta reikiamo dozių ir ląstelių skaičiaus analizė;
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 didžiausios dozės pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 25–28 pastraipose.
                              
                           
                        Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas
                     
                     Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 bent viena iš apdorotų grupių rodo statistiškai reikšmingą ląstelių su struktūrinėmis chromosomų aberacijomis (išskyrus plyšius) dažnumo padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 padidėjimas bent vienam ėminio ėmimo laikui yra susijęs su doze, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų ir
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų).
                              
                           Jei tam tikru ėminio ėmimo laiku tiriama tik didžiausia dozė, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei yra statistiškai reikšmingas padidėjimas, palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, o rezultatai yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų). Rekomendacijų dėl tinkamų statistinių metodų galima rasti literatūroje (13). Atliekant dozės ir atsako priklausomybės analizę, reikėtų analizuoti ne mažiau kaip tris dozę gavusias grupes. Taikant statistinius kriterijus, bandymo vienetu turėtų būti gyvūnas. Teigiami chromosomų aberacijų bandymo rezultatai rodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukelia bandomųjų rūšių kaulų čiulpų struktūrines chromosomų aberacijas.
                     Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 nei viena apdorota grupė nerodo statistiškai reikšmingo ląstelių su struktūrinėmis chromosomų aberacijomis (išskyrus plyšius) dažnumo padidėjimo palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 nėra su doze susijusio padidėjimo bet kuriuo ėminių ėmimo laiku, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų) ir
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 kaulų čiulpai buvo veikiami bandomąja (-osiomis) chemine (-ėmis) medžiaga (-omis).
                              
                           Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (13). Kaulų čiulpų veikimo bandomąja chemine medžiaga įrodymu gali būti mitozinio indekso sumažėjimas arba bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) koncentracijos verčių plazmoje ar kraujyje matavimas. Jei cheminė medžiaga leidžiama į veną, įrodyti poveikio nebūtina. Siekiant įrodyti, kad kaulų čiulpai buvo paveikti, taip pat galima naudoti ADME (absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo, šalinimo) duomenis, gautus atliekant nepriklausomą tyrimą, kuriame būtų naudojamas tas pats davimo būdas ir ta pati rūšis. Neigiami rezultatai rodo, kad tyrimo sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga nesukelia chromosomų aberacijų bandytos gyvūnų rūšies kaulų čiulpuose.
                     Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar aiškų neigiamą atsaką.
                     Tais atvejais, kai atsakas nėra aiškiai neigiamas ar teigiamas, ir siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą (pvz., mažas ar tarpinis padidėjimas), duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) papildomai tiriant esamus atliktus bandymus. Kai kuriais atvejais galėtų būti naudinga analizuoti didesnį ląstelių skaičių arba pakartoti bandymą šiek tiek pakeistomis bandymo sąlygomis.
                     Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, nepakaks duomenų padaryti išvadą, ar gauti bandomosios cheminės medžiagos rezultatai yra teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad tyrimas yra dviprasmis.
                     Poliploidinių ir endoreduplikuotų metafazės ląstelių dažnumas turėtų būti registruojamas atskirai. Poliploidinių ar endoreduplikuotų ląstelių skaičiaus padidėjimas gali rodyti, kad bandomoji cheminė medžiaga gali slopinti mitozinius procesus ar ląstelių ciklo eigą (žr. 3 pastraipą).
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                        Santrauka
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kilmė, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vienkomponentė cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             nešiklio pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos tirpumas ir stabilumas tirpiklyje ar nešiklyje, jei yra žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             preparatų su pašarais, geriamuoju vandeniu arba inhaliacinių preparatų ruošimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             preparatų analizinis nustatymas (pvz., stabilumo, vienalytiškumo, nominalių koncentracijos verčių), kai atliekamas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo gyvūnai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             rūšis ir (arba) veislė ir jų pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kilmė, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų unikalaus identifikavimo būdas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje, atliekant trumpalaikius tyrimus; kiekvieno gyvūno masė bandymo eigoje ir pašaro suvartojimas, atliekant ilgesnius nei savaitės trukmės bandymus. Reikėtų įtraukti kiekvienos grupės kūno masės intervalą, vidurkį ir standartinį nuokrypį.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             teigiami ir neigiami (nešiklio ir (arba) tirpiklio) kontroliniai ėminiai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             intervalo nustatymo tyrimo, jei atliekamas, duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             davimo būdo ir trukmės pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tikrinimo, ar bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pateko į kraujotakos sistemą ar kaulų čiulpus, metodai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             faktinė dozė (mg/kg kūno masės per parą), apskaičiuota pagal bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją pašaruose ir (arba) geriamajame vandenyje (ppm) ir suvartojimą, jei tinka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             numarinimo metodas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nuskausminimo metodas (jei taikomas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsamus apdorojimo ir ėminių ėmimo tvarkaraščių aprašymas, pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             objektinių stiklelių paruošimo metodai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             toksiškumo matavimo metodai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metafazės tarpsnyje stabdančios cheminės medžiagos pavadinimas, jos koncentracija, dozė ir davimo laikas prieš ėminių ėmimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ėminių izoliavimo ir konservavimo procedūros;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberacijų įvertinimo kriterijai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analizuotų metafazės ląstelių skaičius vienam gyvūnui ir mitoziniam indeksui nustatyti analizuotų ląstelių skaičius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tyrimo priimtinumo kriterijai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kriterijai, pagal kuriuos tyrimas laikomas teigiamu, neigiamu ar nedavusiu rezultato.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų būklė prieš bandymą ir visą bandymo laikotarpį, įskaitant toksiškumo požymius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mitozinis indeksas, nurodytas atskirai kiekvienam gyvūnui;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aberacijų tipas bei skaičius ir ląstelių su aberacijomis skaičius, pateiktas atskirai kiekvienam gyvūnui;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienos grupės suminis aberacijų skaičius, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienos grupės ląstelių su aberacijomis skaičius, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ploidiškumo pokyčiai, jei matomi, įskaitant poliploidinių ląstelių ir (arba) endoreduplikuotų ląstelių dažnumus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dozės ir atsako priklausomybė, jei įmanoma nustatyti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             statistinės analizės duomenys ir taikytas metodas.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kaulų čiulpų poveikio patvirtinimo duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio ir teigiamo kontrolinio ėminio duomenys, nurodant intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             istorinių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių duomenys, intervalai, vidurkiai, standartiniai nuokrypiai ir skirstinio 95 % kontrolinės ribos, taip pat apimamas laikotarpis ir stebėjimų skaičius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             atitikti teigiamo ar neigiamo atsako kriterijai.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvada.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nuorodos.
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Adler, I.D. (1984), „Cytogenetic Tests in Mammals“, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Aneuploidija
                           – vienos arba daugiau kaip vienos chromosomų, bet ne viso (-ų) jų rinkinio (-ų) (žr. poliploploidija) nukrypimas nuo normalaus diploidinio (arba haploidinio) chromosomų skaičiaus.
                        
                           
                              Centromera
                           – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Chromatidinė aberacija
                           – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip vienos iš chromatidžių trūkis arba kaip chromatidžių trūkis ir susijungimas.
                        
                           
                              Chromosominė aberacija
                           – struktūrinis chromosomos pažeidimas, pasireiškiantis kaip abiejų chromatidžių trūkis arba kaip trūkis ir susijungimas toje pačioje vietoje.
                        
                           
                              Endoreduplikacija
                           – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replikacijos S periodui, branduolys nepradeda dalytis mitozės būdu, bet prasideda naujas S periodas. Taip atsiranda chromosomos, turinčios 4, 8, 16 ... chromatidžių.
                        
                           
                              Plyšys
                           – achromatinė, mažesnė nei vienos chromatidės plotis, spraga, kurioje yra mažiausias skaičius klaidingai suporuotų bazių.
                        
                           
                              Mitozinis indeksas
                           – santykis tarp metafazėje esančių ląstelių skaičiaus ir visų populiacijos ląstelių skaičiaus, kuris yra tos ląstelių populiacijos proliferacijos būsenos matas.
                        
                           
                              Chromosomų skaičiaus aberacija
                           – naudojamų gyvūnų chromosomų skaičiaus pokytis palyginti su normaliu jų skaičiumi (aneuploidija).
                        
                           
                              Poliploidija
                           – chromosomų skaičiaus aberacija ląstelėse arba organizmuose, apimanti viso chromosomų rinkinio skaičiaus pokytį, bet ne chromosomų rinkinio dalies skaičiaus pokytį (žr. aneuploidija).
                        
                           
                              Struktūrinė chromosomų aberacija
                           – chromosomos struktūros pokytis, kurį galima nustatyti dalijimosi ciklo metafazės ląsteles tiriant mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, pokyčiai grandinių viduje ar tarp grandinių.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           FAKTORINĖS ANALIZĖS SCHEMA LYČIŲ SKIRTUMAMS NUSTATYTI ATLIEKANT CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ TYRIMĄ IN VIVO
                           
                        
                        
                           Faktorinės analizės schema ir jos taikymas
                        
                        Pagal šią schemą kiekvienai koncentracijos vertei bandomi ne mažiau kaip 5 patinai ir 5 patelės. Iš viso pagal schemą naudojama ne mažiau kaip 40 gyvūnų (20 patinų ir 20 patelių ir dar atitinkami teigiami kontroliniai ėminiai).
                        Schema, kuri yra viena iš paprastesnių faktorinės analizės schemų, atitinka dvifaktorinės dispersinės analizės schemą, kurios pagrindiniai veiksniai yra lytis ir koncentracijos vertė. Duomenis galima analizuoti naudojant daug standartinių statistinės programinės įrangos rinkinių, pvz., SPSS, SAS, STATA, Genstat taip pat naudojant programavimo kalbą R.
                        Atliekant analizę, duomenų rinkinio kintamumas perdalijamas į kintamumą tarp lyčių, tarp koncentracijos verčių ir į kintamumą, susijusį su sąveika tarp lyčių ir koncentracijos verčių. Kiekvienas iš narių tikrinamas tos pačios lyties kartotinių gyvūnų kintamumo grupių viduje įverčio atžvilgiu, esant vienodai koncentracijai. Išsami informacija apie bazinę metodiką pateikta daugelyje standartinių statistinių vadovėlių (žr. nuorodas) ir su statistiniais rinkiniais pateikiamose pagalbinėse priemonėse.
                        Analizė tęsiama tikrinant ANOVA lentelės x lyties ir koncentracijos sąveikos narį (5). Nesant reikšmingo sąveikos nario, lytims ar koncentracijos vertėms gautos jungtinės vertės duoda patikimus statistinius kriterijus tarp koncentracijos verčių, pagrįstus grupės jungtiniu ANOVA kintamumo nariu.
                        Atliekant analizę toliau, kintamumo tarp koncentracijos verčių įvertis dalijamas į kontrastus, taip gaunamas atsakų pagal koncentracijos vertes tiesinių ir kvadratinių kontrastų kriterijus. Kai yra reikšminga x lyties ir koncentracijos sąveika, šį narį taip pat galima padalyti į tiesinius x lyties ir kvadratinius x lyties sąveikos kontrastus. Šie nariai pateikia kriterijus, ar abiejų lyčių atsakas į koncentraciją yra lygiagretus, ar abiejų lyčių atsakas yra skirtuminis.
                        Grupės jungtinio kintamumo įvertis gali būti naudojamas skirtumų tarp vidurkių poriniams kriterijams gauti. Galima lyginti abiejų lyčių vidurkius ir skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius, pvz., palyginimui su neigiamų kontrolinių ėminių vidurkiais. Jei sąveika yra reikšminga, galima lyginti vienos lyties skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius ir vienos koncentracijos lytims gautus vidurkius.
                        
                           Nuorodos
                        
                        Yra daug statistikos vadovėlių, kuriuose aptariama faktorinės analizės schemų, nuo paprasčiausios dvifaktorinės analizės iki bandymų planavimo metodikoje naudojamų sudėtingesnių formų, teorija, projektavimas, metodika, analizė ir aiškinimas. Toliau pateikiamas sąrašas nėra išsamus. Kai kuriose knygose pateikiami palyginamųjų schemų pavyzdžiai su skaičiavimais, kartais su kompiuterine programa analizei atlikti naudojant įvairius programinės įrangos rinkinius.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     5)
                  
                  
                     B dalies B.12 skyrius pakeičiamas taip:
                     „B.12   Žinduolių eritrocitų mikrobranduolių bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 474 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).
                     Žinduolių mikrobranduolių bandymas in vivo ypač tinka genotoksiškumui vertinti, nes, nors skirtingų gyvūnų rūšių mikrobranduoliai gali skirtis, metabolizmo in vivo veiksniai, farmakokinetika ir DNR atkūrimo procesai yra aktyvūs ir prisideda prie atsakų. Tyrimas in vivo taip pat yra naudingas toliau tiriant genotoksiškumą, aptiktą in vitro sistema.
                     Žinduolių mikrobranduolių bandymas in vivo yra naudojamas aptikti pažaidoms, kurias bandomoji cheminė medžiaga sukelia chromosomoms ar eritroblastų mitoziniam aparatui. Atliekant bandymą įvertinamas mikrobranduolių susidarymas eritrocituose, imant gyvūnų, paprastai graužikų, kaulų čiulpų arba periferinio kraujo ląstelių ėminius.
                     Mikrobranduolių bandymo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, sukeliančias citogenetinius pažeidimus, dėl kurių susiformuoja mažieji branduoliai, turintys atsilikusių chromosomų fragmentų ar ištisas chromosomas.
                     Kai kaulų čiulpų eritroblastas virsta nesubrendusiu eritrocitu (kartais vadinamu polichrominiu eritrocitu ar retikulocitu), pagrindinis branduolys yra išstumiamas; susiformavęs mikrobranduolys gali likti citoplazmoje. Matyti ar aptikti mikrobranduolius šiose ląstelėse nėra sunku, nes jos neturi pagrindinio branduolio. Nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumo padidėjimas apdorotuose gyvūnuose rodo sukeltas struktūrines arba kiekybines chromosomų aberacijas.
                     Naujai susidarę eritrocitai su mikrobranduoliais nustatomi ir kiekybiškai įvertinami juos dažant ir vizualiai skaičiuojant pro mikroskopą arba atliekant automatizuotą analizę. Nepakankamai subrendusių eritrocitų suaugusių gyvūnų periferiniame kraujyje ar kaulų čiulpuose suskaičiavimą labai palengvina automatizuota kompiuterinė skaičiavimo sistema. Tokios sistemos yra priimtinos vertinimo rankiniu būdu alternatyvos (2). Palyginamieji tyrimai parodė, kad, naudojant atitinkamus kalibravimo etalonus, tokiais metodais galima gauti geresnį laboratorinį ir tarplaboratorinį atkuriamumą ir jautrį, palyginti su skaičiavimu rankiniu būdu (3) (4). Automatizuotos sistemos, kurios gali matuoti eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą, yra tėkmės citometrai (5), vaizdo analizės sistemos (6) (7) ir lazeriniai skenuojantys citometrai (8), tačiau gali būti ir kitų sistemų.
                     Nors paprastai tai neatliekama kaip bandymo dalis, chromosomų fragmentus galima atskirti nuo ištisų chromosomų pagal kelis kriterijus. Tai yra kinetochorų ar centromerinių DNR buvimo ar nebuvimo nustatymas, nes abu dalykai yra nepažeistų chromosomų charakteristika. Kai kinetochorų ar centromerinių DNR nėra, tai rodo, kad mikrobranduoliai turi tik chromosomų fragmentus, o kai jų yra – chromosomų praradimą.
                     Taikomų terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI
                     Jaunų suaugusių graužikų kaulų čiulpai yra šio bandymo genetinių pažeidimų tikslinis audinys, nes eritrocitai gaminami šiame audinyje. Galima vertinti kitų rūšių žinduolių mikrobranduolius periferinio kraujo nesubrendusiuose eritrocituose, jei įrodyta (mikrobranduolių indukcijos nesubrendusiuose eritrocituose būdu), kad jie pakankamai jautrūs, kad būtų galima išsiaiškinti, ar cheminės medžiagos sukelia struktūrines chromosomų ar jų skaičiaus aberacijas tose ląstelėse, ir jei pateiktas mokslinis pagrindimas. Nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumas yra pagrindinė vertinamoji baigtis. Rūšims be stiprios ląstelių su mikrobranduoliais atrankos blužnyje ir gyvūnus nuolat apdorojant laikotarpiu, kurio trukmė yra didesnė nei naudojamos gyvūnų rūšies eritrocitų gyvavimo trukmė (pvz., pelių – 4 savaitės arba ilgiau) kaip vertinamoji baigtis taip pat gali būti naudojamas periferinio kraujo subrendusių eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, dažnumas.
                     Jei yra duomenų, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) ar jos arba jų metabolitas (-ai) nepasieks tikslinio audinio, šis metodas gali būti netinkamas.
                     Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti duomenys numatomo reglamentavimo tikslu, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.
                     BANDYMŲ METODO PRINCIPAS
                     Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga reikiamu būdu. Jei naudojami kaulų čiulpai, gyvūnai humaniškai numarinami reikiamu (-ais) momentu (-ais) po apdorojimo, kaulų čiulpai išimami ir ruošiami bei dažomi jų preparatai (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Kai naudojamas periferinis kraujas, jis imamas reikiamu (-ais) momentu (-ais) po apdorojimo ir ruošiami bei dažomi jo preparatai (12) (16) (17) (18). Jei apdorojama ūmiu būdu, svarbu pasirinkti tokį kaulų čiulpų ar kraujo surinkimo laiką, kuriuo būtų galima aptikti su apdorojimu susijusią nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais indukciją. Imant periferinio kraujo ėminius taip pat turi praeiti pakankamai laiko, kad šie reiškiniai pasireikštų cirkuliuojančiame kraujyje. Preparatai analizuojami mikrobranduolių buvimui nustatyti vizualiai pro mikroskopą, naudojant vaizdo analizę, tėkmės citometriją ar lazerinę skenuojančią citometriją.
                     LABORATORIJOS KVALIFIKACIJOS TIKRINIMAS
                     
                        Kvalifikacijos tyrimai
                     
                     Siekdama įgyti pakankamos tyrimo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams bandymams, laboratorija turėtų įrodyti gebėjimą atkurti paskelbtų duomenų (17) (19) (20) (21) (22) tikėtinus mikrobranduolių dažnumo rezultatus, naudodama ne mažiau kaip dvi teigiamas kontrolines chemines medžiagas (įskaitant mažos dozės teigiamų kontrolinių ėminių sukeltus silpnus atsakus), pvz., išvardytas 1 lentelėje, ir suderinamų tirpiklių ir (arba) nešiklių kontrolinius ėminius (žr. 26 pastraipą). Atliekant šiuos bandymus, reikėtų naudoti dozes, kurioms esant tiriamajame audinyje (kaulų čiulpuose ar periferiniame kraujyje) gaunami atkuriami ir su doze susiję padidėjimai, bei įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, pasitelkiant laboratorijoje taikomą vertinimo metodą. Šis reikalavimas netaikomas patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 14–18 pastraipose.
                     
                        Istorinių kontrolinių ėminių duomenys
                     
                     Atlikdama kvalifikacijos tyrimus, laboratorija turėtų nustatyti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 istorinių neigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą.
                              
                           Pirmą kartą gaunant istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymo duomenis, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Istorinių kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas. Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė turėtų būti statistiškai patikima, kad būtų užtikrinta laboratorijos gebėjimas vertinti savo neigiamų kontrolinių ėminių duomenų pasiskirstymą. Literatūroje daroma prielaida, kad gali prireikti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (23)), kad galėtų nustatyti savo duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje. Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (24).
                     Jei atliekant 13 skirsnyje aprašytus kvalifikacijos tyrimus laboratorijai nepakanka bandymų skaičiaus statistiškai patikimam neigiamų kontrolių ėminių skirstiniui gauti (žr. 15 pastraipą), priimtina skirstinį papildyti atliekant pirmuosius įprastinius bandymus. Taikant šį būdą, reikėtų laikytis literatūroje nurodytų rekomendacijų (24), o atliekant šiuos bandymus gauti neigiamų kontrolinių ėminių rezultatai turėtų būti suderinami su paskelbtais neigiamų kontrolinių ėminių duomenimis.
                     Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų poveikį gaunamiems duomenims, kurie turi likti suderinami su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Tik esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė, jei atsižvelgiant į ekspertų nuomonę nustatoma, kad ji skiriasi nuo ankstesnio skirstinio (žr. 15 pastraipą). Atkūrimo metu atliekamam bandymui gali neprireikti visos neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės, jei laboratorija gali įrodyti, kad vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių vertės ir toliau yra suderinamos su ankstesne duomenų baze arba su atitinkamais paskelbtais duomenimis.
                     Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti kiekvieno gyvūno nesubrendusių, mažųjų branduolių turinčių eritrocitų dažnumas. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas. Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 15 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Parengiamieji darbai
                     
                     
                        Gyvūnų rūšies parinkimas
                     
                     Reikėtų tirti dažniausiai naudojamas sveikų jaunų suaugusių gyvūnų laboratorines veisles. Galima naudoti peles, žiurkes ar kitas tinkamas žinduolių rūšis. Kai naudojamas periferinis kraujas, turi būti nustatyta, ar indukuotų mikrobranduolių aptikimas netrikdomas, pasirinktos rūšies gyvūno blužniai iš apytakos šalinant ląsteles su mikrobranduoliais. Tai buvo aiškiai įrodyta pelių ir žiurkių periferiniam kraujui (2). Kitų nei žiurkės ar pelės rūšių naudojimas turėtų būti moksliškai pagrįstas ataskaitoje. Jei naudojamos kitos nei graužikai rūšys, rekomenduojama indukuotų mikrobranduolių matavimą įtraukti į kitą tinkamą toksiškumo bandymą.
                     
                        Gyvūnų laikymo ir šėrimo sąlygos
                     
                     Temperatūra graužikų patalpoje turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors geriausia būtų užtikrinti 50–60 % drėgmę, ji neturėtų būti mažesnė kaip 40 % ir būtų gerai, jei ji nebūtų didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos valymo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė užtikrinti tinkamą bandomosios cheminės medžiagos sumaišymą su pašaru, kai ji duodama tokiu būdu. Jei nesitikima agresyvaus elgesio, graužikus reikėtų laikyti nedidelėmis vienos lyties vienodai apdorotomis grupėmis (ne daugiau kaip po penkis viename narvelyje), pageidautina narveliuose su kietomis grindimis ir esant atitinkamai pagerintai aplinkai. Tik moksliškai pagrįstais atvejais gyvūnus galima laikyti atskirai.
                     
                        Gyvūnų paruošimas
                     
                     Paprastai naudojami sveiki jauni suaugę gyvūnai (geriausias graužikų amžius apdorojimo pradžioje yra 6–10 savaičių, nors leidžiama naudoti šiek tiek vyresnius gyvūnus), kurie atsitiktinai paskirstomi į kontrolines ir apdorotas grupes. Atskiri gyvūnai unikaliai paženklinami humanišku minimaliai invaziniu būdu (pvz., žieduojant, kabinant etiketę, naudojant mikrolustą ar biometrinį identifikavimą, bet ne ausų ar pėdų spaustukus) ir aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis ne trumpiau kaip 5 paras. Narvelius reikėtų įrengti taip, kad jų išdėstymo poveikis būtų minimalus. Reikėtų vengti teigiamo kontrolinio ėminio ir bandomosios cheminės medžiagos kryžminės taršos. Tyrimo pradžioje gyvūnų masės skirtumas turėtų būti kuo mažesnis ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyvūno masės.
                     
                        Dozių ruošimas
                     
                     Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas, prieš dozuojant gyvūnams, reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose, paruošti jų suspensiją arba įmaišyti į pašarą ar geriamąjį vandenį. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dozuoti tiesiogiai arba prieš tai praskiesti. Jei bandomoji cheminė medžiaga patenka per kvėpavimo takus, ją galima duoti dujų, garų arba kietojo ar skystojo aerozolio pavidalu, atsižvelgiant į jos fizikines ir chemines savybės. Reikėtų naudoti tik iš naujo paruoštus bandomosios cheminės medžiagos preparatus, nebent stabilumo duomenys rodo, kad laikymas priimtinas ir šiuo atveju apibrėžiamos tinkamos laikymo sąlygos.
                     
                        Bandymo sąlygos
                     
                     
                        Tirpiklis ir (arba) nešiklis
                     
                     Neturėtų būti tirpiklio ar nešiklio toksinio poveikio, esant naudojamiems dozių dydžiams, ir negalėtų vykti jų cheminė reakcija su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis. Jei naudojami kiti nei gerai žinomi tirpikliai ar nešikliai, juos galima įtraukti, pateikus suderinamumą rodančius nuorodų duomenis. Rekomenduojama visuomet iš pradžių atsižvelgti į galimybę naudoti vandeninį tirpiklį arba nešiklį. Dažniausiai naudojamų suderinamų tirpiklių ar nešiklių pavyzdžiai yra vanduo, fiziologinis tirpalas, metilceliuliozės tirpalas, karboksimetilceliuliozės natrio druskos tirpalas, alyvuogių ir kukurūzų aliejus. Jei nėra istorinių arba paskelbtų kontrolinių duomenų, kurie rodo, kad pasirinktas netipinis tirpiklis ar nešiklis nesukelia mikrobranduolių atsiradimo ir kitokio žalingo poveikio, reikėtų atlikti pradinį tyrimą tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio priimtinumui nustatyti.
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     
                        Teigiami kontroliniai ėminiai
                     
                     Paprastai į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti grupę gyvūnų, apdorotų teigiama kontroline chemine medžiaga. To galima atsisakyti, jei bandymų laboratorija įrodė turinti kvalifikaciją atlikti bandymą ir nustatė istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą. Jei vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių grupė neįtraukiama, į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti vertinimo kontrolinius ėminius (fiksuotus ir nedažytus objektinius stiklelius arba ląstelių suspensijos ėminius, atsižvelgiant į vertinimo metodą). Juos galima gauti į tyrimo vertinimą įtraukiant atitinkamus etaloninius ėminius, kurie būtų gauti periodiškai (pvz., kas 6–18 mėnesių) atliekant atskirą teigiamo kontrolinio ėminio bandymą, pvz., kvalifikacijos tyrimo metu ir reguliariai vėliau, jei būtina, ir tuos ėminius laikyti.
                     Teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos turėtų patikimai sukelti aiškų mikrobranduolių dažnumo padidėjimą palyginti su savaiminiu lygiu. Kai skaičiuojama rankiniu būdu žiūrint pro mikroskopą, reikėtų pasirinkti tokias teigiamų kontrolinių ėminių dozes, kad poveikis būtų ryškus, bet skaičiuotojui ne iškarto atsiskleistų užkoduotų ėminių tapatybė. Teigiamą kontrolinę cheminę medžiagą galima duoti kitu nei bandomoji cheminė medžiaga būdu, taikant skirtingą apdorojimo planą ir ėminius imant tik vienu laiko momentu. Be to, jei tinka, galima atsižvelgti į tos pačios cheminės klasės teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų naudojimą. Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai pateikti 1 lentelėje.
                     
                        1 lentelė.
                     
                     
                        Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai
                     
                     Cheminės medžiagos ir CAS Nr.
                     Etilmetansulfonatas [CAS Nr. 62-50-0]
                     Metilmetansulfonatas [CAS Nr. 66-27-3]
                     Etilnitrozokarbamidas [CAS Nr. 759-73-9]
                     Mitomicinas C [CAS Nr. 50-07-7]
                     Ciklofosfamidas (monohidratas) [CAS Nr. 50-18-0 (CAS Nr. 6055-19-2)]
                     Trietilenmelaminas [CAS Nr. 51-18-3]
                     Kolchicinas [CAS Nr. 64-86-8] ar vinblastinas [CAS Nr. 865-21-4] – kaip aneugenai
                     
                        Neigiami kontroliniai ėminiai
                     
                     Neigiamos kontrolinės grupės gyvūnus reikėtų įtraukti kiekvieną kartą imant ėminį ir su jais elgtis kaip su apdorota grupe, išskyrus tai, kad gyvūnai nepaveikiami bandomąja chemine medžiaga. Jei bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas tirpiklis ar nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti šio tirpiklio ar nešiklio. Tačiau jei kiekvienam ėminių ėmimo laikui bandymų laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys rodo pastovų kintamumą tarp gyvūnų ir ląstelių su mikrobranduoliais dažnumą, gali pakakti paimti tik vieną neigiamą kontrolinį ėminį. Jei imamas tik vienas neigiamas kontrolinis ėminys, jis turėtų būti imamas pirmą kartą imant atliekamo tyrimo ėminį.
                     Jei naudojamas periferinis kraujas, vietoj vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio atliekant trumpalaikius tyrimus galima naudoti parengtinio apdorojimo ėminį, kai gauti duomenys yra suderinami su bandymų laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų baze. Naudojant žiurkes buvo įrodyta, kad mažo tūrio parengtinio ėminio ėmimas (pvz., mažesnio kaip 100 μl/parai) turi minimalų poveikį mikrobranduolių foniniam dažnumui (25).
                     PROCEDŪRA
                     
                        Gyvūnų skaičius ir lytis
                     
                     Apskritai, vyriškos ir moteriškos lyties gyvūnų mikrobranduolių atsakas yra panašus, todėl daugumą tyrimų būtų galima atlikti su bet kurios lyties gyvūnais (26). Jei duomenys rodytų esminius skirtumus tarp patinų ir patelių (pvz., sisteminio toksiškumo, metabolizmo, biologinio įsisavinamumo, toksiškumo kaulų čiulpams ir kt. skirtumus, įskaitant, pvz., intervalo nustatymo tyrimą), tai paskatintų naudoti abiejų lyčių gyvūnus. Šiuo atveju galbūt reikėtų atlikti tyrimą su abiejų lyčių gyvūnais, pvz., kaip kartotinės dozės toksiškumo tyrimo dalį. Jei naudojamos abi lytys, galbūt tiktų taikyti faktorinės analizės schemą. Išsami informacija, kaip analizuoti duomenis taikant šią schemą, pateikta 2 priedėlyje.
                     Reikėtų nustatyti grupių dydį tyrimo pradžioje, turint tikslą vienai grupei gauti ne mažiau kaip 5 analizei tinkamus vienos lyties gyvūnus arba kiekvienos lyties gyvūnus, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai. Jei cheminių medžiagų poveikis žmonėms gali priklausyti nuo lyties, pvz., kai kurių vaistų atveju, bandymas turėtų būti atliekamas su atitinkamos lyties gyvūnais. Atliekant kaulų čiulpų tyrimą pagal 37 pastraipoje nustatytus parametrus, kai yra trys dozių grupės ir vienalaikio neigiamo ir teigiamo kontrolinių ėminių grupės (kiekvieną grupę sudaro penki vienos lyties gyvūnai), rekomenduojamas tipinis maksimalus gyvūnų poreikis būtų nuo 25 iki 35 gyvūnų.
                     
                        Dozės dydžiai
                     
                     Jei atliekamas parengiamasis intervalo nustatymo tyrimas, nes nėra tinkamų duomenų, kurie padėtų pasirinkti dozę, jį reikėtų atlikti toje pačioje laboratorijoje, naudojant pagrindiniam tyrimui naudoti numatytą rūšį, veislę, lytį ir apdorojimo schemą (27). Tyrimo tikslas – nustatyti didžiausią toleruojamą dozę (MTD), apibrėžiamą kaip didžiausia dozė, kuri būtų toleruojama nesant tyrimą ribojančio toksiškumo požymių, susijusių su tyrimo laikotarpio trukme (pvz., sukeliant kūno masės sumažėjimą arba hematopoetinės sistemos citotoksiškumą, bet ne žūtį ar skausmo, kančių ar išsekimo požymius, dėl kurių reikėtų humaniškai numarinti (28)).
                     Didžiausią dozę taip pat būtų galima apibrėžti kaip dozę, kuri sukeltų toksiškumą kaulų čiulpams (pvz., kaulų čiulpų arba periferinio kraujo nesubrendusių eritrocitų dalies sumažėjimas suminio eritrocitų skaičiaus atžvilgiu daugiau kaip 50 %, bet iki ne mažiau kaip 20 % kontrolinės vertės). Tačiau analizuojant periferinės kraujotakos CD71 teigiamas ląsteles (t. y. tėkmės citometrijos metodu), ši labai jauna nesubrendusių eritrocitų frakcija gali reaguoti į toksinius veiksnius labiau nei didesnė RNR teigiama nesubrendusių eritrocitų grupė. Todėl didesnis akivaizdus toksiškumas gali būti matomas naudojant ūmaus paveikimo schemas, kai tiriama CD71 teigiamų nesubrendusių eritrocitų frakcija, palyginti su schemomis, pagal kurias nustatomi nesubrendę eritrocitai pagal RNR kiekį. Todėl, kai bandant apdorojama penkias paras arba mažiau, didžiausia toksiškumą sukeliančių cheminių medžiagų dozė gali būti apibrėžta kaip dozė, kuri sukelia statistiškai reikšmingą CD71 teigiamų nesubrendusių eritrocitų sumažėjimą suminio eritrocitų skaičiaus atžvilgiu, bet ne mažesnį kaip 5 % kontrolinės vertės (29).
                     Cheminės medžiagos, kurios rodo toksikokinetinių savybių prisotinimą arba po ilgalaikio davimo sukelia detoksifikavimo procesus, galinčius mažinti veikimą, gali būti dozės nustatymo kriterijų išimtys ir turėtų būti įvertinamos kiekvienu atveju atskirai.
                     Siekiant gauti informacijos apie dozės ir atsako priklausomybę, į išsamų tyrimą reikėtų įtraukti neigiamo kontrolinio ėminio grupę ir ne mažiau kaip tris dozes, kurių dydžio skirtumo faktorius būtų 2, bet ne didesnis kaip 4. Jei cheminė medžiaga nėra toksiška atliekant intervalo nustatymo tyrimą arba atsižvelgiant į turimus duomenis, 14 parų ar ilgesnio laikotarpio didžiausia davimo dozė turėtų būti 1 000 mg/kg kūno masės per parą arba 2 000 mg/kg kūno masės per parą, jei laikotarpis trumpesnis kaip 14 parų. Tačiau, jei bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška, didžiausia duodama dozė turėtų būti MTD, o naudojami dozių dydžiai turėtų aprėpti intervalą nuo didžiausios dozės iki mažo toksiškumo arba visiškai jo nesukeliančios dozės. Kai toksiškumas tiksliniam audiniui (kaulų čiulpams) stebimas naudojant visus bandomus dozės dydžius, patartina toliau tirti netoksines dozes. Tyrimams, kurių tikslas būtų išsamiau apibūdinti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją, gali prireikti papildomų dozių grupių. Tam tikrų tipų bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., vaistų žmonėms), kurioms taikomi specifiniai reikalavimai, šios ribos gali skirtis.
                     
                        Ribinis bandymas
                     
                     Jei dozės intervalo nustatymo bandymai arba esami susijusių gyvūnų veislių duomenys rodo, kad apdorojimo režimu bent ribinė dozė (aprašyta toliau) nesukelia jokio toksinio poveikio (įskaitant tai, kad nėra kaulų čiulpų proliferacijos slopinimo ar kitų citotoksiškumo tiksliniam audiniui požymių) ir, jei atsižvelgiant į in vitro genotoksiškumo tyrimus arba į giminingos struktūros cheminėms medžiagoms gautus duomenis, genotoksiškumo nereikėtų tikėtis, visas bandymas naudojant trijų dydžių dozes gali būti nebūtinas, jei būtų įrodyta, kad bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pasiekia tikslinį audinį (kaulų čiulpus). Tokiais atvejais gali pakakti vienos ribinio dydžio dozės. Jei davimo laikotarpis – 14 parų arba ilgesnis, ribinė dozė yra 1 000 mg/kg kūno masės per parą. Jei davimo laikotarpis yra trumpesnis kaip 14 parų, ribinė dozė yra 2 000 mg/kg kūno masės per parą.
                     
                        Dozių davimas
                     
                     Rengiant bandymo schemą, reikėtų atsižvelgti į numatomą poveikio žmogui būdą. Todėl galima pasirinkti pagrįstus poveikio būdus, pvz., duoti su pašaru, geriamuoju vandeniu, atlikti vietinę poodinę arba intraveninę injekciją, duoti per burną (per zondą), kvėpavimo takus, intubacinį vamzdelį ar implantuoti. Visais atvejais turėtų būti pasirinktas būdas, kuris užtikrintų reikiamą tikslinio (-ių) audinio (-ių) veikimą. Injekcija į pilvo ertmę paprastai nerekomenduojama, nes tai nėra numatytas poveiko žmogui būdas ir jį reikėtų naudoti, tik, jei būtų specialiai moksliškai pagrįstas. Jei bandomoji cheminė medžiaga įmaišoma į pašarą ar į geriamąjį vandenį, ypač vienkartinio dozavimo atveju, reikėtų imtis priemonių, kad laiko tarpas nuo maisto bei vandens vartojimo iki ėminių ėmimo būtų pakankamas poveikiui aptikti (žr. 37 pastraipą). Skysčio, kurį galima duoti per zondą arba įšvirkšti per vieną kartą, maksimalus tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti ne daugiau kaip po 2 ml/100 g kūno masės. Didesnio nei šis tūrio naudojimą reikėtų pagrįsti. Išskyrus dirginančias ar ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukeltų sunkinantį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kuo mažesnis reguliuojant koncentraciją, kad būtų užtikrintas visų didžių dozių tūrio pastovumas kūno masės atžvilgiu.
                     
                        Apdorojimo planas
                     
                     Pageidautina apdoroti 2 kartus arba daugiau, duodant kas 24 h, ypač kai šis bandymas įtraukiamas į kitus toksiškumo tyrimus. Arba galima apdoroti duodant vieną kartą, jei tai būtų moksliškai pagrįsta (pvz., žinoma, kad bandomosios cheminės medžiagos stabdo ląstelių ciklą). Bandomąsias chemines medžiagas galima duoti kaip padalytą dozę (t. y. siekiant palengvinti didelių tūrių davimą, per vieną dieną apdorojama du kartus arba daugiau, tarp apdorojimų esant ne ilgesniam kaip 2–3 h tarpui). Šiomis aplinkybėmis arba tais atvejais, kai bandomoji cheminė medžiaga duodama ją įkvepiant, ėminių ėmimo tvarkaraštį reikėtų sudaryti atsižvelgiant į paskutinės dozės davimo arba veikimo pabaigos laiką.
                     Bandymą su pelėmis arba žiurkėmis galima atlikti vienu iš trijų būdų:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga vieną kartą. Kaulų čiulpų ėminiai imami ne mažiau kaip du kartus (iš nepriklausomų gyvūnų grupių), pirmą kartą imant ne anksčiau kaip 24 h po apdorojimo, bet ne vėliau kaip 48 h po apdorojimo, esant atitinkamam (-iems) laiko tarpui (-ams) tarp ėminių, nebent būtų žinoma, kad bandomosios cheminės medžiagos pusėjimo trukmė yra labai didelė. Jei ėminiai imami anksčiau nei praėjus 24 h po apdorojimo, tai reikėtų pagrįsti. Periferinio kraujo ėminiai imami ne mažiau kaip du kartus (iš tos pačios gyvūnų grupės), pirmą kartą imant ne anksčiau kaip 36 h po apdorojimo, bet ne vėliau kaip 72 h po apdorojimo, esant atitinkamam (-iems) laiko tarpui (-ams) po pirmojo ėminio paėmimo. Imant ėminį pirmą kartą visos dozių grupės turėtų būti apdorotos ir ėminiai paimti analizei, tačiau, imant ėminį kitą (-us) kartą (-us), reikia duoti tik didžiausią dozę. Kai kurį nors kartą imant ėminį aptinkamas teigiamas atsakas, papildomų ėminių imti nereikia, nebent reikia gauti kiekybinę dozės ir atsako priklausomybės informaciją. Aprašyti ėminių surinkimo laikai yra mikrobranduolių atsiradimo ir išnykimo šiuose 2 audinių dalyse kinetikos rezultatas.
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 Jei apdorojama du kartus kas parą (pvz., apdorojama du kartus kas 24 h), kaulų čiulpų ėminiai turėtų būti surenkami vieną kartą, nuo galutinio apdorojimo praėjus nuo 18 iki 24 h, periferinio kraujo ėminiai surenkami vieną kartą, nuo galutinio apdorojimo praėjus nuo 36 iki 48 h (30). Aprašyti ėminių surinkimo laikai yra mikrobranduolių atsiradimo ir išnykimo šiuose 2 audinių dalyse kinetikos rezultatas.
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 Jei kas parą apdorojama tris ir daugiau kartų (pvz., apdorojama tris kartus arba daugiau maždaug kas 24 h), kaulų čiulpų ėminiai turėtų būti surenkami nuo paskutinio apdorojimo praėjus ne daugiau kaip 24 h, periferinio kraujo ėminiai turėtų būti surenkami nuo paskutinio apdorojimo praėjus ne daugiau kaip 40 h (31). Ši apdorojimo pasirinktis leidžia suderinti kometų bandymą (pvz., imant ėminius 2–6 h po paskutinio apdorojimo) su mikrobranduolių bandymu ir sujungti mikrobranduolių bandymą su kartotinės dozės toksiškumo tyrimais. Sukaupti duomenys parodė, kad mikrobranduolių indukciją galima stebėti šiuo ilgesniu laikotarpiu, kai dozė duodama 3 ir daugiau kartų (15).
                              
                           Galima naudoti kitas dozavimo ar ėminių ėmimo schemas, siekiant palengvinti sujungimą su kitais toksiškumo bandymais, jei jos būtų tinkamos ir moksliškai pagrįstos.
                     
                        Stebėjimai
                     
                     Reikėtų atlikti bendruosius bandymo gyvūnų klinikinius stebėjimus ir bent kartą per dieną registruoti klinikinius požymius, pageidautina kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Mažiausiai du kartus per dieną, siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius, dozavimo laikotarpiu visus gyvūnus reikėtų apžiūrėti. Visi gyvūnai turėtų būti sveriami tyrimo pradžioje, bent kartą per savaitę kartotinės dozės tyrimų metu ir numarinant. Jei tyrimai atliekami ne trumpiau kaip vieną savaitę, bent kartą per savaitę reikėtų matuoti pašaro suvartojimą. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiekį reikėtų išmatuoti kaskart, kai vanduo keičiamas, ir bent kartą per savaitę. Gyvūnus, kuriems pasireiškia nemirtini pernelyg didelio toksiškumo požymiai, reikėtų humaniškai numarinti iki bandymo laikotarpio pabaigos (28). Tam tikromis aplinkybėmis būtų galima kontroliuoti gyvūnų kūno temperatūrą, nes apdorojimo sukelta hipertermija ir hipotermija prisidėjo gaunant klaidingus rezultatus (32) (33) (34).
                     
                        Tikslinio audinio veikimas
                     
                     Reikiamu laiku vieną ar kelis kartus reikėtų paimti kraujo ėminį bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijai plazmoje nustatyti, siekiant įsitikinti, ar kaulų čiulpai buvo paveikti, jei reikalaujama ir jei nėra kitų poveikio duomenų (žr. 48 pastraipą).
                     
                        Kaulų čiulpų ar kraujo paruošimas
                     
                     Kaulų čiulpų ląstelės gaunamos iš gyvūnų šlaunikaulių ar blauzdikaulių iš karto po humaniško numarinimo. Paprastai ląstelės yra išskiriamos, paruošiamos ir dažomos nustatytais būdais. Maži periferinio kraujo tūriai gali būti gauti pagal atitinkamus gyvūnų gerovės reikalavimus, taikant metodą, kuris užtikrintų bandymų gyvūno išgyvenamumą, pvz., imant kraują iš uodeginės venos ar kito tinkamo kraujo indo, atliekant širdies punkciją ar imant ėminį iš didelio kraujo indo gyvūną numarinus. Atsižvelgiant į analizės metodą, kaulų čiulpų ar iš periferinio kraujo gautų eritrocitų ląstelės gali būti nedelsiant supravitaliai dažomos (16) (17) (18), daromi tepinėliai ir tada dažomi mikroskopijai arba fiksuojami ir tinkamai dažomi tėkmės citometrinei analizei atlikti. Naudojant DNR specifinius dažus, pvz., akridino oranžinį (35) ar Hoechst 33258 ir pironiną Y (36), galima pašalinti kai kuriuos artefaktus, susijusius su DNR atžvilgiu nespecifinių dažų naudojimu. Šis privalumas netrukdo naudoti įprastinių dažų (pvz., Giemsa dažus mikroskopinei analizei atlikti). Taip pat galima naudoti papildomas sistemas (pvz., celiulioze užpildytas kolonėles, skirtas branduolius turinčioms ląstelėms pašalinti (37) (38)), jei būtų įrodyta, kad šios sistemos yra suderinamos su ėminių paruošimu laboratorijoje.
                     Jei taikomi šie metodai, mikrobranduolių tipui identifikuoti (chromosomų ar chromosomų fragmentų), kad būtų galima nustatyti, ar mikrobranduolių indukcijos mechanizmas susijęs su klastogeniniu ir (arba) aneugeniniu aktyvumu, gali būti naudojami antikinetochoro antikūnai (39), FISH analizė ir pancentromeriniai DNR zondai (40) arba in situ ženklinimas pancentromerų specifiniais užpildais kartu su atitinkamu DNR priešpriešiniu dažymu (41). Gali būti taikomi kiti metodai klastogenams ir aneugenams atskirti, jei jie pasirodytų efektyvūs.
                     
                        Analizė (rankiniu būdu ir automatizuota)
                     
                     Prieš atliekant bet kurio tipo analizę visi objektiniai stikleliai ar ėminiai, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius ėminius, turėtų būti nepriklausomai užkoduoti ir randomizuoti, kad skaičiuotojas rankiniu būdu nežinotų apdorojimo sąlygų; toks kodavimas nebūtinas, kai naudojamos automatizuotos skaičiavimo sistemos, kurios nepriklauso nuo vizualios apžiūros ir negali būti paveiktos veiklos vykdytojo šališkumo. Nustatomas kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų kiekis kaip visų eritrocitų (subrendusių ir nesubrendusių) skaičiaus dalis, suskaičiuojant ne mažiau kaip 500 kaulų čiulpų eritrocitų ir 2 000 periferinio kraujo eritrocitų (42). Reikėtų suskaičiuoti ne mažiau kaip 4 000 nesubrendusių eritrocitų vienam gyvūnui, kad būtų galima nustatyti nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą (43). Jei istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazė rodo, kad bandymo laboratorijos vidutinis foninis nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumas yra < 0,1 %, reikėtų atsižvelgti į galimybę skaičiuoti papildomas ląsteles. Analizuojant ėminius, apdorotų gyvūnų nesubrendusių eritrocitų dalis visų eritrocitų atžvilgiu neturėtų būti mažesnė kaip 20 % nešiklio ar tirpiklio kontrolinių ėminių dalies, kai skaičiuojama mikroskopu, ir ne mažesnė kaip maždaug 5 % nešiklio ar tirpiklio kontrolinių ėminių dalies, kai CD71+ nesubrendę eritrocitai skaičiuojami citometriniais metodais (žr. 31 pastraipą) (29). Pvz., jei atliekant kaulų čiulpų tyrimą mikroskopu, kontrolinio ėminio kaulų čiulpų nesubrendusių eritrocitų dalis yra 50 %, viršutinė toksiškumo riba būtų 10 % nesubrendusių eritrocitų.
                     Kadangi žiurkių blužnis atskiria ir suardo eritrocitus su mikrobranduoliais, siekiant užtikrinti didelį tyrimo jautrį, kai analizuojamas žiurkių periferinis kraujas, atliekant nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais analizę pageidautina apsiriboti jauniausia frakcija. Kai taikomi automatizuotos analizės metodai, šiuos labiausiai nesubrendusius eritrocitus galima nustatyti pagal jų didelį RNR kiekį arba jų paviršiuje ekspresuotų transferino receptorių (CD71+) didelį lygį (31). Tačiau tiesioginis daugelio dažymo būdų palyginimas parodė, kad priimtinus rezultatus galima gauti taikant įvairius būdus, įskaitant įprastinį dažymą akridino oranžiniu (3) (4).
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     Kiekvienam gyvūnui gauti rezultatai turėtų būti pateikiami lentelėse. Turėtų būti atskirai įrašytas kiekvieno tirto gyvūno suskaičiuotų nesubrendusių eritrocitų skaičius, nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais skaičius bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis. Kai pelės apdorojamos nuolat 4 savaites ar ilgiau, taip pat reikėtų pateikti subrendusių eritrocitų skaičiaus ir subrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dalies duomenis, jei renkami. Ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti toksiškumo gyvūnams ir klinikinių požymių duomenis.
                     
                        Priimtinumo kriterijai
                     
                     Apie bandymo priimtinumą sprendžiama pagal šiuos kriterijus:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys laikomas tinkamu įtraukti į laboratorijos istorinių kontrolinių duomenų bazę (žr. 15-18 pastraipas);
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai arba skaičiavimo kontroliniai ėminiai turėtų sukelti atsakus, kurie būtų suderinami su rastais istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 24–25 pastraipas);
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 atlikta reikiamo dozių ir ląstelių skaičiaus analizė;
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 didžiausios dozės pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 30–33 pastraipose.
                              
                           
                        Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas
                     
                     Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 bent viena iš apdorotų grupių rodo statistiškai reikšmingą nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumo padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 šis padidėjimas bent vienam ėminio ėmimo laikui yra susijęs su doze, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų, ir
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų).
                              
                           Jei tam tikru ėminio ėmimo laiku tiriama tik didžiausia dozė, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei yra statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, o rezultatai yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų). Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (44) (45) (46) (47). Atliekant dozės ir atsako priklausomybės analizę, reikėtų analizuoti ne mažiau kaip tris dozę gavusias grupes. Statistiniai kriterijai turėtų naudoti gyvūną kaip bandymo vienetą. Atliekant mikrobranduolių bandymą gauti teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukelia mažųjų branduolių atsiradimą dėl bandymo rūšies gyvūnų chromosomų ar eritroblastų mitozinio aparato pažeidimų. Jei bandymas atliekamas centromeroms mikrobranduoliuose aptikti, bandomoji cheminė medžiaga, kuri gamina centromeras turinčius mikrobranduolius (centromeros DNR ar kinetochoras, kurie rodo ištisos chromosomos praradimą), akivaizdžiai yra aneugenas.
                     Jei įvykdomi visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 nei viena apdorota grupė nerodo statistiškai reikšmingo nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumo padidėjimo palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 nėra su doze susijusio padidėjimo bet kuriuo ėminių ėmimo laiku, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų) ir
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 kaulų čiulpai paveikti bandomąja (-osioms) chemine (-ėms) medžiaga (-oms).
                              
                           Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų galima rasti literatūroje (44) (45) (46) (47). Kaulų čiulpų paveikimo bandomąja chemine medžiaga įrodymu gali būti nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykio sumažėjimas arba bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių plazmoje ar kraujyje matavimas. Jei cheminė medžiaga leidžiama į veną, poveikio įrodyti nebūtina. Siekiant įrodyti, kad kaulų čiulpai buvo paveikti, taip pat galima naudoti ADME (absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo, šalinimo) duomenis, gautus atliekant nepriklausomą tyrimą, kuriame būtų naudojamas tas pats davimo būdas ir ta pati rūšis. Neigiami rezultatai rodo, kad bandymo sąlygomis bandomoji cheminė medžiaga nesukelia mažųjų branduolių atsiradimo bandymo rūšies gyvūnų nesubrendusiuose eritrocituose.
                     Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.
                     Tais atvejais, kai atsakas nėra aiškiai neigiamas ar teigiamas, ir siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą (pvz., mažas ar fono padidėjimas), duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus baigtų bandymų tyrimus. Kai kuriais atvejais galėtų būti naudinga analizuoti didesnį ląstelių skaičių arba pakartoti bandymą, naudojant modifikuotas bandymo sąlygas.
                     Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, duomenų nepakaks padaryti išvadą, ar bandomajai cheminei medžiagai gauti rezultatai yra teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad tyrimas yra dviprasmis.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Santrauka
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kilmė, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vienkomponentė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             nešiklio pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje ar nešiklyje ir stabilumas, jei yra žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             preparatų su pašarais, geriamuoju vandeniu arba inhaliacinių preparatų ruošimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             preparatų analizinis nustatymas (pvz., stabilumo, vienalytiškumo, nominalių koncentracijos verčių), kai atliekamas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo gyvūnai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             rūšis ir (arba) veislė ir jų pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kilmė, laikymo sąlygos, pašaras ir kt.,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų unikalaus identifikavimo būdas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje, atliekant trumpalaikius tyrimus; kiekvieno gyvūno masė bandymo eigoje ir pašaro suvartojimas, atliekant ilgesnius nei savaitės trukmės bandymus. Reikėtų įtraukti kiekvienos grupės kūno masės intervalą, vidurkį ir standartinį nuokrypį.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių (tirpiklio ir (arba) nešiklio) duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             intervalo nustatymo tyrimo, jei atliekamas, duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             davimo būdo ir trukmės pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tikrinimo, ar bandomoji (-osios) cheminė (-ės) medžiaga (-os) pateko į kraujotakos sistemą ar tikslinį audinį, metodai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             faktinė dozė (mg/kg kūno masės per parą), apskaičiuota pagal bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją pašaruose ir (arba) geriamajame vandenyje (ppm) ir suvartojimą, jei tinka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             numarinimo metodas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nuskausminimo metodas (jei taikomas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsamus apdorojimo ir ėminių ėmimo tvarkaraščio aprašymas, pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             objektinių stiklelių paruošimo metodai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ėminių izoliavimo ir konservavimo procedūros;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             toksiškumo matavimo metodai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais skaičiavimo kriterijai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analizuotų ląstelių skaičius vienam gyvūnui, nustatant nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais dažnumą bei nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų santykį;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tyrimo priimtinumo kriterijai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metodai, pvz., antikinetochoro antikūnų ar centromerų specifinių DNR zondų naudojimas, kurie apibūdintų, ar mikrobranduolys turi ištisą chromosomą ar jos fragmentą, jei taikomi.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų būklė prieš bandymą ir visą bandymo laikotarpį, įskaitant toksiškumo požymius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nesubrendusių ir subrendusių eritrocitų skaičiaus santykis,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno gyvūno nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais skaičius,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nesubrendusių eritrocitų su mikrobranduoliais grupės vidurkis ± standartinis nuokrypis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dozės ir atsako priklausomybė, jei įmanoma nustatyti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             statistinės analizės duomenys ir taikyti metodai.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio ir teigiamo kontrolinio ėminio duomenys, nurodant intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             istorinių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių duomenys, intervalai, vidurkiai, standartiniai nuokrypiai ir skirstinio 95 % kontrolinės ribos, taip pat aprėptas laikotarpis ir duomenų taškų skaičius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kaulų čiulpų poveikio patvirtinimo duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             apibūdinimo duomenys, kurie rodo, ar mikrobranduolys turi ištisą chromosomą ar jos fragmentą, jei tinka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             atitikti teigiamo ar neigiamo atsako kriterijai.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvada.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nuorodos.
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10-30.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92-107.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83-91.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139-145.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65-73.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149-154.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153-155.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187-190.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9-15.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61-118.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555-558.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513-522.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245-249.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83-98.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153-159.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239-273.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45-50.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419-424.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84-100.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-120.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222-228.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/– 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313-319.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234-252.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79-83.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7-14.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120-127.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91-104.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121-126.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411-415.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99-104.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97-99.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays“, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays“, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49-52.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233-241.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Centromera
                           – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Eritroblastas
                           – ankstyvoji eritrocitų vystymosi stadija, prieš pat nesubrendusių eritrocitų stadiją, kai ląstelė dar turi branduolį.
                        
                           
                              Kinetochoras
                           – ant eukariotinių lastelių centromeros susidaranti baltyminė struktūra, kuri mitozės ir mejozės metu sujungia chromosomą su mitozinės verpstės mikrovamzdelių polimerais ir dalijantis ląstelėms veikia kaip dukterinių chromatidžių atstūmimo vieną nuo kitos priemonė.
                        
                           
                              Mikrobranduoliai
                           – nuo ląstelių pagrindinių branduolių atskirti papildomi maži branduoliai, susidarę mitozės (mejozės) telofazėje, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos lėtai juda link ląstelės polių.
                        
                           
                              Normochrominis ar subrendęs eritrocitas
                           – visiškai subrendęs eritrocitas, pametęs po enukleacijos likusias RNR ir (arba) kitus trumpalaikius ląstelių žymeklius, kurie jiems būdingu būdu išnyksta po enukleacijos, vykstančios po galutinio eritroblasto dalijimosi.
                        
                           
                              Polichrominis ar nesubrendęs eritrocitas
                           – naujai susidaręs tarpinėje vystymosi stadijoje esantis eritrocitas, kuris nusidažo klasikinių kraujo dažų, pvz., Wright Giemsa, mėlynuoju ir raudonuoju komponentais dėl liekamųjų RNR buvimo naujai susidariusioje ląstelėje. Tokios naujai susidariusios ląstelės yra maždaug tas pats kaip retikulocitai, kurios vizualizuojamos naudojant vitalinį dažą, sukeliantį liekamųjų ląstelių RNR sulipimą į būdingą tinklą. Šiuo metu dažnai taikomi kiti naujai susidariusių raudonųjų kraujo ląstelių identifikavimo metodai, įskaitant RNR monochrominį dažymą fluorescenciniais dažais arba trumpalaikių paviršinių žymeklių, pvz., CD71, ženklinimą fluorescuojančiais antikūnais. Polichrominiai eritrocitai, retikulocitai ir CD71 teigiami eritrocitai yra nesubrendę eritrocitai, nors kiekvienas iš jų kažkiek skiriasi amžiaus pasiskirstymu.
                        
                           
                              Retikulocitas
                           – naujai susidaręs eritrocitas, dažytas vitaliniu dažu, kuris sukelia liekamųjų ląstelių RNR sulipimą į būdingą tinklą. Retikulocitų ir polichrominių eritrocitų ląstelių amžiaus pasiskirstymas yra panašus.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           FAKTORINĖS ANALIZĖS CHEMA LYČIŲ SKIRTUMAMS NUSTATYTI ATLIEKANT MIKROBRANDUOLIŲ TYRIMĄ IN VIVO
                           
                        
                        
                           Faktorinės analizės schema ir jos taikymas
                        
                        Pagal šią schemą kiekvienai koncentracijos vertei bandomi ne mažiau kaip 5 patinai ir 5 patelės, iš viso pagal schemą naudojant ne mažiau kaip 40 gyvūnų (20 patinų ir 20 patelių ir dar atitinkami teigiami kontroliniai ėminiai).
                        Schema, kuri yra viena iš paprastesnių faktorinės analizės schemų, atitinka dvifaktorinės dispersinės analizės schemą, kurios pagrindiniai veiksniai yra lytis ir koncentracijos vertė. Duomenis galima analizuoti naudojant daug standartinių statistinės programinės įrangos rinkinių, pvz., SPSS, SAS, STATA, Genstat taip pat naudojant programavimo kalbą R.
                        Atliekant analizę, duomenų rinkinio kintamumas perdalijamas į kintamumą tarp lyčių, tarp koncentracijos verčių ir į kintamumą, susijusį su sąveika tarp lyčių ir koncentracijos verčių. Kiekvienas iš narių tikrinamas tos pačios lyties kartotinių gyvūnų kintamumo grupių viduje įverčio atžvilgiu, esant vienodai koncentracijai. Išsami informacija apie bazinę metodiką pateikta daugelyje standartinių statistinių vadovėlių (žr. nuorodas) ir su statistiniai rinkiniais pateikiamose pagalbinėse priemonėse.
                        Analizė tęsiama tikrinant ANOVA lentelės x lyties ir koncentracijos sąveikos narį (6). Nesant reikšmingo sąveikos nario, lytims ar koncentracijos vertėms gautos jungtinės vertės duoda patikimus statistinius kriterijus tarp koncentracijos verčių, pagrįstus grupės jungtiniu ANOVA kintamumo nariu.
                        Atliekant analizę toliau, kintamumo tarp koncentracijos verčių įvertis dalijamas į kontrastus, taip gaunamas atsakų pagal koncentracijos vertes tiesinių ir kvadratinių kontrastų kriterijus. Kai yra reikšminga x lyties ir koncentracijos sąveika, šį narį taip pat galima padalyti į tiesinius x lyties ir kvadratinius x lyties sąveikos kontrastus. Šie nariai pateikia kriterijus, ar abiejų lyčių atsakas į koncentraciją yra lygiagretus, ar abiejų lyčių atsakas yra skirtuminis.
                        Grupės jungtinio kintamumo įvertis gali būti naudojamas skirtumų tarp vidurkių poriniams kriterijams gauti. Galima lyginti abiejų lyčių vidurkius ir skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius, pvz., palyginimui su neigiamų kontrolinių ėminių vidurkiais. Jei sąveika yra reikšminga, galima lyginti vienos lyties skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius ir vienos koncentracijos lytims gautus vidurkius.
                        
                           Nuorodos
                        
                        Yra daug statistikos vadovėlių, kuriuose aptariama faktorinės analizės schemų teorija, projektavimas, metodika, analizė ir aiškinimas, kurios varijuoja nuo paprasčiausios dvifaktorinės analizės iki „bandymų planavimo“ metodikoje naudojamų sudėtingesnių formų. Toliau pateikiamas sąrašas nėra išsamus. Kai kuriose knygose pateikiami palyginamųjų schemų pavyzdžiai su skaičiavimais, kartais su kompiuterine programa analizei atlikti naudojant įvairius programinės įrangos rinkinius.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     6)
                  
                  
                     B dalies B.15 skyrius išbraukiamas.
                  
               
                     7)
                  
                  
                     B dalies B.16 skyrius išbraukiamas.
                  
               
                     8)
                  
                  
                     B dalies B.18 skyrius išbraukiamas.
                  
               
                     9)
                  
                  
                     B dalies B.19 skyrius išbraukiamas.
                  
               
                     10)
                  
                  
                     B dalies B.20 skyrius išbraukiamas.
                  
               
                     11)
                  
                  
                     B dalies B.24 skyrius išbraukiamas.
                  
               
                     12)
                  
                  
                     B dalies B.47 skyrius pakeičiamas taip:
                     „B.47   Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) 437 (2013). Galvijų ragenos drumstumo ir pralaidumo (angl. Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) bandymo metodą 2006 m. ir 2010 m. įvertino Alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybinio koordinavimo komitetas (angl. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) kartu su Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) ir Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) (1)(2). Atliekant pirmąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar BCOP bandymo metodas tinka nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (1). Atliekant antrąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar BCOP bandymų metodas tinka nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios neklasifikuojamos kaip dirginančios akis ar sukeliančios smarkų akių pažeidimą (2). BCOP tinkamumo patvirtinimo duomenų bazę iš viso sudarė 113 medžiagų ir 100 mišinių (2)(3). Atsižvelgiant į šiuos įvertinimus ir jų ekspertizę buvo padaryta išvada, kad taikant bandymų metodą galima tinkamai identifikuoti chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), sukeliančias smarkų akių pažeidimą (1 kategorijos), taip pat medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (4) ir Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (7), todėl jis buvo patvirtintas kaip moksliškai tinkamas abiem tikslams. Smarkus akių pažeidimas – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kuris ne visiškai praeina per 21 dieną nuo uždėjimo. Bandomosios cheminės medžiagos, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą, pagal JT GHS klasifikuojamos kaip 1 kategorijos medžiagos. Cheminės medžiagos, neklasifikuojamos kaip dirginančios akis ar sukeliančios smarkų akių pažeidimą, apibrėžiamos kaip medžiagos, kurios neatitinka JT GHS 1 ar 2 kategorijos (2A ar 2B) klasifikavimo reikalavimų, t. y. jos nurodomos kaip JT GHS be kategorijos. Į šį bandymų metodą įtrauktas BCOP bandymų metodo rekomenduojamas taikymas ir apribojimai, pagrįsti jo įvertinimo darbais. Pagrindiniai skirtumai tarp EBPO bandymų gairių originalios 2009 m. versijos ir atnaujintos 2013 m. versijos yra susiję su šiais dalykais (tačiau ne tik): BCOP metodo taikymas nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti pagal JT GHS (2 ir 7 pastraipos); pateikti paaiškinimai dėl BCOP bandymo metodo taikomumo bandant alkoholius, ketonus ir kietąsias medžiagas (6 ir 7 pastraipos) bei medžiagas ir mišinius (8 pastraipa); paaiškinta, kaip reikėtų bandyti paviršinio aktyvumo medžiagas ir jų turinčius mišinius (28 pastraipa); atnaujintas ir paaiškintas teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas (39 ir 40 pastraipos); atnaujinti BCOP bandymų metodo sprendimo priėmimo kriterijai (47 pastraipa); atnaujinti tyrimo priimtinumo kriterijai (48 pastraipa); atnaujinti bandymo ataskaitos elementai (49 pastraipa); atnaujintos 1 priedėlio apibrėžtys; papildytas 2 priedėlis dėl BCOP bandymų metodo tinkamumo prognozėms daryti pagal skirtingas klasifikavimo sistemas; atnaujintas 3 priedėlio kvalifikacijai tikrinti naudojamų cheminių medžiagų sąrašas ir atnaujintas 4 priedėlis dėl BCOP ragenos laikiklio (1 pastraipa) ir drumstumo matuoklio (2 ir 3 pastraipos).
                     Šiuo metu visuotinai pripažįstama, kad artimiausioje ateityje joks vienas in vitro akių dirginimo bandymas negalės pakeisti Draize akių bandymo in vivo siekiant prognozuoti skirtingų cheminių klasių visą dirginimo gebos intervalą. Tačiau kelių alternatyvių bandymų metodų strateginiai deriniai taikant (nuosekliųjų) bandymų strategiją galėtų pakeisti Draize akių bandymą (5). Žemynkryptis metodas (5) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida apie didelę cheminės medžiagos dirginamojo poveikio gebą, o aukštynkryptis metodas (5) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida, kad cheminė medžiaga nepakankamai dirgina akis, kad ją reikėtų klasifikuoti. BCOP bandymų metodas – bandymų metodas in vitro, kuris su tam tikrais apribojimais ir tam tikromis aplinkybėmis gali būti taikomas klasifikuoti ir ženklinti cheminėms medžiagoms, keliančioms pavojų akims. Nors kaip atskiras metodas BCOP metodas nelaikomas tinkamu pakeisti triušių akių bandymą in vivo, jis rekomenduojamas kaip pirmas bandymų strategijos etapas, pvz., žemynkryptis metodas, pasiūlytas Scott et al. (5), be papildomų bandymų nustatant chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagas (4). BCOP bandymų metodas taip pat rekomenduojamas, kai reikia identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančias akis ar sukeliančias smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta JT GHS (JT GHS be kategorijos) (4), taikant bandymų strategiją, pvz., aukštynkryptį metodą (5). Tačiau cheminė medžiaga, kuri pagal BCOP bandymų metodą nelaikoma galinčia sukelti smarkų akių pažeidimą arba neklasifikuojama dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo, turėtų būti bandoma papildomai (in vitro ir (arba) in vivo) galutinei klasifikavimo kategorijai nustatyti.
                     Šio bandymo metodo tikslas – aprašyti procedūras, taikomas įvertinant bandomosios cheminės medžiagos keliamo pavojaus akims galimybę, matuojant jos gebą sukelti atskirai paimtos galvijo ragenos drumstumą ir padidėjusį pralaidumą. Toksinis poveikis ragenai vertinamas pagal: (i) sumažėjusį šviesos pralaidumą (drumstumą) ir ii) padidėjusią fluoresceino natrio druskos dažiklio skverbtį (pralaidumą). Bandomąja chemine medžiaga paveiktos ragenos drumstumo ir pralaidumo vertinimo rezultatai bendrinami, kad būtų gautas in vitro dirginimo balas (angl. In Vitro Irritancy Score, IVIS), kuris naudojamas bandomosios cheminės medžiagos dirginimo gebos lygiui klasifikuoti.
                     Apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                     Šis bandymų metodas pagrįstas ICCVAM BCOP bandymo metodo protokolu (6)(7), kuris iš pradžių buvo sukurtas pagal informaciją, gautą iš In vitro bandymų metodų instituto (angl. Institute for In Vitro Sciences, IIVS) protokolo ir iš INVITTOX protokolo Nr. 124 (8). Pastarasis atitinka protokolą (10), kuris buvo naudojamas 1997–1998 m. atliekant Europos bendrijos finansuotą preliminaraus patvirtinimo tyrimą. Abu šie protokolai buvo pagrįsti BCOP bandymų metodu, kurį pirmasis paskelbė Gautheron et al. (9).
                     BCOP bandymų metodas gali būti taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą, kaip apibrėžta JT GHS, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia priskirti JT GHS 1 kategorijai (4). Kai taikomas šiuo tikslu, BCOP bandymų metodo visuminis tikslumas – 79 % (150/191), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 25 % (32/126), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 14 % (9/65), palyginti su triušio akies bandymo metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (3) (žr. 2 priedėlio 1 lentelę). Kai tam tikrų cheminių (t. y. alkoholių, ketonų) ar fizikinių (t. y. kietųjų medžiagų) klasių bandomosios cheminės medžiagos pašalinamos iš duomenų bazės, BCOP bandymo metodo bendras tikslumas pagal JT GHS klasifikavimo sistemą siekia 85 % (111/131), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 20 % (16/81), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 8 % (4/50) (3). Galimi BCOP bandymo metodo trūkumai, kai jis taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorijos), susiję su didele klaidingai teigiamų rezultatų dalimi bandant alkoholius bei ketonus ir didele klaidingai neigiamų rezultatų dalimi bandant kietąsias medžiagas, kaip nurodyta tinkamumo patvirtinimo duomenų bazėje (1)(2)(3). Tačiau kadangi taikant BCOP bandymų metodą neteisingai įvertinami ne visi alkoholiai ar ketonai, o kai kurie tiksliai nustatomi kaip JT GHS 1 kategorijos, šios dvi organinės funkcinės grupės nelaikomos nepatenkančiomis į bandymo metodo taikymo sritį. Šio bandymo metodo naudotojas turi nuspręsti, ar galimas alkoholio arba ketono pervertinimas yra priimtinas ar reikia atlikti papildomus bandymus taikant įrodomosios duomenų galios metodą. Kalbant apie klaidingai neigiamų rezultatų dalį, reikėtų pažymėti, kad atliekant kietųjų medžiagų Draize akių dirginimo bandymą in vivo, gali susidaryti kintamos ir ribinės veikimo sąlygos, todėl gali būti gautos netinkamos jų tikrosios dirginamosios gebos prognozės (10). Taip pat reikėtų pažymėti, kad, identifikuojant chemines medžiagas, sukeliančias smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorijos), nė vienai ICCVAM tinkamumo įvertinimo duomenų bazėje (2)(3) nurodytai klaidingai neigiamai cheminei medžiagai nebuvo gauta IVIS ≤ 3 vertė, kuri naudojama kaip kriterijus cheminę medžiagą identifikuojant kaip JT GHS be kategorijos. Be to, BCOP klaidingai neigiamas rezultatas šiame kontekste esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunama 3 < IVIS ≤ 55 vertė, vėliau būtų bandomos atliekant tinkamai patvirtintus bandymus in vitro arba, blogiausiu atveju, atliekant bandymą su triušiais pagal įrodomosios duomenų galios metodą taikant nuosekliųjų bandymų strategiją. Kadangi taikant BCOP bandymų metodą kai kurios kietosios medžiagos yra tiksliai nustatomos kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagos, ši agregatinė būsena taip pat nelaikoma nepatenkančia į bandymo metodo taikymo sritį. Tyrėjai galėtų spręsti, ar taikyti šį bandymų metodą visų tipų cheminėms medžiagoms, o IVIS > 55 turėtų būti priimta kaip smarkų akių pažeidimą sukeliančio atsako rodiklis ir cheminę medžiagą reikėtų klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos be papildomų bandymų. Tačiau, kaip buvo nurodyta pirmiau, alkoholiams ar ketonams gautus teigiamus rezultatus dėl galimo pervertinimo reikėtų aiškinti atsargiai.
                     BCOP bandymo metodą taip pat galima taikyti nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (4). Kai taikomas šiuo tikslu, BCOP bandymų metodo bendras tikslumas – 69 % (135/196), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 69 % (61/89), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 0 % (0/107) palyginti su triušio akies bandymo metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (3) (žr. 2 priedėlio 2 lentelę). Gauta klaidingai teigiamų rezultatų dalis (in vivo JT GHS be kategorijos cheminės medžiagos, kurių IVIS > 3, žr. 47 pastraipą) yra labai didelė, bet šiame kontekste ji esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunama 3 < IVIS ≤ 55 vertė, vėliau būtų bandomos atliekant tinkamai patvirtintus bandymus in vitro arba, blogiausiu atveju, atliekant bandymą su triušiais, pagal įrodomosios duomenų galios metodą taikant nuosekliųjų bandymų strategiją. BCOP bandymų metodas neturi specifinių trūkumų bandant alkoholius, ketonus ir kietąsias medžiagas, kai tikslas yra identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą (JT GHS be kategorijos) (3). Tyrėjai galėtų pamąstyti apie šio bandymo metodo taikymą visų tipų cheminėms medžiagoms, o neigiamas rezultatas (IVIS ≤ 3) turėtų būti laikomas kaip rodiklis, kad nereikia klasifikuoti (JT GHS be kategorijos). Kadangi BCOP bandymų metodu galima tiksliai identifikuoti tik 31 % cheminių medžiagų, kurių nereikia klasifikuoti kaip dirginančių akis arba sukeliančių smarkų akių pažeidimą, šis bandymų metodas neturėtų būti pirmoji pasirinktis pradedant taikyti aukštynkryptį metodą (5), jei yra kitų patvirtintų ir priimtų panašaus didelio jautrumo ir dar didesnio specifiškumo in vitro metodų.
                     BCOP tinkamumo patvirtinimo duomenų bazę iš viso sudarė 113 medžiagų ir 100 mišinių (2)(3). Todėl BCOP bandymų metodas laikomas tinkamu bandyti medžiagas ir mišinius.
                     BCOP bandymų metodas nerekomenduojamas, kai reikia identifikuoti bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis dirginančias (JT GHS 2 kategorija ar 2A kategorija), arba bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis nestipriai dirginančias (JT GHS 2B kategorija), dėl gana didelio skaičiaus JT GHS 1 kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai, ir JT GHS be kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai (2)(3). Šiuo tikslu gali prireikti papildomų bandymų taikant kitą tinkamą metodą.
                     Visos procedūros su galvijų akimis ir galvijų ragenomis turėtų būti atliekamos pagal bandymų laboratorijos taisykles ir procedūras, taikytinas gyvūninės kilmės medžiagoms, įskaitant audinius ir audinių skysčius, bet neapsiribojant tik jais. Rekomenduojama laikytis bendrųjų laboratorijose taikytinų atsargumo priemonių (11).
                     Nors taikant šį BCOP bandymų metodą neatsižvelgiama į akies junginės ir rainelės pažeidimus, tiriamas poveikis ragenai, kuris yra pagrindinis rodiklis, klasifikuojant in vivo pagal JT GHS klasifikavimą. Taikant BCOP bandymų metodą, ragenos pažeidimų grįžtamumas negali būti tiesiogiai įvertintas. Atsižvelgiant į triušio akies tyrimus, buvo pasiūlyta ragenos žaizdos pradinį gylį naudoti kaip galimą būdą kai kuriems negrįžtamo poveikio tipams nustatyti (12). Tačiau reikia turėti papildomų mokslinių duomenų, kad būtų galima suprasti, kaip atsiranda negrįžtamas poveikis, kuris nėra susijęs su dideliu pradinio pažeidimo lygiu. Galiausiai, taikant BCOP bandymų metodą, negalima įvertinti su poveikiu akims susijusio sisteminio toksiškumo galimybės.
                     Šis bandymų metodas bus periodiškai atnaujinamas, kai tik bus išnagrinėta nauja informacija ir duomenys. Pvz., histopatologija gali būti naudinga, kai reikia išsamiau apibūdinti ragenos pažeidimus. Kaip aprašyta EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 160 (13), naudotojai skatinami konservuoti ragenas ir ruošti histopatologinius bandinius, kuriuos galima naudoti kuriant duomenų bazę ir sprendimo priėmimo kriterijus, galinčius pagerinti šio bandymų metodo tikslumą.
                     Kiekviena laboratorija, kuri pradėtų taikyti šį bandymo metodą, turėtų naudoti 3 priedėlyje nurodytas kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas. Laboratorija gali naudoti šias chemines medžiagas, norėdama įrodyti savo techninę kompetenciją taikyti BCOP bandymų metodą, prieš pateikdama BCOP bandymo duomenis teisės aktuose numatytais pavojų klasifikavimo tikslais.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     BCOP bandymo metodas yra tipinis konkretaus organo tyrimo modelis, pagal kurį galima išsaugoti normalų trumpalaikį fiziologinį ir biocheminį galvijų ragenos funkcionavimą in vitro. Pagal šį bandymo metodą bandomosios cheminės medžiagos sukeltas pažeidimas nustatomas kiekybiškai įvertinant ragenos drumstumo ir pralaidumo pokyčius drumstumo matuokliu ir regimosios šviesos spektrofotometru. Abu matavimai naudojami siekiant apskaičiuoti IVIS, kuri naudojama in vitro dirginimo pavojaus klasifikavimo kategorijai nustatyti, kad būtų galima prognozuoti bandomosios cheminės medžiagos gebą dirginti akis in vivo (žr. 48 pastraipą Sprendimo priėmimo kriterijai).
                     Pagal BCOP bandymo metodą naudojamos atskirtos ragenos, paimtos iš ką tik paskerstų galvijų akių. Ragenos drumstumas kiekybiškai įvertinamas matuojant ragenos praleidžiamos šviesos kiekį. Ragenos pralaidumas kiekybiškai įvertinamas kaip per visą ragenos storį prasiskverbusio fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekis, nustatytas užpakalinės kameros terpėje. Bandomosios cheminės medžiagos uždedamos ant ragenos epitelio paviršiaus jų įdedant į ragenos laikiklio priekinę kamerą. 4 priedėlyje pateiktas ragenos laikiklio, naudojamo taikant BCOP bandymo metodą, aprašymas ir schema. Ragenų laikiklių galima įsigyti iš įvairių šaltinių arba pasidaryti.
                     
                        Galvijų akių šaltinis bei amžius ir gyvūnų rūšies pasirinkimas
                     
                     Į skerdyklas atvežti galvijai paprastai skerdžiami žmonių maistui arba kitais komerciniais tikslais. BCOP bandymo metodui skirtų ragenų šaltinis gali būti tik sveiki gyvūnai, kurie laikomi tinkamais naudoti žmonių maisto grandinėje. Kadangi galvijų masės intervalas gana didelis ir priklauso nuo veislės, amžiaus bei lyties, nėra nustatyta rekomenduojama skerdžiamo gyvūno masė.
                     Ragenų matmenys gali skirtis dėl gyvūnų amžiaus skirtumo. Ragenos, kurių horizontalus skersmuo > 30,5 mm ir ragenos storio per vidurį vertės ≥ 1 100 μm, paprastai gaunamos iš senesnių kaip aštuonerių metų galvijų, o ragenos, kurių horizontalus skersmuo < 28,5 mm ir ragenos storis per vidurį < 900 μm, paprastai gaunamos iš jaunesnių kaip penkerių metų galvijų (14). Dėl šios priežasties senesnių kaip 60 mėnesių galvijų akys paprastai nenaudojamos. Jaunesnių kaip 12 mėnesių galvijų akys paprastai nenaudojamos, nes jos vis dar vystosi, o jų ragenos storis ir skersmuo yra gerokai mažesni nei suaugusių galvijų. Tačiau jaunų gyvūnų (t. y. 6–12 mėnesių) ragenas naudoti leidžiama, nes jų naudojimas turi tam tikrų pranašumų, pvz., jų lengviau gauti, amžiaus intervalas yra nedidelis ir yra mažiau pavojų, susijusių su galimu galvijų spongiforminės encefalopatijos poveikiu darbuotojams (15). Kadangi būtų naudinga papildomai įvertinti ragenos matmenų arba storio įtaką atsako į ėsdinančias ir dirginančias chemines medžiagas jautriui, naudotojai prašomi pateikti duomenis apie gyvūnų, iš kurių gautos per tyrimą naudotos ragenos, apytikrį amžių ir (arba) masę.
                     
                        Akių paėmimas ir transportavimas į laboratoriją
                     
                     Akis surenka skerdyklų darbuotojai. Siekiant, kad mechaninis ir kitoks akių pažeidimas būtų kuo mažesnis, jas iš paskersto gyvulio reikėtų išimti kiek įmanoma greičiau, nedelsiant atšaldyti ir atšaldytas vežti. Skerdyklų darbuotojai neturėtų naudoti valiklių gyvulio galvai nuplauti, kad į akis nepatektų galinčių dirginti cheminių medžiagų.
                     Akis reikėtų visiškai panardinti į atvėsintą Hankso subalansuotą druskos tirpalą (angl. Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS), supiltą į tinkamo dydžio talpyklą, ir į laboratoriją jos turėtų būti vežamos taip, kad būtų kuo mažiau pažeistos ir (arba) užkrėstos bakterijomis. Kadangi akys imamos skerdžiant, jos gali būti išteptos krauju ir kitomis biologinėmis medžiagomis, įskaitant bakterijas ir kitus mikroorganizmus. Todėl svarbu užtikrinti kuo mažesnį užkrėtimo pavojų (pvz., surenkant ir vežant indą su akimis laikyti ant drėgno ledo ir į joms vežti naudojamą HBSS tirpalą įdėti antibiotikų, pvz., 100 IU/ml penicilino ir 100 μg/ml streptomicino).
                     Laiko tarpas nuo akių surinkimo iki ragenų panaudojimo taikant BCOP bandymų metodą turėtų būti kuo trumpesnis (paprastai jos surenkamos ir naudojamos tą pačią dieną) ir reikėtų įrodyti, kad dėl to neigiamos įtakos tyrimo rezultatams nepadaryta. Šie rezultatai yra pagrįsti akių atrankos kriterijais ir teigiamų bei neigiamų kontrolinių ėminių atsaku. Visos tyrimui naudojamos akys turėtų būti iš tos pačios tam tikrą dieną surinktų akių grupės.
                     
                        Taikant BCOP bandymo metodą naudojamų akių atrankos kriterijai
                     
                     Į laboratoriją atvežtos akys atidžiai apžiūrimos, ar jos neturi defektų, įskaitant padidėjusį drumstumą, įbrėžimus ir neovaskuliarizaciją. Turėtų būti naudojamos tik tokių defektų neturinčių akių ragenos.
                     Be to, kiekvienos ragenos kokybė įvertinama vėlesniais tyrimo etapais. Ragenos, kurių drumstumas po pradinio vienos valandos trukmės pusiausvirinimo laikotarpio yra didesnis kaip septyni drumstumo vienetai arba lygiavertis, naudojant kitą drumstumo matuoklį ir ragenos laikiklį, atmetamos (PASTABA. Drumstumo matuoklis turėtų būti kalibruotas pagal drumstumo etalonus, naudojamus drumstumo vienetams nustatyti, žr. 4 priedėlį).
                     Kiekvieną apdorojimo grupę (bandomosios cheminės medžiagos, vienalaikių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių) sudaro ne mažiau kaip trys akys. Taikant BCOP bandymų metodą, neigiamam kontroliniam ėminiui reikėtų naudoti tris ragenas. Kadangi visos ragenos yra išpjaunamos iš viso akies obuolio ir įdedamos į ragenų kameras, dėl tvarkymo veiksmų gali būti ragenų drumstumo ir pralaidumo verčių artefaktų (įskaitant neigiamą kontrolinį ėminį). Be to, drumstumo ir pralaidumo vertės, gautos neigiamų kontrolinių ėminių ragenoms, yra naudojamos bandomąja chemine medžiaga apdorotų ir teigiamų kontrolinių ėminių ragenų drumstumo ir pralaidumo vertėms koreguoti, atliekant IVIS skaičiavimus.
                     PROCEDŪRA
                     
                        Akių paruošimas
                     
                     Stengiantis nepažeisti ragenos epitelio ir endotelio, defektų neturinčios ragenos išpjaunamos kartu su 2–3 mm pločio odenos žiedu, kuris paliekamas tam, kad vėliau būtų patogiau tvarkyti rageną. Atskirtos ragenos įdedamos į specialios konstrukcijos ragenų laikiklius, sudarytus iš priekinės ir užpakalinės kamerų, kurios liečiasi su ragenos epitelio ir endotelio pusėmis. Abi kameros iki viršaus pripildomos pašildyta Eagle'o minimalia pagrindine terpe (angl. Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) be fenolio raudonojo (pirmiau užpakalinė kamera) taip, kad nesusidarytų burbulų. Tada ne trumpiau kaip vieną valandą įtaisas pusiausvirinamas 32 ± 1 °C temperatūroje, kad susilygintų ragenų bei terpės temperatūra ir būtų gautas kiek įmanoma normalus metabolinis aktyvumas (apytikrė ragenos paviršiaus temperatūra in vivo yra 32 °C).
                     Pasibaigus pusiausvirinimo laikotarpiui, abi kameros pripildomos naujos pašildytos EMEM be fenolio raudonojo, ir registruojami kiekvienos ragenos pradinio drumstumo rodmenys. Visos ragenos, turinčios makroskopinių audinio pažeidimų (pvz., įbrėžimų, pigmentinių dėmių, neovaskuliarizacijos požymių) arba kurių drumstumas yra didesnis kaip septyni drumstumo vienetai arba lygiavertis, naudojant kitą drumstumo matuoklį ir ragenos laikiklį, atmetamos. Ne mažiau kaip trys ragenos pasirenkamos kaip neigiamo (arba tirpiklio) kontrolinio ėminio ragenos. Likusios ragenos padalijamos į paveikimo bandomąja chemine medžiaga grupę ir teigiamo kontrolinio ėminio grupę.
                     Kadangi vandens šiluminė talpa didesnė už oro, vanduo užtikrina stabilesnes inkubavimo temperatūros sąlygas. Todėl ragenos laikiklį ir jo turinį rekomenduojama laikyti vandens vonioje, kurioje būtų palaikoma 32 ± 1 °C temperatūra. Tačiau gali būti naudojami ir oro inkubatoriai, jei būtų imtasi priemonių temperatūros stabilumui užtikrinti (pvz., iš anksto pašildant laikiklius ir terpę).
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas
                     
                     Taikomi du skirtingi apdorojimo protokolai: vienas – skysčiams ir paviršinio aktyvumo medžiagoms (kietosioms medžiagoms arba skysčiams), kitas – kietosioms ne paviršinio aktyvumo medžiagoms.
                     Skysčiai bandomi neskiesti. Pusiau kietosios medžiagos, tepalai ir vaškai paprastai bandomi kaip skysčiai. Grynos paviršinio aktyvumo medžiagos bandomos naudojant 10 % m/V koncentracijos tirpalą 0,9 % natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje, kuris, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. Reikėtų tinkamai pagrįsti kitas praskiestų tirpalų koncentracijos vertes. Paviršinio aktyvumo medžiagų turinčius mišinius galima bandyti neskiestus arba praskiestus iki reikiamos koncentracijos, atsižvelgiant į atitinkamą veikimo scenarijų in vivo. Bandyme naudojamą koncentraciją reikėtų tinkamai pagrįsti. Ragenos veikiamos skysčiais ir paviršinio aktyvumo medžiagomis 10 min. Jei taikoma kitokia veikimo trukmė, ją reikėtų tinkamu būdu moksliškai pagrįsti. Žr. 1 priedėlį, kuriame pateiktos paviršinio aktyvumo medžiagų ir paviršinio aktyvumo medžiagų turinčio mišinio apibrėžtys.
                     Ne paviršinio aktyvumo kietosios medžiagos paprastai bandomos kaip 20 % m/V koncentracijos tirpalai ar suspensijos 0,9 % natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje, kuris, kaip įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. Tam tikromis aplinkybėmis ir pateikus reikiamą mokslinį pagrindimą, kietąsias medžiagas taip pat būtų galima bandyti grynas, jas tiesiogiai uždedant ant ragenos paviršiaus taikant atvirosios kameros metodą (žr. 32 skirsnį). Ragenos veikiamos kietosiomis medžiagomis keturias valandas, tačiau skysčiams ir paviršinio aktyvumo medžiagoms gali būti taikoma kitokia veikimo trukmė, pateikus reikiamą mokslinį pagrindimą.
                     Atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizikinę būseną ir chemines savybes (pvz., kietoji medžiaga, skystis, klampus arba neklampus skystis), galima taikyti įvairius apdorojimo būdus. Pagrindinis veiksnys – užtikrinti, kad bandomoji cheminė medžiaga tinkamai padengtų epitelio paviršių ir būtų gerai pašalinta atliekant plovimo veiksmus. Neklampios ir nedidelės klampos bandomosios cheminės medžiagos paprastai bandomos uždarosios kameros metodu, o pusiau klampios ir klampios skystosios bandomosios cheminės medžiagos bei grynos kietosios medžiagos – atvirosios kameros metodu.
                     Taikant uždarosios kameros metodą, bandomosios cheminės medžiagos kiekis, kurio pakanka ragenos epitelio paviršiui padengti (750 μl), įterpiamas į priekinę kamerą per jos viršutiniame paviršiuje esančią dozavimo angą, veikimo metu užkemšama kamščiu. Svarbu užtikrinti, kad reikiamą laiko tarpą kiekvieną rageną veiktų bandomoji cheminė medžiaga.
                     Taikant atvirosios kameros metodą, prieš apdorojimą iš priekinės kameros išimamas lango fiksavimo žiedas ir stiklinis langas. Kontrolinė arba bandomoji cheminė medžiaga (750 μl arba toks bandomosios cheminės medžiagos kiekis, kurio pakaktų visai ragenai padengti) tiesiogiai užlašinama ant ragenos epitelio paviršiaus mikropipete. Jei bandomąją cheminę medžiagą sunku įlašinti pipete, dozavimui palengvinti bandomoji cheminė medžiaga gali būti įšvirkšta į stūmoklinę pipetę. Stūmoklinės pipetės antgalis įstatomas į švirkšto dozavimo galą taip, kad medžiagą būti galima įšvirkšti į stūmoklinės pipetės galą. Švirkšto stūmoklis stumiamas, tuo pat metu pipetės stūmoklis traukiamas į viršų. Jei antgalyje atsiranda oro burbuliukų, bandomoji cheminė medžiaga pašalinama (išstumiama), ir procedūra kartojama tol, kol antgalis užpildomas be oro burbuliukų. Prireikus gali būti naudojamas paprastas švirkštas (be adatos), kadangi jį naudojant galima tiksliai išmatuoti bandomosios cheminės medžiagos kiekį ir lengviau padengti ragenos epitelio paviršių. Baigus dozuoti, stiklinis langas įdedamas atgal į priekinę kamerą, taip vėl atkuriant uždarąją sistemą.
                     
                        Inkubavimas po paveikimo
                     
                     Pasibaigus veikimo laikotarpiui, bandomoji cheminė medžiaga, neigiama kontrolinė medžiaga arba teigiama kontrolinė cheminė medžiaga pašalinama iš priekinės kameros, epitelis plaunamas ne mažiau kaip tris kartus (arba kol nelieka matomų bandomosios cheminės medžiagos žymių) naudojant EMEM (kurios sudėtyje yra fenolio raudonojo). Plovimui naudojama terpė su fenolio raudonuoju, nes galima stebėti fenolio raudonojo spalvos kitimą, kad būtų galima nustatyti rūgštinių ar šarminių bandomųjų cheminių medžiagų nuplovimo efektyvumą. Jei fenolio raudonasis vis dar keičia spalvą (į geltoną ar į raudonai violetinę) arba jei bandomoji cheminė medžiaga vis dar yra matoma, ragenos plaunamos daugiau kaip tris kartus. Iš terpės pašalinus bandomąją cheminę medžiagą, ragenos paskutinį kartą plaunamos EMEM (be fenolio raudonojo). Paskutinį kartą plaunama EMEM (be fenolio raudonojo) tam, kad prieš drumstumo matavimą fenolio raudonasis būtų visiškai pašalintas iš priekinės kameros. Tada priekinė kamera iš naujo pripildoma nauja EMEM be fenolio raudonojo.
                     Jei bandomi skysčiai arba paviršinio aktyvumo medžiagos, nuplautos ragenos dar dvi valandas laikomos 32 ± 1 °C temperatūroje. Tam tikromis aplinkybėmis gali būti naudinga ilgesnė laikymo po paveikimo trukmė ir dėl jos būtų galima spręsti kiekvienu konkrečiu atveju. Pasibaigus keturių valandų veikimo laikotarpiui, kietosiomis medžiagomis apdorotos ragenos kruopščiai nuplaunamos, bet papildomai inkubuoti jų nereikia.
                     Pasibaigus skysčių ir paviršinio aktyvumo medžiagų inkubaciniam laikotarpiui po veikimo ir keturių valandų trukmės ne paviršinio aktyvumo kietųjų medžiagų veikimo laikotarpiui, matuojamas kiekvienos ragenos drumstumas ir pralaidumas. Be to, kiekviena ragena apžiūrima ir registruojamos susijusios pastabos (pvz., audinio lupimasis, bandomosios cheminės medžiagos likučiai, nevienodo drumstumo vaizdai). Šios pastabos galėtų būti svarbios, nes jos gali paaiškinti drumstumo matuoklio rodmenų svyravimus.
                     
                        Kontrolinės cheminės medžiagos
                     
                     Atliekant kiekvieną bandymą, naudojami vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai arba tirpiklis ar nešiklis ir teigiami kontroliniai ėminiai.
                     Kai pagal BCOP bandymo metodą bandoma 100 % grynumo skystoji cheminė medžiaga, naudojamas vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys (pvz., 0,9 % natrio chlorido tirpalas arba distiliuotas vanduo), kad bandymo sistemoje būtų galima aptikti netipinius pokyčius ir gauti bandymo vertinamųjų baigčių atskaitos vertę. Taip pat užtikrinama, kad tyrimo sąlygos nesukeltų netinkamo dirginamojo atsako.
                     Kai bandomas atskiestas skystis, paviršinio aktyvumo arba kietoji cheminė medžiaga, taikant BCOP bandymo metodą, įtraukiama vienalaikių tirpiklio ar nešiklio kontrolinių ėminių grupė, kad būtų galima aptikti nebūdingus bandymo sistemos pokyčius ir gauti bandymo vertinamųjų baigčių atskaitos vertę. Galima naudoti tik tokį tirpiklį ar nešiklį, kurie, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamos įtakos bandymo sistemai.
                     Cheminė medžiaga, kuri žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką, yra įtraukiama į kiekvieną bandymą kaip vienalaikis teigiamas kontrolinis ėminys, kad būtų patikrintas bandymo sistemos vientisumas ir jos tinkamas veikimas. Tačiau siekiant užtikrinti galimybę užtikrinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, atsakas į dirginimą neturėtų būti per stiprus.
                     Skystųjų bandomųjų cheminių medžiagų teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai yra 100 % etanolis ar 100 % dimetilformamidas. Kietųjų bandomųjų cheminių medžiagų teigiamo kontrolinio ėminio pavyzdys yra 20 % m/V imidazolo tirpalas 0,9 % natrio chlorido tirpale.
                     Palyginamosios cheminės medžiagos yra naudingos, kai reikia įvertinti tam tikros cheminių medžiagų ar produktų klasės nežinomų cheminių medžiagų gebą dirginti akis arba akis dirginančios medžiagos santykinę dirginamąją gebą tam tikrame atsako į dirginimą intervale.
                     
                        Matuojamos vertinamosios baigtys
                     
                     Drumstumas nustatomas pagal ragenos praleidžiamą šviesos kiekį. Ragenos drumstumas kiekybiškai matuojamas drumstumo matuokliu, kuriuo gaunamos drumstumo vertės tolydžioje skalėje.
                     Pralaidumas nustatomas pagal fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekį, prasiskverbusį per visus ragenos ląstelių sluoksnius (t. y. nuo išorinio ragenos paviršiaus epitelio per vidinio ragenos paviršiaus endotelį). Į priekinę ragenos laikiklio kamerą, kuri liečiasi su ragenos epitelio paviršiumi, įpilamas 1 ml fluoresceino natrio druskos tirpalo (4 arba 5 mg/ml, kai bandomos skystosios, paviršinio aktyvumo medžiagos arba ne paviršinio aktyvumo medžiagos), o į užpakalinę kamerą, kuri liečiasi su ragenos endotelio paviršiumi, pripilama naujos EMEM. Laikiklis laikomas 90 ± 5 min horizontalioje padėtyje 32 ± 1 °C temperatūroje. UV/VIS spektrofotometrijos metodu matuojamas į užpakalinę kamerą patekusios fluoresceino natrio druskos kiekis. Spektrofotometrinio matavimo duomenys registruojami kaip optinio tankio esant 490 nm bangos ilgiui (OD490) arba sugerties vertės, išmatuotos tolydžioje skalėje. Fluoresceino pralaidumo vertės nustatomos naudojant OD490 vertes, išmatuotas regimosios šviesos spektrofotometru, taikant standartinį 1 cm storio sluoksnį.
                     Taip pat galima naudoti 96 duobučių mikrotitravimo plokštelės skaitytuvą, jei: i) gali būti nustatytas plokštelės skaitytuvo, naudojamo fluoresceino OD490 vertėms nustatyti, tiesinis intervalas ir ii) į 96 duobučių plokštelės duobutes įpilamas reikiamas tūris, kad būtų gautos OD490 vertės, atitinkančios standartinį 1 cm storio sluoksnį (gali prireikti visiškai pripildyti duobutę (įprastas kiekis – 360 μl)).
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Duomenų įvertinimas
                     
                     Drumstumo ir vidutinio pralaidumo (OD490) vertes pakoregavus pagal foninio drumstumo ir neigiamo kontrolinio ėminio pralaidumo OD490 vertes, kiekvienos paveiktos bandomąja chemine mežiaga grupės vidutinės drumstumo ir pralaidumo OD490 vertes reikėtų įrašyti į empiriniu būdu gautą formulę, skirtą kiekvienos apdorotų ėminių grupės in vitro dirginimo skaitinei vertei (IVIS) apskaičiuoti:
                     IVIS = vidutinė drumstumo vertė + (15 × vidutinė pralaidumo OD490 vertė).
                     Sina et al. (16) paskelbė, kad ši formulė buvo gauta atliekant laboratorinius ir tarplaboratorinius tyrimus. Buvo atlikta duomenų, gautų atlikus 36 junginių serijos tarplaboratorinį tyrimą, daugiafaktorinė analizė, kad būtų gauta geriausiai in vivo ir in vitro duomenis atitinkanti lygtis. Šią analizę atliko dviejų atskirų bendrovių mokslininkai, kurie gavo beveik vienodas lygtis.
                     Drumstumo ir pralaidumo vertės taip pat turėtų būti įvertintos atskirai, siekiant nustatyti, ar bandomoji cheminė medžiaga sukėlė ėsdinimą arba stiprų dirginimą tik pagal vieną iš dviejų vertinamųjų baigčių (žr. Sprendimo priėmimo kriterijai).
                     
                        Sprendimo priėmimo kriterijai
                     
                     IVIS ribinės vertės, pagal kurias bandomosios cheminės medžiagos identifikuojamos kaip sukeliančios smarkų akių pažeidimą (JT GHS 1 kategorija) ir bandomosios cheminės medžiagos, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo (JT GHS be kategorijos), pateiktos toliau:
                     
                                 IVIS
                              
                              
                                 JT GHS
                              
                           
                                 ≤ 3
                              
                              
                                 Be kategorijos
                              
                           
                                 > 3; ≤ 55
                              
                              
                                 Prognozės pateikti negalima
                              
                           
                                 > 55
                              
                              
                                 1 kategorija
                              
                           
                        Tyrimo priimtinumo kriterijai
                     
                     Bandymas laikomas priimtinu, jei teigiamam kontroliniam ėminiui gaunama IVIS, kuri patenka į dabartinio istorinio vidurkio dviejų standartinių nuokrypių intervalą, vidurkį atnaujinant ne rečiau kaip kartą per tris mėnesius arba kiekvieną kartą laboratorijose atliekant priimtiną bandymą, kai bandymai atliekami nedažnai (t. y. rečiau kaip kartą per mėnesį). Vertinant atsaką į neigiamą kontrolinę medžiagą arba tirpiklį ar nešiklį, gautos drumstumo ir pralaidumo vertės neturėtų viršyti foninio drumstumo ir pralaidumo verčių viršutinių ribų, nustatytų galvijų ragenoms, apdorotoms atitinkama neigiama kontroline medžiaga arba tirpikliu ar nešikliu. Jei klasifikavimas nedviprasmis, bandomajai cheminei medžiagai turėtų pakakti vieno bandymo, bandant ne mažiau kaip tris ragenas. Tačiau jei atliekant pirmąjį bandymą gaunami tarpiniai rezultatai, reikėtų spręsti klausimą dėl antrojo bandymo (bet jo nebūtinai reikia), taip pat, esant prieštaringiems pirmų dviejų bandymų IVIS vidutiniams rezultatams, – dėl trečiojo bandymo. Šiuo atveju pirmojo bandymo rezultatas laikomas tarpine verte, jei bandymų su 3 ragenomis gautos prognozės nesutapo taip, kad:
                     
                                 —
                              
                              
                                 2 iš 3 ragenų gautos prieštaringos prognozės pagal visų trijų ragenų vidurkį AR,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 1 iš 3 ragenų gauta prieštaringa prognozė pagal visų trijų ragenų vidurkį IR prieštaringas rezultatas buvo > 10 IVIS vienetų nuo ribinės vertės 55;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jei kartotinis bandymas patvirtina pradinio bandymo prognozę (pagrįstą vidutine IVIS verte), galutinį sprendimą galima priimti be papildomo bandymo; Jei, atlikus kartotinį bandymą, gaunama pirmajam bandymui prieštaraujanti prognozė (pagrįsta vidutine IVIS verte), turėtų būti atliekamas trečiasis ir galutinis bandymas nuspręsti dėl dviprasmių prognozių ir klasifikuoti bandomąją cheminę medžiagą. Gali būti leidžiama neatlikti tolesnių klasifikavimo ir ženklinimo bandymų, jei kuris nors bandymų rezultatas duoda JT GHS 1 kategorijos prognozę.
                              
                           
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija, jei ji yra svarbi atliekant tyrimą:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomosios ir kontrolinės cheminės medžiagos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminės medžiagos pavadinimas (-ai), pvz., Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. Chemical Abstracts Service, CAS) naudojamas struktūrinis pavadinimas ir kiti pavadinimai, jei jie žinomi; CAS registro numeris (RN), jei žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios ir (arba) kontrolinės cheminės medžiagos grynumas ir sudėtis (masės procentinėmis dalimis), jei tokia informacija yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tyrimui atlikti reikiamos fizikinės ir cheminės savybės, pvz., fizikinis būvis, lakumas, pH, stabilumas, cheminė klasė, tirpumas vandenyje;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomųjų ir (arba) kontrolinių cheminių medžiagų apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilumas, jei jis žinomas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Informacija apie rėmėją ir bandymų laboratoriją
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             rėmėjo pavadinimas ir adresas, bandymų laboratorija ir tyrimo vadovas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymų metodo sąlygos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             naudojamas drumstumo matuoklis (pvz., modelis ir specifikacijos) ir prietaiso nuostačiai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             drumstumo ir pralaidumo matavimo prietaisų (pvz., drumstumo matuoklio ir spektrofotometro) kalibravimo informacija, kad būtų užtikrintas matavimų tiesiškumas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotų ragenos laikiklių tipas (pvz., modelis ir specifikacijos);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kitos naudojamos įrangos aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             procedūra, taikyta bandymų metodo vientisumui (t. y. tikslumui ir patikimumui) užtikrinti laikui bėgant (pvz., kvalifikaciniam bandymui skirtų cheminių medžiagų periodinis tikrinimas).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo priimtinumo kriterijai
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Priimtini vienalaikių teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių intervalai, pagrįsti istoriniais duomenimis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             priimtini vienalaikių palyginamųjų cheminių medžiagų kontrolinių ėminių intervalai, pagrįsti istoriniais duomenimis, jei taikoma.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Akių surinkimas ir paruošimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             akių šaltinio identifikavimo duomenys (t. y. įmonė, iš kurios jos buvo paimtos);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ragenos skersmuo, kaip šaltinio gyvūno amžiaus ir tinkamumo bandymui matas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             akių laikymo ir transportavimo sąlygos (pvz., akių paėmimo data ir laikas, laiko tarpas iki bandymo pradžios, kelionėje naudojama terpė ir temperatūra, naudoti antibiotikai);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             galvijų ragenų paruošimas ir įdėjimas, įskaitant pastabas dėl jų kokybės, ragenų laikiklių temperatūra ir bandymams skirtų ragenų atrankos kriterijai.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo procedūra
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kartotinių ėminių skaičius
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotų neigiamų ir teigiamų kontrolinių medžiagų identifikavimo duomenys (taip pat tirpiklio ir palyginamųjų kontrolinių cheminių medžiagų, jei tinka);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertė (-ės), naudojamas įterpimo būdas, veikimo trukmė ir inkubavimo po paveikimo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             įvertinimo ir taikytų sprendimo priėmimo kriterijų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikytų tyrimo priimtinumo kriterijų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų bandymo procedūros pakeitimų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikytų sprendimo priėmimo kriterijų aprašymas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Atskirų ėminių duomenų lentelė (pvz., drumstumo ir OD490 vertės, bandomosios cheminės medžiagos, teigiamų, neigiamų bei lyginamųjų cheminių medžiagų (jei naudojamos) ėminių apskaičiuotos IVIS vertės, pateiktos lentelės pavidalu, įskaitant kartotinių bandymų duomenis, jei tinka, kiekvieno bandymo vidurkiai ± standartinis nuokrypis);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kitų pastebėtų reiškinių aprašymas.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gautas in vitro JT GHS klasifikavimas, jei tinka.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvada
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm].
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 UN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html].
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24:1-9.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm].
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm].
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on – Part I. The Lancet 349: 636-641.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Šio priedo B.5 skyrius. Ūmus akių dirginimas ar ėsdinimas.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).
                                 Available at: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Tikslumas
                           – bandymo metodo rezultatų ir patvirtintų pamatinių verčių sutapimo artumas. Tikslumas yra bandymo metodo taikymo charakteristikų matas ir vienas iš „tinkamumo“ aspektų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „atitiktis“ tinkamų bandymo metodo rezultatų daliai išreikšti.
                        
                           
                              Palyginamoji cheminė medžiaga
                           – cheminė medžiaga, naudojama kaip etalonas lyginant su bandomąja chemine medžiaga. Palyginamoji cheminė medžiaga turėtų turėti šias savybes: i) pastovų (-ius) ir patikimą (-us) šaltinį (-ius); ii) struktūrinį ir funkcinį panašumą su bandomųjų cheminių medžiagų klase; iii) žinomas fizikines ir (arba) chemines charakteristikas; iv) žinomą poveikį patvirtinančius duomenis ir v) žinomą veikimo gebą reikiamo atsako intervale.
                        
                           
                              Aukštynkryptis metodas
                           – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad jos nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo, kurio pradžioje cheminės medžiagos, kurių nereikia klasifikuoti (duodančios neigiamą rezultatą), atskiriamos nuo nuo kitų cheminių medžiagų (duodančių teigiamą rezultatą).
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Ragena
                           – permatoma priekinė akies obuolio dalis, dengianti rainelę bei vyzdį ir praleidžianti šviesą į vidų.
                        
                           
                              Ragenos drumstumas
                           – ragenos, paveiktos bandomąja chemine medžiaga, neskaidrumo laipsnio matas. Padidėjęs ragenos drumstumas rodo ragenos pažeidimą. Drumstumą galima įvertinti subjektyviai, kaip tai daroma atliekant Draize triušio akies bandymą, arba objektyviai, naudojant prietaisą, pvz., drumstumo matuoklį.
                        
                           
                              Ragenos pralaidumas
                           – kiekybinis ragenos epitelio pažeidimo matas, gautas nustatant fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekį, kuris prasiskverbia per visus ragenos ląstelių sluoksnius.
                        
                           
                              Akių dirginimas
                           – akių pokyčių sukėlimas, uždėjus bandomosios cheminės medžiagos ant priekinio akies paviršiaus, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą nuo uždėjimo. Atitinka klasifikaciją Grįžtamasis poveikis akims ir JT GHS 2 kategorija (4).
                        
                           
                              Klaidingai neigiamų rezultatų dalis
                           – visų teigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip neigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.
                        
                           
                              Klaidingai teigiamų rezultatų dalis
                           – visų neigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip teigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.
                        
                           
                              Pavojus
                           – būdingoji medžiagos savybė arba situacija, galinti sukelti neigiamų padarinių, kai organizmą, sistemą ar populiaciją (arba jos dalį) veikia ta medžiaga.
                        
                           
                              
                                 In vitro dirginimo skaitinė vertė (IVIS)
                           – vertė, apskaičiuojama pagal empiriniu būdu gautą formulę, naudojamą taikant BCOP bandymų metodą, kai kiekvienos apdorotos grupės vidutinės drumstumo ir vidutinio pralaidumo vertės bendrinamos į vieną kiekvienos apdorotos grupės in vitro skaitinę vertę. IVIS = vidutinė drumstumo vertė + (15 × vidutinė pralaidumo vertė).
                        
                           
                              Negrįžtamasis poveikis akims
                           – žr. Smarkus akių pažeidimas.
                        
                           
                              Mišinys
                           – dviejų arba daugiau medžiagų mišinys arba tirpalas, kuriame jos nereaguoja (4)
                        
                           
                              Neigiamas kontrolinis ėminys
                           – neapdorotas kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus. Šis ėminys tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga paveiktais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti, ar vyksta tirpiklio sąveika su bandymo sistema.
                        
                           
                              Neklasifikuojamos
                           – cheminės medžiagos, kurios neklasifikuojamos dėl akių dirginimo (JT GHS 2, 2A ar 2B kategorija) ar dėl smarkaus akių pažeidimo (JT GHS 1 kategorija). Atitinka klasifikaciją JT GHS be kategorijos.
                        
                           
                              Drumstumo matuoklis
                           – prietaisas, naudojamas ragenos drumstumui matuoti, kiekybiškai įvertinant šviesos praleidimą per rageną. Paprastai šis prietaisas yra sudarytas iš dviejų skyrių, iš kurių kiekvienas turi savo šviesos šaltinį ir fotoelementą. Vienas skyrius skirtas apdorotai ragenai, kitas – prietaisui kalibruoti ir nuliui nustatyti. Halogeninės lempos šviesa perduodama per valdymo skyrių (tuščią kamerą be langų ar skysčio) į fotoelementą ir lyginama su šviesa, į fotoelementą perduota per bandymo skyrių, kuriame yra kamera su ragena. Fotoelementų praleistos šviesos skirtumas palyginamas ir skaitmeniniame ekrane rodoma skaitinė drumstumo vertė.
                        
                           
                              Teigiamas kontrolinis ėminys
                           – kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus ir paveiktas chemine medžiaga, kuri yra žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką. Siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus.
                        
                           
                              Grįžtamasis poveikis akims
                           – žr. Akių dirginimas.
                        
                           
                              Patikimumas
                           – pagal tą patį protokolą atliekamo bandymo metodo, tam tikrą laiką taikomo laboratorijose ir tarp laboratorijų, atkuriamumo laipsnio matas. Jis įvertinamas apskaičiuojant atkuriamumą laboratorijoje ir tarp laboratorijų ir pakartojamumą laboratorijoje.
                        
                           
                              Smarkus akių pažeidimas
                           – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kuris ne visiškai praeina per 21 dieną nuo uždėjimo. Atitinka klasifikaciją Negrįžtamasis poveikis akims ir su JT GHS 1 kategorija (4).
                        
                           
                              Tirpiklio ar nešiklio kontrolinis ėminys
                           – visus bandymo sistemos komponentus, įskaitant tirpiklį ar nešiklį, turintis neapdorotas ėminys, kuris tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti atskaitos vertę ėminiams, paveiktiems bandomąja chemine medžiaga, ištirpinta tame pačiame tirpiklyje ar nešiklyje. Kai bandomas kartu su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, šis ėminys taip pat parodo, ar vyksta tirpiklio arba nešiklio sąveika su bandymo sistema.
                        
                           
                              Medžiaga
                           – gamtoje randami arba gamybos procese gaunami cheminiai elementai ir jų junginiai, įskaitant visus priedus, kurių reikia produkto stabilumui užtikrinti, ir visas priemaišas, patenkančias į produktą taikomo proceso metu, tačiau neįskaitant tirpiklio, kurį galima atskirti, nepaveikiant medžiagos stabilumo ar nekeičiant jos sudėties (4).
                        
                           
                              Paviršinio aktyvumo medžiaga
                           – dar vadinama paviršinio aktyvumo agentu, tai yra medžiaga, pvz., ploviklis, kuri gali sumažinti skysčio paviršiaus įtemptį, kad jis galėtų putoti ar prasiskverbti į kietąsias medžiagas; be to, ji žinoma kaip drėkiklis.
                        
                           
                              Paviršinio aktyvumo medžiagų turintis mišinys
                           – šio bandymų metodo kontekste tai yra mišinys, turintis vieną arba daugiau paviršinio aktyvumo medžiagų, kurių galutinė koncentracija > 5 %.
                        
                           
                              Žemynkryptis metodas
                           – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad ji sukelia smarkų akių pažeidimą, pagal kurį cheminės medžiagos, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (duodančios teigiamą rezultatą), atskiriamos nuo kitų cheminių medžiagų (duodančių neigiamą rezultatą).
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Nuosekliųjų bandymų strategija
                           – pakopomis atliekamų bandymų strategija, kai tam tikra eilės tvarka nagrinėjama visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, kiekvienoje pakopoje taikant įrodomosios vertės analizės procesą, siekiant nustatyti, ar yra pakankamai duomenų sprendimui dėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš pereinant prie kitos pakopos. Jei bandomosios cheminės medžiagos dirginamąją gebą galima nustatyti atsižvelgiant į turimą informaciją, papildomų bandymų atlikti nereikia. Jei atsižvelgiant į turimą informaciją, bandomajai cheminei medžiagai dirginamosios gebos priskirti neįmanoma, taikoma nuosekliųjų bandymų su gyvūnais procedūra tol, kol galima gauti nedviprasmį klasifikavimą.
                        
                           
                              Jungtinių Tautų visuotinai suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema (JT GHS)
                           – sistema, kurioje pateikiamas cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimas pagal standartizuotus fizikinių pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai tipus ir nagrinėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signaliniai žodžiai, pavojingumo frazės, atsargumo frazės ir saugos duomenų lapai, kad būtų galima informuoti apie cheminių medžiagų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vežėjus, vartotojus ir avarijų likvidatorius) ir aplinką (4).
                        
                           
                              JT GHS 1 kategorija
                           – žr. Smarkus akių pažeidimas.
                        
                           
                              JT GHS 2 kategorija
                           – žr. Akių dirginimas.
                        
                           
                              JT GHS be kategorijos
                           – cheminės medžiagos, kurios neatitinka JT GHS 1 arba 2 (2A ar 2B) kategorijos klasifikavimo reikalavimų. Atitinka Neklasifikuojamos.
                        
                           
                              Patvirtinto tinkamumo bandymų metodas
                           – bandymų metodas, kurio patvirtinimo tyrimai atlikti, kad būtų nustatytas jo tinkamumas tam tikram tikslui pasiekti (įskaitant tikslumą) ir patikimumas. Svarbu pažymėti, kad patvirtinto tinkamumo bandymo metodo tikslumo ir patikimumo charakteristikos gali būti nepakankamos, kad jį būtų galima laikyti priimtinu siūlomam tikslui pasiekti.
                        
                           
                              Įrodomoji duomenų galia
                           – įvairių informacijos dalių privalumų ir trūkumų nagrinėjimo procesas priimant ir patvirtinant sprendimą dėl cheminės medžiagos pavojingumo.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           BCOP BANDYMŲ METODO PROGNOZAVIMO GEBA
                        
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           BCOP prognozavimo geba nustatant chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus (JT GHS ar ES CLP 1 kategorijos palyginti su ne 1 kategorijos (2 kategorijos ir be kategorijos); JAV AAA I kategorijos palyginti su ne I kategorijos (II kategorijos + III kategorijos + IV kategorijos)
                        
                        
                                    Klasifikavimo sistema
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    Tikslumas
                                 
                                 
                                    Jautris
                                 
                                 
                                    Klaidingai neigiami
                                 
                                 
                                    Specifiškumas
                                 
                                 
                                    Klaidingai teigiami
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                              
                                    JT GHS
                                    ES CLP
                                 
                                 
                                    191
                                 
                                 
                                    78,53
                                 
                                 
                                    150/191
                                 
                                 
                                    86,15
                                 
                                 
                                    56/65
                                 
                                 
                                    13,85
                                 
                                 
                                    9/65
                                 
                                 
                                    74,60
                                 
                                 
                                    94/126
                                 
                                 
                                    25,40
                                 
                                 
                                    32/126
                                 
                              
                                    JAV AAA
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    78,95
                                 
                                 
                                    150/190
                                 
                                 
                                    85,71
                                 
                                 
                                    54/63
                                 
                                 
                                    14,29
                                 
                                 
                                    9/63
                                 
                                 
                                    75,59
                                 
                                 
                                    96/127
                                 
                                 
                                    24,41
                                 
                                 
                                    31/127
                                 
                              
                           
                        
                           2 lentelė
                        
                        
                           BCOP prognozavimo geba nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo (nedirginančias) (JT GHS/ES CLP be kategorijos palyginti su ne be kategorijos (1 kategorijos + 2 kategorijos); JAV AAA IV kategorijos palyginti su ne IV kategorijos (I kategorijos + II kategorijos + III kategorijos))
                        
                        
                                    Klasifikavimo sistema
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    Tikslumas
                                 
                                 
                                    Jautris
                                 
                                 
                                    Klaidingai neigiami
                                 
                                 
                                    Specifiškumas
                                 
                                 
                                    Klaidingai teigiami
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Skaičius
                                 
                              
                                    JT GHS
                                    ES CLP
                                 
                                 
                                    196
                                 
                                 
                                    68,88
                                 
                                 
                                    135/196
                                 
                                 
                                    100
                                 
                                 
                                    107/107
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    0/107
                                 
                                 
                                    31,46
                                 
                                 
                                    28/89
                                 
                                 
                                    68,54
                                 
                                 
                                    61/89
                                 
                              
                                    JAV AAA
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    82,11
                                 
                                 
                                    156/190
                                 
                                 
                                    93,15
                                 
                                 
                                    136/146
                                 
                                 
                                    6,85
                                 
                                 
                                    10/146
                                 
                                 
                                    45,45
                                 
                                 
                                    20/44
                                 
                                 
                                    54,55
                                 
                                 
                                    24/44
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           KVALIFIKACIJAI TIKRINTI SKIRTOS CHEMINĖS MEDŽIAGOS TAIKANT BCOP BANDYMŲ METODĄ
                        
                        Prieš pradėdamos įprastiniu būdu taikyti šį bandymų metodą, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, tinkamai klasifikuodamos 1 lentelėje rekomenduojamų 13 cheminių medžiagų keliamą pavojų akims. Šios cheminės medžiagos buvo parinktos taip, kad atitiktų pavojų akims atsakų intervalą (t. y. 1, 2A, 2B kategorijas arba be kategorijos), atsižvelgiant į in vivo triušio akių bandymo (TG 405) (17) rezultatus ir į JT GHS klasifikavimo sistemą (4). Kiti atrankos kriterijai buvo cheminių medžiagų komercinis prieinamumas ir tai, ar galima gauti aukštos kokybės in vivo etaloninius duomenis bei aukštos kokybės in vitro BCOP bandymų metodo duomenis. Etaloniniai duomenys pateikti supaprastintame suvestiniame dokumente (3) ir BCOP bandymų metodo ICCVAM istorinės apžvalgos dokumente (2)(18).
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           Cheminės medžiagos, rekomenduojamos techninei kvalifikacijai tikrinti taikant BCOP bandymų metodą
                        
                        
                                    Cheminė medžiaga
                                 
                                 
                                    CAS Nr.
                                 
                                 
                                    Cheminė klasė (8)
                                    
                                 
                                 
                                    Agregatinė būsena
                                 
                                 
                                    
                                       In Vivo klasifikavimas (9)
                                    
                                 
                                 
                                    BCOP klasifikavimas
                                 
                              
                                    Benzalkonio chloridas (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Onio junginys
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Chlorheksidinas
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    Aminas, amidinas
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Dibenzoil-L-vyno rūgštis
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    Karboksirūgštis, esteris
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Imidazolas
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    Heterociklinis junginys
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Trichloracto rūgštis (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    Karboksirūgštys.
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    2,6-dichlorbenzoilchloridas
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    Acilhalogenidas
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    2A kategorija
                                 
                                 
                                    Negalima padaryti tikslios ir (arba) patikimos prognozės
                                 
                              
                                    Etil-2-metilacetoacetatas
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Ketonas, esteris
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    2 B kategorija
                                 
                                 
                                    Negalima padaryti tikslios ir (arba) patikimos prognozės
                                 
                              
                                    Amonio nitratas
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Neorganinė druska
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    2 kategorija (10)
                                    
                                 
                                 
                                    Negalima padaryti tikslios ir (arba) patikimos prognozės
                                 
                              
                                    EDTA dikalio druska
                                 
                                 
                                    25102-12-9
                                 
                                 
                                    Aminas, karboksirūgštis (druska)
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                              
                                    Tween 20
                                 
                                 
                                    9005-64-5
                                 
                                 
                                    Esteris, polieteris
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                              
                                    2-merkaptopirimidinas
                                 
                                 
                                    1450-85-7
                                 
                                 
                                    Acilhalogenidas
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                              
                                    Fenilbutazonas
                                 
                                 
                                    50-33-9
                                 
                                 
                                    Heterociklinis junginys
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                              
                                    Polioksietileno (23) laurileteris (BRIJ-35) (10 %)
                                 
                                 
                                    9002-92-0
                                 
                                 
                                    Alkoholis
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojama
                                 
                              
                                    Santrumpos: CAS NR. – Cheminių medžiagų pavadinimų santrumpų tarnybos registracijos numeris.
                                 
                              
                     
                        4 priedėlis
                        BCOP BANDYMUI NAUDOJAMAS RAGENOS LAIKIKLIS
                        BCOP ragenų laikikliai gaminami iš inertinės medžiagos (pvz., polipropileno). Laikikliai yra sudaryti iš dviejų dalių (priekinės ir užpakalinės kamerų) ir turi dvi panašias cilindro pavidalo vidines kameras. Kiekvienos kameros projektinė talpa yra maždaug 5 ml, jų galuose yra stikliniai langai, per kuriuos registruojamos drumstumo matavimų vertės. Kiekviena vidinė kamera yra 1,7 cm skersmens ir 2,2 cm gylio (11). Į užpakalinę kamerą yra įdėtas žiedinis tarpiklis, kad būtų išvengta nuotėkio. Ragenos endotelio puse dedamos ant užpakalinių kamerų žiedinio tarpiklio, o priekinės kameros dedamos ant ragenų epitelio. Kameros tvirtinamos trimis nerūdijančiojo plieno varžtais, esančiais išoriniuose kameros kraštuose. Kiekvienos kameros gale yra stiklinis langas, kurį galima išimti, kad būtų patogiau pasiekti rageną. Žiedinis tarpiklis taip pat yra įdėtas tarp stiklinio lango ir kameros, kad būtų išvengta nuotėkio. Kiekvienos kameros viršuje yra dvi angos, per kurias įpilama bei pašalinama terpė ir bandomosios cheminės medžiagos. Apdorojimo ir inkubavimo laikotarpiais jos uždaromos guminiais kamšteliais. Šviesos praleidimas per ragenos laikiklius gali kisti, nes susidėvėjimo reiškiniai arba tam tikrų cheminių medžiagų likučių kaupimasis ant vidinių kamerų angų arba ant stiklinių langų gali turėti įtakos šviesos sklaidai arba atspindžio gebai. Dėl to galėtų padidėti ar sumažėti šviesos praleidimo per ragenos laikiklius atskaitos vertės (drumstumo rodmenų atskaitos vertės pasikeistų priešingai), ir galėtų atrodyti kaip žymūs atskirų kamerų pradinio drumstumo matavimų tikėtinos atskaitos vertės pokyčiai (t. y. tam tikrų atskirų ragenų laikiklių pradinės ragenų drumstumo vertės gali įprastai skirtis daugiau kaip 2 ar 3 drumstumo vienetais, palyginti su numatomomis atskaitos vertėmis). Kiekviena laboratorija turėtų atsižvelgti į galimybę sukurti programą, kurią taikant būtų įvertinti šviesos praleidimo per ragenų laikiklius pokyčiai, atsižvelgiant į bandomųjų cheminių medžiagų tipą ir kamerų naudojimo dažnumą. Siekiant gauti atskaitos vertes, ragenų laikiklius galima patikrinti prieš įprastinį naudojimą, išmatuojant drumstumo (ar šviesos praleidimo) atskaitos vertes, į kameras be ragenų įpylus visos sudėties terpės. Tada būtų galima periodiškai tikrinti ragenų laikiklių šviesos praleidimo pokyčius naudojimo laikotarpiu. Kiekviena laboratorija, atsižvelgdama į tai, kokios cheminės medžiagos bandomos, į naudojimo dažnumą ir pastebėtus ragenų drumstumo atskaitos verčių pokyčius, galėtų nustatyti ragenų laikiklių tikrinimo dažnumą. Jei būtų pastebėti žymūs šviesos praleidimo per ragenų laikiklius pokyčiai, reikėtų spręsti ragenų laikiklių vidinių paviršių tinkamų valymo ir (arba) poliravimo procedūrų ar laikiklių pakeitimo klausimą.
                        
                           Ragenos laikiklio surinkimo schema.
                        
                        
                     
                        5 priedėlis
                        DRUMSTUMO MATUOKLIS
                        Drumstumo matuoklis yra šviesos praleidimo matavimo prietaisas. Pvz., jei BCOP bandymo metodo tinkamumui patvirtinti naudojama OP-KIT įranga iš Electro Design (Riomas, Prancūzija), halogeninės lempos šviesa perduodama per valdymo skyrių (tuščią kamerą be langų ar skysčio) į fotoelementą ir lyginama su šviesa, į fotoelementą perduodama per bandymo skyrių, kuriame yra kamera su ragena. Fotoelementų praleistos šviesos skirtumas palyginamas ir skaitmeniniame ekrane rodoma skaitinė drumstumo vertė. Drumstumo vienetai yra nustatyti. Galima naudoti kitokios konstrukcijos drumstumo matuoklius (pvz., kuriems nereikia atlikti lygiagrečių valdymo ir bandymo skyrių matavimų), jei būtų įrodyta, kad jais gaunami rezultatai yra panašūs į gautus patvirtinta įranga.
                        Drumstumo matuokliu gautas atsakas turėtų būti tiesinis tam tikrame drumstumo rodmenų intervale, kuris aprėptų ribas, atitinkančias įvairius klasifikavimo būdus, aprašytus pagal prognozavimo modelį (t. y. iki ribos, susijusios su ėsdinimu ir (arba) stipriu dirginimu). Siekiant užtikrinti tiesinius ir tikslius rodmenis iki 75–80 drumstumo vienetų, drumstumo matuoklį būtina kalibruoti naudojant įvairius kalibravimo etalonus. Kalibravimo etalonai dedami į kalibravimo kamerą (ragenos kamerą, skirtą kalibravimo etalonams laikyti) ir registruojami drumstumo matuoklio rodmenys. Kalibravimo kamera suprojektuota kalibravimo etalonams laikyti tarp šviesos šaltinio ir fotoelemento maždaug tokiu atstumu, kokiu įdedamos ragenos matuojant jų drumstumą. Etaloninės vertės ir pradinis nuostatis priklauso nuo naudojamos įrangos tipo. Drumstumo matavimų tiesiškumą turėtų užtikrinti reikiamos (prietaisui nustatytos) procedūros. Pvz., jei naudojama OP-KIT įranga iš Electro Design (Riomas, Prancūzija), drumstumo matuoklis iš pradžių kalibruojamas drumstumo vienetų nulinei vertei gauti, naudojant kalibravimo kamerą be kalibravimo etalono. Tada vienas po kito į kalibravimo kamerą dedami trys kalibravimo etalonai ir matuojamas drumstumas. Naudojant 1, 2 ir 3 kalibravimo etalonus, reikėtų gauti jų nuostačių vertes atitinkančius drumstumo rodmenis – 75, 150 ir 225 drumstumo vienetų ± 5 %.
                     “
               
                     13)
                  
                  
                     B dalies B.48 skyrius pakeičiamas taip:
                     „B.48   Atskirtų viščiukų akių bandymo metodas, skirtas identifikuoti i) chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, ir ii) chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 438 (2013). Atskirtų viščiukų akių (ICE) bandymo metodą 2006 ir 2010 m. įvertino Alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybinio koordinavimo komitetas (angl. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) kartu su Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) ir Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) (1) (2) (3). Atliekant pirmąjį įvertinimą, ICE buvo patvirtintas kaip moksliškai pagrįstas bandymų metodas, tinkamas kaip atrankos bandymas nustatant chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurios sukelia smarkius akių pažeidimus (1 kategorijos), kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (4) ir Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (12). Atliekant antrąjį įvertinimą, buvo tiriama, ar ICE bandymų metodas tinka kaip atrankos bandymas nustatant chemines medžiagas, kurios pagal JT GHS neklasifikuojamos dėl akių dirginimo ar smarkių akių pažeidimų (3) (4). Remiantis tinkamumo patvirtinimo tyrimo rezultatais ir ekspertų grupės rekomendacijomis, palikta galioti pirminė rekomendacija, kad ICE galima naudoti klasifikuojant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkius akių pažeidimus (JT GHS 1 kategorijos), nes turima duomenų bazė nepasikeitė nuo pradinio ICCVAM tinkamumo patvirtinimo. Tame etape nebuvo pasiūlyta jokių papildomų rekomendacijų dėl ICE taikymo srities išplėtimo, kad būtų įtrauktos kitos kategorijos. Buvo iš naujo įvertintas in vitro ir in vivo duomenų rinkinys, naudotas atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą, siekiant visų pirma įvertinti ICE naudingumą nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo (5). Atlikus pakartotinį įvertinimą, buvo prieita prie išvados, kad ICE bandymų metodas taip pat gali būti taikomas, kai reikia nustatyti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo pagal JT GHS (4) (5). Atsižvelgiant į šiuos įvertinimus, į šį bandymų metodą įtrauktos rekomenduojamos ICE bandymų metodo taikymo sritys ir apribojimai. Pagrindiniai skirtumai tarp EBPO bandymų gairių originalios 2009 m. versijos ir atnaujintos 2013 m. versijos yra, be kita ko, susiję su šiais dalykais: ICE metodo taikymas nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti pagal JT GHS klasifikavimo sistemą, atnaujinti bandymo ataskaitos elementai, atnaujintos 1 priedėlio apibrėžtys ir atnaujintas 2 priedėlio kvalifikacijai tikrinti naudojamų cheminių medžiagų sąrašas.
                     Šiuo metu visuotinai pripažįstama, kad artimiausioje ateityje joks atskiras in vitro akių dirginimo bandymas negalės pakeisti Draize akių bandymo in vivo, kad būtų galima prognozuoti skirtingų cheminių klasių visą dirginimo intervalą. Tačiau kelių alternatyvių bandymų metodų strateginiai deriniai taikant (nuosekliųjų) bandymų strategiją galėtų pakeisti Draize akių bandymą (6). Žemynkryptis metodas (7) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida apie didelę cheminės medžiagos dirginamojo poveikio gebą, o aukštynkryptis metodas (7) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida, kad cheminė medžiaga nepakankamai dirgina akis, kad ją reikėtų klasifikuoti. ICE bandymų metodas – bandymų metodas in vitro, kuris tam tikromis aplinkybėmis ir su tam tikrais apribojimais, kaip aprašyta 8–10 pastraipose, gali būti taikomas akims keliamam pavojui klasifikuoti ir cheminėms medžiagoms ženklinti. Nors kaip atskiras metodas ICE metodas nelaikomas tinkamu pakeisti triušių akių bandymą in vivo, jis rekomenduojamas kaip pirmas bandymų strategijos etapas, pvz., žemynkryptis metodas, pasiūlytas Scott et al. (7), be papildomų bandymų nustatant chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagas (4). ICE bandymų metodas taip pat rekomenduojamas, kai reikia identifikuoti chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo, kaip apibrėžta JT GHS (JT GHS be kategorijos) (4), ir todėl gali būti taikomas kaip pradinis aukštynkrypčio metodo bandymo strategijos etapas (7). Tačiau cheminė medžiaga, kuri pagal ICE bandymų metodą nelaikoma galinčia sukelti smarkų akių pažeidimą arba neklasifikuojama dėl akių dirginimo ar smarkaus akių pažeidimo, turėtų būti bandoma papildomai (in vitro ir (arba) in vivo) galutinei kategorijai nustatyti. Be to, prieš pradedant taikyti ICE kaip aukštinkryptį metodą pagal kitas nei JT GHS klasifikavimo schemas, reikėtų pasitarti su atitinkamomis priežiūros institucijomis.
                     Šio bandymo metodo tikslas – aprašyti procedūras, taikomas įvertinant bandomosios cheminės medžiagos keliamo pavojaus akims galimybę, matuojant jos gebą sukelti toksiškumą iš kūno paimtai viščiuko akiai. Toksinis poveikis ragenai matuojamas šiais būdais: i) kokybiškai vertinamas drumstumas, ii) kokybiškai vertinami epitelio pažeidimai ant akies uždėjus fluoresceino (fluoresceino sulaikymas), iii) kiekybiškai matuojamas storio padidėjimas (pabrinkimas) ir iv) kokybiškai įvertinami makroskopiniai morfologiniai paviršiaus pažeidimai. Ragenos drumstumas, pabrinkimas ir pažeidimai, paveikus bandomąja chemine medžiaga, vertinami atskirai ir kartu, kad būtų nustatyta akies dirginimo kategorija.
                     Apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                     Šis bandymo metodas pagrįstas EBPO rekomendaciniame dokumente 160 pasiūlytu protokolu (8), kuris buvo parengtas ICCVAM atlikus tarptautinį tinkamumo patvirtinimo tyrimą (1) (3) (9), padedant Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centrui, Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centrui ir TNO Gyvenimo kokybės – Toksikologijos ir taikomosios farmakologijos departamentui (Nyderlandai). Protokolas pagrįstas informacija, gauta iš paskelbtų protokolų ir iš TNO dabar taikomo protokolo (10) (11) (12) (13) (14).
                     Atliekant šio bandymų metodo tinkamumo patvirtinimą, buvo išbandyta didelė cheminių medžiagų grupė, o tinkamumo patvirtinimo tyrimo empirinę duomenų bazę sudarė 152 cheminės medžiagos, įskaitant 72 medžiagas ir 80 mišinių (5). Bandymų metodas tinka kietosioms medžiagoms, skysčiams, emulsijoms ir geliams. Skysčiai gali būti vandeniniai arba nevandeniniai; kietosios medžiagos gali būti tirpios arba netirpios vandenyje. Atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą, dujos ir aerozoliai nebuvo vertinami (24).
                     ICE bandymų metodas gali būti taikomas nustatant chemines medžiagas, kurios sukelia smarkius akių pažeidimus, t. y. chemines medžiagas, kurias reikia klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos medžiagas (4). Kai ICE metodas taikomas šiuo tikslu, nustatyti jo apribojimai – didelė alkoholiams gautų teigiamų rezultatų dalis ir didelė kietosioms medžiagoms bei paviršinio aktyvumo medžiagoms gautų klaidingai neigiamų rezultatų dalis (1) (3) (9). Tačiau klaidingai neigiamų rezultatų dalis šiame kontekste (JT GHS 1 kategorijos identifikuota kaip ne JT GHS 1 kategorijos) esmės nekeičia, nes, priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų, visos bandomosios cheminės medžiagos, kurioms gaunamas neigiamas rezultatas, vėliau bandomos atliekant tinkamai patvirtintą (-us) bandymą (-us) in vitro arba, blogiausiu atveju, bandymą su triušiais pagal nuosekliųjų bandymų strategiją, taikant įrodomosios duomenų galios metodą. Reikėtų pažymėti, kad atliekant kietųjų medžiagų Draize akių dirginimo bandymą in vivo gali būti kintamos ir ribinės veikimo sąlygos, dėl kurių gali būti gautos netinkamos jų tikrosios dirginamosios gebos prognozės (15). Tyrėjai galėtų spręsti, ar taikyti šį bandymų metodą visų tipų cheminėms medžiagoms, kai teigiamas rezultatas turėtų būti priimtas kaip smarkų akių pažeidimą sukeliančio atsako rodiklis ir cheminę medžiagą reikėtų klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos be papildomų bandymų. Tačiau teigiamus rezultatus, gautus bandant alkoholius, reikėtų aiškinti atsargiai, vengiant nepagrįstų prognozių.
                     Kai ICE bandymų metodas taikomas siekiant nustatyti chemines medžiagas, sukeliančias smarkius akių pažeidimus (JT GHS 1 kategorijos), jo visuminis tikslumas – 86 % (120/140), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 6 % (7/113), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 48 % (13/27), palyginti su triušio akių bandymų metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (4) (5).
                     ICE bandymų metodą taip pat galima taikyti nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo pagal JT GHS klasifikavimo sistemą (4). Prieš pradedant taikyti ICE kaip aukštinkryptį metodą pagal kitas klasifikavimo schemas, reikėtų pasitarti su atitinkamomis reguliavimo institucijomis. Šį bandymų metodą galima taikyti visų tipų cheminėms medžiagoms, kurioms gautą neigiamą rezultatą būtų galima priimti kaip įrodymą, kad cheminės medžiagos nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ir smarkaus akių pažeidimo. Tačiau, atsižvelgiant į vieną rezultatą iš tinkamumo įvertinimo duomenų bazės, organinių tirpiklių turintiems nuo apnašų apsaugantiems dažams galėtų būti gautas klaidingai neigiamas rezultatas (5).
                     Kai ICE bandymų metodas taikomas nustatant chemines medžiagas, kurių nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo ir smarkaus akių pažeidimo, jo visuminis tikslumas – 82 % (125/152), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 33 % (26/79), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 1 % (1/73), palyginti su triušio akių bandymų metodo in vivo duomenimis, klasifikuojamais pagal JT GHS (4) (5). Kai tam tikrų klasių bandomosios cheminės medžiagos (t. y. organinių tirpiklių turintys nuo apnašų apsaugantys dažai) pašalinamos iš duomenų bazės, ICE bandymų metodo tikslumas taikant JT GHS klasifikavimo sistemą yra 83 % (123/149), klaidingai teigiamų rezultatų dalis – 33 % (26/78), klaidingai neigiamų rezultatų dalis – 0 % (0/71) (4) (5).
                     ICE bandymų metodas nerekomenduojamas, kai reikia nustatyti bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis dirginančias (t. y. JT GHS 2 kategorijos ar 2A kategorijos), arba bandomąsias chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis nestipriai dirginančias (JT GHS 2B kategorijos), dėl gana didelio skaičiaus JT GHS 1 kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai, ir JT GHS be kategorijos cheminių medžiagų, klaidingai priskiriamų JT GHS 2, 2A ar 2B kategorijai. Šiuo tikslu gali prireikti papildomų bandymų taikant kitą tinkamą metodą.
                     Visos procedūros su viščiukų akimis turėtų būti atliekamos pagal bandymų laboratorijos taikytinas žmogaus arba gyvūninės kilmės medžiagų, įskaitant audinius ir audinių skysčius, bet neapsiribojant tik jais, tvarkymo taisykles ir procedūras. Rekomenduojama laikytis bendrųjų laboratorijose taikytinų atsargumo priemonių (16).
                     Nors ICE bandymų metode neatsižvelgiama į akies junginės ir rainelės pažeidimus, kurie yra įvertinami taikant triušio akių dirginimo bandymų metodą, tiriamas poveikis ragenai, kuris yra pagrindinis rodiklis, klasifikuojant in vivo pagal JT GHS klasifikavimą. Be to, nors pagal ICE bandymų metodą ragenos pažeidimų grįžtamumas negali būti įvertintas tiesiogiai, atsižvelgiant į triušio akių tyrimus, buvo pasiūlyta naudoti ragenos žaizdos pradinį gylį, kaip galimą būdą kai kuriems negrįžtamo poveikio tipams nustatyti (17). Visų pirma reikia turėti papildomų mokslinių duomenų, kad būtų galima suprasti, kaip atsiranda negrįžtamas poveikis, nesusijęs su dideliu pradinio pažeidimo lygiu. Galiausiai taikant ICE bandymų metodą negalima įvertinti su poveikiu akims susijusio sisteminio toksiškumo galimybės.
                     Šis bandymų metodas bus periodiškai atnaujinamas, kai tik bus išnagrinėta nauja informacija ir duomenys. Pvz., gali būti naudinga histopatologija, kai reikia išsamiau apibūdinti ragenos pažeidimus. Siekiant įvertinti šią galimybę, naudotojai skatinami konservuoti ragenas ir ruošti histopatologinius bandinius, kuriuos galima naudoti kuriant duomenų bazę ir sprendimo priėmimo kriterijus, galinčius pagerinti šio bandymų metodo tikslumą. EBPO parengė toksiškumo akims bandymų in vitro metodų rekomendacinį dokumentą, kurį sudaro išsamiai aprašytos histopatologinių bandinių ėmimo procedūros ir informacija apie tai, kur pateikti bandinius ir (arba) histopatologinius duomenis (8).
                     Kiekviena laboratorija, kuri pradėtų taikyti šį bandymo metodą, turėtų naudoti kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas, nurodytas 2 priedėlyje. Laboratorija gali naudoti šias chemines medžiagas, norėdama įrodyti savo techninę kompetenciją taikyti ICE bandymo metodą, prieš pateikdama ICE bandymų duomenis teisės aktuose numatytais pavojų klasifikavimo tikslais.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     ICE bandymo metodas yra organotipinių audinių tyrimo modelis, pagal kurį galima išsaugoti trumpalaikį viščiuko akies funkcionavimą in vitro. Pagal šį bandymų metodą bandomosios cheminės medžiagos padarytas pažeidimas nustatomas įvertinant ragenos pabrinkimą, drumstumą ir fluoresceino sulaikymą. Pastarieji du parametrai vertinami kokybiškai, o ragenos pabrinkimo analizė yra kiekybinis įvertinimas. Kiekvienas matavimas perskaičiuojamas į kiekybinį balą, naudojamą visuminiam dirginimo indeksui apskaičiuoti, arba priskiriama kokybinė kategorija, kuri naudojama pavojui akims in vitro klasifikuoti kaip JT GHS 1 kategorijos arba kaip JT GHS be kategorijos. Bet kuris iš šių rezultatų po to gali būti naudojamas bandomosios cheminės medžiagos sukeliamam smarkiam akių pažeidimui in vivo prognozuoti arba nustatyti, kad bendomosios cheminės medžiagos pavojaus akims klasifikuoti nereikia (žr. Sprendimo priėmimo kriterijai). Tačiau ICE bandymų metodu neįmanoma suklasifikuoti cheminių medžiagų, kurios nenustatytos kaip sukeliančios smarkius akių pažeidimus arba kurios neklasifikuojamos (žr.11 pastraipą).
                     
                        Viščiukų akių šaltinis ir amžius
                     
                     Paprastai šiam tyrimui naudojamos žmonėms skirtų vartoti viščiukų akys, paimtos skerdykloje, kurioje viščiukai skerdžiami, kad nereikėtų naudoti laboratorinių gyvūnų. Naudojamos tik sveikų gyvūnų, kurie laikomi tinkamais patekti į žmonių maisto grandinę, akys.
                     Nors kontrolinis tyrimas tinkamiausiam viščiukų amžiui įvertinti nebuvo atliktas, anksčiau taikant šį bandymų metodą buvo naudojami viščiukai, kurių amžius ir masė atitinka paukščių skerdykloje pavasarį skerdžiamų mėsinių viščiukų amžių ir masę (t. y. maždaug 7 savaičių amžiaus, 1,5–2,5 kg masės).
                     
                        Akių paėmimas ir transportavimas į laboratoriją
                     
                     Galvos turėtų būti nupjautos iš karto po to, kai viščiukai numarinami, paprastai elektros šoku, ir įpjaunamas kaklas, kad nubėgtų kraujas. Reikėtų rasti netoli laboratorijos esantį vietinį viščiukų šaltinį, kad galvas būtų galima nuvežti iš skerdyklos į laboratoriją pakankamai greitai ir būtų kuo mažesnė jų pažeidimo ir (arba) užteršimo bakterijomis tikimybė. Laikotarpis nuo viščiukų galvų surinkimo iki išpjautų akių pernešimo į perfuzijos aparato kamerą turėtų būti kuo mažesnis (paprastai trumpesnis kaip dvi valandos), kad būtų užtikrinta atitiktis tyrimo priimtinumo kriterijams. Visos bandymui atlikti naudojamos akys turėtų būti iš tos pačios tam tikrą dieną surinktos akių grupės.
                     Kadangi akys išpjaunamos laboratorijoje, iš skerdyklos vežamos galvos su akimis laikomos plastikinėse dėžėse aplinkos temperatūroje (paprastai nuo 18 °C iki 25 °C) ir drėkinamos servetėlėmis, įmirkytomis izotoniniu druskos tirpalu.
                     
                        ICE bandymui skirtų akių atrankos kriterijai ir skaičius
                     
                     Išimtos akys atmetamos, jei jų dažymo fluoresceinu atskaitos vertės (t. y. > 0,5) arba ragenos drumstumo atskaitos vertės (t. y. > 0,5) yra didelės.
                     Kiekvieną apdorotų ėminių ir vienalaikių kontrolinių ėminių grupę sudaro ne mažiau kaip trys akys. Neigiamo kontrolinio ėminio arba tirpiklio ar nešiklio kontrolinio ėminio (jei naudojamas kitas nei druskos tirpalas tirpiklis) grupę sudaro bent viena akis.
                     Jei kietosioms medžiagoms gaunamas GHS be kategorijos rezultatas, rekomenduojama atlikti antrąjį bandymą su trimis akimis, kad būtų patvirtintas arba paneigtas neigiamas rezultatas.
                     PROCEDŪRA
                     
                        Akių paruošimas
                     
                     Atsargiai, nepažeidžiant ragenos, išpjaunami akių vokai. Ragenos vientisumas greitai įvertinamas ant ragenos paviršiaus kelioms sekundėms užlašinus 2 % (m/V) fluoresceino natrio druskos tirpalo lašą ir jį nuplovus izotoniniu druskos tirpalu. Fluoresceinu apdorotos akys apžiūrimos per mikroskopą su plyšine lempa, siekiant įsitikinti, ar ragena yra nepažeista (t. y. ar fluoresceino sulaikymo ir ragenos drumstumo vertės yra ≤ 0,5).
                     Jei ragena nepažeista, akis išpjaunama iš kaukolės, nepažeidžiant ragenos. Akies obuolys ištraukiamas iš akiduobės tvirtai suimant mirksimąją membraną chirurginėmis žnyplėmis, tada lenktomis, bukais galais žirklėmis nupjaunami akies raumenys. Svarbu nepažeisti ragenos (t. y. nepalikti spaudimo žymių) per daug ją spaudžiant.
                     Akį išėmus iš akiduobės, matoma regos nervo dalis turėtų būti palikta. Iš akiduobės išimta akis padedama ant sugeriamojo padėklo, tada nupjaunama mirksimoji membrana ir kiti jungiamieji audiniai.
                     Išimta akis tvirtinama nerūdijančiojo plieno laikiklyje taip, kad ragenos padėtis būtų vertikali. Laikiklis perkeliamas į perfuzijos aparato kamerą (18). Laikiklius perfuzijos aparate reikėtų įtaisyti taip, kad izotoninis druskos tirpalas lašėtų ant visos ragenos (3–4 lašai per minutę ar 0,1–0,15 ml/min). Kontroliuojama perfuzijos aparato kamerų temperatūra turėtų būti 32 ± 1,5 °C. 3 priedėlyje pateikta perfuzijos aparato ir akių laikiklių, kuriuos galima nusipirkti arba pasigaminti, schema. Aparato konstrukciją galima keisti, atsižvelgiant į kiekvienos laboratorijos poreikius (pvz., norint įdėti kitokį akių skaičių).
                     Įdėjus akis į perfuzijos aparatą, jos dar kartą apžiūrimos per mikroskopą su plyšine lempa, siekiant įsitikinti, ar jos nebuvo pažeistos per išpjovimo procedūrą. Kartu taip pat turėtų būti išmatuotas ragenos storis jos viršūnėje, naudojant gylio matavimo prietaisą, įrengtą mikroskope su plyšine lempa. Akis, kurių i) fluoresceino sulaikymo vertė > 0,5, ii) ragenos drumstumas > 0,5 arba iii) yra papildomų pažeidimo požymių, reikėtų pakeisti. Jei akys nebuvo atmestos pagal kurį nors iš šių kriterijų, reikėtų atmesti atskiras akis, kurių ragenos storio nuokrypis nuo visų akių vidurkio didesnis kaip 10 %. Naudotojai turėtų žinoti, kad matuojant mikroskopu su plyšine lempa gautas ragenų storis gali skirtis, pasirinkus nevienodus plyšio pločio nuostačius. Reikėtų nustatyti 0,095 mm pločio plyšį.
                     Apžiūrėjus akis ir patvirtinus jų tinkamumą, jos maždaug 45–60 min inkubuojamos, kad prieš dozavimą būtų pasiekta pusiausvyra su bandymo sistema. Pasibaigus pusiausvirinimo laikotarpiui, registruojamos ragenos nulinės storio ir drumstumo vertės, kurios būtų naudojamos kaip atskaitos vertės (t. y. laikas = 0). Išpjovimo metu gauta fluoresceino skaitinė vertė naudojama kaip šios vertinamosios baigties atskaitos vertė.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos įterpimas
                     
                     Iš karto po nulinio laiko atskaitos verčių matavimo, akis (su laikikliu) išimama iš perfuzijos aparato, padedama horizontaliai ir ant ragenos uždedama bandomosios cheminės medžiagos.
                     Skystos bandomosios cheminės medžiagos paprastai bandomos grynos, tačiau prireikus (pvz., jei tai yra tyrimo schemos dalis) jas galima atskiesti. Tinkamiausias bandomųjų cheminių medžiagų tirpiklis yra fiziologinis tirpalas. Kontroliuojamomis sąlygomis galima naudoti kitus tirpiklius, tačiau būtina įrodyti tirpiklių, kurie nėra fiziologinis tirpalas, tinkamumą.
                     Skystos bandomosios cheminės medžiagos užlašinamos ant ragenos taip, kad visas ragenos paviršius būtų tolygiai padengtas bandomąja chemine medžiaga, kurios tipinis tūris – 0,03 ml.
                     Jei įmanoma, kietąsias bandomąsias chemines medžiagas reikėtų kuo smulkiau sumalti grūstuve arba panašia malimo priemone. Milteliai ant ragenos beriami taip, kad jos paviršius būtų tolygiai padengtas bandomąja chemine medžiaga, kurios tipinis kiekis – 0,03 g.
                     Bandomoji cheminė medžiaga (skysta arba kieta) laikoma uždėta 10 sekundžių ir nuplaunama nuo akies aplinkos temperatūros izotoniniu druskos tirpalu (maždaug 20 ml). Tada akis (su laikikliu) vėl įdedama į perfuzijos aparatą, į pradinę vertikaliąją padėtį. Prireikus po 10 sekundžių laikymo ir vėlesniais laiko momentais (pvz., ant ragenos radus bandomosios cheminės medžiagos likučių) galima plauti papildomai. Apskritai papildomam plovimui naudojamas druskos tirpalo tūris neturi didelės reikšmės, bet svarbu pastebėti, ar ant ragenos yra prilipusios cheminės medžiagos.
                     
