CELEX: 32017R0735
Language: sk
Date: 2017-02-14
Title: Nariadenie Komisie (EÚ) 2017/735 zo 14. februára 2017, ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) (Text s významom pre EHP )

28.4.2017   
               
               
                  SK
               
               
                  Úradný vestník Európskej únie
               
               
                  L 112/1
               
            NARIADENIE KOMISIE (EÚ) 2017/735
      zo 14. februára 2017,
      ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH)
      (Text s významom pre EHP)
      EURÓPSKA KOMISIA,
      so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,
      so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a najmä na jeho článok 13 ods. 2,
      keďže:
      
                  (1)
               
               
                  V nariadení Komisie (ES) č. 440/2008 (2) sa uvádzajú testovacie metódy na určovanie fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity chemikálií, ktoré sa majú používať na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006.
               
            
                  (2)
               
               
                  Je potrebné aktualizovať nariadenie (ES) č. 440/2008 tak, aby sa v ňom uvádzali nové a aktualizované testovacie metódy nedávno prijaté Organizáciou pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD) v záujme zohľadnenia technického pokroku, a aby sa ním zabezpečilo zníženie počtu zvierat používaných na pokusné účely v súlade so smernicou Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ (3). Tento návrh bol prekonzultovaný so zainteresovanými stranami.
               
            
                  (3)
               
               
                  Prispôsobenie technickému pokroku sa týka dvadsiatich testovacích metód: jednej novej metódy na stanovenie fyzikálno-chemickej vlastnosti, piatich nových a jednej aktualizovanej testovacej metódy na hodnotenie ekotoxicity, dvoch aktualizovaných testovacích metód na hodnotenie osudu a pôsobenia chemikálie v životnom prostredí a štyroch nových a siedmich aktualizovaných testovacích metód na stanovenie účinkov na ľudské zdravie.
               
            
                  (4)
               
               
                  OECD pravidelne reviduje svoje usmernenia na vykonávanie testov s cieľom určiť tie, ktoré sú z vedeckého hľadiska zastarané. V dôsledku tohto prispôsobenia technickému pokroku sa vypúšťa šesť testovacích metód, v prípade ktorých došlo k zrušeniu príslušných usmernení OECD na vykonávanie testov.
               
            
                  (5)
               
               
                  Nariadenie (ES) č. 440/2008 by sa preto malo zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.
               
            
                  (6)
               
               
                  Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom výboru zriadeného podľa článku 133 nariadenia (ES) č. 1907/2006,
               
            PRIJALA TOTO NARIADENIE:
      Článok 1
      Príloha I k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení v súlade s prílohou k tomuto nariadeniu.
      Článok 2
      Toto nariadenie nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.
      
         Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch
         V Bruseli 14. februára 2017
         
            
               Za Komisiu
            
            
               predseda
            
            Jean-Claude JUNCKER
         
      
      
         (1)  Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1.
      
         (2)  Nariadenie Komisie (ES) č. 440/2008 z 30. mája 2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) (Ú. v. EÚ L 142, 31.5.2008, s. 1).
      
         (3)  Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33).
      
         PRÍLOHA
         Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení takto:
         
                     1.
                  
                  
                     Do časti A sa dopĺňa táto kapitola:
                     „A.25   DISOCIAČNÉ KONŠTANTY VO VODE (TITRAČNÁ METÓDA – SPEKTROFOTOMETRICKÁ METÓDA – KONDUKTOMETRICKÁ METÓDA)
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 112 (1981).
                     
                        Základné požiadavky
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Vhodná analytická metóda
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Rozpustnosť vo vode
                              
                           
                        Usmerňujúce informácie
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Štruktúrny vzorec
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Elektrická vodivosť na účely konduktometrickej metódy
                              
                           
                        Všeobecné informácie o metóde
                     
                     
                                 —
                              
                              
                                 Všetky testovacie metódy možno vykonať s čistými látkami alebo látkami obchodnej akosti. Mali by sa zvážiť možné účinky nečistôt na výsledky.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Titračná metóda nie je vhodná pre málo rozpustné látky (testované roztoky pozri ďalej).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Spektrofotometrickú metódu možno použiť len na látky, ktorých disociované a nedisociované formy majú značne odlišné absorpčné spektrá v oblasti UV žiarenia/viditeľného svetla (VIS). Táto metóda môže byť vhodná aj pre málo rozpustné látky a látky, ktoré nedisociujú acidobázicky, napr. komplexy.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 V prípadoch, v ktorých platí Onsagerova rovnica, možno použiť konduktometrickú metódu dokonca aj pri stredne nízkych koncentráciách a dokonca aj v prípadoch, keď nejde o acidobazickú rovnováhu.
                              
                           
                        Štandardné dokumenty
                     
                     Táto testovacia metóda je založená na metódach uvedených v odkazoch v oddiele „Literatúra“ a v publikácii Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA, August 18, 1978.
                     METÓDA – ÚVOD, ÚČEL, ROZSAH, RELEVANTNOSŤ, POUŽITIE A OBMEDZENIA TESTU
                     Disociácia látky vo vode je dôležitá pri posudzovaní jej vplyvu na životné prostredie. Riadi formu látky, ktorá zas určuje jej správanie a prenos. Môže ovplyvniť adsorpciu chemikálií na pôdach a sedimentoch a absorpciu do biologických buniek.
                     
                        Definície a jednotky
                     
                     
                        Disociácia je reverzibilné štiepenie na dve alebo viaceré chemické podoby, ktoré môžu byť iónmi. Tento proces sa vo všeobecnosti vyjadruje ako
                     
                        RX ⇌ R
                        ++ X
                        –
                     
                     a konštanta definovaná rovnovážnymi koncentráciami (rovnovážna konštanta), ktorou sa reakcia riadi je
                     
                        
                     Napríklad v konkrétnom prípade, kde R je vodík (látka je kyselina), konštanta je
                     
                        
                     alebo
                     
                        
                     
                        Referenčné látky
                     
                     Tieto referenčné látky sa nemusia použiť vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová látka. Uvádzajú sa predovšetkým preto, aby sa z času na čas mohla vykonať kalibrácia metódy a aby sa umožnilo porovnanie výsledkov, ak sa použije iná metóda.
                     
                                  
                              
                              
                                 pKa
                                     (1)
                                 
                              
                              
                                 Tepl. v °C
                              
                           
                                 p-nitrofenol
                              
                              
                                 7,15
                              
                              
                                 25 (1)
                                 
                              
                           
                                 Kyselina benzoová
                              
                              
                                 4,12
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 p-chlóranilín
                              
                              
                                 3,93
                              
                              
                                 20
                              
                           Bolo by užitočné mať látku s niekoľkými pK, ako sa uvádza v princípe metódy uvedenom ďalej. Takýmito látkami by mohli byť:
                     
                                 Kyselina citrónová
                              
                              
                                 pKa (8)
                              
                              
                                 Tepl. v °C
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1) 3,14
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2) 4,77
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3) 6,39
                              
                              
                                 20
                              
                           
                        Princíp testovacej metódy
                     
                     Chemický proces opísaný vo všeobecnosti len mierne závisí od teploty v teplotnom rozsahu relevantnom pre dané prostredie. Určenie disociačnej konštanty si vyžaduje meranie koncentrácií disociovaných a nedisociovaných foriem chemickej látky. So znalosťou stechiometrie disociačnej reakcie uvedenej v časti Definície a jednotky možno určiť príslušnú konštantu. V tomto konkrétnom prípade opísanom v tejto testovacej metóde sa látky správajú ako kyseliny alebo zásady a ich stanovenie možno najľahšie uskutočniť stanovením relatívnej koncentrácie ionizovanej a neionizovanej formy látky a pH roztoku. Vzťah medzi uvedenými pojmami je daný rovnicou pre pKa v časti Definície a jednotky. Niektoré látky vykazujú viac ako jednu disociačnú konštantu. V takom prípade možno rozvinúť podobné rovnice. Niektoré z metód uvedených v tomto dokumente sú vhodné aj pri iných ako acidobázických disociáciách.
                     
                        Kritériá kvality
                     
                     
                        Opakovateľnosť
                     
                     Disociačná konštanta by sa mala dať zopakovať (pri minimálne troch stanoveniach) s presnosťou na ± 0,1 log jednotiek.
                     OPIS TESTOVACEJ METÓDY
                     K stanoveniu pKa existujú dva základné prístupy. V rámci jedného sa známe množstvo látky titruje podľa potreby kyselinou alebo zásadou, druhý zahŕňa určenie relatívnej koncentrácie ionizovanej a neionizovanej formy látky a jej závislosti od pH.
                     
                        Príprava
                     
                     Metódy založené na uvedených zásadách možno rozdeliť na titráciu, spektrofotometriu a konduktometriu.
                     
                        Testovacie roztoky
                     
                     Pri titračnej a konduktometrickej metóde by sa chemická látka mala rozpustiť v destilovanej vode. Pri spektrofotometrickej alebo inej metóde sa použijú tlmivé roztoky. Koncentrácia testovanej látky by nemala presiahnuť 0,01 M alebo polovicu koncentrácie látky v nasýtenom roztoku, podľa toho, ktorá z uvedených koncentrácií je nižšia, pričom by sa na prípravu roztokov mala použiť najčistejšia dostupná forma látky. Ak je látka len čiastočne rozpustná, možno ju pred prípravou roztokov s uvedenými koncentráciami rozpustiť v malom množstve vodou miešateľného rozpúšťadla.
                     Roztoky by sa mali skontrolovať na prítomnosť emulzií s využitím Tyndallovho javu, najmä ak bol na zvýšenie rozpustnosti použitý kosolvent. Ak sa použijú tlmivé roztoky, ich koncentrácia by nemala presiahnuť 0,05 M.
                     
                        Podmienky testu
                     
                     
                        Teplota
                     
                     Teplota by sa mala udržiavať s presnosťou najmenej ± 1 °C. Stanovenie by sa podľa možnosti malo uskutočniť pri 20 °C.
                     Ak existuje podozrenie, že látka je významne závislá od teploty, stanovenie by sa malo vykonať aspoň pri dvoch ďalších teplotách. V takom prípade by intervaly medzi teplotami mali byť 10 °C a teplota by sa mala udržiavať v rozmedzí ± 0,1 °C.
                     
                        Analýzy
                     
                     Konkrétna analytická metóda sa určí na základe charakteristických vlastností testovanej látky. Musí byť dostatočne citlivá, aby ňou bolo možné stanoviť rôzne druhy chemikálií pri každej koncentrácii testovaného roztoku.
                     
                        Vykonanie testu
                     
                     
                        Titračná metóda
                     
                     Testovaný roztok sa stanovuje titráciou štandardným roztokom kyseliny alebo zásady (podľa vhodnosti), pričom po každom pridaní titračného činidla sa odmeria pH. Pred dosiahnutím bodu ekvivalencie by sa malo pridať aspoň 10 čiastkových množstiev. Ak sa rovnováha dosiahne dostatočne rýchlo, možno použiť potenciometer so zapisovaním. Pri tejto metóde musí byť presne známe celkové množstvo látky a jej koncentrácia. Musia sa prijať preventívne opatrenia na vylúčenie oxidu uhličitého. Podrobnosti postupu, preventívnych opatrení a výpočtu sú uvedené v štandardných testoch, napr. odkazy (1), (2), (3), (4).
                     
                        Spektrofotometrická metóda
                     
                     Zistí sa vlnová dĺžka, pri ktorej má ionizovaná a neionizovaná forma látky výrazne odlišné mólové absorpčné (extinkčné) koeficienty. Absorpčné spektrum UV/VIS sa získa z roztokov konštantnej koncentrácie pri pH, pri ktorom je príslušná látka v podstate neionizovaná, pri ktorom je plne ionizovaná a pri niekoľkých pH nachádzajúcich sa medzi nimi. Dosiahnuť to možno buď pridaním koncentrovanej kyseliny (zásady) k pomerne veľkému objemu roztoku látky vo viaczložkovom tlmivom roztoku, a to spočiatku pri vysokom (nízkom) pH (odkaz 5), alebo pridaním rovnakých objemov zásobného roztoku látky, napr. vo vode, v metanole, do konštantných objemov rôznych tlmivých roztokov pokrývajúcich požadovaný rozsah pH. Z hodnôt pH a absorbancie pri zvolenej vlnovej dĺžke sa vypočíta dostatočný počet hodnôt pKa, pričom sa použije aspoň 5 hodnôt pH, pri ktorých je látka ionizovaná najmenej na 10 percent a zároveň menej ako na 90 percent. Ďalšie podrobnosti experimentu a metóda výpočtu sú uvedené v odkaze (1).
                     
                        Konduktometrická metóda
                     
                     Odmeria sa vodivosť približne 0,1 M elektricky vodivého vodného roztoku látky, pričom sa použije vodivostný článok so známou malou konštantou vodivostného článku. Odmeria sa aj vodivosť niekoľkých presných zriedení daného roztoku. Koncentrácia sa pri každom riedení zníži na polovicu, pričom celá séria by mala pokrývať aspoň koncentrácie v rozmedzí jedného rádu. Medzná (limitná) vodivosť pri nekonečnom riedení sa zistí vykonaním podobného experimentu so sodíkovou soľou a následnou extrapoláciou. Stupeň disociácie možno potom vypočítať z vodivosti každého roztoku pomocou Onsagerovej rovnice, a teda pomocou Ostwaldovho zrieďovacieho zákona možno disociačnú konštantu vypočítať ako K = α2C/(1 – α), kde C je koncentrácia v mol/l a α je (disociačný stupeň) disociovaná frakcia. Musia sa prijať preventívne opatrenia na vylúčenie CO2. Ďalšie podrobnosti experimentu a metóda výpočtu sú uvedené v štandardných textoch a v odkazoch (1), (6) a (7).
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     
                        Titračná metóda
                     
                     Hodnota pKa sa vypočíta z 10 nameraných bodov na titračnej krivke. Vypočíta sa priemer a štandardná odchýlka týchto hodnôt pKa. Spolu s tabuľkou výsledkov by sa mal predložiť aj graf závislosti pH od objemu štandardnej zásady alebo kyseliny.
                     
                        Spektrofotometrické metódy
                     
                     Z hodnôt absorbancie a pH z každého spektra sa zostaví tabuľka. Z medziľahlých údajov spektier sa vypočíta aspoň päť hodnôt pKa a takisto priemer a štandardná odchýlka týchto výsledkov.
                     
                        Konduktometrická metóda
                     
                     Pre každú koncentráciu kyseliny a pre každú koncentráciu zmesi jedného ekvivalentu kyseliny a 0,98 ekvivalentu bezuhličitanového hydroxidu sodného sa vypočíta ekvivalent vodivosti Λ. Kyselina má byť v prebytku, aby sa predišlo prebytku OH– iónov v dôsledku hydrolýzy. Hodnoty 1/Λ sa zobrazia v grafe v závislosti od √C a Λo soli možno zistiť extrapoláciou pri nulovej koncentrácii.
                     Hodnotu Λo kyseliny možno vypočítať z hodnôt pre H+ a Na+ uvádzaných v literatúre. Hodnotu pKa možno vypočítať zo vzorca α = Λi/Λo a Ka = α2C/(1 – α) pre každú koncentráciu. Presnejšie hodnoty Ka možno získať vykonaním korekcií na mobilitu a aktivitu. Mal by sa vypočítať priemer a štandardná odchýlka hodnôt pKa.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Predložiť by sa mali všetky nespracované údaje a vypočítané hodnoty pKa spolu s metódou výpočtu (najlepšie v tabuľkovej forme, napr. podľa návrhu v odkaze 1), ako aj štatistické parametre opísané v predchádzajúcej časti. V prípade titračných metód by sa mali uviesť podrobnosti o štandardizácii štandardných roztokov.
                     V prípade spektrofotometrickej metódy by sa mali uviesť všetky spektrá. V prípade konduktometrickej metódy by sa mali uviesť podrobnosti o stanovení konštanty vodivostného článku. Mali by sa uviesť informácie o použitej technike, analytických metódach a povahe všetkých použitých tlmivých roztokov.
                     Mala by sa uviesť skúšobná teplota(-y).
                     LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (pozri vyššie 4).
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 
                                    Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).“
                              
                           
               
                     2.
                  
                  
                     V časti B sa kapitola B.5 nahrádza takto:
                     „B.5   AKÚTNE PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 405 (2012). Usmernenia OECD na testovanie chemikálií sa pravidelne preskúmavajú, aby sa zabezpečilo, že odzrkadľujú najaktuálnejšie vedecké poznatky. Pri predchádzajúcich preskúmaniach tohto usmernenia na vykonávanie testov sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam na základe vyhodnotenia všetkých existujúcich informácií o testovanej chemikálii, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na pokusných zvieratách a aby sa tým zohľadnili dobré životné podmienky zvierat. Metóda TG 405 (prijatá v roku 1981 a aktualizovaná v rokoch 1987, 2002 a 2012) zahŕňa odporúčanie, podľa ktorého by sa pred uskutočnením opísaného testu akútneho podráždenia/poleptani oka in vivo mala uskutočniť analýza váhy dôkazov (1) na základe existujúcich relevantných údajov. Ak nie sú k dispozícii dostačujúce údaje, podľa odporúčania by sa mali získať na základe postupného testovania (2) (3). Stratégia testovania zahŕňa vykonanie validovaných a uznaných testov in vitro a je uvedená ako doplnok k tejto testovacej metóde. Na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) (2) je do príslušných usmernení ECHA takisto zahrnutá integrovaná stratégia testovania (21). Testovanie na zvieratách by sa malo vykonať len vtedy, ak sa po zvážení dostupných alternatívnych metód stanoví, že je to nevyhnutné a že jeho použitie je v týchto stanovených prípadoch vhodné. V čase prípravy tejto aktualizovanej testovacej metódy existujú prípady, keď je použitie tejto testovacej metódy stále potrebné alebo vyžadované podľa niektorých regulačných rámcov.
                     Najnovšia aktualizácia sa zameriava najmä na použitie analgetík a anestetík bez toho, aby bola ovplyvnená základná koncepcia a štruktúra usmernenia na vykonávanie testov. ICCVAM (3) a nezávislý medzinárodný vedecký panel pre partnerské preskúmanie preskúmali užitočnosť a obmedzenia bežného používania lokálnych anestetík, systémových analgetík a parametrov pre humánne ukončenie postupu v priebehu bezpečnostnej štúdie očnej dráždivosti in vivo (12). V rámci preskúmania sa dospelo k záveru, že využívaním lokálnych anestetík a systémových analgetík by sa dalo zabrániť väčšine bolesti a ťažkostí alebo ich úplne odstrániť bez toho, aby to malo vplyv na výsledky testu, a vyslovilo sa odporúčanie, že takéto látky by sa mali vždy používať. V tejto testovacej metóde sa prihliada na uvedené preskúmanie. V priebehu in vivo testovania akútneho podráždenia a poleptania oka by sa mali bežne používať lokálne anestetiká, systémové analgetiká a parametre pre humánne ukončenie postupu. Výnimky z ich použitia by sa mali odôvodniť. Jemnejšie prístupy uvedené v tejto metóde výrazne zmiernia bolesť a ťažkosti zvierat alebo im zabránia vo väčšine situácií, keď je štúdia bezpečnosti prostredníctvom očného testovania in vivo stále potrebná.
                     Súčasťou vyváženého preventívneho tíšenia bolesti by malo byť i) bežné predbežné ošetrenie lokálnym anestetikom (napr. proparakaínom alebo tetrakaínom) a systémovým analgetikom (napr. buprenorfínom), ii) bežné pravidelné dávkovanie systémových analgetík (napr. buprenorfínu a meloxikamu) po ošetrení, iii) naplánované pozorovanie, monitorovanie a zaznamenávanie klinických príznakov bolesti a/alebo ťažkostí u zvierat a iv) naplánované pozorovanie, monitorovanie a zaznamenávanie charakteru, závažnosti a priebehu všetkých poranení oka. Ďalšie podrobnosti sú uvedené v aktualizovaných postupoch opísaných ďalej. Po podaní testovanej chemikálie by sa nemali podávať žiadne ďalšie lokálne anestetiká ani analgetiká, aby sa zabránilo interferencii so štúdiou. Analgetiká s protizápalovým účinkom (napr. meloxikam) by sa nemali aplikovať lokálne a dávky používané systémovo by nemali interferovať s účinkami na oko.
                     Definície sú uvedené v dodatku k testovacej metóde.
                     ÚVODNÉ ÚVAHY
                     V záujme vedeckej spoľahlivosti, ako aj dobrých životných podmienok zvierat by sa o testovaní in vivo nemalo uvažovať, pokiaľ analýzou váhy dôkazov neboli vyhodnotené všetky dostupné údaje súvisiace s potenciálom chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie oka. Medzi takéto údaje patria dôkazy z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkazy o schopnosti jednej alebo viacerých štrukturálne príbuzných látok alebo zmesí takýchto látok vyvolať poleptanie/podráždenie oka, informácie svedčiace o silnej kyslosti alebo zásaditosti chemikálie (4) (5) a výsledky z validovaných a uznaných testov na poleptanie kože a poleptanie/podráždenie oka in vitro alebo ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Štúdie sa mohli uskutočniť pred analýzou váhy dôkazov alebo ako jej dôsledok.
                     V prípade určitých chemikálií môže takáto analýza poukazovať na potrebu in vivo štúdií potenciálu chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie oka. Vo všetkých takýchto prípadoch by sa pred uvažovaním o použití očného testu in vivo mala pokiaľ možno najskôr uskutočniť štúdia žieravých účinkov chemikálie na kožu in vitro a/alebo in vivo, a potom vyhodnotiť v súlade so stratégiou postupného testovania testovacou metódou B.4 (7) alebo s integrovanou stratégiou testovania uvedenou v usmernení ECHA (21).
                     Stratégia postupného testovania, ktorej súčasťou je vykonanie validovaných testov poleptania/podráždenia oka in vitro alebo ex vivo, je zahrnutá ako doplnok k tejto testovacej metóde, a na účely nariadenia REACH v usmernení ECHA (21). Odporúča sa, aby sa pred vykonaním testovania in vivo uplatnila takáto stratégia testovania. V prípade nových chemikálií sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o schopnosti chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie odporúča stratégia postupného testovania. V prípade existujúcich chemikálií s nedostatkom údajov o schopnosti chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie kože a oka možno uvedenú stratégiu použiť na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišnej stratégie testovania alebo testovacej metódy alebo rozhodnutie nepoužiť stratégiu postupného testovania treba zdôvodniť.
                     PRINCÍP TESTU IN VIVO
                     
                     Po predbežnom ošetrení systémovým analgetikom a indukcii vhodnej lokálnej anestézie sa chemikália, ktorá sa má testovať, aplikuje v jednorazovej dávke do jedného oka pokusného zvieraťa; chemikáliou neovplyvňované oko slúži ako kontrola. Stupeň podráždenia/poleptania oka sa vyhodnotí na základe hodnotenia lézií spojovky, rohovky a dúhovky, a to v špecifických intervaloch. V záujme úplného vyhodnotenia účinkov sa opíšu aj iné účinky na oko a nepriaznivé systémové účinky. Trvanie štúdie by malo byť dostatočné na posúdenie vratnosti alebo nevratnosti účinkov.
                     Zvieratá vykazujúce príznaky závažných ťažkostí a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu alebo lézie, ktoré sú zhodné s parametrami pre humánne ukončenie postupu opísanými v tejto testovacej metóde (pozri bod 26), by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť a daná chemikália by sa mala príslušným spôsobom vyhodnotiť. Kritéria pre rozhodnutie o humánnom usmrtení moribundných a silne trpiacich zvierat sú predmetom usmerňovacieho dokumentu OECD (8).
                     PRÍPRAVA NA TEST IN VIVO
                     
                     
                        Výber druhov
                     
                     Podľa možnosti sa ako laboratórne zviera použije králik – albín a použijú sa zdravé mladé dospelé zvieratá. Použitie iných kmeňov alebo druhov by sa malo zdôvodniť.
                     
                        Príprava zvierat
                     
                     Obe oči každého pokusného zvieraťa predbežne vybratého na testovanie by sa mali vyšetriť počas 24 hodín pred začatím testovania. Zvieratá vykazujúce podráždenie oka, očné poruchy alebo predchádzajúce poranenie rohovky by sa nemali použiť.
                     
                        Podmienky umiestnenia a kŕmenia
                     
                     Zvieratá by sa mali umiestniť jednotlivo. V prípade králikov by teplota experimentálnej miestnosti mala byť 20 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 % a pokiaľ možno, okrem obdobia počas čistenia miestnosti, by nemala prevyšovať 70 %, cieľová relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé so striedaním 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Malo by sa zabrániť nadmernej intenzite svetla. Na kŕmenie možno používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.
                     POSTUP TESTOVANIA
                     
                        Použitie lokálnych anestetík a systémových analgetík
                     
                     Uvádzané postupy sa odporúčajú, aby sa pri štúdii bezpečnosti prostredníctvom očného testovania zabránilo bolesti a ťažkostiam alebo aby sa bolesť a utrpenie minimalizovali. Tieto postupy možno nahradiť alternatívnymi postupmi, o ktorých sa preukázalo, že aspoň tak alebo ešte lepšie bránia bolesti a ťažkostiam alebo poskytujú aspoň takú alebo ešte lepšiu úľavu od bolesti a utrpenia ako tieto postupy.
                     
                                 —
                              
                              
                                 Šesťdesiat minút pred aplikáciou testovanej chemikálie (ATC), sa podkožnou injekciou (SC) podá buprenorfín 0,01 mg/kg s cieľom zabezpečiť terapeutickú úroveň systémovej analgézie. O buprenorfíne a iných podobných opioidových analgetikách podávaných systémovo nie je známe alebo sa o nich nepredpokladá, že by menili reakcie oka (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Päť minút pred ATC sa do každého oka aplikuje jedna alebo dve kvapky lokálneho očného anestetika (napr. 0,5 % proparakaín hydrochlorid alebo 0,5 % tetrakaín hydrochlorid). S cieľom zabrániť možnej interferencii so štúdiou sa odporúča lokálne anestetikum, ktoré neobsahuje konzervačné látky. Oko každého zvieraťa, ktoré nebolo ovplyvňované testovanou chemikáliou, bolo však ošetrené lokálnym anestetikom, slúži ako kontrola. Ak sa o testovanej chemikálii predpokladá, že spôsobuje značnú bolesť a ťažkosti, nemala by sa za normálnych okolností testovať in vivo. Ak sa však vyskytnú pochybnosti alebo je testovanie nevyhnutné, mala by sa zvážiť ďalšia aplikácia lokálneho anestetika v 5-minútových intervaloch pred ATC. Používatelia by mali vedieť, že viacnásobná aplikácia lokálnych anestetík by mohla mať za následok mierny nárast závažnosti lézií vyvolaných chemikáliou a/alebo času potrebného na ich vymiznutie.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Osem hodín po ATC sa podkožne podá buprenorfín 0,01 mg/kg a meloxikam 0,5 mg/kg, aby sa zabezpečila nepretržitá terapeutická úroveň systémovej analgézie. Hoci žiadne údaje nenaznačujú, že by mal meloxikam pri podkožnom podávaní raz denne protizápalové účinky na oči, nemal by sa podávať skôr ako 8 hodín po ATC s cieľom zabrániť akejkoľvek možnej interakcii so štúdiou (12).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Po uvedenom ošetrení po prvých 8 hodinách po ATC by sa mal každých 12 hodín podkožne podávať buprenorfín 0,01 mg/kg a súčasne každých 24 hodín podkožne meloxikam 0,5 mg/kg, až kým nevymiznú očné lézie a všetky klinické príznaky bolesti a ťažkostí. Dostupné sú analgetické prípravky s predĺženým uvoľňovaním, ktorých podávanie by sa mohlo zvážiť na zníženie frekvencie dávkovania analgetika.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Ak preventívna analgézia a lokálna anestézia niemajú dostatočný účinok, bezprostredne po ATC by sa mala poskytnúť „záchranná” analgézia. Ak zviera počas štúdie preukazuje známky bolesti a ťažkostí, okamžite sa mu podkožne podá „záchranná” dávka buprenorfínu 0,03 mg/kg a ak je to potrebné, podanie sa opakuje každých 8 hodín namiesto podkožného podania 0,01 mg/kg každých 12 hodín. Každých 24 hodín by sa mal podkožne podať meloxikam 0,5 mg/kg súčasne so „záchrannou” dávkou buprenorfínu, ale nie skôr ako 8 hodín po ATC.
                              
                           
                        Aplikácia testovanej chemikálie
                     
                     Testovaná chemikália by sa mala umiestniť do spojovkového vaku jedného oka každého zvieraťa po jemnom odtiahnutí spodného viečka od očnej gule. Viečka sa potom jemne pritlačia k sebe asi na jednu sekundu, aby sa zabránilo strate materiálu. Druhé oko, ktoré nebolo ovplyvňované chemikáliou, slúži ako kontrola.
                     
                        Vymývanie
                     
                     Oči testovaných zvierat by sa nemali vymývať aspoň 24 hodín po instilácii testovanej chemikálie, okrem tuhých látok (pozri bod 18) a v prípade okamžitých žieravých alebo dráždivých účinkov. Po 24 hodinách možno oči vypláchnuť, ak sa to považuje za potrebné.
                     Použitie náhradnej skupiny zvierat na vyšetrenie vplyvu vyplachovania sa neodporúča, pokiaľ to nie je vedecky odôvodnené. Ak je náhradná skupina potrebná, mali by sa použiť dva králiky. Podmienky vyplachovania by sa mali starostlivo zdokumentovať, napr. čas vyplachovania, zloženie a teplota vyplachovacieho roztoku, trvanie, objem a rýchlosť aplikácie.
                     
                        Veľkosť dávky
                     
                     1.   Testovanie kvapalín
                     
                     Na testovanie kvapalín sa používa dávka 0,1 ml. Na instiláciu chemikálie priamo do oka by sa nemali použiť tlakové dávkovače aerosólu. Tekutina zo spreja by sa mala nastriekať do nádobky pred instiláciou 0,1 ml do oka.
                     2.   Testovanie tuhých látok
                     
                     Pri testovaní tuhých látok, pást a chemikálií, ktoré sú tvorené z častíc, by použité množstvo malo mať objem 0,1 ml alebo hmotnosť najviac 100 mg. Testovaná chemikália by sa mala pomlieť na jemný prášok. Objem tuhého materiálu by sa mal odmerať po jemnom zhutnení, napr. poklepaním nádobky na meranie. Ak testovaná tuhá chemikália nebola fyziologicky odstránená z oka pokusného zvieraťa pri prvom pozorovaní v časovom bode 1 hodina po ovplyvňovaní, oko možno vypláchnuť fyziologickým roztokom alebo destilovanou vodou.
                     3.   Testovanie aerosólov
                     
                     Odporúča sa, aby sa pred instiláciou do oka všetky chemikálie z tlakových dávkovačov a aerosóly vyprázdnil do nádobky. Jedinou výnimkou sú chemikálie v tlakových aerosólových nádobách, ktoré sa nedajú vystriekať a zozbierať kvôli vyparovaniu. V takýchto prípadoch by sa oko malo držať otvorené a testovaná chemikália by sa mala aplikovať do oka jednorazovým striekaním trvajúcim približne jednu sekundu zo vzdialenosti 10 cm priamo pred okom. Túto vzdialenosť možno meniť v závislosti od tlaku spreja a jeho obsahu. Pozornosť je potrebné venovať tomu, aby sa tlakom zo spreja nepoškodilo oko. Vo vhodných prípadoch môže byť potrebné posúdiť potenciál „mechanického” poškodenia oka tlakom kvapaliny zo spreja.
                     Odhad dávky z aerosólu možno urobiť simulovaním testu takto: Chemikália sa nasprejuje na navažovací papier cez otvor veľkosti oka králika nachádzajúci sa priamo pred papierom. Na základe zvýšenia hmotnosti papiera sa odhadne množstvo nasprejované do oka. V prípade prchavých chemikálií možno dávku odhadnúť tak, že sa nádobka odváži pred odstránením testovanej chemikálie a po ňom.
                     
                        Počiatočný test (test podráždenia/poleptania oka in vivo s použitím jedného zvieraťa)
                     
                     Dôrazne sa odporúča, aby sa test in vivo najprv uskutočnil s použitím jedného zvieraťa (pozri doplnok k tejto testovacej metóde: Stratégia postupného testovania podráždenia a poleptania oka). Pozorovania by mali umožniť stanovenie závažnosti a vratnosti pred tým, ako sa pristúpi k potvrdzujúcemu testu na druhom zvierati.
                     Ak z výsledkov tohto testu vyplynie, že chemikália je po použití uvedeného postupu žieravá alebo silne dráždivá pre oko, ďalšie testovanie očnej dráždivosti by sa nemalo vykonať.
                     
                        Potvrdzujúci test (test podráždenia oka in vivo na ďalších zvieratách)
                     
                     Ak sa v počiatočnom teste nezistí žieravý alebo silne dráždivý účinok, dráždivá alebo negatívna reakcia by sa mala potvrdiť na maximálne dvoch ďalších zvieratách. Ak sa dráždivý účinok zistí v počiatočnom teste, odporúča sa, aby sa potvrdzujúci test uskutočnil postupným spôsobom, naraz len na jednom zvierati, a nie súčasnou expozíciou dvoch ďalších zvierat. Ak sa na druhom zvierati prejavia žieravé alebo silne dráždivé účinky, test sa preruší. Ak sú výsledky z druhého zvieraťa dostatočné na to, aby umožnili stanovenie klasifikácie nebezpečnosti, potom nie je potrebné uskutočniť ďalšie testovanie.
                     
                        Dĺžka pozorovania/Doba pozorovania/Sledované obdobie/Pozorovacie obdobie
                     
                     Dĺžka pozorovania by mala byť dostatočná na úplné vyhodnotenie veľkosti/závažnosti a vratnosti/reverzibility zistených účinkov. Pokus by sa však mal ukončiť vždy, keď zviera vykazuje známky silnej bolesti alebo ťažkostí (8). Na stanovenie vratnosti účinkov by sa zvieratá za normálnych okolností mali pozorovať 21 dní po podaní testovanej chemikálie. Ak sa vratnosť pozoruje pred uplynutím 21 dní, pokus by sa mal v tej chvíli ukončiť.
                     
                        Klinické pozorovania a klasifikácia reakcií oka
                     
                     Oči by sa mali hodnotiť komplexne na prítomnosť alebo neprítomnosť očných lézií jednu hodinu po ATC, po ktorom nasledujú hodnotenia aspoň raz denne. Počas prvých 3 dní by sa zvieratá mali hodnotiť niekoľkokrát denne, aby sa zabezpečilo, že rozhodnutia o ukončení testu sa prijmú včas. Pokusné zvieratá by sa mali počas celého trvania štúdie pravidelne hodnotiť na prítomnosť klinických príznakov bolesti a/alebo ťažkostí (napr. opakované dotýkanie sa oka labkou alebo trenie oka, nadmerné žmurkanie, nadmerné slzenie) (9) (10) (11), a to najmenej dvakrát denne s rozostupom najmenej 6 hodín alebo v prípade potreby aj častejšie. Toto hodnotenie je potrebné, aby i) sa zvieratá náležite posúdili v záujme získania dôkazov o bolesti a ťažkostiach s cieľom prijať kvalifikované rozhodnutia o potrebe zvýšiť dávkovanie analgetík a aby ii) sa zvieratá posúdili v záujme získania dôkazov o stanovených parametroch pre humánne ukončenie postupu s cieľom prijať kvalifikované rozhodnutia o tom, či je vhodné, aby sa zvieratá humánne usmrtili, a zabezpečiť, aby sa takéto rozhodnutia prijímali včas. Farbenie fluoresceínom by sa malo používať pravidelne a v náležitých prípadoch by sa mala použiť biomikroskopia oka (štrbinová lampa a binokulárny stereomikroskop) (napr. pri posudzovaní hĺbky poranenia, ak je prítomná ulcerácia rohovky) ako pomôcky na detekciu a meranie poškodenia oka a s cieľom vyhodnotiť, či sú splnené stanovené kritériá týkajúce sa sledovaných parametrov v súvislosti s humánnym usmrtením. Na referenčné účely a na účely poskytnutia trvalého záznamu rozsahu poškodenia oka možno vyhotoviť digitálne fotografie pozorovaných lézií. Zvieratá by nemali byť podrobené testovaniu dlhšie, ako je potrebné, a mali by sa z neho vyradiť ihneď po získaní definitívnej informácie. Zvieratá vykazujúce silnú bolesť alebo ťažkosti by sa mali bezodkladne humánne usmrtiť a daná chemikália by sa mala príslušným spôsobom vyhodnotiť.
                     Humánne usmrtiť by sa mali zvieratá, ktoré po instilácii vykazujú tieto očné lézie (pozri tabuľku 1 s opisom tried lézií): perforácia rohovky alebo významná ulcerácia rohovky vrátane stafylómu; krv v prednej komore oka; zákal rohovky 4. triedy; neprítomnosť reflexu zreničky na osvit (reakcia zrenice 2. triedy), ktorá pretrváva 72 hodín; ulcerácia spojovky; nekróza spojovky alebo žmurky; alebo odlupovanie. Je to kvôli tomu, že takéto lézie sú zvyčajne nevratné. Okrem toho sa odporúča, aby sa očné lézie uvedené ďalej v texte použili ako parametre pre humánne ukončenie postupu s cieľom ukončiť štúdie pred koncom plánovaného 21-dňového pozorovania. Tieto lézie sa považujú za predpoveď silne dráždivých alebo žieravých poranení a poranení, v prípade ktorých sa do konca 21-dňového pozorovania nepredpokladá úplné zvrátenie poškodenia (úplné zotavenie): veľká hĺbka poranenia (napr. ulcerácia rohovky presahujúca povrchové vrstvy strómy), viac ako 50 % poškodenie limbusu (čo sa prejaví vyblednutím spojovkového tkaniva) a silná infekcia oka (hnisavý výtok). Za potenciálne užitočné kritérium, ktoré môže ovplyvniť klinické rozhodnutie o predčasnom ukončení štúdie, by sa mohla považovať aj kombinácia vaskularizácie povrchu rohovky (t. j. panus), oblasti sfarbenej fluoresceínom, ktorá sa podľa každodenného posudzovania časom nezmenšuje, a/alebo nedostatočnej/neexistujúcej reepitelizácie 5 dní po aplikovaní testovanej chemikálie. Uvedené nálezy však jednotlivo nepostačujú na zdôvodnenie predčasného ukončenia štúdie. Po zistení závažných účinkov na oko by sa klinické vyšetrenie malo konzultovať s ošetrujúcim veterinárnym lekárom, veterinárnym lekárom laboratórnych zvierat alebo kvalifikovaným personálom vyškoleným na identifikáciu klinických lézií s cieľom stanoviť, či si kombinácia uvedených účinkov vyžaduje predčasné ukončenie štúdie. Triedy reakcie oka (spojovky, rohovky a dúhovky) by sa mali zisťovať a zaznamenávať po 1 hodine po aplikácii testovanej chemikálie a následne po 24, 48 a 72 hodinách (tabuľka 1). Zvieratá, u ktorých sa nevytvoria žiadne lézie oka, možno usmrtiť najskôr 3 dni po instilácii. Zvieratá s léziami oka, ktoré nemajú závažný charakter, by sa mali pozorovať do ich vymiznutia alebo 21 dní, kedy štúdia ukončí. S cieľom stanoviť stav lézií a ich vratnosť alebo nevratnosť by sa mali uskutočniť a zaznamenať pozorovania aspoň v týchto časových intervaloch: po 1 hodine, 24 hodinách, 48 hodinách, 72 hodinách, 7 dňoch, 14 dňoch a 21 dňoch. Pozorovanie by sa malo vykonávať častejšie, ak je to potrebné na zistenie toho, či by sa testované zviera malo z humánnych dôvodov usmrtiť alebo by sa malo z dôvodu negatívnych výsledkov zo štúdie vylúčiť.
                     Pri každom vyšetrení by sa mali zaznamenať triedy lézií oka (tabuľka 1). Zaznamenať by sa mali aj všetky ďalšie lézie oka (napr. panus, sfarbenie, zmeny prednej komory oka) alebo nepriaznivé systémové účinky.
                     Vyšetrenie reakcií možno uľahčiť použitím binokulárnej lupy, ručnej štrbinovej lampy, biomikroskopu alebo iného vhodného prístroja. Po zaznamenaní pozorovaní po 24 hodinách možno oči ďalej vyšetriť fluoresceínom.
                     Klasifikácia reakcií oka je nevyhnutne subjektívna. Na podporu harmonizácie pri klasifikácii reakcií oka a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní pozorovaní, musí byť personál, ktorý pozorovania uskutočňuje, adekvátne vyškolený na používanie zavedeného systému hodnotenia.
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Vyhodnotenie výsledkov
                     
                     Triedy očnej dráždivosti by sa mali vyhodnocovať v súvislosti s charakterom a závažnosťou lézií a ich vratnosťou alebo nevratnosťou. Jednotlivé stupne nepredstavujú absolútne meradlo dráždivých vlastností chemikálie, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovanej chemikálie. Skôr by sa na jednotlivé stupne malo nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré majú zmysel iba vtedy, ak sú doložené úplným opisom a vyhodnotením všetkých pozorovaní.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zdôvodnenie testovania in vivo: analýza váhy dôkazov na základe údajov z predchádzajúcich testov vrátane výsledkov stratégie postupného testovania:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             opis relevantných údajov dostupných z predchádzajúceho testovania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje získané v každom štádiu stratégie testovania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis uskutočnených testov in vitro vrátane podrobností o postupoch, výsledkoch získaných s testovanými/referenčnými chemikáliami,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis uskutočnenej štúdie kožnej dráždivosti/žieravosti in vivo vrátane získaných výsledkov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analýza váhy dôkazov pre uskutočnenie štúdie in vivo.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikačné údaje (napr. systematický názov, a CAS číslo, ak je k dispozícii, čistota, známe nečistoty, zdroj, číslo šarže),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzikálny charakter a fyzikálno-chemické vlastnosti (napr. pH, prchavosť, rozpustnosť, stabilita, reaktivita s vodou),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade zmesi by sa mali identifikovať komponenty vrátane identifikačných údajov zložiek (napr. chemické názvy a CAS čísla, ak sú k dispozícii) a ich koncentrácie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             aplikovaná dávka.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nosič:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikácia, koncentrácia (ak je to vhodné), použitý objem,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie výberu nosiča.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované zvieratá:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý druh/kmeň, zdôvodnenie použitia iných zvierat ako králika – albína,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vek každého zvieraťa na začiatku štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet zvierat každého pohlavia v testovaných a kontrolných skupinách (v prípade potreby),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku a na konci testu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Anestetiká a analgetiká:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             dávky a časy podania lokálnych anestetík a systémových analgetík,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ak sa použije lokálne anestetikum, identifikácia, čistota, typ a prípadná interakcia s testovanou látkou.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             opis metódy použitej na hodnotenie podráždenia v každom čase pozorovania (napr. ručná štrbinová lampa, biomikroskop, fluoresceín),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabuľkové spracovanie údajov o dráždivých/žieravých účinkoch na každé zviera v každom čase pozorovania až do vylúčenia každého zvieraťa z testu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             slovný opis stupňa a povahy zisteného podráždenia alebo poleptania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis všetkých ďalších pozorovaných lézií oka (napr. vaskularizácia, vytvorenie panusu, zrastov, sfarbenie),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis lokálnych a systémových nežiaducich účinkov na iné časti tela ako na oči, záznam klinických príznakov bolesti a utrpenia, digitálne fotografie a prípadné histopatologické pozorovania.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky a diskusia
                                 
                              
                           
                        Interpretácia výsledkov
                     
                     Extrapolácia výsledkov štúdií očnej dráždivosti u laboratórnych zvierat na ľudí platí len v obmedzenej miere. V mnohých prípadoch je králik – albín citlivejší na látky, ktoré spôsobujú podráždenie alebo poleptanie oka, ako ľudia.
                     Malo by sa dbať na to, aby sa pri interpretácii údajov vylúčilo podráždenie spôsobené sekundárnou infekciou.
                     LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410 – 429.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159 – 164.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483 – 524.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Kapitola B.4 tejto prílohy, akútna toxicita: podráždenie/poleptanie kože.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.
                                 http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Kapitola B.40 tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou transkutánneho elektrického odporu (TER).
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Kapitola B.40a tejto prílohy, Poleptanie kože in vitro: test pomocou modelu ľudskej kože.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Kapitola B.47 tejto prílohy, Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Kapitola B.48 tejto prílohy, Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 ES (2008), nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 ECHA, Usmernenie k požiadavkám na informácie a k hodnoteniu chemickej bezpečnosti, kapitola R.7a: Usmernenia ku konkrétnemu sledovanému parametru.
                                 http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
                              
                           
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Klasifikácia očných lézií
                     
                     
                                 Rohovka
                              
                              
                                 Trieda
                              
                           
                                 Zákal: stupeň optickej hustoty (odčítavať by sa mal v najhustejšej oblasti) (*1)
                                 
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Žiadna ulcerácia ani zákal
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Roztrúsené alebo difúzne zakalené oblasti (iné ako ľahká stratanormálneho lesku); zreteľne viditeľné detaily dúhovky
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Ľahko rozoznateľná priesvitná oblasť; detaily dúhovky mierne nejasné
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Perleťová oblasť; detaily dúhovky nie sú viditeľné veľkosť zreničky ťažko rozoznateľná
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Zakalená rohovka; dúhovka nie je rozoznateľná cez zákal
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Maximálne možný: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Dúhovka
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normálna
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Výrazné zvráskavenie, prekrvenie, opuch, mierna cirkumkorneálna hyperémia alebo nastrieknutie ciev; dúhovka reaguje na svetlo (pomalá reakcia sa pokladá za účinok)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Krvácanie, výrazné poškodenie, alebo bez reakcie na svetlo
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Maximálne možný: 2
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Spojovky
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Sčervenanie (týka sa spojovky mihalnice a spojovky očnej gule; bez rohovky a dúhovky)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normálne
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Niektoré cievy prekrvené (injektované)
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Difúzne, karmínovočervené sfarbenie, jednotlivé cievy nie sú ľahko rozoznateľné
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Difúzne krvavočervené
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Maximálne možný: 3
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Chemóza
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Opuch (týka sa viečok a/alebo žmurky)
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 Normálna
                              
                              
                                 0
                              
                           
                                 Trochu opuchnuté nad normálom
                              
                              
                                 1
                              
                           
                                 Zreteľný opuch s čiastočným vyvrátením viečok
                              
                              
                                 2
                              
                           
                                 Opuch s približne polovičným uzavretím viečok
                              
                              
                                 3
                              
                           
                                 Opuch s viac ako polovičným uzavretím viečok
                              
                              
                                 4
                              
                           
                                 Maximálne možný: 4
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Dodatok
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Tlmivá kapacita
                           : v prípade kyslých prípravkov ide o množstvo (v g) hydroxidu sodného/100 g prípravku potrebné na dosiahnutie určitého pH. V prípade zásaditých prípravkov ide o množstvo (v g) hydroxidu sodného ekvivalentného množstvu (v g) kyseliny sírovej/100 g prípravku potrebné na dosiahnutie určitého pH (Young et al, 1988).
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Nedráždivé chemikálie
                           : látky, ktoré nie sú podľa EPA klasifikované ako očné dráždivé látky kategórie I, II alebo III; alebo podľa GHS ako očné dráždivé látky kategórie 1, 2, 2A alebo 2B; alebo podľa EÚ ako látky kategórie 1 alebo 2 (17) (18) (19).
                        