                        Kontrolinės cheminės medžiagos
                     
                     Atliekant kiekvieną bandymą turėtų būti įtraukti vienalaikiai neigiami arba tirpiklio ar nešiklio kontroliniai ėminiai ir teigiami kontroliniai ėminiai.
                     Kai pagal ICE bandymo metodą bandomi gryni skysčiai arba kietosios medžiagos, kaip vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys naudojamas fiziologinis tirpalas, kad būtų galima aptikti netipinius bandymo sistemos pokyčius ir kad tyrimo sąlygos nesukeltų netinkamo dirginamojo atsako.
                     Kai taikant bandymo metodą bandomi atskiesti skysčiai, įtraukiama vienalaikė tirpiklio ar nešiklio kontrolinė grupė, kad būtų galima aptikti netipinius bandymo sistemos pokyčius ir kad tyrimo sąlygos nesukeltų netinkamo dirginamojo atsako. Kaip nurodyta 31 skirsnyje, galima naudoti tik tokį tirpiklį ar nešiklį, kuris, kaip įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai.
                     Siekiant patikrinti, ar sukeliamas reikiamas atsakas, atliekant kiekvieną bandymą kaip teigiama kontrolinė medžiaga įtraukiama žinoma akis dirginanti medžiaga. Kadangi pagal šį bandymo metodą ICE bandymas atliekamas ėsdinančioms arba smarkiai dirginančioms medžiagoms nustatyti, šio bandymų metodo teigiama kontrolinė medžiaga turėtų būti etaloninė cheminė medžiaga, kuri sukelia stiprų atsaką. Tačiau, siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus. Turėtų būti gauta pakankamai in vitro duomenų apie teigiamą kontrolinę medžiagą, kad būtų galima apskaičiuoti statistiškai apibrėžtą priimtiną teigiamos kontrolinės medžiagos intervalą. Jei tinkamų istorinių ICE bandymo metodo duomenų apie tam tikrą teigiamą kontrolinę medžiagą nėra, gali tekti atlikti tyrimus šiai informacijai gauti.
                     Tinkamų teigiamų kontrolinių medžiagų pavyzdžiai bandant skystas chemines medžiagas yra 10 % acto rūgštis arba 5 % benzalkonio chloridas, o bandant kietąsias chemines medžiagas – natrio hidroksidas arba imidazolas.
                     Palyginamosios cheminės medžiagos yra naudingos, kai reikia įvertinti tam tikros cheminių medžiagų ar produktų klasės nežinomų cheminių medžiagų gebą dirginti akis arba akis dirginančios medžiagos santykinę dirginamąją gebą tam tikrame atsako į dirginimą intervale.
                     
                        Matuojamos vertinamosios baigtys
                     
                     Apdorotos ragenos įvertinamos prieš apdorojimą ir 30, 75, 120, 180 bei 240 min (± 5 min) po apdorotų ragenų nuplovimo. Matuojant tokiais laiko momentais užtikrinamas tinkamas matavimų skaičius keturių valandų apdorojimo laikotarpiu, tarp matavimų paliekant pakankamai laiko reikiamai visų akių apžiūrai.
                     Nustatytos vertinamosios baigtys – ragenos drumstumas, pabrinkimas, fluoresceino sulaikymas ir morfologiniai padariniai (pvz., epitelio išopėjimas arba atsiskyrimas). Visos vertinamosios baigtys, išskyrus fluoresceino sulaikymą (kuris nustatomas tik prieš apdorojimą ir praėjus 30 min nuo paveikimo bandomąja chemine medžiaga), vertinamos kiekvienu pirmiau nurodytu laiko momentu.
                     Patariama padaryti nuotraukas, kad būtų gauti ragenos drumstumo, fluoresceino sulaikymo, morfologinių padarinių ir histopatologinių tyrimų, jei atliekami, dokumentai.
                     Baigus keturių valandų tyrimą, naudotojams siūloma konservuoti akis tinkamame fiksavimo tirpale (pvz., neutraliame buferuotame formalino tirpale), kad būtų galima atlikti histopatologinį tyrimą (išsamesnės informacijos pateikta 14 pastraipoje ir (8) nuorodoje).
                     Ragenų pabrinkimas nustatomas ragenos storį matuojant optiniu pachimetru, įrengtu mikroskope su plyšine lempa. Jis išreiškiamas procentais ir taikant ragenos storio matavimo duomenis apskaičiuojamas pagal šią formulę:
                     
                        
                     Apskaičiuojamas visų bandytų akių vidutinis ragenos pabrinkimas procentais kiekvienu stebėjimo laiko momentu. Pagal didžiausią vidutinį ragenos pabrinkimo balą, nustatytą kuriuo nors laiko momentu, kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai priskiriamas visuminis kategorijos balas (žr. 51 pastraipą).
                     Ragenos drumstumas įvertinamas tame ragenos plote, kuris labiausiai nepraleidžia šviesos, kad būtų gautas drumstumo balas, pateiktas 1 lentelėje. Apskaičiuojama visų bandytų akių vidutinė ragenos drumstumo vertė kiekvienu stebėjimo laiko momentu. Pagal didžiausią vidutinį ragenos drumstumo balą, nustatytą kuriuo nors laiko momentu, kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai priskiriamas bendras kategorijos balas (žr. 51 pastraipą).
                     
                        1 lentelė
                     
                     
                        Ragenos drumstumo balai
                     
                     
                                 Balas
                              
                              
                                 Stebėjimo rezultatas
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 Jokio drumstumo
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 Labai nežymus drumstumas
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 Taškinės arba pasklidosios drumstumo sritys; rainelės elementai aiškiai matomi
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 Lengvai įžiūrima pusskaidrė sritis; rainelės elementai šiek tiek neryškūs
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 Didelis ragenos drumstumas, atskirų rainelės elementų nesimato; vyzdžio dydis vos įžiūrimas
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 Visiškas ragenos drumstumas; vyzdys nematomas
                              
                           Fluoresceino sulaikymas įvertinamas tik 30 min atitinkančiu stebėjimo momentu, kaip pateikta 2 lentelėje. Visų bandytų akių vidutinė fluoresceino sulaikymo vertė apskaičiuojama tik 30 min atitinkančiam stebėjimo momentui ir ji naudojama kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos visuminiam kategorijos balui gauti (žr. 51 pastraipą).
                     
                        2 lentelė
                     
                     
                        Fluoresceino sulaikymo balai
                     
                     
                                 Balas
                              
                              
                                 Stebėjimo rezultatas
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 Jokio fluoresceino sulaikymo
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 Labai nedaug pavienių dažytų ląstelių
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 Pavienės dažytos ląstelės, išsklaidytos per visą apdorotą ragenos plotą
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 Dažytų pavienių ląstelių tankūs židiniai arba susilieję plotai
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 Dideli susilieję fluoresceiną sulaikančios ragenos plotai
                              
                           Morfologiniai padariniai aprėpia ragenos epitelio ląstelių opėjimą, epitelio atsiskyrimą, ragenos paviršiaus šiurkštėjimą ir bandomosios cheminės medžiagos sulipimą su ragena. Šių požymių stiprumas gali būti įvairus ir jie gali pasireikšti kartu. Šių požymių klasifikavimas yra subjektyvus, priklauso nuo tyrėjo aiškinimų.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Duomenų įvertinimas
                     
                     Ragenos drumstumo, pabrinkimo ir fluoresceino sulaikymas turėtų būti įvertinti atskirai, kad būtų gauta kiekvienos vertinamosios baigties ICE klasė. Tada kiekvienos vertinamosios baigties ICE klasės apibendrinamos, kad būtų gautas kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos akių dirginimo klasifikavimas.
                     
                        Sprendimo priėmimo kriterijai
                     
                     Nustačius kiekvieną vertinamąją baigtį, ICE klasės gali būti priskirtos atsižvelgiant į iš anksto nustatytą intervalą. Ragenos pabrinkimo (3 lentelė), drumstumo (4 lentelė) ir fluoresceino sulaikymo (5 lentelė) rezultatų aiškinimas, taikant keturias ICE klases, atliekamas pagal toliau pateiktas skales. Svarbu atkreipti dėmesį į tai, kad 3 lentelėje pateikti ragenos pabrinkimo balai taikomi tik tada, jei storis matuojamas mikroskopu su plyšine lempa (pvz., Haag-Streit BP900), gylio matavimo įtaisu Nr.1 ir plyšio pločio nuostačiu 9, kuris yra lygus 0,095 mm. Naudotojai turėtų žinoti, kad matuojant mikroskopu su plyšine lempa ragenos storio matmenys gali skirtis, jei skirtingas plyšio pločio nuostatis.
                     
                        3 lentelė
                     
                     
                        ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į ragenos pabrinkimą
                     
                     
                                 Vidutinis ragenos pabrinkimas (%) (*2)
                                 
                              
                              
                                 ICE klasė
                              
                           
                                 nuo 0 iki 5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 nuo > 5 iki 12
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 nuo > 12 iki 18 (> 75 min nuo apdorojimo)
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 nuo > 12 iki 18 (≤ 75 min nuo apdorojimo)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 nuo > 18 iki 26
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 nuo > 26 iki 32 (> 75 min nuo apdorojimo)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 nuo > 26 iki 32 (≤ 75 min nuo apdorojimo)
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                                 > 32
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        4 lentelė
                     
                     
                        ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į drumstumą
                     
                     
                                 Maksimalus vidutinis drumstumo balas (*3)
                                 
                              
                              
                                 ICE klasė
                              
                           
                                 0,0–0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6–1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6–2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6–4,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        .5 lentelė
                     
                     
                        ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į vidutinį fluoresceino sulaikymą
                     
                     
                                 Vidutinis fluoresceino sulaikymo balas, praėjus 30 min nuo apdorojimo (*4)
                                 
                              
                              
                                 ICE klasė
                              
                           
                                 0,0–0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6–1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6–2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6–3,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           Bandomosios cheminės medžiagos in vitro klasifikavimas vertinamas gaunant GHS klasifikavimą, kuris atitinka gautų ragenų pabrinkimo, ragenų drumstumo ir fluoresceino sulaikymo kategorijų derinį, kaip aprašyta 6 lentelėje.
                     
                        6 lentelė
                     
                     
                        Visuminis in vitro klasifikavimas
                     
                     
                                 JT GHS klasifikavimas
                              
                              
                                 Trijų vertinamųjų baigčių deriniai
                              
                           
                                 Be kategorijos
                              
                              
                                 3 × I
                                 2 × I, 1 × II
                              
                           
                                 Prognozės pateikti negalima
                              
                              
                                 Kiti deriniai
                              
                           
                                 1 kategorija
                              
                              
                                 3 × IV
                                 2 × IV, 1 × III
                                 2 × IV, 1 × II (*5)
                                 
                                 2 × IV, 1 × I (*5)
                                 
                                 Ragenos drumstumas ≥ 3 po 30 min (ne mažiau kaip dviejų akių)
                                 Ragenos drumstumas = 4 kuriuo nors laiko momentu (ne mažiau kaip dviejų akių)
                                 Didelis epitelio atsiskyrimas (bent vienos akies)
                              
                           
                        Tyrimo priimtinumo kriterijai
                     
                     Bandymas laikomas priimtinu, jei vienalaikiai neigiami arba nešiklio ar tirpiklio kontroliniai ėminiai ir vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai nustatomi kaip GHS neklasifikuojami ar GHS 1 kategorijos ėminiai.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija, jei ji yra svarbi atliekant tyrimą:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga ir kontrolinės cheminės medžiagos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminės medžiagos pavadinimas (-ai), pvz., Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. Chemical Abstracts Service, CAS) naudojamas struktūrinis pavadinimas ir kiti pavadinimai, jei jie žinomi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             CAS registro numeris (RN), jei žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios ir (arba) kontrolinės cheminės medžiagos grynumas ir sudėtis (masės procentinėmis dalimis), jei tokia informacija yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tyrimui atlikti reikiamos fizikinės ir cheminės savybės, pvz., agregatinė būsena, lakumas, pH, stabilumas, cheminių junginių klasė, tirpumas vandenyje;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomųjų ir (arba) kontrolinių cheminių medžiagų apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilumas, jei jis žinomas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Informacija apie rėmėją ir bandymų laboratoriją
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             rėmėjo pavadinimas ir adresas, bandymų laboratorija ir tyrimo vadovas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             akių šaltinio identifikavimo duomenys (t. y. įmonė, iš kurios jos buvo paimtos);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymų metodo sąlygos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotos bandymo sistemos aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotas mikroskopas su plyšine lempa (pvz., modelis) ir naudoto prietaiso padaryti nuostačiai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             istorinių neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių rezultatų nuorodos ir, jei tinka, istoriniai duomenys, kurie parodo priimtinus vienalaikių palyginamųjų medžiagų kontrolinių ėminių intervalus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             procedūra, taikyta bandymų metodo vientisumui (t. y. tikslumui ir patikimumui) užtikrinti laikui bėgant (pvz., kvalifikaciniam bandymui skirtų cheminių medžiagų periodinis tikrinimas).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Akių surinkimas ir paruošimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūno donoro amžius ir masė ir, jei yra, kitos gyvūnų, kurių akys buvo imamos, specifinės charakteristikos (pvz., lytis, veislė);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             akių laikymo ir transportavimo sąlygos (pvz., akių paėmimo data ir laikas, laiko tarpas nuo viščiukų galvų surinkimo iki išpjautų akių įdėjimo į perfuzijos kamerą);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             akių paruošimas ir įdėjimas, įskaitant pastabas dėl jų kokybės, akių kamerų temperatūra ir bandymams skirtų akių atrankos kriterijai.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymų procedūra
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kartotinių ėminių skaičius
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotų neigiamų ir teigiamų kontrolinių medžiagų identifikavimo duomenys (taip pat tirpiklio ir palyginamųjų kontrolinių cheminių medžiagų, jei tinka);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos dozė, naudotas uždėjimo laikas ir veikimo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stebėjimo laiko momentai (pieš apdorojimą ir po jo);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             įvertinimo ir taikytų sprendimo priėmimo kriterijų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikytų tyrimo priimtinumo kriterijų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų bandymo procedūros pakeitimų aprašymas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienu stebėjimo momentu gautų kiekvienos atskiros akies ragenos pabrinkimo, drumstumo ir fluoresceino sulaikymo balų lentelė, įskaitant visų bandytų akių vidutinį balą kiekvienu stebėjimo momentu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stebėti (bet kuriuo laiko momentu) didžiausi vidutiniai ragenos pabrinkimo, drumstumo ir fluoresceino sulaikymo balai ir susijusi ICE klasė.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų kitų pastebėtų reiškinių aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gautas in vitro GHS klasifikavimas, jei tinka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             akies nuotraukos, jei reikia.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvada
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Available: [http://ecvam.jrc.it/index.htm].
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Available: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm]
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, UN New York and Geneva, 2011. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html]
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Šio priedo B.5 skyrius. Ūmus akių dirginimas arba ėsdinimas.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1-9.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2011) Guidance Document on „The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants“. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Available: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/].
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78-81.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Tikslumas
                           – bandymo metodo rezultatų ir patvirtintų pamatinių verčių sutapimo artumas. Tikslumas yra bandymo metodo taikymo charakteristikų matas ir vienas iš „tinkamumo“ aspektų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „atitiktis“ tinkamų bandymo metodo rezultatų daliai išreikšti.
                        
                           
                              Palyginamoji cheminė medžiaga
                           – cheminė medžiaga, naudojama kaip etalonas lyginant su bandomąja chemine medžiaga. Palyginamoji cheminė medžiaga turėtų turėti šias savybes: i) pastovų (-ius) ir patikimą (-us) šaltinį (-ius); ii) struktūrinį ir funkcinį panašumą su bandomųjų cheminių medžiagų klase; iii) žinomas fizikines ir (arba) chemines charakteristikas; iv) žinomą poveikį patvirtinančius duomenis ir v) žinomą veikimo gebą reikiamo atsako intervale.
                        
                           
                              Aukštynkryptis metodas
                           – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad jos nereikia klasifikuoti dėl akių dirginimo arba smarkaus akių pažeidimo, kai cheminės medžiagos, kurių nereikia klasifikuoti (duoda neigiamą rezultatą), nustatomos atskiriant jas nuo kitų cheminių medžiagų (duoda teigiamą rezultatą).
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Ragena
                           – permatoma priekinė akies obuolio dalis, dengianti rainelę bei vyzdį ir praleidžianti šviesą į vidų.
                        
                           
                              Ragenos drumstumas
                           – ragenos, paveiktos bandomąja chemine medžiaga, neskaidrumo laipsnio matas. Padidėjęs ragenos drumstumas rodo ragenos pažeidimą.
                        
                           
                              Ragenos pabrinkimas
                           – objektyvus atliekant ICE bandymą nustatomas ragenos išsipūtimo lygio, baigus veikti bandomąja chemine medžiaga, matas. Išreiškiamas procentais ir apskaičiuojamas pagal ragenos storio atskaitos vertę (nustatytą prieš veikiant doze) ir ragenos storį, užregistruotą vienodais laiko tarpais, baigus veikti bandomąja chemine medžiaga atliekant ICE bandymą. Ragenos pabrinkimo lygis rodo ragenos pažeidimą.
                        
                           
                              Akių dirginimas
                           – akių pokyčių sukėlimas, uždėjus bandomosios cheminės medžiagos ant priekinio akies paviršiaus, kai pokyčiai visiškai išnyksta per 21 parą nuo uždėjimo. Sukeičiama su Grįžtamasis poveikis akims ir su JT GHS 2 kategorija (4).
                        
                           
                              Klaidingai neigiamų rezultatų dalis
                           – visų teigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai nustatytos kaip neigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.
                        
                           
                              Klaidingai teigiamų rezultatų dalis
                           – visų neigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip teigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.
                        
                           
                              Fluoresceino sulaikymas
                           – per ICE bandymą subjektyviai nustatomas fluoresceino natrio druskos kiekis, išlikęs ragenos epitelio ląstelėse, rageną baigus veikti bandomąja chemine medžiaga. Fluoresceino sulaikymo laipsnis rodo ragenos epitelio pažeidimą.
                        
                           
                              Pavojus
                           – būdingoji agento savybė arba situacija, galinti sukelti neigiamų padarinių, kai organizmą, sistemą ar populiaciją (arba jos dalį) veikia tas agentas.
                        
                           
                              Negrįžtamasis poveikis akims
                           – žr. smarkus akių pažeidimas ir JT GHS 1 kategorija.
                        
                           
                              Mišinys
                           – dviejų arba daugiau medžiagų mišinys arba tirpalas, kuriuose jos nereaguoja (4)
                        
                           
                              Neigiamas kontrolinis ėminys
                           – neapdorotas kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus. Šis ėminys tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti, ar vyksta tirpiklio sąveika su bandymo sistema.
                        
                           
                              Neklasifikuojamos
                           – cheminės medžiagos, kurios neklasifikuojamos dėl akių dirginimo (JT GHS 2 kategorija) ar dėl smarkaus akių pažeidimo (JT GHS 1 kategorija). Sukeičiama su JT GHS be kategorijos.
                        
                           
                              Teigiamas kontrolinis ėminys
                           – kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus ir paveiktas chemine medžiaga, kuri yra žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką. Siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus.
                        
                           
                              Patikimumas
                           – pagal tą patį protokolą atliekamo bandymų metodo, tam tikrą laiką taikomo laboratorijose ir tarp laboratorijų, atkuriamumo laipsnio matai. Jis įvertinamas apskaičiuojant atkuriamumą laboratorijoje ir tarp laboratorijų ir pakartojamumą laboratorijoje.
                        
                           
                              Grįžtamasis poveikis akims
                           – žr. akių dirginimas ir JT GHS 2 kategorija.
                        
                           
                              Smarkus akių pažeidimas
                           – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kuris ne visiškai išnyksta praėjus 21 parai nuo uždėjimo. Sukeičiama su Nerįžtamasis poveikis akims ir su JT GHS 1 kategorija (4).
                        
                           
                              Mikroskopas su plyšine lempa
                           – prietaisas, naudojamas tiesiogiai ištirti akį, jos vaizdą padidinant binokuliniu mikroskopu ir sukuriant tiesioginį stereoskopinį vaizdą. Taikant ICE bandymo metodą, šis prietaisas naudojamas viščiukų akių priekinėms struktūroms apžiūrėti ir ragenos storiui objektyviai išmatuoti pritaisytu gylio matavimo prietaisu.
                        
                           
                              Tirpiklio ar nešiklio kontrolinis ėminys
                           – visus bandymo sistemos komponentus, įskaitant tirpiklį ar nešiklį, turintis neapdorotas ėminys, kuris tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti atskaitos vertę ėminiams, paveiktiems bandomąja chemine medžiaga, ištirpinta tame pačiame tirpiklyje ar nešiklyje. Kai bandomas kartu su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, šis ėminys taip pat parodo, ar vyksta tirpiklio arba nešiklio sąveika su bandymo sistema.
                        
                           
                              Medžiaga
                           – natūralios būsenos arba gamybos procese gaunami cheminiai elementai ir jų junginiai, įskaitant visus priedus, kurie reikalingi produkto stabilumui užtikrinti, ir visas priemaišas, patenkančias į produktą jo gamybos proceso metu, tačiau neįskaitant tirpiklio, kurį galima atskirti, nepaveikiant medžiagos stabilumo ar nekeičiant jos sudėties;
                        
                           
                              Paviršinio aktyvumo medžiaga
                           – dar vadinama paviršinio aktyvumo agentu, tai yra medžiaga, pvz., ploviklis, kuri gali sumažinti skysčio paviršiaus įtemptį, kad skystis galėtų putoti ar prasiskverbti į kietąsias medžiagas; be to, ji žinoma drėkiklio pavadinimu.
                        
                           
                              Žemynkryptis metodas
                           – pakopinis metodas, taikomas cheminei medžiagai, apie kurią daroma prielaida, kad ji sukelia smarkų akių pažeidimą, kai cheminės medžiagos, kurios sukelia smarkų akių pažeidimą (duoda teigiamą rezultatą), nustatomos atskiriant jas nuo kitų cheminių medžiagų (duoda neigiamą rezultatą).
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Nuosekliųjų bandymų strategija
                           – pakopomis atliekamų bandymų strategija, kai tam tikra eilės tvarka nagrinėjama visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, kiekvienoje pakopoje taikant įrodomosios vertės analizės procesą, siekiant nustatyti, ar yra pakankamai duomenų sprendimui dėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš pereinant prie kitos pakopos. Jei bandomosios cheminės medžiagos dirginamąją gebą galima nustatyti atsižvelgiant į turimą informaciją, papildomų bandymų atlikti nereikia. Jei atsižvelgiant į turimą informaciją, bandomajai cheminei medžiagai dirginamosios gebos priskirti neįmanoma, taikoma nuosekliųjų bandymų su gyvūnais procedūra tol, kol būtų galima gauti nedviprasmį klasifikavimą.
                        
                           
                              Jungtinių Tautų visuotinai suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema (JT GHS)
                           – sistema, kurioje pateikiamas cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimas pagal standartizuotus fizikinių pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai tipus ir nagrinėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signaliniai žodžiai, pavojingumo frazės, atsargumo frazės ir saugos duomenų lapai, kad būtų galima informuoti apie medžiagų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vežėjus, vartotojus ir avarijų likvidatorius) ir aplinką (4).
                        
                           
                              JT GHS 1 kategorija
                           – žr. Smarkus akių pažeidimas ir (arba) Negrįžtamasis poveikis akims.
                        
                           
                              JT GHS 2 kategorija
                           – žr. Akių dirginimas ir (arba) Grįžtamasis poveikis akims.
                        
                           
                              JT GHS be kategorijos
                           – cheminės medžiagos, kurios neatitinka JT GHS 1 arba 2 (2A ar 2B) kategorijos klasifikavimo reikalavimų. Sukeičiama su Neklasifikuojamos.
                        
                           
                              Patvirtinto tinkamumo bandymų metodas
                           – bandymų metodas, kurio patvirtinimo tyrimai atlikti, kad būtų nustatytas jo tinkamumas tam tikram tikslui pasiekti (įskaitant tikslumą) ir patikimumas. Svarbu pažymėti, kad patvirtinto tinkamumo bandymo metodo tikslumo ir patikimumo charakteristikos gali būti nepakankamos, kad jį būtų galima laikyti priimtinu siūlomam tikslui pasiekti.
                        
                           
                              Įrodomoji duomenų galia
                           – įvairių informacijos dalių privalumų ir trūkumų nagrinėjimo procesas priimant ir patvirtinant sprendimą dėl cheminės medžiagos pavojingumo.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           CHEMINĖS MEDŽIAGOS, SKIRTOS KVALIFIKACIJAI TIKRINTI TAIKANT ICE BANDYMŲ METODĄ
                        
                        Prieš pradėdamos įprastiniu būdu atlikti bandymus, susijusius su šiuo bandymo metodu, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, tinkamai klasifikuodamos 1 lentelėje rekomenduojamų 13 cheminių medžiagų keliamą pavojų akims. Šios cheminės medžiagos buvo parinktos taip, kad atitiktų pavojų akims atsakų intervalą, atsižvelgiant į in vivo triušio akių bandymo (TG 405) rezultatus ir į JT GHS klasifikavimo sistemą (t. y. JT GHS 1, 2A, 2B kategorijas ar į GHS be kategorijos) (4)(6). Kiti atrankos kriterijai buvo galimybė pirkti chemines medžiagas ir tai, ar galima gauti aukštos kokybės in vivo etaloninius duomenis bei aukštos kokybės in vitro ICE bandymų metodo duomenis. Etaloniniai duomenys pateikti supaprastintame suvestiniame dokumente (5) ir ICE bandymų metodo ICCVAM istorinės apžvalgos dokumente (9).
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           Cheminės medžiagos, rekomenduojamos techninei kvalifikacijai tikrinti taikant ICE bandymų metodą
                        
                        
                                    Cheminė medžiaga
                                 
                                 
                                    CAS Nr.
                                 
                                 
                                    Cheminė klasė (13)
                                    
                                 
                                 
                                    Agregatinė būsena
                                 
                                 
                                    
                                       In vivo klasifikavimas (14)
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       In vitro klasifikavimas (15)
                                    
                                 
                              
                                    Benzalkonio chloridas (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Onio junginys
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Chlorheksidinas
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    Aminas, amidinas
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Dibenzoil-L-vyno rūgštis
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    Karboksirūgštis, esteris
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Imidazolas
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    Heterociklinis junginys
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    Trichloracto rūgštis (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    Karboksirūgštis
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                              
                                    2,6-dichlorbenzoil chloridas
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    Acilhalogenidas
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    2A kategorija
                                 
                                 
                                    Neįmanoma pateikti prognozių (16)
                                    
                                 
                              
                                    Amonio nitratas
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Neorganinė druska
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    2A kategorija (17)
                                    
                                 
                                 
                                    Neįmanoma pateikti prognozių (16)
                                    
                                 
                              
                                    Etil-2-metilaceto acetatas
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Ketonas, esteris
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    2 B kategorija
                                 
                                 
                                    Neįmanoma pateikti prognozių (16)
                                    
                                 
                              
                                    Dimetil sulfoksidas
                                 
                                 
                                    67-68-5
                                 
                                 
                                    Organinis sieros junginys
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Jokios kategorijos
                                 
                                 
                                    Jokios kategorijos
                                 
                              
                                    Glicerolis
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Alkoholis
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Be kategorijos
                                 
                                 
                                    Be kategorijos (tarpinė vertė)
                                 
                              
                                    Metilciklo pentanas
                                 
                                 
                                    96-37-7
                                 
                                 
                                    Angliavandenilis (ciklinis)
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Be kategorijos
                                 
                                 
                                    Be kategorijos
                                 
                              
                                    n-heksanas
                                 
                                 
                                    110-54-3
                                 
                                 
                                    Angliavandenilis (alifatinis)
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Be kategorijos
                                 
                                 
                                    Be kategorijos
                                 
                              
                                    Triacetinas
                                 
                                 
                                    102-76-1
                                 
                                 
                                    Lipidas
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Neklasifikuojamos
                                 
                                 
                                    Be kategorijos
                                 
                              
                                    Santrumpos: CAS Nr. – Cheminių medžiagų pavadinimų santrumpų tarnybos registracijos numeris.
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           ICE PERFUZIJOS APARATO IR AKIŲ LAIKIKLIŲ SCHEMOS
                        
                        
                           (Perfuzijos aparato ir akies laikiklio išsamesnis bendrasis aprašymas pateiktas Burton et al. (18))
                        
                        
                                    Detalės Nr.
                                 
                                 
                                    Aprašymas
                                 
                                 
                                    Detalės Nr.
                                 
                                 
                                    Aprašymas
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    Šilto vandens išleidžiamoji anga
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    Kamera
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    Slankiojamosios durys
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Akies laikiklis
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Perfuzijos aparatas
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    Viščiuko akis
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    Optinis matavimo prietaisas
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    Fiziologinio tirpalo išleidžiamoji anga
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    Šilto vandens įleidžiamoji anga
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    Fiksavimo varžtas
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    Fiziologinis tirpalas
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    Reguliuojamos padėties viršutinė svirtis
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    Šiltas vanduo
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    Nejudamoji apatinė svirtis
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    Fiziologinio tirpalo įleidžiamoji anga
                                 
                                 
                                     
                                 
                              “
               
                     14)
                  
                  
                     B dalies B.49 skyrius pakeičiamas taip:
                     „B.49   
                           In vitro žinduolių ląstelių mikrobranduolių bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 487 (2014). Jis yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (1).
                     
                        In vitro mikrobranduolių (MNvit) tyrimas yra genotoksiškumo bandymas, skirtas tarpfazinių ląstelių citoplazmos mikrobranduoliams (angl. micronuclei, MN) aptikti. Mikrobranduoliai gali susidaryti iš chromosomų acentrinių fragmentų (t. y. neturinčių centromeros) arba iš visų chromosomų, kurios ląstelių dalijimosi anafazės stadijoje negali migruoti link polių. Todėl MNvit bandymas yra in vitro metodas, kuris užtikrina patikimą pagrindą tiriant in vitro chromosomų pažeidimo gebą, nes galima aptikti aneugenus ir klastogenus (2) (3) ląstelėse, kurioms įvyko ląstelių dalijimasis veikiant chemine medžiaga arba pasibaigus veikimui (daugiau informacijos pateikta 13 pastraipoje). Mikrobranduoliai rodo pažeidimą, kuris buvo perduotas dukterinėms ląstelėms, o metafazės ląstelėse užfiksuotos chromosomų aberacijos gali būti neperduotos. Bet kuriuo atveju pokyčiai gali būti nesuderinami su ląstelės išgyvenamumu.
                     Pagal šį bandymo metodą galima naudoti protokolus su aktino polimerizacijos inhibitoriumi citochalazinu B (citoB) arba be jo. Pridėjus citoB prieš mitozę gaunamos dvibranduolės ląstelės, todėl yra galimybė atpažinti ir analizuoti mikrobranduolius tik tose ląstelėse, kuriose įvyko viena mitozė (4) (5). Pagal šį bandymo metodą taip pat galima naudoti protokolus be citokinezės blokavimo, jei yra įrodymų, kad analizuojamoje ląstelių populiacijoje įvyko mitozė.
                     Be MNvit tyrimo taikymo nustatant chemines medžiagas, kurios indukuoja mikrobranduolius, imunocheminio kinetochorų ženklinimo arba hibridizacijos su centromeriniais ar telomeriniais zondais (fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH)) naudojimas taip pat gali suteikti papildomos informacijos apie chromosomų pažeidimo ir mikrobranduolių susidarymo mechanizmus (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Šias ženklinimo ir hibridizacijos procedūras galima taikyti, kai yra padidėjęs mikrobranduolių susidarymas ir tyrėjas nori nustatyti, ar tą padidėjimą sukėlė klastogeniniai ir (arba) aneugeniniai reiškiniai.
                     Kadangi tarpfazinių ląstelių mikrobranduoliai gali būti įvertinti palyginti objektyviai, laboratorijos personalui tereikia nustatyti ląstelių su dviem branduoliais skaičių, kai naudojamas citoB, ir ląstelių su mikrobranduoliais dažnumą visais atvejais. Todėl objektinių stiklelių tyrimas yra palyginti spartus ir analizė gali būti automatizuota. Dėl to įmanoma įvertinti ne šimtus, o tūkstančius vieno apdorojimo ląstelių, todėl kriterijaus galia padidėja. Galiausiai, kadangi mikrobranduoliai gali susidaryti iš atsiliekančių chromosomų, yra galimybė aptikti aneuploidiją sukeliančias medžiagas, kurias sunku tirti įprastais chromosomų aberacijos bandymais, pvz., šio priedo B.10 (18). Tačiau taikant šiame bandymo metode aptašytą MNvit bandymą, negalima atskirti cheminių medžiagų, sukeliančių chromosomų skaičiaus pokyčius ir (arba) ploidiją, nuo klastogeniškumą sukeliančių medžiagų, jei netaikomi specialieji metodai, pvz., 4 pastraipoje nurodytas FISH metodas.
                     MNvit tyrimas yra patikimas ir gali būti atliekamas su įvairių tipų ląstelėmis, esant citoB arba jo nesant. Yra daug duomenų, kurie patvirtina MNvit bandymo tinkamumą, naudojant įvairių tipų ląsteles (ląstelių linijų kultūras ar pirminių ląstelių kultūras) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Pirmiausia tai yra tarptautiniai tinkamumo patvirtinimo tyrimai, kuriuos koordinavo Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23), ir tarptautinio genotoksiškumo bandymų seminaro ataskaitos (5) (17). Turimi duomenys buvo pakartotinai įvertinti atliekant retrospektyvųjį tinkamumo patvirtinimo tyrimą įrodomosios vertės analizės metodu, kurį atliko Europos Komisijos Europos alternatyvių metodų tinkamumo patvirtinimo centras (ECVAM), o ECVAM mokslinis patariamasis komitetas (ESAC) patvirtino tyrimo metodą kaip moksliškai patikimą (37) (38) (39).
                     Atliekant žinduolių ląstelių MNvit bandymą, galima naudoti gerai žinomų ląstelių linijų arba žmogaus ar graužikų kilmės pirminių ląstelių kultūras. Kadangi foninis mikrobranduolių dažnumas turės poveikį bandymo jautriui, rekomenduojama naudoti ląstelių tipus, kurių mikrobranduolių susidarymo foninis dažnumas yra mažas ir stabilus. Naudojamos ląstelės pasirenkamos pagal jų sugebėjimą gerai augti kultūroje, kariotipų stabilumą (įskaitant chromosomų skaičių) ir spontaninį mikrobranduolų dažnumą. Atsižvelgiant į šiuo metu turimus duomenis, neįmanoma pateikti tvirtų rekomendacijų, bet svarbu nurodyti, kad, įvertinant cheminius pavojus, reikėtų atsižvelgti į bandymams pasirinktų ląstelių p53 būseną, genetinį (kariotipo) stabilumą, DNR atkūrimo gebą ir kilmę (graužikų palyginti su žmogaus). Todėl šio bandymo metodo naudotojai raginami atsižvelgti į šių ir kitų ląstelių charakteristikų įtaką ląstelių linijos savybėms aptinkant mikrobranduolių indukciją, nes šios srities žinių visą laiką daugėja.
                     Vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                     Bandymus atliekant in vitro paprastai reikia naudoti egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį, išskyrus atvejus, kai ląstelės yra metaboliškai pajėgios bandomųjų cheminių medžiagų atžvilgiu. Egzogeninė metabolinio aktyvinimo sistema nevisiškai atkartoja in vivo sąlygas. Reikėtų imtis priemonių, kad būtų išvengta sąlygų, kurioms esant būtų gauti dirbtinai teigiami rezultatai, nerodantys bandomųjų cheminių medžiagų genotoksiškumo. Tokios sąlygos gali atsirasti dėl tokių veiksnių kaip pH pH (41) (42) (43) ar osmolialumo pokyčiai, sąveika su ląstelių kultūros terpe (44) (45) ar per didelis citotoksiškumas (žr. 29 pastraipą).
                     Mikrobranduolių indukcijai analizuoti svarbiausia, kad apdorotose ir neapdorotose kultūrose būtų įvykusi mitozė. Informatyviausias mikrobranduolių vertinimo etapas vyksta ląstelėse, kuriose veikiant bandomąja chemine medžiaga arba po to įvyko viena mitozė. Pramoninėms nanomedžiagoms gali prireikti tam tikro šio bandymų metodo pakeitimų, kurie šiame bandymų metode neaprašyti.
                     Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, tai dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     Žmogaus ar kitų žinduolių kilmės ląstelių kultūros veikiamos bandomąja chemine medžiaga naudojant egzogeninį metabolinio aktyvinimo šaltinį arba jo nenaudojant, jei naudojamos reikiamą metabolinę gebą turinčios ląstelės (žr. 19 pastraipą).
                     Ląstelės auginamos pakankamą laikotarpį veikimo bandomąja chemine medžiaga metu arba po jo, kad įvyktų chromosomų pažeidimas arba kiti ląstelių ciklo ar ląstelių dalijimosi reiškiniai, dėl kurių interfazinėse ląstelėse imtų formuotis mikrobranduoliai. Aneuploidijai indukuoti bandomoji cheminė medžiaga paprastai turėtų būti mitozės metu. Surinktos ir nudažytos interfazinės ląstelės analizuojamos ieškant mikrobranduolių. Geriausiai būtų skaičiuoti mikrobranduolius tik tose ląstelėse, kuriose mitozė pasibaigia veikimo bandomąja chemine medžiaga metu arba jam pasibaigus, jei toks taikomas. Citokinezės blokatoriumi apdorotose kultūrose tai lengvai pasiekiama skaičiuojant tik dvibranduoles ląsteles. Jei nėra citokinezės blokatoriaus, svarbu įrodyti, kad analizuojamų ląstelių dalijimasis galimai įvyko atsižvelgiant į ląstelių populiacijos didėjimą veikimo bandomąja chemine medžiaga metu arba po jo. Pagal visus protokolus svarbu įrodyti, kad ląstelių proliferacija įvyko kontrolinėje ir apdorotoje kultūrose, o bandomosios cheminės medžiagos sukelto citotoksiškumo arba citostazės laipsnį reikėtų įvertinti visose kultūrose, kuriose skaičiuojami mikrobranduoliai.
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Ląstelės
                     
                     Galima naudoti pirminių žmogaus arba kitų žinduolių periferinio kraujo limfocitų kultūras (7) (20) (46) (47) ir įvairias graužikų ląstelių linijas, pvz., CHO, V79, CHL/IU ir L5178Y ląsteles, arba žmogaus ląstelių linijas, pvz., TK6, (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (žr. 6 pastraipą). Atliekant mikrobranduolių bandymus, buvo naudotos kitos ląstelių linijos, pvz., HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), HepG2 ląstelės (52) (53), A549 ir pirminės Sirijos žiurkėno embrioninės ląstelės (54), bet jų tinkamumas šiuo metu nėra plačiai patvirtintas. Todėl šių ląstelių linijų ir tipų naudojimą reikėtų pagrįsti, atsižvelgiant į jų įrodytas bandymo charakteristikas, kaip aprašyta Priimtinumo kriterijų skyriuje. Buvo paskelbta, kad CitoB gali daryti įtaką L5178Y ląstelių augimui, todėl jis nerekomenduojamas naudoti su šia ląstelių linija (23). Naudojant pirmines ląsteles, dėl gyvūnų gerovės priežasčių reikėtų atsižvelgti į galimybę naudoti, jei įmanoma, žmogiškos kilmės pirmines ląsteles, ir ėminius imti atsižvelgiant į žmonių etikos principus ir reglamentus.
                     Žmogaus periferinio kraujo limfocitus reikėtų gauti iš jaunų (maždaug 18–35 metų amžiaus), nerūkančių žmonių, kurie nesirgtų ar nebūtų neseniai paveikti genotoksiniais agentais (pvz., cheminėmis medžiagomis, jonizuojančiąja spinduliuote), esant tokiems jų lygiams, kurie padidintų ląstelių su mikrobranduoliais foninį dažnumą. Tai užtikrintų, kad ląstelių su mikrobranduoliais foninis dažnumas būtų mažas ir pastovus. Ląstelių su mikrobranduoliais dažnumo atskaitos vertė didėja senstant ir ši tendencija labiau pasireiškia moterims nei vyrams (55). Jei naudojamos ląstelės paimamos daugiau kaip iš vieno donoro, turėtų būti nurodytas donorų skaičius. Būtina įrodyti, kad ląstelės dalijosi nuo ląstelių ėminio veikimo bandomąja chemine medžiaga pradžios. Ląstelių kultūros laikomos eksponentinio augimo fazėje (ląstelių linijos) arba stimuliuojamos dalytis (pirminės limfocitų kultūros), kad ląstelės būtų veikiamos skirtingose ląstelės ciklo stadijose, nes ląstelių stadijų jautris bandomosioms cheminėms medžiagoms gali būti nežinomas. Pirminės ląstelės, kurias reikia stimuliuoti mitogeniniais agentais, kad jos pradėtų dalytis, paprastai daugiau nesinchronizuojamos jas veikiant bandomąja chemine medžiaga (pvz., žmogaus limfocitai po 48 h mitogeninio stimuliavimo). Naudoti sinchronizuotas ląsteles veikimo bandomąja chemine medžiaga metu nerekomenduojama, bet gali būti priimtina, jei būtų pagrįsta.
                     
                        Terpės ir kultūros sąlygos
                     
                     Prižiūrimoms kultūroms reikėtų naudoti reikiamą kultūros terpę ir inkubavimo sąlygas (kultūros indus, drėkinamąją 5 % CO2 atmosferą, jei tinka, temperatūrą – 37 °C). Ląstelių linijos turėtų būti reguliariai tikrinamos, ar nesikeičia modalinis chromosomų skaičius ir nėra mikoplazmos užkrato, o užkrėstos arba pakitusio modalinio chromosomų skaičiaus ląstelės neturėtų būti naudojamos. Turėtų būti nustatyta bandymo laboratorijoje naudojamų ląstelių linijų ar pirminių kultūrų normalaus ląstelių ciklo trukmė ir ji turėtų atitikti paskelbtas ląstelių charakteristikas.
                     
                        Kultūrų paruošimas
                     
                     Ląstelių linijos: ląstelės yra dauginamos iš kamieninių kultūrų, sėjamos kultūros terpėje tokiu tankiu, kad ląstelės suspensijose ar monosluoksniuose visą laiką iki pat surinkimo laiko augtų eksponentiškai (pvz., reikėtų vengti monosluoksniuose augančių ląstelių susiliejimo).
                     Limfocitai: viso kraujo ėminys, apdorotas antikoaguliantu (pvz., heparinu), ar iš to kraujo atskirti limfocitai auginami (pvz., žmogaus limfocitai – 48 h) esant mitogeno (pvz., žmogaus limfocitams – fitohemagliutinino (PHA)), kad ląstelės pradėtų dalytis prieš jas paveikiant bandomąja chemine medžiaga ir citoB.
                     
                        Metabolinis aktyvinimas
                     
                     Kai naudojamos nepakankamos endogeninės metabolinės gebos ląstelės, reikėtų naudoti egzogenines metabolinimo sistemas. Jei nebūtų pagrįsta kita sistema, dažniausiai kaip numatytoji rekomenduojama sistema yra kofaktoriumi papildyta pomitochondrinė frakcija (S9), ruošiama iš graužikų (paprastai žiurkių) kepenų, paveiktų fermentų aktyvumą skatinančiais agentais, pvz,. Aroclor 1254 (56) (57) ar fenobarbitalio ir b-naftoflavono deriniu (58) (59) (60). Pastarasis derinys neprieštarauja Stokholmo konvencijai dėl patvariųjų organinių teršalų (61) ir pasirodė esąs toks pat veiksmingas kaip Aroclor 1254 mišrių funkcijų oksidazėms skatinti (58) (59) (60) (28). S9 frakcija paprastai naudojama nuo 1 % iki 2 % (tūrio) koncentracijos, bet galutinio bandymo terpėje gali būti padidinta iki 10 % (tūrio). Paveikiant bandomąja chemine medžiaga reikėtų vengti naudoti produktus, kurie mažina mitozinį indeksą, ypač su kalciu kompleksus sudarančius produktus (62). Naudojamos egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos ar metabolizmo skatinimo priemonės tipo ir koncentracijos pasirinkimui įtakos gali turėti naudojamų cheminių medžiagų klasė.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos ruošimas
                     
                     Prieš apdorojant ląsteles, kietąsias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti atitinkamuose tirpikliuose ir, jei reikia, praskiesti. Skystąsias chemines medžiagas galima dėti tiesiogiai į bandymo sistemą ir (arba) praskiesti prieš apdorojant bandymo sistemą. Dujos ar lakiosios bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti bandomos atitinkamai pakeitus standartinius protokolus, pvz., apdorojimas sandariuose kultūros induose (63) (64) (65). Bandomųjų cheminių medžiagų preparatus reikėtų ruošti prieš pat apdorojimą, išskyrus atvejus, kai stabilumo duomenys rodo, kad juos galima laikyti.
                     
                        Bandymo sąlygos
                     
                     
                        Tirpikliai
                     
                     Tirpiklį reikėtų pasirinkti taip, kad būtų optimizuotas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas, bet nebūtų daroma neigiama įtaka tyrimo eigai, pvz., kistų ląstelių augimas, būtų paveiktas bandomosios cheminės medžiagos vientisumas, vyktų reakcija su kultūros indais, būtų pakenkta metabolinio aktyvinimo sistemai. Jei įmanoma, rekomenduojama naudoti vandeninį tirpiklį (ar kultūros terpę). Gerai ištirti tirpikliai yra vanduo ar dimetilsulfoksidas (DMSO). Paprastai organinių tirpiklių kiekis neturėtų būti didesnis kaip 1 % (tūrio). Jei citoB tirpinamas DMSO, cheminei medžiagai ir citoB tirpinti naudojamas organinio tirpiklio suminis kiekis neturėtų būti didesnis kaip 1 % (tūrio); priešingu atveju reikėtų naudoti neapdorotus kontrolinius ėminius, kad būtų galima įsitikinti, ar organinio tirpiklio procentinis kiekis nedaro neigiamo poveikio. Vandeninių tirpiklių (natrio chlorido tirpalo ar vandens) koncentracija galutinėje apdorojimo terpėje neturėtų būti didesnė kaip 10 % (tūrio). Jei naudojami tinkamai neištirti tirpikliai (pvz., etanolis ar acetonas), jų naudojimas turėtų būti pagrįstas duomenimis, kurie rodytų tirpiklio suderinamumą su bandomąja chemine medžiaga bei bandymo sistema ir genetinio toksiškumo nebuvimą, esant naudojamai koncentracijai. Jei tokių patvirtinančių duomenų nėra, svarbu įtraukti neapdorotus kontrolinius ėminius (žr. 1 priedėlį), taip pat tirpiklio kontrolinius ėminius, siekiant įrodyti, kad pasirinktas tirpiklis nėra žalingas ir nesukelia žalingo poveikio chromosomoms (pvz., aneuploidijos ar klastogeniškumo).
                     
                        CitoB kaip citokinezės blokatoriaus naudojimas
                     
                     Vienas iš svarbiausių aspektų atliekant MNvit bandymą – užtikrinti, kad skaičiuojamų ląstelių mitozė būtų baigta apdorojimo metu ar po jo. Todėl mikrobranduolių skaičiavimas turėtų apsiriboti ląstelėmis, kuriose mitozė įvyko apdorojimo metu ar po jo. CitoB yra medžiaga, kuri plačiausiai naudojama citokinezei blokuoti, nes slopina aktino susijungimą ir taip neleidžia dukterinėms ląstelėms atsiskirti po mitozės, dėl ko ima formuotis dvibranduolės ląstelės (6) (66) (67). Kai naudojamas citoB, kartu galima matuoti bandomosios cheminės medžiagos įtaką ląstelių proliferacijos kinetikai. CitoB reikėtų naudoti kaip citokinezės blokatorių, kai naudojami žmogaus limfocitai, nes ląstelių ciklo trukmė tarp donorų skirsis ir ne visi limfocitai reaguos į stimuliavimą PHA. CitoB nėra privalomas kitų tipų ląstelėms, jei būtų galima nustatyti, kad jos pasidalijo, kaip aprašyta 27 pastraipoje. Be to, citoB paprastai nenaudojamas, kai ėminių mikrobranduoliai įvertinami taikant tėkmės citometrinius metodus.
                     Laboratorija turėtų nustatyti reikiamą citoB koncentraciją kiekvieno tipo ląstelėms, kad būtų gautas optimalus dvibranduolių ląstelių dažnumas tirpiklio kontrolinėse kultūrose ir būtų įrodyta, kad gaunama skaičiavimui tinkama dvibranduolių ląstelių išeiga. Tinkama citoB koncentracija paprastai yra 3–6 μg/ml.
                     
                        Ląstelių proliferacijos bei citotoksiškumo matavimas ir apdorojimo koncentracijos verčių parinkimas
                     
                     Nustatant didžiausią bandymui naudojamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją reikėtų vengti koncentracijos, galinčios sukelti dirbtinį teigiamą atsaką, pvz., kuri sukeltų per didelį citotoksiškumą (žr. 29 pastraipą), nuosėdų kultūros terpėje (žr. 30 pastraipą) ar žymius pH arba osmolialumo pokyčius (žr. 9 pastraipą). Jei bandomosios cheminės medžiagos pridėjimo metu žymiai pakinta terpės pH vertė, ją būtų galima reguliuoti buferuojant galutinio apdorojimo terpę, kad būtų išvengta dirbtinių teigiamų rezultatų ir būtų užtikrintos tinkamos kultūros sąlygos.
                     Ląstelių proliferacija matuojama siekiant įsitikinti, ar bandymo metu pakankamas paveiktų ląstelių skaičius pasiekė mitozę ir ar apdorojama esant reikiamam citotoksiškumo lygiui (žr. 29 pastraipą). Citotoksiškumą reikėtų nustatyti pagrindinio bandymo metu pagal atitinkamus ląstelių žūties ir augimo rodiklius, esant ir nesant metaboliniam aktyvinimui (žr. 26 ir 27 pastraipas). Nors citotoksiškumo įvertinimas atliekant pradinį parengiamąjį bandymą gali būti naudingas pagrindinio bandymo koncentracijos vertėms geriau apibrėžti, pradinis bandymas nėra privalomas. Jei jis būtų atliekamas, jis neturėtų pakeisti citotoksiškumo matavimo atliekant pagrindinį bandymą.
                     Ląstelių apdorojimas citoB ir santykinio vienbranduolių, dvibranduolių ir daugiabranduolių ląstelių dažnumo kultūroje matavimas yra tikslus metodas kiekybiškai įvertinant poveikį ląstelių proliferacijai ir apdorojimo citotoksinį ar citostatinį aktyvumą (6) ir juo užtikrinama, kad per mikroskopą būtų skaičiuojamos tik apdorojimo metu ar po jo pasidalijusios ląstelės. Apdorojimo citotoksiniam ar citostatiniam aktyvumui įvertinti, lyginant apdorotų ir kontrolinių kultūrų vertes, rekomenduojamas citokinezės blokavimo proliferacijos indeksas (angl. cytokinesis-block proliferation index, CBPI)(6) (27) (68) arba replikacijos indeksas (angl. Replication Index, RI), imant ne mažiau kaip 500 ląstelių vienai kultūrai (dėl formulių žr. 2priedėlį). Kitų citotoksiškumo rodiklių (pvz., ląstelių vientisumo, apoptozės, nekrozės, metafazės ląstelių skaičiaus, ląstelės ciklo) vertinimas galėtų suteikti naudingos informacijos, bet jų nereikėtų naudoti vietoj CBPI ar RI.
                     Atliekant tyrimus be citoB, būtina įrodyti, kad kultūros ląstelės dalijosi taip, kad didžioji skaičiuojamų ląstelių dalis pasidalijo veikimo bandomąja cheminė medžiaga metu arba po jo. Apdorojimo citotoksiniam ar citostatiniam aktyvumui įvertinti rekomenduojamas santykinio populiacijos padvigubėjimo (RPD) ar santykinio ląstelių skaičiaus padidėjimo (RICC) matavimas (17) (68) (69) (70) (71) (dėl formulių žr. 2priedėlį). Jei atliekamas ilgalaikis apdorojimas (t. y. 1,5–2,0 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, o surenkama praėjus laikui, dar 1,5–2,0 karto ilgesniam nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, iš viso gaunant ėminių ėmimo trukmę 3–4 kartus ilgesnę nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, kaip aprašyta 38 ir 39 pastraipose), taikant RPD gali būti gautas per mažas citotoksiškumo įvertis (71). Šiomis aplinkybėmis geresnis matas galėtų būti RICC arba naudingas įvertis galėtų būti ir RPD, citotoksiškumą įvertinant praėjus laikui, kuris būtų 1,5–2 karto ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė. Kitų citotoksiškumo ar citostazės rodiklių (pvz., ląstelių vientisumo, apoptozės, nekrozės, metafazės ląstelių skaičiaus, proliferacijos indekso (PI), ląstelės ciklo, nukleoplazmos tiltelių ar branduolų užuomazgų) vertinimas galėtų suteikti naudingos informacijos, bet jų nereikėtų naudoti vietoj RPD ar RICC.
                     Reikėtų įvertinti ne mažiau kaip tris bandymo koncentracijos vertes (neįskaitant tirpiklio ir teigiamus kontrolinius ėminius), kurios atitinka priimtinumo kriterijus (reikiamas citotoksiškumas, ląstelių skaičius ir kt.). Neatsižvelgiant į ląstelių tipą (ląstelių linijos ar pirminės limfocitų kultūros), galima naudoti kiekvienos bandymo koncentracijos kartotines ar pavienes apdorotas kultūras. Nors patariama naudoti kartotines kultūras, pavienės kultūros taip pat priimtinos, jei vertinamas vienodas suminis pavienės ar kartotinės kultūros ląstelių skaičius. Naudoti pavienę kultūrą ypač tinka, kai vertinamos daugiau kaip 3 koncentracijos vertės (žr. 44–45 pastraipas). Nepriklausomoms kartotinėms kultūroms gauti tam tikros koncentracijos rezultatai gali būti subendrinti duomenų analizei (38). Jei bandomoji cheminė medžiaga rodo mažą citotoksiškumą arba jo visai nėra, paprastai tiktų maždaug nuo 2 iki 3 kartų besiskiriančios koncentracijos intervalai. Jei citotoksiškumas nustatomas, pasirinktos koncentracijos vertės turėtų aprėpti intervalą nuo koncentracijos, kuriai citotoksiškumas pasireiškia, kaip aprašyta 29 pastraipoje, įtraukiant koncentracijos vertes, kurioms gaunamas vidutinis citotoksiškumas ar jo visai nėra. Daugelio bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijos atsako kreivės kyla staigiai, todėl norint gauti mažo arba vidutinio citotoksiškumo duomenis arba išsamiai ištirti dozės ir atsako santykį, būtina naudoti arčiau išdėstytas ir (arba) daugiau kaip tris koncentracijos vertes (pavienių ar kartotinių kultūrų), ypač tomis aplinkybėmis, kai reikia atlikti kartotinį bandymą (žr. 60 pastraipą).
                     Jei maksimali koncentracija pagrįsta citotoksiškumu, didžiausiai koncentracijai reikėtų pasiekti 55 ± 5 % citotoksiškumą, taikant rekomenduotus citotoksiškumo parametrus (t. y. ląstelių linijų RICC bei RPD sumažėjimą, kai citoB nenaudojamas, ir CBPI ar RI sumažėjimą iki 45 ± 5 % vienalaikio neigiamo kontrolinio ėminio, kai citoB yra naudojamas) (72). Reikėtų atsargiai aiškinti teigiamus rezultatus, kurie būtų gauti tik viršutiniam šio 55 ± 5 % citotoksiškumo intervalo galui (71).
                     Jei mažai tirpios bandomosios cheminės medžiagos nėra citotoksiškos, kai koncentracija yra mažesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, veikimo bandomąja chemine medžiaga pabaigoje, esant didžiausiai analizuojamai koncentracijai, turėtų atsirasti drumstumas arba nuosėdos, matomos plika akimi arba per inversinį mikroskopą. Netgi jei citotoksiškumas pasireiškia, kai koncentracija yra didesnė nei mažiausia netirpumo koncentracija, patartina bandyti tik esant vienai drumstumą ar matomas nuosėdas sukeliančiai koncentracijai, nes nuosėdos gali daryti dirbtinį poveikį. Esant koncentracijai, kurioje susidaro nuosėdos, reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad nuosėdos netrukdytų atlikti bandymą (pvz., dažymą ar įvertinimą). Gali padėti tirpumo nustatymas kultūros terpėje prieš atliekant bandymą.
                     Jei nuosėdų ar ribinio citotoksiškumo nestebima, didžiausia bandymo koncentracija turėtų atitikti 10 mmol/l, 2 mg/ml ar 2 μl/ml, pasirenkant mažiausią (73) (74) (75). Jei bandomoji cheminė medžiaga yra neapibrėžtos sudėties, pvz., nežinomos ar kintamos sudėties medžiaga, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos (UVCB) (76), iš aplinkos ekstrahuojamas ėminys ir kt., nesant pakankamam citotoksiškumui, gali prireikti didesnės didžiausios koncentracijos (pvz., 5 mg/ml), kad būtų didesnė kiekvieno iš komponentų koncentracija. Reikėtų pažymėti, kad žmonėms skirtiems vaistiniams preparatams šie reikalavimai gali skirtis (93).
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     Kiekvieną kartą surenkant kultūrą, reikėtų įtraukti vienalaikius neigiamus kontrolinius ėminius (žr. 21 pastraipą), sudarytus vien tik iš tirpiklio apdorojimo terpėje ir apdorotus taip pat, kaip apdorojamos kultūros.
                     Vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai yra būtini siekiant įrodyti laboratorijos gebėjimą naudojamo bandymų protokolo sąlygomis identifikuoti klastogenus bei aneugenus ir egzogeninės metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą (jei taikoma). Teigiamų kontrolinių ėminių pavyzdžiai pateikiami toliau 1 lentelėje. Galima naudoti alternatyvias teigiamas kontrolines chemines medžiagas, jei tai būtų pagrįsta.
                     Šiuo metu nežinoma jokių aneugenų, kurių genotoksiniam aktyvumui būtinas metabolinis aktyvinimas (17). Kadangi genetinio toksiškumo žinduolių ląstelėms bandymai in vitro yra pakankamai standartizuoti, esant trumplaikiam apdorojimui, atliekamam vienu metu su metaboliniu aktyvinimu ar be jo, naudojant vienodą apdorojimo trukmę, teigiamų kontrolinių ėminių naudojimas gali apsiriboti klastogenu, kuriam būtinas metabolinis aktyvinimas. Šiuo atveju vieno klastogeninio teigiamo kontrolinio ėminio atsakas įrodys metabolinio aktyvinimo sistemos aktyvumą ir bandymo sistemos jautrį. Tačiau ilgalaikiam apdorojimui (be S9) reikėtų turėti savo teigiamą kontrolinį ėminį, nes apdorojimo trukmė skirsis nuo metabolinį aktyvinimą naudojančio bandymo trukmės. Jei atliekant trumpalaikį apdorojimą su metaboliniu aktyvinimu ar be jo, kaip vienas teigiamas kontrolinis ėminys pasirenkamas klastogenas, tai atliekant ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo reikėtų pasirinkti aneugeną. Reikėtų naudoti teigiamus kontrolinius ėminius su klastogenu ir aneugenu, jei ląstelės yra metaboliškai pajėgios ir joms nereikia S9.
                     Kiekvienas teigiamas kontrolinis ėminys turėtų būti naudojamas vienos arba kelių koncentracijos verčių, kurioms esant būtų galima tikėtis gauti atkuriamą ir aptinkamą didesnį nei fonas atsaką, kad būtų galima įrodyti bandymo sistemos jautrį (t. y. poveikis yra aiškus, bet tyrėjui ne iš karto atskleidžiama užkoduotų objektinių stiklelių tapatybė), ir atsako neturėtų sutrikdyti citotoksiškumas, kuris viršytų šiam bandymo metodui nustatytas ribas.
                     
                        1 lentelė
                     
                     
                        Etaloninės cheminės medžiagos, rekomenduojamos laboratorijos kvalifikacijai vertinti ir teigiamiems kontroliniams ėminiams pasirinkti
                     
                     
                                 Kategorija
                              
                              
                                 Cheminė medžiaga
                              
                              
                                 CAS Nr.
                              
                           
                                 1.   Klastogenai, aktyvūs be metabolinio aktyvinimo
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Metilmetansulfonatas
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Mitomicinas C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-nitrochinolin-N-oksidas
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Citozino arabinozidas
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           
                                 2.   Klastogenai, kuriems reikia metabolinio aktyvinimo
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Benz(a)pirenas
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Ciklofosfamidas
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           
                                 3.   Aneugenai
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Kolchicinas
                              
                              
                                 64-86-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Vinblastinas
                              
                              
                                 143-67-9
                              
                           PROCEDŪRA
                     
                        Apdorojimo planas
                     
                     Siekiant padidinti tikimybę aptikti aneugeną ar klastogeną, veikiantį tam tikroje ląstelės ciklo stadijoje, svarbu, kad bandomąja chemine medžiaga būtų apdorotas pakankamas skaičius ląstelių, reprezentuojančių visas įvairias ląstelių ciklo stadijas. Kiekvienas apdorojimas turėtų prasidėti ir baigtis ląstelėms augant eksponentiškai ir ląstelės turėtų augti iki ėminio ėmimo pradžios. Todėl ląstelių linijų ir pirminių ląstelių kultūrų apdorojimo planas gali kažkiek skirtis nuo taikomo limfocitams, kurių ląstelių ciklui pradėti būtinas mitogeninis stimuliavimas (17). Jei tai limfocitai, veiksmingiausias metodas yra pradėti veikti bandomąja chemine medžiaga praėjus 44–48 h nuo stimuliavimo PHA, kai ląstelės toliau dalysis nesinchroniškai (6).
                     Paskelbti duomenys (19) rodo, kad dauguma aneugenų ir klastogenų bus aptikti per trumpą 3–6 h apdorojimo laikotarpį esant ir nesant S9, vėliau bandomoji cheminė medžiaga pašalinama ir ėminiai imami nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (7).
                     Tačiau siekiant atlikti išsamų įvertinimą, kurio prireiktų neigiamam rezultatui patvirtinti, visos šios trys Bandymo sąlygos turėtų būti įgyvendintos, taikant trumpalaikį apdorojimą su metaboliniu aktyvinimu ir be jo bei ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo (žr. 56, 57 ir 58 pastraipas):
                     
                                 —
                              
                              
                                 ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga be metabolinio aktyvinimo 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ląstelės turėtų būti veikiamos bandomąja chemine medžiaga esant metaboliniam aktyvinimui 3–6 h ir surenkamos nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ląstelės turėtų būti nuolat veikiamos be metabolinio aktyvinimo tol, kol bus surenkamos praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.
                              
                           Jei esant kuriai nors vienai iš pirmiau nurodytų bandymo sąlygų gaunamas teigiamas atsakas, gali būti nebūtina tirti kurią nors kitą apdorojimo schemą.
                     Jei žinoma ar yra įtarimų, kad bandomoji cheminė medžiaga daro įtaką ląstelių ciklo trukmei (pvz., kai bandomi nukleozidų analogai), ypač p53 kompetentinėms ląstelėms (35) (36) (77), papildomas ėminių ėmimo arba regeneravimo laikas galėtų būti dar 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė (t. y. laikas nuo trumpalaikio ir ilgalaikio apdorojimo pradžios iš viso būtų 3,0–4,0 kartus ilgesnis nei ląstelių ciklo trukmė). Šios pasirinktys skirtos situacijoms, kai gali kilti susirūpinimas dėl galimos bandomosios cheminės medžiagos ir citoB sąveikos. Jei taikoma ilgesnė ėminių ėmimo trukmė (t. y. laikas iš viso būtų 3,0–4,0 kartus ilgesnis nei kultūros ląstelių ciklo trukmė), reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad vis dar vyktų aktyvus ląstelių dalijimasis. Pvz., limfocitų eksponentinis augimas gali pradėti mažėti praėjus 96 h nuo stimuliavimo ir vienasluoksnės ląstelių kultūros gali susilieti.
                     Siūlomi ląstelių apdorojimo planai pateikti 2 lentelėje. Šie bendrieji apdorojimo planai gali būti keičiami (ir turėtų būti pagrįsti), atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos stabilumą ar reaktyvumą ar tam tikras naudojamų ląstelių augimo charakteristikas.
                     
                        2 lentelė
                     
                     
                        MNvit tyrimo ląstelių apdorojimo ir surinkimo trukmė
                     
                     
                                 Limfocitai, pagrindinės ląstelės ir ląstelių linijos, apdorotos citoB
                              
                              
                                 Trumpalaikis apdorojimas esant S9
                              
                              
                                 Apdorojama 3–6 h esant S9;
                                 pašalinama S9 ir apdorojimo terpė;
                                 įpilama naujos terpės ir citoB;
                                 surenkama nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.
                              
                           
                                 Trumpalaikis apdorojimas nesant S9
                              
                              
                                 Apdorojama 3–6 h;
                                 pašalinama apdorojimo terpė;
                                 įpilama naujos terpės ir citoB;
                                 surenkama nuo apdorojimo pradžios praėjus laikui, kuris būtų 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.
                              
                           
                                 Ilgalaikis apdorojimas nesant S9
                              
                              
                                 Apdorojama 1,5 – 2 kartus ilgiau nei normalaus ląstelių ciklo trukmė, esant citoB;
                                 surenkama pasibaigus apdorojimo laikotarpiui.
                              
                           
                                 Ląstelių linijos, apdorotos nenaudojant citoB
                                 (Apdorojama pagal pirmiau pateiktus apdorojimo planus, išskyrus tai, kad nededama citoB)
                              
                           Vienasluoksnių kultūrų 3–6 h trukmės apdorojimo pabaigoje gali būti mitozinių ląstelių (atpažįstamų iš apvalios formos ir atsiskyrimo nuo paviršiaus). Kadangi šios mitozinės ląstelės lengvai atsiskiria, jos gali būti prarastos šalinant terpę su bandomąja chemine medžiaga. Jei yra įrodymų dėl esminio mitozinių ląstelių skaičiaus padidėjimo palyginti su kontroliniais ėminiais, rodančio galimą ląstelių susilaikymą mitozės metu, jas reikėtų surinkti centrifugavimu ir surinkimo metu grąžinti į kultūrą, kad nebūtų prarastos mitozės ląstelės, kurioms kyla mikrobranduolių susidarymo ar chromosomų aberacijos rizika.
                     
                        Ląstelių surinkimas ir preparatų ant objektinių stiklelių paruošimas
                     
                     Kiekviena kultūra turėtų būti surenkama ir apdorojama atskirai. Ruošiamos ląstelės gali būti apdorojamos hipotoniniu tirpalu, tačiau šis veiksmas nebūtinas, jei ląsteles galima tinkamai paskleisti kitu būdu. Objektinius stiklelius galima paruošti įvairiais būdais, jei skaičiavimui gaunami aukštos kokybės ląstelių preparatai. Ląstelės su nepaliesta ląstelių membrana ir citoplazma turėtų būti išsaugotos, kad būtų galima aptikti mikrobranduolius ir citokinezės blokavimo metodu patikimai nustatyti dvibranduoles ląsteles.
                     Preparatai ant objektinio stiklelio gali būti dažomi įvairiais metodais, pvz., Giemsa arba DNR specifiniais dažikliais. Naudojant tinkamus fluorescencinius dažus (pvz., akridino oranžinį (78) ar Hoechst 33258 ir pironiną Y (79)), galima pašalinti kai kuriuos artefaktus, susijusius su DNR nespecifinių dažų naudojimu. Mikrobranduolių turiniui nustatyti gali būti naudojami antikinetochoro antikūnai FISH analizė ir pancentromeriniai DNR zondai arba in situ ženklinimas pancentromerų specifiniais užpildais kartu su atitinkamu DNR priešpriešiniu dažymu (nusidažo sveika chromosoma, bet ne acentriniai chromosomų fragmentai), jei domina informacija apie mikrobranduolių susidarymo mechanizmą (16) (17). Gali būti taikomi kiti metodai klastogenams ir aneugenams atskirti, jei jie pasirodytų efektyvūs ir būtų patvirtintas jų tinkamumas. Pvz., tam tikrų ląstelių linijų hipodiploidinių ląstelių branduolių kaip hipodiploidinių reiškinių matavimas taikant, pvz., vaizdo analizės, lazerinės skenuojančios citometrijos ar tėkmės citometrijos metodus, taip pat galėtų suteikti naudingos informacijos (80) (81) (82). Morfologiniai branduolių stebėjimai taip pat galėtų rodyti galimą aneuploidiją. Be to, metafazės chromosomų aberacijų bandymas, pageidautina to paties ląstelių tipo ir taikant palyginamojo jautrio protokolą, taip pat galėtų būti patogus būdas nustatyti, ar mikrobranduoliai susidaro dėl chromosomų trūkimo (žinant, kad chromosomų praradimas nebūtų aptiktas atliekant chromosomų aberacijų bandymą).
                     
                        Analizė
                     
                     Prieš atliekant mikrobranduolių dažnumo mikroskopinę analizę, visi objektiniai stikleliai turėtų būti nepriklausomai užkoduoti, įskaitant tirpiklio, neapdorotų ėminių (jei naudojami) ir teigiamų kontrolinių ėminių stiklelius. Reikėtų taikyti atitinkamus metodus, kad būtų galima kontroliuoti sistemingąsias paklaidas ar poslinkį, kai naudojamos automatizuotos skaičiavimo sistemos, pvz., tėkmės citometrijos, lazerinės skenuojančios citometrijos ar vaizdo analizės sistemos. Neatsižvelgiant į mikrobranduoliams skaičiuoti naudojamą automatizuotą sistemą, tuo pačiu metu reikėtų įvertinti CBPI, RI, RPD ar RICC.
                     CitoB apdorotose kultūrose mikrobranduolių dažnumą reikėtų analizuoti bent 2 000 dvibranduolių ląstelių kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam ėminiui (83), vienodai padalytų tarp kartotinių ėminių, jei jie naudojami Jei dozei naudojama po vieną kultūrą (žr. 28 pastraipą), reikėtų suskaičiuoti ne mažiau kaip 2 000 dvibranduolių šios pavienės kultūros ląstelių (83). Jei vienai (kartotinių kultūrų) kultūrai būtų suskaičiuota gerokai mažiau kaip po 1 000 dvibranduolių ląstelių arba mažiau kaip 2 000 ląstelių (pavienei kultūrai), o reikšmingo mikrobranduolių skaičiaus padidėjimo nebūtų aptikta, bandymą reikėtų pakartoti naudojant daugiau ląstelių arba mažiau citotoksinę koncentraciją, jei tai būtų tinkamiau. Reikia imtis atsargumo priemonių, kad nebūtų skaičiuojamos netaisyklingos formos arba labai nevienodo dydžio branduolių dvibranduolės ląstelės. Be to, dvibranduolių ląstelių nereikia painioti su blogai pasklidusiomis daugiabranduolėmis ląstelėmis. Ląstelės, kuriose yra daugiau kaip du pagrindiniai branduoliai, neturi būti analizuojamos dėl mikrobranduolių, nes šių ląstelių mikrobranduolių dažnumo atskaitos vertė gali būti didesnė (84). Skaičiuoti vienbranduoles ląsteles galima, jei yra įrodyta, kad bandomoji cheminė medžiaga veikia citoB aktyvumą. Tokiais atvejais galėtų būti naudingas kartotinis bandymas be citoB. Be dvibranduolių ląstelių skaičiaus naudingos informacijos galėtų suteikti vienbranduolių ląstelių skaičius (85) (86), bet jis nėra privalomas.
                     CitoB neapdorotų ląstelių linijų mikrobranduolių dažnumą reikėtų analizuoti bent 2 000 ląstelių kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam ėminiui (83), vienodai padalytų tarp kartotinių ėminių, jei jie naudojami. Jei koncentracijai naudojama po vieną kultūrą (žr. 28 pastraipą), reikėtų suskaičiuoti ne mažiau kaip 2 000 šios pavienės kultūros ląstelių (83). Jei kiekvienos koncentracijos vienai (kartotinių kultūrų) kultūrai būtų suskaičiuota gerokai mažiau kaip po 1 000 ląstelių arba mažiau kaip 2 000 ląstelių (pavienei kultūrai), o reikšmingo mikrobranduolių skaičiaus padidėjimo nebūtų aptikta, bandymą reikėtų pakartoti naudojant daugiau ląstelių arba mažiau citotoksinę koncentraciją, jei tai būtų tinkamiau.
                     Kai naudojamas citoB, reikėtų nustatyti CBPI arba RI ląstelių proliferacijai įvertinti (žr. 2 priedėlį), naudojant ne mažiau kaip 500 ląstelių vienai kultūrai. Jei apdorojama nesant citoB, svarbu pateikti įrodymą, kad kultūros ląstelės dalijosi, kaip aptarta 24–28 skirsniuose.
                     
                        Laboratorijos kvalifikacija
                     
                     Siekdama įgyti pakankamos bandymo atlikimo patirties prieš jį taikydama įprastiniams tyrimams, laboratorija turėtų būti atlikusi etaloninių teigiamų cheminių medžiagų bandymų seriją, joms veikiant pagal skirtingus mechanizmus (bent vieną su metaboliniu aktyvinimu, vieną – be jo ir vieną, kuri veiktų pagal aneugeninį mechanizmą, medžiagas pasirenkant iš 1 lentelės sąrašo) su įvairiais neigiamais kontroliniais ėminiais (įskaitant neapdorotas kultūras ir įvairius tirpiklius ar nešiklį). Šių teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių atsakas turėtų atitikti literatūros duomenis. Tai netaikoma patirties turinčioms laboratorijoms, t. y. kurios turi istorinių duomenų bazę, prieinamą kaip apibrėžta 49–52 pastraipose.
                     Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų rinkinį (žr. 1 lentelę) reikėtų tirti atliekant trumpalaikį ir ilgalaikį apdorojimą be metabolinio aktyvinimo, taip pat trumpalaikį apdorojimą esant metaboliniam aktyvinimui, kad būtų galima įrodyti kvalifikaciją aptikti klastogenines ir aneugenines chemines medžiagas, nustatyti metabolinio aktyvinimo sistemos efektyvumą ir įrodyti skaičiavimo procedūrų (vizualios mikroskopinės analizės, tėkmės citometrijos, lazerinės skenuojančios citometrijos ar vaizdo analizės) tinkamumą. Pasirinktų cheminių medžiagų koncentracijos verčių intervalas turėtų būti pasirinktas taip, kad, siekiant įrodyti bandymo sistemos jautrį ir dinaminį diapazoną, būtų gautas atkuriamas ir su koncentracija susijęs padidėjimas palyginti su fonu.
                     
                        Istorinių kontrolinių ėminių duomenys
                     
                     Laboratorija turėtų nustatyti:
                     
                                 —
                              
                              
                                 istorinių teigiamų kontrolinių ėminių intervalą ir pasiskirstymą,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 istorinių neigiamų kontrolinių ėminių (neapdorotų, tirpiklio) intervalą ir pasiskirstymą.
                              
                           Pirmą kartą gaunant duomenis, skirtus istorinių neigiamų kontrolinių ėminių pasiskirstymui, vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai turėtų atitikti paskelbtus kontrolinius duomenis, jei jie yra. Kontrolinių ėminių pasiskirstymą papildant vis didesniu bandymų duomenų kiekiu, būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į to skirstinio 95 % kontrolines ribas (87) (88). Laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę iš pradžių turėtų sudaryti ne mažiau kaip 10 bandymų, bet būtų geriau, jei tokių palyginamosiomis Bandymo sąlygomis atliktų bandymų skaičius būtų ne mažesnis kaip 20. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (88)), kad galėtų nustatyti savo teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje (83). Papildomas rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (87).
                     Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į duomenų suderinamumą su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė.
                     Neigiamų kontrolinių ėminių duomenis turėtų sudaryti pavienės kultūros ląstelių mikrobranduolių dažnumo skaičius arba kartotinių kultūrų skaičių suma, kaip aprašyta 28 pastraipoje. Būtų gerai, kad vienalaikiai neigiami kontroliniai ėminiai patektų į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazės skirstinio 95 % kontrolines ribas (87) (88). Jei vienalaikių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys nepatenka į 95 % kontrolines ribas, jie gali būti tinkami įtraukti į istorinių kontrolinių ėminių skirstinį, jei nėra kraštiniai riktai ir yra įrodymų, kad bandymo sistema „valdoma“ (žr. 50 pastraipą) ir kad nėra techninių ar žmogaus klaidų.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų pateikimas
                     
                     Jei taikomas citokinezės blokavimo metodas, vertinant mikrobranduolių indukciją naudojamas tik dvibranduolių ląstelių su mikrobranduoliais (nepriklausomai nuo mikrobranduolių skaičiaus ląstelėje) dažnumas. Naudingos informacijos galėtų suteikti ląstelių su vienu, dviem ar keliais mikrobranduoliais skaičiai ir jų pateikimas atskirai ataskaitoje, bet tai neprivaloma.
                     Turėtų būti nustatyti visų apdorotų, neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių citotoksiškumo ir (arba) citostazės vienalaikių matavimų duomenys (16). Visų apdorotų ir kontrolinių kultūrų CBPI arba RI turi būti apskaičiuoti kaip ląstelių ciklo delsos matavimų duomenys, kai taikomas citokinezės blokavimo metodas. Jei apdorojama be citoB, reikėtų taikyti RPD arba RICC ar PI (žr. 2 priedėlį).
                     Turėtų būti pateikti atskiri kiekvienos kultūros duomenys. Be to, visi duomenys turi būti suvesti į lenteles.
                     
                        Priimtinumo kriterijai
                     
                     Bandymo priimtinumas pagrįstas šiais kriterijais:
                     
                                 —
                              
                              
                                 laikoma, kad vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys gali būti įtrauktas į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę, kaip aprašyta 50 pastraipoje;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai (žr. 50 pastraipą) turėtų sukelti atsakus, kurie yra suderinami su rastais laboratorijos istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 turėtų atitikti ląstelių proliferacijos tirpiklio kontroliniame ėminyje kriterijus (25–27 pastraipos);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bandoma esant visoms Bandymo sąlygoms, nebent vienai iš jų gaunami teigiami rezultatai (žr. 36–40 pastraipas);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 analizuojamas pakankamas ląstelių ir koncentracijos verčių skaičius (28 ir 44–46 pastraipos).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 didžiausios koncentracijos pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 24–31 pastraipose.
                              
                           
                        Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas
                     
                     Kai įvykdyti visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei esant kuriai nors ištirtai bandymo sąlygai (žr. 36–39 pastraipas):
                     
                                 —
                              
                              
                                 bent vienai bandymo koncentracijai gaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu (89);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 padidėjimas yra susijęs su doze esant bent vienai iš bandymo sąlygų, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų (žr. 28 pastraipą);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kuris nors iš rezultatų yra už istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 52 pastraipą).
                              
                           Kai įvykdyti visi šie kriterijai, laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga gali sukelti šios bandymų sistemos chromosomų trūkius ir (arba) skaičiaus padidėjimą ar sumažėjimą. Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų taip pat galima rasti literatūroje (90) (91) (92).
                     Kai įvykdyti visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei visomis ištirtomis bandymo sąlygomis (žr. 36–39 pastraipas):
                     
                                 —
                              
                              
                                 jokiai bandymo koncentracijai negaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 nėra su koncentracija susijusio padidėjimo, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 visi rezultatai patenka tarp istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų (pvz., Puasono skirstinio 95 % kontrolinių ribų; žr. 52 pastraipą).
                              
                           Laikoma, kad ši bandomoji cheminė medžiaga negali sukelti šios bandymų sistemos chromosomų trūkių ir (arba) skaičiaus padidėjimo ar sumažėjimo. Rekomendacijų dėl tinkamiausių statistinių metodų taip pat galima rasti literatūroje (90) (91) (92).
                     Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.
                     Jei atsakas nėra aiškiai neigiamas ar aiškiai teigiamas, kaip apibūdinta pirmiau, ir (arba) siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą, duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus tyrimus. Galėtų būti naudingas papildomų ląstelių skaičiavimas (jei tinka) arba kartotinis bandymas galbūt modifikuotomis bandymo sąlygomis (pvz., tarpai tarp koncentracijos verčių, kitos metabolinio aktyvinimo sąlygos (t. y. S9 koncentracija ar S9 kilmė)).
                     Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, gautų duomenų rinkinio nepakaks padaryti išvadą, ar rezultatai teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad atsakas yra dviprasmis.
                     Bandomosios cheminės medžiagos, kurios atliekant MNvit bandymą indukuoja mikrobranduolius, tai gali daryti todėl, kad sukelia chromosomų trūkimą, netekimą arba abiejų veiksnių derinį. Siekiant nustatyti, ar mikrobranduolių indukcijos mechanizmas yra klastogeninio ir (arba) aneugeninio aktyvumo rezultatas, gali būti atliekama papildoma analizė naudojant antikinetochoro antikūnus, centromeroms skirtus in situ zondus ar taikant kitus metodus.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             šaltinis, partijos numeris, galiojimo pabaigos data, jei yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pačios bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomųjų cheminių medžiagų reaktyvumas tirpiklio ar nešiklio arba ląstelių kultūros terpės atžvilgiu.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje ir stabilumas, jei žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pH, osmolialumo ir nuosėdų matavimas kultūros terpėje, į kurią bandomoji cheminė medžiaga buvo pridėta, jei reikia.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vienkomponentė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tirpiklis:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             tirpiklio pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tirpiklio galutinėje kultūros terpėje procentinė dalis.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Ląstelės:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             naudojamų ląstelių tipas ir šaltinis,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudojamo ląstelių tipo tinkamumas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ar nėra mikoplazmos, jei naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informacija apie ląstelių ciklo trukmę ar proliferacijos indeksą, jei naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei naudojami limfocitai, kraujo donorų lytis, amžius ir visa tinkama informacija apie donorą, visas kraujas ar atskirti limfocitai, naudotas mitogenas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             normalaus ląstelių ciklo (neigiamo kontrolinio ėminio) trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių sėjimų skaičius, jei žinomas, kai naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių kultūros priežiūros metodai, jei naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             modalinis chromosomų skaičius, jei naudojamos ląstelių linijos.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             citokinezės blokavimo medžiagos (pvz., citoB) identifikavimo duomenys, jei naudojama, jos koncentracija ir ląstelių veikimo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, išreikšta kaip galutinė koncentracija kultūros terpėje (pvz., μg ar mg/ml ar mmol/l kultūros terpės);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentracijos verčių ir kultūrų skaičiaus parinkimo pagrindimas, įskaitant citotoksiškumo duomenis ir tirpumo apribojimus;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             terpių sudėtis, CO2 koncentracija, jei tinka, drėgmės lygis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tirpiklio ir bandomosios cheminės medžiagos, pridėtos į kultūros terpę, koncentracija (ir (arba) tūris);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubavimo temperatūra ir trukmė,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             apdorojimo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             surinkimo laikas po apdorojimo,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių tankis sėjimo metu, jei tinka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metabolinio aktyvinimo sistemos tipas ir sudėtis (S9 šaltinis, S9 mišinio paruošimo metodas, S9 mišinio ir S9 galutinėje kultūros terpėje koncentracija ar tūris, S9 kokybės kontrolės ėminiai (pvz., fermentinis aktyvumas, sterilumas, metabolinė geba));
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teigiamos ir neigiamos kontrolinės cheminės medžiagos, galutinės koncentracijos vertės, apdorojimo sąlygos bei trukmė ir regeneravimo laikotarpio trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             objektinių stiklelių ruošimo metodai ir taikytas dažymo būdas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių su mikrobranduoliais skaičiavimo kriterijai (analizei tinkamų ląstelių atranka ir mikrobranduolių nustatymas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tirtų ląstelių skaičius,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             citotoksiškumo matavimo metodai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visa papildoma informacija, susijusi su citotoksiškumu ir taikomu metodu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tyrimų vertinimo kaip teigiami, neigiami arba dviprasmiai kriterijai,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikytas (-i) statistinės analizės metodas (-ai),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metodai, pvz., antikinetochoro antikūnų, ar specifinių pancentromerų zondų naudojimas, kad būtų galima apibūdinti, ar mikrobranduoliai turi ištisas chromosomas ar jų fragmentus, jei taikoma.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pH, osmolialumo ir nusėdimo nustatymo metodai.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             analizei priimtinų ląstelių apibrėžtis,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienos kultūros apdorotų ląstelių, nenaudojant citoB, skaičius ir surinktų ląstelių skaičius, kai naudojamos ląstelių linijos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotas citotoksiškumo matas, pvz., CBPI ar RI, jei taikomas citokinezės blokavimo metodas; RICC ar RPD, kai šis metodas netaikomas; kiti pastebėjimai, jei yra (pvz., ląstelių susiliejimas, apoptozė, nekrozė, metafazės ląstelių skaičius, dvibranduolių ląstelių dažnumas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nusėdimo požymiai ir nustatymo laikas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             apdorojamos terpės pH ir osmolialumo duomenys, jei nustatyti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vienbranduolių, dvibranduolių ir daugiabranduolių ląstelių pasiskirstymas, jei taikomas citokinezės blokavimo metodas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             atskirai kiekvienos apdorotos ir kontrolinės kultūros ląstelių su mikrobranduoliais skaičius, nurodant, ar jie yra dvibranduolių ar vienbranduolių ląstelių, jei tinka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentracijos ir atsako priklausomybė, jei įmanoma,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vienalaikio neigiamo (tirpiklio) ir teigiamo kontrolinio ėminio duomenys (koncentracijos vertės ir tirpikliai);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             istorinių neigiamų (tirpiklio) ir teigiamų kontrolinių ėminių duomenys, intervalai, vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai bei skirstinio 95 % kontrolinės ribos, taip pat duomenų skaičius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             statistinė analizė, p vertės, jei yra.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvados.
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 1-4.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Parry, J.M., A. Sors (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 3-15.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios, Vol. 43/172-173, pp. 233-246.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 167-172.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols, Vol. 2/5, pp. 1084-1104.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Research, Vol. 161/2, pp. 193-198.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., J.D. Tucker (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 13/1, pp. 34-43.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., D. Pinkel (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probe. Mutation Research, Vol. 234/5, pp. 9-20.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Farooqi, Z., F. Darroudi, A. T. Natarajan (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis, Vol. 8/4, pp. 329-334.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Migliore, L. et al. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Research, Vol. 319/3, pp. 205-213.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Norppa, H., L. Renzi, C. Lindholm (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 519-525.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Eastmond, D.A, D.S. Rupa, L.S. Hasegawa (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Research, Vol. 322/1, pp. 9-20.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Marshall, R.R. et al. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Research, Vol. 372/2, pp. 233-245.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Zijno, P. et al. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 372/2, 211-219.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders et al. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research, Vol. 540/2, pp. 153-163.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Šio priedo B.10 skyrius. Žinduolių chromosomų aberacijų bandymas in vitro.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 13-36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Clare, G. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 37-60.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Aardema, M.J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 61-87.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 88-124.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Oliver, J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 125-152.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Albertini, S. et al. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 187-208.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 45-59.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Research, Vol. 410, pp. 81-116.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Kalweit, S. et al. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches. Mutation Research, Vol. 439/2, pp. 183-190.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Kersten, B. et al. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Research, Vol. 445/1, pp. 55-71.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 von der Hude, W. et al. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Research, Vol. 468/2, pp. 137-163.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Garriott, M.L., J.B. Phelps, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 123-134.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis, Vol. 14/6, pp. 569-580.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., E. Lorge (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 1-152.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Kirkland, D. (2010). Evaluation of different cytotoxic and cytostatic measures for the in vitromicronucleus test (MNVit): Introduction to the collaborative trial. Mutation Research, Vol. 702/2, pp. 139-147.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Hashimoto K. et al. (2011). Comparison of four different treatment conditions of extended exposure in the in vitro micronucleus assay using TK6 lymphoblastoid cells. Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 59/1, pp. 28-36.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Honma, M., M. Hayashi (2011). Comparison of in vitro micronucleus and gene mutation assay results for p53-competent versus p53-deficient human lymphoblastoid cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 373-384.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Zhang, L.S. et al. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Research Letters, Vol. 347/3-4, pp. 105-115.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November 2006, Available at: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Available at: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Corvi, R. et al. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis, Vol 23/4, pp. 271-283.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 ILSI paper (draft). Lorge, E., M.M. Moore, J. Clements, M. O'Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, A. Sutter, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Young-Tannir. Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. Mutation Research.
                                 
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Research, Vol. 257/2, pp. 147-205.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Research, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environmental Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007). Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium. Mutation Research, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environmental and Molecular Mutation., Vol. 49, pp. 439-452.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Research, Vol. 147/1-2, pp. 29-36.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Research, Vol. 392, pp. 11-18.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Payne, C.M. et al. (2010). Hydrophobic bile acid-induced micronuclei formation, mitotic perturbations, and decreases in spindle checkpoint proteins: relevance to genomic instability in colon carcinogenesis. Nutrition and Cancer, Vol. 62/6, pp. 825-840.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Bazin, E. et al. (2010). Genotoxicity of a Freshwater Cyanotoxin,Cylindrospermopsin, in Two Human Cell Lines: Caco-2 and HepaRG. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 51/3, pp. 251-259.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Le Hegarat, L. et al. (2010). Assessment of the genotoxic potential of indirect chemical mutagens in HepaRG cellsby the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays. Mutagenesis, Vol. 25/6, pp. 555-560.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Josse, R. et al. (2012). An adaptation of the human HepaRG cells to the in vitro micronucleus assay. Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 295-304.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Ehrlich, V. et al. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis, Vol. 17/3, pp. 257-260.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Knasmüller, S. et al. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicology, Vol. 198/1-3, pp. 315-328.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 Gibson, D.P. et al. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 61-70.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Bonassi, S. et al. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 37/1, pp. 31-45.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Elliott, B.M. et al. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, Vol. 7, pp. 175-177.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976). „A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems“, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres, F.J. et al. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D. R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28, pp. 51-59.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 UNEP (2001), Stokholmo konvencija dėl patvariųjų organinių teršalų, Jungtinių Tautų aplinkos programa (UNEP). Pateikiama http://www.pops.int/
                              
                           
                                 (62)
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987). Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes. Mutation Research, Vol.190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 (63)
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982). „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids“, in Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 (64)
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environmental Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 (65)
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008). An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay. Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 (66)
                              
                              
                                 Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Research, Vol. 285/1, pp. 35-44.
                              
                           
                                 (67)
                              
                              
                                 Phelps, J.B., M.L. Garriott, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 521/1-2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 (68)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2004). Corrigendum to „Report from the in vitro micronucleus assay working group“. Mutation Research, 564, 97-100.
                              
                           
                                 (69)
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Research, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 (70)
                              
                              
                                 Surralles, J. et al. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 341/3, pp. 169-184.
                              
                           
                                 (71)
                              
                              
                                 Honma, M. (2011). Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test. Mutation Research, Vol. 724, pp. 86-87.
                              
                           
                                 (72)
                              
                              
                                 Pfuhler, S. et al. (2011). In vitro genotoxicity test approaches with better predictivity: Summary of an IWGT workshop. Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 101-107.
                              
                           
                                 (73)
                              
                              
                                 OECD (2014). Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). ENV/JM/TG(2014)17. Available upon request.
                              
                           
                                 (74)
                              
                              
                                 Morita T., M. Honma, K. Morikawa (2012). Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity. Mutation Research, Vol. 741, pp. 32-56.
                              
                           
                                 (75)
                              
                              
                                 Brookmire L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro Chromosome Aberrations Assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 (76)
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances. http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 (77)
                              
                              
                                 Sobol, Z. et al. (2012). Development and validation of an in vitro micronucleus assay platform in TK6 cells. Mutation Research, Vol.746/1, pp. 29-34.
                              
                           
                                 (78)
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 (79)
                              
                              
                                 MacGregor, J. T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 (80)
                              
                              
                                 Bryce, S.M. et al. (2011). Miniaturized flow cytometry-based CHO-K1 micronucleus assay discriminates aneugenic and clastogenic modes of action. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/4, pp. 280–286.
                              
                           
                                 (81)
                              
                              
                                 Nicolette, J. et al. (2011). in vitro micronucleus screening of pharmaceutical candidates by flow cytometry in Chinese hamster V79 cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 355–362.
                              
                           
                                 (82)
                              
                              
                                 Shi, J., R. Bezabhie, A. Szkudlinska (2010). Further evaluation of a flow cytometric in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells: a reliable platform that detects micronuclei and discriminates apoptotic bodies. Mutagenesis, Vol. 25/1, pp. 33-40.
                              
                           
                                 (83)
                              
                              
                                 OECD (2014). Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on testing and assessment, No.198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (84)
                              
                              
                                 Fenech, M. et al. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 534/1-2, pp. 65-75.
                              
                           
                                 (85)
                              
                              
                                 Elhajouji, A., M. Cunha, M. Kirsch-Volders (1998). Spindle poisons can induce polyploidy by mitotic slippage and micronucleate mononucleates in the cytokinesis-block assay. Mutagenesis, Vol. 13/2, pp. 193-8.
                              
                           
                                 (86)
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2011). The in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput methodologies and toxicological relevance. Archives of Toxicology, Vol. 85/8, pp. 873-99.
                              
                           
                                 (87)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2010). Compilation and use of genetic toxicity historical control Data. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol.723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (88)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000). Statistical Methods for Quality Improvement. 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 (89)
                              
                              
                                 Hoffman, W.P., M.L. Garriott, C. Lee (2003). „In vitro micronucleus test“, in Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2nd ed. Chow, S. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, pp. 463-467.
                              
                           
                                 (90)
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed. John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 (91)
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987). Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 (92)
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989). Analysis of Data from in vitro Cytogenetic Assays. in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 (93)
                              
                              
                                 International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Aneugenas
                           – cheminė medžiaga ar procesas, kuris dėl sąveikos su mitozinio ir mejozinio ląstelių dalijimosi ciklo komponentais sukelia aneuploidiją ląstelėse ar organizmuose.
                        
                           
                              Aneuploidija
                           – vienos arba daugiau kaip vienos chromosomų, bet ne viso (-ų) jų rinkinio (-ų) (poliploidija) nukrypimas nuo normalaus diploidinio (arba haploidinio) chromosomų skaičiaus.
                        
                           
                              Apoptozė
                           – užprogramuota ląstelių žūtis, kuriai būdinga serija etapų, per kuriuos ląstelės suyra į membrana apsuptas daleles, kurios vėliau pašalinamos fagocitoze arba numetimo būdu.
                        
                           
                              Ląstelių proliferacija
                           – ląstelių skaičiaus didėjimas dėl mitozinio jų dalijimosi.
                        
                           
                              Centromera
                           – chromosomos regionas, su kuriuo ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Koncentracijos vertės
                           – taikoma bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos kultūros terpėje galutinėms vertėms.
                        
                           
                              Klastogenas
                           – сheminė medžiaga, kuri sukelia ląstelių arba eukariotinių organizmų populiacijų struktūrines chromosomų aberacijas.
                        
                           
                              Citokinezė
                           – ląstelių dalijimosi procesas iškart po mitozės, kai susidaro dvi dukterinės ląstelės, turinčios po vieną branduolį.
                        
                           
                              Citokinezės blokavimo proliferacijos indeksas (CBPI)
                           – apdorotos populiacijos ląstelių po antrojo pasidalijimo dalis palyginti su neapdorotu kontroliniu ėminiu (formulė pateikta 2 priedėlyje).
                        
                           
                              Citostazė
                           – ląstelių augimo slopinimas (formulė pateikta 2 priedėlyje).
                        
                           
                              Citotoksiškumas
                           – jei šio bandymo metodo tyrimai atliekami esant citochalazinui B, citotoksiškumas nustatomas kaip apdorotų ląstelių citokinezės blokavimo proliferacijos indekso (CBPI) ar replikacijos indekso (RI) sumažėjimas palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 26 pastraipą ir 2 priedėlį).
                        Jei šio bandymo metodo tyrimai atliekami be citochalazino B, citotoksiškumas nustatomas kaip apdorotų ląstelių santykinio populiacijos padvigubėjimo (RPD) sumažėjimas ar santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (RICC) palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu (žr. 27 pastraipą ir 2 priedėlį).
                        
                           
                              Genotoksinis
                           – bendrasis terminas, kuriuo išreiškiamas visų tipų DNR arba chromosomų pažeidimas, įskaitant trūkius, delecijas, aduktus, nukleotidų modifikacijas ir ryšius, pergrupavimus, genų mutacijas, chromosomų aberacijas ir aneuploidiją. Ne visų tipų genotoksiniai poveikiai sukelia mutacijas ar pastovų chromosomų pažeidimą.
                        
                           
                              Interfazinės ląstelės
                           – ląstelės, kurios nėra mitozės stadijoje.
                        
                           
                              Kinetochoras
                           – baltyminė struktūra, susidaranti chromosomos centromeroje, prie kurios dalijantis ląstelėms jungiasi verpstės siūlai ir dėl to dukterinės chromosomos tvarkingai išsidėsto dukterinių ląstelių poliuose.
                        
                           
                              Mikrobranduoliai
                           – nuo ląstelių pagrindinių branduolių atskirti papildomi maži branduoliai, susidarę mitozės ar mejozės telofazėje, kai chromosomų fragmentai ar ištisos chromosomos lėtai juda ląstelės polių link.
                        
                           
                              Mitozė
                           – ląstelės branduolio dalijimasis, paprastai į profazę, prometafazę, metafazę, anafazę ir telofazę.
                        
                           
                              Mitozinis indeksas
                           – metafazės ląstelių skaičiaus ir ląstelių populiacijos stebimų ląstelių suminio skaičiaus dalmuo, kuris rodo tos ląstelių populiacijos proliferacijos laipsnį.
                        
                           
                              Mutageninis
                           – sukeliantis paveldimą DNR bazinės poros sekos (-ų) pokytį genuose arba chromosomų struktūroje (chromosomų aberacijas).
                        
                           
                              Neatsijungimas
                           – porinių chromatidžių nesugebėjimas atsijungti ir tinkamai atsiskirti į besivystančias dukterines ląsteles, todėl pastarosiose susidaro nenormalus chromosomų skaičius.
                        
                           
                              p53 būsena
                           – p53 baltymo dalyvavimas reguliuojant ląstelių ciklą, apoptozę ir DNR atkūrimą. Ląstelės, kurioms trūksta funkcinio p53 baltymo ir negali sustabdyti ląstelių ciklo arba pašalinti pažeistas ląsteles per apoptozę arba kitais mechanizmais (pvz., DNR atkūrimo skatinimą), susijusiais su p53 funkcijomis atsakant į DNR pažaidą, teoriškai turėtų būti labiau linkusios genų mutacijai ar chromosomų aberacijoms.
                        
                           
                              Poliploidija
                           – chromosomų skaičiaus aberacijos ląstelėse arba organizmuose, apimančios visą (-us) chromosomų rinkinį (-us), skirtingai nei atskiros chromosomos ar chromosomų (aneuploidija).
                        
                           
                              Proliferacijos indeksas (PI)
                           – citotoksiškumo matavimo metodas, kai citoB nenaudojamas (formulė pateikta 2 priedėlyje).
                        
                           
                              Santykinis ląstelių skaičiaus padidėjimas (RICC)
                           – citotoksiškumo matavimo metodas, kai citoB nenaudojamas (formulė pateikta 2 priedėlyje).
                        
                           
                              Santykinis populiacijos padvigubėjimas (RPD)
                           – citotoksiškumo matavimo metodas, kai citoB nenaudojamas (formulė pateikta 2 priedėlyje).
                        
                           
                              Replikacijos indeksas (RI)
                           – apdorotos kultūros ląstelių pasibaigusių dalijimosi ciklų skaičiaus santykis su neapdorotos kontrolinės kultūros ląstelių skaičiumi veikimo ir regeneravimo laikotarpiu (formulė pateikta 2 priedėlyje).
                        
                           
                              S9 kepenų frakcija
                           – skystis virš kepenų homogenato, gautas po centrifugavimo esant 9 000 g, t. y. žalių kepenų ekstraktas.
                        
                           
                              S9 mišinys
                           – S9 kepenų frakcijos ir fermentų metaboliniam aktyvumui būtinų kofaktorių mišinys.
                        
                           
                              Tirpiklio kontrolinis ėminys
                           – bendrasis terminas, apibūdinantis kontrolines kultūras, į kurias dedama vien tik tirpiklio, naudoto bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Neapdorotas kontrolinis ėminys
                           – kultūros, kurios neapdorojamos (t. y. nededama bandomosios cheminės medžiagos ar tirpiklio), bet yra tiriamos vienu metu su kultūromis, į kurias dedama bandomoji cheminė medžiaga.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           CITOTOKSIŠKUMO VERTINIMO FORMULĖS
                        
                        
                           
                              
                                 Kai naudojamas citoB
                              
                           , citotoksiškumo įvertinimas turėtų būti pagrįstas citokinezės blokavimo proliferacijos indeksu (CBPI) ar replikacijos indeksu (RI) (17) (69). CBPI rodo vidutinį ląstelės branduolių skaičių ir gali būti naudojamas ląstelių proliferacijai skaičiuoti. RI rodo apdorotų kultūrų santykinį ląstelių ciklų skaičių vienai ląstelei citoB veikimo laikotarpiu palyginti su kontrolinėmis kultūromis ir gali būti naudojamas citostazės % skaičiuoti:
                        % citostazės = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)},
                        kai:
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    bandomąja chemine medžiaga apdorota kultūra;
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    kontrolinė kultūra,
                                 
                              čia:
                        
                           
                        Taigi, CBPI lygus 1 (visos ląstelės yra vienbranduolės) atitinka 100 % citostazę.
                        Citostazė = 100 – RI,
                        
                           
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    apdorotos kultūros;
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    kontrolinės kultūros.
                                 
                              Taigi, RI = 53 % reiškia, kad, palyginti su kontrolinės kultūros ląstelių, kurios pasidalijo sudarydamos dvibranduoles ir daugiabranduoles ląsteles, skaičiumi, apdorotos kultūros pasidalijusių ląstelių skaičius yra tik 53 %, t. y. 47 % citostazė.
                        
                           
                              
                                 Kai citoB nenaudojamas
                              
                           , rekomenduojamas citotoksiškumo įvertinimas, pagrįstas santykiniu ląstelių skaičiaus padidėjimu (RICC) arba santykiniu populiacijos padvigubėjimu (RPD) (69), nes abiem atvejais atsižvelgiama į pasidalijusią ląstelių populiacijos dalį.
                        
                           
                        
                           
                        čia:
                        
                           Populiacijos padvigubėjimas = [log (ląstelių skaičius po apdorojimo ÷ pradinis ląstelių skaičius)] ÷ log 2
                        Taigi 53 % RICC ar RPD rodo 47 % citotoksiškumą ar citostazę.
                        Naudojant proliferacijos indeksą (PI), citotoksiškumą galima įvertinti skaičiuojant skaičių klonų, sudarytų iš 1 ląstelės (cl1), 2 ląstelių (cl2), 3–4 ląstelių (cl4) ir 5–8 ląstelių (cl8).
                        
                           
                        PI vartojamas kaip vertingas ir patikimas citotoksiškumo parametras be citoB auginamoms in vitro ląstelių linijoms (35) (36) (37) (38) ir į jį galima žiūrėti kaip į naudingą papildomą parametrą.
                        Visais atvejais apdorotų ir neigiamų kontrolinių ėminių kultūrų ląstelių skaičius prieš apdorojimą turėtų būti vienodas.
                        Nors praeityje kaip citotoksiškumo parametras buvo naudojamas RCC (t. y. apdorotų kultūrų ląstelių skaičius/kontrolinių kultūrų ląstelių skaičius), jis daugiau nerekomenduojamas, nes gali būti gautas per mažas citotoksiškumo įvertis.
                        Kai naudojamos automatizuotos skaičiavimo sistemos, pvz., tėkmės citometrija, lazerinė skenuojanti citometrija ar vaizdo analizė, ląstelių skaičių formulėje galima pakeisti branduolių skaičiumi.
                        Neigiamų kontrolinių kultūrų populiacijos padvigubėjimas ar replikacijos indeksas turėtų būti suderinamas su reikalavimų imti ląstelių ėminius nuo apdorojimo praėjus laikui, kuris būtų maždaug 1,5–2,0 kartus ilgesnis nei normalaus ląstelių ciklo trukmė.
                     “
               
                     15)
                  
                  
                     B dalis papildoma šiais skyriais:
                     „B.59   Odos jautrinimas in chemico. Tiesioginio peptidų reaktyvumo bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 442C (2015). Odą jautrinančia medžiaga vadinama medžiaga, kuri susilietusi su oda sukelia alerginį atsaką, kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (1) ir Europos Sąjungos Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (18). Šiame bandymų metode pateikta in chemico procedūra (tiesioginio peptidų reaktyvumo bandymas) (angl. Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA) kuri turi būti taikoma siekiant patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų pagal JT GHS ir CLP.
                     Yra bendrasis susitarimas dėl pagrindinių biologinių reiškinių, kurie pagrįstų odos jautrinimą. Turimos žinios apie cheminius ir biologinius mechanizmus, susijusius su odos jautrinimu, buvo apibendrintos kaip nepalankios baigties kelias (angl. Adverse Outcome Pathway, AOP) (2) nuo molekulinio inicijavimo įvykio per tarpinius įvykius iki neigiamo poveikio, būtent, iki žmonių alerginio kontaktinio dermatito arba graužikų kontaktinio hiperjautrumo. Kalbant apie odos jautrinimo AOP, molekulinio inicijavimo įvykis yra kovalentinio ryšio atsiradimas tarp elektrofilinių medžiagų ir odos baltymų nukleofilinių centrų.
                     Odos jautrinimas paprastai yra įvertinamas naudojant laboratorinius gyvūnus. Klasikiniai metodai, atliekant bandymus su jūrų kiaulytėmis, yra Magnussono Kligmano jūrų kiaulyčių maksimizavimo bandymas (GMPT) ir Buehlerio bandymas (TM B.6 (3)), kuriuos taikant tiriamos odos jautrinimo indukcijos ir atsako sukėlimo tarpsniai. Bandymas su pelėmis, vietinių limfmazgių bandymas (LLNA, TM B.42 (4)) ir jo dvi modifikacijos nenaudojant radioaktyviųjų medžiagų, LLNA: DA (TM B.50 (5)) ir LLNA: BrdU-IFA (TM B.51 (6)), kurie visi vertina tik atsaką į indukciją, taip pat buvo priimti, nes jų privalumas palyginti su bandymais naudojant kiaulytes – gyvūnų gerovė ir odos jautrinimo indukcijos tarpsnio objektyvus matavimas.
                     Vėliau in chemico ir in vitro mechanizmų tyrimais pagrįsti bandymų metodai buvo patvirtinti kaip moksliniu požiūriu tinkami metodai cheminių medžiagų keliamam odos jautrinimo pavojui vertinti. Tačiau bandymų nenaudojant gyvūnų metodų deriniai (in silico, in chemico, in vitro), kaip integruotųjų bandymo ir vertinimo metodų (IATA) dalis, turės visiškai pakeisti šiuo metu atliekamus bandymus su gyvūnais, atsižvelgiant į kiekvieno iš dabar turimų bandymų be gyvūnų metodų apribojimus, susijusius su AOP mechanizmų aprėptimi (2) (7).
                     DPRA yra siūlomas, kad būtų galima ištirti odos jautrinimo AOP molekulinio inicijavimo įvykį, būtent, baltymų reaktyvumą, kiekybiškai įvertinant bandomųjų cheminių medžiagų aktyvumą lizino ar cisteino turinčių modelinių sintetinių peptidų atžvilgiu (8). Paskui cisteino ir lizino peptidų procentinio kiekio sumažėjimo vertės naudojamos medžiagos kategorijai nustatyti pagal vieną iš keturių reaktyvumo klasių, kad būtų galima patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų (9).
                     DPRA buvo įvertintas, Europos Sąjungos bandymų su gyvūnais alternatyvų etaloninei laboratorijai (angl. European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing, EURL ECVAM) atlikus tinkamumo patvirtinimo tyrimą ir vėliau EURL ECVAM patariamajam moksliniam komitetui (angl. EURL ECVAM Scientific Advisory Committee, ESAC) – nepriklausomą ekspertizę, ir buvo patvirtintas kaip moksliškai pagrįstas metodas (10), kuris gali būti taikomas kaip IATA dalis, kad būtų galima patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų pavojams klasifikuoti ir ženklinti. DPRA taikymo duomenys kartu su kita informacija yra pateikti literatūroje (11) (12) (13) (14).
                     Apibrėžtys pateiktos I priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI, TAIKOMUMAS IR APRIBOJIMAI
                     Baltymų reaktyvumo koreliacija su odos jautrinimo geba yra aiškiai nustatyta (15) (16) (17). Vis dėlto, kadangi baltymų surišimas yra tik vienas svarbus įvykis, nors tai būtų odos jautrinimo AOP molekulinio inicijavimo įvykis, vien tik baltymų reaktyvumo informacijos, gautos bandymų ir ne bandymų metodais, gali nepakakti gauti išvadą apie cheminių medžiagų jautrinimo gebos nebuvimą. Todėl į duomenis, gautus taikant šį bandymų metodą, reikėtų žiūrėti kaip į integruotųjų metodų, pvz., IATA, dalį, juos derinant su kita papildančia informacija, pvz., gauta atliekant in vitro bandymus, kurie nagrinėja kitus svarbius odos jautrinimo AOP įvykius, taip pat taikant ne bandymų metodus, įskaitant kryžmines nuorodas į cheminius analogus.
                     Šis bandymų metodas gali būti taikomas kaip IATA dalis kartu su kita papildančia informacija, kad būtų galima patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų (t. y. JT GHS ar CLP 1 kategorijos) ir odos nejautrinančių medžiagų. Šis bandymų metodas negali būti taikomas atskirai odą jautrinančioms medžiagoms priskirti 1A ir 1B subkategorijoms, kaip apibrėžta JT GHS ar CLP, arba prognozuoti jų jautrinimo gebą priimant saugos vertinimo sprendimus. Tačiau teigiamas rezultatas, gautas taikant DPRA, priklausomai nuo reglamentavimo sistemos gali būti naudojamas atskirai, kad cheminė medžiaga galėtų būti priskirta JT GHS ar CLP 1 kategorijai.
                     Buvo patvirtinta, kad DPRA bandymo metodą galima pritaikyti laboratorijose, kurios turi analizės efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu patirties. Prognozių atkuriamumo lygis, kurio būtų galima tikėtis taikant bandymų metodą, yra maždaug 85 % laboratorijų viduje ir 80 % tarp laboratorijų (10). Rezultatų, gautų atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą (18), ir paskelbtų tyrimų rezultatų (19) visuma rodo, kad, palyginti su LLNA rezultatais, DPRA tikslumas atskiriant jautrinančias medžiagas (t. y. JT GHS ar CLP 1 kategorijos) nuo nejautrinančių medžiagų yra 80 % (N=157), esant 80 % (88/109) jautriui ir 77 % (37/48) specifiškumui. Labiau tikėtina, kad DPRA sumažintų prognozę dėl cheminių medžiagų, kurios rodo mažą ar vidutinę odos jautrinimo gebą (t. y. JT GHS ar CLP 1B subkategorijos), nei cheminės medžiagos, kurios rodo didelę odos jautrinimo gebą (t. y. JT GHS ar CLP 1A kategorijos) (18) (19). Tačiau čia pateiktos DPRA, kaip atskirai taikomo bandymų metodo, tikslumo vertės yra tik orientacinės, kadangi bandymų metodo duomenis reikėtų nagrinėti kartu su kitais informacijos šaltiniais kaip IATA dalimis ir atsižvelgiant į 9 pastraipos nuostatas. Be to, įvertinant odos jautrinimo metodus, kurie nenaudoja gyvūnų, reikėtų turėti omenyje, kad LLNA bandymas, kaip ir kiti bandymai su gyvūnais, gali ne visiškai atitikti situaciją, susijusią su tiriamąja rūšimi, t. y. žmonėmis. Atsižvelgiant į turimų duomenų visumą, buvo įrodyta, kad DPRA tinka bandomosioms cheminėms medžiagoms, kurios aprėpia įvairias organines funkcines grupes, reakcijų mechanizmus, odos jautrinimo gebą (kaip nustatyta atliekant in vivo tyrimus) ir fizikines chemines medžiagų savybes (8) (9) (10) (19). Kartu paimta ši informacija rodo DPRA naudą prisidedant prie odos jautrinimo pavojaus identifikavimo.
                     Šiame bandymų metode vartojamas terminas bandomoji cheminė medžiaga reiškia tai, kas yra bandoma, ir nėra susijęs su DPRA tinkamumu bandyti chemines medžiagas ir (arba) mišinius. Šis bandymų metodas netinka metalų junginiams, nes, kaip žinoma, jie su baltymais reaguoja pagal kitus nei kovalentinio ryšio mechanizmus. Bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti tirpi atitinkamame tirpiklyje, kai jos galutinė koncentracija būtų 100 mmol/l (žr. 18 pastraipą). Tačiau bandomąsias chemines medžiagas, kurios netirpsta tiek, kad būtų gauta ši koncentracija, vis vien galima bandyti esant mažesnei tirpumo koncentracijai. Tokiu atveju teigiamas rezultatas vis tiek galėtų būti taikomas bandomajai cheminei medžiagai patvirtinti kaip odą jautrinančiai medžiagai, bet pagal neigiamą rezultatą negalima daryti tvirtos išvados dėl reaktyvumo nebuvimo. Šiuo metu turima nedaug informacijos apie DPRA tinkamumą žinomos sudėties mišiniams (18) (19). DPRA vis dėlto laikomas techniškai tinkamu bandyti daugiakomponentes medžiagas ir žinomos sudėties mišinius (žr. 18 pastraipą). Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar šiuo metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, tai dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį. Dabartinis prognozavimo modelis negali būti taikomas nežinomos sudėties sudėtingiems mišiniams arba nežinomos ar kintamos sudėties medžiagoms, sudėtingųjų reakcijų produktams ar biologinėms medžiagoms (t. y. UVCB medžiagoms) dėl tam tikro bandomosios cheminės medžiagos ir peptido molinio santykio. Šiam tikslui reikės sukurti gravimetriniu metodu pagrįstą naują prognozavimo modelį. Tais atvejais, kai galima pateikti įrodymų dėl bandymų metodo netinkamumo kitų specifinių kategorijų cheminėms medžiagoms, bandymų metodo nereikėtų taikyti toms specifinių kategorijų cheminėms medžiagoms.
                     Šis bandymų metodas yra in chemico metodas, kuris neaprėpia metabolinės sistemos. Cheminės medžiagos, kurioms būtinas biologinis aktyvinimas fermentais, kad galėtų pasireikšti jų odos jautrinimo geba (t. y. prohaptenai) negali būti aptiktos šiuo bandymų metodu. Yra pranešimų, kad cheminės medžiagos, kurios tampa odą jautrinančiomis po abiotinio virsmo (t. y. prehaptenai) kartais tiksliai aptinkamos šiuo bandymų metodu (18). Atsižvelgiant į tai, kas buvo pasakyta pirmiau, taikant bandymų metodą gauti neigiami rezultatai turėtų būti aiškinami, atsižvelgiant į nurodytus apribojimus ir kartu su kitais IATA sistemos informacijos šaltiniais. Dėl bandomųjų cheminių medžiagų, kurios kovalentiškai nesijungia su peptidu, bet skatina jo oksidaciją (t. y. cisteino dimerizaciją) galėtų būti pervertintas peptidų kiekio sumažėjimas, dėl ko galbūt būtų gautos klaidingai teigiamos prognozės ir (arba) medžiagos būtų priskirtos didesnio reaktyvumo klasei (žr. 29 ir 30 pastraipas).
                     Kaip aprašyta, DPRA padeda patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų. Tačiau jis taip pat gali prisidėti prie jautrinimo gebos vertinimo (11), kai taikomas kaip integruotųjų metodų, pvz IATA, dalis. Tačiau būtinas tolesnis darbas, pageidautina pagrįstas gautais duomenimis apie žmones, kad būtų galima nustatyti, kaip DPRA rezultatai gali prisidėti prie veikimo gebos vertinimo.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     DPRA yra in chemico metodas, kuriuo kiekybiškai nustatoma cisteino ar lizino turinčio peptido liekamoji koncentracija po 24 h trukmės inkubavimo su bandomąja chemine medžiaga 25 ± 2,5 °C temperatūroje. Aptikimui palengvinti sintetiniai peptidai turi fenilalanino. Santykinė peptidų koncentracija matuojama efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu, taikant gradientinį eliuavimą ir UV aptikimą esant 220 nm. Apskaičiuojamos cisteino ir lizino peptido kiekio sumažėjimo procentinės vertės, ir jos naudojamos kuriant prognozavimo modelį (žr. 29 pastraipą), pagal kurį bandomąją cheminę medžiagą galima priskirti vienai iš keturių reaktyvumo klasių, naudojamų patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų.
                     Prieš pradėdamos taikyti bandymų metode aprašytą procedūrą įprastiniu būdu, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, naudodamos dešimt kvalifikacijai tikrinti skirtų cheminių medžiagų, išvardytų 2 priedėlyje.
                     PROCEDŪRA
                     Šis bandymų metodas yra pagrįstas DPRA DB-ALM protokolu Nr. 154 (20), kuris atitinka protokolą, taikytą atliekant EURL ECVAM koordinuotą tinkamumo patvirtinimo tyrimą. Rekomenduojama šį protokolą taikyti tada, kai metodas įdiegiamas ir taikomas laboratorijoje. Toliau pateiktas pagrindinių DPRA komponentų ir procedūrų aprašymas. Jei naudojama alternatyvioji HPLC schema, reikėtų įrodyti jos atitiktį patvirtintai schemai, aprašytai DB-ALM protokole (pvz., bandant 2 priedėlyje nurodytas kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas).
                     
                        Cisteino ar lizino turinčių peptidų paruošimas
                     
                     Sintetinių peptidų, turinčių cisteino (Ac-RFAACAA-COOH) ir lizino (Ac-RFAAKAA-COOH), pradiniai tirpalai, kurių grynumas yra didesnis kaip 85 % ir pageidautina 90–95 % intervale, turėtų būti iš naujo paruošti visiškai prieš jų inkubavimą su bandomąja chemine medžiaga. Galutinė cisteino peptido koncentracija turėtų būti 0,667 mmol/l fosfatinio buferinio tirpalo, kurio pH 7,5, o lizino peptido – 0,667 mmol/l amonio acetato buferinio tirpalo, kurio pH 10,2. HPLC eigos seka turėtų būti sudaryta taip, kad HPLC analizės trukmė būtų trumpesnė kaip 30 h. Jei tai HPLC įrenginys, naudotas atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą ir aprašytas šiame bandymų metode, atliekant vieną HPLC bandymų seriją galima įdėti iki 26 analizės ėminių (kuriuos sudaro bandomosios cheminės medžiagos ėminiai, teigiami kontroliniai ėminiai ir reikiamas skaičius tirpiklio kontrolinių ėminių, pagrįstas atskirų bandyme naudojamų tirpiklių skaičiumi, kiekvieną ėminį bandant kaip trijų kartotinių ėminių rinkinį). Visus vienos serijos analizuojamus kartotinius ėminius reikėtų ruošti iš identiškų cisteino ir lizino peptidų pradinių tirpalų. Prieš naudojant, rekomenduojama patikrinti atskiras peptidų partijas, ar jie pakankamai gerai tirpsta.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos paruošimas
                     
                     Prieš atliekant bandymą, reikėtų įvertinti bandomosios cheminės medžiagos tirpumą tinkamame tirpiklyje pagal soliubilizavimo procedūrą, aprašytą DPRA DB-ALM protokole (20). Tinkamas tirpiklis – tai tirpiklis, kuriame bandomoji cheminė medžiaga visiškai ištirpsta. Kadangi taikant DPRA bandomoji cheminė medžiaga inkubuojama esant dideliam jos pertekliui palyginti su cisteino ar lizino peptidais, pakankamu įrodymu, kad bandomoji cheminė medžiaga (ir visi jos komponentai, jei bandoma daugiakomponentė medžiaga ar mišinys) yra ištirpusi, yra skaidraus tirpalo susidarymas. Tinkami tirpikliai yra acetonitrilas, vanduo, vandens ir acetonitrilo 1:1 mišinys, izopropanolis, acetonas arba acetono ir acetonitrilo 1:1 mišinys. Galima naudoti kitus tirpiklius, jei jie neturi įtakos peptidų stabilumui, kuriam kontroliuoti naudojami etaloniniai kontroliniai ėminiai C (t. y. ėminiai, kuriuos sudaro vien tik peptidas, ištirpintas tinkamame tirpiklyje; žr. 3 priedėlį). Jei bandomoji cheminė medžiaga netirpsta nei viename iš šių tirpiklių, blogiausiu atveju reikėtų mėginti ją soliubilizuoti 300 μl DMSO ir gautą tirpalą atskiesti 2 700 μl acetonitrilo, o jei bandomoji cheminė medžiaga netirpsta šiame mišinyje, reikėtų mėginti tą patį bandomosios cheminės medžiagos kiekį soliubilizuoti 1 500 μl DMSO ir gautą tirpalą atskiesti 1 500 μl acetonitrilo. Bandomąją cheminę medžiagą reikėtų iš anksto pasverti į stiklinius buteliukus ir nedelsiant ištirpinti prieš pat bandymą tinkamame tirpiklyje, paruošiant 100 mmol/l tirpalą. Jei tiriami žinomos sudėties mišiniai ir daugiakomponentės medžiagos, reikėtų nustatyti vieną grynumą, kaip jų sudedamųjų dalių (išskyrus vandenį) sumą, ir vieną vidutinę molekulinę masę – atsižvelgiant į kiekvieno atskiro mišinio komponento (išskyrus vandenį) molekulinę masę ir kiekvieno iš jų dalį. Gautas grynumo ir vidutinės molekulinės masės vertes reikėtų naudoti apskaičiuojant bandomosios cheminės medžiagos masę, kurios reikia 100 mmol/l tirpalui paruošti. Kadangi negalima nustatyti polimerų pagrindinės molekulinės masės, galima imti monomero molekulinę masę (ar polimerą sudarančių monomerų vidutinę molekulinę masę) 100 mmol/l tirpalui paruošti. Tačiau, bandant žinomos sudėties mišinius, daugiakomponentes medžiagas ar polimerus, reikėtų numatyti galimybę bandyti grynąją cheminę medžiagą. Skystąsias grynas chemines medžiagas reikėtų bandyti kaip tokias ir iš anksto neskiestas, inkubuojant atitinkamai 1:10 ir 1:50 moliniu santykiu su cisteino ir lizino peptidais. Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti gaunant maksimalią tirpumo koncentraciją tame pačiame tirpiklyje, kuris naudojamas 100 mmol/l efektyviosios koncentracijos tirpalui ruošti. Jas reikėtų bandyti kaip tokias ir papildomai neskiesti, inkubuojant atitinkamai 1:10 ir 1:50 moliniu santykiu su cisteino ir lizino peptidais. Jei efektyviosios koncentracijos 100 mmol/l tirpalui ir grynai cheminei medžiagai gauti rezultatai (reaktyvumo ar nereaktyvumo) sutaptų, būtų galima padaryti tvirtą išvadą dėl rezultato.
                     
                        Teigiamų kontrolinių ėminių, etaloninių kontrolinių ėminių ir koeliuavimo kontrolinių ėminių paruošimas
                     
                     Kaip teigiamą kontrolinę cheminę medžiagą (PC) reikėtų naudoti cinamono aldehidą (CAS 104-55-2; ≥95 % maistinio grynumo), ruošiant 100 mmol/l koncentracijos tirpalą acetonitrile. Galima naudoti kitas tinkamas teigiamas kontrolines chemines medžiagas, kurioms būtų gautos vidutinės kiekio sumažėjimo vertės, jei yra istorinių duomenų, kad būtų galima gauti palyginamuosius bandymo eigos priimtinumo kriterijus. Be to, į HPLC bandymų seką reikėtų įtraukti etaloninius kontrolinius ėminius (t. y. ėminius, kuriuos sudaro vien tik peptidas, ištirpintas tinkamame tirpiklyje), kurie naudojami HPLC sistemos tinkamumui tikrinti prieš analizę (etaloninius kontrolinius ėminius A), etaloninių kontrolinių ėminių laikiniam stabilumui tikrinti (etaloninius kontrolinius ėminius B), ir ėminius, kurie patikrintų, ar bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti naudojamas tirpiklis nedaro įtakos procentiniam peptidų kiekio sumažėjimui (etaloninius kontrolinius ėminius C) (žr. 3 priedėlį). Kiekvienai cheminei medžiagai naudojamas reikiamas kontrolinis ėminys tos cheminės medžiagos procentiniam peptidų kiekio sumažėjimui apskaičiuoti (žr. 26 pastraipą). Be to, kiekvienai analizuojamai bandomajai cheminei medžiagai į bandymų seką reikėtų įtraukti koeliuavimo kontrolinį ėminį, kurį sudarytų vien tik bandomoji cheminė medžiaga, kad būtų galima aptikti galimą bandomosios cheminės medžiagos koeliuavimą su lizino ar cisteino peptidu.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos inkubavimas su cisteino ir lizino peptidų tirpalais
                     
                     Cisteino ir lizino peptidų tirpalus reikėtų inkubuoti su bandomąja chemine medžiaga stikliniuose automatinio ėminių ėmiklio buteliukuose atitinkamai 1:10 ir 1:50 santykiu. Jei iš karto po bandomosios cheminės medžiagos tirpalo įpylimo į peptidų tirpalą atsiranda nuosėdų dėl jos mažo tirpumo vandenyje, šiuo atveju nėra aišku, koks bandomosios cheminės medžiagos kiekis liko tirpale reakcijai su peptidu. Todėl tokiu atveju teigiamą rezultatą vis tiek būtų galima panaudoti, bet neigiamas rezultatas yra neapibrėžtas ir jį reikėtų aiškinti gana atsargiai (taip pat žr. 11 pastraipos nuostatas dėl cheminių medžiagų, kurių tirpumo nepakanka 100 mmol/l koncentracijai gauti, bandymo). Prieš atliekant HPLC analizę, reakcijos tirpalą reikėtų laikyti 24 ± 2 h tamsoje ir 25 ± 2,5 °C temperatūroje. Kiekviena bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti analizuojama tris kartus su abiem peptidais. Prieš HPLC analizę ėminiai turi būti vizualiai patikrinti. Jei stebimos nuosėdos arba fazių atsiskyrimas, atsargumo dėlei ėminius galima centrifuguoti mažu greičiu (100–400 × g), kad nuosėdos nusėstų ant buteliuko dugno, nes dėl didelio nuosėdų kiekio gali užsikimšti HPLC vamzdeliai ar kolonėlės. Jei, pasibaigus inkubavimo laikotarpiui, stebimos nuosėdos arba fazių atsiskyrimas, peptidų kiekio sumažėjimo įvertis gali būti per mažas ir neigiamo rezultato atveju negalima padaryti pakankamai patikimos išvados dėl reaktyvumo nebuvimo.
                     
                        HPLC etaloninės kalibravimo kreivės sudarymas
                     
                     Reikėtų sudaryti abiejų peptidų, cisteino ir lizino, etaloninę kalibravimo kreivę. Peptidų etalonus reikėtų ruošti 20 % ar 25 % acetonitrilo ir buferinio tirpalo mišinio tirpale, naudojant fosfatinį buferinį tirpalą (pH 7,5) cisteino peptidui ir amonio acetato buferinį tirpalą (pH 10,2) lizino peptidui. Naudojant peptidų pradinio tirpalo (0,667 mmol/l) praskiestų etaloninių tirpalų seriją, reikėtų paruošti 6 kalibravimo tirpalus, kurie apimtų 0,534–0,0167 mmol/l intervalą. Į etaloninę kalibravimo kreivę taip pat reikėtų įtraukti buferinio tirpalo tuščiąjį ėminį. Tinkamos kalibravimo kreivės turėtų turėti r2>0,99.
                     
                        Pasiruošimas HPLC ir analizė
                     
                     Prieš atliekant analizę reikėtų patikrinti HPLC sistemos tinkamumą. Peptidų kiekio sumažėjimas stebimas HPLC sistema, sujungta su UV detektoriumi (fotodiodinės matricos detektoriumi ar fiksuoto bangos ilgio sugerties detektoriumi, matuojant 220 nm signalą). HPLC sistemoje įrengiama reikiama kolonėlė. HPLC įrenginio struktūra yra aprašyta patvirtintame protokole, kuriame kaip tinkamiausia kolonėlė naudojama Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 mikronų kolonėlė. Naudojant šią atvirkštinių fazių HPLC kolonėlę 2 h iki bandymo pradžios visoje sistemoje turi būti nustatyta pusiausvyra 30 °C su 50 % A fazės (0,1 % (tūrio) trifluoracto rūgšties tirpalas vandenyje) ir 50 % B fazės (0,085 % (tūrio) trifluoracto rūgšties tirpalas acetonitrile) tirpalu.. HPLC analizė turėtų būti atliekama esant 0,35 ml/min srautui ir tiesiniam gradientui nuo 10 % iki 25 % acetonitrilo per 10 min, tada staigiai padidinama iki 90 % acetonitrilo kitoms medžiagoms pašalinti. Reikėtų įpurkšti vienodą kiekvieno etalono, ėminio ir kontrolinio ėminio tūrį. Tarp įpurškimų pradinėmis sąlygomis kolonėlėje 7 min turėtų būti nustatoma pusiausvyra. Jei naudojama kitokia atvirkštinių fazių HPLC kolonėlė, pirmiau aprašytus nustatomuosius parametrus reikėtų reguliuoti, kad būtų užtikrintas reikiamas eliuavimas ir cisteino bei lizino peptidų smailių integravimas, įskaitant įpurškiamą tūrį, kuris gali skirtis atsižvelgiant į naudojamą sistemą (paprastai 3–10 μl). Svarbu pažymėti, kad naudojant alternatyviąją HPLC schemą, reikėtų įrodyti jos atitiktį pirmiau aprašytai patvirtintai schemai (pvz., bandant 2 priedėlyje nurodytas kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas). Sugerties koeficientas matuojamas esant 220 nm. Jei naudojamas fotodiodinės matricos detektorius, reikėtų registruoti sugerties koeficientą esant 258 nm. Reikėtų pažymėti, kad kai kurių tiekėjų acetonitrilas gali daryti neigiamą įtaką peptidų stabilumui ir tai reikėtų įvertinti, kai naudojama nauja acetonitrilo partija. Kaip koeliuavimo rodiklį galima naudoti 220 smailės ploto ir 258 smailės ploto santykį. Jei kiekvieno ėminio santykio intervalas atitinka 90 % < kontrolinių ėminių santykio vidurkis (19) <100 %, tai būtų tinkamas įrodymas, kad koeliuavimo nebuvo.
                     Gali būti bandomųjų cheminių medžiagų, kurios galėtų skatinti cisteino peptido oksidaciją. Cisteino peptido dimero smailę galima stebėti vizualiai. Jei pasirodytų, kad vyko dimerizacija, ji būtų stebima kaip galimas per didelis procentinio peptidų kiekio sumažėjimo įvertis, dėl ko būtų gaunamos klaidingai teigiamos prognozės ir (arba) medžiaga priskirta aukštesnei reaktyvumo klasei (žr. 29 ir 30 pastraipas).
                     Cisteino ir lizino peptidų HPLC analizę galima atlikti vienu metu (jei yra dvi HPLC sistemos) ar skirtingomis dienomis. Jei analizė atliekama skirtingomis dienomis, visi bandomosios cheminės medžiagos tirpalai turėtų būti iš naujo ruošiami abiem bandymams kiekvieną dieną. Analizės trukmę reikėtų matuoti, siekiant užtikrinti, kad pirmasis ėminys būtų įpurškiamas praėjus 22–26 h nuo bandomosios cheminės medžiagos sumaišymo su peptidų tirpalu. HPLC eigos seka turėtų būti sudaryta taip, kad HPLC analizės trukmė būtų trumpesnė kaip 30 h. Jei tai HPLC įrenginys, naudotas atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą ir aprašytas šiame bandymų metode, atliekant vieną HPLC bandymų seriją galima įdėti iki 26 analizės ėminių (taip pat žr. 17 pastraipą). HPLC analizės sekos pavyzdys pateiktas 3 priedėlyje.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Duomenų įvertinimas
                     
                     Kiekvieno ėminio cisteino ar lizino peptidų koncentracija nustatoma fotometriškai, matuojant 220 nm bangos ilgį atitinkančių reikiamų smailių plotą (plotą po kreive) ir peptidų koncentraciją apskaičiuojant pagal etalonams gautą tiesinio kalibravimo kreivę.
                     Kiekvieno ėminio procentinis peptidų kiekio sumažėjimas nustatomas, matuojant smailės plotą, kuris dalijamas iš atitinkamų etaloninių kontrolinių ėminių C vidutinio smailės ploto (žr. 3 priedėlį) pagal toliau pateiktą formulę.
                     
                        
                     
                        Priimtinumo kriterijai
                     
                     Bandymų seka būtų laikoma tinkama, jei ji atitiktų šiuos kriterijus:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 etaloninė kalibravimo kreivė turėtų turėti r2>0,99,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 cinamono aldehido, kaip teigiamos kontrolinės medžiagos, trijų kartotinių ėminių vidutinė procentinio peptidų kiekio sumažėjimo vertė, gauta cisteino peptidui, turėtų būti 60,8 %–100 %, o lizino peptidui – 40,2 %–69,0 %, kartotinių teigiamų kontrolinių ėminių cisteino procentinio kiekio sumažėjimo maksimalus standartinis nuokrypis (SN) turėtų būti <14,9 %, lizino – <11,6 %, ir
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 etaloninių kontrolinių ėminių A vidutinė peptidų koncentracija turėtų būti 0,50 ± 0,05 mmol/l, devynių etaloninių kontrolinių ėminių B ir C tirpalo acetonitrile smailių plotų variacijos koeficientas (CV) turėtų būti <15,0 %.
                              
                           Jei nėra atitikties vienam arba daugiau kriterijų, bandymą reikėtų pakartoti.
                     Bandomajai cheminei medžiagai gauti rezultatai būtų laikomi tinkamais, jei jie atitiktų šiuos kriterijus:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 bandomosios cheminės medžiagos kartotinių ėminių cisteino procentinio kiekio sumažėjimo maksimalus standartinis nuokrypis turėtų būti < 14,9 %, lizino – < 11,6 %,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 trijų etaloninių kontrolinių ėminių C vidutinė peptidų koncentracija atitinkamame tirpiklyje turėtų būti 0,50 ± 0,05 mmol/l. Jei šių kriterijų nesilaikoma, duomenys turėtų būti atmesti ir bandymas su ta konkrečia bandomąja chemine medžiaga turėtų būti pakartotas.
                              
                           
                        Prognozavimo modelis
                     
                     Apskaičiuojamas kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai gautas cisteino ir lizino vidutinis kiekio sumažėjimas procentais. Skaičiuojant vidurkį, neigiamas sumažėjimas prilyginamas nuliui. Naudojant cisteino 1:10 ir lizino 1:50 prognozavimo modelį, pateiktą 1 lentelėje, peptidų kiekio sumažėjimo vidurkio 6,38 % riba turėtų būti naudojama kaip odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų skiriamoji riba IATA sistemoje. Prognozavimo modelio taikymas, bandomąją cheminę medžiagą priskiriant reaktyvumo klasei (t. y. mažo, vidutinio ir didelio reaktyvumo), gali būti naudingas jautrinimo gebos vertinimo informacijai gauti IATA sistemoje.
                     
                        1 lentelė
                     
                     
                        Cisteino 1:10 ir lizino 1:50 prognozavimo modelis
                         (20)
                     
                     
                                 Cisteino ir lizino vidutinis kiekio sumažėjimas %
                              
                              
                                 Reaktyvumo klasė
                              
                              
                                 DPRA prognozė (21)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ vidutinis kiekio sumažėjimas % ≤ 6,38 %
                              
                              
                                 Jokio reaktyvumo arba jis minimalus
                              
                              
                                 Neigiama
                              
                           
                                 6,38 % < vidutinis kiekio sumažėjimas % ≤ 22,62 %
                              
                              
                                 Mažas reaktyvumas
                              
                              
                                 Teigiama
                              
                           
                                 22,62 % < vidutinis kiekio sumažėjimas % ≤ 42,47 %
                              
                              
                                 Vidutinis reaktyvumas
                              
                           
                                 42,47 % < vidutinis kiekio sumažėjimas % ≤ 100 %
                              
                              
                                 Didelis reaktyvumas
                              
                           Gali pasitaikyti atvejų, kai bandomoji cheminė medžiaga (medžiaga ar vienas arba keli daugiakomponentės medžiagos ar mišinio komponentai) reikšmingai sugeria esant 220 nm bangos ilgiui ir sulaikymo trukmė yra lygi peptido sulaikymo trukmei (koeliuavimas). Koeliuavimo problemą galima išspręsti šiek tiek suderinant HPLC įrenginį, kad labiau atsiskirtų bandomosios cheminės medžiagos ir peptido sulaikymo trukmė. Jei sprendžiant atskyrimo problemą naudojamas alternatyvus HPLC įrenginys, turėtų būti įrodyta jo atitiktis patvirtintai procedūrai (pvz., bandant 2 priedėlyje nurodytas kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas). Jei vyksta koeliuavimas, peptido smailė negali būti integruojama ir neįmanoma apskaičiuoti procentinio peptidų kiekio sumažėjimo. Kai tokios bandomosios cheminės medžiagos koeliuavimas vyksta su abiem, cisteino ir lizino, peptidais, analizė turėtų būti pateikta ataskaitoje kaip „nedavusi rezultato“. Jei koeliuavimas vyksta tik su lizino peptidu, galima naudoti cisteino 1:10 prognozavimo modelį, pateiktą 2 lentelėje.
                     
                        2 lentelė
                     
                     
                        Cisteino 1:10 prognozavimo modelis
                         (22)
                     
                     
                                 Cisteino (Cys) kiekio sumažėjimas %
                              
                              
                                 Reaktyvumo klasė
                              
                              
                                 DPRA prognozė (23)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ Cys kiekio sumažėjimas, % ≤ 13,89 %
                              
                              
                                 Jokio reaktyvumo arba jis minimalus
                              
                              
                                 Neigiama
                              
                           
                                 13,89 % < Cys kiekio sumažėjimas, % ≤ 23,09 %
                              
                              
                                 Mažas reaktyvumas
                              
                              
                                 Teigiama
                              
                           
                                 23,09 % < Cys kiekio sumažėjimas, % ≤ 98,24 %
                              
                              
                                 Vidutinis reaktyvumas
                              
                           
                                 98,24 % < Cys kiekio sumažėjimas, % ≤ 100 %
                              
                              
                                 Didelis reaktyvumas
                              
                           Gali būti kitų atvejų, kai bandomosios cheminės medžiagos ir kurio nors iš peptidų sulaikymo trukmės persidengimas yra nepakankamas. Tokiais atvejais procentinį peptidų kiekio sumažėjimą galima įvertinti apytikriai ir naudoti kaip cisteino 1:10 ar lizino 1:50 prognozavimo modelį, tačiau bandomosios cheminės medžiagos negalima tiksliai priskirti reaktyvumo klasei.
                     Vienos cisteino ir lizino peptidų HPLC analizės turėtų pakakti bandomajai cheminei medžiagai, kai rezultatas yra aiškus. Tačiau kai rezultatai yra arti naudojamos teigiamo ir neigiamo rezultatų atskyrimo ribos (t. y. tarpiniai rezultatai), gali prireikti papildomo bandymo. Jei pagal cisteino 1:10 ar lizino 1:50 prognozavimo modelį procentinio peptidų kiekio sumažėjimo vidurkis yra 3 %–10 % intervale, o pagal cisteino 1:10 prognozavimo modelį cisteino procentinio kiekio sumažėjimo vidurkis yra 9 %–17 % intervale, reikėtų spręsti klausimą dėl antrojo bandymo, taip pat dėl trečiojo, jei per pirmuosius du būtų gauti prieštaraujantys rezultatai.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Vienkomponentė medžiaga
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas (-ai), CAS numeris (-iai), SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė ir (arba) kiti identifikavimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje, molekulinė masė ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertė (-ės);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišinys:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, pvz., cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), grynumas, kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         molekulinė masė arba vidutinė molekulinė masė, jei tai žinomos sudėties mišiniai ar polimerai arba kita tyrimams atlikti svarbi informacija;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertė (-ės);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontroliniai ėminiai
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Teigiami kontroliniai ėminiai
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas (-ai), CAS numeris (-iai), SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė ir (arba) kiti identifikavimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje, molekulinė masė ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertė (-ės);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nuoroda į istorinių teigiamų kontrolinių ėminių rezultatus, kurie įrodytų tinkamus bandymo priėmimo kriterijus, jei tinka.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Tirpiklis ir (arba) nešiklis
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         naudotas tirpiklis ir (arba) nešiklis ir jų sudedamųjų dalių santykis, jei tinka;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas (-ai), CAS numeris (-iai) ir (arba) kiti identifikavimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, molekulinė masė ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, jei naudojami kiti nei bandymų metode nurodyti tirpikliai ar nešikliai, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos tirpiklio pasirinkimo pagrindimas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         įtakos peptido stabilumui bandymo rezultatai, jei naudojamas acetonitrilas.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Peptidų, teigiamo kontrolinio ėminio ir bandomosios cheminės medžiagos paruošimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             peptidų tirpalų apibūdinimas (tiekėjas, partija, tiksli peptido masė, į pradinį tirpalą įpiltas tūris);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teigiamo kontrolinio ėminio tirpalo apibūdinimas (tiksli teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos masė, į bandymo tirpalą įpiltas tūris);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos tirpalų apibūdinimas (tiksli bandomosios cheminės medžiagos masė, į bandymo tirpalą įpiltas tūris).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    HPLC prietaiso nuostačiai ir analizė
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             HPLC prietaiso, HPLC ir prieškolonėlių, detektoriaus, automatinio ėminių ėmiklio tipas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             su HPLC analize susiję parametrai, pvz., kolonėlės temperatūra, įpurškiami tūriai, srautas ir gradientas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sistemos tinkamumas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno etalono ir etaloninio kontrolinio ėminio A kartotinių ėminių peptidų smailių plotas esant 220 nm;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             grafinis tiesinės kalibravimo kreivės vaizdas ir ataskaitoje pateikta r2 vertė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             etaloninio kontrolinio ėminio A kiekvieno kartotinio ėminio peptidų koncentracija;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             trijų etaloninių kontrolinių ėminių A peptidų koncentracija (mmol/l), standartinis nuokrypis ir variacijos koeficientas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             etaloninių kontrolinių ėminių A ir C peptidų koncentracija.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Analizės seka
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Etaloninių kontrolinių ėminių:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno B ir C kartotinio ėminio peptidų smailių plotas esant 220 nm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         devynių etaloninių kontrolinių ėminių B ir C peptidų tirpalo acetonitrile vidutinis smailių plotas esant 220 nm, standartinis nuokrypis ir variacijos koeficientas (dėl kontrolinių ėminių stabilumo per visą analizės trukmę);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno naudoto tirpiklio trijų atitinkamų etaloninių kontrolinių ėminių C vidutinis peptidų smailės plotas esant 220 nm (procentiniam peptidų kiekio sumažėjimui skaičiuoti);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno naudoto tirpiklio trijų atitinkamų etaloninių kontrolinių ėminių C peptidų koncentracija (mmol/l);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno naudoto tirpiklio trijų atitinkamų etaloninių kontrolinių ėminių C vidutinė peptidų koncentracija (mmol/l), standartinis nuokrypis ir variacijos koeficientas.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Teigiamų kontrolinių ėminių:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno kartotinio ėminio peptidų smailių plotas esant 220 nm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno kartotinio ėminio procentinis peptidų kiekio sumažėjimas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         trijų kartotinių ėminių procentinio peptidų kiekio sumažėjimo vidurkis, standartinis nuokrypis ir variacijos koeficientas.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         reakcijos mišinyje susidariusių nuosėdų išvaizda inkubavimo laikotarpio pabaigoje, jei jų yra. Ar nuosėdos buvo pakartotinai soliubilizuojamos ar centrifuguojamos;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koeliuavimo buvimas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         visų kitų svarbių stebėjimų aprašymas, jei tinka;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno kartotinio ėminio peptidų smailių plotas esant 220 nm;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno kartotinio ėminio procentinis peptidų kiekio sumažėjimas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         trijų kartotinių ėminių procentinio peptidų kiekio sumažėjimo vidurkis, standartinis nuokrypis ir variacijos koeficientas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vidutinės cisteino ir lizino procentinio sumažėjimo vertės;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         naudotas prognozavimo modelis ir DPRA prognozė.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kvalifikacijos tikrinimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Procedūra, taikyta įrodant laboratorijos kvalifikaciją atlikti bandymus pagal šį metodą, jei tinka (pvz., bandant kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas) arba įrodant metodo taikymo charakteristikų atkuriamumą laikui bėgant.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Rezultatų, gautų taikant DPRA bandymų metodą, aptarimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandymų metodo rezultatų aptarimas atsižvelgiant į IATA, jei turima kita susijusi informacija.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvada
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Šio priedo B.6 skyrius. Odos jautrinimas.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Šio priedo B.42 skyrius. Vietinio limfmazgio bandymas
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Šio priedo B.50 skyrius. Odos jautrinimas: Vietinio limfmazgio bandymas. DA.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Šio priedo B.51 skyrius: Odos jautrinimas: Vietinio limfmazgio bandymas. BrdU-ELISA
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367-485.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332-343.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417-427.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Available at: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: 10.1002/jat.2869.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489-504.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Ball et al (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Accessible at: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Accessible at: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Accessible at: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf - 138
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Tikslumas
                           – bandymo metodo rezultatų ir patvirtintų pamatinių verčių sutapimo artumas. Tikslumas yra bandymo metodo taikymo charakteristikų matas ir vienas iš „tinkamumo“ aspektų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „atitiktis“ tinkamų bandymo metodo rezultatų daliai išreikšti (21).
                        
                           
                              Nepalankios baigties kelias (angl. Adverse Outcome Pathway, AOP)
                           – įvykių seka nuo tikslinės cheminės medžiagos ar panašių cheminių medžiagų grupių cheminės sandaros per molekulinio inicijavimo įvykį iki in vivo tiriamo rezultato (2).
                        
                           
                              Kalibravimo kreivė
                           – bandant žinomą cheminę medžiagą gauto atsako vertės priklausomybė nuo analizinės koncentracijos (tai pat vadinama etalonine kalibravimo kreive).
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Variacijos koeficientas
                           – kintamumo matas, apskaičiuojamas kartotinių ėminių duomenų grupei kaip standartinio nuokrypio ir vidurkio dalmuo. Jį galima padauginti iš 100, kad būtų išreikštas procentais.
                        
                           
                              Pavojus
                           – būdingoji agento savybė arba situacija, galinti sukelti neigiamų padarinių, kai organizmą, sistemą ar populiaciją (arba jos dalį) veikia tas agentas.
                        
                           
                              Integruotasis bandymo ir vertinimo metodas (angl. Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA)
                           – struktūrinis metodas, taikomas cheminės medžiagos ar cheminių medžiagų grupės (galimam) pavojui identifikuoti, pavojui (veikimo gebai) apibūdinti ir (arba) saugai vertinti (galimo pavojaus ir (arba) veikimo gebos ir paveikimo), kurį taikant strategiškai apjungiami į vieną visumą ir įvertinami visi susiję duomenys, kad būtų galima pateikti informaciją reglamentavimo sprendimui priimti dėl galimo pavojaus ir (arba) rizikos, ir (arba) dėl būtinumo atlikti papildomą tikslinį, taigi minimalų bandymą.
                        
                           
                              Molekulinio inicijavimo įvykis
                           – cheminės medžiagos sukelta biologinės sistemos triktis molekuliniu lygiu, kuri identifikuojama kaip nepalankios baigties kelio pradinis įvykis.
                        
                           
                              Mišinys
                           – iš dviejų arba daugiau medžiagų sudarytas mišinys arba tirpalas, kuriame jos nereaguoja (1)
                        
                           
                              Vienkomponentė medžiaga
                           – medžiaga, kurią apibrėžia jos kiekybinė sudėtis, kai vienas pagrindinis komponentas sudaro ne mažiau kaip 80 % (masės).
                        
                           
                              Daugiakomponentė medžiaga
                           – medžiaga, kurią apibrėžia jos kiekybinė sudėtis, kai daugiau kaip vieno pagrindinio komponento koncentracija ≥ 10 % (masės) ir < 80 % (masės). Daugiakomponentė medžiaga yra gamybos proceso rezultatas. Skirtumas tarp mišinio ir daugiakomponentės medžiagos yra tas, kad mišinys gaunamas sumaišant dvi medžiagas arba daugiau nevykstant cheminei reakcijai. Daugiakomponentė medžiaga yra cheminės reakcijos rezultatas.
                        
                           
                              Teigiamas kontrolinis ėminys
                           – kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus ir apdorotas chemine medžiaga, kuri yra žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką. Siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus.
                        
                           
                              Pamatinis kontrolinis ėminys
                           – visus bandymo sistemos komponentus, įskaitant tirpiklį ar nešiklį, turintis neapdorotas ėminys, kuris tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga, apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti atskaitos vertę ėminiams, apdorotiems bandomąja chemine medžiaga, ištirpinta tame pačiame tirpiklyje ar nešiklyje. Kai bandomas kartu su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, šis ėminys taip pat parodo, ar vyksta tirpiklio arba nešiklio sąveika su bandymo sistema.
                        
                           
                              Tinkamumas
                           – santykio tarp bandymo ir tiriamo poveikio bei bandymo reikšmingumo bei naudingumo siekiant tam tikro tikslo apibūdinimas. Tai yra atliekant bandymą tiriamo biologinio poveikio matavimo ar prognozavimo tikslumo laipsnis. Tinkamumas aprėpia bandymų metodo tikslumo (atitikties) aspektą (21).
                        
                           
                              Patikimumas
                           – pagal tą patį protokolą atliekamo bandymų metodo, tam tikrą laiką taikomo laboratorijose ir tarp laboratorijų, atkuriamumo laipsnio matas. Jis įvertinamas apskaičiuojant atkuriamumą laboratorijoje ir tarp laboratorijų ir pakartojamumą laboratorijoje (21).
                        
                           
                              Atkuriamumas
                           – rezultatų, gautų pagal vienodą bandymų protokolą bandant tą pačią cheminę medžiagą, sutapimas (žr. patikimumas) (21).
                        
                           
                              Jautris
                           – visų teigiamų ar veikliųjų cheminių medžiagų, kurios buvo tiksliai klasifikuotos atliekant bandymą, dalis. Jis yra bandymų metodo, kuriuo gaunami kategorijos nustatymo rezultatai, tikslumo matas ir svarbus aspektas vertinant bandymų metodo tinkamumą (21).
                        
                           
                              Specifiškumas
                           – visų neigiamų ar neveikliųjų cheminių medžiagų, kurios buvo tiksliai klasifikuotos atliekant bandymą, dalis. Jis yra bandymų metodo, kuriuo gaunami kategorijos nustatymo rezultatai, tikslumo matas ir svarbus aspektas vertinant bandymų metodo tinkamumą (21).
                        
                           
                              Medžiaga
                           – gamtoje randami arba gamybos procese gaunami cheminiai elementai ir jų junginiai, įskaitant visus priedus, kurių reikia produkto stabilumui užtikrinti, ir visas priemaišas, patenkančias į produktą taikomo proceso metu, tačiau neįskaitant tirpiklio, kurį galima atskirti, nepaveikiant medžiagos stabilumo ar nekeičiant jos sudėties (1).
                        
                           
                              Sistemos tinkamumas
                           – prietaiso eksploatacinių charakteristikų (pvz., jautrio) nustatymas analizuojant pamatinį etaloną prieš atliekant ėminių partijos analizę (22).
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – terminas bandomoji cheminė medžiaga vartojamas bandomam dalykui nurodyti.
                        
                           
                              Jungtinių Tautų visuotinai suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema (JT GHS)
                           – sistema, kurioje pateikiamas cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimas pagal standartizuotus fizikinių pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai tipus ir nagrinėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signaliniai žodžiai, pavojingumo frazės, atsargumo frazės ir saugos duomenų lapai, kad būtų galima informuoti apie medžiagų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vežėjus, vartotojus ir avarijų likvidatorius) ir aplinką (1).
                        
                           
                              UVCB
                           – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos.
                        
                           
                              Patvirtinto tinkamumo bandymų metodas
                           – bandymų metodas, kurio tinkamumo ir patikimumo pakanka tam tikram tikslui pasiekti ir kuriam taikomi moksliškai pagrįsti principai. Bandymų metodas niekuomet nėra visiškai tinkamas absoliučiąja prasme, bet tik tam tikro tikslo atžvilgiu (21).
                     
                     
                        2 priedėlis
                        KVALIFIKACIJAI TIKRINTI SKIRTOS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                        
                           Odos jautrinimas in chemico. Tiesioginio peptidų reaktyvumo tyrimas
                        
                        Prieš pradėdamos įprastiniu būdu taikyti šį bandymų metodą, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, pateikdamos tikslią DPRA prognozę, tam naudodamos 10 cheminių medžiagų, kurios rekomenduojamos 1 lentelėje, siekiant nustatyti kiekvienam peptidui cisteino ir lizino kiekio sumažėjimo vertes, kurios patektų į atitinkamą 8 iš 10 kvalifikacijos tikrinimui panaudotų etaloninių medžiagų nurodytą intervalą. Šios kvalifikacijai tikrinti skirtos etaloninės medžiagos buvo pasirinktos taip, kad atitiktų odos jautrinimo pavojaus intervalą. Kiti atrankos kriterijai buvo galimybė pirkti chemines medžiagas ir tai, ar yra aukštos kokybės in vivo etaloniniai duomenys bei aukštos kokybės in vitro DPRA bandymų metodo duomenys ir ar jie buvo naudojami atliekant EURL ECVAM koordinuotą tinkamumo patvirtinimo tyrimą, siekiant įrodyti sėkmingą bandymų metodo įdiegimą tyrime dalyvaujančiose laboratorijose.
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           Rekomenduojamos kvalifikacijai tikrinti skirtos cheminės medžiagos laboratorijos techninei kvalifikacijai įrodyti atliekant tiesioginio peptidų reaktyvumo tyrimą
                        
                        
                                    Kvalifikacijai tikrinti skirtos cheminės medžiagos
                                 
                                 
                                    CAS Nr.
                                 
                                 
                                    Agregatinė būsena
                                 
                                 
                                    Prognozė in vivo
                                        (24)
                                    
                                 
                                 
                                    DPRA prognozė (25)
                                    
                                 
                                 
                                    Cisteino peptido kiekio sumažėjimo, %, intervalas (26)
                                    
                                 
                                 
                                    Lizino peptido kiekio sumažėjimo, %, intervalas (26)
                                    
                                 
                              
                                    2,4-dinitrochlorbenzenas
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga
                                    (ypač stipriai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    90–100
                                 
                                 
                                    15–45
                                 
                              
                                    Oksazolonas
                                 
                                 
                                    15646-46-5
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga
                                    (ypač stipriai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    60–80
                                 
                                 
                                    10–55
                                 
                              
                                    Formaldehidas
                                 
                                 
                                    50-00-0
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga
                                    (stipriai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    30–60
                                 
                                 
                                    0–24
                                 
                              
                                    Benzilidenacetonas
                                 
                                 
                                    122-57-6
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga
                                    (vidutinio stiprumo)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    80–100
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                              
                                    Farnezalis
                                 
                                 
                                    19317-11-4
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga
                                    (silpnai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    15–55
                                 
                                 
                                    0–25
                                 
                              
                                    2,3-butandionas
                                 
                                 
                                    431-03-8
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga
                                    (silpnai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    60–100
                                 
                                 
                                    10–45
                                 
                              
                                    1-butanolis
                                 
                                 
                                    71-36-3
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0–5,5
                                 
                              
                                    6-metilkumarinas
                                 
                                 
                                    92-48-8
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0–5,5
                                 
                              
                                    Pieno rūgštis
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0–5,5
                                 
                              
                                    4-metoksiacetofenonas
                                 
                                 
                                    100-06-1
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    0–7
                                 
                                 
                                    0–5,5
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           ANALIZĖS SEKOS PAVYZDŽIAI
                        
                        
                                    
                                       Kalibravimo etalonai ir etaloniniai kontroliniai ėminiai
                                    
                                 
                                 
                                    STD1
                                    STD2
                                    STD3
                                    STD4
                                    STD5
                                    STD6
                                    Skiesti naudotas buferinis tirpalas
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys A, 1 kartotinis ėminys
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys A, 2 kartotinis ėminys
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys A, 3 kartotinis ėminys
                                 
                              
                                    
                                       Koeliuavimo kontroliniai ėminiai
                                    
                                 
                                 
                                    1-osios bandomosios cheminės medžiagos 1 koeliuavimo kontrolinis ėminys
                                    2-osios bandomosios cheminės medžiagos 2 koeliuavimo kontrolinis ėminys
                                 
                              
                                    
                                       Etaloniniai kontroliniai ėminiai
                                    
                                 
                                 
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys B, 1 kartotinis ėminys
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys B, 2 kartotinis ėminys
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys B, 3 kartotinis ėminys
                                 
                              
                                    
                                       Pirmasis kartotinių ėminių rinkinys
                                    
                                 
                                 
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys C, 1 kartotinis ėminys
                                    Cinamono aldehidas, 1 kartotinis ėminys
                                    1ėminys, 1 kartotinis ėminys
                                    2 ėminys, 1 kartotinis ėminys
                                 
                              
                                    
                                       Antrasis kartotinių ėminių rinkinys
                                    
                                 
                                 
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys C, 2 kartotinis ėminys
                                    Cinamono aldehidas, 2 kartotinis ėminys
                                    1ėminys, 2 kartotinis ėminys
                                    2 ėminys, 2 kartotinis ėminys
                                 
                              
                                    
                                       Trečiasis kartotinių ėminių rinkinys
                                    
                                 
                                 
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys C, 3 kartotinis ėminys
                                    Cinamono aldehidas, 3 kartotinis ėminys
                                    1ėminys, 3 kartotinis ėminys
                                    2 ėminys, 3 kartotinis ėminys
                                 
                              
                                    
                                       Etaloniniai kontroliniai ėminiai
                                    
                                 
                                 
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys B, 4 kartotinis ėminys
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys B, 5 kartotinis ėminys
                                    Etaloninis kontrolinis ėminys B, 6 kartotinis ėminys
                                 
                              
                                    Į kiekvieną analizės seką turėtų būti įtraukti trys etaloninių kontrolinių ėminių rinkiniai (t. y. ėminiai, kuriuos sudaro vien tik peptidas, ištirpintas tinkamame tirpiklyje):
                                    
                                                 
                                             
                                             
                                                etaloninis kontrolinis ėminys A naudojamas HPLC sistemos tinkamumui tikrinti;
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                etaloninis kontrolinis ėminys B įtraukiamas į analizės seką jos pradžioje ir pabaigoje, kad būtų galima patikrinti etaloninių kontrolinių ėminių stabilumą visą analizės trukmę;
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                etaloninis kontrolinis ėminys C įtraukiamas į analizės seką, kad būtų galima patikrinti, ar bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti naudojamas tirpiklis nedaro įtakos procentinio peptidų kiekio sumažėjimui.
                                             
                                          
                              
                     B.60   Odos jautrinimas in vitro. ARE-Nrf2 liuciferazės bandymų metodas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 442D (2015). Odą jautrinančia medžiaga vadinama medžiaga, kuri susilietusi su oda sukelia alerginį atsaką, kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (1) ir Europos Sąjungos Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (27). Šiame bandymų metode pateikiama procedūra in vitro (ARE-Nrf2 liuciferazės bandymas), kuri turi būti taikoma, kad būtų galima nustatyti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų pagal JT GHS (1) ir CLP.
                     Yra bendrasis susitarimas dėl pagrindinių biologinių reiškinių, kurie pagrįstų odos jautrinimą. Turimos žinios apie cheminius ir biologinius mechanizmus, susijusius su odos jautrinimu, buvo apibendrintos kaip nepalankios baigties kelias (angl. Adverse Outcome Pathway, AOP) (2) nuo molekulinio inicijavimo įvykio per tarpinius įvykius iki neigiamo poveikio sveikatai, t. y. žmonių alerginio kontaktinio dermatito arba graužikų kontaktinio hiperjautrumo (2) (3). Molekulinio inicijavimo įvykis yra kovalentinio ryšio atsiradimas tarp elektrofilinių medžiagų ir odos baltymų nukleofilinių centrų. Antrasis pagrindinis šio AOP įvykis vyksta keratinocituose ir aprėpia uždegiminius atsakus, taip pat genų ekspresiją, susijusią su specifiniais ląstelių signalizacijos keliais, pvz., nuo antioksidacinio ar elektrofilinio atsako elemento (ARE) priklausomais keliais. Trečiasis pagrindinis įvykis – dendritinių ląstelių aktyvinimas, paprastai įvertinamas kaip specifinių ląstelių paviršinių žymeklių, chemokinų ir citokinų, ekspresija. Ketvirtasis pagrindinis įvykis – yra T ląstelių proliferacija, kuri netiesiogiai vertinama atliekant pelių vietinių limfmazgių bandymą (4).
                     Odos jautrinimas paprastai buvo įvertinamas naudojant laboratorinius gyvūnus. Klasikiniai metodai, atliekant bandymus su jūrų kiaulytėmis, yra Magnussono Kligmano jūrų kiaulyčių maksimizavimo bandymas (GMPT) ir Buehlerio bandymas (TM B.6 (5)), kurie tiria odos jautrinimo indukcijos ir atsako sukėlimo tarpsnius. Bandymas su pelėmis, vietinių limfmazgių bandymas (LLNA, TM B.42 (4)) ir jo dvi modifikacijos nenaudojant radioaktyviųjų medžiagų, LLNA: DA (TM B.50 (6)) ir LLNA: BrdU-IFA (TM B.51 (7)), kurie visi vertina tik atsaką į indukciją, taip pat buvo priimti, nes jų privalumai palyginti su bandymais naudojant kiaulytes – gyvūnų gerovė ir odos jautrinimo indukcijos tarpsnio objektyvus matavimas.
                     Vėliau in chemico ir in vitro mechanizmų tyrimais pagrįsti bandymų metodai buvo patvirtinti kaip moksliniu požiūriu tinkami metodai cheminių medžiagų keliamam odos jautrinimo pavojui vertinti. Tačiau bandymų nenaudojant gyvūnų metodų deriniai (in silico, in chemico, in vitro), kaip integruotųjų bandymo ir vertinimo metodų (IATA) dalis, turės visiškai pakeisti šiuo metu atliekamus bandymus su gyvūnais, atsižvelgiant į kiekvieno iš dabar turimų bandymų be gyvūnų metodų apribojimus, susijusius su AOP mechanizmų aprėptimi (2) (3).
                     Šis bandymų metodas (ARE-Nrf2 liuciferazės bandymas) siūlomas antrajam įvykiui tirti, kaip paaiškinta 2 pastraipoje. Buvo pranešimų, kad odą jautrinančios medžiagos indukuoja genus, kuriuos reguliuoja antioksidacinis atsako elementas (ARE) (8) (9). Mažos molekulinės masės elektrofilinės medžiagos, pvz., odą jautrinančios medžiagos gali veikti receptorinį baltymą Keap1 (angl. Kelch-like ECH-associated protein 1), pvz., kovalentiškai modifikuodamos jo cisteino liekaną, dėl ko jis atsiskiria nuo transkripcijos faktoriaus Nrf2 (angl. nuclear factor-erythroid 2-related factor 2). Atsiskyręs Nrf2 gali aktyvinti nuo ARE priklausomus genus, pvz., kurie koduoja II fazės detoksikuojančius fermentus (8) (10) (11).
                     Šiuo metu pagal šį bandymų metodą atliekamas in vitro ARE-Nrf2 liuciferazės bandymas yra tik KeratinoSensTM bandymas, kurio tinkamumo patvirtinimo tyrimai buvo baigti (9) (12) (13) ir jo nepriklausomą ekspertizę atliko Europos Sąjungos bandymų su gyvūnais alternatyvų etaloninė laboratorija (angl. European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing, EURL ECVAM) (14). KeratinoSensTM bandymas buvo laikomas moksliškai pagrįstu, kad galėtų būti naudojamas kaip IATA dalis, kad būtų galima patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų ir odos nejautrinančių medžiagų pavojams klasifikuoti ir ženklinti (14). Laboratorijos, kurios norėtų įdiegti bandymų metodą, gali gauti rekombinantinių ląstelių liniją, naudojamą atliekant KeratinoSensTM bandymą, sudarydamos licencinę sutartį su bandymų metodo kūrėju (15).
                     Apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI, TAIKOMUMAS IR APRIBOJIMAI
                     Kadangi Keap1-Nrf2-ARE kelio aktyvinimu tiriamas tik antrasis odos jautrinimo AOP atvejis, neatrodo, kad vien šios informacijos, gautos taikant šio kelio aktyvinimu pagrįstus bandymų metodus pakaktų ją naudojant išvadai apie cheminės medžiagos odos jautrinimo gebą gauti. Todėl į duomenis, gautus taikant šį bandymų metodą, reikėtų žiūrėti kaip į integruotųjų metodų, pvz., IATA, dalį, juos derinant su kita papildančia informacija, pvz., gauta atliekant in vitro bandymus, kurie nagrinėja kitus svarbius odos jautrinimo AOP įvykius, taip pat taikant ne bandymų metodus, įskaitant kryžmines nuorodas į cheminius analogus. ARE-Nrf2 liuciferazės bandymų metodo taikymo kartu su kita informacija pavyzdžiai pateikti literatūroje (13) (16) (17) (18) (19).
                     Šis bandymų metodas gali būti taikomas kaip IATA dalis, kad būtų galima patvirtinti skirtumą tarp odą jautrinančių medžiagų (t. y. JT GHS ar CLP 1 kategorijos) ir odos nejautrinančių medžiagų. Šis bandymų metodas negali būti taikomas atskirai odą jautrinančioms medžiagoms priskirti 1A ir 1B subkategorijoms, kaip apibrėžta JT GHS ar CLP, arba prognozuoti jų jautrinimo gebą priimant saugos vertinimo sprendimus. Tačiau teigiamas rezultatas priklausomai nuo reglamentavimo sistemos gali būti naudojamas atskirai, kad cheminė medžiaga galėtų būti priskirta JT GHS ar CLP 1 kategorijai.
                     Atsižvelgiant į tinkamumo patvirtinimo tyrime gautą duomenų rinkinį ir į duomenis, gautus atliekant vidinę bandymo metodo nepriklausomą ekspertizę, buvo patvirtinta, kad KeratinoSensTM bandymų metodą galima pritaikyti laboratorijose, kurios turi darbo su ląstelių kultūromis patirties. Taikant metodą tikėtinas prognozių laboratorinio ir tarplaboratorinio atkuriamumo lygis yra 85 % eilės (14). Su LLNA palyginti KeratinoSensTM bandymo tikslumo (77 % – 155/201), jautrio (78 % – 71/91) ir specifiškumo (76 % – 84/110) rezultatai, atskiriant odą jautrinančias medžiagas (t. y. JT GHS ar CLP 1 kategorijos) ir nejautrinančias medžiagas, buvo apskaičiuoti atsižvelgiant į visus duomenis, pateiktus EURL ECVAM bandymo metodui įvertinti ir ekspertizei atlikti (14). Šie skaičiai yra panašūs į neseniai paskelbtus skaičius, pagrįstus maždaug 145 medžiagų bandymais laboratorijos viduje (tikslumas – 77 %, jautris – 79 %, specifiškumas – 72 %) (13). Labiau tikėtina, kad KeratinoSens
                        TM sumažintų prognozę dėl cheminių medžiagų, kurios rodo mažą ar vidutinę odos jautrinimo gebą (t. y. JT GHS ar CLP 1B subkategorijos), nei dėl cheminių medžiagų, kurios rodo didelę odos jautrinimo gebą (t. y. JT GHS ar CLP 1A subkategorijos) (13) (14). Kartu paimta ši informacija rodo KeratinoSens
                        TM bandymo naudą prisidedant prie odos jautrinimo pavojaus identifikavimo. Tačiau čia pateiktos KeratinoSens
                        TM, kaip atskirai taikomo bandymų metodo, tikslumo vertės yra tik orientacinės, kadangi bandymų metodo duomenis reikėtų nagrinėti kartu su kitais informacijos šaltiniais kaip IATA dalimis ir atsižvelgiant į 9 pastraipos nuostatas. Be to, įvertinant odos jautrinimo metodus, kurie nenaudoja gyvūnų, reikėtų turėti omenyje, kad LLNA bandymas, kaip ir kiti bandymai su gyvūnais, gali nevisiškai atitikti situaciją, susijusią su tiriamąja rūšimi, t. y. žmonėmis.
                     Šiame bandymų metode vartojamas terminas bandomoji cheminė medžiaga reiškia tai, kas yra bandoma, ir nėra susijęs su ARE-Nrf2 liuciferazės bandymo metodo tinkamumu bandyti chemines medžiagas ir (arba) mišinius. Atsižvelgiant į šiuo metu turimų duomenų visumą, buvo įrodyta, kad KeratinoSens
                        TM bandymas tinka bandomosioms cheminėms medžiagoms, kurios aprėpia įvairias organines funkcines grupes, reakcijų mechanizmus, odos jautrinimo gebą (nustatyta atliekant in vivo tyrimus) ir fizikines chemines medžiagų savybes (9) (12) (13) (14). Daugiausia buvo bandomos vienkomponentės medžiagos, nors yra šiek tiek duomenų apie mišinių bandymus (20). Badymų metodas vis dėlto laikomas techniškai tinkamu bandyti daugiakomponentes medžiagas ir žinomos sudėties mišinius. Tačiau, prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, tai dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį. Be to, bandant daugiakomponentes medžiagas ar mišinius, reikėtų atsižvelgti į citotoksinių sudedamųjų dalių galimus trikdžius, keliamus stebimiems atsakams. Bandymų metodas taikomas tirpioms bandomosioms cheminėms medžiagoms arba jų stabilioms dispersijoms (t. y. koloidams ar suspensijoms, iš kurių bandomoji cheminė medžiaga neiškrenta į nuosėdas ar nesudaro su tirpikliu skirtingų fazių) vandenyje arba DMSO (įskaitant visus bandomosios cheminės medžiagos komponentus, jei bandoma daugiakomponentė medžiaga ar mišinys). Bandomosios cheminės medžiagos, kurios neatitinka šių sąlygų, būdamos reikiamos didžiausios galutinės koncentracijos 2 000 μmol/l (žr. 22 pastraipą), vis tiek gali būti bandomos mažesnės koncentracijos. Tokiu atveju rezultatai, kurie atitinka teigiamo atsako kriterijus, aprašytus 39 pastraipoje, vis tiek galėtų būti naudojami bandomosios cheminės medžiagos, kaip odą jautrinančios medžiagos, identifikavimui patvirtinti, bet neigiamą rezultatą, gautą esant < 1 000 μmol/l koncentracijai, reikėtų laikyti negalutiniu (žr. 39 pastraipoje pateiktą prognozavimo modelį). Paprastai tų medžiagų, kurių logP yra ne didesnis kaip 5, bandymas buvo sėkmingas, o ypač hidrofobinės medžiagos, kurių logP didesnis kaip 7, nepatenka į žinomą metodo taikymo sritį (14). Apie medžiagas, kurių logP yra nuo 5 iki 7, turima tik ribota informacija.
                     Neigiamus rezultatus reikėtų aiškinti atsargiai, nes, taikant bandymų metodą, kaip neigiamos gali būti aptiktos medžiagos, kurios rodo ypač didelį reaktyvumą lizino liekanų atžvilgiu. Be to, dėl ribotos naudojamos ląstelių linijos metabolinės gebos (21) ir dėl bandymo sąlygų prohaptenai (t. y. cheminės medžiagos, kurias būtina aktyvinti fermentais, pvz., P450 fermentais) ir prehaptenai (t. y. cheminės medžiagos, kurios aktyvinamos autooksidacija), ypač esant mažam oksidacijos greičiui, taip pat gali duoti neigiamus rezultatus. Kita vertus, klaidingai teigiami rezultatai gali būti gauti bandomosioms cheminėms medžiagoms, kurios neveikia kaip jautrinančios, bet yra stresą sukeliantys cheminiai veiksniai (14). Be to, neįmanoma visuomet patikimai įvertinti ypač didelio citotoksiškumo bandomąsias chemines medžiagas. Pagaliau, bandomosios cheminės medžiagos, kurios kelia trukdžius liuciferazės fermentui, gali iškreipti jos aktyvumą atliekant bandymus su ląstelėmis, sukeldamos akivaizdų slopinimą arba padidėjusią liuminescenciją (22). Pavyzdžiui, buvo pranešta, kad fitoestrogenai, būdami didesnės kaip 1 μmol/l koncentracijos, trikdo liuminescencijos signalus, kai atliekami kiti liuciferazės reporterinių genų bandymai dėl per didelio liuciferazės reporterinio geno aktyvinimo (23). Dėl to liuciferazės ekspresiją reikia tirti atidžiai, kai ji gaunama esant didelei koncentracijai fitoestrogenų ar panašių cheminių medžiagų, kurios, kaip manoma, sukelia fitoestrogenams būdingą per didelį liuciferazės reporterinio geno aktyvinimą (23). Tais atvejais, kai galima pateikti įrodymų dėl bandymų metodo netinkamumo kitų specifinių kategorijų cheminėms medžiagoms, toms specifinių kategorijų cheminėms medžiagoms bandymų metodo nereikėtų taikyti.
                     Be to, kad patvirtinamas skirtumas tarp odą jautrinančių medžiagų ir nejautrinančių medžiagų, atliekant KeratinoSens
                        TM bandymą, taip pat gaunama informacijos apie koncentracijos ir atsako priklausomybę, ir ši informacija galėtų papildyti jautrinimo gebos vertinimą, kai bandymas naudojamas kaip integruotųjų metodų, pvz., IATA, dalis (19). Tačiau būtinas papildomas darbas, pageidautina pagrįstas gautais patikimais duomenimis apie žmones, kad būtų galima nustatyti, kaip KeratinoSens
                        TM bandymo rezultatai gali prisidėti prie veikimo gebos vertinimo (24) ir jautrinančių medžiagų skirstymo į subkategorijas pagal JT GHS ar CLP.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     ARE-Nrf2 liuciferazės bandymų metode naudojama imortalizuotų adhezinių ląstelių linija, gauta iš HaCaT žmogaus keratinocitų, stabiliu būdu atlikus transfekciją pasirinkta plazmide. Ląstelių linija turi liuciferazės geną, kurio transkripcinę kontrolę atlieka konstitutyvinis promotorius, sujungtas su geno ARE elementu, apie kurį yra žinoma, kad jo aktyvumą gali skatinti odą jautrinančios medžiagos (25) (26). Liuciferazės signalas rodo nuo Nrf2 priklausančių endogeninių genų aktyvinimą odą jautrinančiomis medžiagomis, ir ši rekombinantinių ląstelių linijos liuciferazės signalo priklausomybė nuo Nrf2 buvo įrodyta (27). Todėl, naudojant gerai ištirtus liuminescenciją sukeliančius liuciferazės substratus, galima kiekybiškai matuoti (aptikti liuminescenciją) elektrofilinėmis medžiagomis apdorotų ląstelių liuciferazės geno indukciją, kaip Nrf2 transkripcijos faktoriaus aktyvumo rodiklį.
                     Atliekant KeratinoSens™ bandymą, laikoma, kad bandomųjų cheminių medžiagų atsakas yra teigiamas, jei jos sukelia statistiškai reikšmingą liuciferazės aktyvumo indukciją, kuri būtų didesnė už tam tikrą ribinę vertę (t. y. padidėtų > 1,5 karto arba 50 %), esant koncentracijai, kuri būtų mažesnė nei tam tikra koncentracija, kuri nedaro reikšmingos įtakos ląstelių gyvybingumui (t. y. mažesnei kaip 1 000 μmol/l ir kuriai esant ląstelių gyvybingumas būtų didesnis kaip 70 % (9) (12)). Šiuo tikslu nustatomas maksimalus liuciferazės aktyvumo indukcijos padidėjimas kartais (Imax) palyginti su tirpiklio (neigiamu) kontroliniu ėminiu. Be to, kadangi ląstelės apdorojamos bandomosiomis cheminėmis medžiagomis, imant koncentracijos verčių seriją, koncentraciją, kuri sukeltų didesnę nei ribinė (t. y. EC1,5 vertės) statistiškai reikšmingą liuciferazės aktyvumo indukciją, reikėtų interpoliuoti pagal dozės ir atsako priklausomybės kreivę (skaičiavimai pateikti 32 pastraipoje). Galiausiai reikėtų atlikti vienalaikius citotoksiškumo matavimus, siekiant įvertinti, ar liuciferazės aktyvumo indukcija vyksta esant mažesnėms nei citotoksinės koncentracijos vertėms.
                     Prieš pradėdamos taikyti ARE-Nrf2 liuciferazės bandymų metodą nuolatiniam naudojimui, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, naudodamos dešimt kvalifikacijai tikrinti skirtų cheminių medžiagų, išvardytų 2 priedėlyje.
                     Galima gauti naudojimo charakteristikų standartus (28), kurie padėtų patvirtinti naujus arba modifikuotus į KeratinoSens™ bandymą panašius in vitro ARE-Nrf2 liuciferazės bandymų metodus, kad būtų galima laiku iš dalies pakeisti šį bandymų metodą ir juos įtraukti į bandymų gaires. Savitarpis duomenų pripažinimas (angl. Mutual Acceptance of Data, MAD) pagal EBPO susitarimą bus užtikrintas tik bandymų metodams, kurių tinkamumas būtų patvirtintas atsižvelgiant į naudojimo charakteristikų standartus, jei būtų atlikta šių bandymų metodų ekspertizė ir EBPO juos įtrauktų į atitinkamas bandymų gaires.
                     PROCEDŪRA
                     Šiuo metu į šį bandymų metodą yra įtrauktas tik vienas moksliškai pagrįstas KeratinoSensTM bandymas (9) (12) (13) (14). Galima gauti keratinoSensTM bandymo standartines veiklos procedūras (angl. Standard Operating Procedures, SOP), kurias reikėtų naudoti, įdiegiant ir taikant šį bandymų metodą laboratorijoje (15). Laboratorijos, kurios norėtų įdiegti bandymų metodą, gali gauti rekombinantinių ląstelių liniją, naudojamą atliekant KeratinoSensTM bandymą, sudarydamos licencinę sutartį su bandymų metodo kūrėju. Tolesnėse pastraipose pateikiamas ARE-Nrf2 liuciferazės bandymų metodo pagrindinių komponentų ir procedūrų aprašymas.
                     
                        Keratinocitų kultūrų paruošimas
                     
                     Reikėtų naudoti transgeninių ląstelių liniją, turinčią stabilų liuciferazės reporterinio geno intarpą, kontroliuojamą ARE elemento (pvz., KeratinoSens™ ląstelių linija). Gautos ląstelės dauginamos (pvz., nuo 2 iki 4 sėjimų) ir laikomos užšaldytos kaip vienalytė pradinė kultūra. Šios pradinės kultūros ląstelės gali būti dauginamos iki maksimalaus sėjimų skaičiaus (t. y. 25 sėjimų KeratinoSens
                        TM atveju) ir naudojamos nuolatiniams bandymams, jas imant iš reikiamos maitinimo terpės (KeratinoSens
                        TM atveju tai yra DMEM, turinti serumo ir geneticino).
                     Bandomos ląstelės turėtų būti 80–90 % susiliejusios ir reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad ląstelės niekuomet neaugtų iki visiško susiliejimo. Vieną dieną prieš bandymą ląstelės yra surenkamos ir paskirstomos į 96 duobučių plokšteles (10 000 ląstelių vienai duobutei KeratinoSens
                        TM atveju). Reikėtų žiūrėti, kad sėjant nebūtų ląstelių nusėdimo, ir taip užtikrinti tolygų ląstelių skaičiaus pasiskirstymą tarp duobučių. Jei taip nėra, dėl šio veiksmo gali atsirasti didelis kintamumas tarp duobučių. Kiekvienam kartotiniam liuciferazės aktyvumo matavimų veiksmui naudojami trys kartotiniai ėminiai ir vienas analogiškas ląstelių gyvybingumo bandymo ėminys.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos ir kontrolinių cheminių medžiagų paruošimas
                     
                     Bandomoji cheminė medžiaga ir kontrolinės cheminės medžiagos ruošiamos bandymo dieną. Atliekant KeratinoSens
                        TM bandymą, bandomosios cheminės medžiagos ištirpinamos dimetilsulfokside (DMSO) galutinei reikiamai koncentracijai gauti (pvz., 200 mmol/l). Galima laikyti, kad DMSO tirpalai yra sterilūs savaime, todėl sterilus filtravimas nebūtinas. DMSO netirpios bandomosios cheminės medžiagos ištirpinamos steriliame vandenyje ar kultūros terpėje ir tirpalai sterilizuojami, pvz., filtruojant. Jei bandomoji cheminė medžiaga neturi nustatytos molekulinės masės, KeratinoSens
                        TM bandymui atlikti ruošiamas numatytosios koncentracijos pradinis tirpalas (40 mg/ml arba 4 % (m/V)). Jei vietoj DMSO, vandens ar kultūros terpės naudojami kiti tirpikliai, tai reikėtų tinkamai moksliškai pagrįsti.
                     Iš pradinių bandomosios cheminės medžiagos tirpalų ruošiama praskiestų tirpalų serija, tirpikliu naudojant DMSO, kad būtų gauta 12 pagrindinių bandomų cheminės medžiagos koncentracijos verčių (nuo 0,098 iki 200 mmol/l KeratinoSens
                        TM bandyme). Jei bandomoji cheminė medžiaga netirpsta DMSO, praskiesti tirpalai pagrindinėms koncentracijos vertėms gauti ruošiami naudojant sterilų vandenį ar sterilią kultūros terpę. Neatsižvelgiant į naudojamą tirpiklį, pagrindinių koncentracijos verčių tirpalai papildomai skiedžiami 25 kartus serumo turinčia kultūros terpe ir galiausiai dar kartą praskiesti 4 kartus naudojami apdorojimui, taigi KeratinoSens
                        TM bandymo bandomosios cheminės medžiagos galutinių koncentracijos verčių intervalas yra nuo 0,98 iki 2 000 μmol/l. Galima naudoti alternatyvias koncentracijos vertes, jei jos būtų pagrįstos (pvz., dėl citotoksiškumo ar blogo tirpumo).
                     Neigiamas (tirpiklio) kontrolinis ėminys, naudojamas KeratinoSens
                        TM bandyme, yra DMSO (CAS Nr. 67-68-5, ≥ 99 % grynumo), kiekvienoje plokštelėje paruošiant šešias jo duobutes. Jis skiedžiamas vienodai su pagrindinių koncentracijos verčių tirpalais, kaip aprašyta 22 pastraipoje, todėl neigiamo (tirpiklio) kontrolinio ėminio galutinė DMSO koncentracija yra 1 %, nes, kaip žinoma, tokios koncentracijos DMSO nedaro įtakos ląstelių gyvybingumui, ir ji atitinka bandomosios cheminės medžiagos ir teigiamo kontrolinio ėminio DMSO koncentraciją. Jei bandomoji cheminė medžiaga netirpsta DMSO ir buvo skiedžiama vandeniu, DMSO koncentracija visose duobutėse su galutiniu bandymo tirpalu turi būti nustatyta lygi 1 %, kaip kitų bandomųjų cheminių medžiagų ir kontrolinių cheminių medžiagų.
                     Teigiama kontrolinė medžiaga, naudojama atliekant KeratinoSens
                        TM bandymą, yra cinamono aldehidas (CAS Nr. 14371-10-9, ≥ 98 % grynumo), iš kurio, skiedžiant DMSO, ruošiama 5 pagrindinių koncentracijos verčių nuo 0,4 iki 6,4 mmol/l tirpalų serija (iš 6,4 mmol/l pradinio tirpalo) ir tirpalai toliau skiedžiami, kaip aprašyta 22 pastraipoje dėl pagrindinių koncentracijos verčių, taigi galutinė teigiamo kontrolinio ėminio koncentracija yra nuo 4 iki 64 μmol/l. Galima naudoti kitas teigiamas kontrolines medžiagas, pageidautina tas, kurioms EC1,5 vertė būtų gaunama per intervalo vidurį, jei yra istorinių duomenų palyginamiems bandymų priėmimo kriterijams gauti.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos ir kontrolinių cheminių medžiagų įterpimas
                     
                     Reikia atlikti vieną kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos ir teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos bandymą, kurį sudarytų ne mažiau kaip du nepriklausomi kartotiniai trijų kartotinių ėminių bandymai (t. y. n = 6) kad būtų gauta prognozė (teigiama ar neigiama). Jei nepriklausomų kartotinių bandymų rezultatai būtų prieštaraujantys, reikėtų atlikti trečiąjį kartotinį bandymą naudojant tris kartotinius ėminius (t. y. n = 9). Kiekvienas nepriklausomas kartotinis bandymas atliekamas ne tą pačią dieną, naudojant naują bandomosios cheminės medžiagos pradinį tirpalą ir nepriklausomai surinktas ląsteles. Tačiau ląstelės gali būti to paties sėjimo.
                     Pasėtos, kaip aprašyta 20 pastraipoje, ląstelės 24 h auginamos 96 duobučių mikrotitravimo plokštelėse. Tada terpė pašalinama ir pakeičiama nauja kultūros terpe (150 μl kultūros terpės, turinčios serumo, bet be geneticino KeratinoSens
                        TM atveju), į kurią įlašinama 50 μl 25 kartus praskiestos bandomosios cheminės medžiagos ir kontrolinių cheminių medžiagų. Bent vieną plokštelės duobutę reikėtų palikti tuščią (be ląstelių ir be apdorojimo), kad būtų įvertintos foninės vertės.
                     Atliekant KeratinoSens
                        TM bandymą, apdorotos plokštelės inkubuojamos maždaug 48 h 37 ± 1 °C temperatūroje, esant 5 % CO2. Reikėtų imtis priemonių lakiųjų bandomųjų cheminių medžiagų nuostoliams ir kryžminei bandomųjų cheminių medžiagų taršai tarp duobučių išvengti, pvz., uždengiant plokšteles folija prieš inkubavimą su bandomąja chemine medžiaga.
                     
                        Liuciferazės aktyvumo matavimai
                     
                     Trys veiksniai yra labai svarbūs, kad būtų galima užtikrinti reikiamus liuminescencijos rodmenis:
                     
                                 —
                              
                              
                                 jautraus liuminometro parinkimas,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 plokštelių, kurių aukščio pakaktų šviesos kryžminei taršai išvengti, naudojimas ir
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pakankamos šviesos išeigos liuciferazės substrato naudojimas, kad būtų užtikrintas pakankamas jautris ir mažas kintamumas.
                              
                           Prieš bandymą reikėtų atlikti kontrolinį bandymą pagal 3 priedėlyje aprašytą procedūrą, kad būtų galima įsitikinti, ar šie trys reikalavimai yra įvykdyti.
                     Po 48 h trukmės apdorojimo bandomąja chemine medžiaga ir kontrolinėmis cheminėmis medžiagomis, atliekant KeratinoSens
                        TM bandymą, ląstelės plaunamos fiziologiniu tirpalu fosfatiniame buferiniame tirpale ir atitinkamu lizės buferiniu tirpalu, įlašinamu į kiekvieną duobutę 20 min kambario temperatūroje, liuminescencijos rodmenims gauti.
                     Plokštelės su ląstelių lizatu dedamos į liuminometrą rodmenims gauti, kuris atliekant KeratinoSens
                        TM bandymą yra suprogramuotas: i) įlašinti liuciferazės substrato į kiekvieną duobutę (t. y. 50 μl), ii) palaukti 1 s ir iii) integratuoti liuciferazės aktyvumą 2 s laikotarpiu. Jei naudojami alternatyvūs nuostačiai, pvz., atsižvelgiant į naudojamo liuminometro modelį, juos reikėtų pagrįsti. Be to, galima naudoti švytinti substratą, jei sėkmingai atliekamas 3 priedėlyje aprašytas kokybės kontrolės bandymas.
                     
                        Citotoksiškumo vertinimas
                     
                     Kad būtų galima atlikti KeratinoSensTM ląstelių gyvybingumo bandymą, veikimo terpė po 48 h trukmės pakeičiama nauja terpe, turinčia MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolinio bromido, tiazolilo mėlynojo tetrazolinio bromido, CAS Nr. 298–93–1)] ir ląstelės inkubuojamos 4 h 37 °C temperatūroje esant 5 % CO2. MTT terpė pašalinama ir per naktį atliekama ląstelių lizė (pvz., į kiekvieną duobutę įpilant 10 % natrio dodecilsulfato tirpalo). Sumaišius tirpalą, fotometru matuojama absorbcija, esant 600 nm bangos ilgiui.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Duomenų įvertinimas
                     
                     Atliekant KeratinoSensTM tyrimą, apskaičiuojami šie parametrai:
                     
                                 —
                              
                              
                                 maksimalus vidutinis liuciferazės aktyvumo padidėjimas (Imax), stebimas esant tam tikrai bandomosios cheminės medžiagos ir teigiamo kontrolinio ėminio koncentracijai;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 EC1,5 – koncentracijos vertė, atitinkanti koncentraciją, kuriai esant liuciferazės aktyvumo indukcija daugiau kaip 1,5 karto didesnė už ribinę (t. y. 50 % didesnis liuciferazės aktyvumas); ir
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 IC50 ir IC30 – koncentracijos vertės, kurioms esant ląstelių gyvybingumas sumažėja 50 % ir 30 %.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Liuciferazės indukcijos padidėjimas kartais, apskaičiuojamas pagal 1 lygtį, o visuminis maksimalus liuciferazės aktyvumo padidėjimas (Imax) kartais, yra apskaičiuojamas kaip atskirų kartotinių ėminių vidurkis.
                              
                           
                        1 lygtis:
                     
                     
                        
                     čia
                     
                                 Lsample
                                 
                              
                              
                                 duobutės su bandomąja chemine medžiaga liuminescencijos rodmuo;
                              
                           
                                 Lblank
                                 
                              
                              
                                 tuščiojo ėminio duobutės be ląstelių ir be apdorojimo liuminescencijos rodmuo;
                              
                           
                                 Lsolvent
                                 
                              
                              
                                 duobučių su ląstelėmis ir tirpiklio (neigiamu) kontroliniu ėminiu vidutinis liuminescencijos rodmuo;
                              
                           EC1,5 apskaičiuojama tiesinės interpoliacijos metodu pagal 2 lygtį, o visuminė EC1,5 apskaičiuojama kaip atskirų kartotinių ėminių geometrinis vidurkis.
                     
                        2 lygtis:
                     
                     
                        
                     čia:
                     
                                 
                                    C
                                    a
                                 
                              
                              
                                 mažiausia koncentracija, kuriai esant indukcija didesnė > 1,5 karto, μmol/l;
                              
                           
                                 
                                    C
                                    b
                                 
                              
                              
                                 didžiausia koncentracija, kuriai esant indukcija didesnė < 1,5 karto, μmol/l;
                              
                           
                                 
                                    I
                                    a
                                 
                              
                              
                                 indukcijos padidėjimas kartais, išmatuotas esant mažiausiai koncentracijai, kuriai indukcija buvo didesnė > 1,5 karto (trijų kartotinių duobučių vidurkis);
                              
                           
                                 
                                    I
                                    b
                                 
                              
                              
                                 indukcijos padidėjimas kartais, išmatuotas esant didžiausiai koncentracijai, kuriai indukcija buvo didesnė < 1,5 karto (trijų kartotinių duobučių vidurkis).
                              
                           Gyvybingumas apskaičiuojamas pagal 3 lygtį:
                     
                        3 lygtis:
                     
                     
                        
                     čia:
                     
                                 
                                    V
                                    band
                                 
                              
                              
                                 duobutės su bandomąja chemine medžiaga MTT optinio tankio rodmuo;
                              
                           
                                 
                                    V
                                    tuščio
                                 
                              
                              
                                 tuščiojo ėminio duobutės be ląstelių ir be apdorojimo MTT optinio tankio rodmuo;
                              
                           
                                 
                                    V
                                    tirpiklio
                                 
                              
                              
                                 duobučių su ląstelėmis ir tirpiklio (neigiamu) kontroliniu ėminiu MTT vidutinio optinio tankio rodmuo;
                              
                           
                        IC
                        50 ir IC
                        30 apskaičiuojamos tiesinės interpoliacijos metodu pagal 4 lygtį, o visuminės IC
                        50 ir IC
                        30 yra apskaičiuojamos kaip atskirų kartotinių ėminių geometrinis vidurkis
                     
                        4 lygtis:
                     
                     
                        
                     čia:
                     
                                 X
                              
                              
                                 sumažėjimas esant koncentracijai, kuriai jį reikia apskaičiuoti, % (50 ir 30, kai IC
                                    50 ir IC
                                    30);
                              
                           
                                 
                                    C
                                    a
                                 
                              
                              
                                 mažiausia koncentracija, kuriai esant gyvybingumas sumažėja > x %, μmol/l;
                              
                           
                                 
                                    C
                                    b
                                 
                              
                              
                                 didžiausia koncentracija, kuriai esant gyvybingumas sumažėja < x %, μmol/l;
                              
                           
                                 
                                    V
                                    a
                                 
                              
                              
                                 gyvybingumas esant mažiausiai koncentracijai, kuriai buvo gautas > x % mažesnis gyvybingumas, %;
                              
                           
                                 
                                    V
                                    b
                                 
                              
                              
                                 gyvybingumas esant didžiausiai koncentracijai, kuriai buvo gautas < x % mažesnis gyvybingumas, %.
                              
                           Kiekvienai koncentracijos vertei, kuriai gaunama > 1,5 karto didesnė liuciferazės aktyvumo indukcija, apskaičiuojamas statistinio reikšmingumo lygmuo (pvz., taikant dvipusį Stjudento t kriterijų), lyginant trijų kartotinių ėminių liuminescencijos vertes su liuminescencijos vertėmis tirpiklio (neigiamo) kontrolinio ėminio duobutėse, kad būtų nustatyta, ar liuciferazės aktyvumo indukcija yra statistiškai reikšminga (p < 0,05). Mažiausia koncentracija, kuriai esant gaunama > 1,5 karto didesnė liuciferazės aktyvumo indukcija, yra vertė, pagal kurią nustatoma EC
                        1,5 vertė. Kiekvieną kartą tikrinama, ar ši vertė yra mažesnė nei IC
                        30 vertė, ir tai rodytų, kad esant EC
                        1,5 apsprendžiančiai koncentracijai ląstelių gyvybingumo sumažėjimas yra mažesnis kaip 30 %.
                     Rekomenduojama duomenis tikrinti vizualiai pagal grafikus. Jei nėra aiškios dozės ir atsako kreivės arba gauta dozės ir atsako kreivė yra dvifazė (t. y. 1,5 karto atitinkančią ribą kerta du kartus), bandymą reikėtų pakartoti, kad būtų galima patikrinti, ar tai yra susiję su bandomąja chemine medžiaga ar dėl bandymo artefakto. Jei, atliekant nepriklausomą bandymą, dvifazis atsakas pasikartoja, ataskaitoje reikėtų nurodyti mažesnę EC1,5 vertę (koncentracija, kuriai esant 1,5 karto atitinkanti riba kertama pirmą kartą).
                     Retais atvejais, kai stebima statistiškai nereikšminga daugiau kaip 1,5 karto didesnė indukcija, po kurios didesnei koncentracijai gaunama statistiškai reikšminga indukcija, šio kartotinio bandymo rezultatai laikomi tinkamais ir teigiamais, jei didesnė kaip ribinė 1,5 karto statistiškai reikšminga indukcija buvo gauta esant citotoksiškumo nesukeliančiai koncentracijai.
                     Galiausiai, jei 1,5 karto ar dar didesnę indukciją bandomosios cheminės medžiagos sukelia esant mažiausiai bandymo koncentracijai 0,98 μmol/l, nustatoma EC
                        1,5 < 0,98 vertė pagal vizualiai ištirtą dozės ir atsako kreivę.
                     
                        Priimtinumo kriterijai
                     
                     Atliekant KeratinoSens
                        TM bandymą, reikėtų atitikti šiuos priimtinumo kriterijus. Pirma, teigiamai kontrolinei cheminei medžiagai, cinamono aldehidui, gauta liuciferazės aktyvumo indukcija turėtų būti statistiškai reikšmingai didesnė nei 1,5 karto ribinė vertė (pvz., taikant t kriterijų) bent vienai bandymo koncentracijai (nuo 4 iki 64 μmol/l).
                     Antra, EC1,5 vertė turėtų patekti bandymo laboratorijos istorinio vidurkio dviejų standartinių nuokrypių intervalą (pvz., nuo 7 μmol/l iki 30 μmol/l, pagal tinkamumo patvirtinimo duomenų rinkinį), vidurkį reguliariai atnaujinant. Be to, 64 μmol/l koncentracijos cinamono aldehido trijų kartotinių ėminių vidutinė indukcija turėtų būti nuo 2 iki 8. Jei pastarasis kriterijus nevykdomas, cinamono aldehidą reikėtų kruopščiai patikrinti ir bandymai gali būti priimti tik tuo atveju, jei yra aiški dozės ir atsako priklausomybė, kai, didėjant teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos koncentracijai, liuciferazės aktyvumo indukcija didėja.
                     Galiausiai, atliekant kiekvieną kartotinį bandymą, kurį sudaro trijų kartotinių ėminių 6 duobutės, neigiamo (tirpiklio) DMSO kontrolinio ėminio liuminescencijos rodmens vidutinis variacijos koeficientas turėtų būti mažesnis kaip 20 %. Jei kintamumas didesnis, rezultatus reikėtų atmesti.
                     
                        Rezultatų aiškinimas ir prognozavimo modelis
                     
                     
                        KeratinoSens
                        TM prognozė laikoma teigiama, jei visos šios 4 sąlygos įvykdomos 2 iš 2 ar 2 iš 3 kartotinių bandymų, kitaip KeratinoSens
                        TM prognozė laikoma neigiama (1 paveikslas):
                     
                                 1.
                              
                              
                                 
                                    I
                                    max yra didesnė kaip (>) 1,5 karto ir statistiškai reikšmingai skiriasi palyginti su tirpiklio (neigiamu) kontroliniu ėminiu (nustatyta taikant dvipusį neporinį Stjudento t kriterijų);
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 ląstelių gyvybingumas yra didesnis kaip (>) 70 % esant mažiausiai koncentracijai, kai liuciferazės aktyvumo indukcija yra didesnė kaip 1,5 karto (t. y. esant EC1,5 apsprendžiančiai koncentracijai);
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 
                                    EC
                                    1,5 vertė yra mažesnė kaip (<) 1 000 μmol/l (ar < 200 μg/ml, jei tai nenustatytos molekulinės masės bandomoji cheminė medžiaga);
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 yra aiški liuciferazės indukcijos dozės ir atsako priklausomybė visoje kreivėje (arba atsakas yra dvifazis, kaip nurodyta 33 pastraipoje).
                              
                           Jei atliekant tam tikrą kartotinį bandymą, įvykdomos visos trys pirmosios sąlygos, bet negalima matyti aiškios liuciferazės indukcijos dozės ir atsako priklausomybės, to kartotinio bandymo rezultatą reikėtų laikyti negalutiniu ir gali prireikti papildomų bandymų (1 paveikslas). Be to, negalutiniu reikėtų laikyti neigiamą rezultatą, gautą < 1 000 μmol/l (ar < 200 μg/ml, jei tai nenustatytos molekulinės masės bandomoji cheminė medžiaga) koncentracijai (žr. 11 pastraipą).
                     
                        1 paveikslas.
                     
                     
                        Prognozavimo modelis, naudojamas atliekant KeratinoSensTM bandymą. Į KeratinoSensTM prognozę reikėtų žiūrėti kaip į IATA sistemos dalį ir atsižvelgti į 9 ir 11 pastraipų nuostatas.
                     
                     
                        
                     Retais atvejais bandomosios cheminės medžiagos, sukeliančios liuciferazės aktyvumo indukciją, kai jų koncentracija yra labai arti citotoksiškumo koncentracijos, atliekant vienus kartotinius bandymus gali būti teigiamos, kai jų koncentracija mažesnė nei citotoksiškumo koncentracija (t. y. EC
                        1,5 apsprendžianti koncentracija mažesnė nei (<) IC
                        30), o atliekant kitus kartotinius bandymus, gali būti teigiamos tik esant citotoksiškumo koncentracijai (t. y. EC
                        1,5 apsprendžiančiai koncentracijai didesnei kaip (>) IC
                        30). Tokias bandomąsias chemines medžiagas reikėtų bandyti pakartotinai, dozės ir atsako analizę atliekant siauresniame intervale ir naudojant mažesnį skiedimo faktorių (pvz., praskiedimas tarp duobučių skiriasi 1,33 ar Ö2 (= 1,41) karto), kad būtų nustatyta, ar esant citotoksiškumo koncentracijai indukcija vyko ar nevyko (9).
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Vienkomponentė medžiaga
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas (-ai), CAS numeris (-iai), SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė ir (arba) kiti identifikavimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje, tirpumas DMSO, molekulinė masė ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertė (-ės);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišinys:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, pvz., cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), grynumas, kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje, tirpumas DMSO ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         molekulinė masė arba vidutinė molekulinė masė, jei tai žinomos sudėties mišiniai ar polimerai arba kita tyrimams atlikti svarbi informacija;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertė (-ės);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontroliniai ėminiai
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Teigiamas kontrolinis ėminys
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas (-ai), CAS numeris (-iai), SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė ir (arba) kiti identifikavimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje, tirpumas DMSO, molekulinė masė ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, atsižvelgiant į turimus duomenis ir jei tinka;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertė (-ės);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nuoroda į istorinių teigiamų kontrolinių ėminių rezultatus, kurie įrodytų tinkamus bandymo priėmimo kriterijus, jei tinka.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Neigiamas (nešiklio) kontrolinis ėminys
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas (-ai), CAS numeris (-iai) ir (arba) kiti identifikavimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka ir praktiškai įmanoma, kt.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė išvaizda, molekulinė masė ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės, jei naudojami kiti nei šiame bandymų metode nurodyti neigiami kontroliniai ėminiai ar nešikliai, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         laikymo sąlygos ir stabilumas, atsižvelgiant į turimus duomenis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos tirpiklio pasirinkimo pagrindimas.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymų metodo sąlygos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             rėmėjo pavadinimas ir adresas, bandymų laboratorija ir tyrimo vadovas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikyto bandymo metodo aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudota ląstelių linija, jos laikymo sąlygos ir šaltinis (pvz., įmonė, iš kurios ląstelės buvo gautos);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandant naudotų ląstelių sėjimų skaičius ir susiliejimo laipsnis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių skaičiavimo metodas, taikytas sėjant prieš bandymus, ir priemonės, kurių buvo imtasi, kad būtų užtikrintas tolygus ląstelių skaičiaus pasiskirstymas (žr. 20 pastraipą);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudojamas liuminometras (pvz., modelis), įskaitant prietaiso nuostačius, naudojamas liuciferazės substratas, ir reikiamų liuminescencijos matavimų įrodymas pagal 3 priedėlyje aprašytą kontrolinį bandymą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             procedūra, taikyta įrodant laboratorijos kvalifikaciją atlikti bandymus pagal šį metodą (pvz., bandant kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas) arba įrodant metodo taikymo charakteristikų atkuriamumą laikui bėgant.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymų procedūra
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Atliktų kartotinių bandymų ir naudotų kartotinių ėminių skaičius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės, įterpimo procedūra ir naudota veikimo trukmė (jei skiriasi nuo rekomenduojamos);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikytų įvertinimo ir sprendimo priėmimo kriterijų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikytų tyrimo priimtinumo kriterijų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų bandymo procedūros pakeitimų aprašymas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Lentelės, į kurias įtraukiamos kiekvieno kartotinio bandymo metu gautos bandomosios cheminės medžiagos ir teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos I
                                                max, EC
                                                1,5 ir gyvybingumo (t. y. IC
                                                50, IC
                                                30) vertės, taip pat vidutinės vertės (I
                                                max– vidurkio; o EC
                                                1,5 ir gyvybingumo verčių – geometrinio vidurkio), standartinis nuokrypis, apskaičiuotas naudojant visų atskirų kartotinių bandymų duomenis, bandomosios cheminės medžiagos įvertis pagal prognozavimo modelį;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienam bandymui gautas neigiamo kontrolinio ėminio liuminescencijos rodmenų variacijos koeficientas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             grafikas, kuriame pateiktos dozės ir atsako priklausomybės kreivės, gautos liuciferazės aktyvumo indukcijai ir gyvybingumui;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų kitų svarbių stebėjimų aprašymas, jei tinka.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Rezultatų, gautų atliekant KeratinoSens
                                                TM bandymą, aptarimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandymų metodo rezultatų nagrinėjimas atsižvelgiant į IATA, jei turima kita susijusi informacija.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvada
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367-485.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Šio priedo B.42 skyrius. Odos jautrinimas. Vietinio limfmazgio bandymas.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Šio priedo B.6 skyrius. Odos jautrinimas.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Šio priedo B.50 skyrius. Odos jautrinimas: Vietinio limfmazgio bandymas. DA.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Šio priedo B.51 skyrius: Odos jautrinimas: Vietinio limfmazgio bandymas. BrdU-ELISA.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284-292.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281-290.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779-1791.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45-49.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733-744.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337-1352.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing, 42 pp. Available at: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM., 17 pp. Available: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106-121.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389-400.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489-504.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353-1364.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSensTM assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220-1225.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683-1969.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646-657.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813-1822.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301-316.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225-2232.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment N0 213, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.34. OECD, Paris, France.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides – (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Tikslumas
                           – bandymo metodo rezultatų ir patvirtintų pamatinių verčių sutapimo artumas. Tikslumas yra bandymo metodo taikymo charakteristikų matas ir vienas iš „tinkamumo“ aspektų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „atitiktis“ tinkamų bandymo metodo rezultatų daliai išreikšti (29).
                        
                           
                              Nepalankios baigties kelias (angl. Adverse Outcome Pathway, AOP)
                           – įvykių seka nuo tikslinės cheminės medžiagos ar panašių cheminių medžiagų grupių cheminės sandaros per molekulinio inicijavimo įvykį iki in vivo tiriamo rezultato (2).
                        
                           
                              ARE
                           – antioksidacinis atsako elementas (angl. Antioxidant response element) (taip pat vadinamas EpRE, elektrofilinis atsako elementas) yra atsako elementas, randamas daugelio citoprotektorių genų ir II fazės genų priekinėje promotorinėje srityje. Aktyvinamas Nfr2, jis tarpininkauja šių genų transkripcinei indukcijai.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Variacijos koeficientas
                           – kintamumo matas, apskaičiuojamas kartotinių ėminių duomenų grupei kaip standartinio nuokrypio ir vidurkio dalmuo. Jį galima padauginti iš 100, kad būtų išreikštas procentais.
                        
                           
                              
                                 EC
                                 1,5
                              
                           – koncentracija gauta interpoliacijos būdu, kai liuciferazės indukcijos vertė yra didesnė 1,5 karto.
                        
                           
                              
                                 IC
                                 30
                              
                           – koncentracija, kuriai esant ląstelių gyvybingumas sumažėja 30 %.
                        
                           
                              
                                 IC
                                 50
                              
                           – koncentracija, kuriai esant ląstelių gyvybingumas sumažėja 50 %.
                        
                           
                              Pavojus
                           – būdingoji agento savybė arba situacija, galinti sukelti neigiamų padarinių, kai organizmą, sistemą ar populiaciją (arba jos dalį) veikia tas agentas.
                        
                           
                              Integruotasis bandymo ir vertinimo metodas (angl. Integrated Approach to Testing and Assessment, IATA)
                           – struktūrinis metodas, taikomas cheminės medžiagos ar cheminių medžiagų grupės (galimam) pavojui identifikuoti, pavojui (veikimo gebai) apibūdinti ir (arba) saugai vertinti (galimo pavojaus ir (arba) veikimo gebos ir veikimo), kurį taikant strategiškai apjungiami į vieną visumą ir įvertinami visi susiję duomenys, kad būtų galima pateikti informaciją reglamentavimo sprendimui priimti dėl galimo pavojaus ir (arba) rizikos, ir (arba) dėl būtinumo atlikti papildomą tikslinį, taigi minimalų bandymą.
                        
                           
                              I
                              max
                           – maksimalus liuciferazės aktyvumo indukcijos padidėjimo palyginti su tirpiklio (neigiamu) kontroliniu ėminiu rodiklis, išmatuotas esant kuriai nors bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai.
                        
                           
                              Keap1
                           – Keap1 (angl. Kelch-like ECH-associated protein 1) yra receptorinis baltymas, kuris gali reguliuoti Nrf2 aktyvumą. Indukavimo nebuvimo sąlygomis Keap1 receptorinis baltymas pasirenka Nrf2 transkripcijos faktorių kaip ubikvitinilinimo ir proteolitinio skaidymo proteasomoje taikinį. Dėl reaktyviųjų Keap1 cisteino liekanų modifikavimo, susidarant jų kovalentiniam ryšiui su mažomis molekulėmis, Nrf2 gali atsiskirti nuo Keap1 (8) (10) (11)8) (10) (11).
                        
                           
                              Mišinys
                           – iš dviejų arba daugiau medžiagų sudarytas mišinys arba tirpalas, kuriame jos nereaguoja (1)
                        
                           
                              Vienkomponentė medžiaga
                           – medžiaga, kurią apibrėžia jos kiekybinė sudėtis, kai vienas pagrindinis komponentas sudaro ne mažiau kaip 80 % (masės).
                        
                           
                              Daugiakomponentė medžiaga
                           – medžiaga, kurią apibrėžia jos kiekybinė sudėtis, kai daugiau kaip vieno pagrindinio komponento koncentracija ≥ 10 % (masės) ir < 80 % (masės). Daugiakomponentė medžiaga yra gamybos proceso rezultatas. Skirtumas tarp mišinio ir daugiakomponentės medžiagos yra tas, kad mišinys gaunamas sumaišant dvi medžiagas arba daugiau nevykstant cheminei reakcijai. Daugiakomponentė medžiaga yra cheminės reakcijos rezultatas.
                        
                           
                              Nrf2
                           – Nrf2, branduolinis faktorius (angl. nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 factor), yra transkripcijos faktorius, kuris dalyvauja antioksidacinio atsako kelyje. Kai Nrf2 nėra ubikvitinilintas, jis gaminasi citoplazmoje ir perkeliamas į branduolius, kur jis jungiasi prie ARE daugelio citoprotekcinių genų priekinėje promotorinėje srityje, inicijuodamas jų transkripciją (8) (10) (11).
                        
                           
                              Teigiamas kontrolinis ėminys
                           – kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus ir apdorotas chemine medžiaga, kuri yra žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką. Siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus.
                        
                           
                              Tinkamumas
                           – santykio tarp bandymo ir tiriamo poveikio bei bandymo reikšmingumo bei naudingumo siekiant tam tikro tikslo apibūdinimas. Tai yra atliekant bandymą tiriamo biologinio poveikio matavimo ar prognozavimo tikslumo laipsnis. Tinkamumas aprėpia bandymų metodo tikslumo (atitikties) aspektą (29).
                        
                           
                              Patikimumas
                           – pagal tą patį protokolą atliekamo bandymų metodo, tam tikrą laiką taikomo laboratorijose ir tarp laboratorijų, atkuriamumo laipsnio matas. Jis įvertinamas apskaičiuojant atkuriamumą laboratorijoje ir tarp laboratorijų ir pakartojamumą laboratorijoje (29).
                        
                           
                              Atkuriamumas
                           – rezultatų, gautų pagal vienodą bandymų protokolą bandant tą pačią cheminę medžiagą, sutapimas (žr. patikimumas) (29).
                        
                           
                              Jautris
                           – visų teigiamų ar veikliųjų cheminių medžiagų, kurios buvo tiksliai klasifikuotos atliekant bandymą, dalis. Jis yra bandymų metodo, kuriuo gaunami kategorijos nustatymo rezultatai, tikslumo matas ir svarbus aspektas vertinant bandymų metodo tinkamumą (29).
                        
                           
                              Tirpiklio ar nešiklio kontrolinis ėminys
                           – visus bandymo sistemos komponentus, įskaitant tirpiklį ar nešiklį, turintis kartotinis ėminys. Jis naudojamas tam, kad būtų nustatyta atskaitos vertė ėminiams, apdorotiems bandomąja chemine medžiaga, ištirpinta tame pačiame tirpiklyje.
                        
                           
                              Specifiškumas
                           – visų neigiamų ar neveikliųjų cheminių medžiagų, kurios buvo tiksliai klasifikuotos atliekant bandymą, dalis. Jis yra bandymų metodo, kuriuo gaunami kategorijos nustatymo rezultatai, tikslumo matas ir svarbus aspektas vertinant bandymų metodo tinkamumą (29).
                        
                           
                              Medžiaga
                           – gamtoje randami arba gamybos procese gaunami cheminiai elementai ir jų junginiai, įskaitant visus priedus, kurių reikia produkto stabilumui užtikrinti, ir visas priemaišas, patenkančias į produktą taikomo proceso metu, tačiau neįskaitant tirpiklio, kurį galima atskirti, nepaveikiant medžiagos stabilumo ar nekeičiant jos sudėties (1).
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – terminas bandomoji cheminė medžiaga vartojamas bandomam dalykui nurodyti.
                        
                           
                              Jungtinių Tautų visuotinai suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema (JT GHS)
                           – sistema, kurioje pateikiamas cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimas pagal standartizuotus fizikinių pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai tipus ir nagrinėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signaliniai žodžiai, pavojingumo frazės, atsargumo frazės ir saugos duomenų lapai, kad būtų galima informuoti apie medžiagų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vežėjus, vartotojus ir avarijų likvidatorius) ir aplinką (1).
                        
                           
                              UVCB
                           – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos.
                        
                           
                              Patvirtinto tinkamumo bandymų metodas
                           – bandymų metodas, kurio tinkamumo ir patikimumo pakanka tam tikram tikslui pasiekti ir kuriam taikomi moksliškai pagrįsti principai. Bandymų metodas niekuomet nėra visiškai tinkamas absoliučiąja prasme, bet tik tam tikro tikslo atžvilgiu (29).
                     
                     
                        2 priedėlis
                        KVALIFIKACIJAI TIKRINTI SKIRTOS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                        
                           Odos jautrinimas in vitro. ARE-Nrf2 liuciferazės bandymų metodas
                        
                        Prieš pradėdamos įprastiniu būdu taikyti šį bandymų metodą, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, gaudamos tinkamą KeratinoSens™ prognozę dėl 10 kvalifikacijai tikrinti skirtų cheminių medžiagų, rekomenduotų 1 lentelėje, ir gaudamos EC1,5 bei IC50 vertes, kurios patenka į atitinkamus etaloninius intervalus, ne mažiau kaip 8 iš 10 kvalifikacijai tikrinti skirtų cheminių medžiagų. Kvalifikacijai tikrinti skirtos cheminės medžiagos buvo pasirinktos taip, kad atitiktų odos jautrinimo pavojų intervalą. Kiti atrankos kriterijai buvo galimybė pirkti chemines medžiagas ir tai, ar galima gauti aukštos kokybės in vivo etalonus ir aukštos kokybės KeratinoSens
                           TM bandymo in vitro duomenis.
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           Cheminės medžiagos, rekomenduojamos techninei kvalifikacijai tikrinti taikant KeratinoSensTM bandymą
                        
                        
                                    Kvalifikacijai tikrinti skirtos cheminės medžiagos
                                 
                                 
                                    CAS Nr.
                                 
                                 
                                    Agregatinė būsena
                                 
                                 
                                    Prognozė in vivo
                                        (28)
                                    
                                 
                                 
                                    KeratinoSensTM prognozė (29)
                                    
                                 
                                 
                                    EC1,5 (μmol/l) etaloninis intervalas (30)
                                    
                                 
                                 
                                    IC50 (μmol/l) etaloninis intervalas (30)
                                    
                                 
                              
                                    Izopropanolis
                                 
                                 
                                    67-63-0
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Salicilo rūgštis
                                 
                                 
                                    69-72-7
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Pieno rūgštis
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Glicerolis
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Nejautrinanti medžiaga
                                 
                                 
                                    Neigiama
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Cinamilo alkoholis
                                 
                                 
                                    104-54-1
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga (silpnai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    25–175
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    Etilenglikolio dimetilakrilatas
                                 
                                 
                                    97-90-5
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga (silpnai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    5–125
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    2-merkaptobenztiazolas
                                 
                                 
                                    149-30-4
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga (vidutinio stiprumo)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    25–250
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    Metildibromglutaronitrilas
                                 
                                 
                                    35691-65-7
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga (strong)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    < 20
                                 
                                 
                                    20–100
                                 
                              
                                    4-metilaminofenolio sulfatas
                                 
                                 
                                    55-55-0
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga (stipriai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    20 – 200
                                 
                              
                                    2,4-dinitrochlorbenzenas
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    Jautrinanti medžiaga (ypač stipriai)
                                 
                                 
                                    Teigiama
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    5–20
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           LIUMINESCENCIJOS MATAVIMO KOKYBĖS KONTROLĖ
                        
                        
                           Pagrindinis bandymas atliekant KeratinoSensTM tyrimą, kad būtų užtikrinti optimalūs liuminescencijos matavimai
                        
                        Šie trys parametrai yra ypač svarbūs, kad liuminometru būtų gauti patikimi rezultatai:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    pakankamas jautris, kad būtų užtikrintas stabilus fonas kontrolinėse duobutėse;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    nėra jokio gradiento per visą plokštelę dėl didelės rodmenų skaitymo trukmės; ir
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    nėra šviesos taršos gretimose duobutėse nuo ypač aktyvių duobučių.
                                 
                              Prieš bandymus rekomenduojama užtikrinti tinkamus liuminescencijos matavimus, bandant kontrolinės plokštelės rinkinį, kaip aprašyta toliau (trijų kartotinių ėminių analizė).
                        
                           Pirmojo mokomojo bandymo plokštelės rinkinys
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                              
                                    A
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    B
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    
                                       D
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 0,98
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1,95
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 3,9
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 7,8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 15,6
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 31,25
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 62,5
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 125
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 250
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 500
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1000
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 2000
                                    
                                 
                              
                                    E
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    F
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    G
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    H
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    
                                       CA 4
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 16
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 32
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 64
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       Tuščiasis ėminys
                                    
                                 
                              
                           EGDMA– etilenglikolio dimetakrilatas (CAS Nr. 97-90-5), stipriai indukuojanti cheminė medžiaga,
                        
                           CA– cinamono aldehidas, teigiama etaloninė cheminė medžiaga (CAS Nr. 104-55-2).
                        
                           Kokybės kontrolės analizė turėtų rodyti:
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    aiškų dozės atsaką D eilutėje, kai Imax > 20 kartų didesnis nei fonas (dažniausiai gaunamos 100–300 I
                                       max vertės);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    jokio dozės atsako C ir E eilutėse (indukcija ne didesnė kaip 1,5 (būtų gerai, jei nebūtų didesnis kaip 1,3) dėl galimos šviesos taršos, ypač šalia didelio aktyvumo duobučių EGDMA eilutėje;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    jokio statistiškai reikšmingo skirtumo tarp A, B, C, E, F ir G eilučių (t. y. jokio gradiento per visą plokštelę); ir
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    ne didesnį kaip 20 % kintamumą visose A, B, C, E, F ir G eilutėse ir H eilutės DMSO duobutėse (t. y. stabilų foną).
                                 
                              
                     B.61   Fluoresceino nuotėkio bandymų metodas akis ėsdinančioms ir stipriai dirginančioms medžiagoms identifikuoti
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 460 (2012). Fluoresceino nuotėkio (angl. Fluorescein Leakage, FL) bandymų metodas yra bandymų metodas in vitro, kuris tam tikromis aplinkybėmis ir esant tam tikriems apribojimams gali būti taikomas cheminėms medžiagoms (medžiagoms ir mišiniams) klasifikuoti kaip akis ėsdinančias ir stipriai dirginančias medžiagas, kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (1 kategorijos), Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) (31) (1 kategorijos) ir JAV Aplinkos apsaugos agentūros (AAA) (angl. Environmental Protection Agency, EPA) (I kategorijos) (1)(2). Šiame bandymų metode kaip stipriai dirginančios cheminės medžiagos yra apibrėžiamos cheminės medžiagos, kurios sukelia akies audinių pažeidimą, neišnykstantį per 21 parą nuo įterpimo, arba sukelia smarkų fizinį regėjimo pablogėjimą, o akis ėsdinančios cheminės medžiagos yra cheminės medžiagos, kurios sukelia negrįžtamąjį akies audinio pažeidimą. Šios cheminės medžiagos yra klasifikuojamos kaip JT GHS 1 kategorijos, ES CLP 1 kategorijos arba JAV AAA I kategorijos.
                     Nors FL bandymų metodas nelaikomas tinkamu visiškai pakeisti triušių akių bandymą in vivo, FL rekomenduojamas kaip klasifikavimo ir ženklinimo reguliavimo tikslais taikomų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis. Todėl FL rekomenduojamas kaip pirmas žemynkrypčio metodo etapas akis ėsdinančioms ar stipriai dirginančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti, specialiai skirtas tik tam tikro tipo cheminėms medžiagoms (t. y. vandenyje tirpioms medžiagoms ir mišinimas) (3)(4).
                     Šiuo metu visuotinai pripažįstama, kad artimiausioje ateityje joks atskiras in vitro akių dirginimo bandymas negalės pakeisti in vivo akių bandymo (TM B.5 (5)), kad būtų galima prognozuoti skirtingų cheminių klasių visą dirginimo būdų intervalą. Tačiau kelių alternatyvių bandymų metodų strateginiai deriniai taikant (nuosekliųjų) bandymų strategiją galėtų pakeisti in vivo akių bandymą (4). Žemynkryptis metodas (4) skirtas taikyti tada, kai, atsižvelgiant į esamą informaciją, daroma prielaida apie didelę cheminės medžiagos dirginamojo poveikio gebą.
                     Taikant prognozavimo modelį, išsamiai aprašytą 35 pastraipoje, FL bandymų metodu be jokio papildomo bandymo galima identifikuoti chemines medžiagas kaip akis ėsdinančias ar stipriai dirginančias (JT GHS 1 kategorijos; ES CLP 1 kategorijos; JAV AAA I kategorijos), esant ribotai metodo taikymo sričiai. Tokia pati prielaida daroma dėl mišinių, nors atliekant tinkamumo patvirtinimą, mišiniai nebuvo naudojami. Todėl FL bandymų metodas gali būti taikomas cheminių medžiagų akių dirginimo ar ėsdinimo gebai nustatyti, laikantis TM B.5 nuosekliųjų bandymų strategijos (5). Tačiau cheminę medžiagą, kuriai taikant FL bandymų metodą nebuvo gauta akių ėsdinimo ar stipraus dirginimo prognozės, reikėtų bandyti vienu ar keliais papildomais bandymų metodais (in vitro ir (arba) in vivo), kad būtų galima tiksliai identifikuoti i) chemines medžiagas, kurios pagal FL yra in vitro klaidingai neigiamos akis ėsdinančios ar stipriai dirginančios (JT GHS 1 kategorijos, ES CLP 1 kategorijos, JAV AAA I kategorijos); ii) chemines medžiagas, kurios neklasifikuojamos dėl akių ėsdinimo ar dirginimo (JT GHS be kategorijos, ES CLP be kategorijos, U.S. EPA IV kategorijos) ir (arba) iii) chemines medžiagas, kurios yra vidutiniškai ar nestipriai akis dirginančios (JT GHS 2A ir 2B kategorijos, ES CLP 2 kategorijos, JAV AAA II ir III kategorijos).
                     Šio bandymo metodo tikslas – aprašyti procedūras, taikomas įvertinant akių ėsdinimo ar stipraus dirginimo bandomąja chemine medžiaga galimybę, matuojant jos gebą pažeisti sandarų susiliejusių epitelio ląstelių monosluoksnį. Epitelio pralaidumo vientisumas yra pagrindinė epitelio funkcija, kurią atlieka junginės ir ragenos epitelis. Epitelio pralaidumą reguliuoja įvairios sandarios jungtys. Buvo įrodyta, kad epitelio pralaidumo padidėjimas in vivo yra susijęs su uždegimo lygiu ir paviršiaus pažeidimu, stebimu stiprėjant akių dirginimui.
                     Taikant FL bandymų metodą, toksinis bandomosios cheminės medžiagos poveikis po trumpalaikio veikimo matuojamas kaip fluoresceino natrio druskos pralaidumo per epitelio monosluoksnį, kurį sudaro ant pralaidžių įdėklų auginamos Madin Darby šunų inkstų (angl. Madin-Darby Canine Kidney, MDCK) ląstelės, padidėjimas. Vykstančio fluoresceino nuotėkio vertė yra proporcinga cheminės medžiagos sukeltam sandarių jungčių, desmosominių jungčių ir ląstelių membranų pažeidimui ir gali būti naudojama kaip bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo akims stiprumo įvertis. 1 priedėlyje pateikta FL bandymų metodui skirtų MDCK ląstelių auginimo ant įdėklo membranos schema.
                     Apibrėžtys pateiktos 2 priedėlyje.
                     PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                     Šis bandymų metodas yra pagrįstas INVITTOX protokolu Nr. 71 (6), kuris buvo įvertintas tarptautiniame tinkamumo patvirtinimo tyrime, kurį atliko Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centras (ECVAM), bendradarbiaudamas su JAV alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybiniu koordinavimo komitetu (ICCVAM) ir Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (JaCVAM).
                     FL bandymų metodas nerekomenduojamas, kai reikia identifikuoti chemines medžiagas, kurias reikėtų klasifikuoti kaip akis vidutiniškai ar nestipriai dirginančias, arba chemines medžiagas (medžiagas ir mišinius), kurių nereikėtų klasifikuoti dėl akių dirginimo (t. y. JT GHS 2A ar 2B kategorijos, be kategorijos, ES CLP 2 kategorijos, be kategorijos, JAV AAA II, III ir IV kategorijos), kaip buvo įrodyta atliekant patvirtinimo tyrimą (3) (7).
                     Bandymų metodas taikomas tik vandenyje tirpioms cheminėms medžiagoms (medžiagoms ir mišiniams). Taikant FL bandymų metodą, paprastai galima tiksliai prognozuoti vandenyje tirpių cheminių medžiagų stiprų akių dirginimą ir (arba) chemines medžiagas, kurių toksiniam poveikiui įtakos nedaro praskiedimas (7). Cheminė medžiaga turėtų būti tirpi steriliame kalcio jonų turinčiame (1,0-1,8 mmol/l koncentracijos) Hankso subalansuotame druskos tirpale (HBSS) be fenolio raudonojo, esant koncentracijai ≥ 250 mg/ml (didesnei nei 100 mg/ml ribinei dozei), kad ją būtų galima klasifikuoti kaip bandymo sąlygomis vandenyje tirpią cheminę medžiagą. Tačiau jei bandomosios cheminės medžiagos tirpumas yra mažesnis kaip 100 mg/ml, bet toje koncentracijoje ji sukelia 20 % FL (t. y. FL20 < 100 mg/ml), ją vis dar galima klasifikuoti kaip GHS 1 kategorijos ar AAA I kategorijos.
                     Dėl nustatytų šio bandymų metodo apribojimų į jo taikymo sritį neįtraukiamos stiprios rūgštys ir bazės, ląstelių fiksavimo priemonės ir labai lakios cheminės medžiagos. Šių cheminių medžiagų veikimo mechanizmo negalima nustatyti FL bandymų metodu, pvz., didelio laipsnio koaguliacija, muilinimas ar specifinės cheminės reakcijos. Kiti nustatyti šio metodo apribojimai yra pagrįsti prognozavimo dėl spalvotųjų ir klampių bandomųjų cheminių medžiagų gebos rezultatais (7). Daroma prielaida, kad abiejų tipų chemines medžiagas sunku pašalinti nuo monosluoksnio po trumpalaikio veikimo ir kad bandymų metodo prognozavimo gebą būtų galima pagerinti atliekant didesnį plovimo veiksmų skaičių. Kietųjų cheminių medžiagų suspensijos turi polinkį iškristi į nuosėdas ir gali būti sunku nustatyti jų galutinę koncentraciją prie ląstelių. Iš duomenų bazės pašalinus šių cheminių ir fizikinių klasių chemines medžiagas, FL bandymų metodo tikslumas pagal ES, EPA ir GHS klasifikavimo sistemas iš esmės pagerėjo (7).
                     Tačiau, atsižvelgiant į šio bandymų metodo tikslą (t. y. identifikuoti tik akis ėsdinančias ar stipriai dirginančias chemines medžiagas), klaidingai neigiamų rezultatų dalis (žr. 13 pastraipą) esmės nekeičia, nes priklausomai nuo reglamentavimo reikalavimų tokios cheminės medžiagos vėliau būtų bandomos atliekant tinkamai patvirtintus bandymus in vitro arba bandymą su triušiais įrodomosios duomenų galios metodui (5) taikant nuosekliųjų bandymų strategiją (taip pat žr. 3 ir 4 pastraipas).
                     Kiti nustatyti FL bandymų metodo apribojimai yra pagrįsti klaidingai neigiamų rezultatų ir klaidingai teigiamų rezultatų dalimi. Kai taikomas kaip pradinis žemynkrypčio metodo etapas, kad būtų identifikuotos akis ėsdinančios ar stipriai dirginančios vandenyje tirpios cheminės medžiagos ir mišiniai (JT GHS 1 kategorijos, ES CLP 1 kategorijos, JAV AAA I kategorijos), su in vivo rezultatais palygintų FL bandymų metodo klaidingai teigiamų rezultatų dalis buvo nuo 7 % (7/103, JT GHS ir ES CLP) iki 9 % (9/99, JAV AAA), o klaidingai neigiamų rezultatų dalis buvo nuo 54 % (15/28, JAV AAA) iki 56 % (27/48, JT GHS ir ES CLP). Cheminės grupės, kurioms taikant FL bandymų metodą gaunami klaidingai teigiami ir (arba) klaidingai neigiami rezultatai, šame dokumente neapibrėžtos.
                     Tam tikri techniniai apribojimai yra susiję su MDCK ląstelių kultūra. Didėjant sėjimų skaičiui, blogėja sandarių jungčių, kurios trukdo fluoresceino natrio druskos dažikliui prasiskverbti per monosluoksnį, kokybė. Dėl nevisiško sandarių jungčių susidarymo padidėja neapdorotiems kontroliniams ėminiams gautas FL. Todėl svarbu nustatyti tam tikrą leidžiamą maksimalų nuotėkį, kuris būtų gautas neapdorotiems kontroliniams ėminiams (žr. 38 pastraipą, nuotėkis 0 %). Kaip visų kitų bandymų in vitro atveju, ląstelės bėgant laikui turi galimybę pasikeisti, todėl svarbu nurodyti bandant atliekamų ląstelių sėjimų skaičiaus intervalus.
                     Dabartinę taikomumo sritį kai kuriais atvejais galima išplėsti, bet tik atlikus tirtų bandomųjų cheminių medžiagų išplėsto duomenų rinkinio, pageidautina gauto bandymų keliu, analizę (3). Šis bandymų metodas bus atnaujinamas, kai tik bus išnagrinėta nauja informacija ir duomenys.
                     Kiekviena laboratorija, kuri pradėtų taikyti šį bandymo metodą, turėtų naudoti kvalifikacijai tikrinti skirtas chemines medžiagas, nurodytas 3 priedėlyje. Laboratorijos gali naudoti šias chemines medžiagas, norėdamos įrodyti savo techninę kompetenciją taikyti FL bandymų metodą, prieš pateikdama FL bandymų duomenis teisės aktuose numatytais pavojų klasifikavimo tikslais.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     FL bandymų metodas yra citotoksiškumu ir ląstelių funkcija pagrįstas bandymas in vitro, atliekamas su susiliejusiu monosluoksniu, kurį sudaro MDCK CB997 kanalėlių epitelio ląstelės, auginamos ant pusiau pralaidžių įdėklų, ir kuris modeliuoja ragenos epitelio in vivo nesidalijančių ląstelių būseną. MDCK ląstelių linija yra gerai ištirta ir sudaro sandarias jungtis bei desmosomines jungtis, panašias į tas, kurios yra junginės ir ragenos epitelio priekinėje pusėje. Sandarios ir desmosominės jungtys in vivo neleidžia tirpalams ir pašalinėms medžiagoms prasiskverbti per ragenos epitelį. Epitelio sandarumo praradimas dėl sandarių jungčių ir desmosominių jungčių pažeidimo yra vienas iš ankstesnių įvykių, kuriuos sukelia dirginimas chemine medžiaga.
                     Bandomoji cheminė medžiaga įterpiama ant susiliejusio sluoksnio, sudaryto iš įdėklo viršutinėje pusėje auginamų ląstelių. Paprastai taikomas trumpalaikis 1 min veikimas, kad būtų galima aptikti įprastinio pralaidumo padidėjimą, kai veikiami žmonės. Trumpalaikio veikimo privalumas yra tas, kad vandenyje ištirpintas medžiagas ir mišinius galima bandyti grynus, jei juos galima nesunkiai pašalinti pasibaigus veikimo laikotarpiui. Tai yra labiau tiesioginis būdas palyginti su cheminio poveikio žmonėms rezultatais. Bandomoji cheminė medžiaga pašalinama ir viršutinė monosluoksnio pusė 30 min veikiama netoksiniu fluoresceino natrio druskos stipriai fluosescuojančiu dažikliu. Bandomąja chemine medžiaga sukeltas sandarių jungčių pažeidimas nustatomas pagal fluoresceino kiekį, kuris per tam tikrą laikotarpį prasiskverbia per ląstelių sluoksnį.
                     Fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekis, kuris praeina per monosluoksnį ir įdėklo membraną į duobutėje esančio tirpalo nustatytą tūrį (į kurį skverbiasi fluoresceino natrio druskos dažiklis), nustatomas spektrofluorimetriniu metodu matuojant fluoresceino koncentraciją duobutėje. Fluoresceino nuotėkio (FL) vertė apskaičiuojama pagal dviejų kontrolinių ėminių fluoresencijos intensyvumo (FI) rodmenis: tuščiojo kontrolinio ėminio ir maksimalaus nuotėkio kontrolinį ėminį. Kiekvienai bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertei gauta nuotėkio procentinė vertė, taigi ir sandarių jungčių pažeidimo dydis, yra išreiškiama šių kontrolinių ėminių atžvilgiu. Tada apskaičiuojama FL20 (t. y. koncentracijos, kuri sukelia 20 % FL palyginti su verte, gauta neapdorotam susiliejusiam monosluosniui ir įdėklams be ląstelių) vertė. FL20 (mg/ml) vertė yra naudojama akis ėsdinančioms ir stipriai dirginančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti pagal prognozavimo modelį (žr. 35 pastraipą).
                     Regeneravimasis yra svarbi bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo profilio dalis, kuri taip pat įvertinama atliekant akių dirginimo bandymą in vivo. Parengiamoji analizė parodė, kad regeneravimosi duomenys (iki 72 h po paveikimo chemine medžiaga) galėtų padidinti prognozavimo taikant INVITTOX 71 protokolą gebą, bet būtinas papildomas įvertinimas ir būtų naudingi papildomi duomenys, pageidautina, gauti atliekant papildomus bandymus (6). Šis bandymų metodas bus atnaujinamas, kai tik bus išnagrinėta nauja informacija ir duomenys.
                     PROCEDŪRA
                     
                        Ląstelių monosluoksnio paruošimas
                     
                     MDCK CB997 ląstelių monosluoksnis ruošiamas naudojant dar nesusiliejusias ląsteles, auginamas ląstelių kultūros kolbose su DMEM ir maistinių medžiagų mišiniu F12 (1× koncentratas su L-glutaminu, 15 mmol/l HEPES buferiniu tirpalu, kalciu (koncentracija – 1,0–1,8 mmol/l) ir 10 % šildant inaktyvuoto fetalinio veršiukų serumo (FCS) ar fetalinio jaučių serumo (FBS)). Svarbu, kad visą FL bandymą naudojamos terpės ar tirpalai turėtų kalcio jonų, kurių koncentracija būtų nuo 1,8 mmol/l (200 mg/l) iki 1,0 mmol/l (111 mg/l), kad būtų užtikrintas sandarių jungčių susidarymas ir vientisumas. Reikėtų kontroliuoti ląstelių sėjimų skaičiaus intervalą, kad būtų galima užtikrinti tolygų ir atkuriamą sandarių jungčių susidarymą. Pageidautina, kad atitirpintų ląstelių sėjimų skaičius būtų 3–30, nes tokio sėjimų skaičiaus ląstelės turi panašias funkcines savybes, todėl gaunamas geresnis bandymų rezultatų atkuriamumas.
                     Prieš atliekant bandymus pagal FL metodą, ląstelės paimamos iš kolbos apdorojant tripsinu, centrifuguojamos ir reikiamas jų skaičius sėjamas į įdėklus, įdėtus į 24 duobučių plokšteles (žr. 1 priedėlį). Ląsteles reikėtų sėti į 12 mm skersmens įdėklus su mišriųjų celiuliozės esterių membrana, kurios storis būtų 80–150 μm ir akučių dydis – 0,45 μm. Atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą buvo naudojami Millicell-HA 12 mm įdėklai. Įdėklo ir membranos savybės yra svarbios, nes jos gali daryti įtaką ląstelių augimui ir cheminiam ryšiui. Gali atsirasti ryšys tarp tam tikrų tipų cheminių medžiagų ir Millicell-HA įdėklo membranos, kuris gali daryti įtką rezultatų aiškinimui. Reikėtų naudoti kvalifikaciniam bandymui skirtą cheminę medžiagą (žr. 3 priedėlį), kad būtų galima įrodyti lygiavertiškumą, jei naudojamos kito tipo membranos.
                     Cheminis ryšys su įdėklo membrana daugiau būdingas katijoninėms cheminėms medžiagoms, pvz., benzalkonio chloridui, kurį traukia krūvį turinti membrana (7). Cheminis ryšys su įdėklo membrana gali padidinti cheminės medžiagos poveikio trukmę, todėl būtų gautas per didelis cheminės medžiagos toksinio poveikio įvertis, taip pat gali fiziškai sumažėti fluoresceino nuotėkis per įdėklą dėl dažiklio ryšio su katijonine chemine medžiaga, susijungusia su įdėklo membrana, todėl būtų gautas per mažas cheminės medžiagos toksinio poveikio įvertis. Tai galima lengvai kontroliuoti veikiant tik membraną didžiausios koncentracijos bandomąja chemine medžiaga, įpilant įprastinės koncentracijos fluoresceino natrio druskos dažiklio ir laikant nustatytą laiką (be ląstelių kontrolinio ėminio). Jei yra ryšys su fluoresceino natrio druskos dažikliu, įdėklo membrana, nuplovus bandomąją cheminę medžiagą, lieka nudažyta geltonai. Todėl svarbu žinoti bandomosios cheminės medžiagos rišamąsias savybes, kad būtų galima paaiškinti cheminės medžiagos poveikį ląstelėms.
                     Į įdėklą sėjamos ląstelės, prieš pradedant veikti chemine medžiaga, turėtų sudaryti susiliejusį monosluoksnį. Į kiekvieną įdėklą reikėtų įdėti 1,6 × 105 ląstelių (400 μl ląstelių suspensijos, kurios tankis 4 × 105 ląstelių/ml). Šiomis sąlygomis susiliejęs monosluoksnis gaunamas po 96 h auginimo kultūroje. Įdėklus reikėtų apžiūrėti prieš sėjimą, siekiant įsitikinti, kad visi pažeidimai, užregistruoti 30 pastraipoje aprašytos apžiūros metu, atsirado dėl apdorojimo veiksmų.
                     MDCK ląstelių kultūras reikėtų laikyti inkubatoriuose, drėgnoje atmosferoje, turinčioje 5 % ± 1 % CO2, ir 37 ± 1 °C temperatūroje. Ląstelės neturėtų būti užkrėstos bakterijomis, virusais, mikoplazma ar grybeliais.
                     
                        Bandomųjų ir kontrolinių cheminių medžiagų įterpimas
                     
                     Kiekvienam bandymui reikėtų paruošti naują bandomosios cheminės medžiagos pradinį tirpalą ir jį panaudoti ne vėliau kaip per 30 min nuo paruošimo. Bandomąsias chemines medžiagas reikėtų ruošti kalcio jonų turinčiame (1,0–1,8 mmol/l koncentracijos) Hankso subalansuotame druskos tirpale (HBSS) be fenolio raudonojo, kad būtų išvengta serumo baltymų surišimo. Prieš bandymus reikėtų įvertinti, ar cheminės medžiagos tirpumas HBSS yra 250 mg/ml. Jei būdama tokios koncentracijos cheminė medžiaga sudaro stabilią suspensiją ar emulsiją (t. y. užtikrina vienalytiškumą ir neiškrenta į nuosėdas ar nesudaro daugiau kaip vienos fazės) ilgiau kaip 30 min, HBSS vis dar gali būti naudojamas kaip tirpiklis. Tačiau jei nustatoma, kad cheminė medžiaga neištirpsta HBSS tokiai koncentracijai gauti, reikėtų pagalvoti apie tai, ar nereikėtų taikyti kitus nei FL metodus. Į galimybę naudoti lengvąją mineralinę alyvą kaip tirpiklį, jei nustatoma, kad cheminė medžiaga netirpsta HBSS, reikėtų žiūrėti atsargiai, nes nėra pakankamai duomenų išvadai apie FL bandymo charakteristikas tokiomis sąlygomis padaryti.
                     Visos cheminės medžiagos, kurias reikia bandyti, ruošiamos pradinį tirpalą skiedžiant steriliu kalcio jonų turinčiu (1,0–1,8 mmol/l koncentracijos) HBSS be fenolio raudonojo, kad būtų gauti penki pastovių verčių masės tūrinės koncentracijos tirpalai: 1, 25, 100, 250 mg/ml, gryna medžiaga arba sotus tirpalas. Bandant kietąją cheminę medžiagą, reikėtų įtraukti labai didelę 750 mg/ml koncentraciją. Tokios koncentracijos cheminę medžiagą gali tekti lašinti ant ląstelių stūmokline pipete. Jei nustatoma, kad toksiškumas pasireiškia nuo 25 iki 100 mg/ml, šias papildomas koncentracijos vertes reikėtų bandyti du kartus: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml. FL20 vertė turėtų būti gauta pagal šias koncentracijos vertes, jei yra įvykdyti priimtinumo kriterijai.
                     Prieš susiliejusius ląstelių monosluoksnius apdorojant bandomąja chemine medžiaga, pašalinama ląstelių kultūros terpė ir sluoksniai plaunami du kartus steriliu, šiltu (37 °C), kalcio jonų turinčiu (1,0–1,8 mmol/l koncentracijos) HBSS be fenolio raudonojo. Prieš tai filtrai vizualiai patikrinami, ar nėra pažeidimų, kurie galėtų būti klaidingai priskirti galimiems nesuderinamumams su bandomąja chemine medžiaga. Atliekant kiekvieną bandymą, reikėtų naudoti ne mažiau kaip tris kartotinius kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos ir kontrolinius ėminius. Po 1 min veikimo kambario temperatūroje bandomoji cheminė medžiaga atsargiai pašalinama nusiurbiant, monosluoksnis plaunamas du kartus steriliu, šiltu (37 °C), kalcio jonų turinčiu (1,0–1,8 mmol/l koncentracijos) HBSS be fenolio raudonojo, ir nedelsiant matuojamas nuotėkis.
                     Atliekant kiekvieną bandymą, reikėtų naudoti vienalaikius neigiamus (NC) ir teigiamus (PC) kontrolinius ėminius, siekiant įrodyti, kad monosluoksnio vientisumas (NC) ir ląstelių jautris (PC) atitinka apibrėžtą istorinį priimtinumo intervalą. Siūloma PC cheminė medžiaga yra 100 mg/ml koncentracijos Brij 35 (CAS Nr. 9002-92-0). Esant šiai koncentracijai, turėtų būti gautas maždaug 30 % fluoresceino nuotėkis (priimtinas intervalas – 20–40 % fluoresceino nuotėkis, t. y. ląstelių sluoksnio pažeidimas). Siūloma NC cheminė medžiaga yra kalcio jonų turintis (1,0–1,8 mmol/l koncentracijos) HBSS be fenolio raudonojo (neapdorotas, tuščiasis kontrolinis ėminys). Taip pat į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti maksimalaus nuotėkio kontrolinį ėminį, kad būtų galima apskaičiuoti FL20 vertes. Maksimalus nuotėkis nustatomas naudojant kontrolinį įdėklą be ląstelių.
                     
                        Fluoresceino pralaidumo nustatymas
                     
                     Pašalinus bandomąją ir kontrolines chemines medžiagas, į įdėklus (pvz., Millicell-HA) iškart įpilama 400 μl 0,1 mg/ml fluoresceino natrio druskos tirpalo (0,01 % (m/V) kalcio jonų turinčiame (1,0–1,8 mmol/l koncentracijos) HBSS be fenolio raudonojo. Kultūros laikomos 30 min kambario temperatūroje. Pasibaigus inkubavimui su fluoresceinu, įdėklai atsargiai išimami iš kiekvienos duobutės. Kiekvienas filtras vizualiai patikrinamas ir registruojami visi pažeidimai, kurie galėjo atsirasti atliekant apdorojimo veiksmus.
                     Kiekybiškai įvertinamas per monosluoksnį ir įdėklą prasiskverbusio fluoresceino kiekis tirpale, kuris liko duobutėse iš jų išėmus įdėklus. Matuojama spektrofluorimetru esant 485 nm sužadinimo ir 530 nm emisijos bangų ilgiams. Turėtų būti nustatytas toks spektrofluorimetro jautris, kad būtų didžiausias skaitmeninis skirtumas tarp maksimalaus FL (įdėklo be ląstelių) ir minimalaus FL (įdėklo su susiliejusiu monosluoksniu, apdorotu NC). Dėl skirtumų tarp naudojamų spektrofluorimetrų patariama naudoti tokį jautrį, kad maksimalaus fluoresceino nuotėkio ėminiui fluorescencijos intensyvumas būtų > 4 000. Maksimali FL vertė neturėtų būti didesnė kaip 9 999. Maksimalaus fluoresceino nuotėkio ėminio fluorescencijos intensyvumas turėtų atitikti naudojamo spektrofluorimetro tiesinį intervalą.
                     
                        Rezultatų aiškinimas ir prognozavimo modelis
                     
                     FL kiekis yra proporcingas sandarių jungčių pažeidimui, kurį sukelia cheminė medžiaga. Cheminės medžiagos kiekvienos bandymo koncentracijos procentinė FL vertė apskaičiuojama pagal bandomajai cheminei medžiagai gautas FL vertes, palygintas su FL vertėmis, gautomis NC (rodmuo, gautas susiliejusio monosluoksnio ląstelėms, apdorotoms NC) ir maksimalaus nuotėkio kontroliniam ėminiui (rodmuo, gautas FL nuotėkiui per įdėklą be ląstelių).
                     Maksimalaus nuotėkio fluorescencijos intensyvumas = x,
                     0 % nuotėkio vidutinis fluorescencijos intensyvumas (NC) = y.
                     Vidutinis 100 % nuotėkis gaunamas atimant vidutinį 0 % nuotėkį iš vidutinio maksimalaus nuotėkio,
                     t. y. x – y = z.
                     Kiekvienos tam tikros dozės procentinė nuotėkio vertė gaunama 0 % nuotėkio vertę atimant iš trijų kartotinių fluorescencijos intensyvumo rodmenų vidurkio (m), ir šią vertę dalijant iš 100 % nuotėkio vertės, t. y. % FL = [(m – y)/z] × 100 %, čia:
                     
                                 
                                    M
                                 
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 naudotos koncentracijos trijų kartotinių matavimų vidutinis fluorescencijos intensyvumas;
                              
                           
                                 % FL
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 fluoresceino kiekis, kuris prasiskverbia per ląstelių sluoksnį.
                              
                           Cheminės medžiagos koncentraciją, kuriai esant sukeliamas 20 % FL, reikėtų apskaičiuoti pagal šią lygtį:
                     FLD = [(A–B) / (C–B)] × (MC –MB) + MB,
                     čia:
                     
                                 D
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 slopinimas, %;
                              
                           
                                 A
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 pažeidimas, % (20 % fluoresceino nuotėkis)
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 fluoresceino nuotėkis < A, %;
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 fluoresceino nuotėkis > A, %.
                              
                           
                                 MC
                                 
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 C koncentracija (mg/ml);
                              
                           
                                 MB
                                 
                              
                              
                                 –
                              
                              
                                 B koncentracija (mg/ml).
                              
                           FL20 ribinė vertė prognozuojant akis ėsdinančias ar stipriai dirginančias chemines medžiagas pateikta toliau:
                     
                                 FL20 (mg/ml)
                              
                              
                                 JT GHS C&L
                              
                              
                                 ES CLP C&L
                              
                              
                                 JAV AAA C&L
                              
                           
                                 ≤ 100
                              
                              
                                 1 kategorija
                              
                              
                                 1 kategorija
                              
                              
                                 I kategorija
                              
                           
                                 C&L – klasifikavimas ir ženklinimas.
                              
                           FL bandymų metodas yra rekomenduojamas tik vandenyje tirpioms akis ėsdinančioms ir stipriai dirginančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti (JT GHS 1 kategorijos, ES CLP 1 kategorijos, JAV AAA I kategorijos) (žr. 1 ir 10 pastraipas).
                     Vandenyje tirpioms bandomosioms cheminėms medžiagoms (medžiagoms ir mišiniams) reikėtų gauti FL20 vertę ≤ 100 mg/ml, kad jas būtų galima identifikuoti kaip „sukeliančias smarkius akių pažeidimus“ (JT GHS ar ES CLP 1 kategorijos) ar kaip „akis ėsdinančias ar stipriai dirginančias“ (JAV AAA I kategorijos) (3) (6) (7).
                     
                        Rezultatų priimtinumas
                     
                     Vidutinė maksimali fluoresceino nuotėkio vertė (x) turėtų būti didesnė kaip 4 000 (žr. 31 pastraipą), vidutinė 0 % nuotėkio vertė (y) turėtų būti lygi 300 arba mažesnė, o vidutinė 100 % nuotėkio vertė (z) turėtų būti nuo 3 700 iki 6 000.
                     Bandymas laikomas priimtinu, jei teigiamam kontroliniam ėminiui buvo gautas 20 %–40 % ląstelių sluoksnio pažeidimas (išmatuotas kaip fluoresceino nuotėkis, %).
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Duomenys
                     
                     Ataskaitoje lentelės forma reikėtų pateikti kiekvieno bandymo kiekvieno kartotinio ėminio duobutei gautus duomenis (pvz., kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos fluorescencijos intensyvumo vertes ir apskaičiuotas FL duomenų procentines vertes, įskaitant klasifikavimą). Be to, reikėtų pateikti kiekvieno bandymo atskirų kartotinių matavimų vidurkius ± standartinį nuokrypį.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomosios ir kontrolinės cheminės medžiagos:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminės medžiagos pavadinimas (-ai), pvz., Cheminių medžiagų santrumpų tarnybos (angl. Chemical Abstracts Service, CAS) naudojamas struktūrinis pavadinimas ir kiti pavadinimai, jei jie žinomi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminės medžiagos CAS numeris, jei žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminės medžiagos arba mišinio grynumas ir sudėtis (masės procentinėmis dalimis), kiek tai žinoma remiantis turima informacija;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fizikinės ir cheminės savybės, svarbios atliekamam tyrimui (pvz., agregatinė būsena, lakumas, pH, stabilumas, tirpumas vandenyje, cheminė klasė),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomųjų ir (arba) kontrolinių cheminių medžiagų apdorojimas prieš bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             laikymo sąlygos.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Taikyto bandymų metodo ir protokolo pagrindimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Turėtų būti įtraukti aspektai, susiję su bandymų metodo taikymo sritimi ir apribojimais.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotos ląstelių sistemos aprašymas, įskaitant autentiškumo sertifikatą ir ląstelių linijos mikoplazmos būseną;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsamūs taikytos procedūros duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudota (-os) bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertė (ės);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             veikimo bandomąja chemine medžiaga trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubavimo su fluoresceinu trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų bandymo procedūros pakeitimų aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikytų vertinimo kriterijų aprašymas.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nuoroda į modelio istorinius duomenis (pvz., neigiami ir teigiami kontroliniai ėminiai, palyginamosios cheminės medžiagos, jei tinka);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informacija apie laboratorijos įrodytą techninę kvalifikaciją.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Lentelė, kurioje pateikti atskirų bandomųjų cheminių medžiagų ir kontrolinių ėminių kiekvieno bandymo ir kiekvieno kartotinio ėminio duomenys (įskaitant atskirus rezultatus, vidurkius ir standartinius nuokrypius);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gautas klasifikavimas su nuoroda į prognozavimo modelį ir (arba) taikyti sprendimo priėmimo kriterijai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kitų pastebėtų reiškinių aprašymas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Turėtų būti įtraukti aspektai, susiję su negalutiniu rezultatu (35 pastraipa: FL20 > 100 mg/ml) ir papildomais bandymais.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvados
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 U.S. EPA (1996), Label Review Manual: 2nd Edition, EPA737-B-96-001, Washington DC: U.S. Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2009), Statement on the scientific validity of cytotoxicity/cell-function based in vitro assays for eye irritation testing.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Scott, L. et al. (2010), A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches, Toxicol. In Vitro 24, 1-9
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Šio priedo B.5 skyrius. Ūmus toksiškumas. Akių dirginimas ar ėsdinimas
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (1999), INVITOX Protocol 71: Fluorescein Leakage Test, Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM). Available at: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2008), Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Paris.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        
                           FL BANDYMŲ METODUI SKIRTŲ MDCK LĄSTELIŲ AUGINIMO ANT ĮDĖKLO MEMBRANOS SCHEMA
                        
                        Susiliejantis MDCK ląstelių sluoksnis auginamas ant pusiau pralaidžios įdėklo membranos. Įdėklai dedami į 24 duobučių plokštelių duobutes.
                        Paveikslas paimtas iš: Wilkinson, P.J. (2006), Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure, Ph.D. Thesis, University of Nottingham, UK.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Tikslumas
                           – bandymo metodo rezultatų ir patvirtintų pamatinių verčių sutapimo artumas. Tikslumas yra bandymo metodo taikymo charakteristikų matas ir vienas iš „tinkamumo“ aspektų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „atitiktis“ tinkamų bandymo metodo rezultatų daliai išreikšti.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              AAA (angl. Environmental Protection Agency, EPA) I kategorijos
                           – cheminės medžiagos, kurios sukelia ėsdinamąjį pažeidimą (negrįžtamą akies audinio suardymą) arba ragenos pažeidimą ar dirginimą, kuris trunka ilgiau kaip 21 parą (2).
                        
                           
                              ES CLP (Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo)
                           – įgyvendina JT GHS cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimo sistemą Europos Sąjungoje (ES).
                        
                           
                              Klaidingai neigiamų rezultatų dalis
                           – visų teigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip neigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.
                        
                           
                              Klaidingai teigiamų rezultatų dalis
                           – visų neigiamų cheminių medžiagų, kurios taikant bandymų metodą klaidingai identifikuotos kaip teigiamos, dalis. Tai yra vienas iš bandymo metodo taikymo charakteristikų rodiklių.
                        
                           
                              FL20
                              
                           – bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kuriai esant sukeliamas 20 % fluoresceino nuotėkis per ląstelių sluoksnį, įvertis.
                        
                           
                              Fluoresceino nuotėkis
                           – per ląstelių sluoksnį prasiskverbusio fluoresceino kiekis, išmatuotas spektrofluorimetriniu metodu.
                        
                           
                              GHS (Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderinta cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistema)
                           – sistema, kurioje pateikiamas cheminių medžiagų (medžiagų ir mišinių) klasifikavimas pagal standartizuotus fizikinių pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai tipus ir nagrinėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signaliniai žodžiai, pavojingumo frazės, atsargumo frazės ir saugos duomenų lapai, kad būtų galima informuoti apie medžiagų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vežėjus, vartotojus ir avarijų likvidatorius) ir aplinką (1).
                        
                           
                              JT GHS 1 kategorija
                           – akies audinio pažeidimo arba smarkaus fizinio regėjimo pablogėjimo, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, iki galo nepraeinančio per 21 dieną nuo uždėjimo, kategorija.
                        
                           
                              Pavojus
                           – būdingoji agento savybė arba situacija, galinti sukelti neigiamų padarinių, kai organizmą, sistemą ar populiaciją (arba jos dalį) veikia tas agentas.
                        
                           
                              Mišinys
                           – JT GHS kontekste tai yra iš dviejų arba daugiau medžiagų sudarytas mišinys arba tirpalas, kuriame jos nereaguoja.
                        
                           
                              Neigiamas kontrolinis ėminys
                           – neapdorotas kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus. Šis ėminys tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti, ar vyksta tirpiklio sąveika su bandymo sistema.
                        
                           
                              Neklasifikuojamos
                           – cheminės medžiagos, kurios neklasifikuojamos kaip JT GHS 1, 2A ar 2B kategorijos; ES CLP 1 ar 2 kategorijos arba JAV AAA I, II ar III kategorijos akis dirginančios medžiagos.
                        
                           
                              Akis ėsdinanti cheminė medžiaga
                           – a) cheminė medžiaga, kuri sukelia negrįžtamąjį akies audinio pažeidimą; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip JT GHS 1 kategorijos, ES CLP 1 kategorijos ar JAV AAA I kategorijos akis dirginančios medžiagos.
                        
                           
                              Akis dirginanti cheminė medžiaga
                           – a) cheminė medžiaga, kuri sukelia grįžtamuosius akies pokyčius jos uždėjus ant priekinio akies paviršiaus; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip JT GHS 2A ar 2B kategorijos, ES CLP 2 kategorijos ar JAV AAA II ar III kategorijos akis dirginančios medžiagos.
                        
                           
                              Akis stipriai dirginančios medžiagos
                           – a) cheminės medžiagos, kurios sukelia akies audinių pažeidimą, neišnykstantį per 21 parą nuo įterpimo, arba sukelia smarkų fizinį regėjimo pablogėjimą; b) cheminės medžiagos, kurios klasifikuojamos kaip JT GHS 1 kategorijos, ES CLP 1 kategorijos arba JAV AAA I kategorijos akis dirginančios medžiagos.
                        
                           
                              Teigiamas kontrolinis ėminys
                           – kartotinis ėminys, turintis visus bandymo sistemos komponentus ir apdorotas chemine medžiaga, kuri yra žinoma kaip sukelianti teigiamą atsaką. Siekiant užtikrinti galimybę vertinti teigiamo kontrolinio ėminio atsako kintamumą per tam tikrą laiką, teigiamas atsakas neturėtų būti per stiprus.
                        
                           
                              Kvalifikacijai tikrinti skirtos cheminės medžiagos
                           – cheminių medžiagų grupė, pasirinkta iš sąrašo etaloninių cheminių medžiagų, kurias patirties neturinti laboratorija, taikydama patvirtinto tinkamumo bandymų metodą, gali naudoti savo kvalifikacijai įrodyti.
                        
                           
                              Tinkamumas
                           – santykio tarp bandymo ir tiriamo poveikio bei bandymo reikšmingumo bei naudingumo siekiant tam tikro tikslo apibūdinimas. Tai yra atliekant bandymą tiriamo biologinio poveikio matavimo ar prognozavimo tikslumo laipsnis. Tinkamumas aprėpia bandymų metodo tikslumo (atitikties) aspektą (8).
                        
                           
                              Patikimumas
                           – pagal tą patį protokolą atliekamo bandymų metodo, tam tikrą laiką taikomo laboratorijose ir tarp laboratorijų, atkuriamumo laipsnio matas. Jis įvertinamas apskaičiuojant atkuriamumą laboratorijoje ir tarp laboratorijų ir pakartojamumą laboratorijoje.
                        
                           
                              Pakaitinis bandymas
                           – bandymas, kuris skirtas pakeisti bandymą, įprastiniu būdu naudojamą ir pripažintą tinkamu pavojui identifikuoti ir (arba) rizikai įvertinti, ir kuris nustatytas kaip bandymas, užtikrinantis lygiavertę ar geresnę, palyginti su patvirtintu bandymu, žmonių ar gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsaugą, jei tinka, esant visoms galimoms bandymo aplinkybėms ir bandomosioms cheminėms medžiagoms.
                        
                           
                              Jautris
                           – visų teigiamų ar veikliųjų cheminių medžiagų, kurios buvo tiksliai klasifikuotos atliekant bandymą, dalis. Jis yra bandymų metodo, kuriuo gaunami kategorijos nustatymo rezultatai, tikslumo matas ir svarbus aspektas vertinant bandymų metodo tinkamumą (8).
                        
                           
                              Smarkus akių pažeidimas
                           – tai akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis regėjimo pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus uždėjus bandomosios cheminės medžiagos, kurie nevisiškai išnyksta praėjus 21 parai nuo uždėjimo.
                        
                           
                              Tirpiklio ar nešiklio kontrolinis ėminys
                           – visus bandymo sistemos komponentus, įskaitant tirpiklį ar nešiklį, turintis neapdorotas ėminys, kuris tiriamas kartu su bandomąja chemine medžiaga apdorotais ėminiais ir kitais kontroliniais ėminiais, siekiant nustatyti atskaitos vertę ėminiams, apdorotiems bandomąja chemine medžiaga, ištirpinta tame pačiame tirpiklyje ar nešiklyje. Kai bandomas kartu su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu, šis ėminys taip pat parodo, ar vyksta tirpiklio arba nešiklio sąveika su bandymo sistema.
                        
                           
                              Specifiškumas
                           – visų neigiamų ar neveikliųjų cheminių medžiagų, kurios buvo tiksliai klasifikuotos atliekant bandymą, dalis. Jis yra bandymų metodo, kuriuo gaunami kategorijos nustatymo rezultatai, tikslumo matas ir svarbus aspektas vertinant bandymų metodo tinkamumą.
                        
                           
                              Medžiaga
                           – gamtoje randami arba gamybos procese gaunami cheminiai elementai ir jų junginiai, naudojami JT GHS kontekste, įskaitant visus priedus, kurių reikia produkto stabilumui užtikrinti, ir visas priemaišas, patenkančias į produktą taikomo proceso metu, tačiau neįskaitant tirpiklio, kurį galima atskirti, nepaveikiant medžiagos stabilumo ar nekeičiant jos sudėties.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Nuosekliųjų bandymų strategija
                           – pakopomis atliekamų bandymų strategija, kai tam tikra eilės tvarka nagrinėjama visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, kiekvienoje pakopoje taikant įrodomosios vertės analizės procesą, siekiant nustatyti, ar yra pakankamai duomenų sprendimui dėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš pereinant prie kitos pakopos. Jei bandomajai cheminei medžiagai dirginamąją gebą galima priskirti atsižvelgiant į turimą informaciją, papildomų bandymų atlikti nereikia. Jei, atsižvelgiant į turimą informaciją, bandomajai cheminei medžiagai dirginamosios gebos priskirti neįmanoma, taikoma nuosekliųjų bandymų su gyvūnais procedūra tol, kol būtų galima gauti nedviprasmį klasifikavimą.
                        
                           
                              Patvirtinto tinkamumo bandymų metodas
                           – bandymų metodas, kurio tinkamumo tam tikram tikslui pasiekti patvirtinimo tyrimai buvo atlikti, nustatant tinkamumą (įskaitant tikslumą) ir patikimumą. Svarbu pažymėti, kad patvirtinto tinkamumo bandymo metodo tikslumo ir patikimumo charakteristikos gali būti nepakankamos, kad jį būtų galima laikyti priimtinu siūlomam tikslui pasiekti (8).
                        
                           
                              Įrodomoji duomenų galia
                           – įvairių informacijos dalių pranašumų ir trūkumų nagrinėjimo procesas priimant ir patvirtinant sprendimą dėl cheminės medžiagos pavojingumo.
                     
                     
                        3 priedėlis
                        
                           CHEMINĖS MEDŽIAGOS, SKIRTOS KVALIFIKACIJAI TIKRINTI TAIKANT FL BANDYMŲ METODĄ
                        
                        Prieš pradėdamos įprastiniu būdu taikyti šį bandymų metodą, laboratorijos turėtų įrodyti savo techninę kvalifikaciją, tinkamai nustatydamos 1 lentelėje rekomenduojamų 8 cheminių medžiagų akių ėsdinimo klasifikavimą. Šios cheminės medžiagos buvo parinktos taip, kad atitiktų atsako į vietinį akių dirginimą ir (arba) ėsdinimą intervalą, atsižvelgiant į triušio akių bandymų in vivo (TG 405, TM B.5 (5)) rezultatus (t. y. 1, 2A, 2B kategorijos arba neklasifikuojamas pagal JT GHS ir ES CLP. Tačiau, atsižvelgiant į patvirtintą FL bandymo naudingumą (t. y. identifikuoti tik ėsdinančias ir stipriai dirginančias chemines medžiagas), yra tik du klasifikavimui tinkami bandymų rezultatai (ėsdinančios ir (arba) stipriai dirginančios arba neėsdinančios ir (arba) stipriai nedirginančios), kad būtų galima įrodyti kvalifikaciją. Kiti atrankos kriterijai buvo galimybė pirkti chemines medžiagas ir tai, ar galima gauti aukštos kokybės duomenis in vivo bei aukštos kokybės FL bandymų metodo duomenis. Dėl šios priežasties kvalifikacijai tikrinti skirtos cheminės medžiagos buvo parinktos iš Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing (8) dokumento, kuris buvo naudojamas FL bandymų metodo retrospektyviam tinkamumo patvirtinimui.
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           Cheminės medžiagos, rekomenduojamos techninei kvalifikacijai tikrinti taikant FL
                        
                        
                                    Cheminė medžiaga
                                 
                                 
                                    CAS Nr.
                                 
                                 
                                    Cheminė klasė (32)
                                    
                                 
                                 
                                    Agregatinė būsena
                                 
                                 
                                    Klasifikavimas in vivo
                                        (33)
                                    
                                 
                                 
                                    Klasifikavimas in vitro
                                        (34)
                                    
                                 
                              
                                    Benzalkonio chloridas (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    Onio junginys
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    Ėsdinanti ir (arba) stipriai dirginanti
                                 
                              
                                    Prometazino hidrochloridas
                                 
                                 
                                    58-33-3
                                 
                                 
                                    Aminas ar amidinas, heterociklinis junginys, organinis sieros junginys
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    Ėsdinanti ir (arba) stipriai dirginanti
                                 
                              
                                    Natrio hidroksidas (10 %)
                                 
                                 
                                    1310-73-2
                                 
                                 
                                    Šarmas
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    Ėsdinanti ir (arba) stipriai dirginanti
                                 
                              
                                    Natrio laurilulfatas (15 %)
                                 
                                 
                                    151-21-3
                                 
                                 
                                    Karboksirūgštis (druska)
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    1 kategorija
                                 
                                 
                                    Ėsdinanti ir (arba) stipriai dirginanti
                                 
                              
                                    4-karboksibenz aldehidas
                                 
                                 
                                    619-66-9
                                 
                                 
                                    Karboksirūgštis, aldehidas
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    2 (A) kategorija
                                 
                                 
                                    Neėsdinanti ir (arba) stipriai nedirginanti
                                 
                              
                                    Amonio nitratas
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    Neorganinė druska
                                 
                                 
                                    Kietoji medžiaga
                                 
                                 
                                    2 (A) kategorija
                                 
                                 
                                    Neėsdinanti ir (arba) stipriai nedirginanti
                                 
                              
                                    Etil-2-metilaceto acetatas
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    Ketonas, esteris
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    2 (B) kategorija
                                 
                                 
                                    Neėsdinanti ir (arba) stipriai nedirginanti
                                 
                              
                                    Glicerolis
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Alkoholis
                                 
                                 
                                    Skystis
                                 
                                 
                                    Be kategorijos
                                 
                                 
                                    Neėsdinanti ir (arba) stipriai nedirginanti
                                 
                              
                                    Santrumpos: CAS Nr. – Cheminių medžiagų pavadinimų santrumpų tarnybos registracijos numeris.
                                 
                              
                     B.62   Žinduolių ląstelių bandymas in vivo kometų metodu šarminėmis sąlygomis
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 489 (2016). Kometų bandymas in vivo šarminėmis sąlygomis (pavienių ląstelių gelio elektroforezė) (toliau tiesiog vadinamas kometų bandymu) naudojamas DNR gijų trūkiams aptikti ląstelėse ar branduoliuose, išskirtuose iš daugelio gyvūnų, dažniausiai graužikų, audinių, kurie buvo veikiami galimai genotoksine (-ėmis) medžiaga (-omis). Kometų bandymą peržiūrėjo ir rekomendacijas paskelbė įvairių ekspertų grupės (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10). Šis bandymų metodas yra genetinės toksikologijos metodų serijos dalis. Yra parengtas EBPO dokumentas, kuriame glaustai pateikiama informacijos apie genetinės toksikologijos bandymus ir naujausių šių gairių pakeitimų apžvalga (11).
                     Šio kometų bandymo tikslas – identifikuoti chemines medžiagas, kurios sukelia DNR pažaidas. Atliekant kometų bandymą šarminėmis sąlygomis (> pH 13), galima aptikti vienos ir dviejų gijų trūkius dėl, pvz., tiesioginės sąveikos su DNR, šarmams jautrių vietų arba pereinamuosius DNR trūkius, susijusius su DNR ekscizine reparacija. Šie gijų trūkiai gali būti pataisyti, bet poveikis būtų ne nuolatinis, todėl tai gali būti mirtina ląstelei arba likti kaip mutacija, kuri vyktų kaip nuolatinis gyvybingas kitimas. Dėl jų taip pat gali atsirasti chromosomų pažeidimas, kuris taip pat yra susijęs su daugeliu žmonių ligų, įskaitant vėžį.
                     Graužikų kometų bandymo in vivo oficialus tinkamumo patvirtinimo tyrimas buvo atliekamas 2006–2012 m., jį koordinavo Japonijos alternatyvių metodų patvirtinimo centras (angl. Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) kartu su Europos alternatyvių metodų patvirtinimo centru (angl. European Centre for the Validation of Alternative Methods, Alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybinio koordinavimo komitetu (angl. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) ir Nacionalinės toksikologijos programos alternatyvių toksikologinių metodų patvirtinimo tarpžinybinio koordinavimo komitetu (angl. NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM) (12). Į šį bandymų metodą įtrauktas kometų bandymo rekomenduojamas taikymas ir apribojimai, jis yra pagrįstas galutiniu protokolu (12), naudotu atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimą, ir susijusiais papildomais paskelbtais bei nepaskelbtais (laboratorijų nuosavybės teisėmis turimais) duomenimis.
                     Pagrindinių terminų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje. Reikia pažymėti, kad šiam bandymui atlikti galima naudoti daug skirtingų sistemų (mikroskopo objektiniai stikleliai, gelio dėmės, 96 duobučių plokštelės ir kt.) Patogumo dėlei toliau šiame dokumente vartojamas terminas objektinis stiklelis, bet jis taip pat aprėpia visas kitas sistemas.
                     PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                     Kometų bandymas yra eukariotinių ląstelių DNR gijų trūkių matavimo metodas. Atliekama ant objektinio stiklelio į agarozę įlietų pavienių ląstelių ar branduolių lizė plovikliu ir didelės koncentracijos druska. Šiame lizės etape suyra ląstelių ir branduolių membranos ir galima išskirti DNR spiralių kilpas, kurios paprastai vadinamos nukleotidais ir DNR fragmentais. Atliekant elektroforezę esant didelei pH vertei, susidaro į kometas panašios struktūros, kurias galima stebėti fluorescencinės mikroskopijos metodu naudojant atitinkamus fluorescencinius dažus; DNR fragmentai, priklausomai nuo jų dydžio, migruoja nuo „galvos“ link „uodegos“, o kometos uodegos fluorescencijos intensyvumas palyginti su suminiu intensyvumu (galvos ir uodegos) rodo DNR trūkio dydį (13) (14) (15).
                     Kometų bandymas in vivo šarminėmis sąlygomis ypač tinka įvertinant genotoksinį pavojų, kai bandymo atsakai priklauso nuo absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo ir šalinimo (angl. absorption, distribution, metabolism, excretion, ADME) in vivo, taip pat nuo DNR reparacijos procesų. Šie dalykai gali skirtis tarp rūšių, tarp audinių ir tarp DNR pažaidų tipų.
                     Siekiant atitikti gyvūnų gerovės reikalavimus, ypač dėl jų naudojimo mažinimo (laikantis 3R principo – pakeitimas, mažinimas, tobulinimas (angl. Replacement, Reduction, Refinement)), šį bandymą taip pat galima integruoti su kitais toksikologiniais tyrimais, pvz., kartotinės dozės toksiškumo tyrimais (10) (16) (17), arba vertinamąją baigtį galima derinti su kitomis genotoksiškumo vertinamosiomis baigtimis, pvz., žinduolių eritrocitų mikrobranduolių bandymo in vivo baigtimis (18) (19) (20). Kometų bandymas dažniausiai atliekamas su graužikais, tačiau jis buvo taikomas kitoms žinduolių ir ne žinduolių rūšims. Kitų nei graužikai rūšių naudojimas kiekvienu atskiru atveju turėtų būti pagrįstas moksliniu ir etiniu požiūriu; kometų bandymą su kitomis nei graužikai rūšimis primygtinai rekomenduojama atlikti tik kaip kito toksiškumo tyrimo dalį, o ne kaip atskirą bandymą.
                     Veikimo būdą ir tiriamą (-us) audinį (-ius) reikėtų pasirinkti atsižvelgiant į visas turimas ar esamas žinias apie bandomąją cheminę medžiagą, pvz., numatomą ar tikėtiną žmonių veikimo būdą, metabolizmą ir pasiskirstymą, poveikio sąlyčio vietoje galimybę, struktūrinius toksiškumo požymius, kitus genotoksiškumo ar toksiškumo duomenis ir tyrimo tikslą. Todėl tam tikrais atvejais bandomosios cheminės medžiagos genotoksinis potencialas gali būti tikrinamas tiriant kancerogeninį ir (arba) kitą toksinį poveikį tiksliniame (-iuose) audinyje (-iuose). Bandymas taip pat yra naudingas toliau tiriant genotoksiškumą, aptiktą in vitro sistema. Tiriamo audinio kometų bandymą in vivo reikia atlikti tada, kai galima pagrįstai tikėtis, kad tiriamas audinys bus veikiamas tinkamu būdu.
                     Bandymo tinkamumas buvo išsamiai patvirtintas atliekant tarplaboratorinius žiurkių patinų somatinių audinių tyrimus, pvz., JaCVAM (12) ir Rothfuss et al., 2010 (10) tyrimus. Atliekant JaCVAM tarptautinį tinkamumo patvirtinimo tyrimą buvo naudojamos kepenys ir skrandis. Kepenys buvo pasirinktos todėl, kad jos yra aktyviausias cheminių medžiagų metabolizme dalyvaujantis organas, taip pat dažnai yra kancerogeniškumo tikslinis audinys. Skrandis pasirinktas todėl, kad jis yra pirmoji sąlyčio su chemine medžiaga vieta, kai ji patenka per burną, nors į kitas virškinimo trakto zonas, pvz., dvylikapirštę žarną ir tuščiąją žarną, taip pat reikėtų žiūrėti kaip į sąlyčio vietos audinius ir jos gali būti laikomos svabesnėmis žmonėms nei graužikų liaukinis skrandis. Reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad tokie audiniai nebūtų veikiami ypač didelės koncentracijos bandomąja chemine medžiaga (21). Metodas iš esmės tinka visiems audiniams, iš kurių galima gauti analizei tinkamas pavienių ląstelių ar branduolių suspensijas. Kelių laboratorijų nuosavybės teise turimi duomenys rodo jo sėkmingą taikymą daugeliui skirtingų audinių ir yra daug leidinių, kuriuose pateikta įrodymų, kad metodas tinka kitiems nei kepenys ar skrandis organams ir audiniams, pvz., tuščiajai žarnai (22), inkstams (23) (24), odai (25) (26), šlapimo pūslei (27) (28), plaučių ir bronchų bei alveolių išplovų ląstelėms (tinka įkvėptų cheminių medžiagų tyrimams) (29) (30), be to, bandymai buvo atlikti du daugeliu kitų organų (31) (32).
                     Nors gali būti įdomu tirti genotoksinį poveikį embrioninėms ląstelėms, reikėtų pažymėti, kad šiame bandymų metode aprašytas standartinis kometų bandymas šarminėje terpėje nelaikomas tinkamu subrendusių embrioninių ląstelių DNR gijų trūkiams matuoti. Kadangi literatūros apžvalgoje dėl kometų bandymo naudojimo tiriant embrioninių ląstelių genotoksiškumą buvo pranešta apie didelius ir kintamus DNR pažaidų lygius (33), manoma, kad prieš įtraukiant subrendusių embrioninių ląstelių (pvz., spermos) kometų bandymą į bandymų metodą, būtina protokolą modifikuoti ir atlikti patobulintus standartizavimo ir tinkamumo patvirtinimo tyrimus. Be to, šiame bandymų metode aprašyta rekomenduojama veikimo schema nėra optimali ir galbūt būtų būtina ilgesnė veikimo ar ėminių ėmimo trukmė, kad būtų galima atlikti subrendusių spermatozoidų DNR gijų trūkių reikšmingą analizę. Literatūroje yra aprašytas genotoksinis poveikis, išmatuotas skirtingais diferenciacijos etapais atliekant sėklidžių ląstelių kometų bandymą (34) (35). Tačiau reikėtų pažymėti, kad lytinės liaukos turi somatinių ir embrioninių ląstelių mišinį. Dėl šios priežasties visai lytinei liaukai (sėklidei) gauti teigiami rezultatai nebūtinai rodo embrioninių ląstelių pažeidimą; visgi jie rodo, kad bandomoji (-osios) cheminė medžiaga (-os) ir (arba) jos ar jų metabolitai pasiekė lytinę liauką.
                     Taikant kometų bandymo standartines Bandymo sąlygas, skersinių jungčių negalima patikimai aptikti. Tam tikromis pakeistomis Bandymo sąlygomis būtų galima aptikti DNR-DNR ir DNR-baltymo skersines jungtis ir kitas bazių modifikacijas, pvz., oksiduotas bazes (23) (36) (37) (38) (39). Vis dėlto reikėtų atlikti papildomus darbus, kad būtų galima tinkamai apibūdinti būtinus protokolo pakeitimus. Todėl skersines jungtis sudarančių agentų aptikimas nėra pagrindinis čia aprašyto bandymo tikslas. Bandymas netinka, netgi su pakeitimais, aneugenams aptikti.
                     Atsižvelgiant į šiuo metu turimas žinias, keli papildomi apribojimai (žr. 3 priedėlį) yra susiję su kometų bandymu in vivo. Tikimasi ateityje bandymų metodą peržiūrėti ir, atsižvelgiant į įgytą patirtį, prireikus pataisyti.
                     Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, tai dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.
                     METODO PRINCIPAS
                     Gyvūnai veikiami bandomąja chemine medžiaga reikiamu būdu. Išsamus dozavimo ir ėminių ėmimo aprašymas pateiktas 36–40 pastraipose. Pasirinktu (-ais) ėminių ėmimo momentu (-ais) tiriami audiniai išpjaunami ir ruošiamos pavienių ląstelių ar branduolių suspensijos (galima atlikti perfuziją in situ, jei manoma, kad tai būtų naudinga, pvz., kepenų) ir įliejamos į minkštąjį agarą, kad jas būtų galima fiksuoti ant objektinių stiklelių. Ląstelės ar branduoliai apdorojamos lizės buferiniu tirpalu, kad būtų pašalintos ląstelių ir (arba) branduolių membranos, ir veikiama stipriais šarmais, pvz., pH ≥ 13, kad būtų galima išvyti DNR spiralę ir išlaisvinti išvytų DNR kilpas ir fragmentus. Tada atliekama branduolio DNR elektroforezė. Į fragmentus nesuskilusios normalios DNR molekulės lieka toje vietoje, kurioje agare buvo branduolio DNR, o visos fragmentuotos DNR ir išlaisvintos DNR kilpos migruotų anodo link. Po elektoforezės DNR vizualizuojama naudojant reikiamą fluorescencinį dažą. Preparatus reikėtų analizuoti naudojant mikroskopą ir visiškai ar pusiau automatizuotas vaizdo analizės sistemas. Elektroforezės metu migravusios DNR kiekis ir migracijos atstumas rodo DNR fragmentų kiekį ir dydį. Yra kelios kometų bandymo vertinamosios baigtys. DNR pažaidoms vertinti buvo rekomenduojamas DNR kiekis uodegoje (uodegos procentinė DNR dalis ar uodegos intensyvumo procentinė dalis) (12) (40) (41) (42). Atlikus pakankamo branduolių skaičiaus analizę, duomenys analizuojami tinkamais metodais, kad būtų galima spręsti apie bandymo rezultatus.
                     Reikėtų pažymėti, kad buvo tiriami įvairūs kintami metodikos aspektai, įskaitant ėminių paruošimą, elektroforezės sąlygas, vizualios analizės parametrus (pvz., dažo intensyvumą, mikroskopo lempos šviesos stiprį, mikroskopo filtrų naudojimą ir dinaminius filmavimo kameros parametrus) ir aplinkos sąlygas (pvz., foninį apšvietimą), ir jie gali daryti įtaką DNR migracijai (43) (44) (45) (46).
                     LABORATORIJOS KVALIFIKACIJOS TIKRINIMAS
                     Kiekviena laboratorija turėtų nustatyti savo kompetenciją atliekant kometų bandymą, įrodydama sugebėjimą gauti kiekvienos naudotos rūšies kiekvieno tikslinio audinio pakankamos kokybės pavienių ląstelių ar branduolių suspensijas. Preparatų kokybė bus įvertinta visų pirma pagal nešikliu apdorotiems gyvūnams gautą uodegos DNR procentinę dalį, kurios vertė patektų į atkuriamą mažų verčių intervalą. Šiuo metu turimi duomenys rodo, kad būtų gerai, jei žiurkių kepenims gautos uodegos DNR procentinės dalies grupės vidurkis (pagal medianų vidurkį, žr. 57 pastraipą, kurioje šie terminai išsamiai paaiškinti), būtų ne didesnis kaip 6 %, kuris sutaptų su vertėmis, gautomis atliekant JaCVAM tinkamumo patvirtinimo tyrimą (12) ir su kitais paskelbtais ir nuosavybės teise turimais duomenimis. Šiuo metu nėra pakankamai duomenų, kad būtų galima pateikti rekomendacijas apie kitiems audiniams gautus optimalius arba priimtinus intervalus. Tai netrukdo naudoti kitus audinius, jei būtų pagrįsta. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta tinkama kometų bandymo naudojant šiuos audinius charakteristikų apžvalga, atsižvelgiant į mokslinėje literatūroje paskelbtus arba nuosavybės teise turimus duomenis. Pirma, pageidautina, kad kontroliniams ėminiams gautą uodegos DNR procentinė dalis būtų maža, nes tai užtikrintų pakankamą dinaminį intervalą teigiamam poveikiui aptikti. Antra, kiekviena laboratorija turėtų gebėti atkurti tikėtinus atsakus į tiesioginius mutagenus ir promutagenus, esant skirtingiems veikimo būdams, kurie pateikti 1 lentelėje (29 pastraipa).
                     Teigiamas medžiagas galima pasirinkti, pvz., iš naudotų atliekant JaCVAM tinkamumo patvirtinimo tyrimą (12) arba iš kitų paskelbtų duomenų (žr. 9 pastraipą), jei tinka, jas pagrįsti ir parodyti tiriamų audinių aiškius teigiamus atsakus. Reikėtų parodyti gebėjimą nustatyti silpną žinomų mutagenų poveikį, pvz., etilmetansulfonato (EMS) mažomis dozėmis, pvz., nustatant dozės ir atsako priklausomybes, esant reikiamam dozių skaičiui ir tarpams tarp jų. Iš pradžių reikėtų sutelkti dėmesį į kvalifikacijos nustatymą imant dažniausiai naudojamus audinius, pvz,. graužikų kepenis, nes laukiamus rezultatus galima palyginti su esamais duomenimis (12). Kitiems audiniams, pvz., skrandžiui, dvylikapirštei, tuščiajai žarnai ar kraujui gauti duomenys galėtų būti renkami tuo pačiu metu. Laboratorija turi įrodyti kvalifikaciją atlikdama bandymus su kiekvienu numatytu tirti kiekvienos rūšies atskiru audiniu, jai taip pat reikės įrodyti, kad su žinomu mutagenu (pvz., EMS) gali gauti priimtiną teigiamą to audinio atsaką.
                     Turėtų būti renkami nešiklio ar neigiamų kontrolinių ėminių duomenys, siekiant įrodyti neigiamų duomenų atsakų atkuriamumą ir užtikrinti tinkamą techninių bandymo aspektų kontrolę arba pasiūlyti, kad būtina iš naujo sukurti istorinių kontrolinių ėminių duomenų intervalus (žr. 22 pastraipą).
                     Reikėtų pažymėti, kad, nors atliekant skrodimą galima paimti daugelį audinių ir apdoroti juos kometų analizei atlikti, laboratorija turi turėti patirties daugelį šių audinių paimti iš vieno gyvūno ir taip užtikrinti, kad bus atsižvelgta į visas galimas DNR pažaidas ir kad kometų analizė nebus sugadinta. Laiko tarpas nuo numarinimo iki apdoroti skirtų audinių pašalinimo gali būti labai svarbus (žr. 44 pastraipą).
                     Tobulinant šio bandymo atlikimo kvalifikaciją, būtina atsižvelgti į gyvūnų gerovę, todėl galima naudoti kituose bandymuose naudotų gyvūnų audinius, kai reikia įgyti patirties įvairiais bandymo aspektais. Be to, vykdant naujo bandymų metodo įdiegimo laboratorijoje etapus, viso tyrimo atlikti nebūtina, tobulinant būtinus įgūdžius, galima naudoti mažiau gyvūnų ar bandymo koncentracijos verčių.
                     
                        Istorinių kontrolinių ėminių duomenys
                     
                     Atlikdama su kvalifikacijos tikrinimu susijusius tyrimus, laboratorija turėtų sukurti istorinių duomenų bazę, kad atitinkamiems audiniams ir rūšims būtų galima nustatyti teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių intervalus ir skirstinius. Rekomendacijas, kaip kurti ir naudoti istorinius duomenis (t. y. duomenų įtraukimo ir pašalinimo iš istorinių duomenų kriterijus ir tam tikro bandymo priimtinumo kriterijus) galima rasti literatūroje (47). Skirtingiems audiniams ir skirtingoms rūšims, taip pat skirtingiems nešikliams ir dozės davimo būdams gali būti gautos skirtingos neigiamų kontrolinių ėminių uodegos DNR procentinės dalies vertės. Todėl svarbu nustatyti neigiamų kontrolinių ėminių intervalus kiekvienam audiniui ir rūšiai. Laboratorijos turėtų taikyti kokybės kontrolės metodus, tokius kaip kontrolinės diagramos (pvz., C tipo ar X juostinės diagramos (48)), kad galėtų nustatyti savo duomenų kintamumą ir įrodyti metodikos „valdomumą“ savo laboratorijoje. Taip pat gali tekti optimizuoti reikiamų teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų, dozių intervalų ir Bandymo sąlygų (pvz., elektroforezės sąlygų) pasirinkimą, kad būtų galima aptikti silpną poveikį (žr. 17pastraipą).
                     Į visus bandymų protokolo pakeitimus reikėtų žiūrėti atsižvelgiant į jų suderinamumą su esamomis laboratorijos istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazėmis. Esant didesnėms neatitiktims turėtų būti kuriama nauja istorinių kontrolinių ėminių duomenų bazė.
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Parengiamieji darbai
                     
                     
                        Gyvūnų rūšies parinkimas
                     
                     Paprastai naudojamos sveikų jaunų suaugusių graužikų laboratorinės veislės (6–10 savaičių amžiaus nuo apdorojimo pradžios, nors leidžiama naudoti šiek tiek vyresnius gyvūnus). Pasirenkant graužikų rūšį, reikėtų atsižvelgti į i) rūšis, naudotas atliekant toksiškumo tyrimus (kad būtų galima susieti duomenis ir atlikti integruotuosius tyrimus), ii) rūšis, kurioms susidarė augliai tiriant kancerogeniškumą (kancerogenezės mechanizmą) arba iii) rūšis, kurių metabolizmas daugiausiai panašus į žmonių, jei jis žinomas. Atliekant šį bandymą dažniausiai naudojamos žiurkės. Tačiau galima naudoti kitas rūšis, jei jų naudojimas būtų etiškai ir moksliškai pagrįstas.
                     
                        Gyvūnų laikymo ir šėrimo sąlygos
                     
                     Jei naudojami graužikai, temperatūra bandymo gyvūnų patalpoje turėtų būti 22 °C (± 3 °C). Nors geriausia būtų užtikrinti 50–60 % santykinę drėgmę, ji neturėtų būti mažesnė kaip 30 % ir būtų gerai, jei ji nebūtų didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos valymo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos seką. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė užtikrinti tinkamą bandomosios cheminės medžiagos sumaišymą su pašaru, kai ji duodama tokiu būdu. Graužikai turėtų būti laikomi mažomis grupėmis (paprastai ne daugiau kaip po penkis) tos pačios lyties gyvūnus, jei nėra agresyvaus elgesio pavojaus. Tik moksliškai pagrįstais atvejais gyvūnus galima laikyti atskirai. Jei yra galimybė, reikėtų naudoti narvelius su kietomis grindimis, nes tinklinės grindys gali būti sunkių sužeidimų priežastimi (49). Turi būti užtikrinta reikiama pagerinta aplinka.
                     
                        Gyvūnų paruošimas
                     
                     Gyvūnai yra atsitiktinai suskirstomi į kontrolines ir apdorojimo grupes. Gyvūnai unikaliai paženklinami ir aklimatizuojami laboratorinėmis sąlygomis ne trumpiau kaip 5 paras iki apdorojimo pradžios. Gyvūnai turi būti paženklinami minimaliai invaziniu būdu. Tinkamiausi būdai būtų žiedavimas, etiketės kabinimas, mikrolusto naudojimas ir biometrinis identifikavimas. Pėdų ar ausų spaustukai nėra moksliškai pagrįsti atliekant šiuos bandymus. Narvelius reikėtų įrengti taip, kad jų išdėstymo poveikis būtų minimalus. Tyrimo pradžioje gyvūnų masės skirtumas turėtų būti minimalus ir neviršyti ± 20 %.
                     
                        Dozių ruošimas
                     
                     Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas prieš duodant gyvūnams reikėtų ištirpinti atitinkamuose nešikliuose, paruošti jų suspensiją arba įmaišyti į pašarą ar geriamąjį vandenį. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dozuoti tiesiogiai arba prieš tai praskiesti. Jei bandomoji cheminė medžiaga patenka per kvėpavimo takus, ją, atsižvelgiant į jos fizikines ir chemines savybes (50) (51), galima duoti dujų, garų arba kietojo ar skystojo aerozolio pavidalu.
                     Reikėtų naudoti tik iš naujo paruoštus bandomosios cheminės medžiagos preparatus, nebent stabilumo duomenys rodo, kad laikymas priimtinas ir šiuo atveju apibrėžiamos tinkamos laikymo sąlygos.
                     
                        Bandymo sąlygos
                     
                     
                        Nešiklis
                     
                     Neturėtų būti nešiklio toksinio poveikio, esant naudojamai dozei, ir neturėtų kilti įtarimų, kad galėtų vykti jų cheminė reakcija su bandomosiomis cheminėmis medžiagomis. Jei naudojami kiti nei gerai žinomi tirpikliai ar nešikliai, juos galima įtraukti, pateikus etaloninius duomenis, kurie rodytų suderinamumą su bandymo gyvūnais, davimo būdu ir vertinamąja baigtimi. Rekomenduojama visuomet iš pradžių atsižvelgti į galimybę naudoti vandeninį tirpiklį arba nešiklį. Reikėtų pažymėti, kad kai kurie nešikliai (ypač klampūs nešikliai) gali sukelti uždegimą ir padidinti DNR gijų trūkių sąlyčio vietoje foninį lygį, ypač medžiagą duodant daug kartų.
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     
                        Teigiami kontroliniai ėminiai
                     
                     Šiuo metu atliekant kiekvieną bandymą paprastai reikėtų imti gyvūnų grupę, kurią sudarytų ne mažiau kaip 3 vienos lyties ar kiekvienos lyties, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai (žr. 32 pastraipą), apdoroti teigiama kontroline chemine medžiaga. Ateityje galbūt laboratorija galės įrodyti, kad jos kvalifikacijos pakanka teigiamų kontrolinių ėminių skaičiui sumažinti. Jei ėminiai imami kelis kartus (pvz., pagal vieno dozės davimo protokolą), teigiamus kontrolinius ėminius būtina įtraukti tik į vieną ėminių ėmimą, bet reikėtų užtikrinti subalansuotą schemą (žr. 48 pastraipą). Vienalaikio teigiamo kontrolinio ėminio chemines medžiagas nebūtina duoti tokiu pačiu būdu, kaip bandomąją cheminę medžiagą, nors svarbu, kad būtų naudojamas vienodas būdas matuojant poveikį sąlyčio vietoje. Turėtų būti įrodyta, kad teigiamos kontrolinės medžiagos sukelia DNR gijų trūkius visuose audiniuose, kurie naudojami bandomajai cheminei medžiagai tirti, ir atrodo, kad kaip teigiamą kontrolinę medžiagą reikėtų pasirinkti EMS, nes jis sukelia visų tirtų audinių DNR gijų trūkius. Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų dozes reikėtų parinkti taip, kad būtų sukeltas vidutinis poveikis, pagal kurį galima kritiškai įvertinti bandymo charakteristikas ir jautrumą, o jas būtų galima pagrįsti dozės ir atsako kreivėmis, gautomis atliekant kvalifikacijos tikrinimą. Vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių gyvūnams gauta uodegos DNR procentinė dalis turėtų atitikti iš anksto tos rūšies audiniui nustatytą laboratorijos intervalą ir ėminių ėmimo laiką (žr. 16 pastraipą). Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai ir kai kurie jų tiksliniai audiniai (graužikų) yra įtraukti į 1 lentelę. Galima pasirinkti kitas chemines medžiagas, nei nurodytos 1 lentelėje, jei moksliškai būtų pagrįsta.
                     
                        1 lentelė.
                     
                     
                        Teigiamų kontrolinių cheminių medžiagų pavyzdžiai ir kai kurie jų tiksliniai audiniai
                     
                     Medžiagos ir CAS Nr.
                     Etilmetansulfonatas (CAS Nr. 62-50-0), visi audiniai
                     Etilnitrozokarbamidas (CAS Nr. 759-73-9), kepenys ir skrandis, dvylikapirštė ar tuščioji žarna
                     Metilmetansulfonatas (CAS Nr. 66-27-3) kepenys, skrandis, dvylikapirštė ar tuščioji žarna, plaučių ir bronchų bei alveolių išplovų (BAL) ląstelės, inkstai, šlapimo pūslė, plaučiai, sėklidės ir kaulų čiulpai ar kraujas
                     
                        N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidinas (CAS Nr.: 70-25-7) skrandis, dvylikapirštė ar tuščioji žarna
                     1,2-dimetilhidrazinas 2HCl (CAS Nr. 306-37-6), kepenys ir žarnynas
                     
                        N-metil-N-nitrozokarbamidas (CAS Nr. 684-93-5), kepenys, kaulų čiulpai, kraujas, inkstai, skrandis, tuščioji žarna ir smegenys.
                     
                        Neigiami kontroliniai ėminiai
                     
                     Neigiamos kontrolinės grupės gyvūnus, apdorotus vien tik nešikliu, reikėtų įtraukti į kiekvieną bandymą kiekvienam ėminių ėmimo laikui ir audiniui, ir su jais elgtis kaip su apdorotomis grupėmis. Neigiamų kontrolinių ėminių gyvūnams gauta uodegos DNR procentinė dalis turėtų atitikti iš anksto kiekvienam audiniui nustatytą laboratorijos foninį intervalą ir ėminių ėmimo laiką (žr. 16 pastraipą). Jei nėra istorinių arba paskelbtų kontrolinių duomenų, kurie rodo, kad pasirinktas nešiklis nesukelia jokio žalingo arba genotoksinio poveikio dėl davimų skaičiaus arba davimo būdo, prieš atliekant visą tyrimą reikėtų atlikti pradinį tyrimą nešiklio kontrolinio ėminio priimtinumui nustatyti.
                     PROCEDŪRA
                     
                        Gyvūnų skaičius ir lytis
                     
                     Nors patelėms gautų duomenų yra per mažai, kad atliekant kometų bandymą būtų galima palyginti lytis, kiti patinams ir patelėms gauti genotoksiškumo in vivo atsakai iš esmės yra panašūs, todėl daugumą tyrimų galima atlikti su bet kurios lyties gyvūnais. Jei duomenys rodytų esminius skirtumus tarp patinų ir patelių (pvz., sisteminio toksiškumo, metabolizmo, biologinio įsisavinamumo ir kt. skirtumus, įskaitant, pvz., intervalo nustatymo tyrimą), tai paskatintų naudoti abiejų lyčių gyvūnus. Šiuo atveju galbūt reikėtų atlikti tyrimą su abiejų lyčių gyvūnais, pvz., kaip kartotinės dozės toksiškumo tyrimo dalį. Jei naudojamos abi lytys, galbūt tiktų taikyti faktorinės analizės schemą. Išsami informacija, kaip analizuoti duomenis taikant šią schemą, pateikta 2 priedėlyje.
                     Tyrimo pradžioje ir nustatant kvalifikaciją reikėtų nustatyti grupių dydį turint tikslą vienai grupei gauti ne mažiau kaip 5 analizei tinkamus vienos lyties gyvūnus arba kiekvienos lyties gyvūnus, jei naudojami abiejų lyčių gyvūnai (vienalaikių teigiamų kontrolinių ėminių grupei reikia mažiau gyvūnų, žr. 29 pastraipą). Jei cheminių medžiagų poveikis žmonėms gali priklausyti nuo lyties, pvz., kai kurių vaistų atveju, bandymas turėtų būti atliekamas su atitinkamos lyties gyvūnais. Atliekant tyrimą pagal 33 pastraipoje nustatytus parametrus, kai yra trys dozių grupės ir vienalaikio neigiamo ir teigiamo kontrolinių ėminių grupės (kiekvieną grupę sudaro penki vienos lyties gyvūnai), rekomenduojamas tipinis maksimalus gyvūnų poreikis būtų nuo 25 iki 35 gyvūnų.
                     APDOROJIMO PLANAS
                     Gyvūnai turėtų būti apdorojami kasdien 2 paras ar ilgiau (t. y. apdorojama du kartus ar daugiau maždaug kas 24 h), ir ėminiai surenkami vieną kartą, nuo paskutinio apdorojimo praėjus 2–6 h (arba Tmax) (12). Priimtini išplėstinių dozių davimo schemų (pvz., 28 parų kasdienio dozavimo) ėminiai. Buvo parodyta, kad galima sėkmingai derinti kometų ir eritrocitų mikrobranduolių bandymus (10) (19). Tačiau reikėtų kruopščiai ištirti kometų analizei paimtų ėminių tiekimo klausimus, atsižvelgiant į reikalavimus, susijusius su kitiems toksikologinių įvertinimų tipams skirtų audinių ėminių ėmimu. Surinkimas praėjus 24 h nuo paskutinės dozės davimo, kuris yra tipinis laikas atliekant bendrojo toksiškumo tyrimą, daugumoje atveju netinka (žr. 40 pastraipą apie ėminių ėmimo laiką). Kitokių apdorojimo ir ėminių ėmimo tvarkaraščių naudojimą reikėtų pagrįsti (žr. 3 priedėlį). Pvz., būtų galima imti daugkartinius ėminius po vienkartinio apdorojimo, tačiau reikėtų pažymėti, kad tyrimui su vienkartiniu davimu atlikti prireiks daugiau gyvūnų, nes ėminius reikės imti daug kartų, bet kartais tai gali tikti labiau, pvz., kai bandomoji cheminė medžiaga sukelia per didelį toksiškumą po pakartotinio dozių davimo.
                     Nepriklausomai nuo bandymo atlikimo būdo, jis yra priimtinas, jei bandomajai cheminei medžiagai gaunamas teigiamas atsakas arba, kai atsakas yra neigiamas, ar yra tikslinio (-ų) audinio (-ų) paveikimą patvirtinančių tiesioginių ar netiesioginių įrodymų ir ar pasiekta ribinė dozė (žr. 36 pastraipą).
                     Bandomąsias chemines medžiagas galima duoti kaip padalytą dozę, t. y. siekiant palengvinti didelių tūrių davimą, per vieną dieną apdorojama du kartus arba daugiau, tarp apdorojimų esant ne ilgesniam kaip 2–3 h tarpui. Šiomis aplinkybėmis ėminių ėmimo tvarkaraštį reikėtų sudaryti atsižvelgiant į paskutinės dozės davimo laiką (žr. 40 pastraipą).
                     
                        Dozių dydžiai
                     
                     Jei atliekamas parengiamasis intervalo nustatymo tyrimas, nes nėra kitų susijusių tyrimų tinkamų duomenų, kurie padėtų pasirinkti dozę, jį reikėtų atlikti toje pačioje laboratorijoje, naudojant pagrindiniam tyrimui naudoti numatytą rūšį, veislę, lytį ir apdorojimo schemą pagal dabartinius intervalo nustatymo tyrimų atlikimo metodus. Tyrimo tikslas – nustatyti didžiausią toleruojamą dozę (MTD), apibrėžiamą kaip dozė, kuri sukeltų nestiprų toksinį poveikį, susijusį su tyrimo laikotarpio trukme (pvz., būtų aiškūs klinikiniai požymiai, pvz., nenormalus elgesys ar reakcija, nedidelis kūno masės sumažėjimas arba tikslinio audinio citotoksiškumas), bet ne žūtį ar skausmo, kančių ar išsekimo požymius, dėl kurių gyvūną reikėtų numarinti. Jei bandomoji cheminė medžiaga nėra toksiška, 14 parų ar ilgesnio laikotarpio didžiausia (ribinė) davimo dozė turėtų būti 1 000 mg/kg kūno masės per parą. Jei davimo laikotarpis yra trumpesnis kaip 14 parų, maksimali (ribinė) dozė yra 2 000 mg/kg kūno masės per parą. Tam tikrų tipų bandomųjų cheminių medžiagų (pvz., vaistų žmonėms), kurioms taikomi specifiniai reglamentai, šios ribos gali skirtis.
                     Cheminės medžiagos, kurios rodo toksikokinetinių savybių prisotinimą arba po ilgalaikio davimo sukelia detoksifikavimo procesus, galinčius mažinti poveikį, gali būti dozės nustatymo kriterijų išimtys ir turėtų būti įvertinamos kiekvienu atveju atskirai.
                     Atliekant ūmaus ir poūmio poveikio kometų bandymą, be didžiausios dozės (MTD, didžiausios leidžiamos dozės, didžiausios poveikio ar ribinės dozės) kiekvienam ėminio ėmimo laikui reikėtų pasirinkti ne mažiau kaip dvi papildomas mažėjančios sekos ir reikiamo skirtumo (pageidautina, kad skirtumas būtų mažesnis kaip 10 kartų) dozes, kad būtų įrodyti su doze susiję atsakai. Tačiau būtų gerai, jei naudojami dozių dydžiai aprėptų intervalą nuo didžiausios dozės iki mažo toksiškumo arba visiškai jo nesukeliančios dozės. Kai toksiškumas tiksliniam audiniui stebimas visiems bandomiems dozės dydžiams, patartina toliau tirti netoksines dozes (žr. 54–55 pastraipas). Tyrimams, kurių tikslas būtų išsamiau ištirti dozės ir atsako priklausomybės kreivės formą, gali prireikti papildomos (-ų) dozių grupės (-ių).
                     