                           
                              Očná žieravina
                           : a) chemikália, ktorá spôsobuje nevratné poškodenie tkaniva oka; b) chemikálie, ktoré sú podľa GHS klasifikované ako očné dráždivé látky kategórie 1, alebo podľa EPA ako očné dráždivé látky kategórie I, alebo podľa EÚ ako látky kategórie 1 (17) (18) (19).
                        
                           
                              Očná dráždivá látka
                           : a) chemikália, ktorá spôsobuje vratné zmenu v oku; b) chemikálie, ktoré sú podľa EPA klasifikované ako očné dráždivé látky kategórie II alebo III; alebo podľa GHS ako očné dráždivé látky kategórie 2, 2A alebo 2B; alebo podľa EÚ ako látky kategórie 2 (17) (18) (19).
                        
                           
                              Očná silne dráždivá chemikália
                           : a) chemikália, ktorá spôsobuje poškodenia tkaniva oka, ktoré nevymizne do 21 dní po aplikácii alebo spôsobí veľmi výrazné zhoršenie zraku; b) chemikálie, ktoré sú podľa GHS klasifikované ako očná dráždivá látka kategórie 1, alebo podľa EPA ako očné dráždivé látky kategórie I, alebo podľa EÚ ako látky kategórie 1 (17) (18) (19).
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje touto testovacou metódou.
                        
                           
                              Viacstupňový prístup
                           : stratégia postupného testovania, pri ktorej sa v presne určenom poradí na každom stupni preskúmavajú všetky existujúce informácie o testovanej chemikálii postupmi analýzy váhy dôkazov s cieľom určiť, či sú k dispozícii dostatočné informácie na to, aby sa mohlo prijať rozhodnutie o klasifikácii nebezpečnosti pred tým, ako sa postúpi na ďalší stupeň. Ak testovanej chemikálii možno na základe existujúcich informácií pripísať potenciál vyvolať podráždenie, nevyžaduje sa ďalšie testovanie. Ak testovanej chemikálii nemožno na základe existujúcich informácií pripísať potenciál vyvolať podráždenie, použije sa prístup postupného testovania na zvieratách v jednotlivých stupňoch, až kým ju nebude možné jednoznačne klasifikovať.
                        
                           
                              Analýza váhy dôkazov (postup)
                           : Ako základ pre vyvodenie záveru, ktorý z jednotlivých údajov nemusí byť zrejmý, sa použijú silné a slabé stránky vyplývajúce zo zozbieraných informácií.
                     
                     
                        DOPLNOK K TESTOVACEJ METÓDE B.5
                         (4)
                     
                     STRATÉGIA POSTUPNÉHO TESTOVANIA PODRÁŽDENIA A POLEPTANIA OKA
                     
                        Všeobecné úvahy
                     
                     Je dôležité, aby sa v záujme vedeckej spoľahlivosti a dobrých životných podmienok zvierat zabránilo používaniu zvierat v prípade, že to nie je nevyhnutné, a aby sa minimalizovalo testovanie, ktoré u zvierat potenciálne spôsobuje závažné reakcie. Pred zvažovaním použitia testovania in vivo by sa mali posúdiť všetky informácie o chemikálii, ktoré sú relevantné z hľadiska jej potenciálu spôsobiť podráždenie/poleptanie oka. Na účely klasifikácie testovanej látky v súvislosti s jej potenciálom spôsobiť podráždenie alebo poleptanie oka už môžu existovať dostatočné dôkazy, a teda testovanie na laboratórnych zvieratách nemusí byť potrebné. Použitie analýzy váhy dôkazov a stratégie postupného testovania preto minimalizuje potrebu testovania in vivo, najmä ak by chemikália pravdepodobne spôsobila silné reakcie.
                     Odporúča sa, aby sa na posúdenie existujúcich informácií o chemikáliách, ktoré sa týkajú podráždenia a poleptania oka, a na stanovenie potreby vykonať okrem štúdie oka in vivo aj ďalšie štúdie, použila analýza váhy dôkazov, ktorá by pomohla charakterizovať tento potenciál. Ak sú potrebné ďalšie štúdie, odporúča sa, aby sa na získanie príslušných experimentálnych údajov použila stratégia postupného testovania. V prípade látok, ktoré sa ešte netestovali, by sa na získanie údajov potrebných na vyhodnotenie ich potenciálu spôsobiť poleptanie/podráždenie oka, mala použiť stratégia postupného testovania. Stratégia prvotného testovania opísaná v tomto doplnku bola vypracovaná na seminári OECD (1). Následne bola potvrdená a rozšírená v publikácii Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances (Harmonizovaný integrovaný systém klasifikácie nebezpečnosti chemických látok pre ľudské zdravie a ich účinku na životné prostredie), podporená na 28. spoločnom zasadnutí Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie v novembri 1998 (2) a aktualizovaná skupinou expertov OECD v roku 2011.
                     Hoci táto stratégia testovania nie je integrálnou súčasťou testovacej metódy B.5, vyjadruje odporúčaný prístup pre určovanie vlastností spočívajúcich v podráždení/poleptaní oka. Tento prístup predstavuje osvedčený postup, ako aj etické kritérium pre testovanie očnej dráždivosti/žieravosti in vivo. Táto testovacia metóda poskytuje usmernenie na vykonanie testu in vivo a sumarizuje faktory, ktoré treba preskúmať pred zvažovaním takéhoto testu. Súčasťou stratégie postupného testovania je prístup založený na analýze váhy dôkazov slúžiaci na vyhodnocovanie existujúcich údajov o schopnosti chemikálií podráždiť/poleptať oko a viacstupňový prístup na účely vytvorenia relevantných údajov o chemikáliách, v prípade ktorých sú potrebné ďalšie štúdie, alebo sa ešte žiadne neuskutočnili. Stratégia zahŕňa najprv vykonanie validovaných a uznaných testov in vitro alebo ex vivo a potom štúdií s testovacou metódou B.4 za špecifických okolností (3)(4).
                     
                        Opis stratégie postupného testovania
                     
                     Pred vykonaním testov ako súčasti stratégie postupného testovania (obrázok) by sa mali vyhodnotiť všetky dostupné informácie na určenie potreby očného testovania in vivo. Hoci by z hodnotenia jednotlivých parametrov (napr. extrémna hodnota pH) bolo možné získať významné informácie, mal by sa posúdiť súhrn existujúcich informácií. Pri rozhodovaní na základe analýzy váhy dôkazov by sa mali vyhodnocovať všetky relevantné údaje o účinkoch príslušnej chemikálie a jej štruktúrnych analógov a toto rozhodnutie by sa malo odôvodniť. Prednostne by sa bolo treba zamerať na existujúce údaje o účinkoch chemikálie na ľudí a zvieratá, za ktorými by mali nasledovať výsledky z testovania in vitro alebo ex vivo. Štúdie žieravých chemikálií by sa podľa možnosti nemali uskutočňovať in vivo. Faktory zvažované v stratégii testovania zahŕňajú:
                     
                                  
                              
                              
                                 Vyhodnotenie existujúcich údajov o účinkoch chemikálie na ľudí a/alebo zvieratá a/alebo údajov z validovaných a medzinárodne akceptovaných metód testovania in vitro (krok 1).
                                 Existujúce údaje o účinkoch na ľudí, napr. klinické štúdie alebo štúdie expozície na pracovisku a prípadové správy a/alebo údaje z testovania zvierat zo štúdií účinkov na oči a/alebo údaje z validovaných a medzinárodne akceptovaných metód in vitro testovania očnej dráždivosti/žieravosti by sa mali posúdiť ako prvé, pretože poskytujú informácie priamo súvisiace s účinkami na oči. Potom by sa mali vyhodnotiť dostupné údaje zo štúdií na ľuďoch a/alebo zvieratách, pri ktorých sa vyšetrovala kožná dráždivosť/žieravosť, a/alebo zo štúdií in vitro na základe validovaných a medzinárodne akceptovaných metód týkajúcich sa poleptania kože. Do očí zvierat by sa nemali aplikovať chemikálie so známou očnou žieravosťou alebo silnou očnou dráždivosťou a obdobne by sa nemali aplikovať ani chemikálie vykazujúce žieravé alebo silne dráždivé účinky na kožu, takéto chemikálie by sa totiž mali považovať za žieravé a/alebo dráždivé aj na oči. Látky s dostatočnými dôkazmi o nežieravých a nedráždivých účinkoch z prechádzajúcich štúdií uskutočnených na očiach by sa takisto nemali testovať na očiach v štúdiách in vivo.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Analýza vzťahu štruktúry a účinku (SAR) (krok 2).
                                 Ak sú k dispozícii výsledky testovania štruktúrne príbuzných chemikálií, mali by sa posúdiť. Ak je k dispozícii dostatok údajov o účinkoch štruktúrne príbuzných látok alebo zmesí takýchto látok na ľudí a/alebo zvieratá, z ktorých vyplýva ich potenciál spôsobiť poleptanie/podráždenie očí, dá sa predpokladať, že testovaná chemikália vyvolá rovnaké reakcie. V týchto prípadoch sa chemikália nemusí testovať. Negatívne údaje zo štúdií štruktúrne príbuzných látok alebo zmesí takýchto látok neposkytujú dostatočný dôkaz o nežieravých/nedráždivých účinkoch chemikálie v kontexte stratégie postupného testovania. Na identifikáciu potenciálu chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie kože, ako aj očí by sa mali použiť validované a uznané prístupy SAR.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Fyzikálno-chemické vlastnosti a chemická reaktivita (krok 3).
                                 Chemikálie vykazujúce extrémne hodnoty pH ako ≤ 2,0 a ≥ 11,5 môžu mať silné lokálne účinky. Ak je extrémna hodnota pH základom pre identifikáciu chemikálie ako žieravej alebo dráždivej pre oko, potom možno takisto zohľadniť jej tlmivú (pufračnú) kapacitu (5)(6)(7). Ak z tlmivej kapacity vyplýva, že látka nemusí byť žieravá pre oko (t. j. chemikálie s extrémnymi hodnotami pH a nízkou tlmivou kapacitou), potom by sa malo uskutočniť ďalšie testovanie na potvrdenie tejto domnienky, pričom sa prednostne použije validovaný a uznaný test in vitro alebo ex vivo (pozri bod 10).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Posúdenie ďalších existujúcich informácií (krok 4).
                                 Na tomto stupni by sa mali posúdiť všetky dostupné informácie o systémovej toxicite transdermálnou cestou. Mala by sa takisto zohľadniť akútna dermálna toxicita testovanej chemikálie. Ak sa testovaná chemikália prejavila ako vysokotoxická transdermálnou cestou, nemusí sa testovať na oku. Aj keď bezpodmienečne neexistuje vzťah medzi akútnou dermálnou toxicitou a očnou dráždivosťou/žieravosťou, možno predpokladať, že ak je látka vysokotoxická transdermálnou cestou, bude vykazovať vysokú toxicitu aj pri aplikácii do oka. Takéto údaje možno takisto zohľadniť medzi krokmi 2 a 3.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Posúdenie potenciálu chemikálie poleptať kožu, ak je to potrebné aj na regulačné účely (krok 5).
                                 Najprv by sa mal vyhodnotiť potenciál chemikálie poleptať a silne podráždiť kožu v súlade s testovacou metódou B.4 (4) a sprievodným doplnkom (8) vrátane použitia validovaných a medzinárodne akceptovaných testovacích metód na poleptanie kože in vitro (9) (10) (11). Ak je o chemikálii známe, že spôsobuje poleptanie alebo silné podráždenie kože, možno ju takisto považovať za chemikáliu žieravú alebo silne dráždivú pre oko. Preto by sa ďalšie testovanie nemalo vyžadovať. Ak chemikália nie je žieravá alebo silne dráždivá pre kožu, mal by sa vykonať očný test in vitro alebo ex vivo.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Výsledky testov in vitro alebo ex vivo (krok 6).
                                 Chemikálie, ktoré preukázali žieravé alebo silne dráždivé vlastnosti v testoch in vitro alebo ex vivo (12) (13), ktoré boli validované a medzinárodne uznané na špecifické posúdenie očnej žieravosti/dráždivosti, nemusia byť testované na zvieratách. Možno predpokladať, že takéto látky vyvolajú podobné závažné účinky in vivo. Ak validované a uznané testy in vitro/ex vivo nie sú k dispozícii, vynechá sa krok 6 a pristúpi sa priamo ku kroku 7.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 Test in vivo na králikoch (kroky 7 a 8):
                                 Očné testovanie in vivo by sa malo začať počiatočným testom na jednom zvierati. Ak výsledky tohto testu preukážu, že chemikália je silne dráždivá alebo žieravá pre oči, ďalšie testovanie by sa nemalo vykonať. Ak sa uvedeným testom nepreukážu žiadne žieravé alebo silne dráždivé účinky, uskutoční sa potvrdzujúci test na dvoch ďalších zvieratách. V závislosti od výsledkov potvrdzujúceho testu môžu byť potrebné ďalšie testy. [pozri testovaciu metódu B.5]
                              
                           
                        STRATÉGIA TESTOVANIA A HODNOTENIA OČNEJ DRÁŽDIVOSTI/ŽIERAVOSTI
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Činnosť
                                 
                              
                              
                                 
                                    Zistenie
                                 
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           
                                 
                                    1
                                 
                              
                              
                                 Existujúce údaje o účinkoch chemikálie na oči ľudí a/alebo zvierat a/alebo údaje o uvedených účinkoch z validovaných a medzinárodne akceptovaných metód in vitro
                                 
                              
                              
                                 Závažné poškodenie očí
                              
                              
                                 Koncový sledovaný parameter: považuje sa za žieravú pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 Dráždivá pre oči
                              
                              
                                 Koncový sledovaný parameter: považuje sa za dráždivú pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 Nežieravá/nedráždivá pre oči
                              
                              
                                 Koncový sledovaný parameter: považuje sa za nežieravú a nedráždivú pre oči. Nevyžaduje sa ďalšie testovanie.
                              
                           
                                 Existujúce údaje o žieravých účinkoch chemikálie na kožu ľudí a/alebo zvierat a/alebo údaje o uvedených účinkoch z validovaných a medzinárodne akceptovaných metód in vitro
                                 
                              
                              
                                 Žieravá pre kožu
                              
                              
                                 Predpoklad žieravosti pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 Existujúce údaje o silne dráždivých účinkoch chemikálie na kožu ľudí a/alebo zvierat a/alebo údaje o uvedených účinkoch z validovaných a medzinárodne akceptovaných metód in vitro
                                 
                              
                              
                                 Silne dráždivá pre kožu
                              
                              
                                 Predpoklad dráždivosti pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Nie sú dostupné žiadne informácie, alebo dostupné informácie nie sú presvedčivé
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2
                                 
                              
                              
                                 Vykonajte analýzu SAR na posúdenie potenciálu poleptať/podráždiť oči
                              
                              
                                 Predpoklad vážneho poškodenia očí
                              
                              
                                 Predpoklad žieravosti pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 Predpoklad podráždenia očí
                              
                              
                                 Predpoklad dráždivosti pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 Zvážte vykonanie analýzy SAR na posúdenie potenciálu poleptať kožu
                              
                              
                                 Predpoklad poleptania kože
                              
                              
                                 Predpoklad žieravosti pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Nemožno urobiť žiadne predpoklady, alebo predpoklady nie sú presvedčivé alebo sú negatívne
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    3
                                 
                              
                              
                                 Zmerajte pH (tlmivú kapacitu, ak je to relevantné)
                              
                              
                                 pH ≤ 2 alebo ≥ 11,5 (s vysokou tlmivou kapacitou, ak je to relevantné)
                              
                              
                                 Predpoklad žieravosti pre oči. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    2< pH < 11,5, alebo pH ≤ 2,0 alebo ≥ 11,5 s nízkou/žiadnou tlmivou kapacitou, ak je to relevantné
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    4
                                 
                              
                              
                                 Posúďte existujúce údaje o systémovej toxicite transdermálnou cestou
                              
                              
                                 Vysokotoxická pri koncentráciách, ktoré by sa testovali na oku.
                              
                              
                                 Chemikália by bola príliš toxická na testovanie. Nie je potrebné testovanie.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Takáto informácia nie je dostupná alebo chemikália nie je vysokotoxická
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    5
                                 
                              
                              
                                 Experimentálne posúďte potenciál poleptať kožu v súlade so stratégiou testovania v kapitole B.4 tejto prílohy, ak je to potrebné aj na regulačné účely.
                              
                              
                                 Reakcia vo forme poleptania alebo silného podráždenia
                              
                              
                                 Predpoklad žieravosti pre oči. Nie je potrebné ďalšie testovanie.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Chemikália nie je žieravá ani silne dráždivá pre kožu
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    6
                                 
                              
                              
                                 Vykonajte validovaný a uznaný očný test(-y) in vitro alebo ex vivo
                                 
                              
                              
                                 Žieravá alebo silne dráždivá reakcia
                              
                              
                                 Predpoklad žieravosti alebo silnej dráždivosti pre oči, pod podmienkou, že vykonaný test možno použiť na určenie žieravých/silne dráždivých chemikálií, pričom predmetná chemikália patrí do oblasti uplatniteľnosti daného testu. Nie je potrebné ďalšie testovanie.
                              
                           
                                 Dráždivá reakcia
                              
                              
                                 Predpoklad dráždivosti pre oči, pod podmienkou, že vykonaný test, resp. testy možno použiť na správne určenie žieravých, silne dráždivých a dráždivých chemikálií, pričom predmetná chemikália patrí do oblasti uplatniteľnosti daného testu, resp. testov. Nie je potrebné ďalšie testovanie.
                              
                           
                                 Bez dráždivej reakcie
                              
                              
                                 Predpoklad nedráždivosti pre oči, pod podmienkou, že vykonaný test, resp. testy možno použiť na správnu identifikáciu nedráždivých chemikálií, na správne rozlišovanie týchto chemikálií od chemikálií, ktoré sú pre oči dráždivými, silne dráždivými alebo žieravými, pričom predmetná chemikália patrí do oblasti uplatniteľnosti daného testu. Nie je potrebné ďalšie testovanie.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Validovaný a uznaný očný test, resp. testy in vitro alebo ex vivo nemožno použiť na vyvodenie záveru
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    7
                                 
                              
                              
                                 Vykonajte počiatočný test in vivo na oku králika s použitím jedného zvieraťa.
                              
                              
                                 Závažné poškodenie očí
                              
                              
                                 Považuje sa za žieravú pre oči. Nie je potrebné ďalšie testovanie.
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    Žiadne závažné poškodenie alebo žiadna reakcia
                                 
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 ↓
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                                 
                                    8
                                 
                              
                              
                                 Vykonajte potvrdzujúcu skúšku s jedným alebo dvomi ďalšími zvieratami.
                              
                              
                                 Žieravá alebo dráždivá
                              
                              
                                 Považuje sa za žieravú alebo dráždivú pre oči. Nie je potrebné ďalšie testovanie.
                              
                           
                                 Nežieravá ani nedráždivá
                              
                              
                                 Považuje sa za nedráždivú a nežieravú pre oči. Nie je potrebné ďalšie testovanie.
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Chapter B.4 of this Annex, Acute Dermal Irritation/Corrosion.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483 – 524.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Supplement to Chapter B.4 of this Annex, A Sequential Testing Strategy for Skin Irritation and Corrosion.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Chapter B.40 of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER).
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Chapter B.40bis of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Kapitola B.47 tejto prílohy, Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na identifikáciu i) chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí a ii) chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Kapitola B.48 tejto prílohy, Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka na identifikáciu i) chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí a ii) chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí“
                              
                           
               
                     3.
                  
                  
                     V časti B sa kapitola B.10 nahrádza takto:
                     „B.10   Test in vitro na chromozómové aberácie u cicavcov
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 473 (2016). Je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. V tejto súvislosti bol vypracovaný aj dokument OECD, ktorý poskytuje stručné informácie o vykonávaní testov v oblasti genetickej toxikológie a prehľad o súčasných zmenách, ktorými tieto usmernenia na vykonávanie testov prešli (1).
                     Účelom testu na chromozómové aberácie in vitro je identifikovať chemikálie, ktoré spôsobujú štruktúrne chromozómové aberácie v bunkových kultúrach cicavcov (2) (3) (4). Štruktúrne chromozómové aberácie sa vyskytujú v dvoch typoch, chromozómové alebo chromatidové. V in vitro testoch na chromozómové aberácie môže vzniknúť polyploidia (vrátane endoreduplikácie). Zatiaľ čo aneugény môžu vyvolať vznik polyploidie, samotná polyploidia nenaznačuje aneugénny potenciál a môže jednoducho znamenať narušenie bunkového cyklu alebo cytotoxicitu (5). Tento test nie je určený na meranie aneuploidie. Na zistenie aneuploidie by sa mohol doporučiť in vitro mikronukleový test (6).
                     V in vitro teste na chromozómové aberácie možno používať kultúry zavedených (permanentných) bunkových línií alebo primárne bunkové kultúry ľudského alebo hlodavčieho pôvodu. Použité bunky by sa mali vyberať na základe schopnosti rastu v kultúre, stability karyotypu (vrátane počtu chromozómov), ako aj frekvencie spontánnych chromozómových aberácií (7). Na základe v súčasnosti dostupných údajov nemožno vysloviť jednoznačné odporúčania, vyplýva z nich však to, že pri hodnotení nebezpečnosti chemikálií je dôležité zvážiť stav p53, genetickú stabilitu (stabilitu karyotypu), kapacitu na opravu DNA a pôvod (hlodavčí alebo ľudský) buniek vybratých pre testovanie. Keďže poznatky v tejto oblasti sa vyvíjajú, používateľom tejto testovacej metódy sa odporúča, aby zvážili vplyv týchto a iných charakteristík buniek na výkonnosť bunkovej línie pri detekcii indukcie chromozómových aberácií.
                     Použité definície sú uvedené v dodatku 1.
                     POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                     Testy, ktoré sa vykonávajú in vitro, si zvyčajne vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie okrem prípadov, keď majú bunky metabolickú kapacitu s ohľadom na testované chemikálie. Exogénny systém metabolickej aktivácie nenapodobňuje v plnej miere podmienky in vivo. Bolo by sa treba vyhnúť podmienkam, ktoré by mohli viesť k falošne pozitívnym výsledkom, t. j. poškodeniam chromozómov nespôsobeným priamou interakciou medzi testovanými chemikáliami a chromozómami. Takéto podmienky zahŕňajú zmeny pH alebo osmolality (8) (9) (10), interakciu so zložkami média (11) (12) alebo nadmerné úrovne cytotoxicity (13) (14) (15) (16).
                     Tento test sa používa na detekciu chromozómových aberácií, ktoré môžu byť výsledkom klastogénnych udalostí. Analýza indukcie chromozómových aberácií by sa mala vykonať na bunkách v metafáze. Je preto nevyhnutné, aby bunky dosiahli mitózu v ovplyvňovaných aj v neovplyvňovaných kultúrach. V prípade vyrobených nanomateriálov môže byť potrebné túto testovaciu metódu osobitne upraviť, tieto úpravy však nie sú opísané v tejto testovacej metóde.
                     Pred použitím testovacej metódy v prípade zmesi s cieľom generovať údaje pre stanovený regulačný účel by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tento účel, a ak áno, malo by sa to zdôvodniť. Takéto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.
                     PRINCÍP TESTU
                     Bunkové kultúry ľudského pôvodu alebo pochádzajúce z iných cicavcov sú vystavené testovanej chemikálii spolu s exogénnym zdrojom metabolickej aktivácie aj bez neho, pokiaľ nie sú použité bunky so zodpovedajúcou schopnosťou metabolizácie (pozri bod 13). Vo vhodných vopred určených intervaloch po začatí expozície bunkových kultúr testovanej chemikálii sa tieto bunkové kultúry ošetria chemikáliou zastavujúcou bunkové delenie v metafáze (napr kolcemidom alebo kolchicínom), odoberú sa, zafarbia sa a bunky v metafáze sa mikroskopicky analyzujú na prítomnosť aberácií chromatidového a chromozómového typu.
                     OPIS METÓDY
                     
                        Príprava
                     
                     
                        Bunky
                     
                     Použiť možno rôzne bunkové línie [napr. bunky vaječníkov škrečka čínskeho (CHO), pľúcne bunky škrečka čínskeho V79, pľúcne bunky škrečka čínskeho (CHL)/IU, TK6] alebo primárne bunkové kultúry vrátane periférnych lymfocytov ľudí alebo iných cicavcov (7). Výber použitých bunkových línií by sa mal vedecky odôvodniť. Ak sa použijú primárne bunky, z dôvodu dobrých životných podmienok zvierat by sa malo podľa možnosti zvážiť použitie primárnych buniek ľudského pôvodu, pričom by sa mal odber vzoriek uskutočniť v súlade s etickými zásadami a právnymi predpismi. Ľudské periférne lymfocyty by sa mali získať od mladých (približne 18 až 35 ročných) nefajčiarov, ktorí podľa známych informácií netrpia nejakou chorobou, a ktorí v poslednom čase neboli vystavení genotoxickým činiteľom (napr. chemikáliám, ionizujúcemu žiareniu) na úrovniach, ktoré by zvýšili výskyt chromozómových aberácií v pozadí. Tým by sa zabezpečil nízky a ustálený výskyt chromozómových aberácií v pozadí. Základný výskyt chromozómových aberácií sa vekom zvyšuje, pričom je tento trend výraznejší u žien než u mužov (17) (18). Ak sa spoločne použijú bunky od viacerých darcov, mal by sa uviesť počet darcov. Je potrebné preukázať, že bunky sa v čase od začiatku aplikácie testovanej chemikálie do odberu vzoriek delili. Bunkové kultúry sú udržiavané v exponenciálnej fáze rastu buniek (bunkové línie) alebo sa ich delenie stimuluje (primárne kultúry lymfocytov), aby boli testovanej chemikálii vystavené bunky v rôznych fázach bunkového cyklu, pretože citlivosť jednotlivých fáz bunkového cyklu na testovanú chemikáliu nemusí byť známa. Primárne bunky, ktoré sa musia stimulovať mitogénnymi aktivátormi, aby sa delili, sa už vo všeobecnosti počas vystavenia testovanej chemikálii nesynchronizujú (napr. ľudské lymfocyty po 48 hodinách mitogénnej stimulácie). Používanie synchronizovaných buniek sa počas ovplyvňovania neodporúča, ale môže byť prijateľné, ak je to odôvodnené.
                     
                        Médiá a kultivačné podmienky
                     
                     Na udržiavanie kultúr by sa malo použiť vhodné kultivačné médium a inkubačné podmienky (kultivačné nádoby, podľa potreby atmosféra s vyššou relatívnou vlhkosťou a 5 % CO2, inkubačná teplota 37 °C). Bunkové línie by sa mali pravidelne kontrolovať, pokiaľ ide o stabilitu modálneho počtu chromozómov a o vylúčenie kontaminácie mykoplazmou (7) (19), a v prípade kontaminácie alebo zmeny modálneho počtu chromozómov by sa nemali použiť. Mal by sa stanoviť čas bežného bunkového cyklu použitej bunkovej línie alebo primárnych kultúr v testovacom laboratóriu a mal by byť zhodný s publikovanými charakteristikami buniek (20).
                     
                        Príprava kultúr
                     
                     Bunkové línie: bunky sa množia zo zásobných kultúr, zakladajú sa do rastového média, a to v takej hustote, pri ktorej sa počet buniek v suspenzii alebo v monovrstvách bude ďalej exponenciálne zvyšovať až do času odberu [napr. malo by sa zabrániť zhlukovaniu (konfluencii) buniek rastúcich v monovrstvách].
                     Lymfocyty: celá krv ošetrená antikoagulantom (napríklad: heparínom) alebo separované lymfocyty sa v prítomnosti mitogénu [napr. fytohemaglutinínu (PHA) v prípade ľudských lymfocytov] kultivujú (napr. počas 48 hodín v prípade ľudských lymfocytov), aby sa vyvolalo delenie buniek predtým, ako sa bunky vystavia testovanej chemikálii.
                     
                        Metabolická aktivácia
                     
                     Ak sa použijú bunky s nedostatočnou endogénnou metabolickou kapacitou, mali by sa použiť exogénne systémy metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom, ktorý sa štandardne odporúča, pokiaľ to nie je odôvodnené inak, je kofaktormi obohatená postmitochondriálna frakcia (S9) pripravená z pečene hlodavcov (väčšinou potkanov) ošetrená činidlami na indukciu enzýmov, ako napríklad Aroclorom 1254 (21) (22) (23) alebo kombináciou fenobarbitálu a beta-naftoflavónu (3-fenyl-1H-nafto[2,1-b]pyrán-1-ón) (27) (28) (29). Uvedená kombinácia nie je v rozpore so Štokholmským dohovorom o perzistentných organických látkach (30) a preukázateľne je pri indukovaní oxidáz so zmiešanými funkciami rovnako účinná ako Aroclor 1254 (24) (25) (26) (28). Frakcia S9 sa zvyčajne používa v koncentráciách v rozpätí od 1 do 2 obj. %, ale v konečnom testovacom médiu ju možno zvýšiť na 10 obj. %. Počas ovplyvňovania by sa malo zabrániť použitiu produktov, ktorými sa znižuje mitotický index, najmä produktov tvoriacich komplexy s vápnikom (31). Výber druhu a koncentrácie použitého exogénneho systému metabolickej aktivácie alebo metabolického induktora môže ovplyvniť trieda testovanej chemikálie.
                     
                        Príprava testovanej chemikálie
                     
                     Testované chemikálie v tuhom skupenstve by sa prípadne mali rozpustiť vo vhodnom rozpúšťadle pred ich aplikáciou na bunky (pozri bod 23). Testované chemikálie v kvapalnom skupenstve možno pridať priamo do testovacieho systému a/alebo ich rozriediť pred použitím na ovplyvňovanie testovacieho systému. Plynné alebo prchavé testované chemikálie by sa mali testovať tak, že sa štandardné protokoly vhodne upravia, napríklad sa v nich uskutoční ovplyvňovanie v uzavretých kultivačných nádobách (32) (33) (34). Príprava testovanej chemikálie by sa mala uskutočniť tesne pred ovplyvňovaním, pokiaľ z údajov o stabilite nevyplýva prípustnosť uskladnenia.
                     
                        Podmienky testu
                     
                     
                        Rozpúšťadlá
                     
                     Rozpúšťadlo by sa malo zvoliť tak, aby sa optimalizovala rozpustnosť testovaných chemikálií bez toho, aby to malo negatívny vplyv na vykonávanie skúšky (napr. zmenou rastu buniek), ovplyvňovalo integritu testovanej chemikálie, reagovalo s kultivačnými nádobami, narušovalo systém metabolickej aktivácie. Vždy, keď je to možné, odporúčame zvážiť, aby sa prednostne použilo vodné rozpúšťadlo (alebo rastové médium). Medzi overené rozpúšťadlá patrí napr. voda alebo dimetylsulfoxid. Organické rozpúšťadlá by vo všeobecnosti nemali presiahnuť 1 obj. % a vodné rozpúšťadlá (fyziologický roztok alebo voda) by nemali presiahnuť 10 obj. % v konečnom médiu s testovanou chemikáliou. Ak sa použijú iné ako overené rozpúšťadlá (napr. etanol alebo acetón), ich použitie by malo byť podložené údajmi potvrdzujúcimi ich kompatibilitu s testovanou chemikáliou, testovacím systémom a absenciu genetickej toxicity pri použitej koncentrácii. V prípade, že tieto podkladové údaje nie sú k dispozícii, je dôležité do testu zahrnúť neovplyvňované kontroly (pozri dodatok 1) s cieľom preukázať, že zvolené rozpúšťadlo nevyvoláva žiadne rušivé alebo klastogénne účinky.
                     
                        Meranie proliferácie buniek a cytotoxicity a výber expozičných koncentrácií
                     
                     Pri stanovovaní najvyššej koncentrácie testovanej chemikálie by sa malo zabrániť použitiu koncentrácií, ktoré majú schopnosť vyvolať falošné pozitívne reakcie, napr. koncentrácií vyvolávajúcich nadmernú cytotoxicitu (pozri bod 22), zrážanie rastového média (pozri bod 23) alebo výrazné zmeny pH alebo osmolality (pozri bod 5). Ak testovaná chemikália spôsobí výrazné zmeny pH média v čase jej pridania, pH možno upraviť tlmením finálneho média s testovanou chemikáliou tak, aby sa zabránilo falošným pozitívnym výsledkom a aby sa udržali vhodné kultivačné podmienky.
                     Aby sa zaistilo, že dostatočný počet ovplyvňovaných buniek dosiahol počas testu mitózu a že ošetrenia sa vykonávali na vhodných úrovniach cytotoxicity (pozri body 18 a 22), vykonávajú sa merania proliferácie buniek. V hlavnom experimente by sa mala stanoviť cytotoxicita s metabolickou aktiváciou a bez nej, a to použitím vhodného indikátora bunkovej smrti a rastu. Aj keď z hľadiska lepšieho definovania koncentrácií, ktoré sa majú použiť v hlavnom experimente, môže byť užitočné hodnotenie cytotoxicity v počiatočnom teste, počiatočný test nie je povinný. Ak sa vykonáva, nemal by nahradiť meranie cytotoxicity pri hlavnom experimente.
                     Relatívne zdvojenie populácie (RPD) alebo relatívne zvýšenie počtu buniek (RICC) sú vhodné metódy na posúdenie cytotoxicity cytogenetických testoch (13) (15) (35) (36) (55) (pozri vzorce v dodatku 2). V prípade dlhodobej aplikácie chemikálie a v prípade, že sa odbery vykonávajú neskôr, ako je 1,5-násobok trvania normálneho bunkového cyklu od začiatku aplikácie (t. j. neskôr, ako je dĺžka 3 bunkových cyklov spolu), môže RPD viesť k podhodnoteniu cytotoxicity. Za týchto okolností by lepšou alternatívou mohlo byť meranie RICC alebo by na vyhodnotenie cytotoxicity po 1,5-násobku trvania bunkového cyklu bolo užitočné použiť odhad pomocou RPD.
                     Pokiaľ ide o lymfocyty v primárnych kultúrach, meradlom cytotoxických/cytostatických účinkov je mitotický index (MI), ktorý je však ovplyvnený časom od aplikácie testovanej chemikálie do jeho merania použitým mitogénom a prípadným narušením bunkového cyklu. MI je však prijateľný, pretože iné merania cytotoxicity môžu byť náročné a nepraktické a nemusia sa vzťahovať na cieľovú populáciu lymfocytov rastúcich v dôsledku reakcie na stimuláciu pomocou PHA.
                     Zatiaľ čo v prípade bunkových línií sú odporúčanými parametrami cytotoxicity hodnoty RICC a RPD a v prípade primárnej kultúry lymfocytov sa na rovnaký účel odporúča hodnota MI, užitočné informácie by mohli vyplynúť aj z ďalších ukazovateľov (napr. z integrity buniek, apoptózy, nekrózy, bunkového cyklu).
                     Mali by sa vyhodnocovať aspoň tri testované koncentrácie (bez zahrnutia kontroly s rozpúšťadlom a pozitívnej kontroly), ktoré spĺňajú kritériá prípustnosti (vhodná cytotoxicita, počet buniek atď.). Pri každej testovanej koncentrácii možno použiť akýkoľvek typ buniek (bunkové línie alebo primárne kultúry lymfocytov), buď replikátne kultúry alebo jednu ovplyvňovanú kultúru. Zatiaľ čo sa odporúča používanie duplikátnych kultúr, jednotlivé kultúry sú rovnako prípustné za predpokladu, že sa hodnotí rovnaký celkový počet buniek v jednotlivých resp. duplikátnych kultúrach. Použitie jednotlivých kultúr je obzvlášť dôležité pri viac ako 3 posudzovaných koncentráciách (pozri bod 31). Výsledky získané v nezávislých replikátnych kultúrach pri danej koncentrácii možno združiť na účely analýzy údajov (38). V prípade testovaných chemikálií, ktoré preukazujú malú alebo žiadnu cytotoxicitu, sú zvyčajne vhodné približne 2 až 3-násobné intervaly testovaných koncentrácií. Pri výskyte cytotoxicity by vybrané testované koncentrácie mali pokrývať rozsah od koncentrácie, ktorá vyvoláva cytotoxicitu, ako sa opisuje v bode 22, vrátane koncentrácií, pri ktorých je cytotoxicita mierna a slabá alebo žiadna. Mnohé testované chemikálie vykazujú strmé krivky závislosti reakcie od koncentrácie a s cieľom získať údaje pri nízkej a miernej cytotoxicite alebo podrobne preskúmať vzťah medzi dávkou a reakciou bude nevyhnutné použiť viac koncentrácií s tesným odstupom a/alebo viac ako tri koncentrácie (pre jednotlivé kultúry alebo replikáty), najmä v situáciách, kde sa vyžaduje opakovať experiment (pozri bod 47).
                     Ak je maximálna koncentrácia založená na cytotoxicite, najvyššia koncentrácia by mala dosiahnuť 55 ± 5 % cytotoxicity pri použití odporúčaných parametrov cytotoxicity (t. j. v prípade bunkových línií zníženie hodnôt RICC a RPD a v prípade primárnych kultúr lymfocytov zníženie hodnoty MI na 45 ± 5 % hodnôt súbežnej negatívnej kontroly). Pozitívne výsledky, ktoré sa zistia len pri hornej hranici tohto 55 ± 5 % rozpätia cytotoxicity, by sa mali interpretovať s mimoriadnou opatrnosťou (13).
                     V prípade málorozpustných testovaných chemikálií, ktoré nie sú cytotoxické pri koncentráciách nižších, ako je ich rozpustnosť, by najvyššia analyzovaná koncentrácia mala na konci aplikovania testovanej chemikálie vyvolať zákal alebo zrazeninu viditeľnú voľným okom alebo pomocou inverzného mikroskopu. Aj keď sa cytotoxicita vyskytne pri koncentrácii vyššej, ako je najnižšia nerozpustná koncentrácia daných chemikálií, testovať sa odporúča len pri jednej koncentrácii vyvolávajúcej zákal alebo viditeľnú zrazeninu, pretože falošné účinky môžu byť spôsobené zrazeninou. Pri koncentráciách vyvolávajúcich zrazeninu treba dbať na to, aby nedochádzalo k interferencii zrazeniny s priebehom testu (napr. pri farbení alebo bodovom hodnotení). Mohlo by byť užitočné pred začatím experimentu stanoviť rozpustnosť v rastovom médiu.
                     Ak sa nezistí žiadna zrazenina alebo obmedzujúca cytotoxicita, najvyššia testovaná koncentrácia by mala zodpovedať 10 mM, 2 mg/ml alebo 2 μl/ml, podľa toho, ktorá je najnižšia (39) (40) (41). Ak testovaná chemikália nemá definované zloženie, napr. látka neznámeho alebo variabilného zloženia, produkt komplexných reakcií alebo biologický materiál (UVCB) (42), environmentálny extrakt atď., je možné, že v prípade nedostatočnej cytotoxicity sa na zvýšenie koncentrácie jednotlivých zložiek danej testovanej chemikálie bude musieť najvyššia koncentrácia zvýšiť (napr. na 5 mg/ml). Je však potrebné poznamenať, že tieto požiadavky sa môžu v prípade humánnych liekov líšiť (43).
                     
                        Kontroly
                     
                     Pri každom odbere by sa mali vykonať súbežné negatívne kontroly (pozri bod 15), ktoré pozostávajú iba zo samotného rozpúšťadla v médiu s testovanou chemikáliou a ktoré sú ovplyvňované rovnakým spôsobom ako ovplyvňované kultúry.
                     Súbežné pozitívne kontroly sú potrebné na preukázanie schopnosti laboratória identifikovať klastogény v podmienkach použitého skúšobného protokolu a v prípade potreby aj (na preukázanie) účinnosti exogénneho systému metabolickej aktivácie. Príklady pozitívnych kontrol sú uvedené v tabuľke 1. Ak je to odôvodnené, možno použiť alternatívne iné chemikálie na pozitívnu kontrolu. Pretože testy genetickej toxicity in vitro na bunkách cicavcov sú dostatočne normalizované, použitie pozitívnych kontrol možno obmedziť len na metabolickú aktiváciu, ktorá si vyžaduje klastogén. Za predpokladu, že sa takýto test vykonáva súbežne s neaktivovaným testom s použitím rovnakej dĺžky ovplyvňovania, táto jediná pozitívna reakcia kontroly bude preukazovať aktivitu systému metabolickej aktivácie, ako aj citlivosť testovacieho systému. Dlhodobé ovplyvňovanie (bez S9) by však malo mať svoju vlastnú pozitívnu kontrolu, keďže dĺžka ovplyvňovania sa bude líšiť od testu s metabolickou aktiváciou. Každá pozitívna kontrola by sa mala použiť pri jednej alebo viacerých koncentráciách, pri ktorých sa očakáva reprodukovateľný a zistiteľný nárast nad hodnoty v pozadí, aby sa preukázala citlivosť testovacieho systému (t. j. aby účinky boli jasné, ale aby sa pri odčítavaní priamo neodhaľovala identita kódovaných preparátov), pričom by reakcia nemala byť narušená cytotoxicitou prevyšujúcu limity stanovené v testovacej metóde.
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Referenčné chemikálie odporúčané na posúdenie spôsobilosti laboratória a na výber pozitívnych kontrol.
                     
                     
                                 Kategória
                              
                              
                                 Chemikália
                              
                              
                                 Číslo CAS
                              
                           1.   Klastogény aktívne bez metabolickej aktivácie
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 metylmetánsulfonát
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 mitomycín C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-nitrochinolín-N-oxid
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 cytarabín
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           2.   Klastogény vyžadujúce metabolickú aktiváciu
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 benzo[a]pyrén
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 cyklofosfamid
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           POSTUP
                     
                        Aplikácia testovanej chemikálie
                     
                     Proliferujúce bunky sa ovplyvnia testovanou chemikáliou za prítomnosti aj za neprítomnosti systému metabolickej aktivácie.
                     
                        Čas odberu kultúry
                     
                     Na účely dôkladného vyhodnotenia, ktoré by bolo potrebné na vyslovenie záveru, že ide o negatívny výsledok, by sa mali vykonať testy za všetkých troch ďalej uvedených experimentálnych podmienok, a to s použitím krátkodobého ovplyvňovania testovanou chemikáliou spolu s metabolickou aktiváciou alebo bez nej a s použitím dlhodobého ovplyvňovania testovanou chemikáliou bez metabolickej aktivácie (pozri body 43, 44 a 45):
                     
                                 —
                              
                              
                                 Bunky by sa mali vystaviť testovanej chemikálii bez metabolickej aktivácie na 3 – 6 hodín, a vzorky z nich by sa mali odobrať v čase ekvivalentnom približne 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania (18).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Bunky by sa mali vystaviť testovanej chemikálii spolu s metabolickou aktiváciou na 3 – 6 hodín, a vzorky z nich by sa mali odobrať v čase ekvivalentnom približne 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania (18).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Bunky by sa mali nepretržite vystavovať testovanej chemikálii bez metabolickej aktivácie až do odobratia vzorky v čase ekvivalentnom približne 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu. Určité chemikálie (napr. analógy nukleozidov) sa dajú jednoduchšie zistiť pri dlhšom ovplyvňovaní resp. pri odoberaní vzoriek v čase dlhšom, ako je 1,5-násobok dĺžky bežného bunkového cyklu (24).
                              
                           V prípade, že ktorákoľvek z uvedených experimentálnych podmienok vedie k pozitívnej reakcii, nie je potrebné preskúmať ostatné dávkovacie schémy.
                     
                        Chromozómové preparáty
                     
                     Bunkové kultúry sa ošetrujú kolcemidom alebo kolchicínom zvyčajne 1 – 3 hodiny pred odberom. Každá bunková kultúra sa na prípravu chromozómových preparátov odoberá a spracúva oddelene. Príprava chromozómových preparátov zahŕňa hypotonické ošetrenie buniek, fixáciu a farbenie. V monovrstvových bunkových kultúrach sa mitotické bunky (možno ich identifikovať ako okrúhle a oddeľujúce sa od povrchu) môžu vyskytovať na konci 3 – 6 hodinového pôsobenia. Keďže sa tieto mitotické bunky dajú ľahko oddeliť, môžu sa stratiť pri odstraňovaní média obsahujúceho testovanú chemikáliu. Ak v čase odberu existuje dôkaz o výraznom zvýšení počtu mitotických buniek v porovnaní s kontrolami, čo by poukazovalo na možné zastavenie mitózy, potom by sa bunky mali zhromaždiť odstreďovaním a vrátiť späť ku kultúram, aby sa predišlo strate buniek v mitóze, ktorým hrozí vznik chromozómových aberácií.
                     
                        Analýza
                     
                     Všetky preparáty vrátane preparátov s negatívnymi a pozitívnymi kontrolami by sa pred mikroskopickou analýzou chromozómových aberácií mali nezávisle označiť kódmi. Keďže fixačné postupy často vedú k tomu, že časť metafázových buniek stratí chromozómy, vyhodnocované bunky by preto mali obsahovať centroméry, ktorých počet by sa mal rovnať modálnemu počtu chromozómov ± 2.
                     Hodnotiť by sa malo najmenej 300 dobre rozotretých buniek v metafáze na jednu koncentráciu a kontrolu, aby bolo možné dôjsť k záveru, že testovaná chemikália je jednoznačne negatívna (pozri bod 45). V prípade používania replikátnych kultúr by sa uvedených 300 buniek malo rovnomerne rozdeliť medzi replikáty. Ak sa pri každej koncentrácii použije len jedna kultúra (pozri bod 21), uvedených najmenej 300 dobre rozprestrených buniek v metafáze by sa malo hodnotiť z tejto jednej kultúry. Prednosťou hodnotenia 300 buniek je zvyšovanie štatistickej sily testu, pričom sa okrem toho zriedka vyskytnú nulové hodnoty (predpokladá sa len 5 %) (44). Počet hodnotených metafáz možno znížiť, ak sa zistí veľký počet buniek s chromozómovými aberáciami a testovaná chemikália sa považuje za jasne pozitívnu.
                     Mali by sa hodnotiť bunky so štruktúrnymi chromozómovými aberáciami, a to s gapmi a bez gapov. Definície zlomov a gapov sú uvedené v dodatku 1, podľa (45) (46). Aberácie chromatídového a chromozómového typu by sa mali zaznamenávať oddelene a klasifikovať podľa druhu (zlomy, výmeny). Postupy používané v laboratóriu by mali zabezpečiť, aby analýzy chromozómových aberácií vykonávali primerane vyškolení hodnotiaci pracovníci a aby sa podľa potreby partnersky preskúmali.
                     Hoci účelom tohto testu je zistiť štruktúrne chromozómové aberácie, v prípade polyploidie a endoreduplikácie je dôležité zaznamenať frekvenciu týchto javov. (pozri bod 2).
                     
                        Spôsobilosť laboratória
                     
                     V záujme nadobudnutia dostatočných skúseností s testom pred jeho použitím na rutinné testovanie by laboratórium malo mať uskutočnené série experimentov s referenčnými pozitívnymi chemikáliami pôsobiacimi rôznymi mechanizmami a s rôznymi negatívnymi kontrolami (s použitím rôznych rozpúšťadiel/nosičov). Tieto reakcie pozitívnych a negatívnych kontrol by mali byť konzistentné s literatúrou. Táto požiadavka sa nevzťahuje na laboratóriá, ktoré majú skúsenosti, t. j. majú dostupnú historickú databázu, ako sa vymedzuje v bode 37.
                     Na preukázanie spôsobilosti detegovať klastogénne chemikálie a určiť účinnosť systému metabolickej aktivácie by sa mal preskúmať výber chemikálií na pozitívnu kontrolu (pozri tabuľku 1 v bode 26), a to na základe krátkodobého a dlhodobého ovplyvňovania bez metabolickej aktivácie, ako aj na základe krátkodobého pôsobenia za prítomnosti metabolickej aktivácie. V záujme preukázania citlivosti a dynamického rozsahu testovacieho systému by sa rozsah koncentrácií vybraných chemikálií mal zvoliť tak, aby vznikali reprodukovateľné reakcie zvyšujúce sa v závislosti od koncentrácie nad úrovňou v pozadí.
                     