                        Dozių davimas
                     
                     Rengiant bandymo schemą, reikėtų atsižvelgti į numatomą poveikio žmogui būdą. Todėl galima pasirinkti pagrįstus veikimo būdus, pvz., duoti su pašaru, geriamuoju vandeniu, dėti ant odos, atlikti vietinę poodinę arba intraveninę injekciją, duoti per burną (per zondą), kvėpavimo takus, intubacinį vamzdelį ar implantuoti. Visais atvejais turėtų būti pasirinktas būdas, kuris užtikrintų reikiamą tikslinio (-ių) audinio (-ių) veikimą. Injekcija į pilvo ertmę paprastai nerekomenduojama, nes tai nėra numatytas poveikio žmogui būdas ir jį reikėtų naudoti, tik, jei jis būtų specialiai moksliškai pagrįstas (pvz., kai kurios teigiamos kontrolinės cheminės medžiagos, tyrimo tikslai ar kai kurie vaistai, kurie duodami darant injekciją į pilvo ertmę). Skysčio, kurį galima duoti per zondą arba įšvirkšti per vieną kartą, maksimalus tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100g kūno masės. Didesnio nei šis tūrio naudojimą (jei leidžiama pagal gyvūnų gerovės teisės aktus) reikėtų pagrįsti. Visais įmanomais atvejais skirtingo dydžio dozes reikėtų gauti atitinkamai reguliuojant dozuojamo preparato koncentraciją, kad būtų užtikrintas visų dydžių dozių tūrio pastovumas kūno masės atžvilgiu.
                     
                        Ėminių ėmimo laikas
                     
                     Ėminių ėmimo laikas yra kritinis kintamasis, nes jį lemia laikotarpis, per kurį bandomosios cheminės medžiagos pasieka maksimalią koncentraciją tiksliniame audinyje ir yra gauti DNR gijų trūkiai, bet jie dar nėra pašalinti ir pataisyti ar dar nežuvo ląstelės. Kai kurių pažaidų, kurios sukeltų kometų bandymu aptinkamus DNR gijų trūkius, buvimo trukmė gali būti labai trumpa, bent kai kurioms in vitro bandomoms cheminėms medžiagoms (52) (53). Todėl įtariant tokias laikinas DNR pažaidas, reikėtų imtis priemonių jų praradimui sumažinti, užtikrinant pakankamai ankstyvą audinių ėminių ėmimą, galbūt imant anksčiau nei toliau nurodytos numatomosios vertės. Optimalus (-ūs) ėminių ėmimo laikas (-ai) gali būti susijęs (-ę) su chemine medžiaga ar davimo būdu, dėl kurio, pvz., audinys būtų paveikiamas būtų greita, suleidus į veną ar įkvėpus. Todėl, jei įmanoma, ėminių ėmimo laikus reikėtų nustatyti pagal kinetinius duomenis (pvz., pagal laiką (Tmax), kuriuo pasiekiama didžiausia koncentracija (Cmax) plazmoje ar audinyje, arba pasiekus nuostoviąją būseną, taikant daugkartinį dozės davimą). Neturint kinetinių duomenų, tinkamas genotoksiškumo matavimo kompromisas būtų ėminių ėmimas, praėjus 2–6 h nuo paskutinio apdorojimo, jei apdorojama du kartus ar daugiau, arba praėjus 2–6 ir 16–26 h po vienkartinio davimo, bet reikėtų imtis priemonių atlikti vienalaikį visų gyvūnų skrodimą po paskutinės (ar vienintelės) dozės. Informacija apie tikslinių audinių toksinio poveikio vaizdą (jei yra) taip pat gali būti naudojama reikiamiems ėminių ėmimo laikams pasirinkti.
                     
                        Stebėjimai
                     
                     Bandymo gyvūnų sveikatos bendruosius klinikinius stebėjimus reikėtų atlikti ir registruoti bent kartą per dieną, ir pageidautina tai daryti kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo (54). Mažiausiai du kartus per dieną, siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius, visus gyvūnus reikėtų apžiūrėti. Jei tyrimų trukmė ilgesnė, visus gyvūnus reikėtų sverti bent kartą per savaitę ir pasibaigus bandymo laikotarpiui. Pašaro suvartojimą reikėtų matuoti jį keičiant ir bent kas savaitę. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiekį reikėtų išmatuoti kaskart, kai vanduo keičiamas, ir bent kartą per savaitę. Gyvūnus, kuriems pasireiškia nemirtini per didelio toksiškumo požymiai, reikėtų humaniškai numarinti iki bandymo laikotarpio pabaigos, ir jie paprastai nenaudojami kometų analizei.
                     
                        Audinių surinkimas
                     
                     Kadangi iš esmės įmanoma tirti kiekvieno audinio DNR gijų trūkių indukciją (kometas), renkamo audinio (-ų) pasirinkimo principą reikėtų aiškiai apibrėžti ir pagrįsti atsižvelgiant į tyrimo atlikimo priežastį ir į turimus tiriamų bandomųjų cheminių medžiagų ADME, genotoksiškumo, kancerogeniškumo ar kitus toksiškumo duomenis. Svarbūs nagrinėjami veiksniai turėtų aprėpti davimo būdą (pagrįstą galimu (-ais) poveikio žmonėms būdu (-ais)), prognozuojamą pasiskirstymą ir absorbciją audiniuose, metabolizmo vaidmenį ir galimą bandomųjų cheminių medžiagų veikimo mechanizmą. Dažniausiai tiriamas audinys yra kepenys, apie kurias sukaupta daugiausiai duomenų. Todėl, jei nėra bendrosios informacijos ir neidentifikuoti specifiniai audiniai, kuriuos reikėtų tirti, pagrįstai būtų galima imti kepenų ėminius, nes jos yra pagrindinė ksenobiotinio metabolizmo vieta, dažnai labai veikiama pačios -ų) pradinės (-ių) medžiagos (-ų) ir metabolito (-ų). Kartais labiausiai tiktų tirti tiesioginio sąlyčio vietą (pvz., liaukinį skrandį arba dvylikapirštę ar tuščiąją žarną, chemines medžiagas duodant per burną, arba plaučius, jei tiriamos įkvepiamos cheminės medžiagos). Atsižvelgiant į specifines bandymo atlikimo priežastis, reikėtų pasirinkti papildomus ar alternatyvius audinius, tačiau būtų naudinga ištirti kelis tų pačių gyvūnų audinius, jei laboratorija įrodė turinti kvalifikaciją visus tuos audinius ištirti ir geba juos apdoroti vienu metu.
                     
                        Bandinių paruošimas
                     
                     Kalbant apie procesus, aprašytus kitose pastraipose (44–49), yra svarbu tai, kad visi tirpalai ar stabilios suspensijos būtų panaudotos iki galiojimo pabaigos datos, arba prireikus būtų paruoštos iš naujo. Be to, toliau pateiktose pastraipose kritiniais kintamaisiais laikomas i) kiekvieno audinio pašalinimo po skrodimo, ii) kiekvieno audinio apdorojimo gaunant ląstelių ar branduolių suspensiją ir iii) suspensijos apdorojimo ir objektinių stiklelių paruošimo laikas (žr. 1 priedėlį Apibrėžtys), o priimtina kiekvieno šių etapų trukmė turėjo būti nustatyta kuriant metodą ir atliekant kvalifikacijos įrodymą.
                     Laikantis galiojančių gyvūnų gerovės teisės aktų ir trijų R principų ir praėjus reikiamam (-iems) laikui (-ams) po paskutinio apdorojimo bandomąja chemine medžiaga, gyvūnai numarinami. Pasirinktas (-i) audinys (-ai) yra pašalinamas (-i), preparuojamas (-i), ir jo ar jų dalis yra surenkama kometų bandymui atlikti, o kartu reikėtų paimti tos pačios audinio dalies išpjovą ir ją įdėti į formaldehido tirpalą ar reikiamą fiksavimo priemonę galimai histopatologinei analizei (žr. 55 pastraipą) pagal standartinius metodus (12) atlikti. Kometų bandymo audinys dedamas į malimo buferinį tirpalą, gerai išplaunamas šaltu malimo buferiniu tirpalu liekamajam kraujui pašalinti ir laikomas lediniame malimo buferiniame tirpale iki apdorojimo pradžios. Taip pat galima atlikti perfuziją in situ, pvz., kepenų, inkstų.
                     Yra daug paskelbtų metodų ląstelėms ar branduoliams atskirti. Juos sudaro audinių, pvz., kepenų ir inkstų, malimas, virškinimo trakto gleivėtų paviršių grandymas, homogenizavimas ir fermentinis skaidymas. Atliekant JaCVAM tinkamumo patvirtinimo tyrimą, buvo tiriamos tik atskiros ląstelės, todėl, kad būtų galima kurti metodą ir naudoti JaCVAM tyrimų duomenis kvalifikacijai įrodyti, pageidautina naudoti atskiras ląsteles. Tačiau buvo įrodyta, kad skirtumas tarp bandymo rezultatų nelabai priklausė nuo to, ar buvo naudojamos atskiros ląstelės, ar branduoliai (8). Palyginami rezultatai taip pat gaunami, taikant skirtingus metodus ląstelėms ar branduoliams atskirti (pvz., homogenizavimą, malimą, fermentinį skaidymą ir filtravimą per tinklelį (55). Todėl galima naudoti atskiras ląsteles arba atskirus branduolius. Laboratorija turėtų kruopščiai įvertinti audiniams būdingus atskirų ląstelių ar branduolių gavimo metodus ir patvirtinti jų tinkamumą. Kaip aptarta 40 pastraipoje, kai kurios pažaidos, pagal kurias kometų metodu aptinkami DNR gijų trūkiai, gali būti labai trumpą laiką (52) (53). Todėl, neatsižvelgiant į metodą, taikomą atskirų ląstelių ar branduolių suspensijoms gauti, yra svarbu, kad numarinus gyvūnus audiniai būtų apdoroti kuo greičiau ir būtų laikomi sąlygomis, kurios mažintų pažaidų išnykimą (pvz., audinius laikyti žemoje temperatūroje). Ląstelių suspensijas iki naudojimo pradžios reikėtų laikyti ledo temperatūroje taip, kad galima būtų įrodyti minimalius pokyčius tarp ėminių ir reikiamus teigiamų bei neigiamų kontrolinių ėminių atsakus.
                     OBJEKTINIŲ STIKLELIŲ PARUOŠIMAS
                     Objektiniai stikleliai turėtų būti ruošiami kuo greičiau (geriausia per vieną valandą) po atskirų ląstelių ar branduolių paruošimo, bet temperatūra ir laiko tarpas tarp gyvūnų numarinimo ir objektinių stiklelių paruošimo turėtų būti griežtai kontroliuojami ir patvirtinti laboratorijos sąlygomis. Ląstelių suspensijos tūris, įdėtas į žemos lydymosi temperatūros agarozę (paprastai 0,5–1,0 %) objektiniams stikleliams paruošti, neturėtų sumažinti žemos lydymosi temperatūros agarozės procentinės dalies iki mažesnės kaip 0,45 %. Optimalus ląstelių tankis bus nustatytas vaizdo analizės sistema, naudojama kometoms skaičiuoti.
                     
                        Lizė
                     
                     Lizės sąlygos taip pat yra kritinis kintamasis ir gali trukdyti gijų trūkiams, gautiems specifinių DNR modifikacijų tipams (tam tikroms alkilintoms DNR ir baziniams aduktams). Todėl rekomenduojama užtikrinti kiek įmanoma pastovesnes lizės sąlygas visiems vieno bandymo objektiniams stikleliams. Paruoštus objektinius stiklelius reikėtų panardinti į atšaldytą iki maždaug 2–8 °C lizės tirpalą ne trumpiau kaip vienai valandai (arba per naktį) prislopinto apšvietimo, pvz., geltonos šviesos (arba šviesos nepatekimo) sąlygomis, kad būtų išvengta UV komponentų galinčio turėti baltos šviesos poveikio. Pasibaigus inkubavimo laikotarpiui ir prieš pradedant išvijimo šarminėje terpėje etapą, objektinius stiklelius reikėtų nuplauti, kad būtų pašalintas ploviklis ir druskos. Tai galima daryti naudojant dejonizuotą vandenį, neutralizavimo buferinį tirpalą ar fosfatinį buferinį tirpalą. Taip pat galima naudoti elektroforezės buferinį tirpalą. Taip būtų užtikrintos šarminės sąlygos elektroforezės kameroje.
                     
                        Gijų išvijimas ir elektroforezė
                     
                     Objektiniai stikleliai turėtų būti atsitiktinai sudėti ant panardinamo tipo elektroforezės bloko, turinčio pakankamai elektroforezės tirpalo objektinių stiklelių paviršiams visiškai padengti, platformos (padengimo gylis taip pat turėtų būti vienodas tarp atskirų bandymų). Naudojant kito tipo kometų bandymo elektroforezės blokus, t. y. aktyviojo aušinimo su aušalo cirkuliacija ir su didelės galios maitinimo šaltiniu, bus gauta didesnė elektros srovė esant storesniam tirpalo sluoksniui, bet įtampa bus pastovi. Reikėtų naudoti subalansuotą objektinių stiklelių dėjimo į elektroforezės indą schemą, kad būtų sušvelnintas visų nukrypimų poveikis ar kraštinis efektas indo viduje ir sumažintas kintamumas tarp partijų, t. y. atliekant kiekvieną elektroforezės bandymą, turėtų būti tas pats kiekvieno tyrime naudoto gyvūno objektinių stiklelių skaičius ir būtų įtraukti skirtingo dozavimo grupių ėminiai, neigiami ir teigiami kontroliniai ėminiai. Objektiniai stikleliai paliekami bent 20 min, kad DNR galėtų išsivyti, ir atliekama elektroforezė kontroliuojamomis sąlygomis, kurios kiek įmanoma padidintų bandymo jautrį ir dinaminį diapazoną (t. y. būtų gauta priimtina neigiamų ir teigiamų kontrolinių ėminių uodegos DNR procentinė dalis, kuri užtikrintų didžiausią jautrį). Yra tiesinė priklausomybė tarp DNR migracijos atstumo ir elektroforezės trukmės bei jos potencialo (V/cm). Atsižvelgiant į JaCVAM tyrimą, potencialas turėtų būti 0,7 V/cm, o trukmė – bent 20 min. Elektroforezės trukmė yra laikoma kritiniu kintamuoju ir ji turėtų būti nustatoma dinaminiam diapazonui optimizuoti. Dėl ilgesnės elektroforezės trukmės (pvz., 30 ar 40 min, didžiausiam jautriui gauti) paprastai gaunamas stipresnis žinomų mutagenų teigiamas atsakas. Tačiau dėl ilgesnės elektroforezės trukmės gali būti gauta per didelė kontroliniams ėminiams migracija. Kiekvieno bandymo metu reikėtų užtikrinti pastovią įtampą, o kitų parametrų kintamumas turėtų atitikti siauras ir nustatytas ribas, pvz., atliekant JaCVAM tyrimą 0,7 V/cm įtampai buvo gauta 300 mA pradinė srovė. Buferinio tirpalo gylį reikėtų reguliuoti, kad reikiamos sąlygos būtų pasiektos ir užtikrintos per visą bandymą. Srovė turėtų būti registruojama elektroforezės laikotarpio pradžioje ir pabaigoje. Todėl kiekvieno tirto audinio optimalios sąlygos turėtų būti nustatytos laboratorijoje atliekant pradinį kvalifikacijos įrodymą. Elektroforezės tirpalo temperatūra išvijimo ir elektroforezės laikotarpiu turėtų būti žema, paprastai 2–10 °C (10). Reikėtų registruoti elektroforezės tirpalo temperatūrą išvijimo pradžioje, elektroforezės pradžioje ir elektroforezės pabaigoje.
                     Baigus elektroforezę, objektinius stiklelius reikėtų įmerkti į neutralizavimo buferinį tirpalą ar juo plauti ne trumpiau kaip 5 min. Galima dažyti tik ką gautus gelius ir vertinti (pvz., po 1–2 dienų) ar juos galima dehidratuoti, kad būtų galima vertinti vėliau (pvz., po 1–2 savaičių nuo dažymo) (56). Tačiau sąlygos turėtų būti patvirtintos atliekant kvalifikacijos įrodymo bandymus, o istoriniai duomenys turėtų būti gauti ir saugomi atskirai kiekvienai iš šių sąlygų. Tuo atveju, kai vertinama vėliau, objektinius stiklelius reikėtų dehidratuoti, panardinant į absoliutųjį etanolį ne trumpiau kaip 5 min, palikti džiūti ir laikyti kambario temperatūroje arba sudėti į talpyklą ir laikyti šaldytuve iki vertinimo pradžios.
                     
                        Matavimo metodai
                     
                     Kometas reikėtų vertinti kiekybiškai, naudojant automatizuotą ar pusiau automatizuotą vaizdo analizės sistemą. Objektiniai stikleliai dažomi tinkamu fluorescenciniu dažu, pvz., SYBR Gold, Green I, propidiumo jodidu ar etidiumo bromidu ir stebimi esant tinkamam didinimui (pvz., 200×) per epifluorescencinį mikroskopą, turintį reikiamus detektorius ar skaitmeninį (pvz., CCD) fotoaparatą.
                     Ląsteles galima suskirstyti į tris kategorijas, kaip aprašyta kometų vaizdų atlase (57), t. y. skaičiuojamas, neskaičiuojamas ir „ląsteles vaiduoklius“ (aptarimas pateiktas 56 pastraipoje). Siekiant išvengti artefaktų, vertinamos tik skaičiuojamos ląstelės (su aiškiai apibrėžta galva bei uodega ir be kaimyninių ląstelių trukdžių) uodegos DNR procentinei daliai nustatyti. Ataskaitoje nebūtina nurodyti neskaičiuojamų ląstelių dažnumą. Ląstelių vaiduoklių dažnumas turėtų būti nustatytas pagal vizualų 150 ląstelių vienam ėminiui vertinimą (nes aiškiai apibrėžtos galvos nebuvimas reikštų, kad jas būtų nelengva aptikti vaizdo analizės metodu) (aptarimas pateiktas 56 pastraipoje) ir dokumentuotas atskirai.
                     Visi objektiniai stikleliai, įskaitant teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių, turėtų būti atskirai koduojami ir vertinami „aklai“, kad skaičiuotojas nežinotų apdorojimo sąlygų. Reikėtų analizuoti ne mažiau kaip kiekvieno ėminio (vienam audiniui ir vienam gyvūnui) 150 ląstelių (išskyrus ląsteles vaiduoklius, žr. 56 pastraipa). Vertinant ne mažiau kaip 5 gyvūnus (vienalaikio teigiamo kontrolinio ėminio gyvūnų yra mažiau, žr. 29 pastraipą) vienai dozei ir 150 ląstelių vienam gyvūnui, gaunama pakankama statistinė galia pagal Smith et al., 2008 analizę (5). Jei naudojami objektiniai stikleliai, vienam ėminiui galėtų būti vertinami 2–3 stikleliai, kai kiekvieną grupę sudaro penki gyvūnai. Reikėtų apžiūrėti kelias objektinio stiklelio zonas, kuriose yra toks tankis, kuris užtikrina, kad nebūtų uodegų sanklotos. Reikėtų vengti ląsteles vertinti objektinių stiklelių kraštuose.
                     Atliekant kometų bandymą, DNR gijų trūkius galima matuoti pagal nepriklausomas vertinamąsias baigtis, pvz., uodegos DNR procentinę dalį, uodegos ilgį ir uodegos momentą. Galima matuoti visus tris parametrus, jei naudojama tinkama vaizdo analizės sistemos programinė įranga. Tačiau rekomenduojama naudoti uodegos DNR procentinę dalį (taip pat vadinamą uodegos intensyvumo %) rezultatams įvertinti ir aiškinti (12) (40) (41) (42), ir ji nustatoma pagal DNR fragmento intensyvumą uodegoje, išreikštą kaip viso ląstelės intensyvumo procentinė dalis (13).
                     
                        Audinių pažeidimas ir citotoksiškumas
                     
                     Teigiami kometų bandymo rezultatai gali būti gauti ne vien tik dėl genotoksiškumo, nes DNR migracija gali padidėti ir dėl toksiškumo tiksliniam audiniui (12) (41). Ir atvirkščiai, žinomoms genotoksinėms medžiagoms dažnai stebimas mažas arba vidutinis citotoksiškumas (12), ir tai rodo, kad vien tik pagal kometų bandymą neįmanoma atskirti genotoksiškumo ir citotoksiškumo sukeltos DNR migracijos. Tačiau jei stebimas DNR migracijos padidėjimas, rekomenduojama ištirti vieną ar kelis citotoksiškumo rodiklius, nes tai palengvintų aiškinti rezultatus. DNR migracijos padidėjimą esant aiškiems citotoksiškumo požymiams reikėtų aiškinti atsargiai.
                     Pasiūlyta daug citotoksiškumo matavimo kriterijų ir iš jų, kaip tinkamas citotoksiškumo audiniams kriterijus, buvo pasiūlyti histopatologiniai pokyčiai. Stebėjimų rezultatai, pvz., uždegimas, ląstelių infiltracija, apoptoziniai ar nekroziniai pokyčiai, buvo susiję su padidėjusia DNR migracija, tačiau, kaip matyti iš JaCVAM tinkamumo patvirtinimo tyrimo (12), negalima pateikti galutinio histopatologinių pokyčių, kurie yra visada susiję su padidėjusia DNR migracija, sąrašo. Naudingos informacijos apie audinių pažeidimą galima gauti iš klinikinės biochemijos tyrimų (pvz., AST, ALT), ir galima taip pat atsižvelgti į papildomus rodiklius, pvz., kaspazių aktyvinimą, apoptozės aptikimą TUNEL metodu, Annexin V dažymu ir kt. Tačiau yra paskelbta mažai duomenų apie tai, kad pastarieji metodai buvo taikomi atliekant tyrimus in vivo, o kai kurie gali būti mažiau patikimi nei kiti.
                     Ląstelės vaiduokliai (arba debesys) yra ląstelės, kurių mikroskopinį vaizdą sudaro maža galva ar jos apskritai nėra ir didelės pasklidosios uodegos, ir kurios laikomos stipriai pažeistomis ląstelėmis, nors ląstelių vaiduoklių etiologija nėra aiški (žr. 3 priedėlį). Uodegos DNR procentinės dalies matavimai vaizdo analizės metodu yra nepatikimi dėl ląstelių vaiduoklių išvaizdos, todėl ląstelės vaiduokliai turėtų būti įvertintos atskirai. Ląstelių vaiduoklių buvimas turėtų būti pažymėtas ir pateiktas ataskaitoje, o kiekvienas reikšmingas jų kiekio padidėjimas, kurį būtų galima susieti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti ištirtas ir išsamiai paaiškintas. Žinios apie bandomųjų cheminių medžiagų galimą veikimo būdą gali padėti tiriant šiuos aspektus.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     Gyvūnas yra bandymo vienetas, todėl atskirų gyvūnų duomenys ir apibendrinti rezultatai turėtų būti pateikti lentelių pavidalu. Dėl hierarchinės duomenų prigimties rekomenduojama, kad kiekvienam objektiniam stikleliui būtų nustatyta uodegos DNR procentinės dalies mediana ir kiekvienam gyvūnui būtų apskaičiuotas medianinių verčių vidurkis (12). Nustatomi atskiriems gyvūnams gauti vidurkiai, kad būtų gautas grupės vidurkis. Visos šios vertės turėtų būti įtrauktos į ataskaitą. Galima taikyti alternatyvius metodus (žr. 53 pastraipą), jei jie būtų pagrįsti moksliniu ir statistiniu požiūriu. Statistinę analizę galima atlikti taikant įvairius metodus (58) (59) (60) (61). Kaip aptarta pirmiau pateiktose nuorodose, renkantis taikomus statistinius metodus, reikėtų atsižvelgti į duomenų transformacijos poreikį (pvz., logaritminės arba kvadratinės šaknies) ir (arba) į poreikį pridėti mažą skaičių (pvz., 0,001) prie visų (net ne nulio) verčių, kad būtų sušvelnintas ląstelių nulinių verčių poveikis. Išsami informacija apie apdorojimo ir lyčių sąveiką, kai naudojami abiejų lyčių gyvūnai, ir apie vėliau atliekamą duomenų analizę, nustačius skirtumus ar jų nenustačius, pateikta 2 priedėlyje. Ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti toksiškumo ir klinikinių požymių duomenis.
                     
                        Priimtinumo kriterijai
                     
                     Bandymo priimtinumas pagrįstas šiais kriterijais:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 vienalaikis neigiamas kontrolinis ėminys laikomas tinkamu įtraukti į laboratorijos istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazę, kaip aprašyta 16 pastraipoje;
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 vienalaikiai teigiami kontroliniai ėminiai (žr. 29 pastraipą) turėtų sukelti atsakus, kurie yra suderinami su rastais istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenų bazėje, ir duoti statistiškai reikšmingą padidėjimą palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 analizuojamas pakankamas ląstelių ir dozių verčių skaičius (52 ir 36–38 pastraipos).
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 didžiausios dozės pasirinkimo kriterijai atitinka aprašytus 36 pastraipoje.
                              
                           
                        Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas
                     
                     Kai įvykdyti visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai teigiama, jei:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 bent vienai bandymo dozei gaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu;
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 padidėjimas yra susijęs su doze, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų;
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 kuris nors iš rezultatų yra už tam tikrai rūšiai, nešikliui, davimo būdui, audiniui ir davimų skaičiui gautų istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų;
                              
                           Atitinkant visus šiuos kriterijus, laikoma, kad bandomoji cheminė medžiaga gali sukelti šioje bandymų sistemoje tirtų audinių DNR gijų trūkius. Jei yra tik vieno ar dviejų kriterijų atitiktis, žr. 62 pastraipą.
                     Kai įvykdyti visi priimtinumo kriterijai, bandomoji cheminė medžiaga laikoma aiškiai neigiama, jei:
                     
                                 a.
                              
                              
                                 jokiai bandymo koncentracijai negaunamas statistiškai reikšmingas padidėjimas palyginti su vienalaikiu neigiamu kontroliniu ėminiu,
                              
                           
                                 b.
                              
                              
                                 nėra su koncentracija susijusio padidėjimo, kai įvertinama pagal atitinkamą tendencijos kriterijų,
                              
                           
                                 c.
                              
                              
                                 visi rezultatai patenka tarp tam tikrai rūšiai, nešikliui, davimo būdui, audiniui ir davimų skaičiui gautų istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenų skirstinio ribų;
                              
                           
                                 d.
                              
                              
                                 pateikti tikslinio (-ų) audinio (-ų) paveikimą patvirtinantys tiesioginiai ar netiesioginiai įrodymai.
                              
                           Laikoma, kad ši bandomoji cheminė medžiaga negali sukelti šioje bandymų sistemoje tirtų audinių DNR gijų trūkių.
                     Nėra reikalavimo patikrinti aiškų teigiamą ar neigiamą atsaką.
                     Jei atsakas nėra aiškiai neigiamas ar aiškiai teigiamas (t. y. atitinka ne visus 59 ar 60 pastraipoje išvardytus kriterijus), ir siekiant padėti nustatyti rezultato biologinę svarbą, duomenys turėtų būti įvertinti pateikiant ekspertų nuomonę ir (arba) atliekant papildomus tyrimus, jei jie būtų moksliškai pagrįsti. Galėtų būti naudingas papildomų ląstelių skaičiavimas (jei tinka) arba kartotinis bandymas galbūt optimizuotomis bandymo sąlygomis (pvz., kiti tarpai tarp dozės verčių, kiti davimo būdai, kitas ėminių ėmimo laikas arba kiti audiniai).
                     Retais atvejais, netgi atlikus papildomus tyrimus, gautų duomenų rinkinio nepakaks padaryti išvadą, ar rezultatai teigiami ar neigiami, todėl bus priimtas sprendimas, kad atsakas yra dviprasmis.
                     Siekiant įvertinti teigiamo ar dviprasmio rezultato biologinę svarbą, reikia turėti informacijos apie citotoksiškumą tiksliniam audiniui (žr. 54–55 pastraipas). Jei teigiami ar dviprasmiai rezultatai stebimi tik esant aiškiems citotoksiškumo įrodymams, būtų daroma išvada, kad tyrimas dviprasmis dėl genotoksiškumo, nebent būtų informacijos, kurios pakaktų galutinei išvadai patvirtinti. Jei neigiamas tyrimo rezultatas gautas tokiomis aplinkybėmis, kai visoms bandytoms dozėms yra toksiškumo požymių, gal būtų naudinga atlikti papildomą tyrimą esant netoksinėms dozėms.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kilmė, partijos numeris, jei yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, galiojimo pabaigos data arba pakartotinės analizės data, jei žinoma.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vienkomponentė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             kuo išsamesnis sudedamųjų dalių cheminis pavadinimas (žr. pirmiau), kiekybinis paplitimas ir būdingos fizikinės ir cheminės savybės.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Tirpiklis ar nešiklis:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             tirpiklio ir (arba) nešiklio pasirinkimo pagrindimas,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos tirpumas tirpiklyje ar nešiklyje ir stabilumas, jei yra žinomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dozių receptūros ruošimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             preparatų analizinis nustatymas (pvz., stabilumo, vienalytiškumo, nominalių koncentracijos verčių).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo gyvūnai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             rūšis ir (arba) veislė, jų pasirinkimo mokslinis ir etinis pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras, pagerintos aplinkos sąlygos ir kt.,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje, įskaitant kūno masės intervalą, vidurkį ir standartinį nuokrypį.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių (tirpiklio ir (arba) nešiklio) duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             intervalo nustatymo tyrimo, jei atliekamas, rezultatai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos paruošimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pagrindinė priežastis, nulėmusi davimo būdo pasirinkimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             injekcijos vieta (atliekant poodinio ar intraveninio davimo tyrimus);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ėminių paruošimo metodai, jei yra, histopatologinė analizė, ypač jei cheminei medžiagai gautas teigiamas kometų bandymo atsakas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             audinio pasirinkimo pagrindimas,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metodai, kuriais patikrinama, ar bandomoji cheminė medžiaga pateko į tikslinį audinį arba į kraujotakos sistemą, jei gauti neigiami rezultatai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             faktinė dozė (mg/kg kūno masės per parą), apskaičiuota pagal bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją pašaruose ir (arba) geriamajame vandenyje (ppm) ir suvartojimą, jei tinka;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsamus apdorojimo ir ėminių ėmimo tvarkaraščio aprašymas, pasirinkimo pagrindimas (pvz., toksikokinetiniai duomenys, jei yra);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nuskausminimo metodas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             numarinimo metodas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             audinių atskyrimo ir konservavimo procedūros;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pavienių ląstelių ar branduolių suspensijų paruošimo metodai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų reagentų šaltinis ir partijų numeriai (jei įmanoma);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             citotoksiškumo įvertinimo metodai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             elektroforezės sąlygos;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikyti dažymo metodai ir
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kometų skaičiavimo ir matavimo metodai.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Bendrieji kiekvieno gyvūno klinikiniai stebėjimai, jei buvo atliekami, prieš bandymą ir visą bandymo laikotarpį;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             citotoksiškumo duomenys, jei yra;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             atliekant ilgesnius nei savaitės trukmės bandymus: kiekvieno gyvūno masė bandymo eigoje, įskaitant kiekvienos grupės kūno masės intervalą, vidurkį ir standartinį nuokrypį, pašaro suvartojimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dozės ir atsako priklausomybė, jei ji yra akivaizdi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienam audiniui ir (arba) gyvūnui gauta uodegos DNR procentinės dalis (arba kiti matai, jei būtų pasirinkti), vieno objektinio stiklelio medianinės vertės, vidutinės vertės gyvūnui ir vidutinės vertės grupei;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvieno įvertinto audinio vienalaikių ir istorinių neigiamų kontrolinių ėminių duomenys, nurodant intervalus, vidurkius ir (arba) medianas ir standartinius nuokrypius;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vienalaikių ir istorinių teigiamų kontrolinių ėminių duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             audinių, išskyrus kepenis, dozės ir atsako priklausomybės kreivė, gauta teigiamam kontroliniam ėminiui. Ji gali būti gauta pagal duomenis, surinktus atliekant kvalifikacijos įrodymo bandymus (žr. 16–17 pastraipas), kurie, taikant nuorodą į dabartinius literatūros šaltinius, pagrįstų tam audiniui gautų atsakų dydį ir sklaidą kontrolinių ėminių atžvilgiu;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             statistinės analizės duomenys ir taikyti metodai; atsako vertinimo kaip teigiamo, neigiamo ar dviprasmio kriterijai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ląstelių vaiduoklių dažnumas kiekvienoje grupėje ir kiekvienam gyvūnui.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatų aptarimas
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Išvada
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nuorodos
                                 
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Kirkland, D., G. Speit (2008), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens III. Appropriate follow-up testing in vivo, Mutation Research, Vol. 654/2, pp. 114-32.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S. et al. (2005), The in vivo Comet assay: use and status in genotoxicity testing, Mutagenesis, Vol. 20/4, pp. 245-54.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Burlinson, B. (2012), The in vitro and in vivo Comet assays, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 143-63.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Smith, C.C. et al. (2008), Recommendations for design of the rat Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 233-40.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/1, pp. 45-51.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 McKelvey-Martin, V.J. et al. (1993), The single cell gel electrophoresis assay (Comet assay): a European review, Mutation Research, Vol. 288/1, pp. 47-63.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (2000), Single cell gel/Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 206-21.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Singh, N.P. et al. (1988), A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells, Experimental Cell Research, Vol. 175/1, pp. 184-91.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2010), Collaborative study on fifteen compounds in the rat-liver Comet assay integrated into 2- and 4-week repeat-dose studies, Mutation Research, Vol., 702/1, pp. 40-69.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Olive, P.L., J.P. Banath, R.E. Durand (1990), Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the „Comet“ assay, Radiation Research, Vol. 122/1, pp. 86-94.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Tice, R.R., G.H. Strauss (1995), The single cell gel electrophoresis/Comet assay: a potential tool for detecting radiation-induced DNA damage in humans, Stem Cells, Vol. 13/1, pp. 207-14.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Collins, A.R (2004), The Comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations, Molecular Biotechnology, Vol. 26/3, pp. 249-61.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-20.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kushwaha, S. et al. (2010), Evaluation of multi-organ DNA damage by Comet assay from 28 days repeated dose oral toxicity test in mice: A practical approach for test integration in regulatory toxicity testing, Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 58/1, pp. 145–54.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Vasquez, M.Z. (2010), Combining the in vivo Comet and micronucleus assays: a practical approach to genotoxicity testing and data interpretation, 
                                       Mutagenesis
                                    
                                    , Vol. 25/2, pp. 187-99.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Bowen, D.E. (2011), Evaluation of a multi-endpoint assay in rats, combining the bone-marrow micronucleus test, the Comet assay and the flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, Mutation Research, Vol. 722/1, pp. 7-19.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Recio, L. et al. (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, The Journal of Toxicological Science, Vol. 35/2, pp. 149-62.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 O'Donovan, M., B. Burlinson (2013), Maximum dose levels for the rodent comet assay to examine damage at the site of contact or to the gastrointestinal tract, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 621-3.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Hartmann, A. (2004), Use of the alkaline
                                    
                                       in vivo
                                    
                                    Comet assay for mechanistic genotoxicity investigations,
                                    Mutagenesis, Vol. 19/1, pp. 51-9.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Nesslany, F. (2007), In vivo Comet assay on isolated kidney cells to distinguish genotoxic carcinogens from epigenetic carcinogens or cytotoxic compounds, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 630/1, pp. 28-41.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S.Y., B.A. Herbold (1997), A new method for the enrichment of single renal proximal tubular cells and their first use in the Comet assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis,Vol. 393/1-2, pp. 175-8.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Toyoizumi, T. et al. (2011), Use of the in vivo skin Comet assay to evaluate the DNA-damaging potential of chemicals applied to the skin, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 726/2, pp. 175-80.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Struwe, M. et al. (2008), Detection of photogenotoxicity in skin and eye in rat with the photo Comet assay, Photochemical and Photobiological Sciences, Vol. 7/2, pp. 240-9.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Wada, K. et al. (2012), A comparison of cell-collecting methods for the Comet assay in urinary bladders of rats, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 742/1-2, pp. 26-30.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 Wang, A. et al. (2007), Measurement of DNA damage in rat urinary bladder transitional cells: improved selective harvest of transitional cells and detailed Comet assay protocols, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/ 1-2, pp. 51-9.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), In Vivo Comet Assay Workgroup, part of the Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing. Fourth International Workgroup on Genotoxicity testing: results of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Jackson, P. et al. (2012), Pulmonary exposure to carbon black by inhalation or instillation in pregnant mice: effects on liver DNA strand breaks in dams and offspring, Nanotoxicology, Vol. 6/5, pp. 486-500.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Sasaki, Y.F. et al. (2000), The comet assay with multiple mouse organs: comparison of Comet assay results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from the IARC monographs and U.S. NTP Carcinogenicity Database, Critical Reviews in Toxicology, Vol. 30/6, pp. 629-799.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Sekihashi, K. et al. (2002), Comparative investigations of multiple organs of mice and rats in the Comet assay, Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 53-74.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Speit, G, M. Vasquez, A. Hartmann (2009), The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity,
                                    Mutation Research, Vol. 681/1, pp. 3-12.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Zheng, H., P.L. Olive (1997), Influence of oxygen on radiation-induced DNA damage in testicular cells of C3H mice, International Journal of Radiation Biology, Vol. 71/3, pp. 275-282.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Cordelli, E. et al. (2003), Evaluation of DNA damage in different stages of mouse spermatogenesis after testicular X irradiation, Journal of Radiation Research, Vol. 160/4, pp. 443-451.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Merk, O., G. Speit (1999), Detection of crosslinks with the Comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 33/2, pp. 167-72.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Pfuhler, S., H.U. Wolf (1996), Detection of DNA-crosslinking agents with the alkaline Comet assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 196-201.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Wu, J.H., N.J. Jones (2012), Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline Comet assay, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 165-81.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Spanswick, V.J., J.M. Hartley, J.A. Hartley (2010), Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay,
                                    Methods in Molecular Biology, Vol. 613, pp. 267-282.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S., A.N. Jha (2006), Reliable Comet assay measurements for detecting DNA damage induced by ionizing radiation and chemicals, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 605(1-2), pp. 7-16.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol.627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S. et al. (2009), Comet Assay measurements: a perspective, Cell Biology and Toxicology, Vol. 25/1, pp. 53-64.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Ersson, C., L. Möller (2011), The effects on DNA migration of altering parameters in the Comet assay protocol such as agarose density, electrophoresis conditions and durations of the enzyme or the alkaline treatments, Mutagenesis, Vol. 26/6, pp. 689-95.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Møller, P. et al. (2010), Assessment and reduction of Comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 109-11.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Forchhammer, L. et al. (2010), Variation in the measurement of DNA damage by Comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 113-23.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Azqueta, A. et al. (2011), Towards a more reliable comet assay: Optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions, Mutation Research, Vol. 724/1-2, pp. 41-45.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, John Wiley and Sons, New York 2nd ed.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Appendix A of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS No. 123)
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 Šio priedo B.8 skyrius. Poūmis toksiškumas įkvėpus. 28 dienų tyrimas.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 Šio priedo B.29 skyrius. Pusiau lėtinis toksiškumas įkvėpus. 90 dienų tyrimas.
                              
                           
                                 (52)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1984), Transient DNA lesions induced by benzo[a]pyrene in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 140/2-3, pp. 141-45.
                              
                           
                                 (53)
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1990), The role of excision repair in the removal of transient benzo[a]pyrene-induced DNA lesions in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 236/1, pp. 35-41.
                              
                           
                                 (54)
                              
                              
                                 OECD (2002), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (55)
                              
                              
                                 Nakajima, M. (2012), Tissue sample preparation for in vivo rodent alkaline Comet assay, Genes and Environment, Vol. 34/1, pp. 50-4.
                              
                           
                                 (56)
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol.18/1, pp.45–51.
                              
                           
                                 (57)
                              
                              
                                 Atlas of Comet Assay Images, Scientist Press Co., Ltd., Tokyo, Japan.
                              
                           
                                 (58)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., G. Thomas, R. Dubow (1999), Issues related to the experimental design and subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro Comet studies, Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis, Vol. 19/2, pp. 109-19.
                              
                           
                                 (59)
                              
                              
                                 Wiklund, S.J., E. Agurell (2003), Aspects of design and statistical analysis in the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 167-75.
                              
                           
                                 (60)
                              
                              
                                 Bright, J. et al. (2011), Recommendations on the statistical analysis of the Comet assay, Pharmaceutical Statistics, Vol. 10/6, pp. 485-93.
                              
                           
                                 (61)
                              
                              
                                 Lovell, D.P., T. Omori (2008), Statistical issues in the use of the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 171-82.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        TERMINŲ APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Pavienių ląstelių gelio elektroforezė šarminėmis sąlygomis
                           – jautrus metodas pirminėms DNR pažaidoms aptikti atskirų ląstelių ar branduolių lygiu.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Kometa
                           – forma, kurią įgauna elektroforezės lauko veikiamas nukleotidas, pavadinta dėl savo panašumo į kometas: galva yra branduolys, o uodegą sudaro DNR, migruojanti iš branduolio elektriniame lauke.
                        
                           
                              Kritinis kintamasis ar parametras
                           – protokolo kintamasis, kurio mažas pokytis gali daryti didelę įtaką bandymo išvadai. Kritiniai kintamieji gali būti audiniui būdingi kintamieji. Kritinių kintamųjų nereikėtų keisti, ypač vieno bandymo metu, neatsižvelgus į tai, kaip pakeitimas paveiks bandymo atsaką, pvz., kaip rodo teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių atsako dydis ir kintamumas. Bandymo ataskaitoje turėtų būti išvardyti kritinių kintamųjų pakeitimai, padaryti bandymo metu, arba palyginti su standartiniu laboratorijos protokolu, ir pateiktas kiekvieno pakeitimo pagrindimas.
                        
                           
                              Uodegos intensyvumas arba uodegos procentinė DNR dalis
                           – atitinka kometos uodegos fluorescencijos intensyvumą palyginti su suminiu intensyvumu (galvos ir uodegos). Šis parametras rodo DNR trūkių mastą, išreikštą procentais.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              UVCB
                           – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           FAKTORINĖS ANALIZĖS SCHEMA LYČIŲ SKIRTUMAMS NUSTATYTI ATLIEKANT KOMETŲ BANDYMĄ IN VIVO
                           
                        
                        
                           Faktorinės analizės schema ir jos taikymas
                        
                        Pagal šią schemą kiekvienai koncentracijos vertei bandomi ne mažiau kaip 5 patinai ir 5 patelės, iš viso pagal schemą naudojant ne mažiau kaip 40 gyvūnų (20 patinų ir 20 patelių ir dar atitinkami teigiami kontroliniai ėminiai).
                        Schema, kuri yra viena iš paprastesnių faktorinės analizės schemų, atitinka dvifaktorinės dispersinės analizės schemą, kurios pagrindiniai veiksniai yra lytis ir koncentracijos vertė. Duomenis galima analizuoti naudojant daug standartinių statistinės programinės įrangos rinkinių, pvz., SPSS, SAS, STATA, Genstat taip pat naudojant programavimo kalbą R.
                        Atliekant analizę, duomenų rinkinio kintamumas perdalijamas į kintamumą tarp lyčių, tarp koncentracijos verčių ir į kintamumą, susijusį su sąveika tarp lyčių ir koncentracijos verčių. Kiekvienas iš narių tikrinamas tos pačios lyties kartotinių gyvūnų kintamumo grupių viduje įverčio atžvilgiu, esant vienodai koncentracijai. Išsami informacija apie bazinę metodiką pateikta daugelyje standartinių statistinių vadovėlių (žr. nuorodas) ir su statistiniais rinkiniais pateikiamose pagalbinėse priemonėse.
                        Analizė tęsiama tikrinant ANOVA lentelės x lyties ir koncentracijos sąveikos narį (35). Nesant reikšmingo sąveikos nario, lytims ar koncentracijos vertėms gautos jungtinės vertės duoda patikimus statistinius kriterijus tarp koncentracijos verčių, pagrįstus grupės jungtiniu ANOVA kintamumo nariu.
                        Atliekant analizę toliau, kintamumo tarp koncentracijos verčių įvertis dalijamas į kontrastus, taip gaunamas atsakų pagal koncentracijos vertes tiesinių ir kvadratinių kontrastų kriterijus. Kai yra reikšminga x lyties ir koncentracijos sąveika, šį narį taip pat galima padalyti į tiesinius x lyties ir kvadratinius x lyties sąveikos kontrastus. Šie nariai pateikia kriterijus, ar abiejų lyčių atsakas į koncentraciją yra lygiagretus, ar abiejų lyčių atsakas yra skirtuminis.
                        Grupės jungtinio kintamumo įvertis gali būti naudojamas skirtumų tarp vidurkių poriniams kriterijams gauti. Galima lyginti abiejų lyčių vidurkius ir skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius, pvz., palyginimui su neigiamų kontrolinių ėminių vidurkiais. Jei sąveika yra reikšminga, galima lyginti vienos lyties skirtingoms koncentracijos vertėms gautus vidurkius ir vienos koncentracijos lytims gautus vidurkius.
                        
                           Nuorodos
                        
                        Yra daug statistikos vadovėlių, kuriuose aptariama faktorinės analizės schemų, nuo paprasčiausios dvifaktorinės analizės iki bandymų planavimo metodikoje naudojamų sudėtingesnių formų, teorija, projektavimas, metodika, analizė ir aiškinimas. Toliau pateikiamas sąrašas nėra išsamus. Kai kuriose knygose pateikiami palyginamųjų schemų pavyzdžiai su skaičiavimais, kartais su kompiuterine programa analizei atlikti naudojant įvairius programinės įrangos rinkinius.
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987) Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007) Analysis of Variance and Covariance: How to choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990) The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997) Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971) Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009) Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           DABARTINIAI BANDYMO APRIBOJIMAI
                        
                        Atsižvelgiant į šiuo metu turimas žinias, keli apribojimai yra susiję su kometų bandymu in vivo. Tikimasi, kad šie apribojimai bus sumažinti arba tiksliau apibrėžti, kai bus daugiau bandymo taikymo patirties, kad būtų išspręstos su reglamentavimu susijusios saugos problemos.
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Kai kurių tipų DNR pažaidos gali būti trumpalaikės, t. y. gali būti pataisytos per greitai, kad jas būtų galima stebėti 24 h po paskutinės dozės arba vėliau. Nėra nustatyto trumpalaikių pažaidų tipų ar cheminių medžiagų, kurios gali sukelti šio tipo pažaidas, sąrašo, ir nėra žinoma, kiek būna laiko šio tipo pažaidoms aptikti. Optimalus ėminių ėmimo laikas (-ai) taip pat gali būti susijęs (-ę) su chemine medžiaga ar davimo būdu, ir ėminių ėmimo laikai turėtų būti nustatyti pagal kinetinius duomenis (pvz., pagal laiką Tmax, kuriuo pasiekiama didžiausia koncentracija plazmoje ar audinyje), kai tokių duomenų yra. Daugumoje tinkamumo patvirtinimo tyrimų šiam bandymų metodui pagrįsti nurodoma, kad skrodimą reikia atlikti praėjus 2–3 h po paskutinės dozės davimo. Daugumoje literatūroje paskelbtų tyrimų nurodoma, kad nuo paskutinės dozės davimo iki numarinimo turėtų praeiti nuo 2 iki 6 h. Todėl, atsižvelgiant į šią patirtį, buvo pateikta bandymo metodo rekomendacija, kad paskutinė dozė turėtų būti duota tam tikru momentu 2–6 h laikotarpiu iki skrodimo, jei nėra tam prieštaraujančių duomenų.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Nėra nustatytų tyrimų duomenų, kurie tirtų bandymo jautrį trumpalaikėms DNR pažaidoms aptikti po davimo su pašaru ar geriamuoju vandeniu palyginti su davimu per zondą. DNR pažaidos buvo aptiktos, davus su pašaru ir geriamuoju vandeniu, tačiau tokių pranešimų yra mažai, palyginti su daug didesne patirtimi duodant per zondą ar darant injekciją į pilvo ertmę. Taigi bandymo jautris gali būti mažesnis tiriant trumpalaikes pažaidas sukeliančias chemines medžiagas, kurios duodamos su pašaru ar geriamuoju vandeniu.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Buvo atlikti tik kepenų ir skrandžio audinių tarplaboratoriniai tyrimai, todėl nėra parengta jokia rekomendacija, kaip kitiems nei kepenys audiniams gauti jautrų ir atkuriamą atsaką, kuris atitiktų tikėtinus teigiamų ir neigiamų kontrolinių ėminių intervalus. Negalėjo būti pasiektas susitarimas dėl kepenims naudojamo neigiamo kontrolinio ėminio vertės apatinės ribos nustatymo.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Nors yra keletas leidinių, kuriuose parodoma, kad citotoksiškumas in vitro yra trukdantis veiksnys, yra paskelbta labai mažai duomenų in vivo, todėl negalima rekomenduoti jokio citotoksiškumo mato. Histopatologiniai pokyčiai, pvz., uždegimas, ląstelių infiltracija, apoptoziniai ar nekroziniai pokyčiai, susiję su padidėjusia DNR migracija, tačiau, kaip matyti iš JaCVAM tinkamumo patvirtinimo tyrimo (EBPO, 2014 m.), šiems pokyčiams ne visada gaunami teigiami kometų bandymo rezultatai, todėl negalima pateikti galutinio histopatologinių pokyčių, kurie yra visada susiję su padidėjusia DNR migracija, sąrašo. Ląstelės vaiduokliai (arba debesys) anksčiau buvo siūlomos kaip citotoksiškumo rodiklis, tačiau jų etiologija neaiški. Yra duomenų, kurie rodytų, kad jos gali atsirasti dėl su chemine medžiaga susijusio citotoksiškumo, mechaninės ar fermento sukeltos pažaidos, pradėtos ruošiant ėminį (Guerard et al., 2014), ir (arba) dėl bandomosios cheminės medžiagos genotoksiškumo stipresnio poveikio. Kiti duomenys rodo, kad jos yra susijusios su labai didele, bet galbūt pataisoma DNR pažaida (Lorenzo et al., 2013).
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Audiniai arba ląstelių branduoliai buvo sėkmingai užšaldyti, kad analizė galėtų būti atlikta vėliau. Dėl to paprastai gaunamas išmatuojamas poveikis nešiklio ir teigiamo kontrolinio ėminio atsakui (Recio et al., 2010; Recio et al., 2012; Jackson et al., 2013). Jei prireiktų taikyti užšaldymo metodikas, laboratorija turėtų įrodyti kompetenciją tai daryti, patvirtinti nešikliu apdorotų gyvūnų tikslinių audinių priimtinus uodegos DNR procentinės dalies mažus intervalus ir galimybę vis dar aptikti teigiamus atsakus. Literatūroje yra aprašytas audinių užšaldymas taikant skirtingus metodus. Tačiau šiuo metu nėra susitarta dėl geriausio audinių užšaldymo ir atšildymo būdo ir dėl to, kaip įvertinti, ar galbūt pakitęs atsakas gali turėti įtakos bandymo jautriui.
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Naujausi darbai rodo, kad kritinių kintamųjų sąrašas turėtų toliau trumpėti, o kritinių kintamųjų parametrai turėtų būti apibrėžti tiksliau (Guerard et al., 2014).
                                 
                              
                           Nuorodos
                        
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Guerard, M., C. Marchand, U. Plappert-Helbig (2014), Influence of Experimental Conditions on Data Variability in the Liver Comet Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 55/2, pp. 114-21.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Jackson, P. et al. (2013), Validation of use of frozen tissues in high-throughput comet assay with fully-automatic scoring, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 699-707.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Lorenzo,Y. et al. (2013), The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead, Mutagenesis, Vol. 28/4, pp. 427-32.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Recio L, Hobbs C, Caspary W, Witt KL, (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, J. Toxicol. Sci. 35:149-62.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Recio, L. et al. (2012), Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 53/2, pp. 101-13.
                                 
                              “
               
                     16)
                  
                  
                     C dalies C.13 skyrius pakeičiamas taip:
                     „C.13   Biologinis kaupimasis žuvyse. Veikimo per vandeninę terpę metodas ir mitybos bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 305 (2012). Šios bandymų metodo peržiūros pagrindinis tikslas yra dvejopas. Pirma, numatyta įtraukti biologinio kaupimosi per maistą (36) bandymą, kuris tiktų labai mažai tirpių vandenyje medžiagų biologinio kaupimosi gebai nustatyti. Antra, numatyta sukurti bandymų metodą, kuriame dėl gyvūnų gerovės priežasčių būtų naudojama mažiau žuvų, jei tinka, ir kuris būtų ekonomiškai efektyvesnis.
                     Per metus, praėjusius nuo konsoliduoto bandymų metodo C.13 (1) priėmimo, buvo išbandyta daug medžiagų ir laboratorijos bei priežiūros institucijos įgijo nemažą patirtį. Tai padėjo įsitikinti, kad bandymo sudėtingumą galima sumažinti, jei būtų įvykdyti specifiniai kriterijai (žr. 88 pastraipą), ir kad galimas nuosekliųjų bandymų metodas. Patirtis taip pat parodė, kad biologiniai veiksniai, pvz., augimas bei žuvų lipidų kiekis, gali daryti didelę įtaką rezultatams ir į juos gali tekti atsižvelgti. Be to, buvo pripažinta, kad vandenyje labai mažai tirpių medžiagų bandymus gali būti techniškai neįmanoma atlikti. Be to, jei medžiagos labai mažai tirpsta vandeninėje terpėje, veikimo per vandeninę terpę metodas gali būti ne toks svarbus, palyginti su mitybos bandymu. Taip buvo sukurtas bandymų metodas, kurį atliekant žuvys paveikiamos per jų maistą (žr. 7–14 pastraipas ir nuo 97 pastraipos). Mitybos tinkamumo patvirtinimo bandymas (tarplaboratorinis bandymas) buvo atliktas 2010 m. (51).
                     Pagrindinius pakeitimus sudaro:
                     
                                 —
                              
                              
                                 jei yra tikimybė, kad biologinio koncentravimo faktorius (BCF) nepriklauso nuo bandymo koncentracijos, galima manyti, kad pakaktų bandyti tik vieną bandymo koncentraciją.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 veikimo per vandeninę terpę supaprastinto bandymo schema, pagal kurią įmanomas mažesnis ėminių ėmimo taškų skaičius, jei yra atitiktis specifiniams kriterijams;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 reikėtų išmatuoti žuvų lipidų kiekį, kad BCF būtų galima išreikšti pagal 5 % lipidų kiekį.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 didesnis dėmesys kreipiamas kinetinio BCF įvertinimui (kai įmanoma) kartu su nuostoviosios būsenos BCF įvertinimu;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tam tikrų medžiagų grupėms bus siūlomas mitybos bandymas, jei manoma, kad jis tiktų labiau nei veikimo per vandeninę terpę bandymas.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 reikėtų matuoti žuvų masę, kad būtų galima daryti BCFk pataisą atsižvelgiant į praskiedimą dėl augimo.
                              
                           Prieš atliekant bet kurį iš biologinio kaupimosi bandymų, reikėtų turėti šią informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 analizės metodo, taikomo matuojant bandomosios cheminės medžiagos ir jos galimų metabolitų koncentraciją audinyje, vandenyje ar maiste, jautrį (žr. 65 pastraipą);
                              
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 tirpumą vandenyje [TM A.6; (2)]; jį reikėtų nustatyti taikant metodą, kuris atitinka (įvertintą) tirpumo intervalą, kad būtų gauta patikima vertė. Hidrofobinėms cheminėms medžiagoms tiktų kolonėlės eliuavimo metodas.
                              
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą, K
                                    OW
                                     (37) [TM A.8 (4), A.24 (5), A.23 (6)]; arba kitą tinkamą informaciją apie pasiskirstymo charakteristikas (pvz., sorbciją lipidais, K
                                    OC); šį koeficientą reikėtų nustatyti taikant metodą, kuris atitinka (įvertintą) K
                                    OW intervalą, kad būtų gauta patikima vertė. Hidrofobinėms cheminėms medžiagoms paprastai tiktų lėto maišymo metodas [TM A.23 (6)];
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 cheminės medžiagos stabilumą vandenyje (hidrolizė [TM C.7 (7)]);
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 cheminės medžiagos stabilumą maiste (ypač, jei pasirinktas mitybos metodas);
                              
                           
                                 (f)
                              
                              
                                 informaciją apie fotocheminį virsmą, susijusį su švitinimo sąlygomis atliekant bandymą (8);
                              
                           
                                 (g)
                              
                              
                                 paviršiaus įtemptį (t. y. cheminių medžiagų, kurių log K
                                    OW negali būti nustatytas) (TM A.5 (9));
                              
                           
                                 (h)
                              
                              
                                 garų slėgį (TM A.4 (10));
                              
                           
                                 (i)
                              
                              
                                 visą informaciją apie biotinį ar abiotinį skaidymą vandenyje, pvz., lengvą biologinį skaidumą (TM C.4, I–VII dalys(11), C.29 (12)) (bet juo neapsiribojant), jei tinka;
                              
                           
                                 (j)
                              
                              
                                 informaciją apie metabolitus: struktūrą, log K
                                    OW, susidarymą ir skaidumą, jei tinka;
                              
                           
                                 (k)
                              
                              
                                 rūgšties disociacijos konstantą (pK
                                    a), jei cheminės medžiagos gali jonizuotis. Jei būtina, reikėtų nustatyti bandymo vandens pH, siekiant užtikrinti, kad bandant medžiaga būtų jonizuotos formos, jei tai suderinama su žuvų rūšimi.
                              
                           Nepriklausomai nuo pasirinkto veikimo būdo ar ėminių ėmimo schemos, šiame bandymų metode aprašyta procedūra cheminių medžiagų biologinio kaupimosi žuvyse gebai nustatyti. Nors visiška pirmenybė teikiama dinaminių bandymų režimams, leidžiami pusiau statiniai režimai, jei jie atitinka tinkamumo kriterijus (žr. 24 ir 113 pastraipas). Taikant mitybos metodą, dinaminė sistema nėra būtina, kad būtų išlaikyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija vandenyje, tačiau ji padės užtikrinti reikiamą ištirpusio deguonies koncentraciją bei vandens grynumą ir pašalinti įtaką darančius veiksnius, pvz., organizmo išskiriamus produktus.
                     Nepriklausomai nuo pasirinkto bandymų metodo, pateikta pakankamai daug duomenų šiam bandymui atlikti, bet paliekant reikiamą laisvę bandymo schemai priderinti prie konkrečių laboratorijų sąlygų ir prie įvairių bandomųjų cheminių medžiagų charakteristikų. Veikimo per vandeninę terpę bandymas labiausiai tinka stabilioms organinėms medžiagoms, kurių log K
                        OW vertės yra nuo 1,5 iki 6,0 (13), bet vis dar gali būti taikoma stipriai hidrofobinėms medžiagoms (kurių log K
                        OW > 6,0), jei galima įrodyti visiškai vandenyje ištirpusios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos stabilumą. Jei vandenyje ištirpintos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos stabilumo negalima įrodyti, veikimo per vandeninę terpę tyrimas netiktų, todėl medžiagą žuvyse reikėtų nustatyti mitybos metodu (nors mitybos bandymo rezultatų aiškinimas ir naudojimas gali priklausyti nuo reglamentavimo sistemos). Organinių medžiagų, kurių log K
                        OW vertės yra ne didesnės kaip maždaug 9,0, biologinio kaupimosi faktoriaus (BCF, kartais žymimo K
                        B) pradinius įverčius galima gauti taikant Bintein et al. lygtį (14). Tokių stipriai hidrofobinių medžiagų biologinio kaupimosi faktoriaus pradinis įvertis gali būti didesnis nei nuostoviosios būsenos biologinio kaupimosi faktoriaus (BCFSS) vertė, kurią būtų tikimasi gauti atliekant laboratorinius bandymus, ypač, kai pradiniam įverčiui gauti naudojamas paprastas tiesinis modelis. Parametrai, kurie apibūdina biologinio kaupimosi gebą, yra sugerties greičio konstanta (k
                        1), šalinimo greičio konstantos, įskaitant apsivalymo greičio konstantą (k
                        2), nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BCFSS), kinetinis biologinio koncentravimo faktorius (BCFK) ir mitybos biomagnifikacijos faktorius (BMF) (38).
                     Žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos gali palengvinti vandens, maisto ir žuvų ėminių analizę, ir gali būti naudojamos tam, kad būtų nustatyta, ar reikės atlikti metabolitų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą. Jei matuojamas vien tik suminis radioaktyviųjų likučių kiekis (pvz., sudeginant arba soliubilizuojant audinį), BCF ar BMF yra pagrįsti pradinės cheminės medžiagos, visų išlikusių metabolitų, taip pat asimiliuotos anglies suminiu kiekiu. Todėl BCF ar BMF vertės, pagrįstos suminiu radioaktyviųjų likučių kiekiu, negali būti tiesiogiai lyginamos su BCF ar BMF, gautų atliekant vien tik pradinės cheminės medžiagos specifinę analizę. Atliekant žymėtųjų medžiagų tyrimus, prieš analizę galima taikyti atskyrimo procedūras, pvz., plonasluoksnė chromatografija TLC, HPLC ar GC (39), kad BCF ar BMF būtų nustatyti pagal pradinę cheminę medžiagą. Taikant atskyrimo metodus, reikėtų atlikti pradinės cheminės medžiagos ir atitinkamų metabolitų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą (40) (žr. 65 pastraipą), jei BCF ar BMF reikia gauti pagal pradinės cheminės medžiagos koncentraciją žuvyje, o ne pagal žymėtųjų likučių suminį kiekį. Taip pat galima sujungti žuvų metabolizmo ar in vivo pasiskirstymo tyrimą su biologinio kaupimosi tyrimu dėl likučių audiniuose analizės ir identifikavimo. Metabolizmo tikimybę galima prognozuoti tinkamomis priemonėmis (pvz., naudojant EBPO QSAR instrumentines priemones (15) ir nuosavybės teise turimas QSAR programas).
                     Sprendimas dėl veikimo per vandeninę terpę ar mitybos bandymo atlikimo ir dėl jo schemos turėtų būti pagrįstas 3 pastraipos veiksniais, kurie būtų nagrinėjami kartu su atitinkama reglamentavimo sistema. Pvz., jei cheminės medžiagos turi didelį log K
                        OW, bet jų tirpumas vandenyje vis dar yra pakankamas atsižvelgiant į turimų analizės metodų jautrį, pirmenybę reikėtų teikti veikimo per vandeninę terpę bandymui. Tačiau gali būti, kad nėra galutinės informacijos apie šių hidrofobinių medžiagų tirpumą vandenyje, todėl, prieš priimant sprendimą dėl taikomo bandymų metodo, reikėtų ištirti galimybę gauti stabilias ir matuojamas vandenyje ištirpusios medžiagos koncentracijos vertes (stabilios emulsijos neleidžiamos), tinkamas veikimo per vandeninę terpę metodui (16). Neįmanoma pateikti tikslių nurodymų dėl metodo, kurį reikia taikyti atsižvelgiant į tirpumo vandenyje ir pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficiento „ribinius“ kriterijus, nes dėl pirmiau nurodytų priežasčių metodo taikomumui gali turėti reikšmingą įtaką kiti veiksniai (analizės metodai, skaidumas, adsorbcija ir kt.). Tačiau didesnis kaip 5 K
                        OW ir mažesnis kaip ~0,01 – 0,1 mg/l tirpumas vandenyje žymi grupę medžiagų, kurių veikimo per vandeninę terpę bandymas gali būti vis sunkesnis.
                     Reikėtų atsižvelgti į kitus veiksnius, kurie gali turėti įtakos bandymo pasirinkimui, įskaitant cheminės medžiagos adsorbcijos ant bandymo indų ir aparatūros gebą, jos stabilumą vandeniniame tirpale palyginti su jos stabilumu žuvų maiste (17) (18) ir kt.
                     Informacijos apie tokius praktinius aspektus galima gauti iš kitų baigtų vandeninės terpės tyrimų. Papildomos informacijos apie tai, kaip įvertinti aspektus, susijusius su biologinio kaupimosi tyrimų charakteristikomis, galima rasti literatūroje (pvz., (19)).
                     Jei medžiagų tirpumas arba vandeninio tirpalo koncentracijos užtikrinimas, taip pat šių koncentracijos verčių analizė niekaip netrukdo taikyti veikimo per vandeninę terpę metodo, šiam metodui yra teikiama pirmenybė, kai reikia nustatyti medžiagos biologinio koncentravimo gebą. Bet kuriuo atveju reikėtų patikrinti, ar naudoti numatyta (-os) veikimo per vandeninę terpę koncentracijos vertė (-ės) atitinka tirpumo bandymo terpėje vertes. Galima taikyti įvairius metodus ištirpintos bandomosios cheminės medžiagos stabiliai koncentracijai užtikrinti, pvz., naudoti pradinius tirpalus ar pasyvaus dozavimo sistemas (pvz., kolonėlės eliuavimo metodą), jei galima įrodyti, kad galima užtikrinti stabilias koncentracijos vertes ir kad bandymo terpės nepakito palyginti su rekomenduotomis 27 pastraipoje.
                     Stipriai hidrofobinių medžiagų (kurių log K
                        OW > 5, o tirpumas mažesnis kaip ~ 0,01–0,1 mg/l) veikimo per vandeninę terpę bandymas gali būti vis sunkesnis. Apribojimų priežastimi gali būti nesugebėjimas užtikrinti vandeninės terpės koncentracijos, kurią būtų galima laikyti pakankamai pastovia (pvz., dėl sorbcijos ant veikimo indų stiklo ar dėl to, kad žuvys ją greitai sugeria), arba naudojamos koncentracijos vandeninėje terpėje vertės yra tokios mažos, kad jos atitinka analizės kiekybinio nustatymo ribą arba yra dar mažesnės (41). Šioms stipriai hidrofobinėms medžiagoms rekomenduojamas mitybos bandymas, jei bandymas yra suderinamas su atitinkama reglamentavimo sistema ir rizikos vertinimo poreikiais.
                     Tiriant paviršinio aktyvumo medžiagas reikėtų spręsti, ar, atsižvelgiant į cheminės medžiagos savybes, biologinio koncentravimo bandymą vandeninėje terpėje įmanoma atlikti, kitu atveju turbūt labiau tiktų mitybos tyrimas. Paviršinio aktyvumo medžiagos yra paviršiuje veikiantys agentai, kurie mažina sąlyčio tarp dviejų skysčių paviršiaus įtemptį. Dėl savo amfifilinės prigimties (t. y. jos turi hidrofilinę ir hidrofobinę dalį) jos kaupiasi sąlyčio paviršiuje, pvz., vandens ir oro sąlyčio paviršiuje, vandens ir maisto bei stiklinių sienų sąlyčio paviršiuje, ir tai trukdo nustatyti jų koncentraciją vandenyje.
                     Atliekant mitybos bandymą, galima apeiti kai kuriuos veikimo aspektus, kai tiriami sudėtingi mišiniai, kurių komponentų tirpumo vandenyje ribos skiriasi, nes tolygesnis veikimas įvairiems mišinio komponentams yra labiau tikėtinas palyginti su veikimo per vandeninę terpę metodu (žr. (20)).
                     Reikėtų pažymėti, kad taikant mitybos metodą gaunamas mitybos biomagnifikacijos faktorius (BMF), o ne biologinio koncentravimo faktorius (BCF) (42). Yra metodų, kuriuos taikant galima įvertinti kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BCFK) pagal duomenis, gautus tiriant mitybą (kaip aptarta 8 priedėlyje), tačiau šie metodai turėtų būti taikomi atsargiai. Apskritai, taikant šiuos metodus daroma prielaida dėl pirmojo laipsnio kinetikos ir jie yra taikomi tik tam tikrų grupių junginiams. Mažai tikėtina, kad šiuos metodus galima taikyti paviršinio aktyvumo medžiagoms (žr. 12 pastraipą).
                     Veikimo per vandeninę terpę supaprastinto bandymo schemą, imant mažiau ėminių ėmimo taškų gyvūnų skaičiui ir (arba) ištekliams sumažinti (žr. 83 pastraipą), reikėtų taikyti tik toms cheminėms medžiagoms, iš kurių galima pagrįstai tikėtis, kad sugertis ir apsivalymas vyks maždaug pagal pirmojo laipsnio kinetiką (t. y. apskritai nejoninėms organinėms medžiagoms, žr. 88 pastraipą).
                     C.13 – I.   Biologinio kaupimosi žuvyse bandymas veikiant per vandeninę terpę
                     
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     Bandymą sudaro du tarpsniai – veikimo (sugerties) tarpsnis ir (apsivalymo) tarpsnis po veikimo. Sugerties tarpsniu vienos rūšies žuvų grupė veikiama vienos ar kelių koncentracijos verčių bandomąja chemine medžiaga, priklausomai nuo bandomosios cheminės medžiagos savybių (žr. 49 pastraipą). Vėliau apsivalymo tarpsniui jos pernešamos į terpę be bandomosios cheminės medžiagos. Apsivalymo tarpsnis yra būtinas visada, išskyrus atvejus, kai sugerties tarpsniu cheminės medžiagos sugertis buvo nereikšminga. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvyje ir (arba) jos paviršiuje (ar tam tikrame jos audinyje) stebima abiem bandymo tarpsniais. Be apdorotos grupės yra kontrolinė žuvų grupė, kuri laikoma tokiomis pačiomis sąlygomis, bet be bandomosios cheminės medžiagos, kad, atliekant biologinio koncentravimo bandymą, pastebėtą galimą neigiamą poveikį būtų galima palyginti su vienodos sudėties kontroline grupe ir gauti bandomosios cheminės medžiagos fonines koncentracijos vertes (43).
                     Atliekant veikimo per vandeninę terpę bandymą, sugerties tarpsnis paprastai trunka 28 paras. Prireikus galima bandyti ilgiau (žr. 18 pastraipą) arba trumpiau, jei įrodoma, kad nuostovioji būsena pasiekiama anksčiau (žr. 1 priedėlį, Apibrėžtys ir vienetai). Sugerties tarpsnio trukmę ir laiką nuostoviajai būsenai pasiekti galima prognozuoti pagal 5 priedėlio lygtis. Apsivalymo tarpsnis prasideda tada, kai žuvys nebeveikiamos bandomąja chemine medžiaga, žuvis pernešant į švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandomosios cheminės medžiagos. Jei įmanoma, apskaičiuojamas biologinio koncentravimo faktorius, pageidautina kaip koncentracijos žuvyje (C
                        f) ir vandenyje santykis (C
                        w), esant nuostoviajai būsenai (BCFSS; apibrėžtis pateikta 1 priedėlyje), ir kaip kinetinis biologinio koncentravimo faktorius (BCFK; žr. 1 priedėlį, Apibrėžtys ir vienetai), kuris įvertinamas kaip sugerties (k
                        1) ir apsivalymo (k
                        2) greičio konstantų santykis, darant prielaidą dėl pirmojo laipsnio kinetikos (44).
                     Jei nuostovioji būsena nepasiekiama per 28 paras, BCF apskaičiuojamas taikant kinetinį metodą (žr. 38 pastraipą) arba galima prailginti sugerties tarpsnį. Jei dėl to sugerties tarpsnis nuostoviajai būsenai pasiekti būtų per ilgas (žr. 37 ir 38 pastraipas, 5 priedėlį), pirmenybė teikiama kinetiniam metodui. Arba reikėtų atsižvelgti į galimybę atlikti stipriai hidrofobinių cheminių medžiagų mitybos tyrimą (45), jei mitybos bandymas suderinamas su atitinkama reglamentavimo sistema.
                     Sugerties greičio konstanta, apsivalymo (netekimo) greičio konstanta (ar konstantos, jei naudojami sudėtingesni modeliai), biologinio koncentravimo faktorius (nuostovioji būsena ir (arba) kinetika) ir, jei įmanoma, kiekvieno šių parametrų pasikliovimo ribos apskaičiuojami pagal modelį, kuris geriausiai aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertes (žr. 5 priedėlį).
                     Dėl žuvies masės padidėjimo bandymo metu mažės bandomosios cheminės medžiagos koncentracija augančioje žuvyje (vadinamas praskiedimas dėl augimo), todėl kinetinio BCF įvertis būtų per mažas, jei nebūtų daroma pataisos dėl augimo (žr. 72 ir 73 pastraipas).
                     BCF yra pagrįstas sumine koncentracija žuvyje (t. y. suminės žuvies šlapios kūno masės atžvilgiu). Tačiau specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didelė, gali būti naudojami tam tikri audiniai ar organai (pvz., raumuo, kepenys) arba žuvis gali būti padalyta į valgomąją (filė) ir nevalgomą (viduriai) dalis. Kalbant apie daugelį organinių cheminių medžiagų yra aiški priklausomybė tarp jų biologinio koncentravimo gebos ir hidrofobiškumo, bet taip pat yra atitinkama priklausomybė tarp lipidų kiekio bandymo žuvyse ir stebimo tokių cheminių medžiagų biologinio koncentravimo. Todėl, siekiant sumažinti šį medžiagų su dideliu lipofiliškumu (t. y. kurių log K
                        OW > 3) bandymų rezultatų kintamumo šaltinį, biologinį koncentravimą, gautą tiesiogiai atliekant tyrimą, papildomai reikėtų išreikšti kaip normalizuotą 5 % lipidų (viso šlapios kūno masės atžvilgiu) turinčiai žuviai. Tai yra būtina siekiant turėti galimybę tarpusavyje palyginti skirtingoms cheminėms medžiagoms ir (arba) bandymų rūšims gautus rezultatus. Skaičius – 5 % lipidų kiekiui buvo plačiai taikomas, nes jis atitinka bandymo metode dažniausiai naudojamų žuvų vidutinį lipidų kiekį (21).
                     INFORMACIJA APIE BANDOMAJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                     Be įvade (3 pastraipa) pateiktų bandomosios cheminės medžiagos savybių, kita reikiama informacija yra toksiškumas žuvų rūšims, kurios turi būti naudojamos atliekant bandymus, pageidautina asimptotinė LC50 (t. y. nuo laiko nepriklausanti), ir (arba) toksiškumas, įvertintas atliekant ilgalaikius žuvų bandymus (pvz., C.47 (22), C.15 (23), C.14 (24) bandymų metodai).
                     Reikėtų turėti tinkamą žinomo tikslumo, preciziškumo ir jautrio analizės metodą cheminei medžiagai kiekybiškai nustatyti bandymo tirpaluose ir biologinėje medžiagoje, kartu su ėminių ruošimo ir laikymo duomenimis. Taip pat reikėtų žinoti bandomosios cheminės medžiagos kiekybinio analizinio nustatymo vandenyje ir žuvų audiniuose ribą. Jei naudojama žymėtoji bandomoji cheminė medžiaga, ji turėtų būti kuo grynesnė (pvz., pageidautina > 98 %) ir turėtų būti žinoma su priemaišomis susijusio radioaktyvumo procentinė dalis.
                     BANDYMO TINKAMUMAS
                     Taikomos šios bandymo tinkamumo sąlygos:
                     
                                  
                              
                              
                                 vandens temperatūra turėtų kisti mažiau kaip ± 2 °C, nes didelis nukrypimas gali turėti įtakos su sugertimi ir apsivalymu susijusiems biologiniams parametrams, taip pat gali sukelti stresą gyvūnams;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 ištirpusio deguonies koncentracija neturi sumažėti iki mažesnės nei 60 % soties koncentracijos;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 bandomosios cheminės medžiagos koncentracija kamerose yra lygi sugerties tarpsnio metu išmatuotoms vidutinėms vertėms ± 20 %;
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 bandomosios cheminės medžiagos koncentracija yra mažesnė nei jos tirpumo vandenyje ribinė vertė, atsižvelgiant į tai, kad bandymo vanduo gali turėti įtakos faktiniam tirpumui (46);
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 kontrolinių ir apdorotų ėminių žuvų gaištamumas arba kiti neigiami reiškiniai ir (arba) susirgimai bandymo pabaigoje yra mažesni nei 10 %; jei bandymas pratęsiamas kelioms savaitėms ar mėnesiams, žūtis arba kiti neigiami reiškiniai abiejuose žuvų rinkiniuose turėtų būti mažesni nei 5 % per mėnesį ir ne didesni kaip 30 % apskritai. Reikšmingi vidutinio augimo skirtumai tarp bandymo ir kontrolinių grupių ėminiams paimtų žuvų galėtų būti bandomosios cheminės medžiagos toksinio poveikio rodiklis.
                              
                           ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                     Būtų naudinga naudoti žinomos biologinio koncentravimo gebos ir mažo metabolizmo etalonines chemines medžiagas tikrinant bandymo procedūrą, kai reikia (pvz., kai laboratorija neturi ankstesnės bandymų patirties ar pakito Bandymo sąlygos).
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Aparatūra
                     
                     Reikia užtikrinti, kad visoms įrangos dalims gaminti nebūtų naudojamos medžiagos, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir turėti neigiamą poveikį žuvims. Galima naudoti stačiakampio arba ritinio formos standartines talpyklas, kurios būtų pagamintos iš chemiškai inertiškų medžiagų ir kurių tūris atitiktų įkrovos dydį (žr. 43 pastraipą). Minkšti plastikiniai vamzdžiai turi būti kuo mažiau naudojami. Reikėtų naudoti politetrafluoretileno, nerūdijančiojo plieno ir (arba) stiklinius vamzdžius. Patirtis parodė, kad bandant chemines medžiagas su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetinius piretroidus, gali prireikti silanizuoto stiklo. Šiomis sąlygomis įrangą po naudojimo reikėtų išmesti. Prieš dedant bandymų organizmus, bandymų sistemas pageidautina veikti tokių koncentracijos verčių bandomąja chemine medžiaga, kurias numatoma naudoti atliekant tyrimą, ir taip ilgai, kad būtų galima įrodyti veikimo koncentracijos verčių stabilumą.
                     
                        Vanduo
                     
                     Bandymuose dažniausiai naudojamas gamtinis vanduo, jis turi būti imamas iš neužteršto ir vienodos kokybės šaltinio. Vis dėlto, atkurtasis vanduo (t. y. demineralizuotas vanduo su žinomu tam tikrų mitybinių medžiagų kiekiu) galbūt tiktų labiau, siekiant laikui bėgant užtikrinti vienodą kokybę. Skiedimo vanduo, t. y. vanduo, su kuriuo bandomojo cheminė medžiaga maišoma prieš ją dedant į bandymo indą (žr. 30 pastraipą), turėtų būti tokios kokybės, kuri užtikrintų pasirinktų žuvų rūšių išgyvenamumą aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiais, nepasireiškiant jokiems neįprastiems jų išvaizdos ar elgesio pokyčiams. Būtų gerai įrodyti, kad bandomosios rūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis (pvz., laboratorinėje kultūroje arba atliekant gyvavimo ciklo trukmės toksiškumo bandymą). Skiedimo vandenį reikėtų apibūdinti nurodant bent pH vertę, kietumą, suminį kietųjų dalelių kiekį, suminį organinės anglies kiekį (TOC (47)), taip pat būtų gerai nurodyti amonio bei nitrito jonų kiekį bei šarmingumą, o jūros žuvų rūšims – druskingumą. Parametrai, kurie būtų svarbūs žuvų optimaliai gerovei, nėra visiškai žinomi, tačiau 1 priedėlyje pateiktos kelių gėlo ir jūros vandens komponentų rekomenduojamos didžiausios koncentracijos vertės.
                     Skiedimo vanduo turėtų būti pastovios kokybės visą bandymo laikotarpį. pH vertė turėtų būti 6,0–8,5 intervale, tačiau atliekant tam tikrą bandymą, ji galėtų kisti ne daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Siekiant užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., sudarydamas kompleksinius junginius su bandomąja chemine medžiaga) arba neigiamai veiktų žuvų būrio elgesį, ėminius reikėtų imti analizei per tam tikrus laiko tarpus, bent jau bandymo pradžioje ir pabaigoje. Pagrindinių sunkiųjų metalų anijonų ir katijonų (pvz., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– ir SO4
                        2-), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų suminio kiekio), suminio organinės anglies kiekio ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turėtų būti atliekama, pvz., kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei buvo įrodyta, kad skiedimo vandens kokybė buvo pastovi bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o tarpai padidinti (pvz., kas šešis mėnesius).
                     Natūralus kietųjų dalelių kiekis, taip pat suminės organinės anglies (TOC) kiekis skiedimo vandenyje turėtų būti kuo mažesnis, kad būtų išvengta bandomosios cheminės medžiagos adsorbcijos ant organinės medžiagos, dėl ko gali sumažėti bandomosios cheminės medžiagos biologinis įsisavinamumas, todėl būtų gautas per mažas BCF įvertis. Didžiausias leidžiamas kietųjų dalelių kiekis yra 5 mg/l (sausos medžiagos, sulaikomos 0,45 μm filtru), o suminės organinės anglies kiekis – 2 mg/l (žr. 2 priedėlį). Jei reikia, prieš naudojant skiedimo vandenį reikėtų filtruoti. Bandymų žuvų (ekskrementų) ir maisto likučių bandymo vandenyje indėlis į organinės anglies kiekį turėtų būti kuo mažesnis (žr. 46 pastraipą).
                     
                        Bandymų tirpalai
                     
                     Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas. Pradinį tirpalą geriausiai būtų ruošti bandomąją cheminę medžiagą tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Kaip tinkama alternatyva kartais galėtų būti naudojama kietosios fazės desorbcijos dozavimo sistema. Naudoti tirpiklius arba dispergentus (soliubilizavimo agentus) paprastai nerekomenduojama (žr. (25)); tačiau juos leidžiama naudoti tinkamos koncentracijos pradiniam tirpalui gauti, bet reikėtų dėti visas pastangas tokių medžiagų naudojimui sumažinti, o jų ribinė micelių koncentracija neturėtų būti viršyta (jei tinka). Tirpikliai, kuriuos būtų galima naudoti, yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilformamidas ir trietilenglikolis; naudoti dispergentai yra Tween 80, metilceliuliozės 0,01 % tirpalas ir HCO-40. Tirpiklio koncentracija visų apdorotų ėminių galutinėje bandymų terpėje turėtų būti vienoda (t. y. neatsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją) ir neturėtų būti didesnė nei atitinkamos toksiškumo ribinės vertės, nustatytos tirpikliui Bandymo sąlygomis. Maksimali koncentracija – 100 mg/l (arba 0,1 ml/l). Maža tikimybė, kad 100 mg/l koncentracijos tirpiklis reikšmingai pakeistų ištirpusios bandomosios cheminės medžiagos maksimalią koncentraciją, kurią būtų galima pasiekti terpėje (25). Reikėtų žinoti, kokią viso organinės anglies kiekio bandymų vandenyje dalį sudaro tirpiklis (kartu su bandomąja chemine medžiaga). Suminės organinės anglies koncentracija bandymų induose visą bandymo laiką neturėtų viršyti bandomosios cheminės medžiagos ir tirpiklio ar soliubilizavimo agento (48), jei naudojamas, anglies koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %) Organinės medžiagos koncentracija gali daryti reikšmingą įtaką laisvai ištirpintos bandomosios cheminės medžiagos kiekiui atliekant dinaminius žuvų bandymus, ypač – labai lipofilinių medžiagų. Mikroekstrahavimas kietąja faze (žr. 60 pastraipą) gali suteikti svarbios informacijos apie santykį tarp sujungtų ir laisvai ištirpintų junginių, iš kurių pastarieji, kaip manoma, ir yra biologiškai įsisavinama frakcija. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija turėtų būti mažesnė nei jos tirpumo bandymų terpėje ribinė koncentracija, neatsižvelgiant į tirpiklio ar soliubilizavimo agento naudojimą. Naudojant lengvai biologiškai skaidžius tirpiklius, reikėtų imtis priemonių, kad neatsirastų problemų dėl bakterijų augimo atliekant dinaminius bandymus. Jei pradinio tirpalo neįmanoma paruošti nenaudojant soliubilizavimo agento, reikėtų atsižvelgti į tai, ar nebūtų tikslinga vietoj veikimo per vandeninę terpę tyrimo atlikti mitybos bandymo.
                     Atliekant dinaminius bandymus reikia turėti sistemą, kuri nuolat dozuoja ir skiedžia bandomosios cheminės medžiagos (pvz., dozavimo siurblį, proporcinį skiestuvą, sotintuvo sistemą), arba kietosios fazės desorbcijos dozavimo sistemą reikiamoms bandymo koncentracijos vertėms bandymų kamerose gauti. Pageidautina, kad bandymo kamerų tūris pasikeistų per parą ne mažiau kaip penkis kartus. Pirmenybė teikiama dinaminiam režimui, tačiau jei jis neįmanomas (pvz., kai tai kenkia bandymo organizmams), galima taikyti pusiau statinį metodą, jei jis atitinka tinkamumo kriterijus (žr. 24 pastraipą). Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi būti tikrinamas 48 h prieš bandymą ir vėliau bent kasdien visą bandymo laiką. Tikrinant nustatomas srautas per kiekvieną kamerą ir užtikrinama, kad kameroje arba tarp kamerų srautas nesiskirtų daugiau kaip 20 %.
                     
                        Rūšių parinkimas
                     
                     Pasirenkant rūšis svarbu yra tai, ar jas lengva gauti, ar jas galima gauti tinkamų matmenų ir ar galima tinkamai prižiūrėti laboratorijoje. Kitus žuvų rūšių atrankos kriterijus sudaro rekreacinė, komercinė, ekologinė svarba, taip pat palyginamas jautris, sėkmingas naudojimas praeityje ir kt. Rekomenduojamos žuvų rūšys nurodytos 3 priedėlyje. Galima naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymų procedūrą. Šiuo atveju ataskaitoje reikėtų pagrįsti rūšies pasirinkimą ir bandymo metodą. Apskritai, naudojant mažesnių žuvų rūšis trumpėja laikas, per kurį pasiekiama nuostovioji būsena, bet gali prireikti daugiau žuvų (ėminių), kad būtų galima tinkamai atlikti lipidų kiekio analizę ir cheminės medžiagos koncentraciją žuvyje. Be to, yra tikimybė, kad kvėpavimo spartos ir metabolizmo skirtumai tarp jaunų ir vyresnio amžiaus žuvų gali trukdyti palyginti skirtingų bandymų ir skirtingoms rūšims gautus rezultatus. Reikėtų pažymėti, kad bandant žuvų rūšis jų spartaus augimo (jauniklių) laikotarpiu, gali būti sunkiau aiškinti duomenis.
                     
                        Žuvų laikymas (atsižvelgiant į veikimą per vandeninę terpę ir mitybą)
                     
                     Pradinė populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vandenyje (žr. 28 pastraipą) bandymų temperatūroje ir visą laiką pakankamai maitinama (žr. 45 pastraipą). Vanduo ir maistas turėtų atitikti naudojamus atliekant bandymą.
                     Po 48 h stabilizacijos laikotarpio, registruojamas gaištamumas ir taikomi tokie kriterijai:
                     
                                 —
                              
                              
                                 jei populiacijos gaištamumas per septynias paras yra didesnis kaip 10 %, visa partija atmetama;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jei populiacijos gaištamumas per septynias paras 5–10 %, aklimatizuojama dar septynias paras ir, jei gaištamumas per kitas septynias paras didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 jei populiacijos gaištamumas per septyniais paras yra mažesnis kaip 5 %, partija priimama.
                              
                           Bandymams atlikti naudojamos žuvys neturėtų turėti pastebimų ligų ir išsigimimų. Visas ligotas žuvis reikėtų atmesti. Dvi savaites prieš bandymą ir visą bandymo laiką žuvys neturėtų būti gydomos vaistais.
                     BANDYMO EIGA
                     
                        Parengiamasis bandymas
                     
                     Gali būti naudinga atlikti parengiamąjį bandymą, kad būtų galima optimizuoti galutinio bandymo sąlygas, pvz., pasirinkti bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertę (-es) ir sugerties bei apsivalymo tarpsnių trukmę, arba nustatyti, ar reikia atlikti viso masto bandymą. Parengiamojo bandymo schema turėtų būti tokia, kad būtų galima gauti reikiamą informaciją. Būtų galima aptarti, ar BCF gauti pakaktų supaprastinto bandymo ar reikia atlikti viso masto tyrimą (žr. 83–95 pastraipas apie supaprastintą bandymą).
                     
                        Veikimo sąlygos
                     
                     
                        Sugerties tarpsnio trukmė
                     
                     Sugerties tarpsnio trukmę galima prognozuoti atsižvelgiant į praktinę patirtį (pvz., iš ankstesnio panašios struktūros cheminės medžiagos sugerties tyrimo) arba pagal tam tikras empirines priklausomybes, naudojant bandomosios cheminės medžiagos tirpumo vandenyje arba pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficiento duomenis (jei sugertis vyksta pagal pirmojo laipsnio kinetiką, žr. 5 priedėlį).
                     Sugerties tarpsnis turėtų trukti 28 paras, nebent galima įrodyti, kad nuostovioji būsena pasiekiama anksčiau (žr. 1 priedėlį, Apibrėžtys ir vienetai). Nuostovioji būsena pasiekiama, kai bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyje (C
                        f) ir laiko priklausomybės kreivė tampa lygiagreti su laiko ašimi, kai bent kas dvi paras paimtų ėminių trijų nuoseklių C
                        f analizės rezultatai skiriasi ne daugiau kaip ± 20 % ir nėra reikšmingo C
                        f padidėjimo tarp pirmosios ir paskutinės nuoseklios analizės. Kai analizuojami jungtiniai ėminiai, reikia atlikti ne mažiau kaip keturias nuoseklias analizes. Jei bandomųjų cheminių medžiagų sugertis vyksta lėtai, labiau tiktų septynių parų intervalai. Jei nuostovioji būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, BCF apskaičiuojamas taikant tik kinetinį metodą, kuris nėra pagrįstas pasiekiama nuostoviąja būsena, arba sugerties tarpsnį galima pratęsti atliekant papildomus matavimus tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba iki 60 parų, jei tai trumpiau. Be to, bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvyje sugerties tarpsnio pabaigoje turi būti pakankamai didelė, kad būtų galima užtikrinti patikimą apsivalymo tarpsnio k
                        2 įvertį. Jei po 28 parų reikšmingos sugerties nėra, bandymą galima nutraukti.
                     
                        Apsivalymo tarpsnio trukmė
                     
                     Jei cheminių medžiagų apsivalymas vyksta pagal pirmojo laipsnio kinetiką, pusės sugerties tarpsnio trukmės paprastai pakanka, kad kūno sugertos cheminės medžiagos kiekis sumažėtų iki atitinkamos vertės (pvz., 95 %) (žr. 5 priedėlį dėl šio įverčio aiškinimo). Jei laikas 95 % netekčiai gauti yra praktiškai per ilgas ir, pvz., yra dvigubai ilgesnis nei įprastinė sugerties tarpsnio trukmė (t. y. ilgiau kaip 56 paros), galima naudoti trumpesnį laikotarpį (pvz., kai bandomosios cheminės medžiagos koncentracija yra mažesnė nei 10 % nuostoviosios būsenos koncentracijos). Tačiau ilgesnių apsivalymo tarpsnių gali prireikti cheminėms medžiagoms, turinčioms sudėtingesnį modelį, nei žuvims taikomas vienos aplinkos terpės sugerties ir apsivalymo modelis, kuris atitinka pirmojo laipsnio kinetiką. Jei yra stebimi ir (arba) numanomi tokie sudėtingi modeliai, reikėtų klausti biologinės statistikos ir (arba) farmakologinės kinetikos specialisto patarimo tinkamai bandymo schemai užtikrinti. Jei apsivalymo tarpsnis pratęsiamas, ribojančiu veiksniu gali tapti ėminiams imamų žuvų skaičius, o įtaką rezultatams gali daryti žuvų augimo skirtumai. Tačiau tarpsnio trukmę taip pat lems laikotarpis, kurį bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvyse yra didesnė nei analizės kiekybinio nustatymo riba.
                     
                        Bandymo žuvų skaičius
                     
                     Vienai bandymo koncentracijai imamas toks žuvų skaičius, kad kiekvienam ėminiui tektų ne mažiau kaip keturios žuvys. Žuvis galima sujungti į vieną grupę tik tada, jei pavienių žuvų analizė neįmanoma. Jei numatoma gauti geresnį kreivių priderinimo (ir išvestų parametrų) tikslumą arba reikia atlikti metabolizmo tyrimus (pvz., atskirti metabolitus ir pradinę cheminę medžiagą, kai naudojamos žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos), vienam ėminiui prireiks daugiau žuvų. Lipidų kiekį reikėtų nustatyti toje pačioje biologinėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandomosios cheminės medžiagos koncentracija. Jei tai būtų neįmanoma, gali prireikti papildomų žuvų (žr. 56 ir 57 pastraipas).
                     Jei naudojamos suaugusios (t. y. lytiškai subrendusios) žuvys, prieš bandymą ar bandymo metu jos neturėtų būti neršto būsenos ar neseniai išleidusios ikrus (t. y. jau po neršto). Taip pat ataskaitoje reikėtų pateikti duomenis, ar atliekant bandymą buvo naudojami vyriškos ar moteriškos lyties ar abiejų lyčių žuvys. Jei naudojamos abiejų lyčių žuvys, reikėtų pateikti dokumentus, kurie rodytų nereikšmingus augimo ir lipidų kiekio skirtumus veikimo pradžioje, ypač jei numatoma, kad prireiks sujungti vyriškos ir moteriškos lyties žuvis aptinkamai cheminės medžiagos koncentracijai ir (arba) lipidų kiekiui užtikrinti.
                     Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios masės žuvys, kad mažiausių žuvų masė būtų ne mažesnė kaip du trečdaliai didžiausios žuvies masės. Visos žuvys turėtų būti tų pačių metų ir iš to paties šaltinio. Kadangi masė ir amžius gali daryti reikšmingą įtaką BCF vertėms (12), šie duomenys turėtų būti tiksliai registruojami. Prieš pat bandymų pradžią rekomenduojama pasverti žuvų būrio poėminį, kad būtų gauta vidutinė masė (žr. 61 pastraipą).
                     
                        Įkrova
                     
                     Reikėtų naudoti didelius vandens ir žuvų kiekio santykius, kad dėl žuvų pridėjimo bandymo pradžioje kuo mažiau sumažėtų bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, taip pat būtų išvengta ištirpusio deguonies koncentracijos mažėjimo. Svarbu, kad įkrovos dydis atitiktų naudojamą bandymų rūšį. Bet kuriuo atveju paprastai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1–1,0 g žuvies (šlapios kūno masės) litrui vandens per parą. Galima naudoti didesnio žuvų ir vandens santykio įkrovas, jei žinoma, kad reikiamą bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją įmanoma užtikrinti ± 20 % tikslumu ir kad ištirpusio deguonies koncentracija nesumažėja daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos (žr. 24 pastraipą).
                     Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies įprastosios gyvenimo aplinkos sąlygas. Pvz., dugne gyvenančioms žuvims tam pačiam vandens tūriui gali būti reikalingas didesnis akvariumo dugno plotas nei jūros žuvų rūšims.
                     
                        Maitinimas
                     
                     Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu maistu, kurio lipidų ir baltymų suminis kiekis yra žinomas ir kurio pakanka, kad žuvys būtų sveikos ir būtų palaikoma jų kūno masė (galimas nedidelis augimas). Maitinama kasdien visą aklimatizavimo ir bandymo laikotarpį duodant nustatytą kiekį priklausomai nuo naudojamos rūšies, Bandymo sąlygų ir maisto energinės vertės (pvz., vaivorykštiniam upėtakiui per parą duodama nuo 1 iki 2 % kūno masės). Maisto norma turėtų būti parinkta taip, kad būtų išvengta greito augimo ir didelio lipidų kiekio padidėjimo. Siekiant užtikrinti tą pačią maisto normą, jo kiekis turėtų būti iš naujo apskaičiuojamas, jei reikia, pvz., vieną kartą per savaitę. Šiam apskaičiavimui atlikti žuvų masę kiekvienoje kameroje galima įvertinti pagal neseniai iš šios kameros ėminiams paimtų žuvų masę. Nereikia sverti kameroje likusių žuvų.
                     Nesuėstą maistą ir išmatas reikėtų išsiurbti iš kameros kasdien, netrukus po maitinimo (nuo 30 min iki vienos valandos). Kameros visą bandymų trukmę turėtų būti kiek įmanoma švarios, kad organinių medžiagų koncentracija būtų kuo mažesnė (žr. 29 pastraipą), nes organinės anglies buvimas gali riboti bandomosios cheminės medžiagos biologinį įsisavinamumą (12).
                     Kadangi dauguma maisto gaunama iš žuvų miltų, reikėtų užtikrinti, kad maistas neturėtų įtakos bandymų rezultatams arba nebūtų jokių nepageidaujamų reiškinių, pvz., dėl pesticidų, sunkiųjų metalų ir (arba) pačios bandomosios cheminės medžiagos ( pėdsakų) buvimo.
                     
                        Šviesa ir temperatūra
                     
                     Rekomenduojama 12–16 h šviesiojo laikotarpio trukmė, o temperatūra (± 2 °C) turėtų atitikti bandymo rūšį (žr. 3 priedėlį). Reikėtų žinoti apšvietimo tipą ir jo charakteristikas. Reikėtų atkreipti dėmesį į galimą bandomosios cheminės medžiagos fotocheminį virsmą tyrimo metu naudoto apšvietimo sąlygomis. Reikėtų naudoti tinkamą apšvietimą ir vengti žuvis veikti negamtiniais fotocheminio virsmo produktais. Kai kuriais atvejais galbūt tiktų filtras, kuris nepraleistų trumpesnio nei 290 nm bangos ilgio UV spinduliuotę.
                     
                        Bandymų koncentracijos vertės
                     
                     Bandymas iš pradžių buvo sumanytas nepolinėms organinėms medžiagoms. Manoma, kad šio tipo cheminėms medžiagos pakaktų žuvų paveikimo vienos vertės koncentracija, nes nesitikima jos poveikio, nors, atsižvelgiant į atitinkamą reglamentavimo sistemą, gali prireikti dviejų koncentracijos verčių. Jei bandomos kitokio tipo cheminės medžiagos arba yra duomenų apie galimą priklausomybę nuo koncentracijos, bandymą reikėtų atlikti naudojant dvi koncentracijos vertes arba daugiau. Jei bandoma tik viena koncentracija, reikėtų pagrįsti tokios koncentracijos pasirinkimą (žr. 79 pastraipą). Be to, bandoma koncentracija turėtų būti praktiškai ar techniškai kuo mažesnė (t. y. toliau nuo tirpumo ribinės koncentracijos).
                     Kai kuriais atvejais galima numanyti, kad cheminės medžiagos biologinis koncentravimas priklauso nuo koncentracijos vandenyje (pvz., metalų, kurių sugertis žuvimis gali būti bent iš dalies reguliuojama). Tokiu atveju būtina bandyti bent dvi, bet geriau daugiau koncentracijos verčių (žr. 49 pastraipą), kurios atitinka aplinkos sąlygas. Be to, jei dėl praktinių priežasčių cheminės medžiagos bandomos koncentracijos vertės yra arti tirpumo ribinės koncentracijos, rekomenduojama bandyti esant bent dviem koncentracijos vertėms, nes taip būtų galima susidaryti vaizdą apie veikimo koncentracijos verčių patikimumą. Reikėtų pasirinkti bandymo koncentracijos vertes, kurios aprėptų faktines aplinkos sąlygas atitinkančias vertes, taip pat koncentraciją, kuri atitiktų specifinio vertinimo tikslą.
                     Pasirinkta (-os) bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertė (-ės) turėtų būti mažesnė (-ės) nei lėtinio poveikio koncentracija arba lygi 1 % ūmaus poveikio asimptotinės LC50, atitikti su aplinka susijusį intervalą ir būti bent viena eile didesnė nei taikomo analizės metodo kiekybinio nustatymo vandenyje riba. Didžiausią leidžiamą koncentraciją taip pat galima nustatyti, ūmaus poveikio 96 h LC50 padalijus iš atitinkamo ūmaus ir lėtinio poveikio koncentracijos santykio (pvz., kai kurių cheminių medžiagų reikiamas santykis yra didesnis kaip trys, bet keli yra didesni kaip 100). Jei naudojama antroji koncentracija, ji turėtų dešimt kartų skirtis nuo pirmosios. Jei tai neįmanoma atsižvelgiant į toksiškumo kriterijų (kuris riboja viršutinę bandymo koncentraciją) ir analizinio nustatymo ribą (ji nustato apatinę bandymo koncentraciją), galima naudoti mažesnį nei dešimt daugiklį ir reikėtų atsižvelgti į galimybę naudoti žymėtąją bandomąją cheminę medžiagą (didžiausio grynumo, pvz., pageidautina > 98 %). Reikėtų užtikrinti, kad nei viena naudota koncentracija nebūtų didesnė nei bandomosios cheminės medžiagos tirpumo bandymo terpėje ribinė koncentracija.
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     Be bandomosios cheminės medžiagos serijos reikėtų bandyti vieną vandens kontrolinį ėminį arba, jei tinka (žr. 30 ir 31 pastraipas), vieną tirpiklio turintį kontrolinį ėminį.
                     
                        Vandens kokybės matavimo dažnumas
                     
                     Bandymo metu bandymo ir kontroliniuose induose reikėtų matuoti ištirpusį deguonį, TOC, pH ir temperatūrą. Reikėtų išmatuoti kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) suminį kietumą ir druskingumą (jei tinka) ir tai daryti viename inde. Jei bandomos dvi koncentracijos vertės arba daugiau, šie parametrai matuojami didesnei (arba didžiausiai) koncentracijai. Reikėtų matuoti bent jau ištirpusį deguonį ir druskingumą (jei tinka), ir sugerties tarpsniu tai daryti tris kartus – pradžioje, maždaug per vidurį ir pabaigoje, o apsivalymo tarpsniu – kartą per savaitę. TOC reikėtų matuoti bandymo pradžioje (24 h ir 48 h iki bandymo sugerties tarpsnio pradžios) prieš dedant žuvis ir bent kartą per savaitę sugerties ir apsivalymo tarpsnių metu. Temperatūrą reikėtų matuoti ir registruoti kasdien, pH – kiekvieno tarpsnio pradžioje ir pabaigoje, o kietumą – kartą bandymo metu. Temperatūrą bent viename inde reikėtų kontroliuoti nuolat.
                     
                        Žuvų bei vandens ėminių ėmimas ir analizė
                     
                     
                        Žuvų ir vandens ėminių ėmimo tvarkaraštis
                     
                     Vandens ėminius iš bandymo kamerų bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai nustatyti reikėtų imti prieš dedant žuvis ir sugerties bei apsivalymo tarpsnių metu. Vandens ėminius reikėtų imti prieš maitinimą, tuo pačiu metu, kai imami žuvų ėminiai. Gali būti naudinga ėminius imti dažniau, kad būtų užtikrintos stabilios koncentracijos vertės įdėjus žuvis. Sugerties tarpsnio metu reikėtų matuoti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją, kad būtų galima patikrinti atitikti tinkamumo kriterijams (24 pastrapa). Jei, atliekant vandens ėminių analizę apsivalymo tarpsnio pradžioje nepavyksta aptikti bandomosios cheminės medžiagos, tai galima būtų naudoti kaip įrodymą, kad visą likusį apsivalymo tarpsnio laiką nereikia analizuoti bandymo ir kontrolinių ėminių vandens bandomajai cheminei medžiagai nustatyti.
                     Žuvų ėminius bandomajai cheminei medžiagai nustatyti reikėtų imti bent penkis kartus sugerties tarpsniu ir ne mažiau kaip keturis kartus apsivalymo tarpsniu. Kadangi turint tokį ėminių skaičių kartais bus sunku gauti pakankamai tikslų BCF vertės įvertį (ypač kai yra požymių, kad sugerties ir apsivalymo kinetika nėra vien tik paprasto pirmojo laipsnio), būtų patartina ėminius imti dažniau abiem tarpsniais (žr. 4 priedėlį).
                     Lipidų kiekį reikėtų nustatyti bent jau sugerties tarpsnio pradžioje ir pabaigoje ir apsivalymo tarpsnio pabaigoje, jį nustatant toje pačioje biologinėje medžiagoje, kuri naudojama bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai nustatyti. Jei tai būtų neįmanoma, reikėtų atskirai paimti bent tris žuvis lipidų kiekiui nustatyti kiekvienu nurodytu laiko momentu. Žuvų skaičius vienam indui bandymo pradžioje turėtų būti atitinkamai pakoreguotas (49). Arba, jei kontrolinio ėminio žuvyje (t. y. pradinės populiacijos žuvyje) nebuvo aptikta reikšmingų bandomosios cheminės medžiagos kiekių, bandymo kontrolinio ėminio žuvis gali būti analizuojama tik lipidų kiekiui nustatyti, o bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos bandymų grupės (-ių) žuvyse (ir susijusių sugerties greičio konstantos, apsivalymo greičio konstantos ir BCF verčių) pataisa gali būti daroma, atsižvelgiant į kontrolinės grupės lipidų kiekio pokyčius bandymo metu (50).
                     Negyvos ar ligotos žuvys neturėtų būti analizuojamos bandomosios cheminės medžiagos ar lipidų koncentracijai nustatyti.
                     Tinkamo ėminių ėmimo tvarkaraščio pavyzdys pateiktas 4 priedėlyje. Kitus tvarkaraščius būtų galima nesunkiai apskaičiuoti, naudojant kitas numatytas K
                        OW vertes skaičiuojant veikimo trukmę, atitinkančią 95 % sugertį (skaičiavimai pateikti 5 priedėlyje).
                     Ėminius reikėtų imti sugerties tarpsnio metu tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena (žr. 1 priedėlį, Apibrėžtys ir vienetai) arba baigiasi sugerties tarpsnis (po 28 ar 60 parų, žr. 37 ir 38 pastraipas). Prieš pradedant apsivalymo tarpsnį žuvis reikėtų pernešti į švarius indus.
                     
                        Ėminių ėmimas ir ėminių ruošimas
                     
                     Vandens ėminius analizei reikėtų imti, pvz., siurbiant juos vamzdžiais iš inertinės medžiagos, įstatytais į bandymo kameros vidurį. Filtravimu ar centrifugavimu ne visada pasiseka atskirti biologiškai neįsisavinamas ir įsisavinamas bandomosios cheminės medžiagos frakcijas. Jei taikomas atskyrimo metodas, bandymo ataskaitoje, atsižvelgiant į biologinio įsisavinamumo sunkumus (25), reikėtų visada pagrįsti arba patvirtinti atskyrimo metodo tinkamumą. Visų pirma stipriai hidrofobinių cheminių medžiagų (t. y. cheminių medžiagų, kurių log K
                        OW > 5) (12) (26), galinčių adsorbuotis ant filtro matricos ar ant centrifugavimo indų, ėminiai neturėtų būti apdorojami tokiais būdais. Vietoj to reikėtų imtis priemonių, kad indai būtų kuo švaresni (žr. 46 pastraipą), o suminės organinės anglies kiekį reikėtų kontroliuoti sugerties ir apsivalymo tarpsnio metu (žr. 53 pastraipą). Siekiant išvengti galimų mažesnio biologinio įsisavinamumo problemų, mažai tirpių ir stipriai hidrofobinių cheminių medžiagų ėminius galima imti mikroekstrahavimo kietąja faze metodais.
                     Paimtos ėminiams žuvys turėtų būti numarinamos akimirksniu, naudojant tinkamiausią ir humanišką būdą (atliekant su visu žuvies kūnu susijusius matavimus, nereikėtų daryti jokių papildomų veiksmų, išskyrus plovimą vandeniu (žr. 28 pastraipą) ir paviršiaus džiovinimą). Žuvys sveriamos ir matuojamas jų visas ilgis (51) Kiekvienos žuvies atskirai išmatuotą masę ir ilgį reikėtų susieti su analizuojamos cheminės medžiagos koncentracija (ir lipidų kiekiu, jei taikoma), pvz., kiekvienai ėminio žuviai naudojant unikalų identifikavimo kodą.
                     Žuvis ir vandenį geriausiai analizuoti iškart po ėminio paėmimo, kad būtų išvengta irimo arba kitų nuostolių, ir apskaičiuoti apytikres sugerties bei apsivalymo greičio konstantas bandymo eigoje. Be to, atliekant analizę iškart, laiku nustatoma, kai pasiekiama gulsčioji sritis (nuostovioji būsena).
                     Jei analizė iš karto neįmanoma, ėminius reikėtų laikyti taikant reikiamus metodus. Prieš pradedant tyrimą, reikėtų gauti informaciją apie tinkamą konkrečios bandomosios cheminės medžiagos laikymo metodą, pvz., užšaldymą, laikymą 4 °C temperatūroje, ekstrahavimą ir kt. Laikymo trukmę reikėtų parinkti taip, kad būtų užtikrintas laikomos cheminės medžiagos patvarumas.
                     
                        Analizės metodo kokybė
                     
                     Kadangi visa bandymo procedūra iš esmės priklauso nuo bandomajai cheminei medžiagai nustatyti taikomo analizės metodo tikslumo, preciziškumo ir jautrio, bandymų keliu patikrinama, ar cheminės medžiagos analizės tikslumas ir atkuriamumas, taip pat bandomosios cheminės medžiagos atgavimo iš vandens ir žuvies laipsnis yra patenkinami taikant tam tikrą metodą. Tai turėtų būti parengiamųjų bandymų dalis. Taip pat patikrinama, ar bandomoji cheminė medžiaga neaptinkama naudojamame skiedimo vandenyje. Jei būtina, bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vandenyje ir žuvyse vertės, gautos atliekant bandymą, taisomos atsižvelgiant į atgavimo laipsnius ir kontrolinių ėminių fonines vertes. Žuvų ir vandens ėminius reikėtų visą laiką apdoroti taip, kad tarša ir nuostoliai (pvz., dėl adsorbcijos ėminių ėmimo įtaisu) būtų kuo mažesni.
                     
                        Žuvų ėminių analizė
                     
                     Jei bandant naudojamos žymėtosios medžiagos, galima nustatyti jų suminį kiekį (t. y. pradinę medžiagą ir metabolitus) arba ėminiai gali būti gryninami, kad pradinę medžiagą galima būtų analizuoti atskirai. Jei BCF reikia skaičiuoti pagal pradinę cheminę medžiagą, pagrindinius metabolitus reikėtų apibūdinti bent jau sugerties tarpsnio pabaigoje (žr. 6 pastraipą). Pagrindiniai metabolitai yra tie junginiai, kurie sudaro ≥ 10 % likučių žuvies audiniuose suminio kiekio, kurie sudaro ≥ 5 % dviejose gretimose ėminių ėmimo vietose, kurių kiekiai didėja sugerties tarpsnio metu ir kurių žinomas toksiškumas kelia susirūpinimą. Jei visos žuvies BCF pagal suminį žymėtųjų likučių kiekį yra ≥ 500, būtų galima patarti, o dėl tam tikrų kategorijų cheminių medžiagų, pvz., pesticidų, primygtinai rekomenduoti identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti svarbiausius metabolitus. Tokių metabolitų kiekybinio nustatymo gali reikalauti kai kurios priežiūros institucijos. Jei žuvų audiniuose identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktai sudaro ≥ 10 % suminio žymėtųjų likučių kiekio, juos taip pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti bandymo vandenyje. Jei nustatymas būtų neįmanomas, tai reikėtų paaiškinti bandymo ataskaitoje.
                     Bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją paprastai reikėtų nustatyti kiekvienoje atskirai pasvertoje žuvyje. Jei tai neįmanoma, kiekvienu atskiro ėmimo atveju paimti ėminiai gali būti sujungti, bet sujungimas riboja statistines procedūras, kurias būtų galima taikyti duomenims, todėl bandymui reikėtų paimti reikiamą žuvų skaičių, kad būtų galima užtikrinti norimą sujungimą, statistinę procedūrą ir galią. Kaip įvadą į atitinkamas sujungimo procedūras galima naudoti (27) ir (28) nuorodas.
                     Be vertės, gautos tiesiogiai atliekant tyrimą (žr. 21 pastraipą), BCF reikėtų išreikšti kaip normalizuotą žuviai, turinčiai 5 % lipidų (pagal šlapią kūno masę), nebent būtų galima įrodyti, kad ne lipidai sukaupia didžiausią bandomosios cheminės medžiagos kiekį. Jei įmanoma, žuvies lipidų kiekį reikėtų nustatyti kiekvienu ėminių ėmimo atveju ir pageidautina tame pačiame ekstrakte, kuris buvo gautas bandomajai cheminei medžiagai analizuoti, nes, prieš atliekant jo chromatografinę analizę, lipidus iš ekstrakto dažnai tenka pašalinti. Tačiau bandomųjų cheminių medžiagų analizei dažnai yra būtinos specifinės ekstrahavimo procedūros, kurios galėtų neatitikti lipidams nustatyti taikomų bandymo metodų. Šiuo atveju (iki bus sukurti tinkami neardomieji instrumentiniai metodai), rekomenduojama taikyti kitą žuvų lipidų kiekio nustatymo strategiją (žr. 56 pastraipą). Reikėtų taikyti tinkamus lipidų kiekio nustatymo metodus (20). Kaip standartinį metodą galima rekomenduoti (30) ekstrahavimo chloroformu ir metanoliu metodą (29), bet kaip alternatyvus metodas rekomenduojamas Smedes metodas (31). Pastarasis metodas pasižymi palyginamu ekstrahavimo efektyvumu, dideliu tikslumu, mažesnio toksiškumo organinių tirpiklių naudojimu ir atlikimo patogumu. Būtų galima taikyti kitus tinkamai pagrįstus metodus, kurių tikslumas palankiai skiriasi nuo rekomenduojamų metodų tikslumo. Svarbu pateikti taikomo metodo duomenis.
                     
                        Žuvų augimo matavimas
                     
                     Bandymo pradžioje atskirai pasveriama nuo penkių iki dešimties pradinės populiacijos žuvų ir išmatuojamas jų visas ilgis. Tai gali būti tos pačios žuvys, kurios būtų naudojamos lipidų analizei (žr. 56 pastraipą). Prieš atliekant cheminės medžiagos ar lipidų analizę, kiekvienu atskiro ėminių ėmimo atveju reikėti išmatuoti bandymo ir kontrolinių grupių žuvų masę ir ilgį. Šių ėminiams paimtų žuvų matavimai taip pat gali būti naudojami bandymo ir kontroliniuose induose likusių žuvų masei ir ilgiui įvertinti (žr. 45 pastraipą).
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     Bandomosios cheminės medžiagos sugerties kreivę aritmetinėje skalėje reikėtų gauti bandymu nustatytą koncentraciją žuvyje arba jos paviršiuje (arba tam tikruose audiniuose) pateikiant kaip laiko funkciją. Jei kreivė pasiekė gulsčiąją sritį, t. y. tapo maždaug asimptotinė laiko ašiai, nuostoviosios būsenos BCF (BCFSS) reikėtų apskaičiuoti taip:
                     
                        
                     
                        C
                        f kitimui įtakos gali turėti žuvų augimas (žr. 72 ir 73 pastraipas). Vidutinei veikimo koncentracijai (Cw
                        ) įtaką daro jos kitimas laikui bėgant. Galima tikėtis, kad laikinė svertinė vidutinė koncentracija yra tinkamesnė ir tikslesnė vertė atliekant biologinio kaupimosi tyrimus, net jei kitimas atitinka reikiamą tinkamumo intervalą (žr. 24 pastraipą). Koncentracijos vandenyje laikinis svertinis vidurkis (LSV) gali būti apskaičiuotas pagal 5 priedėlio 1 skirsnį.
                     Kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BCFK) reikėtų nustatyti kaip dviejų pirmojo laipsnio kinetikos greičio konstantų k
                        1/k
                        2 santykį. Greičio konstantas k
                        1 ir k
                        2 bei BCFK galima išvesti atliekant vienalaikį sugerties ir apsivalymo tarpsnių vertinimą. Arba k
                        1 ir k
                        2 gali būti nustatytos nuosekliai (žr. 5 priedėlį, kuriame šie metodai aprašyti ir palyginti). Apsivalymo greičio konstantai (k
                        2) gali tekti daryti praskiedimo dėl augimo pataisą (žr. 72 ir 73 pastraipas). Jei apsivalymo kreivė akivaizdžiai yra ne pirmojo laipsnio, reikėtų taikyti sudėtingesnius modelius (žr. 5 priedėlio nuorodas, taip pat klausti biologinės statistikos ir (arba) farmakologinės kinetikos specialisto patarimo).
                     
                        Žuvų masės ir ilgio duomenys
                     
                     Atskirų žuvų šlapios kūno masės ir viso ilgio duomenys, gauti kiekvieną kartą imant ėminius sugerties tarpsniu (įskaitant pradinę populiaciją sugerties tarpsnio pradžioje) ir apsivalymo tarpsniu, įtraukiami į lenteles atskirai bandymo ir kontrolinių ėminių grupei. Kiekvienos žuvies atskirai išmatuotą masę ir ilgį reikėtų susieti su cheminės medžiagos koncentracija, pvz., naudojant unikalų identifikavimo kodą kiekvienai ėminio žuviai. Masei kaip augimo matui teikiama pirmenybė, kai reikia daryti kinetinio BCF verčių praskiedimo dėl augimo pataisą (žr. 73 pastraipą ir 5 priedėlį dėl metodo, taikomo darant praskiedimo dėl augimo pataisą).
                     
                        Praskiedimo dėl augimo pataisa ir normalizavimas pagal lipidus
                     
                     Dėl žuvų augimo apsivalymo tarpsniu gali būti gautos mažesnės išmatuotos cheminės medžiagos koncentracijos vertės, todėl visuminė apsivalymo greičio konstanta (k
                        2) yra didesnė nei būtų gauta vien tik pagal pašalinimo procesus (pvz., kvėpavimą, metabolizmą, šalinimą iš organizmo). Reikėtų daryti kinetinių biologinio koncentravimo faktorių praskiedimo dėl augimo pataisą. BCFSS taip pat darys įtaką augimas, bet nėra sutartos procedūros BCFSS pataisai dėl augimo daryti. Jei augimas reikšmingas, taip pat reikėtų apskaičiuoti BCFK, pataisytą dėl augimo (BCFKg), nes jis gali būti tinkamesnis biologinio koncentravimo faktoriaus matas. Lipidų kiekis bandymo žuvyse (kuris yra labai susijęs su hidrofobinių cheminių medžiagų biologiniu kaupimusi) praktiškai gali gerokai keistis, todėl jį būtina normalizuoti pagal nustatytą žuvų lipidų kiekį (5 % masės), siekiant kinetinį ir nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius pateikti prasmingu būdu, nebent būtų galima įrodyti, kad ne lipidai sukaupia didžiausią bandomosios cheminės medžiagos kiekį (pvz., kai kurios perfluorintos cheminės medžiagos gali jungtis su baltymais). Šių skaičiavimų lygtys ir pavyzdžiai pateikti 5 priedėlyje.
                     Siekiant padaryti kinetinio BCF praskiedimo dėl augimo pataisą, reikėtų daryti apsivalymo greičio konstantos pataisą dėl augimo. Ši dėl augimo pataisyta apsivalymo greičio konstanta(k
                        2g) apskaičiuojama iš visuminės apsivalymo greičio konstantos (k
                        2) atimant augimo greičio konstantą (k
                        g, gautą iš išmatuotos masės duomenų). Paskui apskaičiuojamas dėl augimo pataisytas kinetinis biologinio koncentravimo faktorius sugerties greičio konstantą (k
                        1) dalijant iš dėl augimo pataisytos apsivalymo greičio konstantos (k
                        2g) (žr. 5 priedėlį). Kai kuriais atvejais šis metodas turi trūkumų. Pvz., jei labai lėtai pasišalinančios cheminės medžiagos bandomos greitai augančiose žuvyse, apskaičiuota k
                        2g gali būti labai maža, todėl labai svarbia tampa jai gauti naudojamų dviejų greičio konstantų paklaida ir kai kuriais atvejais k
                        g įverčiai gali būti didesni nei k
                        2. Alternatyvus metodas, kurį taikant nereikia daryti praskiedimo dėl augimo pataisos, kai apsivalymo duomenys gaunami naudojant bandomosios cheminės medžiagos masę vienoje žuvyje (pagal visos žuvies masę), o ne įprastiniai (koncentravimo) duomenys, gaunami kaip bandomosios cheminės medžiagos masė žuvies masės vienetui. Šiuos duomenis galima nesunkiai gauti, nes bandymai pagal šį bandymų metodą turėtų susieti audiniui registruotas koncentracijos vertes su atskirų žuvų mase. Paprasta šių veiksmų atlikimo procedūra apibūdinta 5 priedėlyje. Reikia pažymėti, kad k
                        2 vis tiek reikėtų pateikti ataskaitoje, jei taikomas šis alternatyvus metodas.
                     Kinetinį ir nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius taip pat reikėtų pateikti ataskaitoje numatytojo 5 % (masės) žuvų lipidų kiekio atžvilgiu, nebent būtų galima įrodyti, kad ne lipidai sukaupia didžiausią bandomosios cheminės medžiagos kiekį. Koncentravimo žuvyse duomenys arba BCF normalizuojami pagal santykį tarp 5 % ir faktinį (atskirą) vidutinį lipidų kiekį ( % šlapios kūno masės) (žr. 5 priedėlį).
                     Jei cheminės medžiagos ir lipidų analizės buvo atliekamos su ta pačia žuvimi, atskirų žuvų pagal lipidus normalizuotus duomenis reikėtų naudoti pagal lipidus normalizuotam BCF apskaičiuoti. Arba, jei augimas kontroliniuose ir apdorotų žuvų ėminiuose yra panašus, pataisai dėl lipidų galima naudoti tik kontrolinių ėminių žuvų lipidų kiekį (žr. 56 pastraipą). Pagal lipidus normalizuoto BCF skaičiavimo metodas aprašytas 5 priedėlyje.
                     
                        Rezultatų aiškinimas
                     
                     Rezultatus reikėtų aiškinti atsargiai, jei išmatuotos bandymo tirpalų koncentracijos vertės yra arti analizės metodo aptikimo ribos.
                     Bandymo ir kontrolinių grupių vidutiniai augimo duomenys iš esmės neturėtų reikšmingai skirtis, kad būtų pašalintas toksinis poveikis. Abiejų grupių augimo greičio konstantas arba augimo kreives reikėtų lyginti taikant tinkamą procedūrą (52)).
                     Aiškiai apibrėžtos sugerties ir apsivalymo kreivės yra biologinio koncentravimo duomenų geros kokybės ženklas. Greičio konstantoms gautas χ2 suderinamumo kriterijaus rezultatas turėtų rodyti gerą suderinamumą su biologinio kaupimosi modeliu (t. y. mažą matavimo paklaidos procentinę dalį (32)), kad greičio konstantas būtų galima laikyti patikimomis (žr. 5 priedėlį). Jei naudojama daugiau kaip viena bandymo koncentracija, sugerties ir apsivalymo konstantų kitimas kintant bandymo koncentracijai turėtų būti mažesnis kaip 20 % (53). Jei taip nėra, reikėtų pažymėti priklausomybę nuo koncentracijos. Reikėtų registruoti stebimus didelius sugerties ir apsivalymo greičio konstantų skirtumus, kintant naudojamoms bandymo koncentracijos vertėms, ir pateikti galimus paaiškinimus. Jei tyrimo schema sukurta tinkamai, BCF 95 % pasikliovimo riba yra ± 20 % gauto BCF.
                     Jei bandomos dvi koncentracijos vertės arba jų yra daugiau, abiejų ar visų koncentracijos verčių rezultatai yra naudojami jų nuoseklumui patikrinti ir įrodyti, ar yra priklausomybė nuo koncentracijos. Jei bandoma tik viena koncentracija, siekiant sumažinti gyvūnų ir (arba) išteklių naudojimą, vienos koncentracijos naudojimą reikėtų pagrįsti.
                     Gautas BCFSS kelia abejonių, jei BCFK yra reikšmingai didesnis nei BCFSS, nes tai gali rodyti, kad nebuvo pasiekta nuostovioji būsena arba nebuvo atsižvelgta į praskiedimo dėl augimo ir netekimo procesus. Tais atvejais, kai BCFSS yra ypač daug didesnis nei BCFK, reikėtų patikrinti sugerties ir apsivalymo greičių konstantų skaičiavimą dėl paklaidų ir jas įvertinti iš naujo. BCFK galėtų pagerinti kitokia priderinimo procedūra (žr. 5 priedėlį).
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Be 3 pastraipoje nurodytos informacijos apie bandomąją cheminę medžiagą, bandymo ataskaitą sudaro ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 fizikinė būsena ir, jei tinka, fizikinės ir cheminės savybės;
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt. (įskaitant organinės anglies kiekį, jei tinka).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aprašymas, kuo išsamesnis, atskirų komponentų cheminis pavadinimas ir kiekvieno jų procentinė dalis nuo suminės cheminės medžiagos masės, jei bandomos daugiakomponentės medžiagos, nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ir biologinės medžiagos (UVCB). Reikėtų apibendrinti, kodėl bandymams taikomas analizės metodas yra tinkamas cheminės medžiagos koncentracijos matui gauti; reikėtų aprašyti visas analizės procedūras, įskaitant metodo tikslumą, metodo aptikimo ribą ir kiekybinio nustatymo ribą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei turi žymėtųjų atomų, tiksli žymėtojo atomo (-ų) padėtis ir su priemaišomis susijusio aktyvumo procentinė dalis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informacija apie bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą žuvims (būtų gerai nurodyti bandymo rūšį). Toksiškumą reikėtų pateikti ataskaitoje kaip ūmaus poveikio 96 h LC50 bei lėtinio poveikio tyrimo NOAEC ir LOAEC (t. y. pradinių gyvenimo stadijų bandymo ar viso gyvavimo ciklo bandymo, jei yra);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos ar bandomosios medžiagos laikymo sąlygos ir bandomosios cheminės medžiagos ar bandomosios medžiagos stabilumas laikymo sąlygomis, jei laikomos prieš naudojant.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo gyvūnų rūšys:
                                 
                                 mokslinis pavadinimas, veislė, šaltinis, pradinis apdorojimas, aklimatizavimas, amžius, lytis (jei tinka), dydžių intervalas (masės ir ilgio), kt.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             taikyta bandymų procedūra (pvz., dinaminė ar pusiau statinė); viso masto tyrimas ar pagal supaprastintą schemą (įskaitant priežasčių aiškinimą ir pagrindimą);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudojamo apšvietimo tipas bei charakteristikos ir šviesiojo laikotarpio trukmė (-ės);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandymų schema (pvz., bandymo kamerų skaičius ir matmenys, vandens tūrio pakeitimo dažnumas, įkrovos dydis, kartotinių ėminių skaičius, kartotinio ėminio žuvų skaičius, bandyme naudotų koncentracijos verčių skaičius, sugerties ir apsivalymo tarpsnių trukmė, žuvų ir vandens ėminių ėmimo dažnumas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pradinių tirpalų ruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas (reikėtų nurodyti tirpiklį, jei naudojamas, jo koncentraciją ir jam tenkančią bandymo vandens organinės anglies dalį) arba alternatyvios dozavimo sistemos aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nominalios bandymų koncentracijos vertės, bandymų induose išmatuotų verčių vidurkiai ir jų standartiniai nuokrypiai, jų nustatymo metodas ir dažnumas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             skiedimo vandens šaltinis, parengtinio apdorojimo aprašymas, bandymų žuvų gebėjimo gyventi vandenyje įrodymo rezultatai ir vandens charakteristikos: bandymų terpės pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro koncentracija (jei matuojama), suminė organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės (jei tinka) ir visi kiti atlikti matavimai);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vandens kokybė bandymų induose, pH, kietumas, TOC, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija; jų nustatymo metodai ir matavimų dažnumas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie maitinimą, pvz., maisto produkto (-ų) tipas, šaltinis, sudėtis (bent lipidų ir baltymų kiekis, jei įmanoma), pasirinkta maisto norma, duodamas kiekis ir dažnumas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informacija apie žuvų ir vandens ėminių apdorojimą, įskaitant bandomosios cheminės medžiagos ir lipidų ruošimo, laikymo, ekstrahavimo ir analizės procedūrų (ir tikslumo) duomenis;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             taikyti apdorojimo randomizavimo ir žuvų paskirstymo tarp bandymų indų metodai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandymų organizmų įleidimo į bandymų tirpalus data ir bandymo trukmė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             intervalo nustatymo bandymų ir rezultatų, jei yra, aprašymas.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             visų parengiamųjų tyrimų rezultatai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontrolinių ėminių žuvų ir žuvų kiekvienoje veikimo kameroje gaištamumas bei jų neįprastas elgesys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų pastebėtų neigiamų reiškinių aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų taikytų cheminės analizės procedūrų aprašymas, įskaitant aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribas, kintamumą ir atgavimo laipsnį;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             žuvų lipidų kiekis, įskaitant taikytą metodą ir, jei apskaičiuotas, normalizavimo pagal lipidus faktorius (L
                                                n faktorius rezultatams išreikšti pagal 5 % žuvų lipidų kiekį).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontrolinės ir veikiamosios grupių žuvų masės (ir ilgio) duomenų, susijusių su atskirų žuvų cheminės medžiagos koncentracijos vertėmis (ir lipidų kiekiu, jei taikoma), lentelės (pvz., naudojant unikalų kiekvienos ėminio žuvies identifikavimo kodą) ir gautos (-ų) augimo greičio konstantos (-ų) skaičiavimai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyse (C
                                                f, susijusios su atskira žuvimi) ir vandenyje (C
                                                w) duomenų, gautų kiekvieną kartą imant ėminius, lentelės (nurodant bandymo ir kontrolinių grupių vidutines vertes, standartinį nuokrypį ir intervalą, jei tinka) (C
                                                f išreikšta mg/kg visos šlapios kūno masės ar tam tikrų jo audinių, pvz., lipidų, ir C
                                                w – mg/l); kontrolinių ėminių serijos C
                                                w vertės (taip pat reikėtų pateikti foninę vertę);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kreivės (įskaitant visus matavimo duomenis), kurios vaizduoja (jei taikoma, koncentracijos vertes galima išreikšti viso gyvūno kūno masės atžvilgiu, o lipidų kiekį – normalizuotą 5 % gyvūno ar jo audinių masės):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         augimą, t. y. žuvies masę arba į natūralųjį logaritmą transformuotą masę kaip laiko funkciją (įskaitant apskaičiuotą augimo greičio konstantą k
                                                            g),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandomosios cheminės medžiagos sugerties ir apsivalymo žuvyje eigą (viename grafike),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nuostoviosios būsenos pasiekimo trukmę (jei pasiekiama),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         į natūralųjį logaritmą transformuotą koncentraciją kaip laiko funkciją (įskaitant apskaičiuotą sugerties greičio konstantą k
                                                            1),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         į natūralųjį logaritmą transformuotą koncentraciją (ln koncentracijos) kaip apsivalymo trukmės funkciją (įskaitant apskaičiuotą apsivalymo greičio konstantą k
                                                            2), ir
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         sugerties ir apsivalymo tarpsnių kreives, kuriose pateikti duomenys ir priderintas modelis;
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei apžiūrint kreives aiškiai matomi riktai, galima taikyti statistiškai pagrįstą riktų kriterijų, kad būtų pašalinti klaidingi duomenų taškai, taip pat galima pateikti dokumentuotą jų pašalinimo pagrindimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius, (BCFSS), jei nuostovioji būsena yra (beveik) pasiekta;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kinetinis biologinio koncentravimo faktorius (BCFK) bei apskaičiuotos sugerties ir apsivalymo greičio konstantos k
                                                1 ir k
                                                2, kartu su k
                                                2 kitimo duomenimis (kampinio koeficiento ir atkarpos), jei taikomas nuoseklusis priderinimas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pasikliovimo ribos, standartinis nuokrypis (jei žinomas) ir kiekvienos naudotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos kiekvieno parametro duomenų apdorojimo ar duomenų analizės metodai;
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         visa informacija apie žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos metabolitus ir jų kaupimąsi;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         augimo greičio konstantos (-ų) (įskaitant 95 % pasikliovimo intervalą (-us))) ir apskaičiuotos apsivalymo greičio konstantos su pataisa dėl augimo (k
                                                            2g), pusėjimo trukmės ir BCF (BCFKg) vertės;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         visi neįprasti reiškiniai bandymo metu, visi nukrypimai nuo šių procedūrų ir kita tinkama informacija;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tokia reikiamų išmatuotų ir apskaičiuotų duomenų suvestinė lentelė:
                                                         
                                                                     Cheminės medžiagos sugerties ir apsivalymo greičio konstantos bei biologinio koncentravimo faktoriai (BCF)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        g (augimo greičio konstanta, paros– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (95 % PI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        1 (visuminė sugerties greičio konstanta, l kg– 1 paros-1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (95 % PI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2 (visuminė apsivalymo greičio konstanta, paros– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (95 % PI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2g (apsivalymo greičio konstanta su pataisa dėl augimo, paros– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (95 % PI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        f (cheminės medžiagos koncentracija žuvyje, esant nuostoviajai būsenai, mg kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę ± SN (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        w (cheminės medžiagos koncentracija vandenyje, mg l– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę ± SN (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        L
                                                                        n (normalizavimo pagal lipidus faktorius):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (3)
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSS (nuostoviosios būsenos BCF, l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę ± SN (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSSL (pagal lipidus normalizuotas nuostoviosios būsenos BCF, l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (3) ± SN (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFK (kinetinis BCF, l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (95 % PI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKg (kinetinis BCF su pataisa dėl augimo, l kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (95 % PI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        t
                                                                        1/2g (pusėjimo trukmė su pataisa dėl augimo, paros):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę (95 % PI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKL (pagal lipidus normalizuotas kinetinis BCF, l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKLG (pagal lipidus normalizuotas kinetinis BCF su pataisa dėl augimo, l kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     Įrašyti vertę
                                                                  
                                                               Kuriant parengiamąjį bandymų metodą ir bandymų schemą, reikėtų vengti rezultatų, kurie ataskaitoje būtų pateikti kaip neaptikti arba kiekybiškai nustatyti arti aptikimo ar kiekybinio nustatymo ribos, nes tokie rezultatai negali būti panaudoti greičio konstantoms skaičiuoti.
                                                      
                                                   
                                       
                           C.13 -II.   II. Žuvų veikimo per vandeninę terpę supaprastintas bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Vis didesnė laboratorijų ir reglamentavimo institucijų patirtis, įgyta atliekant viso masto bandymą ir aiškinant jo rezultatus, rodo, kad, esant kai kurioms išimtims, galioja pirmojo laipsnio kinetika skaičiuojant sugerties ir apsivalymo greičio konstantas. Todėl įvertinti sugerties ir apsivalymo greičio konstantas ir apskaičiuoti kinetinį BCF galima pagal minimalų ėminių ėmimo taškų skaičių.
                     Pradinis tikslas tiriant alternatyvias BCF tyrimų schemas buvo sukurti nedidelio masto bandymą, kuris būtų naudojamas kaip tarpinis bandymo etapas pagal K
                        OW ir QSAR gautiems BCF įverčiams atmesti arba patvirtinti ir taip atsisakyti daugelio cheminių medžiagų viso masto tyrimo ir sumažinti sąnaudas bei naudojamų gyvūnų skaičių, imant mažiau ėminių ir atliekant mažiau analizės procedūrų. Laikantis pagrindinės pirmiau taikyto bandymų metodo schemos, kad bandymo rezultatus būtų galima apjungti su esamais BCF duomenimis ir palengvinti bandymų atlikimą ir duomenų aiškinimą, buvo siekiama gauti reikiamo tikslumo ir preciziškumo BCF įverčius rizikos vertinimo sprendimams priimti. Galioja dauguma viso masto bandymo aspektų, pvz., tinkamumo patvirtinimo kriterijai (žr. 24 pastraipą) ir bandymo nutraukimas, jei sugerties tarpsnio pabaigoje stebima nereikšminga sugertis (žr. 16 ir 38 pastraipas).
                     Cheminės medžiagos, kurioms būtų galima pasirinkti supaprastinto bandymo schemą, turėtų priklausyti bendrajai grupei, kuriai jis buvo sukurtas, t. y. nepolinėms organinėms medžiagoms (žr. 49 pastraipą). Jei yra kokių nors požymių, kad cheminė medžiaga, kurią reikia bandyti, gali elgtis kitaip (pvz., aiškiai nukrypsta nuo pirmojo laipsnio kinetikos), viso masto bandymas turėtų būti atliekamas reglamentavimo tikslais.
                     Paprastai, supaprastinto bandymo trukmė nėra mažesnė nei standartinio BCF bandymo, bet jį atliekant imama mažiau žuvų ėminių (žr. pagrindimą 6 priedėlyje). Tačiau sparčiai pasišalinančių cheminių medžiagų apsivalymo laikotarpį galima sutrumpinti, kad prieš bandymo pabaigą būtų išvengta koncentracijos žuvyse verčių, mažesnių nei aptikimo ar kiekybinio nustatymo riba. Galima naudoti supaprastintą žuvų veikimo vienos vertės koncentracija bandymą, jei reikia nustatyti, ar būtinas viso masto bandymas, ir, jei gauti duomenys, naudojami greičio konstantoms ir BCF apskaičiuoti, yra patikimi (žr. 93 pastraipą), viso masto bandymo galima atsisakyti, jei gauta BCF vertė yra labai nutolusi nuo susirūpinimą keliančių reglamentavimo verčių.
                     Kai kuriais atvejais kaip parengiamąjį bandymą gali būti naudinga atlikti supaprastintą bandymą pagal schemą su daugiau kaip viena bandymo koncentracija, siekiant nustatyti, ar cheminei medžiagai gauti BCF įverčiai priklauso nuo koncentracijos. Jei BCF įverčiai, gauti atliekant supaprastintą bandymą, rodo priklausomybę nuo koncentracijos, būtina atlikti viso masto bandymą. Jei pagal tokio supaprastinto bandymo rezultatus BCF įverčiai nepriklauso nuo koncentracijos, bet rezultatai nėra laikomi galutiniais, galima atlikti vienos koncentracijos viso masto bandymą, taip sumažinant naudojamų gyvūnų skaičių palyginti su dviejų (ar daugiau) koncentracijos verčių viso masto bandymu.
                     Cheminės medžiagos, kurias būtų galima pasirinkti supaprastintam bandymui, turėtų:
                     
                                 —
                              
                              
                                 rodyti maždaug pirmojo laipsnio sugerties ir apsivalymo kinetiką, pvz., gautą atsižvelgiant į kryžmines nuorodas dėl panašių cheminių medžiagų;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 turėti log K
                                    OW < 6, jei nelaukiama greito metabolizmo (56);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pakankamai gerai tirpti vandenyje atsižvelgiant į analizės metodą (žr. 24 pastraipą);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 būti aiškiai kiekybiškai nustatomos (t. y. koncentracijos vertės turėtų būti bent viena eile didesnės nei kiekybinio nustatymo riba) žuvyje ir vandenyje, taip pat rekomenduojamos žymėtosios medžiagos (žr. 23 pastraipą); ir
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 turėti apsivalymo laikotarpį, ilgesnį nei prognozuojama pusėjimo trukmė (žr. 5 priedėlį dėl skaičiavimų), arba apsivalymo trukmę reikėtų atitinkamai reguliuoti (žr. 91 pastraipą). Šiai taisyklei galima taikyti išimtį, jei laukiamas greitas cheminės medžiagos metabolizmas.
                              
                           ĖMINIŲ ĖMIMO PROGRAMA ATLIEKANT TYRIMUS PAGAL SUPAPRASTINTĄ SCHEMĄ
                     
                        Žuvų ėminių ėmimas
                     
                     Žuvų ėminių ėmimo kartų skaičius sumažintas iki keturių:
                     
                                 —
                              
                              
                                 sugerties tarpsnio viduryje ir pabaigoje (jo pabaiga kartu būtų apsivalymo tarpsnio pradžia), pvz., po 14 ir 28 parų (33).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 apsivalymo tarpsnio viduryje ir tyrimo pabaigoje (kai cheminės medžiagos koncentracija yra < 10 % didžiausios koncentracijos, arba aiškiai ne anksčiau kaip cheminės medžiagos pusėjimo trukmė), pvz., praėjus 7 ir 14 parų nuo apsivalymo pradžios (33). Jei laukiamas ar stebimas spartus apsivalymas, apsivalymo laikotarpį gali tekti sutrumpinti, kad koncentracija žuvyse nesumažėtų iki mažesnės nei kiekybinio nustatymo riba;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 lipidų kiekis matuojamas kaip ir atliekant viso masto tyrimą;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pataisa dėl augimo kaip ir atliekant viso masto tyrimą;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 BCF apskaičiuojamas kaip kinetinis BCF.
                              
                           
                        Vandens ėminių ėmimas
                     
                     Taikant supaprastintą schemą, vandens ėminiai imami kaip atliekant viso masto tyrimą (žr. 54 pastraipą) arba bent penkis kartus vienodais tarpais sugerties tarpsniu ir kas savaitę apsivalymo tarpsniu.
                     
                        Schemos pakeitimai
                     
                     Atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos savybes, pagrįstas QSAR prognozes ir specifinį tyrimo tikslą, galima nuspręsti dėl kai kurių schemos pakeitimų:
                     
                                 —
                              
                              
                                 jei reikia geresnio tikslumo, sugerties tarpsnio pabaigoje galima imti didesnio žuvų skaičiaus ėminį (6 arba 8, o ne 4);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 įtraukti „papildomą“ naudojamų žuvų grupę, jei po 14 parų (arba prognozuojamoje apsivalymo tarpsnio pabaigoje) apsivalymas buvo nepakankamas (t. y. > 50 %). Jei prognozuojama apsivalymo tarpsnio trukmė yra trumpesnė arba ilgesnė nei 14 parų, reikėtų derinti ėminių ėmimo tvarkaraštį (t.y.vieną žuvų grupę imti prognozuojamoje apsivalymo tarpsnio pabaigoje ir vieną – praėjus pusei to laiko);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 naudoti dvi bandymo koncentracijos vertes galimai priklausomybei nuo koncentracijos tirti. Jei supaprastinto bandymo naudojant dvi bandymo koncentracijos vertes rezultatai rodo, kad BCF nepriklauso nuo koncentracijos (t. y. skiriasi mažiau kaip 20 %), galima laikyti, kad pakanka vienos koncentracijos viso masto bandymui atlikti, jei jis yra atliekamas;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tikėtina, kad planuojant sugerties ir apsivalymo tarpsnių trukmę gali padėti biologinio kaupimosi modeliai, pvz., pasiūlyti Arnot et al. (35) (taip pat žr. 5 priedėlį).
                              
                           
                        Skaičiavimai
                     
                     Šio metodo pagrindinis argumentas yra tas, kad atliekant viso mato bandymą biologinio koncentravimo faktorius gali būti nustatytas kaip nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BCFSS), skaičiuojant bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvies audinyje ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vandenyje santykį, arba skaičiuojant kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BCFK) kaip sugerties greičio konstantos k
                        1 ir apsivalymo greičio konstantos k
                        2 santykį. BCFK yra tikras netgi nepasiekus cheminės medžiagos nuostoviosios būsenos koncentracijos sugerties tarpsniu, jei sugertis ir apsivalymas vyksta maždaug kaip pirmojo laipsnio kinetikos procesai. Sugerties ir apsivalymo greičio konstantoms įvertinti būtinai reikia turėtų ne mažiau kaip du taškus, kurių vienas būtų sugerties tarpsnio pabaigoje (t. y. apsivalymo tarpsnio pradžioje), o kitas – apsivalymo tarpsnio pabaigoje (arba praėjus reikšmingai jo daliai). Rekomenduojamas tarpinis ėminių ėmimo taškas sugerties ir apvalymo tarpsnių kinetikai patikrinti (57). Dėl skaičiavimų žr. 5 ir 6 priedėlį.
                     