                        Historické údaje o kontrolách
                     
                     Laboratórium by malo vytvoriť:
                     
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a rozdelenie historických pozitívnych kontrol,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a rozdelenie historických negatívnych kontrol (neovplyvňované, s rozpúšťadlom).
                              
                           Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s rozdelením historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi kontrol, ak takéto údaje existujú. S pridávaním ďalších experimentálnych údajov k rozdeleniu kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tohto rozdelenia (44) (47). Historickú databázu negatívnych kontrol laboratória by na začiatku malo tvoriť minimálne 10 experimentov, ale podľa možnosti by mala pozostávať aspoň z 20 experimentov vykonaných za porovnateľných experimentálnych podmienok. Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (48)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov týkajúcich sa pozitívnych a negatívnych kontrol a preukázať, že metodika v ich laboratóriu je „pod kontrolou“ (44). Ďalšie odporúčania k vytváraniu a využívaniu historických údajov (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného experimentu) možno nájsť v literatúre (47).
                     Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska ich súladu s existujúcou historickou databázou kontrol laboratória. Akékoľvek závažné nezrovnalosti by mali vyústiť do vytvorenia novej historickej databázy kontrol.
                     Údaje týkajúce sa negatívnych kontrol by mali zahŕňať výskyt buniek s chromozómovými aberáciami z jednej kultúry alebo súčet z replikátov kultúr, ako je opísané v bode 21. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí rozloženia historickej databázy negatívnych kontrol laboratória (44) (47). Ak údaje zo súbežných negatívnych kontrol nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do rozloženia historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne odľahlými hodnotami a pokiaľ existujú dôkazy, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 37) a neexistujú žiadne dôkazy o technickom alebo ľudskom zlyhaní.
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Prezentovanie výsledkov
                     
                     Vyhodnotiť by sa mal percentuálny podiel buniek so štruktúrnou chromozómovou aberáciou(-ami). Aberácie chromatídového a chromozómového typu klasifikované podľa druhu (zlomy, výmeny) by mali byť uvedené oddelene spolu s ich počtami a frekvenciami výskytu v prípade experimentálnych a kontrolných kultúr. Gapy sa zaznamenávajú a uvádzajú oddelene, ale neudávajú sa pri celkovej frekvencii aberácií. Uvádza sa percentuálny podiel polyploidie a/alebo endoreduplikovaných buniek, ak boli pozorované.
                     Mali by sa zaznamenať súbežné merania cytotoxicity pre všetky ovplyvňované, ako aj negatívne a pozitívne kontrolné kultúry v hlavnom experimente zameranom na aberácie.
                     Mali by sa uvádzať údaje o jednotlivých kultúrach. Okrem toho by sa všetky údaje mali uvádzať v tabuľkovej podobe.
                     
                        Kritériá prijateľnosti
                     
                     Prijateľnosť vychádza z týchto kritérií:
                     
                                 —
                              
                              
                                 Súbežná negatívna kontrola sa považuje za prijateľnú na doplnenie do historickej databázy negatívnych kontrol laboratória, ako je opísané v bode 39.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Súbežné pozitívne kontroly by mali vyvolať reakcie, ktoré sú zlučiteľné s reakciami generovanými v historickej databáze pozitívnych kontrol a viesť k štatisticky významnému nárastu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kritériá proliferácie buniek v kontrole s rozpúšťadlom by mali byť splnené (body 17 a 18).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Pokiaľ jedna experimentálna podmienka neviedla k pozitívnym výsledkom (pozri bod 28), testovali sa všetky tri experimentálne podmienky.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Analyzovateľný je adekvátny počet buniek a koncentrácií (body 31 a 21).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Kritériá výberu najvyššej koncentrácie sú v súlade s kritériami opísanými v bodoch 22, 23 a 24.
                              
                           
                        Vyhodnotenie a interpretácia výsledkov
                     
                     Za predpokladu, že všetky kritériá prijateľnosti sú splnené, sa testovaná chemikália pokladá za jasne pozitívnu, ak pre ktorúkoľvek z preskúmaných experimentálnych podmienok platí, že (pozri bod 28):
                     
                                 a)
                              
                              
                                 aspoň jedna z testovaných koncentrácií vykazuje štatisticky významné zvýšenie v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 toto zvýšenie je závislé od dávky, ak sa hodnotenie vykonáva na základe vhodného testu trendu,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 niektorý z týchto výsledkov je mimo rozloženia historických údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol (napr. mimo 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia, pozri bod 39).
                              
                           Ak sú splnené všetky tieto kritériá, potom sa testovaná chemikália považuje za schopnú vyvolať chromozómové aberácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (49) (50) (51).
                     Za predpokladu, že všetky kritériá prijateľnosti sú splnené, sa testovaná chemikália pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných experimentálnych podmienkach (pozri bod 28) platí, že:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 žiadna z testovaných koncentrácií nevykazuje štatisticky významné zvýšenie v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 nedochádza k zvýšeniu závislému od dávky, ak sa hodnotenie vykonáva na základe vhodného testu trendu,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 všetky výsledky sa vyskytujú v rámci rozložení historických údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol (napr. v 95 % regulačných medziach Poissonovho rozdelenia, pozri bod 39).
                              
                           Testovaná chemikália sa považuje za neschopnú vyvolať chromozómové aberácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme.
                     Overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie sa nevyžaduje.
                     V prípade, že reakcia nie je jednoznačne negatívna, ani jednoznačne pozitívna podľa uvedeného opisu, alebo v prípade, že ide o pomoc pri stanovovaní biologickej relevantnosti výsledku, by sa údaje mali odborne posúdiť a/alebo podrobiť ďalšiemu skúmaniu. Užitočné by mohlo byť hodnotenie ďalších buniek (ak je to vhodné) alebo opakovanie experimentu podľa možnosti za modifikovaných experimentálnych podmienok [napr. odstup koncentrácií, iné podmienky metabolickej aktivácie (t. j. koncentrácia S9 alebo pôvod S9)].
                     V zriedkavých prípadoch, dokonca aj po ďalších skúmaniach, z údajov nemožno vyvodiť záver o tom, či sú výsledky pozitívne alebo negatívne, a preto sa reakcia na testovanú chemikáliu uzavrie ako reakcia s nejasným výsledkom.
                     Nárast počtu polyploidných buniek môže naznačovať, že testované chemikálie majú potenciál brzdiť mitotické procesy a indukovať numerické chromozómové aberácie (52). Nárast počtu buniek s endoreduplikovanými chromozómami môže naznačovať, že testované chemikálie majú potenciál brzdiť priebeh bunkového cyklu (53) (54) (pozri bod 2). Preto by sa incidencia polyploidných buniek a buniek s endoreduplikovanými chromozómami mala zaznamenávať oddelene.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita samotnej testovanej chemikálie, ak je známa,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle, ak je známa,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             výsledky merania pH, osmolality a tvorby zrazeniny v rastovom médiu, ku ktorej bola pridaná testovaná chemikália, podľa vhodnosti.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Jednozložková látka:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             chemická identifikácia ako názov IUPAC alebo názov CAS, CAS číslo, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt podľa vhodnosti a praktickej realizovateľnosti atď.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Viaczložková látka, UVCB a zmesi:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             čo najviac charakterizované chemickou identitou (pozri vyššie), kvantitatívnym výskytom a príslušnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami zložiek.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozpúšťadlo:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie výberu rozpúšťadla,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             percentuálny podiel rozpúšťadla v konečnom rastovom médiu by sa mal takisto uviesť.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bunky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a zdroj buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             karyotyp a vhodnosť použitého typu buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií neprítomnosť mykoplazmy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií informácie o dĺžke bunkového cyklu, čase zdvojenia alebo proliferačnom indexe,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pohlavie darcov krvi, vek a akékoľvek relevantné informácie o darcovi, či ide o celú krv alebo separované lymfocyty, použitý mitogén,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií počet pasážovaní, ak je k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií metódy udržiavania bunkovej kultúry,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií modálny počet chromozómov.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identita chemikálie zastavujúcej metafázu, jej koncentrácia a trvanie expozície buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia testovanej chemikálie vyjadrená ako konečná koncentrácia v rastovom médiu (napr. μg alebo mg/ml alebo mM rastového média),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie výberu koncentrácií a počtu kultúr vrátane napríklad údajov o cytotoxicite a obmedzení rozpustnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zloženie média, v prípade vhodnosti koncentrácia CO2, úroveň vlhkosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia (a/alebo objem) rozpúšťadla a testovanej chemikálie pridaných do rastového média,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubačná teplota,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             inkubačný čas,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             trvanie ovplyvňovania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             čas odberu po ovplyvňovaní,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hustota buniek pri zakladaní do rastového média, ak je to vhodné,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a zloženie systému metabolickej aktivácie (zdroj S9, metóda prípravy zmesi S9, koncentrácia alebo objem zmesi S9 a S9 v konečnom rastovom médiu, kontroly kvality S9),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             chemikálie na pozitívnu a negatívnu kontrolu, konečné koncentrácie pre každú z podmienok ovplyvňovania;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použité metódy prípravy preparátov a metóda farbenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá prijateľnosti skúšky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá pre hodnotenie aberácií,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet analyzovaných metafáz,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy merania cytoxicity,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             všetky doplňujúce informácie týkajúce sa cytotoxicity a použitej metódy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá považovanie štúdií za pozitívne, negatívne alebo nejasné,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy použité na určenie pH, osmolality a zrážania.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií počet ovplyvňovaných buniek a počet odobratých buniek za každú kultúru,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             meranie cytotoxicity, napr. RPD, RICC, MI, ďalšie pozorovania, ak existujú,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií informácie o dĺžke bunkového cyklu, čase zdvojenia alebo proliferačnom indexe,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             príznaky tvorby zrazeniny a čas jej stanovenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             definícia aberácií vrátane gapov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet hodnotených buniek, počet buniek s chromozómovými aberáciami a typ chromozómových aberácií uvedené oddelene pre každú ovplyvňovanú a kontrolnú kultúru spolu s gapmi a bez gapov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zmeny v ploidii (polyploidné bunky a bunky s endoreduplikovanými chromozómami uvedené oddelene), ak boli pozorované,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vzťah medzi koncentráciou a reakciou, ak ho možno určiť,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje týkajúce sa súbežných negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrol (koncentrácie a rozpúšťadlá),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             historické údaje týkajúce sa negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrol spolu s rozsahmi, priemermi, so štandardnými odchýlkami, s 95 % regulačnými medzami rozdelenia a počtom údajov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štatistická analýza, p-hodnoty, ak existujú.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky a diskusia
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Evans, H.J. (1976), “Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens”, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), “The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture” in Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Muehlbauer, P.A. et al. (2008), “Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods”, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318-327.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Kapitola B.49 tejto prílohy: Mikrojadrový test cicavcov in vitro.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, pp. 147-204.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439-452.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191-201.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, pp. 1–256.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305-309.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95-106.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261-287.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, pp.163-167.
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347-363.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83-90.
                              
                           
                                 24.
                              
                              
                                 Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277-290.
                              
                           
                                 25.
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 26.
                              
                              
                                 Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175-177.
                              
                           
                                 27.
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976), “A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems”, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 28.
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241-261.
                              
                           
                                 29.
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). K dispozícii na webovej lokalite: http://www.pops.int/.
                              
                           
                                 31.
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 32.
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), “CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids”, in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 33.
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 34.
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 35.
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 36.
                              
                              
                                 Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77-83.
                              
                           
                                 37.
                              
                              
                                 Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, pp. 86-87.
                              
                           
                                 38.
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 39.
                              
                              
                                 OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. K dispozícii na požiadanie.
                              
                           
                                 40.
                              
                              
                                 Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, pp. 32-56.
                              
                           
                                 41.
                              
                              
                                 Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 42.
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 43.
                              
                              
                                 USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. K dispozícii na webovej lokalite: https://federalregister.gov/a/2012-13774.
                              
                           
                                 44.
                              
                              
                                 OECD (2014), “Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS)”, Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 45.
                              
                              
                                 ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.
                              
                           
                                 46.
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1990), “Metaphase chromosome aberration assays in vitro”, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86.
                              
                           
                                 47.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 48.
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 49.
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 50.
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 51.
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989), “Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 52.
                              
                              
                                 Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29-46.
                              
                           
                                 53.
                              
                              
                                 Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403-413.
                              
                           
                                 54.
                              
                              
                                 Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362-1364.
                              
                           
                                 55.
                              
                              
                                 Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139-149.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Aneuploidia
                           : akákoľvek odchýlka od bežného diploidného (alebo haploidného) počtu chromozómov vo forme jedného alebo viacerých chromozómov, nie však vo forme celého súboru(-ov) chromozómov (polyploidia).
                        
                           
                              Apoptóza
                           : programovaná bunková smrť charakterizovaná sériou krokov, ktoré vedú k rozpadu buniek na telieska ohraničené membránou, ktoré sa následne fagocytujú alebo vypudzujú.
                        
                           
                              Proliferácia buniek
                           : zvýšenie počtu buniek v dôsledku mitotického delenia bunky.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Chromatidový zlom
                           : prerušenie jednej chromatídy so zjavným posunutím jednej z chromatíd.
                        
                           
                              Chromatidový gap
                           : nefarbiaca sa oblasť (achromatická lézia) jednej chromatídy s minimálnym posunutím chromatíd.
                        
                           
                              Aberácia chromatidového typu
                           : štruktúrne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako zlom jednej z chromatíd alebo zlom a opätovné spojenie medzi chromatídami.
                        
                           
                              Aberácia chromozómového typu
                           : štruktúrne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako zlom alebo zlom a opätovné spojenie oboch chromatíd na rovnakej strane.
                        
                           
                              Klastogén
                           : každá chemikália, ktorá spôsobuje štruktúrne chromozómové aberácie v populáciách buniek alebo eukaryotických organizmov.
                        
                           
                              Koncentrácie
                           : odkaz na konečné koncentrácie testovanej chemikálie v rastovom médiu.
                        
                           
                              Cytotoxicita
                           : V prípade skúšok uvedených v tejto testovacej metóde s využitím bunkových línií je cytotoxicita identifikovaná ako zníženie relatívneho zdvojenia populácie (RPD) alebo relatívne zvýšenie počtu buniek (RICC), pokiaľ ide o ovplyvňované bunky v porovnaní s negatívnou kontrolnou (pozri bod 17 a dodatok 2). V prípade skúšok uvedených v tejto testovacej metóde s využitím primárnych kultúr lymfocytov je cytotoxicita identifikovaná ako zníženie mitotického indexu (MI) ošetrených buniek v porovnaní s negatívnou kontrolnou (pozri bod 18 a dodatok 2).
                        
                           
                              Endoreduplikácia
                           : proces, v ktorom po S fáze replikácie DNA jadro neprechádza do mitózy, ale začína ďalšiu S fázu. Výsledkom sú chromozómy so 4, 8, 16… chromatídami.
                        
                           
                              Genotoxický
                           : všeobecný pojem, ktorý zahŕňa všetky typy poškodení DNA alebo chromozómov vrátane zlomov, delécií, aduktov, modifikácií a spojení nukleotidov, prestavby, génových mutácií, chromozómových aberácií a aneuploidie. Nie všetky typy genotoxických účinkov majú za následok mutácie alebo trvalé poškodenie chromozómu.
                        
                           
                              Mitotický index (MI)
                           : pomer medzi počtom buniek v metafáze a celkovým počtom buniek v populácii buniek, ktorý je meradlom stupňa proliferácie tejto populácie.
                        
                           
                              Mitóza
                           : delenie bunkového jadra, ktoré sa zvyčajne delí na profázu, prometafázu, metafázu, anafázu a telofázu.
                        
                           
                              Mutagénny
                           : produkujúci dedičnú zmenu sekvencie(-í) bázových párov DNA v génoch alebo štruktúre chromozómov (chromozómové aberácie).
                        
                           
                              Numerická aberácia
                           : zmena v počte chromozómov v porovnaní s bežným počtom charakteristickým pre použité bunky.
                        
                           
                              Polyploidia
                           : numerické chromozómové aberácie v bunkách alebo organizmoch, ktoré sa týkajú celého súboru(-ov) chromozómov na rozdiel od jednotlivého chromozómu alebo chromozómov (aneuploidia).
                        
                           
                              Stav p53
                           : proteín p53 je zapojený do regulácie bunkového cyklu, apoptózy a opravy DNA. Bunky s nedostatkami vo funkčnom proteíne p53, ktoré nie sú schopné zastaviť bunkový cyklus alebo odstrániť poškodené bunky prostredníctvom apoptózy alebo iných mechanizmov (napr. indukciou opravy DNA) súvisiacich s funkciami p53 pri reakcii na poškodenie DNA, by mali byť teoreticky náchylnejšie na génové mutácie či chromozómové aberácie.
                        
                           
                              Relatívne zvýšenie počtu buniek (Relative Increase in Cell Counts, RICC)
                           : zvýšenie počtu buniek v kultúrach vystavených chemikálii voči zvýšeniu v neošetrených kultúrach, pomer vyjadrený v percentách.
                        
                           
                              Relatívne zdvojenie populácie (Relative Population Doubling, RPD)
                           : zvýšenie počtu zdvojení populácie v kultúrach vystavených chemikálii voči zvýšeniu v neošetrených kultúrach, pomer vyjadrený v percentách.
                        
                           
                              Frakcia pečene S9
                           : supernatant homogenátu pečene po odstredení pri 9 000 g, t. j. surový pečeňový extrakt.
                        
                           
                              Zmes S9
                           : zmes frakcie pečene S9 a kofaktorov potrebných pre aktivitu metabolických enzýmov
                        
                           
                              Kontrola s aplikovaným rozpúšťadlom
                           : všeobecný pojem na vymedzenie kontrolných kultúr, na ktoré bolo aplikované samotné rozpúšťadlo, ktoré bolo použité na rozpustenie testovanej chemikálie.
                        
                           
                              Štruktúrna chromozómová aberácia
                           : zmena v chromozómovej štruktúre rozpoznateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia buniek, pozorovaná ako delécie a fragmenty, intrachromozómové výmeny alebo interchromozómové výmeny.
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje touto testovacou metódou.
                        
                           
                              Neošetrené kontroly
                           : kultúry, ktoré sa neovplyvňujú (t. j. ani testovanou chemikáliou ani rozpúšťadlom), ale súbežne sa spracúvajú rovnakým spôsobom ako kultúry ovplyvňované testovanou chemikáliou.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           VZORCE NA POSÚDENIE CYTOTOXICITY
                        
                        
                           Mitotický index (MI):
                        
                        
                           
                        Odporúča sa použiť relatívne zvýšenie počtu buniek (RICC) alebo relatívne zdvojenie populácie (RPD), pretože obidva indexy zohľadňujú pomer populácie buniek, u ktorých došlo k deleniu.
                        
                           
                        
                           
                        kde:
                        
                           Zdvojenie populácie = [log (počet buniek po ošetrení ÷ počiatočný počet buniek)] ÷ log 2.
                        Napríklad hodnota 53 % RICC alebo RDP poukazuje na 47 % cytotoxicitu/cytostázu a 55 % cytotoxicita/cytostáza meraná prostredníctvom MI znamená, že skutočný MI predstavuje 45 % kontroly.
                        V každom prípade by sa mal merať počet buniek pred ovplyvňovaním, ako aj počet buniek v ovplyvňovaných a negatívnych kontrolných kultúrach.
                        Hoci sa pomer RCC (t. j. počet buniek v ovplyvňovaných kultúrach/počet buniek v kontrolných kultúrach) v minulosti používal ako parameter cytotoxicity, už sa viac neodporúča, pretože sa ním môže podceniť cytotoxicita.
                        V negatívnych kontrolných kultúrach by zdvojenie populácie malo byť zlučiteľné s požiadavkou na odber vzorky buniek po ovplyvňovaní v čase ekvivalentnom približne 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu a mitotický index by mal byť dostatočne zvýšený na získanie dostatočného počtu buniek v mitóze a na spoľahlivé vypočítanie 50 % zníženia.
                     “
               
                     4.
                  
                  
                     V časti B sa kapitola B.11 nahrádza takto:
                     „B.11   Test na chromozómové aberácie v cicavčích bunkách kostnej drene
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 475 (2016). Je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. V tejto súvislosti bol vypracovaný aj dokument OECD, ktorý poskytuje stručné informácie o vykonávaní testov v oblasti genetickej toxikológie a prehľad o súčasných zmenách, ktorými tieto usmernenia na vykonávanie testov prešli (1).
                     Tento in vivo test na chromozómové aberácie v cicavčích bunkách kostnej drene je osobitne relevantný pre posúdenie genotoxicity, pretože faktory ako in vivo metabolizmus, farmakokinetika a oprava DNA sú aktívne a prispievajú k reakciám, hoci sa v prípade rôznych druhov môžu líšiť. Skúška in vivo je užitočná aj pre ďalšie skúmanie genotoxicity zistenej pomocou in vitro systému.
                     Test na chromozómové aberácie v cicavčích bunkách in vivo sa používa na zisťovanie štruktúrnych chromozómových aberácií indukovaných testovanou chemikáliou v bunkách kostnej drene zvierat, zvyčajne hlodavcov (2) (3) (4) (5). Štruktúrne chromozómové aberácie sa vyskytujú v dvoch typoch, chromozómové alebo chromatidové. Zatiaľ čo väčšina aberácií indukovaných genotoxickou chemikáliou je chromatidového typu, vyskytujú sa aj aberácie chromozómového typu. Chromozómové poškodenia a súvisiace javy sú príčinou mnohých ľudských genetických chorôb a existujú dostatočné dôkazy o tom, že pokiaľ tieto lézie a súvisiace javy spôsobujú zmeny onkogénov a tumor supresorových génov, sú zapojené do vzniku rakoviny u ľudí a v pokusných systémoch. V in vivo testoch na chromozómové aberácie by mohla vzniknúť polyploidia (vrátane endoreduplikácie). Samotné zvýšenie polyploidie však nenaznačuje aneugénny potenciál a môže jednoducho znamenať narušenie bunkového cyklu alebo cytotoxicitu. Tento test nie je určený na meranie aneuploidie. Na detekciu aneuploidie sa odporúčajú in vivo a in vitro testy ako in vivo mikrojadrový test na erytrocytoch cicavcov (kapitola B.12 tejto prílohy) alebo in vitro mikrojadrový test bunkách cicavcov (kapitola B.49 tejto prílohy).
                     Použité definície termínov sú uvedené v dodatku 1.
                     ÚVODNÉ ÚVAHY
                     V tomto teste sa zvyčajne používajú hlodavce, ale ak je to vedecky opodstatnené, v niektorých prípadoch môžu byť vhodné aj iné druhy. Cieľovým tkanivom v tomto teste je kostná dreň, pretože je to vysokovaskularizovaným tkanivom a obsahuje populáciu rýchlo sa deliacich buniek, ktoré sa dajú jednoducho izolovať a spracovať. V správe by sa malo uviesť vedecké odôvodnenie použitia iných druhov než potkanov a myší. Ak sa použijú iné druhy než hlodavce, odporúča sa, aby sa meranie chromozómových aberácií v bunkách kostnej drene začlenilo do iného vhodného testu toxicity.
                     Ak existujú dôkazy, že testovaná chemikália, resp. testované chemikálie alebo ich metabolity nedosiahnu cieľové tkanivo, použitie tohto testu nemusí byť vhodné.
                     Pred použitím testovacej metódy v prípade zmesi s cieľom generovať údaje pre zamýšľaný regulačný účel by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tento účel, a ak môže, malo by sa to zdôvodniť. Takéto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.
                     PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY
                     Zvieratá sa testovanej chemikálii vystavia vhodnou cestou a vo vhodnom čase po aplikácii testovanej chemikálie sa humánne usmrtia. Pred usmrtením sa zvieratám aplikuje prostriedok zastavujúci metafázu (napr kolchicín alebo kolcemid). Následne sa z kostnej drene urobia chromozómové preparáty, zafarbia sa a bunky v metafáze sa analyzujú na chromozómové aberácie.
                     OVEROVANIE SPÔSOBILOSTI LABORATÓRIA
                     
                        Zisťovanie spôsobilosti
                     
                     V záujme nadobudnutia dostatočných skúseností s vykonávaním skúšky pred jej použitím na rutinné testovanie by laboratórium malo preukázať schopnosť reprodukovať výsledky predpokladané na základe zverejnených údajov [napr. (6)], pokiaľ ide o frekvenciu výskytu chromozómových aberácií, s minimálne dvomi chemikáliami na pozitívnu kontrolu (vrátane slabých reakcií indukovaných nízkymi dávkami pozitívnych kontrol), ako sú chemikálie uvedené v tabuľke 1, a s kompatibilnými kontrolami s nosičom/rozpúšťadlom (pozri bod 22). Pri týchto experimentoch by sa mali používať dávky, ktoré vyvolajú reprodukovateľný a od dávky závislý nárast účinku a preukážu citlivosť a dynamický rozsah testovacieho systému v predmetnom tkanive (kostná dreň), pričom sa použije metóda hodnotenia, ktorá sa má uplatňovať v laboratóriu. Táto požiadavka sa nevzťahuje na laboratóriá, ktoré majú skúsenosti, t. j. majú dostupnú historickú databázu, ako sa vymedzuje v bodoch 10 – 14.
                     
                        Historické údaje o kontrolách
                     
                     V priebehu zisťovania spôsobilosti by malo laboratórium určiť:
                     
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a rozdelenie historických pozitívnych kontrol a
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a rozdelenie historických negatívnych kontrol.
                              
                           Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s rozdelením historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi týkajúcimi sa kontrol, ak takéto údaje existujú. S pridávaním ďalších experimentálnych údajov k rozdeleniu historických kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tohto rozdelenia. Historická databáza negatívnych kontrol laboratória by mala byť štatisticky solídna, aby sa zaistila schopnosť laboratória posudzovať rozdelenie jeho údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol. Na základe literatúry môže byť potrebných minimálne 10 experimentov, no bolo by vhodnejšie vykonať aspoň 20 experimentov za porovnateľných experimentálnych podmienok. Laboratóriá by mali používať metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (7)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov a preukázať, že metodika v ich laboratóriu je „pod kontrolou“. Ďalšie odporúčania k vytváraniu a využívaniu historických údajov (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného experimentu) možno nájsť v literatúre (8).
                     Ak laboratórium nevykoná dostatočný počet experimentov na vytvorenie štatisticky solídneho rozdelenia negatívnych kontrol (pozri bod 11) počas zisťovania spôsobilosti (ako sa opisuje v bode 9), je prijateľné, aby sa rozdelenie vytváralo počas prvých rutinných testov. Tento postup by mal vychádzať z odporúčaní uvedených v literatúre (8) a výsledky negatívnych kontrol získané na základe týchto experimentov by mali zostať v súlade s uverejnenými údajmi týkajúcimi sa negatívnych kontrol.
                     Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska ich vplyvu na výsledné údaje, ktoré musia zostať v súlade s existujúcou historickou databázou kontrol laboratória. K vytvoreniu novej historickej databázy kontrol by mali viesť len veľké rozdiely, ak sa na základe odborného posúdenia stanoví, že sa líši od predchádzajúceho rozdelenia (pozri bod 11). Počas tejto obnovy nemusí byť na vykonanie príslušného testu potrebná úplná databáza negatívnych kontrol, ak laboratórium vie preukázať, že jeho hodnoty súbežných negatívnych kontrol sú naďalej v súlade s jeho predchádzajúcou databázou alebo s príslušnými uverejnenými údajmi.
                     Údaje týkajúce sa negatívnych kontrol by mali zahŕňať údaje o výskyte štruktúrnych chromozómových aberácií (s výnimkou gapov) u každého zvieraťa. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí rozdelenia historickej databázy negatívnych kontrol laboratória. Ak údaje zo súbežných negatívnych kontrol nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do rozdelenia historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne odľahlými hodnotami a pokiaľ existujú dôkazy, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 11) a neexistujú žiadne dôkazy o technickom alebo ľudskom zlyhaní.
                     OPIS METÓDY
                     
                        Príprava
                     
                     
                        Výber živočíšnych druhov
                     
                     Mali by sa vyberať bežne používané laboratórne kmene zdravých mladých dospelých zvierat. Bežne sa používajú potkany, hoci vhodné môžu byť aj myši. Použiť možno akékoľvek iné vhodné druhy cicavcov, ak je to vedecky zdôvodnené v správe.
                     
                        Podmienky umiestnenia a kŕmenia zvierat
                     
                     V prípade hlodavcov by mala byť teplota v miestnosti pre zvieratá 22 °C (± 3 °C). Hoci ideálna relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %, mala by dosahovať minimálne 40 % a podľa možnosti by nemala presiahnuť 70 % okrem času čistenia miestnosti. Osvetlenie by malo byť umelé so striedaním 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie možno používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzeným prísunom pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Hlodavce by mali byť umiestnené do malých skupín (najviac päť zvierat na jednu klietku) rovnakého pohlavia a testovanej skupiny, pokiaľ sa nepredpokladá žiadne agresívne správanie, pričom sa uprednostňujú klietky s pevnou podlahou a vhodne obohateným prostredím. Zvieratá môžu byť umiestnené samostatne len vtedy, ak je to vedecky opodstatnené.
                     
                        Príprava zvierat
                     
                     Bežne sa používajú zdravé mladé dospelé zvieratá (pri hlodavcoch je ideálny vek 6 – 10 týždňov na začiatku testovania, hoci je prijateľný aj trochu vyšší vek), ktoré sa náhodne rozdelia do kontrolných a testovaných skupín. Každé zviera sa jedinečne označí humánnou, minimálne invazívnou metódou (napr. krúžkovanie, označenie štítkom, aplikácia mikročipu alebo biometrická identifikácia, nie však skracovanie uší ani prstov) a aklimatizuje sa na laboratórne podmienky v priebehu minimálne piatich dní. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Malo by sa zabrániť krížovej kontaminácii pozitívnou kontrolou a testovanou chemikáliou. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variácia zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia.
                     
                        Príprava dávok
                     
                     Tuhé testované chemikálie by sa pred podávaním dávok zvieratám mali rozpustiť alebo rozptýliť vo vhodných rozpúšťadlách alebo nosičoch alebo primiešať do krmiva alebo pitnej vody. Kvapalné testované chemikálie sa môžu podávať priamo alebo ich pred podávaním možno rozriediť. V prípade inhalačných expozícií možno testované chemikálie v závislosti od ich fyzikálno-chemických vlastností podávať vo forme plynu, pary alebo aerosólu (tuhá látka/kvapalina). Pokiaľ sa v údajoch o stabilite neuvádza prijateľnosť skladovania a nevymedzujú sa jeho vhodné podmienky, testovaná chemikália by sa mala používať čerstvo pripravená.
                     
                        Rozpúšťadlo/nosič
                     
                     Rozpúšťadlo/nosič by nemali vyvolávať toxické účinky pri používaných dávkach a nemalo by sa o nich predpokladať, že budú chemicky reagovať s testovanými chemikáliami. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podporiť referenčné údaje uvádzajúce ich kompatibilitu. Odporúča sa podľa možnosti najskôr zvážiť použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Príklady bežne používaných kompatibilných rozpúšťadiel/nosičov zahŕňajú vodu, fyziologický roztok, roztok metylcelulózy, roztok sodnej soli karboxymetylcelulózy, olivový olej a kukuričný olej. Ak neexistujú historické alebo zverejnené údaje o kontrolách, z ktorých vyplýva, že zvolené atypické rozpúšťadlo/nosič neindukuje tvorbu štruktúrnych chromozómových aberácií ani iné škodlivé účinky, mala by sa vykonať východisková štúdia s cieľom stanoviť prijateľnosť rozpúšťadla/nosiča ako kontroly.
                     
                        Kontroly
                     
                     
                        Pozitívne kontroly
                     
                     Do každého testu by sa za normálnych okolností mala zahrnúť skupina zvierat, ktorej bola podaná chemikália na pozitívnu kontrolu. Možno od toho upustiť v prípade, že testovacie laboratórium preukázalo spôsobilosť pri vykonávaní testu a stanovilo rozsah historických pozitívnych kontrol. Ak nie je zahrnutá súbežná pozitívna kontrolná skupina, do každého experimentu by sa mali zahrnúť kontroly hodnotenia (fixované a nezafarbené preparáty). Možno ich získať tak, že sa do hodnotenia štúdie zahrnú vhodné referenčné vzorky získané a uchované zo samostatného experimentu s pozitívnou kontrolou, ktorý sa vykonáva periodicky (napr. každých 6 až 18 mesiacov) v laboratóriu, kde sa test vykonáva; napríklad počas testovania spôsobilosti a potom pravidelne, podľa potreby.
                     Chemikálie na pozitívnu kontrolu by mali spoľahlivo vyvolať zistiteľný nárast frekvencie buniek so štruktúrnymi chromozómovými aberáciami nad spontánnu úroveň. Dávky pozitívnej kontroly by sa mali voliť tak, aby boli účinky zjavné, ale aby hodnotiteľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných vzoriek. Je prijateľné, aby sa pozitívne kontroly podávali inou cestou ako testovaná chemikália, na základe iného harmonogramu aplikácie, a aby sa vzorky odoberali len jeden raz. V náležitých prípadoch možno na pozitívnu kontrolu takisto zvážiť použitie chemikálií rovnakej chemickej triedy. Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu sú uvedené v tabuľke 1.
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu
                     
                     
                                 Chemikália
                              
                              
                                 Číslo CAS
                              
                           
                                 etylmetánsulfonát
                              
                              
                                 62-50-0
                              
                           
                                 metylmetánsulfonát
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                 N-etyl-N-nitrózomočovina
                              
                              
                                 759-73-9
                              
                           
                                 mitomycín C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                 cyklofosfamid (monohydrát)
                              
                              
                                 50-18-0 (6055-19-2)
                              
                           
                                 tretamín
                              
                              
                                 51-18-3
                              
                           
                        Negatívne kontroly
                     
                     Zvieratá v negatívnych kontrolných skupinách by mali byť zahrnuté do každého odberu a inak by sa s nimi malo zaobchádzať rovnako ako s testovanými skupinami, nebude im však podaná testovaná chemikália. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie použije rozpúšťadlo/nosič, kontrolná skupina by mala dostať toto rozpúšťadlo/nosič. Ak sa však na základe historických údajov o negatívnych kontrolách pri každom odbere vzoriek v danom testovacom laboratóriu preukážu konzistentné údaje o variabilite medzi zvieratami a o frekvenciách buniek so štruktúrnymi aberáciami, môže byť pre negatívnu kontrolu potrebný len jeden odber. Ak sa na negatívne kontroly použije len jeden odber, mal by to byť odber vykonaný prvý raz v štúdii.
                     POSTUP
                     
                        Počet zvierat a ich pohlavie
                     
                     Vo všeobecnosti je reakcia vo forme vzniku mikrojadier podobná u samcov a samíc (9) a očakáva sa, že to bude platiť aj v prípade štruktúrnych chromozómových aberácií, preto by sa väčšina štúdií mohla uskutočniť na oboch pohlaviach. Údaje, ktoré poukazujú na relevantné rozdiely medzi samcami a samicami (napr. rozdiely v systémovej toxicite, metabolizme, biodostupnosti, toxicite pre kostnú dreň atď. vrátane napr. štúdie na vyhľadávanie rozsahu), by boli v prospech používania oboch pohlaví. V takomto prípade môže byť vhodné vykonať štúdiu na oboch pohlaviach, a to napr. ako súčasť štúdie toxicity po opakovaných dávkach. Ak sa použijú obe pohlavia, mohlo by byť vhodné použiť faktoriálny návrh. Podrobnosti o analýze údajov s použitím tohto návrhu sú uvedené v dodatku 2.
                     Mala by sa stanoviť veľkosť skupín na začiatku štúdie s cieľom poskytnúť minimálne 5 analyzovateľných zvierat jedného pohlavia alebo, ak sa použijú zvieratá oboch pohlaví, 5 zvierat každého pohlavia za skupinu. V prípade, že expozícia ľudí chemikáliám potenciálne súvisí s pohlavím, ako napríklad v prípade niektorých liekov, daný test by sa mal vykonať na jedincoch príslušného pohlavia. Ako pomôcku pri bežných požiadavkách týkajúcich sa maximálneho počtu zvierat možno uviesť, že štúdia na kostnej dreni s dvomi odbermi vzoriek, tromi dávkovými skupinami a so súbežnými negatívnymi a pozitívnymi kontrolami (každá skupina zložená z piatich zvierat jedného pohlavia) by si vyžadovala 45 zvierat.
                     
                        Úrovne dávok
                     
                     Ak sa z dôvodu, že ešte nie sú dostupné vhodné údaje na pomoc pri výbere dávky, vykoná predbežná štúdia na vyhľadávanie rozsahu, mala by sa vykonať v tom istom laboratóriu s použitím toho istého druhu, kmeňa, pohlavia a dávkovacej schémy, aké majú byť použité v hlavnej štúdii (10). Štúdia by sa mala zamerať na zistenie maximálnej tolerovanej dávky (MTD) definovanej ako najvyššia dávka, ktorá sa bude tolerovať bez dôkazu toxicity obmedzujúcej štúdiu, a to vzhľadom na trvanie štúdie (napr. indukovaním zníženia telesnej hmotnosti alebo hematopoetickej systémovej cytotoxicity), ale nie smrti ani znakov bolesti, utrpenia či ťažkostí, ktoré si vyžadujú humánne usmrtenie (11).
                     Najvyššiu dávku možno takisto definovať ako dávku, ktorá spôsobuje určité známky toxicity v kostnej dreni.
                     Chemikálie, ktoré vykazujú saturáciu toxikokinetických vlastností alebo indukujú detoxikačné procesy, ktoré môžu viesť k zníženiu expozície po dlhodobom ovplyvňovaní, môžu byť vyňaté z kritérií na stanovenie dávok a mali by sa hodnotiť jednotlivo.
                     V záujme získania informácií o reakcii na dávku by kompletná štúdia mala zahŕňať negatívnu kontrolnú skupinu a minimálne tri úrovne dávok vo všeobecnosti oddelené faktorom 2, ale nie vyšším ako 4. Ak testovaná chemikália nevyvoláva toxicitu v štúdii na vyhľadávanie rozsahu alebo na základe existujúcich údajov, najvyššia dávka pri jednorazovom podaní by mala byť 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti. Ak však testovaná chemikália spôsobuje toxicitu, maximálna tolerovaná dávka by mala byť najvyššia podávaná dávka a použité úrovne dávky by mali podľa možnosti pokrývať rozsah od maximálnej dávky po dávku, ktorá spôsobuje slabú alebo nespôsobuje žiadnu toxicitu. Ak sa zistí toxicita v cieľovom tkanive (kostná dreň) pri všetkých testovaných úrovniach dávok, odporúča sa vykonať ďalšiu štúdiu s netoxickými dávkami. Štúdie, ktorých cieľom je podrobnejšie charakterizovať kvantitatívne informácie o reakcii na dávku, si môžu vyžadovať ďalšie dávkové skupiny. V prípade určitých druhov testovaných chemikálií (napr. humánne lieky), na ktoré sa vzťahujú osobitné požiadavky, sa tieto limity môžu líšiť.
                     
                        Limitný test
                     
                     Ak z pokusov na vyhľadávanie rozsahu dávok alebo existujúcich údajov týkajúcich sa príbuzných kmeňov zvierat vyplýva, že dávkovací režim, aspoň pokiaľ ide o limitujúcu dávku (opísanú ďalej v texte), nespôsobuje žiadne pozorovateľné toxické účinky (vrátane žiadneho poklesu proliferácie kostnej drene alebo iného dôkazu cytotoxicity v cieľovom tkanive), a ak by sa genotoxicita na základe in vitro štúdií genotoxicity alebo na základe údajov týkajúcich sa štrukturálne príbuzných chemikálií neočakávala, potom nemusí byť potrebná úplná štúdia s použitím troch úrovní dávok, ak sa preukázalo, že testovaná chemikália(-e) dosahuje cieľové tkanivo (kostná dreň). V takýchto prípadoch môže byť postačujúca jedna dávka na úrovni limitujúcej dávky. V prípade obdobia podávania chemikálie dlhšieho než 14 dní predstavuje limitujúca dávka 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň. V prípade období podávania chemikálie počas najviac 14 dní predstavuje limitujúca dávka 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň.
                     
                        Podávanie dávok
                     
                     Pri plánovaní skúšky by sa mal zvážiť predpokladaný spôsob expozície ľudí. Preto možno ako opodstatnené zvoliť spôsoby expozície prostredníctvom stravy, pitnej vody, topickou, subkutánnou cestou, intravenózne, perorálne (pomocou sondy), inhalačne, intratracheálne alebo implantačne. V každom prípade by sa mal zvoliť spôsob, ktorým sa zabezpečí primeraná expozícia cieľového tkaniva(-ív). Vo všeobecnosti sa neodporúča použitie intraperitoneálnej injekcie, keďže to nie je zamýšľaný spôsob expozície ľudí, a mal by sa použiť iba s osobitným vedeckým zdôvodnením. Ak je testovaná chemikália primiešaná do krmiva alebo pitnej vody, najmä v prípade jednej dávky, treba venovať pozornosť tomu, aby sa medzi spotrebou potravy a vody a odberom vzorky ponechal dostatočný čas na zistenie účinkov (pozri body 33 – 34). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti testovaného zvieraťa. Objem by za bežných okolností nemal prekročiť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti okrem vodných roztokov, pri ktorých možno použiť najviac 2 ml/100 g. Požitie väčších ako uvedených objemov by malo byť opodstatnené. S výnimkou dráždivých alebo žieravých testovaných chemikálií, ktoré pri vyšších koncentráciách zvyčajne vyvolajú zhoršenie účinkov, by sa variabilita v objeme testovanej chemikálie mala minimalizovať tým, že sa koncentrácia upraví tak, aby sa na všetkých úrovniach dávok zabezpečil stály objem vo vzťahu k telesnej hmotnosti.
                     
                        Harmonogram aplikácie
                     
                     Testované chemikálie sa bežne podávajú jednorazovou aplikáciou, ale možno ich podať v delenej dávke (t. j. dve alebo viaceré aplikácie v jeden deň s časovým odstupom najviac 2 – 3 hodiny), čím sa uľahčí podávanie veľkého objemu chemikálie. Za týchto okolností alebo pri podávaní testovanej chemikálie inhalačne by sa mal čas odberu vzoriek naplánovať na základe posledného podania dávky alebo skončenia vystavenia.
                     V prípade tohto testu existuje len málo dostupných údajov o vhodnosti protokolu opakovanej dávky. V prípadoch, kedy je žiaduce, aby tento test zahŕňal test toxicity po opakovaných dávkach, treba dbať na to, aby sa zabránilo strate mitotických buniek s poškodenými chromozómami, čo sa pri toxických dávkach môže stať. Táto integrácia je prijateľná, ak je najvyššia dávka väčšia alebo sa rovná limitujúcej dávke (pozri bod 29) a dávkovej skupine sa počas trvania testu podáva limitujúca dávka. Ak je žiaduca integrácia s inými štúdiami, v prípade chromozómových aberácií by sa ako preferovaný in vivo test mal posúdiť mikrojadrový test (testovacia metóda B.12).
                     Vzorky kostnej drene by sa mali odoberať v dvoch rôznych časoch po jednej aplikácii testovanej chemikálie. V prípade hlodavcov by prvým intervalom odberu vzorky mal byť čas potrebný na dokončenie 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu (zvyčajne 12 – 18 hodín) po období aplikácie chemikálie. Keďže čas potrebný na príjem a metabolizmus testovanej látky(-ok) a účinky testovanej látky na kinetiku bunkového cyklu môžu ovplyvniť optimálny čas na zistenie chromozómovej aberácie, odporúča sa neskoršie odobratie vzorky – 24 hodín po čase prvého odberu vzorky. V čase prvého odberu by sa mala všetkým dávkovým skupinám aplikovať chemikália a mali by sa odobrať vzorky na analýzu; pri neskoršom odbere(-och) je však potrebné podať len najvyššiu dávku. Ak sa na základe vedeckého zdôvodnenia používajú dávkovacie režimy dlhšie ako jeden deň, všeobecne by sa mal uskutočniť jeden odber vzorky pri približne 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po poslednej aplikácii chemikálie.
                     Po ošetrení a pred odberom vzoriek sa zvieratám intraperitoneálne vstrekne vhodná dávka prostriedku zastavujúceho metafázu (napr. kolcemid alebo kolchicín) a vzorky sa odoberú po uplynutí vhodného času. V prípade myší je tento interval približne 3 – 5 hodín pred odberom a v prípade potkanov 2 – 5 hodín. Bunky sa po odobratí z kostnej drene nechajú napučať, fixujú a farbia sa a analyzujú sa na chromozómové aberácie (12).
                     
                        Pozorovania
                     
                     Najmenej raz denne by sa mali vykonať všeobecné klinické pozorovania testovaných zvierat a zaznamenať klinické príznaky, najlepšie každý deň v rovnakom čase a s ohľadom na časový interval najintenzívnejších predpokladaných účinkov po podaní dávky. Počas obdobia podávania dávok by sa mala aspoň dvakrát denne sledovať chorobnosť a úmrtnosť zvierat. Všetky zvieratá by sa mali odvážiť na začiatku štúdie, a to aspoň raz za týždeň počas štúdií s opakovanou dávkou, a potom pri usmrtení. V prípade štúdií, ktoré trvajú aspoň jeden týždeň, by sa malo aspoň raz za týždeň vykonať meranie spotreby potravy. Ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode, spotreba vody by sa mala merať pri každej výmene vody a aspoň raz za týždeň. Zvieratá, ktoré vykazujú neletálne ukazovatele nadmernej toxicity, by mali byť humánne usmrtené pred ukončením testovacieho obdobia (11).
                     
                        Expozícia cieľového tkaniva
                     
                     Vzorka krvi by sa mala odobrať vo vhodnom čase(-och), aby bolo možné preskúmať úrovne testovaných chemikálií v plazme na účely preukázania, že došlo k expozícii kostnej drene, ak je to opodstatnené a ak neexistujú iné údaje o expozícii (pozri bod 45).
                     
                        Príprava kostnej drene a chromozómov
                     
                     Ihneď po humánnom usmrtení sa zo stehenných alebo holenných kostí zvierat odoberú bunky kostnej drene, ktoré sa vystavia pôsobeniu hypotonického roztoku a následne sa fixujú. Bunky v metafáze sa potom rozotrú na sklíčka a zafarbia sa bežnými metódami pozri [(3) (12)].
                     