                        Rezultatų aiškinimas
                     
                     Siekiant įvertinti bandymo tinkamumą ir informacinę vertę, reikia patikrinti, ar apsivalymo laikotarpis yra ilgesnis nei viena pusėjimo trukmė. Be to, BCFKm (kinetinį BCF, gautą atliekant supaprastintą bandymą) reikėtų palyginti su supaprastinto bandymo BCFSS verte (kuri yra lygi BCFSS, apskaičiuotam sugerties tarpsnio pabaigoje, darant prielaidą, kad nuostovioji būsena buvo pasiekta. Galima daryti tik prielaidą, nes ėminių ėmimo taškų yra per mažai, kad tai būtų galima įrodyti). Jei BCFKm < supaprastinto bandymo BCFSS, supaprastinto bandymo BCFSS reikėtų teikti pirmenybę. Jei BCFKm yra mažesnis nei 70 % supaprastinto bandymo BCFSS, rezultatai netinka ir reikėtų atlikti viso masto bandymą.
                     Jei atliekant supaprastintą bandymą gautas BCFKm atitinka kurios nors susirūpinimą keliančios reglamentavimo vertės sritį, reikėtų atlikti viso masto bandymą. Jei rezultatas visiškai neatitinka kurios nors susirūpinimą keliančios reglamentavimo vertės (gerokai didesnis arba mažesnis), viso masto bandymas gali būti nebūtinas, arba galima atlikti vienos koncentracijos viso masto bandymą, jei to reikalauja atitinkama reglamentavimo sistema.
                     Jei, atlikus vienos koncentracijos supaprastintą bandymą, nustatoma, kad būtinas viso masto bandymas, jį galima atlikti naudojant kitą koncentraciją. Jei rezultatai yra suderinami, tolesnio viso masto bandymo naudojant skirtingas koncentracijos vertes galima atsisakyti, nes nesitikima, kad cheminės medžiagos biologinis koncentravimas priklausytų nuo koncentracijos. Jei supaprastintas bandymas buvo atliktas naudojant dvi koncentracijos vertes ir rezultatai nerodo priklausomybės nuo koncentracijos, viso masto bandymą galima atlikti naudojant tik vieną koncentraciją (žr. 87 pastraipą).
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į supaprastinto bandymo ataskaitą reikėtų įtraukti viso masto bandymui reikiamą informaciją (žr. 81 pastraipą), išskyrus tą informaciją, kurios neįmanoma gauti (t. y. kreivę, rodančią nuostoviosios būsenos pasiekimo trukmę, ir nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorių; vietoj pastarojo reikėtų pateikti supaprastinto bandymo BCFss). Be to, į ją turėtų būti įtrauktas supaprastinto bandymo naudojimo priežasčių aptarimas ir gautas BCFKm.
                     C.13 – III.   Biologinio kaupimosi žuvyse bandymas veikiant per mitybą
                     
                     ĮVADAS
                     Šiame skyriuje aprašytą metodą reikėtų taikyti cheminėms medžiagoms, kurioms neįmanoma taikyti veikimo per vandeninę terpę metodo (pvz., kai neįmanoma užtikrinti stabilios išmatuojamos koncentracijos vandenyje arba per 60 veikimo parų neįmanoma pasiekti reikiamo kūno sugerto kiekio; žr. ankstesnius veikimo per vandeninę terpę metodo skirsnius). Visgi reikėtų aiškiai suvokti, kad šio bandymo vertinamoji baigtis bus mitybos biomagnifikacijos faktorius (BMF), o ne biologinio koncentravimo faktorius (BCF) (58).
                     2001 m. gegužę Madride vykusioje Aplinkos toksikologijos ir chemijos draugijos (angl. Society of Environmental Toxicology and Chemistry) Europos skyriaus konferencijoje buvo pristatytas naujas vandenyje mažai tirpių organinių cheminių medžiagų biologinio kaupimosi bandymo metodas (36). Šis darbas pagrįstas įvairiais literatūroje pateiktais biologinio kaupimosi tyrimais, kuriuos atliekant taikomas dozavimo metodas naudojant sodrintą maistą (pvz. (37)). 2004 m. pradžioje ES PBT darbo grupei buvo pateiktas mažai vandenyje tirpių organinių cheminių medžiagų, kurioms neįmanoma taikyti etaloninio veikimo per vandeninę terpę metodo, biologinio kaupimosi gebos matavimo protokolo projektas (38) ir jį patvirtinančių nuorodų dokumentas (39). Papildomai metodui pagrįsti buvo nurodyta, kad galimas aplinkos poveikis esant tokioms mažai vandenyje tirpioms cheminėms medžiagoms (t. y. log K
                        OW > 5) daugiausia gali vykti per maistą (žr. (40) (41) (42) (43) (44)). Dėl šios priežasties mitybos bandymai buvo nurodyti kai kuriuose paskelbtuose cheminių medžiagų reglamentuose (59). Tačiau reikėtų suvokti, kad šiame skyriuje aprašytame bandymų metode griežtai vengiama veikti per vandeninę terpę, todėl šio bandymų metodo BMF vertė negali būti tiesiogiai lyginama su BMF verte, gauta atliekant tyrimą lauko sąlygomis (kai galima sujungti veikimą per vandeninę terpę ir mitybą).
                     Šis bandymų metodo skyrius atitinka šį protokolą (38) ir yra naujas metodas, kurio nėra ankstesnėje C.13 bandymų metodo versijoje. Taikant šį alternatyvų bandymą, galima tiesiogiai tirti mitybos kelią kontroliuojamomis laboratorinėmis sąlygomis.
                     Galimi tyrėjai turėtų remtis šio bandymų metodo 1–14 pastraipomis dėl informacijos apie tai, kada mitybos bandymui gali būti teikiama pirmenybė palyginti su veikimo per vandeninę terpę bandymu. Pateikta informacija apie įvairius cheminių medžiagų aspektus ir į juos reikėtų atsižvelgti prieš atliekant bandymą.
                     Galima atsižvelgti į galimybę naudoti žymėtąsias bandomąsias chemines medžiagas dėl panašių priežasčių, kurios buvo naudojamos taikant veikimo per vandeninę terpę metodą (žr. 6 ir 65 pastraipas).
                     Mitybos metodas gali būti taikomas daugiau kaip vienai cheminei medžiagai patikrinti atliekant vieną bandymą, jei jos atitinka tam tikrus kriterijus; jie nagrinėjami 112 pastraipoje. Procedūroms supaprastinti čia aprašomas bandymas, kurį atliekant tiriama tik viena cheminė medžiaga.
                     Mitybos bandymas daugeliu aspektų yra panašus į veikimo per vandeninę terpę bandymą, išskyrus, aišku, veikimo būdą. Taigi daugelis čia aprašyto metodo aspektų sutampa su veikimo per vandeninę terpę metodu, aprašytu pirmiau pateiktame skyriuje. Kiek įmanoma, pateikiamos kryžminės nuorodos į atitinkamas to skyriaus pastraipas, bet dėl skaitomumo ir supratimo priežasčių tam tikri pasikartojimai yra neišvengiami.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     Galima naudoti dinamines arba pusiau statines sąlygas (žr. 4 pastraipą); dinaminės sąlygos rekomenduojamos, kad būtų ribojamas galimas veikimas per vandenį bandomąja chemine medžiaga dėl desorbcijos nuo sodrinto maisto ar išmatų. Bandymą sudaro du tarpsniai – sugerties (bandomąja chemine medžiaga sodrintas maistas) ir apsivalymo (švarus, neapdorotas maistas) (žr. 16 pastraipą). Sugerties tarpsniu žuvų bandymo grupė kasdien šeriama nustatytos žinomos sudėties komerciniu žuvų maistu, sodrintu bandomąja chemine medžiaga. Būtų gerai, jei žuvys suėstų visą duodamą maistą (žr. 141 pastraipą). Apsivalymo etapu žuvys šeriamos grynu, neapdorotu komerciniu žuvų maistu. Esant poreikiui, galima naudoti daugiau negu vieną tyrimo grupę su skirtingomis tiriamomis cheminių medžiagų koncentracijomis, kaip veikimo per vandeninę terpę metode, tačiau daugumai stipraus hidrofobiškumo organinių cheminių medžiagų tyrimui vienos tyrimo grupės užtenka (žr. 49 ir 107 pastraipas). Jei naudojamos pusiau statinės sąlygos, sugerties tarpsnio pabaigoje žuvis reikėtų perkelti į naują terpę ir (arba) į naują bandymų kamerą (tuo atveju, kai naudojama įsisavinimo etape terpė ir / arba aparatūra buvo užteršta tiriamąja chemine medžiaga). Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyse vertės matuojamos abiem bandymo tarpsniais. Be sodrintu maistu šeriamos žuvų grupės (bandymo grupės) yra kontrolinė žuvų grupė, laikoma vienodomis sąlygomis ir vienodai šeriama, išskyrus tai, kad komercinis žuvų maistas nesodrinamas bandomąja chemine medžiaga. Galima kiekybiškai įvertinti bandomosios cheminės medžiagos foninę koncentraciją tokios kontrolinės grupės neapdorotose žuvyse ir tą grupę naudoti palyginimui su nepageidaujamais reiškiniais, stebimais bandymo grupėje (-ėse) dėl apdorojimo (60). Taip pat galima lyginti augimo greičio konstantas tarp grupių, kaip būdą patikrinti, ar buvo suvartoti panašūs duodamo maisto kiekiai (aiškinant skirtingas augimo greičio konstantas, reikia atsižvelgti į galimus maisto skonio skirtumus; žr. 138 pastraipą). Svarbu, kad sugerties ir apsivalymo tarpsniais bandymo ir kontrolinės grupės būtų maitinamos vienodos mitybinės vertės maistu.
                     Atsižvelgiant į metodo kūrėjų patirtį, sugerties tarpsnis turėtų trukti 7–14 parų (38) (39). Toks laikotarpis turėtų kiek įmanoma sumažinti bandymo atlikimo kainą, bet kartu užtikrinti pakankamą daugelio tiriamų cheminių medžiagų poveikį. Tačiau kai kuriais atvejais sugerties tarpsnis gali būti pratęstas (žr. 127 pastraipą). Per sugerties tarpsnį cheminės medžiagos koncentracija žuvyse gali nepasiekti nuostoviosios būsenos, todėl duomenų apdorojimas ir šiuo metodu gauti rezultatai paprastai yra pagrįsti likučių audiniuose kinetikos analize. (Pastaba. Šiuo atveju kaip ir veikimo per vandeninę terpę metodui galima naudoti nuostoviosios būsenos pasiekimo trukmės nustatymo lygtis, žr. 5 priedėlį). Apsivalymo tarpsnis prasideda žuvims pirmą kartą davus nesodrinto maisto ir jis paprastai trunka iki 28 parų arba trumpiau, kai bandomosios cheminės medžiagos nebegalima kiekybiškai nustatyti visoje žuvyje. Apsivalymo tarpsnį galima sutrumpinti ar tęsti ilgiau kaip 28 paras, priklausomai nuo cheminės medžiagos koncentracijos ir žuvų dydžio pokyčių laikui einant.
                     Šiuo metodu galima nustatyti cheminės medžiagos būdingą pusėjimo trukmę žuvyse (t
                        1/2, pagal apsivalymo greičio konstantą k
                        2), bandomosios cheminės medžiagos žuvyje įsisavinimo efektyvumą (absorbciją per virškinimo traktą a), kinetinį mitybos biomagnifikacijos faktorių (BMFK), kinetinį mitybos biomagnifikacijos faktorių su pataisa dėl augimo (BMFKg), kinetinį mitybos biomagnifikacijos faktorių su pataisa dėl lipidų (61) (BMFKL) (ir (arba) kinetinį mitybos biomagnifikacijos faktorių su pataisa dėl augimo ir lipidų BMFKgL). Kaip ir veikimo per vandeninę terpę metodo atveju, dėl žuvies masės padidėjimo bandymo metu vyksta bandomosios cheminės medžiagos praskiedimas dėl žuvies augimo, todėl (kinetinio) BMF reikšmė bus per maža, jei nebūtų daroma pataisa dėl augimo (žr. 162 ir 163 pastraipas). Be to, jei įvertinama, kad sugerties tarpsniu buvo pasiekta nuostovioji būsena, galima apskaičiuoti būdingąjį nuostoviosios būsenos BMF. Naudojant šiuos metodus galima apskaičiuoti kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BKFK) iš mitybos tyrimo duomenų (pvz., (44) (45) (46) (47) (48). 8 priedėlyje yra aptariami šių metodų privalumai ir trūkumai.
                     Bandymas buvo pirmiausia skirtas mažai tirpioms nepolinėms organinėms cheminėms medžiagoms, kurių sugerties ir apsivalymo kinetika žuvyse yra maždaug pirmojo laipsnio. Jei bandoma cheminė medžiaga, kurios sugerties ir apsivalymo kinetika nėra maždaug pirmojo laipsnio, reikėtų taikyti sudėtingesnius modelius (žr. 5 priedėlio nuorodas), taip pat klausti biologinės statistikos ir (arba) farmakologinės kinetikos specialisto patarimo.
                     BMF paprastai yra nustatomas atliekant bandomosios cheminės medžiagos kiekio analizę visoje žuvyje (šlapios kūno masės atžvilgiu). Tačiau jei tai atitinka tyrimo tikslus, gali būti imami tam tikrų audinių (pvz., raumenų, kepenų) ėminiai, jei žuvis padalyta į valgomąją ir nevalgomą dalis (žr. 21 pastraipą). Be to, galima pašalinti virškinimo traktą ir jį analizuoti atskirai, kad būtų nustatytas jo indėlis į visos žuvies koncentracijos vertę, imant ėminius sugerties tarpsnio pabaigoje ir prieš apsivalymo tarpsnio pradžią, arba šį būdą galima naudoti kaip masių balanso metodo dalį.
                     Reikėtų išmatuoti visos žuvies ėminio lipidų kiekį, kad būtų galima daryti koncentracijos pataisą dėl lipidų, atsižvelgiant į jų kiekį maiste ir žuvyje (žr. 56 bei 57 pastraipas ir 7 priedėlį).
                     Reikėtų matuoti ir registruoti ėminiams paimtų atskirų žuvų masę, kuri būtų susieta su analizuojamos cheminės medžiagos koncentracija toje žuvyje (pvz., naudojant unikalų identifikavimo kodą kiekvienai ėminio žuviai), kad būtų galima apskaičiuoti galimą augimą bandymo metu. Jei įmanoma, reikėtų išmatuoti visą žuvies ilgį (62). Masės duomenys taip pat yra būtini vertinant BKF pagal mitybos bandymo apsivalymo duomenis.
                     INFORMACIJA APIE BANDOMAJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                     Reikėtų turėti informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kaip aprašyta 3 ir 22 pastraipose. Analizės metodas bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vandenyje analizės metodas paprastai nėra būtinas; reikia turėti tinkamo jautrio metodus koncentracijai žuvų maiste ir žuvų audiniuose matuoti.
                     Atliekant vieną bandymą, gali būti taikomas metodas daugiau kaip vienai cheminei medžiagai nustatyti. Tačiau bandomosios cheminės medžiagos turėtų būti suderinamos, kad negalėtų vykti jų sąveika ir nepakistų jų cheminė sudėtis sodrinant jomis žuvų maistą. Siekiama, kad išmatuoti kiekvienos cheminės medžiagos rezultatai neturėtų labai skirtis nuo rezultatų, gautų kiekvieną cheminę medžiagą bandant atskirai. Atliekant parengiamuosius analizės darbus, reikėtų nustatyti, ar kiekvieną cheminę medžiagą galima atgauti iš daugeliu cheminių medžiagų sodrinto maisto ir žuvies audinių ėminio, esant i) dideliam atgavimo laipsniui (pvz., > 85 % nominalaus kiekio) ir ii) bandymui atlikti reikiamam jautriui. Suminė kartu bandytų cheminių medžiagų dozė turėtų būti mažesnė nei jungtinė koncentracija, kuri galėtų sukelti toksinį poveikį (žr. 51 pastraipą). Be to, kuriant bandymų schemą, reikėtų atsižvelgti į galimus nepageidaujamus reiškinius žuvyse ir į interaktyvių poveikių potencialą (pvz., metabolizmo reiškinių), susijusius su daugelio cheminių medžiagų bandymu, vienu metu. Reikėtų vengti kartu bandyti jonizuojančias chemines medžiagas. Kalbant apie veikimą, metodas taip pat tinka kompleksiniams mišiniams (žr. 51 pastraipą), nors galioja tie patys analizės apribojimai, kaip ir taikant bet kurį kitą metodą.
                     BANDYMO TINKAMUMAS
                     Taikomos šios bandymo tinkamumo sąlygos (žr. 24 pastraipą):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Tiriamosioms ir kontrolinėms grupėms vandens temperatūros svyravimai mažiau kaip ± 2 °C;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ištirpusio deguonies koncentracija neturi būti žemesnė nei 60 % soties ore vertės;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvų maiste prieš sugerties tarpsnį ir jo pabaigoje skiriasi ne daugiau kaip ± 20 % (pagrįsta bent trijų ėminių rezultatais paimtais prieš ir po sugerties tarpsnio;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 didelį cheminės medžiagos homogeniškumo laipsnį maiste reikia įrodyti, atliekant preliminarinius parengiamuosius sodrinto maisto analizės darbus; bent trijų bandymo pradžioje paimtų ėminių cheminės medžiagos koncentracija neturėtų skirtis daugiau kaip ± 15 % nuo vidurkio;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 nesodrintame maiste arba kontroliniuose žuvų audiniuose bandomosios cheminės medžiagos neaptinkama arba jos kiekis atitinka tipinius pėdsakų lygius palyginus su apdorotais ėminiais;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kontrolinių ir apdorotų ėminių žuvų gaištamumas arba kiti neigiami reiškiniai ir (arba) susirgimai bandymo pabaigoje turėtų būti mažesni nei 10 %; jei dėl kokios nors priežasties bandymas pratęsiamas, neigiami reiškiniai abiejose žuvų grupėse turėtų būti mažesni nei 5 % per mėnesį ir apskritai ne didesni kaip 30 %. Reikšmingi vidutinio augimo skirtumai tarp bandymo ir kontrolinių žuvų grupių ėminių galėtų būti bandomosios cheminės medžiagos toksinio poveikio rodiklis.
                              
                           ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS
                     Jei laboratorija anksčiau nė karto nebuvo atlikusi tokio tyrimo arba buvo padaryti reikšmingi pakeitimai (pvz., pakeista žuvų veislė ar tiekėjas, kita žuvų rūšis, reikšmingi žuvų dydžio pasikeitimai, maisto ar sodrinimo metodo pakeitimai ir kt.), patartina atlikti techninės kvalifikacijos tyrimą, naudojant etaloninę cheminę medžiagą. Pagrindinis etaloninės medžiagos naudojimo tikslas – nustatyti, ar tinka taikomas maisto sodrinimo metodas, kad būtų užtikrintas maksimalus bandomųjų cheminių medžiagų homogeniškumas ir biologinis įsisavinamumas. Vienas iš naudojamų nepolinių hidrofobinių medžiagų pavyzdžių yra heksachlorbenzenas (HCB), bet dėl jo pavojingų savybių būtų galima pagalvoti apie kitas chemines medžiagas, jei yra patikimų duomenų apie sugertį ir biologinį koncentravimą per maistą (63). Jei naudojama etaloninė cheminė medžiaga, bandymo ataskaitoje apie ją reikėtų pateikti pagrindinę informaciją kaip ir apie bandomąsias chemines medžiagas, įskaitant pavadinimą, grynumą, CAS numerį, struktūrą, toksiškumo duomenis (jei yra) (žr. 3 ir 22 pastraipas).
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Aparatūra
                     
                     Medžiagos ir aparatūra turi būti naudojamos kaip nurodyta veikimo per vandeninę terpę metodo aprašyme (žr. 26 pastraipą). Reikėtų naudoti dinaminio ar statinio atnaujinimo sistemą, kuri užtikrina pakankamą į bandymo indus tiekiamo skiedimo vandens tūrį. Reikėtų registruoti srautą.
                     
                        Vanduo
                     
                     Vanduo turi būti naudojamos kaip nurodyta veikimo per vandeninę terpę metodo aprašyme (žr. 27–29 pastraipas). Bandymo terpė turėtų būti apibūdinta, kaip aprašyta, ir jos kokybė turėtų būti pastovi visą bandymo trukmę. Natūralus kietųjų dalelių kiekis ir suminės organinės anglies (TOC) kiekis prieš bandymo pradžią turėtų būti kuo mažesnis (≤ 5 mg/l kietųjų dalelių; ≤ 2 mg/l suminės organinės anglies). TOC, kaip vieną iš vandens charakteristikų, reikia matuoti tik prieš bandymą (žr. 53 pastraipą).
                     
                        Maistas
                     
                     Rekomenduojama naudoti pirktinį žuvų maistą (plūduriuojančias ir (arba) lėtai skęstančias maisto granules), kuris yra apibūdinamas, nurodant bent baltymų ir riebalų kiekį. Maisto granulės turėtų būti vienodo dydžio, kad būtų didesnis mitybos poveikio efektyvumas, t. y. žuvys suėstų daugiau maisto, nei ėsdamos tik didesnius gabalus ir nematydamos mažesnių. Granulių matmenys turėtų atitikti žuvų dydį bandymo pradžioje (pvz., galima naudoti granules, kurių skersmuo yra maždaug 0,6–0,85 mm, kai visas žuvų ilgis yra 3–7 cm, ir 0,85–1,2 mm, kai visas ilgis yra 6–12 cm). Granulių dydį, atsižvelgiant į žuvų augimą, apsivalymo tarpsnio pradžioje galima keisti. Tinkamos pirktinio maisto sudėties pavyzdys yra pateiktas 7 priedėlyje. Kuriant šį bandymų metodą, paprastai buvo naudojamas maistas, kurio suminis lipidų kiekis buvo 15–20 % (w/w)). Kai kuriuose regionuose gali nebūti maisto su tokia didele lipidų koncentracija. Tokiais atvejais tyrimai turėtų būti atliekami esant mažesnei tiekiamo maisto lipidų koncentracijai, bet prireikus reikėtų tinkamai reguliuoti maitinimo dažnumą, kad būtų užtikrinta gera žuvų sveikata (atsižvelgiant į parengiamuosius bandymus). Suminį lipidų kiekį bandymo grupės ir kontrolinės grupės maiste reikia matuoti ir registruoti prieš bandymo pradžią ir sugerties tarpsnio pabaigoje. Tyrimo ataskaitoje reikėtų pateikti maistinių medžiagų, drėgmės, ląstelienos, pelenų ir, jei įmanoma, mineralų bei pesticidų likučių (pvz., tipinių ypač pavojingų teršalų) analizės duomenis, kuriuos pateikia pirktinio maisto tiekėjas.
                     Sodrinant maistą bandomąja chemine medžiaga, reikia imtis visų priemonių maisto homogeniškumui užtikrinti viso bandymo metu. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija bandymo grupės maiste turėtų būti pasirinkta atsižvelgiant į analizės metodo jautrį, bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą (NOEC, jei žinoma) ir atitinkamus fizikinius ir cheminius duomenis. Naudojant etaloninę cheminę medžiagą, ją reikėtų įterpti esant koncentracijai, kuri būtų maždaug 10 % bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos (arba kiek įmanoma mažesnė), atsižvelgiant į analizės jautrį (pvz., buvo nustatyta, kad priimtina heksachlorbenzeno koncentracija maiste yra 1–100 μg/g; daugiau informacijos apie HCB įsisavinimo efektyvumą pateikta (47).
                     Žuvų maistą galima sodrinti bandomąja chemine medžiaga keliais būdais, atsižvelgiant į fizikines charakteristikas ir tirpumą (daugiau duomenų apie sodrinimo metodus pateikta 7 priedėlyje):
                     
                                 —
                              
                              
                                 jei cheminė medžiaga yra tirpi ir stabili trigliceriduose, ją prieš sumaišant su žuvų maistu reikėtų ištirpinti nedideliame žuvų taukų arba maistinio augalinio aliejaus kiekyje. Šiuo atveju reikėtų pasirūpinti, kad, atsižvelgiant į natūralų lipidų kiekį sodrintame maiste, nebūtų gaminamas per daug lipidų turintis racionas, pridedant žinomą minimalų aliejaus kiekį, kurio reikia bandomosios cheminės medžiagos paskirstymui ir homogeniškumui pasiekti; arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 maistą reikėtų sodrinti naudojant tinkamą organinį tirpiklį, jei tai neblogina homogeniškumo ir biologinio įsisavinamumo (yra tikimybė, kad dėl tirpiklio garavimo gali susidaryti bandomosios cheminės medžiagos (mikro) kristalai ir nėra lengvo būdo įrodyti, kad taip neįvyko; žr. (49)); arba
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Neklampius skysčius reikėtų tiesiogiai įterpti į žuvų maistą, tačiau juos reikėtų gerai sumaišyti, kad būtų užtikrintas homogeniškumas ir palengvintas geras įsisavinamumas. Maišymo metodas turėtų užtikrinti sodrinto maisto homogeniškumą.
                              
                           Kai kuriais atvejais, pvz., kadangi mažiau hidrofobinių bandomųjų cheminių medžiagų desorbcija iš maisto yra labai tikėtina, paruoštas maisto granules reikėtų padengti plonu kukurūzų aliejaus ar žuvų taukų sluoksniu (žr. 142 pastraipą). Tokiais atvejais, kontrolinių ėminių maistas turėtų būti apdorojamas panašiai ir galutinai paruoštas maistas naudojamas lipidų kiekiui nustatyti.
                     Jei naudojamos etaloninės medžiagos, jų rezultatai turėtų būti palyginami su literatūroje pateiktais panašiomis sąlygomis atliktų tyrimų, naudojant palyginamą maisto normą, duomenimis (žr. 45 pastraipą), o etaloninei cheminei medžiagai būdingi parametrai turėtų atitikti taikytinus 113 pastraipos (3, 4 ir 5 punktų) kriterijus.
                     Jei kaip bandomosios cheminės medžiagos nešiklis naudojamas aliejus arba tirpiklis, to paties nešiklio (be bandomosios cheminės medžiagos) lygiavertį kiekį reikėtų sumaišyti su kontrolinio ėminio maistu, kad būtų užtikrintas lygiavertiškumas su sodrintu maistu. Svarbu, kad sugerties ir apsivalymo tarpsniais bandymo ir kontrolinės grupės būtų maitinamos vienodos mitybinės vertės maistu.
                     Sodrintą maistą reikėtų laikyti sąlygomis, kurios užtikrina bandomosios cheminės medžiagos stabilumą maisto mišinyje (pvz., laikyti šaldytuve), ir šias sąlygas pateikti ataskaitoje.
                     
                        Žuvų rūšių parinkimas
                     
                     Galima naudoti žuvų rūšis, nurodytas atliekant veikimo per vandeninę terpę metodą (žr. 32 pastraipą ir 3 priedėlį). Atliekant organinių cheminių medžiagų biologinio kaupimosi per maistą tyrimus prieš šio bandymų metodo paskelbimą, dažniausiai naudojamos rūšys buvo vaivorykštinis upėtakis (Oncorhynchus mykiss), karpis (Cyprinus carpio) ir juodoji drūtagalvė rainė (Pimephales promelas). Bandymo žuvų rūšys turėtų kuo sparčiau suėsti duodamą maisto normą, siekiant užtikrinti, kad visi veiksniai, kurie daro įtaką bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai maiste (pvz., išplovimas į vandenį ir veikimo per vandeninę terpę galimybė) pasireikštų kuo mažiau. Reikėtų naudoti žuvis, kurios atitiktų rekomenduojamą dydžio ir masės intervalą (žr. 3 priedėlį). Žuvys neturėtų būti per mažos, kad nebūtų apsunkinta atskirų žuvų analizė. Gyvavimo ciklo metu sparčiai augančios bandymų žuvų rūšys gali apsunkinti duomenų aiškinimą, o didelis augimo greitis gali daryti įtaką įsisavinimo efektyvumo skaičiavimui (64).
                     
                        Žuvų laikymas
                     
                     Priimtinumo kriterijai, susiję su aklimatizavimu, gaištamumu ir susirgimais, atitinka veikimo per vandeninę terpę metodo kriterijus, išmatavus laidumą prieš tyrimą (žr. 33–35 pastraipas).
                     BANDYMŲ EIGA
                     
                        Pasirengimo tyrimui darbai ir intervalo nustatymo bandymas
                     
                     Pasirengimo tyrimui analizės darbai yra būtini, kad būtų galima įrodyti cheminės medžiagos atgavimą iš prisodrinto maisto ar prisodrinto žuvų audinio. Intervalo nustatymo bandymas tinkamai koncentracijai maiste pasirinkti ne visada būtinas. Būtų galima atlikti parengiamuosius maisto davimo bandymus, turint tikslą įrodyti neigiamo poveikio nebuvimą, įvertinti sodrinto maisto skonines savybes ir žuvų audinių bei maisto analizės metodo jautrį ir pasirinkti tinkamą maisto normą bei ėminių ėmimo intervalus apsivalymo tarpsnio metu ir kt., tačiau jie nėra privalomi. Parengiamasis tyrimas gali būti naudingas įvertinant apsivalymo tarpsniu imamų ėminių žuvų skaičių. Taip būtų galima žymiai sumažinti naudojamų žuvų skaičių, ypač jautrioms metabolizmui tiriamosioms cheminėms medžiagoms.
                     
                        Veikimo sąlygos
                     
                     
                        Sugerties tarpsnio trukmė
                     
                     Paprastai pakanka 7–14 parų trukmės sugerties tarpsnio, kurio metu viena žuvų grupė maitinama kontroliniu maistu, o kita žuvų grupė kasdien maitinama bandymo maistu esant nustatytam daviniui, kuris priklauso nuo žuvų bandymų rūšies ir bandymo sąlygų, pvz., vaivorykštiniam upėtakiui – nuo 1 iki 2 % kūno masės (šlapios kūno masės). Maisto norma turėtų būti parinkta taip, kad būtų išvengta greito augimo ir didelio lipidų kiekio padidėjimo. Jei reikia, atsižvelgiant į praktinę ankstesnių tyrimų patirtį ar turint bandomosios cheminės medžiagos (arba jos analogų) sugerties ir (arba) apsivalymo žuvyse duomenų, sugerties tarpsnis gali būti pratęstas. Bandymo pradžia nustatoma kaip laikas, kai žuviai pirmą kartą duodama sodrinto maisto. Bandymo para trunka nuo maisto davimo iki truputį anksčiau (pvz., viena valanda) nei kitas maisto davimo momentas. Taigi pirmoji bandymo sugerties tarpsnio para prasideda nuo pirmo sodrinto maisto davimo momento ir baigiasi beveik prieš pat sodrinto maisto davimą antrą kartą. Praktiškai sugerties tarpsnis baigiasi beveik prieš pat (pvz., viena valanda) pirmą kartą duodant bandomąja chemine medžiaga nesodrinto maisto, nes žuvis ir toliau virškina sodrintą maistą ir sugeria bandomąją cheminę medžiaga per tarpines 24 h. Svarbu užtikrinti, kad, atsižvelgiant į analizės metodą, sugertų pakankamai didelį (netoksinį) bandomosios cheminės medžiagos kiekį, kad apsivalymo metu būtų galima matuoti bent vienos eilės dydžio sumažėjimą. Specialiais atvejais sugerties tarpsnį galima pratęsti (iki 28 parų), imant papildomus ėminius, kad būtų galima įsigilinti į sugerties kinetiką. Per sugerties tarpsnį cheminės medžiagos koncentracija žuvyse gali nepasiekti nuostoviosios būsenos. Siekiant įvertinti nuostoviosios būsenos pasiekimo trukmę, kaip reikšmingos koncentracijos žuvyje gavimo tikėtinos trukmės rodiklį, galima taikyti veikimo per vandeninę terpę metodo skirtas lygtis (žr. 5 priedėlį).
                     Kartais gali būti žinoma, kad, dėl per mažo analizės jautrio ar įsisavinimo efektyvumo, per 7–14 parų žuvies sugertas cheminės medžiagos kiekis, esant naudojamai koncentracijai maiste, gali būti per mažas gauti koncentraciją, kuri leistų išmatuoti bent vienos eilės jos mažėjimą apsivalymo. Tokiais atvejais gali būti naudinga pratęsti pradinį maitinimo tarpsnį ilgiau nei 14 parų arba reikėtų atsižvelgti į galimybę padidinti koncentraciją maiste, ypač tų cheminių medžiagų, kurios yra labai jautrios metabolizmui. Tačiau reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad sugerties tarpsniu kūno sugertos medžiagos kiekis būtų mažesnis nei (įvertinta) lėtinio poveikio nebuvimo koncentracija (NOEC) žuvies audinyje (žr. 138 pastraipą).
                     
                        Apsivalymo tarpsnio trukmė
                     
                     Apsivalymas paprastai trunka ne ilgiau kaip 28 paras ir prasideda, kai bandymo grupės žuvys po sugerties tarpsnio gauna gryno, neapdoroto maisto. Apsivalymas prasideda ne iš karto po paskutinio sodrinto maisto davimo, bet pirmą kartą davus nesodrinto maisto, nes žuvis toliau virškins maistą ir įsisavins bandomąją cheminę medžiagą per tarpines 24 h, kaip nurodyta 126 pastraipoje. Todėl pirmasis apsivalymo tarpsnio ėminys imamas beveik prieš pat antrąjį maitinimą nesodrintu maistu. Per šį apsivalymo laikotarpį numatoma aptikti medžiagas, kurių galima pusėjimo trukmė yra iki 14 parų, nes ji atitinka biologiškai kauptis galinčių cheminių medžiagų savybes, todėl (65) 28 paros sudaro dvi tokių cheminių medžiagų pusėjimo trukmes. Jei cheminių medžiagų biologinio kaupimosi geba yra labai didelė, gali būti naudinga pratęsti apsivalymo tarpsnį (jei tai rodo preliminarūs parengiamieji bandymai).
                     Jei cheminė medžiaga pasišalina labai lėtai, pvz., kai apsivalymo tarpsniu neįmanoma nustatyti tikslios pusėjimo trukmės, informacijos vis dar gali pakakti vertinimo tikslams, kad būtų pažymėta didelė biologinio kaupimosi geba. Ir atvirkščiai, jei cheminė medžiaga pasišalina taip greitai, kad patikima nulinio laiko koncentracija (koncentracija sugerties tarpsnio pabaigoje ar apsivalymo tarpsnio pradžioje C
                        0,d) ir k
                        2 negali būti apskaičiuotos, galima gauti sumažintą k
                        2 įvertį (žr. 7 priedėlį).
                     Jei žuvų analizė ankstesniais laikotarpiais (pvz., 7 arba 14 parą) rodo, kad cheminė medžiaga pasišalino ir jos kiekis sumažėjo iki mažesnės nei kiekybinio nustatymo koncentracija greičiau nei per 28 paras, ėminių galima nebeimti ir bandymą nutraukti.
                     Kartais gali būti taip, kad sugerties tarpsnio pabaigoje (ar antrame apsivalymo tarpsnio ėminyje) nenustatoma matuoti tinkama bandomosios cheminės medžiagos sugertis. Jei galima įrodyti, kad: i) yra atitiktis 113 pastraipoje nurodytiems tinkamumo kriterijams ir ii) sugerties nebuvimas nėra susijęs su kai kuriais kitais bandymo atlikimo trūkumais (pvz., nepakankama sugerties trukmė, dėl netinkamo maisto sodrinimo metodo yra per mažas biologinis įsisavinamumas, nepakankamas analizės metodo jautris, žuvys nevartoja maisto ir kt.), tyrimą galima nutraukti ir nekartoti taikant ilgesnę sugerties trukmę. Jei atliekant parengiamąjį darbą buvo įrodyta, kad tai yra būtent toks atvejis, būtų galima patarti atlikti, jei įmanoma, išmatų analizę, kaip masių balanso metodo dalį, neįsisavintai bandomajai cheminei medžiagai nustatyti.
                     
                        Bandomųjų žuvų skaičius
                     
                     Kaip ir atliekant veikimo per vandeninę terpę metodą, reikėtų pasirinkti panašios masės ir ilgio žuvis, kad mažiausios žuvies masė būtų ne mažesnė nei dvi trečiosios didžiausios žuvies masės (žr. 40–42 pastraipas).
                     Suminis tyrimo žuvų skaičius turėtų būti pasirinktas pagal ėminių ėmimo tvarkaraštį (ne mažiau kaip po vieną ėminį sugerties tarpsnio pabaigoje ir nuo keturių iki šešių ėminių apsivalymo tarpsnio metu, bet priklausomai nuo tarpsnių trukmės), atsižvelgiant į analizės metodo jautrį, koncentraciją, kuri galėtų būti sugerties tarpsnio pabaigoje (pagal ankstesnius duomenis) ir apsivalymo tarpsnio trukmę (jei galima įvertinti turint ankstesnių duomenų). Kiekvienu ėminio ėmimo atveju reikėtų ištirti nuo penkių iki dešimties žuvų, kurių augimo parametrai (masė ir visas ilgis) būtų išmatuoti prieš cheminės medžiagos ar lipidų analizę.
                     Dėl žuvų dydžio, augimo greičio bei fiziologijos ir galbūt dėl duodamo maisto kiekio, kurį suvartoja kiekviena žuvis, būdingo kintamumo, kiekvieną kartą reikėtų imti ne mažiau kaip penkių žuvų bandymo grupės ėminį ir penkių žuvų kontrolinės grupės ėminį, kad būtų tinkamai nustatyta vidutinė koncentracija ir jos kintamumas. Naudojamų žuvų parametrų kintamumas gali turėti daugiau įtakos visuminiam nekontroliuojamam bandymo kintamumui, nei taikomoms analizės metodikoms būdingas kintamumas, todėl kartais pasiteisina iki dešimties žuvų ėminys vienam ėminių ėmimo kartui. Tačiau, jei apsivalymo tarpsnio pradžioje neįmanoma išmatuoti kontrolinių žuvų foninės bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, gali pakakti tik dviejų ar trijų žuvų cheminės analizės galutiniu ėminių ėmimo laikotarpiu, jei likusių kontrolinių žuvų ėminiai būtų imami visuose taškuose masei ir visam ilgiui nustatyti (taigi augimui nustatyti imamas vienodas bandymo ir kontrolinių grupių žuvų skaičius). Žuvis reikėtų sukaupti, atskirai pasverti (netgi jei būtų taip, kad ėminio rezultatus reikėtų vėliau sujungti) bei išmatuoti jų visą ilgį.
                     Atliekant tipinį bandymą, pvz., esant 28 parų apsivalymo trukmei ir apsivalymo tarpsnio metu imant penkis ėminius, reikėtų 59–120 žuvų bandymo grupei ir 50–110 žuvų kontrolinei grupei, darant prielaidą, kad cheminės medžiagos analizės metodas duoda galimybę nustatyti lipidų kiekį toje pačioje žuvyje. Jei lipidų analizei negalima panaudoti cheminės medžiagos analizei paimtos žuvies ir taip pat yra neįmanoma kontrolines žuvis naudoti vien tik lipidų analizei (žr. 56 pastraipą), reikėtų paimti papildomai dar 15 žuvų (tris iš pradinės populiacijos bandymo pradžioje, po tris iš kontrolinės ir bandymo grupės apsivalymo tarpsnio pradžioje ir po tris iš kontrolinės ir bandymo grupės bandymo pabaigoje). Žuvų ėmimo tvarkaraščio ir žuvų skaičiaus pavyzdys pateiktas 4 priedėlyje.
                     
                        Įkrova
                     
                     Panašiai kaip taikant veikimo per vandeninę terpę metodą (žr. 43 ir 44 pastraipas), reikėtų naudoti didelius vandens ir žuvų santykius. Nors atliekant šį bandymą žuvų įkrovos dydis neturi įtakos veikimo koncentracijai, rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1–1,0 g žuvies (šlapios kūno masės) litrui vandens per parą, kad būtų galima užtikrinti reikiamą ištirpusio deguonies koncentraciją ir sumažinti bandymo organizmams keliamą stresą.
                     
                        Bandymų maistas ir maitinimas
                     
                     Aklimatizavimo laikotarpiu žuvis reikėtų maitinti tinkamu maistu, kaip aprašytą pirmiau (117 pastraipa). Jei bandymas atliekamas dinaminėmis sąlygomis, srautą reikėtų stabdyti žuvų maitinimo metu.
                     Bandymo grupės maistas atliekant bandymą turėtų atitikti pirmiau aprašytą (116–121 pastraipa). Pasirenkant tikslinę sodrinimo koncentraciją, reikėtų atsižvelgti ne tik į cheminei medžiagai būdingus veiksnius, analizės jautrį, tikėtiną koncentraciją maiste aplinkos sąlygomis ir lėtinio toksiškumo koncentracijos vertes ar kūno sugertą kiekį, bet ir į maisto skonines savybes (kad žuvis nenustotų jo ėsti). Ataskaitoje reikėtų pateikti bandomosios cheminės medžiagos nominalią sodrinimo koncentraciją. Atsižvelgiant į patirtį, sodrinimo koncentracija 1–1 000 μg/g yra praktinis darbinis intervalas, taikomas bandomosioms cheminėms medžiagoms, kurios nerodo specifinio toksiškumo mechanizmo. Jei cheminė medžiaga veikia ne pagal specifinį mechanizmą, likučių audiniuose koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 5 μmol/g lipidų, nes dėl didesnio nei šis likučių kiekio gali pasireikšti lėtinis poveikis (19) (48) (50) (66). Dėl kitų cheminių medžiagų reikėtų imtis priemonių, kad dėl kaupiamojo poveikio nebūtų jokių neigiamų reiškinių (žr. 127 pastraipą). Tai ypač galioja tam atvejui, kai vienu metu bandoma daugiau kaip viena cheminė medžiaga (žr. 112 pastraipą).
                     Reikiamu bandomosios cheminės medžiagos kiekiu galima sodrinti žuvų maistą vienu iš trijų būdų, kaip aprašyta 119 pastraipoje ir 7 priedėlyje. Maisto sodrinimo metodus ir procedūras reikėtų aprašyti ataskaitoje. Kontrolinėms žuvims duodamas neapdorotas maistas, turintis lygiavertį nesodrinto aliejaus nešiklio kiekį, jei sugerties tarpsniu aliejus buvo naudojamas sodrintam maistui, arba apdorotas grynu tirpikliu, jei bandymo grupių maistui ruošti kaip nešiklis buvo naudojamas tirpiklis. Bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją apdorotame ir neapdorotame maiste reikėtų nustatyti sugerties tarpsnio pradžioje ir pabaigoje, atliekant ne mažiau kaip trijų kartotinių ėminių analizę. Nustojus žuvis veikti apdorotu maistu (sugerties tarpsniui), žuvys (abi grupės) maitinamos neapdorotu maistu (apsivalymo tarpsniu).
                     Žuvys maitinamos duodant nustatytą kiekį (kuris priklauso nuo rūšies; pvz., vaivorykštiniam upėtakiui – nuo 1 iki 2 % šlapios kūno masės per parą). Maisto norma turėtų būti parinkta taip, kad būtų išvengta greito augimo ir didelio lipidų kiekio padidėjimo. Reikėtų registruoti tikslią bandymui nustatytą maisto normą. Pradinė maisto norma turėtų būti pagrįsta reguliariu pradinės populiacijos masės matavimu prieš pat bandymo pradžią. Maisto kiekį reikėtų koreguoti, atsižvelgiant į ėminių žuvų šlapią kūno masę kiekvieną kartą imant ėminius bandymo metu. Bandymo ir kontrolinių indų žuvų masę ir ilgį galima įvertinti pagal žuvų, paimtų kiekvieną kartą imant ėminį, masę ir ilgį; bandymo ir kontroliniame inde likusių žuvų masė ir ilgis nematuojami. Svarbu visą bandymą užtikrinti vienodą nustatytą maisto normą.
                     Maitinimo procesą reikėtų stebėti, siekiant įsitikinti, ar žuvys akivaizdžiai suvartoja visą duotą maistą, nes tai užtikrintų, kad atliekant skaičiavimus bus naudojamos reikiamos suvartojimo normos. Reikėtų atsižvelgti į parengiamuosius maitinimo bandymus ar į ankstesnę patirtį, renkantis maisto normą, kuri užtikrintų, kad suvartojamas visas vienos paros maistas. Tuo atveju, kai maistas nuolat lieka nesuėstas, galbūt reikėtų paskirstyti dozę ilgesniam maitinimo laikotarpiui kiekvieną bandymo dieną (pvz., vietoj vienkartinio maitinimo duoti pusę kiekio du kartus per parą). Jei būtina maitinti antrą kartą, tai reikėtų daryti nustatytu laiku ir tokiu momentu, kad iki žuvų ėminių ėmimo būtų maksimalus laiko tarpas (pvz., antrąjį kartą maitinti bandymo paros pirmoje pusėje).
                     Nors paprastai žuvys suėda maistą greitai, svarbu užtikrinti, kad cheminė medžiaga liktų adsorbuota ant maisto Reikėtų imtis priemonių bandomosios cheminės medžiagos išsiskyrimui iš maisto į vandenį išvengti, nes tada, be veikimo per maistą, žuvis veiktų tam tikros koncentracijos bandomoji cheminė medžiaga vandenyje. Tai galima pasiekti pašalinant visus nesuėsto maisto likučius (ir išmatas) iš bandymo ir kontrolinių indų ne vėliau kaip per valandą, bet geriau, per 30 min nuo maitinimo. Be to, galima naudoti nuolatinio vandens valymo per aktyvintųjų anglių filtrą sistemą, kad būtų absorbuoti visi „ištirpę“ teršalai. Naudojant dinaminio bandymo sistemas, būtų lengviau greitai nuplauti maisto daleles ir ištirpusias chemines medžiagas (67). Kai kuriais atvejais problemą galėtų sumažinti šiek tiek pakeistas sodrinto maisto paruošimo metodas (žr. 119 pastraipą).
                     
                        Šviesa ir temperatūra
                     
                     Kaip ir taikant veikimo per vandeninę terpę metodą (žr. 48 pastraipą), rekomenduojama 12–16 h šviesiojo laikotarpio trukmė ir naudojamoms bandymų rūšims tinkama temperatūra (± 2 °C) (žr. 3 priedėlį). Reikėtų žinoti ir dokumentuoti apšvietimo tipą bei jo charakteristikas.
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     Reikėtų naudoti vieną kontrolinę grupę, kurios žuvys maitinamos tuo pačiu maisto kiekiu kaip bandomosios grupės žuvys, bet be bandomosios cheminės medžiagos maiste. Jei kaip nešiklis bandymo grupės maistui sodrinti naudojamas aliejus ar tirpiklis, kontrolinės grupės maistas turėtų būti apdorotas visiškai vienodai, bet be bandomosios cheminės medžiagos, taigi bandymo grupės ir kontrolinės grupės maistas yra lygiavertis (žr. 121 ir 139 pastraipas).
                     
                        Vandens kokybės matavimo dažnumas
                     
                     Čia taip pat taikomos sąlygos, aprašytos veikimo per vandeninę terpę metodui, išskyrus tai, kad TOC reikia matuoti tik prieš bandymą, kaip bandymo vandens charakteristikų dalį (žr. 53 pastraipą).
                     
                        Žuvų bei vandens ėminių ėmimas ir analizė
                     
                     
                        Žuvų maisto ėminių analizė
                     
                     Reikėtų analizuoti bent tris kartotinius bandymo ir kontrolinio maisto ėminius bent sugerties tarpsnio pradžioje ir pabaigoje. Analizės metodai ir procedūros maisto homogeniškumui užtikrinti turėtų būti įtrauktos į ataskaitą.
                     Bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti analizuojama taikant nustatytą ir patvirtintą metodą. Reikėtų atlikti pasirengimo tyrimui darbus, kad būtų nustatyta kiekybinio nustatymo riba, atgavimo laipsnis procentais, trukdžiai ir numatomo ėminio matricos analizinis kintamumas. Jei bandoma žymėtoji medžiaga, reikėtų atsižvelgti į panašius aspektus kaip ir taikant veikimo per vandeninę terpę metodą, vandens analizę pakeičiant maisto analize (žr. 65 pastraipą).
                     
                        Žuvų analizė
                     
                     Kiekvieną kartą imant žuvų ėminį reikia imti po 5–10 žuvų iš poveikio ir kontrolinio apdorojimo indų (kai kuriais atvejais kontrolinio ėminio žuvų skaičių galima sumažinti; žr. 134 pastraipą).
                     Ėminius reikėtų imti kiekvieną bandymų dieną tuo pačiu metu (maitinimo laiko atžvilgiu), ir tokiu laiku, kad būtų kuo mažesnė tikimybė maistui likti virškinimo trakte sugerties tarpsnio metu ir pačioje apsivalymo tarpsnio pradžioje, siekiant išvengti klaidingo suminės bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos padidėjimo (t. y. žuvų ėminius reikėtų imti bandymų paros pabaigoje, turint omenyje, kad bandymų para prasideda maitinimo momentu ir baigiasi kito maitinimo momentu, maždaug po 24 h. Apsivalymo tarpsnis prasideda pirmą kartą davus nesodrinto maisto; žr. 128 pastraipą). Pirmasis apsivalymo tarpsnio ėminys (paimtas prieš pat antrąjį maitinimą nesodrintu maistu) yra svarbus, nes ekstrapoliavimas vieną parą atgal nuo šio matavimo naudojamas nulinio laiko koncentracijai įvertinti (C
                        0,d, koncentracija žuvyje sugerties tarpsnio pabaigoje ar apsivalymo tarpsnio pradžioje). Arba galima pašalinti virškinimo traktą ir jį analizuoti atskirai sugerties tarpsnio pabaigoje bei 1 ir 3 apsivalymo tarpsnio parą.
                     Kiekvieną kartą imant ėminį, žuvis reikėtų paimti iš abiejų bandymo indų ir apdoroti veikimo per vandeninę terpę metode taikytu būdu (žr. 61–63 pastraipas).
                     Kontrolinių ir bandymo grupių ėminių bandomosios cheminės medžiagos koncentracija visoje žuvyje (šlapios kūno masės atžvilgiu) matuojama bent sugerties tarpsnio pabaigoje ir visą apsivalymo etapą. Apsivalymo etapu rekomenduojama matuoti nuo keturių iki šešių kartų (pvz., 1, 3, 7, 14 ir 28 parą). Pasirinktinai galima imti papildomai dar vieną kartą 1–3 sugerties tarpsnio parą, kad būtų galima įvertinti įsisavinimo žuvimis efektyvumą tiesiniu sugerties tarpsniu,, kai dar esama beveik poveikio laikotarpio pradžioje. Yra du pagrindiniai nukrypimai nuo tvarkaraščio: i) jei sugerties kinetikai tirti sugerties tarpsnis pratęsiamas, bus papildomi ėminių ėmimo taškai sugerties tarpsnio metu, todėl reikės turėti papildomų žuvų (žr. 126 pastraipą); ii) jei tyrimas buvo nutrauktas sugerties tarpsnio pabaigoje dėl neišmatuojamos sugerties (žr. 131 pastraipą). Ėminiams imamas žuvis reikėtų atskirai pasverti (ir išmatuoti visą ilgį), kad būtų galima nustatyti augimo greičio konstantas. Cheminės medžiagos koncentraciją tam tikruose žuvų audiniuose (valgomų ir nevalgomų dalių) taip pat galima išmatuoti sugerties tarpsnio pabaigoje ir pasirinktais apsivalymo etapo tarpsnio momentais. Jei bandoma žymėtoji medžiaga, reikėtų atsižvelgti į panašius aspektus kaip ir taikant veikimo per vandeninę terpę metodą, vandens analizę pakeičiant maisto analize (žr. 65 pastraipą).
                     Jei periodiškai naudojama etaloninė cheminė medžiaga (žr. 25 pastraipą), pageidautina, kad koncentracija bandymo grupės žuvyse būtų matuojama sugerties tarpsnio pabaigoje ir visus bandomajai cheminei medžiagai nurodytus kartus apsivalymo tarpsniu (visos žuvies); koncentraciją kontrolinės grupės žuvyse reikėtų nustatyti sugerties tarpsnio pabaigoje (visos žuvies). Tam tikromis aplinkybėmis (pvz., jei nesutampa bandomosios cheminės medžiagos ir etaloninės cheminės medžiagos analizės metodai ir dėl to reikės papildomų žuvų, kad būtų galima atitikti ėminių ėmimo tvarkaraštį) galima taikyti kitą toliau nurodytą metodą, siekiant kiek įmanoma sumažinti papildomų žuvų skaičių. Etaloninės cheminės medžiagos koncentracijos vertės yra matuojamos tik 1 ir 3 apsivalymo tarpsnio parą ir dar du kartus, laiką pasirenkant taip, kad būtų gauti patikimi etaloninės cheminės medžiagos nulinio laiko koncentracijos (C
                        0,d) ir k
                        2 įverčiai.
                     Jei įmanoma, atskirų žuvų lipidų kiekį reikėtų nustatyti kiekvienu ėminių ėmimo atveju arba bent sugerties tarpsnio pradžioje bei pabaigoje ir apsivalymo tarpsnio pabaigoje (žr. 56 ir 67 pastraipas). Priklausomai nuo analizės metodo (žr. 67 pastraipą ir 4 priedėlį), galima naudoti tą pačią žuvį lipidų kiekiui ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai nustatyti. Tokiems metodams teikiama pirmenybė dėl galimybės sumažinti žuvų skaičių. Tačiau, jei tai būtų neįmanoma, galima taikyti metodą, kuris aprašytas veikimo per vandeninę terpę bandymui (žr. 56 pastraipą dėl šių alternatyvių lipidų matavimo būdų). Bandymo ataskaitoje reikėtų pateikti lipidų kiekybinio nustatymo metodą.
                     
                        Analizės metodo kokybė
                     
                     Bandymų keliu reikėtų patikrinti, ar užtikrinamas cheminei medžiagai būdingo analizės metodo specifiškumas, tikslumas, preciziškumas ir atkuriamumas, taip pat bandomosios cheminės medžiagos atgavimo iš maisto ir žuvies laipsnis.
                     
                        Žuvų augimo matavimas
                     
                     Bandymo pradžioje reikia pasverti nuo penkių iki dešimties pradinės populiacijos žuvų ėminį ir išmatuoti jų visą ilgį. Šios žuvys turėtų būti imamos prieš pat pirmą sodrinto maisto davimą (pvz., likus vienai valandai) ir ėmimą priskirti 0 bandymų parai. Šio ėminio žuvų skaičius turėtų būti bent jau toks pat, kaip atliekant bandymą imamų ėminių. Kai kurios iš šių žuvų gali būti tos pačios žuvys, kurios buvo naudojamos lipidų analizei prieš sugerties tarpsnio pradžią (žr. 153 pastraipą). Kiekvieną kartą imant ėminius, žuvys sveriamos ir matuojamas jų ilgis. Kiekvienos žuvies atskirai išmatuotą masę ir ilgį reikėtų susieti su analizuojamos cheminės medžiagos koncentracija (ir lipidų kiekiu, jei taikoma), pvz., naudojant unikalų identifikavimo kodą kiekvienai ėminio žuviai. Šių ėminiams paimtų žuvų matavimai taip pat gali būti naudojami bandymo ir kontroliniuose induose likusių žuvų masei ir ilgiui įvertinti.
                     
                        Įvertinimas atliekant bandymus
                     
                     Gaištamumą reikėtų stebėti ir registruoti kasdien. Reikėtų papildomai stebėti neigiamus reiškinius, pvz., nenormalų elgesį ar pigmentines dėmes, ir duomenis registruoti. Žuvis laikoma negyva, jei negalima aptikti kvėpavimo judesių ir reakcijos į nestiprius mechaninius dirgiklius. Visas negyvas arba aiškiai gaištančias žuvis reikėtų pašalinti.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     Bandymų rezultatai naudojami apsivalymo greičio konstantai (k
                        2) kaip žuvies visos šlapios kūno masės funkcijai gauti. Prireikus apskaičiuojama augimo greičio konstanta, k
                        g, pagrįsta žuvies masės vidutiniu padidėjimu, ir ji naudojama apsivalymo greičio konstantai su pataisa dėl augimo k
                        2g gauti. Be to, reikėtų pateikti įsisavinimo efektyvumą (a; absorbciją iš virškinimo trakto), kinetinį biomagnifikacijos faktorių (BMFK) (jei būtina, su pataisa dėl augimo BMFKg), jo vertę su pataisa dėl lipidų (BMFKL arba BMFKgL, jei daroma praskiedimo dėl augimo pataisa) ir maisto normą. Taip pat, jei galima gauti nuostoviosios būsenos pasiekimo sugerties tarpsniu trukmės įvertį (pvz., 95 % nuostoviosios būsenos arba t
                        95 = 3,0/k
                        2), galima įtraukti nuostoviosios būsenos BMF (BMFSS) (žr. 105 bei 106 pastraipas ir 5 priedėlį), jei t
                        95 vertė rodo, kad galėjo būti pasiektos nuostoviosios būsenos sąlygos. Šiam BMFSS reikėtų taikyti tą pačią pataisą dėl lipidų, kaip ir kinetiniu metodu gautam BMF (BMFK), kad būtų gauta vertė su pataisa dėl lipidų BMFSSL (reikia pažymėti, kad nėra sutartos procedūros kaip gauti nuostoviosios būsenos BMF praskiedimo dėl augimo pataisą). Formulės ir skaičiavimo pavyzdžiai pateikti 7 priedėlyje. Yra metodų, kuriuos taikant įmanoma įvertinti kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BCFK) pagal veikimo per maistą tyrimo duomenis. Tai aptariama 8 priedėlyje.
                     
                        Žuvų masės ir ilgio duomenys
                     
                     Atskirų žuvų šlapios kūnomasės ir viso ilgio duomenys, gauti kiekvieną kartą imant ėminius sugerties tarpsniu (pradinės populiacijos – sugerties tarpsnio pradžioje, kontrolinės grupės ir bandymo grupės – sugerties tarpsnio pabaigoje ir, jei atliekama, sugerties tarpsnio pačioje pradžioje, pvz., sugerties tarpsnio 1–3 parą) ir apsivalymo tarpsniu (kontrolinės ir bandymo grupės – pvz., 1, 2, 4, 7, 14, 28 parą) įtraukiami į lenteles atskirai bandymo ir kontrolinių ėminių grupei. Masei kaip augimo matui teikiama pirmenybė darant praskiedimo dėl augimo pataisą. Metodai, taikomi darant duomenų praskiedimo dėl augimo pataisą, pateikti toliau (162 ir 163 pastraipos) ir 5 priedėlis.
                     
                        Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyje duomenys
                     
                     Bandomosios cheminės medžiagos likučių atskiroje žuvyje (arba jungtinių žuvų ėminių, jei atskirų žuvų matavimas neįmanomas) kiekiai, gauti kiekvieną kartą imant ėminius ir išreikšti koncentracija (w/w ) šlapios kūno masės atžvilgiu, įtraukiami į lenteles atskirai bandymo ir kontrolinių ėminių grupei. Jei buvo atlikta kiekvienos ėminio žuvies lipidų analizė, galima gauti ir įtraukti į lenteles atskiras koncentracijos vertes su pataisa dėl lipidų, išreikštas lipidų koncentracija (w/w lipidų).
                     
                                 —
                              
                              
                                 Bandomosios cheminės medžiagos likučių atskiroje žuvyje (arba jungtinių žuvų ėminių, jei atskirų žuvų matavimas neįmanomas, žr. 66 pastraipą) kiekiai, gauti apsivalymo tarpsniu, perskaičiuojami į natūraliuosius logaritmus ir pateikiami kaip laiko (paros) funkcijos kreivė. Jei apžiūrint kreives aiškiai matomi riktai, galima taikyti statistiškai pagrįstą riktų kriterijų, kad būtų pašalinti klaidingi duomenų taškai, taip pat pateikti dokumentuotą jų pašalinimo pagrindimą;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Mažiausiųjų kvadratų metodu skaičiuojama tiesinė ln(koncentracijos) kaip apsivalymo trukmės (paros) duomenų koreliacija. Tiesės krypties koeficientas ir atkarpa yra pateikiami ataskaitoje kaip visuminė apsivalymo greičio konstanta (k
                                    2) ir kaip gautos nulinio laiko koncentracijos (C
                                    0,d) natūralusis logaritmas (daugiau duomenų pateikta 5 ir 7 priedėliuose). Jei tai būtų neįmanoma dėl tos priežasties, kad antrojo apsivalymo tarpsnio ėminio koncentracija yra mažesnė nei kiekybinio nustatymo riba, galima pateikti sumažintą k
                                    2 įvertį (žr. 7 priedėlį).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Taikant standartines statistines procedūras, apskaičiuojamos tiesės krypties koeficiento ir atkarpos dispersijos ir įvertinami bei pateikiami 90 % (ar 95 %) pasikliovimo intervalai apie šiuos rezultatus.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Taip pat apskaičiuojama vidutinė žuvų koncentracija paskutinę sugerties dieną (išmatuota nulinio laiko koncentracija C
                                    0,m) ir palyginama su C
                                    0,d apskaičiuota vertė. Jei apskaičiuota vertė yra mažesnė nei išmatuota vertė, skirtumas gali reikšti nesuvirškinto sodrinto maisto buvimą virškinimo trakte. Jei apskaičiuota vertė yra gerokai didesnė nei išmatuota vertė, tai gali rodyti, kad vertė, gauta atliekant apsivalymo duomenų tiesinę regresiją, yra klaidinga ir ją reikėtų įvertinti iš naujo (žr. 7 priedėlį).
                              
                           
                        Apsivalymo greitis ir biomagnifikacijos faktorius
                     
                     Turint duomenis biomagnifikacijos faktoriui apskaičiuoti, iš pradžių reikėtų gauti įsisavinimo efektyvumo vertę (bandomosios cheminės medžiagos absorbciją per virškinimo traktą, α). Šią vertę reikėtų gauti pagal 7 priedėlio A7.1 lygtį, pagal kurią reikia žinoti apskaičiuotą apsivalymo tarpsnio nulinio laiko koncentraciją žuvyje (C
                        0,d), (visuminę) apsivalymo greičio konstantą (k
                        2), koncentraciją maiste (C
                        maisto), maisto suvartojimo normą (I) ir sugerties tarpsnio trukmę (t). Gautas tiesinės priklausomybės tarp ln(koncentracijos) ir apsivalymo trukmės krypties koeficientas ir atkarpa ataskaitoje pateikiami kaip visuminė apsivalymo greičio konstanta (k
                        2 = krypties koeficientui) ir nulinio laiko koncentracija (C
                        0,d = eatkarpa), kaip minėta pirmiau. Apskaičiuotas vertes reikėtų tikrinti dėl biologinio patikimumo (pvz., ar įsisavinimo efektyvumas kaip trupmena nėra didesnis už 1). (I) skaičiuojamas maisto masę dalijant iš kasdien maitinamos žuvies masės (jei dozė – 2 % kūno masės, (I) bus 0,02). Tačiau skaičiavimams naudojamai maisto normai gali prireikti pataisos dėl žuvies augimo (tai galima daryti, naudojant žinomą augimo greičio konstantą žuvies masės įverčiui gauti kiekviename sugerties tarpsnio laiko taške; žr. 7 priedėlį). Tais atvejais, kai k
                        2 ir C
                        0,d negali būti apskaičiuotos, pvz., dėl to, kad antrojo apsivalymo tarpsnio ėminio koncentracija yra mažesnė nei kiekybinio nustatymo riba, galima gauti mažesnį k
                        2 įvertį ir BMFk„viršutinę ribą“ (žr. 7 priedėlį).
                     Gavus įsisavinimo efektyvumo vertę (α), galima apskaičiuoti biomagnifikacijos faktorių, dauginant α iš suvartojimo normos (I) ir dalijant iš (visuminės) apsivalymo greičio konstantos (k
                        2). Biomagnifikacijos faktorius su pataisa dėl augimo yra apskaičiuojamas tokiu pat būdu, bet naudojant apsivalymo greičio konstantą su pataisa dėl augimo (k
                        2g; žr. 162 ir 163 pastraipas. Galima gauti alternatyvų įsisavinimo efektyvumo įvertį, jei žuvų audinių analizė buvo atliekama sugerties tarpsnio ankstyvuoju tiesiniu tarpsniu; žr. 151 pastraipą ir 7 priedėlį. Ši vertė atitinka nepriklausomą įsisavinimo efektyvumo įvertį, gauta iš esmės tada, kai organizmas dar nebuvo paveiktas (t. y. žuvis yra pačioje sugerties tarpsnio pradžioje). Įsisavinimo efektyvumo įvertis, gautas pagal apsivalymo duomenis, paprastai naudojamas BMF skaičiuoti.
                     
                        Pataisa dėl lipidų ir praskiedimo dėl augimo pataisa
                     
                     Dėl žuvų augimo apsivalymo tarpsniu išmatuota cheminės medžiagos koncentracija žuvyje gali būti mažesnė, dėl to visuminė apsivalymo greičio konstanta k2
                         yra didesnė nei jį būtų vien dėl pašalinimo procesų (pvz., metabolizmo, šalinimo iš organizmo) (žr. 72 pastraipą). Bandymo žuvų lipidų kiekis (kuris yra labai susijęs su hidrofobinių cheminių medžiagų biologiniu kaupimusi) ir maisto lipidų kiekis praktiškai gali gerokai skirtis, todėl būtina jų kiekio pataisa biomagnifikacijos faktoriams pateikti prasmingu būdu. Reikėtų daryti biomagnifikacijos faktoriaus dėl augimo praskiedimo pataisą (kuri daroma kinetiniam BCF, taikant veikimo per vandeninę terpę metodą) ir pataisą dėl maisto lipidų kiekio palyginti su žuvies lipidų kiekiu (pataisos dėl lipidų faktorius). Šių skaičiavimų lygtys ir pavyzdžiai pateikti 5 ir 7 priedėliuose.
                     Reikėtų apskaičiuoti apsivalymo greičio konstantą su pataisa dėl augimo (k
                        2g), kad būtų galima daryti praskiedimo dėl augimo pataisą (lygtys pateiktos 5 priedėlyje). Vėliau ši apsivalymo greičio konstanta su pataisa dėl augimo (k
                        2g) naudojama biomagnifikacijos faktoriui su pataisa dėl augimo skaičiuoti kaip 73 pastraipoje. Kai kuriais atvejais šis metodas netinka. Alternatyvus metodas, kurį taikant nereikia daryti praskiedimo dėl augimo pataisos, kai apsivalymo duomenys gaunami naudojant bandomosios cheminės medžiagos masę vienoje žuvyje (pagal visos žuvies masę), o ne įprastiniai (koncentravimo) duomenys, gaunami kaip bandomosios cheminės medžiagos masė žuvies masės vienetui. Šiuos duomenis galima nesunkiai gauti, nes bandymai pagal šį metodą turėtų susieti audiniui registruotas koncentracijos vertes su atskirų žuvų mase. Paprasta šių veiksmų atlikimo procedūra apibūdinta 5 priedėlyje. Reikia pažymėti, kad, netgi taikant šį alternatyvų metodą, k
                        2 vis tiek reikėtų įvertinti ir pateikti ataskaitoje.
                     Jei reikia daryti pataisą dėl žuvų ir maisto lipidų kiekio, kai buvo atliekama ne visų ėminiams paimtų žuvų lipidų analizė, gaunamos vidutinės žuvų ir maisto lipidų dalys (masės w/w) (68). Paskui, žuvų lipidų dalies vidurkį dalijant iš maisto lipidų dalies vidurkio, apskaičiuojamas pataisos dėl lipidų faktorius (Lc
                        ). Biomagnifikacijos faktorius, su pataisa dėl augimo arba be jos, jei taikoma, dalijamas iš pataisos dėl lipidų faktoriaus biomagnifikacijos faktoriui su pataisa dėl lipidų gauti.
                     Jei cheminės medžiagos ir lipidų analizė buvo atliekama su ta pačia žuvimi kiekviename ėminių ėmimo taške, atskirų žuvų pagal lipidus pataisytus duomenis galima naudoti pagal lipidus pataisytam BMF tiesiogiai apskaičiuoti (žr. (37)). Pagal koncentracijos su pataisa dėl lipidų duomenis gaunama C
                        0,d ir k
                        2. Matematinę analizę galima tęsti naudojant tas pačias 7 priedėlio lygtis, bet įsisavinimo efektyvumas (a) apskaičiuojamas imant pagal lipidus normalizuotą maisto suvartojimo normą (I
                        lipidai) ir koncentraciją maiste pagal lipidus (C
                        maistas-lipidai). Tada parametrai su pataisa dėl lipidų panašiu būdu naudojami BMF apskaičiuoti (reikia pažymėti, kad augimo greičio konstantos pataisa turėtų būti taikoma pagal lipidų dalį, o ne pagal žuvies šlapią kūno masę, kad būtų apskaičiuotas BMFKgL su pataisa dėl lipidų ir dėl augimo).
                     
                        Rezultatų aiškinimas
                     
                     Bandymo ir kontrolinių grupių vidutiniai augimo duomenys iš esmės neturėtų reikšmingai skirtis, kad būtų pašalintas toksinis poveikis. Abiejų grupių augimo greičio konstantas arba augimo kreives reikėtų lyginti taikant tinkamą procedūrą (69)
                     
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Baigus tyrimą, rengiama galutinė ataskaita, kurioje pateikiama informacija apie bandomąją cheminę medžiagą, bandymų rūšis ir Bandymo sąlygas, kaip išvardyta 81 pastraipoje (taikant veikimo per vandeninę terpę metodą). Be to, būtina ši informacija:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Visa informacija apie bandomosios cheminės medžiagos stabilumą paruoštame maiste;
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Cheminės medžiagos nominali koncentracija maiste, sodrinimo būdas, (lipidų) nešiklio kiekis, naudotas sodrinant maistą (jei taikoma), bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos sodrintame maiste matavimo duomenys, atliekant kiekvieną analizę (ne mažiau kaip trys kartotiniai ėminiai prieš tyrimo pradžią ir sugerties tarpsnio pabaigoje), ir vidutinės vertės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aliejaus ar tirpiklio tipas ir kokybė (rūšis, tiekėjas ir kt.), jei naudojamas kaip nešiklis maistui sodrinti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudoto maisto tipas (apytikriai analizės duomenys (70), rūšis ar kokybė, tiekėjas ir kt.), maisto norma sugerties tarpsniu, maisto porcijos dydis ir dažnumas (įskaitant visas pataisas dėl ėminių žuvų masės);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             žuvų surinkimo ir numarinimo laikas kiekvieną kartą imant ėminius cheminei analizei atlikti (pvz., vieną valandą iki kitos dienos maitinimo);
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             visų parengiamųjų tyrimų rezultatai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų pastebėtų neigiamų reiškinių aprašymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visų taikytų cheminės analizės procedūrų aprašymas, įskaitant aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribas, kintamumą ir atgavimo laipsnį;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išmatuota lipidų koncentracija maiste (sodrintame ir kontroliniame maiste), atskiros vertės, vidutinės vertės ir standartiniai nuokrypiai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontrolinės ir veikiamosios grupių žuvų masės (ir ilgio) duomenų, susijusių su atskira žuvimi, lentelės (pvz., naudojant unikalų kiekvienos žuvies identifikavimo kodą), skaičiavimai ir gautos (-ų) augimo greičio konstantos (-ų) bei 95 % pasikliovimo intervalas (-ai);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyse, vidutinės koncentracijos, išmatuotos sugerties tarpsnio pabaigoje (C
                                                0,m), apskaičiuotos (visuminės) apsivalymo greičio konstantos (k
                                                2) ir koncentracijos žuvyje apsivalymo tarpsnio pradžioje (C
                                                0,d) duomenų lentelės kartu su šių verčių dispersija (krypties koeficientas ir atkarpa);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             žuvų lipidų kiekio (pateikto tam tikrų cheminės medžiagos koncentracijos verčių atžvilgiu, jei taikoma), bandymo grupės ir kontrolinės grupės vidutinių verčių bandymo pradžioje, sugerties pabaigoje ir apsivalymo tarpsnio pabaigoje duomenų lentelės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kreivės (įskaitant visus matavimo duomenis), kurios vaizduoja (jei taikoma, koncentracijos vertes galima išreikšti viso gyvūno kūno masės ar jo audinių masės atžvilgiu):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         augimą, t. y. žuvies masę (ir ilgį) arba į natūralųjį logaritmą transformuotą masę kaip laiko funkciją;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandomosios cheminės medžiagos apsivalymo žuvyje eigą; ir
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         į natūralųjį logaritmą transformuotą koncentraciją (ln koncentracijos) kaip apsivalymo trukmės funkciją (įskaitant apskaičiuotą apsivalymo greičio konstantą k
                                                            2), ir iš natūraliojo logaritmo apskaičiuotą koncentraciją žuvyje apsivalymo tarpsnio pradžioje C
                                                            0,d).
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei apžiūrint kreives aiškiai matomi riktai, galima taikyti statistiškai pagrįstą riktų kriterijų, kad būtų pašalinti klaidingi duomenų taškai, taip pat galima pateikti dokumentuotą jų pašalinimo pagrindimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             apskaičiuota apsivalymo greičio konstanta su pataisa dėl augimo ir pusėjimo trukmė su pataisa dėl augimo;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             apskaičiuotas įsisavinimo efektyvumas (α).
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             „neapdorotas“ mitybos BMF, kinetinis BMF su pataisa dėl lipidų ir praskiedimo dėl augimo pataisa („neapdorotas“ ir su pataisa dėl lipidų pagal viso žuvies šlapią kūno masę), audiniams būdingas BMF, jei taikomas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visa informacija apie žymėtosios bandomosios cheminės medžiagos metabolitus ir jų kaupimąsi;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             visi neįprasti reiškiniai bandymo metu, visi nukrypimai nuo šių procedūrų ir kita tinkama informacija;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tokia reikiamų išmatuotų ir apskaičiuotų duomenų suvestinė lentelė:
                                             
                                                         Cheminės medžiagos apsivalymo greičio konstantos ir biomagnifikacijos faktoriai (BMFK)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            g (augimo greičio konstanta, paros– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę (95 % PI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2 (visuminė apsivalymo greičio konstanta, paros– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę (95 % PI)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2g (apsivalymo greičio konstanta su pataisa dėl augimo, paros– 1):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę (95 % PI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,m (išmatuota nulinio laiko koncentracija, koncentracija žuvyje sugerties tarpsnio pabaigoje) (μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę ± SN (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,d (apsivalymo tarpsnio apskaičiuota nulinio laiko koncentracija, μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę ± SN (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I (nustatyta maisto suvartojimo norma, g maisto/g žuvies/parai):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I
                                                            g (efektyvioji maisto norma su pataisa dėl augimo, g maisto/g žuvies/parai) (72):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę ± SN (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            food (cheminės medžiagos koncentracija maiste, μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę ± SN (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            α (cheminės medžiagos įsisavinimo efektyvumas):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę ± SN (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFK (kinetinis mitybos BMF):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę (95 % PI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFKg (kinetinis mitybos BMF su pataisa dėl augimo):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę (95 % PI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            t
                                                            1/2g (pusėjimo trukmė su pataisa dėl augimo, paros):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę ± SN (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            Lc (pataisos dėl lipidų faktorius):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę
                                                      
                                                   
                                                         BMFKgL (kinetinis mitybos BMF su pataisa dėl lipidų):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę
                                                      
                                                   
                                                         BMFSS-L (nuostoviosios būsenos būdingasis BMF su pataisa dėl lipidų) (72):
                                                      
                                                      
                                                         Įrašyti vertę ± SN (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                       
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Šio priedo C.13 skyrius. Biologinis koncentravimas. Dinaminis bandymas su žuvimis.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Šio priedo A.6 skyrius. Tirpumas vandenyje.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Li A, Doucette W.J. (1993), The effect of cosolutes on the aqueous solubilities and octanol/water partition coefficients of selected polychlorinated biphenyl congeners. Environ Toxicol Chem 12: 2031-2035
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 
                                    Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolio / vandens). Kratomos kolbos metodas.
                                 
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 
                                    Šio priedo A.24 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolio / vandens). Didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) metodas.
                                 
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 
                                    Šio priedo A.23 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolio / vandens). Lėto maišymo metodas.
                                 
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Šio priedo C.7 skyrius. Hidrolizė kaip pH funkcija.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 (OECD (1997), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Number 7: Guidance Document on Direct Phototransformation of Chemicals in Water OCDE/GD(97)21. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 
                                    Šio priedo A.5 skyrius. Paviršiaus įtemptis. Vandeninių tirpalų paviršiaus įtemptis.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Šio priedo A.4 skyrius. Garų slėgis.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Šio priedo C.4 skyrius. Lengvas biologinis skaidumas.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Šio priedo C.29 skyrius. Lengvas biologinis skaidumas. CO2 sandariuose induose.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Connell D.W. (1988), Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102: 117-156.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brown R.S., Akhtar P., Åkerman J., Hampel L., Kozin I.S., Villerius L.A. and Klamer H.J.C. (2001), Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) films. Environ. Sci. Technol. 35: 4097-4102.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Fernandez J.D., Denny J.S. and Tietge J.E. (1998), A simple apparatus for administering 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin to commercially available pelletized fish food. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2058-2062.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N., Whiteman F.W. and Dawson T.D. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: I. Feeding studies with 2,2′, 5,5′-tetrachlorobiphenyl. Toxicol. Sci. 77: 206-218.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Parkerton T.F., Arnot J.A., Weisbrod A.V., Russom C., Hoke R.A., Woodburn K., Traas T., Bonnell M., Burkhard L.P. and Lampi M.A. (2008), Guidance for evaluating in vivo fish bioaccumulation data. Integr. Environ. Assess. Manag. 4: 139-155.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Verbruggen E.M.J., Beek M., Pijnenburg J. and Traas T.P. (2008). Ecotoxicological environmental risk limits for total petroleum hydrocarbons on the basis of internal lipid concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2436-2448.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Schlechtriem C., Fliedner A. and Schäfers C. (2012), Determination of lipid content in fish samples from bioaccumulation studies: Contributions to the revision of OECD Test Guideline 305. Environmental Sciences Europe 2012, 24:13. published: 3 April 2012.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 
                                    Šio priedo C.47 skyrius. Toksiškumo ankstyvųjų gyvenimo stadijų žuvims bandymas.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Šio priedo C.15 skyrius. Trumpalaikio toksiškumo žuvims bandymas embriono ir trynio maišelio stadijose.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Šio priedo C.14 skyrius. Žuvų mailiaus augimo bandymas.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 OECD (2000), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 23: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures ENV/JM/MONO(2000)6. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 US-EPA (1994), Great Lake water quality initiative technical support document for the procedure to determine bioaccumulation factors 822-R-94-002. US EPA, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington, DC, USA.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 US-FDA (1999), Pesticide analytical manual (PAM). Vol.1. US Food and Drug Administration, Rockville, MD, USA.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 US-EPA (1974), Section 5, A (1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson, J.F., Editor. US-EPA, Research Triangle Park, NC, USA
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Bligh E.G. and Dyer W.J. (1959), A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A. and Parrish C.C. (1985), Micromethod for lipids in aquatic invertebrates. Limnol. Oceanogr. 30: 1099-1105.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Smedes F. (1999), Determination of total lipid using non-chlorinated solvents. Analyst. 124: 1711-1718.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 OECD (2006), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 54: Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. ENV/JM/MONO(2006)18. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Springer T.A. (2009), Statistical Research Related to Update of OECD Guideline 305. Wildlife International, Ltd, Easton, MD, USA.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Parkerton T., Letinski D., Febbo E., Davi R., Dzambia C., Connelly M., Christensen K. and Peterson D. (2001), A practical testing approach for assessing bioaccumulation potential of poorly water soluble organic chemicals (presentation). in SETAC Europe 12th Annual Meeting: Madrid, Spain.
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Fisk A.T., Cymbalisty C.D., Bergman Ã. and Muir D.C.G. (1996), Dietary accumulation of C12- and C16-chlorinated alkanes by juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ. Toxicol. Chem. 15: 1775-1782.
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Fish, dietary bioaccumulation study – Basic protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Bruggeman W.A., Opperhuizen A., Wijbenga A. and Hutzinger O. (1984), Bioaccumulation of super-lipophilic chemicals in fish, Toxicol. Environ. Chem. 7: 173-189.
                              
                           
                                 (41)
                              
                              
                                 Muir D.C.G., Marshall W.K. and Webster G.R.B. (1985), Bioconcentration of PCDDs by fish: effects of molecular structure and water chemistry. Chemosphere. 14: 829-833.
                              
                           
                                 (42)
                              
                              
                                 Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                              
                           
                                 (43)
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N. and Whiteman F.W. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: II. Stimulation of chronic exposure scenarios. Toxicol. Sci. 77: 219-229.
                              
                           
                                 (44)
                              
                              
                                 Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                              
                           
                                 (45)
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M. and van der Linde A. (1995), Size-dependent bioconcentration kinetics of hydrophobic organic chemicals in fish based on diffusive mass transfer and allometric relationships. Environ. Sci. Technol. 29: 2769-2777.
                              
                           
                                 (46)
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                              
                           
                                 (47)
                              
                              
                                 Fisk A.T., Norstrom R.J., Cymbalisty C.D. and Muir D.G.G. (1998), Dietary accumulation and depuration of hydrophobic organochlorines: Bioaccumulation parameters and their relationship with the octanol/water partition coefficient. Environ. Toxicol. Chem. 17: 951-961.
                              
                           
                                 (48)
                              
                              
                                 McGrath J.A., Parkerton T.F. and Di Toro D.M. (2004), Application of the narcosis target lipid model to algal toxicity and deriving predicted-no-effect concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2503-2517.
                              
                           
                                 (49)
                              
                              
                                 Poppendieck D.G. (2002), Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Desorption Mechanisms from Manufactured Gas Plant Site Samples. Dissertation. Department of Civil, Architectural and Environmental Engineering, University of Texas, Austin, TX, USA.
                              
                           
                                 (50)
                              
                              
                                 McCarty L.S. and Mackay D. (1993), Enhancing ecotoxicological modelling and assessment: body residues and modes of toxic action. Environ. Sci. Technol. 27: 1718-1728.
                              
                           
                                 (51)
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 175: Part I – Validation Report of a ring test for the OECD TG 305 dietary exposure bioaccumulation fish test. Part II – Additional Report including comparative analysis of trout and carp results ENV/JM/MONO(2012)20. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS IR VIENETAI
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Įsisavinimo efektyvumas (α) – iš virškinimo trakto į organizmą absorbuotos cheminės medžiagos santykinio kiekio matas (α yra nedimensinis dydis, bet dažnai išreiškiamas procentais, o ne dalimi).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biologinis kaupimasis – paprastai nurodomas kaip procesas, kuriam vykstant cheminės medžiagos koncentracija organizme pasiekia lygį, didesnį nei kvėpavimo terpėje (pvz., žuvims – vandenyje, žinduoliams – ore), maiste ar abiejose terpėse (1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biologinis koncentravimas – bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos didėjimas organizme (ar tam tikruose jo audiniuose) arba organizmo paviršiuje palyginti su bandomosios cheminės medžiagos koncentracija aplinkinėje terpėje.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biologinio koncentravimo faktorius (BCF ar K
                                       B) yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvies viduje ir jos paviršiuje ir (arba) tam tikruose audiniuose bet kuriuo šio kaupimosi bandymo įsisavinimo etapo momentu (C
                                       f, išreikšta mg/kg), padalyta iš cheminės medžiagos koncentracijos aplinkinėje terpėje (C
                                       w, išreikšta mg/l). BCF yra išreiškiamas l·kg– 1. Reikia atkreipti dėmesį į tai, kad neatsižvelgiama į pataisas dėl augimo ir (arba) etaloninio lipidų kiekio.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Biomagnifikacija yra yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos didėjimas organizme ar organizmo paviršiuje (arba tam tikruose jo audiniuose), susijęs su bandomosios cheminės medžiagos koncentracija maiste.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biomagnifikacijos faktorius (BMF) yra bandomosios cheminės medžiagos koncentracija plėšrūne palyginti su jos koncentracija plėšrūno grobyje (ar maiste) esant nuostoviajai būsenai. Taikant šiose gairėse aprašytą bandymų metodą, griežtai vengiama veikimo per vandeninę terpę metodo, todėl šio bandymų metodo BMF vertė negali būti tiesiogiai lyginama su BMF verte, gauta atliekant tyrimą lauko sąlygomis (kai galima sujungti veikimą per vandeninę terpę ir mitybą).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Mitybos biomagnifikacijos faktorius (mitybos BMF) yra terminas, taikomas šiame bandymų metode mitybos bandymo rezultatui apibūdinti, kai griežtai vengiama veikimo per vandeninę terpę metodo, todėl šio bandymų metodo mitybos BMF negali būti tiesiogiai lyginamas su BMF verte, gauta atliekant lauko tyrimą (kai galima sujungti veikimą per vandeninę terpę ir mitybą).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Apsivalymo arba (netekimo) tarpsnis po veikimo yra laikas nuo to momento, kai bandymo žuvis buvo pernešta iš terpės su bandomąja chemine medžiaga į jos neturinčią terpę, kuomet tiriamas apsivalymas nuo šios medžiagos žuvyje (arba tam tikruose audiniuose) (arba suminis sumažėjimas).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Apsivalymo (netekimo) greičio konstanta (k
                                       2) yra skaitinė vertė, apibūdinanti bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba tam tikruose jos audiniuose) mažėjimo greitį, bandymo žuvį pernešus iš terpės su bandomąja chemine medžiaga į jos neturinčią terpę (k
                                       2 išreiškiama para– 1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ištirpusi organinė anglis (DOC) yra anglies, gautos iš bandymų terpėje ištirpusių organinių anglies šaltinių, koncentracijos matas.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Veikimo arba sugerties tarpsnis yra laikas, kurį žuvis yra veikiama bandomąja chemine medžiaga.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Maisto suvartojimo norma (I) yra per parą kiekvienos žuvies suvartoto maisto vidutinio kiekio santykis su žuvies viso kūno masės įverčiu (išreiškiamas g maisto/g žuvies/parai).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Kinetinis biologinio koncentravimo faktorius (BCFK) yra sugerties greičio konstantos k
                                       1 santykis su apsivalymo greičio konstanta k
                                       2 (t. y. k
                                       1/k
                                       2 – žr. atitinkamas šio priedėlio apibrėžtis). Iš esmės ši vertė turėtų būti palyginama su BCFSS (žr. pirmiau pateiktą apibrėžtį), bet gali būti nuokrypių, jei nuostovioji būsena buvo neapibrėžta arba jei kinetiniam BCF buvo taikomos pataisos dėl augimo.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Pagal lipidus normalizuotas kinetinis biologinio koncentravimo faktorius (BCFKL) yra normalizuotas pagal žuvį, kurioje lipidų kiekis sudaro 5 %.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Pagal lipidus normalizuotas kinetinis biologinio koncentravimo faktorius su pataisa dėl augimo (BCFKgL) yra normalizuotas pagal žuvį, kurioje lipidų kiekis sudaro 5 %, ir pataisytas dėl augimo tyrimo laikotarpiu, kaip aprašyta 5 priedėlyje.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Pagal lipidus normalizuotas nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BCFSSL) yra normalizuotas pagal žuvį, kurioje lipidų kiekis sudaro 5 %.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    REACH tikslams daugiakomponentė medžiaga apibrėžiama kaip medžiaga, sudaryta iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies, kurios koncentracija yra nuo 10 % iki 80 % (masės).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (K
                                       OW) yra cheminės medžiagos tirpumo n-oktanolyje ir vandenyje pusiausvyrasis santykis (A.8 (2), A.24 (3), A.23 metodai(4)); taip pat išreiškiamas kaip P
                                       OW. K
                                       OW logaritmas naudojamas kaip cheminės medžiagos biologinio koncentravimo vandens organizmuose gebos rodiklis.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Kietųjų dalelių organinė anglis (POC) yra anglies, gautos iš bandymų terpėje suspenduotų organinių anglies šaltinių, koncentracijos matas.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Mikroekstrahavimas kietąja faze – (angl. Solid-phase microextraction, SPME) yra praskiestoms sistemoms sukurtas analizės metodas, kuriame nenaudojami tirpikliai. Pagal šį metodą polimeru dengtas pluoštas veikiamas dujine arba skystąja faze, turinčia tiriamą analitę. Paprastai minimali analizės trukmė nustatoma taip, kad tarp kietosios ir takiosios fazės matuojamų junginių atžvilgiu nusistovi pusiausvyros sąlygos. Vėliau tiriamos analitės koncentracija gali būti nustatyta tiesiogiai pluošte arba ekstrahavus ją iš pluošto į tirpiklį, priklausomai nuo nustatymo metodo.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Nuostovioji būsena pasiekiama, kai bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyje (C
                                       f) ir laiko priklausomybės kreivė tampa lygiagreti su laiko ašimi, kai bent kas dvi paras paimtų ėminių trijų nuoseklių C
                                       f analizės rezultatai skiriasi ne daugiau kaip ± 20 % ir nėra reikšmingo C
                                       f padidėjimo tarp pirmosios ir paskutinės nuoseklios analizės. Kai analizuojami jungtiniai ėminiai, reikia atlikti ne mažiau kaip keturias nuoseklias analizes. Jei bandomųjų cheminių medžiagų sugertis vyksta lėtai, labiau tiktų septynių parų intervalai.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BCFSS) žymiai nekinta ilgesnį laiko tarpą, bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai aplinkinėje terpėje šį laiko tarpą esant pastoviai (žr. nuostoviosios būsenos apibrėžtį).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Suminė organinė anglis (TOC) yra anglies, gautos iš visų bandymų terpės organinių anglies šaltinių, įskaitant kietąsias daleles ir ištirpusius šaltinius, koncentracijos matas.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sugerties greičio konstanta (k
                                       1) yra skaitinė vertė, apibūdinanti bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba tam tikruose jos audiniuose) didėjimo greitį, kai žuvis yra veikiama ta bandomąja chemine medžiaga (k
                                       1 yra išreiškiama l kg– 1 para– 1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ir biologinės medžiagos žinomos kaip UVCB.
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Bandomoji cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys, kurie buvo bandyti pagal šį bandymo metodą.
                                 
                              LITERATŪRA
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    
                                       Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolio / vandens). Kratomos kolbos metodas
                                    
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    
                                       Šio priedo A.24 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolio / vandens). Didelio slėgio skysčių chromatografijos (HPLC) metodas.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    
                                       Šio priedo A.23 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolio / vandens). Lėto maišymo metodas.
                                 
                              
                     
                        2 priedėlis
                        
                           KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS CHARAKTERISTIKOS
                        
                        
                                    Komponentas
                                 
                                 
                                    Ribinė koncentracija
                                 
                              
                                    Kietosios dalelės
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Suminė organinė anglis
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Nejonizuotas amoniakas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Liekamasis chloras
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Suminis organinių fosforo pesticidų kiekis
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Suminis chloro organinių pesticidų ir polichlorintųjų bifenilų kiekis
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Suminis organinio chloro kiekis
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Aliuminis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Arsenas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Chromas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kobaltas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Varis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Geležis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Švinas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Nikelis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Cinkas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kadmis
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Gyvsidabris
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Sidabras
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           BANDYMAMS REKOMENDUOJAMOS ŽUVŲ RŪŠYS
                        
                        
                                    Rekomenduojamos rūšys
                                 
                                 
                                    Rekomenduojamas bandymų temperatūros intervalas (°C)
                                 
                                 
                                    Rekomenduojamas bandomojo gyvūno visas ilgis (cm) (74)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Danio rerio
                                        (73)
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Hamilton-Buchanan) Zebrinė danija
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 0,5
                                 
                              
                                    
                                       Pimephales promelas
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Rafinesque) Juodoji drūtagalvė rainė
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Cyprinus carpio
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Linnaeus) Paprastasis karpis
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0 (75)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Oryzias latipes
                                    
                                    (Teleostei, Poecilliidae)
                                    (Temminck and Schlegel) Japoninė medaka
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    4,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Poecilia reticulata
                                    
                                    (Teleostei, Poeciliidae)
                                    (Peters) Paprastasis gupis
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Lepomis macrochirus
                                    
                                    (Teleostei Centrarchidae)
                                    (Rafinesque) Melsvažiaunis saulešeris
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Oncorhynchus mykiss
                                    
                                    (Teleostei Salmonidae)
                                    (Walbaum) Vaivorykštinis upėtakis
                                 
                                 
                                    13 – 17
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0
                                 
                              
                                    
                                       Gasterosteus aculeatus
                                    
                                    (Teleostei, (Gasterosteidae)
                                    (Linnaeus) Trispyglė dyglė
                                 
                                 
                                    18 – 20
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                           Ne taip plačiai naudojamos įvairios upių žiočių ir jūros žuvų rūšys, pvz:
                        
                        
                                    Spotas
                                 
                                 
                                    (Leiostomus xanthurus)
                                 
                              
                                    Lėlžuvė
                                 
                                 
                                    (Cyprinodon variegatus)
                                 
                              
                                    Priekrantinė menidija
                                 
                                 
                                    (Menidia beryllina)
                                 
                              
                                    Gyvavedis šaineris
                                 
                                 
                                    (Cymatogaster aggregata)
                                 
                              
                                    Kalifornijos jūrų liežuvis
                                 
                                 
                                    (Parophrys vetulus)
                                 
                              
                                    Siauragalvė plernė
                                 
                                 
                                    (Leptocottus armatus)
                                 
                              
                                    Trispyglė dyglė
                                 
                                 
                                    (Gasterosteus aculeatus)
                                 
                              
                                    Paprastasis vilkešeris
                                 
                                 
                                    (Dicentracus labrax)
                                 
                              
                                    Paprastoji aukšlė
                                 
                                 
                                    (Alburnus alburnus)
                                 
                              (Lentelėje nurodytas gėlųjų vandenų žuvis lengva auginti ir (arba) jų visur galima gauti ištisus metus, o jūros ir upių žiočių žuvų iš dalies galima gauti tik atitinkamose šalyse. Žuvis galima auginti ir veisti žuvų fermose arba laboratorijoje, ligų ir parazitų kontrolės sąlygomis, kad bandymo gyvūnai būtų sveiki ir būtų žinoma jų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio kraštų.
                        LITERATŪRA
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Meyer A., Biermann C.H. and Orti G. (1993), The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: An invitation to the comparative method Proc. R. Soc. Lond. B. 252: 231-236.
                                 
                              
                     
                        4 priedėlis
                        
                           ĖMINIŲ ĖMIMO TVARKARAŠČIAI ATLIEKANT VEIKIMO PER VANDENINĘ TERPĘ IR MITYBOS BANDYMUS
                        
                        1.   Ėminių ėmimo tvarkaraščio, atliekant cheminės medžiagos, kurios log KOW = 4, visą veikimo per vandeninę terpę biologinio koncentravimo bandymą, teorinis pavyzdys
                        
                        
                                    Žuvų ėminių ėmimas
                                 
                                 
                                    Ėminių ėmimo tvarkaraštis
                                 
                                 
                                    Vandens ėminių skaičius (76)
                                    
                                 
                                 
                                    Žuvų skaičius ėminyje (76)
                                    
                                 
                              
                                    Mažiausias reikiamas dažnumas (paros)
                                 
                                 
                                    Papildomas ėminių ėmimas (paros) (77)
                                    
                                 
                              
                                    Sugerties tarpsnis
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    – 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2 (78)
                                    
                                 
                                 
                                    4 (79)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    0,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,4
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    0,6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,9
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    1,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1,7
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    2,4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    3,3
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    4,7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    Apsivalymo tarpsnis
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Pernešti žuvis į vandenį be bandomosios cheminės medžiagos
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    5,9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    7,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    9,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    11,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                    14,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    17,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4+3 (81))
                                 
                              
                                    VISO
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    40 – 72
                                    (48 – 80) (80)
                                    
                                 
                              2.   Ėminių ėmimo tvarkaraščio, atliekant cheminės medžiagos biologinio kaupimosi per maistą bandymą esant 10 parų sugerties ir 42 parų apsivalymo tarpsniui, teorinis pavyzdys
                        
                        
                                    Ėminių ėmimas
                                 
                                 
                                    Ėminių ėmimo tvarkaraštis
                                 
                                 
                                    Maisto ėminių skaičius
                                 
                                 
                                    Žuvų skaičius ėminyje
                                 
                              
                                    Tarpsnio para
                                 
                                 
                                    Ar reikia papildomų žuvų ėminių?
                                 
                                 
                                    Bandymo grupė
                                 
                                 
                                    Kontrolinė grupė
                                 
                              
                                    Sugerties tarpsnis
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    Galbūt (82)
                                        (83)
                                    
                                 
                                 
                                    3 – bandymo grupė
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 – kontrolinė grupė (82)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (83)
                                    
                                 
                              
                                    1A (84)
                                    
                                 
                                 
                                    1-3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    Taip (85)
                                    
                                 
                                 
                                    3 – bandymo grupė
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 – kontrolinė grupė (82)
                                    
                                 
                                 
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    Apsivalymo tarpsnis
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    Taip (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    Taip (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    28
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    42
                                 
                                 
                                    Taip (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    VISO
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    59 – 120
                                    (63 – 126) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                                 
                                    50 – 110
                                    (56 – 116) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                              
                           Pastaba dėl tarpsnio trukmės ir ėminių ėmimo laiko nustatymo. Sugerties tarpsnis prasideda pirmą kartą davus sodrinto maisto. Bandymų para trunka nuo vieno maisto davimo iki šiek tiek anksčiau nei kito maitinimo po 24 h. Pirmą kartą ėminiai imami (lentelėje pažymėta 1) prieš pat pirmą maitinimą (pvz., likus vienai valandai). Būtų gerai, jei atliekant tyrimą ėminiai būtų imami prieš pat kitos paros maitinimo laiką (t. y. maždaug 23 h po maitinimo ėminių ėmimo dieną). Sugerties tarpsnis baigiasi prieš pat pirmą maitinimą nesodrintu maistu, kai prasideda apsivalymo tarpsnis (tikėtina, kad bandymo grupės žuvys vis dar virškina sodrintą maistą per tas tarpines 24 h po paskutinio sodrinto maisto davimo). Tai reiškia, kad sugerties tarpsnio pabaigos ėminį reikėtų imti prieš pat pirmą maitinimą nesodrintu maistu, o pirmąjį apsivalymo tarpsnio ėminį reikėtų imti maždaug 23 h po pirmo maitinimo nesodrintu maistu.
                     
                     
                        5 priedėlis
                        
                           BENDRIEJI SKAIČIAVIMAI
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Įvadas
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Sugerties tarpsnio trukmės prognozavimas
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Apsivalymo tarpsnio trukmės prognozavimas
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Nuoseklusis metodas. Apsivalymo (netekimo) greičio konstantos k
                                       2 nustatymas
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Nuoseklusis metodas. Sugerties greičio konstantos k
                                       1 nustatymas (tik veikimo per vandeninę terpę metodas)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Vienalaikis metodas sugerties ir apsivalymo (netekimo) greičio konstantoms apskaičiuoti (tik veikimo per vandeninę terpę metodas)
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Kinetinio BCF ir BMF pataisa atsižvelgiant į praskiedimą dėl augimo
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Lipidų normalizavimas pagal 5 % lipidų kiekį (tik veikimo per vandeninę terpę metodas)
                                 
                              1.   ĮVADAS
                        Bendrasis biologinio kaupimosi žuvyse veikimo per vandeninę terpę modelis gali būti aprašytas kaip sugerties ir netekimo procesai, neatsižvelgiant į sugertį per maistą. Diferencialinė lygtis (dC
                           f/dt), kuria aprašomas koncentracijos žuvyje kitimo greitis (mg·kg– 1·day– 1) atrodo taip (1):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.1 lygtis]
                                 
                              Čia
                        
                                    
                                       k
                                       1
                                    
                                 
                                 
                                    pirmojo laipsnio sugerties žuvimi greičio konstanta (l·kg– 1·paros– 1);
                                 
                              
                                    
                                       k
                                       2
                                    
                                 
                                 
                                    pirmojo laipsnio žuvies apsivalymo greičio konstanta (paros– 1);
                                 
                              
                                    
                                       kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    pirmojo laipsnio žuvies augimo greičio konstanta („praskiedimas dėl augimo“) (paros– 1);
                                 
                              
                                    
                                       km
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    pirmojo laipsnio metabolinio virsmo greičio konstanta (paros– 1);
                                 
                              
                                    
                                       ke
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    pirmojo laipsnio išmatų šalinimo iš organizmo greičio konstanta (paros– 1);
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    koncentracija vandenyje·l– 1);
                                 
                              
                                    
                                       Cf
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    koncentracija žuvyje (mg·kg– 1 šlapios kūno masės).
                                 
                              Jei cheminės medžiagos biologiškai kaupiasi, galima tikėtis, kad laikinis svertinis vidurkis (LSV) yra tinkamiausia veikimo per vandeninę terpę koncentracija (Cw
                           ), atsižvelgiant į leidžiamą svyravimų intervalą (žr. 24 pastraipą). Koncentracijos vandenyje LSV rekomenduojama skaičiuoti pagal C.20 bandymų metodo 6 priedėlio procedūrą (2). Reikėtų pažymėti, kad yra patogu transformuoti koncentraciją vandenyje į natūralųjį logaritmą, jei laukiama eksponentinio skaidymo tarp atnaujinimo laikotarpių, pvz., taikant pusiau statinio bandymo schemą. Jei naudojama dinaminė sistema, veikimo koncentracijos verčių transformavimas į natūralųjį logaritmą gali būti nebūtinas. Jei gaunami koncentracijos vandenyje LSV, juos reikėtų pateikti ataskaitoje ir naudoti vėlesniems skaičiavimams.
                        Taikant tipinį žuvų BCF bandymą, sugertį ir apsivalymą galima aprašyti kaip du pirmojo laipsnio kinetinius procesus.
                        
                                    
                                       Sugerties greitis = k
                                       1 × C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    [A5.2 lygtis]
                                 
                              
                                    
                                       Visuminis netekimo greitis = (k
                                       2 + k
                                       g + k
                                       m
                                       + k
                                       e) × C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    [A5.3 lygtis]
                                 
                              Darant prielaidą, kad augimas ir metabolizmas yra nykstamai maži (t. y. k
                           g ir k
                           m vertės yra arti nulio), esant nuostoviajai būsenai sugerties greitis yra lygus apsivalymo greičiui, todėl jungiant A5.2 ir A5.3 lygtis gaunama tokia priklausomybė:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.4 lygtis]
                                 
                              Čia
                        
                                    
                                       C
                                       f-SS
                                    
                                 
                                 
                                    koncentracija žuvyje esant nuostoviajai būsenai (mg kg– 1 šlapios kūno masės);
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w-SS
                                    
                                 
                                 
                                    koncentracija vandenyje esant nuostoviajai būsenai (mg l– 1).
                                 
                              Santykis k
                           1/k
                           2 yra žinomas kaip kinetinis BCF (BCFK) ir turėtų būti lygus nuostoviosios būsenos BCF (BCFSS) yra gaunamas kaip nuostoviosios būsenos koncentracijos žuvyje ir vandenyje santykis, bet gali būti nukrypimų, jei nuostovioji būsena buvo neapibrėžta arba jei kinetiniam BCF buvo taikomos pataisos dėl augimo. Tačiau, kadangi k
                           1 ir k
                           2 yra konstantos, nuostoviosios būsenos pasiekti nebūtina, kad būtų gautas BCFK.
                        Į šį 5 priedėlį įtraukti bendrieji skaičiavimai pagal šias pirmojo laipsnio kinetikos lygtis, kurie yra būtini taikant veikimo per vandeninę terpę mitybos biologinio kaupimosi metodus. Tačiau 5, 6 ir 8 skirsniai tinka tik veikimo per vandeninę terpę metodui, bet jie įtraukti į šį priedėlį, nes yra „bendrosios“ procedūros. Taikant nuosekliuosius (4 ir 5 skirsniai) ir vienalaikius (6 skirsnis) metodus, galima apskaičiuoti sugerties ir apsivalymo konstantas, kurios naudojamos kinetiniams BCF gauti. Nuoseklusis k
                           2 nustatymo metodas (4 skirsnis) yra svarbus mitybos metodui ir yra būtinas, kai reikia apskaičiuoti įsisavinimo efektyvumą ir BMF. 7 priedėlyje išsamiai aprašyti mitybos metodui būdingi skaičiavimai.
                        2.   SUGERTIES TARPSNIO TRUKMĖS PROGNOZAVIMAS
                        Taikant empirines priklausomybes tarp k
                           2 ir pasiskirstymo tarp n-oktanolio ir vandens koeficiento (K
                           OW) arba tarp k
                           1 ir BCF, dar prieš bandymo pradžią galima gauti k
                           2 įvertį, taigi ir laiką, kuris būtinas tam tikrai nuostoviosios būsenos procentinei daliai pasiekti. Tačiau reikėtų suvokti, kad šio skyriaus lygtys galioja tik tada, kai sugertis ir apsivalymas atitinka pirmojo laipsnio kinetiką. Jei tai nėra visiškai aišku, patariama konsultuotis su biologinės statistikos ir (arba) farmakologinės kinetikos specialistu, jei norima gauti prognozes dėl sugerties tarpsnio.
                        
                           k
                           2 (paros– 1) įvertis gali būti gautas keliais metodais. Pvz., pirmuoju atveju galima naudoti tokią empirinę priklausomybę (87):
                        
                                    log k
                                       2 = 1,47 – 0,414logKOW
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    (r2 = 0,95) [(3); A5.5 lygtis]
                                 
                              arba
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.6 lygtis]
                                 
                              
                                    Čia k
                                       1 = 520 × W
                                       – 0,32 (cheminių medžiagų, kurių log K
                                       OW > 3)
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,85) [(4); A5.7 lygtis]
                                 
                              Ir
                                       
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,90) [(5); A5.8 lygtis]
                                 
                              
                           W – vidutinė paveiktos tiriamąja chemine medžiaga žuvies masė (šlapia kūno masė gramais) sugerties tarpsnio pabaigoje ar apsivalymo tarpsnio pradžioje (88)
                        
                        Kitos priklausomybės pateiktos (6). Gali būti naudinga taikyti sudėtingesnius k2 įvertinimo modelius, pvz., jei yra tikimybė, kad gali atsirasti reikšmingas metabolizmas (7) (8). Tačiau, didėjant modelio sudėtingumui, reikėtų atsargiau aiškinti prognozes. Pvz., nitrogrupių buvimas galėtų reikšti greitą metabolizmą, bet tai ne visuomet pasitvirtina. Todėl, kurdamas tyrimo schemą, naudotojas turėtų įvertinti prognozavimo metodu gautus rezultatus, atsižvelgdamas į cheminę sandarą ir kitą susijusią informaciją (pvz., parengiamųjų tyrimų).
                        Laikas, per kurį pasiekiama tam tikra nuostoviosios būsenos procentinė dalis, gali būti gautas taikant k
                           2- įvertį, nustatytą pagal sugertį ir apsivalymą aprašančią bendrąją kinetinę lygtį (pirmojo laipsnio kinetika), ir darant prielaidą apie nežymų augimą ir metabolizmą. Jei tyrimo metu augimas yra reikšmingas, toliau aprašyti įverčiai nebus patikimi. Tokiais atvejais geriau taikyti k
                           2g su pataisa dėl augimo, kaip aprašyta toliau (žr. šio priedėlio 7 skirsnį):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.9 lygtis]
                                 
                              arba, jei C
                           w yra pastovi:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.10 lygtis]
                                 
                              Artėjant prie nuostoviosios būsenos (t → ∞), A5.10 lygtį galima supaprastinti (žr. (9) (10)) iki:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.11 lygtis]
                                 
                              arba
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.12 lygtis]
                                 
                              Tada BCF × C
                           w yra koncentracijos žuvyje nuostoviosios būsenos sąlygomis artinys (C
                           f-SS). (Pastaba. Tas pats metodas tinka nuostoviosios būsenos BMF įverčiui gauti, atliekant mitybos bandymą. Šiuo atveju pirmiau pateiktose lygtyse BCF yra keičiamas BMF, o C
                           w – C
                           food, koncentracija maiste).
                        A.5.10 lygtis gali būti pertvarkyta į
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.13 lygtis]
                                 
                              arba į
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.14 lygtis]
                                 
                              Taikant A5.14 lygtį, galima prognozuoti laiką, per kurį pasiekiama nuostoviosios būsenos tam tikra procentinė dalis, kai prieš tai gaunamas k
                           2 įvertis pagal A5.5 arba A5.6 lygtį.
                        Maždaug statistiškai optimalia sugerties tarpsnio trukme statistiškai priimtiniems duomenims (BCFK) gauti yra laikomas laikas, per kurį bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvyje logaritmo, kaip laiko tiesinėje skalėje funkcijos, kreivė pasiekia ne mažiau kaip 50 % nuostoviosios būsenos (t. y. 0,69/k
                           2), bet ne daugiau kaip 95 % nuostoviosios būsenos (t. y. 3,0/k
                           2) (11). Jei sugertis didesnė kaip 95 % nuostoviosios būsenos, galima skaičiuoti BCFSS.
                        Laikas 80 % nuostoviosios būsenos pasiekti yra lygus (pagal A5.14 lygtį):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.15 lygtis]
                                 
                              arba
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.16 lygtis]
                                 
                              Panašiai laikas 95 % nuostoviosios būsenos pasiekti yra lygus:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.17 lygtis]
                                 
                              Pvz., bandomosios cheminės medžiagos, kurios log K
                           OW = 4, sugerties tarpsnio trukmė (t. y. laikas, per kurį pasiekiama nuostoviosios būsenos tam tikra procentinė dalis, pvz., t
                           80 arba t
                           95) būtų (pagal A5.5, A5.16 ir A5.17 lygtis):
                        
                           logk
                           2 = 1,47 – 0,414 · 4
                        
                           k
                           2 = 0,652 paros-1
                        
                        
                           
                        arba 
                        Kaip alternatyva, lygtis:
                        
                                    
                                       teSS
                                        = 6,54 · 10 – 3 · K
                                       OW + 55,31 (h)
                                 
                                 
                                    [A5.18 lygtis]
                                 
                              gali būti naudojama apskaičiuojant laiką, per kurį pasiekiama faktinė nuostovioji būsena (t
                           eSS
                           ) (12). Jei bandomosios cheminės medžiagos log K
                           OW = 4, gaunama:
                        
                           teSS
                            = 6,54 · 10 – 3 · 104 + 55,31 = 121 h
                        
                        3.   APSIVALYMO TARPSNIO TRUKMĖS PROGNOZAVIMAS
                        Taikant bendrąją lygtį, kuri aprašo sugertį ir apsivalymą (darant prielaidą dėl pirmojo laipsnio kinetikos), žr. A5.9 lygtį (1) (13), galima prognozuoti laiką, per kurį organizmo sugertos cheminės medžiagos kiekis sumažėja iki pradinės koncentracijos tam tikros procentinės dalies.
                        Daroma prielaida, kad apsivalymo tarpsnio C
                           w (arba C
                           maisto atliekant mitybos bandymą) yra lygi nuliui. Tada lygtį galima supaprastinti taip:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.19 lygtis]
                                 
                              arba
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.20 lygtis]
                                 
                              čia: C
                           f,0 – koncentracija apsivalymo tarpsnio pradžioje.
                        50 % apsivalymas bus pasiektas laiko momentu (t
                           50):
                        
                           
                        arba
                        
                           
                        Panašiai 95 % apsivalymo trukmė yra lygi:
                        
                           
                        Jei pirmajam laikotarpiui taikoma 80 % sugerties trukmė (1,6/k
                           2), o apsivalymo tarpsnio trukmė atitinka 95 % netekimą (3,0/k
                           2), apsivalymo tarpsnio trukmė maždaug du kartus ilgesnė nei sugerties tarpsnio trukmė.
                        Reikia pažymėti, kad įverčiai pagrįsti prielaida dėl sugerties ir apsivalymo vyksmo pagal pirmojo laipsnio kinetiką. Jei procesai akivaizdžiai vyksta ne pagal pirmojo laipsnio kinetiką, šie įverčiai netinka.
                        4.   NUOSEKLUSIS METODAS. APSIVALYMO (NETEKIMO) GREIČIO KONSTANTOS K
                           2 NUSTATYMAS
                        Buvo padaryta prielaida, kad biologinio koncentravimo duomenis gana tiksliai aprašo paprastas dviejų aplinkos terpių ir dviejų parametrų modelis, kurį rodo ištiesinta kreivė, einanti maždaug per koncentracijos žuvyje apsivalymo tarpsniu taškus (natūraliojo logaritmo skalėje).
                        
                           
                        Tekstas paveikslėlio
                        
                           In(koncentracija)
                           Cf2
                           Cf1
                           t2
                           t1
                           Laikas
                        
                        Reikia pažymėti, kad nukrypimai nuo tiesės gali rodyti sudėtingesnę nei pirmojo laipsnio kinetikos apsivalymo schemą. Galima taikyti grafinį metodą, kad būtų nustatytas pirmojo laipsnio kinetikos neatitinkantis apsivalymo tipas.
                        Atliekama tiesinė ln(koncentracijos) kaip laiko funkcijos regresija, kad k
                           2 būtų apskaičiuota pagal kelis laiko (ėminių ėmimo) taškus. Regresijos tiesės krypties koeficientas yra apsivalymo greičio konstantos k
                           2 įvertis (89). Pagal atkarpos dydį galima nesunkiai apskaičiuoti vidutinę koncentraciją žuvyje apsivalymo tarpsnio pradžioje (C
                           0,d, kuri yra lygi vidutinei koncentracijai žuvyje sugerties tarpsnio pabaigoje) (įskaitant leidžiamąsias paklaidas) (89):
                        
                                    
                                       C
                                       0,
                                       
                                          d
                                        = eatkarpa
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [A5.21 lygtis]
                                 
                              Jei k
                           2 reikia apskaičiuoti tik pagal du turimus laiko (ėminių ėmimo) taškus (kaip pagal supaprastintą schemą), dvi vidutinės koncentracijos vertės įrašomos į šią lygtį:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.22 lygtis]
                                 
                              Šioje lygtyje ln(C
                           f1) ir ln(C
                           f2) yra koncentracijos verčių laiko momentais t
                           1 ir t
                           2 natūralieji logaritmai, o t
                           2 ir t
                           1 – dviejų ėminių ėmimo laikas nuo apsivalymo tarpsnio pradžios (90).
                        5.   NUOSEKLUSIS METODAS. SUGERTIES GREIČIO KONSTANTOS K
                           1 NUSTATYMAS (TIK VEIKIMO PER VANDENINĘ TERPĘ METODAS)
                        k1 vertę galima rasti sugerties tarpsnio koncentracijos ir laiko sekos duomenims taikant kompiuterinę programą šiam modeliui pritaikyti:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.23 lygtis]
                                 
                              Čia k
                           2 pateikta atliekant ankstesnį skaičiavimą, C
                           f(t) ir C
                           w(t) – koncentracija žuvyje ir vandenyje momentu t.
                        Jei k
                           1 reikia apskaičiuoti tik pagal du turimus laiko (ėminių ėmimo) taškus (kaip pagal supaprastintą schemą), naudojama tokia formulė:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.24 lygtis]
                                 
                              Čia k
                           2 pateikta atliekant ankstesnį skaičiavimą, C
                           f – koncentracija žuvyje apsivalymo tarpsnio pradžioje ir C
                           w – vidutinė koncentracija vandenyje sugerties tarpsnio metu (91).
                        Apžiūra tikrinant k
                           1 ir k
                           2 krypties koeficientus, gautus grafike pagal ėminių ėmimo taškuose išmatuotus duomenis, gali būti naudojama suderintumui įvertinti. Jei pasirodo, kad nuosekliuoju metodu gautas netinkamas k
                           1 įvertis, reikėtų taikyti vienalaikį metodą k
                           1 ir k
                           2 apskaičiuoti (žr. kitą 6 skirsnį). Vėlgi, gautus krypties koeficientus reikėtų palyginti su išmatuotų duomenų grafiku, kad apžiūrint būtų įvertintas suderintumas. Jei suderintumas yra blogas, tai gali rodyti, kad pirmojo laipsnio kinetika netinka ir reikėtų taikyti sudėtingesnius modelius.
                        6.   VIENALAIKIS METODAS SUGERTIES IR APSIVALYMO (NETEKIMO) GREIČIO KONSTANTOMS APSKAIČIUOTI (TIK VEIKIMO PER VANDENINĘ TERPĘ METODAS)
                        Galima naudoti kompiuterines programas k
                           1 ir k
                           2 vertėms nustatyti pagal koncentracijos ir laiko sekos duomenis ir modelį:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    0 < t < t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [A5.25 lygtis]
                                 
                              
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    
                                       t > t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [A5.26 lygtis]
                                 
                              čia
                        
                                    
                                       t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    sugerties tarpsnio pabaigos laikas.
                                 
                              Šiuo metodu tiesiogiai gaunamos k
                           1 ir k
                           2 įverčių standartinės paklaidos. Kai k
                           1/k
                           2 A5.25 lygtyje ir A5.26 lygtyje pakeičiamos BCF (žr. A5.4 lygtį), taip pat galima įvertinti BCF standartinę paklaidą ir 95 % PI. Tai ypač naudinga lyginant skirtingus įverčius, gautus transformuojant duomenis. Priklausomasis kintamasis (koncentracija žuvyje) gali būti priderintas atliekant transformavimą į natūralųjį logaritmą arba be jo, o gauto BCF neapibrėžtis gali būti įvertinta.
                        Kadangi tarp vienu metu įvertinamų dviejų parametrų k
                           1 ir k
                           2 yra stipri koreliacija, galbūt būtų geriau iš pradžių apskaičiuoti k
                           2 tik pagal apsivalymo duomenis (žr. pirmiau); k
                           2 dažniausiai galima įvertinti pagal apsivalymo kreivę, esant palyginti geram tikslumui. Vėliau pagal sugerties duomenis galima apskaičiuoti k
                           1, taikant netiesinę regresiją (92). Priderinant nuosekliai, patartina naudoti tokį patį duomenų transformavimą.
                        Apžiūra tikrinant krypties koeficientus, gautus grafike pagal ėminių ėmimo taškuose išmatuotus duomenis, gali būti naudojama suderintumui įvertinti. Jei pasirodo, kad šiuo metodu gautas netinkamas k1
                            įvertis, reikėtų taikyti vienalaikį metodą k
                           1 ir k
                           2 apskaičiuoti. Vėlgi, priderintą modelį reikėtų palyginti su išmatuotų duomenų grafiku, kad apžiūrint būtų įvertintas suderintumas, ir gautus k
                           1, k
                           2 parametrų įverčius, pagal juos gautą BCF, jų standartines paklaidas ir (arba) pasikliovimo intervalus reikėtų palyginti atsižvelgiant į skirtingus priderinimo tipus.
                        Jei suderintumas yra blogas, tai gali rodyti, kad pirmojo laipsnio kinetika netinka ir reikėtų taikyti sudėtingesnius modelius. Vienas iš dažniausiai pasitaikančių trukdžių yra žuvų augimas bandymo metu.
                        7.   KINETINIO BCF IR BMF PATAISA ATSIŽVELGIANT Į PRASKIEDIMĄ DĖL AUGIMO
                        Šiame skirsnyje aprašytas standartinis metodas pataisai dėl žuvų augimo bandymų metu gauti (vadinamasis „praskiedimas dėl augimo“), kuris tinka tik tada, kai galioja pirmojo laipsnio kinetika. Jei yra požymių, kad pirmojo laipsnio kinetika negalioja, siūloma klausti biologinės statistikos specialisto patarimo, kaip tinkamai įvertinti praskiedimo dėl augimo pataisą, arba taikyti toliau aprašytą mase pagrįstą metodą.
                        Kartais šiam praskiedimo dėl augimo pataisos metodui trūksta tikslumo arba jis kartais visiškai netinka (pvz., jei labai lėtai pasišalinančios cheminės medžiagos bandomos greitai augančiose žuvyse, apskaičiuota apsivalymo greičio konstanta su praskiedimo dėl augimo pataisa k
                           2g gali būti labai maža, todėl labai svarbia tampa jai gauti naudojamų dviejų greičio konstantų paklaida ir kai kuriais atvejais k
                           g įverčiai gali būti didesni nei k
                           2). Tokiais atvejais gali būti taikomas alternatyvus metodas (t. y. masių metodas), kuris taip pat tinka tada, kai augimo kinetika nėra pirmojo laipsnio ir kurį taikant nereikia daryti pataisos. Šis metodas aprašytas skirsnio gale.
                        
                           Augimo greičio konstantos atėmimas darant pataisą dėl augimo
                        
                        Taikant standartinį metodą, atskirai chemine medžiaga paveiktų ir kontrolinių grupių visi atskiri masės ir ilgio duomenys perskaičiuojami į natūraliuosius logaritmus ir gaunami ln(masės) ar ln(1/masės) kaip laiko (paros) funkcijos grafikai. Tas pats procesas kartojamas atskirai sugerties ir apsivalymo tarpsnių duomenims. Darant praskiedimo dėl augimo pataisą, paprastai geriau imti viso tyrimo masės duomenis augimo greičio konstantai (k
                           g) gauti, bet statistiškai reikšmingi skirtumai tarp gautų sugerties ir apsivalymo tarpsnių greičio konstantų, gali reikšti, kad reikėtų naudoti apsivalymo tarpsnio greičio konstantą. Visuminiai augimo greičiai, gauti atliekant veikimo per vandeninę terpę metodo tyrimus, gali būti naudojami visiems su chemine medžiaga paveiktomis žuvimis susijusiems reiškiniams patikrinti.
                        Taikant standartines statistines procedūras, mažiausiųjų kvadratų metodu apskaičiuojama viso tyrimo, sugerties ir apsivalymo tarpsnių kiekvienos grupės (bandymo (-ų) ir kontrolinės grupės, atskirų duomenų, ne paros vidutinių verčių) ln(žuvų masės) kaip laiko (paros) funkcijos (ir ln(1/masės) kaip laiko (paros) funkcijos) tiesinė koreliacija. Apskaičiuojama tiesių krypties koeficientų dispersijos, kurios naudojamos krypties koeficientų (augimo greičio konstantų) skirtumo statistiniam reikšmingumui įvertinti (p = 0,05), taikant Stjudento t kriterijų (arba ANOVA, jei bandoma daugiau kaip viena koncentracija). Darant pataisą dėl augimo, pirmenybė dažniausiai teikiama masės duomenims. Tokiu pačiu būdu apdoroti ilgio duomenys gali būti naudingi kontrolinėms ir bandymų grupėms palyginti dėl su apdorojimu susijusių reiškinių. Jei yra statistiškai reikšmingi masės duomenų analizės skirtumai, bandymų ir kontroliniai duomenys gali būti sujungti ir tyrimo visuminė žuvų augimo greičio konstanta (k
                           g) apskaičiuojama kaip tiesinės koreliacijos visuminis krypties koeficientas. Jei stebimi statistiškai reikšmingi skirtumai, kiekvienos žuvų grupės ir (arba) tyrimo tarpsnio augimo greičio konstantos ataskaitoje pateikiamos atskirai. Tada kiekvienos apdorotos grupės greičio konstantą reikėtų naudoti tos grupės praskiedimo dėl augimo pataisai daryti. Jei buvo pastebėti statistiniai skirtumai tarp sugerties ir apsivalymo tarpsnių greičio konstantų, reikėtų naudoti apsivalymo tarpsniui gautas greičio konstantas.
                        Apskaičiuotą augimo greičio konstantą (k
                           g, išreikštą paros– 1) galima atimti iš visuminės apsivalymo greičio konstantos (k
                           2) apsivalymo greičio konstantai k
                           2g gauti.
                        
                                    
                                       k
                                       2
                                       
                                          g
                                        = k
                                       2 – kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [A5.27 lygtis]
                                 
                              Sugerties greičio konstanta dalijama iš dėl augimo pataisytos apsivalymo greičio konstantos, kad būtų gautas kinetinis BCF su pataisa dėl augimo, žymimas BCFKg (arba BMFKg).
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.28 lygtis]
                                 
                              Mitybos tyrimui gauta augimo greičio konstanta naudojama A7.5 lygtyje BMFKg su pataisa dėl augimo apskaičiuoti (žr. 7 priedėlį).
                        
                           Mase pagrįstas metodas, taikomas vietoj pataisos dėl augimo
                        
                        Pirmiau nurodytą augimo greičio konstantos atėmimo metodą galima pakeisti kitu metodu, kurį taikant nereikia daryti pataisos dėl augimo. Jo principą sudaro tai, kad naudojami apsivalymo tarpsnio duomenys, gauti pagal visą žuvies masę, o ne pagal koncentraciją.
                        Apsivalymo tarpsnio audinių koncentracijos vertės (bandomosios cheminės medžiagos masė/žuvies masės vienetas) perskaičiuojamos į bandomosios cheminės medžiagos masę/žuviai: koncentracija ir atskiros žuvies masė pateikiamos greta lentelės pavidalu (pvz., naudojant kompiuterinę elektroninę lentelę) ir kiekviena to matavimo koncentracijos vertė padauginama iš visos žuvies masės, kad būtų gautas visų apsivalymo tarpsnio ėminių bandomosios cheminės medžiagos masės/žuviai duomenų rinkinys.
                        Gaunamas apskaičiuotų cheminės medžiagos masės duomenų natūraliojo logaritmo kaip bandymo (apsivalymo tarpsnio) laiko funkcijos grafikas, kaip tai paprastai būtų daroma.
                        Taikant veikimo per vandeninę terpę metodą, įprastiniu būdu gaunama sugerties greičio konstanta (žr. 4 ir 6 skirsnius); (reikia pažymėti, kad k
                           1 kreivių priderinimo lygtyse reikia naudoti „įprastinę“k
                           2) ir pagal pirmiau nurodytus duomenis apskaičiuojamą apsivalymo greičio konstantą. Kadangi gauta apsivalymo greičio konstantos vertė nepriklauso nuo augimo, nes ji buvo gauta pagal visos žuvies masę, ją reikėtų žymėti k
                           2g, bet ne k
                           2.
                        8.   LIPIDŲ NORMALIZAVIMAS PAGAL 5 % LIPIDŲ KIEKĮ (TIK VEIKIMO PER VANDENINĘ TERPĘ METODAS)
                        BCF (kinetinio ir nuostoviosios būsenos) rezultatai, gauti atliekant veikimo per vandeninę terpę bandymus, taip pat turėtų būti pateikti ataskaitoje numatytojo 5 % šlapios kūno masės žuvų lipidų kiekio atžvilgiu, nebent būtų galima įrodyti, kad ne lipidai sukaupia didžiausią bandomosios cheminės medžiagos kiekį (pvz., kai kurios perfluorintos cheminės medžiagos gali jungtis su baltymais). Koncentravimo žuvyse duomenis arba BCF reikia perskaičiuoti lipidų kiekiui, kuris sudaro 5 % šlapios kūno masės. Jei ta pati žuvis buvo naudojama visų ėminių ėmimo taškų cheminės medžiagos koncentracijai ir lipidų kiekiui matuoti, kiekvienai atskirai išmatuotai koncentracijai žuvyje turi būti daroma pataisa pagal tos žuvies lipidų kiekį.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.29 lygtis]
                                 
                              čia:
                        
                                    
                                       C
                                       f,L
                                    
                                 
                                 
                                    pagal lipidus normalizuota koncentracija žuvyje (mg kg– 1 šlapios kūno masės);
                                 
                              
                                    
                                       L
                                    
                                 
                                 
                                    lipidų dalis (pagal šlapią kūno masę);
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvyje (mg kg– 1 šlapios kūno masės).
                                 
                              Jei buvo atliekama ne visų ėminio žuvų lipidų analizė, BCF normalizuojamas pagal vidutinę lipidų vertę. Jei kalbama apie nuostoviosios būsenos BCF, reikėtų naudoti paveiktos chemine medžiaga grupės sugerties tarpsnio gale gautą vertę. Jei reikia normalizuoti kinetinį BCF, kartais pasiteisina kitas metodas, pvz., jei lipidų kiekis reikšmingai pakito sugerties ar apsivalymo tarpsniu. Tačiau paprastai reikėtų naudoti maisto normą, kuri kiek įmanoma sumažina staigius lipidų kiekio pokyčius.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A5.30 lygtis]
                                 
                              čia:
                        
                                    BCFKL
                                    
                                 
                                 
                                    pagal lipidus normalizuotas kinetinis BCF (l kg– 1);
                                 
                              
                                    
                                       L
                                       n
                                    
                                 
                                 
                                    vidutinė lipidų dalis (pagal šlapią kūno masę);
                                 
                              
                                    BCFK
                                    
                                 
                                 
                                    kinetinis BCF (l kg– 1).
                                 
                              LITERATŪRA
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems, Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343–2355.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Šio priedo C.20 skyrius. Daphnia magna reprodukcijos bandymas.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1: 309-320.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute, Hørsholm, Denmark.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. Available from: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). Bioconcentration of 2,2',4,4' tetrachlorobiphenyl in rainbow trout as measured by an accelerated test. T. Am. Fish. Soc. 104: 785-792.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Ernst W. (1985), Accumulation in aquatic organisms, in Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals, Sheeman, P., et al., Editors. John Wiley & Sons Ltd, New York, NY, USA: 243-255.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models. Can. J. Chem. Eng. 55: 614-622.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Konemann H. and van Leeuwen K. (1980), Toxicokinetics in fish: Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by guppies. Chemosphere. 9: 3-19.
                                 
                              
                     
                        6 priedėlis
                        
                           VEIKIMO PER VANDENINĘ TERPĘ BANDYMO LYGČIŲ SKYRIUS. SUPAPRASTINTO BANDYMO SCHEMA
                        
                        Šio metodo pagrindinis argumentas yra tai, kad atliekant viso mato bandymą biologinio koncentravimo faktorius gali būti nustatytas kaip nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BCFSS), skaičiuojant bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos žuvies audinyje ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vandenyje santykį, arba skaičiuojant kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BCFK) kaip sugerties greičio konstantos k
                           1 ir apsivalymo greičio konstantos k
                           2 santykį. BCFK yra tinkamas sugerties tarpsniu netgi nepasiekus cheminės medžiagos nuostoviosios būsenos koncentracijos, jei sugertis ir apsivalymas vyksta maždaug kaip pirmojo laipsnio kinetikos procesai.
                        Jei cheminės medžiagos koncentracija audiniuose (C
                           f1) matuojama veikimo pabaigos momentu (t
                           1) ir dar kartą matuojama laiko momentu (t
                           2) kaip koncentracija audiniuose (C
                           f2), apsivalymo greičio konstanta (k
                           2) gali būti įvertinta, naudojant 5 priedėlio A5.22 lygtį.
                        Tada, naudojant 5 priedėlio A5.23 lygtį, algebriniu metodu galima nustatyti sugerties greičio konstantą k
                           1 (kai C
                           f yra lygi C
                           f1, o t lygus t
                           1) (1). Taigi pagal supaprastintą schemą gautas kinetinis biologinio koncentravimo faktorius (žymimas BCFKm, kad būtų galima atskirti nuo kinetinių biologinio koncentravimo faktorių, nustatytų pagal kitus metodus) yra lygus:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A6.1 lygtis]
                                 
                              Reikėtų daryti koncentracijos verčių arba rezultatų praskiedimo dėl augimo pataisą ir normalizuoti pagal 5 % lipidų kiekį, kaip aprašyta 5 priedėlyje.
                        Pagal supaprastintą schemą gautas BCFSS
                            yra BCF, apskaičiuotas sugerties tarpsnio pabaigoje, darant prielaidą, kad nuostovioji būsena buvo pasiekta. Galima daryti tik prielaidą, nes ėminių ėmimo taškų yra per mažai, kad tai būtų galima įrodyti.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A6.2 lygtis]
                                 
                              Čia:
                        
                           
                              
                                 C
                                 f-minSS
                              
                            koncentracija žuvyje, darant prielaidą dėl nuostoviosios būsenos sugerties tarpsnio pabaigoje (mg kg– 1 šlapios kūno masės);
                        
                           
                              
                                 C
                                 w-minSS
                              
                            koncentracija vandenyje, darant prielaidą dėl nuostoviosios būsenos sugerties tarpsnio pabaigoje (mg l– 1).
                        LITERATŪRA
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                                 
                              
                     
                        7 priedėlis
                        
                           MITYBOS BANDYMO LYGČIŲ SKYRIUS
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Pirktinio žuvų maisto sudedamųjų dalių kiekio pavyzdžiai
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Maisto sodrinimo būdų pavyzdžiai
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Įsisavinimo efektyvumo ir biomagnifikacijos faktoriaus skaičiavimas
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Pataisa dėl lipidų
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Skirtumų tarp išmatuotos nulinio laiko koncentracijos (C
                                       0,m) ir apskaičiuotos nulinio laiko koncentracijos (C
                                       0,d)įvertinimas
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Nurodymai dėl labai sparčiai pasišalinančių bandomųjų cheminių medžiagų
                                 
                              1.   PIRKTINIO ŽUVŲ MAISTO SUDEDAMŲJŲ DALIŲ KIEKIO PAVYZDŽIAI
                        
                                    Pagrindinė sudedamoji dalis
                                 
                                 
                                    Žuvų maistas
                                 
                              
                                    Žali baltymai
                                 
                                 
                                    ≤ 55,0 %
                                 
                              
                                    Žali riebalai
                                 
                                 
                                    ≤ 15,0 % (93)
                                    
                                 
                              
                                    Žalia ląsteliena
                                 
                                 
                                    ≥ 2,0 %
                                 
                              
                                    Drėgmė
                                 
                                 
                                    ≥ 12 %
                                 
                              
                                    Pelenai
                                 
                                 
                                    ≥ 8 %
                                 
                              2.   MAISTO SODRINIMO BŪDŲ PAVYZDŽIAI
                        
                           Bendrosios nuostatos
                        
                        Kontrolinių ėminių maistą reikėtų ruošti visiškai tokiu pačiu būdu, kaip ir sodrintą maistą, bet be bandomosios cheminės medžiagos.
                        Norint patikrinti koncentraciją apdorotame maiste, tinkamu ekstrahavimo metodu reikėtų ekstrahuoti tris kartotinius maisto su medžiagos doze ėminius ir ekstraktuose išmatuoti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją ar radioaktyvumą. Reikėtų įrodyti didelį atgavimo laipsnį (> 85 %) ir mažą skirtumą tarp ėminių rezultatų (bandymo pradžioje paimtų trijų ėminių cheminės medžiagos koncentracijos vertės neturėtų skirtis daugiau kaip ± 15 % nuo vidurkio).
                        Atliekant mitybos bandymą, reikėtų paimti po tris maisto ėminius 0 parą ir sugerties tarpsnio pabaigoje bandomajai cheminei medžiagai maiste nustatyti.
                        
                           Žuvų maisto su skysta bandomąja chemine medžiaga (gryna) paruošimas
                        
                        Nustatoma tikslinė nominali bandymo koncentracija apdorotame žuvų maiste, pvz., 500 μg bandomosios cheminės medžiagos/g maisto. Reikiamas grynos bandomosios cheminės medžiagos kiekis (pagal molinę masę ar savitąjį aktyvumą) įdedamas į stiklinį indą arba sukamojo garintuvo apvaliadugnę kolbą. Žuvų maisto masės turėtų pakakti visai sugerties tarpsnio trukmei (atsižvelgiant į būtinumą didinti kiekį kiekvieną kartą maitinant dėl žuvų augimo). Žuvų maistas ir bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti maišomi per naktį lėtai vartant ( pvz., naudojant būgninį maišytuvą arba sukant, jei naudojama sukamojo garintuvo apvaliadugnė kolba). Sodrintą maistą reikėtų laikyti tokiomis sąlygomis, kurios užtikrina bandomosios cheminės medžiagos stabilumą maisto mišinyje iki jis bus panaudotas (pvz., šaldytuve).
                        
                           Žuvų maisto paruošimas, kaip nešiklį naudojant kukurūzų aliejų ar žuvų taukus
                        
                        Kietąsias bandomąsias chemines medžiagas reikėtų sumalti grūstuvėje į smulkius miltelius. Skystąsias bandomąsias chemines medžiagas galima dėti tiesiogiai į kukurūzų aliejų ar žuvų taukus. Bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama žinomame kukurūzų aliejaus ar žuvų taukų tūryje (pvz., 5–15 ml). Sudozuotas aliejus yra kiekybiškai supilamas į tinkamo tūrio sukamojo garintuvo apvaliadugnę kolbą. Kolbą, naudojamą dozei aliejuje ruošti, reikėtų praplauti dviem nedideliais alikvotiniais aliejaus tūriais ir šį aliejų supilti į apvaliadugnę kolbą, siekiant užtikrinti, kad būtų supilta visa ištirpinta bandomoji cheminė medžiaga. Siekiant užtikrinti visišką ištirpimą ar dispergavimą aliejuje (arba jei tiriama daugiau nei viena bandomoji cheminė medžiaga), įdedama mikromaišyklė, kolba užkemšama ir mišinys greitai maišomas per naktį. Į apvaliadugnę kolbą įdedamas bandymui reikiamas žuvų maisto kiekis (paprastai granulių pavidalu), kolbos turinys tolygiai maišomas, nepertraukiamai sukant kolbą ne trumpiau kaip 30 min, bet pageidautina per naktį. Sodrintą maistą reikia tinkamai laikyti (pvz., šaldytuve), kad būtų užtikrintas bandomosios cheminės medžiagos stabilumas maiste iki jis bus naudojamas.
                        
                           Žuvų maisto paruošimas naudojant organinį tirpiklį
                        
                        Tikslinei dozei gauti reikiamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis (pagal molinę masę ar savitąjį aktyvumą) ištirpinamas tinkamame organiniame tirpiklyje (pvz., cikloheksane arba acetone; 10–40 ml ar didesniame tūryje, jei reikia, atsižvelgiant į sodrinamo maisto kiekį). Šio tirpalo alikvotinė dalis arba visas (dalimis įpilamas) tirpalas sumaišomas su bandymui atlikti pakankama žuvų maisto mase, kad būtų gautas reikiamas nominalus dozės dydis. Maistą ir bandomąją cheminę medžiagą galima sumaišyti nerūdijančiojo plieno maišymo dubenėlyje ir naujai paruoštas žuvų maistas su doze dviem dienom paliekamas laboratorijos traukos spintoje tame pačiame inde (ir kartais maišomas), kad galėtų išgaruoti tirpiklio perteklius, arba maišomas sukamojo garintuvo apvaliadugnėje kolboje, ją nuolat sukant. Prireikus tirpiklio perteklių galima „išpūsti“ oro ar azoto srove. Reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad bandomoji cheminė medžiaga neišsikristalizuotų, kai pašalinamas tirpiklis. Sodrintą maistą reikėtų laikyti tokiomis sąlygomis (pvz., šaldytuve), kurios užtikrintų bandomosios cheminės medžiagos stabilumą maiste iki jis bus naudojamas.
                        3.   ĮSISAVINIMO EFEKTYVUMO IR BIOMAGNIFIKACIJOS FAKTORIAUS SKAIČIAVIMAS
                        Įsisavinimo efektyvumas apskaičiuojamas, turint visuminės apsivalymo greičio konstantos įvertį pagal 5 priedėlio 4 skirsnį (taikant nuoseklųjį metodą, t. y. standartinę tiesinę regresiją), naudojant apsivalymo tarpsnio ėminių vidutines koncentracijos vertes. Maisto norma I ir sugerties trukmė t yra žinomi tyrimo parametrai. C
                           maisto, vidutinė išmatuota bandomosios cheminės medžiagos koncentracija maiste, yra matuojamas tyrimo kintamasis. C
                           0,d, bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvyje sugerties tarpsnio pabaigoje, paprastai apskaičiuojama pagal ln(koncentracijos) kaip apsivalymo trukmės funkcijos grafiko atkarpą.
                        Cheminės medžiagos įsisavinimo efektyvumas (a, bandomosios cheminės medžiagos absorbcija per virškinimo traktą) apskaičiuojamas taip:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.1 lygtis]
                                 
                              čia:
                        
                           
                              
                                 C
                                 0,d
                              
                            apskaičiuota koncentracija žuvyje apsivalymo tarpsnio nuliniu laiku (mg kg– 1);
                        
                           
                              
                                 k
                                 2
                              
                            visuminė (be pataisos dėl augimo) apsivalymo greičio konstanta (paros– 1), apskaičiuota pagal 5 priedėlio 3 skirsnį;
                        
                           
                              
                                 I
                              
                            maisto suvartojimo norma (g maisto g– 1 žuvies paros– 1);
                        
                           
                              
                                 C
                                 food
                              
                            koncentracija maiste (mg kg-1 maisto);
                        
                           
                              t
                            maitinimo laikotarpio trukmė (paros).
                        Tačiau gali tekti daryti skaičiuojant naudojamos maisto normos I pataisą dėl žuvų augimo, kad būtų gautas tikslus įsisavinimo efektyvumas a. Jei atliekant bandymą žuvų augimas sugerties tarpsniu (kurio eigoje maisto kiekis nekeičiamas nustatytai maisto normai užtikrinti) yra reikšmingas, efektyvioji maisto norma sugerties tarpsnio eigoje bus mažesnė nei nustatyta, todėl „faktinis“ įsisavinimo efektyvumas bus didesnis. (Reikia pažymėti, kad tai nėra svarbu atliekant bendruosius BMF skaičiavimus, nes A7.1 lygties ir A7.4 lygties I nariai faktiškai pasinaikina). Vidutinė maisto norma su praskiedimo dėl augimo pataisa I
                           g gali būti gauta keliais būdais, bet paprasčiausias ir tikslus būdas yra žinomos augimo greičio konstantos (k
                           g) naudojimas žuvų masei sugerties tarpsnio momentais įvertinti, t. y.:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.2 lygtis]
                                 
                              čia
                        
                           
                              W
                              f(t)– vidutinė žuvies masė sugerties tarpsnio parą t;
                        
                           
                              W
                              f,0
                           – vidutinė žuvies masė bandymo pradžioje.
                        Šiuo būdu galima įvertinti (bent jau) vidutinę žuvies masę paskutinę veikimo parą (W
                           f, sugerties pabaiga). Kadangi maisto norma buvo nustatyta pagal W
                           f,0, kiekvienos paros efektyvioji maisto norma gali būti apskaičiuota naudojant šias dvi masės vertes. Tada maisto norma su pataisa dėl augimo I
                           g (g maisto g– 1 žuvies paros-1), kuri būtų naudojama vietoj I žuvims greitai augant sugerties tarpsniu, gali būti apskaičiuota taip:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.3 lygtis]
                                 
                              Gavus įsisavinimo efektyvumo vertę, BMF galima apskaičiuoti ją dauginant iš maisto normos I (arba I
                           g, jei naudota α apskaičiuoti) ir sandaugą dalijant iš visuminės apsivalymo greičio konstantos k
                           2:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.4 lygtis]
                                 
                              Taip pat reikėtų tokiu pačiu būdu apskaičiuoti biomagnifikacijos faktorių su pataisa dėl augimo, naudojant apsivalymo greičio konstantą su pataisa dėl augimo (gauta pagal 5 priedėlio 7 skirsnį). Vėlgi, jei α apskaičiuoti buvo naudojama I
                           g, ją taip pat reikėtų naudoti šioje lygtyje vietoj I:. Vėlgi, jei α apskaičiuoti buvo naudojama I
                           g, ją taip pat reikėtų naudoti šioje lygtyje vietoj I:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.5 lygtis]
                                 
                              čia:
                        
                           
                              
                                 α
                              
                            įsisavinimo efektyvumas (bandomosios cheminės medžiagos absorbcija per virškinimo traktą);
                        
                           
                              
                                 k
                                 2
                              
                            visuminė (be pataisos dėl augimo) apsivalymo greičio konstanta (paros– 1), apskaičiuota pagal 5 priedėlio 3 skyriaus lygtis
                        
                           
                              
                                 k
                                 2g
                              
                            (apsivalymo greičio konstanta su pataisa dėl augimo, paros– 1);
                        
                           
                              
                                 I
                              
                            maisto suvartojimo norma (g maisto g– 1 žuvies paros– 1);
                        Pusėjimo trukmė su pataisa dėl augimo (t
                           1/2) apskaičiuojama taip:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.6 lygtis]
                                 
                              Cheminės medžiagos įsisavinimo iš maisto efektyvumą taip pat galima įvertinti, jei likučiai žuvų audiniuose nustatomi sugerties tarpsnio ankstyvuoju tiesiniu tarpsniu (nuo 1 iki 3 paros). Šiuo atveju cheminės medžiagos įsisavinimo efektyvumas (α) gali būti nustatytas taip:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.7 lygtis]
                                 
                              Čia:
                        
                           
                              
                                 C
                                 žuvyje
                                 (t)
                              
                            bandomosios cheminės medžiagos koncentracija žuvyje momentu t (mg kg– 1 šlapios kūno masės).
                        4.   PATAISA DĖL LIPIDŲ
                        Jei visais ėminių ėmimo momentais lipidų kiekis buvo matuojamas cheminės medžiagos analizei paimtoje žuvyje, reikėtų daryti atskirų koncentracijos verčių pataisą dėl lipidų ir gauti ln(koncentracijos, su pataisa dėl lipidų) kaip sugerties tarpsnio trukmės (paros) funkcijos grafiką C
                           0,d ir k
                           2 apskaičiuoti. Tada galima apskaičiuoti įsisavinimo efektyvumą (A7.1 lygtis) su pataisa dėl lipidų, naudojant C
                           maisto su pataisa dėl lipidų (t. y. C
                           maisto dauginama iš vidutinės maisto lipidų dalies). Toliau skaičiuojant pagal A7.4 lygtį ir A7.5 lygtį, bus tiesiogiai gautas BMF su pataisa dėl lipidų (ir praskiedimo dėl augimo pataisa).
                        Kitu atveju apskaičiuojama apdorotos ir kontrolinės grupių vidutinė žuvies ir maisto lipidų dalis (masės) (maisto ir kontrolinės grupės žuvų lipidų dalis apskaičiuojama pagal veikimo pradžioje ir pabaigoje gautus duomenis, chemine medžiaga paveiktos grupės žuvų – paprastai tik pagal veikimo pabaigoje gautus duomenis). Atliekant kai kuriuos tyrimus, gali gerokai padidėti žuvų lipidų kiekis; tokiais atvejais labiau tinka naudoti vidutinę bandymų žuvų lipidų koncentraciją, apskaičiuotą pagal veikimo pabaigoje ir apsivalymo pradžioje išmatuotas vertes. Apskritai, apdorojimo grupės duomenis reikėtų naudoti tik abiem lipidų dalims apskaičiuoti.
                        Pataisos dėl lipidų faktorius (Lc
                           ) apskaičiuojamas taip:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.8 lygtis]
                                 
                              čia: L
                           žuvies ird L
                           maisto – vidutinė žuvies ir maisto lipidų dalis.
                        Pataisos dėl lipidų faktorius yra naudojamas biomagnifikacijos faktoriui su pataisa dėl lipidų (BMFL) apskaičiuoti:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [A7.9 lygtis]
                                 
                              5.   SKIRTUMŲ TARP IŠMATUOTOS NULINIO LAIKO KONCENTRACIJOS (C
                           0,M) IR APSKAIČIUOTOS NULINIO LAIKO KONCENTRACIJOS (C
                           0,D)ĮVERTINIMAS
                        Reikėtų palyginti išmatuotą nulinio laiko koncentraciją (C
                           0,m) ir apskaičiuotą nulinio laiko koncentraciją (C
                           0,d). Jei jos labai panašios, tai tik patvirtintų pirmojo laipsnio modelį, taikomą apsivalymo parametrams gauti.
                        Atliekant kai kuriuos tyrimus, gali būti gautas gana didelis skirtumas tarp apskaičiuotos nulinio laiko koncentracijos vertės C
                           0,d ir vidutinės išmatuotos nulinio laiko koncentracijos C
                           0,m (žr. šio bandymų metodo 159 pastraipos paskutinę įtrauką). Jei C
                           0,d yra gerokai mažesnė nei C
                           0,m (C
                           0,d << C
                           0,m), skirtumas gali reikšti nesuvirškinto sodrinto maisto buvimą virškinimo trakte. Tai galima patikrinti bandymo keliu, atliekant išpjauto virškinimo trakto analizę, jei sugerties tarpsnio pabaigoje buvo paimti ir laikomi papildomi (visos žuvies) ėminiai. Arba, jei apsivalymo tarpsnio duomenų tiesinei regresijai taikant statistiškai pagrįstą riktų kriterijų pasirodo, kad pirmajam apsivalymo ėminių ėmimo taškui gaunama klaidingai didelė vertė, galbūt, atliekant tiesinę regresiją k
                           2 gauti, reikėtų atmesti pirmojo apsivalymo tarpsnio taško koncentracijos vertę. Jei tokiais atvejais gerokai sumažėja tiesinės regresijos neapibrėžtis ir yra aišku, kad apsivalymo kinetika buvo maždaug pirmojo laipsnio, galbūt reikėtų naudoti gautas C
                           0,d ir k
                           2 vertes įsisavinimo efektyvumui skaičiuoti. Tai reikėtų išsamiai pagrįsti ataskaitoje. Gali būti, kad apsivalymo tarpsniui galiojo ne pirmojo laipsnio kinetika. Jei taip galėtų būti (t. y. vietoj tiesinės regresijos tiesės į natūralųjį logaritmą transformuoti duomenys duotų kreivę), maža tikimybė, kad k
                           2 ir C
                           0,d skaičiavimai yra pagrįsti, todėl reikėtų konsultuotis su biologinės statistikos specialistu.
                        Jei C
                           0,d yra ypač daug didesnis nei išmatuota vertė (C
                           0,d >> C
                           0,m), tai gali rodyti, kad cheminė medžiaga pasišalina labai greitai (t. y. koncentracija ėminių ėmimo taškuose jau pačioje apsivalymo tarpsnio pradžioje buvo arti analizės metodo kiekybinio nustatymo ribos, žr. 6 skirsnį), kad buvo nukrypimas nuo pirmojo laipsnio apsivalymo kinetikos, kad tiesinė regresija k
                           2 ir C
                           0,d apskaičiuoti turi trūkumų arba kad buvo problemų matuojant koncentracijos vertes kai kuriuose tyrimo ėminių ėmimo laiko taškuose. Tokiais atvejais reikėtų labai kruopščiai ištirti tiesinės regresijos grafiką dėl ėminių, kurių koncentracija atitinka kiekybinio nustatymo ribą ar yra arti jo, dėl riktų ir dėl akivaizdaus kreivumo (kuris leistų daryti prielaidą apie ne pirmojo laipsnio kinetiką), ir pažymėti ataskaitoje. Visi paskesni pakartotinai atlikti tiesinės regresijos skaičiavimai įverčiams pagerinti turėtų būti aprašyti ir pagrįsti. Jei stebimas aiškus nukrypimas nuo pirmojo laipsnio kinetikos, maža tikimybė, kad k
                           2 ir C
                           0,d skaičiavimai yra pagrįsti, todėl reikėtų pasitarti su biologinės statistikos specialistu.
                        6.   NURODYMAI DĖL LABAI SPARČIAI PASIŠALINANČIŲ BANDOMŲJŲ CHEMINIŲ MEDŽIAGŲ
                        Kaip aptarta bandymų metodo 129 pastraipoje, kai kurios cheminės medžiagos gali pasišalinti taip greitai, kad patikima nulinio laiko koncentracija C
                           0,d ir k
                           2 negali būti apskaičiuotos, nes cheminės medžiagos koncentracijos faktiškai nebeįmanoma išmatuoti jau pačioje apsivalymo tarpsnio pradžioje (t. y. nuo apsivalymo tarpsnio antrojo ėminio ir vėliau) (ataskaitoje koncentracijos vertės pateikiamos kaip kiekybinio nustatymo ribos koncentracija). Ši situacija buvo stebima atliekant tarplaboratorinį tyrimą su benz[a]pirenu šiam bandymų metodui patvirtinti ir buvo pateikta metodo tinkamumo patvirtinimo ataskaitos dokumentuose. Tokiais atvejais neįmanoma patikimai atlikti tiesinė regresijos ir yra tikimybė gauti neįtikėtinai didelį C
                           0,d įvertį, todėl gautas tariamasis įsisavinimo efektyvumas yra daug didesnis už 1. Taip galima apskaičiuoti mažesnį k
                           2 įvertį ir BMFk„viršutinę ribą“.
                        Naudojant tuos apsivalymo tarpsnio taškus, kuriuose koncentracija buvo matuojama iki pirmos „neaptiktos“ koncentracijos vertės imtinai (kiekybinio nustatymo ribos koncentracijos), (į natūralųjį logaritmą transformuotos koncentracijos ir laiko priklausomybės) tiesinės regresijos metodu gaunamas k
                           2 įvertis. Esant tokiems atvejams greičiausiai būtų galima įtraukti tik du duomenų taškus (pvz., apsivalymo tarpsnio 1 ir 2 paros ėminių ėmimo taškus) ir pagal 5 priedėlio A5.22 lygtį gali būti gautas k
                           2 įvertis. Šis k2 įvertis gali būti naudojamas įsisavinimo efektyvumui įvertinti pagal A7.1 lygtį, C0,d vertę joje pakeičiant išmatuota nulinio laiko koncentracija (C0,m) tais atvejais, kai būtų aiškiai įvertinta, kad C0,d yra daug didesnė, nei būtų gauta atliekant bandymą. Jei C0,m buvo neišmatuojama, reikėtų naudoti aptikimo žuvies audinyje ribą. Jei kai kuriais atvejais gaunama α > 1 vertė, daroma prielaida, kad „blogiausiojo atvejo“ įsisavinimo efektyvumas yra lygus 1.
                        Tada pagal A7.4 lygtį galima gauti maksimalų BMFK įvertį, ir reikėtų nurodyti, kad tai yra „gerokai mažesnė“ (<<) vertė. Pvz., jei tyrimas atliekamas, kai maisto norma yra 3 %, apsivalymo pusėjimo trukmė yra trumpesnė kaip 3 paros, o „blogiausiojo atvejo“ α yra lygus 1, BMFK tikėtinai yra mažesnis nei maždaug 0,13. Atsižvelgiant į šio įvertinimo tikslą ir tą faktą, kad vertės iš esmės bus su atsarga, nebūtina daryti praskiedimo dėl augimo arba dėl žuvų ir maisto lipidų kiekio pataisą.
                     
                     
                        8 priedėlis
                        
                           METODAI LAIKINIESIEMS BCF ĮVERČIAMS GAUTI PAGAL DUOMENIS, SUKAUPTUS ATLIEKANT MITYBOS TYRIMĄ
                        
                        Į šį bandymų metodą įtrauktas veikimo per mitybą metodas, skirtas bandyti chemines medžiagas, kurių praktiškai neįmanoma bandyti taikant veikimo per vandeninę terpę metodą. Bandant veikimo per vandeninę terpę metodu, gaunamas biologinio koncentravimo faktorius, o mitybos metodu tiesiogiai gaunama informacija apie maitinimo biomagnifikacijos gebą. Daugumai cheminės medžiagos saugos sistemų reikia turėti informacijos apie veikimo per vandeninę terpę biologinį koncentravimą (pvz., vertinant riziką ir taikant visuotinai suderintą cheminių medžiagų klasifikavimo sistemą). Todėl reikia naudoti mitybos tyrimo duomenis, kad būtų galima gauti biologinio koncentravimo faktoriaus įvertį, kuris būtų palyginamas su gautu taikant veikimo per vandeninę terpę metodą (94). Šiame skyriuje nagrinėjami metodai, kuriuos taikant tai būtų galima padaryti, kartu pripažįstant šiems įverčiams būdingus trūkumus.
                        Atliekant mitybos tyrimą, matuojamas apsivalymas jo greičio konstantai k
                           2 gauti. Jei sugerties greičio konstantos įvertį galima gauti turint duomenis tai situacijai, kurioje žuvys buvo veikiamos bandomąja chemine medžiaga per vandenį, galima būtų įvertinti kinetinį BCF.
                        Sugerties greičio konstantos vertinimas, kai bandomąja chemine medžiaga veikiama per vandenį, yra pagrįstas daugeliu prielaidų, kurių kiekviena prisidės prie įverčio neapibrėžties. Be to, taikant šį BCF įverčio gavimo metodą daroma prielaida, kad visuminis apsivalymo greitis (įskaitant prisidedančius veiksnius, pvz., pasiskirstymą kūne ir atskirus apsivalymo procesus) nepriklauso nuo veikimo būdo, kuriuo buvo gautas kūno sugertas bandomosios cheminės medžiagos kiekis.
                        Įvertinimo metodui būdingas prielaidas galima apibendrinti taip:
                        apsivalymas nuo tam tikros cheminės medžiagos po mitybos tyrimo vyksta taip pat, kaip ir po veikimo per vandeninę terpę metodo;
                        sugertis iš vandens vyks pagal pirmojo laipsnio kinetiką;
                        atsižvelgiant į sugerčiai įvertinti taikytą metodą:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    sugertį galima susieti vien tik su žuvies mase,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    sugertį galima susieti vien tik su cheminės medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientu,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    sugertį galima susieti su žuvies masės ir cheminės medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficiento deriniu,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    veiksniai, kurie praktiškai gali turėti įtakos sugerčiai atliekant veikimo per vandeninę terpę metodo tyrimą, pvz., cheminės medžiagos biologinis įsisavinamumas, adsorbcija ant aparatūros, molekulių dydis ir kt., daro mažą poveikį,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    ir, svarbiausia:
                                 
                              duomenų bazė („mokomasis rinkinys“), naudota sugerties įvertinimo metodui sukurti, reprezentuoja tiriamą cheminę medžiagą.
                        Keliuose atvirai paskelbtuose darbuose yra pateiktos lygtys, kurios sugertį per žuvų žiaunas susieja su pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientu, žuvies mase (1) (2) (3) (4), tūriu ir (arba) lipidų kiekiu, sugertimi ar difuzija per membraną (5) (6), žuvų ventiliacijos tūriu (7) ir kurioms taikomas lakumo ir masių balanso metodas (8) (9) (10). Išsamus tokių metodų įvertinimas šiame kontekste yra pateiktas Crookes & Brooke (11). Barber (12) publikacija, kurioje dėmesys sutelktas į biologinio kaupimosi dėl mitybos modeliavimą, taip pat yra naudinga šiomis aplinkybėmis, nes į ją įtraukti sugerties per žiaunas indėlio į kinetiką modeliai. 2004 m. mitybos protokolo patvirtinančių nuorodų dokumentas (13) taip pat buvo skirtas šiam aspektui.
                        Atrodo, kad dauguma šių modelių buvo gauti turint ribotas duomenų bazes. Jei yra informacijos apie modeliams sukurti naudojamų duomenų bazes, pasirodo, kad naudojamos cheminės medžiagos dažnai yra panašios struktūros arba klasės (funkcinių grupių požiūriu, pvz., chloro organiniai junginiai). Tokį modelį taikant kito tipo cheminės medžiagos sugerties greičio konstantai prognozuoti, neapibrėžtis didėja ne tik dėl bandymui būdingų aspektų, pvz., rūšies, temperatūros ir kt., bet ir dėl modelio.
                        Turimų metodų apžvalga (11) parodė, kad nei vienas iš metodų nėra „tikslesnis“ nei kiti. Todėl kiekvieną naudotą modelį reikėtų aiškiai pagrįsti. Jei yra keli metodai, kurių taikymą būtų galima pagrįsti, galbūt būtų tikslinga pateikti kelis k
                           1 (tuo pačiu BCF) įverčius arba k
                           1 (ir BCF) verčių intervalą pagal kelis sugerties įvertinimo metodus. Tačiau, atsižvelgiant į modelių tipų ir jiems kurti naudojamų duomenų rinkinių skirtumus, netiktų naudoti skirtingais būdais gautų įverčių vidutinę vertę.
                        Kai kurie tyrėjai teigė, kad, siekiant atsižvelgti į cheminės medžiagos adsorbciją ant ištirpusios organinės anglies (DOC) veikimo per vandeninę terpę sąlygomis, būtina daryti šios rūšies BCF įverčio pataisą dėl biologinio įsisavinamumo, kad įvertis atitiktų veikimo per vandeninę terpę tyrimų rezultatus (pvz., (13) (14)). Tačiau ši pataisa gali netikti, atsižvelgiant į tai, kad, atliekant veikimo per vandeninę terpę tyrimą, reikia mažos DOC koncentracijos (t. y. biologiškai įsisavinamos ir tirpale išmatuotos cheminės medžiagos santykio) „blogiausiojo atvejo“ įverčiui gauti. Stipriai hidrofobinių cheminių medžiagų sugertį per žiaunas gali riboti pasyvios difuzijos šalia žiaunų paviršiaus greitis; šiuo atveju gali būti taip, kad darant pataisą būtų įvertintas ne tas reiškinys, dėl kurio ji buvo numatyta.
                        Patartina atkreipti didesnį dėmesį į metodus, kuriems reikia nesunkiai gaunamų įvesties duomenų apie chemines medžiagas, bandomas pagal čia aprašytą mitybos tyrimą (t. y. log K
                           OW, žuvų masė). Gali būti taikomi kiti metodai, kuriems galima naudoti sudėtingesnius įvesties duomenis, tačiau bandant gali prireikti papildomų matavimų arba ne visiems prieinamų išsamių žinių apie bandomąją cheminę medžiagą ar žuvų rūšį. Be to, modelio pasirinkimui gali turėti įtakos tinkamumo lygis ir taikymo sritis (įvairių metodų peržiūra ir palyginimas pateiktas (11)).
                        Reikėtų turėti omenyje, kad gautas k
                           1 įvertis ir apskaičiuotas BCF yra neapibrėžti ir jiems gali tekti taikyti įrodomosios duomenų galios metodą kartu su gautu BMF ir cheminės medžiagos parametrais (pvz., molekulių dydžiu), kad būtų gautas visas cheminės medžiagos biologinio kaupimosi gebos vaizdas. Šių parametrų aiškinimas ir naudojimas gali priklausyti nuo reglamentavimo sistemos.
                        LITERATŪRA
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Pärt P. and Opperhuizen A. (1993), The influence of temperature on the uptake rate constants of hydrophobic compounds determined by the isolated perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 25: 1-14.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., Part P. and Opperhuizen A. (1994), Experimentally determined blood and water flow limitations for uptake of hydrophobic compounds using perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Allometric applications. Aquat. Toxicol. 30: 325-341.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2003), A review and comparison of models for predicting dynamic chemical bioconcentration in fish. Environ. Toxicol. Chem. 22: 1963-1992.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Opperhuizen A. (1986), Bioconcentration of hydrophobic chemicals in fish, in Aquatic Toxicology and Environmental Fate, STP 921, Poston, T.M. and Purdy, R., Editors. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, USA: 304-315.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343-2355.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                                 
                              
                                    (8)
                                 
                                 
                                    Hendriks A.J., van der Linde A., Cornelissen G. and Sijm D.T.H.M. (2001). The power of size. 1. Rate constants and equilibrium ratios for accumulation of organic substances related to octanol-water partition ratio and species weight. Environ. Toxicol. Chem. 20: 1399-1420.
                                 
                              
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Campfens J. and Mackay D. (1997), Fugacity-based model of PCB bioaccumulation in complex aquatic food webs. Environ. Sci. Technol. 31: 577-583.
                                 
                              
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2003), A generic QSAR for assessing the bioaccumulation potential of organic chemicals in aquatic food webs. QSAR Comb. Sci. 22: 337-345.
                                 
                              
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Crookes M. and Brooke D. (2010), Estimation of fish bioconcentration factor (BCF) from depuration data. Draft Report. Environmental Agency, Bristol, UK.
                                 
                              
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2008), Dietary uptake models used for modelling the bioaccumulation of organic contaminants in fish. Environ. Toxicol. Chem. 27: 755-777
                                 
                              
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                                 
                              
                                    (14)
                                 
                                 
                                    Gobas F. and Morrison H. (2000), Bioconcentration and biomagnification in the aquatic environment, in Handbook of property estimation methods for chemicals, Boethling, R.S. and Mackay, D., Editors. Lewis Publishers, Boca Racton, FL, USA: 189-231.
                                 
                              “
               
                     17)
                  
                  
                     C dalies C.20 skyrius pakeičiamas taip:
                     „C.20   
                           Daphnia magna reprodukcijos bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 211 (2012). EBPO bandymų gairės, atsižvelgiant į mokslo pažangą, yra periodiškai peržiūrimos ir atnaujinamos. Reprodukcijos bandymo gairės 211 kilo iš bandymų gairių 202, II dalies, Daphnia sp. reprodukcijos bandymas (1984). Bendrai visų buvo pripažinta, kad duomenys, gauti taikant testą, atitinkantį TG 202, gali būti kintami. Todėl įdėta daug pastangų norint nustatyti šių duomenų kintamumo priežastis, siekiant sukurti geresnį bandymų metodą. Bandymų gairės 211 pagristos šių įvairių tyrimo darbų, tarplaboratorinių tyrimų ir tinkamumo patvirtinimo tyrimų, atliktų 1992 m. (1), 1994 m. (2) ir 2008 m. (3), rezultatais.
                     Pagrindiniai skirtumai tarp reprodukcijos bandymo gairių pirmosios versijos (TG 202, 1984 m.) ir antrosios versijos (TG 211, 1998 m.) yra:
                     
                                 —
                              
                              
                                 rekomenduojama naudoti rūšis yra Daphnia magna;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bandymo trukmė – 21 para;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 atliekant pusiau statinius bandymus, kiekvienai atskirai koncentracijai, naudojamų gyvūnų skaičius buvo sumažintas nuo ne mažiau kaip 40 gyvūnų, pageidautina, suskirstytų į keturias grupes po 10 gyvūnų, iki ne mažiau kaip 10 gyvūnų, laikomų atskirai (nors atliekant dinaminius bandymus galima naudoti skirtingas schemas);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pateiktos patikslintos rekomendacijos dėl bandymų terpės ir maitinimo sąlygų.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Pagrindiniai skirtumai tarp reprodukcijos bandymo gairių antrosios versijos (TG 211, 1998 m.) ir šios versijos yra:
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 įtrauktas 7 priedėlis, kuriame aprašytos naujagimių lyties nustatymo, jei reikia, procedūros. Kaip ir pagal ankstesnes šio bandymų metodo versijas, lyčių santykis yra neprivaloma vertinamoji baigtis;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 atsako kintamasis – gyvų palikuonių vienam išgyvenusiam motininiam gyvūnui skaičius, buvo papildytas dar vienu dafnijų reprodukcijos atsako kintamuoju, t. y. suminiu skaičiumi gyvų palikuonių, bandymo pabaigoje gautų vienai bandymo pradžioje buvusiai motininei dafnijai, į analizę neįtraukiant atsitiktinio ir (arba) netyčinio motininių gyvūnų gaištamumo. Papildomo atsako kintamojo tikslas – suderinti šį atsako kintamąjį su kitais reprodukcijos bandymų su bestuburiais metodais. Be to, taikant šį bandymų metodą, galima pašalinti šio atsako kintamojo paklaidos šaltinį, t. y. netyčinį ir (arba) atsitiktinį motininių gyvūnų gaištamumą, jei jis pasitaikytų veikimo laikotarpiu.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 įtraukti papildomi statistiniai nurodymai dėl bandymo schemos ir dėl rezultatų apdorojimo, abu juos pritaikant ECX (pvz., EC10 ar EC50) ir NOEC/LOEC būdams;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Įtrauktas ribinis bandymas.
                              
                           Taikomų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                     BANDYMO PRINCIPAS
                     Pagrindinis šio bandymo tikslas – įvertinti cheminių medžiagų poveikį Daphnia magna reprodukcijos našumui. Šiuo tikslu jaunos moteriškos lyties dafnijos (motininiai gyvūnai), kurių amžius bandymo pradžioje jaunesnis kaip 24 h, yra veikiamos kelių koncentracijos verčių vandenyje ištirpinta bandomąja chemine medžiaga. Bandymo trukmė – 21 para. Baigus bandymą vertinamas suminis gautų gyvų palikuonių skaičius. Motininių gyvūnų reprodukcijos našumą galima išreikšti kitais būdais (pvz., gyvų palikuonių, gautų iš vieno gyvūno per parą nuo pirmos palikuonių pastebėjimo dienos, skaičiumi), tačiau šie skaičiai turėtų būti pateikti ataskaitoje papildomai prie gyvų palikuonių, gautų iki bandymo pabaigos, suminio skaičiaus. Dėl ypatingos pusiau statinio bandymo schemos, palyginti su kitais bestuburių reprodukcijos bandymų metodais, taip pat galima suskaičiuoti iš kiekvieno atskiro motininio gyvūno gautus gyvus palikuonis. Kitaip nei taikant kitus bestuburių reprodukcijos bandymų metodus, į vertinimo duomenis galima neįtraukti bandymo laikotarpiu atsitiktinai ir (arba) netyčia žuvusių motininių gyvūnų palikuonių skaičiaus. Todėl, jei motininių gyvūnų gaištamumas pasitaiko apdorotų kartotinių ėminių induose, reikėtų ištirti, ar gaištamumas atitinka koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivę ar jos neatitinka, pvz., ar yra reikšminga atsako regresija su teigiamu krypties koeficientu bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos atžvilgiu (čia gali būti naudingas statistinis kriterijus, pvz., Cochran-Armitage tendencijos kriterijus). Jei gaištamumas neatkartoja koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivės, šie kartotiniai ėminiai su žuvusiais motininiais gyvūnais neturėtų būti įtraukti į rezultatų analizę. Jei gaištamumas atkartoja koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivę, motininių gyvūnų gaištamumą reikėtų priskirti prie bandomosios cheminės medžiagos poveikio ir kartotiniai ėminiai neturėtų būti pašalinti iš analizės. Jei motininis gyvūnas žūsta bandymo metu atsitiktinai dėl netinkamų veiksmų ar nelaimingo atsitikimo, arba netyčia dėl nepaaiškinamo incidento, nesusijusio su bandomosios cheminės medžiagos poveikiu, arba jei paaiškėja, kad gyvūnas yra vyriškos lyties, kartotinis ėminys pašalinamas iš analizės (daugiau pateikta 51 pastraipoje). Bandomosios cheminės medžiagos toksinis poveikis reprodukcijos našumui yra išreiškiamas kaip ECx, duomenis derinant netiesinės regresijos metodu prie atitinkamo modelio, kad būtų įvertinta koncentracija, kuriai esant reprodukcijos našumas sumažėtų x %, arba kaip NOEC ar LOEC vertė (4). Pageidautina, kad bandymų koncentracijos vertės aprėptų mažiausią iš naudotų poveikio koncentracijos verčių (pvz., EC10), nes tai reikštų, kad ši vertė apskaičiuojama interpoliavimo, o ne ekstrapoliavimo būdu.
                     
                     Ataskaitoje taip pat turėtų būti pateikta išgyvenusių motininių gyvūnų dalis ir pirmosios vados atsiradimo laikas. Taip pat galima tirti kitokį su chemine medžiaga susijusį poveikį parametrams, pvz., augimui (ilgiui), ir galimam populiacijos prieaugio greičiui (žr. 44 pastraipą).
                     INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                     Renkantis reprodukcijos bandymo reikiamą koncentracijos verčių intervalą, gali būti naudingi su Daphnia magna atliekamo ūmaus toksiškumo bandymo rezultatai (žr. šio priedo C.2 skyrių Daphnia sp. ūmaus judrumo slopinimo bandymas). Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje ir garų slėgis, be to, reikėtų turėti patikimą analizės metodą medžiagos kiekiui bandymo tirpaluose nustatyti, kurio atgavimo laipsnis ir nustatymo riba būtų žinomi.
                     Informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kuri gali būti naudinga bandymo sąlygoms nustatyti, sudaro struktūrinė formulė, cheminės medžiagos grynumas, atsparumas šviesai, stabilumas bandymo sąlygomis, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidymo bandymo rezultatai (žr. šio priedo C.4 (Lengvo biodegradavimo nustatymas) ir C.29 (Lengvas biodegradavimas. CO2 sandariuose induose) skyrius).
                     BANDYMO TINKAMUMAS
                     Bandymas laikomas tinkamu, jei kontroliniai ėminiai atitinka nurodytus charakteristikų kriterijus:
                     
                                 —
                              
                              
                                 bandymo pabaigoje motininių gyvūnų gaištamumas (moteriškos lyties dafnijų) nesiekia 20 %;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 iš vieno iki bandymo pabaigos išgyvenusio motininio gyvūno gautų gyvų palikuonių vidutinis skaičius yra > 60.
                              
                           Pastaba. Tas pats tinkamumo kriterijus (20 %) gali būti taikomas atsitiktiniam ir netyčiniam kontrolinių ėminių, taip pat kiekvienos bandymo koncentracijos ėminių motininių gyvūnų gaištamumui.
                     METODO APRAŠYMAS
                     
                        Aparatūra
                     
                     Bandymo indai ir kita aparatūra, kuri liečiasi su bandymo tirpalais, turėtų būti pagaminta vien tik iš stiklo arba kitos chemiškai inertinės medžiagos. Bandymo indai paprastai yra laboratorinės stiklinės.
                     Papildomai reikalinga visa ar tam tikra įranga:
                     
                                 —
                              
                              
                                 deguonies matuoklis (su mikroelektrodu arba kitokiu įtaisu, tinkamu ištirpusiam deguoniui mažo tūrio ėminiuose matuoti);
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tinkamas įtaisas temperatūrai kontroliuoti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pH-metras;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 įranga vandens kietumui nustatyti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 įranga suminės organinės anglies vandenyje koncentracijai (TOC) ar įranga cheminiam deguonies suvartojimui (COD) nustatyti;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 tinkama aparatūra apšvietimo režimui kontroliuoti ir šviesos stipriui matuoti.
                              
                           
                        Bandymo organizmai
                     
                     Bandymui reikėtų naudoti Daphnia magna Straus (95).
                     Kloną geriau būtų identifikuoti pagal genotipą. Tyrimas (1) parodė, kad A klono (jo kilmė – IRCHA (Institut de Recherche en Chimie Appliquee), Prancūzija) (5) reprodukcijos našumas visą laiką atitinka tinkamumo kriterijų, pagal kurį auginant šiame metode aprašytomis sąlygomis vieno gyvo likusio motininio gyvūno vidutinis palikuonių skaičius ≥ 60. Tačiau priimtini ir kiti klonai, jei parodoma, kad dafnijų kultūra atitinka bandymo tinkamumo kriterijus.
                     Bandymo pradžioje gyvūnai turėtų būti jaunesnio kaip 24 h amžiaus ir tai neturėtų būti pirmoji palikuonių karta. Jos turėtų būti gautos iš sveikos pradinės kultūros (t. y. neturi būti streso požymių, tokių kaip, didelis gaištamumas, vyriškos lyties atstovai ir efipijų buvimas, pirmosios vados vėlavimas, gyvūnų spalvos pasikeitimas ir kt.). Pradinės kultūros gyvūnus reikėtų laikyti tokiomis sąlygomis (šviesos, temperatūros, terpės, maitinimo ir gyvūnų skaičiaus tūrio vienetui), kurios būtų panašios į bandymo sąlygas. Jei bandant naudota kultūros terpė skiriasi nuo įprastinės dafnijų kultūros, motininių gyvūnų stresui išvengti pagal gerąją praktiką reikalaujama leisti dafnijoms aklimatizuotis maždaug tris savaites (t. y. vienos kartos laikotarpiu).
                     
                        Bandymo terpė
                     
                     Rekomenduojama šiems bandymams naudoti visiškai apibrėžtą terpę. Taip galima išvengti sunkiai apibūdinamų priedų naudojimo (pvz., jūros dumblių, dirvožemio ekstrakto), taigi pagerėja tarplaboratorinio standartizavimo galimybės. Buvo nustatyta, kad labiausiai tinka Elendt M4 (6) ir M7 terpės (žr. 2 priedėlį). Tačiau yra priimtinos ir kitos terpės (pvz., (7) (8)), jei jose išauginta dafnijų kultūra atitinka bandymui nustatytus tinkamumo kriterijus.
                     Jei naudojamos terpės su neapibrėžtais priedais, šie priedai turėtų būti aiškiai apibūdinti ir bandymo ataskaitoje turėtų būti informacija apie jų sudėtį, ypač apie organinės anglies kiekį, nes ji gali būti tiekiamo maisto dalis. Rekomenduojama nustatyti organinio priedo pradinio tirpalo suminę organinę anglį (TOC) ir (arba) cheminį deguonies suvartojimą (COD) ir įvertinti jų indėlį į paruoštos terpės TOC ar COD. Papildomai rekomenduojama, kad terpės (t. y. prieš pridedant dumblių) TOC koncentracija būtų mažesnė kaip 2 mg/l (9).
                     Bandant metalų turinčias chemines medžiagas, svarbu suvokti, kad bandomosios terpės savybės (pvz., kietumas, chelatinimo geba) gali turėti įtakos bandomosios cheminės medžiagos toksiškumui. Dėl šios priežasties pageidautina turėti visiškai apibrėžtą terpę. Tačiau vienintelės visiškai apibrėžtos terpės, kurios, kiek šiandien žinoma, tiktų ilgą laiką auginti Daphnia magna, yra Elendt M4 ir M7. Abiejose terpėse esama chelanto EDTA. Šis darbas (2) parodė, kad, reprodukcijos bandymą atliekant M4 ir M7 terpėje, kadmio „tariamasis toksiškumas“ paprastai yra mažesnis palyginti su EDTA neturinčia terpe. Todėl M4 ir M7 nerekomenduojama naudoti bandant metalų turinčias chemines medžiagas, taip pat reikėtų vengti naudoti terpes, turinčias žinomus chelantus. Jei cheminės medžiagos turi metalų, galima patarti naudoti alternatyviąją terpę, pvz., ASTM atkurtojo kieto gėlo vandens terpę (9), kuri neturi EDTA. Šis ASTM atkurtojo kieto gėlo vandens ir jūros dumblių ekstrakto derinys (10) tinka ilgą laiką auginti Daphnia magna (2).
                     Ištirpusio deguonies koncentracija bandymo pradžioje ir visą bandymų laikotarpį turėtų būti didesnė kaip 3 mg/l. pH turėtų būti 6–9 intervale ir kurio nors bandymo metu paprastai neturėtų kisti daugiau kaip 1,5 vieneto. Rekomenduojamas didesnis kaip 140 mg/l kietumas (išreikštas CaCO3). Bandymai, atlikti esant šiai arba didesnei koncentracijai, parodė, kad reprodukcijos našumas atitinka tinkamumo kriterijus (11) (12).
                     
                        Bandymų tirpalai
                     
                     Pasirinktų koncentracijos verčių bandymo tirpalai paprastai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinius tirpalus reikėtų ruošti nenaudojant jokių tirpiklių ar dispergentų, jei įmanoma, maišant arba purtant bandomąją cheminę medžiagą bandymo terpėje mechaninėmis priemonėmis, pvz., naudojant maišyklę, purtyklę, ultragarsinę vonelę, ar taikant kitus tinkamus metodus. Prieš dedant bandymų organizmus, pageidautina veikti bandymų sistemas bandomąja chemine medžiaga tokios koncentracijos, kurią numatoma naudoti atliekant tyrimą, ir taip ilgai, kad būtų galima įrodyti veikimo koncentracijos verčių stabilumą. Jei bandomoji cheminė medžiaga sunkiai tirpsta vandenyje, reikėtų taikyti procedūras, aprašytas EBPO rekomendaciniame dokumente apie sunkiai apdorojamas chemines medžiagas (13). Reikėtų vengti naudoti tirpiklius ar dispergentus, bet kartais jie gali būti būtini, kad būtų galima gauti dozavimui tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą.
                     Be bandymo koncentracijos ėminių reikėtų bandyti reikiamą skaičių skiedimo vandens kartotinių kontrolinių ėminių ir, jei tinka, reikiamą skaičių tirpiklio kartotinių kontrolinių ėminių. Atliekant bandymą, reikėtų naudoti tik tuos tirpiklius ar dispergentus, kuriuos tiriant įrodyta, kad jie nedaro jokio reikšmingo poveikio atsako kintamiesiems ar šis poveikis yra labai mažas. Tinkami tirpikliai (pvz., acetonas, etanolis, metanolis, dimetilformamidas ir trietilenglikolis) ir dispergentai (pvz., Cremophor RH40, 0,01 % metilceliuliozė ir HCO-40) kaip pavyzdžiai yra pateikti (13). Jei naudojamas tirpiklis, jo galutinė koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 0,1 ml/l (13) ir ji turėtų būti vienoda visose bandymo induose, išskyrus skiedimo vandens kontrolinių ėminių indus. Tačiau reikėtų imtis visų priemonių, kad tirpiklio koncentracija būtų kuo mažesnė.
                     PROCEDŪRA
                     
                        Veikimo sąlygos
                     
                     
                        Trukmė
                     
                     Bandymo trukmė – 21 para.
                     
                        Įkrova
                     
                     Jei bandymams atlikti nebūtina dinaminių bandymų schema, motininiai gyvūnai laikomi atskirai po vieną inde, paprastai su 50–100 ml terpės kiekviename inde (Daphnia magna atveju, bet galimas mažesnis tūris, ypač jei dafnijos mažesnės, pvz., Ceriodaphnia dubia).
                     Atsižvelgiant į analizės procedūros bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai nustatytus reikalavimus, kartais gali prireikti didesnio tūrio, nors taip pat leidžiama sujungti kartotinius ėminius cheminei analizei atlikti. Jei naudojamas didesnis kaip 100 ml tūris, gali tekti padidinti dafnijų maisto davinį, kad turimo maisto pakaktų ir būtų užtikrinta tinkamumo kriterijų atitiktis.
                     
                        Bandymo gyvūnai
                     
                     Pusiau statiniams bandymams kiekvienai koncentracijai imama bent 10 atskirai laikomų gyvūnų ir bent 10 atskirai laikomų kontrolinių ėminių serijos gyvūnų.
                     Buvo parodyta, kad dinaminiams bandymams kiekvienai koncentracijai tinka naudoti 40 gyvūnų, padalytų į keturias grupes po 10 gyvūnų (1). Galima naudoti mažiau bandymo organizmų, bet kiekvienai koncentracijai rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip po 20 gyvūnų, padalytų dviem ėminiams ar daugiau su vienodu gyvūnų skaičiumi (pvz., keturiems ėminiams su 5 dafnijomis kiekvienam ėminiui). Reikia pažymėti, kad atliekant bandymus, kai gyvūnai laikomi grupėmis, iš statistinės analizės nebus įmanoma pašalinti nei vieno palikuonio, jei reprodukcijos pradžioje atsitiktinai ar netyčia nugaišta motininiai gyvūnai, todėl šiais atvejais reprodukcijos našumą reikėtų išreikšti gautų gyvų palikuonių skaičiumi vienam bandymo pradžioje buvusiam motininiam gyvūnui.
                     Apdorojimo dozės turėtų būti priskirtos bandymų indams, o toliau visi bandymų indai turėtų būti tvarkomi atsitiktiniu būdu. Taip nedarant, gali atsirasti sistemingoji paklaida, kuri galėtų būti aiškinama koncentracijos poveikiu. Ypač jei bandymo vienetai tvarkomi tokia seka, kokia jie buvo apdoroti, arba pagal koncentraciją, todėl kai kurie su laiku susiję veiksniai, pvz., operatoriaus nuovargis ar kita klaida esant didesnėms koncentracijos vertėms galėtų turėti didesnį poveikį. Be to, jei bandymo rezultatai galimai yra susiję su bandymo pradinėmis ar aplinkos sąlygomis, pvz., padėtimi laboratorijoje, reikėtų svarstyti galimybę stabdyti bandymą.
                     
                        Maitinimas
                     
                     Atliekant pusiau statinius bandymus geriau maitinti kasdien, tačiau ne mažiau kaip tris kartus per savaitę (t. y. kartu su terpės pakeitimu). Reikėtų atsižvelgti į galimą veikimo koncentracijos verčių sumažėjimą dėl praskiedimo dedant maistą ir to kiek įmanoma vengti imant didelės koncentracijos dumblių suspensiją. Nukrypimai nuo šių sąlygų (pvz., dinaminių bandymų) nurodomi ataskaitoje.
                     Atliekant bandymą motininių gyvūnų maistą turėtų sudaryti šių gyvų dumblių ląstelės: Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata (seniau Selenastrum capricornutum) ir Desmodesmus subspicatus (seniau Scenedesmus subspicatus). Tiekiamas maistas turėtų būti apskaičiuotas pagal organinės anglies (C) kiekį, duodamą kiekvienam motininiam gyvūnui. Tyrimas (14) parodė, kad Daphnia magna pakanka duoti 0,1–0,2 mg C/dafnijai/parai, kad būtų gautas reikiamas gyvų palikuonių skaičius, kuris atitiktų bandymo tinkamumo kriterijus. Maistą galima duoti vienodu kiekiu visą bandymo trukmę, ar, jei norima, mažiau bandymo pradžioje ir daugiau bandymo eigoje, atsižvelgiant į motininių gyvūnų augimą. Šiuo atveju davinys turi visą laiką atitikti rekomenduotą 0,1–0,2 mg C/dafnijai/parai intervalą.
                     Jei maisto kiekiui nustatyti reikia naudoti pakaitinius parametrus, pvz., dumblių ląstelių skaičių ar šviesos absorbciją (t. y., kad būtų patogiau, nes anglies kiekiui nustatyti reikia daug laiko), kiekviena laboratorija turėtų daryti savo nomogramą, kuri pakaitinį parametrą susietų su anglies kiekiu dumbliuose (žr. 3 priedėlį dėl patarimo, kaip gauti nomogramą). Nomogramas reikėtų tikrinti bent kartą per metus ar dažniau, jei kinta dumblių auginimo sąlygos. Buvo nustatyta, kad šviesos absorbcija yra geresnis anglies kiekio pakaitinis parametras nei ląstelių skaičius (15).
                     Dafnijas reikėtų maitinti koncentruota dumblių suspensija, kad į bandymų indus įpiltos kultūros terpės tūris būtų kuo mažesnis. Dumblius galima koncentruoti centrifugavimu ir ruošti naują suspensiją dafnijų kultūros terpėje.
                     
                        Apšvietimas
                     
                     16 h trukmės apšvietimas, kurio intensyvumas, išmatuotas indo vandens paviršiuje, būtų ne didesnis kaip 15–20 μE·m– 2·s– 1. Jei apšvietimo matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, šaltos baltos šviesos 1 000–1 500 liuksų apšvieta beveik atitinka rekomenduotą 15–20 μE·m– 2·s– 1 šviesos stiprį.
                     
                        Temperatūra
                     
                     Bandymų terpės temperatūra turėtų būti 18–22 °C. Tačiau, atliekant kurį nors bandymą, temperatūra neturėtų kisti daugiau kaip 2 °C, jei įmanoma, esant šioms dienos intervalo riboms (pvz., 18–20, 19–21 ar 20–22 °C). Temperatūrai kontroliuoti gali būti naudingas papildomas bandymų indas.
                     
                        Aeravimas
                     
                     Atliekant bandymą bandymo indai neturėtų būti aeruojami.
                     
                        Bandymų schema
                     
                     
                        Intervalo nustatymo bandymas
                     
                     Prireikus atliekamas intervalo nustatymo bandymas, pvz., imant penkių koncentracijos verčių bandomąją cheminę medžiagą ir du kartotinius kiekvienos koncentracijos ir kontrolinius ėminius. Sprendžiant dėl intervalo nustatymo bandymo koncentracijos verčių, gali būti naudinga papildoma informacija, gauta atliekant panašių cheminių medžiagų bandymus, ar žinios iš literatūros šaltinių apie ūmų toksiškumą dafnijoms ir (arba) kitiems vandens organizmams.
                     Intervalo nustatymo bandymo trukmė – 21 para arba tokia trukmė, kurios pakaktų patikimai prognozuoti poveikio lygius. Baigus bandymą, vertinama dafnijų reprodukcija. Reikėtų registruoti motininių gyvūnų skaičių ir palikuonių buvimą.
                     
                        Galutinis bandymas
                     
                     Paprastai reikėtų naudoti ne mažiau kaip penkias bandymų koncentracijos vertes, kurios aprėptų efektyviąją koncentraciją (pvz., ECx), ir būtų išdėstytos geometrine progresija, kurios vardiklis turėtų būti ne didesnis kaip 3,2. Kiekvienai koncentracijai reikėtų naudoti reikiamą kartotinių ėminių skaičių (žr. 24–25 pastraipas). Reikėtų pagrįsti mažesnio nei penkių koncentracijos verčių skaičiaus naudojimą. Cheminės medžiagos neturėtų būti bandomos didesnės koncentracijos, nei jų tirpumo bandymų terpėje ribinė koncentracija. Prieš atliekant bandymą, patartina atsižvelgti į bandymų schemos statistinę galią ir taikyti reikiamus statistinius metodus (4). Nustatant koncentracijos verčių intervalą reikėtų turėti omenyje, kad:
                     
                                 i)
                              
                              
                                 kai dėl poveikio reprodukcijai vertinama ECx, reikėtų naudoti pakankamą koncentracijos verčių skaičių jai nustatyti esant reikiamam pasikliovimo lygiui. Pageidautina, kad bandymo koncentracijos vertės aprėptų vertinamą ECx, tam, kad ECx būtų nustatoma interpoliacijos, o ne ekstrapoliacijos būdu. Vėliau atliekant statistinę analizę, geriau turėti daugiau bandymo koncentracijos verčių (pvz., 10), bet mažiau kiekvienos koncentracijos kartotinių ėminių (pvz., 5, kai suminis indų skaičius lieka pastovus) ir 10 kontrolinių ėminių.
                              
                           
                                 ii)
                              
                              
                                 įvertinant LOEC ir (arba) NOEC, mažiausia bandymų koncentracija turėtų būti pakankamai maža, kad tai koncentracijai gautas reprodukcijos našumas, palyginti su kontroliniu ėminiu, nebūtų reikšmingai mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikėtų pakartoti su mažesne mažiausia koncentracija;
                              
                           
                                 iii)
                              
                              
                                 įvertinant LOEC ir (arba) NOEC, didžiausia bandymų koncentracija turėtų būti pakankamai didelė, kad tai koncentracijai gautas reprodukcijos našumas, palyginti su kontroliniu ėminiu, būtų reikšmingai mažesnis. Jei taip nėra, bandymą reikėtų pakartoti su didesne didžiausia koncentracija, nebent kaip didžiausia pradinio bandymo koncentracija būtų naudojama maksimali koncentracija, kurios reikia lėtinio poveikio bandymams atlikti (t. y., 10 mg/l).
                              
                           Jei atliekant intervalo nustatymo bandymą, nestebima jokio poveikio, esant didžiausiai koncentracijai (pvz., 10 mg/l), arba kai yra labai didelė tikimybė, kad, atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos toksiškumą kitiems organizmams, jos toksiškumas yra mažas arba jo nėra ir (arba) sugertis yra maža arba jos nėra, reprodukcijos bandymas gali būti atliekamas kaip ribinis bandymas, naudojant bandymo koncentraciją, pvz., 10 mg/l, ir kontrolinį ėminį. Apdorojimo ir kontrolinei grupei reikėtų naudoti dešimt kartotinių ėminių. Jei ribinį bandymą tektų atlikti dinaminio bandymo sistemoje, pakaktų mažiau kartotinių ėminių. Ribinis bandymas suteiks galimybę įrodyti, kad, esant ribinei koncentracijai, nėra statistiškai reikšmingo poveikio, bet jei poveikis registruojamas, paprastai reikėtų atlikti visą bandymą.
                     
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     Be bandomosios cheminės medžiagos ėminių serijos, bandoma viena bandymų terpės kontrolinių ėminių serija ir, jei tinka, viena tirpiklio ar dispergento kontrolinių ėminių serija. Naudojamo tirpiklio ar dispergento koncentracija turėtų atitikti koncentraciją induose su bandomąja chemine medžiaga. Reikėtų naudoti reikiamą kartotinių ėminių skaičių (žr. 23–24 pastraipas).
                     Paprastai tinkamai atliekant bandymą, kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) variacijos koeficientas turėtų būti ≥ 25 %, skaičiuojant vidutiniam iš vieno motininio gyvūno gautų palikuonių skaičiui, ir jis turėtų būti pateiktas bandymo schemų su atskirai laikomais gyvūnais ataskaitose.
                     
                        Bandymų terpės atnaujinimas
                     
                     Bandymų terpės atnaujinimo dažnumas priklauso nuo bandomosios cheminės medžiagos, tačiau terpė turėtų būti atnaujinama bent tris kartus per savaitę. Jei pagal išankstinius stabilumo bandymus (žr. 7 pastraipą) bandomosios cheminės medžiagos koncentracija ilgiausiu (t. y. trijų parų) atnaujinimo laikotarpiu nėra pastovi (t. y. neatitinka 80–120 % nominalios koncentracijos ribų ar sumažėja iki mažesnės kaip 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), reikėtų numatyti dažnesnį terpės atnaujinimą arba atlikti dinaminį bandymą.
                     Kai atnaujinama pusiau statinių bandymų terpė, paruošiama antra bandymų indų serija, ir į juos pernešami motininiai gyvūnai, pvz., tinkamo skersmens stikline pipete. Su dafnijomis pernešamos terpės tūris turėtų būti kuo mažesnis.
                     
                        Stebėjimai
                     
                     Stebėjimų rezultatai, gauti atliekant bandymą, registruojami duomenų lentelėse (pavyzdžiai pateikti 4 ir 5 priedėlyje). Jei reikia atlikti kitus matavimus (žr. 44 pastraipą), gali prireikti papildomų stebėjimų.
                     
                        Palikuonys
                     
                     Iš kiekvieno motininio gyvūno gautus palikuonis geriau atskirti ir skaičiuoti kasdien nuo pirmosios vados atsiradimo, kad jie nevartotų motininiams gyvūnams skirto maisto. Pagal šį bandymų metodą reikia skaičiuoti tik gyvus palikuonis, tačiau reikėtų registruoti neapvaisintų kiaušinių ar negyvų palikuonių skaičių.
                     
                        Gaištamumas
                     
                     Motininių gyvūnų gaištamumą pageidautina registruoti kasdien arba bent jau taip dažnai, kaip skaičiuojami palikuonys.
                     
                        Kiti parametrai
                     
                     Nors pagrindinis šio metodo tikslas – poveikio reprodukcijos našumui vertinimas, įmanoma gana kiekybiškai įvertinti kitus poveikio būdus, kad būtų įmanoma jų statistinė analizė. Galima registruoti reprodukcijos našumą vienam išgyvenusiam motininiam gyvūnui, t. y. gyvų palikuonių skaičių, gautą bandymo metu iš vieno išgyvenusio motininio gyvūno. Jį galima palyginti su pagrindiniu atsako kintamuoju (reprodukcijos našumu vienam motininiam gyvūnui bandymo pradžioje, kuris netyčia ar atsitiktinai nežuvo atliekant bandymą). Jei motininių gyvūnų gaištamumas pasitaiko apdorotų kartotinių ėminių induose, reikėtų ištirti, ar gaištamumas atitinka koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivę ar jos neatitinka, pvz., ar yra reikšminga atsako regresija su teigiamu krypties koeficientu bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos atžvilgiu (čia gali būti naudingas statistinis kriterijus, pvz., Cochran-Armitage tendencijos kriterijus). Jei gaištamumas neatkartoja koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivės, šie kartotiniai ėminiai su žuvusiais motininiai gyvūnais neturėtų būti įtraukti į rezultatų analizę. Jei gaištamumas atkartoja koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivę, motininių gyvūnų gaištamumą reikėtų priskirti prie bandomosios cheminės medžiagos poveikio ir kartotiniai ėminiai neturėtų būti pašalinti iš rezultato analizės. Labai pageidautina, kad būtų atliekami augimo matavimai, nes jie suteikia duomenų apie galimą subletalų poveikį, kurie gali būti naudingi reprodukcijos rezultatams papildyti; baigiant bandymą rekomenduojama išmatuoti motininių gyvūnų ilgį (t. y. kūno ilgį, išskyrus analinį dyglį). Kiti parametrai, kuriuos galima išmatuoti ar apskaičiuoti, yra pirmosios vados (ir vėlesnių vadų) atsiradimo laikas, vieno gyvūno vadų skaičius ir dydis, neapvaisintų kiaušinių skaičius, vyriškos lyties atstovų (EBPO, 2008 m.) ar efipijų buvimas ir būdingasis populiacijos prieaugio greitis (žr. 1 priedėlį dėl apibrėžčių ir 7 priedėlį dėl naujagimių lyties nustatymo).
                     
                        Analizinių nustatymų ir matavimų dažnumas
                     
                     Deguonies koncentracija, temperatūra, kietumas ir pH vertės turėtų būti matuojamos bent kartą per savaitę prieš ir po terpės atnaujinimo kontroliniame (-iuose) ėminyje (-iuose) ir induose su didžiausia bandomosios cheminės medžiagos koncentracija.
                     Atliekant bandymą bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės nustatomos reguliariais laiko tarpais.
                     Jei atliekami pusiau statiniai bandymai, dėl kurių daroma prielaida, kad bandomosios medžiagos koncentracija yra nominalios koncentracijos ± 20 % (t. y. 80–120 % intervale, žr. 6, 7 ir 39 pastraipas), rekomenduojama nustatyti bent didžiausią ir mažiausią bandymo koncentraciją iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinimą pirmąją bandymo savaitę (t. y. turi būti atliekama to paties tirpalo ėminių analizė iš karto po tirpalo paruošimo ir jį atnaujinant). Vėliau šis nustatymas turėtų būti kartojamas bent kas savaitę.
                     Jei atliekant bandymus nesitikima, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija galėtų likti nominalios vertės ± 20 %, būtina analizuoti visų koncentracijos verčių bandymo tirpalus iš karto po jų paruošimo ir prieš pat atnaujinimą. Tačiau jei atliekant bandymus išmatuota pradinė bandomosios cheminės medžiagos koncentracija nėra nominalios vertės ± 20 %, bet galima gauti pakankamai įrodymų, kad pradinės koncentracijos vertės yra pakartojamos ir stabilios (t. y. 80–120 % pradinių koncentracijos verčių intervale), bandymo antros ir trečios savaitės cheminių analizių skaičių galima sumažinti ir apsiriboti didžiausios ir mažiausios bandymo koncentracijos nustatymu. Visais atvejais prieš atnaujinimą bandomosios cheminės medžiagos koncentracija turi būti nustatoma tik viename kiekvienos bandymo koncentracijos kartotinio ėminio inde.
                     Jei atliekamas dinaminis bandymas, ėminius galima imti pusiau statinių bandymų ėminių ėmimo režimu (bet „senų“ tirpalų analizė šiuo atveju netinka). Tačiau, siekiant įsitikinti, ar bandymo koncentracijos vertės yra stabilios, patartina pirmąją savaitę ėminius imti dažniau (pvz., trys matavimų serijos). Atliekant šio tipo bandymus, skiediklio srautas ir bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti tikrinami kasdien.
                     Jei yra įrodymų, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija visą bandymo trukmę gali būti nominalios koncentracijos ar išmatuotos pradinės koncentracijos vertės ± 20 %, rezultatai gali būti pagrįsti nominaliomis ar išmatuotomis pradinėmis vertėmis. Jei nuokrypis nuo nominalios ar išmatuotos pradinės koncentracijos yra didesnis kaip ± 20 %, rezultatus reikėtų išreikšti kaip laikinį svertinį vidurkį (skaičiavimo rekomendacijos pateiktos 6 priedėlyje).
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį reprodukcijos našumui. Reikėtų apskaičiuoti suminį vieno motininio gyvūno palikuonių skaičių kiekvienam bandymų indui (t. y. kartotiniam ėminiui). Be to, galima apskaičiuoti reprodukciją, pagrįstą išgyvenusiam motininiam organizmui gautų gyvų palikuonių skaičiumi. Tačiau ekologiniu požiūriu tinkamiausias atsako kintamasis yra suminis gyvų palikuonių skaičius, gautas vienam motininiam gyvūnui, kuris atsitiktinai (96) ar netyčia (97) nežuvo atliekant bandymą. Jei motininis gyvūnas atsitiktinai ar netyčia žūsta bandymo metu arba jei paaiškėja, kad gyvūnas yra vyriškos lyties, kartotinis ėminys pašalinamas iš analizės. Tuomet analizė bus pagrįsta mažesniu kartotinių ėminių skaičiumi. Jei motininių gyvūnų gaištamumas pasitaiko apdorotų kartotinių ėminių induose, reikėtų ištirti, ar gaištamumas atitinka koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivę ar jos neatitinka, pvz., ar yra reikšminga atsako regresija su teigiamu krypties koeficientu bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos atžvilgiu (čia gali būti naudingas statistinis kriterijus, pvz., Cochran-Armitage tendencijos kriterijus). Jei gaištamumas neatkartoja koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivės, šie kartotiniai ėminiai su žuvusiais motininiai gyvūnais neturėtų būti įtraukti į rezultatų analizę. Jei gaištamumas atkartoja koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivę, motininių gyvūnų gaištamumą reikėtų priskirti prie bandomosios cheminės medžiagos poveikio ir kartotiniai ėminiai neturėtų būti pašalinti iš rezultato analizės.
                     Apibendrinant, kai poveikiui išreikšti naudojamos LOEC ir NOEC ar ECx vertės, poveikį reprodukcijai rekomenduojama skaičiuoti naudojant abu pirmiau nurodytus atsako kintamuosius, t. y.
                     
                                 —
                              
                              
                                 suminį gyvų palikuonių skaičių, gautą vienam motininiam gyvūnui, kuris atsitiktinai ar netyčia nežūsta atliekant bandymą;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 gyvų palikuonių skaičių, gautą vienam išgyvenusiam motininiam gyvūnui;
                              
                           ir tada kaip galutinį rezultatą naudoti mažiausią NOEC ir LOEC ar ECx vertę, apskaičiuotą naudojant kurį nors vieną iš šių dviejų atsako kintamųjų.
                     Prieš pradedant taikyti statistinės analizės, pvz., ANOVA, procedūras, apdorotų ėminių lyginimą su kontroliniais ėminiais, taikant Stjudento t kriterijų, Dunnetto kriterijų, Williamso kriterijų ar Jonckheere-Terpstra kriterijų mažėjimo tvarka, rekomenduojama patikrinti, ar reikia duomenis transformuoti, kad jie atitiktų tam tikro statistinio kriterijaus reikalavimus. Kaip neparametrines alternatyvas būtų galima taikyti Dunn ar Mann-Whitney kriterijus. Atskiriems gautiems apdorojimo dozių vidurkiams apskaičiuojami 95 % pasikliovimo intervalai.
                     Neapdorotuose kontroliniuose ėminiuose išgyvenusių motininių gyvūnų skaičius yra tinkamumo kriterijus ir jį reikėtų dokumentuoti bei pateikti ataskaitoje. Galutinėje ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti visus kitus kenksmingo poveikio požymius, pvz., nenormalų elgesį ir reikšmingus toksikologinius rezultatus.
                     
                        ECx
                     
                     ECx vertės, įskaitant su jomis susijusias apatinę ir viršutinę pasikliovimo ribas, skaičiuojamos taikant tinkamus statistinius metodus (pvz., logistinę ar Weibull funkciją, supaprastintą Spearman-Karber metodą arba paprastą interpoliaciją). Norint apskaičiuoti EC10, EC50 ar kitą ECx, reikėtų atlikti viso duomenų rinkinio regresinę analizę.
                     
                        NOEC ir (arba) LOEC
                     
                     Jei numatoma atlikti statistinę analizę NOEC ir (arba) LOEC nustatyti, reikėtų taikyti tinkamus statistinius metodus pagal EBPO 54 dokumentą Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application (4). Apskritai, neigiami cheminės medžiagos poveikiai palyginti su kontroliniu ėminiu tiriami taikant vienpusį hipotezės tikrinimą, kai p ≤ 0,05.
                     Normalusis pasiskirstymas ir dispersijos vienalytiškumas gali būti tikrinamas taikant tinkamą statistinį kriterijų, pvz., Shapiro-Wilk kriterijų ir Levene kriterijų (p ≤ 0,05). Galima atlikti vienfaktorinę ANOVA ir vėliau taikyti daugybinio lyginimo kriterijų. Galima taikyti daugybinio lyginimo kriterijus (pvz., Dunnett kriterijų) arba tendencijos kriterijus mažėjimo tvarka (pvz., Williams kriterijų arba ar Jonckheere-Terpstra kriterijų mažėjimo tvarka), kad būtų apskaičiuota, ar yra reikšmingi skirtumai (p ≤ 0,05) tarp kontrolinių ėminių ir įvairios koncentracijos cheminės medžiagos ėminių (rekomenduojamas kriterijus pasirenkamas pagal EBPO rekomendacinį dokumentą 54 (4)). Kitais atvejais NOEC ir LOEC galima būtų nustatyti taikant neparametrinius metodus (pvz., Bonferroni U kriterijų pagal Holm ar Jonckheere-Terpstra tendencijos kriterijų).
                     
                        Ribinis bandymas
                     
                     Jei buvo atliekamas ribinis bandymas (lyginamas tik kontrolinis ir tik vienos apdorojimo dozės ėminys) ir yra vykdomi parametrinių kriterijų procedūrų reikalavimai (normalumas, vienalytiškumas), metrinius atsakus galima įvertinti taikant Student kriterijų (t kriterijų). Jei šie reikalavimai nevykdomi, galima taikyti nelygių dispersijų t kriterijų (pvz., Welch kriterijų) arba neparametrinį kriterijų, pvz., Mann-Whitney U kriterijų.
                     Jei norima nustatyti reikšmingus skirtumus tarp kontrolinių ėminių (kontrolinių ir tirpiklio ar dispergento kontrolinių ėminių), kiekvieno kontrolinio ėminio kartotinius ėminius galima bandyti, kaip aprašyta atliekant ribinį bandymą. Jei šiais bandymais reikšmingų skirtumų neaptinkama, visi kontroliniai ir tirpiklio kontroliniai ėminiai gali būti sujungti. Priešingu atveju visus apdorojimo dozių ėminius reikėtų lyginti su tirpiklio kontroliniais ėminiais.
                     
                        Bandymo ataskaita
                     
                     Į bandymo ataskaitą įtraukiama:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fizikinė būsena ir atitinkamos fizikinės ir cheminės savybės;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynumą.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymų gyvūnų rūšys:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             klonas (jei nustatytas jo genotipas), tiekėjas ar šaltinis (jei žinomas) ir taikytos auginimo sąlygos. Jei naudojama ne Daphnia magna rūšis, tai turėtų būti nurodyta ataskaitoje ir pagrįsta.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bandymo sąlygos:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             taikyta bandymų procedūra (pvz., pusiau statinis ar dinaminis bandymas, tūris, įkrova ir dafnijų skaičius litrui);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             šviesiojo laikotarpio trukmė ir šviesos stipris;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandymų schema (pvz., kartotinių ėminių skaičius, vieno kartotinio ėminio motininių gyvūnų skaičius);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             naudotos kultūros terpės duomenys;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             organinės medžiagos priedai, jei naudojami, įskaitant sudėtį, šaltinį, ruošimo metodą, pradinių tirpalų TOC ir (arba) COD, gautų bandymo terpės TOC ir (arba) COD verčių nustatymas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             išsami informacija apie maitinimą, įskaitant kiekį (mg C/dafnijai/parai) ir programa (pvz., maisto rūšies (-ių) tipas, įskaitant, jei tai dumbliai, specifinį pavadinimą (rūšį) ir, jei žinomas, štamą, kultūros sąlygas);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pradinių tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas (reikėtų nurodyti tirpiklį ar dispergentą, jei naudojami, ir jų koncentraciją).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rezultatai:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             visų parengiamųjų bandomosios cheminės medžiagos stabilumo tyrimų rezultatai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bandymo koncentracijos nominalios vertės ir cheminės medžiagos kiekiui bandymų induose nustatyti analizės rezultatai (žr. 5 priedėlio duomenų lentelių pavyzdžius); ataskaitoje reikėtų pateikti metodo atgavimo laipsnį ir nustatymo ribą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vandens kokybė bandymų induose (t. y. pH, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, TOC ir (ar) COD bei kietumas, jei tinka) (žr. 4 priedėlio duomenų lentelės pavyzdį);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             gyvų palikuonių, bandymo metu gautų iš kiekvieno motininio gyvūno, visi duomenys (žr. 4 priedėlio duomenų lentelių pavyzdžius);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nugaišusių motininių gyvūnų skaičius ir įvykio diena (žr. 4 priedėlio duomenų lentelės pavyzdį);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kontrolinių ėminių reprodukcijos našumo variacijos koeficientas (pagrįstas suminiu gyvų palikuonių skaičiumi, tenkančiu vienam iki bandymo pabaigos gyvam išlikusiam motininiam gyvūnui);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei tinka, kiekvieno kartotinio ėminio suminio gyvų palikuonių skaičiaus vienam motininiam gyvūnui, atmetant visus motininius gyvūnus, kurie galėjo atsitiktinai ar netyčia žūti bandymo metu, priklausomybės nuo bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos kreivė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei tinka, kiekvieno kartotinio ėminio suminio gyvų palikuonių skaičiaus vienam išgyvenusiam motininiam gyvūnui priklausomybės nuo bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos kreivė;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei tinka, reprodukcijos mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC), įskaitant taikytų statistinių procedūrų aprašymą ir nurodymą, kokio dydžio poveikį būtų galima tikėtis aptikti (prieš bandymo pradžią galima atlikti galios analizę šiai informacijai gauti) ir reprodukcijos nestebimo poveikio koncentracija (NOEC); informacija apie atsako kintamąjį, kuris buvo naudotas LOEC ir NOEC vertei apskaičiuoti (suminis gyvų palikuonių skaičius, gautas motininiam organizmui, kuris atsitiktinai ar netyčia nežuvo bandymo metu, ar suminis gyvų palikuonių skaičius vienam išgyvenusiam motininiam organizmui); jei tinka, ataskaitoje taip pat reikėtų pateikti motininių gyvūnų gaištamumo LOEC ar NOEC;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei tinka, reprodukcijos ECx ir pasikliovimo intervalai (pvz., 90 % ar 95 %), jai apskaičiuoti pritaikyto modelio grafikas, dozės ir atsako kreivės krypties koeficientas ir jos standartinė paklaida,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiti pastebėti ar išmatuoti biologinio poveikio rezultatai:pateikiami visi kiti pastebėti ar išmatuoti biologiniai rezultatai (pvz., motininių gyvūnų augimas), įskaitant bet kurį reikiamą pagrindimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bet kokio nukrypimo nuo bandymo metodo pagrindimas.
                                          
                                       
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD Test Guidelines Programme. Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, U.K., 20-21 March 1993.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (1997). Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.6. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2008). Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, No.88. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Number 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Straus. Ecotox. and Environ. Safety, 21, 257-265.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Elendt, B.-P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 EPA (2002). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Edition. EPA/821/R-02/012. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, DC. www.epa.gov/waterscience/methods
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Vigano, L. (1991). Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, 775-782.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 ASTM. (2008) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. In: Annual Book of ASTM Standards; Water and Environmental Technology, vol. 11.04; ASTM E729 – 96 (2007) American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988. (H. Løkke, H. Tyle and F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144-148.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Parkhurst, B.R., J.L Forte. And G.P. and Wright (1981) Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26: 1-8.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Cowgill, U.M. and Milazzo, D.P. (1990). The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2): 185-196.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Sims, I.R., S. Watson. and D. Holmes (1993) Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 2053-2058.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Sims, I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        Šiame bandymo metode taikomos šios apibrėžtys:
                        
                           
                              Atsitiktinis gaištamumas
                           – su chemine medžiaga nesusijęs gaištamumas, sukeltas atsitiktinio įvykio (t. y. žinoma priežastis).
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Ecx
                           – vandenyje ištirpintos cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant dafnijų reprodukcija per nurodytą veikimo laikotarpį sumažėja x %.
                        
                           
                              Netyčinis gaištamumas
                           – su chemine medžiaga nesusijęs gaištamumas dėl nežinomos priežasties.
                        
                           
                              Būdingasis populiacijos prieaugio greitis
                           – populiacijos augimo matas, kuris aprėpia reprodukcijos našumą ir su amžiumi susijusį gaištamumą (1) (2) (3). Stacionarios būsenos populiacijų jis lygus nuliui. Augančių populiacijų greitis yra teigiamas, o nykstančių populiacijų – neigiamas. Aišku, kad pastarosios yra neilgaamžės ir galiausiai išnyksta.
                        
                           
                              Aptikimo riba
                           – mažiausia koncentracija, kuriai esant medžiagą galima aptikti, bet negalima nustatyti kiekybiškai.
                        
                           
                              Nustatymo riba
                           – mažiausia kiekybiškai nustatoma koncentracija.
                        
                           
                              Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC)
                           – mažiausia bandymo koncentracija, kuriai esant stebimas statistiškai reikšmingas cheminės medžiagos poveikis reprodukcijai ir motininių gyvūnų gaištamumui nurodytu veikimo laikotarpiu palyginti su kontroliniu ėminiu (kai p < 0,05). Tačiau esant visoms didesnėms nei LOEC bandymo koncentracijos vertėms, kenksmingas poveikis turėtų būti lygus arba didesnis nei poveikis, kuris būtų esant LOEC. Kai negalima įvykdyti šių dviejų sąlygų, turėtų būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kaip buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vertė.
                        
                           
                              Gaištamumas
                           – gyvūnas registruojamas kaip nugaišęs, kai jis nejuda, t. y. kai negali plaukti arba kai nestipriai pakračius bandymų indą per 15 s negalima pastebėti galūnių ar pilvelio judėjimo. (Jei taikoma kita apibrėžtis, ji turėtų būti pateikta kartu su jos nuoroda.).
                        
                           
                              Nestebimo poveikio koncentracija (NOEC)
                           – vos mažesnė nei LOEC bandymo koncentracija, kuri per nurodytą veikimo laikotarpį nedaro statistiškai reikšmingo poveikio (p < 0,05) palyginti su kontroliniu ėminiu.
                        
                           
                              Palikuonys
                           – jaunos dafnijos, atsiradusios atliekant bandymą.
                        
                           
                              Motininiai gyvūnai
                           – bandymo pradžioje esančios moteriškos lyties dafnijos, kurių reprodukcijos našumas yra tyrimo objektas.
                        
                           
                              Reprodukcijos našumas
                           – iš motininių gyvūnų bandymo metu gautų palikuonių skaičius.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        LITERATŪRA
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Wilson, E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Poole, R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Meyer, J. S., Ingersoll, C. G., McDonald, L.L. and Boyce, M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156-1166.
                                 
                              
                     
                        2 priedėlis
                        
                           VISIŠKAI APIBRĖŽTŲ ELENDT M7 IR M4 TERPIŲ RUOŠIMAS
                        
                        
                           Aklimatizavimas Elendt M7 ir M4 terpėje
                        
                        Kai kurios laboratorijos turėjo sunkumų norėdamos dafnijas pernešti tiesiai į M4 (1) ir M7 terpes. Tačiau, aklimatizuojant laipsniškai, t. y. perkeliant dafnijas iš jų terpės į 30 % Elendt, paskui į 60 % Elendt ir pagaliau į 100 % Elendt, pasiekta geresnių rezultatų. Aklimatizavimas gali trukti visą mėnesį.
                        
                           Pasirengimas
                        
                        
                           Mikroelementai
                        
                        Atskirų mikroelementų pradiniai tirpalai (I) iš pradžių ruošiami naudojant tinkamo grynumo vandenį, pvz., dejonizuotą, distiliuotą arba grįžtamojo osmoso būdu gautą vandenį. Iš šių skirtingų pradinių tirpalų (I) ruošiamas antras atskiras pradinis tirpalas (II), turintis visus mikroelementus (sudėtinis tirpalas), t. y.:
                        
                                    I pradinis (-iai) tirpalas (-ai)
                                    (atskira medžiaga)
                                 
                                 
                                    Kiekis, įdedamas į vandenį
                                 
                                 
                                    Koncentracija (palyginti su M4 terpe)
                                 
                                 
                                    II pradiniam sudėtiniam tirpalui paruošti į vandenį įpilamas šis I pradinio tirpalo tūris
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    57 190 
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    MnCl2 · 4 H2O
                                 
                                 
                                    7 210 
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    LiCl
                                 
                                 
                                    6 120 
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    RbCl
                                 
                                 
                                    1 420 
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    SrCl2 · 6 H2O
                                 
                                 
                                    3 040 
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    NaBr
                                 
                                 
                                    320
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    Na2MoO4 · 2H2O
                                 
                                 
                                    1 260 
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    CuCl2 · 2H2O
                                 
                                 
                                    335
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    ZnCl2
                                    
                                 
                                 
                                    260
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    CoCl2 · 6H2O
                                 
                                 
                                    200
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    KI
                                 
                                 
                                    65
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SeO3
                                    
                                 
                                 
                                    43,8
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    NH4VO3
                                    
                                 
                                 
                                    11,5
                                 
                                 
                                    20 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2EDTA · 2H2O
                                 
                                 
                                    5 000 
                                 
                                 
                                    2 000  kartų
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    FeSO4 · 7H2O
                                 
                                 
                                    1 991 
                                 
                                 
                                    2 000  kartų
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    Na2EDTA ir FeSO4 tirpalai ruošiami atskirai, supilami kartu ir iškart apdorojami autoklave. Taip gaunama:
                                 
                              
                                    Fe EDTA tirpalas
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1 000  kartų
                                 
                                 
                                    20,0
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                              
                           M4 ir M7 terpės
                        
                        M4 ir M7 terpės naudojant II pradinį tirpalą, makroelementus ir vitaminus yra ruošiamos taip:
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Kiekis, įdedamas į vandenį
                                 
                                 
                                    Koncentracija (palyginti su M4 terpe)
                                 
                                 
                                    Pradinio tirpalo tūris, įpilamas ruošiant terpę
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    II pradinis tirpalas
                                    (sudėtinis mikroelementų tirpalas)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 kartų
                                 
                                 
                                    50
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Pradiniai mitybinių makroelementų tirpalai (atskira medžiaga)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2H2O
                                 
                                 
                                    293 800 
                                 
                                 
                                    1 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7H2O
                                 
                                 
                                    246 600 
                                 
                                 
                                    2 000  kartų
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                              
                                    KCl
                                 
                                 
                                    58 000 
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    64 800 
                                 
                                 
                                    1 000  kartų
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SiO3 · 9H2O
                                 
                                 
                                    50 000 
                                 
                                 
                                    5 000  kartų
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                              
                                    NaNO3
                                    
                                 
                                 
                                    2 740 
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    KH2PO4
                                 
                                 
                                    1 430 
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    K2HPO4
                                    
                                 
                                 
                                    1 840 
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Vitaminų mišinio pradinis tirpalas
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    Vitaminų mišinio pradinis tirpalas ruošiamas į 1 litrą vandens įdedant tokį 3 vitaminų kiekį:
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Tiamino hidrochloridas
                                 
                                 
                                    750
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Ciankobalaminas (B12)
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Biotinas
                                 
                                 
                                    7,5
                                 
                                 
                                    10 000  kartų
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              Vitaminų mišinio pradinis tirpalas laikomas užšaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis. Į terpę vitaminai dedami prieš pat naudojimą.
                        
                                    
                                       N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Jei ruošiant galutinę terpę norima išvengti druskų nuosėdų susidarymo, alikvotinės pradinio tirpalo dalys įpilamos į maždaug 500–800 ml dejonizuoto vandens ir skiedžiama 1 litro.
                                 
                              
                                    
                                       N.N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Pirmąją publikaciją apie M4 terpę galima rasti: Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           SUMINĖS ORGANINĖS ANGLIES (TOC) ANALIZĖ IR DUMBLIŲ MAISTO TOC KIEKIO NOMOGRAMŲ GAVIMAS
                        
                        Pripažįstama, kad dumblių maisto anglies kiekis tiesioginiu metodu paprastai nematuojamas, bet taikoma jo koreliacija (t. y. nomogramos) su pakaitiniais parametrais, pvz., dumblių ląstelių skaičiumi ar šviesos absorbcija.
                        TOC reikėtų matuoti taikant oksidavimo aukštos temperatūros sąlygomis metodą, bet ne UV ar persulfatinį metodą. (Patarimo žr.: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
                        Nomogramai gauti dumbliai ir auginimo terpė atskiriami centrifuguojant ir dumbliai vėl suspenduojami distiliuotame vandenyje. Kiekvieno ėminio pakaitinis parametras ir TOC koncentracija matuojami tris kartus. Analizuojami distiliuoto vandens tuštieji ėminiai ir jų TOC koncentracija atimama iš dumblių ėminio TOC koncentracijos.
                        Nustatyto anglies koncentracijos verčių intervalo nomograma turėtų būti tiesinė. Pavyzdžiai pateikti toliau.
                        
                                    
                                       N.B.
                                    
                                 
                                 
                                    Jų negalima naudoti perskaičiavimui; svarbu, kad laboratorijos parengtų savo nomogramas.
                                 
                              
                           Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12).
                        Sausosios masės mg/l ir mg C/l regresija. Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.
                        x ašis: koncentruoto dumblių maisto mg C/l
                        y ašis: koncentruoto dumblių maisto sausosios masės mg/l
                        Koreliacijos koeficientas -0,980
                        
                           Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12)
                        Ląstelių skaičiaus ir mg C/l regresija. Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.
                        x ašis: koncentruoto dumblių maisto mg C/l
                        y ašis: ląstelių skaičius/1 koncentruoto dumblių maisto
                        Koreliacijos koeficientas -0,926
                        Chlorella vulgaris, var. viridis (CCAP 211/12)
                        Optinio tankio ir mg C/l regresija (1 cm optinis kelias). Koncentruotų suspensijų, gautų iš pusiau nepertraukiamu būdu auginamų ląstelių partijų ir pakartotinai suspenduotų distiliuotame vandenyje, duomenys.
                        x ašis: koncentruoto dumblių maisto mg C/l
                        y ašis: 1/10 praskiesto koncentruoto dumblių maisto optinis tankis, esant 440 mm bangos ilgiui
                        Koreliacijos koeficientas -0,998
                     
                     
                        4 priedėlis
                        
                           TERPĖS ATNAUJINIMO, FIZIKINIO AR CHEMINIO MONITORINGO DUOMENŲ, MAITINIMO, DAFNIJŲ REPRODUKCIJOS IR MOTININIŲ GYVŪNŲ GAIŠTAMUMO DUOMENŲ REGISTRAVIMO LENTELĖS PAVYZDYS
                        
                        
                                    Bandymo Nr.:
                                 
                                 
                                    Pradžios data:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Klonas:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Terpė:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Maisto tipas:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Bandomoji cheminė medžiaga:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Nominali koncentracija:
                                 
                              
                                    Para
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    19
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    21
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Terpės atnaujinimas (dėti varnelę)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    pH (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    naujos
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    senos
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    O2 (mg/l) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    naujos
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    senos
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Temperatūra (°C) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    naujos
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    senos
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Duota maisto (dėti varnelę)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Nėra gyvų palikuonių (*7)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Suminis
                                 
                              
                                    1 indas
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Suminis
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    Suminis motininių gyvūnų gaištamumas (*8)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        5 priedėlis
                        
                           CHEMINĖS ANALIZĖS REZULTATŲ REGISTRAVIMO LENTELĖS PAVYZDYS
                        
                        a)   Išmatuotos koncentracijos vertės
                        
                        
                                    Nominali koncentracija
                                 
                                 
                                    1 savaitės ėminys
                                 
                                 
                                    2 savaitės ėminys
                                 
                                 
                                    3 savaitės ėminys
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Naujas
                                 
                                 
                                    Senas
                                 
                                 
                                    Naujas
                                 
                                 
                                    Senas
                                 
                                 
                                    Naujas
                                 
                                 
                                    Senas
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              b)   Išmatuotos koncentracijos vertės, išreikštos kaip nominalios koncentracijos procentinė dalis
                        
                        
                                    Nominali koncentracija
                                 
                                 
                                    1 savaitės ėminys
                                 
                                 
                                    2 savaitės ėminys
                                 
                                 
                                    3 savaitės ėminys
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Naujas
                                 
                                 
                                    Senas
                                 
                                 
                                    Naujas
                                 
                                 
                                    Senas
                                 
                                 
                                    Naujas
                                 
                                 
                                    Senas
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        6 priedėlis
                        
                           LAIKINIO SVERTINIO VIDURKIO APSKAIČIAVIMAS
                        
                        
                           Laikinis svertinis vidurkis
                        
                        Darant prielaidą, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija laikotarpiu tarp terpės atnaujinimų gali mažėti, būtina nuspręsti, kurią koncentracijos vertę reikėtų pasirinkti kaip motinines dafnijas veikiančios medžiagos koncentracijos verčių intervalo reprezentatyviąją vertę. Pasirinkimas turėtų būti pagrįstas biologiniais ir statistiniais aspektais. Pvz., jei manoma, kad reprodukciją labiausiai veikia didžiausia koncentracija, reikia naudoti maksimalios koncentracijos vertę. Tačiau jei svarbesniu laikomas kaupiamasis ar ilgalaikis toksiškos cheminės medžiagos poveikis, labiau tinka vidutinė koncentracija. Šiuo atveju tinkamas naudoti vidurkis yra laikinė svertinė vidutinė koncentracija, nes ją nustatant atsižvelgiama į momentinį koncentracijos kitimą laike.
                        
                           1 paveikslas.
                        
                        
                           Laikinio svertinio vidurkio pavyzdys
                        
                        1 paveiksle pateiktas septynių parų trukmės (supaprastinto) bandymo pavyzdys, terpę atnaujinant 0, 2 ir 4 parą.
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Zigzagas rodo koncentracijos vertę bet kuriuo matavimo momentu. Daroma prielaida, kad koncentracija mažėja vykstant eksponentiniam irimo procesui.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Šeši pažymėti taškai rodo stebimas koncentracijų vertes, išmatuotas kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Stora linija rodo laikinio svertinio vidurkio padėtį.
                                 
                              Laikinis svertinis vidurkis apskaičiuojamas taip, kad plotas po laikinio svertinio vidurkio kreive yra lygus plotui po koncentracijos kreive. Pirmiau pateikto pavyzdžio apskaičiavimas pateiktas 1 lentelėje.
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           Laikinio svertinio vidurkio apskaičiavimas
                        
                        
                                    Atnaujinimų skaičius
                                 
                                 
                                    Paros
                                 
                                 
                                    Konc. 0
                                 
                                 
                                    Konc. 1
                                 
                                 
                                    ln(konc. 0)
                                 
                                 
                                    ln(konc. 1)
                                 
                                 
                                    Plotas
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,493
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,503
                                 
                                 
                                    13,767
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    11,000
                                 
                                 
                                    6,037
                                 
                                 
                                    2,398
                                 
                                 
                                    1,798
                                 
                                 
                                    16,544
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,066
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,403
                                 
                                 
                                    19,781
                                 
                              
                                    Suminis parų skaičius:
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Suminis plotas:
                                 
                                 
                                    50,092
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    LS vidurkis:
                                 
                                 
                                    7,156
                                 
                              
                           
                              Paros
                           – atnaujinimo laikotarpio parų skaičius;
                        
                           
                              Konc. 0
                           – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje išmatuota koncentracija;
                        
                           
                              Konc. 1
                           – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pabaigoje išmatuota koncentracija;
                        
                           ln(konc. 0)– konc. 0 natūralusis logaritmas;
                        
                           ln(konc. 1)– konc. 1 natūralusis logaritmas.
                        
                           Plotas – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio plotas po eksponentine kreive. Jis apskaičiuojamas:
                        
                           
                        Laikinis svertinis vidurkis (LS vidurkis) yra suminio ploto ir suminio parų skaičiaus dalmuo.
                        Savaime aišku, kad atliekant dafnijų reprodukcijos bandymą, lentelė turėtų būti pratęsta iki 21 paros.
                        Aišku, kad matuojant tik kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, neįmanoma patvirtinti, kad irimo procesas iš tikrųjų vyksta eksponentiškai. Kitokiai kreivei būtų gautas kitas ploto apskaičiavimo rezultatas. Tačiau irimo pagal eksponentinę kreivę procesas nėra neįmanomas ir, kai nėra kitos informacijos, tai turbūt labiausiai naudoti tinkama kreivė.
                        Tačiau reikia būti atsargiems, jei atliekant cheminę analizę atnaujinimo laikotarpio pabaigoje nerandama jokios cheminės medžiagos. Jei negalima įvertinti, kaip greitai cheminė medžiaga išnyko iš tirpalo, neįmanoma gauti tikrojo ploto po kreive, taigi neįmanoma gauti pagrįsto laikinio svertinio vidurkio.
                     
                     
                        7 priedėlis
                        
                           NAUJAGIMIŲ LYTIES NUSTATYMO REKOMENDACIJOS
                        
                        Vyriškos lyties naujagimiai gali atsirasti kintamomis aplinkos sąlygomis, pvz., mažėjanti šviesiojo laikotarpio trukmė, temperatūra, mažėjanti maisto koncentracija ir didėjantis populiacijos tankis (Hobaek and Larson, 1990; Kleiven et al., 1992). Yra žinoma, kad patinėlių atsiradimui įtakos turi tam tikros kovos su vabzdžiais priemonės (Oda et al., 2005). Tomis sąlygomis, kai dėl cheminių streso veiksnių sumažėja partenogeninių patelių naujagimių, reikėtų laukti patinėlių padaugėjimo (EBPO, 2008). Atsižvelgiant į turimą informaciją, neįmanoma nuspėti, ar jautresnis būtų lyčių santykis, ar reprodukcija kaip vertinamoji baigtis, tačiau yra požymių (nuoroda Tinkamumo patvirtinimo ataskaita, 1 dalis), kad šis patinėlių skaičiaus padidėjimas galėtų būti ne toks jautrus palyginti su naujagimių skaičiaus sumažėjimu. Kadangi pagrindinis bandymų metodo tikslas – įvertinti gautų palikuonių skaičių, atsiradusių patinėlių kiekis yra neprivalomas stebėjimas. Jei atliekant tyrimą įvertinama ši neprivaloma vertinamoji baigtis, tada, kaip papildomą bandymo tinkamumo kriterijų, reikėtų naudoti ne didesnį kaip 5 % patinėlių kiekį kontroliniuose ėminiuose.
                        Praktiškiausias ir patogiausias būdas nustatyti dafnijų lytį – naudoti jų fenotipines charakteristikas, nes patinai ir patelės yra genetiškai identiški ir jų lytis nustatoma pagal išorę. Skiriasi patinėlių ir patelių pirmojo čiuptuvėlio ilgis ir morfologija, patinėlių čiuptuvėlis yra ilgesnis (1 paveikslas). Šį skirtumą galima atpažinti iš karto po gimimo, nors jiems augant vystosi kiti antriniai lytiniai požymiai (pvz., žr. 2 paveikslą, pateiktą Olmstead and LeBlanc, 2000).
                        Norint stebėti morfologinę lytį, kiekvieno bandymo gyvūno naujagimius reikėtų paimti pipete ir pernešti į petri lėkštelę su bandymo terpe. Terpės reikia imti kuo mažiau, kad gyvūnų judesiai būtų suvaržyti. Pirmąjį čiuptuvėlį galima stebėti per stereomikroskopą (× 10–60).
                        
                           1 paveikslas
                        
                        
                           
                              D. magna 24 h amžiaus patinai (kairėje) ir patelės (dešinėje). Patinėlius nuo patelių galima atskirti pagal pirmojo čiuptuvėlio ilgį ir morfologiją, kaip pavaizduota apskritimuose (Tatarazako et al., 2004).
                        
                        NUORODOS
                        Hobaek A and Larson P. 1990. Sex determination in Daphnia magna. Ecology 71: 2255-2268.
                        Kleiven O.T., Larsson P., Hobaek A. 1992. Sexual reproduction in Daphnia magna requires three stimuli. Oikos 65, 197-206.
                        Oda S., Tatarazako N, Watanabe H., Morita M., and Iguchi T. 2005. Production of male neonates in Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) exposed to juvenile hormones and their analogs. Chemosphere 61:1168-1174.
                        OECD, 2008. Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. OECD Series on Testing and Assessment, Number 88. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
                        Olmstead, A.W., LeBlanc, G.A., 2000. Effects of endocrine-active chemicals on the development characteristics of Daphnia magna. Environmental Toxicology and Chemistry 19:2107-2113.
                        Tatarazako, N., Oda, S., Abe, R., Morita M. and Iguchi T., 2004. Development of a screening method for endocrine disruptors in crustaceans using Daphnia magna (Cladocera, Crustacea). Environmental Science 17, 439-449.
                     “
               
                     18)
                  
                  
                     C dalies C.29 skyriaus 66 pastraipa pakeičiama taip:
                     
                                 „66.
                              
                              
                                 Bandymas laikomas tinkamu, jei:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             vidutinė skaidymo procentinė dalis induose FC su etalonine chemine medžiaga yra > 60 % iki 14 inkubavimo paros; ir
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             tuščių kontrolinių ėminių FB vidutinis TIC kiekis bandymo pabaigoje yra < 3 mg C/l.
                                          
                                       Jei šios ribinės vertės nėra gautos, bandymą reikėtų pakartoti naudojant iš kito šaltinio paimtą sėjimo kultūrą ir (arba) reikėtų peržiūrėti procedūras. Pvz., jei problema yra didelis IC kiekis tuščiuosiuose ėminiuose, turėtų būti taikoma 27–32 pastraipose nurodyta procedūra.“
                              
                           
               
                     19)
                  
                  
                     C dalis papildoma šiais skyriais:
                     „C.47   Toksiškumo ankstyvųjų gyvenimo stadijų žuvims bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 210 (2013). Bandymų, naudojant ankstyvųjų gyvenimo stadijų žuvis, tikslas – nustatyti cheminių medžiagų letalų ir subletalų poveikį bandytų stadijų ir bandytų rūšių žuvims. Jie suteikia vertingos informacijos, pagal kurią galima įvertinti cheminės medžiagos lėtinį letalų ir subletalų poveikį kitų rūšių žuvims.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Bandymų gairės 210 yra pagrįstos Jungtinės Karalystės pasiūlymu, aptartu EBPO ekspertų susitikime, sušauktame Medmenhame (Jungtinė Karalystė) 1988 m. lapkričio mėn., ir atnaujintu 2013 m., atsižvelgiant į bandymo taikymo patirtį ir į rekomendacijas, pateiktas 2010 m. rugsėjo mėn. vykusiame EBPO seminare dėl toksiškumo žuvims bandymų (1).
                              
                           BANDYMO PRINCIPAS
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Ankstyvųjų gyvenimo stadijų žuvys veikiamos vandenyje ištirpinta kelių koncentracijos verčių bandomąja chemine medžiaga. Pirmenybė teikiama dinaminėms sąlygoms, tačiau, jei jų neįmanoma įgyvendinti, priimtinos pusiau statinės sąlygos. Išsamesnės informacijos reikėtų ieškoti EBPO rekomendaciniame dokumente apie probleminių cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (2). Bandymo pradžioje apvaisinti ikrai dedami į bandymų kameras ir bandymas tęsiamas rūšiai būdingą laikotarpį, kuris yra būtinas kontrolinių ėminių žuvims pasiekti mailiaus stadiją. Letalus ir subletalus poveikis vertinamas ir lyginamas su kontrolinėmis vertėmis siekiant nustatyti mažiausiai stebimo poveikio koncentraciją (LOEC) tam, kad būtų galima nustatyti i) nestebimo poveikio koncentraciją (NOEC) ir (arba) ii) ECx (pvz., EC10, EC20) pritaikant regresijos modelį, norint įvertinti koncentraciją, kuri sukelia matuojamo poveikio x % pokytį. Ataskaitoje pateikiamos poveikio koncentracijos vertės ir parametrai gali priklausyti nuo reglamentavimo sistemos. Reikėtų, kad bandymų koncentracijos vertės aprėptų ECx, tam, kad ECx būtų apskaičiuojama interpoliavimo, o ne ekstrapoliavimo būdu (apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje).
                              
                           INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Bandomoji cheminė medžiaga reiškia tai, kas yra bandoma. Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje (žr. šio priedo A.6 skyrių) ir garų slėgis (žr. šio priedo A.4 skyrių), be to, reikėtų turėti patikimą analizės metodą medžiagos kiekiui bandymo tirpaluose nustatyti, kurio tikslumas ir kiekybinio nustatymo riba būtų žinomi ir pateikiami ataskaitoje. Nors ūmaus toksiškumo bandymas nėra būtinas, jo rezultatai (žr. šio priedo skyrių C.1 ar C.49), pageidautina gauti būtent šiam bandymui pasirinktoms rūšims, galėtų suteikti naudingos informacijos.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Jei šiuo metodu bandomas mišinys, jis turėtų būti kuo išsamiau apibūdintas, pvz., nurodant jo sudedamųjų dalių cheminius pavadinimus, jų kiekius ir toms cheminėms medžiagoms būdingas savybes (tokias kaip nurodytos pirmiau). Prieš taikant bandymų metodą mišiniui reglamentavimo tikslais, reikėtų atsižvelgti į tai, ar jį atlikus bus galima gauti reglamentavimo tikslu priimtinus rezultatus.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Naudingą informaciją sudaro struktūrinė formulė, cheminės medžiagos grynumas, tirpumas vandenyje, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidumo bandymo rezultatai (pvz., šio priedo C.4 ar C.29 skyriai).
                              
                           BANDYMO TINKAMUMAS
                     
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Taikomos šios bandymo tinkamumo sąlygos:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             ištirpusio deguonies koncentracija turi būti > 60 % oro prisotinimo vertės per visą poveikio laikotarpį;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienu bandymo momentu vandens temperatūra bandymo kamerose ar kiekvieną bandymų parą neturėtų skirtis daugiau kaip ± 1,5 °C ir turėtų atitikti bandymų rūšiai nurodytą temperatūros intervalą (2 priedėlis);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             privalomas bandymo koncentracijos verčių analizės matas;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bendras apvaisintų ikrų ir išsiritusių lervų išgyvenamumas kontroliniuose ir, jei reikia, tirpiklio kontroliniuose induose turėtų būti lygus arba didesnis nei 2 priedėlyje nurodytos ribos;
                                          
                                       
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Jei stebimas nedidelis nukrypimas nuo bandymo tinkamumo kriterijų, į padarinius reikėtų atsižvelgti įvertinant bandymo duomenų patikimumą ir šie aspektai turėtų būti įtraukti į ataskaitą. Ataskaitoje turėtų būti pateiktas poveikis išgyvenamumui, išsiritimui ar augimui tirpiklio kontroliniame ėminyje, palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu, ir jį reikėtų aptarti vertinant bandymų duomenų patikimumą.
                              
                           METODO APRAŠYMAS
                     
                        Bandymų kameros
                     
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Galima naudoti stiklo, nerūdijančiojo plieno ar kitos chemiškai inertinės medžiagos kameras. Kadangi yra žinoma, kad polisiloksanas pasižymi didele geba absorbuoti lipofilines medžiagas, reikėtų kiek įmanoma riboti polisiloksano vamzdelių naudojimą atliekant dinaminius tyrimus ir polisiloksano sandariklių naudojimą sąlyčio su vandeniu vietose, pvz., naudojant vientisus stiklinius akvariumus. Indų matmenys turėtų būti pakankamai dideli, tam, kad būtų galima užtikrinti tinkamas augimo sąlygas, išlaikant ištirpusio deguonies koncentraciją kontrolinių ėminių induose (pvz., mažų žuvų rūšims pakaktų 7 l indo talpos šioms sąlygoms užtikrinti) ir atitikti įkrovos dydžio kriterijus, nurodytus 19 pastraipoje. Bandymo kameras pageidautina išdėstyti bandymo plote atsitiktinai. Palyginti su visiško atsitiktinio išdėstymo schema, geriau rinktis atsitiktinai išdėstytų blokų schemą, pagal kurią kiekviename bloke yra kiekvienos dozės ėminys. Bandymo kameros turėtų būti apsaugotos nuo nepageidaujamų trikdžių. Prieš dedant bandymų organizmus, bandymų sistemą pageidautina pakankamai ilgai kondicionuoti esant naudojamoms bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertėms, kad būtų įrodytas koncentracijos stabilumas veikimo sąlygomis.
                              
                           
                        Rūšių parinkimas
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Rekomenduotos žuvų rūšys nurodytos 1 lentelėje. Tai netrukdo naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymų procedūrą. Šiuo atveju ataskaitoje reikėtų pagrįsti rūšies pasirinkimą ir bandymo metodą.
                              
                           
                        Veislinių žuvų laikymas
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Išsamius duomenis apie veislinių žuvų laikymą patenkinamomis sąlygomis galima rasti 3 priedėlyje ir nuorodose (3) (4) (5).
                              
                           
                        Apvaisintų ikrų, embrionų ir lervų veikimas bandomąją medžiaga
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Iš pradžių apvaisinti ikrai, embrionai ir lervos gali būti veikiami į pagrindinę kamerą įdėtuose mažesniuose stikliniuose ar nerūdijančiojo plieno induose, kurių šoninės ar galinės sienelės pakeistos tinklu, kad bandymo tirpalas galėtų tekėti per indą. Per mažus indus tekantį srautą be sūkurių galima gauti indus pakabinant ant svirties, kuri juos pakeltų ir nuleistų taip, kad visą laiką organizmai būtų po vandeniu. Apvaisintus lašišinių žuvų ikrus galima laikyti ant padėklų ar tinklų su pakankamai didelėmis angomis, kad išsiritusios lervos galėtų per jas iškristi.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Jei ikrų talpyklos, grotelės ar tinkleliai buvo naudojami ikrams pagrindiniame bandymų inde laikyti, išsiritus lervoms šias sulaikymo priemones reikėtų pašalinti pagal 3 priedėlio rekomendacijas, tačiau reikia palikti tinklelius, kad lervos negalėtų ištrūkti. Jei lervas reikia pernešti, jų neturėtų veikti oras, o lervoms iš ikrų talpyklų išleisti neturėtų būti naudojami tinklai. Šio pernešimo laikas įvairioms rūšims skirtingas ir jis turėtų būti nurodytas ataskaitoje. Tačiau ne visuomet pernešti yra būtina.
                              
                           
                        Vanduo
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Kaip bandymo vandenį galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame bandymo rūšis galėtų ilgai gyventi ir augti (žr. 4 priedėlį). Jo kokybė turėtų būti pastovi visą bandymo trukmę. Siekiant užtikrinti, kad skiedimo vanduo neturėtų per daug įtakos bandymo rezultatui (pvz., sudarydamas kompleksus su bandomąja medžiaga) ar nedarytų neigiamo poveikio neršiančių žuvų elgesiui, kartkarčiais reikėtų imti vandens ėminius ir juos analizuoti. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4
                                    2-), amoniako, bendro liekamųjų chloro pesticidų kiekio, bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizę reikėtų atlikti, pvz., du kartus per metus, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei žinoma, kad vandens kokybė nėra pastovi, jos matavimus reikia atlikti dažniau; dažnumas priklauso nuo kokybės kintamumo. Kai kurios skiedimui tinkamo vandens charakteristikos yra pateiktos 4 priedėlyje.
                              
                           
                        Bandymo tirpalai
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Atliekant dinaminius bandymus reikia turėti sistemą, kuri visą laiką dozuotų ir skiestų bandomosios cheminės medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojamąjį siurblį, proporcingojo skiedimo sistemą, sotintuvo sistemą), kad į bandymo kameras būtų galima tiekti kelių bandymo koncentracijos verčių tirpalus. Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautą reikėtų tikrinti tam tikrais laiko tarpais ir per visą bandymą jis neturėtų kisti daugiau kaip 10 %. Nustatyta, kad tinkamas srautas – toks, kuris atitinka bent penkis bandymo kameros tūrius per 24 h (3). Tačiau jei laikomasi 19 pastraipoje nurodyto įkrovos dydžio, galimas mažesnis srautas, pvz., 2–3 bandymų kameros tūriai, kad maistas nebūtų šalinamas per greitai.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Pasirinktos koncentracijos bandymo tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinį tirpalą geriau ruošti tiesiog maišant ar plakant bandomąją cheminę medžiagą skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ir (arba) ultragarsu). Gana koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles) ar pasyvaus dozavimo metodus (6). Nerekomenduojama naudoti tirpiklinio nešiklio. Tačiau jei tirpiklis yra būtinas, lygiagrečiai reikėtų bandyti kontrolinį tirpiklio ėminį, kurio koncentracija atitiktų ėminių su chemine medžiaga tirpiklio koncentraciją; t. y. tirpiklio kiekis turėtų būti vienodas visų koncentracijų tirpaluose, taip pat ir kontroliniame ėminyje. Naudojant kai kurias skiedimo sistemas, tai galėtų būti techniškai sunku įgyvendinti; šiuo atveju tirpiklio koncentracija jo kontroliniame ėminyje turėtų būti lygi didžiausiai tirpiklio koncentracijai apdorotos grupės ėminyje. Informacijos apie sunkiai bandomas chemines medžiagas reikėtų ieškoti EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 23 apie sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (2). Jei naudojamas tirpiklis, jo pasirinkimą lems medžiagos cheminės savybės. EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 23 rekomenduojama ne didesnė kaip 100 μl/l koncentracija. Siekiant išvengti galimo tirpiklio poveikio išmatuotoms vertinamosioms baigtims (7), rekomenduojama naudoti kuo mažesnę tirpiklio koncentraciją.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Pusiau statinio bandymo atveju galima taikyti dvi skirtingas atnaujinimo procedūras. Nauji bandymo tirpalai ruošiami švariuose induose ir į juos atsargiai pernešami išgyvenę ikrai ir lervos arba bandymo organizmai paliekami bandymo induose, bet dalis (ne mažiau kaip du trečdaliai) bandymo tirpalo ir kontrolinio ėminio tūrio pakeičiama.
                              
                           PROCEDŪRA
                     
                        Veikimo sąlygos
                     
                     
                        Trukmė
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Bandymą reikėtų pradėti kuo greičiau po ikrų apvaisinimo, pageidautina, kad jie būtų panardinti į bandymo tirpalus prieš blastodisko dalijimosi pradžią arba kuo arčiau šios stadijos pradžios. Bandymo trukmė priklauso nuo naudotos rūšies. Kai kurios rekomenduojamos trukmės vertės pateiktos 2 priedėlyje.
                              
                           
                        Įkrova
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Bandymo pradžioje turimų apvaisintų ikrų skaičiaus turėtų pakakti, kad būtų užtikrinta atitiktis statistikos reikalavimams. Jie turėtų būti atsitiktinai paskirstyti tarp apdorotų ėminių ir vienai koncentracijai turėtų tekti ne mažiau kaip 80 ikrų, vienodai padalytų tarp ne mažiau kaip keturių kartotinių ėminių bandymo kamerų. Įkrovos dydis (biomasės kiekis bandymo tirpalo tūriui) turėtų būti pakankamai mažas, kad ikrų ir lervų stadijų metu be aeravimo būtų galima užtikrinti ištirpusio deguonies koncentraciją ne mažesnę kaip 60 % prisotinto oro prisotinimo vertės. Atliekant dinaminius bandymus, rekomenduojama, kad drėgnų ikrų masės įkrova per 24 h būtų ne didesnė kaip 0,5 g/l ir bet kuriuo momentu ne didesnė kaip 5 g/l tirpalo (3).
                              
                           
                        Šviesa ir temperatūra
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Šviesiojo laikotarpio trukmė ir vandens temperatūra turėtų būti tinkama bandymo rūšiai (žr. 2priedėlį).
                              
                           
                        Maitinimas
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Maistas ir maitinimas yra kritiniai veiksniai, todėl yra svarbu, kad nuo reikiamo momento, atsižvelgiant į kiekvieną gyvenimo stadiją, būtų duodamas tinkamas maistas ir jo kiekio turėtų pakakti normaliam augimui užtikrinti. Maitinimas turėtų būti maždaug vienodas visuose kartotinių ėminių induose, nebent būtų koreguojama atsižvelgiant į gaištamumą. Maisto perteklių ir išmatas prireikus reikėtų pašalinti, kad nesikauptų atliekos. Maitinimo režimai išsamiai aprašyti 3 priedėlyje, bet įgijus patirties, maistas ir maitinimo režimai nuolat tobulinami, kad būtų pagerintas išgyvenamumas ir optimizuotas augimas. Gyvas maistas pagerina aplinką, todėl turėtų būti naudojamas vietoj sauso ar šaldyto maisto arba jį papildyti, jei tai tinka atsižvelgiant į rūšį ir gyvenimo stadiją.
                              
                           
                        Bandymo koncentracijos vertės
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Paprastai reikia naudoti ne mažiau kaip penkias bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertes, kurių skirtumo pastovus faktorius būtų ne didesnis kaip 3,2, ir keturis kartotinius vienos koncentracijos ėminius. Nustatant bandymų koncentracijos verčių intervalą, reikėtų atsižvelgti į ūmaus toksiškumo bandymų, jei yra, pageidautina naudojant tą pačią rūšį, ir (arba) intervalo nustatymo bandymo informaciją (1). Tačiau nustatant bandymų koncentracijos verčių intervalą reikėtų atsižvelgti į visus informacijos šaltinius, įskaitant, pvz., kryžmines nuorodas, žuvų embrionų ūmaus toksiškumo duomenis. Jei reikia nustatyti tik empirines NOEC vertes, ribinis bandymas arba išplėstinis ribinis bandymas naudojant mažiau kaip penkias koncentracijos vertes gali būti priimtini kaip galutiniai bandymai. Reikėtų pagrįsti mažesnio nei penkių koncentracijos verčių skaičiaus naudojimą. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių, didesnių kaip 96 h LC50 ar 10 mg/l, jei ši mažesnė, bandyti nebūtina.
                              
                           
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Be bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių serijos reikėtų bandyti tik skiedimo vandens kontrolinius ėminius ir, jei reikia, tirpiklio kontrolinius ėminius su tirpikliniu nešikliu (žr. 16 pastraipą).
                              
                           
                        Analizinių nustatymų ir matavimų dažnumas
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Prieš pradedant veikimo laikotarpį, reikėtų patikrinti, ar cheminės medžiagos tiekimo į visus kartotinius ėminius sistema tinkamai veikia (pvz., matuojant bandymų koncentracijos vertes). Reikėtų nustatyti reikiamus analizės metodus, įskaitant reikiamą kiekybinio nustatymo ribą (LOQ) ir pakankamus duomenis apie cheminės medžiagos stabilumą bandymų sistemoje. Atliekant bandymą bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės nustatomos reguliariais laiko tarpais, kad būtų galima apibūdinti veikimą ja. Koncentracija turi būti nustatoma ne mažiau kaip penkis kartus. Naudojant dinamines sistemas, kiekvienos koncentracijos bandomosios cheminės medžiagos vieno kartotinio ėminio analizė turėtų būti atliekama bent kartą per savaitę, sistemingai pasirenkant kitus kartotinius ėminius. Papildomi analiziniai matavimai dažnai pagerintų bandymų rezultatų kokybę. Siekiant užtikrinti tikrojo tirpalo cheminę analizę, ėminius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akučių filtrą) arba centrifuguoti, kad būtų pašalintos visos kietosios dalelės. Prieš naudojant, filtrus reikėtų prisotinti, kad būtų mažesnė bandomosios cheminės medžiagos adsorbcija. Kai išmatuotos koncentracijos vertės nepatenka į 80–120 % nominalios koncentracijos intervalą, reikėtų nustatyti poveikio koncentracijos vertes ir dinaminių bandymų atveju jas išreikšti koncentracijos aritmetinio vidurkio atžvilgiu (žr. C.20 bandymų metodo 6 priedėlį dėl aritmetinio vidurkio skaičiavimo (8)), o pusiau statinių bandymų – išmatuotų koncentracijų geometrinio vidurkio atžvilgiu (žr. EBPO rekomendacinio dokumento Nr. 23 apie sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (2) 5 skyrių).
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Ištirpusio deguonies koncentraciją, pH ir temperatūrą reikėtų matuoti visuose induose bent kartą per savaitę visą bandymo trukmę, o druskingumą ir kietumą, jei reikia, – bandymo pradžioje ir pabaigoje. Bent viename bandymų inde temperatūrą reikėtų kontroliuoti nuolat.
                              
                           
                        Stebėjimai
                     
                     26.   
                           Embrioninio vystymosi stadija
                        : prieš veikimo bandomąja chemine medžiaga pradžią reikėtų kuo tiksliau patikrinti embrioninio vystymosi stadiją. Tai galima padaryti naudojant tinkamai konservuotų ir nuvalytų ikrų reprezentatyvų ėminį.
                     27.   
                           Išsiritimas ir išgyvenamumas
                        : išsiritimą ir išgyvenamumą reikėtų stebėti bent kartą kasdien, o gautus skaičius registruoti. Jei ankstyvoje embriono vystymosi stadijoje (pvz., pirmąją ar antrąją bandymo parą) ant ikrų pastebimas grybelis, tuos ikrus reikėtų suskaičiuoti ir pašalinti. Negyvus embrionus, lervas ir mailių reikėtų pašalinti iš karto, kai tik pastebimi, nes jie greitai suyra ir gali būti sudraskyti kitų žuvų. Negyvus individus reikėtų šalinti ypač atsargiai, kad nebūtų fiziškai sužaloti šalia esantys ikrai ir (arba) lervos. Žūties požymiai skiriasi atsižvelgiant į rūšį ir gyvenimo stadiją. Pavyzdžiui:
                     
                                 —
                              
                              
                                 apvaisintų ikrų: ypač ankstyvosiomis stadijomis stipriai sumažėja permatomumas ir pakinta spalva dėl baltymo koaguliacijos ir (arba) nusėdimo, todėl atsiranda baltas matinis atspalvis;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 embrionų, lervų ir mailiaus: nejudrumas ir (arba) kvėpavimo judesių, ir (arba) širdies plakimo nebuvimas ir (arba) reakcijos į mechaninius dirgiklius nebuvimas.
                              
                           28.   
                           Nenormali išvaizda
                        : kūno formos anomalijų turinčių lervų arba mailiaus skaičių reikėtų registruoti atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę, ir aprašyti anomalijų požymius. Reikėtų pažymėti, kad nenormalios lervos ir mailius pasitaiko natūraliai ir kai kurių rūšių gali būti kelių kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) procentų eilės. Jei laikoma, kad išsigimimo požymiai ir susijęs nenormalus elgesys yra toks ryškus, kad organizmas patiria dideles kančias ir nėra galimybės atsigauti, jis gali būti pašalintas iš bandymo. Tokius gyvūnus reikėtų numarinti ir vėliau atliekant duomenų analizę priskirti prie nugaišusių. Daugumos šiam bandymų metodui rekomenduotų rūšių normalus embrioninis vystymasis yra aprašytas (9) (10) (11) (12).
                     29.   
                           Nenormalus elgesys
                        : anomalijas, pvz., hiperventiliaciją, nekoordinuotą plaukimą, netipišką nejudrumą ir elgesį maitinant reikėtų registruoti atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę (pvz., šiltųjų vandenų žuvų – kartą per parą). Nors šie reiškiniai yra sunkiai kiekybiškai įvertinami, kartą pastebėti jie gali padėti aiškinti gaištamumo duomenis.
                     30.   
                           Masė
                        : pasibaigus bandymui, reikėtų pasverti visas išgyvenusias žuvis bent kartotinio ėminio (ataskaitoje pateikiant kartotinio ėminio gyvūnų skaičių ir vieno gyvūno vidutinę masę); pageidautina nurodyti drėgno kūno (nušluostyto filtravimo popieriumi) masę, tačiau ataskaitoje galima pateikti sauso kūno masės duomenis (13).
                     31.   
                           Ilgis
                        : pasibaigus bandymui matuojamas atskirų žuvų ilgis. Rekomenduojama matuoti visą ilgį, tačiau jei supuvo uodegos pelekas ar jis yra išėstas, galima matuoti standartinį ilgį. Visas vieno bandymo žuvis reikėtų matuoti tuo pačiu būdu. Atskirų žuvų ilgį galima matuoti, pvz., slankmačiu, skaitmeniniu fotoaparatu arba kalibruotu okuliaro mikrometru. Tipinis mažiausias ilgis nurodytas 2 priedėlyje.
                     DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Rekomenduojama, kad bandymo schema ir pasirinktas statistinis kriterijus užtikrintų pakankamą galią (80 % ar didesnę) vertinamųjų baigčių biologinės svarbos pokyčiams aptikti, jei ataskaitoje reikia pateikti NOEC. Ataskaitoje pateikiamos poveikio koncentracijos vertės ir parametrai gali priklausyti nuo reglamentavimo sistemos. Jei ataskaitoje reikia pateikti ECx, bandymo schema ir pasirinktas regresijos modelis turėtų užtikrinti galimybę gauti tokį ECx įvertį, kad i) ataskaitoje pateiktame ECx 95 % pasikliovimo intervale nebūtų nulio ir jis nebūtų per platus, ii) prognozuojamo ECx vidurkio pasikliovimo intervale nebūtų kontrolinio ėminio vidurkio ir iii) nebūtų reikšmingo regresijos modelio nesuderinamumo su duomenimis. Pagal kiekvieną iš metodų reikia nustatyti kiekvienos vertinamosios baigties, kurią svarbu aptikti ar įvertinti, procentinį pokytį. Bandymo schema turėtų būti pritaikyta tokiai galimybei užtikrinti. Kai pirmiau nurodytos ECx nustatymo sąlygos neįvykdytos, reikėtų taikyti NOEC metodą. Maža tikimybė, kad toks pats procentinis pokytis tiktų visoms vertinamosioms baigtims, taip pat mažai tikėtina, kad galima sukurti įgyvendinamą bandymą, kuris atitiktų šiuos kriterijus visoms vertinamosioms baigtims, todėl kuriant tinkamą bandymo schemą yra svarbu sutelkti dėmesį į jam svarbias vertinamąsias baigtis. 5 ir 6 priedėliuose pateiktos statistinės struktūrinės diagramos bei kiekvieno metodo rekomendacijos, kurios padėtų apdoroti duomenis ir pasirinkti tinkamiausią statistinį kriterijų ar modelį. Galima taikyti kitus statistinius metodus, jei jie yra moksliškai pagrįsti.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Reikės analizuoti kiekvieno kartotinių ėminių rinkinio kitimus atliekant dispersinės analizės ar faktorinės analizės lentelės procedūras ir šia analize pagrįstus reikiamus statistinės analizės metodus. Rekomenduojamas daugybinio palyginimo mažėjimo tvarka Jonckheere-Terpstra ar Williams kriterijus, kad būtų galima palyginti atskirų koncentracijų ir kontrolinių ėminių rezultatus, jei atsakas yra tolydusis, ir lyginimo mažėjimo tvarka Cochran-Armitage kriterijus, jei atsakai yra dvireikšmiai ir atitinka monotonišką koncentracijos bei atsako priklausomybę, nesant didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų (14). Kai yra didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų, rekomenduojama Cochran-Armitage kriterijaus Rao-Scott modifikacija (15) (16) arba Williams ar Dunnett (po kvadratinės šaknies arksinuso transformacijos) ar Jonckheere-Terpstra kriterijus, taikomas kartotinių ėminių dalims. Jei duomenys neatitinka monotoniškos koncentracijos ir atsako priklausomybės, gali būti naudingas Dunnett ar Dunn arba Mann-Whitney metodas, jei atsakai tolydieji, ir Fisher tikslusis kriterijus, jei atsakai dvireikšmiai (14) (17) (18). Taikant statistinį metodą ar modelį, reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad būtų atitiktis metodo ar modelio reikalavimams (pvz., bandymo schemoje ir naudojant kriterijų ar modelį turi būti atsižvelgta į įvertintą kintamumą tarp kamerų). Reikėtų įvertinti duomenų normalumą, o 5 priedėlyje nurodyta, ką reikėtų daryti su ANOVA liekanomis. 6 priedėlyje aptariami papildomi regresijos metodo taikymo aspektai. Reikėtų atsižvelgti į transformacijas, kad būtų įvykdyti statistinio kriterijaus reikalavimai. Tačiau transformacijas regresijos modeliui priderinti reikia daryti atsargiai, pvz., žinant, kad 25 % netransformuoto atsako pokytis neatitinka 25 % transformuoto atsako pokyčio. Tiek hipotezės tikrinimo kriterijuose, tiek regresijos modelyje reikėtų atsižvelgti į tai, kad, atliekant visas analizes, analizės ir bandymų vienetas yra bandymo kamera, o ne atskira žuvis (3) (14) (19) (20).
                              
                           
                        Bandymo ataskaita
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandomoji cheminė medžiaga:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Vienakomponentė cheminė medžiaga:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizinės ir cheminės savybės;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, priemaišų cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt. (įskaitant organinės anglies kiekį, jei jos yra).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminio identifikavimo duomenis (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymo gyvūnų rūšys:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         mokslinis pavadinimas, veislė, šaltinis, apvaisintų ikrų surinkimo metodas ir vėlesnis tvarkymas.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymo sąlygos:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         taikyta bandymų procedūra (pusiau statinis ar dinaminis, įkrova),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         šviesiojo laikotarpio trukmė (-ės);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymų schema (pvz., bandymų kamerų ir kartotinių ėminių skaičius, vieno kartotinio ėminio ikrų skaičius, bandymų kameros medžiaga ir matmenys (aukštis, plotis, tūris), vienos kameros vandens tūris);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         pradinių tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas (reikėtų nurodyti tirpumo agentą, jei naudojamas, ir jo koncentraciją);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandomosios cheminės medžiagos dozavimo metodas (pvz., siurbliai, skiedimo sistemos);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metodo atgavimo efektyvumas ir nominalios bandymų koncentracijos vertės, kiekybinio nustatymo riba, išmatuotų verčių vidurkiai bandymo indui ir jų standartiniai nuokrypiai, šių verčių gavimo metodas ir įrodymas, kad matavimai susiję su bandomosios cheminės medžiagos tikrojo tirpalo koncentracija;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         skiedimo vandens charakteristikos: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro koncentracija (jei matuojama), bendroji organinė anglis (jei matuojama), suspenduotos kietosios dalelės (jei matuojamos), bandymo terpės druskingumas (jei matuojamas) ir visi kiti atlikti matavimai,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymų indų vandens kokybė, pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         išsami informacija apie maitinimą (pvz., maisto rūšis (-ys), šaltinis, duodamas kiekis ir maitinimo dažnumas).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Šių vertinamųjų baigčių rezultatai, kurie ataskaitoje pateikiami atskirai (arba kaip kartotinių ėminių rezultatai), jų vidurkis ir variacijos koeficientas, jei reikia:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         įrodymai, kad kontroliniai ėminiai atitinka bandymų rūšies išgyvenamumo priimtinumo standartą (2 priedėlis);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         gaištamumo kiekvienoje stadijoje (embrionas, lervos ir mailius) ir bendri gaištamumo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         paros iki išsiritimo, kiekvieną parą išsiritusių lervų skaičius ir išsiritimo pabaiga;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         sveikų žuvų skaičius bandymo pabaigoje;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         išgyvenusių gyvūnų ilgio (nurodyti standartinio ar viso) ir masės duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         morfologinių anomalijų, jei yra, dažnumas, aprašymas ir skaičius;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         neįprasto elgesio reiškinių, jei pasireiškė, dažnumas, aprašymas ir skaičius;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         statistinės analizės metodas (regresinė analizė ar dispersinė analizė) ir duomenų apdorojimas (taikytas statistinis kriterijus ar modelis);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno vertinto atsako nestebimo poveikio koncentracija (NOEC);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno vertinto atsako mažiausia stebimo poveikio koncentracija (kai p = 0,05) (LOEC);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno vertinto atsako ECx, jei taikoma, ir pasikliovimo intervalai (pvz., 90 % ar 95 %); skaičiavimams naudoto priderinto modelio grafikas, koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivės krypties koeficientas, regresijos modelio formulė, įvertinti modelio parametrai ir jų standartinės paklaidos.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Visi nukrypimai nuo bandymų metodo.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rezultatų aptarimas, įskaitant nukrypimų nuo šio bandymų metodo įtaką bandymų rezultatams.
                                             
                                          
                                       
                                    1 lentelė
                                 
                                 
                                    Bandyti rekomenduojamų žuvų rūšys
                                 
                                 
                                             GĖLAVANDENĖS
                                          
                                          
                                             UPIŲ ŽIOČIŲ ir JŪRŲ
                                          
                                       
                                             
                                                Oncorhynchus mykiss
                                             
                                             Vaivorykštinis upėtakis
                                          
                                          
                                             
                                                Cyprinodon variegatus
                                             
                                             Margasis dančiakarpis
                                          
                                       
                                             
                                                Pimephales promelas
                                             
                                             Juodoji drūtagalvė rainė
                                          
                                          
                                             
                                                Menidia sp.
                                             Priekrančių menidija
                                          
                                       
                                             
                                                Danio rerio
                                             
                                             Zebrinė danija
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                                             
                                                Oryzias latipes
                                             
                                             Japoninė medaka
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Šio priedo C.20 skyrius. Daphnia magna reprodukcijos bandymas.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C..
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 – 376.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Ilgis iki šakutės (FL)– ilgis nuo snukio galo iki uodeginio peleko vidurinių spindulių galo ir naudojamas toms žuvims, kurioms sunku nustatyti stuburo pabaigą (www.fishbase.org).
                        
                           
                              Standartinis ilgis (SL)
                           – žuvies ilgis, išmatuotas nuo snukio galo iki paskutiniojo slankstelio užpakalinio galo arba iki stuburo plokštės mediolateralinės dalies užpakalinio galo. Kitaip tariant, į šį matmenį neįtrauktas uodeginio peleko ilgis. (www.fishbase.org).
                        
                           
                              Visas ilgis (TL)
                           – ilgis nuo snukio galo iki uodeginio peleko ilgesnės mentės galo, paprastai matuojamas mentes prispaudus išilgai vidurio linijos. Tai yra tiesinis matmuo, o ne matuojamas pagal kūno išlinkimą (www.fishbase.org).
                        
                           1 paveikslas
                        
                        
                           Įvairių naudojamų ilgių apibūdinimas
                        
                        Standartinis ilgis
                        Ilgis iki šakutės
                        Visas ilgis
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              ECx
                              
                           – (x % poveikio koncentracija) – koncentracija, kuriai esant daromas poveikis x % bandymo organizmų, palyginti su kontroliniu ėminiu per tam tikrą veikimo laikotarpį. Pvz., EC50 yra įvertinta koncentracija, kuri daro poveikį 50 % veikiamos populiacijos bandymo vertinamajai baigčiai per tam tikrą veikimo laikotarpį.
                        
                           
                              Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC)
                           – mažiausia bandymo koncentracija, kuriai esant stebimas cheminės medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas, palyginti su kontroliniu ėminiu (p < 0,05). Tačiau esant visoms didesnėms nei LOEC bandymo koncentracijos vertėms, kenksmingas poveikis turėtų būti lygus arba didesnis nei poveikis, kuris būtų esant LOEC. Kai negalima įvykdyti šių dviejų sąlygų, turėtų būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kaip buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vertė. Nurodymai pateikti 5 ir 6 priedėliuose.
                        
                           
                              Nestebimo poveikio koncentracija (NOEC)
                           – vos mažesnė nei LOEC bandymo koncentracija, kuri per nurodytą veikimo laikotarpį nedaro statistiškai reikšmingo poveikio (p < 0,05), palyginti su kontroliniu ėminiu.
                        
                           
                              UVCB
                           – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos.
                        
                           
                              IUPAC
                           – Tarptautinė teorinės ir taikomosios chemijos sąjunga.
                        
                           
                              SMILES
                           – supaprastinto molekulių pateikimo linijine forma specifikacija.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           REKOMENDUOJAMŲ RŪŠIŲ BANDYMŲ SĄLYGOS, TRUKMĖ IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI
                        
                        
                                    RŪŠIS
                                 
                                 
                                    BANDYMŲ SĄLYGOS
                                 
                                 
                                    REKOMENDUOJAMA BANDYMŲ TRUKMĖ
                                 
                                 
                                    Tipinis mažiausias kontrolinių žuvų visas vidutinis ilgis tyrimo pabaigoje (mm) (98)
                                    
                                 
                                 
                                    KONTROLINIŲ ĖMINIŲ ŽUVŲ IŠGYVENAMUMAS (ne mažesnis)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Temperatūra (°C)
                                 
                                 
                                    Druskingumas (0/00)
                                 
                                 
                                    Šviesiojo laikotarpio trukmė (h)
                                 
                                 
                                    Išsiritimo procentinė dalis
                                 
                                 
                                    Išsiritusių lervų išgyvenamumas
                                 
                              
                                    
                                       Gėlasis vanduo
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Vaivorykštinis upėtakis
                                 
                                 
                                    10 ± 1,5 (99)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12–16 (100)
                                    
                                 
                                 
                                    2 savaitės po kontrolinių ėminių žuvų maitinimo iki soties pradžios (arba 60 parų po išsiritimo)
                                 
                                 
                                    40
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Juodoji drūtagalvė rainė
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    32 paros nuo bandymo pradžios (arba 28 paros po išsiritimo)
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Zebrinė danija
                                 
                                 
                                    26 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12–16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 parų po išsiritimo
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Japoninė medaka
                                 
                                 
                                    25 ± 2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12–16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 parų po išsiritimo
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Upių žiočių ir jūrų:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    Margasis dančiakarpis
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                    15–35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    12–16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    32 paros nuo bandymo pradžios (arba 28 paros po išsiritimo)
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    Priekrančių menidija
                                 
                                 
                                    22–25
                                 
                                 
                                    15–35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    28 paros
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    60 %
                                 
                              
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           REKOMENDUOJAMŲ RŪŠIŲ NERŠIANČIŲ IR BANDYMŲ GYVŪNŲ MAITINIMO BEI PRIEŽIŪROS REKOMENDACIJOS
                        
                        
                                    RŪŠIS
                                 
                                 
                                    MAISTAS (*9)
                                    
                                 
                                 
                                    PERNEŠIMO PO IŠSIRITIMO LAIKAS
                                 
                                 
                                    PIRMOJO MAITINIMO LAIKAS
                                 
                              
                                    Neršianti žuvis
                                 
                                 
                                    Tik ką išsiritusios lervos
                                 
                                 
                                    Mailius
                                 
                              
                                    Tipas
                                 
                                 
                                    Dažnumas
                                 
                              
                                    
                                       Gėlasis vanduo
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    Vaivorykštinis upėtakis
                                 
                                 
                                    upėtakių maistas
                                 
                                 
                                    Jokio (1)
                                    
                                 
                                 
                                    upėtakių mailiaus maistas BSN
                                 
                                 
                                    2–4 kartus per parą
                                 
                                 
                                    14–16 parų po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios (pasirinktinai)
                                 
                                 
                                    19 parų po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    Juodoji drūtagalvė rainė
                                 
                                 
                                    BSN, maisto dribsniai FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN 48, maisto dribsniai
                                 
                                 
                                    2–3 kartus per parą
                                 
                                 
                                    kai išsirita 90 %
                                 
                                 
                                    2 paros po išsiritimo
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    Zebrinė danija
                                 
                                 
                                    BSN, maisto dribsniai
                                 
                                 
                                    Pirktinis lervų maistas, pirmuonys (2), baltymai (3)
                                    
                                 
                                 
                                    BSN48, maisto dribsniai,
                                 
                                 
                                    BSN kartą per parą; maisto dribsniai du kartus per parą
                                 
                                 
                                    kai išsirita 90 %
                                 
                                 
                                    2 paros po išsiritimo
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    Japoninė medaka
                                 
                                 
                                    maisto dribsniai
                                 
                                 
                                    BSN, maisto dribsniai (arba pirmuonys ar verpetės)
                                 
                                 
                                    BSN48, maisto dribsniai (arba verpetės)
                                 
                                 
                                    BSN kartą per parą; maisto dribsniai du kartus per parą arba maisto dribsniai ir verpetės kartą per parą
                                 
                                 
                                    Netaikoma
                                 
                                 
                                    6–7 paros po neršto
                                 
                              
                                    
                                       Upių žiočių ir jūrų:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon varieqatus
                                       
                                    
                                    Margasis dančiakarpis
                                 
                                 
                                    BSN, maisto dribsniai, FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2–3 kartus per parą
                                 
                                 
                                    Netaikoma
                                 
                                 
                                    1 para po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    Priekrančių menidija
                                 
                                 
                                    BSN 48, maisto dribsniai
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2–3 kartus per parą
                                 
                                 
                                    Netaikoma
                                 
                                 
                                    1 para po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios
                                 
                              
                              
                     
                        4 priedėlis
                        
                           KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS CHARAKTERISTIKOS
                        
                        
                                    Komponentas
                                 
                                 
                                    Ribinė koncentracija
                                 
                              
                                    Kietosios dalelės
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Bendroji organinė anglis
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Nejonizuotas amoniakas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Liekamasis chloras
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintųjų bifenilų kiekis
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Bendras organinio chloro kiekis
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Aliuminis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Arsenas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Chromas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kobaltas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Varis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Geležis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Švinas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Nikelis
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Cinkas
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kadmis
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Gyvsidabris
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Sidabras
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        5 priedėlis
                        
                           NOEC NUSTATYMO STATISTINĖS ANALIZĖS REKOMENDACIJOS
                        
                        
                           Bendrosios nuostatos
                        
                        Analizės vienetas yra kartotinio ėminio indas. Todėl, atliekant nuolatinius matavimus, pvz., dydžio, reikėtų apskaičiuoti kartotinio ėminio vidurkį arba medianą ir šios kartotinio ėminio vertės yra analizės duomenys. Reikėtų įrodyti taikomų kriterijų galią, pageidautina pagrįstą atitinkama kiekvienos laboratorijos istorinių duomenų baze. Kiekvienai vertinamajai baigčiai reikėtų gauti poveikio dydį, kuris, taikant statistinius kriterijus, gali būti aptiktas esant 75–80 % galiai.
                        Šio bandymų metodo kūrimo metu turimos duomenų bazės nustato galią, kuri yra įmanoma taikant rekomenduojamas statistines procedūras. Atskira laboratorija turėtų įrodyti savo sugebėjimą atitikti šį galios reikalavimą, atlikdama savo galios analizę arba įrodydama, kad kiekvieno atsako variacijos koeficientas (VK) nėra didesnis nei rengiant šias bandymo gaires naudoto VK 90-oji procentilė. Šios VK vertės pateiktos 1 lentelėje. Jei yra tik kartotinių ėminių vidurkiai ar medianos, į kartotinių ėminių VK galima neatsižvelgti.
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           90-osios procentilės VK vertės, gautos pasirinktoms gėlavandenėms rūšims
                        
                        
                                    Rūšis
                                 
                                 
                                    Atsakas
                                 
                                 
                                    VK tarp kartotinių ėminių
                                 
                                 
                                    Kartotinių ėminių VK
                                 
                              
                                    Vaivorykštinis upėtakis
                                 
                                 
                                    Ilgis
                                 
                                 
                                    17,4
                                 
                                 
                                    9,8
                                 
                              
                                    Masė
                                 
                                 
                                    10,1
                                 
                                 
                                    28
                                 
                              
                                    Juodoji drūtagalvė rainė
                                 
                                 
                                    Ilgis
                                 
                                 
                                    16,9
                                 
                                 
                                    13,5
                                 
                              
                                    Masė
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                                 
                                    38,7
                                 
                              
                                    Zebrinė danija
                                 
                                 
                                    Ilgis
                                 
                                 
                                    43,7
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                              
                                    Masė
                                 
                                 
                                    11,9
                                 
                                 
                                    32,8
                                 
                              Beveik visi statistiniai kriterijai, taikyti įvertinant laboratorijos toksikologinius tyrimus, yra skirti apdorotos grupės ir kontrolinių ėminių tiriamiems palyginimams. Dėl šios priežasties negalima reikalauti tikrinti pagal reikšmingą ANOVA F kriterijų prieš taikant Dunnett ar Williams kriterijų arba pagal reikšmingą Kruskal-Wallis kriterijų prieš taikant Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney ar Dunn kriterijų (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964).
                        Taikant Dunnett kriterijų, galima atlikti daugybines korekcijas, todėl jo klaidingi teigiami ir klaidingi neigiami rodikliai yra netinkami F kriterijaus reikšmingumui nustayti. Panašiai, mažėjimo tvarka taikomi Williams ir Jonckheere-Terpstra kriterijai, naudojant 0,05 reikšmingumo lygį, kiekvienoje pakopoje užtikrina visuminę 5 % klaidingai teigiamų rodiklių dalį, ir ši dalis bei kriterijų galia yra netinkami nustatant pagal F ar Kruskal-Wallis kriterijų reikšmingumą. Todėl reikia daryti Mann-Whitney ir Dunn kriterijų pataisą dėl daugybinių korekcijų ir tam rekomenduojama Bonferroni-Holm pataisa.
                        Daugumą rekomendacijų dėl hipotezių tikrinimo ir šiems kriterijams pagrįsti naudojamų prielaidų tikrinimo išsamiai aptariama EBPO (2006 m.) dokumente, kuriame taip pat pateikiama daug bibliografijos šaltinių.
                        
                           Kontrolinių ėminių apdorojimas, kai naudojamas tirpiklis
                        
                        Jei naudojamas tirpiklis, reikėtų įtraukti skiedimo vandens kontrolinį ėminį ir tirpiklio kontrolinį ėminį. Jei tarp kontrolinių ėminių nenustatoma reikšmingo skirtumo, abu kontrolinius ėminius reikėtų palyginti dėl kiekvieno atsako ir sujungti atliekant statistinę analizę. Priešingu atveju tirpiklio kontrolinį ėminį reikėtų naudoti nustatant NOEC ar įvertinant ECx, o vandens kontrolinio ėminio nenaudoti. Žr. tinkamumo kriterijų apribojimus (7 pastraipa)
                        Ilgiui, masei, išsiritusių ikrų arba nugaišusių ar nenormalių lervų daliai ir pirmajai ar paskutinei išsiritimo parai ar plaukimo pradžiai reikėtų taikyti T kriterijų arba Mann-Whitney kriterijų skiedimo vandens ir tirpiklio kontroliniams ėminiams palyginti esant 0,05 reikšmingumo lygiui, nekreipiant dėmesio į apdorotas grupes. Tikrinimo pagal šiuos kriterijus rezultatai turėtų būti pateikti ataskaitoje.
                        
                           Dydžio matavimai (ilgio ir masės)
                        
                        Atskirų žuvų ilgio ir masės verčių pasiskirstymas gali būti normalusis ar lognormalusis. Bet kuriuo atveju kartotinių ėminių vidutinės vertės linkusios į normalųjį pasiskirstymą, atsižvelgiant į centrinę ribinę teoremą, ir tai patvirtina daugiau kaip šimtas trijų gėlavandenių žuvų rūšių ankstyvųjų gyvenimo stadijų toksiškumo tyrimų. Be to, jei duomenys ar istorinės duomenų bazės rodo atskirų žuvų dydžio verčių lognormalųjį pasiskirstymą, galima apskaičiuoti atskirų žuvų verčių kartotinio ėminio vidurkio logaritmą ir tada analizės duomenys gali būti šių kartotinių ėminių vidurkių logaritmų antilogaritmai.
                        Duomenis reikėtų patikrinti dėl atitikties normaliajam pasiskirstymui ir dispersijos vienalytiškumui. Šiam tikslu reikėtų naudoti ANOVA modelio liekanas ir koncentraciją kaip vienintelį nepriklausomą kintamąjį. Galima naudoti vizualinį nustatymą pagal sklaidos diagramas ir histogramas arba kamieninę-lapinę diagramą. Arba galima taikyti formalųjį kriterijų, pvz., Shapiro-Wilk ar Anderson-Darling. Atitiktis dispersijos vienalytiškumui gali būti įvertinta vizualiai tiriant tą pačią sklaidos diagramą arba formaliai pagal Levene kriterijų. Įvertinamas tik parametrinių kriterijų (pvz., Williams, Dunnett) normalumas ar dispersijos vienalytiškumas.
                        Reikėtų atkreipti dėmesį į galimus riktus ir jų įtaką analizei. Galima taikyti Tukey riktų kriterijų ir vizualiai patikrinti pirmiau aprašytus liekanų grafikus. Reikėtų priminti, kad stebėjimo vienetas yra visas kartotinis ėminys, todėl riktus iš analizės reikėtų šalinti tik po kruopštaus tyrimo.
                        Statistiniai kriterijai, kurie yra naudojami bandymų schemų ir biologinės tikimybės charakteristikoms yra tendencijos mažėjimo kriterijai, tokie kaip pvz., Williams ir Jonckheere-Terpstra. Tokiems kriterijams taikoma prielaida dėl koncentracijos ir atsako priklausomybės monotoniškumo, todėl duomenys turėtų būti vertinami siekiant nuoseklaus atitikimo tokiai prielaidai. Tai galima atlikti vizualiai, pagal kartotinių ėminių vidurkių sklaidos diagramą palyginant su bandymo koncentracijom. Būtų naudinga perdengti sklaidos diagramą tiesinio grafiko dalimis, kurios sujungtų koncentracijos vidurkius kaip kartotinio ėminio imties dydžio svertinius vidurkius. Didelis tokio tiesinio grafiko dalių nukrypimas nuo monotoniškumo rodytų, kad galbūt reikėtų naudoti ne tendencijos mažėjimo kriterijus. Arba galima taikyti formalius kriterijus. Paprastas formalus kriterijus yra apskaičiuoti koncentracijos vidurkių tiesinius ir kvadratinius kontrastus. Jei kvadratinis kontrastas yra reikšmingas, o tiesinis – ne, tai rodo, kad gali būti monotoniškumo problema, kurią reikėtų įvertinti pagal grafikus. Jei problema – normalumas ar dispersijos vienalytiškumas, šiuos kontrastus galima gauti pagal rangų transformacijos duomenis. Galima taikyti alternatyvias procedūras, pvz., Bartholomew monotoniškumo kriterijų, bet ši procedūra sudėtingesnė.
                        
                           2 paveikslas
                        
                        
                           Struktūrinė diagrama NOEC gauti pagal dydžio (ilgio ir masės) matavimus
                        
                        Tais atvejais, kai duomenys neatitinka šių kriterijų reikalavimų, NOEC nustatoma mažėjimo tvarka taikant Williams ar Jonckheere-Terpstra kriterijus. Šios procedūros pateiktos EBPO (2006 m.). Jei duomenys neatitinka mažėjimo tvarka taikomo tendencijos kriterijaus, galima taikyti Dunnett kriterijų ar Tamhane-Dunnett (T3) kriterijų, kurie abu turi pataisas dėl daugybinių korekcijų. Taikant šiuos kriterijus daroma prielaida dėl normalumo, o Dunnett kriterijaus atveju – dėl dispersijos vienalytiškumo. Jei duomenys šių sąlygų neatitinka, galima taikyti Dunn neparametrinį kriterijų. Išsami informacija apie šiuos kriterijus pateikta EBPO (2006 m.). 2 paveiksle pateikta tinkamų kriterijų pasirinkimo apžvalga.
                        
                           Išsiritimas iš ikrų ir lervų išgyvenamumas
                        
                        Duomenys yra išsiritimo iš ikrų ar išgyvenusių lervų dalis atskirame kartotiniame ėminyje. Šias dalis reikėtų įvertinti dėl didesnės nei binominio skirstinio dispersijos, kuri yra įprastinė, bet ne visuotinė tokių matavimų dispersija. 3 paveiksle pateiktoje struktūrinėje diagramoje pateiktos rekomendacijos dėl tinkamo kriterijaus pasirinkimo; išsamus aprašymas pateiktas tekste.
                        Dažniausiai taikomi du kriterijai. Tai yra Tarone C(α) kriterijus (Tarone, 1979 m.) ir chi kvadratu kriterijus, kurių kiekvienas taikomas atskirai kiekvienai bandymo koncentracijai. Jei didesnė nei binominio skirstinio dispersija nustatoma nors vienai bandymo koncentracijai, reikėtų taikyti metodus, kurie su tokia sąlyga būtų suderinami.
                        
                           1 formulė.
                        
                        
                           Tarone C (α) kriterijus (Tarone 1979 m.)
                        
                        
                           
                        čia: ̂ – vidutinė dalis esant tam tikrai koncentracijai, m – kartotinių ėminių indų skaičius, nj
                            – subjektų skaičius kartotiniame ėminyje j, ir xj
                            – reaguojančių subjektų tame kartotiniame ėminyje skaičius, pvz., neišsiritusių ar žuvusių. Šis kriterijus taikomas kiekvienai koncentracija atskirai. Į šį kriterijų galima žiūrėti kaip į pataisytą chi kvadratu kriterijų, bet Tarone atliktas ribotos galios modeliavimas parodė, kad jis yra didesnės galios nei chi kvadratu kriterijus.
                        
                           3 paveikslas.
                        
                        
                           Struktūrinė diagrama NOEC gauti pagal išsiritimą iš ikrų ir lervų gaištamumą
                        
                        Jei nėra reikšmingų didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų, galima taikyti Cochran-Armitage kriterijų mažėjimo tvarka. Šis kriterijus neatsižvelgia į kartotinius ėminius, todėl, jei yra tokių įrodymų, reikėtų taikyti Cochran-Armitage kriterijų su Rao-Scott pataisa (RSCA), kuri atsižvelgia į kartotinius ėminius, kartotinių ėminių dydį ir į didesnę nei binominio skirstinio dispersiją, todėl ir yra rekomenduojama. Alternatyvūs kriterijai yra Williams ir Jonckheere-Terpstra kriterijai mažėjimo tvarka ir Dunnett kriterijus, aprašyti dydžio matavimams. Šie kriterijai taikomi, kai yra didesnė nei binominio skirstinio dispersija ar kai jos nėra, bet jų galia yra kažkiek mažesnė (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996).
                        
                           Pirmoji arba paskutinė išsiritimo arba plaukimo para
                        
                        Atsakas yra sveikas skaičius, rodantis bandymo dieną, kurią yra stebimas nurodytas parametras tam tikrame kartotinio ėminio inde. Verčių intervalas paprastai yra labai ribotas ir dažnai esama didelės susijusių verčių dalies, pvz., ta pati pirmoji išsiritimo para stebima visuose kontroliniuose kartotiniuose ėminiuose ir galbūt vienos ar dviejų mažos koncentracijos verčių ėminiuose. Tokiems duomenims netinka parametriniai kriterijai, pvz., Williams ir Dunnett kriterijai. Jei nėra didelio nemonotoniškumo įrodymų, Jonckheere-Terpstra kriterijus mažėjimo tvarka turi didelę galią bandomosios cheminės medžiagos poveikiui aptikti. Priešingu atveju galima taikyti Dunn kriterijų.
                        
                           Lervų anomalijos
                        
                        Atsakas yra kokių nors anomalijų turinčių lervų skaičius. Šis atsakas labai dažnai yra mažo dažnumo ir turi kai kurių panašių pirmosios išsiritimo dienos problemų, taip pat kartais pastebima nepastovi koncentracijos ir atsako priklausomybė. Jei duomenys bent apytikriai atitinka monotonišką priklausomybės nuo koncentracijos formą, Jonckheere-Terpstra kriterijus mažėjimo tvarka turi didelę galią poveikiui aptikti. Priešingu atveju galima taikyti Dunn kriterijų.
                        NUORODOS
                        Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken.
                        Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121.
                        Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252.
                        Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491.
                        Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648.
                        Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454.
                        Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York.
                        Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton.
                        Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133.
                        Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris..
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                        Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley.
                        Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590.
                        Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117.
                        Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531.
                        Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952.
                        Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14.
                     
                     
                        6 priedėlis
                        
                           STATISTINĖS ANALIZĖS REKOMENDACIJOS ĮVERČIAMS GAUTI REGRESIJOS METODU
                        
                        
                           Bendrosios nuostatos
                        
                        Modeliui priderinti naudoti stebėjimų duomenys yra kartotinių ėminių vidurkiai (ilgio ir masės) arba kartotinių ėminių dalys (išsiritimo iš ikrų ir lervų gaištamumo) (EBPO, 2006 m.).
                        Paprastai patariama svertinė regresija pagal kartotinio ėminio imties dydį. Galima taikyti kitas svertinio įvertinimo schemas, pvz., svertinį įvertinimą pagal prognozuojamą vidutinį atsaką arba jo ir kartotinio ėminio imties dydžio derinį. Svertinis įvertinimas pagal vienos koncentracijos ėminių atvirkštinę dispersiją nerekomenduojamas (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003).
                        Transformuojant atsakus prieš analizę, reikėtų išsaugoti stebėjimo duomenų nepriklausomybę, ir ECx, o jos pasikliovimo ribos turėtų būti išreikštos pradiniais matavimo vienetais, o ne transformuotais vienetais. Pvz., ilgio logaritmo 20 % pokytis nėra lygiavertis ilgio 20 % pokyčiui (Lyles et.al 2008, Draper and Smith 1999).
                        4 paveiksle pateikta struktūrinė diagrama ECx įverčiams gauti. Išsamesnis paaiškinimas pateiktas tolesniame tekste.
                        
                           4 paveikslas
                        
                        
                           ECx įvertinimo pagal kartotinių ėminių vidutinį ilgį, masę arba išsiritimo iš ikrų ar lervų gaištamumo dalį struktūrinė diagrama, išsamesnis paaiškinimas pateiktas tekste
                        
                        
                           Išsiritimo iš ikrų ir lervų gaištamumo aspektai
                        
                        Jei imamas išsiritimas iš ikrų ir lervų gaištamumas, paprastai būtų geriau priderinti mažėjimo modelį, nebent būtų priderinamas probit regresijos modelis, kaip aprašyta toliau. T. y reikėtų modeliuoti pagal neišsiritusių ikrų ar žuvusių lervų dalį. To priežastis – ECx atitinka koncentraciją, kuriai esant pokytis yra lygus x % kontrolinio ėminio vidutinio atsako. Jei neišsirita 5 % kontrolinio ėminio ikrų ir modeliuojama pagal neišsiritusių ikrų skaičių, EC20 rodytų koncentraciją, kuriai esant yra 20 % pokytis, palyginti su 5 % kontrolinio ėminio neišsiritusių ikrų, t. y. pokytis yra 0,2 × 0,05 = 0,01 arba 1 procentinis punktas ir iš viso neišsirito 6 %. Toks nedidelis pokytis negali būti kaip nors prasmingai įvertintas pagal turimus duomenis ir nėra biologiškai svarbus. Tačiau, jei modeliuojama pagal išsiritusių ikrų kiekį, kontrolinio ėminio dalis šiame pavyzdyje būtų 95 %, o 20 % sumažėjimas, palyginti su kontrolinio ėminio vidurkiu, sudarytų pokytį 0,95 × 0,2 = 0,18, taigi nuo 95 % iki 77 % (= 95 – 18) išsiritusių ikrų procentinės dalies, todėl poveikio koncentracija gali būti įvertinta ir ji turbūt daug svarbesnė. Taip nėra matuojant dydį, nors neigiamas poveikis dydžiui paprastai reiškia dydžio sumažėjimą.
                        
                           Dydžio (ilgio arba masės) ir išsiritimo iš ikrų ar lervų išgyvenamumo dalies modeliai
                        
                        Išskyrus Brain-Cousens hormezės modelį, visi šie modeliai yra aprašyti ir rekomenduojami EBPO (2006 m.). Tai, kas vadinama EBPO 2-5, taip pat yra aptarta dėl ekotoksiškumo bandymų, Slob (2002). Aišku, kad yra daug kitų modelių, kurie galėtų būti naudingi. Bunke et al. (1999) išvardyta daug į šį dokumentą neįtrauktų modelių ir yra labai daug nuorodų į kitus modelius. Toliau išvardyti metodai yra siūlomi kaip ypač tinkami ekotoksiškumo bandymams ir yra plačiai taikomi.
                        
                           Penkios bandymo koncentracijos vertės ir kontrolinis ėminys:
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Bruce-Versteeg;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    paprastasis eksponentinis (EBPO 2);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    eksponentinis su formos parametru (EBPO 3);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    paprastasis eksponentinis su apatine riba (EBPO 4).
                                 
                              
                           Daugiau kaip šešios bandymo koncentracijos vertės ir kontrolinis ėminys:
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    eksponentinis su formos parametru ir apatine riba (EBPO 5);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Michaelis-Menten;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Hill.
                                 
                              Jei yra vizualūs hormezės įrodymai (maža jos tikimybė išsiritimo iš ikrų ar lervų išgyvenamumo daliai, bet kartais stebima dydžio duomenims):
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Brain-Cousens Hormetic; Brain and Cousens (1989 m.)
                                 
                              
                           Alternatyvūs išsiritimo iš ikrų ar lervų išgyvenamumo dalies modeliai
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Šių atsakų didėjimo modeliai gali būti priderinti pagal probit (ar logistinio skirstinio) modelį, jei nėra didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų, o priderinant modelį įvertinamas kontrolinio ėminio incidentiškumas. Šis metodas nėra tinkamiausias, nes kaip analizės vienetas imamas pavienis, o ne kartotinis ėminys (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003).
                                 
                              
                           Atskiro modelio suderintumas
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Vizualiai lyginamas stebimas ir prognozuojamas procentinis sumažėjimas kiekvienai bandymo koncentracijai (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Taikant F kriterijų lyginama regresijos vidutinė kvadratinė paklaida ir grynoji vidutinė kvadratinė paklaida (Draper and Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    tikrinama, ar kad kiekvienas modelio narys gerokai skiriasi nuo nulio (pvz., nustatoma, ar visi modelio nariai yra svarbūs), (Motulsky and Christopoulos 2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Gaunamas regresijos liekanų kaip bandymų koncentracijos funkcijos grafikas, galbūt log (koncentracijos) skalėje. Neturėtų būti jokio šio grafiko modelio; taškai turėtų būti atsitiktinai išsisklaidę apie horizontalią liniją nulio aukštyje.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Duomenys turėtų būti įvertinami dėl normalumo ir dispersijos vienalytiškumo 5 priedėlyje nurodytu būdu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Be to, liekanų apie regresijos modelį normalumas turėtų būti vertinamas taikant metodus, kurie 5 priedėlyje yra nurodyti ANOVA liekanoms.
                                 
                              
                           Modelių palyginimas
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Taikomi Akiake informacijos kriterijai (AICc). Mažesnės AIC vertės žymi geresnius suderintumus ir, jei AICc(B)-AICc(A) ≥ 10, A modelis beveik neabejotinai yra geresnis nei B modelis (Motulsky and Christopoulos (2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Du modeliai lyginami vizualiai pagal tai, kaip gerai jie atitinka pirmiau nurodytus vieno modelio kriterijus.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Siūlomas paprastumo principas, kai taikomas paprasčiausias duomenis atitinkantis modelis (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008).
                                 
                              
                           ECx įverčio kokybė
                        
                        ECx pasikliovimo intervalas (PI) neturėtų būti labai platus. Statistiškai reikėtų pagrįsti sprendimą dėl pasikliovimo intervalo pločio ir dėl vis dar tinkamo ECx naudingumo. Išsiritimo iš ikrų ir dydžių duomenų regresijos modelių priderinimo tikrinimas rodo, kad maždaug 75 % ECx (x = 10, 20 ar 30) pasikliovimo intervalų aprėpia ne daugiau kaip dvi koncentracijos vertes. Taip gaunamos bendrosios priimtinumo rekomendacijos ir praktinės pasiekiamumo rekomendacijos. Daug autorių teigia, kad ataskaitoje reikia pateikti visų modelio parametrų pasikliovimo intervalus, o platus modelio parametrų pasikliovimo intervalas rodo nepriimtiną modelį (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005).
                        ECx pasikliovimo intervale (ar kitame modelio parametre) neturėtų būti nulio (Motulsky and Christopoulos 2004). Tai yra tas pat, kaip regresijai būtų minimalus reikšmingas skirtumas, kuris dažnai nurodomas taikant hipotezių tikrinimo metodus (pvz., Wang et al 2000). Tai taip pat atitinka LOEC atsakų vidurkių pasikliovimo intervalą, į kurį nepatenka kontrolinio ėminio vidurkis. Reikėtų įsitikinti, kad parametrų įverčiai yra moksliškai patikimi. Pvz., jei y0 pasikliovimo intervalas yra ± 20 %, joks EC10 įvertis nėra patikimas. Jei koncentracijai C pagal modelį prognozuojamas 20 % poveikis, o didžiausias stebimas poveikis esant C ir mažesnei koncentracijai yra 10 %, EC20 nėra patikima (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005).
                        ECx neturėtų prireikti ekstrapoliacijos toliau nei teigiamų koncentracijos verčių intervalas (Draper and Smith 1999, EBPO 2006). Pvz., bendroji rekomendacija galėtų būti tokia, kad ECx turi būti ne daugiau kaip 25 % mažesnė nei mažiausia bandyta koncentracija ir ne daugiau kaip 25 % didesnė nei didžiausia bandyta koncentracija.
                        NUORODOS
                        Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163.
                        Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96.
                        Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240.
                        Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons.
                        Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46
                        Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York.
                        Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886.
                        Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA.
                        O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121
                        OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.
                        Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA
                        Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199.
                        Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003
                        Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312
                        Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000.
                     
                     C.48   Trumpalaikis žuvų reprodukcijos tyrimas
                     
                     ĮVADAS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 229 (2012). Poreikis parengti ir patvirtinti žuvų bandymą, kuriuo galima nustatyti endokrininę sistemą veikiančias chemines medžiagas, atsirado susirūpinus, kad aplinkos užterštumas cheminėmis medžiagomis gali kelti neigiamą poveikį ir žmonėms, ir laukinei gyvūnijai dėl šių cheminių medžiagų sąveikos su endokrinine sistema. 1998 m. EBPO iniciatyva pradėtas didelės svarbos darbas – peržiūrėti esamas gaires ir parengti naujas endokrininę sistemą galimai ardančių medžiagų atrankos ir bandymų gaires. Viena iš šio darbo dalių – parengti žuvų endokrininę sistemą veikiančių cheminių medžiagų atrankos bandymų gaires. Kad būtų įrodyta tyrimo svarba ir patikimumas, buvo atlikta trumpalaikio žuvų reprodukcijos tyrimo plataus masto patvirtinimo programa, kurią sudaro pasirinktų cheminių medžiagų tarplaboratoriniai tyrimai, siekiant aptikti chemines medžiagas, kurios pagal įvairius mechanizmus veikia žuvų reprodukciją, įskaitant poveikį endokrininei sistemai (1, 2, 3, 4, 5). Buvo patvirtintos visos EBPO juodosios drūtagalvės rainės bandymų gairių vertinamosios baigtys ir japoninės medakos (t. y. vitelogeninas ir antriniai lytiniai požymiai) bei zebrinės danijos (t. y. vitelogenino) vertinamųjų baigčių rinkinio dalis. Tinkamumo patvirtinimo darbus iš dalies peržiūrėjo ekspertų grupė, kurią paskyrė nacionaliniai EBPO bandymų gairių programos koordinatoriai (6), ir nepriklausoma ekspertų grupė, kurią įgaliojo Jungtinių Amerikos Valstijų Aplinkos apsaugos agentūra (29). Bandymas nėra skirtas specifiniams hormonų veiklos sutrikimo mechanizmams nustatyti, nes bandymo gyvūnai vis dar turi sveiką pagumburio, hipofizės ir lytinių liaukų (PHL) ašį, galinčią reaguoti į ją veikiančias chemines medžiagas, joms esant skirtingos koncentracijos.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Šiame bandymų metode aprašomas in vivo atrankos tyrimas, kai lytiškai subrendęs žuvies patinas ir neršianti patelė ribotą jų gyvavimo ciklo dalį (21 parą) laikomi kartu ir veikiami tam tikra chemine medžiaga. Pasibaigus 21 paros veikimo laikotarpiui, matuojamos dvi bandomosios cheminės medžiagos endokrininio aktyvumo biologinių žymenų vertinamosios baigtys; šios vertinamosios baigtys yra vitelogeninas ir antriniai lytiniai požymiai. Vitelogeninas matuojamas juodosios drūtagalvės rainės, japoninės medakos ir zebrinės danijos, o antriniai lytiniai požymiai – juodosios drūtagalvės rainės ir japoninės medakos organizme. Be to, kasdien visą bandymo laiką stebimas kiekybinis veislumas. Siekiant įvertinti bandymų gyvūnų reprodukcinį tinkamumą ir į įrodomosios vertės analizę įtraukti kitas vertinamąsias baigtis, lytinės liaukos konservuojamos ir gali būti įvertinta jų histopatologija.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Ši biologinis tyrimas yra in vivo poveikio reprodukcijai atrankos tyrimas ir jo taikymą reikėtų vertinti pagal EBPO endokrininę sistemą ardančių cheminių medžiagų bandymo ir vertinimo konceptualiąją sistemą (angl. Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (30). Pagal šią konceptualiąją sistemą trumpalaikis žuvų reprodukcijos bandymas pasiūlytas 3 lygiu kaip in vivo bandymas, kurį atliekant gaunami duomenys apie pasirinktą (-us) endokrininį (-ius) mechanizmą (-us) ar kelią (-ius).
                              
                           PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Vitelogeniną (VTG) paprastai gamina kiaušinius dedančių moteriškos lyties stuburinių gyvūnų kepenys, kaip atsaką į cirkuliuojantį endogeninį estrogeną. Jis yra kiaušinio trynio baltymų pirmtakas ir, pagamintas kepenyse, keliauja krauju į kiaušidę, kurioje jį įsisavina ir modifikuoja besivystantys kiaušinėliai. Nesubrendusių žuvų patelių ir patinų plazmoje vitelogenino beveik neįmanoma aptikti, nes jų organizme nepakanka cirkuliuojančio estrogeno, tačiau kepenys gali sintetinti ir išskirti VTG, kaip atsaką į išorinį dirginimą estrogenais.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Matuojant vitelogenino kiekį, galima nustatyti įvairias chemines medžiagas, turinčias įvairaus pobūdžio estrogeninį poveikį. Estrogenines chemines medžiagas galima aptikti matuojant vitelogenino indukciją žuvies patino organizme – tai išsamiai aprašyta ekspertų įvertintoje literatūroje (pvz. (7)). Taip pat nustatyta, kad vitelogenino indukciją sukelia aromatizuotų androgenų poveikis (8, 9). Sumažėjus patelių organizme cirkuliuojančiam estrogenų kiekiui, pvz., jei slopinama aromatazė, kuri endogeninį androgeną paverčia natūraliu estrogenu 17β-estradioliu, mažėja VTG koncentracija, naudojama aromatazės slopinimo savybių turinčioms cheminėms medžiagoms (10, 11). Yra nustatyta ir plačiai dokumentuota VTG atsako po estrogenų ar aromatazės slopinimo biologinė svarba. Tačiau įmanoma, kad VTG gamybai patelėse įtaką taip pat daro bendrasis toksiškumas ir neendokrininio toksinio veikimo būdai, pvz., toksinis poveikis kepenims.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Įprastam naudojimui sėkmingai sukurti ir standartizuoti keli matavimo metodai. Toks yra rūšių specifinės imunofermentinės analizės metodas (IFA), kurį taikant imunocheminiu būdu kiekybiškai nustatomas VTG, gautas mažuose iš atskirų žuvų paimtuose kraujo ar kepenų ėminiuose (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). VTG kiekiui išmatuoti imami juodosios drūtagalvės rainės kraujo, zebrinės danijos kraujo arba galvos ir uodegos homogenato bei medakos kepenų ėminiai. Tarp VTG kiekio, išmatuoto medakos kraujyje ir kepenyse, esama geros koreliacijos (19). 6 priedėlyje pateiktos rekomenduojamos VGT analizei skirtų ėminių ėmimo procedūros. VTG matavimo rinkiniai yra plačiai prieinami; tokie rinkiniai turėtų būti pagrįsti patvirtintu rūšims specifiniu IFA metodu.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Tam tikrų rūšių žuvų patinų antriniai lytiniai požymiai yra išoriškai matomi, kiekybiškai įvertinami ir reaguoja į cirkuliuojančius endogeninių androgenų kiekius; tai taikytina juodajai drūtagalvei rainei ir medakai, bet ne zebrinei danijai, kuri neturi kiekybiškai įvertinamų antrinių lytinių požymių. Patelės išlaiko gebėjimą išvystyti vyriškuosius antrinius lytinius požymius, kai yra paveikiamos androgeninėmis cheminėmis medžiagomis vandenyje. Mokslinėje literatūroje pateikiami keli tyrimai tokio tipo juodosios drūtagalvės rainės (20) ir medakos (21) organizmo reakcijai pagrįsti dokumentais. Patinų antrinių lytinių požymių sumažėjimą reikėtų vertinti atsargiai dėl mažos statistinės galios, be to, jis turėtų būti pagrįstas ekspertų vertinimais ir įrodomosios vertės analize. Kadangi zebrinė danija neturi kiekybiškai įvertinamų antrinių lytinių požymių, kurie reaguotų į androgeninio poveikio chemines medžiagas, jos naudojimas šiame tyrime yra ribotas.
                              
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Kalbant apie juodąją drūtagalvę rainę, pagrindinis išorinio androgeninio veikimo rodiklis yra poravimosi gumburėlių skaičius priekinėje patelės galvos dalyje. Kalbant apie medaką, pagrindinis išorinio veikimo androgeninėms cheminėms medžiagoms požymis yra patelės spenelinių ataugų skaičius. 5A ir 5B priedėliuose nurodytos rekomenduojamos procedūros, skirtos juodosios drūtagalvės rainės ir medakos lyties požymiams įvertinti.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 21 paros žuvų tyrimas aprėpia kiekybinį ikrų gamybos įvertinimą ir lytinių liaukų konservavimą, kad būtų galima atlikti neprivalomą histopatologinį tyrimą. Kad būtų galima išsamiau įvertinti bandymų gyvūnų reprodukcinį tinkamumą, arba tais atvejais, kai veikiant cheminei medžiagai nebuvo vitelogenino ir antrinių lytinių požymių atsako, kai kurios priežiūros institucijos gali pareikalauti papildomų vertinamųjų baigčių. Nors kai kurios vertinamosios baigtys gali ypač tikti diagnostikai (pvz., VTG indukcija patinuose ir gumburėlių susidarymas patelėse), ne visos tyrimo vertinamosios baigtys (pvz., vislumas ir lytinių liaukų histopatologija) yra skirtos vienareikšmiškai nustatyti specifinius ląstelių veikimo mechanizmus. Atvirkščiai, vertinamųjų baigčių seka, kaip visuma, leidžia daryti išvadas dėl galimų endokrininių sutrikimų ir tokiu būdu užtikrinti tolesnių bandymų gaires. Nors vislumas endokrininiu požiūriu nėra specifinis veiksnys, jis dėl įrodyto jautrio žinomoms endokrininę sistemą veikiančioms cheminėms medžiagoms (5) yra svarbi vertinamoji baigtis, kurią reikią įtraukti, nes kai ji ir kitos vertinamosios baigtys nėra paveiktos, yra didesnė tikimybė, kad junginys nerodo endokrininio aktyvumo. Tačiau jei paveikiamas vislumas, labai padidėja įrodomoji duomenų galia išvadoms padaryti. Rekomendacijos dėl duomenų aiškinimo ir bandymų rezultatų priimtinumo pateikiamos toliau šio bandymų metodo aprašyme.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Šiame bandymų metode vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                              
                           BANDYMO PRINCIPAS
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Atliekant tyrimą, chemine medžiaga veikiami kartu į bandymo indus patalpinti reprodukcinio amžiaus žuvų patinai ir patelės. Tyrime naudojamos suaugusios reprodukcinio amžiaus žuvys, todėl jas galima aiškiai atskirti pagal lytį, taigi ir atlikti su lytimi susijusią kiekvienos vertinamosios baigties analizę, be to, taip užtikrinamas jų jautrumas išorinėms cheminėms medžiagoms. Baigus bandymą, lytis patvirtinama makroskopiniu lytinių liaukų tyrimu atvėrus pilvo ertmę žirklėmis. Atitinkamų biologinio tyrimo sąlygų apžvalga pateikta 2 priedėlyje. Tyrimas paprastai pradedamas atrenkant žuvis iš neršiančių žuvų populiacijos; tyrime neturėtų būti naudojami senstantys gyvūnai. Rekomendacijos dėl žuvų amžiaus ir reprodukcinės būklės pateiktos skirsnyje Žuvų atranka. Tyrimas atliekamas naudojant trijų koncentracijos verčių cheminę medžiagą, taip pat vandens kontrolinį ėminį ir, jei reikia, tirpiklio kontrolinį ėminį. Tiriant zebrinę daniją, vienai bandomosios medžiagos dozei naudojami du indai arba du kartotiniai ėminiai (kiekviename inde yra po penkis patinus ir penkias pateles). Tiriant juodąją drūtagalvę rainę, vienai bandomosios medžiagos dozei naudojami keturi indai arba keturi kartotiniai ėminiai (kiekviename inde yra po du patinus ir keturias pateles). Taip daroma siekiant atsižvelgti į teritorinį juodosios drūtagalvės rainės patino elgesį, tačiau užtikrinant pakankamą tyrimo statistinę galią. Tiriant medaką, vienai bandomosios medžiagos dozei naudojami keturi indai arba keturi kartotiniai ėminiai (kiekviename inde yra po tris patinus ir tris pateles). Žuvys veikiamos 21 parą, o žuvų ėminiai imami 21-ą parą. Kiekybinių vislumo duomenų kontrolė atliekama kasdien.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Imant ėminius 21-ą parą visi gyvūnai humaniškai numarinami. Įvertinami juodosios drūtagalvės rainės ir medakos antriniai lytiniai požymiai (žr. 5A ir 5B priedėlius); iš zebrinės danijos ir juodosios drūtagalvės rainės paimami kraujo ėminiai VTG kiekiui nustatyti, arba jam nustatyti vietoj zebrinės danijos kraujo galima paimti jų galvą ir uodegą (6 priedėlis); iš medakos VTG analizei atlikti paimamos kepenys (6 priedėlis); lytinės liaukos fiksuojamos su visu kūnu arba išpjautos, kad būtų galima atlikti histopatologinį įvertinimą (22).
                              
                           BANDYMO PRIIMTINUMO KRITERIJAI
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Taikomos šios sąlygos, kad bandymo rezultatai būtų priimtini:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             gaištamumas vandens (arba tirpiklio) kontrolinių ėminių induose veikimo laikotarpio pabaigoje neturėtų būti didesnis kaip 10 %;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ištirpusio deguonies koncentracija visą veikimo laikotarpį turėtų būti ne mažesnė kaip 60 % oro soties vertės (OSV);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kiekvienu veikimo laikotarpio momentu bandymo indų vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau kaip ± 1,5 °C ir turėtų būti bandymų rūšiai nurodytame intervale 2 °C tikslumu (2 priedėlis);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             turėtų būti įrodymų, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tirpale yra išmatuotų vidutinių verčių ± 20 % intervale;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             turėtų būti įrodymų, kad žuvys aktyviai neršia visuose kartotinių ėminių induose prieš pradedant jas veikti chemine medžiaga ir visą bandymo trukmę kontrolinių ėminių induose.
                                          
                                       
                           METODO APRAŠYMAS
                     
                        Aparatūra
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Įprasta laboratorinė įranga ir ši speciali įranga:
                                 
                                             a.
                                          
                                          
                                             deguonies ir pH matuokliai,
                                          
                                       
                                             b.
                                          
                                          
                                             įranga vandens kietumui ir šarmingumui nustatyti,
                                          
                                       
                                             c.
                                          
                                          
                                             atitinkama aparatūra temperatūrai kontroliuoti, geriau nuolatinės kontrolės aparatūra,
                                          
                                       
                                             d.
                                          
                                          
                                             indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos, kurių talpa atitinka rekomenduojamą įkrovą bei žuvų tankį (žr. 2 priedėlį);
                                          
                                       
                                             e.
                                          
                                          
                                             neršto substratas juodajai drūtagalvei rainei ir zebrinei danijai, reikiama išsami informacija pateikta 4 priedėlyje;
                                          
                                       
                                             f.
                                          
                                          
                                             reikiamo tikslumo svarstyklės (t. y. ± 0,5 mg tikslumo).
                                          
                                       
                           
                        Vanduo
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame bandomoji rūšis gali ilgai gyventi ir augti. Jo kokybė turėtų būti pastovi visą bandymų trukmę. Vandens pH vertė turėtų būti 6,5–8,5, tačiau, atliekant konkretų bandymą, pH vertė neturėtų pakisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Siekiant užtikrinti, kad skiedimo vanduo netinkamai nepaveiktų bandymo rezultatų (pvz., sudarydamas kompleksus su bandomąja chemine medžiaga), tam tikrais intervalais turėtų būti imami mėginiai analizei atlikti. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ir Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– ir SO4
                                    2-), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų bendrojo kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turėtų būti atliekama, pvz., kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei būtų įrodyta, kad vandens kokybė išlieka pastovi bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai – padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens cheminės savybės pateiktos 3 priedėlyje.
                              