                        Analýza
                     
                     Všetky preparáty vrátane pozitívnych a negatívnych kontrol by sa mali pred analýzou nezávisle označiť kódmi a mali by sa náhodne usporiadať, aby hodnotiaci nebol oboznámený s podmienkami testovania.
                     Ako meradlo cytotoxicity by sa mal stanoviť mitotický index, a to aspoň na 1 000 bunkách na jedno zviera v prípade všetkých ovplyvňovaných zvierat (vrátane pozitívnych kontrol), neovplyvňovaných alebo negatívnych kontrolných zvierat s nosičom/rozpúšťadlom.
                     V prípade každého zvieraťa by sa malo analyzovať aspoň 200 metafáz na štruktúrne chromozómové aberácie vrátane gapov a bez gapov (6). Ak historická databáza negatívnych kontrol naznačuje, že v testovacom laboratóriu je priemerná hodnota frekvencie štruktúrnych chromozómových aberácií v pozadí < 1 %, malo by sa zvážiť hodnotenie ďalších buniek. Aberácie chromatidového a chromozómového typu by sa mali zaznamenávať oddelene a klasifikovať podľa podtypov (zlomy, výmeny). Postupy používané v laboratóriu by mali zabezpečiť, aby analýzy chromozómových aberácií vykonávali dobre vyškolení hodnotiaci pracovníci a aby sa podľa potreby partnersky preskúmali. Vzhľadom na to, že pri príprave preparátov často dochádza k zlomom časti buniek v metafáze s následnou stratou chromozómov, vyhodnocované bunky by preto mali obsahovať najmenej 2n ± 2 centromér, kde n je haploidný počet chromozómov pre daný druh.
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     Údaje o jednotlivých zvieratách by sa mali uvádzať v tabuľkovej forme. V prípade každého zvieraťa by sa mal vyhodnotiť mitotický index, počet hodnotených buniek v metafáze, počet aberácií na bunku v metafáze a percentuálny podiel buniek so štruktúrnou chromozómovou aberáciou, resp. aberáciami. V prípade ovplyvňovaných a kontrolných skupín by sa mali uvádzať rôzne typy štruktúrnych chromozómových aberácií s príslušnými počtami a frekvenciami. Gapy, polyploidné bunky a bunky s endoreduplikovanými chromozómami sa zaznamenávajú oddelene. Frekvencia gapov sa zaznamenáva, ale vo všeobecnosti sa nezahŕňa do analýzy celkovej frekvencie štruktúrnych aberácií. Ak neexistujú dôkazy o rozdieloch medzi reakciami rôznych pohlaví, údaje možno na účely štatistickej analýzy kombinovať. Mali by sa uvádzať aj údaje o toxicite a klinických príznakoch u zvierat.
                     
                        Kritériá prijateľnosti
                     
                     Prijateľnosť testu určujú tieto kritériá:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Údaje o súbežných negatívnych kontrolách sa pokladajú za prijateľné na to, aby sa doplnili do historickej databázy kontrol (pozri body 11 – 14).
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Súbežné pozitívne kontroly alebo kontroly hodnotenia by mali vyvolať reakcie, ktoré sú zlučiteľné s reakciami generovanými v historickej databáze pozitívnych kontrol a viesť k štatisticky významnému nárastu v porovnaní s negatívnou kontrolou (pozri body 20 – 21).
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Vykonala sa analýza primeraného počtu dávok a buniek.
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Kritériá výberu najvyššej dávky sú v súlade s kritériami opísanými v bodoch 25 – 28.
                              
                           
                        Vyhodnotenie a interpretácia výsledkov
                     
                     Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 aspoň jedna z testovaných skupín vykazuje štatisticky významné zvýšenie frekvencie buniek so štruktúrnymi chromozómovými aberáciami (bez gapov) v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 toto zvýšenie súvisí s dávkou aspoň pri jednom odbere vzorky, keď sa posúdenie vykonáva vhodným testom trendov, a
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 niektorý z týchto výsledkov je mimo rozdelenia historických údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol (napr. mimo 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia).
                              
                           Ak sa v konkrétnom čase odberu vzorky preskúma len najvyššia dávka, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak dôjde k štatisticky významnému zvýšeniu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou a výsledky sú mimo rozdelenia historických údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol (napr. mimo 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia). Odporúčania týkajúce sa vhodných štatistických metód možno nájsť v literatúre (13). Pri vykonávaní analýzy vzťahu medzi dávkou a reakciou by sa mali analyzovať aspoň tri ovplyvňované dávkové skupiny. Pri štatistických testoch by sa malo použiť zviera ako experimentálna jednotka. Pozitívne výsledky testu na chromozómové aberácie naznačujú, že testovaná chemikália indukuje štruktúrne chromozómové aberácie v bunkách kostnej drene testovaného druhu.
                     Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, sa testovaná chemikália pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných experimentálnych podmienkach platí, že:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 žiadna z testovaných skupín nevykazuje štatisticky významné zvýšenie frekvencie buniek so štruktúrnymi chromozómovými aberáciami (bez gapov) v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 počas žiadneho odberu vzorky nedochádza k zvýšeniu závislému od dávky, ak sa vykoná posúdenie pomocou vhodného testu trendu,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 všetky výsledky sa vyskytujú v rámci rozloženia historických údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol (napr. v 95 % regulačných medziach Poissonovho rozdelenia) a
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 došlo k expozícii kostnej drene testovanej chemikálii(-ám).
                              
                           Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (13). Ako dôkaz o expozícii kostnej drene testovanej chemikálii môže slúžiť zníženie mitotického indexu alebo meranie hladín testovanej chemikálie resp. chemikálií v plazme alebo krvi. V prípade intravenózneho podania nie je potrebný dôkaz o expozícii. Alternatívne možno na preukázanie expozície kostnej drene použiť údaje ADME získané v nezávislej štúdii s použitím toho istého spôsobu podania a toho istého druhu. Negatívne výsledky naznačujú, že za daných testovacích podmienok testovaná chemikália neindukuje štruktúrne chromozómové aberácie v bunkách kostnej drene testovaného druhu.
                     Overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie sa nevyžaduje.
                     V prípade, že reakcia nie je jednoznačne negatívna alebo pozitívna, a v prípade, že ide o pomoc pri stanovovaní biologickej relevantnosti výsledku (napr. slabé alebo hraničné zvýšenie), by sa údaje mali odborne posúdiť a/alebo by sa existujúce vykonané pokusy mali podrobiť ďalšiemu skúmaniu. V niektorých prípadoch by mohlo byť užitočné vykonať analýzu viacerých buniek alebo zopakovať experiment za upravených experimentálnych podmienok.
                     V zriedkavých prípadoch, dokonca ani po ďalších skúmaniach, z údajov nemožno vyvodiť záver, že testovaná chemikália vedie k negatívnym alebo pozitívnym výsledkom, a preto sa štúdia uzavrie ako štúdia s nejasným výsledkom.
                     Frekvencia výskytu polyploidných, ako aj endoreduplikovaných metafáz medzi všetkými metafázami by sa mala zaznamenávať oddelene. Nárast počtu polyploidných/endoreduplikovaných buniek môže naznačovať, že testovaná chemikália má potenciál brzdiť mitotické procesy alebo postup bunkového cyklu (pozri bod 3).
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:
                     
                        Zhrnutie
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita testovanej chemikálie, ak je známa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Jednozložková látka:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             chemická identifikácia ako názov IUPAC alebo názov CAS, CAS číslo, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt podľa vhodnosti a praktickej realizovateľnosti atď.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Viaczložková látka, UVCB a zmesi:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             čo najviac charakterizované chemickou identitou (pozri vyššie), kvantitatívnym výskytom a príslušnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami zložiek.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Príprava testovanej chemikálie:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie výberu nosiča,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             príprava krmiva, pitnej vody alebo inhalačných prípravkov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analytické stanovenie prípravkov (napr. stabilita, homogenita, nominálne koncentrácie), ak bolo vykonané.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované zvieratá:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý druh/kmeň a zdôvodnenie použitia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet, vek a pohlavie zvierat,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda jedinečnej identifikácie zvierat,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade krátkodobých štúdií: hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku a na konci testu, v prípade štúdií dlhších ako jeden týždeň: hmotnosť jednotlivých zvierat počas štúdie a konzumácie potravy. V prípade každej skupiny by sa mal uviesť aj rozsah telesnej hmotnosti, priemer a štandardná odchýlka.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             pozitívne a negatívne (rozpúšťadlo/nosič) kontroly,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje zo štúdie na vyhľadávanie rozsahu, ak sa vykonala,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odôvodnenie výberu veľkosti dávky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o príprave testovanej chemikálie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie cesty a trvania podávania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy overovania, že testovaná chemikália resp. chemikálie dosiahli veľký krvný obeh alebo kostnú dreň,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             skutočná dávka (mg/kg telesnej hmotnosti/deň) vypočítaná z koncentrácie testovanej chemikálie (ppm) v krmive/pitnej vode a zo spotreby krmiva/pitnej vody, ak sa uplatňuje,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o kvalite potravy a vody,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             spôsob usmrtenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda analgézie (v prípade použitia),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobný opis harmonogramu aplikácie chemikálie a odberu vzoriek a zdôvodnenie volieb,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy prípravy preparátov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy merania toxicity,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identita chemikálie zastavujúcej metafázu, jej koncentrácia, dávka a čas podania pred odberom vzoriek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             postupy izolácie a uchovávania vzoriek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá pre hodnotenie aberácií,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet analyzovaných buniek v metafáze na jedno zviera a počet analyzovaných buniek na určenie mitotického indexu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá prijateľnosti štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá pre považovanie štúdií za pozitívne, negatívne alebo nejednoznačné.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             stav zvieraťa pred testovaním a počas obdobia testovania vrátane príznakov toxicity,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             mitotický index uvedený oddelene pre každé zviera,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a počet aberácií a buniek s aberáciami uvedený oddelene pre každé zviera,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             celkový počet aberácií na skupinu s priemerom a štandardnou odchýlkou,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet buniek s aberáciami na skupinu s priemerom a štandardnou odchýlkou,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zmeny v ploídii, ak sa pozorovali, vrátane frekvencie polyploidných a/alebo endoreduplikovaných buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je možné ho určiť,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použité štatistické analýzy a štatistická metóda,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje na podporu výskytu expozície kostnej drene,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o súbežných negatívnych a pozitívnych kontrolách s rozsahmi, priemermi a štandardnými odchýlkami,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             historické údaje týkajúce sa pozitívnych a negatívnych kontrol, ich rozsahy, priemery, štandardné odchýlky a 95 % regulačné medze rozdelenia, ako aj príslušné časové obdobie a počet pozorovaní,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             splnené kritériá pre pozitívne alebo negatívne reakcie.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky a diskusia
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Odkazy
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Adler, I.D. (1984), “Cytogenetic Tests in Mammals”, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Aneuploidia
                           : akákoľvek odchýlka od bežného diploidného (alebo haploidného) počtu chromozómov vo forme jedného alebo viacerých chromozómov, nie však vo forme viacnásobkov celého(-ých) súboru(-ov) chromozómov (pozri polyploidia).
                        
                           
                              Centroméra
                           : oblasť(-ti) chromozómu, v ktorej(-ých) sa vlákna deliaceho vretienka pripájajú k chromozómu počas delenia bunky a ktorá(-é) umožňuje(-ú) riadny pohyb dcérskych chromozómov k pólom dcérskych buniek.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Aberácia chromatidového typu
                           : štruktúrne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako zlom jednej z chromatíd alebo zlom a opätovné spojenie medzi chromatídami.
                        
                           
                              Aberácia chromozómového typu
                           : štruktúrne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako zlom alebo zlom a opätovné spojenie oboch chromatíd na rovnakej strane.
                        
                           
                              Endoreduplikácia
                           : proces, v ktorom po S fáze replikácie DNA jadro neprechádza do mitózy, ale začína ďalšiu S fázu. Výsledkom sú chromozómy so 4, 8, 16... chromatídami.
                        
                           
                              Gap
                           : achromatická lézia menšia ako šírka jednej chromatídy s minimálnym posunutím chromatíd.
                        
                           
                              Mitotický index
                           : pomer medzi počtom buniek v mitóze a celkovým počtom buniek v populácii, ktorý je meradlom stavu proliferácie tejto bunkovej populácie.
                        
                           
                              Numerická aberácia
                           : zmena v počte chromozómov v porovnaní s bežným počtom charakteristickým pre použité zvieratá (aneuploidia).
                        
                           
                              Polyploidia
                           : numerická chromozómová aberácia, ktorá zahŕňa zmenu počtu celých súborov chromozómov, na rozdiel od numerickej zmeny v časti súboru chromozómov (pozri aneuploidia).
                        
                           
                              Štruktúrna chromozómová aberácia
                           : zmena v chromozómovej štruktúre rozpoznateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia buniek, pozorovaná ako delécie a fragmenty, intrachromozomálne výmeny alebo interchromozomálne výmeny.
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           FAKTORIÁLNY NÁVRH NA IDENTIFIKÁCIU ROZDIELOV MEDZI POHLAVIAMI V IN VIVO SKÚŠKE NA CHROMOZÓMOVÚ ABERÁCIU
                        
                        
                           Faktoriálny návrh a jeho analýza
                        
                        Na základe tohto návrhu sa testuje minimálne 5 samcov a 5 samíc pri každej úrovni koncentrácie, čo vedie k návrhu s použitím minimálne 40 zvierat (20 samčekov a 20 samičiek, plus príslušné pozitívne kontroly).
                        Uvedený návrh, ktorý predstavuje jeden z jednoduchších faktoriálnych návrhov, je ekvivalentný s dvojfaktorovou analýzou rozptylu, pričom pohlavie a úroveň koncentrácie sú hlavnými účinkami. Údaje možno analyzovať použitím mnohých štandardných softvérových balíkov pre štatistiku, ako sú napr. SPSS, SAS, STATA, Genstat, ako aj pomocou „R“.
                        Pomocou analýzy sa variabilita v súbore údajov rozdelí na variabilitu medzi pohlaviami, variabilitu medzi koncentráciami a variabilitu v súvislosti s interakciou medzi pohlaviami a koncentráciami. Každá z podmienok sa testuje voči odhadu variability medzi paralelnými zvieratami v rámci skupín zvierat rovnakého pohlavia pri rovnakej koncentrácii. Podrobné informácie o použitej metodike sú dostupné v mnohých štandardných štatistických príručkách (pozri odkazy) a v rámci podpory poskytnutej v balíkoch pre štatistiku.
                        Analýza prebieha formou preskúmania podmienky interakcie medzi pohlavím a koncentráciou v tabuľke ANOVA (5). Ak nenastane výrazná interakcia kombinovaných hodnôt (obe pohlavia a rôzne koncentrácie testovanej látky), platné štatistické testy ANOVA poskytnú informáciu o významnosti rozdielov medzi porovnávanými skupinami a parametrami na základe ich vnútornej variability.
                        Analýza pokračuje rozdelením odhadovaných hodnôt pre variabilitu medzi koncentráciami na kontrasty, ktoré umožňujú testovanie na lineárne a kvadratické kontrasty reakcií pri všetkých úrovniach koncentrácií. Ak existuje významná interakcia medzi pohlavím a koncentráciou, možno túto podmienku rozdeliť aj na kontrast interakcie medzi lineárnou hodnotou a pohlavím a kontrast interakcie medzi kvadratickou hodnotou a pohlavím. Tieto podmienky umožňujú testovanie toho, či sú reakcie na koncentráciu u oboch pohlaví rovnaké, alebo či je reakcia každého pohlavia rozdielna.
                        Na základe odhadov týkajúcich sa združených údajov v rámci skupinovej variability možno vykonať párové testy na zistenie rozdielu medzi priemernými hodnotami. Tieto porovnania by sa mohli vykonať medzi priemernými hodnotami pre obe pohlavia a medzi priemernými hodnotami pre rôzne úrovne koncentrácie, ako sú napríklad porovnania s úrovňami negatívnych kontrol. V prípadoch, keď dochádza k významnej interakcii, možno vykonať porovnania medzi priemernými hodnotami rôznych koncentrácií v rámci jedného pohlavia alebo medzi priemernými hodnotami pohlaví pri rovnakej koncentrácii.
                        
                           Odkazy
                        
                        Existuje mnoho štatistických príručiek, v ktorých sa rozoberá teória, návrh, metodika, analýza a výklad faktoriálnych návrhov počnúc najjednoduchšími dvojfaktorovými analýzami po komplexnejšie formy používané v metodike plánovania experimentu. Ide o tento neúplný zoznam. Niektoré knihy poskytujú spracované príklady porovnateľných návrhov, v niektorých prípadoch s kódom na vykonanie analýz pomocou rôznych softvérových balíkov.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     5.
                  
                  
                     V časti B sa kapitola B.12 nahrádza takto:
                     „B.12.   Mikrojadrový (mikronukleový) test na erytrocytoch cicavcov
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 474 (2016). Je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. Bol vypracovaný dokument OECD, ktorý obsahuje stručné informácie o testovaní v oblasti genetickej toxikológie a prehľad posledných zmien, ktoré sa vykonali v týchto usmerneniach na vykonávanie testov (1).
                     Tento in vivo mikrojadrový test na cicavcoch je osobitne relevantný pre hodnotenie genotoxicity, pretože faktory in vivo metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA sú aktívne a prispievajú k reakciám, hoci sú v prípade rôznych druhov odlišné. In vivo skúška je takisto užitočná pre ďalšie skúmanie genotoxicity zistenej pomocou in vitro systému.
                     
                        In vivo mikrojadrový test na cicavcoch sa používa na zisťovanie poškodenia vyvolaného testovanou chemikáliou na chromozómoch alebo mitotickom aparáte erytroblastov. Testom sa hodnotí tvorba mikrojadier v erytrocytoch odobratých buď z kostnej drene alebo z periférnych krvných buniek zvierat, zvyčajne hlodavcov.
                     Účelom mikrojadrového testu je identifikovať chemikálie spôsobujúce cytogenetické poškodenie, ktorého výsledkom je tvorba mikrojadier obsahujúcich buď oneskorené chromozómové fragmenty alebo celé chromozómy.
                     Keď sa erytroblast kostnej drene vyvinie na nezrelý erytrocyt (niekedy sa uvádza aj ako polychromatický erytrocyt alebo retikulocyt), hlavné jadro sa vypudzuje; akékoľvek mikrojadro, ktoré sa vytvorilo, môže zostať v cytoplazme. Vizualizácia alebo detekcia mikrojadier je v týchto bunkách jednoduchšia, pretože nemajú hlavné jadro. Zvýšenie frekvencie nezrelých erytrocytov s mikrojadrami u ovplyvnených zvierat je indikáciou vyvolaných štruktúrnych alebo numerických chromozómových aberácií.
                     Novovytvorené erytrocyty s mikrojadrami sa identifikujú a ich počty sa stanovujú farbením, po ktorom nasleduje buď vizuálne hodnotenie pomocou mikroskopu alebo automatická analýza. Použitie automatizovanej hodnotiacej platformy značne uľahčuje počítanie dostatočného množstva nezrelých erytrocytov v periférnej krvi alebo v kostnej dreni dospelých zvierat. Takéto platformy sú prijateľnými alternatívami manuálneho hodnotenia (2). Porovnávacie štúdie ukázali, že takéto metódy s použitím vhodných kalibračných štandardov môžu priniesť lepšiu vnútrolaboratórnu a medzilaboratórnu reprodukovateľnosť a citlivosť než manuálne mikroskopické hodnotenie (3) (4). Automatizované systémy, ktoré dokážu merať frekvencie erytrocytov s mikrojadrami, zahŕňajú, nie sú však obmedzené na prietokové cytometre (5), platformy obrazovej analýzy (6) (7) a laserové skenovacie cytometre (8).
                     Hoci to nie je bežnou súčasťou testu, chromozómové fragmenty možno odlíšiť od celých chromozómov na základe niekoľkých kritérií. Tieto kritériá zahŕňajú identifikáciu prítomnosti alebo neprítomnosti kinetochoru alebo centromerickej DNA, ktoré sú charakteristické pre neporušené chromozómy. Neprítomnosť kinetochoru alebo centromerickej DNA naznačuje, že mikrojadro obsahuje len fragmenty chromozómov, zatiaľ čo ich prítomnosť je príznačná pre stratu chromozómov.
                     Použité definície termínov sú uvedené v dodatku 1.
                     ÚVODNÉ ÚVAHY
                     Cieľovým tkanivom pre genetické poškodenie v tomto teste je kostná dreň mladých dospelých hlodavcov, keďže erytrocyty sa tvoria v tomto tkanive. Meranie mikrojadier v nezrelých erytrocytoch v periférnej krvi je prijateľné aj u iných druhov cicavcov, v prípade ktorých bola preukázaná primeraná citlivosť na detekciu chemikálií spôsobujúcich štruktúrne alebo numerické chromozómové aberácie v týchto bunkách (indukciou vzniku mikrojadier v nezrelých erytrocytoch) a v prípade ktorých je poskytnuté vedecké zdôvodnenie. Hlavným sledovaným parametrom je frekvencia nezrelých erytrocytov s mikrojadrami. Frekvenciu zrelých erytrocytov obsahujúcich mikrojadrá v periférnej krvi možno takisto použiť ako sledovaný parameter pri druhoch bez silného vychytávania buniek s mikrojadrami v slezine a v prípade, že sú zvieratá ovplyvňované nepretržite počas obdobia, ktoré presahuje životnosť erytrocytov u použitých druhov (napr. 4 alebo viac týždňov v prípade myší).
                     Ak existujú dôkazy, že testovaná(-é) chemikália(-e) alebo jej/ich metabolit(-y) nedosiahne(-u) cieľové tkanivo, nemusí byť vhodné použiť tento test.
                     Pred použitím testovacej metódy v prípade zmesi s cieľom generovať údaje pre stanovený regulačný účel by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tento účel, a ak môže, malo by sa to zdôvodniť. Takéto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.
                     PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY
                     Zvieratá sú vystavené testovanej chemikálii vhodným spôsobom. Ak sa používa kostná dreň, zvieratá sa vo vhodnom(-ých) čase(-och) po ovplyvnení humánnym spôsobom utratia, odoberie sa kostná dreň a pripravia a zafarbia sa preparáty (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)sa. Ak sa používa periférna krv, odoberá sa vo vhodnom(-ých) čase(-och) po ovplyvnení a pripravia a zafarbia sa preparáty (12) (16) (17) (18). Ak sa ovplyvnenie vykoná akútne, je dôležité zvoliť časy odberu kostnej drene alebo krvi, kedy možno zistiť indukciu nezrelých erytrocytov s mikrojadrami súvisiacu s ovplyvnením. V prípade odberu periférnej krvi musí takisto ubehnúť dostatočný čas na to, aby sa tieto javy objavili v krvnom obehu. Preparáty sa analyzujú na prítomnosť mikrojadier buď vizualizáciou pod mikroskopom, obrazovou analýzou, prietokovou cytometriou alebo laserovou skenovacou cytometriou.
                     OVEROVANIE SPÔSOBILOSTI LABORATÓRIA
                     
                        Zisťovanie spôsobilosti
                     
                     S cieľom potvrdiť dostatočné skúsenosti s vykonávaním skúšky pred jej použitím na rutinné testovanie by laboratórium malo preukázať schopnosť reprodukovať predpokladané výsledky zo zverejnených údajov (17) (19) (20) (21) (22), pokiaľ ide o frekvenciu výskytu mikrojadier, s minimálne dvoma chemikáliami na pozitívnu kontrolu (vrátane slabých reakcií vyvolaných nízkymi dávkami pozitívnych kontrol), ako sú chemikálie uvedené v tabuľke 1, a s kompatibilnými kontrolami nosiča/rozpúšťadla (pozri bod 26). Pri týchto pokusoch by sa mali používať dávky, ktoré vyvolajú reprodukovateľný a od dávky závislý nárast účinku a preukážu citlivosť a dynamický rozsah testovacieho systému v predmetnom tkanive (kostná dreň alebo periférna krv), pričom sa použije metóda hodnotenia, ktorá sa má uplatňovať v laboratóriu. Táto požiadavka sa nevzťahuje na laboratóriá, ktoré majú skúsenosti, t. j. majú dostupnú historickú databázu, ako sa vymedzuje v bodoch 14 – 18.
                     
                        Údaje o historických kontrolách
                     
                     V priebehu zisťovania spôsobilosti by malo laboratórium určiť:
                     
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a rozdelenie historických pozitívnych kontrol a
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a rozdelenie historických negatívnych kontrol.
                              
                           Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s rozdelením historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi o kontrolách, ak takéto údaje existujú. S pridávaním ďalších údajov k rozdeleniu historických kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tohto rozdelenia. Databáza historických negatívnych kontrol laboratória by mala byť štatisticky solídna, aby sa laboratóriu zabezpečila možnosť posudzovať rozdelenie svojich údajov o negatívnych kontrolách. Na základe literatúry môže byť potrebných minimálne 10 pokusov, no bolo by vhodnejšie vykonať aspoň 20 pokusov za porovnateľných podmienok. Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (23)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov a preukázať, že metodika je v laboratóriu „pod kontrolou“. Ďalšie odporúčania ako vytvárať a využívať historické údaje (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného pokusu) možno nájsť v literatúre (24).
                     Ak laboratórium nevykoná dostatočný počet pokusov na vytvorenie štatisticky solídneho rozdelenia negatívnych kontrol (pozri bod 15) počas zisťovania spôsobilosti (ako sa opisuje v bode 13), je prijateľné, aby sa rozdelenie mohlo vytvárať počas prvých rutinných testov. Tento postup by mal vychádzať z odporúčaní uvedených v literatúre (24) a výsledky negatívnych kontrol získané na základe týchto pokusov by mali zostať v súlade s uverejnenými údajmi o negatívnych kontrolách.
                     Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska ich vplyvu na výsledné údaje, ktoré musia zostať v súlade so súčasnou databázou historických kontrol v laboratóriu. K vytvoreniu novej databázy historických kontrol by mali viesť len veľké rozdiely, ak sa na základe odborného posúdenia zistí, že sa líši od predchádzajúceho rozdelenia (pozri bod 15). Počas tejto obnovy nemusí byť potrebná úplná databáza negatívnych kontrol na vykonanie príslušného testu, ak vie laboratórium preukázať, že jeho hodnoty súbežných negatívnych kontrol sú naďalej v súlade s jeho predchádzajúcou databázou alebo s príslušnými uverejnenými údajmi.
                     Údaje o negatívnych kontrolách by mali zahŕňať údaje o výskyte nezrelých erytrocytov s mikrojadrami v každom zvierati. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí rozdelenia databázy historických negatívnych kontrol laboratória. Ak údaje o súbežných negatívnych kontrolách nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do rozdelenia historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne mimo uvedených medzí a pokiaľ existujú dôkazy, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 15) a neexistujú žiadne dôkazy o technickom alebo ľudskom zlyhaní.
                     OPIS METÓDY
                     
                        Príprava
                     
                     
                        Výber živočíšnych druhov
                     
                     Mali by sa vyberať bežne používané laboratórne kmene zdravých mladých dospelých zvierat. Použiť možno myši, potkany alebo iné vhodné druhy cicavcov. Ak sa používa periférna krv, musí byť preukázané, že odstránenie buniek s mikrojadrami z krvného obehu uskutočnené v slezine neovplyvní detekciu indukovaných mikrojadier vo vybraných druhoch. Toto bolo jasne preukázané v prípade periférnej krvi myší a potkanov (2). V správe by malo byť poskytnuté vedecké zdôvodnenie použitia iných druhov než potkanov a myší. Ak sa použijú iné druhy než hlodavce, odporúča sa, aby sa meranie indukovaných mikrojadier začlenilo do iného vhodného testu toxicity.
                     
                        Podmienky umiestnenia a kŕmenia zvierat
                     
                     V prípade hlodavcov by mala byť teplota v miestnosti pre zvieratá 22 °C (± 3 °C). Hoci ideálna relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %, mala by dosahovať minimálne 40 % a podľa možnosti by nemala presiahnuť 70 % inokedy než počas čistenia miestnosti. Osvetlenie by malo byť umelé so striedaním 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzeným prísunom pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Hlodavce by mali byť umiestnené do malých skupín (najviac päť zvierat na jednu klietku) rovnakého pohlavia a ovplyvnenej skupiny, pokiaľ sa nepredpokladá žiadne agresívne správanie, pričom sa uprednostňujú klietky s pevnou podlahou a vhodne obohateným prostredím. Zvieratá môžu byť umiestnené samostatne len vtedy, ak je to vedecky opodstatnené.
                     
                        Príprava zvierat
                     
                     Bežne sa používajú zdravé mladé dospelé zvieratá (pri hlodavcoch je ideálny vek 6 – 10 týždňov na začiatku ovplyvňovania, hoci je prijateľný aj trochu vyšší vek), ktoré sa náhodne rozdelia do kontrolných a ovplyvnených skupín. Každé zviera sa jednotlivo označí humánnou, minimálne invazívnou metódou (napr. krúžkovanie, označenie štítkom, aplikácia mikročipu alebo biometrická identifikácia, nie však skracovanie uší ani prstov) a aklimatizuje sa na laboratórne podmienky v priebehu minimálne piatich dní. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Malo by sa zabrániť krížovej kontaminácii pozitívnou kontrolou a testovanou chemikáliou. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variabilita zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia.
                     
                        Príprava dávok
                     
                     Tuhé testované chemikálie by sa pred podávaním dávok zvieratám mali rozpustiť alebo rozptýliť vo vhodných rozpúšťadlách alebo nosičoch alebo primiešať do krmiva alebo pitnej vody. Kvapalné testované chemikálie sa môžu podávať priamo alebo ich pred podávaním možno rozriediť. V prípade inhalačných expozícií možno testované chemikálie v závislosti od ich fyzikálno-chemických vlastností podávať vo forme plynu, pary alebo aerosólu (tuhá látka/kvapalina). Pokiaľ sa v údajoch o stabilite neuvádza prijateľnosť skladovania a nevymedzujú sa jeho vhodné podmienky, testovaná chemikália by sa mala používať čerstvo pripravená.
                     
                        Podmienky testu
                     
                     
                        Rozpúšťadlo/nosič
                     
                     Rozpúšťadlo/nosič by nemali vyvolávať toxické účinky pri používaných dávkach a nemali by mať schopnosť chemicky reagovať s testovanou chemikáliou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podporiť referenčné údaje uvádzajúce ich kompatibilitu. Odporúča sa podľa možnosti najskôr zvážiť použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Príklady bežne používaných kompatibilných rozpúšťadiel/nosičov zahŕňajú vodu, fyziologický roztok, roztok metylcelulózy, roztok sodnej soli karboxymetylcelulózy, olivový olej a kukuričný olej. Ak neexistujú historické alebo zverejnené údaje o kontrolách, z ktorých vyplýva, že zvolené atypické rozpúšťadlo/nosič neindukuje tvorbu mikrojadier ani iné škodlivé účinky, mala by sa vykonať východisková štúdia s cieľom stanoviť prijateľnosť kontroly rozpúšťadla/nosiča.
                     
                        Kontroly
                     
                     
                        Pozitívne kontroly
                     
                     Do každého testu by sa za normálnych okolností mala zahrnúť skupina zvierat ovplyvnená chemikáliou na pozitívnu kontrolu. Možno od toho upustiť v prípade, že skúšobné laboratórium preukázalo spôsobilosť pri vykonávaní testu a stanovilo rozsah historických pozitívnych kontrol. Ak nie je zahrnutá súbežná pozitívna kontrolná skupina, do každého pokusu by sa mali zahrnúť kontroly hodnotenia (fixované a nezafarbené podložné sklíčka alebo vzorky bunkovej suspenzie, podľa toho, čo je pre danú metódu hodnotenia vhodné). Možno ich získať tak, že sa do hodnotenia štúdie zahrnú vhodné referenčné vzorky získané a uchované zo samostatného pokusu s pozitívnou kontrolou, ktorý sa vykonáva periodicky (napr. každých 6 až 18 mesiacov); napríklad počas testovania spôsobilosti a potom pravidelne, podľa potreby.
                     Chemikálie na pozitívnu kontrolu by mali spoľahlivo vyvolať zistiteľný nárast frekvencie mikrojadier nad spontánnu úroveň. Pri manuálnom hodnotení pomocou mikroskopu by sa dávky pozitívnej kontroly mali zvoliť tak, aby boli účinky zjavné, ale aby hodnotiteľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných vzoriek. Je prijateľné, aby sa pozitívne kontroly podávali inou cestou ako testovaná chemikália, na základe iného harmonogramu ovplyvňovania a aby sa vzorky odoberali len jeden raz. V náležitých prípadoch možno na pozitívnu kontrolu takisto zvážiť použitie chemikálií rovnakej chemickej triedy. Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu sú uvedené v tabuľke 1
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu:
                     
                     Chemikálie a CAS čísla
                     etyl-metánsulfonát [CAS číslo 62-50-0]
                     metyl-metánsulfonát [CAS číslo 66-27-3]
                     N-etyl-N-nitrózomočovina [CAS číslo 759-73-9]
                     mitomycín C [CAS číslo 50-07-7]
                     cyklofosfamid (monohydrát) [CAS číslo 50-18-0 (CAS číslo 6055-19-2)]
                     tretamín [CAS číslo 51-18-3]
                     kolchicín [CAS číslo 64-86-8] alebo vinblastín [CAS číslo 865-21-4] – ako aneugény
                     
                        Negatívne kontroly
                     
                     Zvieratá v negatívnych kontrolných skupinách by mali byť zahrnuté do každého odberu a inak by sa s nimi malo zaobchádzať rovnako ako s ovplyvnenými skupinami, nebudú však ovplyvnené testovanou chemikáliou. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie použije rozpúšťadlo/nosič, kontrolná skupina by mala dostať toto rozpúšťadlo/nosič. Ak sa však na základe historických údajov negatívnych kontrol pri každom odbere vzoriek v danom skúšobnom laboratóriu preukážu konzistentné údaje o variabilite medzi zvieratami a o frekvenciách buniek s mikrojadrami, môže byť pre negatívnu kontrolu potrebný len jeden odber. Ak sa na negatívne kontroly použije len jeden odber, mal by to byť odber vykonaný prvý raz v tejto štúdii.
                     Ak sa použije periférna krv, je namiesto súbežnej negatívnej kontroly prijateľná vzorka pred ovplyvnením, a to v prípade krátkych štúdií, keď sú výsledné údaje v súlade s databázou historických kontrol skúšobného laboratória. Preukázalo sa, že v prípade potkanov má odber vzoriek malých objemov (napr. menej ako 100 μl/deň) pred ovplyvnením minimálny vplyv na frekvenciu mikrojadier v pozadí (25).
                     POSTUP
                     
                        Počet zvierat a ich pohlavie
                     
                     Vo všeobecnosti je reakcia vo forme mikrojadier u samcom a samíc podobná, a preto by sa väčšina štúdií mohla vykonávať so zvieratami ktoréhokoľvek pohlavia (26). Údaje, ktoré preukazujú relevantné rozdiely medzi samcami a samicami (napr. rozdiely v systémovej toxicite, metabolizme, biodostupnosti, toxicite kostnej drene atď. vrátane napr. štúdie na zistenie rozsahu), by boli v prospech používania oboch pohlaví. V takomto prípade môže byť vhodné vykonať štúdiu na oboch pohlaviach, a to napr. ako súčasť štúdie toxicity pri opakovaných dávkach. Ak sa použijú obe pohlavia, mohlo by byť vhodné použiť faktoriálny návrh. Podrobnosti o analýze údajov s použitím tohto návrhu sú uvedené v dodatku 2.
                     Mala by sa stanoviť veľkosť skupín na začiatku štúdie s cieľom poskytnúť minimálne 5 analyzovateľných zvierat jedného pohlavia alebo, ak sa použijú zvieratá oboch pohlaví, 5 z každého pohlavia za skupinu. Ak je možné, že vystavenie ľudí účinkom chemikálií závisí od pohlavia, ako napríklad v prípade niektorých liekov, test by sa mal vykonať na jedincoch príslušného pohlavia. Ako smerná hodnota v prípade bežných požiadaviek na maximálny počet zvierat by štúdia kostnej drene vykonaná podľa parametrov stanovených v bode 37 s troma dávkovými skupinami a so súbežnými negatívnymi a pozitívnymi kontrolami (každá skupina zložená z piatich zvierat jedného pohlavia) vyžadovala 25 a 35 zvierat.
                     
                        Úrovne dávok
                     
                     Ak sa z dôvodu, že ešte nie sú dostupné vhodné údaje na pomoc pri výbere dávky, vykoná predbežná štúdia na zistenie rozsahu, mala by sa vykonať v tom istom laboratóriu s použitím toho istého druhu, kmeňa, pohlavia a dávkovacej schémy, aké majú byť použité v hlavnej štúdii (27). Štúdia by sa mala zamerať na zistenie maximálnej tolerovanej dávky (MTD) definovanej ako najvyššia dávka, ktorá sa bude tolerovať bez dôkazu toxicity obmedzujúcej štúdiu, a to vzhľadom na trvanie štúdie [napr. indukovaním zníženia telesnej hmotnosti alebo hematopoetickej systémovej cytotoxicity, ale nie smrti ani znakov bolesti, utrpenia či stavu, ktorý si vyžaduje humánnu eutanáziu (28)].
                     Najvyššiu dávku možno takisto definovať ako dávka, ktorá spôsobuje toxicitu v kostnej dreni (napr. zníženie podielu nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov v kostnej dreni alebo v periférnej krvi o viac než 50 %, no nie na menej než 20 % kontrolnej hodnoty). Pri analýze CD71 pozitívnych buniek v periférnom krvnom obehu (t. j. prietokovou cytometrickou analýzou) však táto veľmi mladá frakcia nezrelých erytrocytov reaguje na toxické výzvy rýchlejšie než väčší RNA pozitívny kohort nezrelých erytrocytov. Preto môže byť zjavná vyššia toxicita evidentná pri plánoch akútnej expozície na skúmanie frakcie CD71 pozitívnych nezrelých erytrocytov v porovnaní s tými, ktoré označujú nezrelé erytrocyty na základe obsahu RNA. Z tohto dôvodu, ak v rámci pokusov prebieha ovplyvnenie päť alebo menej dní, najvyššiu dávku testovaných chemikálií spôsobujúcich toxicitu možno definovať ako dávku, ktorá spôsobuje štatisticky významné zníženie podielu CD71 pozitívnych nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov, no nie na menej než 5 % kontrolnej hodnoty (29).
                     Chemikálie, ktoré vykazujú saturáciu toxikokinetických vlastností alebo indukujú detoxikačné procesy, ktoré môžu viesť k zníženiu expozície po dlhodobom podávaní, môžu byť vyňaté z kritérií na stanovenie dávok a mali by sa hodnotiť jednotlivo.
                     Na získanie informácií o reakcii na dávku by kompletná štúdia mala zahŕňať negatívnu kontrolnú skupinu a minimálne tri úrovne dávok vo všeobecnosti oddelené faktorom 2, ale nie vyšším ako 4. Ak testovaná chemikália nevyvoláva na základe štúdie na zistenie rozsahu alebo na základe existujúcich údajov toxicitu, najvyššia dávka pri 14-dňovom alebo dlhšom období podávania by mala byť 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň alebo 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň v prípade obdobia podávania kratšieho ako 14 dní. Ak však testovaná chemikália spôsobuje toxicitu, maximálna tolerovaná dávka by mala byť najvyššia podávaná dávka a použité úrovne dávky by mali podľa možnosti pokrývať rozsah od maximálnej dávky po dávku, ktorá spôsobuje slabú alebo nespôsobuje žiadnu toxicitu. Ak sa zistí toxicita v cieľovom tkanive (kostná dreň) pri všetkých testovaných úrovniach dávok, odporúča sa vykonanie ďalšej štúdie s netoxickými dávkami. Štúdie, ktorých cieľom je podrobnejšie charakterizovať kvantitatívne informácie o reakcii na dávku, môžu vyžadovať dodatočné dávkové skupiny. V prípade určitých druhov testovaných chemikálií (napr. humánne lieky), na ktoré sa vzťahujú osobitné požiadavky, sa tieto limity môžu líšiť.
                     
                        Limitný test
                     
                     Ak pokusy na stanovenie rozsahu dávok alebo existujúce údaje týkajúce sa súvisiacich kmeňov zvierat naznačujú, že dávkovacia schéma, aspoň pokiaľ ide o limitujúcu dávku (opísanú ďalej v texte), nespôsobuje žiadne pozorovateľné toxické účinky, (vrátane žiadneho poklesu proliferácie kostnej drene ani iný dôkaz cytotoxicity v cieľovom tkanive), a ak by sa genotoxicita na základe in vitro štúdií genotoxicity alebo na základe údajov týkajúcich sa štrukturálne príbuzných chemikálií neočakávala, potom nemusí byť potrebná úplná štúdia s použitím troch úrovní dávok, ak sa ukázalo, že testovaná(-é) chemikália(-e) dosahuje(-ú) cieľové tkanivo (kostná dreň). V takýchto prípadoch môže byť postačujúca jedna dávka na úrovni limitujúcej dávky. Ak sa chemikália podáva počas 14 dní alebo dlhšie, limitujúca dávka predstavuje 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň. V prípade období podávania chemikálie kratších než 14 dní predstavuje limitujúca dávka 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň.
                     
                        Podávanie dávok
                     
                     Pri plánovaní skúšky by sa mal zvážiť predpokladaný spôsob vystavenia ľudí. Preto možno zvoliť spôsoby vystavenia, ako napríklad prostredníctvom stravy, pitnej vody, topickou, subkutánnou cestou, intravenózne, perorálne (pomocou sondy), inhalačne, intratracheálne alebo implantačne, ako opodstatnené spôsoby. V každom prípade by sa mal zvoliť spôsob, ktorým sa zabezpečí primeraná vystavenie cieľového(-ých) tkaniva(-ív). Vo všeobecnosti sa neodporúča použitie intraperitoneálnej injekcie, keďže to nie je zamýšľaný spôsob vystavenia ľudí, a mal by sa použiť iba v prípade, že je k dispozícii osobitné vedecké zdôvodnenie. Ak je testovaná chemikália primiešaná do krmiva alebo pitnej vody, najmä v prípade jednej dávky, treba venovať pozornosť tomu, aby sa medzi spotrebou potravy a vody a odberom vzorky ponechal dostatočný čas, aby sa umožnilo zistenie účinkov (pozri bod 37). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti testovaného zvieraťa. Objem by za bežných okolností nemal prekročiť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti okrem vodných roztokov, pri ktorých sa môže použiť najviac 2 ml/100 g. Požitie väčších ako uvedených objemov by malo byť opodstatnené. S výnimkou dráždivých alebo žieravých testovaných chemikálií, ktoré pri vyšších koncentráciách zvyčajne zhoršia účinky, by sa variabilita v testovanom objeme mala minimalizovať tým, že sa koncentrácia upraví tak, aby sa na všetkých úrovniach dávok zabezpečil stály objem vo vzťahu k telesnej hmotnosti.
                     
                        Harmonogram ovplyvňovania
                     
                     Uprednostňujú sa 2 alebo viaceré ovplyvnenia v 24-hodinových intervaloch, najmä v prípade začlenenia tohto testu do iných toxikologických štúdií toxicity. Alternatívou môže byť jednorazové ovplyvnenie, ak je vedecky opodstatnené (napr. testované chemikálie známe ako blokátory bunkového cyklu). Testované chemikálie môžu byť podávané v rozdelenej dávke, t. j. dve alebo viaceré ovplyvnenia v jeden deň s časovým odstupom najviac 2 – 3 hodiny, čím sa uľahčí podávanie veľkého objemu chemikálie. Za týchto okolností alebo pri podávaní testovanej chemikálie inhalačne by sa čas odberu vzoriek mal naplánovať na základe posledného podania dávky alebo skončenia vystavenia.
                     Test sa môže vykonať na myšiach alebo potkanoch jedným z týchto troch spôsobov:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Zvieratám sa jednorazovo podá testovaná chemikália. Vzorky kostnej drene sa odoberú minimálne dvakrát (nezávislým skupinám zvierat), pričom odber sa začne najskôr 24 hodín po ovplyvnení, ale nie neskôr ako 48 hodín po ovplyvnení s primeraným(-i) intervalom(-mi) medzi odbermi vzoriek, pokiaľ o testovanej chemikálii nie je známe, že má výnimočne dlhý polčas. Vykonanie odberu skôr ako 24 hodín po ovplyvnení by sa malo zdôvodniť. Vzorky periférnej krvi sa odoberajú minimálne dvakrát (tej istej skupine zvierat), pričom odber sa začne najskôr 36 hodín po ovplyvnení, a to s primeraným(-i) intervalom(-mi) po prvom odbere vzorky, nie však neskôr ako po 72 hodinách. V čase prvého odberu by mali byť všetky dávkové skupiny ovplyvnené a mali by sa odobrať vzorky na analýzu; pri neskoršom(-ích) odbere(-och) je však potrebné podať len najvyššiu dávku. Ak sa pri jednom odbere zistí pozitívna reakcia, nevyžaduje sa doplnkový odber vzorky, pokiaľ nie sú potrebné kvantitatívne informácie o reakcii na dávku. Opísané časy odberu sú dôsledkom kinetiky objavovania sa a miznutia mikrojadier v týchto dvoch tkanivových zložkách.
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Ak sa vykoná ovplyvnenie dvakrát denne (napríklad dve ovplyvnenia v 24-hodinových intervaloch), vzorky by sa mali odobrať raz z kostnej drene medzi 18. a 24. hodinou po poslednom ovplyvnení alebo raz z periférnej krvi medzi 36. a 48. hodinou po poslednom ovplyvnení (30). Opísané časy odberu sú dôsledkom kinetiky objavovania sa a miznutia mikrojadier v týchto dvoch tkanivových zložkách.
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Ak sa vykoná ovplyvnenie trikrát alebo viackrát denne (napríklad tri ovplyvnenia alebo viac ovplyvnení v približne 24-hodinových intervaloch), vzorky z kostnej drene by sa mali odobrať najneskôr 24 hodín po poslednom ovplyvnení a vzorky z periférnej krvi by sa mali odobrať najneskôr 40 hodín po poslednom ovplyvnení (31). Táto možnosť ovplyvnenia zahŕňa kombináciu kométového testu (comet assay) (napr. odber vzoriek 2 – 6 hodín po poslednom ovplyvnení) s mikrojadrovým testom a integráciu mikrojadrového testu so štúdiami toxicity pri opakovaných dávkach. Akumulované údaje naznačujú, že indukciu mikrojadier možno pozorovať v týchto širších časových rámcoch, ak došlo k 3 alebo viacerým podaniam (15).
                              
                           Iné režimy podávania dávok alebo odberu vzoriek možno použiť vtedy, ak je to relevantné a vedecky opodstatnené, a s cieľom uľahčiť spojenie s inými testami toxicity.
                     
                        Pozorovania
                     
                     Najmenej raz denne by sa mali vykonať všeobecné klinické pozorovania testovaných zvierat a zaznamenať klinické príznaky, najlepšie každý deň v rovnakom čase a s ohľadom na časový interval najintenzívnejších predpokladaných účinkov po podaní dávky. Počas obdobia podávania dávok je potrebné aspoň dvakrát denne sledovať chorobnosť a úmrtnosť zvierat. Všetky zvieratá by sa mali odvážiť na začiatku štúdie, aspoň raz za týždeň počas štúdií s opakovanou dávkou a potom pri utratení. V prípade štúdií, ktoré trvajú aspoň jeden týždeň, by sa malo aspoň raz za týždeň vykonať meranie spotreby potravy. Ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode, spotreba vody by sa mala merať pri každej výmene vody a aspoň raz za týždeň. Zvieratá, ktoré vykazujú neletálne ukazovatele nadmernej toxicity, by mali byť humánne utratené pred ukončením testovacieho obdobia (28). Za určitých okolností by sa mohla monitorovať telesná teplota zvierat, keďže hypertermia a hypotermia vyvolané ovplyvnením mohli prispieť k falošným výsledkom (32) (33) (34).
                     
                        Vystavenie cieľového tkaniva
                     
                     Vzorka krvi by sa mala odobrať vo vhodnom(-ých) čase(-och), aby bolo možné preskúmať úrovne testovaných chemikálií v plazme na účely preukázania, že došlo k vystaveniu kostnej drene, ak je to opodstatnené a ak neexistujú iné údaje o expozícii (pozri bod 48).
                     