                           
                        Bandymų tirpalai
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Pasirinktos koncentracijos bandymo tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinį tirpalą geriau ruošti tiesiog maišant ar plakant bandomąją cheminę medžiagą skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Nerekomenduojama naudoti tirpiklinio nešiklio. Tačiau jei tirpiklis yra būtinas, lygiagrečiai reikėtų bandyti kontrolinį tirpiklio ėminį, kurio koncentracija atitinka ėminių su chemine medžiaga tirpiklio koncentraciją. Sunkiai bandomoms cheminėms medžiagoms tirpiklis gali būti geriausias techninis sprendimas; informacijos reikėtų ieškoti EBPO rekomendaciniame dokumente apie sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (23). Tirpiklis bus pasirinktas pagal cheminės medžiagos ar mišinio chemines savybes. EBPO rekomendaciniame dokumente rekomenduojama ne didesnė kaip 100 μl/l koncentracija ir šios rekomendacijos reikėtų laikytis. Tačiau neseniai pateiktoje apžvalgoje (24) atkreiptas dėmesys į papildomas problemas, kai tiriant endokrininį aktyvumą naudojami tirpikliai. Todėl prireikus naudoti tirpiklį rekomenduojama kiek įmanoma mažinti jo koncentraciją, jei tai techniškai įmanoma (atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Bus naudojama dinaminė bandymų sistema. Naudojant tokią sistemą (pvz., dozavimo siurblį, proporcingojo skiedimo sistemą, prisotinimo sistemą), pradinis bandomosios cheminės medžiagos tirpalas visą laiką dozuojamas ir skiedžiamas, kad bandymo kamerose būtų reikiamos koncentracijos verčių serijos tirpalai. Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turėtų būti tikrinami tam tikrais laiko tarpais, pageidautina kasdien, ir per visą bandymą neturėtų skirtis daugiau kaip 10 %. Reikėtų vengti naudoti nekokybiškus plastmasinius vamzdelius ar kitas medžiagas, kurios gali turėti biologiškai veiklių cheminių medžiagų. Renkantis dinaminei bandymų sistemai tinkamą medžiagą, reikėtų atsižvelgti į galimą bandomosios cheminės medžiagos adsorbciją ant šios medžiagos.
                              
                           
                        Žuvų laikymas
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Pasirenkamos vienos laboratorinės populiacijos ir geriau to paties neršto žuvys, kurios bent dvi savaites prieš bandymą būtų aklimatizuojamos į bandymo sąlygas panašiomis vandens kokybės ir apšvietimo sąlygomis. Svarbu, kad įkrova ir žuvų tankis (apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje) atitiktų naudojamą bandymų rūšį (žr. 2 priedėlį).
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Po 48 h stabilizacijos laikotarpio, registruojamas gaištamumas ir taikomi tokie kriterijai:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             populiacijos gaištamumas per septynias paras yra didesnis kaip 10 % – visa partija atmetama;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             jei populiacijos gaištamumas per septynias paras 5–10 %, aklimatizuojama dar septynias paras ir, jei gaištamumas per kitas septynias paras didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             populiacijos gaištamumas per septynias paras yra mažesnis kaip 5 % – partija priimama.
                                          
                                       
                           
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Aklimatizacijos, parengiamuoju arba veikimo chemine medžiaga laikotarpiais žuvys neturėtų būti gydomos nuo ligų.
                              
                           
                        Parengiamasis laikotarpis ir žuvų atranka
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Rekomenduojama parengiamojo laikotarpio trukmė – viena ar dvi savaitės, jo metu gyvūnai laikomi induose, kurie būtų panašūs į naudojamus atliekant patį bandymą. Visą laikymo laikotarpį ir veikimo chemine medžiaga tarpsniu žuvys turėtų būti maitinamos iki soties. Veikimo tarpsnis pradedamas iš laboratorijos turimų poravimuisi subrendusių gyvūnų atsargų atrenkant lytiškai dimorfiškas (pvz., turinčias aiškius antrinius lytinius požymius, kurie juodosios drūtagalvės rainės ir medakos atveju yra matomi) ir aktyviai neršiančias suaugusias žuvis. Tik dėl bendrosios orientacijos (nevertinant atskirai nuo stebimos konkrečios žuvų partijos tikrosios reprodukcinės būklės) juodosios drūtagalvės rainės turėtų būti maždaug 20 (± 2) savaičių amžiaus, darant prielaidą, kad visą savo gyvavimo laikotarpį jos augo 25 ± 2 °C temperatūroje. Japoninės medakos turėtų būti maždaug 16 (± 2) savaičių amžiaus, darant prielaidą, kad visą savo gyvavimo laikotarpį jos augo 25 ± 2 °C temperatūroje. Zebrinės danijos turėtų būti maždaug 16 (± 2) savaičių amžiaus, darant prielaidą, kad visą savo gyvavimo laikotarpį jos buvo auginamos 26 ± 2 °C temperatūroje. Parengiamuoju veikimo tarpsniu ikrų gamyba turėtų būti vertinama kasdien. Nerštą rekomenduojama stebėti visuose kartotinių ėminių induose prieš pradedant veikimo bandomąja medžiaga tarpsnį. Šioje stadijoje negalima pateikti pageidautinų kiekybinių kasdienio neršto duomenų, tačiau yra įprasta stebėti, kad kiekvienos rūšies vidutinis nerštas yra > 10 ikrų/patelei/per parą. Reikėtų naudoti atsitiktinio išdėstymo blokinę schemą, kai kartotiniai ėminiai atsitiktinai priskiriami įvairioms bandymų dozėms pagal ikrų gamybos išeigą, kad būtų užtikrintas subalansuotas kartotinių ėminių paskirstymas.
                              
                           BANDYMO SCHEMA
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Naudojami trijų bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių ėminiai, taip pat vienas (vandens) kontrolinis ėminys ir, jei reikia, vienas tirpiklio kontrolinis ėminys. Duomenys gali būti analizuojami, kad būtų nustatyti statistiškai reikšmingi chemine medžiaga apdorotų ir kontrolinių ėminių atsako skirtumai. Šie analizės duomenys suteikia informacijos apie tai, ar reikia atlikti papildomus ilgesnės trukmės cheminės medžiagos bandymus, siekiant nustatyti nepageidaujamą poveikį (t. y. išgyvenamumui, vystymuisi, augimui ir reprodukcijai), o ne tik naudoti šiuos duomenis rizikai vertinti (25).
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 21-ą bandymų parą imami kiekvienos bandomosios medžiagos dozės (penki patinai ir penkios patelės dviejuose kartotinių ėminių induose) ir kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) zebrinės danijos patinų ir patelių ėminiai vitelogenino kiekiui nustatyti. 21-ą bandymų parą imami kiekvienos bandomosios medžiagos dozės (trys patinai ir trys patelės keturiuose kartotinių ėminių induose) ir kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) medakos patinų ir patelių ėminiai vitelogenino kiekiui ir antriniams lytiniams požymiams nustatyti. 21-ą parą imami kiekvienos bandomosios medžiagos dozės (du patinai ir keturios patelės keturiuose kartotinių ėminių induose) ir kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) juodosios drūtagalvės rainės patinų ir patelių ėminiai vitelogenino kiekiui ir antriniams lytiniams požymiams nustatyti. Būtina kiekybiškai nustatyti vislumą, o lytinės liaukos fiksuojamos su visu kūnu arba išpjautos, kad, jei reikia, būtų galima atlikti histopatologinį įvertinimą.
                              
                           
                        Bandymų koncentracijos verčių parinkimas
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Šiame bandyme didžiausia bandymo koncentracija turėtų atitikti didžiausią toleruojamą koncentraciją (DTK), nustatytą atliekant ribinį bandymą arba pagal kitus toksiškumo duomenis, arba 10 mg/l ar didžiausio tirpumo vandenyje koncentracija, jei ji mažesnė. DTK apibrėžiama kaip cheminės medžiagos didžiausia bandymo koncentracija, kuriai esant žuvų gaištamumas yra mažesnis nei 10 %. Taikant tokį metodą, daroma prielaida, kad yra empiriniai ūmaus toksiškumo ar kiti toksiškumo duomenys, pagal kuriuos galima apskaičiuoti DTK. DTK gali būti sunku tiksliai nustatyti, todėl paprastai reikia profesinio sprendimo.
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Reikia naudoti ne mažiau kaip tris bandymų koncentracijos vertes, kurių skirtumo pastovus faktorius būtų ne didesnis kaip 10, ir skiedimo vandens kontrolinį ėminį. Rekomenduojamas faktorių intervalas yra nuo 3,2 iki 10.
                              
                           PROCEDŪRA
                     
                        Bandymų žuvų atranka ir svėrimas
                     
                     
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Svarbu, kad žuvų masės skirtumas bandymų pradžioje būtų kuo mažesnis. Šiam bandymui atlikti rekomenduojamų įvairių žuvų rūšių tinkamo dydžio ribos pateiktos 2 priedėlyje. Bandymams naudotos visos žuvų partijos patinų ir patelių atskiro gyvūno masė bandymo pradžioje, jei įmanoma, neturėtų skirtis nuo tos pačios lyties masės aritmetinio vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Vidutinei masei nustatyti rekomenduojama prieš bandymą pasverti žuvų populiacijos poėminį.
                              
                           
                        Veikimo sąlygos
                     
                     
                        Trukmė
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Bandymo trukmė po parengiamojo laikotarpio – 21 para. Rekomenduojama parengiamojo laikotarpio trukmė – viena arba dvi savaitės.
                              
                           
                        Maitinimas
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Siekiant palaikyti gerą kūno būklę, žuvis reikėtų maitinti tinkamu maistu iki soties (2 priedėlis) ir pakankamai dažnai. Reikėtų imtis priemonių išvengti mikrobų dauginimosi ir vandens drumstumo. Apskritai rekomenduojama paros davinį padalyti į dvi ar tris lygias dalis, kad žuvys maisto davinį gautų kelis kartus per parą, bet ne dažniau kaip kas tris valandas. Priimtinas vienas didesnis davinys – ypač savaitgaliais. Žuvų nereikėtų maitinti 12 h prieš ėminių ėmimą ar skrodimą.
                              
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Reikėtų patikrinti, ar žuvų pašare nėra teršalų, pvz., chloro organinių pesticidų, policiklinių aromatinių angliavandenilių (PAA) ar polichlorintųjų bifenilų (PCB). Reikėtų vengti maisto, kuriame būtų didesnis fitoestrogenų kiekis, nes taip būtų iškreiptas tyrimo atsakas į žinomą estrogenų agonistą (pvz., 17-beta estradiolį).
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Nesuėstą maistą ir išmatas iš bandymo indų reikėtų šalinti bent du kartus per savaitę, pvz., kruopščiai valant kiekvienos talpyklos dugną siurbliu.
                              
                           
                        Šviesa ir temperatūra
                     
                     
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Šviesiojo laikotarpio trukmė ir vandens temperatūra turėtų atitikti bandymo rūšį (žr. 2 priedėlį).
                              
                           
                        Analizinių nustatymų ir matavimų dažnumas
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Prieš veikimo bandomąja medžiaga laikotarpio pradžią reikėtų įsitikinti, ar cheminės medžiagos tiekimo sistema veikia tinkamai. Reikėtų turėti visus reikiamus analizės metodus, taip pat turėti pakankamai duomenų apie cheminės medžiagos stabilumą bandymų sistemoje. Atliekant bandymą, bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės reguliariais intervalais nustatomos taip: skiediklio ir toksinės cheminės medžiagos srautą pageidautina tikrinti kasdien, bet ne rečiau kaip du kartus per savaitę, ir visą bandymų laiką neturėtų skirtis daugiau kaip 10 %. Faktinę bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją visuose induose rekomenduojama matuoti bandymo pradžioje, o vėliau – kas savaitę.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Rekomenduojama rezultatus pagrįsti išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Tačiau, jei bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tirpale per visą bandymą buvo tinkamai užtikrinama ± 20 % tikslumu, rezultatus galima pagrįsti nominaliosiomis arba išmatuotomis vertėmis.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Ėminius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akučių filtrą) ar centrifuguoti. Jei reikia atskirti, rekomenduojama procedūra yra centrifugavimas. Tačiau, jei filtras bandomosios medžiagos neadsorbuoja, priimtinas būtų ir filtravimas.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Atliekant bandymą, visuose bandymo induose bent kartą per savaitę reikėtų matuoti ištirpusį deguonį, temperatūrą ir pH. Bendras kietumas ir šarmingumas kontrolinių ėminių induose ir viename inde su didžiausia koncentracija turėtų būti matuojami bent kartą per savaitę. Bent viename bandymų inde temperatūrą reikėtų kontroliuoti nuolat.
                              
                           
                        Stebėjimai
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Tyrimo laikotarpiu arba jam pasibaigus vertinami tam tikri bendrieji (pvz., išgyvenamumo) ir pagrindiniai biologiniai atsakai (pvz., vitelogenino koncentracija). Kasdien reikia atlikti kiekybinę vislumo stebėseną. Šių vertinamųjų baigčių matavimas ir įvertinimas bei jų naudingumas aprašyti toliau.
                              
                           
                        Išgyvenamumas
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Bandymo laikotarpiu žuvis reikėtų tirti ir jų gaištamumą registruoti kasdien, o nugaišusias žuvis reikėtų kuo greičiau pašalinti. Kontrolinių ar apdorojamų ėminių induose nugaišusių žuvų nereikėtų pakeisti kitomis. Bandymų metu nugaišusių žuvų lytis turėtų būti nustatyta atliekant makroskopinį lytinių liaukų patikrinimą.
                              
                           
                        Elgesys ir išvaizda
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Reikėtų atkreipti dėmesį į visas elgesio anomalijas (palyginti su kontrolinių ėminių gyvūnais); tai galėtų būti bendrojo toksiškumo požymiai, įskaitant hiperventiliaciją, nekoordinuotą plaukimą, pusiausvyros praradimą ir netipišką nejudamumą ar mitybą. Taip pat reikėtų atkreipti dėmesį į papildomas išorines anomalijas (pvz., kraujavimą, spalvos pakeitimą). Atliekant duomenų vertinimą, į tokius toksiškumo požymius reikėtų ypač atkreipti dėmesį, nes jie gali rodyti tokias koncentracijos vertes, kurioms esant biologiniai endokrininio aktyvumo žymenys nėra patikimi. Atliekant tokius elgesio stebėjimus, taip pat galima gauti naudingos kokybinės informacijos, pagal kurią ateityje būtų galima nustatyti galimus žuvų bandymų reikalavimus. Pvz., stebint juodąsias drūtagalves raines, pastebėta, kad androgenų veikiamiems normaliems patinams arba patino požymių įgijusioms patelėms pasireiškia teritorinė agresija; stebint zebrines danijas, nustatyta, kad jas veikiant estrogenais arba antiandrogenais sumažėja arba sutrinka joms būdingo su pirmais saulės spinduliais prasidedančio poravimosi ir neršto aktyvumas.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Dėl to, kad kai kurie išvaizdos aspektai (visų pirma, spalva) apdorojant žuvis gali greitai pasikeisti, prieš išimant žuvis iš bandymo sistemos svarbu atlikti kokybinius stebėjimus. Ligšiolinė juodosios drūtagalvės rainės stebėjimo patirtis rodo, kad kai kurios endokrininę sistemą veikiančios cheminės medžiagos iš pradžių gali sukelti šių išorės savybių pokyčius: kūno spalvos (šviesios ar tamsios), spalvų rašto (t. y. vertikalių dryžių atsiradimą) ir kūno formos (t. y. galvos ir krūtinės srities formos). Todėl žuvų fizinę išvaizdą reikia stebėti viso bandymo metu ir jo pabaigoje.
                              
                           
                        Vislumas
                     
                     
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Kasdienius kiekybinius neršto duomenis reikėtų registruoti pagal kartotinius ėminius. Ikrų gamybą reikėtų registruoti kaip ikrų skaičių vienai išgyvenusiai patelei per parą pagal kartotinius ėminius. Ikrai iš bandymų kamerų pašalinami kasdien. Neršto substratus reikėtų dėti į juodosios drūtagalvės rainės ir zebrinės danijos bandymų kamerą, kad žuvys galėtų neršti normaliomis sąlygomis. 4 priedėlyje pateikta papildoma informacija apie rekomenduojamus zebrinės danijos (4A priedėlis) ir juodosios drūtagalvės rainės (4B priedėlis) neršto substratus. Nemanoma, kad neršto substratas yra būtinas medakai.
                              
                           
                        Humaniškas žuvų numarinimas
                     
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 21 parą, t. y. pasibaigus veikimo laikotarpiui, žuvį reikėtų numarinti atitinkamu kiekiu 100–500 mg/l trikaino (trikaino metansulfonato, metakaino, MS-222 (CAS 886-86-2)) tirpalu 300 mg/l NaHCO3 (natrio hidrokarbonato, CAS 144-55-8) buferiniame tirpale, skirtu gleivinės dirginimui sumažinti; vitelogenino kiekiui nustatyti imami kraujo ar audinių ėminiai, kaip paaiškinta skirsnyje Vitelogeninas.
                              
                           
                        Antrinių lytinių požymių stebėjimas
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Kai kurios endokrininę sistemą veikiančios cheminės medžiagos gali sukelti rūšims būdingų antrinių lytinių požymių (juodosios drūtagalvės rainės patino poravimosi gumburėlių, medakos patino spenelinių ataugų skaičiaus) pokyčius. Visų pirma, dėl pagal tam tikrus mechanizmus veikiančių cheminių medžiagų priešingos lyties gyvūnams gali atsirasti anomalūs antriniai lytiniai požymiai; pvz., veikiant androgenų receptorių agonistams, tokiems kaip trenbolonas, metiltestosteronas ir dihidrotestosteronas, juodosios drūtagalvės rainės patelėms gali išsivystyti aiškiai išreikšti poravimosi gumburėliai, o medakos patelėms – spenelinės ataugos (11, 20, 21). Taip pat buvo pranešimų, kad estrogenų receptorių agonistai gali sumažinti juodosios drūtagalvės rainės suaugusių patinų poravimosi gumburėlių skaičių ir sprando pagalvėlės dydį (26, 27). Atliekant tokius makroskopinius morfologinius stebėjimus, galima gauti naudingos kokybinės ir kiekybinės informacijos, pagal kurią ateityje būtų galima nustatyti galimus žuvų bandymų reikalavimus. Juodosios drūtagalvės rainės poravimosi gumburėlių ir medakos spenelinių ataugų skaičių ir dydį galima nustatyti tiesiogiai, atliekant bandymą, arba tikslesniu būdu – iš išsaugotų bandinių. Rekomenduojamos juodosios drūtagalvės rainės ir medakos antrinių lytinių požymių vertinimo procedūros pateiktos 5A ir 5B priedėliuose.
                              
                           
                        Vitelogeninas (VTG)
                     
                     
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Kraujas paimamas iš uodegos arterijos ar venos, naudojant heparinizuotą kapiliarinį mikrohematokrito vamzdelį, arba švirkštu atliekant širdies punkciją. Atsižvelgiant į žuvies dydį, iš kiekvienos juodosios drūtagalvės rainės paprastai paimama po 5–60 μl, o iš kiekvienos zebrinės danijos – po 5–15 μl kraujo. Plazma nuo kraujo atskiriama centrifugavimu ir iki vitelogenino nustatymo analizės kartu su proteazės inhibitoriais laikoma – 80 °C temperatūroje. Arba kaip audinių šaltinis medakos VTG kiekiui nustatyti naudojamos kepenys, o zebrinės danijos atveju gali būti naudojamas galvos ir (arba) uodegos homogenatas (6 priedėlis). VTG reikėtų matuoti taikant patvirtintą homologinį IFA metodą, naudojant homologinį VTG standartą ir homologinius antikūnus. Rekomenduojama taikyti metodą, kuriuo VTG kiekį plazmoje galima aptikti ng/ml eilės (arba audiniuose – ng/mg eilės), nes tai yra foninė koncentracija chemine medžiaga neapdoroto žuvies patino organizme.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Vitelogenino analizės kokybės kontrolė atliekama naudojant cheminių medžiagų etalonus ir atliekant tuščiųjų ėminių bei ne mažiau kaip dviejų kartotinių ėminių analizę. Kiekvienam IFA metodui reikėtų atlikti matricos efekto (ėminio skiedimo efekto) bandymą mažiausiam ėminio skiedimo faktoriui nustatyti. Kiekvienoje VTG tyrimams naudojamoje IFA plokštelėje turėtų būti šie kokybės kontrolės ėminiai: bent šeši kalibravimo etalonai, kurie aprėptų numatomų vitelogenino koncentracijos verčių diapazoną, ir bent vienas tuščiasis nespecifinio surišimo ėminys (analizuojami du kartotiniai ėminiai). Šių tuščiųjų ėminių optinis tankis turėtų būti mažesnis nei 5 % didžiausios koncentracijos kalibravimo etalono optinio tankio. Analizuojamos bent dvi alikvotinės kiekvienos skiedimo koncentracijos ėminio (kartotiniai duobučių ėminiai). Jei kartotinių duobučių ėminių koncentracija skiriasi daugiau kaip 20 %, analizę reikėtų pakartoti.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Kalibravimo kreivių koreliacijos koeficientas (R2) turėtų būti didesnis kaip 0,99. Tačiau didelės koreliacijos nepakanka tiksliai visų intervalų koncentracijos prognozei užtikrinti. Reikėtų užtikrinti ne tik pakankamai didelę kalibravimo kreivės verčių koreliaciją, bet ir pagal kalibravimo kreivę apskaičiuota kiekvieno etalono koncentracija turėtų būti 70–120 % jo nominaliosios koncentracijos vertės. Jei nominaliosios koncentracijos vertės tolsta nuo kalibravimo kreivės regresijos linijos (pvz., esant mažesnei koncentracijai), gali tekti kalibravimo kreivę padalyti į mažų ir didelių verčių intervalus arba taikyti netiesinį modelį, kad būtų galima tinkamai priderinti optinio tankio duomenis. Jei kreivė padalijama, abiejų tiesiųjų atkarpų R2 > 0,99.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Aptikimo riba apibrėžiama kaip mažiausios koncentracijos analizės etalono koncentracija, o kiekybinio nustatymo riba – kaip mažiausios koncentracijos analizės etalono koncentracija, padauginta iš mažiausio skiedimo faktoriaus.
                              
                           
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Kiekvieną dieną atliekant VTG tyrimus analizuojamas sodrintas ėminys, paruoštas naudojant tyrimų serijos pamatinį etaloną (7 priedėlis). Numatomos ir išmatuotos koncentracijos verčių santykis pateikiamas ataskaitoje kartu su kiekvienos tą dieną atliktų tyrimų grupės rezultatais.
                              
                           
                        Lytinių liaukų histopatologijos įvertinimas
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Priežiūros institucijos gali pareikalauti atlikti lytinių liaukų histopatologijos įvertinimą, kad būtų ištirtas PHL ašies tikslinis organas, jį paveikus chemine medžiaga. Šiuo tikslu lytines liaukos fiksuojamos su visu kūnu arba išpjautos. Kai reikalaujama atlikti histopatologiją, vertinant bandomosios cheminės medžiagos endokrininį aktyvumą bus ieškoma su endokrinine sistema susijusių specifinių lytinių liaukų atsakų. Šiuos diagnostinius atsakus dažniausiai sudaro sėklidžių oocitų buvimas, Leidigo ląstelių hiperplazija, trynio susidarymo sulėtėjimas, padidėjusi spermatogonija ir perifolikulinė hiperplazija. Kitų lytinių liaukų pažeidimų, pvz., oocitų atrezijos, sėklidžių išsigimimo ir stadijos pasikeitimų priežastys gali būti įvairios. Rekomendaciniame dokumente apie žuvų lytinių liaukų histopatologiją nurodytos procedūros, kurios būtų taikomos atliekant lytinių liaukų preparavimą, fiksavimą, pjūvių gamybą ir histopatologinį įvertinimą (22).
                              
                           DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Biologinių žymenų atsako vertinimas taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodą
                     
                     
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Nustatant galimą cheminės medžiagos aktyvumą endokrininės sistemos atžvilgiu lyginami apdorotų ir kontrolinių grupių atsakai taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodą. Jei naudojamas tirpiklio kontrolinis ėminys, reikėtų atlikti tinkamą statistinę skiedimo vandens ir tirpiklio kontrolinių ėminių skirtumo analizę atsižvelgiant į visas vertinamąsias baigtis. Rekomendacijas dėl praskiesto vandens ir tirpiklio kontrolinių ėminių duomenų apdorojimo atliekant paskesnę statistinę analizę, galima rasti EBPO dokumente (2006c) (28). Visi biologinio atsako duomenys turėtų būti analizuojami ir pateikiami atskirai pagal lytį. Jei parametriniams metodams taikyti reikiamos prielaidos nepasitvirtina, t. y. nenormalus pasiskirstymas (pvz., Shapiro-Wilk kriterijus) ar nevienalytė dispersija (Bartlett kriterijus arba Levene kriterijus), reikėtų atsižvelgti į galimybę transformuoti duomenis dispersijoms homogenizuoti prieš atliekant ANOVA arba svertinę ANOVA. Jei dozės ir atsako priklausomybė yra nemonotoniška, daugybiniam lyginimui paporiui gali būti taikomas Dunnett kriterijus (parametrinis) arba Mann-Whitney kriterijus su Bonferroni pataisa (neparametrinis). Galima taikyti kitus kriterijus (pvz., Jonckheere-Terpstra kriterijų arba Williams kriterijų), jei dozės ir atsako priklausomybė yra maždaug monotoniška. Siekiant padėti apsispręsti, kurį statistinį kriterijų geriausia taikyti, 8 priedėlyje pateikta statistinė struktūrinė diagrama. Papildomos informacijos taip pat galima gauti iš OECD dokumento Dabartiniai ekotoksiškumo duomenų statistinės analizės metodai (28).
                              
                           
                        Rezultatų ataskaita
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Tyrimo duomenis turėtų sudaryti ši informacija:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymus atliekanti įstaiga:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         atsakingi darbuotojai ir jų pareigos atliekant tyrimą;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekviena laboratorija turėtų įrodyti savo kvalifikaciją, naudodama reprezentatyviųjų cheminių medžiagų grupę.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandomoji cheminė medžiaga:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandomosios cheminės medžiagos apibūdinimas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fizinė būsena ir atitinkamos fizikinės ir cheminės savybės;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymų koncentracijos verčių tirpalų paruošimo metodas ir dažnumas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         informacija apie stabilumą ir biologinį skaidumą.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Tirpiklis:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tirpiklio apibūdinimas (tipas, naudojama koncentracija);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tirpiklio pasirinkimo pagrindimas (jei ne vanduo).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymų gyvūnai:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rūšis ir veislė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tiekėjas ir speciali tiekėjo įranga;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         žuvų amžius bandymų pradžioje ir reprodukcinė ar neršto būklė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         išsamūs duomenys apie gyvūnų aklimatizavimo procedūrą;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         žuvų (iš veislinių žuvų poėminio) kūno masė veikimo pradžioje.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymų sąlygos
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         taikyta bandymų procedūra (bandymų tipas, įkrova, įkrovos tankis ir kt.);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         pradinių tirpalų paruošimo metodas ir srautas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nominaliosios bandymo koncentracijos vertės, kas savaitę matuojamos bandymo tirpalų koncentracijos vertės, taikomas analizės metodas, bandymų indams gauti išmatuotų verčių vidurkiai bei standartiniai nuokrypiai ir įrodymai, kad matavimai atitinka bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją tikrajame tirpale;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         skiedimo vandens savybės (įskaitant pH, kietumą, šarmingumą, temperatūrą, ištirpusio deguonies koncentraciją, liekamojo chloro kiekį, bendrąją organinę anglį, suspenduotų kietųjų dalelių kiekį ir visus kitus atliktus matavimus);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymų indų vandens kokybė, pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         išsami informacija apie maitinimą (pvz., maisto (-ų) rūšis, šaltinis, duodamas kiekis, maitinimo dažnumas ir, jei yra, atitinkamų teršalų (polichlorintųjų bifenilų, policiklinių aromatinių angliavandenilių ir chloro organinių pesticidų) analizės rezultatai.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rezultatai:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         įrodymai, kad kontroliniai ėminiai atitiko bandymo priimtinumo kriterijus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         duomenys apie gaištamumą induose su kuria nors bandymo koncentracija ir kontroliniame inde;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         taikyti statistiniai analizės metodai, duomenų apdorojimas ir taikomų metodų pagrindimas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bendrųjų morfologinių stebėjimų duomenys, įskaitant apie antrinius lytinius požymius, ikrų gamybą ir VTG;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         duomenų analizių rezultatai, pageidautina – lentelių ir grafikų forma;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         neįprastų žuvų reakcijų dažnumas ir bandomosios cheminės medžiagos sukeltas matomas poveikis.
                                                      
                                                   
                                       
                           BANDYMŲ REZULTATŲ AIŠKINIMO IR PRIĖMIMO REKOMENDACIJOS
                     
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Šiame skirsnyje pateikti keli aspektai, į kuriuos reikia atsižvelgti aiškinant įvairių vertinamųjų baigčių matavimo atliekant bandymą rezultatus. Rezultatus reikėtų vertinti atsargiai, jei atrodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukėlė akivaizdų toksiškumą arba paveikė bendrąją bandymo gyvūno būklę.
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Nustatant bandymo koncentracijos verčių intervalą, reikėtų stengtis neviršyti didžiausios toleruojamos koncentracijos, kad duomenų aiškinimas būtų prasmingas. Svarbu naudoti bent vieną cheminės medžiagos koncentraciją, dėl kurios neatsiranda toksinio poveikio požymių. Ligos ir toksinio poveikio požymius reikėtų atidžiai vertinti ir pateikti ataskaitoje. Pvz., gali būti taip, kad VTG gamybai patelių organizme įtakos taip pat gali turėti bendrasis toksiškumas, o ne endokrininio toksinio poveikio mechanizmai (pvz., toksinis poveikis kepenims). Tačiau poveikio aiškinimas gali tapti patikimesnis naudojant kitas cheminės medžiagos dozes, kurios nėra susijusios su sisteminiu toksiškumu.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Yra keli aspektai, kuriuos reikia apsvarstyti prieš priimant bandymų rezultatus. Reikėtų orientuotis pagal aiškų VTG koncentracijos kontrolinėse patinų ir patelių grupėse skirtumą, kuris juodosios drūtagalvės rainės bei zebrinės danijos atveju turėtų būti maždaug trijų eilių, o medakos – maždaug vienos eilės. Verčių, kurios pasitaiko kontrolinėse ir doze veikiamose grupėse, intervalo pavyzdžiai pateikti tinkamumo patvirtinimo ataskaitose (1, 2, 3, 4). Esant dideliems VTG kiekiams kontrolinių patinų organizme, galėtų sumažėti bandymo jautris ir gebėjimas aptikti silpnus estrogenų agonistus. Esant mažiems VTG kiekiams kontrolinių patelių organizme, galėtų sumažėti bandymo jautris ir gebėjimas aptikti aromatazės inhibitorius ir estrogenų antagonistus. Šioms rekomendacijoms parengti buvo atlikti tinkamumo patvirtinimo tyrimai.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Kalbant apie ikrų gamybos kiekybinį įvertinimą, jų kiekis gali labai stipriai skirtis (variacijos koeficientas (VK) gali būti 20–60 %), ir tai gali mažinti bandymo gebėjimą aptikti reikšmingą ikrų gamybos sumažėjimą, jei jis yra mažesnis kaip 70 %, VK artėjant prie 50 % ar didesnės vertės. Kai VK yra mažesnių verčių (apie 20–30 %), bandymo galia (80 %) bus pakankama 40–50 % ikrų gamybos sumažėjimui aptikti. Bandymų su juodąja drūtagalve raine schema, naudojant keturis kartotinius vienos bandomosios medžiagos dozės ėminius užtikrintų didesnę galią vislumo vertinamajai baigčiai palyginti su bandymų schema naudojant tik du kartotinius ėminius.
                              
                           
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Jei laboratorija anksčiau nė karto nebuvo atlikusi tokio bandymo arba buvo padaryti reikšmingi pakeitimai (pvz., pakeista žuvų veislė ar tiekėjas), patartina atlikti techninės kvalifikacijos tyrimą. Rekomenduojama naudoti chemines medžiagas, kurios veiktų keliais būdais arba turėtų poveikį kelioms bandymo vertinamosioms baigtims. Praktiniu požiūriu kiekvienai laboratorijai rekomenduojama kurti savo istorinių kontrolinių ėminių duomenų patinams ir patelėms bazę ir atlikti estrogeninio aktyvumo bandymus su teigiama kontroline chemine medžiaga (pvz., 17β-estradioliu, 100 ng/l, arba žinomu silpnu agonistu), dėl kurios padidėja VTG kiekis žuvų patinų organizme, su aromatazę slopinančia teigiama kontroline chemine medžiaga (pvz., fadrozolu arba prochlorazu, 300 μg/l), dėl kurios sumažėja VTG kiekis žuvų patelių organizme, ir su androgeninio aktyvumo teigiama kontroline chemine medžiaga (pvz., 17β-trenbolonu, 5 ng/l), dėl kurios juodosios drūtagalvės rainės ir medakos patelės įgauna antrinių lytinių požymių. Visus šiuos duomenis galima palyginti su turimais tinkamumo patvirtinimo tyrimų (1, 2, 3) duomenimis, kad būtų užtikrinta laboratorijos kvalifikacija.
                              
                           
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Apskritai VTG matavimus reikėtų laikyti teigiamais, jei VTG kiekis statistiškai reikšmingai padidėja patinų organizme (p < 0,05) arba statistiškai reikšmingai sumažėja patelių organizme (p < 0,05) bent didžiausiai bandytai dozei, palyginti su kontroline grupe, ir nėra bendrojo toksiškumo požymių. Teigiamas rezultatas dar patvirtinamas įrodant, kad dozės ir atsako priklausomybės kreivė yra biologiškai pagrįsta. Kaip nurodyta pirmiau, VTG kiekio sumažėjimas gali būti ne vien endokrininės kilmės, tačiau teigiamas rezultatas paprastai turėtų būti aiškinamas kaip poveikio endokrininei sistemai in vivo įrodymas, o tokiu atveju paprastai turėtų būti imtasi veiksmų papildomai informacijai gauti.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Priežiūros institucijos gali pareikalauti atlikti lytinių liaukų histopatologijos įvertinimą, kad būtų nustatytas bandymo gyvūnų reprodukcinis tinkamumas ir kad būtų galima atlikti bandymų rezultatų įrodomosios duomenų galios vertinimą. Lytinių liaukų histopatologijos gali neprireikti tais atvejais, kai VTG arba antrinių lytinių požymių rezultatas yra teigiamas (pvz., VTG padidėja ar sumažėja, atsiranda antriniai lytiniai požymiai).
                              
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (accessed 18/09/08).
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 US EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 pp.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, Paris.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Sumpter J.P. and S. Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives; 103 Suppl 7:173-8 Review.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Pawlowski S., et al. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3):277-91.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Andersen L., et al (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3-4):343-52.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences; 67(1):121-30.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1):11-21.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Parks L.G., et al. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (1999). Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG research report reference AQ001. CEFIC, Brussels, Belgium.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Fenske M., et al. (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217-232.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Holbech H., et al. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Rose J., et al. (2002). Vitellogenin induction by 17b-estradiol and 17a-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. 131: 531-539.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brion F., et al. (2002). Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699-1708.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Yokota H., et al. (2001). Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87–98.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Tatarazako N., et al. (2004). Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50:301-308.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350-60.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Seki M, et al (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23(3):774-81.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 OECD (2010). Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 123, Paris.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006a). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006b). Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as „signposts,“ not „traffic lights,“ in risk assessment. Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1:106-14.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Miles-Richardson S.R., et al. (1999). Effects of waterborne exposure to 17β -estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129-145.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 Martinovic D., et al. (2008). Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27, 478-488.
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2006c), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 US EPA (2008), Peer-Review Results for the Fish Short-Term Reproduction Assay, dated 30 January 2008, US Environmental Protection Agency, Washington DC. 110 pp.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150, OECD, Paris.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        SANTRUMPOS IR APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              VK
                           – variacijos koeficientas.
                        
                           
                              IFA
                           – imunofermentinė analizė.
                        
                           
                              PHL ašis
                           – pagumburio, hipofizės ir lytinių liaukų ašis.
                        
                           
                              Įkrova
                           – drėgnų žuvų masė vandens tūrio vienete.
                        
                           
                              DTK
                           – didžiausia toleruojama koncentracija, atitinkanti maždaug 10 % LC50.
                        
                           
                              Žuvų tankis
                           – žuvų skaičius, tenkantis vandens tūrio vienetui.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              VTG
                           – vitelogeninas yra fosfolipoglikoproteininis kiaušinio trynio baltymų pirmtakas, kurio paprastai yra visų kiaušinius dedančių gyvūnų rūšių lytiškai aktyvių patelių organizme.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           BANDYMO SĄLYGOS ATLIEKANT POVEIKIO ŽUVŲ ENDOKRININEI SISTEMAI ATRANKOS TYRIMĄ
                        
                        
                                    
                                                1.
                                             
                                             
                                                Rekomenduojamos rūšys
                                             
                                          
                                 
                                    Juodoji drūtagalvė rainė
                                    (Pimephales promelas)
                                 
                                 
                                    Medaka
                                    (Oryzias latipes)
                                 
                                 
                                    Zebrinė danija
                                    (Danio rerio)
                                 
                              
                                    
                                                2.
                                             
                                             
                                                Bandymo tipas
                                             
                                          
                                 
                                    Dinaminis
                                 
                                 
                                    Dinaminis
                                 
                                 
                                    Dinaminis
                                 
                              
                                    
                                                3.
                                             
                                             
                                                Vandens temperatūra
                                             
                                          
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    26 ± 2 °C
                                 
                              
                                    
                                                4.
                                             
                                             
                                                Apšvietimo kokybė
                                             
                                          
                                 
                                    Liuminescencinės lempos (plataus spektro)
                                 
                                 
                                    Liuminescencinės lempos (plataus spektro)
                                 
                                 
                                    Liuminescencinės lempos (plataus spektro)
                                 
                              
                                    
                                                5.
                                             
                                             
                                                Šviesos stipris
                                             
                                          
                                 
                                    10–20 μE/m2/s, 540–1 000  liuksų arba 50–100 ft-c (laboratorijos apšvietimas)
                                 
                                 
                                    10–20 μE/m2/s, 540–1 000  liuksų arba 50–100 ft-c (laboratorijos apšvietimas)
                                 
                                 
                                    10–20 μE/m2/s, 540–1 000  liuksų arba 50–100 ft-c (laboratorijos apšvietimas)
                                 
                              
                                    
                                                6.
                                             
                                             
                                                šviesiojo laikotarpio trukmė (aušros ir sutemų pasikeitimas galimas, bet nelaikomas privalomu)
                                             
                                          
                                 
                                    16 h šviesa, 8 h tamsa
                                 
                                 
                                    12–16 h šviesa, 12–8 h tamsa
                                 
                                 
                                    12–16 h šviesa, 12–8 h tamsa
                                 
                              
                                    
                                                7.
                                             
                                             
                                                Įkrova
                                             
                                          
                                 
                                    < 5 g vienam litrui
                                 
                                 
                                    < 5 g vienam litrui
                                 
                                 
                                    < 5 g vienam litrui
                                 
                              
                                    
                                                8.
                                             
                                             
                                                Bandymų kameros tūris
                                             
                                          
                                 
                                    10 l (mažiausiai)
                                 
                                 
                                    2 l (mažiausiai)
                                 
                                 
                                    5 l (mažiausiai)
                                 
                              
                                    
                                                9.
                                             
                                             
                                                Bandymų tirpalo tūris
                                             
                                          
                                 
                                    8 l (mažiausiai)
                                 
                                 
                                    1,5 l (mažiausiai)
                                 
                                 
                                    4 l (mažiausiai)
                                 
                              
                                    
                                                10.
                                             
                                             
                                                Bandymų tirpalų tūrio keitimo dažnumas
                                             
                                          
                                 
                                    Ne mažiau kaip 6 kartus per parą
                                 
                                 
                                    Ne mažiau kaip 5 kartus per parą
                                 
                                 
                                    Ne mažiau kaip 5 kartus per parą
                                 
                              
                                    
                                                11.
                                             
                                             
                                                Bandymų organizmų amžius
                                             
                                          
                                 
                                    žr. 21 pastraipą
                                 
                                 
                                    žr. 21 pastraipą
                                 
                                 
                                    žr. 21 pastraipą
                                 
                              
                                    
                                                12.
                                             
                                             
                                                Apytikrė suaugusios žuvies drėgno kūno masė (g)
                                             
                                          
                                 
                                    Patelių: 1,5 ± 20 %
                                    Patinų: 2,5 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Patelių 0,35 ± 20 %
                                    Patinų: 0,35 ± 20 %
                                 
                                 
                                    Patelių: 0,65 ± 20 %
                                    Patinų: 0,4 ± 20 %
                                 
                              
                                    
                                                13.
                                             
                                             
                                                Žuvų skaičius viename bandymų inde
                                             
                                          
                                 
                                    6 (2 patinai ir 4 patelės)
                                 
                                 
                                    6 (3 patinai ir 3 patelės)
                                 
                                 
                                    10 (5 patinai ir 5 patelės)
                                 
                              
                                    
                                                14.
                                             
                                             
                                                Bandomosios medžiagos dozių skaičius
                                             
                                          
                                 
                                    = 3 (ir atitinkami kontroliniai ėminiai)
                                 
                                 
                                    = 3 (ir atitinkami kontroliniai ėminiai)
                                 
                                 
                                    = 3 (ir atitinkami kontroliniai ėminiai)
                                 
                              
                                    
                                                15.
                                             
                                             
                                                Vienos dozės indų skaičius
                                             
                                          
                                 
                                    Ne mažiau kaip 4
                                 
                                 
                                    Ne mažiau kaip 4
                                 
                                 
                                    Ne mažiau kaip 2
                                 
                              
                                    
                                                16.
                                             
                                             
                                                Viena bandymo koncentracija veikiamų žuvų skaičius
                                             
                                          
                                 
                                    16 suaugusių patelių ir 8 suaugę patinai (po 4 pateles ir 2 patinus kiekviename kartotinio ėminio inde)
                                 
                                 
                                    12 suaugusių patelių ir 12 suaugę patinai (po 3 pateles ir 3 patinus kiekviename kartotinio ėminio inde)
                                 
                                 
                                    10 suaugusių patelių ir 10 suaugę patinai (po 5 pateles ir 5 patinus kiekviename kartotinio ėminio inde)
                                 
                              
                                    
                                                17.
                                             
                                             
                                                Maitinimo režimas
                                             
                                          
                                 
                                    Gyvos arba šaldytos suaugusios sūriavandenės krevetės arba jų nauplijai (iki soties) du ar tris kartus per parą, pirktinis maistas arba jo derinys
                                 
                                 
                                    Sūriavandenių krevečių nauplijai (iki soties) du ar tris kartus per parą, pirktinis maistas arba jo derinys
                                 
                                 
                                    Sūriavandenių krevečių nauplijai (iki soties) du ar tris kartus per parą, pirktinis maistas arba jo derinys
                                 
                              
                                    
                                                18.
                                             
                                             
                                                Aeravimas
                                             
                                          
                                 
                                    Jokio, nebent ID koncentracija yra mažesnė nei 60 % oro soties vertės
                                 
                                 
                                    Jokio, nebent ID koncentracija yra mažesnė nei 60 % oro soties vertės
                                 
                                 
                                    Jokio, nebent ID koncentracija yra mažesnė nei 60 % oro soties vertės
                                 
                              
                                    
                                                19.
                                             
                                             
                                                Skiedimo vanduo
                                             
                                          
                                 
                                    Švarus paviršinis, šulinio, atkurtasis ar vandentiekio vanduo be chloro
                                 
                                 
                                    Švarus paviršinis, šulinio, atkurtasis ar vandentiekio vanduo be chloro
                                 
                                 
                                    Švarus paviršinis, šulinio, atkurtasis ar vandentiekio vanduo be chloro
                                 
                              
                                    
                                                20.
                                             
                                             
                                                Laikotarpis prieš veikimą
                                             
                                          
                                 
                                    rekomenduojama 7–14 parų
                                 
                                 
                                    rekomenduojama 7–14 parų
                                 
                                 
                                    rekomenduojama 7–14 parų
                                 
                              
                                    
                                                21.
                                             
                                             
                                                Veikimo chemine medžiaga trukmė
                                             
                                          
                                 
                                    21 para
                                 
                                 
                                    21 para
                                 
                                 
                                    21 para
                                 
                              
                                    
                                                22.
                                             
                                             
                                                Biologinės vertinamosios baigtys
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                išgyvenamumas
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                elgesys
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                vislumas
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                antriniai lytiniai požymiai
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                neprivaloma lytinių liaukų histopatologija
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                išgyvenamumas
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                elgesys
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                vislumas
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                antriniai lytiniai požymiai
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                neprivaloma lytinių liaukų histopatologija
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                išgyvenamumas
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                elgesys
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                vislumas
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                neprivaloma lytinių liaukų histopatologija
                                             
                                          
                              
                                    
                                                23.
                                             
                                             
                                                Bandymo priimtinumo kriterijai
                                             
                                          
                                 
                                    Ištirpęs deguonis sudaro ≥ 60 % oro soties vertės; vidutinė temperatūra 25 ± 2 °C; 90 % žuvų išgyvenamumas kontrolinėse grupėse; išmatuotos bandymo koncentracijos vertės skiriasi ne daugiau kaip 20 % kiekvienos koncentracijos išmatuotos vidutinės vertės.
                                 
                                 
                                    Ištirpęs deguonis sudaro ≥ 60 % oro soties vertės; vidutinė temperatūra 25 ± 2 °C; 90 % žuvų išgyvenamumas kontrolinėse grupėse; išmatuotos bandymo koncentracijos vertės skiriasi ne daugiau kaip 20 % kiekvienos koncentracijos išmatuotos vidutinės vertės.
                                 
                                 
                                    Ištirpęs deguonis sudaro ≥ 60 % oro soties vertės; vidutinė temperatūra 26 ± 2 °C; 90 % žuvų išgyvenamumas kontrolinėse grupėse; išmatuotos bandymo koncentracijos vertės skiriasi ne daugiau kaip 20 % kiekvienos koncentracijos išmatuotos vidutinės vertės.
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS SAVYBĖS
                        
                        
                                    KOMPONENTAS
                                 
                                 
                                    KONCENTRACIJA
                                 
                              
                                    Kietosios dalelės
                                 
                                 
                                    < 20 mg/l
                                 
                              
                                    Bendroji organinė anglis
                                 
                                 
                                    < 2 mg/l
                                 
                              
                                    Nejonizuotas amoniakas
                                 
                                 
                                    < 1 μg/l
                                 
                              
                                    Liekamojo chloro kiekis
                                 
                                 
                                    < 10 μg/l
                                 
                              
                                    Bendras organinių fosforo pesticidų kiekis
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Bendras organinių chloro pesticidų ir polichlorintųjų bifenilų kiekis
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Bendras organinio chloro kiekis
                                 
                                 
                                    < 25 ng/l
                                 
                              
                     
                        4A priedėlis
                        
                           NERŠTO SUBSTRATAS ZEBRINEI DANIJAI
                        
                        
                           
                              Neršto padėklas
                           – vien tik iš stiklo pagamintas instrumentinis indas, pvz., 22 × 15 × 5,5 cm (ilgis × plotis × gylis), uždengtas nuimamomis nerūdijančiojo plieno grotelėmis (su 2 mm pločio akutėmis). Grotelės turėtų uždengti instrumentinio indo angą žemiau jo krašto.
                        Ant grotelių turėtų būti pritvirtintas neršto substratas. Jis turėtų sudaryti struktūrą, į kurią žuvys galėtų įplaukti. Pvz., jai gauti tinka dirbtiniai akvariumo augalai, pagaminti iš žalios spalvos plastiko (reikia pažymėti, kad reikėtų atsižvelgti į galimą bandomosios cheminės medžiagos adsorbciją ant plastiko). Medžiagas iš plastiko reikėtų gana ilgai mirkyti pakankamame šilto vandens tūryje, siekiant užtikrinti, kad jokios cheminės medžiagos nepatektų į bandymo vandenį. Naudojant stiklines medžiagas, reikėtų užtikrinti, kad žuvys negalėtų susižeisti ir nebūtų varžomi jų staigūs judesiai.
                        Siekiant užtikrinti, kad nebūtų neršiama už padėklo ribų, atstumas tarp jo ir stiklinių sienelių turėtų būti bent 3 cm. Ant padėklo padėti ikrai iškrenta pro groteles ir jų ėminius galima paimti praėjus 45–60 min nuo apšvietimo pradžios. Skaidrūs ikrai nelimpa ir juos galima lengvai suskaičiuoti naudojant šoninę šviesą. Viename inde laikant penkias pateles, mažiau kaip 20 per parą padėtų ikrų skaičius gali būti laikomas mažu, iki 100 ikrų – vidutiniu ir daugiau kaip 100 ikrų – dideliu. Neršto padėklą reikėtų išimti, ikrus surinkti ir padėklą įdėti atgal į bandymų indą kuo vėliau vakare arba labai anksti ryte. Padėklas turėtų būti grąžintas į bandymo indą ne vėliau kaip per valandą, nes kitaip neršto substratas kaip dirgiklis gali sukelti individualų poravimąsi ir nerštą neįprastu laiku. Jei atsižvelgiant į situaciją padėklą nerštui reikia įdėti vėliau, tai reikėtų padaryti ne vėliau kaip per devynias valandas nuo apšvietimo pradžios. Tokiu vėlyvu paros metu nerštas nebevyksta.
                     
                     
                        4B priedėlis
                        
                           NERŠTO SUBSTRATAS JUODAJAI DRŪTAGALVEI RAINEI
                        
                        Į kiekvieną bandymų kamerą įdedama po dvi ar tris sujungtas neršto slėptuves ir padėklus, pagamintus iš plastiko, keramikos, stiklo derinio arba nerūdijančiojo plieno (pvz., 80 mm ilgio pilką pusapvalį lataką, padėtą ant 130 mm ilgio padėklo su užlenktais kraštais) (žr. paveikslą). Įrodyta, kad tinkamai pagamintos polivinilchlorido ar keraminės slėptuvės yra tinkamos naudoti kaip neršto substratas (Thorpe ir kiti, 2007).
                        Rekomenduojama slėptuves šlifuoti, kad pagerėtų sukibimas. Padėklą taip pat reikėtų ekranuoti, kad žuvys negalėtų pasiekti nukritusių ikrų, nebent būtų įrodyta, kad ikrai efektyviai prilimpa prie naudojamo neršto substrato.
                        Padėklo pagrindas skirtas visiems prie slėptuvės paviršiaus neprilipusiems, taigi į indo dugną nukritusiems ikrams (arba ikrams, padėtiems tiesiai ant plokščio plastikinio pagrindo) sulaikyti. Prieš naudojant, visi neršto substratai bent 12 h turėtų būti mirkomi skiedimo vandenyje.
                        Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90–98.
                     
                     
                        5A priedėlis
                        
                           JUODOSIOS DRŪTAGALVĖS RAINĖS ANTRINIŲ LYTINIŲ POŽYMIŲ VERTINIMAS TAM TIKROMS ENDOKRININĘ SISTEMĄ VEIKIANČIOMS CHEMINĖMS MEDŽIAGOMS APTIKTI
                        
                        
                           Apžvalga
                        
                        Suaugusios juodosios drūtagalvės rainės fizinės išvaizdos ypatybės, kurios gali būti svarbios atliekant endokrininę sistemą ardančių medžiagų bandymą, yra kūno spalva (t. y. šviesi ar tamsi), spalvų raštas (t. y. vertikalių dryžių buvimas arba nebuvimas), kūno forma (t. y. galvos ir krūtinės srities forma, pilvo išsipūtimas) ir rūšims būdingi antriniai lytiniai požymiai (t. y. poravimosi gumburėlių skaičius ir dydis, sprando pagalvėlės dydis ir kiaušdėtis).
                        Poravimosi gumburėliai yra ant aktyvaus reprodukcinio amžiaus juodosios drūtagalvės rainės patino galvos (sprando pagalvėlės) ir paprastai yra simetriškai išsidėstę iš abiejų pusių (Jensen et al. 2001). Kontrolinės patelės ir abiejų lyčių žuvų jaunikliai gumburėlių neturi (Jensen et al. 2001). Aplink patinų akis ir tarp jų šnervių gali būti iki aštuonių atskirų gumburėlių. Daugiausia (ir didžiausių) gumburėlių yra išsidėstę dviem lygiagrečiomis linijomis iš karto po šnervėmis ir virš burnos. Daugelis žuvų turi gumburėlių grupes po apatiniu žandu; arčiausiai burnos paprastai yra pavienės poros, o arčiau pilvo esančią grupę gali sudaryti iki keturių gumburėlių. Faktinis gumburėlių skaičius retai viršija 30 (18–28 intervalas; Jensen et al. 2001). Pagrindiniai gumburėliai (kalbant apie jų skaičių) yra atskira, palyginti apvali, struktūra, kurios aukštis apytiksliai atitinka spindulį. Dauguma aktyvaus reprodukcinio amžiaus patinų taip pat turi bent kelis gumburėlius, kurie yra padidėję ir išaugę taip, kad jų neįmanoma įžiūrėti kaip atskirų struktūrų.
                        Veikiant kai kurių rūšių endokrininę sistemą ardančioms cheminėms medžiagoms, priešingos lyties gyvūnams gali pasireikšti anomalūs antriniai lytiniai požymiai; pvz., dėl androgenų receptorių agonistų, tokių kaip 17α-metiltestosteronas ar 17β-trenbolonas, juodosios drūtagalvės rainės patelėms gali išsivystyti poravimosi gumburėliai (Smith 1974; Ankley et al. 2001; 2003), o dėl estrogenų receptorių agonistų gali sumažėti patinų poravimosi gumburėlių skaičius arba dydis (Miles-Richardson et al. 1999; Harries et al. 2000).
                        Toliau pateiktas juodosios drūtagalvės rainės poravimosi gumburėlių apibūdinimas, pagrįstas procedūromis, taikytomis JAV Aplinkos apsaugos agentūros Duluto (Minesota) laboratorijoje. Tam tikrus produktus ir (arba) įrangą galima pakeisti panašiomis turimomis medžiagomis.
                        Tyrimą geriausia atlikti naudojant padidinimo stiklą su apšvietimu arba 3× dviejų okuliarų mikroskopą su apšvietimu. Žuvis tiriama iš nugaros pusės, priešakine dalimi į priekį (galva nukreipta į tyrėjo pusę).
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Žuvis įdedama į mažą Petri lėkštelę (pvz., 100 mm skersmens), priešakine dalimi į priekį ir pilvu į apačią. Vaizdo ieškiklis nustatomas gumburėliams matyti. Žuvis atsargiai ir lėtai apverčiama nuo vieno šono ant kito, kad būtų galima nustatyti gumburėlių zonas. Gumburėliai suskaičiuojami ir įvertinami balais.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Žuvies galvos apžiūra kartojama iš pilvo pusės Petri lėkštelėje, padedant žuvį ant nugaros priešakine dalimi į priekį.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kiekvienos žuvies apžiūrą reikėtų atlikti per 2 min.
                                 
                              
                           Gumburėlių skaičiavimas ir įvertinimas balais
                        
                        Nustatytos šešios specifinės juodosios drūtagalvės rainės kūno zonos, kuriose reikia įvertinti gumburėlių buvimą ir vystymąsi. Esamų gumburėlių vietai ir kiekiui sužymėti parengta lentelė (žr. šio priedėlio gale). Gumburėlių skaičius registruojamas, o jų dydis kiekviename organizme gali būti kiekybiškai įvertintas balais taip: 0 – nėra, 1 – yra, 2 – padidėjęs ir 3 – aiškiai išreikštas (1 paveikslas).
                        Įvertis 0 – gumburėlių nėra. Įvertis 1 – gumburėlių yra; įvertis taikomas, jei bent vieno gumburėlio aukštis yra beveik lygus jo spinduliui. Įvertis 2 – padidėję gumburėliai; nustatomi pagal tai, kad jų audiniai primena žvaigždutę, paprastai didelio apskrito pagrindo, su einančiais iš centro grioveliais ir kanalėliais. Gumburėlių viršus dažnai yra nelygus, bet kartais gali būti kiek suapvalintas. Įvertis 3 – gumburėliai aiškiai išreikšti, paprastai gana dideli ir suapvalinti, turi mažiau apibrėžtą struktūrą. Kartais šie gumburėliai susilieja ir sudaro vientisą masę vienoje arba keliose srityse (B, C ir D, kaip apibūdinta toliau). Spalva ir forma panašios į 2 balais įvertintų gumburėlių, bet kartais gali būti gana silpnai išreikštos. Naudojant šią vertinimo balais sistemą, normaliam kontroliniam patinui, kuris turi 18–20 gumburėlių, paprastai gaunama balų suma < 50 (Jensen et al. 2001).
                        
                           1 paveikslas
                        
                        Faktiškai kai kurios žuvys gali turėti daugiau gumburėlių nei lentelėje yra konkrečiai vertinamai sričiai skirtų langelių. Jei taip atsitinka, papildomi įverčiai gali būti įrašomi į langelį arba jo dešinėje ar kairėje. Todėl lentelė nebūtinai turi būti simetriška. Galima būtų sukurti papildomą būdą suporuotiems arba vertikaliai palei horizontaliąją burnos liniją sujungtiems gumburėliams žymėti, dviejų gumburėlių įverčius įrašant į vieną langelį.
                        
                           Žymėjimo sritys:
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    A – aplink akis išsidėstę gumburėliai. Jie išdėstyti nugaros ir pilvo pusėje aplink priekinį akies kraštą. Paprastai daug jų turi subrendę kontroliniai patinai, o kontrolinės patelės jų neturi; paprastai jie yra išsidėstę poromis (po vieną prie kiekvienos akies) arba po vieną jų turi androgenų veikiamos patelės.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    B-tarp šnervių esantys gumburėliai (jutiminio kanalo angos). Ant kontrolinių patinų šie gumburėliai paprastai išsidėstę poromis ir yra labiau išsivystę (du padidėję arba trys aiškiai išreikšti). Jų neturi kontrolinės patelės, tačiau kartais jie atsiranda ir vystosi androgenais veikiamoms patelėms.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    C – gumburėliai, esantys iš karto priešais šnerves, lygiagrečiai su burna. Paprastai subrendusių kontrolinių patinų gumburėliai vertinami kaip padidėję arba aiškiai išreikšti. Mažiau išsivystę patinai arba androgenais veikiamos patelės jų turi arba jie yra padidėję.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    D – lygiagrečiai su burnos liniją išsidėstę gumburėliai. Kontrolinių patinų gumburėliai paprastai vertinami kaip išsivystę. Jų neturi kontrolinės patelės, tačiau turi androgenais veikiamos patelės.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    E – ant apatinio žando, arti burnos išsidėstę gumburėliai, paprastai maži ir dažniausiai išsidėstę poromis. Kontroliniai ar apdoroti patinai ir apdorotos patelės turi įvairų jų kiekį.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    F – gumburėliai, esantys E atžvilgiu arčiau pilvo. Paprastai būna maži ir išsidėstę poromis. Jų turi kontroliniai patinai ir androgenais veikiamos patelės.
                                 
                              NUORODOS
                        
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Kahl MD, Korte JJ, Makynen ME. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290.
                                 
                              
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Hornung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray EL. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22:1350-1360.
                                 
                              
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Harries JE, Runnalls T, Hill E, Harris CA, Maddix S, Sumpter JP, Tyler CR. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34:3003-3011.
                                 
                              
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Jensen KM, Korte JJ, Kahl MD, Pasha MS, Ankley GT. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128:127-141.
                                 
                              
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Kahl MD, Jensen KM, Korte JJ, Ankley GT. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59:515-523.
                                 
                              
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Miles-Richardson SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47:129-145.
                                 
                              
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Smith RJF. 1974. Effects of 17α-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52:1031-1038.
                                 
                              
                           
                        Tekstas paveikslėlio
                        
                           Gumburėlių žymėjimo lentelė:
                           ID
                           Skaitinis įvertis balais
                           Data
                           1 – yra
                           Bendras balas
                           2 – padidėjęs
                           3 – aiškiai išreikštas
                           A
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           B
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           C
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           D
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           E
                           X1
                           X1
                           F
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                        
                     
                     
                        5B priedėlis
                        
                           MEDAKOS ANTRINIŲ LYTINIŲ POŽYMIŲ VERTINIMAS TAM TIKROMS ENDOKRININĘ SISTEMĄ VEIKIANČIOMS CHEMINĖMS MEDŽIAGOMS APTIKTI
                        
                        Aprašytas spenelinių ataugų (*10), kurios yra medakos (Oryzias latipes) antriniai lytiniai požymiai, matavimas.
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Pašalinus kepenis (6 priedėlis) skerdena įdedama į kūginį mėgintuvėlį, kuriame yra maždaug 10 ml 10 % formalino tirpalo neutraliame buferiniame tirpale (galva į viršų, uodega į apačią). Jei lytinė liauka fiksuojama kitame tirpale nei 10 % formalino tirpalas neutraliame buferiniame tirpale, preparavimo peiliu atsargiai, kad nebūtų pažeistas gonoporas ir pati lytinė liauka, skerdena perpjaunama skersai tarp priekinės analinio peleko dalies ir išangės (3 paveikslas). Žuvies kūno dalis su galva dedama į fiksavimo tirpalą lytinei liaukai užkonservuoti, o uodeginė kūno dalis – į 10 % formalino tirpalą neutraliame buferiniame tirpale, kaip aprašyta pirmiau.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Žuvies kūną įdėjus į 10 % formalino tirpalą neutraliame buferiniame tirpale, priekinė analinio peleko dalis suimama pincetu ir 30 s laikoma sulenkta taip, kad analinis pelekas būtų išskleistas. Suimant pincetu analinį peleką, atsargiai, kad nebūtų pažeistos spenelinės ataugos, suimami keli priekinėje dalyje esantys peleko spinduliai.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Palaikius analinį peleką išskleistą apie 30 s, žuvies kūnas įdedamas į 10 % formalino tirpalą neutraliame buferiniame tirpale ir laikomas kambario temperatūroje iki spenelinių ataugų matavimo (matuoti reikėtų po ne mažesnės kaip 24 h trukmės fiksavimo).
                                 
                              Matavimas
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Žuvies kūną fiksavus ne trumpiau kaip 24 h 10 % formalino tirpalo neutraliame buferiniame tirpale, skerdena išimama iš kūginio mėgintuvėlio ir nušluostoma filtravimo popieriumi (arba popierine servetėle).
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Žuvis dedama pilvu į viršų. Analinis pelekas atsargiai nukerpamas mažomis skrodimo žirklėmis (pageidautina analinį peleką nukirpti su nedideliu kiekiu pterigioforo).
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Nupjautas analinis pelekas suimamas už priekinės dalies ir dedamas ant stiklinės plokštelės su keliais vandens lašais. Ant analinio peleko uždedamas dengiamasis stiklelis. Imant analinį peleką pincetu, reikia žiūrėti, kad nebūtų pažeistos spenelinės ataugos.
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Sujungtos plokštelės, ant kurių yra spenelinių ataugų suskaičiuojamos po biologiniu (tiesioginės šviesos arba inversiniu) mikroskopu esančiu skaitikliu. Spenelinės ataugos atpažįstamos, kai ant užpakalinės sujungtos plokštelės dalies matomi nedideli ataugų dariniai. Darbalapyje užrašomas kiekvieno peleko spindulio sujungtų plokštelių, ant kurių yra spenelinių ataugų, skaičius (pvz., pirmasis peleko spindulys – 0, antrasis peleko spindulys – 10, trečiasis peleko spindulys – 12, ir t. t.) ir kiekvienai atskirai žuviai gauta šių skaičių suma įrašoma į Excel elektroninę lentelę. Prireikus daroma analinio peleko nuotrauka ir joje suskaičiuojamos sujungtos plokštelės, ant kurių yra spenelinių ataugų.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Atlikus matavimus, analinis pelekas dedamas į 1) punkte aprašytą kūginį mėgintuvėlį ir jame laikomas.
                                 
                              
                           1 paveikslas
                        
                        
                           Schemoje parodyti analinio peleko formos ir dydžio skirtumai pagal lytį. A – patino, B – patelės. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
                        
                        
                           2 paveikslas
                        
                        
                           A – ataugos ant sujungtų analinio peleko spindulio plokštelių. J.P. – sujungta plokštelė; A.S. – ašinis atstumas; P – atauga. B – distalinis analinio peleko galas. Aktinotrichijos (Act.) yra ant galiuko. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
                        
                        
                           3 paveikslas
                        
                        
                           Nuotraukoje parodyta žuvies kūno pjūvio vieta, kai lytinė liauka fiksuojama kitame fiksavimo tirpale nei 10 % formalino tirpalas neutraliame buferiniame tirpale. Tokiu atveju likusi kūno dalis bus nupjauta preparavimo peiliu (raudona linija) darant pjūvį tarp priekinės analinio peleko dalies ir išangės, žuvies kūno dalis arčiau galvos bus įdėta į lytinės liaukos fiksavimo tirpalą, o uodeginė dalis – į 10 % formalino tirpalą neutraliame buferiniame tirpale.
                        
                        
                     
                        6 priedėlis
                        
                           REKOMENDUOJAMOS ĖMINIŲ ĖMIMO VITELOGENINO ANALIZEI ATLIKTI PROCEDŪROS
                        
                        Reikėtų stengtis išvengti kryžminio patinų ir patelių VTG ėminių užteršimo.
                        
                           
                              1A procedūra.   Juodoji drūtagalvė rainė, kraujo paėmimas iš uodegos venos arba arterijos
                        
                        Po anestezijos uodegos kotelis dalinai įpjaunamas skalpeliu ir iš uodegos venos arba arterijos heparinizuotu mikrohematokrito kapiliariniu vamzdeliu paimamas kraujas. Paėmus kraujo, plazma greitai atskiriama, esant 15 000 g centrifuguojant 3 min (arba esant 15 000 g – 10 min 4 oC temperatūroje). Jei reikia, po centrifūgavimo galima nustatyti hematokrito procentinę dalį. Plazmos frakcija paimama iš mikrohematokrito vamzdelio ir iki vitelogenino analizės laikoma centrifugavimo mėgintuvėlyje su 0,13 vienetų aprotinino (proteazės inhibitoriaus) –80 oC temperatūroje. Atsižvelgiant į juodosios drūtagalvės rainės dydį (kuris priklauso nuo lyties), iš vienos žuvies paprastai surenkama 5–60 mikrolitrų plazmos (Jensen et al. 2001).
                        
                           
                              1B procedūra.   Juodoji drūtagalvė rainė, kraujo paėmimas iš širdies
                        
                        Kraują taip pat galima paimti atliekant širdies punkciją heparinizuotu švirkštu (1 000 vienetų heparino viename ml). Kraujas supilamas į Eppendorfo mėgintuvėlius (laikomus ant ledo) ir centrifuguojamas (5 min, 7 000 g, kambario temperatūroje). Iki analizės plazmą reikėtų perpilti į švarius Eppendorfo mėgintuvėlius (padalijus į alikvotines dalis, jei plazmos tūris yra pakankamas) ir greitai užšaldyti – 80 oC temperatūroje (Panter et al., 1998).
                        
                           
                              2A procedūra.   Japoninė medaka, medakos kepenų pašalinimas
                        
                        
                           Bandymų žuvies paėmimas iš bandymų kameros
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Bandymų žuvį iš bandymų kameros reikėtų išimti mažu tinkleliu. Imti reikia atsargiai, kad bandymų žuvis neįkristų į kitas bandymų kameras.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Paprastai bandymų žuvis reikėtų imti tokia eilės tvarka: kontrolinio, tirpiklio kontrolinio (jei reikia), mažiausios koncentracijos, vidutinės koncentracijos, didžiausios koncentracijos ir teigiamo kontrolinio ėminio indas. Be to, prieš išimant pateles, iš tos pačios bandymų kameros reikėtų išimti visus patinus.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Kiekvienos bandymų žuvies lytis nustatoma pagal išorinius antrinius lytinius požymius (pvz., analinio peleko formą).
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Bandymų žuvis dedama į nešiojamąją talpyklą ir nešama į darbo vietą kepenims pašalinti. Patikrinama, ar bandymų kameros ir nešiojamosios talpyklos etiketės yra tikslios, ir įsitikinama, kad iš bandymų kameros paimtų ir joje likusių žuvų skaičius atitinka numatytą.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Jei lyties neįmanoma nustatyti pagal žuvies išorę, iš bandymų kameros išimamos visos žuvys. Tokiu atveju lytį reikėtų nustatyti lytinę liauką arba antrinius lytinius požymius tiriant stereoskopiniu mikroskopu.
                                 
                              
                           Kepenų pašalinimas
                        
                        
                                 
                                    (1)
                                 
                                 
                                    Bandymų žuvis pernešama mažu tinkleliu iš nešiojamosios talpyklos į anestetiko tirpalą.
                                 
                              
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    Anestezuota bandymų žuvis (paprastu) pincetu pernešama ant filtravimo popieriaus (arba popierinės servetėlės). Bandymų žuvį reikia suimti pincetu už galvos šonų, kad liktų sveika uodega.
                                 
                              
                                 
                                    (3)
                                 
                                 
                                    Vanduo nuo bandymų žuvų paviršiaus nušluostomas filtravimo popieriumi (arba popierine servetėle).
                                 
                              
                                 
                                    (4)
                                 
                                 
                                    Žuvis dedama pilvu į viršų. Tada skrodimo žirklėmis daroma maža skersinė įpjova nuo pilvo pusės kaklo srities iki pilvo vidurio.
                                 
                              
                                 
                                    (5)
                                 
                                 
                                    Į šią mažą įpjovą įkišamos skrodimo žirklės ir pilvas prakerpamas išilgai vidurinės pilvo linijos nuo užpakalinės žiaunų dalies iki išangės priekinės pusės. Reikia žiūrėti, kad žirklės nebūtų įkištos per giliai, kad nebūtų pažeistos kepenys ir lytinė liauka.
                                 
                              
                                 
                                    (6)
                                 
                                 
                                    Tolesni veiksmai atliekami po stereoskopiniu mikroskopu.
                                 
                              
                                 
                                    (7)
                                 
                                 
                                    Žuvis dedama pilvu į viršų ant popierinės servetėlės (taip pat ją galima dėti į stiklinę Petri lėkštelę arba ant objektinio stiklelio).
                                 
                              
                                 
                                    (8)
                                 
                                 
                                    Pilvo ertmės sienelės praplečiamos plonu pincetu ir išimami vidaus organai. Prireikus vidaus organus taip pat galima išimti pašalinant vieną pilvo ertmės sienelės pusę.
                                 
                              
                                 
                                    (9)
                                 
                                 
                                    Kitu plonu pincetu atveriama sujungta kepenų ir tulžies pūslės dalis. Tada tulžies latakas suimamas pincetu ir nupjaunama tulžies pūslė. Reikia žiūrėti, kad tulžies pūslė nebūtų nutraukta.
                                 
                              
                                 
                                    (10)
                                 
                                 
                                    Stemplė suimama ir tokiu pat būdu atskiriamas virškinimo traktas nuo kepenų. Reikia žiūrėti, kad neištekėtų virškinimo trakto turinys. Užpakalinė virškinimo trakto dalis atskiriama nuo išangės ir traktas išimamas iš pilvo ertmės.
                                 
                              
                                 
                                    (11)
                                 
                                 
                                    Pašalinama riebalų masė ir kiti aplink kepenis esantys audiniai. Reikia žiūrėti, kad kepenys nebūtų pažeistos.
                                 
                              
                                 
                                    (12)
                                 
                                 
                                    Plonu pincetu suimama už kepenų vartų ir kepenys išimamos iš pilvo ertmės.
                                 
                              
                                 
                                    (13)
                                 
                                 
                                    Kepenys dedamos ant objektinio stiklelio. Prireikus nuo kepenų paviršiaus plonu pincetu pašalinami visi likę riebalai ir išoriniai audiniai (pvz., pilvo sienelė).
                                 
                              
                                 
                                    (14)
                                 
                                 
                                    Kepenys pasveriamos elektroninėmis analitinėmis svarstyklėmis, kaip tarą naudojant 1,5 ml mikromėgintuvėlį. Gauta vertė užrašoma darbalapyje (0,1 mg tikslumu). Identifikavimo informacija patvirtinama mikromėgintuvėlio etiketėje.
                                 
                              
                                 
                                    (15)
                                 
                                 
                                    Mikromėgintuvėlis su kepenimis uždaromas dangteliu. Laikoma šaldymo stove (arba stove su ledu).
                                 
                              
                                 
                                    (16)
                                 
                                 
                                    Po kiekvienų kepenų pašalinimo skrodimo instrumentai valomi arba pakeičiami švariais.
                                 
                              
                                 
                                    (17)
                                 
                                 
                                    Pagal pirmiau aprašytą procedūrą kepenys pašalinamos iš visų nešiojamojoje talpykloje esančių žuvų.
                                 
                              
                                 
                                    (18)
                                 
                                 
                                    Pašalinus kepenis iš visų nešiojamojoje talpykloje esančių žuvų (t. y. visų bandymo akvariume laikomų patinų ir patelių), visi kepenų bandiniai su identifikavimo etiketėmis sudedami į mėgintuvėlių stovą ir laikomi šaldiklyje. Jei kepenys parengiamajam apdorojimui atlikti pateikiamos netrukus po jų pašalinimo, bandiniai į kitą darbo vietą pernešami šaldymo stove (arba stove su ledu).
                                 
                              Pašalinus kepenis, žuvies skerdeną galima naudoti antriniams lytiniams požymiams įvertinti.
                        
                           Bandinys
                        
                        Jei iš bandymų žuvų paimtų kepenų bandinių parengiamasis apdorojimas atliekamas ne iš karto, jie laikomi ≤ – 70oC temperatūroje.
                        
                           1 paveikslas
                        
                        
                           Vieta priešais krūtinės pelekus įkerpama žirklėmis.
                        
                        
                           2 paveikslas
                        
                        
                           Pilvas prakerpamas žirklėmis išilgai vidurinės pilvo linijos iki vietos, esančios maždaug 2 mm iki išangės nuo galvos pusės.
                        
                        
                           3 paveikslas
                        
                        
                           Pilvo sienelės praskečiamos chirurginėmis žnyplėmis, kad būtų galima išimti kepenis ir kitus vidaus organus.
                        
                        (Taip pat pilvo sieneles galima prispausti iš šonų).
                        Rodykle nurodytos kepenys.
                        
                           4 paveikslas
                        
                        
                           Kepenys išpjaunamos ir išimamos chirurginėmis žnyplėmis.
                        
                        
                           5 paveikslas
                        
                        
                           Žarnynas atsargiai atitraukiamas chirurginėmis žnyplėmis.
                        
                        
                           6 paveikslas
                        
                        
                           Abu žarnyno galai ir prisitvirtinusi žarnaplėvė atskiriami žirklėmis.
                        
                        
                           7 paveikslas (patelė)
                        
                        
                           Tokia pati procedūra atliekama su patele.
                        
                        
                           8 paveikslas
                        
                        
                           Procedūra baigta.
                        
                        
                           
                              2B procedūra.   Japoninė medaka (Oryzias latipes), kepenų parengiamasis apdorojimas vitelogenino analizei
                        
                        Iš IFA rinkinio paimamas homogenizavimo buferio buteliukas ir atvėsinamas smulkintu ledu (tirpalo temperatūra: ≤ 4oC). Jei naudojamas homogenizavimo buferis iš EnBio IFA rinkinio, tirpalas paliekamas atitirpti kambario temperatūroje, o tada butelis atvėsinamas smulkintu ledu.
                        Apskaičiuojamas reikiamas homogenizavimo buferinio tirpalo tūris pagal kepenų masę (vienam kepenų mg imama 50 μl homogenizavimo buferinio tirpalo). Pvz., jei kepenys sveria 4,5 mg, reikia 225 μl homogenizavimo buferinio tirpalo. Ruošiamas visoms kepenims reikiamo homogenizavimo buferinio tirpalo tūrių sąrašas.
                        
                           Kepenų paruošimas parengiamajam apdorojimui
                        
                        
                                 
                                    1)
                                 
                                 
                                    Prieš pat parengiamąjį apdorojimą iš šaldiklio išimamas 1,5 ml mikromėgintuvėlis su kepenimis.
                                 
                              
                                 
                                    2)
                                 
                                 
                                    Patinų kepenų parengiamąjį apdorojimą reikėtų atlikti pirmiau nei patelių, kad būtų išvengta užteršimo vitelogeninu. Be to, bandymų grupių žuvų parengiamasis apdorojimas turėtų būti atliekamas tokia tvarka: kontrolinio, tirpiklio kontrolinio (jei reikia), mažiausios koncentracijos, vidutinės koncentracijos, didžiausios koncentracijos ir teigiamo kontrolinio ėminio indas.
                                 
                              
                                 
                                    3)
                                 
                                 
                                    Bet kuriuo konkrečiu momentu iš šaldiklio turėtų būti paimta ne daugiau 1,5 ml mikromėgintuvėlių su kepenų ėminiais nei tuo metu galima centrifuguoti.
                                 
                              
                                 
                                    4)
                                 
                                 
                                    1,5 ml mikromėgintuvėliai su kepenų ėminiais sudedami į stovą su ledu bandinių numerių eilės tvarka (kepenų atitirpdyti nereikia).
                                 
                              
                           Parengiamojo apdorojimo procedūra
                        
                        1)   Homogenizavimo buferinio tirpalo įpylimas
                        Pagal sąrašą patikrinamas kiekvieno konkretaus ėminio homogenizavimo buferinio tirpalo tūris ir reikiamam tūriui nustatoma mikropipetė (tūrio intervalas: 100–1 000 μl). Ant mikropipetės užmaunamas švarus antgalis.
                        Paimama homogenizavimo buferinio tirpalo iš reagento butelio ir įpilama į 1,5 ml mikromėgintuvėlį su kepenimis.
                        Homogenizavimo buferinio tirpalo įpilama į visus 1,5 ml mikromėgintuvėlius su kepenimis pagal pirmiau aprašytą procedūrą. Mikropipetės antgalio nauju pakeisti nereikia. Tačiau, jeigu antgalis užterštas arba įtariama, kad jis gali būti užterštas, antgalį reikėtų pakeisti.
                        2)   Kepenų homogenizavimas
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Prie mikromėgintuvėlio homogenizatoriaus pritvirtinamas naujas homogenizavimo grūstuvėlis.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Grūstuvėlis įstatomas į 1,5 ml mikromėgintuvėlį. Mikromėgintuvėlio homogenizatorius laikomas taip, kad kepenys būtų suspaustos tarp grūstuvėlio paviršiaus ir 1,5 ml mikromėgintuvėlio vidinės sienelės.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Mikromėgintuvėlio homogenizatorius įjungiamas 10–20 s. Atliekant šį veiksmą, mikromėgintuvėlis aušinamas smulkintu ledu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Grūstuvėlis ištraukiamas iš 1,5 ml mikromėgintuvėlio, kuris paliekamas stovėti maždaug 10 s. Suspensijos būsena patikrinama apžiūrint.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Jei suspensijoje matomi kepenų gabaliukai, (3) ir (4) veiksmai kartojami, kad būtų gautas tinkamas kepenų homogenatas.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Prieš centrifugavimą kepenų homogenato suspensija aušinama stove su ledu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Ruošiant kiekvieną homogenatą, grūstuvėlį reikia pakeisti nauju.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Pagal pirmiau aprašytą procedūrą homogenizuojamos visos kepenys, naudojant homogenizavimo buferinį tirpalą.
                                 
                              3)   Kepenų homogenato suspensijos centrifugavimas
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Šaldomoje centrifugos kameroje nustatoma ≤ 5oC temperatūrą.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Į šaldomą centrifugą įdedami 1,5 ml mikromėgintuvėliai su kepenų homogenato suspensija (jei reikia, reguliuojamas balansas).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kepenų homogenato suspensija 10 min centrifuguojama ≤ 5oC temperatūroje, esant 13 000g. Tačiau, jei skysčiai virš nuosėdų tinkamai atsiskiria, centrifugavimo jėga ir trukmė prireikus gali būti reguliuojama.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Po centrifugavimo tikrinama, ar skystis virš nuosėdų tinkamai atsiskyrė (paviršiuje – lipidai, per vidurį – skystis virš nuosėdų, apačioje – kepenų audiniai). Jei atsiskyrimas nepakankamas, suspensija centrifuguojama dar kartą tomis pačiomis sąlygomis.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Visi bandiniai išimami iš šaldomos centrifugos ir stove su ledu išrikiuojami jų numerių eilės tvarka. Reikia žiūrėti, kad po centrifugavimo atskiri sluoksniai nebūtų sudrumsti.
                                 
                              4)   Skysčio virš nuosėdų surinkimas
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Į mėgintuvėlių stovą įstatomi keturi 0,5 ml mikromėgintuvėliai skysčiui virš nuosėdų įpilti.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Mikropipete paimama 30 μl skysčio virš nuosėdų (atsiskyrusio kaip vidurinis sluoksnis) ir supilama į vieną 0,5 ml mikromėgintuvėlį. Reikia žiūrėti, kad nepatektų lipidų nuo paviršiaus arba kepenų audinio iš apatinio sluoksnio.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Paimama skysčio virš nuosėdų ir jis supilamas į kitus du 0,5 ml mikromėgintuvėlius, kaip aprašyta pirmiau.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Likusi skysčio virš nuosėdų dalis susiurbiama mikropipete (jei įmanoma: 100 μl). Skystis virš nuosėdų supilamas į paskutinį 0,5 ml mikromėgintuvėlį. Reikia žiūrėti, kad nepatektų lipidų nuo paviršiaus arba kepenų audinio iš apatinio sluoksnio.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    0,5 ml mikromėgintuvėlis uždaromas dangteliu ir skysčio virš nuosėdų tūris užrašomas etiketėje. Mikromėgintuvėliai nedelsiant statomi į stovą su ledu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Kiekvienam skysčio virš nuosėdų ėminiui paimti mikropipetės antgalis keičiamas nauju. Jei prie antgalio prilimpa didelis lipidų kiekis, antgalis iš karto keičiamas nauju, kad kepenų ekstraktas nebūtų užterštas riebalais.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Visas po centrifugavimo gautas skystis virš nuosėdų supilamas į keturis 0,5 ml mikromėgintuvėlius pagal pirmiau aprašytą procedūrą.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Supylus skystį virš nuosėdų į 0,5 ml mikromėgintuvėlius, visi jie su identifikavimo etiketėmis sustatomi į mėgintuvėlių stovą ir nedelsiant užšaldomi šaldiklyje. Jei VTG koncentracija matuojama iš karto po parengiamojo apdorojimo, vienas 0,5 ml mikromėgintuvėlis (su 30 μl skysčio virš nuosėdų) atvėsinamas mėgintuvėlių stove ir pernešamas į darbo vietą, kurioje atliekama IFA. Tokiu atveju likę mikromėgintuvėliai sustatomi į mėgintuvėlių stovus ir užšaldomi šaldiklyje.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Surinkus skystį virš nuosėdų, likučiai tinkamai pašalinami.
                                 
                              
                           Bandinio laikymas
                        
                        0,5 ml mikromėgintuvėliai su kepenų homogenato skysčiu virš nuosėdų laikomi ≤ –70 oC iki jie bus panaudoti atliekant IFA.
                        
                           
                              3A procedūra
                              Zebrinė danija, kraujo paėmimas iš uodegos venos arba arterijos
                        
                        Iš karto po anestezijos uodegos kotelis skersai įpjaunamas ir iš uodegos venos arba arterijos heparinizuotu mikrohematokrito kapiliariniu vamzdeliu paimamas kraujas. Imama 5–15 mikrolitrų kraujo, atsižvelgiant į žuvies dydį. Toks pat aprotinino buferinio tirpalo (6 mikrogramai/ml fosfatinio buferinio druskos tirpalo) tūris įtraukiamas į mikrokapiliarinį vamzdelį ir plazma nuo kraujo atskiriama centrifuguojant (5 min esant 600 g). Plazma surenkama į mėgintuvėlius ir iki vitelogenino ar kitų tiriamų baltymų analizės laikoma –20 oC temperatūroje.
                        
                           
                              3B procedūra.   Zebrinė danija, kraujo paėmimas atliekant širdies punkciją
                        
                        Siekiant išvengti kraujo koaguliacijos ir baltymų irimo, ėminiai imami į fosfatinį buferinį druskos tirpalą (PBS), kuriame yra heparino (1 000 vienetų/ml) ir proteazės inhibitoriaus aprotinino (2 TIU/ml). Buferiniam tirpalui paruošti kaip sudedamąsias dalis rekomenduojama naudoti hepariną, amonio druską ir liofilizuotą aprotininą. Kraujo ėminiui paimti rekomenduojama naudoti švirkštą (1 ml) su fiksuota plona adata (pvz., Braun Omnikan-F). Švirkštą reikia iš anksto pripildyti buferinio tirpalo (maždaug 100 mikrolitrų), kad iš kiekvienos žuvies būtų visiškai išplautas nedidelis kraujo tūris. Kraujo ėminiai paimami atliekant širdies punkciją. Iš pradžių žuvį reikėtų anestezuoti MS-222 (100 mg/l). Tinkamai pritaikęs anesteziją, tyrėjas gali atskirti zebrinės danijos širdies plakimą. Atliekant širdies punkciją, švirkšto stūmoklis nestipriai įtempiamas. Paimamas kraujo tūris yra 20–40 mikrolitrų. Atlikus širdies punkciją, kraujo ir buferinio tirpalo mišinį reikėtų supilti į mėgintuvėlį. Plazma nuo kraujo atskiriama centrifuguojant (20 min, 5000 g) ir iki analizės turėtų būti laikoma – 80 oC temperatūroje.
                        
                           
                              3C procedūra.   Standartinė veiklos procedūra (SVP). Zebrinė danija, galvos ir uodegos homogenizavimas
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Žuvys anestezuojamos ir numarinamos pagal bandymo aprašymą.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Žuvies galva ir uodega nupjaunamos taip, kaip parodyta 1 paveiksle.
                                    Svarbu. Po kiekvienos atskiros žuvies preparavimo visi skrodimo instrumentai ir preparavimo stalas turėtų būti tinkamai išplauti ir išvalyti (pvz., 96 % etanoliu), kad būtų išvengta neindukuotų patinų užteršimo patelių arba indukuotų patinų vitelogeninu.
                                    
                                    
                                       1 paveikslas
                                    
                                    
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Bendra kiekvienos žuvies galvos ir uodegos masė, matuojama mg tikslumu.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Pasvėrus kūno dalys įdedamos į atitinkamus mėgintuvėlius (pvz., 1,5 ml Eppendorfo mėgintuvėlius) ir iki homogenizavimo užšaldomos – 80 oC temperatūroje arba tiesiogiai homogenizuojamos ant ledo dviem plastikinėmis piestelėmis. (Kiti metodai gali būti taikomi, jeigu tai atliekama ant ledo ir gaunama vienalytė masė). Svarbu. Mėgintuvėliai turėtų būti tinkamai sunumeruoti, kad žuvies galvą ir uodegą būtų galima susieti su atitinkama jų kūno dalimi, naudojama lytinių liaukų histologinei analizei atlikti.
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Gavus vienalytę masę, įpilama ledo temperatūros homogenizavimo buferinio tirpalo
                                        (*11), kurio masė turi būti keturis kartus didesnė nei audinių. Toliau maišoma piestelėmis, kad būtų gautas vienalytis mišinys. Svarbi pastaba. Kiekvienai žuviai naudojamos naujos piestelės.
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Iki centrifugavimo 30 min 4oC temperatūroje esant 50 000 g ėminiai laikomi ant ledo.
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Naudojama pipetė 20 μl skysčio virš nuosėdų įlašinti bent į du mėgintuvėlius, panardinant jos galiuką žemiau paviršinio riebalų sluoksnio ir atsargiai įsiurbiant skysčio virš nuosėdų be riebalų ar audinių dalelių.
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Iki naudojimo mėgintuvėliai laikomi –80 oC.
                                 
                              
                     
                        7 priedėlis
                        
                           VITELOGENINU SODRINTI ĖMINIAI IR TYRIMŲ SERIJOS PAMATINIS ETALONAS
                        
                        Kiekvieną dieną atliekant vitelogenino tyrimus analizuojamas sodrintas ėminys, paruoštas naudojant tyrimų serijos pamatinį etaloną. Pamatiniam tyrimų serijos etalonui paruošti naudojamas vitelogeninas imamas iš kitos partijos nei ta, kuri naudojama atliekamo tyrimo kalibravimo etalonams paruošti.
                        Sodrintas ėminys ruošiamas į kontrolinio patino plazmą pridedant žinomą tyrimų serijos etalono kiekį. Ėminys sodrinamas turint tikslą gauti vitelogenino koncentraciją, kuri būtų 10–100 kartų didesnę nei numatoma kontrolinio patino vitelogenino koncentracija. Sodrinamą kontrolinio patino plazmos ėminį galima paimti iš vienos žuvies arba jis gali būti kelių žuvų sudėtinis ėminys.
                        Nesodrintas kontrolinio patino plazmos poėminis analizuojamas bent dviejose kartotinėse duobutėse. Sodrintas ėminys taip pat analizuojamas bent dviejose kartotinėse duobutėse. Numatomai koncentracijai apskaičiuoti vidutinis dviejų kontrolinių patinų plazmos nesodrintų ėminių vitelogenino kiekis įdedamas į apskaičiuotą vitelogenino kiekį, įdėtą į sodrintus ėminius. Šios numatomos ir išmatuotos koncentracijos verčių santykis pateikiamas ataskaitoje kartu su kiekvienos tą dieną atliktų tyrimų serijos rezultatais.
                     
                     
                        8 priedėlis
                        
                           SPRENDIMUI PRIIMTI SKIRTA STATISTINĖS ANALIZĖS STRUKTŪRINĖ DIAGRAMA
                        
                        
                     C.49   Ūmaus toksiškumo žuvų embrionams (FET) bandymas
                     
                     ĮVADAS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) 236 (2013). Jame aprašytas ūmaus toksiškumo žuvų embrionams (angl. Fish Embryo Acute Toxicity, FET) bandymas su zebrine danija (Danio rerio). Šio bandymo tikslas – nustatyti cheminių medžiagų toksiškumą žuvims embriono stadijoje. FET bandymas yra pagrįstas tyrimais ir tinkamumo patvirtinimo darbų naudojant zebrinę daniją rezultatais (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14). Taikant FET bandymą, buvo sėkmingai bandomos skirtingais būdais veikiančios įvairių grupių cheminės medžiagos, kurios skiriasi tirpumu, lakumu ir hidrofobiškumu (apžvalga 15 ir 16).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Šiame bandymų metode vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje.
                              
                           BANDYMO PRINCIPAS
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Ką tik apvaisinti zebrinės danijos ikrai 96 h veikiami bandomąja chemine medžiaga. Kas 24 h registruojama iki keturių apikalinių stebėjimo požymių kaip žūstamumo rodiklių (6): i) apvaisinti ikrai koaguliuoja, ii) nesusidaro somitai, iii) uodegos pumpuras ne visiškai atsiskiria nuo trynio maišelio ir iv) neplaka širdis. Pasibaigus veikimo laikotarpiui, ūmus toksiškumas nustatomas pagal kurio nors iš keturių užregistruotų apikalinių stebėjimo požymių teigiamą rezultatą ir apskaičiuojama LC50.
                              
                           PRADINIAI ASPEKTAI
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Naudingą informaciją apie cheminei medžiagai būdingas savybes sudaro struktūrinė formulė, molekulinė masė, grynumas, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pKa ir Kow, tirpumas vandenyje, garų slėgis ir lengvo biologinio skaidumo bandymų rezultatai (C.4 (17) ar C.29 bandymų metodas (18)). Tirpumas ir garų slėgis gali būti naudojami Henrio dėsnio konstantai apskaičiuoti, kuri rodytų, ar dėl bandomosios cheminės medžiagos garavimo gali būti nuostolių. Reikėtų turėti patikimą metodą cheminei medžiagai kiekybiškai nustatyti bandymo tirpaluose žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodomi ataskaitoje.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Jei šiuo metodu bandomas mišinys, turėtų būti kuo išsamiau apibūdinta jo sudėtis, pvz., nurodant jo sudedamųjų dalių cheminį pavadinimą, kiekybinį paplitimą ir cheminei medžiagai būdingas savybes (žr. 4 pastraipą). Prieš taikant bandymų metodą mišinio reglamentavimo bandymams, reikėtų atsižvelgti į tai, ar galima gauti reglamentavimo tikslui skirtus priimtinus rezultatus.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Kalbant apie chemines medžiagas, kurios gali būti aktyvintos per metabolizmą, yra įrodymų, kad zebrinės danijos embrionai turi metabolinio pajėgumo (19)(20)(21)(22). Tačiau embriono žuvų metabolinis pajėgumas ne visada yra panašus į mailiaus arba suaugusių žuvų pajėgumą. Pvz., alilo alkoholis, kuris virsta toksiniu metabolitu (9), nebuvo aptiktas taikant FET. Todėl, jei yra kokių nors požymių, kad metabolitai ar kiti svarbūs virsmo produktai gali būti labiau toksiški nei pirminis junginys, rekomenduojama atlikti bandymą ir su šiais metabolitais ar virsmo produktais bei šiuos rezultatus panaudoti darant išvadą dėl bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo arba atlikti kitą bandymą, kuriame būtų atsižvelgta į metabolizmą.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Jei cheminių medžiagų molekulinė masė ≥ 3 kDa, jų molekulinė struktūra yra labai didelio tūrio ir jei cheminės medžiagos sukelia uždelstą išsiritimą, dėl kurio galėtų būti sutrikdytas arba sumažintas poveikis po išsiritimo, nesitikima, kad embrionai būtų jautrūs cheminei medžiagai dėl jos riboto biologinio įsisavinamumo, todėl galbūt labiau tiktų kiti toksiškumo bandymai.
                              
                           BANDYMO TINKAMUMAS
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Taikomi šie kriterijai, kad bandymo rezultatai būtų tinkami:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             bandytos partijos surinktų ikrų bendras apvaisinimo laipsnis turėtų būti ≥ 70 %;
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             bandymo kamerų vandens temperatūra bet kuriuo momentu turėtų būti 26 ± 1 °C;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             pasibaigus 96 h veikimui, neigiamo (skiedimo vandens) kontrolinio ėminio ir, jei reikia, tirpiklio kontrolinio ėminio vibendras embrionų išgyvenamumas turėtų būti ≥ 90 %;
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             pasibaigus 96 h veikimui, mažiausias žūstamumas, gautas teigiamam kontroliniam ėminiui (pvz., 4,0 mg/l 3,4-dichloranilino zebrinei danijai), yra 30 %;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             pasibaigus 96 h veikimui, išsiritimo laipsnis, gautas neigiamam kontroliniam ėminiui (ir, jei reikia, tirpiklio kontroliniam ėminiui), turėtų būti ≥ 80 %;
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             pasibaigus 96 h veikimui, ištirpusio deguonies koncentracija neigiamo kontrolinio ėminio ir didžiausios bandymo koncentracijos tirpale turėtų būti ≥ 80 % soties.
                                          
                                       
                           METODO APRAŠYMAS
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Rekomenduojamų priežiūros ir bandymo sąlygų apžvalga pateikta 2 priedėlyje.
                              
                           
                        Aparatūra
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Reikalinga ši aparatūra:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             akvariumai, pagaminti iš chemiškai inertinės medžiagos (pvz., stiklo) ir tinkamo tūrio, atsižvelgiant į rekomenduotą įkrovą (žr. Veislinių žuvų priežiūra, 14 pastraipa);
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             inversinis arba dviejų okuliarų mikroskopas, kurio didinimas būtų ne mažesnis kaip 80 kartų. Jei stebėjimams registruoti skirtoje patalpoje neįmanoma užtikrinti 26 ± 1 °C temperatūros, būtinas temperatūros valdomas skersinės pastūmos stalas arba temperatūros pastovumo užtikrinimo metodai;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             bandymo kameros; pvz., maždaug 20 mm gylio standartinės 24 duobučių plokštelės (žr. Bandymo kameros, 11 pastraipa);
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             pvz., lipnioji plėvelė 24 duobučių plokštelėms uždengti;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             inkubatorius arba valdomos temperatūros patalpa su oro kondicionavimu, kad duobutėse (ar bandymo kamerose) būtų galima užtikrinti 26 ± 1 °C temperatūrą;
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             pH-metras;
                                          
                                       
                                             g)
                                          
                                          
                                             deguonies matuoklis
                                          
                                       
                                             h)
                                          
                                          
                                             įranga vandens kietumui ir laidžiui nustatyti,
                                          
                                       
                                             i)
                                          
                                          
                                             ikrų gaudyklė: instrumentiniai padėklai iš stiklo, nerūdijančiojo plieno ar kitos inertinės medžiagos; vielinės grotelės (akučių matmuo 2 ± 0,5 mm) iš nerūdijančiojo plieno ar kitos inertinės medžiagos išleistiems ikrams apsaugoti; neršto substratas (pvz., dirbtiniai akvariumo augalai iš inertinės medžiagos) (C.48 bandymų metodo 4a priedėlis (23));
                                          
                                       
                                             j)
                                          
                                          
                                             platėjančios angos pipetės ikrams surinkti;
                                          
                                       
                                             k)
                                          
                                          
                                             stikliniai indai skirtingos bandymo koncentracijos tirpalams ir skiedimo vandeniui paruošti (laboratorinės stiklinės, matavimo kolbos, graduoti cilindrai ir graduotos pipetės) arba zebrinės danijos ikrams rinkti (pvz., laboratorinės stiklinės, kristalizavimo lėkštelės);
                                          
                                       
                                             l)
                                          
                                          
                                             jei bandymui atlikti naudojamos alternatyvios veikimo sistemos, pvz., dinaminės (24) arba pasyvaus dozavimo sistemos (25), reikia turėti atitinkamus įrenginius ir įrangą.
                                          
                                       
                           
                        Bandymo kameros
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Reikėtų naudoti stiklo arba polistireno bandymo kameras (pvz., 24 duobučių plokšteles su 2,5–5 ml pripildymo talpos duobutėmis). Jei galima įtarti adsorbciją ant polistireno (pvz., nepolinių, plokščios molekulės cheminių medžiagų, kurių didelis KOW), reikėtų naudoti inertinę medžiagą (stiklą), kad būtų mažesni nuostoliai dėl adsorbcijos (26). Bandymo kameros turėtų būti atsitiktinai išdėstytos inkubatoriuje.
                              
                           
                        Vanduo ir bandymo sąlygos
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Gyvūnams laikyti skirtą vandenį rekomenduojama skiesti, kad būtų pasiektas tipinis įvairių paviršinių vandenų kietumas. Skiedimo vanduo turėtų būti ruošiamas iš atkurtojo vandens (27). Gautas kietumo laipsnis turėtų atitikti 100–300 mg/l CaCO3, kad į nuosėdas neiškristų per didelis kalcio karbonato kiekis. Galima naudoti kitokį gerai apibūdintą paviršinį arba šulinių vandenį. Atkurtąjį vandenį galima paversti mažo kietumo gyvūnams laikyti skirtu vandeniu skiedžiant jį dejonizuotu vandeniu ne didesniu kaip 1:5 santykiu iki minimalaus kietumo 30–35 mg/l CaCO3. Prieš dedant bandomąją cheminę medžiagą, vanduo yra aeruojamas, kad būtų pasiekta deguonies soties koncentracija. Visą bandymo laiką duobutėse reikėtų užtikrinti 26 ± 1 °C temperatūrą. pH turėtų būti 6,5–8,5 intervale ir bandymo metu nesiskirti daugiau kaip 1,5 vieneto šio intervalo ribose. Jei nesitikima, kad pH galėtų likti šiame intervale, prieš pradedant bandymą, pH reikėtų reguliuoti. pH reikėtų reguliuoti taip, kad reikšmingai nepasikeistų pradinio tirpalo koncentracija ir kad nepradėtų vykti cheminė reakcija arba nesusidarytų bandomosios cheminės medžiagos nuosėdos. Tirpalams su bandomąja chemine medžiaga pH koreguoti rekomenduojamas vandenilio chloridas (HCl) ir natrio hidroksidas (NaOH).
                              
                           
                        Bandymo tirpalai
                     
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Pasirinktų koncentracijos verčių bandymo tirpalai paprastai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinius tirpalus geriau ruošti bandomąją medžiagą tiesiog maišant ar purtant skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Jei bandomąją cheminę medžiagą sunku ištirpinti vandenyje, reikėtų taikyti procedūras, aprašytas EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 23 dėl sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių (28). Reikėtų vengti naudoti tirpiklius, bet kartais jie gali būti būtini, kad būtų galima gauti tinkamos koncentracijos pradinį tirpalą. Jei naudojamas tirpiklis, jo galutinė koncentracija neturėtų būti didesnė kaip 100 μl/l ir ji turėtų būti vienoda visuose bandymo induose. Jei naudojamas tirpiklis, reikia turėti papildomą tirpiklio kontrolinį ėminį.
                              
                           
                        Veislinių žuvų priežiūra
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Ikrams neršti naudojama laukinio tipo veislinė zebrinės danijos populiacija, kuri nebūtų veikiama chemine medžiaga ir kurios apvaisinimo laipsnis būtų tinkamai patvirtintas dokumentais. Žuvys turėtų būti be makroskopinių infekcijos ir ligų simptomų, ir du mėnesius iki neršto neturėtų būti gydomos vaistais (dėl ūmaus susirgimo ar profilaktiškai). Neršiančios žuvys laikomos akvariumuose su rekomenduojama įkrova 1 l vandens vienai žuviai ir pastovia 12–16 h šviesiojo laikotarpio trukme (29)(30)(31)(32)(33). Reikėtų nustatyti optimalų filtravimo srautą; reikėtų vengti per didelio filtravimo srauto, kuris sukeltų stiprų vandens burbuliavimą. Maitinimo sąlygos nurodytos 2 priedėlyje. Reikėtų vengti duoti per daug maisto, o vandens kokybė ir akvariumų švara turėtų būti reguliariai stebima ir grąžinta į pradinę būseną, jei reikia.
                              
                           
                        Kvalifikacijos tikrinimas
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Pageidautina ne rečiau kaip du kartus per metus bandyti 3,4-dichloraniliną kaip etaloninę cheminę medžiagą (naudotą atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimus (1)(2)), ją bandant visame koncentracijos ir atsako priklausomybės intervale, kad būtų galima patikrinti naudojamos žuvų veislės jautrį. Kiekviena laboratorija, kuri pradėtų taikyti šį bandymų metodą, turėtų naudoti kvalifikacijai tikrinti skirtą cheminę medžiagą. Laboratorija gali naudoti šią cheminę medžiagą, norėdama įrodyti savo techninę kompetenciją atlikti bandymą, prieš pateikdama duomenis reglamentavimo tikslais.
                              
                           
                        Ikrų gamyba
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Zebrinės danijos ikrus galima gauti naudojant neršto grupes (atskirose neršto talpyklose) arba atliekant masinį nerštą (laikymo talpyklose). Jei naudojamos neršto grupės, veisimo grupės patinai ir patelės (pvz., santykiu 2:1) dieną prieš bandymą dedami į neršto talpyklas, likus kelioms valandoms iki sutemų. Kadangi zebrinės danijos neršto grupių nerštas kartais gali nepavykti, rekomenduojama lygiagrečiai naudoti mažiausiai tris neršto talpyklas. Siekiant išvengti genetinės sisteminės paklaidos, renkami ne mažiau kaip trijų veisimo grupių ikrai, kurie sumaišomi ir atsitiktinai pasirenkami.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Dieną prieš bandymą prieš sutemstant arba bandymo dieną prieš auštant į neršto talpyklas arba laikymo talpyklas dedamos ikrų gaudyklės ikrams surinkti. Ikrų gaudyklės uždengiamos reikiamo akučių dydžio (maždaug 2 ± 0,5 mm) vielinėmis grotelėmis iš inertinės medžiagos, kad suaugusios zebrinės danijos negalėtų suėsti ikrų. Jei manoma, kad būtinas neršto dirgiklis, gali būti pritvirtinti dirbtiniai augalai, pagaminti iš inertinės medžiagos (pvz., plastiko ar stiklo) (3)(4)(5)(23)(35). Reikėtų naudoti sendintas plastines medžiagas, iš kurių neišsiplauna (pvz., ftalatai). Poravimasis, nerštas ir apvaisinimas įvyksta per 30 min po to, kai atsiranda šviesa ir ikrų gaudyklės su surinktais ikrais gali būti atsargiai išimtos. Iš ikrų gaudyklių surinktus ikrus rekomenduojama praplauti atkurtuoju vandeniu.
                              
                           
                        Ikrų atskyrimas
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 26 °C temperatūroje maždaug po 15 min įvysta apvaisintų ikrų pirmasis dalijimasis ir vėlesnis sinchroninis dalijimasis, susidarant 4, 8, 16 ir 32 ląstelėms blastomerams (žr. 3 priedėlį) (35). Šiose stadijose apvaisinti ikrai gali būti aiškiai identifikuoti pagal blastulės išsivystymą.
                              
                           PROCEDŪRA
                     
                        Veikimo sąlygos
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Chemine medžiaga veikiama dvidešimt embrionų vienai koncentracijai (vienas embrionas duobutei). Veikiama turi būti taip, kad visą bandymo trukmę cheminės medžiagos koncentracija būtų lygi nominaliajai koncentracijai ± 20 %. Jei tai neįmanoma su statine sistema, reikėtų taikyti reguliuojamą pusiau statinio atnaujinimo intervalą (pvz., atnaujinimą kas 24 h). Tokiais atvejais reikėtų tikrinti bent didžiausią ir mažiausią veikimo koncentraciją kiekvieno veikimo intervalo pradžioje ir pabaigoje (žr. 36 pastraipą). Jei neįmanoma užtikrinti veikimo koncentracijos, kuri būtų lygi nominaliajai koncentracijai ± 20 %, visos koncentracijos vertės turi būti tikrinamos kiekvieno veikimo intervalo pradžioje ir pabaigoje (žr. 36 pastraipą). Atnaujinimo metu reikėtų žiūrėti, kad embrionai būtų apsemti nedideliu senųjų bandymo tirpalų kiekiu, siekiant išvengti jų džiuvimo. Bandymo schema turėtų būti pritaikyta atitikti specifinių cheminių medžiagų bandymų reikalavimams (pvz,. dinaminė (24) ar pasyvaus dozavimo sistemos (25) – lengvai skaidomoms arba stipriai adsorbuojamoms cheminėms medžiagoms (29), arba kitokios – lakiosioms cheminėms medžiagoms (36)(37)). Visais atvejais reikėtų imtis priemonių embrionų stresui sumažinti. Prieš bandymo pradžią bandymo kameras reikėtų kondicionuoti bandymo tirpalais ne trumpiau kaip 24 h. Bandymo sąlygos apibendrintos 2 priedėlyje.
                              
                           
                        Bandymo koncentracijos vertės
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Paprastai reikia naudoti ne mažiau kaip penkias bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertes, kurių pastovus skirtumo faktorius būtų ne didesnis kaip 2,2. Reikėtų pagrįsti mažesnio nei penkių koncentracijos verčių skaičiaus naudojimą. Pageidautina, kad esant didžiausiai bandymo koncentracijai būtų 100 % žūstamumas, o mažiausiai bandymo koncentracijai – nebūtų stebimo poveikio, kaip apibrėžta 28 pastraipoje. Reikiamą koncentracijos intervalą padeda nustatyti intervalo nustatymo bandymas, atliekamas prieš galutinį bandymą. Intervalo nustatymo bandymas paprastai atliekamas naudojant dešimt embrionų vienai koncentracijai. Toliau pateiktos instrukcijos skirtos bandymui atlikti 24 duobučių plokštelėje. Jei naudojamos kitokios bandymo kameros (pvz., mažos Petri lėkštelės) ar bandomas didesnis koncentracijos verčių skaičius, instrukcija reikėtų atitinkamai pakeisti.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Informacija ir vaizdinės instrukcijos skirtingos koncentracijos tirpalams paskirstyti 24 duobučių lėkštelėse yra pateikti 27 pastraipoje ir 4 priedėlio 1 paveiksle.
                              
                           
                        Kontroliniai ėminiai
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Skiedimo vandens kontroliniai ėminiai reikalingi, kaip neigiami kontroliniai ėminiai ir kaip vidiniai plokštelės kontroliniai ėminiai. Jei vidiniame plokštelės kontroliniame ėminyje pastebimas daugiau kaip vienas žuvęs embrionas, plokštelė atmetama, todėl sumažėja koncentracijos verčių skaičius LC50 vertei gauti. Jei atmetama visa plokštelė, gali sumažėti galimybė įvertinti ir atskirti stebimą poveikį, ypač jei atmesta plokštelė yra tirpiklio kontrolinio ėminio plokštelė arba plokštelė, kurioje apdoroti embrionai taip pat yra paveikti. Pirmuoju atveju bandymas turi būti pakartotas. Antruoju atveju visos (-ų) apdorojimo grupės (-ių) netekimas dėl žūstamumo vidiniame plokštelės kontroliniame ėminyje gali apriboti galimybę įvertinti poveikį ir nustatyti LC50 vertes.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Kiekvienai bandomai ikrų partijai atliekamas pastovios 4 mg/l koncentracijos teigiamo kontrolinio 3,4-dichloranilino ėminio bandymas.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Jei naudojamas tirpiklis, papildoma 20 embrionų grupė yra veikiama tirpikliu ant atskiros 24 duobučių plokštelės, tokiu būdu tai yra tirpiklio kontrolinis ėminys. Bandymą būtų galima laikyti priimtinu, jei būtų įrodyta, kad tirpiklis neturi reikšmingo poveikio išsiritimo laikui bei išgyvenamumui ir jokio kitokio neigiamo poveikio embrionams (plg. 8c pastraipą).
                              
                           
                        Veikimo pradžia ir bandymo trukmė
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Bandymas pradedamas kuo greičiau po ikrų apvaisinimo ir baigiamas po 96 h veikimo bandomąja medžiaga. Embrionus reikėtų panardinti į bandymo tirpalus prieš blastodisko dalijimosi pradžią arba ne vėliau kaip pasiekus 16 ląstelių stadiją. Norint pradėti veikimą kuo greičiau, atsitiktinai pasirenkami ikrai, kurių skaičius būtų bent du kartus didesnis nei apdorojimo grupei reikiamas ikrų skaičius, ir ne vėliau kaip 90 min po apvaisinimo ikrai pernešami į atitinkamos koncentracijos ir kontrolinius ėminius (pvz., į 100 ml kristalizavimo lėkšteles; ikrai turėtų būti visiškai apsemti).
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Gyvybingus apvaisintus ikrus reikėtų atskirti nuo neapvaisintų ikrų ir ne vėliau kaip 180 min po apvaisinimo pernešti į 24 duobučių plokšteles, prieš tai kondicionuotas 24 h ir iš naujo pripildytas 2 ml/duobutei naujai paruoštais bandymo tirpalais. Žiūrint per stereomikroskopą (pageidautina didinanti ≥ 30 kartų) atrenkami dalijimosi stadijos apvaisinti ikrai, kurie dalijimosi metu neturi akivaizdžių pažeidimų (pvz., asimetrijos, susidariusių pūslelių) arba apvalkalo sužalojimo. Apie ikrų surinkimą ir atskyrimą žr. 3 priedėlio 1 bei 3 paveikslus ir 4 priedėlio 2 paveikslą.
                              
                           
                        Ikrų paskirstymas 24 duobučių plokštelėse
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Ikrai paskirstomi į duobučių plokšteles tokiais skaičiais (tai pat žr. 4 priedėlio 1 paveikslą):
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             20 ikrų plokštelei kiekvienai bandymo koncentracijai;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 ikrų kaip tirpiklio kontrolinis ėminys vienoje plokštelėje (jei būtina);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 ikrų kaip teigiamas kontrolinis ėminys vienoje plokštelėje;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             4 ikrai skiedimo vandenyje kaip plokštelės vidinis kontrolinis ėminys kiekvienoje iš pirmiau nurodytų plokštelių;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             24 ikrai skiedimo vandenyje kaip neigiamas kontrolinis ėminys vienoje plokštelėje.
                                          
                                       
                           
                        Stebėjimai
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Kiekvieno embriono apikalinius stebėjimo požymius sudaro: embrionų koaguliacija, somitų nesusidarymas, uodegos neatsiskyrimas, širdies plakimo nebuvimas (1 lentelė). Šie stebėjimo požymiai naudojami žūstamumui nustatyti: Vieno kurio nors šių požymių teigiamas rezultatas reiškia, kad zebrinės danijos embrionas yra žuvęs. Be to, išsiritimas apdorojimo ir kontrolinėse grupėse yra registruojamas kasdien, pradedant nuo 48 h. Stebėjimo duomenys yra registruojami kas 24 h iki bandymo pabaigos.
                                 
                                    1 lentelė
                                 
                                 
                                    Ūmaus toksiškumo zebrinės danijos embrionams apikaliniai stebėjimo požymiai, praėjus 24–96 h po apvaisinimo
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Veikimo trukmė
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             24 h
                                          
                                          
                                             48 h
                                          
                                          
                                             72 h
                                          
                                          
                                             96 h
                                          
                                       
                                             Koaguliavę embrionai
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Somitų nesusidarymas
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Uodegos neatsiskyrimas
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Širdies plakimo nebuvimas
                                          
                                          
                                              
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 
                                    Embriono koaguliacija. Koaguliavę embrionai yra pieno baltumo ir žiūrint per mikroskopą atrodo tamsios spalvos (žr. 5 priedėlio 1 paveikslą). Koaguliavusių embrionų skaičius nustatomas po 24, 48, 72 ir 96 h.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 
                                    Somitų nesusidarymas. 26 ± 1 °C temperatūroje normaliai besivystančiame zebrinės danijos embrione po 24 h susidaro apie 20 somitų (žr. 5 priedėlio 2 paveikslą). Normaliai išsivystęs embrionas atlieka spontaninius judesius (susitraukimai į abi puses). Spontaniniai judesiai rodo somitų susidarymą. Somitų nebuvimas registruojamas po 24, 48, 72 ir 96 h. Somitai galėtų nesusidaryti po 24 h dėl bendrojo vystymosi vėlavimo. Ne vėliau kaip po 48 h somitų susidarymas turėtų būti baigtas. Jei jų nėra, embrionai laikomi žuvusiais.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 
                                    Uodegos neatsiskyrimas. Normaliai besivystančio zebrinės danijos embriono uodegos atsiskyrimas (žr. 5 priedėlio 3 paveikslą) nuo trynio stebimas po užpakalinės embriono kūno dalies pailgėjimo. Uodegos neatsiskyrimas registruojamas po 24, 48, 72 ir 96 h.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 
                                    Širdies plakimo nebuvimas. 26 ± 1 °C temperatūroje normaliai besivystančio zebrinės danijos embriono širdies plakimas matomas po 48 h (žr. 5 priedėlio 4 paveikslą). Reikia būti ypač atidiems registruojant šią vertinamąją baigtį, nes nereguliarus (neritmingas) širdies plakimas neturėtų būti registruojamas kaip žūtis. Dar daugiau, žūtimi nelaikomas matomas širdies plakimas be apytakos pilvo aortoje. Siekiant registruoti šią vertinamąją baigtį, embrioną su neplakančia širdimi reikėtų stebėti ne trumpiau kaip 1 min, esant ne mažesniam kaip 80× didinimui. Širdies plakimo nebuvimas registruojamas po 48, 72 ir 96 h.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Išsiritimo laipsnį visose apdorotose ir kontrolinėse grupėse reikėtų pradėti registruoti nuo 48 h ir pateikti ataskaitoje. Nors išsiritimas nėra vertinamoji baigtis, naudojama LC50 apskaičiuoti, išsiritimas užtikrina poveikį embrionui nesant kliūties, kurios funkciją atlieka apvalkalas, ir kaip toks jis gali padėti aiškinti duomenis.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Normalaus zebrinės danijos embrionų vystymosi (35) išsamus aprašymas ir nenormalaus vystymosi pavyzdžiai pateikti 3 ir 5 priedėliuose.
                              
                           
                        Analiziniai matavimai
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Bandymo pradžioje ir pabaigoje matuojamas kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) ir didžiausios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos tirpalų pH, bendras kietumas ir laidis. Naudojant pusiau statines sistemas, pH reikėtų matuoti prieš vandens atnaujinimą ir po jo. Ištirpusio deguonies koncentracija matuojama bandymo pabaigoje neigiamų kontrolinių ėminių ir didžiausios bandymo koncentracijos su gyvybingais embrionais tirpaluose, ir ji turėtų atitikti bandymo tinkamumo kriterijus (žr. 8f pastraipą). Jei susirūpinta dėl temperatūros nevienodumo visose 24 duobučių plokštelėse, temperatūra matuojama trijuose atsitiktinai pasirinktuose induose. Temperatūrą pageidautina registruoti nuolat visą bandymo trukmę arba bent kartą per parą.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Jei naudojama statinė sistema, koncentraciją reikėtų matuoti bandymo pradžioje ir pabaigoje bent didžiausios ir mažiausios bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos tirpaluose, bet pageidautina matuoti visuose tirpaluose su chemine medžiaga. Jei atliekant pusiau statinius (atnaujinimo) bandymus manoma, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija visą laiką yra lygi nominaliajai koncentracijai ± 20 %, rekomenduojama nustatyti bent didžiausią ir mažiausią naujai paruošto tirpalo bandymo koncentraciją ir koncentraciją prieš pat atnaujinimą. Jei atliekant bandymus nesitikima, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija visą laiką yra lygi nominaliajai koncentracijai ± 20 %, reikia nustatyti visas naujai paruoštų tirpalų koncentracijos vertes ir koncentraciją prieš pat atnaujinimą. Jei analizei nepakanka tūrio, gal būti naudinga sujungti bandymo tirpalus arba naudoti dirbtines kameras, pagamintas iš tos pačios medžiagos ir turinčias tokį patį paviršiaus ploto ir tūrio santykį kaip 24 duobučių plokštelės. Primygtinai rekomenduojama rezultatus pagrįsti išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Jei koncentracijos vertės neatitinka 80–120 % nominaliosios koncentracijos, poveikio koncentraciją reikėtų išreikšti kaip išmatuotų koncentracijos verčių geometrinį vidurkį; daugiau duomenų pateikta EBPO rekomendacinio dokumento Nr. 23 apie sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus 5 skyriuje (28).
                              
                           RIBINIS BANDYMAS
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Taikant šiame bandymų metode aprašytas procedūras, galima atlikti ribinį bandymą su bandomosios cheminės medžiagos koncentracija 100 mg/l arba koncentracija, atitinkančia ribinio tirpumo bandymo terpėje vertę (jei ji mažesnė), jei norima įrodyti, kad LC50 yra didesnė už šią koncentraciją. Ribinį bandymą reikėtų atlikti naudojant 20 embrionų apdorotam ėminiui, teigiamam kontroliniam ėminiui ir, jei reikia, tirpiklio kontroliniam ėminiui bei 24 embrionus neigiamam kontroliniam ėminiui. Jei bandytai koncentracijai žūstamumas procentais yra 10 % didesnis nei neigiamo kontrolinio ėminio (ar tirpiklio kontrolinio ėminio) žūstamumas, reikėtų atlikti viso masto tyrimą. Reikėtų registruoti visus pastebėtus reiškinius. Jei neigiamo kontrolinio ėminio (ar tirpiklio kontrolinio ėminio) žūstamumas yra didesnis kaip 10 %, bandymas netinkamas ir jį reikėtų pakartoti.
                              
                           DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Rezultatų apdorojimas
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Atliekant šio bandymo rezultatų statistinę analizę, nepriklausomais kartotiniais ėminiais laikomos atskiros duobutės. Embrionų, kurių bent vienas iš apikalinių stebėjimo požymių yra teigiamas 48 ir (arba) 96 h, procentinė dalis pateikiama grafiškai kaip bandymo koncentracijos verčių funkcija. Reikėtų taikyti tinkamus statistinius metodus (38) ir ieškoti informacijos EBPO rekomendaciniame dokumente Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data (39), kad būtų galima apskaičiuoti kreivės krypties koeficientus, LC50 vertes ir pasikliovimo ribas (95 %).
                              
                           
                        Bandymo ataskaita
                     
                     
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandomoji cheminė medžiaga:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Vienkomponentė cheminė medžiaga:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt. (įskaitant organinės anglies kiekį, jei tinka).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminį pavadinimą (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                bandymo organizmai:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         mokslinis pavadinimas, veislė, šaltinis apvaisintų ikrų surinkimo metodas ir vėlesnis apdorojimas.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymo sąlygos:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         taikyta bandymo procedūra (pvz., pusiau statinis atnaujinimas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         šviesiojo laikotarpio trukmė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo schema (pvz., bandymo kamerų skaičius, kontrolinių ėminių tipai);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vandens, kuriame laikomos žuvys, kokybės charakteristikos (pvz., pH, kietumas, temperatūra, laidis, ištirpusio deguonies koncentracija);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo tirpalų ištirpusio deguonies koncentracija, pH, bendras kietumas, temperatūra ir laidis bandymo pradžioje ir po 96 h;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         pradinių ir bandymo tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         tirpiklio naudojimo pagrindimas ir tirpiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tirpiklis ne vanduo;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos nominaliosios vertės ir analizės cheminės medžiagos koncentracijai bandymo induose nustatyti rezultatas; ataskaitoje reikėtų pateikti metodo atgavimo laipsnį ir kiekybinio nustatymo ribą;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         įrodymas, kad kontroliniai ėminiai atitinka bendram išgyvenamumui taikomus tinkamumo kriterijus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ikrų apvaisinimo laipsnis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         išsiritimo apdorotose ir kontrolinėse grupėse laipsnis.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rezultatai:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         didžiausia bandymo koncentracija, kuriai gautas nulinis žūstamumas bandymo laikotarpiu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         mažiausia bandymo koncentracija, kuriai gautas 100 % žūstamumas bandymo laikotarpiu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bendras žūstamumas kiekvienai koncentracijai rekomenduojamais stebėjimo momentais;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         LC50 vertės po 96 h (neprivalomai po 48 h), kai žūstamumo pasikliovimo ribos yra 95 %, jei įmanoma;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         žūstamumo bandymo pabaigoje kaip koncentracijos funkcijos kreivė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         žūstamumas kontroliniuose ėminiuose (neigiamuose kontroliniuose ėminiuose, vidiniuose plokštelės kontroliniuose ėminiuose, taip pat teigiamame kontroliniame ėminyje ir tirpiklio kontroliniame ėminyje, jei naudotas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno iš keturių apikalinių stebėjimo požymių duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         morfologinių ir fiziologinių anomalijų, jei yra, dažnumas ir aprašymas (žr. pavyzdžius, pateiktus 5 priedėlio 2 paveiksle);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         incidentai bandymo metu, kurie būtų galėję turėti įtakos bandymo rezultatams;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         duomenų statistinė analizė ir apdorojimas (probit analizė, logistinės regresijos modelis ir LC50 geometrinis vidurkis);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         (transformuotos) koncentracijos ir atsako priklausomybės regresijos kreivės krypties koeficientas ir pasikliovimo ribos.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Visi nukrypimai nuo bandymų metodo ir atitinkami paaiškinimai.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.
                                             
                                          
                                       
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2011) Validation Report (Phase 1) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II. Series on Testing and Assessment No. 157, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012) Validation Report (Phase 2) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II (Annexes). Series on Testing and Assessment No. 179, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Böttcher, M., Hollert, H., Kosmehl, T., Lammer, E., Leist, E., Rudolf, M. and Seitz, N. (2005) Towards an alternative for the acute fish LC50 test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species-an update. ALTEX 22: 87-102.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO (2007) International Standard Water quality – Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio). ISO 15088:2007(E) International Organization for Standardization.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Nagel, R. (2002) DarT: The embryo test with the zebrafish (Danio rerio) – a general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX 19: 38-48.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Schulte, C. and Nagel, R. (1994) Testing acute toxicity in embryo of zebrafish, Brachydanio rerio as alternative to the acute fish test – preliminary results. ATLA 22, 12-19.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Bachmann, J. (2002) Development and validation of a teratogenicity screening test with embryos of the zebrafish (Danio rerio). PhD-thesis, Technical University of Dresden, Germany.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Lange, M., Gebauer, W., Markl, J. and Nagel, R. (1995) Comparison of testing acute toxicity on embryo of zebrafish (Brachydanio rerio), and RTG-2 cytotoxicity as possible alternatives to the acute fish test. Chemosphere 30/11: 2087-2102.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Knöbel, M., Busser, F.J.M., Rico-Rico, A., Kramer, N.I., Hermens, J.L.M., Hafner, C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Scholz, S. (2012). Predicting adult fish acute lethality with the zebrafish embryo: relevance of test duration, endpoints, compound properties, and exposure concentration analysis. Environ. Sci. Technol. 46, 9690-9700.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kammann, U., Vobach, M. and Wosniok, W. (2006) Toxic effects of brominated indoles and phenols on zebrafish embryos. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 51: 97-102.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Groth, G., Kronauer, K. and Freundt, K.J. (1994) Effects of N,N-diemethylformamide and its degradation products in zebrafish embryos. Toxicol. In Vitro 8: 401-406.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Groth, G., Schreeb, K., Herdt, V. and Freundt, K.J. (1993) Toxicity studies in fertilized zebrafish fish eggs treated with N-methylamine, N,N-dimethylamine, 2-aminoethanol, isopropylamine, aniline, N-methylaniline, N,N-dimethylaniline, quinone, chloroacetaldehyde, or cyclohexanol. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 50: 878-882.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nguyen, L.T. and Janssen, C.R. (2001) Comparative sensitivity of embryo-larval toxicity assays with African catfish (Clarias gariepinus) and zebra fish (Danio rerio). Environ. Toxicol. 16: 566-571.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Cheng, S.H., Wai, A.W.K., So, C.H. and Wu, R.S.S. (2000) Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in zebrafish embryos. Environ. Toxicol. Chem. 19: 3024-3031.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Belanger, S. E., Rawlings J. M. and Carr G. J.. Use of Fish Embryo Toxicity Tests for the Prediction of Acute Fish Toxicity to Chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry (Accepted).
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Lammer, E., Carr, G. J., Wendler, K., Rawlings, J. M., Belanger, S. E., Braunbeck, T. (2009) Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity test? Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol.: 149 (2), 196–209
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Šio priedo C.29 skyrius. Lengvas biologinis skaidumas. CO2 sandariuose induose.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2011) Zebrafish (Danio rerio) embryos as a model for testing proteratogens. Toxicology 281: 25-36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2012) Developmental effects of coumarin and the anticoagulant coumarin derivative warfarin on zebrafish (Danio rerio) embryos. Reprod. Toxicol. 33: 133-141.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Incardona, J.P, Linbo, T.L., Scholz, N.L. (2011) Cardiac toxicity of 5-ring polycyclic aromatic hydrocarbons is differentially dependent on the aryl hydrocarbon receptor 2 isoform during zebrafish development. Toxicol. Appl. Pharmacol. 257: 242-249.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Kubota, A., Stegeman, J.J., Woodin, B.R., Iwanaga, T., Harano, R., Peterson, R.E., Hiraga, T., Teraoka, H. (2011) Role of zebrafish cytochrome P450 CYP1C genes in the reduced mesencephalic vein blood flow caused by activation of AHR2. Toxicol. Appl. Pharmacol. 253: 244-252.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Šio priedo C.48 skyrius. Trumpalaikis žuvų reprodukcijos tyrimas. Žr. 4a priedėlį.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Lammer, E., Kamp, H.G., Hisgen, V., Koch, M., Reinhard, D., Salinas, E.R., Wendlar, K., Zok, S., Braunbeck, T. (2009) Development of a flow-through system for the fish embryo toxicity test (FET) with zebrafish (Danio rerio). Toxicol. in vitro 23: 1436-1442.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Brown, R.S., Akhtar, P., Åkerman, J., Hampel, L., Kozin, I.S., Villerius, L.A., Klamer, H.J.C., (2001) Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ﬁlms. Environ. Sci. Technol. 35, 4097–4102.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Schreiber, R., Altenburger, R., Paschke, A., Küster, E. (2008) How to deal with lipophilic and volatile organic substances in microtiter plate assays. Environ. Toxicol. Chem. 27, 1676-1682.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 ISO (1996) International Standards. Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)]. ISO 7346-3: Flow-through method. Available: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Series on Testing and Assessment No. 23, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Laale, H.W. (1977) The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio, in fisheries research. A literature review. J. Fish Biol. 10: 121-173.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Westerfield, M. (2007) The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). 5th edition. Eugene, University of Oregon Press, Institute of Neuroscience, USA.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Canadian Council on Animal Care (2005) Guidelines on: the Care and Use of Fish in Research, Teaching and Testing, ISBN: 0-919087-43-4 http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Fish.pdf
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Europos Komisija (2007). 2007 m. birželio 18 d. Komisijos rekomendacija dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo ir priežiūros gairių (Pranešta dokumentu Nr. C(2007) 2525) [http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2007:197:0001:0089:EN:PDF].
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Europos Sąjunga (2010). 2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos. OL L 276, 2010 10 20, p. 33,
                                 http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:EN:PDF
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Nagel, R. (1986) Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio, Ham.-Buch.). J. Appl. Ichthyol. 2: 173-181.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B. and Schilling, T.F. (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203: 253-310.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Šio priedo C.2 skyrius. Daphnia sp. ūmaus judrumo slopinimo (imobilizavimo) bandymas.
                                 
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Weil, M., Scholz, S., Zimmer, M., Sacher, F., Duis, K. (2009) Gene expression analysis in zebrafish embryos: a potential approach to predict effect conentrations in the fish early life stage test. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1970-1978
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ISO (2006) International Standard. Water quality – Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data ISO TS 20281. Available: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2006) Guidance Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Lammer, E., 2006. Detailed review paper „Fish embryo toxicity assays“. UBA report under contract no. 20385422 German Federal Environment Agency, Berlin. 298 pp.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Apikalinė vertinamoji baigtis
                           – sukelianti poveikį populiacijos lygiu.
                        
                           
                              Blastulė
                           – ląstelių darinys apie animalinį polių, kuris dengia tam tikrą trynio dalį.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Epibolija
                           – didžiulė daugiausia epidermio ląstelių proliferacija embriono gastruliacijos tarpsniu ir ląstelių judėjimas iš nugaros į pilvo pusę, dėl ko endoderminiai ląstelių sluoksniai tampa vidiniai į invaginaciją panašaus proceso metu ir trynys atsiduria embriono viduje.
                        
                           
                              Dinaminis bandymas
                           – bandymas, kai per bandymo sistemą teka nuolatinis bandymo tirpalų srautas visą veikimo trukmę.
                        
                           
                              Vidinis plokštelės kontrolinis ėminys
                           – vidinis kontrolinis ėminys, kurį sudaro skiedimo vandens pripildytos 4 duobutės 24 duobučių plokštelėje, kad būtų galima nustatyti galimą gamintojo arba tyrėjo sukeltą plokštelių užteršimą procedūros metu ir visus su plokštele susijusius veiksnius, galbūt darančius įtaką bandymo rezultatui (pvz., temperatūros gradientą).
                        
                           
                              IUPAC
                           – Tarptautinė teorinės ir taikomosios chemijos sąjunga.
                        
                           
                              Gyvūnams laikyti skirtas vanduo
                           – vanduo, kuriame laikomos suaugusios akvariumų žuvys.
                        
                           
                              Medianinė mirtina koncentracija (LC50)
                           – bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant bandymo metu žūsta 50 % bandymo organizmų.
                        
                           
                              Pusiau statinis atnaujinimo bandymas
                           – bandymas, kurį atliekant bandymo tirpalai reguliariai atnaujinami po tam tikro laikotarpio (pvz., kas 24 h).
                        
                           
                              SMILES
                           – supaprastinto molekulių pateikimo linijine forma specifikacija.
                        
                           
                              Somitas
                           – besivystančio stuburinių embriono somitai yra į šonus nuo nervinio vamzdelio pasiskirsčiusi mezoderminė masė, iš kurios vėliau susidaro derma (dermatomas), skeleto raumuo (miotomas) ir slanksteliai (sklerotomas).
                        
                           
                              Statinis bandymas
                           – bandymas, kurį atliekant bandymo tirpalai nekeičiami visą bandymo trukmę.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – taikant šį metodą bandoma medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              UVCB
                           – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           PRIEŽIŪRA, VEISIMAS IR TIPINĖS SĄLYGOS ATLIEKANT ŪMAUS TOKSIŠKUMO ZEBRINĖS DANIJOS EMBRIONUI BANDYMUS
                        
                        
                                    
                                       Zebrinė danija (Danio rerio)
                                    
                                 
                              
                                    Rūšies kilmė
                                 
                                 
                                    Indija, Birma, Malaka, Sumatra
                                 
                              
                                    Lytinis dimorfizmas
                                 
                                 
                                    Patelės: išpūstas pilvas, kai turi ikrų
                                    Patinai: lieknesni, oranžinis atspalvis tarp mėlynų išilginių juostų (ypač aiškiai matomas prie analinio peleko)
                                 
                              
                                    Maitinimo režimas
                                 
                                 
                                    Sauso maisto dribsniai (ne daugiau kaip 3 % žuvies masės per parą) 3 – 5 kartus per parą; papildomai sūriavandenių krevečių (Artemia spec.) nauplijai ir (arba) reikiamo dydžio mažos dafnijos, gautos iš neužteršto šaltinio. Gyvas maistas yra pagerintos aplinkos šaltinis, todėl, jei įmanoma, turėtų būti duodamas, jei įmanoma. Siekiant užtikrinti optimalią vandens kokybę, maisto perteklius ir išmatos turėtų būti pašalintos maždaug po valandos nuo maitinimo.
                                 
                              
                                    Apytikrė suaugusios žuvies masė
                                 
                                 
                                    Patelių:0,65 ± 0,13 g
                                    Patinų: 0,5 ± 0,1 g
                                 
                              
                                    Veislinių žuvų priežiūra
                                 
                                 
                                    Apšvietimas
                                 
                                 
                                    Fluorescencinės lempos (plataus spektro); 10–20 μE/m2/s, 540–1 080  liuksų arba 50–100 ft-c (laboratorijos apšvietimas); 12–16 h šviesiojo laikotarpio trukmė
                                 
                              
                                    Vandens temperatūra
                                 
                                 
                                    26 ± 1 °C
                                 
                              
                                    Vandens kokybė
                                 
                                 
                                    O2 ≥ 80 % soties, kietumas, pvz., ~30–300 mg/l CaCO3, NO3
                                       -: ≤ 48mg/l, NH4
                                       + ir NO2
                                       -: < 0,001 mg/l, liekamojo chloro koncentracija <10 μg/l, bendro organinio chloro koncentracija < 25 ng/l, pH = 6,5–8,5
                                 
                              
                                    Kiti vandens kokybės kriterijai
                                 
                                 
                                    Kietųjų dalelių koncentracija < 20 mg/l, bendrosios organinės anglies koncentracija < 2 mg/l, bendra fosforo organinių pesticidų koncentracija < 50 ng/l, bendra chloro organinių pesticidų ir polichlorintųjų bifenilų koncentracija < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Žuvims laikyti skirtos talpyklos dydis
                                 
                                 
                                    pvz., 180 l, 1 žuvis/l
                                 
                              
                                    Vandens valymas
                                 
                                 
                                    Nuolatinis (per aktyvintųjų anglių filtrą); kitas galimybes sudaro deriniai su pusiau statinio atnaujinimo priežiūra ar dinamine sistema su nuolatiniu vandens atnaujinimu
                                 
                              
                                    Rekomenduojamas patinų ir patelių santykis veisiant
                                 
                                 
                                    2:1 (arba masinis nerštas)
                                 
                              
                                    Neršto talpyklos
                                 
                                 
                                    Pvz., 4 l talpyklos su plieninėmis grotelėmis dugne ir dirbtiniais augalais kaip neršto dirgikliais; išorinio apšiltinimo dembliai, arba masinis nerštas laikymo talpyklose
                                 
                              
                                    Ikrų struktūra ir išvaizda
                                 
                                 
                                    Stabilus apvalkalas (t. y. visiškai skaidrus, nelipnus, skersmuo ~ 0,8–1,5 mm)
                                 
                              
                                    Neršto išeiga
                                 
                                 
                                    Viena subrendusi patelė neršia ne mažiau kaip 50–80 ikrų per parą. Atsižvelgiant į veislę, neršto išeiga gali būti gerokai didesnė. Apvaisinimo laipsnis turėtų būti ≥70 %. Pirmą kartą neršiančių žuvų ikrų apvaisinimo laipsnis pirmuosius kelis nerštus gali būti mažesnis.
                                 
                              
                                    Bandymo tipas
                                 
                                 
                                    Statinis, pusiau statinio atnaujinimo, dinaminis, 26 ± 1 °C, 24 h kondicionuotos bandymų kameros (pvz., 24 duobučių plokštelės, 2,5–5 ml vienai duobutei)
                                 
                              
                     
                        3 priedėlis
                        
                           NORMALUS ZEBRINĖS DANIJOS VYSTYMASIS 26 °C TEMPERATŪROJE
                        
                        
                     
                        4 Priedėlis
                        
                           1 paveikslas
                        
                        
                           24 duobučių plokštelės išdėstymo schema
                        
                        
                                    1–5
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    enkių bandymo koncentracijos verčių cheminė medžiaga;
                                 
                              
                                    nC
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    neigiamas kontrolinis ėminys (skiedimo vanduo);
                                 
                              
                                    iC
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    vidinis plokštelės kontrolinis ėminys (skiedimo vanduo);
                                 
                              
                                    pC
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    teigiamas kontrolinis ėminys (3,4-dichloranilinas, 4mg/l);
                                 
                              
                                    sC
                                 
                                 
                                    –
                                 
                                 
                                    tirpiklio kontrolinis ėminys.
                                 
                              
                           2 paveikslas.
                        
                        
                           Ūmaus toksiškumo zebrinės danijos embrionui bandymo procedūros schema (iš kairės į dešinę): ikrų gamyba, ikrų surinkimas, laikymas stikliniuose induose prieš veikimą iš karto po apvaisinimo, apvaisintų ikrų atranka per inversinį ar dviejų okuliarų mikroskopą ir apvaisintų ikrų paskirstymas į 24 duobučių plokšteles su atitinkamos koncentracijos chemine medžiaga ir kontroliniais ėminiais, n – ikrų skaičius vienai bandymo koncentracijai ar kontroliniam ėminiui (šiame bandyme – 20), hpf – valandoms po apvaisinimo.
                        
                     
                        5 priedėlis
                        
                           ŪMAUS TOKSIŠKUMO ZEBRINĖS DANIJOS EMBRIONUI BANDYMO ŽŪSTAMUMO VERTINAMŲJŲ BAIGČIŲ ATLASAS
                        
                        Šios apikalinės vertinamosios baigtys rodo ūmų toksiškumą, taigi ir embrionų žūtį: Embriono koaguliacija, uodegos neatsiskyrimas, somitų nesusidarymas ir širdies plakimo nebuvimas. Šios mikrofotografijos buvo parinktos kaip šių vertinamųjų baigčių vaizdinė medžiaga.
                        
                           1 paveikslas
                        
                        
                           Embriono koaguliacija
                        
                        Šviesiojo lauko apšvietimo sąlygomis koaguliavusiuose zebrinės danijos embrionuose matomi įvairūs neskaidrūs intarpai.
                        
                           2 paveikslas
                        
                        
                           Somitų nesusidarymas
                        
                        Nors vystymasis vėluoja maždaug 10 h, 24 h amžiaus zebrinės danijos embrionui a) matomi gerai išsivystę somitai (→), o embrionui b) nesimato jokių somitų susidarymo požymių (→). Nors gerai matoma trynio maišelio edema (*), 48 h amžiaus zebrinės danijos embrionui c) ryškiai matomi susidarę somitai (→), o d) pavaizduotas 96 h amžiaus zebrinės danijos embrionas neturi jokių somitų susidarymo požymių (→). Atkreipiamas dėmesys į tai, kad d) pavaizduotas embrionas turi išlinkusį stuburą (skoliozė) ir perikardo edemą (*).
                        
                           3 paveikslas
                        
                        
                           Uodegos pumpuro neatsiskyrimo
                        
                        
                           4 paveikslas
                        
                        
                           Širdies plakimo nebuvimas
                        
                        Atsižvelgiant į apibrėžtį aišku, kad tai būtų sunku pavaizduoti mikrofotografijoje. Širdies plakimo nebuvimą rodo širdies nesusitraukimas (dviguba rodyklė). Kraujo ląstelių nejudrumas, pvz., pilvo aortos (→įklijoje) nėra širdies plakimo nebuvimo rodiklis. Taip pat reikia atkreipti dėmesį į tai, kad nesusidaro šio embriono somitai (*, raumenų audiniai labiau vientisi, o ne segmentuoti). Stebėjimo trukmė širdies plakimo nebuvimui registruoti turėtų būti ne mažesnė kaip viena minutė, esant ne mažesniam kaip 80× didinimui.
                     
                     C.50   Toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymas sistemoje be nuosėdų
                     
                     ĮVADAS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 238 (2014). Jis sukurtas siekiant įvertinti cheminių medžiagų toksiškumą varpotajai plunksnalapei Myriophyllum spicatum, po vandeniu augančiam plunksnalapių šeimos dviskilčiam augalui. Bandymų metodas pagrįstas ASTM taikomu bandymų metodu (1), modifikuotu kaip sistema be nuosėdų (2), kad būtų įvertintas bandomųjų cheminių medžiagų būdingasis ekotoksiškumas (neatsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymo tarp vandens ir nuosėdų pobūdį). Bandymo sistema be nuosėdų analizės požiūriu yra nesudėtinga (tik vandens fazėje), o rezultatai gali būti nagrinėjami lygiagrečiai ir (arba) lyginant su gautais atliekant Lemna sp. bandymą (3); be to, dėl reikiamų sterilių sąlygų yra visiškai sumažintas mikroorganizmų ir dumblių poveikis (cheminės medžiagos sugertis ir (arba) skaidymas ir kt). Šis bandymas nepakeičia kitų toksiškumo vandeninei terpei bandymų; jis greičiau turėtų juos papildyti taip, kad būtų galima išsamiau įvertinti pavojų vandens augalams ir riziką. Bandymų metodo tinkamumas buvo patvirtintas atliekant tarplaboratorinį bandymą (4).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Išsamiai aprašytas bandymas su bandymo tirpalo atnaujinimu (pusiau statinis) ir be atnaujinimo (statinis). Atsižvelgiant į bandymo tikslus ir reglamentavimo reikalavimus, rekomenduojama atsižvelgti į galimybę taikyti pusiau statinį metodą, pvz., jei cheminės medžiagos greitai pasišalina iš tirpalo dėl lakumo, adsorbcijos, fotocheminio skaidymo, nusėdimo arba biologinio skaidymo. Papildomi nurodymai pateikti (5). Šis bandymų metodas taikomas cheminėms medžiagoms, kurioms jis buvo patvirtintas (daugiau duomenų pateikta tarplaboratorinio bandymo ataskaitoje (4)), arba preparatams ar žinomiems mišiniams; jei bandomas mišinys, jo sudedamosios dalys turėtų būti kiek įmanoma geriau identifikuotos ir kiekybiškai nustatytos. Šis sistemos be nuosėdų Myriophyllum spicatum bandymų metodas papildo toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymą vandens ir nuosėdų sistemoje (6). Prieš taikant bandymų metodą mišiniui numatomo reglamentavimo tikslais, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, tai dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.
                              
                           BANDYMO PRINCIPAS
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Nuolat augančios (tik modifikuotoje Andrews terpėje, žr. 2 priedėlį) Myriophyllum spicatum augalinės kultūros auginamos kaip monokultūra, 14 parų jas veikiant įvairios koncentracijos bandomąja chemine medžiaga bandymo sistemoje be nuosėdų. Bandymo tikslas – su chemine medžiaga susijusio poveikio vegetatyviniam augimui šiuo laikotarpiu kiekybinis įvertinimas, pagrįstas pasirinktų matuojamų kintamųjų įvertinimu. Matuojami kintamieji yra augančių ūglių, šoninių šakų ir šaknų ilgis, taip pat žaliosios ir sausos medžiagos masės didėjimas ir žiedų vainikų skaičiaus didėjimas. Be to, atsižvelgiama į būdingus kokybinius bandymo organizmų pokyčius, pvz., defektus arba chlorozę ar nekrozę, kurias rodo pageltimas arba balta ir ruda spalva. Siekiant kiekybiškai nustatyti su cheminė medžiaga susijusį poveikį, augimas bandymo tirpaluose lyginamas su augimu kontroliniuose ėminiuose ir nustatoma x % augimo slopinimą sukelianti koncentracija, išreiškiama ECx; kai x gali būti kuri nors vertė, atsižvelgiant į reglamentavimo reikalavimus, pvz., EC10, EC20, EC50. Reikėtų pažymėti, kad EC10 ir EC20 įverčių vertės yra patikimos ir tinka atliekant tik tokius bandymus, kurių kontroliniams augalams nustatyti variacijos koeficientai yra mažesni nei vertinamas poveikio lygis, t. y. variacijos koeficientai turėtų būti < 20 %, kad EC20 įvertis būtų statistiškai patikimas.
                              
                           
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Reikėtų nustatyti apdorotų ir neapdorotų augalų vidutinį savitąjį augimo greitį (apskaičiuotą pagal pagrindinio ūglio ilgio ir trijų papildomų matuojamų kintamųjų vertinimo duomenis) ir išeigą (apskaičiuotą pagal pagrindinio ūglio ilgio ir trijų papildomų matuojamų kintamųjų padidėjimo duomenis). Savitasis augimo greitis (r) ir išeiga (y) vėliau naudojami ErCx (pvz., ErC10, ErC20, ErC50) ir EyCx (pvz., EyC10, EyC20, EyC50) nustatyti.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Be to, gali būti statistiškai nustatyta mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC) ir nestebimo poveikio koncentracija (NOEC).
                              
                           INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                     
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Turėtų būti atitinkamo jautrio analizės metodas bandomosios cheminės medžiagos kiekiui bandymo terpėje kiekybiškai nustatyti. Informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kuri gali būti naudinga bandymo sąlygoms nustatyti, sudaro struktūrinė formulė, grynumas ir priemaišos, tirpumas vandenyje, patvarumas veikiant vandeniui ir šviesai, rūgšties disociacijos konstanta (pKa), pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (Kow), garų slėgis ir biologinis skaidumas. Tirpumas ir garų slėgis gali būti naudojami Henrio dėsnio konstantai apskaičiuoti, kuri rodytų, ar atliekant bandymą gali būti didelių bandomosios cheminės medžiagos garavimo nuostolių. Tai padėtų nustatyti, ar reikėtų imtis konkrečių priemonių tokiems nuostoliams kontroliuoti. Jei duomenys apie bandomosios cheminės medžiagos tirpumą ir patvarumą yra neapibrėžti, šias savybes rekomenduojama įvertinti bandymo sąlygomis, t. y. bandymui naudotos auginimo terpės, temperatūros, apšvietimo režimo sąlygomis.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Bandymo terpės pH kontrolė yra ypač svarbi, pvz., kai bandomi metalai arba cheminės medžiagos, kurios yra nestabilios dėl hidrolizės. Kiti nurodymai, kaip bandyti chemines medžiagas, kurių fizikinės ir cheminės savybės apsunkina šią užduotį, pateikti EBPO rekomendaciniame dokumente (5).
                              
                           BANDYMO TINKAMUMAS
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Bandymo tinkamumui patvirtinti kontrolinio ėminio pagrindinio ūglio ilgio dvigubėjimo trukmė turi būti trumpesnė kaip 14 parų. Šiame bandymų metode aprašytomis terpių ir bandymo sąlygomis šį kriterijų galima atitikti naudojant statinio ar pusiau statinio bandymo režimą.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Kontrolinių kultūrų kartotinių ėminių išeigos, pagrįstos ūglių žaliosios medžiagos masės matavimais (t. y. nuo bandymo pradžios iki jo pabaigos) ir papildomais matuojamais kintamaisiais (žr. 37 pastraipą), vidutinis variacijos koeficientas yra ne didesnis kaip 35 %.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Visą 14 parų veikimo laikotarpį daugiau kaip 50 % kontrolinės grupės kartotinių ėminių laikoma steriliomis sąlygomis, kurios reiškia, kad nėra matomos taršos kitais organizmais, pvz., dumbliais, grybeliais ir bakterijomis (skaidrus tirpalas). Pastaba. Nurodymai dėl sterilumo vertinimo pateikti tarplaboratorinio tyrimo ataskaitoje (4).
                              
                           ETALONINĖ CHEMINĖ MEDŽIAGA
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Galima bandyti etaloninę (-es) cheminę (-es) medžiagą (-as), pvz., 3,5-dichlorfenolį, naudotą atliekant tarplaboratorinį tyrimą (4), kaip priemonę bandymo procedūrai patikrinti; pagal tarplaboratorinio tyrimo duomenis 3,5-dichlorfenolio vidutinė EC50 vertė, gauta skirtingiems atsako kintamiesiems (žr. šio bandymų metodo 37–41 pastraipą), yra nuo 3,2 mg/l iki 6,9 mg/l (šių verčių pasikliovimo intervalo duomenys pateikti tarplaboratorinio tyrimo ataskaitoje). Patartina etaloninę cheminę medžiagą bandyti bent du kartus per metus arba vienu metu su bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo nustatymu, jei bandymai atliekami rečiau.
                              
                           METODO APRAŠYMAS
                     
                        Aparatūra
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Visa įranga, kuri liečiasi su bandymo terpe, turėtų būti pagaminta vien tik iš stiklo arba kitos chemiškai inertinės medžiagos. Stikliniai indai, skirti kultūroms auginti ir bandymams atlikti, turėtų būti išvalyti nuo cheminių medžiagų priemaišų, kurios galėtų būti išplautos į bandymo terpę, ir jie turėtų būti sterilūs. Bandymo indai turėtų būti pakankamai ilgi, kad kontrolinių ėminių indų ūgliai galėtų augti vandeninėje fazėje ir bandymo pabaigoje nepasiektų bandymo terpės paviršiaus. Rekomenduojama naudoti aliuminio dangteliais uždengiamus storasienius borosilikatinio stiklo mėgintuvėlius be snapelių, kurių vidinis skersmuo būtų apie 20 mm, ilgis – apie 250 mm.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Kadangi modifikuota Andrews terpė turi sacharozės (kuri skatina grybelių ir bakterijų augimą), bandymo tirpalai turi būti ruošiami sterilumo sąlygomis. Visus skysčius ir visą įrangą prieš naudojant reikia sterilizuoti. Sterilizuojama 4 h apdorojant karštu oru (210 °C) arba 20 min autoklave 121 °C temperatūroje. Be to, visos kolbos, lėkštės, dubenys ir kita įranga prieš pat naudojimą apdorojami liepsna ant sterilaus darbastalio.
                              
                           
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Kultūros ir bandymo indai neturėtų būti laikomi kartu. Geriausia tai būtų pasiekti naudojant atskiras klimatines auginimo kameras, inkubatorius arba patalpas. Turėtų būti įmanoma kontroliuoti ir užtikrinti pastovaus lygio apšvietimą ir temperatūrą.
                              
                           
                        Bandymo organizmas
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Varpotoji plunksnalapė Myriophyllum spicatum – po vandeniu augantis plunksnalapių šeimos dviskiltis augalas. Neryškios rožinės spalvos gėlės pasirodo virš vandens paviršiaus nuo birželio iki rugpjūčio mėnesio. Augalai turi į gruntą įleidžiamą tvirtą šakniastiebių sistemą, jų galima rasti viso šiaurės pusrutulio eutrofiniuose, bet ne užterštuose ir daugiau kalkėtuose stovinčio vandens telkiniuose su dumblo substratu. Myriophyllum spicatum labiau patinka gėlas vanduo, bet augalų randama ir sūrokame vandenyje.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Atliekant toksiškumo bandymą sistemoje be nuosėdų, reikia naudoti sterilius augalus. Jei bandymų laboratorija neturi nuolat auginamų Myriophyllum spicatum kultūrų, sterilią augalinę medžiagą galima gauti iš kitos laboratorijos arba (nesterili) augalinė medžiaga gali būti paimta iš lauko arba gauta iš privataus tiekėjo; jei naudojami laukiniai augalai, reikėtų numatyti taksonominį rūšies patikrinimą. Jei kultūra renkama lauke arba gaunama iš privataus tiekėjo, augalus reikėtų sterilizuoti (1) ir ne trumpiau kaip aštuonias savaites prieš bandymą reikėtų laikyti toje pačioje terpėje, kuri naudojama bandymams. Pradinėms kultūroms rinkti naudojamose lauko vietose neturi būti akivaizdžių užkrėtimo šaltinių. Reikėtų imtis visų atsargumo priemonių, kurios padėtų užtikrinti, kad lauko sąlygomis būtų renkama tinkama Myriophyllum spicatum rūšis, ypač tuose regionuose, kuriuose ji gali kryžmintis su kitomis Myriophyllum rūšimis. Jei kultūros gaunamos iš kitos laboratorijos, jos turėtų būti panašiai laikomos bent tris savaites. Ataskaitoje turėtų būti visuomet nurodytas bandymams naudojamos augalinės medžiagos šaltinis ir rūšis.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Bandymui naudojamų augalų kokybė ir vienodumas darys didelę įtaką bandymo rezultatui, todėl jie turėtų būti kruopščiai atrenkami. Turėtų būti naudojami jauni, greitai augantys augalai, neturintys matomų pažeidimų arba spalvos pokyčio (chlorozės). Išsami informacija apie bandymo organizmo paruošimą pateikta 4 priedėlyje.
                              