                        Preparát kostnej drene/krvi
                     
                     Bunky kostnej drene sa zvyčajne získavajú zo stehnových kostí (femur) alebo píšťal (tibia) zvierat ihneď po humánnej eutanázii. Bunky sa zvyčajne odoberú, pripravia sa z nich preparáty a zafarbia sa použitím zavedených metód. Malé objemy periférnej krvi možno získať v súlade s primeranými normami týkajúcimi sa dobrých podmienok zvierat, a to buď pomocou metódy, ktorá umožňuje prežitie testovaného zvieraťa, ako je napríklad získanie krvi z chvostovej žily alebo inej vhodnej žily, alebo srdcovou punkciou alebo odberom vzoriek z veľkej cievy pri utratení zvierat. V prípade erytrocytov získaných z kostnej drene alebo periférnej krvi možno bunky v závislosti od metódy analýzy ihneď supravitálne zafarbiť (16) (17) (18), bunky sa rozotrú na podložnom sklíčku a vzniknuté preparáty sa zafarbia a mikroskopicky vyhodnotia, alebo sa fixujú a vhodne zafarbia na účely prietokovej cytometrickej analýzy. Použitie farbiva so špecifickou väzbou na DNA [napríklad akridínová oranžová (35) alebo Hoechst 33258 plus pyronín-Y (36)] môže eliminovať niektoré umelo vzniknuté štruktúry buniek spojené s používaním farbiva bez špecifickej väzby na DNA. Táto výhoda nebráni používaniu konvenčných farbív (napríklad Giemsa na účely mikroskopickej analýzy). Použiť možno takisto dodatočné systémy [napríklad celulózové kolóny na odstránenie buniek s jadrom (37) (38)], a to za predpokladu, že sa preukázala kompatibilita týchto systémov s prípravou vzoriek v laboratóriu.
                     Ak sú tieto metódy uplatniteľné, na identifikáciu povahy mikrojadier (chromozómy/fragmenty chromozómov) s cieľom zistiť, či je mechanizmus indukcie mikrojadier dôsledkom klastogénnych a/alebo aneugénnych procesov, možno použiť protilátky kinetochoru (39), FISH s pancentromérovými sondami DNA (40) alebo značenie in situ pomocou primerov špecifických pre pancentroméru spolu s vhodným odfarbovacím roztokom DNA (41). Na rozlišovanie medzi klastogénmi a aneugénmi možno použiť aj iné metódy, ak sa ukázalo, že sú účinné.
                     
                        Analýza (ručná a automatizovaná)
                     
                     Všetky sklíčka alebo vzorky na analýzu vrátane pozitívnych a negatívnych kontrol by sa mali pred každou analýzou nezávisle označiť kódmi a mali by byť náhodné, aby hodnotiaci používajúci manuálnu metódu nebol oboznámený s podmienkami ovplyvnenia; takéto kódovanie nie je potrebné pri automatizovaných systémoch hodnotenia, ktoré sa neopierajú o vizuálnu kontrolu a nemôžu byť ovplyvnené zaujatosťou prevádzkovateľa. Pri každom zvierati sa stanovuje podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov (zrelých plus nezrelých), pričom sa počíta celkovo najmenej 500 erytrocytov v prípade kostnej drene a 2 000 erytrocytov v prípade periférnej krvi (42). Pri výskyte nezrelých erytrocytov s mikrojadrami by sa malo hodnotiť aspoň 4 000 nezrelých erytrocytov na jedno zviera (43). Ak databáza historických negatívnych kontrol naznačuje, že priemerná hodnota pozaďovej frekvencie nezrelých erytrocytov s mikrojadrami je < 0,1 % v skúšobnom laboratóriu, malo by sa zvážiť hodnotenie dodatočných buniek. Pri analyzovaní vzoriek by podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov u ovplyvnených zvierat nemal byť nižší ako 20 % podielu kontroly nosiča/rozpúšťadla pri mikroskopickom hodnotení a zároveň by nemal byť nižší než približne 5 % podielu kontroly nosiča/rozpúšťadla pri hodnotení CD71+ nezrelých erytrocytov cytometrickými metódami (pozri bod 31) (29). Napríklad ak je v prípade skúšky kostnej drene hodnotenej mikroskopicky podiel nezrelých erytrocytov v kostnej dreni 50 %, horná hranica toxicity by bola 10 % nezrelých erytrocytov.
                     Pretože potkania slezina vychytáva a ničí erytrocyty s mikrojadrami, je na zachovanie vysokej citlivosti skúšky pri analýze periférnej krvi potkanov vhodnejšie obmedziť analýzu nezrelých erytrocytov s mikrojadrami na najmladšiu frakciu. Ak sa použijú automatizované metódy analýzy, možno tieto najmenej zrelé erytrocyty identifikovať na základe ich vysokého obsahu RNA alebo vysokej úrovne transferínových receptorov (CD71+) na ich povrchu (31). Z priameho porovnania rôznych metód farbenia však vyplýva, že uspokojivé výsledky možno dosiahnuť rôznymi spôsobmi vrátane konvenčného farbenia pomocou farbiva akridínová oranžová (3) (4).
                     PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     Údaje o jednotlivých zvieratách by sa mali uvádzať v tabuľkovej forme. Pri každom zvierati podrobenom analýze by sa mal samostatne uviesť počet hodnotených nezrelých erytrocytov, počet nezrelých erytrocytov s mikrojadrami a podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov. V prípade, že sa myši ovplyvňujú nepretržite počas 4 týždňov alebo dlhšie, mali by sa uvádzať aj údaje o počte a podiele zrelých erytrocytov s mikrojadrami, ak boli odobraté. Mali by sa uvádzať aj údaje o toxicite a klinických príznakoch u zvierat.
                     
                        Kritériá prijateľnosti
                     
                     Prijateľnosť testu určujú tieto kritériá:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 Údaje o súbežných negatívnych kontrolách sa pokladajú za prijateľné na to, aby sa doplnili do databázy historických kontrol laboratória (pozri body 15 – 18).
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 Súbežné pozitívne kontroly alebo kontroly hodnotenia by mali vyvolať reakcie, ktoré sú zlučiteľné s reakciami generovanými v databáze historických pozitívnych kontrol, a viesť k štatisticky významnému nárastu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou (pozri body 24 – 25).
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 Vykonala sa analýza primeraného počtu dávok a buniek.
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 Kritériá výberu najvyššej dávky sú v súlade s kritériami opísanými v bodoch 30 – 33.
                              
                           
                        Vyhodnotenie a výklad výsledkov
                     
                     Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 aspoň jedna z ovplyvnených skupín vykazuje štatisticky významné zvýšenie frekvencie nezrelých erytrocytov s mikrojadrami v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 pri posúdení pomocou vhodného testu trendu sa preukáže, že aspoň pri jednom odbere vzorky toto zvýšenie závisí od dávky, a
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 ktorýkoľvek z týchto výsledkov je mimo rozdelenia historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia).
                              
                           Ak sa preskúma len najvyššia dávka v konkrétnom čase odberu vzorky, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak dôjde k štatisticky významnému zvýšeniu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou a výsledky sú mimo rozdelenia historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia). Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (44) (45) (46) (47). Pri vykonávaní analýzy vzťahu medzi dávkou a reakciou by sa mali analyzovať aspoň tri ovplyvnené dávkové skupiny, v rámci ktorých sa podáva určitá dávka. Pri štatistických testoch by sa malo zviera použiť ako experimentálna jednotka. Pozitívne výsledky mikrojadrového testu naznačujú, že testovaná chemikália indukuje mikrojadrá, ktoré sú výsledkom chromozómového poškodenia alebo poškodenia mitotického aparátu v erytroblastoch testovaného druhu. V prípade, že sa vykonal test na zistenie centromér v mikrojadrách, testovaná chemikália, ktorá produkuje mikrojadrá obsahujúce centroméry (centromérická DNA alebo kinetochor, ktoré sú príznačné pre stratu celých chromozómov), je dôkazom toho, že testovaná chemikália je aneugén.
                     Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných podmienkach pokusu platí, že:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 žiadna z ovplyvnených skupín nevykazuje štatisticky významné zvýšenie frekvencie nezrelých erytrocytov s mikrojadrami v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou;
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 pri posúdení pomocou vhodného testu trendu sa preukáže, že počas žiadneho odberu vzorky nedochádza k zvýšeniu v závislosti od dávky;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 všetky výsledky sú v rámci rozdelenia historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia) a
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 došlo k vystaveniu kostnej drene účinkom testovanej(-ých) chemikálie(-í).
                              
                           Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (44) (45) (46) (47). Ako dôkaz o vystavení kostnej drene účinkom testovanej chemikálie môže slúžiť zníženie pomeru medzi nezrelými a zrelými erytrocytmi alebo meranie hladín testovanej chemikálie v plazme alebo krvi. V prípade intravenózneho podania nie je potrebný dôkaz o vystavení. Alternatívne možno na preukázanie vystavenia kostnej drene použiť údaje ADME získané v nezávislej štúdii s použitím tej istej cesty podania a toho istého druhu. Negatívne výsledky naznačujú, že testovaná chemikália za daných testovacích podmienok nevytvára mikrojadrá v nezrelých erytrocytoch testovaného druhu.
                     Neexistuje požiadavka na overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie.
                     V prípadoch, keď reakcia nie je jasne negatívna ani pozitívna, a s cieľom pomôcť stanoviť biologickú relevantnosť výsledku (napr. slabé alebo hraničné zvýšenie), by na posúdenie údajov malo slúžiť odborné posúdenie a/alebo ďalšie skúmanie vykonaných pokusov. V niektorých prípadoch by mohlo byť užitočné vykonať analýzu viacerých buniek alebo zopakovať pokus s pozmenenými podmienkami.
                     V zriedkavých prípadoch, dokonca aj po ďalších skúmaniach, údaje neumožnia vyvodiť záver, že testované chemikálie vedú k negatívnym alebo pozitívnym výsledkom, a preto sa štúdia uzavrie ako štúdia „s nejasným výsledkom“.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zhrnutie
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita testovanej chemikálie, ak je známa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Jednozložková látka:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikácia chemikálie, ako je názov IUPAC alebo CAS, CAS číslo, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, a to v prípade potreby a uskutočniteľnosti atď.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mnohozložková látka, UVCB a zmesi:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             charakterizovaná pokiaľ možno chemickou identitou (pozri vyššie), kvantitatívnym výskytom a relevantnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami zložiek.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Príprava testovanej chemikálie:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie voľby nosiča,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             príprava potravy, pitnej vody alebo inhalačných aplikačných foriem,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analytické stanovenia týkajúce sa aplikačných foriem (napr. stabilita, homogenita, nominálne koncentrácie) v prípade, že sa vykonáva.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované zvieratá:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý druh/kmeň a zdôvodnenie jeho použitia;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet, vek a pohlavie zvierat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, podmienky umiestnenia, potrava atď.;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda na jedinečnú identifikáciu zvierat;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade krátkodobých štúdií: hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku a na konci testu; v prípade štúdií dlhších ako jeden týždeň: hmotnosť jednotlivých zvierat počas štúdie a konzumácia potravy. Mal by sa zahrnúť rozsah telesnej hmotnosti, priemer a štandardná odchýlka pre každú skupinu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o pozitívnych a negatívnych kontrolách (rozpúšťadlo/nosič),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak sa vykonala,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odôvodnenie voľby úrovne dávky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o príprave testovanej chemikálie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie spôsobu a trvania podávania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy overovania, že testovaná(-é) chemikália(-e) dosiahla(-i) všeobecnú cirkuláciu alebo cieľové tkanivo,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             skutočná dávka (mg/kg telesnej hmotnosti/deň) vypočítaná z koncentrácie testovanej chemikálie (ppm) v potrave/pitnej vode a zo spotreby potravy/pitnej vody, ak sa uplatňuje,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o kvalite potravy a vody,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             spôsob utratenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda analgézie (v prípade použitia),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobný opis harmonogramu aplikácie a harmonogramu odberu vzoriek a zdôvodnenie ich voľby,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy prípravy preparátov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             postupy izolácie a uchovávania vzoriek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy merania toxicity,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá hodnotenia nezrelých erytrocytov s mikrojadrami,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet analyzovaných buniek u každého zvieraťa pri určovaní frekvencie nezrelých erytrocytov s mikrojadrami a na určovanie pomeru medzi nezrelými a zrelými erytrocytmi,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá prijateľnosti štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade potreby metódy, ako je použitie protilátok kinetochoru alebo sond DNA špecifických pre centroméru, na zistenie toho, či mikrojadrá obsahujú celé alebo fragmentované chromozómy.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             stav zvieraťa pred testovaním a počas doby testovania vrátane príznakov toxicity,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet nezrelých erytrocytov s mikrojadrami v prípade každého zvieraťa samostatne,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             priemerná hodnota ± štandardná odchýlka počtu nezrelých erytrocytov s mikrojadrami na skupinu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je možné ho určiť,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použité štatistické analýzy a metódy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o súbežných negatívnych a pozitívnych kontrolách s rozsahmi, priemernými hodnotami a štandardnými odchýlkami,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             historické údaje o negatívnych a pozitívnych kontrolách s rozsahmi, priemernými hodnotami, štandardnými odchýlkami a 95 % regulačnými medzami pre rozdelenie, ako aj príslušné časové obdobie a počet údajových bodov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje na podporu toho, že došlo k vystaveniu kostnej drene,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadne údaje o charakterizácii, ktoré naznačujú, či mikrojadrá obsahujú celé alebo fragmentované chromozómy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             splnené kritériá pozitívnej alebo negatívnej reakcie.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskusia o výsledkoch
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver.
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Referencie.
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10-30.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92-107.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83-91.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139-145.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65-73.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149-154.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153-155.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187-190.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9-15.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61-118.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555-558.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513-522.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245-249.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83-98.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153-159.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239-273.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45-50.
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419-424.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84-100.
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 24.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 25.
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-120.
                              
                           
                                 26.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.
                              
                           
                                 27.
                              
                              
                                 Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.
                              
                           
                                 28.
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 29.
                              
                              
                                 LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222-228.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/– 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313-319.
                              
                           
                                 31.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234-252.
                              
                           
                                 32.
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79-83.
                              
                           
                                 33.
                              
                              
                                 Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7-14.
                              
                           
                                 34.
                              
                              
                                 Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120-127.
                              
                           
                                 35.
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 36.
                              
                              
                                 MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 37.
                              
                              
                                 Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91-104.
                              
                           
                                 38.
                              
                              
                                 Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121-126.
                              
                           
                                 39.
                              
                              
                                 Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411-415.
                              
                           
                                 40.
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 41.
                              
                              
                                 Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99-104.
                              
                           
                                 42.
                              
                              
                                 Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97-99.
                              
                           
                                 43.
                              
                              
                                 OECD (2014), “Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 44.
                              
                              
                                 Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.
                              
                           
                                 45.
                              
                              
                                 Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
                              
                           
                                 46.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49-52.
                              
                           
                                 47.
                              
                              
                                 Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233-241.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Centroméra
                           : oblasť(-ti) chromozómu, v ktorej(-ých) sa vlákna deliaceho vretienka pripájajú k chromozómu počas delenia bunky a ktorá(-é) umožňuje(-ú) riadny pohyb dcérskych chromozómov k pólom dcérskych buniek.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Erytroblast
                           : skoré štádium vývoja erytrocytu bezprostredne predchádzajúce štádiu nezrelého erytrocytu, v ktorom bunka ešte obsahuje jadro.
                        
                           
                              Kinetochor
                           : bielkovinová štruktúra vytvárajúca sa na centromére eukaryotických buniek, ktorá spája chromozóm s mikrotubulovými polymérmi z mitotického vretienka počas mitózy a meiózy a funguje počas delenia buniek tak, že od seba odtrháva sesterské chromatídy.
                        
                           
                              Mikrojadrá
                           : malé jadrá doplňujúce hlavné jadrá buniek a oddelené od nich, ktoré sa vytvárajú počas telofázy mitózy (meiózy) oneskorenými chromozómovými fragmentmi alebo celými chromozómami.
                        
                           
                              Normochromatický alebo zrelý erytrocyt
                           : úplne zrelý erytrocyt, ktorý stratil reziduálnu RNA, ktorá zostáva po enukleácii, a/alebo ktorý stratil iné krátko žijúce bunkové markéry, ktoré spravidla zmiznú po enukleácii po konečnom delení erytroblastov.
                        
                           
                              Polychromatický alebo nezrelý erytrocyt
                           : novovzniknutý erytrocyt na medzistupni vývoja, ktorý sa v dôsledku prítomnosti reziduálnej RNA v novovzniknutej bunke zafarbí modrými aj červenými zložkami klasických krvných farbív, ako napr. Giemsa od Wrighta. Takéto novovzniknuté bunky sú približne rovnaké ako retikulocyty, ktoré sa vizualizujú použitím vitálneho farbiva spôsobujúceho zhlukovanie reziduálnej RNA do retikula. V súčasnosti sa na identifikáciu novovzniknutých červených krviniek používajú iné metódy vrátane monochromatického farbenia RNA fluorescenčnými farbivami alebo označovanie krátko žijúcich povrchových markérov, ako je CD71, fluorescenčnými protilátkami. Polychromatické erytrocyty, retikulocyty, ako aj CD71 pozitívne erytrocyty sú nezrelé erytrocyty, hoci každý z nich má trochu odlišné vekové rozdelenie.
                        
                           
                              Retikulocyt
                           : novo vzniknutý erytrocyt zafarbený vitálnym farbivom, ktoré spôsobuje zhlukovanie reziduálnej bunkovej RNA do charakteristického retikula. Retikulocyty a polychromatické erytrocyty majú podobné bunkové vekové rozdelenie.
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           FAKTORIÁLNY NÁVRH NA IDENTIFIKÁCIU ROZDIELOV MEDZI POHLAVIAMI V IN VIVO MIKRIOJADROVEJ SKÚŠKE
                        
                        
                           Faktoriálny návrh a jeho analýza
                        
                        V tomto návrhu sa testuje minimálne 5 samcov a 5 samíc na každej úrovni koncentrácie, čo vedie k použitiu minimálne 40 zvierat (20 samčekov a 20 samičiek, spolu s príslušnými pozitívnymi kontrolami).
                        Uvedený návrh, ktorý predstavuje jeden z jednoduchších faktoriálnych návrhov, je ekvivalentný s dvojfaktorovou analýzou rozptylu, pričom pohlavie a úroveň koncentrácie sú hlavnými účinkami. Údaje možno analyzovať použitím mnohých štandardných softvérových balíkov pre štatistiku, ako sú napr. SPSS, SAS, STATA, Genstat, ako aj pomocou „R“.
                        Pomocou analýzy sa variabilita v súbore údajov rozdelí na variabilitu medzi pohlaviami, variabilitu medzi koncentráciami a variabilitu v súvislosti s interakciou medzi pohlaviami a koncentráciami. Každá z podmienok sa testuje voči odhadu variability medzi paralelnými zvieratami v rámci skupín zvierat rovnakého pohlavia pri rovnakej koncentrácii. Podrobné informácie o použitej metodike sú dostupné v mnohých štandardných štatistických príručkách (pozri odkazy) a v rámci podpory poskytnutej v balíkoch pre štatistiku.
                        Analýza prebieha formou preskúmania podmienky interakcie medzi pohlavím a koncentráciou v tabuľke ANOVA (6). Ak nenastane výrazná interakcia kombinovaných hodnôt (obe pohlavia a rôzne koncentrácie testovanej látky), platné štatistické testy ANOVA poskytnú informáciu o významnosti rozdielov medzi porovnávanými skupinami a parametrami na základe ich vnútornej variability.
                        Analýza pokračuje rozdelením odhadovaných hodnôt pre variabilitu medzi koncentráciami na kontrasty, ktoré umožňujú testovanie na lineárne a kvadratické kontrasty reakcií pri všetkých úrovniach koncentrácií. Ak existuje významná interakcia medzi pohlavím a koncentráciou, možno túto podmienku rozdeliť aj na kontrast interakcie medzi lineárnou hodnotou a pohlavím a kontrast interakcie medzi kvadratickou hodnotou a pohlavím. Tieto podmienky umožňujú testovanie toho, či sú reakcie na koncentráciu u oboch pohlaví paralelné, alebo či je reakcia každého pohlavia odlišná.
                        Na základe odhadov týkajúcich sa združených údajov v rámci skupinovej variability možno vykonať párové testy na zistenie rozdielu medzi priemernými hodnotami. Tieto porovnania by sa mohli vykonať medzi priemernými hodnotami pre obe pohlavia a medzi priemernými hodnotami pre rôzne úrovne koncentrácie, ako sú napríklad porovnania s úrovňami negatívnych kontrol. V prípadoch, keď dochádza k významnej interakcii, možno vykonať porovnania medzi priemernými hodnotami rôznych koncentrácií v rámci jedného pohlavia alebo medzi priemernými hodnotami pohlaví pri rovnakej koncentrácii.
                        
                           Odkazy
                        
                        Existuje mnoho štatistických príručiek, v ktorých sa rozoberá teória, návrh, metodika, analýza a výklad faktoriálnych návrhov počnúc dvoma najjednoduchšími faktorovými analýzami po komplexnejšie formy používané v metodike plánovania experimentu. Ide o tento neúplný zoznam. Niektoré knihy poskytujú spracované príklady porovnateľných návrhov, v niektorých prípadoch s kódom na vykonanie analýz pomocou rôznych softvérových balíkov.
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              “
               
                     6.
                  
                  
                     V časti B sa vypúšťa kapitola B.15.
                  
               
                     7.
                  
                  
                     V časti B sa vypúšťa kapitola B.16.
                  
               
                     8.
                  
                  
                     V časti B sa vypúšťa kapitola B.18.
                  
               
                     9.
                  
                  
                     V časti B sa vypúšťa kapitola B.19.
                  
               
                     10.
                  
                  
                     V časti B sa vypúšťa kapitola B.20.
                  
               
                     11.
                  
                  
                     V časti B sa vypúšťa kapitola B.24.
                  
               
                     12.
                  
                  
                     V časti B sa kapitola B.47 nahrádza takto:
                     „B.47   Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na identifikáciu i) chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí a ii) chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 437 (2013). Testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky ohodnotil Medziagentúrny koordinačný výbor pre validáciu alternatívnych metód (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) v spojení s Európskym centrom pre validáciu alternatívnych metód (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) a Japonským centrom pre validáciu alternatívnych metód (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) v rokoch 2006 a 2010 (1)(2). V prvom hodnotení bola testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky hodnotená z hľadiska užitočnosti pri identifikácii chemikálií (látok a zmesí), ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (1). V druhom hodnotení bola uvedená testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky hodnotená z hľadiska užitočnosti pri identifikácii chemikálií (látok a zmesí), ktoré nie sú klasifikované ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí (2). Validačná databáza testovacích metód zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky zahŕňala spolu 113 látok a 100 zmesí (2)(3). Z týchto hodnotení a ich partnerského preskúmania sa vyvodil záver, že testovacou metódou možno správne identifikovať chemikálie (látky aj zmesi), ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (kategória 1), ako aj chemikálie, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí, ako sa definuje v Globálnom harmonizovanom systéme klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie spojených národov (OSN) (4) a v nariadení (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (nariadenie CLP) (7), a preto bola schválená ako vedecky platná na oba účely. Vážne poškodenie očí je vyvolanie poškodenia tkaniva v oku alebo vážne fyzické zhoršenie zraku po aplikácii testovanej chemikálie na predný povrch oka, ktoré nie je úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii. Testované chemikálie vyvolávajúce vážne poškodenie očí sa podľa GHS OSN klasifikujú ako kategória 1. Chemikálie neklasifikované ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí sú definované ako chemikálie, ktoré nespĺňajú požiadavky na klasifikáciu v kategórii 1 alebo 2 GHS OSN (2A alebo 2B), t. j. uvádzajú sa ako chemikálie „bez kategórie“ v zmysle GHS OSN. Táto testovacia metóda zahŕňa odporúčané použitie a obmedzenia testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na základe jej hodnotení. Hlavné rozdiely medzi pôvodnou verziou usmernenia OECD na vykonávanie testov z roku 2009 a jeho aktualizovanou verziou z roku 2013 sa okrem iného vzťahujú na: použitie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu podľa GHS OSN (body 2 a7); objasnenie uplatniteľnosti testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na testovanie alkoholov, ketónov a tuhých látok (body 6 a 7) a látok a zmesí (bod 8); objasnenie toho, ako by sa mali testovať povrchovo aktívne látky (surfaktanty) a zmesi, ktoré obsahujú povrchovo aktívne látky (bod 28); aktualizácie a objasnenia týkajúce sa pozitívnych kontrol (body 39 a 40); aktualizáciu rozhodovacích kritérií, pokiaľ ide o testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky (bod 47); aktualizáciu kritérií prijateľnosti štúdie (bod 48); aktualizáciu prvkov skúšobného protokolu (bod 49); aktualizáciu dodatku 1, pokiaľ ide o definície; doplnenie dodatku 2 o prediktívnej schopnosti testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky v rámci rôznych klasifikačných systémov; aktualizáciu dodatku 3, pokiaľ ide o zoznam chemikálií na preukázanie spôsobilosti a aktualizáciu dodatku 4, pokiaľ ide o držiak rohovky testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky (bod 1) a o opacitometer (body 2 a 3).
                     V súčasnosti sa všeobecne uznáva, že ani jediný in vitro test očnej dráždivosti nedokáže v blízkej budúcnosti nahradiť Draizov in vivo očný test slúžiaci na predpovedanie celého radu podráždení pri rôznych triedach chemikálií. Je však možné, že Draizov očný test dokážu nahradiť strategické kombinácie niekoľkých alternatívnych testovacích metód v rámci (viacstupňovej) testovacej stratégie (5). Prístup zhora nadol (5) je určený na použitie vtedy, keď sa na základe existujúcich informácií očakáva, že chemikália bude mať veľký potenciál spôsobiť podráždenie, zatiaľ čo prístup zdola nahor (5) sa má použiť vtedy, keď sa na základe existujúcich informácií očakáva, že chemikália spôsobí podráždenie očí v dostatočnej miere na to, aby si vyžadovala klasifikáciu. Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky je in vitro testovacia metóda, ktorú možno použiť za určitých okolností a so špecifickými obmedzeniami, pokiaľ ide o klasifikáciu chemikálií z hľadiska ich nebezpečnosti pre oči a ich označovanie. Hoci sa testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nepokladá za platnú samostatnú náhradu za očný test in vivo na králikoch, odporúča sa ako úvodný krok v rámci testovacej stratégie, ako je prístup zhora nadol, ktorý odporúča Scott et al. (5) na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí, t. j. chemikálií, ktoré sa majú klasifikovať ako kategória 1 GHS OSN bez ďalšieho testovania (4). Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa takisto odporúča na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa definície GHS OSN (bez kategórie v zmysle GHS OSN) (4) v rámci testovacej stratégie, ako je prístup zdola nahor (5). Chemikália, o ktorej sa na základe testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nepredpokladá, že spôsobí vážne poškodenie očí alebo že nebude klasifikovaná ako chemikália spôsobujúca podráždenie/vážne poškodenie očí, by si však na stanovenie konečnej klasifikácie vyžadovala ďalšie testovanie (in vitro a/alebo in vivo).
                     Účelom tejto testovacej metódy je opísať postupy používané na hodnotenie potenciálu testovanej chemikálie predstavovať nebezpečnosť pre oči, a to na základe merania jej schopnosti vyvolať zákal a zvýšenú priepustnosť v izolovanej hovädzej rohovke. Toxické účinky na rohovku sa merajú: i) zníženou priepustnosťou svetla (zákalom) a ii) zvýšeným prepúšťaním farbiva fluoresceínu sodného (priepustnosťou). Výsledky posudzovania zákalu a priepustnosti rohovky po vystavení účinkom testovanej chemikálie sa skombinujú a odvodí sa z nich skóre in vitro dráždivosti (In Vitro Irritancy Score, IVIS), ktoré sa používa na klasifikáciu úrovne dráždivosti testovanej chemikálie.
                     Definície sa uvádzajú v dodatku 1.
                     ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                     Táto testovacia metóda vychádza z protokolu testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky ICCVAM (6)(7), ktorý bol pôvodne vypracovaný na základe informácií z protokolu Inštitútu pre vedy in vitro a z protokolu INVITTOX 124 (8). Protokol INVITTOX 124 predstavuje protokol používaný pri predbežnej validačnej štúdii, ktorú financovalo Európske spoločenstvo a ktorá prebehla v rokoch 1997 – 1998. Obidva protokoly vychádzajú z testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, ktorú prvýkrát zverejnil Gautheron et al. (9).
                     Testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky možno použiť na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí v zmysle GHS OSN, t. j. chemikálií, ktoré sa majú klasifikovať ako chemikálie kategórie 1 GHS OSN (4). Keď sa testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky používa na tento účel, vykazuje celkovú presnosť 79 % (150/191), mieru falošnej pozitivity 25 % (32/126) a mieru falošnej negativity 14 % (9/65) v porovnaní s údajmi z metódy očného testu in vivo na králikoch s klasifikáciou podľa klasifikačného systému GHS OSN (3) (pozri dodatok 2 tabuľku 1). Keď sa testované chemikálie v rámci určitých chemických (t. j. alkoholy, ketóny) alebo fyzikálnych (t. j. tuhé látky) tried vylúčia z databázy, testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky vykazuje podľa klasifikačného systému GHS OSN celkovú presnosť 85 % (111/131), mieru falošnej pozitivity 20 % (16/81), a mieru falošnej negativity 8 % (4/50) (3). Potenciálne nedostatky testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky pri jej použití na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN) spočívajú vo vysokej miere falošnej pozitivity pri alkoholoch a ketónoch a vysokej miere falošnej negativity pri tuhých látkach, ktoré sa zistili vo validačnej databáze (1)(2)(3). Avšak vzhľadom na to, že nie všetky alkoholy a ketóny sú testovacou metódou zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nadhodnotené a o niektorých sa správne predpokladalo zaradenie do kategórie 1 GHS OSN, nepokladajú sa tieto dve organické funkčné skupiny sa za skupiny mimo oblasti uplatniteľnosti tejto testovacej metódy. Používateľ tejto testovacej metódy sa bude musieť rozhodnúť, či v prípade alkoholov a ketónov možno prípadný nadhodnotený predpoklad akceptovať, alebo či by sa malo vykonať ďalšie testovanie formou analýzy váhy dôkazov. Pokiaľ ide o miery falošnej negativity v prípade tuhých látok, malo by sa poznamenať, že tuhé látky môžu pri Draizovom in vivo teste očnej dráždivosti viesť k premenlivým a extrémnym podmienkam expozície, dôsledkom čoho môžu byť predpoklady týkajúce sa ich skutočného potenciálu spôsobiť podráždenie irelevantné (10). Malo by sa takisto uviesť, že falošne negatívne výsledky identifikované vo validačnej databáze ICCVAM (2)(3) v súvislosti s identifikáciou chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN) v žiadnom prípade neviedli k hodnote IVIS ≤ 3, čo je kritérium používané na identifikáciu testovanej chemikálie ako chemikálie bez kategórie v zmysle GHS OSN. Okrem toho falošné negatívne výsledky testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky v tejto súvislosti nie sú rozhodujúce, keďže všetky testované chemikálie, ktoré vedú k hodnote 3 < IVIS ≤ 55, by sa následne testovali pomocou iných adekvátne validovaných in vitro testov, alebo – ako posledná možnosť na králikoch, v závislosti od regulačných požiadaviek pomocou stratégie postupného testovania v rámci analýzy váhy dôkazov. Vzhľadom na skutočnosť, že v prípade niektorých tuhých chemikálií sa na základe testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky správne predpokladá ich zaradenie do kategórie 1 GHS OSN, nepovažuje sa ani toto fyzikálne skupenstvo za nachádzajúce sa mimo oblasti uplatniteľnosti testovacej metódy. Výskumní pracovníci by mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy pri všetkých typoch chemikálií, pričom hodnota IVIS > 55 by sa mala prijať ako indikátor reakcie vyvolávajúcej vážne poškodenie očí, na základe čoho by sa mala uplatniť klasifikácia v kategórii 1 GHS OSN bez ďalšieho testovania. Ako už bolo uvedené, pozitívne výsledky získané v prípade alkoholov alebo ketónov by sa však mali interpretovať opatrne, v dôsledku prípadného nadhodnotenia.
                     Testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky možno takisto použiť na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa klasifikácie GHS OSN (4). Keď sa testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky používa na tento účel, vykazuje celkovú presnosť 69 % (135/196), mieru falošnej pozitivity 69 % (61/89), a mieru falošnej negativity 0 % (0/107) v porovnaní s údajmi o metóde očného testu in vivo na králikoch s klasifikáciou podľa klasifikačného systému GHS OSN (3) (pozri dodatok 2 tabuľku 2). Zistená miera falošnej pozitivity (chemikálie bez kategórie v zmysle GHS OSN na základe testov in vivo s hodnotou IVIS > 3, pozri bod 47) je značne vysoká, no v tejto súvislosti nie je rozhodujúca, keďže všetky testované chemikálie, ktoré vedú k hodnote 3 < IVIS ≤ 55, by sa následne testovali pomocou iných adekvátne validovaných in vitro testov, alebo – ako posledná možnosť na králikoch, v závislosti od regulačných požiadaviek pomocou stratégie postupného testovania v rámci analýzy váhy dôkazov. Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nevykazuje žiadne osobitné nedostatky v súvislosti s testovaním alkoholov, ketónov a tuhých látok, keď je jej účelom identifikovať chemikálie, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí (bez kategórie v zmysle GHS OSN) (3). Výskumní pracovníci by mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy v prípade všetkých typov chemikálií, pričom negatívny výsledok (IVIS ≤ 3) by sa mal prijať ako indikátor toho, že nie je potrebná klasifikácia (bez kategórie v zmysle GHS OSN). Keďže testovacou metódou zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky možno správne identifikovať len 31 % chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí, nemala by byť táto testovacia metóda prvou voľbou na iniciovanie prístupu zdola nahor, ak sú dostupné iné validované a uznané in vitro metódy s podobným stupňom citlivosti, no vyššou špecifickosťou.
                     Validačná databáza testovacích metód zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky obsahovala spolu 113 látok a 100 zmesí (2)(3). Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa preto považuje za metódu uplatniteľnú na látky, ako aj zmesi.
                     Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa neodporúča na identifikáciu testovaných chemikálií, ktoré by sa mali klasifikovať ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí (kategória 2 alebo kategória 2A GHS OSN), alebo testovaných chemikálií, ktoré by sa mali klasifikovať ako chemikálie spôsobujúce mierne podráždenie očí (kategória 2B GHS OSN), vzhľadom na značné množstvo chemikálií kategórie 1 GHS OSN, ktoré sú zaradené do príliš nízkej kategórie, ako napr. kategória 2, 2A alebo 2B, a chemikálií bez kategórie v zmysle GHS OSN, ktoré sú zaradené do príliš vysokej kategórie, ako napr. kategória 2, 2A alebo 2B GHS OSN (2)(3). Na tento účel sa môže vyžadovať ďalšie testovanie pomocou inej vhodnej metódy.
                     Pri všetkých postupoch, pri ktorých sa používajú hovädzie oči a hovädzie rohovky, by sa mali dodržiavať platné nariadenia a postupy pre dané testovacie zariadenie v oblasti zaobchádzania s materiálom živočíšneho pôvodu, medzi ktoré okrem iného patria tkanivá a tkanivové tekutiny. Odporúčajú sa všeobecne platné laboratórne bezpečnostné opatrenia (11).
                     Zatiaľ čo pri testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa nezohľadňujú spojovkové a dúhovkové poškodenia, zohľadňujú sa v nej účinky na rohovku, ktoré sú hlavným faktorom klasifikácie in vivo pri klasifikácii v zmysle GHS OSN. Reverzibilitu lézií rohovky nemožno v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky posudzovať ako takú. Na základe štúdií na očiach králikov sa navrhlo, aby sa posúdenie počiatočnej hĺbky poškodenia rohovky mohlo používať na identifikáciu niektorých druhov ireverzibilných účinkov (12). Na porozumenie toho, ako dochádza k ireverzibilným účinkom, ktoré nesúvisia s počiatočným vysokým stupňom poškodenia, sú však potrebné ďalšie vedecké poznatky. Nakoniec treba poznamenať, že testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky neumožňuje posúdenie potenciálu systémovej toxicity súvisiacej s vystavením očí.
                     Táto testovacia metóda sa bude s prehodnocovaním nových informácií a údajov pravidelne aktualizovať. Napríklad v prípade potreby ucelenejšej charakteristiky poškodenia rohovky by prípadne mohla byť užitočná histopatológia. Podľa usmerňovacieho dokumentu OECD č. 160 (13) sa používateľom odporúča uchovať rohovky a pripraviť histopatologické vzorky, ktoré možno použiť na vytvorenie databázy a zavedenie rozhodovacích kritérií, ktoré by mohli ďalej zlepšiť presnosť tejto testovacej metódy
                     V každom laboratóriu, ktoré používa túto metódu prvý raz, by sa mali použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 3. Laboratórium môže použiť tieto chemikálie na účely preukázania svojej odbornej spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky pred predložením údajov z testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na účely regulačnej klasifikácie nebezpečnosti.
                     PRINCÍP TESTU
                     Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky predstavuje organotypický model, ktorý poskytuje krátkodobé udržanie normálnej fyziologickej a biochemickej funkcie hovädzej rohovky in vitro. V rámci tejto testovacej metódy sa poškodenie testovanou chemikáliou posudzuje kvantitatívnymi meraniami zmien zákalu rohovky pomocou opacitometra a priepustnosti rohovky pomocou spektrofotometra vo viditeľnej oblasti svetla. Obe merania sa používajú na výpočet hodnoty IVIS, ktorá sa používa na priradenie klasifikačnej kategórie nebezpečnosti podráždenia in vitro na účely predpokladu potenciálu testovanej chemikálie spôsobiť podráždenie očí in vivo (pozri rozhodovacie kritériá v bode 48).
                     V testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú izolované rohovky z očí čerstvo zabitého dobytka. Zákal rohovky sa meria kvantitatívne ako množstvo rohovkou prepusteného svetla. Priepustnosť sa meria kvantitatívne ako množstvo farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prejde celou hrúbkou rohovky, zistené v médiu v zadnej komore. Testované chemikálie sa nanášajú na epitelový povrch rohovky pridaním do prednej komory držiaka rohovky. V dodatku 4 je uvedený opis a schéma držiaka rohovky, ktorý sa používa v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky. Držiaky rohovky sa dajú zakúpiť z rôznych zdrojov, alebo sa dajú zhotoviť.
                     
                        Zdroj a vek hovädzích očí a výber druhov zvierat
                     
                     Dobytok posielaný na bitúnky sa zvyčajne usmrcuje na ľudskú spotrebu alebo na iné komerčné použitia. Ako zdroj rohoviek na použitie v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú iba zdravé zvieratá, ktoré sa považujú za vhodné na vstup do ľudského potravinového reťazca. Keďže dobytok má široký rozsah hmotnosti a závisí od plemena, veku a pohlavia, neexistuje žiadne odporúčanie týkajúce sa hmotnosti zvierat v čase zabitia.
                     Odlišné rozmery rohoviek môžu byť výsledkom použitia očí zo zvierat v rôznom veku. Rohovky s horizontálnym priemerom > 30,5 mm a so stredovou hrúbkou rohovky ≥ 1 100 μm sa zvyčajne získavajú z dobytka staršieho ako osem rokov, zatiaľ čo rohovky s horizontálnym priemerom < 28,5 mm a so stredovou hrúbkou rohovky < 900 μm sa zvyčajne získavajú z dobytka mladšieho ako päť rokov (14). Z toho dôvodu sa oči dobytka staršieho ako 60 mesiacov väčšinou nepoužívajú. Oči dobytka mladšieho ako 12 mesiacov sa takisto bežne nepoužívajú, pretože tieto oči sa ešte vyvíjajú a hrúbka rohovky a jej priemer sú značne menšie než je hrúbka a priemer rohoviek, ktoré sa uvádzajú v prípade očí dospelého dobytka. Použitie rohoviek mladých zvierat (t. j. vo veku 6 až 12 mesiacov) je však prípustné, pretože má niekoľko výhod, ako je lepšia dostupnosť, užší vekový rozsah a nižšia miera nebezpečnosti, pokiaľ ide o potenciálne vystavenie pracovníkov bovinnej spongiformnej encefalopatii (15). Keďže by bolo prínosné vykonať ďalšie posúdenie vplyvu veľkosti alebo hrúbky rohovky na schopnosť reagovať na žieravé a dráždivé chemikálie, odporúča sa, aby používatelia uvádzali odhadovaný vek a/alebo hmotnosť zvierat, ktorých rohovky boli použité v štúdii.
                     
                        Odber a doprava očí do laboratória
                     
                     Odber očí vykonávajú zamestnanci bitúnkov. V snahe minimalizovať mechanické a iné druhy poškodenia očí by sa oči mali odobrať čo najskôr po usmrtení zvieraťa a hneď po odobratí a počas prepravy by sa mali chladiť. Zamestnanci bitúnkov by pri oplachovaní hlavy zvieraťa nemali použiť žiadny detergent, aby sa predišlo vystaveniu očí účinkom potenciálne dráždivých chemikálií.
                     Oči by sa mali úplne ponoriť do vychladnutého Hanksovho vyváženého soľného roztoku (ďalej len „HBSS“) v nádobe s vhodnou veľkosťou a dopraviť do laboratória takým spôsobom, aby sa minimalizovalo poškodenie a/alebo kontaminácia baktériami. Keďže oči sa odoberajú počas zabíjania, môžu byť vystavené krvi alebo iným biologickým materiálom vrátane baktérií a iných mikroorganizmov. Preto je dôležité zabezpečiť, aby bolo riziko kontaminácie minimálne [napr. tak, že sa nádoba, v ktorej sú oči uložené, bude počas odberu a prepravy udržiavať na mokrom ľade a že sa do HBSS, ktorý sa používa na skladovanie očí pri preprave, pridajú antibiotiká (napr. penicilín v dávke 100 IU/ml a streptomycín v dávke 100 μg/ml)].
                     Časový interval medzi odberom očí a použitím rohoviek v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky by sa mal minimalizovať (zvyčajne sa rohovky použijú v ten istý deň, ako sa vykoná odber) a dokázateľne by nemal spochybniť výsledky skúšky. Tieto výsledky sú založené na kritériách výberu očí, ako aj na reakciách pozitívnych a negatívnych kontrol. Všetky oči použité v skúške by mali byť z tej istej skupiny očí odobratých v určitý deň.
                     
                        Kritériá výberu očí používaných v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky
                     
                     Keď sa oči dopravia do laboratória, pozorne sa prekontrolujú s ohľadom na poškodenia vrátane zvýšeného zákalu, škrabnutí a neovaskularizácie. Použiť sa majú len rohovky z očí, ktoré nie sú takto poškodené.
                     V ďalších krokoch skúšky sa posudzuje aj kvalita každej rohovky. Rohovky, ktoré majú zákal silnejší ako sedem zákalových jednotiek alebo zákal ekvivalentnej hodnoty pre použitý opacitometer a príslušné držiaky rohovky po prvej hodine dosahovania rovnovážneho stavu, sa majú vyradiť (POZNÁMKA: opacitometer by sa mal kalibrovať zákalovými štandardmi, ktoré sa použijú na určenie zákalových jednotiek, pozri dodatok 4).
                     Každá ovplyvnená skupina (testovaná chemikália, súbežné negatívne a pozitívne kontroly) pozostáva minimálne z troch očí. V testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky by sa mali použiť tri rohovky na negatívnu kontrolu. Keďže všetky odobrané rohovky sú vyrezané z celej očnej gule a pripevnené do rohovkových komôr, existuje možnosť, že táto manipulácia bude mať vplyv na jednotlivé hodnoty zákalu a priepustnosti rohovky (vrátane negatívnej kontroly). Okrem toho hodnoty zákalu a priepustnosti rohoviek z kontrol na negatívnu kontrolu sa používajú na korigovanie hodnôt zákalu a priepustnosti rohovky po ovplyvnení testovanou chemikáliou a hodnôt z pozitívnej kontroly vo výpočtoch IVIS.
                     POSTUP
                     
                        Príprava očí
                     
                     Rohovky, ktoré nie sú poškodené, sa vyrežú s 2 až 3 mm okrajom očného bielka, ktorý pomáha pri následnej manipulácii, pričom sa dáva pozor na to, aby nedošlo k poškodeniu epitelu a endotelu rohovky. Izolované rohovky sa upevnia do špeciálne navrhnutých držiakov rohovky pozostávajúcich z prednej a zadnej komory, ktoré sú jednotlivo prepojené s epitelovou a s endotelovou stranou rohovky. Obidve komory sa naplnia až po okraj predhriatym minimálnym základným médiom podľa Eagla (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) bez fenolovej červene (najskôr zadná komora), pričom sa zabezpečí, aby sa nevytvorili bubliny. Zariadenie sa potom nechá ustáliť na teplotu 32 ± 1 °C aspoň jednu hodinu, čím sa umožní, aby sa teplota rohoviek vyrovnala s teplotou média a aby rohovky dosiahli bežnú metabolickú aktivitu v najväčšej možnej miere (približná teplota povrchu rohovky in vivo je 32 °C).
                     Po dobe ustálovania sa do oboch komôr pridá čerstvé predhriate EMEM bez fenolovej červene a pri každej rohovke sa odčítajú základné údaje o zákale. Všetky rohovky, ktoré vykazujú makroskopické poškodenie tkaniva (napr. škrabnutia, pigmentáciu, neovaskularizáciu), alebo zákal silnejší ako sedem zákalových jednotiek, alebo ekvivalentnú hodnotu nameranú s použitím opacitometra a držiaka rohovky, sa vyradia. Minimálne tri rohovky sa vyberú ako rohovky na negatívnu kontrolu (alebo kontrolu rozpúšťadla). Zvyšné rohovky sa potom rozdelia do ovplyvnených skupín a pozitívnych kontrolných skupín.
                     Keďže tepelná kapacita vody je vyššia ako tepelná kapacita vzduchu, voda poskytuje stabilnejšie teplotné podmienky na inkubáciu. Preto sa odporúča použiť vodný kúpeľ na udržiavanie držiaka rohovky a jeho obsahu na teplote 32 ± 1 °C. Takisto však možno použiť vzdušné inkubátory za predpokladu, že sa zabezpečí udržiavanie stabilnej teploty (napr. predhriatím držiakov a médií).
                     
                        Aplikácia testovanej chemikálie
                     
                     Používajú sa dva rôzne protokoly o ovplyvnení, jeden na kvapaliny a povrchovo aktívne látky (tuhé látky alebo kvapaliny) a jeden na povrchovo neaktívne tuhé látky.
                     Kvapaliny sa testujú nezriedené. Polotuhé látky, krémy a vosky sa zvyčajne testujú ako kvapaliny. Čisté povrchovo aktívne látky sa testujú pri koncentrácii 10 % hmotnostnej koncentrácie v 0,9 % roztoku chloridu sodného, destilovanej vody alebo iného rozpúšťadla, v prípade ktorého sa preukázalo, že nemá nepriaznivé účinky na testovací systém. Pri alternatívnych koncentráciách zriedenia by sa mali uviesť príslušné dôvody. Zmesi s obsahom povrchovo aktívnych látok možno testovať nezriedené alebo zriedené na vhodnú koncentráciu v závislosti od príslušného expozičného scenára in vivo. Pri testovaných koncentráciách by sa mali uviesť príslušné dôvody. Rohovky sa vystavia kvapalinám a povrchovo aktívnym látkam na 10 minút. Pri použití inej doby expozície by sa malo uviesť primerané vedecké zdôvodnenie. Definíciu povrchovo aktívnej látky a zmesi, ktorá obsahuje povrchovo aktívne látky, možno nájsť v dodatku 1.
                     Povrchovo neaktívne tuhé látky sa zvyčajne testujú ako roztoky alebo suspenzie pri koncentrácii 20 % hmotnostnej koncentrácie v 0,9 % roztoku chloridu sodného, v destilovanej vode alebo v inom rozpúšťadle, o ktorom sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém. Za určitých okolností a pri náležitom vedeckom zdôvodnení sa tuhé látky môžu testovať aj čisté priamym nanesením na povrch rohovky s použitím metódy otvorenej komory (pozri bod 32). Rohovky sa vystavia pôsobeniu tuhých látok na štyri hodiny, no rovnako ako v prípade kvapalín a povrchovo aktívnych látok, možno použiť aj inú dĺžku vystavenia, ak sa primeraným spôsobom vedecky zdôvodní.
                     Je možné používať rôzne metódy ovplyvnenia, ich použitie závisí od fyzikálnej povahy a chemických vlastností (napr. tuhé látky, kvapaliny, viskózne či neviskózne kvapaliny) testovanej chemikálie. Kritický faktor spočíva v zabezpečení, aby testovaná chemikália primerane pokrývala epitelový povrch a aby sa pri oplachovaní dostatočne odstránila. Metóda uzavretej komory sa zvyčajne používa pri neviskóznych až mierne viskóznych kvapalných testovaných chemikáliách, zatiaľ čo metóda otvorenej komory sa zvyčajne používa v prípade poloviskóznych a viskóznych kvapalných testovaných chemikáliách a čistých tuhých látok.
                     V prípade metódy uzavretej komory sa do prednej komory cez dávkovacie otvory na hornom povrchu komory zavedie dostatočné množstvo testovanej chemikálie (750 μl) tak, aby sa ňou pokryla epitelová strana rohovky, a otvory komory sa následne uzavrú komorovými zátkami na čas vystavenia. Je dôležité zabezpečiť, aby každá rohovka bola vystavená pôsobeniu testovanej chemikálie počas primeranej doby.
                     Pri metóde otvorenej komory sa pred ovplyvnením vyberie prstencový zámok okienkovej dosky a sklenená doska z prednej komory. Kontrolná alebo testovaná chemikália (750 μl alebo dostatočné množstvo testovanej chemikálie na úplné pokrytie rohovky) sa pomocou mikropipety nanesie priamo na epitelový povrch rohovky. Ak sa testovaná chemikália ťažko pipetuje, môže sa na uľahčenie dávkovania naplniť do výtlakovej piestovej pipety. Špička výtlakovej piestovej pipety sa vloží do dávkovacieho hrotu injekčnej striekačky tak, aby sa materiál mohol zaviesť do vytláčacieho hrotu pod tlakom. S posúvaním piestu pipety nahor sa súčasne tlačí na piest injekčnej striekačky. Ak sa v špičke pipety objavia vzduchové bubliny, testovaná chemikália sa odstráni (vytlačí) a postup sa opakuje, pokiaľ sa špička nenaplní bez vzduchových bublín. V prípade potreby možno použiť obyčajnú injekčnú striekačku (bez ihly), pretože umožňuje odmeranie presného objemu testovanej chemikálie a jej ľahšie nanesenie na epitelový povrch rohovky. Po dávkovaní sa sklenené okienko vráti na svoje miesto v prednej komore a tým sa obnoví uzavretý systém.
                     
                        Postexpozičná inkubácia
                     
                     Po uplynutí doby expozície sa testovaná chemikália, chemikália na negatívnu kontrolu alebo chemikália na pozitívnu kontrolu odstránia z prednej komory a epitel sa umyje aspoň trikrát (alebo pokiaľ sa nedosiahne stav, že nie sú viditeľné žiadne znaky prítomnosti testovanej chemikálie) s EMEM (obsahujúcim fenolovú červeň). Médium s obsahom fenolovej červene sa používa na oplachovanie, lebo zmena farby fenolovej červene sa môže monitorovať, čím sa zistí účinnosť oplachovania kyslých alebo zásaditých testovaných chemikálií. Rohovky sa umývajú viac ako trikrát, ak je farba fenolovej červene stále zmenená (na žltú alebo fialovú), alebo ak je testovaná chemikália stále viditeľná. Keď médium neobsahuje testovanú chemikáliu, rohovky sa opláchnu posledný raz pomocou EMEM (bez fenolovej červene). EMEM (bez fenolovej červene) sa používa na konečné opláchnutie, aby sa zabezpečilo odstránenie fenolovej červene z prednej komory pred meraním zákalu. Predná komora sa potom znova naplní čerstvým EMEM bez fenolovej červene.
                     V prípade kvapalín alebo povrchovo aktívnych látok sa rohovky po opláchnutí inkubujú ďalšie dve hodiny pri teplote 32 ± 1 °C. Dlhší postexpozičný čas môže byť za určitých okolností užitočný a mohlo by sa o ňom uvažovať v konkrétnych prípadoch. Rohovky ovplyvnené tuhými látkami sa na konci štvorhodinovej doby expozície dôkladne opláchnu, ale nevyžaduje sa ďalšia inkubácia.
                     Na konci postexpozičnej inkubačnej doby (v prípade kvapalín a povrchovo aktívnych látok) a na konci štvorhodinovej doby vystavenia (v prípade povrchovo neaktívnych tuhých látok) sa zaznamená zákal a priepustnosť každej rohovky. Každá rohovka sa takisto vizuálne prehliadne a zaznamenajú sa prípadné zistenia (napr. zlupovanie tkaniva, zvyšky testovanej chemikálie, vzorky s nerovnomerným zákalom). Tieto pozorovania by mohli byť dôležité, lebo sa môžu prejaviť v odchýlkach vo výsledkoch odčítavaných z opacitometra.
                     
                        Kontrolné chemikálie
                     
                     Do každého pokusu sa zaradia súbežné negatívne kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča a pozitívne kontroly.
                     Keď sa testuje kvapalná látka s koncentráciou 100 %, zaradí sa súbežná negatívna kontrola (napr. 0,9 % roztok chloridu sodného alebo destilovaná voda) do testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, aby sa dali zistiť nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa poskytol základ pre sledované parametre skúšky. Tým sa takisto zabezpečí, aby v dôsledku podmienok skúšky nedošlo k neprimeranej reakcii vo forme podráždenia.
                     Keď sa testuje zriedená kvapalina, povrchovo aktívna látka alebo tuhá látka, do testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa zaradí súbežná kontrolná skupina rozpúšťadla/nosiča, aby sa dali zistiť nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa poskytol základ pre sledované parametre skúšky. Môže sa použiť iba také rozpúšťadlo/nosič, u ktorého sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém.
                     Do každého pokusu sa zaradí chemikália známa schopnosťou vyvolať podráždenie očí ako súbežná pozitívna kontrola, čím sa overí integrita testovacieho systému a jeho správne vykonávanie. V snahe zabezpečiť možnosť posúdiť variabilitu reakcie pri pozitívnej kontrole v čase by však rozsah dráždivej reakcie nemal byť nadmerný.
                     Príklady pozitívnych kontrol pri kvapalných testovaných chemikáliách sú 100 % etanol alebo 100 % dimetylformamid. Príkladom pozitívnej kontroly pri tuhých testovaných chemikáliách je 20 % hmotnostnej koncentrácie imidazolu v 0,9 % roztoku chloridu sodného.
                     Referenčné chemikálie sú užitočné na posudzovanie potenciálu neznámych chemikálií určitej chemickej triedy alebo triedy výrobkov vyvolať očnú dráždivosť, alebo na posudzovanie potenciálu pomernej dráždivosti chemikálie spôsobujúcej podráždenie očí v rámci osobitného rozsahu dráždivých reakcií.
                     
                        Merané sledované parametre
                     
                     Zákal sa určuje množstvom prepusteného svetla cez rohovku. Zákal rohovky sa kvantitatívne meria pomocou opacitometra a výsledkom sú hodnoty zákalu merané na spojitej stupnici.
                     Priepustnosť sa určuje množstvom farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prenikne cez všetky bunkové vrstvy rohovky (t. j. od epitelu na vonkajšom povrchu rohovky cez endotel na vnútornom povrchu rohovky). Jeden ml roztoku fluoresceínu sodného (4 mg/ml pri testovaní kvapalín a povrchovo aktívnych látok alebo 5 mg/ml pri testovaní povrchovo neaktívnych tuhých látok) sa pridá do prednej komory držiaka rohovky, ktorá je spojená s epitelovou stranou rohovky, zatiaľ čo zadná komora, ktorá je spojená s endotelovou stranou rohovky, sa naplní čerstvým EMEM. Držiak sa potom inkubuje v horizontálnej polohe počas 90 ± 5 minút pri teplote 32 ± 1 °C. Množstvo fluoresceínu sodného, ktorý prejde do zadnej komory, sa kvantitatívne odmeria pomocou UV/VIS spektrofotometrie. Spektrofotometrické merania hodnotené pri 490 nm sa zaznamenajú ako hodnoty optickej hustoty (OD490) alebo absorbancie, ktoré sa merajú na spojitej stupnici. Hodnoty priepustnosti fluoresceínu sa stanovia použitím hodnôt OD490 nameraných spektrofotometrom pri viditeľnom svetle s použitím štandardnej dĺžky dráhy 1 cm.
                     Alternatívne sa môže použiť snímač 96-jamkovej mikrotitračnej platničky za predpokladu, že i) je možné vytvoriť lineárny rozsah snímača platničiek na stanovenie hodnôt OD490 pre fluoresceín a ii) použije sa správny objem vzoriek fluoresceínu na 96-jamkovej platničke, aby výsledkom boli hodnoty OD490, ktoré sa rovnajú štandardnej dĺžke dráhy 1 cm [to by mohlo vyžadovať kompletné naplnenie jamky (zvyčajne 360 μl)].
                     PREENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Vyhodnotenie údajov
                     
                     Keď sa vykoná korekcia hodnôt zákalu a priemerných hodnôt priepustnosti (OD490) na zákal pozadia a hodnoty priepustnosti OD490 pre negatívnu kontrolu, priemerné hodnoty zákalu a priepustnosti OD490 pre každú ovplyvnenú skupinu by sa mali dosadiť do empiricky odvodeného vzorca na výpočet skóre in vitro dráždivosti (ďalej len „IVIS”) pre každú ovplyvnenú skupinu takto:
                     IVIS = priemerná hodnota zákalu + (15 × priemerná hodnota priepustnosti OD490)
                     Sina et al. (16) oznámili, že tento vzorec bol odvodený pri vnútrolaboratórnych a medzilaboratórnych štúdiách. Údaje vypočítané pre súbor 36 zlúčenín v rámci štúdie za účasti viacerých laboratórií boli podrobené analýze podľa viacerých náhodných premenných s cieľom určiť rovnicu, ktorá by najlepšie vyjadrovala vzťah medzi údajmi in vivo a in vitro. Túto analýzu vykonali vedci v dvoch nezávislých spoločnostiach a odvodili takmer totožné rovnice.
                     Hodnoty zákalu a priepustnosti by sa mali posudzovať aj samostatne, aby sa zistilo, či testovaná chemikália vyvolala žieravý účinok alebo silné podráždenie iba prostredníctvom jedného z dvoch sledovaných parametrov (pozri rozhodovacie kritériá).
                     
                        Rozhodovacie kritériá
                     
                     Ďalej sa uvádzajú hraničné hodnoty IVIS na identifikáciu testovaných chemikálií, ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN), a testovaných chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí (bez kategórie v zmysle GHS OSN):
                     
                                 IVIS
                              
                              
                                 GHS OSN
                              
                           
                                 ≤ 3
                              
                              
                                 bez kategórie
                              
                           
                                 > 3; ≤ 55
                              
                              
                                 predpoklad nie je možný
                              
                           
                                 > 55
                              
                              
                                 kategória 1
                              
                           
                        Kritériá prijateľnosti testu
                     
                     Test sa považuje za prijateľný, ak výsledkom pozitívnej kontroly je IVIS, ktoré patrí do rozsahu dvoch štandardných odchýlok aktuálneho historického priemeru, ktorý sa má aktualizovať aspoň každé tri mesiace, alebo vždy, keď sa vykoná nejaký prijateľný test v laboratóriách, v ktorých sa testy vykonávajú zriedkavo (t. j. menej ako raz za mesiac). Výsledkom reakcií negatívnej kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča by mali byť hodnoty zákalu a priepustnosti, ktoré sú menšie ako stanovené horné medze hodnôt zákalu pozadia a priepustnosti pre hovädzie rohovky ovplyvnené príslušnou negatívnou kontrolou alebo kontrolou rozpúšťadla/nosiča. V prípade testovanej chemikálie s jednoznačnou výslednou klasifikáciou by malo byť postačujúce jedno testovanie, ktoré zahŕňa použitie aspoň troch rohoviek. Ak sa však pri prvom testovaní dosiahnu hraničné výsledky, malo by sa zvážiť druhé testovanie (no nevyžaduje sa nevyhnutne), ako aj tretie v prípade, že sa výsledky priemerného IVIS z prvých dvoch testovaní odlišujú. V tejto súvislosti sa výsledok prvého testovania pokladá za hraničný, ak predpoklady týkajúce sa troch rohoviek boli nesúhlasné tak, že:
                     
                                 —
                              
                              
                                 predpoklady týkajúce sa 2 z 3 rohoviek boli nesúhlasné v porovnaní s predpokladmi založenými na priemere všetkých 3 rohoviek, ALEBO
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 predpoklad týkajúci sa 1 z 3 rohoviek bol nesúhlasný v porovnaní s predpokladom založeným na priemere všetkých 3 rohoviek A tento nesúhlasný výsledok bola hodnota > 10 jednotiek IVIS od hraničnej prahovej hodnoty 55.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Ak sa opakovaným testovaním potvrdí predpoklad vychádzajúci z prvého testovania (na základe priemernej hodnoty IVIS), potom možno prijať konečné rozhodnutie bez ďalšieho testovania. Ak opakované testovanie vedie k predpokladu, ktorý je nesúhlasný v porovnaní s predpokladom vychádzajúcim z prvého testovania (na základe priemernej hodnoty IVIS), potom by sa malo vykonať tretie a konečné testovanie s cieľom vyriešiť rozdiely medzi predpokladmi a klasifikovať príslušnú testovanú chemikáliu. Upustenie od ďalšieho testovania na účely klasifikácie a označovania možno povoliť v prípade, že sa na základe ktoréhokoľvek testovania dospeje k predpokladu, že chemikália má byť zaradená do kategórie 1 GHS OSN.
                              
                           
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie, ak sú relevantné pre vykonanie štúdie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované a kontrolné chemikálie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             názov(-vy) chemikálie(-ií), ako je systémový názov, ktorý používa služba Chemical Abstracts Service (ďalej len „CAS”), a po ňom iné názvy, ak sú známe, registračné číslo CAS, ak je známe,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             čistota a zloženie testovanej/kontrolnej chemikálie (v hmotnostných percentách), pokiaľ je táto informácia k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzikálno-chemické vlastnosti, ako je fyzikálny stav, prchavosť, pH, stabilita, chemická trieda, rozpustnosť vo vode, relevantné pre vykonanie štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadná úprava testovaných/kontrolných chemikálií pred testovaním (napr. zahrievanie, drvenie),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita, ak je známa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Informácie týkajúce sa objednávateľa a testovacieho zariadenia
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             meno a adresa objednávateľa, testovacieho zariadenia a vedúceho štúdie.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testovacej metódy
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý opacitometer (napr. model a špecifikácie) a nastavenia prístroja,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informácie o kalibrácii pomôcok používaných na meranie zákalu a priepustnosti (napr. opacitometer a spektrofotometer) na zabezpečenie linearity meraní,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             typ použitých držiakov rohovky (napr. model a špecifikácie),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis ďalšieho použitého vybavenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             postup použitý na zabezpečenie integrity (t. j. presnosti a spoľahlivosti) testovacej metódy priebežne (napr. pravidelné testovanie chemikálií na preukázanie spôsobilosti).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kritériá na prijateľný test
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             prijateľné rozsahy súbežných pozitívnych a negatívnych kontrol na základe historických údajov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadne prijateľné rozsahy súbežných referenčných kontrol na základe historických údajov.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Odber a príprava očí
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikácia zdroja očí (t. j. zariadenie, v ktorom sa vykonal ich odber),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             priemer rohovky ako meradlo veku zvieraťa, ktoré bolo zdrojom rohovky, a vhodnosti na danú skúšku,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podmienky skladovania a dopravy očí (napr. dátum a čas odberu očí, časový interval pred začiatkom testovania, dopravné médiá a teplotné podmienky, akékoľvek použité antibiotiká),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             príprava a upevnenie hovädzích rohoviek vrátane vyhlásení o ich kvalite, teplota držiakov rohovky a kritériá výberu rohoviek používaných na testovanie.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Postup testu
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             počet použitých replikátov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identita použitých negatívnych a pozitívnych kontrol (prípadne aj kontrola rozpúšťadla a referenčné kontroly),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia(-e) testovanej chemikálie, aplikácia, doba vystavenia a postexpozičná doba inkubácie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých hodnotiacich a rozhodovacích kritérií,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých kritérií prijateľnosti štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis všetkých modifikácií testovacieho postupu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých rozhodovacích kritérií.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje z individuálnych testovacích vzoriek spracované v podobe tabuľky [napr. hodnoty zákalu a OD490 a vypočítané hodnoty IVIS pre testovanú chemikáliu a pozitívne, negatívne a referenčné kontroly (ak sú zahrnuté) poskytnuté vo forme tabuľky vrátane prípadných údajov o opakovaných pokusoch s replikátmi, ako aj priemerné hodnoty ± štandardná odchýlka pri každom pokuse],
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis ďalších pozorovaných účinkov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadne odvodená klasifikácia GHS OSN in vitro.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskusia o výsledkoch
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Dostupné na: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostupné na: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 UN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Dostupné na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24:1-9.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Dostupné na: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Dostupné na: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Dostupné na: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on – Part I. The Lancet 349: 636-641.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Chapter B.5 of this Annex, Acute eye irritation/corrosion.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Dostupné na: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).
                                 Dostupné: na: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Presnosť
                           : blízkosť zhody medzi výsledkami testovacej metódy a akceptovanými referenčnými hodnotami. Ide o meranie analytického výkonu testovacej metódy a jeden aspekt „relevantnosti“. Tento pojem sa často zamieňa s pojmom „zhoda“ na označenie podielu správnych výsledkov testovacej metódy.
                        
                           
                              Referenčná chemikália
                           : chemikália, ktorá sa používa ako štandardná na porovnávanie s testovanou chemikáliou. Referenčná chemikália by mala mať tieto vlastnosti: i) konzistentný(-é) a spoľahlivý(-é) zdroj(-e); ii) štrukturálna a funkčná podobnosť s triedou chemikálií, ktoré sa testujú; iii) známe fyzikálno-chemické vlastnosti; iv) podporné údaje o známych účinkoch a v) známy potenciál v rozsahu želanej reakcie.
                        
                           
                              Prístup zdola nahor
                           : prístup v postupných krokoch použitý v prípade chemikálie, o ktorej sa predpokladá, že nevyžaduje klasifikáciu ako chemikália spôsobujúca podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí. Začína odlíšením chemikálií nevyžadujúcich klasifikáciu (negatívny výsledok) od ostatných chemikálií (pozitívny výsledok).
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Rohovka
                           : priehľadná časť prednej strany očnej gule, ktorá pokrýva dúhovku a zrenicu a prepúšťa svetlo do vnútra oka.
                        
                           
                              Zákal rohovky
                           : meranie rozsahu zakalenia rohovky po vystavení účinkom testovanej chemikálie. Zvýšený zákal rohovky je príznakom poškodenia rohovky. Zákal možno posudzovať subjektívne, ako napr. pomocou Draizovho očného testu na králikoch, alebo objektívne pomocou prístroja, ako je „opacitometer“.
                        
                           
                              Priepustnosť rohovky
                           : kvantitatívne meranie poškodenia epitelu rohovky stanovením množstva farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prejde cez všetky bunkové vrstvy rohovky.
                        
                           
                              Podráždenie očí
                           : vyvolanie zmien v oku po aplikácii testovanej chemikálie na vonkajší povrch oka, ktoré sú do 21 dní po aplikácii úplne reverzibilné. Zamieňa sa s pojmami „reverzibilné účinky na oči“ a „kategória 2 GHS OSN“ (4).
                        
                           
                              Miera falošnej negativity
                           : podiel všetkých pozitívnych chemikálií, ktoré sú na základe testovacej metódy nesprávne identifikované ako negatívne. Je to jeden ukazovateľ analytického výkonu testovacej metódy.
                        
                           
                              Miera falošnej pozitivity
                           : podiel všetkých negatívnych chemikálií, ktoré sú na základe testovacej metódy nesprávne identifikované ako pozitívne. Je to jeden ukazovateľ analytického výkonu testovacej metódy.
                        
                           
                              Nebezpečnosť
                           : inherentná vlastnosť činidla alebo situácia, ktorá má potenciál spôsobiť nepriaznivé účinky, ak sú organizmus, systém alebo populácia (subpopulácia) vystavené účinkom tohto činidla.
                        
                           
                              Skóre in vitro dráždivosti (IVIS)
                           : empiricky odvodený vzorec používaný v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, v ktorom sa priemerná hodnota zákalu a priemerná hodnota priepustnosti v každej ovplyvnenej skupine spoja do jednej hodnoty (skóre) in vitro) ovplyvnenej skupiny. IVIS = priemerná hodnota zákalu + (15 × priemerná hodnota priepustnosti).
                        
                           
                              Ireverzibilné účinky na oči
                           : pozri „vážne poškodenie očí“.
                        
                           
                              Zmes
                           : zmes alebo roztok pozostávajúce z dvoch alebo viacerých látok, ktoré v nej/ňom nereagujú (4).
                        
                           
                              Negatívna kontrola
                           : neovplyvňovaný replikát, ktorý obsahuje všetky zložky testovacieho systému. Táto vzorka sa spracuje so vzorkami ovplyvnenými testovanou chemikáliou a s inými kontrolnými vzorkami s cieľom stanoviť, či rozpúšťadlo a testovací systém na seba navzájom pôsobia.
                        
                           
                              Neklasifikované
                           : chemikálie, ktoré nie sú klasifikované v kategórii chemikálií spôsobujúcich podráždenie očí (kategória 2, 2A, alebo 2B GHS OSN) ani chemikálií spôsobujúcich vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN). Zamieňa sa s pojmom „bez kategórie v zmysle GHS OSN“.
                        
                           
                              Opacitometer
                           : prístroj na meranie „zákalu rohovky“ kvantitatívnym vyhodnotením priepustnosti svetla cez rohovku. Typický prístroj má dve priehradky, z ktorých každá má vlastný zdroj svetla a fotobunku. Jedna priehradka sa používa na ovplyvnenú rohovku, zatiaľ čo druhá sa používa na kalibrovanie a vynulovanie prístroja. Svetlo z halogénovej lampy sa vyšle cez kontrolnú priehradku (prázdna komora bez okienok alebo kvapaliny) do fotobunky a porovná sa so svetlom vyslaným do fotobunky cez testovaciu priehradku, v ktorej je umiestnená komora s rohovkou. Rozdiel v priepustnosti svetla z fotobuniek sa porovná a na číslicovom displeji sa ukáže číselná hodnota zákalu.
                        
                           
                              Pozitívna kontrola
                           : replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému a ovplyvnený chemikáliou, o ktorej je známe, že vyvoláva pozitívnu reakciu. S cieľom zabezpečiť možnosť posudzovať variabilitu reakcie pozitívnej kontroly v priebehu času by rozsah pozitívnej reakcie nemal byť nadmerne veľký.
                        
                           
                              Reverzibilné účinky na oči
                           : pozri „podráždenie očí“.
                        
                           
                              Spoľahlivosť
                           : merania rozsahu, v rámci ktorého môže byť testovacia metóda v priebehu určitého času reprodukovateľná v rámci laboratórií a medzi nimi navzájom, keď sa používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypočítaním vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti a medzilaboratórnej opakovateľnosti.
                        
                           
                              Vážne poškodenie očí
                           : vyvolanie poškodenia tkaniva oka alebo vážneho fyzického zhoršenia zraku po aplikácii testovanej chemikálie na vonkajší povrch oka, ktoré nie je úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii. Zamieňa sa s pojmami „ireverzibilné účinky na oči“ a „kategória 1 GHS OSN“ (4).
                        
                           
                              Kontrola rozpúšťadla/nosiča
                           : neovplyvnená vzorka, ktorá obsahuje všetky zložky testovacieho systému vrátane rozpúšťadla alebo nosiča a ktorá sa spracúva so vzorkami ovplyvnenými testovanou chemikáliou a s inými kontrolnými vzorkami, aby sa zistila základná reakcia vzoriek ovplyvnených testovanou chemikáliou rozpustenou v tom istom rozpúšťadle alebo nosiči. Keď sa táto vzorka testuje so súbežnou negatívnou kontrolou, preukazuje aj to, či rozpúšťadlo alebo nosič na seba s testovacím systémom navzájom pôsobia.
                        
                           
                              Látka
                           : chemické prvky a ich zlúčeniny v prirodzenom stave alebo získané akýmkoľvek procesom výroby vrátane akejkoľvek prísady potrebnej na udržanie stability produktu a akýchkoľvek nečistôt vzniknutých v použitom procese, ale s výnimkou každého rozpúšťadla, ktoré možno oddeliť bez ovplyvnenia stability látky alebo zmeny jej zloženia (4).
                        
                           
                              Povrchovo aktívna látka
                           : takisto nazývaná surfaktant, je látka, ako napríklad detergent, ktorá dokáže znížiť povrchové napätie kvapaliny, a tak jej umožniť penenie alebo prenikanie do tuhých látok. Nazýva sa aj zvlhčujúce činidlo.
                        
                           
                              Zmes obsahujúca povrchovo aktívne látky
                           : v kontexte tejto testovacej metódy je to zmes obsahujúca jednu alebo viac povrchovo aktívnych látok s konečnou koncentráciou > 5 %.
                        
                           
                              Prístup zhora nadol
                           : prístup v postupných krokoch použitý v prípade chemikálie, o ktorej sa predpokladá, že spôsobuje vážne poškodenie očí. Začína odlíšením chemikálií spôsobujúcich vážne poškodenie očí (pozitívny výsledok) od ostatných chemikálií (negatívny výsledok).
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.
                        
                           
                              Stratégia viacúrovňového testovania
                           : stratégia postupného testovania, pri ktorej sa v presne určenom poradí na každej úrovni preskúmavajú všetky existujúce informácie o testovanej chemikálii pomocou analýzy váhy dôkazov s cieľom zistiť, či sú dostupné dostatočné informácie na to, aby sa mohlo prijať rozhodnutie o klasifikácii nebezpečnosti pred tým, ako sa postúpi na ďalšiu úroveň. Ak možno testovanej chemikálii na základe existujúcich informácií pripísať potenciál spôsobiť podráždenie, nevyžaduje sa ďalšie testovanie. Ak na základe existujúcich informácií nemožno testovanej chemikálii pripísať potenciál spôsobiť podráždenie očí, použije sa prístup postupného testovania na zvieratách v jednotlivých krokoch, až kým nebude možná jednoznačná klasifikácia.
                        
                           
                              Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie spojených národov (OSN)
                           : systém navrhujúci klasifikáciu chemikálií (látok a zmesí) podľa štandardizovaných typov a úrovní fyzikálnych, zdravotných a enivornmentálnych nebezpečností a ich označovanie zodpovedajúcimi komunikačnými prvkami, ako sú piktogramy, výstražné slová, výstražné upozornenia, bezpečnostné upozornenia a karty bezpečnostných údajov, s cieľom poskytnúť informácie o nepriaznivých účinkoch daných chemikálií v záujme ochrany osôb (vrátane zamestnávateľov, pracovníkov, prepravcov, spotrebiteľov a subjektov reakcie na núdzové situácie) a životného prostredia (4).
                        
                           
                              Kategória 1 GHS OSN
                           : pozri „vážne poškodenie očí“.
                        
                           
                              Kategória 2 GHS OSN
                           : pozri „podráždenie očí“.
                        
                           
                              Bez kategórie v zmysle GHS OSN
                           : chemikálie, ktoré nespĺňajú požiadavky na klasifikáciu ako chemikálie kategórie 1 alebo 2 (2A alebo 2B) GHS OSN. Zamieňa sa s pojmom „neklasifikované“.
                        
                           
                              Validovaná testovacia metóda
                           : testovacia metóda, v prípade ktorej sa vykonali validačné štúdie s cieľom určiť relevantnosť (vrátane presnosti) a spoľahlivosť na konkrétny účel. Je dôležité poznamenať, že validovaná testovacia metóda nemusí poskytnúť postačujúci analytický výkon z hľadiska presnosti a spoľahlivosti, aby bola prijateľná pre navrhovaný účel.
                        
                           
                              Analýza váhy dôkazov
                           : postup posudzovania silných a slabých stránok rôznych informácií na dosiahnutie a podporu záveru, pokiaľ ide o potenciál nebezpečnosti testovanej chemikálie.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           PREDIKTÍVNA SCHOPNOSŤ TESTOVACEJ METÓDY ZÁKALU A PRIEPUSTNOSTI HOVÄDZEJ ROHOVKY
                        
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Prediktívna schopnosť testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, pokiaľ ide o identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí [kategória 1 GHS OSN/EÚ CLP v. iné ako kategória 1 (kategória 2 + bez kategórie); kategória I US EPA v. iné ako kategória I (kategória II + kategória III + kategória IV)]
                        
                        
                                    Klasifikačný systém
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    Presnosť
                                 
                                 
                                    Citlivosť
                                 
                                 
                                    Falošné negatívne výsledky
                                 
                                 
                                    Špecifickosť
                                 
                                 
                                    Falošné pozitívne výsledky
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                              
                                    GHS OSN
                                    EÚ CLP
                                 
                                 
                                    191
                                 
                                 
                                    78,53
                                 
                                 
                                    150/191
                                 
                                 
                                    86,15
                                 
                                 
                                    56/65
                                 
                                 
                                    13,85
                                 
                                 
                                    9/65
                                 
                                 
                                    74,60
                                 
                                 
                                    94/126
                                 
                                 
                                    25,40
                                 
                                 
                                    32/126
                                 
                              
                                    US EPA
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    78,95
                                 
                                 
                                    150/190
                                 
                                 
                                    85,71
                                 
                                 
                                    54/63
                                 
                                 
                                    14,29
                                 
                                 
                                    9/63
                                 
                                 
                                    75,59
                                 
                                 
                                    96/127
                                 
                                 
                                    24,41
                                 
                                 
                                    31/127
                                 
                              
                           
                        
                           Tabuľka 2
                        
                        
                           Prediktívna schopnosť testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, pokiaľ ide o identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí („nedráždivé látky“) [bez kategórie GHS OSN/EÚ CLP v. nie bez kategórie (kategória 1 + kategória 2); kategória IV US EPA v. iné ako kategória IV (kategória I + kategória II + kategória III)]
                        
                        
                                    Klasifikačný systém
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    Presnosť
                                 
                                 
                                    Citlivosť
                                 
                                 
                                    Falošné negatívne výsledky
                                 
                                 
                                    Špecifickosť
                                 
                                 
                                    Falošné pozitívne výsledky
                                 
                              
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                                 
                                    %
                                 
                                 
                                    Počet
                                 
                              
                                    GHS OSN
                                    EÚ CLP
                                 
                                 
                                    196
                                 
                                 
                                    68,88
                                 
                                 
                                    135/196
                                 
                                 
                                    100
                                 
                                 
                                    107/107
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    0/107
                                 
                                 
                                    31,46
                                 
                                 
                                    28/89
                                 
                                 
                                    68,54
                                 
                                 
                                    61/89
                                 
                              
                                    US EPA
                                 
                                 
                                    190
                                 
                                 
                                    82,11
                                 
                                 
                                    156/190
                                 
                                 
                                    93,15
                                 
                                 
                                    136/146
                                 
                                 
                                    6,85
                                 
                                 
                                    10/146
                                 
                                 
                                    45,45
                                 
                                 
                                    20/44
                                 
                                 
                                    54,55
                                 
                                 
                                    24/44
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           CHEMIKÁLIE NA PREUKÁZANIE SPÔSOBILOSTI VYKONÁVAŤ TESTOVACIU METÓDU ZÁKALU A PRIEPUSTNOSTI HOVÄDZEJ ROHOVKY
                        
                        Pred rutinným použitím tejto testovacej metódy by laboratóriá mali preukázať technickú spôsobilosť tak, že správne určia klasifikáciu nebezpečnosti pre oči v prípade 13 chemikálií odporúčaných v tabuľke 1. Tieto chemikálie boli vybraté tak, aby predstavovali rozsah reakcií na nebezpečnosti pre oči na základe výsledkov očného testu in vivo na králikoch (TG 405) (17) a klasifikačného systému GHS OSN (t. j. kategórie 1, 2A, 2B alebo neklasifikované) (4). Ďalším kritériom výberu bola komerčná dostupnosť chemikálií, dostupnosť vysoko kvalitných referenčných údajov in vivo a dostupnosť vysoko kvalitných údajov z testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky in vitro. Referenčné údaje sú dostupné v skrátenom súhrnnom dokumente (Streamlined Summary Document) (3) a v podkladovom kontrolnom dokumente (Background Review Document) ICCVAM pre testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky (2)(18).
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Odporúčané chemikálie na preukazovanie technickej spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky
                        
                        
                                    Chemikália
                                 
                                 
                                    CAS číslo
                                 
                                 
                                    Chemická trieda (8)
                                    
                                 
                                 
                                    Fyzikálna forma
                                 
                                 
                                    Klasifikácia in vivo
                                        (9)
                                    
                                 
                                 
                                    Klasifikácia na základe testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky
                                 
                              
                                    Benzalkónium chlorid (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    óniová zlúčenina
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Chlórhexidín
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    amín, amidín
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Kyselina dibenzoyl-L-vínna
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    karboxylová kyselina, ester
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Imidazol
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    heterocyklická zlúčenina
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Kyselina trichlóroctová (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    karboxylová kyselina
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    2,6-dichlórbenzoyl chlorid
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    acylhalogenid
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 2A
                                 
                                 
                                    nie je možný presný/spoľahlivý predpoklad
                                 
                              
                                    Etyl-2-metylacetoacetát
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    ketón, ester
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 2B
                                 
                                 
                                    nie je možný presný/spoľahlivý predpoklad
                                 
                              
                                    Dusičnan amónny
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    anorganická soľ
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 2 (10)
                                    
                                 
                                 
                                    nie je možný presný/spoľahlivý predpoklad
                                 
                              
                                    EDTA, di-draselná soľ
                                 
                                 
                                    25102-12-9
                                 
                                 
                                    Amín, karboxylová kyselina (soľ)
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                              
                                    Tween 20
                                 
                                 
                                    9005-64-5
                                 
                                 
                                    Ester, polyéter
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                              
                                    2-merkaptopyrimidín
                                 
                                 
                                    1450-85-7
                                 
                                 
                                    acylhalogenid
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                              
                                    Fenylbutazón
                                 
                                 
                                    50-33-9
                                 
                                 
                                    heterocyklické zlúčeniny
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                              
                                    Polyoxyetylén 23 lauryl éter (BRIJ-35) (10 %)
                                 
                                 
                                    9002-92-0
                                 
                                 
                                    alkohol
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                                 
                                    neklasifikované
                                 
                              
                                    Skratky: CAS číslo = registračné číslo CAS (Chemical Abstracts Service)
                                 
                              
                     
                        Dodatok 4
                        DRŽIAK ROHOVKY TESTOVACEJ METÓDY ZÁKALU A PRIEPUSTNOSTI HOVÄDZEJ ROHOVKY
                        Držiaky rohoviek testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sú vyrobené z inertného materiálu (napr. z polypropylénu). Držiaky sa skladajú z dvoch polovíc (prednej a zadnej komory) a majú dve podobné valcovité vnútorné komory. Každá komora je navrhnutá tak, aby obsiahla objem 5 ml a je ukončená skleneným okienkom, cez ktoré sa zaznamenávajú namerané údaje zákalu. Každá vnútorná komora má priemer 1,7 cm a hĺbku 2,2 cm (11). Proti presakovaniu sa používa tesniaci krúžok umiestnený na zadnej komore. Rohovky sa umiestňujú endotelovou stranou nadol na tesniaci krúžok zadných komôr a predné komory sa umiestnia na epitelovú stranu rohoviek. Komory sú zafixované na mieste tromi nehrdzavejúcimi skrutkami nachádzajúcimi sa na vonkajších okrajoch komory. Na konci každej komory je sklenené okienko, ktoré sa môže vybrať, aby sa zabezpečil ľahší prístup k rohovke. Tesniaci krúžok sa takisto nachádza medzi skleneným okienkom a komorou, aby bránil presakovaniu. Dva otvory na vrchnej strane každej komory umožňujú zavedenie a odstránenie média a testovaných chemikálií. V čase ovplyvňovania a inkubácie sú uzavreté gumovými uzávermi. Priepustnosť svetla držiakmi rohovky sa potenciálne môže zmeniť, keďže účinky opotrebovania alebo akumulácie špecifických chemických rezíduí na otvoroch vnútornej strany komory alebo na sklenených okienkach môžu ovplyvniť rozptyl alebo odraz svetla. Dôsledkom by mohla byť zvýšená alebo znížená priepustnosť základného svetla (a teda zníženie alebo zvýšenie odčítaných základných údajov o zákale) cez držiaky rohoviek, ktoré môže byť viditeľné ako markantné zmeny v očakávaných základných počiatočných meraniach zákalu rohovky v jednotlivých komorách (t. j. počiatočné hodnoty zákalu rohovky sa v určitých jednotlivých držiakoch rohoviek môžu rutinne líšiť o viac než 2 alebo 3 zákalové jednotky od očakávaných základných hodnôt). Každé laboratórium by malo zvážiť zavedenie programu na hodnotenie zmien v priepustnosti svetla cez držiaky rohoviek, a to v závislosti od povahy chemického zloženia testovaných látok a od frekvencie používania komôr. S cieľom stanoviť základné hodnoty sa držiaky rohoviek môžu pred rutinným použitím skontrolovať tak, že sa odmerajú základné hodnoty zákalu (alebo priepustnosť svetla) komôr naplnených kompletným médiom, bez rohoviek. Držiaky rohoviek sa následne pravidelne kontrolujú, či počas používania nenastali zmeny v priepustnosti svetla. Každé laboratórium si môže stanoviť frekvenciu kontrol držiakov rohoviek na základe testovaných chemikálií, frekvenciu používania a pozorovaní zmien v základných hodnotách zákalu rohoviek. Ak sa spozorujú markantné zmeny v priepustnosti svetla cez držiaky rohoviek, je potrebné zvážiť vhodné vyčistenie a/alebo vyleštenie vnútorného povrchu držiakov rohoviek alebo ich výmenu.
                        
                           Držiak rohovky: rozvinutý diagram
                        
                        
                     
                        Dodatok 5
                        OPACITOMETER
                        Opacitometer je prístroj na meranie priepustnosti svetla. Napríklad v prípade zariadenia OP-KIT od výrobcu Electro Design (Riom, Francúzsko) používaného na validáciu testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa svetlo z halogénovej lampy vyšle cez kontrolnú priehradku (prázdna komora bez okienok alebo kvapaliny) do fotobunky a porovná sa so svetlom vyslaným do fotobunky cez testovaciu priehradku, v ktorej je umiestnená komora s rohovkou. Rozdiel v priepustnosti svetla z fotobuniek sa porovná a na číslicovom displeji sa ukáže číselná hodnota zákalu. Stanovia sa zákalové jednotky. Môžu sa používať aj iné typy opacitometrov s odlišným nastavením (napr. nevyžadujúce si paralelné merania kontrolnej a testovacej priehradky), ak sa dokáže, že vedú k podobným výsledkom ako validované zariadenie.
                        Opacitometer by mal poskytovať lineárnu reakciu pomocou radu údajov o zákale, ktoré pokrývajú hraničné hodnoty používané pre rôzne klasifikácie opísané v prediktívnom modeli (t. j. až po hraničnú hodnotu určujúcu žieravosť/silnú dráždivosť). V snahe zabezpečiť lineárne a presné odčítanie údajov až do 75 – 80 zákalových jednotiek je potrebné vykonať kalibráciu opacitometra s použitím súboru kalibrátorov. Kalibrátory sa vložia do kalibračnej komory (komora na rohovku určená na držanie kalibrátorov) a odčíta sa údaj na opacitometri. Kalibračná komora je navrhnutá tak, aby kalibrátory boli v nej uložené približne v rovnakej vzdialenosti medzi svetlom a fotobunkou, ako by boli uložené rohovky počas meraní zákalu. Referenčné hodnoty a počiatočný nastavený bod závisia od typu použitého zariadenia. Linearita meraní zákalu by sa mala zabezpečiť vhodnými postupmi (špecifickými pre konkrétny prístroj). Napríklad v prípade zariadenia OP-KIT od výrobcu Electro Design (Rion, Francúzsko) sa opacitometer najprv kalibruje na hodnotu 0 zákalových jednotiek s použitím kalibračnej komory bez kalibrátora. Potom sa do kalibračnej komory vložia tri rôzne kalibrátory jeden po druhom a odmerajú sa zákaly. Výsledkom meraní s kalibrátormi 1, 2 a 3 by mali byť údaje o zákale, ktoré sa rovnajú ich nastaveným hodnotám 75, 150 a 225 zákalových jednotiek v uvedenom poradí ± 5 %.
                     “
               
                     13.
                  