                           
                        Auginimas
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Siekiant sumažinti kultūros priežiūros dažnumą (pvz., jei tam tikrą laiką neplanuojama atlikti bandymo su Myriophyllum), kultūras galima laikyti esant sumažintam apšvietimui ir žemesnėje temperatūroje (50 μE m0 2 s– 1, 20 ± 2 °C). Išsami informacija apie kultūros auginimą pateikta 3 priedėlyje.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Ne vėliau kaip 14–21 parą prieš bandymą pakankamas sterilių bandymo organizmų kiekis steriliai pernešamas į naują sterilią terpę, kurioje kultūra auginama bandymo sąlygomis 14–21 parą. Išsami informacija apie iš anksto ruošiamos kultūros paruošimą pateikta 4 priedėlyje.
                              
                           
                        Bandymo terpė
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Bandymo sistemai be nuosėdų rekomenduojama tik viena Myriophyllum spicatum skirta mitybinė terpė, aprašyta 2 priedėlyje. Myriophyllum spicatum auginti ir bandyti rekomenduojama modifikuota Andrews terpė, aprašyta (1). Modifikuota Andrews terpė gaunama iš penkių atskirai paruoštų mitybinių pradinių tirpalų, pridedant 3 % sacharozės. Išsami informacija apie terpės paruošimą pateikta 2 priedėlyje.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Dešimteriopos koncentracijos modifikuota Andrews terpė reikalinga bandymo tirpalams gauti (tinkamai atskiedžiant). Šios terpės sudėtis pateikta 2 priedėlyje.
                              
                           
                        Bandymo tirpalai
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Bandymo tirpalai paprastai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Bandomosios cheminės medžiagos pradiniai tirpalai paprastai ruošiami cheminę medžiagą tirpinant demineralizuotame (t. y. distiliuotame arba dejonizuotame) vandenyje. Maistinėmis medžiagomis papildoma naudojant dešimteriopos koncentracijos modifikuotą Andrews terpę.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Bandomosios cheminės medžiagos pradinius tirpalus galima sterilizuoti 20 min autoklave 121 °C temperatūroje arba atliekant sterilųjį filtravimą, jei sterilizavimo metodas nepakeičia bandomosios cheminės medžiagos natūralių savybių. Bandymo tirpalus taip pat galima paruošti steriliomis sąlygomis steriliame demineralizuotame vandenyje arba terpėje. Renkantis bandomosios cheminės medžiagos pradinių tirpalų sterilizavimo procedūrą, reikėtų atsižvelgti į jos terminį stabilumą ir adsorbciją ant įvairių paviršių. Dėl tos priežasties pradinius tirpalus rekomenduojama ruošti steriliame vandenyje ir steriliomis sąlygomis, t. y. naudojant sterilias priemones bandomajai cheminei medžiagai tirpinti steriliomis sąlygomis (pvz., sterilizuoti liepsna, naudoti laminarinius boksus ir kt.). Šis sterilių pradinių tirpalų ruošimo metodas tinka cheminėms medžiagoms ir mišiniams.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Didžiausia bandyta bandomosios cheminės medžiagos koncentracija paprastai neturėtų būti didesnė nei koncentracija, atitinkanti jos tirpumą vandenyje bandymo sąlygomis. Jei bandomosios cheminės medžiagos mažai tirpsta vandenyje, koncentruotą pradinį tirpalą arba cheminės medžiagos dispersiją gali tekti ruošti naudojant organinį tirpiklį arba dispergentą, kad būtų lengviau įterpti tikslius bandomosios cheminės medžiagos kiekius į bandymo terpę ir palengvinti jos dispergavimą ir tirpinimą. Reikia kiek įmanoma vengti naudoti tokias medžiagas. Neturi būti fitotoksiškumo dėl tokių pagalbinių tirpiklių arba dispergentų naudojimo. Pvz., dažniausiai naudojami tirpikliai, kurie nesukelia fitotoksiškumo, kai jų koncentracija ne didesnė kaip 100 μl/l, yra acetonas ir dimetilformamidas. Jei naudojamas tirpiklis arba dispergentas, jo galutinė koncentracija turėtų būti nurodyta ataskaitoje ir būti kuo mažesnė (≤ 100 μl/l), be to, tirpiklio arba dispergento koncentracija turėtų būti vienoda visuose apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Papildomi nurodymai dėl dispergentų naudojimo pateikti (5).
                              
                           
                        Bandymo ir kontrolinių ėminių grupės
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Išankstiniai bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo Myriophyllum spicatum duomenys, gauti atliekant intervalo nustatymo bandymą, padėtų pasirinkti tinkamas bandymo koncentracijos vertes. Atliekant galutinį toksiškumo bandymą, paprastai turėtų būti nuo penkių (kaip atliekant Lemna augimo slopinimo bandymą, šio priedo C.26 skyrius) iki septynių koncentracijos verčių, išdėstytų geometrine progresija; jas reikėtų pasirinkti taip, kad NOEC ir EC50 vertės patektų į šio koncentracijos verčių intervalą (žr. toliau). Pageidautina, kad bandymo koncentracijos verčių skirtumo faktorius būtų ne didesnis kaip 3,2, bet ši vertė gali būti didesnė, jei koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivė yra gulsčia. Reikėtų pagrįsti mažesnio nei penkių koncentracijos verčių skaičiaus naudojimą. Kiekvienai koncentracijai turėtų būti naudojami bent penki kartotiniai ėminiai.
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Nustatant bandymo koncentracijos verčių intervalą (intervalo nustatymo ir (arba) galutinio toksiškumo bandymo), reikėtų atsižvelgti į šias aplinkybes:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Norint nustatyti ECx vertę, ji turėtų būti tarp bandymo koncentracijos verčių reikiamam pasikliovimo lygiui užtikrinti. Pvz., jei įvertinama EC50, didžiausia bandymo koncentracija turėtų būti didesnė nei EC50 vertė. Jei EC50 vertė yra už bandymo koncentracijos verčių intervalo ribų, susiję pasikliovimo intervalai bus dideli ir gali būti neįmanomas tinkamas statistinio modelio atitikties vertinimas.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Jei reikia įvertinti LOEC ir (arba) NOEC, mažiausia bandymo koncentracija turėtų būti pakankamai maža, kad augimas nebūtų gerokai mažesnis nei kontroliniuose ėminiuose. Be to, didžiausia bandymo koncentracija turėtų būti gana didelė, kad augimas būtų gerokai mažesnis nei kontroliniuose ėminiuose. Jei taip nėra, bandymą reikės pakartoti taikant kitą koncentracijos verčių intervalą (išskyrus kai didžiausia koncentracija atitinka ribinę tirpumo vandenyje koncentraciją arba didžiausią reikiamą ribinę koncentraciją, pvz., 100 mg/l).
                                          
                                       
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Į kiekvieną bandymą reikėtų įtraukti kontrolinius ėminius, kuriuos sudaro ta pati kaip bandymo indų mitybinė terpė, bandymo organizmas (pasirenkant kiek įmanoma labiau vienalytę augalinę medžiagą, žalias iš anksto paruoštų kultūrų šonines šakas, sutrumpintas iki 2,5 cm nuo pagrindo), aplinkos sąlygos ir procedūros, bet be bandomosios cheminės medžiagos. Jei naudojamas pagalbinis tirpiklis arba dispergentas, reikėtų įtraukti papildomą kontrolinį ėminį, turintį tirpiklio ir (arba) dispergento, kurių koncentracija atitiktų naudojamą induose su bandomąja chemine medžiaga. Kartotinių kontrolinių ėminių indų skaičius (ir tirpiklio indų, jei taikoma) turėtų būti ne mažiau kaip dešimt.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Jei nereikia nustatyti NOEC, bandymo schema gali būti pakeista padidinant koncentracijos verčių skaičių ir sumažinant kiekvienos bandymo koncentracijos kartotinių ėminių skaičių. Tačiau visais atvejais kartotinių kontrolinių ėminių skaičius turėtų būti ne mažesnis kaip dešimt.
                              
                           
                        Veikimas bandomąja medžiaga
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Žalios iš anksto paruoštos kultūros šoninės šakos, sutrumpintos iki 2,5 cm atstumu nuo pagrindo, atsitiktinai paskirstomos tarp bandymo indų steriliomis sąlygomis; kiekviename bandymo inde turėtų būti viena 2,5 cm ilgio šoninė šaka, kuri viename gale turėtų viršūninę meristemą. Pasirinkta augalinė medžiaga turėtų būti vienodos kokybės visuose bandymo induose.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Reikia taikyti atsitiktinio bandymo indų išdėstymo inkubatoriuje schemą, siekiant kiek įmanoma sumažinti padėties erdvėje, šviesos intensyvumo arba temperatūros skirtumų įtaką. Taip pat reikėtų taikyti blokinę schemą arba atsitiktinį indų vietos pakeitimą (arba dažnesnį vietos pakeitimą), kai atliekami stebėjimai.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Jei parengiamasis stabilumo bandymas rodo, kad neįmanoma užtikrinti bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos visą bandymo trukmę (14 parų) (t. y. išmatuotoji koncentracija sumažėja iki mažesnės nei 80 % išmatuotos pradinės koncentracijos), rekomenduojamas pusiau statinis bandymo režimas. Šiuo atveju bent kartą bandymo laikotarpiu (pvz., 7 parą) augalus reikėtų veikti tik ką paruoštais bandymo ir kontrolinių ėminių tirpalais. Veikiamosios terpės keitimo į naują terpę dažnumas priklausys nuo bandomosios cheminės medžiagos stabilumo; dažniau gali tekti keisti labai nepatvarių arba lakiųjų cheminių medžiagų tirpalus, siekiant užtikrinti beveik pastovias koncentracijos vertes.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Veikimo per lapus (purškiant) scenarijus pagal šį bandymų metodą netaikomas.
                              
                           
                        Bandymo sąlygos
                     
                     
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Reikėtų naudoti šiltą ir (arba) šaltą baltos spalvos fluorescencinių lempų apšvietimą, kurio energinė apšvieta būtų apie 100–150 μE m– 2 s– 1, kai matuojama kaip aktyvioji fotosintezės spinduliuotė (400–700 nm) vienodu atstumu nuo šviesos šaltinio, pvz., bandymo indų apačioje (atitinka maždaug 6 000–9 000 liuksų), ir taikomas šviesos bei tamsos 16:8 h ciklas. Šviesos aptikimo ir matavimo metodas, ypač jutiklio tipas, turės įtakos išmatuotai vertei. Sferiniai jutikliai (kurie reaguoja į šviesą, krintančią iš visų kampų aukščiau ir žemiau matavimo plokštumos) ir „kosinusiniai“ jutikliai (kurie reaguoja į šviesą, krintančią iš visų kampų aukščiau matavimo plokštumos) yra geresni nei vienos krypties jutikliai, ir šiame bandyme aprašytam daugiataškio šviesos šaltinio tipui bus gaunami didesni rodmenys.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Temperatūra bandymo induose turėtų būti 23 ± 2 °C. Reikia imtis papildomų atsargumo priemonių dėl pH kitimo atskirais atvejais, pvz., bandant nepatvarias chemines medžiagas arba metalus; pH visą laiką turėtų būti 6–9 intervale. Papildomi nurodymai pateikti (5).
                              
                           
                        Trukmė
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Bandymas baigiamas praėjus 14 parų nuo augalų pernešimo į bandymo indus.
                              
                           
                        Matavimai ir analiziniai nustatymai
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Bandymo organizmo pagrindinio ūglio ilgis bandymo pradžioje yra 2,5 cm (žr. 29 pastraipą); jis matuojamas su liniuote (žr. 4 priedėlį) arba darant nuotraukas ir atliekant vaizdų analizę. Tai, ar bandymo organizmo pagrindinio ūglio ilgis yra normalus ar nenormalus, turi būti nustatyta bandymo pradžioje, taip pat bent vieną kartą per 14 parų veikimo laikotarpį ir bandymo pabaigoje. Pastaba. Tie, kurie neturi vaizdo analizės sistemos, kaip alternatyvą gali naudoti sterilią liniuotę pagrindinio ūglio ilgiui matuoti bandymo pradžioje ir bandymo metu, jei, prieš dedant augalus į bandymo indus, darbastalis yra sterilizuotas. Turėtų būti pažymėti augalų vystymosi pokyčiai, pvz., ūglių deformacija, išvaizda, nekrozės, chlorozės, smulkėjimo arba plūdrumo netekimo požymiai, šaknų ilgis ir išvaizda. Be to, reikėtų pažymėti reikšmingas bandymo terpės savybes (pvz., neištirpusios medžiagos buvimą, dumblių, grybelių ir bakterijų augimą bandymo inde).
                              
                           
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Be pagrindinio ūglio ilgio nustatymo atliekant bandymą, taip pat reikėtų įvertinti bandomosios cheminės medžiagos poveikį trim (arba daugiau) iš šių matuojamų kintamųjų:
                                 
                                             i.
                                          
                                          
                                             bendram šoninių šakų ilgiui;
                                          
                                       
                                             ii.
                                          
                                          
                                             bendram ūglių ilgiui;
                                          
                                       
                                             iii.
                                          
                                          
                                             bendram šaknų ilgiui;
                                          
                                       
                                             iv.
                                          
                                          
                                             žaliosios medžiagos masei;
                                          
                                       
                                             v.
                                          
                                          
                                             sausos medžiagos masei;
                                          
                                       
                                             vi.
                                          
                                          
                                             žiedų vainikų skaičiui.
                                          
                                       
                                             
                                                1 pastaba.
                                             
                                          
                                          
                                             Stebėjimai atliekant intervalo nustatymo bandymą gali padėti pasirinkti reikiamus papildomus matavimus iš šešių pirmiau išvardytų kintamųjų.
                                          
                                       
                                             
                                                2 pastaba.
                                             
                                          
                                          
                                             Ypač pageidautina, kad būtų nustatyta žaliosios ir sausos medžiagos masė (iv ir v parametrai).
                                          
                                       
                                             
                                                3 pastaba.
                                             
                                          
                                          
                                             Atsižvelgiant į tai, kad sacharozė ir šviesa (dėl šaknų ekspozicijos šviesai bandymo metu) gali turėti įtakos auksino (augalų augimo hormono) pernešėjams ir kad kai kurių cheminių medžiagų veikimo mechanizmas gali būti panašus į auksino, šaknų vertinamųjų baigčių (iii parametro) įtraukimas kelia abejonių.
                                          
                                       
                                             
                                                4 pastaba.
                                             
                                          
                                          
                                             Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai rodo, kad bendro šoninių šakų ilgio (i parametro) variacijos koeficientai yra labai dideli (> 60 %). Bendras šoninių šakų ilgis yra bet kuriuo atveju įtrauktas į bendro ūglių ilgio matmenį (ii parametrą), kuriam gaunami labiau priimtini < 30 % variacijos koeficientai.
                                          
                                       
                                             
                                                5 pastaba.
                                             
                                          
                                          
                                             Atsižvelgiant į pirmiau pateiktus argumentus, rekomenduojamos šios pagrindinės matavimų vertinamosios baigtys: bendras ūglių ilgis, žaliosios ir sausos medžiagos masė (ii, iv ir v parametrai); vi parametras, žiedų vainikų skaičius paliekamas bandytojo nuožiūrai.
                                          
                                       
                           
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Pirmenybė teikiama pagrindinio ūglio ilgiui ir žiedų vainikų skaičiui, nes juos galima nustatyti kiekviename bandymo ir kontrolinio ėminio inde bandymo pradžioje, jo metu ir bandymą baigus, darant nuotraukas ir atliekant vaizdų analizę, nors taip pat galima naudoti (sterilią) liniuotę.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Bendras šoninių šakų ilgis, bendras šaknų ilgis (kaip visų šoninių šakų ar šaknų ilgio suma) ir bendras ūglių ilgis (kaip pagrindinio ūglio ilgio ir visų šoninių šakų ilgio suma) gali būti išmatuotas liniuote veikimo pabaigoje.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Žaliosios ir (arba) sausos medžiagos masę reikėtų nustatyti bandymo pradžioje, imant bandymui pradėti naudojamos iš anksto paruoštos kultūros reprezentatyvųjį ėminį ir bandymo pabaigoje nustatant kiekvieno bandymo ir kontrolinio ėminio indo augalinės medžiagos masę.
                              
                           
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Bendras šoninių šakų ilgis, bendras ūglių ilgis, bendras šaknų ilgis, žaliosios medžiagos masė, sausos medžiagos masė ir žiedų vainikų skaičius gali būti nustatytas taip:
                                 i.   
                                       bendras šoninių šakų ilgis
                                    : šoninių šakų ilgis gali būti nustatytas liniuote matuojant visas šonines šakas veikimo pabaigoje. Bendras šoninių šakų ilgis yra kiekvieno bandymo ir kontrolinio ėminio indo visų šoninių šakų ilgio suma;
                                 ii.   
                                       bendras ūglių ilgis
                                    : pagrindinio ūglio ilgis gali būti nustatytas atliekant vaizdo analizę arba matuojant liniuote. Bendras ūglių ilgis yra kiekvieno bandymo ir kontrolinio ėminio indo visų šoninių šakų ilgio ir pagrindinio ūglio ilgio veikimo pabaigoje suma;
                                 iii.   
                                       bendras šaknų ilgis
                                    : šaknų ilgis gali būti nustatytas liniuote matuojant visas šonines šakas veikimo pabaigoje. Bendras šaknų ilgis yra kiekvieno bandymo ir kontrolinio ėminio indo visų šoninių šakų ilgio suma;
                                 iv.   
                                       žaliosios medžiagos masė
                                    : žaliosios medžiagos masė gali būti nustatyta pasveriant bandymo organizmus veikimo pabaigoje. Visa kiekvieno bandymo bei kontrolinio ėminio indo augalinė medžiaga plaunama distiliuotu vandeniu ir sausai nušluostoma popieriumi iš celiuliozės. Taip paruoštos žaliosios medžiagos masė nustatoma sveriant. Pradinis biomasės kiekis (žaliosios medžiagos masė) nustatomas sveriant bandymo organizmų ėminį, paimtą iš tos pačios partijos, kurios sėjinukai buvo dedami į bandymo indus;
                                 v.   
                                       sausos medžiagos masė
                                    : po paruošiamųjų darbų žaliosios medžiagos masei nustatyti bandymo organizmai džiovinami 60 °C temperatūroje iki pastoviosios masės. Ši masė yra sausos medžiagos masė. Pradinis biomasės kiekis (sausos medžiagos masė) nustatomas sveriant bandymo organizmų ėminį, paimtą iš tos pačios partijos, kurios sėjinukai buvo dedami į bandymo indus;
                                 vi.   
                                       žiedų vainikų skaičius
                                    : suskaičiuojami visi žiedų vainikai išilgai pagrindinio ūglio.
                              
                           
                        Matavimų ir analizinių nustatymų dažnumas
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Jei taikoma statinio bandymo schema, kiekvieno apdoroto ėminio pH vertė turėtų būti matuojama bandymo pradžioje ir pabaigoje. Jei taikoma pusiau statinio bandymo schema, turėtų būti matuojama kiekvienos „naujos“ bandymo tirpalo partijos pH vertė prieš kiekvieną atnaujinimą ir dar atitinkamo „panaudoto“ tirpalo pH vertė.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Šviesos intensyvumas turėtų būti matuojamas tose auginimo kameros, inkubatoriaus arba patalpos vietose, kurios yra pusiaukelėje tarp šviesos šaltinio ir bandymo organizmų. Matuojama bent vieną kartą bandymo laikotarpiu. Terpės temperatūra pakaitiniame inde, kuris laikomas tokiomis pačiomis auginimo kameros, inkubatoriaus arba patalpos sąlygomis, turėtų būti registruojama bent kartą per dieną (arba nuolat duomenų registravimo įtaisu).
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) koncentracijos vertės nustatomos bandymo metu reikiamu dažnumu. Atliekant statinius bandymus, koncentraciją reikia matuoti bent bandymo pradžioje ir pabaigoje.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Atliekant pusiau statinius bandymus, kai nesitikima, kad bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) koncentracijos vertės galėtų visą laiką būti lygios nominaliajai koncentracijai ± 20 %, būtina analizuoti visus naujai paruoštus bandymo tirpalus ir tuos pačius tirpalus kiekvieno atnaujinimo momentu. Tačiau atliekant tuos bandymus, kurių išmatuota pradinė bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) koncentracija neatitinka nominaliosios koncentracijos ± 20 % verčių, bet galima pateikti pakankamai įrodymų, kad pradinės koncentracijos vertės yra pakartojamos ir stabilios (t. y. yra lygios 80–120 % pradinės koncentracijos), galima nustatyti tik didžiausią ir mažiausią bandymo koncentraciją. Visais atvejais bandymo koncentracijos vertes reikia nustatyti tik viename kiekvienos bandymo koncentracijos kartotinio ėminio inde (arba analizuoti sujungtų kartotinių ėminių turinį).
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Jei yra įrodymų, kad visą bandymo trukmę galima patenkinamai užtikrinti nominaliąją ar išmatuotą pradinę koncentraciją ± 20 % tikslumu, rezultatų analizė gali būti pagrįsta nominaliomis ar išmatuotomis pradinėmis vertėmis. Jei nuokrypis nuo nominaliosios arba išmatuotos pradinės koncentracijos yra didesnis kaip ± 20 %, rezultatų analizę reikėtų pagrįsti veikimo laikotarpio koncentracijos geometriniu vidurkiu arba reikėtų taikyti modelius, kurie apibūdintų bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos mažėjimą (5).
                              
                           
                        Ribinis bandymas
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Kai kuriomis aplinkybėmis, pvz., kai parengiamasis bandymas rodo, kad toksinio poveikio nėra, jei bandomosios cheminės medžiagos koncentracija yra mažesnė kaip 100 mg/l arba mažesnė kaip jos tirpumo bandymo terpėje ribinė koncentracija ar preparatų dispersijos ribinė koncentracija, galima atlikti ribinį bandymą, lyginant kontrolinės grupės ir vienos apdorotų ėminių grupės (100 mg/l arba tirpumo ribinei vertei lygios koncentracijos) atsakus. Labai rekomenduojama, kad jis būtų patvirtintas analizuojant veikimo koncentraciją. Ribiniam bandymui taikomos visos anksčiau aprašytos bandymo sąlygos ir tinkamumo kriterijai, išskyrus tai, kad kartotinių apdorotų ėminių turėtų būti du kartus daugiau. Augimą kontrolinių ir apdorotų ėminių grupėse galima analizuoti taikant statistinį kriterijų, pvz., Stjudento t kriterijų, vidurkiams palyginti.
                              
                           DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                        Atsako kintamieji
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį Myriophyllum spicatum vegetatyviniam augimui. Šiame bandymų metode aprašyti du atsako kintamieji.
                                 a)   
                                       Vidutinis savitasis augimo greitis
                                    : šis atsako kintamasis yra apskaičiuojamas pagal kontrolinių ėminių ir kiekvienos apdorotų ėminių grupės pagrindinio ūglio ilgio logaritmo, be to, kitų matuojamų parametrų, t. y. bendro ūglių ilgio, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės arba žiedų vainikų skaičiaus laikinį kitimą (išreiškiamą parai). Pastaba. ei matavimo parametrai yra bendras šoninių šakų ilgis ir bendras šaknų ilgis, jų vidutinio savitojo augimo greičio išmatuoti negalima. Bandymo pradžioje bandomasis organizmas neturi šoninių šakų ir jokių šaknų (taip yra todėl, kad ruošiama imant iš anksto paruoštą kultūrą); vidutinio savitojo augimo greičio skaičiavimas nuo nulinės vertės nėra apibrėžtas.
                                 b)   
                                       Išeiga
                                    : šis atsako kintamasis yra apskaičiuojamas pagal kontrolinių ėminių ir kiekvienos bandymo grupės ėminių pagrindinio ūglio ilgio pokytį, be to, pagal kitų matuojamų parametrų, t. y. bendro ūglių ilgio, kaip pageidautino parametro, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės arba žiedų vainikų skaičiaus, pokytį bei kitų parametrų, jei manoma, kad tai būtų naudinga, pokytį iki bandymo pabaigos.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Toksiškumo įverčius reikėtų pagrįsti pagrindinio ūglio ilgiu ir trimis papildomais matuojamais kintamaisiais (t. y. bendru ūglių ilgiu, kaip pageidautinu parametru, žaliosios medžiagos mase, sausos medžiagos mase arba žiedų vainikų skaičiumi, žr. 37 pastraipą ir jos 2, 4 ir 5 pastabas), nes kai kurių cheminių medžiagų įtaka kitiems matuojamiems kintamiesiems gali būti didesnė nei pagrindinio ūglio ilgiui. Šis poveikis nebūtų aptiktas apskaičiuojant vien tik pagrindinio ūglio ilgį.
                              
                           
                        Vidutinis savitasis augimo greitis
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Kontrolinių ir apdorotų grupių kiekvieno kartotinio ėminio vidutinis savitasis augimo greitis tam tikru laikotarpiu apskaičiuojamas kaip augimo kintamųjų – pagrindinio ūglio ilgio ir trijų papildomų matuojamų kintamųjų (t. y. bendro ūglių ilgio, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės ar žiedų vainikų skaičiaus) logaritminis padidėjimas taikant šią formulę:
                                 
                                    
                                 čia:
                                 
                                    
                                       μi-j
                                       
                                     vidutinis savitasis augimo greitis per laiką nuo i iki j;
                                 
                                    
                                       Ni
                                       
                                     bandymo arba kontrolinio indo matuojamas kintamasis laiko momentu i;
                                 
                                    
                                       Nj
                                       
                                     bandymo arba kontrolinio indo matuojamas kintamasis laiko momentu j;
                                 
                                    
                                       t
                                     laikotarpis nuo i iki j.
                                 Kiekvienai apdorotų ir kontrolinių ėminių grupei apskaičiuojama augimo greičio vidutinė vertė ir dispersijos įverčiai.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Turėtų būti apskaičiuotas viso bandymo laikotarpio (pirmiau pateiktoje formulėje i yra bandymo pradžios laikas, j – bandymo pabaigos laikas) vidutinis savitasis augimo greitis. Kiekvienai bandymo koncentracijai ir kontroliniam ėminiui apskaičiuojama vidutinio savitojo augimo greičio vidutinė vertė ir dispersijos įverčiai. Be to, turėtų būti įvertintas augimo greitis atskirais laikotarpiais, kad būtų galima įvertinti bandomosios cheminės medžiagos poveikį veikimo laikotarpiu (pvz., nagrinėjant logaritmines augimo kreives).
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Kiekvienos bandymo koncentracijos (apdorotų ėminių grupės) augimo greičio mažėjimas procentais (Ir) gali būti apskaičiuotas pagal šią lygtį:
                                 
                                    
                                 čia:
                                 
                                    
                                       % Ir
                                       
                                     vidutinio savitojo augimo greičio mažėjimas procentais;
                                 
                                    
                                       μC
                                     kontrolinio ėminio vidutinė μ vertė;
                                 
                                    
                                       μT
                                     apdorotų ėminių grupės μ vidutinė vertė.
                              
                           
                        Išeiga
                     
                     
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Poveikis išeigai nustatomas kiekvienam bandymo indui pagal bandymo pradžioje ir pabaigoje matuojamą kintamąjį – pagrindinio ūglio ilgį ir tris papildomus matuojamus kintamuosius (t. y. bendrą ūglių ilgį, kaip pageidautiną parametrą, žaliosios medžiagos masę, sausos medžiagos masę arba žiedų vainikų skaičių). Jei matuojama žaliosios medžiagos masė ar sausos medžiagos masė, pradinis biomasės kiekis nustatomas sveriant bandymo organizmų ėminį, paimtą iš tos pačios partijos, kurios sėjinukai buvo dedami į bandymo indus. Kiekvienai bandymo koncentracijai ir kontroliniam ėminiui apskaičiuojama išeigos vidutinė vertė ir dispersijos įverčiai. Kiekvienos apdorotų ėminių grupės vidutinį išeigos mažėjimą procentais ( % Iy) galima apskaičiuoti taip:
                                 
                                    
                                 čia:
                                 
                                    
                                       % I
                                          y
                                       
                                     išeigos mažėjimas procentais;
                                 
                                    
                                       
                                          b
                                          C
                                       
                                     kontrolinių ėminių grupės galutinės ir pradinės biomasės skirtumas;
                                 
                                    
                                       
                                          b
                                          T
                                       
                                     apdorotų ėminių grupės galutinės ir pradinės biomasės skirtumas.
                              
                           
                        Dvigubėjimo trukmė
                     
                     
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Norint nustatyti pagrindinio ūglio ilgio dvigubėjimo trukmę (Td) ir atitiktį šiam tinkamumo kriterijui (žr. 8 pastraipą), gautiems kontrolinių ėminių duomenims taikoma ši formulė:
                                 Td = ln 2/μ,
                                 kurioje μ yra vidutinis savitasis augimo greitis, nustatytas kaip aprašyta 50–52 pastraipose.
                              
                           
                        Koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivių gavimas
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Reikėtų gauti koncentracijos ir atsako kreives, kurios susieja atsako kintamojo vidutinį mažėjimą procentais (Ir ar Iy, apskaičiuotą, kaip nurodyta 53 pastraipoje) ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos logaritmą.
                              
                           
                        ECx įvertinimas
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 ECx įverčius reikėtų gauti pagal vidutinį savitąjį augimo greitį (ErCx) ir išeigą (EyCx), kurių kiekvieną reikėtų gauti pagal pagrindinio ūglio ilgį ir, galbūt, pagal papildomus matuojamus kintamuosius (t. y. bendrą ūglių ilgį, kaip pageidautiną parametrą, žaliosios medžiagos masę, sausos medžiagos masę ar žiedų vainikų skaičių). Tai daroma dėl tos priežasties, kad yra bandomųjų cheminių medžiagų, kurios skirtingai veikia pagrindinio ūglio ilgį ir kitus matuojamus kintamuosius. Todėl reikiami toksiškumo parametrai yra kiekvienam slopinimo lygiui x apskaičiuotos keturios ECx vertės: ErCx (pagrindinio ūglio ilgio); ErCx (t. y. bendro ūglių ilgio, kaip pageidautino parametro, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės ar žiedų vainikų skaičiaus); EyCx (pagrindinio ūglio ilgis) ir EyCx (t. y. bendro ūglių ilgio, kaip pageidautino parametro, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės ar žiedų vainikų skaičiaus).
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Reikėtų pažymėti, kad negalima lyginti ECx verčių, apskaičiuotų taikant šiuos du atsako kintamuosius, ir į šį skirtumą atsižvelgiama naudojant bandymo rezultatus. Jei laikomasi šio bandymų metodo sąlygų, ECx vertės, gautos pagal savitąjį augimo greitį (ErCx), paprastai bus didesnės nei išeiga pagrįsti rezultatai (EyCx, dėl atitinkamo metodo matematinio pagrindimo. Tai reikėtų aiškinti kaip dviejų atsako kintamųjų jautrio skirtumą, tiesiog vertės skiriasi matematiškai.
                              
                           
                        Statistinės procedūros
                     
                     
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Tikslas – gauti kiekybinę koncentracijos ir atsako priklausomybę, taikant regresinę analizę. Galima taikyti svertinę tiesinę regresiją, atlikus atsako duomenų tiesinamąjį transformavimą, pvz., taikant probit, logit arba Weibullo modelius (7), bet geresnės yra netiesinės regresijos metodų procedūros, kurias taikant geriau apdorojami neišvengiami duomenų netolygumai ir nukrypimai nuo tolygiųjų skirstinių. Artėjant į nulinį arba visišką slopinimą, tokie netolygumai dėl transformavimo gali padidėti ir trukdyti analizei (7). Reikėtų pažymėti, kad tipiniai analizės metodai, taikant probit, logit arba Weibullo transformaciją, yra skirti dichotominiams (pvz., mirtingumas arba išgyvenamumas) duomenims ir turėtų būti modifikuojami, norint juos pritaikyti augimo arba išeigos duomenims. Specifinės ECx verčių nustatymo pagal tolydžiuosius duomenis procedūros pateiktos (8)(9) ir (10).
                              
                           
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Kiekvienam analizuojamam atsako kintamajam naudojama koncentracijos ir atsako priklausomybė ECx verčių taškiniams įverčiams apskaičiuoti. Kai įmanoma, turėtų būti nustatytos kiekvieno įverčio 95 % pasikliovimo ribos. Atsako duomenų suderintumas su regresijos modeliu turėtų būti įvertintas grafiškai arba statistiškai. Regresinė analizė turėtų būti atliekama naudojant atskirus kartotinių ėminių atsakus, bet ne apdorotų ėminių grupių vidurkius.
                              
                           
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Be to, jei turimi regresijos modeliai ar metodai netinka duomenims, EC50 įverčiai ir pasikliovimo ribos gali būti gautos taikant tiesinį interpoliavimą su saviranka (įkėla) (10).
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, reikia palyginti apdorotų ėminių vidutines vertes, taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodus. Tuomet kiekvienai koncentracijai gautas vidurkis lyginamas su kontrolinio ėminio vidurkiu, taikant atitinkamą kartotinių palyginimų arba tendencijų kriterijaus metodą. Gali būti naudingas Dunnett arba Williams kriterijus (12)(13)(14)(15)(16). Būtina įvertinti, ar galioja ANOVA dispersijos vienalytiškumo prielaida. Šį įvertinimą galima atlikti grafiškai arba taikant formalųjį kriterijų (15). Tinkami kriterijai yra Levene arba Bartlett kriterijai. Neatitiktį prielaidai dėl dispersijų vienalytiškumo kartais galima pataisyti atliekant duomenų logaritminį transformavimą. Jei dispersijos nevienalytiškumas yra labai didelis ir jo neįmanoma pataisyti transformavimo keliu, reikėtų nagrinėti galimybę taikyti kitus analizės metodus, pvz., taikant Jonkheere tendencijos kriterijų mažėjimo tvarka. Papildomus nurodymus dėl NOEC nustatymo galima rasti (10).
                              
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Atsižvelgiant į naujus mokslo pasiekimus, rekomenduojama atsisakyti NOEC sąvokos ir ją pakeisti regresija pagrįstais ECx taškiniais įverčiais. Atliekant Myriophyllum bandymą, nebuvo nustatyta jokia tinkama x vertė. Tačiau atrodo, kad tiktų į 10–20 % intervalas (atsižvelgiant į pasirinktą atsako kintamąjį), ir pageidautina, kad ataskaitoje būtų pateikta EC10 ir EC20 vertės.
                              
                           
                        Ataskaitos teikimas
                     
                     
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Bandymo ataskaitą sudaro ši informacija:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandomoji cheminė medžiaga
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Vienkomponentė cheminė medžiaga:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt. (įskaitant organinės anglies kiekį, jei tinka).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišinys:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kiek įmanoma išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminį pavadinimą (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymo rūšis:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         mokslinis pavadinimas ir šaltinis.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymo sąlygos
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         taikyta bandymo procedūra (statinio ar pusiau statinio bandymo);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo pradžios data ir jų trukmė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo terpė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo schemos aprašymas: bandymo indai ir dangčiai, tirpalų tūriai, vieno bandymo indo pagrindinio ūglio ilgis bandymo pradžioje;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertės (nominaliosios ir išmatuotos, jei tinka) vienos koncentracijos kartotinių ėminių skaičius;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         pradinių ir bandymo tirpalų ruošimo metodai, įskaitant naudojamus tirpiklius ar dispergentus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo temperatūra;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         šviesos šaltinis, šviesos intensyvumas ir vienalytiškumas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorotų ir kontrolinių ėminių terpės pH vertės;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandomosios cheminės medžiagos analizės metodas ir atitinkami jo kokybės vertinimo duomenys (tinkamumo patvirtinimo tyrimai, analizės rezultatų standartiniai nuokrypiai arba pasikliovimo ribos);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         pagrindinio ūglio ilgio ir kitų matuojamų kintamųjų, pvz., bendro šoninių šakų ilgio, bendro ūglių ilgio, bendro šaknų ilgio, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės arba žiedų vainikų skaičiaus, nustatymo metodai;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno bandymo ir kontrolinio ėminio indo kultūros būsena (sterili ar nesterili) kiekvieno stebėjimo metu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         visi nukrypimai nuo šio bandymų metodo.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rezultatai
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         neapdoroti duomenys: kiekvieno bandymo ir kontrolinio indo pagrindinio ūglio ilgis ir kiti matuojami kintamieji kiekvienu matavimo ir analizės atveju,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno matuojamo kintamojo vidurkis ir standartinis nuokrypis,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno matuojamo kintamojo augimo kreivės;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apskaičiuoti kiekvieno apdoroto kartotinio ėminio atsako kintamieji, jų vidutinės vertės ir kartotinių ėminių variacijos koeficientas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grafinis koncentracijos ir poveikio priklausomybės vaizdas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         toksiškumo vertinamųjų baigčių įverčiai pagal atsako kintamuosius, pvz., EC50, EC10, EC20, ir atitinkami pasikliovimo intervalai. Jei buvo apskaičiuotos, LOEC ir NOEC vertės ir jų nustatymo statistiniai metodai;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         jei buvo taikytas dispersinės analizės metodas ANOVA, poveikio, kurį galima aptikti, dydis (pvz., mažiausiais reikšmingas skirtumas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         augimo skatinimas, nustatytas kurios nors koncentracijos ėminiui,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         visi stebimi fitotoksiškumo požymiai ir bandymo tirpalų stebėjimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rezultatų aptarimas, įskaitant poveikį bandymo rezultatams dėl nukrypimų nuo šio bandymų metodo.
                                                      
                                                   
                                       
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ASTM Designation E 1913-04, Standard Guide for Conducting Static, Axenic, 14-Day Phytotoxicity Tests in Test Tubes with the Submersed Aquatic Macrophyte, Myriophyllum sibiricum Komarov.
                              
                           
                                 (1)
                              
                              
                                 Maletzki, D. et al. (2010), Myriophyllum spicatum als ökotoxikologischer Testorganismus: Methodenentwicklung eines sedimentfreien Testsystems und erste Ergebnisse mit 3,5-Dichlorphenol, Umweltwiss Schadst Forsch, No. 22, pp. 702–710.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Šio priedo C.26 skyrius. Lemna spp. augimo inhibavimo bandymas.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 OECD (2014), „Myriophyllum spicatum Toxicity Test: Results of an inter-laboratory ring test using a sediment-free test system“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series Testing and Assessment, No. 205, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Šio priedo C.51 skyrius. Toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymas vandens ir nuosėdų sistemoje.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science & Technology, Vol. 18/9, 713-718.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, pp. 1485-1494.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 OECD (2006), „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88, US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp. 93-96.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Biomasė
                           – populiacijos gyvosios medžiagos masė, išreiškiama kaip žaliosios ir (arba) sausos medžiagos masė. Šiame bandyme biomasė yra pagrindinio ūglio, visų šoninių šakų ir visų šaknų masė.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Chlorozė
                           – bandymo organizmo, ypač žiedų vainikų, spalvos pasikeitimas iš žalios į gelsvą.
                        
                           
                              ECx
                              
                           – bandymo terpėje ištirpusios bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant Myriophyllum spicatum augimo greitis per nustatytą veikimo laikotarpį (jo trukmę būtina tiksliai nurodyti, jei skiriasi nuo visos ar įprastinės bandymo trukmės) sumažėja x % (pvz., 50 %). EC vertei, gautai pagal augimo greitį arba pagal išeigą, vienareikšmiškai žymėti vartojami simboliai „ErC“ augimo greičiui ir „EyC“ išeigai, toliau nurodant naudotą matuojamą kintamąjį, pvz., ErC (pagrindinio ūglio ilgis).
                        
                           
                              Augimas
                           – matuojamo kintamojo didėjimas, pvz., pagrindinio ūglio ilgio, bendro šoninių šakų ilgio, bendro ūglių ilgio, bendro šaknų ilgio, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės arba žiedų vainikų skaičiaus, bandymo laikotarpiu.
                        
                           
                              Augimo greitis (vidutinis savitasis augimo greitis)– matuojamo kintamojo logaritminis padidėjimas veikimo laikotarpiu. Pastaba. Su augimo greičiu susiję atsako kintamieji nepriklauso nuo bandymo trukmės, jei neveikiamų kontrolinių organizmų augimo schema yra eksponentinė.
                        
                           
                              Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC)– mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis augimo mažėjimui per nustatytą veikimo laikotarpį yra statistiškai reikšmingas palyginti su kontroliniais ėminiais (kai p < 0,05). Tačiau esant visoms didesnėms nei LOEC bandymo koncentracijos vertėms, kenksmingas poveikis turėtų būti lygus arba didesnis nei poveikis, kuris būtų esant LOEC. Kai negalima įvykdyti šių dviejų sąlygų, turėtų būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kaip buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vertė.
                        
                           
                              Matuojami kintamieji
                           – visų tipų kintamieji, kurie yra matuojami bandymo vertinamajai baigčiai išreikšti, naudojant vieną arba daugiau skirtingų atsako kintamųjų. Šiame bandymų metode matuojami kintamieji yra pagrindinio ūglio ilgis, bendras šoninių šakų ilgis, visas ūglių ilgis, bendras šaknies ilgis, žaliosios medžiagos masė, sausos medžiagos masė ir žiedų vainikų skaičius.
                        
                           
                              Monokultūra
                           – vienos rūšies augalų kultūra.
                        
                           
                              Nekrozė
                           – bandymo organizmo žuvęs audinys (t. y. baltas arba tamsiai rudas).
                        
                           
                              Nestebimo poveikio koncentracija (NOEC)
                           – vos mažesnė nei LOEC bandymo koncentracija.
                        
                           
                              Atsako kintamasis
                           – toksiškumui įvertinti naudojamas kintamasis, gautas pagal bet kurį nors iš matuojamų kintamųjų, skirtingais apskaičiavimo metodais apibūdinančių biomasę. Šiame bandymų metode augimo greitis ir išeiga yra atsako kintamieji, gauti pagal matuojamus kintamuosius, pvz., pagrindinio ūglio ilgį, bendrą ūglių ilgį, žaliosios medžiagos masę, sausos medžiagos masę ar žiedų vainikų skaičių.
                        
                           
                              Pusiau statinis (atnaujinimo) bandymas
                           – bandymas, kurį atliekant bandymo tirpalas periodiškai keičiamas po tam tikro laiko tarpo.
                        
                           
                              Statinis bandymas
                           – bandymų metodas, kai bandymo tirpalas neatnaujinamas atliekant bandymą.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys, bandyti pagal šį bandymų metodą.
                        
                           
                              Bandymo vertinamoji baigtis
                           – bendrasis veiksnys, kurio pokytis veikiant bandomąja chemine medžiaga palyginti su kontroliniu ėminiu yra bandymo tikslas. Šiame bandymų metode vertinamoji baigtis yra augimo slopinimas, kuris gali būti išreikštas skirtingais atsako kintamaisiais, pagrįstais vienu arba daugiau matuojamų kintamųjų.
                        
                           
                              Bandymo terpė
                           – visiškai paruošta sintetinė kultūros terpė, kurioje auga bandymo augalai, kai jie veikiami bandomąja chemine medžiaga. Bandomoji cheminė medžiaga paprastai yra ištirpinta bandymo terpėje.
                        
                           
                              UVCB
                           – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos.
                        
                           
                              Išeiga
                           – matuojamo kintamojo, naudojamo biomasės kiekiui išreikšti, vertės veikimo pabaigoje ir jo vertės veikimo pradžioje skirtumas. Pastaba. Kai neveikiamų organizmų augimo schema yra eksponentinė, išeiga pagrįsti atsako kintamieji bandymo eigoje mažės.
                     
                     
                        2 priedėlis
                        
                           MODIFIKUOTA ANDREWS TERPĖ, SKIRTA PRADINEI KULTŪRAI IR IŠ ANKSTO PARUOŠTAI KULTŪRAI
                        
                        Iš penkių atskirai paruoštų pradinių mitybinių tirpalų, pridedant 3 % sacharozės, ruošiama modifikuota Andrews terpė, skirta pradinei kultūrai ir iš anksto paruoštai kultūrai.
                        
                           1 lentelė
                        
                        
                           Andrews mitybinio tirpalo sudėtis (ASTM žymuo E 1913-04)
                        
                        
                                    Pradinio mitybinio tirpalo gamyba
                                 
                                 
                                    Mitybinio tirpalo gamyba
                                 
                              
                                    Pradinis tirpalas
                                 
                                 
                                    Cheminė medžiaga
                                 
                                 
                                    Pradinė masė/1 000  ml
                                 
                                 
                                    ml/5 l mitybinio tirpalo
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    KCl
                                 
                                 
                                    74,6 mg
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    KNO3
                                    
                                 
                                 
                                    8,08 g
                                 
                              
                                    Ca(NO3)2 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    18,88 g
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    MgSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    9,86 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    žr. pradinį tirpalą 3.1
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    2,72 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    FeSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,278 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Na2EDTA × 2 H2O
                                 
                                 
                                    0,372 g
                                 
                              Pradinius tirpalus galima laikyti šaldytuve 6 mėnesius (5–10 °C). Tik pradinio tirpalo Nr. 5 laikymo trukmė yra trumpesnė (du mėnesiai).
                        
                           2 lentelė
                        
                        
                           Pradinis tirpalas 3.1, iš kurio ruošiamas pradinis tirpalas 3
                        
                        
                                    Cheminė medžiaga
                                 
                                 
                                    Pradinė masė g/100 ml
                                 
                              
                                    MnSO4 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,223
                                 
                              
                                    ZnSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,115
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    0,155
                                 
                              
                                    CuSO4 × 5 H2O
                                 
                                 
                                    0,0125
                                 
                              
                                    (NH4)6Mo7O24 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,0037
                                 
                              Paruoštas pradinis tirpalas 3.1 (2 lentelė) užšaldomas maždaug 11 ml alikvotinėmis dalimis (ne aukštesnėje kaip – 18 °C temperatūroje). Padalytą užšaldytą tirpalą galima laikyti penkerius metus.
                        Pradinis tirpalas 3 gaminamas iš atitirpinto tirpalo 3.1, kurio 10 ml įpilama į 1 l matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės ypač švariu vandeniu.
                        Andrews modifikuotai terpei gauti į 5 l matavimo kolbą įpilama maždaug 2 500 ml ypač švaraus vandens. Įpilama po 50 ml kiekvieno pradinio tirpalo, skiedžiama ypač švariu vandeniu iki 90 % matavimo kolbos tūrio ir nustatoma pH vertė 5,8.
                        Įpilama 150 g ištirpintos sacharozės (3 % nuo 5 l tūrio) ir matavimo kolbos turinys skiedžiamas iki žymės ypač švariu vandeniu. Mitybinis tirpalas išpilstomas į 1 l Schott kolbas, kurios 20 min apdorojamos autoklave 121 °C temperatūroje.
                        Taip gautą mitybinį tirpalą galima laikyti steriliai šaldytuve (5–10 °C) tris mėnesius.
                        
                           Modifikuota Andrews terpė, skirta toksiškumo bandymui sistemoje be nuosėdų
                        
                        Iš 1 ir 2 lentelėse nurodytų penkių pradinių mitybinių tirpalų, pridedant 30 % sacharozės, ruošiama dešimteriopos koncentracijos modifikuota Andrews terpė, kurios reikia bandymo tirpalams gauti. Terpei gauti į 1 l matavimo kolbą įpilama maždaug 100 ml ypač švaraus vandens. Įpilus po 100 ml kiekvieno pradinio tirpalo, nustatoma pH vertė 5,8. Paskui įpilama 30 % sacharozės tirpalo (300 g/1 000 ml) ir matavimo kolbos turinys skiedžiamas iki žymės ypač švariu vandeniu.
                        Mitybinis tirpalas išpilstomas į 0,5 l Schott kolbas, kurios 20 min apdorojamos autoklave 121 °C temperatūroje.
                        Taip gautą dešimteriopos koncentracijos modifikuotą mitybinį tirpalą galima laikyti steriliai šaldytuve (5–10 °C) tris mėnesius.
                     
                     
                        3 priedėlis
                        
                           PRADINĖS KULTŪROS PRIEŽIŪRA
                        
                        Šiame 3 priedėlyje aprašyta pradinė kultūra Myriophyllum spicatum L (103) po vandeniu augantis plunksnalapių šeimos dviskiltis augalas. Neryškios rožinės spalvos gėlės pasirodo virš vandens paviršiaus nuo birželio iki rugpjūčio mėnesio. Augalai turi į gruntą įleidžiamą tvirtą šakniastiebių sistemą, jų galima rasti viso šiaurės pusrutulio eutrofiniuose, bet ne užterštuose ir daugiau kalkėtuose stovinčio vandens telkiniuose su dumblo substratu. Myriophyllum spicatum labiau patinka gėlas vanduo, bet augalų randama ir sūrokame vandenyje.
                        Reikia naudoti sterilius augalus pradinei kultūrai be nuosėdų auginti laboratorinėmis sąlygomis. Sterilių augalų turi Vokietijos federalinės aplinkos agentūros ekotoksikologijos laboratorija.
                        Arba bandymo organizmus galima paruošti iš nesterilių augalų pagal ASTM E 1913-04 standartą. Lauko sąlygomis surinktos Myriophyllum sibiricum kultūros auginimo procedūra aprašyta šioje ASTM standarto ištraukoje:
                        
                           „Jei pradedama nuo iš lauko sąlygomis surinktų nesterilių augalų, rudenį reikia rinkti M. sibiricum lapaūglius. Lapaūgliai dedami į 20 l akvariumą, turintį 5 cm storio sterilių nuosėdų sluoksnį, padengtą kvarciniu smėliu arba, pvz., Turface®, ir 18 l distiliuoto vandens. Akvariumas aeruojamas 15 oC temperatūroje esant 200 iki 300 μmol m– 2 s– 1 apšvietai 16 h per parą. Augalų kultūra akvariume gali būti prižiūrima kaip atsarginis augalų šaltinis tam atvejui, kai sterilios augalų kultūros sunaikinamos dėl mechaninės trikties auginimo kameroje, užteršimo arba dėl kitos priežasties. Akvariume auginami augalai nėra sterilūs ir kultūrų sterilumo negalima užtikrinti naudojant kultūros auginimo partijomis sistemą. Kultūrai sterilizuoti augalai paimami iš akvariumo ir apie 0,5 h plaunami tekančiu dejonizuotu vandeniu.Steriliomis laminarinio bokso sąlygomis augalai yra dezinfekuojami trumpiau nei 20 min (kol didžioji dalis augalų audinių išbalinama ir žalia lieka tik auganti viršūnė) 3 % (m/V) natrio hipochlorito tirpale, kuriame yra 0,01 % tinkamos paviršinio aktyvumo medžiagos. Dezinfekantas ir augalinė medžiaga maišomi. Segmentai su keliais bambliais pernešami į sterilius kultūros mėgintuvėlius su 45 ml sterilizuotos modifikuotos Andrews terpės ir mėgintuvėliai uždengiami paprastais kultūros mėgintuvėlio dangčiais. Į kiekvieną bandymo kamerą dedamas tik vienas augalo segmentas. Dangčiui pritvirtinti prie kultūros indo naudojama laboratorinė lipnioji plėvelė. Gavus sterilią kultūrą, augalų segmentus su keliais bambliais kas dešimt ar dvylika parų reikėtų pernešti į naujas bandymų kameras su nauja skystąja mitybine terpe. Auginant agaro lėkštelėse buvo įrodyta, kad augalai turi būti sterilūs ir lieka sterilūs aštuonias savaites prieš pradedant bandymus.“
                        
                        Kadangi modifikuota Andrews terpė turi sacharozės (kuri skatina grybelių ir bakterijų augimą), visos medžiagos, bandymo tirpalai ir kultūros turi būti ruošiamos sterilumo sąlygomis. Visus skysčius ir visą įrangą reikia sterilizuoti prieš naudojant. Sterilizuojama 4 h apdorojant karštu oru (210 oC) arba 20 min autoklave 121 oC temperatūroje.Be to, visos kolbos, lėkštės, dubenys ir kita įranga prieš pat naudojimą apdorojami liepsna ant sterilaus darbastalio.
                        Pradines kultūras galima laikyti ilgesnį laiką žemesnėje temperatūroje (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 oC) ir nereikia rekultivuoti. Myriophyllum auginimo terpė turėtų būti tokia pat, kaip ir bandymo terpė, bet pradinėms kultūroms galima naudoti kitų mitybinių medžiagų turinčias terpes.
                        Augalų segmentai sterilumo sąlygomis paskirstomi į kelias 500 ml kūgines arba (ir) 2 000 ml Fernbacho kolbas, kurių kiekvienoje yra 450 arba 1 000 ml modifikuotos Andrews terpės. Kolbos sterilumo sąlygomis užkemšamos celiuliozės pluošto kamščiais.
                        Be to, prieš pat pradedant naudoti įrangą, ji būtinai turi būti kruopščiai apdorota liepsna ant sterilaus darbastalio. Atsižvelgiant į augalų skaičių ir dydį, jie turi būti pernešami į naują mitybinį tirpalą maždaug kas tris savaites.
                        Šiai atnaujintai kultūrai galima naudoti viršūnes, taip pat stiebo vidurinės dalies segmentus. Perneštų augalų (ar augalų segmentų) skaičius ir dydis priklauso nuo reikiamo augalų skaičiaus. Pvz., į vieną Fernbach kolbą galima pernešti penkis ūglių segmentus, o į vieną kūginę kolbą – tris ūglius, kurių kiekvienas yra 5 cm ilgio. Reikia atmesti visus įsišaknijusias, žydinčias, nuvytusias ar kitaip išsiskiriančias dalis.
                        
                           1 paveikslas.
                        
                        
                           Augalų pjaustymas pradinei ir iš anksto paruoštai kultūrai gauti po trijų savaičių auginimo
                        
                        Augalų kultūras reikia auginti 500 ml kūginėse kolbose ir 2 000 ml Fernbacho kolbose, laikomose aušinimo inkubatoriuje 20 ± 2 oC temperatūroje ir nuolat apšviestose maždaug 100–150 μE m– 2 s– 1 arba 6 000–9 000 liuksų šviesa (kameros apšvietimas, kurio spalvos temperatūra atitinka „šiltą baltą šviesą“).
                        
                           2 paveikslas.
                        
                        
                           Augalų kultūrų auginimas aušinimo inkubatoriuje su kameros apšvietimu.
                        
                        Kultūroms auginti turėtų būti naudojami chemiškai švarūs (rūgštimi išplauti) ir sterilūs stikliniai indai, ir taikomi sterilaus apdorojimo metodai. Jei pradinė kultūra užteršiama, pvz., dumbliais, grybeliais ir (arba) bakterijomis, reikėtų paruošti naują kultūrą arba reikėtų naudoti pradinę kultūrą iš kitos laboratorijos kultūrai atnaujinti.
                     
                     
                        4 priedėlis
                        
                           IŠ ANKSTO PARUOŠTOS KULTŪROS PRIEŽIŪRA IR BANDYMO ORGANIZMO PARUOŠIMAS BANDYMAMS
                        
                        Norint gauti iš anksto paruoštą kultūrą, pradinės kultūros ūgliai supjaustomi į segmentus su dviem žiedų vainikais, segmentai sudedami į Fernbacho kolbas, pripildytas modifikuota Andrews terpe (turinčia 3 % masės sacharozės). Kiekvienoje kolboje gali būti 50 ūglių segmentų. Tačiau reikėtų užtikrinti, kad segmentai būtų gajūs ir neturėtų jokių šaknų ir šoninių šakų ar jų pumpurų (žr. 3 priedėlio 1 paveikslą).
                        Iš anksto paruoštos kultūros organizmai auginami steriliomis sąlygomis klimatinėje kameroje 14– 21 parą, esant 16 h šviesos ir 8 h tamsos tarpsniams. Pasirenkamas šviesos intensyvumas yra 100–150 μE m– 2 s– 1. Temperatūra bandymo induose turėtų būti 23 ± 2 oC.
                        Kadangi modifikuota Andrews terpė turi sacharozės (kuri skatina dumblių, grybelių ir bakterijų augimą), bandomosios cheminės medžiagos tirpalus reikėtų ruošti ir kultūras auginti sterilumo sąlygomis. Visus skysčius ir visą įrangą reikia sterilizuoti prieš naudojant. Sterilizuojama 4 h apdorojant karštu oru (210 oC) arba 20 min autoklave 121 oC temperatūroje. Be to, visos kolbos, lėkštės, dubenys ir kita įranga prieš pat naudojimą apdorojami liepsna ant sterilaus darbastalio.
                        Ūgliai išimami iš kolbų su iš anksto paruošta kultūra sterilumo sąlygomis, pasirenkant kuo vienalytiškesnę medžiagą. Kiekvienam bandymui reikia turėti ne mažiau kaip 60 bandymo organizmų (bandoma aštuonių koncentracijos verčių cheminė medžiaga). Bandymams imamos iš anksto paruoštos kultūros žaliosios šoninės šakos, kurios sutrumpinamos iki 2,5 cm nuo pagrindo (matuojant liniuote) ir pernešamos į stiklinę su sterilia modifikuota Andrews terpe. Šios šoninės šakos gali būti naudojamos atliekant toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymą sistemoje be nuosėdų.
                        
                           2 paveikslas.
                        
                        
                           Iš anksto paruoštos kultūros augalų pjaustymas, atliekant toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymą sistemoje be nuosėdų.
                        
                        
                     C.51   Toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymas vandens ir nuosėdų sistemoje
                     
                     ĮVADAS
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Šis bandymų metodas atitinka OECD bandymo gaires 239 (2014). Tai yra vandens paviršiuje augančio vienaskilčio augalo Lemna rūšiai (1) ir dumblių rūšiai (2) taikomi bandymų metodai. Paprastai šie metodai taikomi siekiant gauti duomenų apie riziką, kurią bandomosios cheminės medžiagos, ypač herbicidinių savybių turinčios cheminės medžiagos, kelia netikslinių vandens augalų rūšims. Tačiau kai kuriais atvejais gali prireikti duomenų apie kitas makrofitų rūšis. Aplinkos toksikologijos ir chemijos draugijos (angl. Society of Environmental Toxicology and Chemistry) Vandens mikrofitams pesticidų keliamos rizikos vertinimo (angl. Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides, AMRAP) darbo grupės neseniai paskelbtose gairėse pateikiama prielaida, kad gali prireikti duomenų apie cheminių medžiagų poveikį įsišaknijusių makrofitų rūšims, jei yra žinoma, kad Lemna ir dumbliai nėra jautrūs veikimo būdui arba jei susirūpinimą kelia pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų, dėl ko jie paveikiami per sugertį šaknimis (3). Atsižvelgiant į turimas žinias ir patirtį, Myriophyllum spp buvo pasirinkta kaip tinkamiausia rūšis tais atvejais, kai reikia duomenų apie po vandeniu augančių plunksnalapių šeimos dviskilčių augalų rūšį (4) (5) (6). Šis bandymas nepakeičia kitų toksiškumo vandeninei terpei bandymų; jis greičiau turėtų juos papildyti taip, kad būtų galima išsamiau įvertinti pavojų vandens augalams ir riziką. Myriophyllum spicatum bandymo vandens ir nuosėdų sistemoje metodas papildo toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymą sistemoje be nuosėdų (7).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Šiame dokumente aprašytas bandymų metodas, kuriuo galima įvertinti bandomosios cheminės medžiagos poveikį Myriophyllum spicatum, vandens ir nuosėdų sistemoje augančių įsišaknijusių vandens augalų rūšiai. Bandymų metodas yra pagrįstas iš dalies esamais metodais (1) (2) (8) ir jame atsižvelgiama į naujausius mokslinius tyrimus, susijusius su rizikos vandens augalams vertinimu (3). Bandymo vandens ir nuosėdų sistemoje metodas buvo patvirtintas atliekant tarptautinį tarplaboratorinį tyrimą, atliktą su statinėmis sąlygomis auginama Myriophyllum rūšimi, veikiama bandomąja chemine medžiaga ją įterpiant per vandens sluoksnį (9). Tačiau bandymo sistemą nesunku pritaikyti, kad būtų veikiama per sodrintas nuosėdas arba per vandeninę fazę taikant pusiau statinį ar kintamos dozės scenarijų, nors šių scenarijų tarplaboratorinis tyrimas nebuvo oficialiai atliekamas. Be to, bendrasis metodas gali būti taikomas kitoms įsišaknijusioms, povandeninėms ir vandens paviršiuje augančioms rūšims, įskaitant kitas Myriophyllum rūšis (pvz., Myriophyllum aquaticum) ir Glyceria maxima (10). Naudojant alternatyvias rūšis, gali tekti keisti bandymo sąlygas, schemą ir trukmę. Visų pirma, būtini papildomi tyrimai reikiamoms Myriophyllum aquaticum taikomoms procedūroms nustatyti. Šios pasirinktys nėra išsamiai pateiktos šiame bandymų metode, kuriame aprašomas standartinis Myriophyllum spicatum veikimo metodas statinėje sistemoje per vandeninę fazę.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Šis bandymų metodas taikomas cheminėms medžiagoms, kurioms bandymų metodas buvo patvirtintas (išsami informacija pateikta tarplaboratorinio tyrimo ataskaitoje (9)), arba preparatams ar žinomos sudėties mišiniams. Myriophyllum bandymas gali būti atliekamas, kad būtų įvykdytas 1 pakopos duomenų reikalavimas dėl galimo bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymo tarp vandens ir nuosėdų ar dėl veikimo būdo ir (arba) selektyvumo problemų. Taip pat gali prireikti atlikti Myriophyllum laboratorinį bandymą, kaip aukštesnės pakopos strategijos dalį, sprendžiant su rizika vandens augalams susijusius klausimus. Konkreti priežastis atlikti bandymą – nustatyti poveikio kelią (t. y. per vandenį ar nuosėdas). Prieš taikant bandymų metodą numatomam mišiniui reglamentuoti, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, tai dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį.
                              
                           BANDYMO PRINCIPAS
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Šio bandymo tikslas – įvertinti cheminės medžiagos poveikį standartizuotose terpėse (vandens, nuosėdų ir maistinių medžiagų) augančių Myriophyllum augalų vegetatyviniam augimui. Šiam tikslui nežydinčių sveikų augalų ūglių viršūnės sodinamos į standartizuotas dirbtines nuosėdas, kurios papildomai gauna maistinių medžiagų, kad būtų užtikrintas tinkamas augalų augimas, ir vėliau jos laikomos Smart ir Barko terpėje (1 priedėlis). Pasibaigus prigijimo laikotarpiui, per kurį susidarytų šaknys, augalai veikiami kelių koncentracijos verčių bandomąja chemine medžiaga, įterpiama per vandens sluoksnį. Arba galima modeliuoti veikimą per dirbtines nuosėdas, jas sodrinant bandomąja chemine medžiaga ir persodinant augalus į šias sodrintas nuosėdas. Abiem atvejais augalai vėliau 14 parų laikomi kontroliuojamomis aplinkos sąlygomis. Poveikis augimui yra nustatomas kiekybiškai įvertinant ūglių ilgį ir žaliosios bei sausos medžiagos masę, taip pat atliekami kokybiniai stebėjimai chlorozės, nekrozės ar augimo defektų požymiams nustatyti.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Siekiant kiekybiškai nustatyti su chemine medžiaga susijusį poveikį, augimas bandymo tirpaluose lyginamas su kontrolinių augalų augimu ir nustatoma tam tikrą x % augimo slopinimą sukelianti koncentracija, išreiškiama ECx; kai x gali būti kuri nors vertė, atsižvelgiant į reglamentavimo reikalavimus, pvz., EC10, EC20 ir EC50. Reikėtų pažymėti, kad EC10 ir EC20 įverčių vertės yra patikimos ir tinka atliekant tik tokius bandymus, kurių kontroliniams augalams nustatyti variacijos koeficientai yra mažesni nei vertinamas poveikio lygis, t. y. variacijos koeficientai turėtų būti < 20 %, kad EC20 įvertis būtų statistiškai patikimas.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Reikėtų nustatyti neapdorotų ir apdorotų augalų vidutinį savitąjį augimo greitį (apskaičiuotą pagal ūglio ilgio, ūglio žaliosios medžiagos masės ir sausos medžiagos masės vertinimą) ir išeigą (apskaičiuotą pagal ūglio ilgio, ūglio žaliosios medžiagos masės ir sausos medžiagos masės padidėjimą). Savitasis augimo greitis (r) ir išeiga (y) vėliau naudojami ErCx (pvz., ErC10, ErC20, ErC50) ir EyCx (pvz., EyC10, EyC20, EyC50) nustatyti.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Prireikus pagal vidutinio savitojo augimo greičio ir išeigos įverčius gali būti statistiškai nustatyta mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC) ir nestebimo poveikio koncentracija (NOEC).
                              
                           INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Turėtų būti atitinkamo jautrio analizės metodas cheminių medžiagų kiekiui bandymo terpėje kiekybiškai nustatyti.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Informaciją apie bandomąją cheminę medžiagą, kuri gali būti naudinga bandymo sąlygoms nustatyti, sudaro struktūrinė formulė, sudėtis, jei tiriamos daugiakomponentės medžiagos, UVCB, mišiniai ar preparatai, grynumas, tirpumas vandenyje, patvarumas veikiant vandeniui ir šviesai, rūgšties disociacijos konstanta (pKa), pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (Kow), pasiskirstymo tarp vandens ir nuosėdų koeficientas Kd, jei žinomas, garų slėgis ir biologinis skaidumas. Tirpumas ir garų slėgis gali būti naudojami Henrio dėsnio konstantai apskaičiuoti, kuri rodytų, ar atliekant bandymą gali būti didelių bandomosios cheminės medžiagos garavimo nuostolių. Jei tikėtina, kad bus bandomosios cheminės medžiagos nuostolių, juos reikėtų kiekybiškai įvertinti, o vėlesnius tokių nuostolių kontrolės veiksmus reikėtų dokumentuoti. Jei duomenys apie bandomosios (-ųjų) cheminės (-ų) medžiagos (ų) tirpumą ir patvarumą yra abejotini, šias savybes rekomenduojama įvertinti bandymo sąlygomis, t. y. bandymui naudotinos auginimo terpės, temperatūros, apšvietimo režimo sąlygomis. Pastaba. Kai bandomi šviesos veikiami peroksidiniai herbicidai, laboratorijos apšvietimas turėtų atitikti natūralios saulės šviesos ultravioletinę spinduliuotę.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Bandymo terpės pH vertė turėtų būti matuojama ir reguliuojama tinkamu būdu. Bandymo terpės pH kontrolė yra ypač svarbi, pvz., kai bandomi metalai arba cheminės medžiagos, kurios yra nestabilios dėl hidrolizės. Kiti nurodymai, kaip bandyti chemines medžiagas, kurių fizikinės ir cheminės savybės apsunkina šią užduotį, pateikti EBPO rekomendaciniame dokumente (11).
                              
                           BANDYMO TINKAMUMAS
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Bandymo rezultatų tinkamumas patvirtinamas, jei bandymo veikimo laikotarpiu kontrolinių augalų vidutinis bendras ūglių ilgis ir vidutinė bendra žaliosios medžiagos masė bent padvigubėja. Be to, neturi būti jokių matomų kontrolinių augalų chlorozės požymių ir matomo užteršimo kitais organizmais, pvz., neturėtų būti dumblių ar ir (arba) bakterijų plėvelės ant augalų, nuosėdų paviršiuje ir bandymo terpėje.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Kontrolinių kultūrų kartotinių ėminių išeigos, pagrįstos ūglių žaliosios medžiagos masės matavimais (t. y. nuo bandymo pradžios iki jo pabaigos), vidutinis variacijos koeficientas yra ne didesnis kaip 35 %.
                              
                           ETALONINĖ CHEMINĖ MEDŽIAGA
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Reikėtų periodiškai bandyti etaloninę (-es) cheminę (-es) medžiagą (-as), pvz., 3,5-dichlorfenolį, naudotą atliekant tarplaboratorinį tyrimą (9), kaip priemonę bandymo procedūros charakteristikoms patikrinti laikui bėgant. Tarplaboratorinio tyrimo duomenys rodo, kad 3,5-dichlorfenolio vidutinė EC50 vertė, gauta skirtingiems atsako kintamiesiems, yra nuo 4,7 mg/l iki 6,1 mg/l (šių verčių pasikliovimo intervalo duomenys pateikti tarplaboratorinio tyrimo ataskaitoje). Patartina etaloninę cheminę medžiagą bandyti bent du kartus per metus arba vienu metu su bandomosios cheminės medžiagos galutiniais toksiškumo nustatymo bandymais, jei bandymai atliekami rečiau. Tikėtinos 3,5-dichlorfenolio EC50 vertės yra pateiktos tarptautinio tarplaboratorinio tyrimo statistinių duomenų ataskaitoje (9).
                              
                           METODO APRAŠYMAS
                     
                        Bandymų aparatūra
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Bandymas turėtų būti atliekamas kontroliuojamomis aplinkos sąlygomis, t. y. auginimo kameroje, auginimo kambaryje ar laboratorijoje, reguliuojant šviesiojo laikotarpio trukmę, apšvietimą ir temperatūrą (žr. skirsnį Bandymo sąlygos, 56–58 skirsniai). Pradines kultūras reikėtų laikyti atskirai nuo bandymo indų.
                              
                           
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Tyrimas turėtų būti atliekamas naudojant stiklinius bandymo indus, pvz., akvariumus ar chemines stiklines; paprastai naudojamos 2 l stiklinės ( maždaug 24 cm aukščio ir 11 cm skersmens). Tačiau galbūt tiktų kiti (t. y. didesni) indai, jei vandens gylio pakanka augalams neribotai augti ir visą bandymo trukmę būti pasinėrusiems po vandeniu.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Plastikiniai ar stikliniai augalų vazonai (maždaug 9 cm skersmens, 8 cm aukščio ir 500 ml talpos) gali būti naudojami kaip indai augalams į nuosėdas sodinti. Arba galima naudoti chemines stiklines, kurioms kartais teikiama pirmenybė (pvz., bandant hidrofobines ar didelį Kow turinčias chemines medžiagas).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Vazono ar stiklinės dydis pasirenkamas atsižvelgiant į pasirinktus bandymo indus ir pageidaujamą bandymo schemą (žr. toliau). Jei naudojama A bandymo schema (vienas ūglis viename vazone ir trys vazonai viename inde), gali prireikti mažesnių vazonų ar didesnių indų. Jei naudojama B bandymo schema (trys ūgliai viename vazone ir vienas vazonas viename inde), nurodyti vazonų ir indų dydžiai turėtų atitikti vienas kitą. Visais atvejais mažiausias vandens gylis turėtų būti 12 cm virš nuosėdų viršaus, o santykį tarp nuosėdų paviršiaus ploto bei tūrio santykio ir vandens paviršiaus ploto bei tūrio santykio reikėtų registruoti.
                              
                           
                        Bandymo organizmas
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Šiame bandymų metodo aprašyme aprašytus bendruosius aspektus galima taikyti įvairioms vandens augalų rūšims bandyti. Tačiau šiame bandymų metodo aprašyme apibrėžtos sąlygos specialiai pritaikytos plunksnalapių rūšiai Myriophyllum spicatum bandyti. Ši rūšis priklauso Haloragaceae dviskilčių šeimai.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum (Eurazinė plunksnalapė) yra po vandeniu auganti įsišaknijanti rūšis, kuri gali augti įvairiomis sąlygomis ir ją galima aptikti stovinčio ir tekančio vandens telkiniuose. M. spicatum yra daugiametis augalas, kuris per žiemą nuvysta iki šaknų. Augalai paprastai žydi ir laisvai barsto sėklas, nors dažnai pagrindinis dauginimosi būdas yra vegetatyvinis dauginimasis iš pažastinių pumpurų arba kamieninių fragmentų, kurie atsiskiria natūraliai arba kai būna pažeisti.
                              
                           
                        Bandymo organizmo auginimas
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Augalus galima gauti iš natūralių populiacijų arba per vandens augalų tiekėjus. Abiem atvejais reikėtų dokumentuoti augalų šaltinį ir patikrinti rūšies tapatybę. Reikėtų ypač atidžiai žiūrėti, kad renkant Myriophyllum spicatum lauko sąlygomis būtų renkama reikiama rūšis, ypač tuose regionuose, kuriuose ji gali būti sukryžminta su kitomis Myriophyllum rūšimis. Jei abejojama, rekomenduojama naudoti patikrintas laboratorines kultūras iš žinomų šaltinių. Atliekant šį bandymą neturėtų būti naudojami augalai, kurie buvo veikiami cheminiais teršalais arba buvo surinkti iš akivaizdžiai užterštų vietų.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Regionuose, kuriuose M. spicatum nėra lengva gauti žiemos mėnesiais, gali tekti užsiimti ilgalaike pradinių kultūrų priežiūra šiltnamio ar laboratorijos sąlygomis. Pradines kultūras reikėtų laikyti tokiomis sąlygomis, kurios būtų panašios į bandymo sąlygas, nors energinę apšvietą ir temperatūrą galima sumažinti, kad kultūrą reikėtų rečiau prižiūrėti (pvz., kai Myriophyllum bandymai kuriam laikui nebūtų numatyti). Rekomenduojama naudoti didesnius nei bandymams skirtus akvariumus ir augalų vazonus, kad būtų galima užtikrinti didesnę dauginimosi erdvę. Nuosėdų ir vandens terpės sudėtis turėtų atitikti naudojamą atliekant bandymus, nors galima pritaikyti alternatyvius nuosėdų tręšimo metodus (pvz., naudoti pirktinius lėtai įsisavinamų trąšų preparatus).
                              
                           
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Pradinių kultūrų augalai iš pažiūros neturėtų būti užteršti kitais organizmais, įskaitant sraiges, siūlinius dumblius, grybelius ir vabzdžius, pvz., drugio Paraponyx stratiotata kiaušinėliais ir lervomis ir ilgasnapių Eubrychius velutus lervomis ar suaugusiais vabalais. Augalinę medžiagą gali tekti plauti gėlame vandenyje, kad būtų galima pašalinti matomus teršalus. Be to, reikėtų imtis priemonių, kurios padėtų sumažinti taršos vienaląsčiais dumbliais ir bakterijomis plitimą, nors visiškas augalinės medžiagos sterilumas nėra būtinas. Pradines kultūras reikėtų stebėti ir persodinti, jei reikia, kad būtų išvengta taršos vienaląsčiais dumbliais ir bakterijomis plitimo. Gali būti naudinga pradines kultūras aeruoti, jei tarša dumbliais ir bakterijomis keltų didelių problemų.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Visais atvejais, prieš augalus naudojant bandymams, jie pakankamai ilgai (t. y. > 2 savaites) auginami ir (arba) aklimatizuojami tokiomis sąlygomis, kurios būtų panašios į bandymo sąlygas, bet nebūtinai tokios pat.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Žydinčios pradinės kultūros neturėtų būti naudojamos bandymams, nes žydėjimo metu ir augalams nužydėjus vegetacinio augimo greitis paprastai mažėja.
                              
                           
                        Nuosėdos
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Šiam bandymui atlikti rekomenduojamos tokios sudėties nuosėdos, gautos pagal šio priedo C.28 skyriuje naudojamas dirbtines nuosėdas (8). Nuosėdos ruošiamos kaip aprašyta C.28 bandymų metode, išskyrus tai, kad dedama šių maistinių medžiagų:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             4–5 % durpių (sausos medžiagos masės, kad būtų 2 ± 0,5 % organinės anglies), kurių pH būtų kuo arčiau pH 5,5–6,0 vertės; svarbu naudoti miltelių pavidalo durpes, smulkiai sumaltas (tinkamas dalelių dydis < 1 mm) ir džiovintas tik ore;
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             20 % (sausos medžiagos masės) kaolino molio (kaolinito kiekis turėtų būti didesnis kaip 30 %);
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             75–76 % (sausos medžiagos masės) kvarcinio smėlio (smulkusis smėlis turėtų sudaryti didžiausią dalį, daugiau negu 50 % dalelių dydis 50–200 μm);
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             įpilama vandeninės mitybinės terpės, kad galutinės sudėties nuosėdų partijoje amonio chlorido ir natrio fosfato būtų po 200 mg/kg sausų nuosėdų masės, o drėgmės kiekis galutiniame mišinyje būtų 30–50 %;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             įdedama chemiškai gryno kalcio karbonato (CaCO3), kad galutinio nuosėdų mišinio pH vertė būtų 7,0 ± 0,5.
                                          
                                       
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Durpių, kaolino molio ir smėlio šaltinis turėtų būti žinomas ir dokumentuotas. Jei kilmė nežinoma ar kelia tam tikrą susirūpinimą, atitinkamus komponentus reikėtų patikrinti dėl cheminės taršos (pvz., ar nėra sunkiųjų metalų, organinių chloro junginių, organinių fosforo junginių).
                              
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Sausos sudedamosios nuosėdų dalys, prieš nuosėdas kruopščiai įmaišant į vandeninį maistinių medžiagų tirpalą, turėtų būti labai gerai sumaišytos. Drėgnas nuosėdas reikėtų paruošti bent prieš dvi dienas iki naudojimo, kad durpės galėtų visiškai įmirkti ir hidrofobinės durpių dalelės negalėtų išplaukti į paviršių, kai ant nuosėdų užpilama terpė; prieš naudojant, drėgnas nuosėdas galima laikyti tamsoje.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Atliekant bandymą, nuosėdos pernešamos į tinkamo dydžio talpyklas, pvz., į tokio skersmens augalų vazonus, kurie tilptų į stiklinius indus (nuosėdų paviršiaus plotas turėtų sudaryti maždaug 70 % indo paviršiaus ploto arba daugiau). Jei talpykla turi skyles apačioje, į jos dugną įdėtas filtravimo popieriaus gabalas neleis nuosėdoms byrėti iš talpyklos. Nuosėdos pilamos į vazonus taip, kad sudarytų lygų paviršių, ant kurio beriamas plonas (~ 2–3 mm) inertinės medžiagos, pvz., smėlio, smulkaus sode naudojamo žvyro (arba smulkinto klintinio kiauto) sluoksnis, kad nuosėdos negalėtų pakilti.
                              
                           
                        Bandymo terpė
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Kaip Myriophyllum spicatum auginimo ir bandymo terpė rekomenduojama Smart ir Barko terpė (12). Šios terpės paruošimas aprašytas 1 priedėlyje. Terpių (vandeninės fazės) pH vertė bandymo pradžioje turėtų būti 7,5–8,0, kad augalai galėtų optimaliai augti.
                              
                           
                        Bandymo schema
                     
                     
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Atliekant bandymą reikėtų naudoti ne mažiau kaip šešis neapdorotų kartotinių ėminių indus ir ne mažiau kaip keturis kiekvienos iš ne mažiau kaip penkių koncentracijos verčių kartotinių ėminių indus.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Jei nereikia nustatyti NOEC, bandymo schema gali būti pakeista padidinant koncentracijos verčių skaičių ir sumažinant kiekvienos bandymo koncentracijos kartotinių ėminių skaičių.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Kiekvienas bandymo indas yra kartotinis ėminys su trimis ūgliais. Yra dvi trijų ūglių auginimo viename bandymo inde pasirinktys:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             A bandymo schema: vienas ūglis viename vazone ir trys vazonai viename inde;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             B bandymo schema: trys ūgliai viename vazone ir vienas vazonas viename inde;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             priimtina vieno ūglio viename vazone vienam bandymo indui schema, jei pasirinktas toks kartotinių ėminių skaičius, kuris užtikrintų atitiktį tinkamumo kriterijams.
                                          
                                       
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Atskiri bandymo indai turėtų būti atsitiktinai priskirti apdorojimo grupėms. Reikia taikyti atsitiktinio bandymo indų išdėstymo bandymo plote schemą, kad būtų kiek įmanoma sumažinta erdvinės padėties, šviesos intensyvumo arba temperatūros skirtumų įtaka.
                              
                           
                        Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija ir kontrolinės grupės
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Koncentracijos vertės paprastai turėtų atitikti geometrinę progresiją, kurios vardiklis turėtų būti ne didesnis kaip 3,2. Tinkamas bandymo koncentracijos vertes padėtų pasirinkti išankstiniai bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo duomenys, gauti atliekant intervalo nustatymo bandymą.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Norint nustatyti ECx vertę, ji turėtų būti tarp bandymo koncentracijos verčių reikiamam pasikliovimo lygiui užtikrinti. Pvz., jei įvertinama EC50, didžiausia bandymo koncentracija turėtų būti didesnė nei EC50 vertė. Jei EC50 vertė nepatenka į bandymo koncentracijos verčių intervalą, susiję pasikliovimo intervalai bus dideli ir gali būti neįmanomas tinkamas statistinio modelio atitikties vertinimas. Naudojant daugiau koncentracijos verčių apie gaunamą ECx vertę bus geresnis pasikliovimo intervalas.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Jei reikia nustatyti LOEC ir (arba) NOEC (neprivalomas vertinamąsias baigtis), mažiausia bandymo koncentracija turėtų būti pakankamai maža, kad augimas reikšmingai nesiskirtų nuo kontrolinių augalų augimo. Be to, didžiausia bandymo koncentracija turėtų būti gana didelė, kad augimas būtų gerokai mažesnis nei kontroliniuose ėminiuose. Jei bus naudojama daugiau kartotinių ėminių, padidės poveikio nesukeliančios koncentracijos modelio ir dispersinės analizės statistinė galia.
                              
                           
                        Ribinis bandymas
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Tais atvejais, kai intervalo nustatymo bandymas rodo, kad nėra bandomosios cheminės medžiagos neigiamo poveikio, jei jos koncentracija yra mažesnė kaip 100 mg/l arba mažesnė kaip jos tirpumo bandymo terpėje ribinė koncentracija ar preparatų dispersijos ribinė koncentracija, galima atlikti ribinį bandymą, kad būtų lengviau palyginti kontrolinės grupės ir vienos apdorotų ėminių grupės, 100 mg/l arba tirpumo ribinei vertei lygios koncentracijos arba ar 1 000 mg/kg sausų nuosėdų koncentracijos, atsakus. Atliekant šį bandymą reikėtų laikytis standartinio dozės ir atsako priklausomybės bandymo bendrųjų principų, išskyrus tai, kad mažiausią kontrolinių ir koncentracijos kartotinių ėminių indų skaičių patariama padidinti iki šešių. Augimą kontrolinių ir apdorotų ėminių grupėse galima analizuoti taikant statistinį kriterijų, pvz., Stjudento t kriterijų, vidurkiams palyginti.
                              
                           
                        Bandymo tirpalai
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Bandymo tirpalai paprastai ruošiami skiedžiant demineralizuotu (t. y. distiliuotu ar dejonizuotu) vandeniu pradinį tirpalą, gautą bandomąją cheminę medžiagą tirpinant arba disperguojant Smart ir Barko terpėse (žr. 1 priedėlį).
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Didžiausia bandymo koncentracija paprastai neturėtų būti didesnė nei bandomosios cheminės medžiagos tirpumo vandenyje koncentracija, arba, jei tai preparatai – neturėtų būti didesnė nei disperguojamumas bandymo sąlygomis.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Jei bandomosios cheminės medžiagos mažai tirpsta vandenyje, koncentruotą pradinį tirpalą arba cheminės medžiagos dispersiją gali tekti ruošti naudojant organinį tirpiklį arba dispergentą, kad būtų lengviau įterpti tikslius bandomosios cheminės medžiagos kiekius į bandymo terpę ir palengvinti jos dispergavimą ir tirpinimą. Tačiau turėtų būti imamasi visų priemonių, kad šios medžiagos nebūtų naudojamos. Neturi būti fitotoksiškumo dėl tokių pagalbinių tirpiklių arba dispergentų naudojimo. Pvz., dažniausiai naudojami tirpikliai, kurie nesukelia fitotoksiškumo, kai jų koncentracija ne didesnė kaip 100 μl/l, yra acetonas ir dimetilformamidas. Jei naudojamas tirpiklis arba dispergentas, jo galutinė koncentracija turėtų būti pateikta ataskaitoje ir būti kuo mažesnė (≤ 100 μl/l). Šiomis aplinkybėmis visų apdorotų ėminių ir (tirpiklio) kontrolinių ėminių tirpiklio ar dispergento koncentracija turėtų būti vienoda. Į taikomą bandymo schemą turėtų būti įtraukti neapdoroti kartotiniai kontroliniai ėminiai, kuriuose nėra tirpiklio arba dispergento. Papildomi nurodymai dėl dispergentų naudojimo pateikti EBPO rekomendaciniame dokumente (11).
                              
                           BANDYMO PROCEDŪRA
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Bandymo procedūra skiriasi atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos įterpimo būdą (t. y. per vandeninę ar nuosėdų fazę). Reikėtų atsižvelgti į galimą bandomosios cheminės medžiagos elgesį vandens ir nuosėdų sistemoje, kad būtų galima pasirinkti bandant naudojamą veikimo režimą (t. y. statinį ar pusiau statinio atnaujinimo, sodrinto vandens ar sodrintų nuosėdų). Kartais sodrintų nuosėdų bandymams gali būti teikiama pirmenybė, jei prognozuojama, kad yra reikšmingas cheminių medžiagų pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų.
                              
                           
                        Prigijimo tarpsnis
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Sveikų ūglių viršūnės ar galai, t. y. be šoninių ūglių, atpjaunami nuo pradinės kultūros augalų 6 cm (± 1 cm) ilgio ūgliams gauti. Taikant A bandymo schemą (vienas ūglis viename vazone ir trys vazonai viename inde), į kiekvieną vazoną sodinama po vieną augalo viršūnę. Taikant B bandymo schemą (trys ūgliai viename vazone ir vienas vazonas viename inde), į kiekvieną vazoną su nuosėdomis sodinamos keturios ar penkios augalų viršūnės.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Abiem atvejais reikėtų sodinti į papildomus vazonus, kad bandymo pradžiai būtų galima atrinkti vienodus augalus, taip pat turėti atsarginių augalų šaknų augimui patikrinti prieš pat apdorojimą ir atsarginių augalų, kurie būtų nupjauti ūglių biomasei ir ilgiui matuoti nulinę parą.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Ūgliai sodinami maždaug į trijų centimetrų gylį žemiau nuosėdų paviršiaus, kad būtų užkasti bent du bambliai.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Vazonai pernešami į bandymo indus veikimo tarpsnį atitinkančiomis aplinkos sąlygomis ir septynias paras laikomi Smart ir Barko terpėje, kad pradėtų susidaryti šaknys.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Praėjus šiam laikui, reikėtų paimti kelis augalus iš atsarginių vazonų šaknų augimui patikrinti. Jei šaknų augimo požymių nesimato (t. y. nesimato šaknų galų), prigijimo tarpsnį reikėtų pratęsti tiek, kad būtų pastebėtas šaknų augimas. Šis veiksmas yra rekomenduojamas siekiant užtikrinti, kad augalai aktyviai augtų bandymo pradžioje.
                              
                           
                        Vienodos augalinės medžiagos parinkimas
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Taikant A bandymo schemą (vienas ūglis viename vazone ir trys vazonai viename inde), vazonai atrenkami prieš bandymo pradžią pagal augalų vienodumą. Taikant B bandymo schemą (trys ūgliai viename vazone ir vienas vazonas viename inde), pertekliniai augalai pašalinami, paliekant tris augalus, kurie yra vienodo dydžio ir išvaizdos.
                              
                           
                        Veikimas per vandeninę fazę
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Pagal vienodus augalus atrinkti vazonai statomi į bandymo indus, atsižvelgiant į reikiamą bandymo schemą. Į bandymo indus įpilama Smart ir Barko terpės. Reikėtų imtis priemonių, kad būtų išvengta nuosėdų susidrumstimo. Todėl terpę galima pilti į bandymo indus per piltuvą arba ją pilant nuosėdas uždengti plastikiniu disku, jei įpylus terpės diskas būtų nedelsiant išimtas. Arba vazonus su augalais galima statyti į bandymo indus įpylus terpės. Abiem atvejais naujos terpės galima įpilti veikimo tarpsnio pradžioje, jei būtina kiek įmanoma sumažinti galimą dumblių ir bakterijų augimą arba kad būtų galima ruošti atskiras kartotinių ėminių bandymo tirpalų partijas.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Ūglių ilgis virš nuosėdų matuojamas prieš įpilant terpę ar jos įpylus.
                              
                           
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Atitinkami bandomosios cheminės medžiagos kiekiai gali būti įdėti į bandymo terpę prieš ją pilant į bandymo indus. Arba bandomąją cheminę medžiagą galima įdėti į terpę, kai ji jau įpilta į bandymo indus. Šiuo atveju reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad bandomoji cheminė medžiaga vienodai pasiskirstytų po visą bandymo sistemą ir nuosėdos nebūtų sudrumstos.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Visais atvejais bandymo pradžioje registruojama terpės išvaizda (pvz., skaidri, drumsta ir kt.).
                              
                           
                        Veikimas per nuosėdas
                     
                     
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Pasirinktos koncentracijos sodrintos nuosėdos paprastai ruošiamos tiesiogiai į nuosėdas įpilant bandomosios cheminės medžiagos tirpalo. Dejonizuotame vandenyje ištirpintas bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas maišomas su dirbtinėmis nuosėdomis valciniu malūnu, pašarų maišikliu arba rankiniu būdu. Jei bandomoji cheminė medžiaga mažai tirpsta vandenyje, ją galima ištirpinti kuo mažesniame tinkamo organinio tirpiklio (pvz., heksano, acetono ar chloroformo) tūryje. Šis tirpalas maišomas su maždaug 10 g smulkaus kvarco smėlio vienam bandymo indui. Palaukiama, kol išgaruos tirpiklis, ir smėlis sumaišomas su vienai bandymo stiklinei numatytu nuosėdų kiekiu. Galima naudoti tik labai lakias medžiagas bandomajai cheminei medžiagai soliubilizuoti, disperguoti ar emulguoti. Reikėtų turėti omenyje, kad į bandomąja chemine medžiaga sodrinto smėlio tūrį ar masę būtina atsižvelgti galutinai ruošiant nuosėdas (t. y. jas reikėtų ruošti imant mažiau smėlio). Reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad į nuosėdas įterpta bandomoji cheminė medžiaga būtų visiškai ir tolygiai paskirstyta nuosėdose.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Sodrintos nuosėdos supilamos į vazonus (kaip aprašyta pirmiau). Dėl vienodumo ir tinkamos šaknų sistemos pasirinkti augalai išimami iš prigijimo tarpsniu naudotų vazonų ir persodinami į sodrintas nuosėdas, kaip aprašyta pirmiau.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Vazonai pagal reikiamą bandymo schemą statomi į bandymo indus. Atsargiai įpilama Smart ir Barko terpės (t. y. per piltuvą), kad nuosėdos nesusidrumstų. Ūglių ilgis virš nuosėdų matuojamas prieš įpilant terpę ar jos įpylus.
                              
                           
                        Vandens lygio užtikrinimas visą bandymo trukmę
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Turi būti registruojamas galutinis vandens tūris ir ant kiekvieno bandymo indo pažymimas vandens lygis. Jei atliekant bandymą išgaruoja daugiau nei 10 % vandens, vandens lygis turėtų būti reguliuojamas distiliuotu vandeniu. Prireikus chemines stiklines galima nesandariai pridengti permatomu dangčiu, pvz., skaidriais plastikiniais dangčiais, kad būtų kuo mažesnis garavimas ir užteršimas dumblių sporomis.
                              
                           
                        Bandymo sąlygos
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Reikėtų naudoti šiltą ir (arba) šaltą baltos spalvos fluorescencinių lempų apšvietimą, kurio energinė apšvieta būtų apie 140 (± 20) μE·m– 2 s– 1, kai matuojama kaip aktyvioji fotosintezės spinduliuotė (400–700 nm) vandens paviršiuje ir taikomas šviesos bei tamsos 16:8 h santykis. Energinės apšvietos virš bandymo vietos skirtumas neturėtų būti didesnis kaip ± 15 % pasirinktos vertės.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Temperatūra bandymo induose yra 20 ± 2 °C.
                              
                           
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Bandymo metu kontrolinių ėminių terpės pH neturėtų padidėti daugiau kaip 1,5 vieneto. Tačiau didesnis nei 1,5 vieneto nuokrypis nesumažintų bandymo vertės, jei būtų galima įrodyti, kad vykdomi pirmiau nurodyti tinkamumo kriterijai.
                              
                           
                        Bandymo trukmė
                     
                     
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Veikimo trukmė – 14 parų.
                              
                           
                        Matavimai ir analiziniai nustatymai
                     
                     
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Pasibaigus prigijimo tarpsniui ir prieš pat apdorojimą (t. y. 0 parą), atsarginiai augalai iš penkių atsitiktinai atrinktų vazonų, taikant trijų augalų viename vazone schemą, ar iš 15 vazonų, taikant vieno augalo viename vazone schemą, yra nupjaunami ūglių ilgiui ir žaliosios bei sausos medžiagos masei įvertinti, kaip aprašyta toliau.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Veikimo tarpsniui skirti augalai vertinami taip, kaip pateikta 1 lentelėje:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             pagrindinio ūglio ilgis ir šoninių ūglių skaičius registruojamas bent veikimo laikotarpio pabaigoje (pvz., 14 parą);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             augalų sveikata vizualiai įvertinama veikimo laikotarpiu bent tris kartus (pvz., 0, 7 ir 14 parą);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ūglių žaliosios ir sausos medžiagos masė įvertinama bandymo pabaigoje (pvz., 14 parą).
                                          
                                       
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Ūglių ilgis matuojamas liniuote. Jei yra šoninių ūglių, juos reikėtų suskaičiuoti ir išmatuoti jų ilgį.
                              
                           
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Augalų sveikata įvertinama vizualiai, registruojant augalų išvaizdą ir bendrąją bandymo terpės būseną. Reikėtų pažymėti tokius pastebėtus dalykus:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             nekrozę, chlorozę arba spalvos pakitimą, pvz., didesnį paraudimą palyginti su kontroliniais augalais;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bakterijų arba dumblių taršos plitimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             augimo sutrikimus, pvz., lėtą augimą, pakitusį tarpubamblių ilgį, deformuotus ūglius ir (arba) lapus, šoninių ūglių skaičiaus didėjimą, lapų kritimą, turgorą ir stiebo fragmentavimą;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             šaknų sveikumą, kuris vizualiai stebimas baigus bandymą, atsargiai nuplovus nuosėdas nuo šaknų, kad būtų galima stebėti šaknų sistemą. Siūloma tokia vertinimo palyginti su kontroliniais augalais skalė:
                                             
                                                         1)
                                                      
                                                      
                                                         šaknų nėra;
                                                      
                                                   
                                                         2)
                                                      
                                                      
                                                         kelios šaknys;
                                                      
                                                   
                                                         3)
                                                      
                                                      
                                                         vidutiniškai išsivysčiusios šaknys;
                                                      
                                                   
                                                         4)
                                                      
                                                      
                                                         labai gerai išsivysčiusios šaknys, panašiai kaip kontrolinių augalų.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                              
                                 64.
                              
                              
                                 Žaliosios medžiagos masė vertinama bandymo pradžioje ir pabaigoje, nupjaunant ūglį nuosėdų lygyje ir jį pasveriant, sausai nušluosčius filtravimo popieriumi. Reikėtų imtis priemonių pašalinti nuosėdų daleles, kurios gali prilipti prie ūglio pagrindo. Paskui ūglių medžiaga dedama į džiovinimo spintą, kurios temperatūra maždaug 60 °C, džiovinama iki pastoviosios masės ir registruojama sausos medžiagos masė.
                              
                           
                              
                                 65.
                              
                              
                                 Biologinio vertinimo atliekant bandymus minimalių reikalavimų santrauka pateikta 1 lentelėje.
                                 
                                    1 lentelė
                                 
                                 
                                    Vertinimo tvarkaraštis
                                 
                                 
                                             Para po apdorojimo
                                             (PPA)
                                          
                                          
                                             
                                                Myriophyllum spicatum
                                             
                                          
                                       
                                             Ūglių ilgis, šoninių ūglių ilgis ir skaičius
                                          
                                          
                                             Vizualus ūglių vertinimas
                                          
                                          
                                             Ūglių žaliosios ir sausos medžiagos masė,
                                             vizualus šaknų vertinimas
                                          
                                          
                                             pH
                                             O2
                                             
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                          
                                             V
                                          
                                       
                                             
                                                         V
                                                      
                                                      
                                                         –
                                                      
                                                      
                                                         rodo, kad tai yra vertinimo laikas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         –
                                                      
                                                      
                                                         rodo, kad matavimų nereikia atlikti.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                        Matavimų ir analizinių nustatymų dažnumas
                     
                     
                              
                                 66.
                              
                              
                                 Terpės temperatūra papildomame inde, kuris laikomas tokiomis pačiomis auginimo kameros, inkubatoriaus arba patalpos sąlygomis, turėtų būti registruojama bent kartą per dieną (arba nuolat duomenų registravimo įtaisu).
                              
                           
                              
                                 67.
                              
                              
                                 Bandymo terpės pH ir ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti tikrinama visuose kartotinių ėminių induose bandymo pradžioje, ne mažiau kaip vieną kartą tyrimo metu ir jį baigus. Kiekvieną kartą reikėtų matuoti tuo pačiu paros metu. Jei kiekvienos bandymo koncentracijos tirpalams paruošti naudojami pradiniai tirpalai, pakanka išmatuoti tik pradinių tirpalų koncentraciją nulinę parą.
                              
                           
                              
                                 68.
                              
                              
                                 Energinę apšvietą reikėtų matuoti augimo kameroje, inkubatoriuje ar patalpoje vandens paviršiaus lygį atitinkančiuose taškuose. Matuojama bent vieną kartą bandymo pradžioje arba bandymo metu. Šviesos aptikimo ir matavimo metodas, ypač jutiklio tipas, turės įtakos išmatuotai vertei. Sferiniai jutikliai (kurie reaguoja į šviesą, krintančią iš visų kampų aukščiau ir žemiau matavimo plokštumos) ir „kosinusiniai“ jutikliai (kurie reaguoja į šviesą, krintančią iš visų kampų aukščiau matavimo plokštumos) yra geresni nei vienos krypties jutikliai, ir šiame bandyme aprašytam daugiataškio šviesos šaltinio tipui bus gaunami didesni rodmenys.
                              
                           
                        Bandomosios cheminės medžiagos analiziniai matavimai
                     
                     
                              
                                 69.
                              
                              
                                 Reikėtų ne tik tinkamai įterpti bandomąją cheminę medžiagą, bet ir atlikti jos koncentracijos analizinius matavimus.
                              
                           
                              
                                 70.
                              
                              
                                 Vandens ėminiai turėtų būti imami bandomosios cheminės medžiagos kiekvienai koncentracijai nustatyti netrukus po bandymo pradžios (t. y. per pirmą patvarių bandomųjų cheminių medžiagų įterpimo parą arba per vieną valandą, jei cheminės medžiagos nepatvarios) ir baigus bandymą.
                              
                           
                              
                                 71.
                              
                              
                                 Koncentracija nuosėdose ir nuosėdų porų vandenyje turėtų būti nustatoma bandymo pradžioje ir jį baigus, bent jau didžiausia bandymo koncentracija, nebent būtų žinoma, kad bandomosios cheminės medžiagos yra patvarios vandenyje (> 80 % nominaliosios koncentracijos). Koncentracijos matavimų nuosėdose ir nuosėdų porų vandenyje gali neprireikti, jei bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų buvo aiškiai nustatytas, atlikus vandens ir nuosėdų sistemos tyrimą palyginamomis sąlygomis (pvz., nuosėdų ir vandens santykis, įterpimo būdas, nuosėdų tipas).
                              
                           
                              
                                 72.
                              
                              
                                 Nuosėdų ėminių ėmimas bandymo pradžioje gali sutrikdyti bandymo sistemą. Todėl gali prireikti papildomų bandymo indų analizės matavimams palengvinti bandymo pradžioje ir pabaigoje. Panašiai, jei manoma, kad būtinas tarpinis įvertinimas, t. y. 7 parą, ir analizuoti reikia didelius nuosėdų ėminius, kuriuos nėra paprasta paimti iš bandymo sistemos, analizinius matavimus reikėtų atlikti naudojant papildomus bandymo indus, kurie apdorojami tuo pačiu būdu, kaip biologiniam vertinimui naudojami indai.
                              
                           
                              
                                 73.
                              
                              
                                 Jei reikia atskirti porų vandenį, rekomenduojama procedūra yra 30 min trukmės centrifugavimas, pvz., esant 10 000 g ir 4 °C temperatūroje. Tačiau galima filtruoti, jei įrodoma, kad filtras nesugeria bandomosios cheminės medžiagos. Tam tikrais atvejais gali būti neįmanoma analizuoti porų vandens koncentracijos, nes ėminys yra per mažas.
                              
                           
                              
                                 74.
                              
                              
                                 Jei atliekant pusiau statinius bandymus (t. y. veikimą per vandeninę fazę) nesitikima, kad atitinkamos (-ų) bandomosios (-ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (-ų) koncentraciją būtų galima užtikrinti 20 % tikslumu visą bandymo trukmę, neatnaujinant bandymo tirpalų, su kiekvienu atnaujinimu reikėtų paimti panaudotų ir naujai paruoštų bandymo tirpalų ėminius bandomosios cheminės medžiagos analizei atlikti.
                              
                           
                              
                                 75.
                              
                              
                                 Tais atvejais kai išmatuota pradinė bandomosios medžiagos koncentracija neatitinka nominaliosios koncentracijos 20 % tikslumu, bet galima pateikti pakankamai įrodančių duomenų, kad pradinės koncentracijos vertės yra atkartojamos ir pastovios (t. y. atitinka 80–120 % pradinės koncentracijos intervalą), galima atlikti tik didžiausios ir mažiausios bandymo koncentracijos tirpalų cheminę analizę.
                              
                           
                              
                                 76.
                              
                              
                                 Visais atvejais bandomosios cheminės medžiagos koncentracija turi būti nustatoma tik viename kiekvienos bandymo koncentracijos kartotinio ėminio inde. Arba kiekvienos koncentracijos visų kartotinių ėminių bandymo tirpalai gali būti sujungti analizei atlikti.
                              
                           
                              
                                 77.
                              
                              
                                 Jei yra įrodymų, kad nominalioji ar išmatuota pradinė bandomosios cheminės medžiagos koncentracija visą bandymo trukmę buvo užtikrinta 20 % tikslumu, rezultatų analizė ir vėliau atliekamas vertinamųjų verčių gavimas gali būti pagrįstas nominaliomis ar išmatuotomis pradinėmis vertėmis.
                              
                           
                              
                                 78.
                              
                              
                                 Šiais atvejais poveikio koncentracijos vertės turėtų būti pagrįstos nominaliomis ar išmatuotomis koncentracijos vandenyje pradinėmis vertėmis.
                              
                           
                              
                                 79.
                              
                              
                                 Tačiau, jei yra įrodymų, kad koncentracija bandymo metu sumažėjo (nuokrypis nuo nominaliosios arba išmatuotos pradinės koncentracijos apdorojimo skyriuje yra didesnis kaip 20 %), rezultatų analizė turėtų būti pagrįsta veikimo laikotarpio koncentracijos geometriniu vidurkiu arba reikėtų taikyti modelius, kurie aprašytų bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos apdorojimo skyriuje mažėjimą (11).
                              
                           DUOMENŲ ĮVERTINIMAS
                     
                              
                                 80.
                              
                              
                                 Jei reikia naudoti tirpiklį arba dispergentą, tirpiklio ir neapdorotų kontrolinių ėminių duomenis galima sujungti, kad būtų galima atlikti statistinę analizę, kai tirpiklio ir neapdorotų kontrolinių ėminių atsakų skirtumas nėra statistiškai reikšmingas.
                              
                           
                        Atsako kintamieji
                     
                     
                              
                                 81.
                              
                              
                                 Bandymo tikslas – nustatyti cheminės medžiagos poveikį bandymo rūšies vegetatyviniam augimui, naudojant du atsako kintamuosius, vidutinį savitąjį augimo greitį ir išeigą, taip:
                              
                           
                        Vidutinis savitasis augimo greitis
                     
                     
                              
                                 82.
                              
                              
                                 Šis atsako kintamasis yra pagrįstas kontrolinių ėminių ir kiekvienos apdorotų ėminių grupės bendro ūglių ilgio, bendros žaliosios medžiagos masės ir bendros sausos medžiagos masės logaritmo laikiniu kitimu. Šis kintamasis yra apskaičiuojamas kiekvienos kontrolinės ir apdorotų ėminių grupės kiekvienam kartotiniam ėminiui. Trijų augalų vienam bandymo indui (kartotinio ėminio) vidutinį ilgį bei masę ir vėliau kiekvieno kartotinio ėminio augimo greitį reikėtų apskaičiuoti taikant šią formulę:
                                 
                                    
                                 čia:
                                 
                                             μi-j
                                             
                                          
                                          
                                             –
                                          
                                          
                                             vidutinis savitasis augimo greitis per laiką nuo i iki j;
                                          
                                       
                                             Ni
                                             
                                          
                                          
                                             –
                                          
                                          
                                             bandymo arba kontrolinio indo matuojamas kintamasis laiku i;
                                          
                                       
                                             Nj
                                             
                                          
                                          
                                             –
                                          
                                          
                                             bandymo arba kontrolinio indo matuojamas kintamasis laiku j;
                                          
                                       
                                             t
                                          
                                          
                                             –
                                          
                                          
                                             laikotarpis nuo i iki j.
                                          
                                       
                           
                              
                                 83.
                              
                              
                                 Pagal kartotinių ėminių atsakus reikėtų apskaičiuoti kiekvienos apdorotų ėminių ir kontrolinės grupės augimo greičio vidutinę vertę ir dispersijos įverčius.
                              
                           
                              
                                 84.
                              
                              
                                 Turėtų būti apskaičiuotas viso bandymo laikotarpio (pirmiau pateiktoje formulėje i yra bandymo pradžios laikas, j – bandymo pabaigos laikas) vidutinis savitasis augimo greitis. Kiekvienai bandymo koncentracijai ir kontroliniam ėminiui apskaičiuojama vidutinio savitojo augimo greičio vidutinė vertė ir dispersijos įverčiai.
                              
                           
                              
                                 85.
                              
                              
                                 Kiekvienos bandymo koncentracijos (apdorotų ėminių grupės) augimo greičio mažėjimas procentais (I
                                    r) gali būti apskaičiuotas pagal šią lygtį:
                                 
                                    
                                 čia:
                                 
                                             % I
                                                r
                                             
                                          
                                          
                                             vidutinio savitojo augimo greičio mažėjimas procentais;
                                          
                                       
                                             
                                                μ
                                                C
                                             
                                          
                                          
                                             kontrolinio ėminio vidutinė μ vidutinė vertė;
                                          
                                       
                                             T
                                          
                                          
                                             apdorotų ėminių grupės μ vidutinė vertė.
                                          
                                       
                           
                        Išeiga
                     
                     
                              
                                 86.
                              
                              
                                 Šis atsako kintamasis yra pagrįstas kontrolinių ėminių ir kiekvienos apdorotų ėminių grupės bendro ūglių ilgio, bendros žaliosios medžiagos masės ir bendros sausos medžiagos masės laikinis kitimas. Kiekvienos apdorotų ėminių grupės vidutinį išeigos mažėjimą procentais ( % Iy) galima apskaičiuoti taip:
                                 
                                    
                                 čia:
                                 
                                             % I
                                                y
                                             
                                          
                                          
                                             išeigos mažėjimas procentais;
                                          
                                       
                                             
                                                b
                                                C
                                             
                                          
                                          
                                             kontrolinių ėminių grupės galutinės ir pradinės biomasės skirtumas;
                                          
                                       
                                             
                                                b
                                                T
                                             
                                          
                                          
                                             apdorotų ėminių grupės galutinės ir pradinės biomasės skirtumas.
                                          
                                       
                           
                        Koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivių gavimas
                     
                     
                              
                                 87.
                              
                              
                                 Reikėtų gauti koncentracijos ir atsako kreives, kurios susieja atsako kintamojo vidutinį mažėjimą procentais (Ir ar Iy, apskaičiuotą, kaip nurodyta pirmiau) ir bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos logaritmą.
                              
                           
                        ECx įvertinimas
                     
                     
                              
                                 88.
                              
                              
                                 ECx įverčius (pvz., EC50) reikėtų gauti pagal vidutinį savitąjį augimo greitį (ErCx) ir išeigą (EyCx), kurių kiekvieną reikėtų gauti pagal ūglio bendrą žaliosios medžiagos masę, ūglio bendrą sausos medžiagos masę ir bendrą ūglių ilgį.
                              
                           
                              
                                 89.
                              
                              
                                 Reikėtų pažymėti, kad negalima lyginti ECx verčių, apskaičiuotų taikant šiuos du atsako kintamuosius, ir į šį skirtumą atsižvelgiama naudojant bandymo rezultatus. Jei laikomasi šio bandymų metodo sąlygų, ECx vertės, gautos pagal savitąjį augimo greitį (ErCx), paprastai bus didesnės nei išeiga pagrįsti rezultatai (EyCx, dėl atitinkamo metodo matematinio pagrindimo. Tai reikėtų aiškinti kaip dviejų atsako kintamųjų jautrio skirtumą, tiesiog vertės skiriasi matematiškai.
                              
                           
                        Statistinės procedūros
                     
                     
                              
                                 90.
                              
                              
                                 Tikslas – gauti kiekybinę koncentracijos ir atsako priklausomybę, taikant regresinę analizę. Galima taikyti svertinę tiesinę regresiją, atlikus atsako duomenų tiesinamąjį transformavimą, pvz., į probito, logito arba Weibullo vienetus (13), bet geresnės yra netiesinės regresijos metodų procedūros, kurias taikant geriau apdorojami neišvengiami duomenų netolygumai ir nukrypimai nuo tolygiųjų skirstinių. Artėjant į nulinį arba visišką slopinimą, tokie netolygumai dėl transformavimo gali padidėti ir trukdyti analizei (13). Reikėtų pažymėti, kad tipiniai analizės metodai, taikant probit, logit arba Weibullo transformaciją, yra skirti dichotominiams (pvz., mirtingumas arba išgyvenamumas) duomenims ir turėtų būti modifikuojami, norint juos pritaikyti augimo arba išeigos duomenims. Specifinės ECx verčių nustatymo pagal tolydžiuosius duomenis procedūros yra pateiktos (14)(15) (16) (17).
                              
                           
                              
                                 91.
                              
                              
                                 Kiekvienam analizuojamam atsako kintamajam naudojama koncentracijos ir atsako priklausomybė ECx verčių taškiniams įverčiams apskaičiuoti. Nustatomos kiekvieno įverčio 95 % pasikliovimo ribos, o atsako duomenų suderintumas su regresijos modeliu turėtų būti įvertintas grafiškai arba statistiškai. Regresinė analizė turėtų būti atliekama naudojant atskirus kartotinių ėminių atsakus, bet ne apdorotų ėminių grupių vidurkius.
                              
                           
                              
                                 92.
                              
                              
                                 Be to, jei turimi regresijos modeliai ar metodai netinka duomenims, EC50 įverčiai ir pasikliovimo ribos gali būti gautos taikant tiesinį interpoliavimą su saviranka (įkėla)(18).
                              
                           
                              
                                 93.
                              
                              
                                 Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, reikia palyginti apdorotų ėminių vidutines vertes, taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodus. Tuomet kiekvienai koncentracijai gautas vidurkis lyginamas su kontrolinio ėminio vidurkiu, taikant atitinkamą tikrinimo metodą (pvz., Dunnett, Williams kriterijus) (19) (20) (21) (22). Būtina įvertinti, ar galioja ANOVA normalaus pasiskirstymo ir dispersijos vienalytiškumo prielaida. Šį vertinimą reikėtų atlikti taikant Shapiro-Wilks kriterijų (dėl normalaus pasiskirstymo) ar Levene kriterijų (dėl dispersijų vienalytiškumo). Neatitiktį prielaidai dėl normalaus pasiskirstymo ir dispersijų vienalytiškumo kartais galima pataisyti atliekant duomenų logaritminį transformavimą. Jei dispersijos nevienalytiškumas ir (arba) nukrypimas nuo normalaus pasiskirstymo yra labai didelis ir jo neįmanoma pataisyti transformavimo keliu, reikėtų nagrinėti galimybę taikyti kitus analizės metodus, pvz., taikant Bonferroni-Welch t kriterijų, Jonkheere Terpstra kriterijų mažėjimo tvarka ir Bonferroni medianos kriterijų. Papildomus nurodymus dėl NOEC nustatymo galima rasti (16).
                              
                           
                        ATASKAITOS RENGIMAS
                     
                     
                              
                                 94.
                              
                              
                                 Bandymo ataskaitą sudaro ši informacija:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandomoji cheminė medžiaga
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Vienkomponentė cheminė medžiaga:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt.;
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminį pavadinimą (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymo rūšis
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         mokslinis pavadinimas ir šaltinis.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Bandymo sąlygos
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prigijimo tarpsnio trukmė ir sąlygos;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         taikyta bandymo procedūra (statinio ar pusiau statinio bandymo);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo pradžios data ir jų trukmė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo terpė, t. y. nuosėdos ir skystoji mitybinė terpė;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo schemos aprašymas: auginimo kamera ar patalpa arba laboratorija, bandymo indai ir dangčiai, tirpalų tūriai, vieno bandymo indo bandymo augalų ilgis ir masė bandymo pradžioje; nuosėdų paviršiaus ir vandens paviršiaus santykis, nuosėdų ir vandens tūrio santykis;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         bandymo koncentracijos vertės (nominaliosios ir išmatuotos, jei tinka) vienos koncentracijos kartotinių ėminių skaičius;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         pradinių ir bandymo tirpalų ruošimo metodai, įskaitant naudojamus tirpiklius ar dispergentus;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         temperatūra bandymo metu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         šviesos šaltinis, energinė apšvieta (μE·m– 2 s– 1);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apdorotų ir kontrolinių ėminių terpės pH vertės, taip pat bandymo terpių išvaizda bandymo pradžioje ir pabaigoje;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         deguonies koncentracija;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         analizės metodas ir atitinkami jo kokybės vertinimo duomenys (tinkamumo patvirtinimo tyrimai, analizės rezultatų standartiniai nuokrypiai arba pasikliovimo ribos);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         matuojamų kintamųjų, pvz., ilgio, sausos medžiagos masės, žaliosios medžiagos masės, nustatymo metodai;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         visi nukrypimai nuo šio bandymų metodo.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rezultatai
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         neapdoroti duomenys: vieno vazono augalų ūglių ilgis ir ūglių masė ir kiti kiekvieno bandymo ir kontrolinio indo matuojami kintamieji kiekvienu stebėjimo momentu ir analizės pagal 1 lentelėje pateiktą vertinimo tvarkaraštį data;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvieno matuojamo kintamojo vidurkis ir standartinis nuokrypis,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kiekvienai koncentracijai gautos augimo kreivės;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kontroliniams augalams gauta dvigubėjimo trukmė ir (arba) augimo greitis, nustatytas pagal ūglių ilgį ir žaliosios medžiagos masę, įskaitant žaliosios medžiagos masės išeigos variacijos koeficientą;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         apskaičiuoti kiekvieno apdoroto kartotinio ėminio atsako kintamieji, jų vidutinės vertės ir kartotinių ėminių variacijos koeficientas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grafinis koncentracijos ir poveikio priklausomybės vaizdas;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         toksiškumo vertinamųjų baigčių įverčiai pagal atsako kintamuosius, pvz., EC50, ir susiję pasikliovimo intervalai. Jei buvo apskaičiuotos, LOEC ir NOEC vertės ir jų nustatymo statistiniai metodai;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         jei buvo taikytas dispersinės analizės metodas ANOVA, poveikio, kurį galima aptikti, dydis (pvz., mažiausiais reikšmingas skirtumas);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         augimo skatinimas, nustatytas kurios nors koncentracijos ėminiui,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         visi stebimi fitotoksiškumo požymiai ir bandymo tirpalų stebėjimo duomenys;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rezultatų aptarimas, įskaitant poveikį bandymo rezultatams dėl nukrypimų nuo šio bandymų metodo.
                                                      
                                                   
                                       
                           LITERATŪRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Šio priedo C.26 skyrius. Lemna rūšių augalų augimo slopinimo bandymas.
                                 
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Šio priedo C.3 skyrius. Gėlavandenių dumblių ir melsvabakterių augimo slopinimo bandymas.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Maltby, L. et al. (2010), Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides, Guidance from the AMRAP Workshop in Wageningen (NL), 14-16 January 2008.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Arts, G.H.P. et al. (2008), Sensitivity of submersed freshwater macrophytes and endpoints in laboratory toxicity tests, Environmental Pollution, Vol. 153, pp. 199-206.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 ISO 16191:2013 Water quality – Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Knauer, K. et al. (2006), Methods for assessing the toxicity of herbicides to submersed aquatic plants, Pest Management Science, Vol. 62/8, pp. 715-722.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Šio priedo C.50 skyrius. Toksiškumo Myriophyllum spicatum bandymas sistemoje be nuosėdų.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Šio priedo C.28 skyrius. Toksiškumo bandymas su chironomidais nuosėdose ir vandenyje, naudojant vandenį su įterpta bandomąja chemine medžiaga.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Ratte, M., H. Ratte (2014), „Myriophyllum Toxicity Test: Result of a ring test using M. aquaticum and M. spicatum grown in a water-sediment system“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 206, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Davies, J. et al. (2003), Herbicide risk assessment for non-target aquatic plants: sulfosulfuron – a case study, Pest Management Science, Vol. 59/2, pp. 231 – 237.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), „Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Smart, R.M., J.W. Barko (1985), Laboratory culture of submersed freshwater macrophytes on natural sediments, Aquatic Botany, Vol. 21/3, pp. 251-263.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science Technology, Vol. 18/9, pp. 713-718.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, 1485-1494.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 OECD (2006), „Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application“, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp/ 93-96.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                        1 priedėlis
                        
                           SMART IR BARKO TERPĖS SUDĖTIS
                        
                        
                                    Komponentas
                                 
                                 
                                    Į vandenį įdėto reagento kiekis (*12) (mg/l)
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    91,7
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    69,0
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    58,4
                                 
                              
                                    KHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    15,4
                                 
                              
                                    pH (pusiausvyroje su oru)
                                 
                                 
                                    7,9
                                 
                              
                     
                        2 priedėlis
                        APIBRĖŽTYS
                        
                           
                              Biomasė
                           – populiacijos gyvosios medžiagos masė, išreiškiama kaip žaliosios ir (arba) sausos medžiagos masė. Šiame bandyme biomasė yra pagrindinio ūglio, visų šoninių šakų ir visų šaknų masė.
                        
                           
                              Cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys.
                        
                           
                              Chlorozė
                           – bandymo organizmo, ypač žiedų vainikų, spalvos pasikeitimas iš žalios į gelsvą.
                        
                           
                              ECx
                              
                           – bandymo terpėje ištirpusios bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant Myriophyllum spicatum augimo greitis per nustatytą veikimo laikotarpį (jo trukmę būtina tiksliai nurodyti, jei skiriasi nuo visos ar įprastinės bandymo trukmės) sumažėja x % (pvz., 50 %). EC vertei, gautai pagal augimo greitį arba pagal išeigą, vienareikšmiškai žymėti vartojami simboliai „ErC“ augimo greičiui ir „EyC“ išeigai, toliau nurodant naudotą matuojamą kintamąjį, pvz., ErC (pagrindinio ūglio ilgis).
                        
                           
                              Augimas
                           – matuojamo kintamojo didėjimas, pvz., pagrindinio ūglio ilgio, bendro šoninių šakų ilgio, bendro ūglių ilgio, bendro šaknų ilgio, žaliosios medžiagos masės, sausos medžiagos masės arba žiedų vainikų skaičiaus, bandymo laikotarpiu.
                        
                           
                              Augimo greitis (vidutinis savitasis augimo greitis)– matuojamo kintamojo logaritminis padidėjimas veikimo laikotarpiu. Pastaba. Su augimo greičiu susiję atsako kintamieji nepriklauso nuo bandymo trukmės, jei neveikiamų kontrolinių organizmų augimo schema yra eksponentinė.
                        
                           
                              Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC)– mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis augimo mažėjimui per nustatytą veikimo laikotarpį yra statistiškai reikšmingas palyginti su kontroliniais ėminiais (kai p < 0,05). Tačiau esant visoms didesnėms nei LOEC bandymo koncentracijos vertėms, kenksmingas poveikis turėtų būti lygus arba didesnis nei poveikis, kuris būtų esant LOEC. Kai negalima įvykdyti šių dviejų sąlygų, turėtų būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kaip buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vertė.
                        
                           
                              Matuojami kintamieji
                           – visų tipų kintamieji, kurie yra matuojami bandymo vertinamajai baigčiai išreikšti, naudojant vieną arba daugiau skirtingų atsako kintamųjų. Šiame bandymų metode matuojami kintamieji yra pagrindinio ūglio ilgis, bendras šoninių šakų ilgis, visas ūglių ilgis, bendras šaknies ilgis, žaliosios medžiagos masė, sausos medžiagos masė ir žiedų vainikų skaičius.
                        
                           
                              Monokultūra
                           – vienos rūšies augalų kultūra.
                        
                           
                              Nekrozė
                           – bandymo organizmo žuvęs audinys (t. y. baltas arba tamsiai rudas).
                        
                           
                              Nestebimo poveikio koncentracija NOEC– vos mažesnė nei LOEC bandymo koncentracija.
                        
                           
                              Atsako kintamasis
                           – toksiškumui įvertinti naudojamas kintamasis, gautas pagal bet kurį nors iš matuojamų kintamųjų, skirtingais apskaičiavimo metodais apibūdinančių biomasę. Šiame bandymų metode augimo greitis ir išeiga yra atsako kintamieji, gauti pagal matuojamus kintamuosius, pvz., pagrindinio ūglio ilgį, bendrą ūglių ilgį, žaliosios medžiagos masę, sausos medžiagos masę ar žiedų vainikų skaičių.
                        
                           
                              Pusiau statinis (atnaujinimo) bandymas
                           – bandymas, kurį atliekant bandymo tirpalas periodiškai keičiamas po tam tikro laiko tarpo.
                        
                           
                              Statinis bandymas
                           – bandymų metodas, kai bandymo tirpalas neatnaujinamas atliekant bandymą.
                        
                           
                              Bandomoji cheminė medžiaga
                           – medžiaga arba mišinys, bandyti pagal šį bandymų metodą.
                        
                           
                              Bandymo vertinamoji baigtis
                           – bendrasis veiksnys, kurio pokytis veikiant bandomąja chemine medžiaga palyginti su kontroliniu ėminiu yra bandymo tikslas. Šiame bandymų metode vertinamoji baigtis yra augimo slopinimas, kuris gali būti išreikštas skirtingais atsako kintamaisiais, pagrįstais vienu arba daugiau matuojamų kintamųjų.
                        
                           
                              Bandymo terpė
                           – visiškai paruošta sintetinė kultūros terpė, kurioje auga bandymo augalai, kai jie veikiami bandomąja chemine medžiaga. Bandomoji cheminė medžiaga paprastai yra ištirpinta bandymo terpėje.
                        
                           
                              UVCB
                           – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos.
                        
                           
                              Išeiga
                           – matuojamo kintamojo, naudojamo biomasės kiekiui išreikšti, vertės veikimo pabaigoje ir jo vertės veikimo pradžioje skirtumas. Pastaba. Kai neveikiamų organizmų augimo schema yra eksponentinė, išeiga pagrįsti atsako kintamieji bandymo eigoje mažės.
                     “
               
            (1)  Nėra vertės, nustatytos esant 20 °C, bet galima daryti prielaidą, kad matavimo rezultatų kintamumas yra didesnis palyginti su tikėtina priklausomybe nuo temperatūros.
         
            (2)  2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantis Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantis Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantis Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB ir 2000/21/EB. OL L 304, 2007 11 22, p. 1.
         
            (3)  JAV Alternatyvių metodų patvirtinimo tarpžinybinis koordinavimo komitetas.
         
            (*1)  Turėtų būti nurodytas ragenos drumstumo srities plotas.
         
            (4)  Jei norima taikyti akių dirginimo kompleksinių bandymų strategiją pagal REACH, žr. taip pat ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
         
            (5)  Statistikai, kurie taiko modeliavimo metodą, pvz., apibendrintuosius tiesinius modelius (GLM), gali atlikti analizę skirtingu, bet palyginamuoju būdu ir nebūtinai sudaryti tradicinę ANOVA lentelę, bet modeliai grąžina atgal prie algoritminių statistinių duomenų skaičiavimo metodų, sukurtų tada, kai nebuvo kompiuterių.
         
            (6)  Statistikai, kurie taiko modeliavimo metodą, pvz., apibendrintuosius tiesinius modelius (GLM), gali atlikti analizę skirtingu, bet palyginamuoju būdu ir nebūtinai sudaryti tradicinę ANOVA lentelę, bet modeliai grąžina atgal prie algoritminių statistinių duomenų skaičiavimo metodų, sukurtų tada, kai nebuvo kompiuterių.
         
            (7)  2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31.
         
            (8)  Kiekviena bandomoji cheminė medžiaga priskirta cheminių junginių klasei, taikant standartinę klasifikavimo sistemą, pagrįstą Vaistų medicininių dalykinių antraščių (MeSH) nacionalinės bibliotekos klasifikavimo sistema (available at http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (9)  Atsižvelgiant į rezultatus, gautus atlikus triušio akies in vivo bandymą (EBPO TG 405) (17) ir taikant JT GHS (4).
         
            (10)  Klasifikavimas kaip 2A ar 2B priklauso nuo JT GHS kriterijaus šioms dviems kategorijoms atskirti aiškinimo, t. y. poveikis 7 parą 1 iš 3 gyvūnų palyginti su 2 iš 3 gyvūnų, kuris yra būtinas norint klasifikuoti kaip 2A kategorijos. In vivo tyrime buvo naudojami 3 gyvūnai. Visos vertinamosios baigtys, išskyrus vieno gyvūno junginės paraudimą, grįžo prie nulinių verčių 7 parą arba anksčiau. Vieno gyvūno, kurio junginės paraudimas ne visiškai išnyko iki 7 paros, paraudimo balas buvo 1 (7 parą), šis paraudimas visiškai išnyko 10 parą.
         
            (11)  Pateikti matmenys atitinka ragenos laikiklį, naudojamą tiriant 12–60 mėnesių karvių ragenas. Jei naudojami 6–12 mėnesių gyvuliai, reikėtų pagaminti laikiklį, kurio kiekvienos kameros talpa būtų 4 ml, o kiekvienos vidinės kameros skersmuo – 1,5 cm, gylis – 2,2 cm. Projektuojant visus naujus ragenų laikiklius, labai svarbu užtikrinti, kad veikiamo ragenos paviršiaus ploto ir užpakalinės kameros talpos santykis būtų lygus įprastinio ragenų laikiklio santykiui. Tai yra būtina, siekiant užtikrinti, kad būtų tinkamai nustatytos pralaidumo vertės, naudojamos IVIS skaičiuoti pagal pasiūlytą formulę.
         
            (12)  2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31.
         
            (*2)  Didžiausias stebimas balas bet kuriuo laiko momentu.
         
            (*3)  Maksimalus vidutinis balas, stebimas bet kuriuo momentu (pagrįstas drumstumo balais, kaip apibrėžta 1 lentelėje).
         
            (*4)  Pagrįstas drumstumo balais, kaip apibrėžta 2 lentelėje.
         
            (*5)  Retai pasitaikantys deriniai.
         
            (13)  Kiekviena bandomoji cheminė medžiaga priskirta cheminių junginių klasei taikant standartinę klasifikavimo sistemą, pagrįstą Vaistų medicininių dalykinių antraščių (MeSH) nacionalinės bibliotekos klasifikavimo sistema (available at http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (14)  Atsižvelgiant į rezultatus, gautus atlikus triušio akies in vivo bandymą (EBPO TG 405), ir taikant JT GHS (4)(6).
         
            (15)  Atsižvelgiant į ICE rezultatus, kaip aprašyta 6 lentelėje.
         
            (16)  Kitų nei 6 lentelėje aprašytų GHS be kategorijos ir GHS 1 kategorijos ICE balų derinys (žr. 6 lentelę).
         
            (17)  Klasifikavimas kaip 2A ar 2B priklauso nuo JT GHS kriterijaus šioms dviems kategorijoms atskirti aiškinimo, t. y. poveikis 7 parą 1 iš 3 gyvūnų palyginti su 2 iš 3 gyvūnų, kuris yra būtinas norint klasifikuoti kaip 2A kategorijos. Į in vivo tyrime buvo naudojami 3 gyvūnai. Visos vertinamosios baigtys, išskyrus vieno gyvūno junginės paraudimą, grįžo prie nulinių verčių 7 parą arba anksčiau. Vieno gyvūno, kurio junginės paraudimas ne visiškai išnyko iki 7 paros, paraudimo balas buvo 1 (7 parą), šis paraudimas visiškai išnyko 10 parą.
         
            (18)  2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31.
         
            (19)  Visame dokumente vidurkis reiškia aritmetinį vidurkį.
         
            (20)  Skaičiai rodo statistiškai gautas ribines vertes ir nėra susiję su matavimo tikslumu.
         
            (21)  Į DPRA prognozę reikėtų žiūrėti kaip IATA sistemos dalį ir atsižvelgti į 9 ir 12 pastraipų nuostatas.
         
            (22)  Skaičiai rodo statistiškai gautas ribines vertes ir nėra susiję su matavimo tikslumu.
         
            (23)  Į DPRA prognozę reikėtų žiūrėti kaip IATA sistemos dalį ir atsižvelgti į 9 bei 12 pastraipų nuostatas.
         
            (24)  Pavojaus (ir veikimo gebos) prognozės in vivo yra pagrįstos LLNA duomenimis (19). Veikimo geba in vivo gauta taikant ECETOC pasiūlytus kriterijus (23).
         
            (25)  Į DPRA prognozę reikėtų žiūrėti kaip į IATA sistemos dalį ir atsižvelgti į 9 bei 11 pastraipų nuostatas.
         
            (26)  Intervalai nustatyti pagal ne mažiau kaip 10 kiekio sumažėjimo verčių, gautų 6 nepriklausomose laboratorijose.
         
            (27)  2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31.
         
            (28)  Pavojaus (ir veikimo gebos) prognozės in vivo yra pagrįstos LLNA duomenimis (13). Veikimo geba in vivo gauta taikant ECETOC pasiūlytus kriterijus (24).
         
            (29)  Į KeratinoSensTM prognozę reikėtų žiūrėti kaip į IATA sistemos dalį ir atsižvelgti į šio bandymų metodo 9 ir 11 pastraipų nuostatas.
         
            (30)  Pagrįstas stebimais istoriniais duomenimis (12).
         
            (31)  2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies keičiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006, OL L 353, 2008 12 31.
         
            (32)  Kiekviena bandomoji cheminė medžiaga priskirta cheminių junginių klasei taikant standartinę klasifikavimo sistemą, pagrįstą Vaistų medicininių dalykinių antraščių (MeSH) nacionalinės bibliotekos klasifikavimo sistema (available at http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (33)  Atsižvelgiant į rezultatus, gautus atlikus triušio akies in vivo bandymą (EBPO TG 405, TM B.5) ir taikant JT GHS bei ES CLP.
         
            (34)  Atsižvelgiant į rezultatus, gautus taikant FL (INVITTOX protokolas Nr. 71(6)).
         
            (35)  Statistikai, kurie taiko modeliavimo metodą, pvz., apibendrintuosius tiesinius modelius (GLM), gali atlikti analizę skirtingu, bet palyginamuoju būdu ir nebūtinai sudaryti tradicinę ANOVA lentelę, bet modeliai grąžina atgal prie algoritminių statistinių duomenų skaičiavimo metodų, sukurtų tada, kai nebuvo kompiuterių.
         
            (36)  Apibrėžtys ir vienetai pateikti 1 priedėlyje.
         
            (37)  Kartais žymimas P
            OW; nustatomas kratomos kolbos metodu pagal TM A.8 (4), HPLC metodu pagal TM A.24 (5) ir lėto maišymo metodu pagal TM A.23 (6). Kartais naudojamos tirpalo generavimo kolonėlės metodas log KOW nustatyti. Yra nedaug tyrimų, kuriuose būtų taikomas šis metodas, pirmiausiai polichlorintiesiems bifenilams ir dibenzdioksinams (pvz., Li and Doucette, 1993) (3). Jei medžiagos gali jonizuotis, log K
            OW būtų naudojamas nejonizuotai formai.
         
            (38)  Apibrėžtys ir vienetai pateikti 1 priedėlyje.
         
            (39)  TLC – plonasluoksnė chromatografija; HPLC –efektyvioji skysčių chromatografija; GC – dujų chromatografija.
         
            (40)  Taikant kai kurias reglamentavimo sistemas, gali būti privaloma metabolitų analizė, kai įvykdomos tam tikros sąlygos (žr. 65 pastraipą).
         
            (41)  Apskritai, vandeninio tirpalo koncentracijos vertės, išmatuotos sugerties tarpsnio metu, turėtų būti bent viena eile didesnės nei kiekybinio nustatymo riba, kad tyrimo apsivalymo tarpsniu būtų galima matuoti kūno sugertą kiekį ilgiau nei viena pusėjimo trukmė.
         
            (42)  Apibrėžtys ir vienetai pateikti 1 priedėlyje.
         
            (43)  Būtų gerai, jei daugumos bandomųjų cheminių medžiagų nebūtų įmanoma aptikti kontrolinių ėminių vandenyje. Foninė koncentracija turėtų būti susijusi tik su natūraliai paplitusiomis medžiagomis (pvz., kai kuriais metalais) ir medžiagomis, kurių yra visur aplinkoje.
         
            (44)  Jei pirmojo laipsnio kinetika aiškiai netinka, reikėtų taikyti sudėtingesnius modelius (žr. 5 priedėlio nuorodas) ir klausti biologinės statistikos specialisto patarimo.
         
            (45)  Atliekant biologinio koncentravimo bandymą, sugertį gali riboti maža veikimo koncentracija dėl mažo tirpumo vandenyje, o taikant mitybos bandymą, galima pasiekti gerokai didesnes koncentracijos vertes.
         
            (46)  Jei bandomos daugiakomponentės medžiagos, UVCB ir mišiniai, galbūt reikėtų nustatyti kiekvieno susijusio komponento tirpumą vandenyje, kad būtų nustatytos reikiamos veikimo koncentracijos vertės.
         
            (47)  TOC sudaro dalelių organinė anglis ir ištirpusi organinė anglis, t. y. TOC = POC + DOC.
         
            (48)  Nors tai paprastai nerekomenduojama, jei yra naudojamas tirpiklis ar soliubilizavimo agentas, iš šio agento gautą organinės anglies kiekį reikėtų sudėti su bandomosios cheminės medžiagos organinės anglies kiekiu, kad būtų įvertinta organinės anglies koncentracija bandymų induose.
         
            (49)  Jei lipidų kiekis nustatomas ne toje pačioje žuvyje kaip bandomoji cheminė medžiaga, žuvis turėtų būti bent jau tokios pačios masės ir (jei tinka) tos pačios lyties.
         
            (50)  Ši alternatyva galioja tik jei visų bandomųjų grupių žuvys laikomos panašaus dydžio grupėse, jos ėminiams imamos pagal tą pačią schemą ir maitinamos tuo pačiu būdu. Tai užtikrina, kad visų grupių žuvys auga panašiai, jei bandoma koncentracija yra mažesnė nei toksinio intervalo koncentracija. Manoma, kad, jei žuvys auga panašiai, lipidų kiekis turėtų būti panašus. Kitoks augimas kontroliniame ėminyje rodytų cheminės medžiagos poveikį ir tyrimo rezultatai būtų netinkami.
         
            (51)  Be masės reikėtų registruoti visą ilgį, nes ilgio padidėjimo palyginimas bandymo metu yra geras neigiamo poveikio buvimo rodiklis.
         
            (52)  Augimo greičio konstantas galima įvertinti taikant Stjudento t kriterijų, kad būtų galima patikrinti, ar yra skirtumas tarp kontrolinių ir bandymo grupių, arbaF kriterijų, jei atliekama dispersinė analizė. Jei reikia, galima taikyti F kriterijų arba tikėtinumo santykio kriterijų, kad būtų lengviau pasirinkti tinkamą augimo modelį (EBPO monografija 54, (32)).
         
            (53)  Šios procentinės vertės gautos darant prielaidą, kad analizės metodai yra patikimi ir pusėjimo trukmė yra < 14 parų. Jei analizės metodai yra ne tokie patikimi arba pusėjimo trukmė yra (gerokai) didesnė, šie skaičiai bus didesni.
         
            (54)  
         
            1PI– pasikliovimo intervalas (jei įmanoma įvertinti);
         
            (55)  
         
            SN– standartinis nuokrypis (jei įmanoma įvertinti).
         
            (56)  Supaprastintas bandymas faktiškai gali būti naudojamas greitam metabolizmui įrodyti, kai žinoma, kad yra greito metabolizmo tikimybė.
         
            (57)  Kai yra tik du duomenų taškai, BCFKm pasikliovimo ribų įverčius galima gauti taikant savirankos metodus. Kai taip pat yra tarpiniai duomenų taškai, BCFKm pasikliovimo ribų įverčius galima gauti taip, kaip jie gaunami atliekant viso masto bandymą.
         
            (58)  Apibrėžtys ir vienetai pateikti 1 priedėlyje.
         
            (59)  Atsižvelgiant į Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH) OL L 396, 2006 12 30, p. 1), šis klausimas nagrinėjamas Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment, R.7c, R.7.10.3.1 skyriuje; R.7.10.4.1 ir R7.10-2 paveiksle.
         
            (60)  Būtų labai gerai, jei daugumos bandomųjų cheminių medžiagų nebūtų aptinkama kontroliniuose vandens ėminiuose. Foninė koncentracija turėtų būti susijusi tik su natūraliai paplitusioms medžiagoms (pvz., kai kuriais metalais) ir medžiagomis, kurios aplinkoje yra labai paplitusios.
         
            (61)  Kadangi BMF yra apibrėžiamas kaip cheminės medžiagos koncentracijos organizme ir jos koncentracijos maiste santykis, esant nuostoviajai būsenai, į lipidų kiekį yra atsižvelgiama darant pataisą dėl jų kiekio organizme ir maiste, todėl vartojamas tikslesnis terminas „pataisa“. Šis metodas skiriasi nuo „normalizavimo“ pagal nustatytą organizmo lipidų kiekį, kaip tai daroma atliekant veikimo per vandeninę terpę biologinio koncentravimo bandymą.
         
            (62)  Visą ilgį taip pat reikėtų matuoti ir registruoti bandymo metu, nes jis yra geras rodiklis, ar nebuvo nepageidaujamo poveikio.
         
            (63)  HCB yra įtrauktas į Stokholmo konvencijos A ir C priedus ir į Reglamento (EB) Nr. 850/2004 dėl patvariųjų organinių teršalų I ir III priedus (OL L 158, 2004 4 30, p. 7).
         
            (64)  Dėl spartaus augimo sugerties tarpsnio metu tikroji maisto norma bus mažesnė nei nustatyta veikimo pradžioje.
         
            (65)  Atliekant veikimo per vandeninę terpę, 14 parų pusėjimo trukmė atitiktų maždaug 10 000 l/kg BCF, jei naudojamos 1 g žuvys ir atitinkamas sugerties greitis yra 500 l/kg/parai (pagal Sijm et al (46) lygtį).
         
            (66)  Kadangi faktinę vidinę koncentraciją galima nustatyti tik atlikus bandymą, būtinas tikėtinos vidinės koncentracijos įvertis (pvz., pagrįstas tikėtinu BMF ir koncentracija maiste; žr. 5 priedėlio A5.8 5 lygtį).
         
            (67)  Neįmanoma visiškai išvengti bandomosios cheminės medžiagos buvimo bandymo terpėje dėl žuvų išmatų ar dėl išplovimo iš maisto. Todėl viena iš galimybių būtų cheminės medžiagos koncentracijos vandenyje matavimas sugerties tarpsnio pabaigoje, ypač jei naudojama pusiau statinio bandymo schema, kad būtų galima nustatyti, ar paveikta per vandeninę terpę.
         
            (68)  Šis metodas taikomas tik mitybos tyrimui, kuris skiriasi nuo veikimo per vandeninę terpę metodo, todėl, siekiant nesupainioti, taikomas žodis „pataisa“, o ne „normalizavimas“, taip pat žr. išnašą 106 pastraipoje.
         
            (69)  Augimo greičio konstantas galima įvertinti taikant Stjudento t kriterijų, kad būtų galima patikrinti, ar yra skirtumas tarp kontrolinių ir bandymo grupių, arba F kriterijų, jei atliekama dispersinė analizė. Jei reikia, galima taikyti F kriterijų arba tikėtinumo santykio kriterijų, kad būtų lengviau pasirinkti tinkamą augimo modelį (EBPO monografija 54 (32)).
         
            (70)  Maisto analizės metodas baltymų, lipidų, ląstelienos ir pelenų kiekiui nustatyti; šią informaciją paprastai galima gauti iš maisto tiekėjo.
         
            (71)  
         
            PI– pasikliovimo intervalas (jei įmanoma įvertinti);
         
            (72)  
         
            SN– standartinis nuokrypis (jei įmanoma įvertinti).
         
            (73)  Meyer et al. (1)
         
            (74)  Reikėtų pažymėti, kad atliekant patį bandymą, masei teikiama pirmenybė kaip dydžio matui ir augimo greičio konstantai išvesti. Tačiau pripažįstama, kad ilgis yra praktiškesnis matas, jei žuvį reikia pasirinkti vizualiai bandymo pradžioje (t. y. iš pradinės populiacijos).
         
            (75)  Šis ilgio intervalas yra nurodytas Naujų cheminių medžiagų bandymo metodai ir kt., pagrįstas Japonijos cheminių medžiagų kontrolės įstatymu (CSCL).
         
            (76)  Vertės skliausteliuose yra ėminių (vandens, žuvų), kuriuos reikia paimti, skaičius, jei imami papildomi ėminiai.
         
            (77)  Prieš bandymą gautas k
            2 įvertis, kai log K
            OW yra lygus 4,0, yra 0,652 paros– 1. Nustatyta suminė bandymo trukmė yra 3 × t
            SS = 3 × 4,6 paros, t. y. 14 parų. Dėl t
            SS įvertinimo žr. 5 priedėlį.
         
            (78)  Vandens ėminys imamas po to, kai kameros vandens tūris buvo pakeistas mažiausiai tris kartus.
         
            (79)  Šios žuvys yra imamos iš pradinės populiacijos.
         
            (80)  Jei būtinas didesnis tikslumas ar metabolizmo tyrimai, kuriems atlikti reikia daugiau žuvų, jas reikėtų imti visų pirma sugerties ir apsivalymo tarpsnių pabaigoje (žr. 40 pastraipą).
         
            (81)  Lipidų kiekiui analizuoti gali prireikti ne mažiau kaip 3 papildomų žuvų, jei neįmanoma naudoti žuvų, kurios buvo paimtos cheminės medžiagos koncentracijos vertėms nustatyti bandymo pradžioje, sugerties tarpsnio pabaigoje ir apsivalymo tarpsnio pabaigoje. Reikėtų pažymėti, kad daugumoje atvejų galima naudoti tik tris kontrolines žuvis (žr. 56 pastraipą).
         
            (82)  Analizuojami 3 maisto ėminiai, paimti iš kontrolinių grupių ir bandymo grupių, bandomosios cheminės medžiagos koncentracijai ir lipidų kiekiui nustatyti.
         
            (83)  Žuvys imamos iš pradinės populiacijos kuo arčiau tyrimo pradžios; bandymo pradžioje paimamos bent 3 žuvys iš pradinės populiacijos lipidų kiekiui nustatyti.
         
            (84)  Imant (neprivalomai) ėminius sugerties tarpsniu, gaunami duomenys bandomosios medžiagos įsisavinimui su maistu apskaičiuoti, kad jį būtų galima palyginti su įsisavinimo efektyvumu, apskaičiuotu pagal apsivalymo tarpsnio duomenis.
         
            (85)  Galima paimti papildomai 5 žuvis audinių specifinei analizei atlikti.
         
            (86)  Lipidų kiekiui analizuoti gali prireikti ne mažiau kaip 3 papildomų žuvų, jei neįmanoma naudoti žuvų, kurios buvo paimtos cheminės medžiagos koncentracijos vertėms nustatyti bandymo pradžioje, sugerties tarpsnio pabaigoje ir apsivalymo tarpsnio pabaigoje. Reikėtų pažymėti, kad daugumoje atvejų galima naudoti tik tris kontrolines žuvis (žr. 56 ir 153 pastraipas).
         
            (87)  Kaip ir kiekvienos empirinės priklausomybės atveju, reikėtų patikrinti, ar bandomoji cheminė medžiaga patenka į priklausomybės taikymo sritį
         
            (88)  Žuvų masė sugerties tarpsnio pabaigoje gali būti įvertinta pagal ankstesnių tyrimų duomenis arba pagal turimas žinias apie bandymo rūšių galimą masės padidėjimą nuo tipinės masės bandymo pradžioje per tipinę sugerties tarpsnio trukmę, pvz., 28 paras).
         
            (89)  Dauguma programų tiesinei regresijai skaičiuoti turi galimybę gauti įverčių standartinį nuokrypį ir pasikliovimo intervalą (PI), pvz., Microsoft Excel naudojant duomenų analizės rinkinį.
         
            (90)  Priešingai nei taikant tiesinės regresijos metodą, naudojant šią formulę nebus gauta standartinė k2 paklaida.
         
            (91)  Priešingai nei taikant tiesės priderinimo procedūrą, šiuo metodu nebus gauta k1 įverčio standartinė paklaida ar pasikliovimo intervalas.
         
            (92)  Reikėtų suvokti, kad k
            2 įverčio neapibrėžtis nėra tinkamai naudojama, taikant biologinio kaupimosi modelį, į ją iš esmės žiūrint kaip į konstantą, kai1 priderinama pagal nuosekliojo priderinimo metodą. Todėl nuosekliuoju ir vienalaikiu priderinimo metodu gauto BCF neapibrėžtis bus skirtinga.
         
            (93)  Kai kuriuose regionuose gali būti įmanoma gauti tik tokį žuvų maistą, kuriame lipidų koncentracija būtų gerokai mažesnė nei ši viršutinė riba. Tokiais atvejais tyrimai turėtų būti atliekami esant mažesnei tiekiamo maisto lipidų koncentracijai, bet reikėtų tinkamai reguliuoti maisto normą, kad būtų užtikrinta žuvų sveikata. Maisto lipidų kiekį nereikėtų dirbtinai didinti pridedant daugiau aliejaus.
         
            (94)  Gamtoje tikėtina, kad stipriai hidrofobinių cheminių medžiagų nurijimas daro didesnį poveikį nei veikimo per vandeninę terpę bandymas, todėl BCF įvertis nėra tokios cheminės medžiagos biologinio kaupimosi gebos tikslus rodiklis.
         
            (95)  Galima naudoti kitas dafnijų rūšis, jei jos atitinka reikiamus tinkamumo kriterijus (su kontrolinių ėminių reprodukcijos našumu susijęs tinkamumo kriterijus turėtų būti taikomas visoms rūšims). Jei naudojamos kitų rūšių dafnijos, jas reikėtų aiškiai identifikuoti ir jų naudojimą pagrįsti.
         
            (96)  Atsitiktinis gaištamumas – su chemine medžiaga nesusijęs gaištamumas, sukeltas atsitiktinio įvykio (t. y. žinoma priežastis).
         
            (97)  Netyčinis gaištamumas – su chemine medžiaga nesusijęs gaištamumas dėl nežinomos priežasties.
         
            (*6)  Nurodomas bandymui naudotas indas.
         
            (*7)  Registruojami neapvaisinti kiaušinėliai, atitinkamame langelyje įrašant „AB“
         
            (*8)  Registruojamas visų motininių gyvūnų giaštamumas, atitinkamame langelyje įrašant „M“
         
            (98)  Tipinis mažiausias visas vidutinis ilgis nėra tinkamumo kriterijus, bet didesnius nei nurodyti skaičiai nukrypimus reikėtų atidžiai ištirti atsižvelgiant į bandymo jautrį. Mažiausias visas vidutinis ilgis yra gautas pagal šiuo metu turimus atrinktus duomenis.
         
            (99)  Tam tikras bandomų vaivorykštinių upėtakių veisles gali tekti laikyti kitoje temperatūroje. Neršiančios žuvys turi būti laikomos toje pačioje temperatūroje, kurioje buvo laikomi ikrai. Gavus ikrus iš komercinio veisėjo, po atvykimo yra būtinas trumpas (pvz., 1–2 h) aklimatizavimas bandymo temperatūroje.
         
            (100)  Lervos vieną savaitę po išsiritimo laikomos tamsoje, išskyrus apžiūros metą, vėliau – prislopintoje šviesoje visą bandymo trukmę (12–16 h šviesiojo laikotarpio trukmė) (4).
         
            (101)  Esant tam tikroms bandymų sąlygoms, apšvietimo režimas turėtų būti pastovus.
         
            (102)  Atliekant visus bandymus tai turi būti nustatyta ± 20/00 tikslumu.
         
            (*9)  Reikėtų maitinti iki soties. Jei būtina, maisto perteklių ir išmatas reikėtų pašalinti, kad nesikauptų atliekos.
         
                     FBS
                  
                  
                     –
                  
                  
                     šaldytos sūriavandenės krevetės; suaugusios Artemia sp;
                  
               
                     BSN
                  
                  
                     –
                  
                  
                     sūriavandenių krevečių nauplijai; tik ką išsiritę;
                  
               
                     BSN48
                  
                  
                     –
                  
                  
                     sūriavandenių krevečių nauplijai; 48 h amžiaus;
                  
               
            (1)  lervų su trynio maišeliu maitinti nereikia;
         
            (2)  filtruoti iš kultūros mišinio;
         
            (3)  fermentavimo proceso granulės.
         
            (*10)  Spenelinės ataugos paprastai atsiranda tik pas suaugusius patinus ir būna tarp antrojo ir septintojo arba aštuntojo analinio peleko spindulio, skaičiuojant nuo analinio peleko užpakalinio galo (1 ir 2 paveikslai). Tačiau ataugos retai atsiranda ant pirmojo peleko spindulio nuo analinio peleko užpakalinio galo. Pagal šią standartinę veiklos procedūrą (SVP) galima matuoti ant pirmojo peleko spindulio esančias ataugas (pagal šią SVP peleko spinduliai skaičiuojami nuo analinio peleko užpakalinio galo).
         
            (*11)  Homogenizavimo buferinis tirpalas:
         
                     —
                  
                  
                     (50 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4; 1 % proteazės inhibitoriaus mišinio (Sigma)): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl proteazės inhibitoriaus mišinio.
                  
               
                     —
                  
                  
                     TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN), pvz., Bie & Berntsen gamybos, Danija.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Proteazės inhibitoriaus mišinys: Sigma gamybos (žinduolių audiniams). Produkto numeris P 8340.
                  
               
            PASTABA. Homogenizavimo buferis turėtų būti naudojamas gamybos dieną. Naudojant dedamas ant ledo.
         
            (103)  Carl von Linné (gimė 1707 m. gegužės 23 d. Elmhulte; mirė 1778 m.sausio 10 dieną Upsaloje).
         
            (*12)  demineralizuotas (t. y. distiliuotas ar dejonizuotas) vanduo.