                  
                     V časti B sa kapitola B.48 nahrádza takto:
                     „B.48   Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka na identifikáciu i) chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí a ii) chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 438 (2013). Testovaciu metódu izolovaného kuracieho oka ohodnotil Medziagentúrny koordinačný výbor pre validáciu alternatívnych metód (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) v spojení s Európskym centrom pre validáciu alternatívnych metód (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) a Japonským centrom pre validáciu alternatívnych metód (Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) v rokoch 2006 a 2010 (1) (2) (3). Pri prvom hodnotení bola testovacia metóda izolovaného kuracieho oka schválená ako vedecky platná testovacia metóda na používanie ako skrínigový test na identifikáciu chemikálií (látok a zmesí), ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (kategória 1) podľa Globálneho harmonizovaného systému klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie Spojených národov (OSN) (1) (2) (4) a nariadenia (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (nariadenie CLP) (12). V druhom hodnotení bola testovacia metóda izolovaného kuracieho oka hodnotená z hľadiska používania ako skríningový test na identifikáciu chemikálií, ktoré nie sú klasifikované ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa GHS OSN (3) (4). Výsledky validačnej štúdie a odporúčaní výboru pre partnerské preskúmanie potvrdili pôvodné odporúčanie týkajúce sa používania testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na klasifikáciu chemikálií, ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN), keďže dostupná databáza zostala nezmenená od pôvodnej validácie ICCVAM. V tomto štádiu neboli navrhnuté ďalšie odporúčania, pokiaľ ide o rozšírenie oblasti uplatniteľnosti testovacej metódy izolovaného kuracieho oka tak, aby zahŕňala iné kategórie. Prehodnotenie súboru údajov in vitro a in vivo použitých vo validačnej štúdii sa vykonalo so zameraním na vyhodnotenie užitočnosti testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na účely identifikácie chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí (5). V závere tohto prehodnotenia sa uvádza, že testovaciu metódu izolovaného kuracieho oka možno takisto použiť na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa klasifikácie GHS OSN (4) (5). Táto testovacia metóda zahŕňa odporúčané použitia a obmedzenia testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na základe týchto hodnotení. Hlavné rozdiely medzi pôvodnou verziou usmernenia OECD na vykonávanie testov z roku 2009 a jeho aktualizovanou verziou z roku 2013 sa okrem iného vzťahujú na používanie testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu podľa klasifikačného systému GHS OSN, aktualizáciu prvkov skúšobného protokolu, aktualizáciu dodatku 1, pokiaľ ide o definície, a aktualizáciu dodatku 2, pokiaľ ide o chemikálie na preukázanie spôsobilosti.
                     V súčasnosti sa všeobecne uznáva, že v dohľadnej budúcnosti nedokáže ani jeden in vitro test očnej dráždivosti nahradiť Draizov in vivo očný test tak, aby sa dal predpokladať celý rad podráždení pri rôznych chemických triedach. Draizov očný test (6) však možno dokážu nahradiť strategické kombinácie niekoľkých alternatívnych testovacích metód v rámci (viacúrovňovej) testovacej stratégie. Prístup zhora nadol (7) sa má uplatiť vtedy, keď sa na základe existujúcich informácií očakáva, že chemikália má veľký potenciál dráždivých účinkov, zatiaľ čo prístup zdola nahor (7) sa má použiť vtedy, keď sa na základe existujúcich informácií očakáva, že chemikália nedráždi oči v dostatočnej miere na to, aby si vyžadovala klasifikáciu. Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka je testovacia metóda in vitro, ktorú možno použiť za určitých okolností a so špecifickými obmedzeniami opísanými v bodoch 8 až 10 na klasifikáciu chemikálií z hľadiska ich nebezpečnosti pre oči a na ich označovanie. Hoci sa testovacia metóda izolovaného kuracieho oka nepokladá za platnú ako samostatná náhrada za očný test in vivo na králikoch, odporúča sa ako úvodný krok v testovacej stratégii, ako je prístup zhora nadol, ktorý odporúča Scott et al. (7) na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí, t. j. chemikálií, ktoré sa majú klasifikovať ako chemikálie kategórie 1 GHS OSN bez ďalšieho testovania (4). Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka sa takisto odporúča na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa definície GHS OSN (bez kategórie) (4) a môže sa preto používať ako prvý krok v rámci prístupu testovacej stratégie zdola nahor (7). Chemikália, o ktorej sa na základe testovacej metódy izolovaného kuracieho oka nepredpokladá, že spôsobí vážne poškodenie očí alebo že nebude klasifikovaná ako chemikália spôsobujúca podráždenie/vážne poškodenie očí, by si však na stanovenie konečnej klasifikácie vyžadovala ďalšie testovanie (in vitro a/alebo in vivo). Okrem toho by sa pred použitím testovacej metódy izolovaného kuracieho oka v rámci prístupu zdola nahor podľa iných klasifikačných schém než GHS OSN malo konzultovať s príslušnými regulačnými orgánmi.
                     Cieľom tejto testovacej metódy je opísať postupy používané na hodnotenie potenciálu testovanej chemikálie predstavovať nebezpečnosť pre oči, a to na základe merania jej schopnosti vyvolať alebo nevyvolať toxicitu v odobratom kuracom oku. Toxické účinky na rohovku sa merajú i) kvalitatívnym posúdením zákalu, ii) kvalitatívnym posúdením poškodenia epitelu na základe aplikácie fluoresceínu do oka (zadržiavanie fluoresceínu), iii) kvantitatívnym meraním zväčšenej hrúbky (opuchu) a iv) kvalitatívnym vyhodnotením makroskopického morfologického poškodenia povrchu. Posúdenie zákalu, opuchu a poškodenia rohovky po vystavení účinkom testovanej chemikálie sa hodnotia jednotlivo a potom sa zlúčia a odvodí sa klasifikácia očnej dráždivosti.
                     Definície sa uvádzajú v dodatku 1.
                     POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                     Táto testovacia metóda vychádza z protokolu navrhnutého v usmerneňovacom dokumente OECD na vykonávanie testov 160 (8), ktorý bol vypracovaný podľa medzinárodnej validačnej štúdie ICCVAM (1) (3) (9) s príspevkami od Európskeho centra pre validáciu alternatívnych metód, Japonského centra pre validáciu alternatívnych metód a z Odboru toxikológie a aplikovanej farmakológie Organizácie pre aplikovaný prírodovedecký výskum pre kvalitu života (ďalej len „TNO”) (Holandsko). Tento protokol vychádza z informácií získaných zo zverejnených protokolov, ako aj z aktuálneho protokolu, ktorý používa TNO (10) (11) (12) (13) (14).
                     V rámci validácie, ktorá je základom tejto testovacej metódy, bol otestovaný celý rad chemikálií a empirická databáza validačnej štúdie obsahovala 152 chemikálií, z toho 72 látok a 80 zmesí (5). Testovacia metóda je uplatniteľná na tuhé látky, kvapaliny, emulzie a gély. Kvapaliny môžu byť vodné alebo nevodné; tuhé látky môžu byť rozpustné alebo nerozpustné vo vode. Plyny a aerosóli ešte neboli vo validačnej štúdii hodnotené.
                     Testovaciu metódu izolovaného kuracieho oka možno použiť na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí, t. j. chemikálií, ktoré sa majú klasifikovať ako kategória 1 GHS OSN (4). Pri používaní na tento účel sú zistené obmedzenia testovacej metódy izolovaného kuracieho oka založené na vysokých mierach falošnej pozitivity pri alkoholoch a vysokých mierach falošnej negativity pri tuhých látkach a povrchovo aktívnych látkach (1) (3) (9). Miery falošnej negativity v tejto súvislosti (kategória 1 GHS OSN neidentifikovaná ako kategória 1 GHS OSN) však nie sú rozhodujúce, keďže všetky testované chemikálie, ktoré majú negatívny výsledok, by sa následne testovali pomocou iného(-ých) adekvátne validovaného(-ých) in vitro testu(-ov), alebo – ako posledná možnosť – na králikoch, v závislosti od regulačných požiadaviek pomocou stratégie postupného testovania v rámci analýzy váhy dôkazov. Malo by sa poznamenať, že tuhé látky môžu spôsobiť premenlivé a extrémne podmienky expozície pri Draizovom in vivo teste očnej dráždivosti, čo môže viesť k nerelevantným predpokladom týkajúcim sa ich skutočného potenciálu spôsobiť podráždenie (15). Výskumní pracovníci by mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy v prípade všetkých typov chemikálií, pri ktorých by sa mal pozitívny výsledok prijať ako indikátor vážneho poškodenia očí, t. j. kategória 1 GHS OSN bez ďalšieho testovania. Pozitívne výsledky získané s použitím alkoholov by sa však mali interpretovať opatrene, keďže existuje riziko nadhodnoteného predpokladu.
                     Keď sa testovacia metóda izolovaného kuracieho oka používa na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN), vykazuje celkovú presnosť 86 % (120/140), mieru falošnej pozitivity 6 % (7/113), a mieru falošnej negativity 48 % (13/27) v porovnaní s údajmi o metóde očného testu in vivo na králikoch s klasifikáciou podľa klasifikačného systému GHS OSN (4) (5).
                     Testovaciu metódu izolovaného kuracieho oka možno takisto použiť na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa klasifikačného systému GHS OSN (4). Pred použitím testovacej metódy izolovaného kuracieho oka v rámci prístupu zdola nahol podľa iných klasifikačných schém by sa malo konzultovať s príslušnými regulačnými orgánmi. Túto testovaciu metódu možno použiť v prípade všetkých typov chemikálií, pričom by sa mohol prijať negatívny výsledok a neklasifikovať chemikáliu ako chemikáliu spôsobujúcu podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí. Na základe jedného výsledku z validačnej databázy však môže v prípade antivegetatívnych farieb obsahujúcich organické rozpúšťadlá dôjsť k podhodnotenému predpokladu (5).
                     Keď sa testovacia metóda izolovaného kuracieho oka používa na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí, vykazuje celkovú presnosť 82 % (125/152), mieru falošnej pozitivity 33 % (26/79), a mieru falošnej negativity 1 % (1/73) v porovnaní s údajmi o metóde očného testu in vivo na králikoch s klasifikáciou podľa klasifikačného systému GHS OSN (4) (5). Keď sa testované chemikálie v rámci určitých tried (t. j. antivegetatívne farby obsahujúce organické rozpúšťadlá) vylúčia z databázy, testovacia metóda izolovaného kuracieho oka vykazuje podľa klasifikačného systému GHS OSN presnosť 83 % (123/149), mieru falošnej pozitivity 33 % (26/78), a mieru falošnej negativity 0 % (0/71) (4) (5).
                     Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka sa neodporúča na identifikáciu testovaných chemikálií, ktoré by sa mali klasifikovať ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí (t. j. kategória 2 alebo kategória 2A GHS OSN) alebo testovaných chemikálií, ktoré by sa mali klasifikovať ako chemikálie spôsobujúce mierne podráždenie očí (kategória 2B GHS OSN) vzhľadom na značné množstvo chemikálií kategórie 1 GHS OSN, ktoré sú zaradené do príliš nízkej kategórie, ako napr. kategória 2, 2A alebo 2B GHS OSN a chemikálií bez kategórie v zmysle GHS OSN, ktoré sú zaradené do príliš vysokej kategórie, ako napr. kategória 2, 2A alebo 2B GHS OSN. Na tento účel sa môže vyžadovať ďalšie testovanie pomocou inej vhodnej metódy.
                     Všetky postupy, pri ktorých sa používajú kuracie oči, by mali byť v súlade s platnými nariadeniami a postupmi vzťahujúcimi sa na dané testovacie zariadenie v oblasti zaobchádzania s materiálom živočíšneho pôvodu (ľudského alebo zvieracieho), medzi ktoré okrem iného patria tkanivá a tkanivové tekutiny. Odporúčajú sa všeobecne platné laboratórne bezpečnostné opatrenia (16).
                     Zatiaľ čo pri testovacej metóde izolovaného kuracieho oka sa nezohľadňujú spojovkové a dúhovkové poškodenia, ktoré sa hodnotia v testovacej metóde očnej dráždivosti na králikoch, zohľadňujú sa v nej účinky na rohovku, ktoré sú hlavným faktorom klasifikácie in vivo pri klasifikácii v zmysle GHS OSN. Takisto je potrebné uviesť, že hoci sa reverzibilita lézií rohovky nemôže v testovacej metóde izolovaného kuracieho oka posudzovať ako taká, na základe štúdií očí králikov sa navrhlo, aby sa posúdenie počiatočnej hĺbky poškodenia rohovky mohlo používať na zistenie niektorých typov irevezibilných účinkov (17). Na porozumenie toho, ako môžu vzniknúť ireverzibilné účinky, ktoré nesúvisia s počiatočným vysokým stupňom poškodenia, sú potrebné najmä ďalšie vedecké poznatky. Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka v konečnom dôsledku neumožňuje posúdenie potenciálu systémovej toxicity súvisiacej s vystavením očí.
                     Táto testovacia metóda sa bude s prehodnocovaním nových informácií a údajov pravidelne aktualizovať. Napríklad v prípade potreby ucelenejšej charakteristiky poškodenia rohovky by mohla byť užitočná histopatológia. Na vyhodnotenie tejto možnosti sa používateľom odporúča uchovať oči a pripraviť histopatologické vzorky, ktoré možno použiť na vytvorenie databázy a zavedenie rozhodovacích kritérií, ktoré môžu ďalej zlepšiť presnosť tejto testovacej metódy. OECD vypracovala usmerňujúci dokument o používaní testovacích metód in vitro na hodnotenie očnej toxicity, ktorý zahŕňa podrobné postupy odberu vzoriek na histopatológiu a informácie o tom, kde treba vzorky a/alebo údaje z histopatológie predkladať (8).
                     V každom laboratóriu, ktoré zavádza túto skúšku, by sa mali použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 2. Laboratórium môže použiť tieto chemikálie na účely preukázania svojej odbornej spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy izolovaného kuracieho oka pred predložením údajov o testovacej metóde izolovaného kuracieho oka na regulačné účely klasifikácie nebezpečnosti.
                     PRINCÍP TESTU
                     Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka predstavuje organotypický model, ktorý poskytuje krátkodobé uchovanie kuracieho oka in vitro. Pri tejto testovacej metóde sa poškodenie testovanou chemikáliou posudzuje zistením opuchu, zákalu rohovky a zadržiavania fluoresceínu. Zatiaľ čo zákal rohovky a zadržiavanie fluoresceínu si vyžadujú kvalitatívne hodnotenie, analýza opuchu rohovky predstavuje kvantitatívne hodnotenie. Každé meranie sa buď prevedie na kvantitatívnu hodnotu, ktorá sa použije na výpočet celkového ukazovateľa podráždenia, alebo sa mu priradí kvalitatívna kategorizácia, ktorá sa použije na stanovenie klasifikácie nebezpečnosti pre oči in vitro buď ako kategória 1 GHS OSN alebo bez klasifikácie v zmysle GHS OSN. Oba uvedené výsledky možno potom použiť na predpoklad potenciálu testovanej chemikálie spôsobiť vážne poškodenie očí in vivo alebo správať sa ako chemikália, ktorá si nevyžaduje klasifikáciu ako chemikália predstavujúca nebezpečnosť pre oči (pozri rozhodovacie kritériá). V prípade chemikálií, o ktorých sa nepredpokladá, že spôsobujú vážne poškodenie očí, alebo že nebudú pomocou testovacej metódy izolovaného kuracieho oka klasifikované, sa však nemôže vykonať klasifikácia (pozri bod 11).
                     
                        Zdroj a vek kuracích očí
                     
                     Historicky sa na túto skúšku používajú oči získané z kurčiat z bitúnkov, kde sa usmrcujú na ľudskú spotrebu, čím sa odstránila potreba laboratórnych zvierat. Používajú sa iba oči zo zdravých zvierat, ktoré sa považujú za vhodné na vstup do ľudského potravinového reťazca.
                     Hoci sa ešte nevykonala kontrolovaná štúdia na posúdenie optimálneho veku kurčiat, vek a hmotnosť kurčiat, ktoré sa historicky používajú v tejto testovacej metóde, zodpovedajú veku a hmotnosti jarných kurčiat spracovávaných tradične na hydinových bitúnkoch (t. j. približne 7 týždňové, 1,5 – 2,5 kg).
                     
                        Odber a doprava očí do laboratória
                     
                     Hlavy by sa mali sňať hneď po znehybnení kurčiat – zvyčajne elektrickým šokom a narezaním krku s následným vykrvácaním. Miestny zdroj kurčiat v blízkosti laboratória by mal byť umiestnený tak, aby sa hlavy mohli dopraviť z bitúnka do laboratória dostatočne rýchlo, čím sa minimalizuje ich znehodnotenie a/alebo kontaminácia baktériami. Časový interval medzi získaním kuracích hláv a vložením očí po ich odobratí do superfúznej komory by mal byť čo najmenší (zvyčajne do dvoch hodín), aby sa zabezpečilo splnenie kritérií prijateľnosti skúšky. Všetky oči použité v skúške by mali byť z tej istej skupiny očí odobratých v určitý deň.
                     Keďže oči sa vyrezávajú v laboratóriu, neporušené hlavy sa dopravujú z bitúnka pri teplote okolitého prostredia (zvyčajne od 18oC do 25oC) v plastových boxoch a zvlhčujú sa utierkami namočenými do izotonického fyziologického roztoku.
                     
                        Kritériá výberu očí a počet očí používaných v testovacej metóde izolovaného kuracieho oka
                     
                     Oči, ktoré majú po odobratí vysoké počiatočné sfarbenie fluoresceínom (t. j. > 0,5) alebo vysokú hodnotu zákalu rohovky (t. j. > 0,5), sa vyradia.
                     Každá ovplyvnená skupina a súbežná pozitívna kontrola zahŕňa najmenej tri oči. Negatívna kontrolná skupina alebo kontrola rozpúšťadla (ak sa používa iné rozpúšťadlo, ako je fyziologický roztok) obsahuje minimálne jedno oko.
                     V prípade tuhých materiálov, ktorých použitie vedie k výsledku „bez kategórie podľa GHS OSN“, sa odporúča druhé testovanie s troma očami na potvrdenie alebo vyvrátenie negatívneho výsledku.
                     POSTUP
                     
                        Príprava očí
                     
                     Očné viečka sa opatrne odrežú, pričom sa dbá na to, aby sa nepoškodila rohovka. Celistvosť rohovky sa rýchlo posúdi kvapkou 2 % (hmotnostnej koncentrácie) fluoresceínu sodného, ktorá sa aplikuje na povrch rohovky na niekoľko sekúnd a potom sa opláchne fyziologickým roztokom. Oči s aplikovaným fluoresceínom sa potom prehliadnu pod mikroskopom so štrbinovou lampou, aby sa zabezpečilo, že rohovka je nepoškodená (t. j. hodnota zadržiavania fluoresceínu a zákalu rohovky ≤ 0,5).
                     Ak je rohovka nepoškodená, oko sa vyreže z lebky, pričom sa dáva pozor na to, aby sa nepoškodila rohovka. Očná guľa sa vytiahne z očnice, pričom sa tretie viečko pevne zachytí chirurgickými kliešťami a očné svaly sa prestrihnú ohnutými nožnicami s tupými hrotmi. Dôležité je zabrániť poškodeniu rohovky nadmerným tlakom (napr. kompresnými artefaktmi).
                     Keď sa oko vyberie z očnice, mala by sa na ňom ponechať viditeľná časť očného nervu. Po vybratí z očnice sa oko položí na absorpčnú podložku a odreže sa tretie viečko a iné spojovacie tkanivá.
                     Odobraté oko sa upevní do svorky z nehrdzavejúcej ocele tak, aby rohovka bola vo zvislej polohe. Svorka sa potom prenesie do komory superfúzneho prístroja (18). Svorky by sa mali do superfúzneho prístroja vložiť tak, aby sa fyziologický roztok dostával na celú rohovku (3 – 4 kvapky za minútu alebo 0,1 – 0,15 ml/min). Komory superfúzneho prístroja by mali mať riadenú teplotu 32 ± 1,5 °C. V dodatku 3 je uvedená schéma typického superfúzneho prístroja a očných svoriek, ktoré možno kúpiť alebo zhotoviť. Prístroj sa môže upraviť tak, aby vyhovoval potrebám konkrétneho laboratória (napr. na uloženie rôzneho počtu očí).
                     Oči sa po vložení do superfúzneho prístroja znova prehliadnu pod mikroskopom so štrbinovou lampou a skontroluje sa, či počas vyrezávania nedošlo k ich poškodeniu. Súčasne by sa mala odmerať aj hrúbka rohovky na vrchole rohovky s použitím zariadenia na meranie hĺbky na mikroskope so štrbinovou lampou. Oči s: i) hodnotou zadržiavania fluoresceínu > 0,5; ii) hodnotou zákalu rohovky > 0,5 alebo iii) s akýmikoľvek inými znakmi poškodenia by sa mali nahradiť. Spomedzi očí, ktoré sa nevyradia na základe niektorého z týchto kritérií, sa musia vyradiť oči s hrúbkou rohovky, ktorá má odchýlku viac ako 10 % od priemernej hodnoty pre všetky oči. Používatelia by mali vedieť, že mikroskopy so štrbinovou lampou môžu poskytovať rôzne namerané hodnoty hrúbky rohovky, ak je nastavená rôzna šírka štrbiny. Šírka štrbiny by mala byť nastavená na 0,095 mm.
                     Keď sa všetky oči prezrú a sú vyhovujúce, inkubujú sa asi 45 až 60 minút, aby sa dosiahol ustálený stav s testovacím systémom pred dávkovaním. Po dobe ustálenia sa zaznamená nulové referenčné meranie pre hrúbku a zákal rohovky, ktoré slúži ako základný stav (t. j. čas = 0). Hodnota fluoresceínu stanovená pri vyrezávaní sa používa ako základné meranie tohto sledovaného parametra.
                     
                        Aplikácia testovanej chemikálie
                     
                     Hneď po nulových referenčných meraniach sa oko (v držiaku) vyberie zo superfúzneho prístroja, uloží sa do vodorovnej polohy a na rohovku sa aplikuje testovaná chemikália.
                     Kvapalné testované chemikálie sa zvyčajne testujú nezriedené, ale ak sa to považuje za potrebné, môžu sa zriediť (napr. ako súčasť návrhu štúdie). Ako rozpúšťadlo pre zriedené testované chemikálie sa uprednostňuje fyziologický roztok. V riadených podmienkach však možno používať aj alternatívne rozpúšťadlá, ale v prípade rozpúšťadiel iných ako fyziologický roztok by sa mala preukázať ich vhodnosť.
                     Kvapalné testované chemikálie sa aplikujú na rohovku tak, aby celý povrch rohovky bol rovnomerne pokrytý testovanou chemikáliou; štandardný objem je 0,03 ml.
                     Ak je to možné, tuhé testované chemikálie by sa mali čo najjemnejšie rozdrviť tĺčikom v mažiari alebo v podobnom drviacom nástroji. Prášok sa potom aplikuje na rohovku tak, aby povrch bol rovnomerne pokrytý testovanou chemikáliou; štandardné množstvo je 0,03 g.
                     Testovaná chemikália (kvapalná alebo tuhá) sa aplikuje na 10 sekúnd a potom sa opláchne z oka fyziologickým roztokom (približne 20 ml) pri teplote okolitého prostredia. Oko (v držiaku) sa následne vráti do superfúzneho prístroja do pôvodnej zvislej polohy. V prípade potreby sa môže opláchnutie zopakovať po 10-sekundovej aplikácii a pri následných časových bodoch (napr. pri zistení rezíduí testovanej chemikálie na rohovke). Všeobecne nie je množstvo fyziologického roztoku, ktoré sa použije dodatočne, rozhodujúce, ale dôležitá je skutočnosť, že došlo k spozorovaniu priľnutia chemikálie k rohovke.
                     
                        Kontrolné chemikálie
                     
                     Do každého experimentu by sa mali zaradiť súbežné negatívne kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča a pozitívne kontroly.
                     Keď sa testujú kvapaliny so 100 % koncentráciou alebo tuhé látky, v testovacej metóde izolovaného kuracieho oka sa používa fyziologický roztok ako súbežná negatívna kontrola na zisťovanie nešpecifických zmien v testovacom systéme a na to, aby sa zabezpečilo, že podmienky skúšky nevedú neprimeraným spôsobom k reakcii vo forme podráždenia.
                     Keď sa testujú zriedené kvapaliny, v testovacej metóde sa používa súbežná kontrolná skupina rozpúšťadla/nosiča na zisťovanie nešpecifických zmien v testovacom systéme a na to, aby sa zabezpečilo, že podmienky skúšky nevedú neprimeraným spôsobom k reakcii vo forme podráždenia. Ako sa uvádza v bode 31, môže sa použiť iba také rozpúšťadlo/nosič, u ktorého sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém.
                     Do každého pokusu sa začleňuje známa očná dráždivá látka ako súbežná pozitívna kontrola na overenie vyvolania primeranej reakcie. Keďže skúška izolovaného kuracieho oka sa používa v tejto testovacej metóde na identifikáciu žieravých alebo silne dráždivých látok, na pozitívnu kontrolu by sa mala použiť referenčná chemikália, ktorá v tejto testovacej metóde vyvoláva silnú reakciu. V snahe zabezpečiť možnosť posúdiť variabilitu reakcie na pozitívnu kontrolu v čase by však rozsah silnej reakcie nemal byť nadmerne veľký. Mali by sa vygenerovať dostatočné údaje in vitro na pozitívnu kontrolu, aby bolo možné vypočítať štatisticky definovaný prijateľný rozsah pre pozitívnu kontrolu. Ak na určitú pozitívnu kontrolu nie sú k dispozícii primerané historické údaje o testovacej metóde izolovaného kuracieho oka, môže byť potrebné vykonať štúdie, ktoré by tieto informácie poskytli.
                     Príkladom pozitívnych kontrol na kvapalné testované chemikálie je 10 % kyselina octová alebo 5 % benzalkónium chlorid, zatiaľ čo príkladom pozitívnych kontrol na tuhé testované chemikálie je hydroxid sodný alebo imidazol.
                     Referenčné chemikálie sú užitočné na posudzovanie potenciálu očnej dráždivosti neznámych chemikálií určitej chemickej triedy alebo triedy výrobkov alebo na posudzovanie potenciálu pomernej dráždivosti látky spôsobujúcej podráždenie očí s osobitným rozsahom dráždivých reakcií.
                     
                        Merané sledované parametre
                     
                     Ovplyvnené rohovky sa posudzujú pred ovplyvnením a 30, 75, 120, 180 a 240 minút (± 5 minút) po opláchnutí nasledujúcom po ovplyvnení. Tieto časové body poskytujú primeraný počet meraní počas štvorhodinového ovplyvňovania, pričom medzi meraniami zostáva dostatok času na vykonanie nevyhnutných pozorovaní všetkých očí.
                     Posudzované sledované parametre sú zákal rohovky, opuch rohovky, zadržiavanie fluoresceínu v rohovke a morfologické účinky (napr. jamkovanie alebo uvoľnenie epitelu). Všetky sledované parametre s výnimkou zadržiavania fluoresceínu (ktoré sa stanovuje iba pred ovplyvnením a 30 minút po vystavení účinkom testovanej chemikálie) sa stanovujú v každom z uvedených časových bodov.
                     Odporúča sa vyhotoviť fotografie na zdokumentovanie zákalu rohovky, zadržiavania fluoresceínu, morfologických účinkov a histopatológie, ak sa vykoná.
                     Po poslednom prehliadnutí po štyroch hodinách sa používateľom odporúča, aby oči uložili do vhodného fixačného roztoku (napr. neutrálneho tlmeného formalínu) pre prípadné histopatologické vyšetrenie [viac podrobných informácií možno nájsť v bode 14 a odkaze (8)].
                     Opuch rohovky sa stanovuje meraním hrúbky rohovky optickým pachymetrom na mikroskope so štrbinovou lampou. Vyjadruje sa v percentách a vypočíta sa z meraní hrúbky rohovky podľa tohto vzorca:
                     
                        
                     Priemerná percentuálna hodnota opuchu rohovky sa pri všetkých testovaných očiach vypočíta pre všetky časové body pozorovania. Na základe najvyššej priemernej hodnoty opuchu rohovky, nameranej v hociktorom časovom bode sa potom určí celková hodnota kategórie pre každú testovanú chemikáliu (pozri bod 51).
                     Zákal rohovky sa vyhodnocuje v tej časti rohovky, na ktorej je zákal najväčší, ako sa uvádza v tabuľke 1. Priemerná hodnota zákalu rohovky sa pri všetkých testovaných očiach vypočíta pre všetky časové body pozorovania. Na základe najvyššej priemernej hodnoty zákalu rohovky, nameranej v hociktorom časovom bode, sa potom určí celková hodnota kategórie pre každú testovanú chemikáliu (pozri bod 51).
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Hodnoty zákalu rohovky
                     
                     
                                 Hodnota
                              
                              
                                 Pozorovanie
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 bez zákalu
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 veľmi slabý zákal
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 rozptýlené alebo roztrúsené plochy; detaily dúhovky sú jasne viditeľné
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 ľahko rozoznateľná priehľadná plocha; detaily dúhovky sú mierne zatemnené
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 silný zákal rohovky; žiadne špecifické detaily dúhovky nie sú viditeľné; veľkosť zrenice je sotva rozoznateľná
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 úplný zákal rohovky; dúhovka nie je viditeľná
                              
                           Zadržiavanie fluoresceínu sa hodnotí len pri meraní v časovom bode 30 minút, ako sa uvádza v tabuľke 2. Priemerná hodnota zadržiavania fluoresceínu pri všetkých testovaných očiach sa potom vypočíta pre časový bod 30-minútového pozorovania a použije sa na určenie celkovej hodnoty kategórie pre každú testovanú chemikáliu (pozri bod 51).
                     
                        Tabuľka 2
                     
                     
                        Hodnoty zadržiavania fluoresceínu
                     
                     
                                 Hodnota
                              
                              
                                 Pozorovanie
                              
                           
                                 0
                              
                              
                                 žiadne zadržiavanie fluoresceínu
                              
                           
                                 0,5
                              
                              
                                 veľmi malá škvrna na jednej bunke
                              
                           
                                 1
                              
                              
                                 škvrny na jednej bunke rozptýlené po celej ovplyvnenej ploche rohovky
                              
                           
                                 2
                              
                              
                                 ohniská alebo splývajúce husté škvrny na jednej bunke
                              
                           
                                 3
                              
                              
                                 splývajúce veľké plochy rohovky so zadržiavaním fluoresceínu
                              
                           Medzi morfologické účinky patrí „jamkovanie“ buniek epitelu rohovky, „uvoľnenie epitelu“, „zdrsnenie“ povrchu rohovky a „nalepenie“ testovanej chemikálie na rohovku. Tieto zistenia môžu byť rôzne, pokiaľ ide o ich závažnosť, a môže k nim dôjsť súčasne. Klasifikácia týchto zistení je subjektívna podľa interpretácie výskumného pracovníka.
                     PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Vyhodnotenie údajov
                     
                     Výsledné hodnoty zákalu rohovky, opuchu rohovky a zadržiavania fluoresceínu by sa mali posudzovať osobitne, aby sa stanovila trieda testovacích metód izolovaného kuracieho oka pre každý sledovaný parameter. Triedy testovacích metód izolovaného kuracieho oka sa pre každý sledovaný parameter následne spoja a stanoví sa klasifikácia dráždivosti pre každú testovanú chemikáliu.
                     
                        Rozhodovacie kritériá
                     
                     Keď sa posúdi každý sledovaný parameter, môžu sa priradiť triedy testovacích metód izolovaného kuracieho oka na základe vopred určeného rozsahu. Interpretácia opuchu rohovky (tabuľka 3), zákalu (tabuľka 4) a zadržiavania fluoresceínu (tabuľka 5) s použitím štyroch tried testovacích metód izolovaného kuracieho oka sa robí podľa nižšie uvedených hodnôt: Je dôležité upozorniť na to, že hodnoty opuchu rohovky uvedené v tabuľke 3 sa uplatňujú len vtedy, ak sa hrúbka meria mikroskopom so štrbinovou lampou (napríklad Haag-Streit BP900) so zariadením na meranie hĺbky č. 1 a pri nastavení šírky štrbiny 9, ktorá sa rovná 0,095 mm. Používatelia by mali vedieť, že mikroskopy so štrbinovou lampou by mohli poskytovať rôzne namerané hodnoty hrúbky rohovky, ak je nastavená rôzna šírka štrbiny.
                     
                        Tabuľka 3
                     
                     
                        Klasifikačné kritériá testovacích metód izolovaného kuracieho oka vzťahujúce sa na opuch rohovky
                     
                     
                                 Priemerná hodnota opuchu rohovky (v %) (*2)
                                 
                              
                              
                                 Trieda testovacích metód izolovaného kuracieho oka
                              
                           
                                 0 až 5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 > 5 až 12
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 až 18 (> 75 min. po ovplyvnení)
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 > 12 až 18 (≤ 75 min. po ovplyvnení)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 18 až 26
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 až 32 (> 75 min. po ovplyvnení)
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 > 26 až 32 (≤ 75 min. po ovplyvnení)
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                                 > 32
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Tabuľka 4
                     
                     
                        Klasifikačné kritériá testovacích metód izolovaného kuracieho oka vzťahujúce sa na zákal
                     
                     
                                 Maximálna priemerná hodnota zákalu (*3)
                                 
                              
                              
                                 Trieda testovacích metód izolovaného kuracieho oka
                              
                           
                                 0,0 až 0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6 až 1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6 až 2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6 až 4,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           
                        
                     
                        Tabuľka 5
                     
                     
                        Klasifikačné kritériá testovacích metód izolovaného kuracieho oka vzťahujúce sa na priemernú hodnotu zadržiavania fluoresceínu
                     
                     
                                 Priemerná hodnota zadržiavania fluoresceínu 30 minút po ovplyvnení (*4)
                                 
                              
                              
                                 Trieda testovacích metód izolovaného kuracieho oka
                              
                           
                                 0,0 až 0,5
                              
                              
                                 I
                              
                           
                                 0,6 až 1,5
                              
                              
                                 II
                              
                           
                                 1,6 až 2,5
                              
                              
                                 III
                              
                           
                                 2,6 až 3,0
                              
                              
                                 IV
                              
                           Klasifikácia testovanej chemikálie in vitro sa hodnotí pomocou klasifikácie GHS, ktorá zodpovedá kombinácii kategórií získaných pre opuch rohovky, zákal rohovky a zadržiavanie fluoresceínu, ako sa uvádza v tabuľke 6.
                     
                        Tabuľka 6
                     
                     
                        Celkové in vitro klasifikácie
                     
                     
                                 Klasifikácia GHS OSN
                              
                              
                                 Kombinácie 3 sledovaných parametrov
                              
                           
                                 Bez kategórie
                              
                              
                                 3 × I
                                 2 × I, 1 × II
                              
                           
                                 predpoklad nie je možný
                              
                              
                                 Iné kombinácie
                              
                           
                                 Kategória 1
                              
                              
                                 3 × IV
                                 2 × IV, 1 × III
                                 2 × IV, 1 × II (*5)
                                 
                                 2 × IV, 1 × I (*5)
                                 
                                 Zákal rohovky ≥ 3 po 30 minútach (aspoň v 2 očiach)
                                 Zákal rohovky = 4 v ktoromkoľvek časovom bode (aspoň v 2 očiach)
                                 Silné uvoľnenie epitelu (aspoň v 1 oku)
                              
                           
                        Kritéria prijateľnosti štúdie
                     
                     Test sa pokladá za prijateľný, ak sa súbežne negatívne kontroly alebo kontroly nosiča/rozpúšťadla a súbežne pozitívne kontroly označujú ako chemikálie bez klasifikácie v zmysle GHS OSN a chemikálie kategórie 1 GHS OSN v uvedenom poradí.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie, ak sú relevantné pre vykonanie štúdie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované chemikálie a kontrolné chemikálie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Názov(-vy) chemikálií, ako je systémový názov, ktorý používa služba Chemical Abstracts Service (CAS), po ktorom nasledujú iné názvy, ak sú známe,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             registračné číslo CAS, ak je známe,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             čistota a zloženie testovaných chemikálií/kontrolných chemikálií (v hmotnostných percentách), pokiaľ je táto informácia k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzikálno-chemické vlastnosti, ako je fyzikálny stav, prchavosť, pH, stabilita, chemická trieda, rozpustnosť vo vode, ktorá má význam pre vykonanie štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadná úprava testovaných chemikálií/kontrolných chemikálií pred testovaním (napr. zahrievanie, drvenie),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita, ak je známa.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Informácie týkajúce sa objednávateľa a testovacieho zariadenia
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             meno a adresa objednávateľa, testovacieho zariadenia a vedúceho štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikácia zdroja očí (napr. zariadenie, v ktorom sa vykonal ich odber).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testovacej metódy
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitého testovacieho systému,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý mikroskop so štrbinovou lampou (napr. model) a nastavenia použitého mikroskopu so štrbinovou lampou,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odkaz na historické výsledky negatívnych a pozitívnych kontrol a v prípade potreby historické údaje preukazujúce prijateľné rozsahy súbežných referenčných kontrol,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             postup použitý na zabezpečenie integrity (t. j. presnosti a spoľahlivosti) testovacej metódy v čase (napr. periodické testovanie chemikálií na preukázanie spôsobilosti).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Odber a príprava očí
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vek a hmotnosť darcovského zvieraťa a iné osobitné charakteristické vlastnosti zvieraťa, ktorému sa odobrali oči, ak sú k dispozícii (napr. pohlavie, kmeň),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podmienky skladovania a dopravy očí (napr. dátum a čas odberu očí, časový interval medzi odberom kuracích hláv a uložením odobratých očí do superfúznej komory),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             príprava a upevnenie očí vrátane vyhlásení o ich kvalite, teplota komôr na oči a kritériá výberu očí použitých na testovanie.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Postup testu
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             počet použitých replikátov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identita použitých negatívnych a pozitívnych kontrol (prípadne aj kontroly rozpúšťadla a referenčné kontroly),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dávka testovanej chemikálie, jej aplikácia a doba expozície,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             časové body pozorovania (pred ovplyvnením a po ňom),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých hodnotiacich a rozhodovacích kritérií,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých kritérií prijateľnosti štúdie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis všetkých zmien postupu testu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             hodnoty opuchu rohovky, zákalu rohovky a zadržiavania fluoresceínu získané pre každé oko samostatne v každom časovom bode pozorovania vrátane priemerných hodnôt v každom časovom bode pri všetkých testovaných očiach spracované v podobe tabuľky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             najvyššie namerané priemerné hodnoty opuchu rohovky, zákalu rohovky a zadržiavania fluoresceínu (z akéhokoľvek časového bodu) a ich príslušná trieda testovacích metód izolovaného kuracieho oka,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis všetkých ďalších pozorovaných účinkov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odvodená klasifikácia GHS OSN in vitro,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadne fotografie oka.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskusia o výsledkoch
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Dostupné na: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Dostupné na: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Dostupné na: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2011). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, UN New York and Geneva, 2011. Dostupné na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Series on Testing and Assessment no. 188 (Part 1 and Part 2), OECD, Paris.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Chapter B.5 of this Annex, Acute eye irritation/corrosion.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1-9.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 OECD (2011) Guidance Document on “The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants”. Series on Testing and Assessment no. 160, OECD, Paris.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Dostupné na: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET)/Isolated Chicken Eye Test, 13pp. Dostupné na: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78-81.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Dostupné na: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Presnosť
                           : blízkosť zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referenčnými hodnotami. Ide o meranie analytického výkonu testovacej metódy a jeden aspekt „relevantnosti“. Tento pojem sa často zamieňa s pojmom „zhoda“ na označenie podielu správnych výsledkov testovacej metódy.
                        
                           
                              Referenčná chemikália
                           : chemikália, ktorá sa používa ako štandardná na porovnávanie s testovanou chemikáliou. Referenčná chemikália by mala mať tieto vlastnosti: i) konzistentný(-é) a spoľahlivý(-é) zdroj(-e); ii) štruktúrna a funkčná podobnosť s triedou chemikálií, ktoré sa testujú; iii) známe fyzikálno-chemické vlastnosti; iv) podporné údaje o známych účinkoch a v) známy potenciál v rozsahu želanej reakcie.
                        
                           
                              Prístup zdola nahor
                           : prístup v postupných krokoch použitý v prípade chemikálie, o ktorej sa predpokladá, že nevyžaduje klasifikáciu ako chemikália spôsobujúca podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí. Začína odlíšením chemikálií nevyžadujúcich klasifikáciu (negatívny výsledok) od ostatných chemikálií (pozitívny výsledok).
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Rohovka
                           : priehľadná časť prednej strany očnej gule, ktorá pokrýva dúhovku a zrenicu a prepúšťa svetlo do vnútra oka.
                        
                           
                              Zákal rohovky
                           : meranie rozsahu zakalenia rohovky po vystavení účinkom testovanej chemikálie. Zvýšený zákal rohovky je príznakom poškodenia rohovky.
                        
                           
                              Opuch rohovky
                           : objektívne meranie rozsahu zakalenia rohovky v teste izolovaného kuracieho oka po vystavení účinkom testovanej chemikálie. Je vyjadrený v percentách a vypočíta sa z meraní základnej hrúbky rohovky (na dávku) a hrúbky zaznamenávanej v pravidelných intervaloch po vystavení účinkom testovanej chemikálie v teste izolovaného kuracieho oka. Stupeň opuchu rohovky je príznakom poškodenia rohovky.
                        
                           
                              Podráždenie očí
                           : vyvolanie zmien na oku po aplikácii testovanej chemikálie na vonkajší povrch oka, ktoré sú do 21 dní po aplikácii úplne reverzibilné. Zamieňa sa s pojmami „reverzibilné účinky na oči“ a „kategória 2 GHS OSN“ (4).
                        
                           
                              Miera falošnej negativity
                           : podiel všetkých pozitívnych chemikálií, ktoré sú na základe testovacej metódy nesprávne identifikované ako negatívne. Je to jeden ukazovateľ analytického výkonu testovacej metódy.
                        
                           
                              Miera falošnej pozitivity
                           : podiel všetkých negatívnych chemikálií, ktoré sú na základe testovacej metódy nesprávne identifikované ako pozitívne. Je to jeden ukazovateľ analytického výkonu testovacej metódy.
                        
                           
                              Zadržiavanie fluoresceínu
                           : v teste izolovaného kuracieho oka subjektívne meranie rozsahu fluoresceínu sodného zadržiavaného epitelovými bunkami v rohovke po vystavení účinkom testovanej chemikálie. Stupeň zadržiavania fluoresceínu je príznakom poškodenia epitelu rohovky.
                        
                           
                              Nebezpečnosť
                           : inherentná vlastnosť činidla alebo situácia, ktorá má potenciál spôsobiť nepriaznivé účinky, ak sú organizmus, systém alebo populácia (subpopulácia) vystavené účinkom tohto činidla.
                        
                           
                              Ireverzibilné účinky na oči
                           : pozri „vážne poškodenie očí“ a „kategória 1 GHS OSN“.
                        
                           
                              Zmes
                           : zmes alebo roztok pozostávajúce z dvoch alebo viacerých látok, ktoré v nej/ňom nereagujú (4).
                        
                           
                              Negatívna kontrola
                           : neovplyvnený replikát, ktorý obsahuje všetky zložky testovacieho systému. Táto vzorka sa spracuje so vzorkami ovplyvnenými testovanou chemikáliou a s ostatnými kontrolnými vzorkami s cieľom stanoviť, či rozpúšťadlo a testovací systém na seba navzájom pôsobia.
                        
                           
                              Neklasifikované
                           : látky, ktoré nie sú klasifikované ako látky spôsobujúce podráždenie očí (kategória 2 GHS OSN) ani ako látky spôsobujúce vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN). Zamieňa sa s pojmom „bez kategórie v zmysle GHS OSN“.
                        
                           
                              Pozitívna kontrola
                           : replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému a ovplyvnený chemikáliou, o ktorej je známe, že vyvoláva pozitívnu reakciu. S cieľom zabezpečiť možnosť posudzovať variabilitu reakcie pozitívnej kontroly po celý čas by rozsah silnej reakcie nemal byť nadmerne veľký.
                        
                           
                              Spoľahlivosť
                           : merania rozsahu, v rámci ktorého môže byť testovacia metóda v priebehu určitého času reprodukovateľná v rámci laboratórií a medzi nimi navzájom, keď sa používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypočítaním vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti a medzilaboratórnej opakovateľnosti.
                        
                           
                              Reverzibilné účinky na oči
                           : pozri „podráždenie očí“ a „kategória 2 GHS OSN“.
                        
                           
                              Vážne poškodenie očí
                           : vyvolanie poškodenia tkaniva v oku alebo vážneho fyzického zhoršenia zraku po aplikácii testovanej chemikálie na vonkajší povrch oka, ktoré nie je úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii. Zamieňa sa s pojmami „ireverzibilné účinky na oči“ a „kategória 1 GHS OSN“ (4).
                        
                           
                              Mikroskop so štrbinovou lampou
                           : nástroj používaný na priame skúmanie oka pri zväčšení pod binokulárnym mikroskopom s vytvorením stereoskopického vzpriameného obrazu. V testovacej metóde izolovaného kuracieho oka sa tento prístroj používa na prehliadanie predných štruktúr kuracieho oka, ako aj na objektívne meranie hrúbky rohovky pomocou pripojeného zariadenia na meranie hĺbky.
                        
                           
                              Kontrola rozpúšťadla/nosiča
                           : neovplyvnená vzorka, ktorá obsahuje všetky zložky testovacieho systému vrátane rozpúšťadla alebo nosiča a ktorá sa spracúva so vzorkami ovplyvnenými testovanou chemikáliou a s inými kontrolnými vzorkami, aby sa zistila základná reakcia vzoriek ovplyvnených testovanou chemikáliou rozpustenou v tom istom rozpúšťadle alebo nosiči. Keď sa táto vzorka testuje so súbežnou negatívnou kontrolou, preukazuje aj to, či rozpúšťadlo alebo nosič s testovacím systémom na seba navzájom pôsobia.
                        
                           
                              Látka
                           : chemické prvky a ich zlúčeniny v prirodzenom stave alebo získané akýmkoľvek procesom výroby vrátane akejkoľvek prísady potrebnej na udržanie stability produktu a akýchkoľvek nečistôt vzniknutých v použitom procese, ale s výnimkou každého rozpúšťadla, ktoré možno oddeliť bez ovplyvnenia stability látky alebo zmeny jej zloženia (4).
                        
                           
                              Povrchovo aktívna látka
                           : takisto nazývaná surfaktant, je látka, ako napríklad detergent, ktorá dokáže znížiť povrchové napätie kvapaliny, a tak jej umožniť penenie alebo prenikanie do tuhých látok. Nazýva sa aj zvlhčujúce činidlo.
                        
                           
                              Prístup zhora nadol
                           : prístup v postupných krokoch použitý v prípade chemikálie, o ktorej sa predpokladá, že spôsobuje vážne poškodenie očí. Začína odlíšením chemikálií spôsobujúcich vážne poškodenie očí (pozitívny výsledok) od ostatných chemikálií (negatívny výsledok).
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.
                        
                           
                              Stratégia viacúrovňového testovania
                           : stratégia postupného testovania, pri ktorej sa v presne určenom poradí na každej úrovni preskúmavajú všetky existujúce informácie o testovanej chemikálii pomocou analýzy váhy dôkazov s cieľom zistiť, či sú dostupné dostatočné informácie na to, aby sa mohlo prijať rozhodnutie o klasifikácii nebezpečnosti pred tým, ako sa postúpi na ďalšiu úroveň. Ak možno testovanej chemikálii na základe existujúcich informácií pripísať potenciál spôsobiť podráždenie, nevyžaduje sa ďalšie testovanie. Ak na základe existujúcich informácií nemožno testovanej chemikálii pripísať potenciál spôsobiť podráždenie očí, použije sa prístup postupného testovania na zvieratách v jednotlivých krokoch, až kým nebude možná jednoznačná klasifikácia.
                        
                           
                              Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie spojených národov (OSN)
                           : systém navrhujúci klasifikáciu chemikálií (látok a zmesí) podľa štandardizovaných typov a úrovní fyzikálnych, zdravotných a enivornmentálnych nebezpečností a ich označovanie zodpovedajúcimi komunikačnými prvkami, ako sú piktogramy, výstražné slová, výstražné upozornenia, bezpečnostné upozornenia a karty bezpečnostných údajov, s cieľom poskytnúť informácie o nepriaznivých účinkoch daných chemikálií v záujme ochrany osôb (vrátane zamestnávateľov, pracovníkov, prepravcov, spotrebiteľov a subjektov reakcie na núdzové situácie) a životného prostredia (4).
                        
                           
                              Kategória 1 GHS OSN
                           : pozri „vážne poškodenie očí“ a/alebo „ireverzibilné účinky na oči“.
                        
                           
                              Kategória 2 GHS OSN
                           : pozri „podráždenie očí“ a/alebo „reverzibilné účinky na oči“.
                        
                           
                              Bez kategórie v zmysle GHS OSN
                           : látky, ktoré nespĺňajú požiadavky na klasifikáciu ako chemikálie kategórie 1 alebo 2 (2A alebo 2B) GHS OSN. Zamieňa sa s pojmom „bez kategórie“.
                        
                           
                              Validovaná testovacia metóda
                           : testovacia metóda, v prípade ktorej sa vykonali validačné štúdie s cieľom určiť relevantnosť (vrátane presnosti) a spoľahlivosť na konkrétny účel. Je dôležité poznamenať, že validovaná testovacia metóda nemusí mať dostatočný analytický výkon z hľadiska presnosti a spoľahlivosti, aby bola prijateľná pre navrhovaný účel.
                        
                           
                              Analýza váhy dôkazov
                           : postup posudzovania silných a slabých stránok rôznych informácií na dosiahnutie a podporu záveru, pokiaľ ide o potenciál nebezpečnosti chemikálie.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           CHEMIKÁLIE NA PREUKÁZANIE SPÔSOBILOSTI VYKONÁVAŤ TESTOVACIU METÓDU IZOLOVANÉHO KURACIEHO OKA
                        
                        Pred rutinným použitím testovacej metódy, ktorá sa pridržiava tejto testovacej metódy, by laboratóriá mali preukázať technickú spôsobilosť tak, že správne určia klasifikáciu nebezpečnosti pre oči v prípade 13 chemikálií odporúčaných v tabuľke 1. Tieto chemikálie boli vybraté tak, aby predstavovali rozsah reakcií na nebezpečnosti pre oči na základe výsledkov očného testu in vivo na králikoch (TG 405) a klasifikačného systému GHS OSN (t. j. kategórie 1, 2A, 2B alebo bez kategórie) (4)(6). Ďalším kritériom výberu bola komerčná dostupnosť chemikálií, dostupnosť vysoko kvalitných referenčných údajov in vivo a dostupnosť vysoko kvalitných údajov z testovacej metódy izolovaného kuracieho oka in vitro. Referenčné údaje sú dostupné v skrátenom súhrnnom dokumente (SSD) (5) a v podkladovom kontrolnom dokumente (Background Review Document) ICCVAM pre testovaciu metódu izolovaného kuracieho oka (9).
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Odporúčané chemikálie na preukazovanie technickej spôsobilosti pomocou testovacej metódy izolovaného kuracieho oka
                        
                        
                                    Chemikália
                                 
                                 
                                    CAS číslo
                                 
                                 
                                    Chemická trieda (13)
                                    
                                 
                                 
                                    Fyzikálna forma
                                 
                                 
                                    Klasifikácia In Vivo
                                        (14)
                                    
                                 
                                 
                                    Klasifikácia In Vitro
                                        (15)
                                    
                                 
                              
                                    Benzalkónium chlorid (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    óniová zlúčenina
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Chlórhexidín
                                 
                                 
                                    55-56-1
                                 
                                 
                                    amín, amidín
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Kyselina dibenzoyl-L-vínna
                                 
                                 
                                    2743-38-6
                                 
                                 
                                    karboxylová kyselina, ester
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Imidazol
                                 
                                 
                                    288-32-4
                                 
                                 
                                    heterocyklická zlúčenina
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    Kyselina trichlóroctová (30 %)
                                 
                                 
                                    76-03-9
                                 
                                 
                                    karboxylová kyselina
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                              
                                    2,6-dichlórbenzoyl chlorid
                                 
                                 
                                    4659-45-4
                                 
                                 
                                    acylhalogenid
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 2A
                                 
                                 
                                    predpoklad nie je možný (16)
                                    
                                 
                              
                                    Dusičnan amónny
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    anorganická soľ
                                 
                                 
                                    tuhá látka
                                 
                                 
                                    kategória 2A (17)
                                    
                                 
                                 
                                    predpoklad nie je možný (16)
                                    
                                 
                              
                                    Etyl-2-metylaceto-octan
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    ketón, ester
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    kategória 2 B
                                 
                                 
                                    predpoklad nie je možný (16)
                                    
                                 
                              
                                    Dimetylsulfoxid
                                 
                                 
                                    67-68-5
                                 
                                 
                                    organická zlúčenina síry
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                              
                                    Glycerol
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    Alcohol
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                                 
                                    bez kategórie (hraničná hodnota)
                                 
                              
                                    Metylcyklopentán
                                 
                                 
                                    96-37-7
                                 
                                 
                                    uhľovodík (cyklický)
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                              
                                    n-hexán
                                 
                                 
                                    110-54-3
                                 
                                 
                                    uhľovodík (acyklický)
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                              
                                    Triacetín
                                 
                                 
                                    102-76-1
                                 
                                 
                                    Lipid
                                 
                                 
                                    kvapalina
                                 
                                 
                                    bez klasifikácie
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                              
                                    Skratky: CASRN = registračné číslo CAS (Chemical Abstracts Service)/CAS číslo
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           SCHEMATICKÝ NÁKRES SUPERFÚZNEHO PRÍSTROJA A OČNÝCH SVORIEK
                        
                        
                           [Ďalšie generické opisy superfúzneho prístroja a očných svoriek uvádza Burton et al.(18)]
                        
                        
                                    Číslo položky
                                 
                                 
                                    Opis
                                 
                                 
                                    Číslo položky
                                 
                                 
                                    Opis
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    odtok teplej vody
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    komora
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    posuvný kryt
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    držiak očí
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    superfúzny prístroj
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    kuracie oko
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    optický merací prístroj
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    odtok fyziologického roztoku
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    prívod teplej vody
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    nastavovacia skrutka
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    fyziologický roztok
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    nastaviteľné horné rameno
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    teplá voda
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    pevné dolné rameno
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    prívod fyziologického roztoku
                                 
                                 
                                     
                                 
                              “
               
                     14
                  
                  
                     V časti B sa kapitola B.49 nahrádza takto:
                     „B.49   Mikrojadrový (mikronukleový) test na cicavčích bunkách in vitro
                        
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 487 (2016). Je súčasťou série testovacích metód genetickej toxikológie. Bol vypracovaný dokument OECD, ktorý obsahuje stručné informácie o testovaní v oblasti genetickej toxikológie a prehľad posledných zmien, ktoré sa vykonali v týchto usmerneniach na vykonávanie testov (1).
                     Mikrojadrový test in vitro (MNvit) je test na genotoxicitu, ktorého cieľom je zistiť prítomnosť mikrojadier (MN) v cytoplazme buniek v interfáze. Mikrojadrá môžu pochádzať z acentrických fragmentov chromozómov (t. j. fragmentov, ktorým chýba centroméra) alebo z celých chromozómov, ktoré v štádiu anafázy pri delení bunky nie sú schopné migrovať k pólom. Preto je test MNvit metódou in vitro, ktorá poskytuje komplexný základ pre skúmanie potenciálu poškodzovania chromozómov in vitro, keďže je možné zistiť aneugény, ako aj klastogény (2) (3) v bunkách, ktoré prešli delením buniek počas vystavenia účinkom testovanej chemikálie alebo po ňom (viac podrobných informácií možno nájsť v bode 13). Mikrojadrá predstavujú poškodenie, ktoré sa prenáša na dcérske bunky, zatiaľ čo chromozómové aberácie zaznamenané v bunkách v metafáze nemožno prenášať. V oboch z týchto prípadoch je možné, že tieto zmeny nebudú zlúčiteľné s prežitím bunky.
                     Táto testovacia metóda umožňuje použitie protokolov s inhibítorom polymerizácie aktínu, cytochalasínom B (cytoB), ako aj bez neho. Pridanie cytoB pred mitózou vedie k vzniku buniek, ktoré sú dvojjadrové, a preto umožňuje identifikáciu a analýzu mikrojadier len v tých bunkách, v ktorých prebehla jedna mitóza (4) (5). Táto testovacia metóda rovnako umožňuje použitie protokolov bez blokovania cytokinézy, pokiaľ existuje dôkaz, že analyzovaná populácia buniek prešla mitózou.
                     Okrem použitia testu MNvit na identifikáciu chemikálií, ktoré vyvolávajú vznik mikrojadier, možno s použitím imunochemického označovania kinetochórov alebo hybridizáciou s použitím centromerických/telomerických sond [(fluorescenčná hybridizácia in situ – (FISH)] takisto získať ďalšie informácie o mechanizmoch poškodzovania chromozómov a tvorbe mikrojadier (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Uvedené postupy označovania a hybridizácie možno použiť vtedy, keď sa zvýši tvorba mikrojadier a výskumný pracovník chce určiť, či je tento nárast výsledkom klastogénnych a/alebo aneugénnych procesov.
                     Keďže mikrojadrá v bunkách v interfáze možno hodnotiť relatívne objektívne, pracovníci laboratória musia zistiť len počet dvojjadrových buniek v prípade použitia cytoB a výskyt buniek s mikrojadrami vo všetkých prípadoch. Vďaka tomu možno preparáty pomerne rýchlo vyhodnotiť a analýzu možno vykonať automaticky. Takto sa počas jedného ovplyvňovania môžu vyhodnotiť prakticky tisíce, a nielen stovky buniek, čím sa zvyšuje sila testu. Nakoniec, keďže mikrojadrá môžu vzniknúť v dôsledku chýbajúcich chromozómov, existuje možnosť zistiť činitele indukujúce aneuploidiu, ktoré je ťažké skúmať pomocou bežných testov na chromozómové aberácie, napr. kapitola B.10 tejto prílohy (18). Test MNvit opísaný v tejto testovacej metóde však neumožňuje rozlišovať chemikálie indukujúce zmeny v počte chromozómov a/alebo polyploidiu od tých chemikálií, ktoré indukujú klastogenicitu bez použitia špeciálnych techník, ako je metóda FISH uvedená v bode 4.
                     Test MNvit je spoľahlivý a možno ho vykonať v prípade rôznych druhov buniek a za prítomnosti alebo neprítomnosti cytoB. Existuje množstvo údajov na podporu validity testu MNvit s použitím rôznych druhov buniek (kultúr bunkových línií alebo primárnych bunkových kultúr) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Patria sem najmä medzinárodné validačné štúdie, ktoré koordinuje spoločnosť Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23), a správy z medzinárodného seminára o testovaní genotoxicity (International Workshop on Genotoxicity Testing) (5) (17). Dostupné údaje boli opätovne prehodnotené pomocou retrospektívnej validačnej štúdie založenej na analýze váhy dôkazov, ktorú uskutočnilo Európske centrum pre validáciu alternatívnych metód (ECVAM) Európskej komisie, a táto testovacia metóda bola Vedeckým poradným výborom (ESAC) ECVAM schválená ako vedecky platná (37) (38) (39).
                     V teste MNvit na cicavčích bunkách možno použiť kultúry bunkových línií alebo primárne bunkové kultúry ľudského alebo hlodavčieho pôvodu. Keďže frekvencia mikrojadier v pozadí ovplyvní citlivosť testu, odporúča sa použiť druhy buniek, ktoré majú stabilnú a definovanú frekvenciu tvorby mikrojadier v pozadí. Použité bunky sa vyberajú na základe ich schopnosti dobrého rastu v kultúre, stability karyotypu (vrátane počtu chromozómov) a spontánnej frekvencie výskytu mikrojadier (40). Údaje, ktoré sú v súčasnosti k dispozícii, neumožňujú vyvodiť jednoznačné odporúčania. Naznačujú však, že pri hodnotení chemickej nebezpečnosti je dôležité zvážiť stav p53, genetickú stabilitu (stabilitu karyotypu), reparačnú schopnosť DNA a pôvod buniek (bunky pochádzajúce z hlodavcov versus bunky ľudského pôvodu), ktoré boli vybraté na testovanie. Používateľom tejto testovacej metódy sa preto odporúča, aby pri zisťovaní indukcie mikrojadier zvážili vplyv týchto a iných charakteristických vlastností buniek na správanie bunkovej línie, a to vzhľadom na rozvíjajúce sa poznatky v tejto oblasti.
                     Použité definície sa uvádzajú v dodatku 1.
                     POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                     Testy, ktoré sa vykonávajú in vitro, si zvyčajne vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie okrem prípadov, keď majú bunky metabolickú kapacitu (schopnosť) s ohľadom na testované chemikálie. Exogénny systém metabolickej aktivácie nenapodobňuje v plnej miere podmienky in vivo. Je potrebné zabrániť vzniku podmienok, ktoré by mohli viesť k umelo pozitívnym výsledkom, ktoré neodrážajú genotoxicitu testovaných chemikálií. Takéto podmienky zahŕňajú zmeny pH (41) (42) (43) alebo osmolality, interakciu s médiom na kultiváciu buniek (44) (45) alebo príliš vysoké úrovne cytotoxicity (pozri bod 29).
                     Pri analýze indukcie mikrojadier je dôležité, aby mitóza prebehla v ovplyvňovaných aj v neovplyvňovaných kultúrach. Najinformatívnejšie štádium na hodnotenie mikrojadier je v bunkách, ktoré prešli jednou mitózou počas ovplyvňovania testovanou chemikáliou alebo po ňom. Pri vyrábaných nanomateriáloch je nutné v tejto testovacej metóde vykonať určité úpravy, ktoré však v tejto testovacej metóde nie sú opísané.
                     Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom získať údaje na zamýšľaný regulačný účel by sa malo zvážiť, či na tento účel dokáže poskytnúť primerané výsledky, a ak dokáže, z akých dôvodov. Také úvahy nie sú nutné, pokiaľ existuje regulatórna požiadavka na testovanie danej zmesi.
                     PRINCÍP TESTU
                     Bunkové kultúry ľudského pôvodu alebo pochádzajúce z iných cicavcov sú vystavené testovanej chemikálii s exogénnym zdrojom metabolickej aktivácie aj bez neho, pokiaľ nie sú použité bunky s dostatočnou schopnosťou metabolizácie (pozri bod 19).
                     Počas vystavenia účinkom testovanej chemikálie alebo po nej sa bunky dostatočne dlho kultivujú, čím sa má umožniť, aby poškodenie chromozómov alebo iné účinky na bunkový cyklus/delenie buniek viedli k vytvoreniu mikrojadier v bunkách v interfáze. Na indukciu aneuploidie je zvyčajne potrebné, aby bola testovaná chemikália prítomná počas mitózy. Odobraté a zafarbené bunky v interfáze sa analyzujú na prítomnosť mikrojadier. V ideálnom prípade by sa mali mikrojadrá hodnotiť len v tých bunkách, v prípade ktorých počas vystavenia účinkom testovanej chemikálie alebo v čase po ovplyvnení (ak sa použije) prebehla mitóza. Ak boli kultúry ovplyvnené blokátorom cytokinézy, tento výsledok sa dosiahne hodnotením len dvojjadrových buniek. Ak sa blokátor cytokinézy nepoužije, je dôležité na základe zvýšenia bunkovej populácie preukázať, že analyzované bunky pravdepodobne prešli delením počas vystavenia účinkom testovanej chemikálie alebo po ňom. V prípade všetkých protokolov je dôležité preukázať, že došlo k proliferácii buniek v kontrolných, ako aj ovplyvnených kultúrach, a vo všetkých kultúrach, v prípade ktorých sa hodnotí výskyt mikrojadier, by sa mala posúdiť miera cytotoxicity alebo cytostázy vyvolané testovanou chemikáliou.
                     OPIS METÓDY
                     
                        Bunky
                     
                     Môžu sa použiť kultivované primárne ľudské alebo iné cicavčie periférne lymfocyty (7) (20) (46) (47) a niekoľko bunkových línií hlodavcov ako CHO, V79, CHL/IU a bunky L5178Y alebo ľudské bunkové línie ako TK6 (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (pozri bod 6). V mikrojadrovom testovaní sa používajú aj iné bunkové línie, ako sú HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), bunky HepG2 (52) (53), A549 a primárne embryonálne bunky škrečka sýrskeho (54), ale v súčasnosti ešte nie sú v rozsiahlej miere validované. Preto musí byť použitie uvedených bunkových línií a typov odôvodnené na základe ich preukázaného správania sa v teste, ako sa uvádza v oddiele kritériá prijateľnosti. O cytoB bolo zaznamenané, že dokáže ovplyvniť rast buniek L5178Y, a preto sa neodporúča používať s touto bunkovou líniou (23). Pri použití primárnych buniek by sa malo z dôvodov rešpektovania dobrých podmienok zvierat, pokiaľ je to možné, zvážiť použitie buniek ľudského pôvodu a odber vzoriek by sa mal vykonať v súlade s humánnymi etickými zásadami a predpismi.
                     Ľudské periférne lymfocyty by mali pochádzať od mladých nefajčiarov (vo veku približne od 18 do 35 rokov), o ktorých nie je známe, že by trpeli nejakou chorobou alebo že by boli v poslednom čase vystavení genotoxickým činidlám (napr. chemikáliám, ionizujúcemu žiareniu) na úrovniach, ktoré by zvýšili výskyt skrytých buniek s mikrojadrami. Tým by sa zabezpečilo, že výskyt buniek s mikrojadrami v pozadí bude nízky a stály. Základný výskyt buniek s mikrojadrami sa vekom zvyšuje a tento trend je výraznejší u žien ako u mužov (55). Ak sa používajú spoločne bunky od viac ako jedného darcu, mal by sa uviesť počet darcov. Je nevyhnutné preukázať, že bunky sa delili od začiatku ovplyvňovania testovanou chemikáliou až do vtedy, kým sa z nich odobrali vzorky. Bunkové kultúry sa udržiavajú vo fáze exponenciálneho rastu (bunkové línie) alebo sa stimulujú k deleniu (primárne kultúry lymfocytov), aby bolo možné vystavenie buniek v rôznych štádiách bunkového cyklu, pretože citlivosť buniek v jednotlivých štádiách na testované chemikálie nemusí byť známa. Primárne bunky, ktoré k deleniu potrebujú stimuláciu mitogénnymi aktivátormi, počas vystavenia účinkom testovanej chemikálie už zvyčajne nie sú synchronizované (napr. ľudské lymfocyty po 48-hodinovej mitogénnej stimulácii). Použitie synchronizovaných buniek počas ovplyvňovania testovanou chemikáliou sa neodporúča, no môže sa akceptovať, ak je odôvodnené.
                     
                        Médiá a podmienky kultivácie
                     
                     Na udržiavanie kultúr by sa mali používať vhodné rastové médiá a inkubačné podmienky (kultivačné nádoby, prípadne atmosféra s vyššou relatívnou vlhkosťou a 5 % CO2, teplota 37 °C). Bunkové línie by sa mali pravidelne kontrolovať na stabilitu modálneho počtu chromozómov a absenciu kontaminácie Mycoplasma. V prípade kontaminácie alebo zmeny modálneho počtu chromozómov by sa nemali používať. Mala by sa stanoviť dĺžka bežného bunkového cyklu bunkových línií alebo primárnych kultúr použitých v skúšobnom laboratóriu, ktorá by mala byť v súlade s bunkovými charakteristikami uvedenými v literatúre.
                     
                        Príprava kultúr
                     
                     Bunkové línie: bunky sa rozmnožujú zo zásobných kultúr, nasadia sa do rastového média v takej hustote, aby u buniek v suspenziách alebo v monovrstvách pokračoval exponenciálny rast až do odberu (napr. malo by sa zabrániť zhlukovaniu v prípade buniek rastúcich v monovrstvách).
                     Lymfocyty: celá krv ovplyvnená antikoagulantom (napríklad. heparínom) alebo separované lymfocyty sa kultivujú (napr. 48 hodín v prípade ľudských lymfocytov) za prítomnosti mitogénu [napr. fytohemaglutinínu (PHA) v prípade ľudských lymfocytov], aby sa vyvolalo bunkové delenie pred vystavením testovanej chemikálii a cytoB.
                     
                        Metabolická aktivácia
                     
                     Ak sa použijú bunky s nedostatočnou endogénnou metabolickou kapacitou, mali by sa použiť exogénne systémy metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom, ktorý sa štandardne odporúča, pokiaľ nie je odôvodnené použitie iného systému, je postmitochondriálna frakcia obohatená o kofaktor (S9), pripravená z pečene hlodavcov (zvyčajne potkanov) ovplyvnených prípravkami na indukciu enzýmov, ako je Aroclor 1254 (56) (57), alebo zmes fenobarbitalu a beta-naftoflavónu (58) (59) (60). Použitie uvedenej zmesi nie je v rozpore so Štokholmským dohovorom o perzistentných organických látkach (61) a preukázalo sa, že táto zmes je rovnako účinná pri indukcii oxidáz so zmiešanou funkciou ako Aroclor 1254 (58) (59) (60). Frakcia S9 sa v konečnom testovacom médiu zvyčajne používa v koncentráciách od 1 obj. % do 2 obj. %, môže sa však zvýšiť až na 10 obj. %. V priebehu ovplyvňovania by sa nemali používať produkty, ktoré znižujú mitotický index, najmä vápnik-viažuce produkty (činidlá) (62). Výber typu a koncentrácie použitého exogénneho systému metabolickej aktivácie alebo metabolického induktora môže ovplyvniť trieda testovaných chemikálií.
                     
                        Príprava testovanej chemikálie
                     
                     Tuhé testované chemikálie by sa mali pred ovplyvnením buniek vo vhodnom rozpúšťadle rozpustiť a prípadne rozriediť. Kvapalné testované chemikálie možno pridať priamo do testovacieho systému a/alebo pred ovplyvnením rozriediť. Plynné alebo prchavé testované chemikálie by sa mali testovať pomocou náležite upravených štandardných protokolov, ako je napríklad ovplyvňovanie v uzatvorených nádobách (63) (64) (65). Prípravky testovanej chemikálie by sa mali pripraviť bezprostredne pred ovplyvňovaním, pokiaľ údaje o stabilite nepoukazujú na prijateľnosť uskladnenia.
                     
                        Podmienky testu
                     
                     
                        Rozpúšťadlá
                     
                     Rozpúšťadlo by sa malo zvoliť tak, aby optimalizovalo rozpustnosť testovaných chemikálií bez toho, aby nepriaznivo ovplyvňovalo vykonávanie skúšky, napr. menilo rast buniek, ovplyvňovalo integritu testovanej chemikálie, reagovalo s kultivačnými nádobami, narúšalo systém metabolickej aktivácie. Odporúča sa, pokiaľ je to možné, najskôr zvážiť použitie vodného rozpúšťadla (alebo rastového média). Osvedčenými rozpúšťadlami sú voda alebo dimetylsulfoxid (DMSO). Organické rozpúšťadlá by všeobecne nemali presiahnuť 1 obj. %. Ak sa cytoB rozpustí v DMSO, celkové množstvo organického rozpúšťadla použitého na testovanú chemikáliu aj na cytoB by nemalo presiahnuť 1 obj. %, v opačnom prípade by sa mali použiť čisté kontroly, aby sa zabezpečilo, že uvedený percentuálny podiel organického rozpúšťadla nebude mať nepriaznivý účinok. Vodné rozpúšťadlá (fyziologický roztok alebo voda) by v konečnom testovacom médiu nemali presiahnuť 10 obj. %. Ak sa použijú iné ako osvedčené rozpúšťadlá (napr. etanol alebo acetón), ich použitie by malo byť podložené údajmi o ich kompatibilite s testovanou chemikáliou a testovacím systémom a o tom, že v použitej koncentrácii nie sú genotoxické. V prípade, že také údaje neexistujú, je dôležité zaradiť čisté kontroly (pozri dodatok 1), ako aj kontrou rozpúšťadla s cieľom preukázať, že zvolené rozpúšťadlo nevyvoláva škodlivé účinky ani účinky na chromozómy (napr. aneuploidiu alebo klastogenicitu).
                     
                        Použitie cytoB ako blokátora cytokinézy
                     
                     Jedným z najdôležitejších faktorov pri vykonávaní testu MNvit je zabezpečenie toho, aby v bunkách, ktoré sa hodnotia, prebehla mitóza počas ovplyvňovania alebo v inkubačnej dobe po ovplyvňovaní, ak sa použije. Preto by sa hodnotenie výskytu mikrojadier malo obmedziť len na bunky, ktoré prešli mitózou počas ovplyvňovania alebo po ňom. CytoB je najbežnejšie používané činidlo na blokovanie cytokinézy, pretože potláča tvorbu aktínu, a tým zabraňuje oddeľovaniu dcérskych buniek po mitóze, čo vedie k vytváraniu dvojjadrových buniek (6) (66) (67). Pri použití cytoB možno simultánne merať účinok testovanej chemikálie na kinetiku proliferácie buniek. CytoB by sa mal používať ako blokátor cytokinézy pri použití ľudských lymfocytov, pretože medzi rôznymi darcami budú dĺžky bunkových cyklov variabilné, a takisto preto, že nie všetky lymfocyty budú reagovať na stimuláciu PHA. Použitie cytoB nie je povinné pri iných typoch buniek, ak možno určiť, že prešli delením, ako sa opisuje v bode 27. CytoB sa okrem toho zvyčajne nepoužíva, ak sa vzorky hodnotia na mikrojadrá metódami prietokovej cytrometrie.
                     Vhodnú koncentráciu cytoB by laboratórium malo stanoviť pre každý druh buniek, aby sa dosiahla optimálna frekvencia dvojjadrových buniek v kultúrach s kontrolou rozpúšťadla, a malo by sa preukázať, že pri tejto koncentrácii je k dispozícii dostatočné množstvo dvojjadrových buniek na hodnotenie. Vhodná koncentrácia cytoB je zvyčajne od 3 do 6 μg/ml (19).
                     
                        Meranie proliferácie buniek a cytotoxicity a výber expozičných koncentrácií
                     
                     Pri stanovovaní najvyššej koncentrácie testovanej chemikálie by sa nemali používať koncentrácie, ktoré majú schopnosť vyvolať falošné pozitívne reakcie, ako napríklad tie, ktoré spôsobujú nadmernú cytotoxicitu (pozri bod 29), zrážanie v rastovom médiu (pozri bod 30) alebo výrazné zmeny pH alebo osmolality (pozri bod 9). Ak testovaná chemikália v čase, keď sa pridáva, spôsobuje výraznú zmenu pH média, mohlo by sa pH upraviť tlmivým roztokom do konečného testovacieho média tak, aby nedošlo k falošným pozitívnym výsledkom a aby sa zachovali vhodné kultivačné podmienky.
                     Merania bunkovej proliferácie sa vykonávajú s cieľom zabezpečiť, aby dostatočný počet ovplyvnených buniek prešiel mitózou počas testovania a aby sa ovplyvňovania vykonávali pri vhodných úrovniach cytotoxicity (bozri bod 29). Cytotoxicita by sa mala stanoviť v hlavnom pokuse s metabolickou aktiváciou a bez nej, pričom sa použije vhodná indikácia bunkovej smrti a rastu buniek (pozri body 26 a 27). Hoci hodnotenie cytotoxicity pri počiatočnom predbežnom teste môže byť užitočné na lepšie vymedzenie koncentrácií, ktoré sa majú použiť v hlavnom pokuse, počiatočný test nie je povinný. Ak sa vykoná, nemal by nahrádzať meranie cytotoxicity v hlavnom pokuse.
                     Ovplyvňovanie kultúr s cytoB a meranie relatívnych frekvencií jednojadrových, dvojjadrových a viacjadrových buniek v kultúre predstavuje presnú metódu kvantifikácie účinkov na bunkovú proliferáciu a cytotoxického alebo cytostatického pôsobenia pri ovplyvňovaní (6) a zabezpečuje, že sa mikroskopicky hodnotia len bunky, ktoré sa delili počas ovplyvňovania alebo po ňom. Proliferačný index blokovania cytokinézy (CBPI) (6) (27) (68) alebo index replikácie (RI) minimálne z 500 buniek na kultúru (pozri vzorce v dodatku 2) sa odporúčajú na odhad cytotoxického alebo cytostatického pôsobenia pri ovplyvňovaní porovnaním hodnôt v ovplyvňovaných kultúrach a kontrolných kultúrach. Užitočné informácie by mohlo poskytnúť aj posúdenie ďalších ukazovateľov cytotoxicity (napr. integrita buniek, apoptóza, nekróza, počítanie metafáz, bunkový cyklus), tieto ukazovatele by sa však nemali používať namiesto CBPI alebo RI.
                     V štúdiách bez použitia cytoB je potrebné preukázať, že bunky v kultúre sa rozdelili, takže podstatná časť z hodnotených buniek prešla delením počas ovplyvňovania testovanou chemikáliou alebo po ňom, inak môžu nastať falošné negatívne reakcie. Na odhad cytotoxického a cytostatického pôsobenia pri ovplyvňovaní sa odporúča vykonať meranie relatívneho zdvojenia populácie (RPD) alebo relatívneho zvýšenia počtu buniek (RICC) (17) (68) (69) (70) (71) (pozri vzorce v dodatku 2). Pri predĺžených časoch odberu vzoriek (napr. ovplyvňovanie počas obdobia zodpovedajúceho 1,5 až 2-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu a odber po ďalšom období zodpovedajúcom 1,5 až 2-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu, čo celkovo vedie k odberom dlhším než 3 až 4-násobok dĺžky bežného bunkového cyklu, ako sa opisuje v bodoch 38 a 39) by použitie RPD mohlo viesť k podhodnotenému odhadu cytotoxicity (71). Za týchto okolností by meranie RICC mohlo predstavovať lepšiu alternatívu alebo by bolo užitočné vykonať odhad na základe hodnotenia cytotoxicity po období zodpovedajúcom 1,5 až 2-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu. Ďalšie užitočné informácie by mohlo poskytnúť aj posúdenie ostatných markerov cytotoxicity alebo cytostázy (napr. integrita buniek, apoptóza, nekróza, počítanie metafáz, proliferačný index (PI), bunkový cyklus, nukleoplazmatické mosty alebo jadrové zárodky), nemali by sa však používať namiesto RPD alebo RICC.
                     Mali by sa vyhodnotiť aspoň tri testovacie koncentrácie (bez rozpúšťadla a pozitívnych kontrol), ktoré spĺňajú kritéria prijateľnosti (vhodná cytotoxicita, počet buniek atď.). Bez ohľadu na typy buniek (bunkové línie alebo primárne kultúry lymfocytov) možno pri každej testovacej koncentrácii použiť replikát alebo jednu ovplyvnenú kultúru. Hoci sa odporúča použitie duplicitných kultúr, akceptovateľná je aj jedna kultúra za predpokladu, že sa v takejto jednej kultúre alebo v duplicitných kultúrach hodnotí rovnaký celkový počet buniek. Použitie jednej kultúry je relevantné najmä v prípade, že sa posudzujú viac než 3 koncentrácie (pozri body 44 – 45). Výsledky získané z nezávislých kultúr použitých na opakovanie pri danej koncentrácii možno na účely analýzy údajov zlúčiť. V prípade testovaných chemikálií, ktoré vykazujú malú alebo nevykazujú žiadnu cytotoxicitu, budú za bežných okolností vhodné približne dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrácií. Ak dôjde k cytotoxicite, mali by zvolené testovacie koncentrácie pokrývať rozpätie počnúc koncentráciou vyvolávajúcou cytotoxicitu, ako sa opisuje v bode 29, až po koncentrácie, pri ktorých dochádza k miernej a malej, alebo nedochádza k žiadnej cytotoxicite. Mnohé testované chemikálie vykazujú strmé krivky závislosti reakcie od koncentrácie a s cieľom získať údaje pri nízkej a miernej cytotoxicite alebo podrobne preštudovať závislosť reakcie od dávky bude potrebné zvoliť menšie rozdiely medzi jednotlivými koncentráciami a/alebo viac než tri koncentrácie (pre jednu kultúru alebo replikáty), a to najmä v situáciách, kedy sa vyžadujú opakované pokusy (pozri bod 60).
                     Ak vychádza maximálna koncentrácia z cytotoxicity, mala by byť najvyššia koncentrácia taká, aby sa dosiahlo 55 ± 5 % cytotoxicity pri použití odporúčaných parametrov cytotoxicity (t. j. zníženie RICC a RPD v prípade bunkových línií, ak sa nepoužije cytoB, a zníženie CBPI alebo RI, ak sa použije cytoB, na 45 ± 5 % v prípade súbežnej negatívnej kontroly) (72). Je potrebné prihliadnuť na to, aby sa interpretovali len tie pozitívne výsledky, ktoré sú zistené pri vyššej hranici tohto 55 ± 5 % rozsahu cytotoxicity (71).
                     V prípade slabo rozpustných testovaných chemikálií, ktoré nie sú cytotoxické pri koncentráciách nižších, než je najnižšia nerozpustná koncentrácia, by najvyššia analyzovaná koncentrácia mala na konci ovplyvňovania testovanou chemikáliou vyvolať zakalenie alebo zrazeninu viditeľnú voľným okom alebo pomocou inverzného mikroskopu. Dokonca aj v prípadoch, kedy k cytotoxicite dochádza pri koncentráciách vyšších, než je najnižšia nerozpustná koncentrácia, sa odporúča testovať len jednu koncentráciu indukujúcu zakalenie alebo viditeľnú zrazeninu, pretože vznik zrazeniny môže viesť k falošným účinkom. Pri koncentrácii, ktorá vedie k vzniku zrazeniny, je potrebné zabezpečiť, aby zrazenina neovplyvnila priebeh testovania (napr. farbenia alebo hodnotenia). Môže byť užitočné pred pokusom stanoviť rozpustnosť v rastovom médiu.
                     Ak sa nezistí zrazenina alebo obmedzujúca cytotoxicita, mala by najvyššia testovacia koncentrácia zodpovedať 10 mM, 2 mg/ml alebo 2 μl/ml, podľa toho, ktorá z uvedených hodnôt je najnižšia (73) (74) (75). Pokiaľ testovaná chemikália nemá stanovené zloženie, ako je to napr. v prípade látok neznámeho alebo variabilného zloženia, produktov komplexných reakcií alebo biologických materiálov (UVCB) (76), prírodných extraktov atď., je možné, že najvyššia koncentrácia bude musieť byť pri nedostatočnej cytotoxicite vyššia (napr. 5 mg/ml), aby sa zvýšila koncentrácia každej zložky. Treba však poznamenať, že v prípade humánnych liekov sa tieto požiadavky môžu líšiť (93).
                     
                        Kontroly
                     
                     Pri každom odbere by sa mali zahrnúť súbežné negatívne kontroly (pozri bod 21), ktoré pozostávajú zo samotného rozpúšťadla v testovacom médiu a ktoré sú spracované rovnakým spôsobom ako ovplyvňované kultúry.
                     Na preukázanie schopnosti laboratória identifikovať klastogény a aneugény za podmienok použitého testovacieho protokolu a účinnosti exogénneho systému metabolickej aktivácie (ak sa používa) sú nutné súbežné pozitívne kontroly. Príklady pozitívnych kontrol sú uvedené v tabuľke 1 ďalej v texte. V odôvodnených prípadoch môžu byť na pozitívnu kontrolu použité alternatívne chemikálie.
                     V súčasnej dobe nie sú známe žiadne aneugény, ktoré by si k svojej genotoxickej aktivite vyžadovali metabolickú aktiváciu (17). Keďže testy na cicavčích bunkách in vitro na zistenie genetickej toxicity sú pri krátkodobých ovplyvňovaniach vykonávaných súbežne s metabolickou aktiváciou a bez nej a pri rovnakom čase ovplyvňovania dostatočne štandardizované, možno použitie pozitívnych kontrol obmedziť na testovanie klastogénu vyžadujúceho metabolickú aktiváciu. V tomto prípade preukáže jednoduchá odpoveď na pozitívnu klastogénnu kontrolu činnosť systému metabolickej aktivácie, ako aj vnímavosť testovacieho systému. Dlhodobé ovplyvňovanie (bez S9) by však malo mať svoju vlastnú pozitívnu kontrolu, keďže dĺžka ovplyvňovania sa bude líšiť od dĺžky testovania s použitím metabolickej aktivácie. Ak sa ako jediná pozitívna kontrola pri krátkodobom ovplyvňovaní s metabolickou aktiváciou a bez nej zvolí klastogén, mal by sa pre dlhodobé ovplyvňovanie bez metabolickej aktivácie zvoliť aneugén. Pozitívne kontroly na klastogenicitu aj aneugenicitu by sa mali použiť v prípade buniek s metabolickou kapacitou, ktoré si nevyžadujú S9.
                     Každá pozitívna kontrola by sa mala použiť pri jednej alebo viacerých koncentráciách, pri ktorých sa očakáva, že poskytnú reprodukovateľný a detegovateľný nárast nad hodnoty v pozadí, aby sa preukázala citlivosť testovacieho systému (t. j. účinky sú jasné, ale neodhalia okamžite identitu kódovaných preparátov pri odčítaní), a reakciu by nemala rušiť cytotoxicita presahujúca hraničné hodnoty stanovené v tejto testovacej metóde.
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Referenčné chemikálie odporúčané na posúdenie spôsobilosti laboratória a na výber pozitívnych kontrol
                     
                     
                                 Kategória
                              
                              
                                 Chemikália
                              
                              
                                 CAS číslo
                              
                           
                                 1.   Klastogény aktívne bez metabolickej aktivácie
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 metylmetánsulfonát
                              
                              
                                 66-27-3
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 mitomycín C
                              
                              
                                 50-07-7
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 4-nitrochinolín-N-oxid
                              
                              
                                 56-57-5
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 cytozín arabinozid
                              
                              
                                 147-94-4
                              
                           
                                 2.   Klastogény vyžadujúce metabolickú aktiváciu
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 benzo[a]pyrén
                              
                              
                                 50-32-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 cyklofosfamid
                              
                              
                                 50-18-0
                              
                           
                                 3.   Aneugény
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 kolchicín
                              
                              
                                 64-86-8
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 vinblastín
                              
                              
                                 143-67-9
                              
                           POSTUP
                     
                        Harmonogram ovplyvňovania
                     
                     S cieľom maximalizovať pravdepodobnosť detekcie aktivity aneugénu alebo klastogénu v špecifickom štádiu bunkového cyklu je dôležité, aby bol testovanej chemikálii vystavený dostatočný počet buniek reprezentujúcich všetky rôzne štádiá bunkových cyklov. Všetky ovplyvňovania by sa mali začať a skončiť v čase exponenciálneho rastu buniek a tento rast by mal pokračovať až do odberu. Harmonogram ovplyvňovania v prípade bunkových línií a primárnych bunkových kultúr sa teda môže určitým spôsobom odlišovať od harmonogramu ovplyvňovania v prípade lymfocytov, ktoré si vyžadujú stimuláciu mitogénom na to, aby sa začal ich bunkový cyklus (17). V prípade lymfocytov je najúčinnejšie začať ovplyvňovanie testovanou chemikáliou 44 – 48 hodín po stimulácii PHA, kedy sa bunky budú deliť asynchronicky (6).
                     Publikované údaje (19) naznačujú, že väčšina aneugénov a klastogénov sa určí na základe krátkodobého ovplyvňovania trvajúceho 3 až 6 hodín s použitím S9 a bez použitia S9, po ktorom nasleduje odstránenie testovanej chemikálie a odber v období zodpovedajúcom 1,5 až 2,0-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania (7).
                     Na dôkladné vyhodnotenie, ktoré by bolo potrebné, aby bolo možné vyvodiť záver o negatívnom výsledku, by však mali byť zrealizované všetky tri nasledujúce podmienky pokusu s použitím krátkodobého ovplyvňovania s metabolickou aktiváciou a bez nej a dlhodobého ovplyvňovania bez metabolickej aktivácie (pozri body 56, 57 a 58):
                     
                                 —
                              
                              
                                 bunky by mali byť vystavené testovanej chemikálii bez metabolickej aktivácie počas 3 – 6 hodín a vzorky z nich by sa mali odobrať v čase rovnajúcom sa približne 1,5 – 2,0-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bunky by mali byť vystavené testovanej chemikálii s metabolickou aktiváciou počas 3 – 6 hodín a vzorky z nich by sa mali odobrať v čase rovnajúcom sa približne 1,5 – 2,0-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania (19),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 bunky by mali byť nepretržite vystavené testovanej chemikálii bez metabolickej aktivácie až do odberu v čase, ktorý zodpovedá 1,5 – 2-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu.
                              
                           V prípade, že niektorá z uvedených podmienok pokusu vedie k pozitívnej reakcii, je možné, že nebude potrebné skúmať žiaden iný režim ovplyvňovania.
                     Ak je známe alebo ak existuje podozrenie, že testovaná chemikália ovplyvňuje dĺžku bunkového cyklu (napr. pri testovaní analógov nukleozidu), najmä u p53-kompetentných buniek (35) (36) (77), možno čas odberu vzoriek alebo čas obnovy kultúr predĺžiť o ďalšie obdobie zodpovedajúce maximálne 1,5 – 2,0-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu (t. j. celkovo 3,0 – 4,0-násobok dĺžky bunkového cyklu po začatí krátkodobého a dlhodobého ovplyvňovania). Tieto možnosti sú určené pre situácie, kedy môžu vniknúť obavy týkajúce sa možných interakcií medzi testovanou chemikáliou a cytoB. Pri použití predĺžených časov odberu vzoriek (t. j. celkovo na obdobie zodpovedajúce 3,0 – 4,0-násobku dĺžky bunkového cyklu kultúr) treba zabezpečiť, aby v tomto čase stále prebiehalo aktívne delenie buniek. Napríklad v prípade lymfocytov môže exponenciálny rast v čase 96 hodín po stimulácii klesať a bunkové kultúry v monovrstvách môžu začať splývať.
                     Navrhované harmonogramy ovplyvňovania pre bunky sú zhrnuté v tabuľke 2. Tieto všeobecné harmonogramy ovplyvňovania možno upravovať (ak je to odôvodnené) v závislosti od stability alebo reaktivity testovanej chemikálie alebo osobitných rastových charakteristík použitých buniek.
                     
                        Tabuľka 2
                     
                     
                        Časy ovplyvňovania a odberu vzoriek buniek v rámci testu MNvit
                     
                     
                                 Lymfocyty, primárne bunky a bunkové línie ovplyvnené s cytoB
                              
                              
                                 + S9
                                 krátke ovplyvňovanie
                              
                              
                                 ovplyvňovanie počas 3 – 6 hodín za prítomnosti S9;
                                 odstránenie S9 a testovacieho média;
                                 pridanie čerstvého média a cytoB;
                                 odber po uplynutí času zodpovedajúceho 1,5 až 2,0-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania.
                              
                           
                                 – S9
                                 krátke ovplyvňovanie
                              
                              
                                 ovplyvňovanie počas 3 – 6 hodín;
                                 odstránenie testovacieho média;
                                 pridanie čerstvého média a cytoB;
                                 odber po uplynutí času zodpovedajúceho 1,5 až 2,0-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po začatí ovplyvňovania.
                              
                           
                                 – S9
                                 predĺžené ovplyvňovanie
                              
                              
                                 ovplyvňovanie počas času zodpovedajúceho 1,5 až 2-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu za prítomnosti cytoB;
                                 odber na konci času ovplyvňovania.
                              
                           
                                 Bunkové línie ovplyvnené bez cytoB
                                 (Harmonogramy sú identické s harmonogramami ovplyvňovania uvedenými vyššie s výnimkou toho, že sa nepridáva cytoB).
                              
                           Na konci ovplyvňovania, ktoré trvá 3 – 6 hodín, sa v monovrstvových kultúrach môžu vyskytovať mitotické bunky (ktoré sú identifikovateľné ako okrúhle a oddeľujúce sa od povrchu). Keďže tieto mitotické bunky sa ľahko oddeľujú, môžu sa pri odstraňovaní média obsahujúceho testovanú chemikáliu stratiť. Ak existuje dôkaz o podstatnom náraste počtu mitotických buniek v porovnaní s kontrolami, čo indikuje pravdepodobné zastavenie mitózy, v čase odberu by sa bunky mali zhromaždiť odstredením a pridať späť do kultúry, aby sa zabránilo strate buniek, u ktorých prebieha mitóza a hrozí, že dôjde k vzniku mikrojadier/chromozómovej aberácii.
                     
                        Odber buniek a príprava preparátov
                     
                     Z každej kultúry by sa bunky mali odoberať a spracúvať zvlášť. Príprava buniek môže zahŕňať hypotonizáciu, tento krok však nie je potrebný, ak sa dosiahne primerané rozšírenie buniek iným spôsobom. Pri príprave preparátov možno použiť rôzne techniky za predpokladu, že sa zabezpečí vysoká kvalita bunkových preparátov na účely vyhodnocovania. Bunky s neporušenou bunkovou membránou a neporušenou cytoplazmou by sa mali uchovať, aby bolo možné zistiť mikrojadrá a (pri použití metódy s blokovaním cytokinézy) spoľahlivo identifikovať dvojjadrové bunky.
                     Preparáty možno farbiť pomocou rôznych metód, ako je Giemsa alebo fluorescenčné farbivá so špecifickou väzbou na DNA. Použitie vhodných fluorescenčných farbív [napr. akridínová oranž (78) alebo Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)] môže eliminovať niektoré umelo vzniknuté štruktúry spojené s používaním farbiva bez špecifickej väzby na DNA. Ak je potrebné získať mechanistické informácie o tvorbe mikrojadier, možno na identifikáciu ich obsahu použiť protilátky proti kinetochorom, FISH s pancentromérovými sondami DNA alebo značenie in situ pomocou primerov špecifických pre pancentroméru spolu s vhodným DNA – kontrastným farbiacim roztokom (celé chromozómy sa zafarbia, zatiaľ čo acentrické fragmenty chromozómov sa nezafarbia) (16) (17). Na odlíšenie klastogénov od aneugénov možno použiť aj iné metódy, pokiaľ sa preukázali ako účinné a boli validované. Napríklad v prípade určitých bunkových línií by sa užitočné informácie mohli získať meraním jadier sub-2N ako hypodiploidných javov použitím takých techník, ako je analýza obrazu, laserová skenovacia cytometria alebo prietoková cytometria (80) (81) (82). Morfologické pozorovanie jadier by takisto mohlo poskytnúť indikácie možnej aneuploidie. Okrem toho test chromozómových aberácií v metafáze vykonaný najlepšie na tom istom type buniek a podľa protokolu s porovnateľnou citlivosťou by mohol byť takisto užitočný na stanovenie toho, či sú mikrojadrá dôsledkom zlomov chromozómov (keďže je známe, že strata chromozómov by sa v teste na chromozómovú aberáciu nezistila).
                     
                        Analýza
                     
                     Všetky preparáty vrátane preparátov z rozpúšťadiel na kontrolu a neovplyvnených (ak sa použijú) a pozitívnych kontrol by sa pred mikroskopickou analýzou frekvencií mikrojadier mali jednotlivo označiť kódom. V prípade automatizovaného systému hodnotenia by sa mali použiť vhodné techniky, ako je napr. prietoková cytometria, laserová skenovacia cytometria alebo analýza obrazu, aby boli skreslenia a posuny pod kontrolou. Bez ohľadu na to, či sa pri vyčíslení mikrojadier používa automatizovaná platforma, mali by sa súbežne posudzovať hodnoty CBPI, RI, RPD alebo RICC.
                     V prípade kultúr ovplyvnených cytoB by sa mali analyzovať frekvencie výskytu mikrojadier aspoň v prípade 2 000 dvojjadrových buniek na každú koncentráciu a každú kontrolu (83), ktoré sa rovnomerne rozdelia medzi replikátmi, ak sa replikáty použijú. V prípade, že sa použije jedna kultúra na každú dávku (pozri bod 28), by sa malo vyhodnotiť aspoň 2 000 dvojjadrových buniek na každú kultúru v rámci tejto jednej kultúry (83). Ak je na hodnotenie pri každej koncentrácii k dispozícii podstatne menej než 1 000 dvojjadrových buniek z každej kultúry (v prípade duplicitných kultúr), alebo 2 000 (v prípade jednej kultúry) a nezistí sa významný nárast výskytu mikrojadier, test by sa mal zopakovať s použitím väčšieho počtu buniek alebo pri menších cytotoxických koncentráciách, podľa toho, ktorá z týchto dvoch možností je vhodná. Je potrebné zabezpečiť, aby sa nehodnotili dvojjadrové bunky, ktoré majú nepravidelný tvar alebo ktorých jadrá sa veľkosťou výrazne odlišujú. Okrem toho dvojjadrové bunky by sa nemali mylne zamieňať s nedostatočne rozšírenými viacjadrovými bunkami. Bunky obsahujúce viac než dve hlavné jadrá by sa nemali analyzovať na prítomnosť mikrojadier, keďže základná frekvencia mikrojadier môže byť v týchto bunkách vyššia (84). Hodnotenie jednojadrových buniek je prijateľné vtedy, ak sa preukáže, že testovaná chemikália zasahuje do pôsobenia cytoB. V takých prípadoch by mohlo byť užitočné zopakovať test bez CytoB. Hodnotenie jednojadrových buniek spolu s hodnotením dvojjadrových buniek by mohlo poskytnúť užitočné informácie (85) (86), nie je však povinné.
                     V bunkových líniách bez ovplyvnenia pomocou cytoB by sa mali mikrojadrá hodnotiť aspoň v prípade 2 000 buniek na koncentráciu a kontrolu (83), ktoré sa rovnomerne rozdelia medzi replikátmi, ak sa replikáty použijú. V prípade, že sa použije jedna kultúra na koncentráciu (pozri bod 28), by sa malo vyhodnotiť aspoň 2 000 buniek na každú kultúru v rámci tejto jednej kultúry. Ak je na hodnotenie pri každej koncentrácii k dispozícii podstatne menej než 1 000 buniek na kultúru (v prípade duplicitných kultúr), alebo 2 000 (v prípade jednej kultúry) a ak sa nezistí výrazný nárast výskytu mikrojadier, test by sa mal zopakovať s použitím väčšieho počtu buniek alebo pri menších cytotoxických koncentráciách, podľa toho, ktorá z týchto dvoch možností je vhodná.
                     Pri použití cytoB by sa mala určiť hodnota CBPI alebo RI na posúdenie bunkovej proliferácie (pozri dodatok 2) s použitím aspoň 500 buniek na kultúru. Ak sa ovplyvňovanie vykonáva bez prítomnosti cytoB, je nevyhnutné preukázať, že bunky v kultúre sa rozdelili, ako sa vysvetľuje v bodoch 24 až 28.
                     
                        Spôsobilosť laboratória
                     
                     Na to, aby sa pred vykonaním rutinného testu zistilo, či má laboratórium s danou skúškou dostatočné skúsenosti, malo by mať vykonanú sériu pokusov s referenčnými pozitívnymi chemikáliami pôsobiacimi prostredníctvom rôznych mechanizmov (aspoň jedna chemikália s metabolickou aktiváciou a jedna bez metabolickej aktivácie a jedna chemikália pôsobiaca prostredníctvom aneugénneho mechanizmu, pričom všetky sa vyberú zo zoznamu v tabuľke 1) a s rôznymi negatívnymi kontrolami (vrátane neovplyvnených kultúr a rôznych rozpúšťadiel/nosičov). Reakcie týchto pozitívnych a negatívnych kontrol by mali byť v súlade s príslušnou literatúrou. Tento postup sa nepoužije v prípade laboratórií, ktoré majú skúsenosti, t. j. ktoré majú k dispozícii databázu historických údajov, ako sa definuje v bodoch 49 až 52.
                     Mal by sa preskúmať celý rad vybratých chemikálií na pozitívnu kontrolu (pozri tabuľku 1) s krátkym a dlhým ovplyvňovaním za neprítomnosti metabolickej aktivácie, ako aj s krátkym ovplyvňovaním za prítomnosti metabolickej aktivácie, aby sa preukázala spôsobilosť zistiť klastogénne a aneugénne chemikálie, stanoviť účinnosť systému metabolickej aktivácie a preukázať vhodnosť postupov hodnotenia (mikroskopická vizuálna analýza, prietoková cytometria, laserová skenovacia cytometria alebo analýza obrazu). Rozsah koncentrácií by sa u vybraných chemikálií mal zvoliť tak, aby poskytol opakovateľné zvýšenia súvisiace s jednotlivými koncentráciami v porovnaní s úrovňou pozadia, aby sa tak preukázala citlivosť a dynamické rozpätie testovacieho systému.
                     
                        Historické údaje na kontrolu
                     
                     Laboratórium by malo určiť:
                     
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a distribúciu historických pozitívnych kontrol,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 rozsah a distribúciu historických negatívnych kontrol (neovplyvnených, s rozpúšťadlom).
                              
                           Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s distribúciou historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými negatívnymi kontrolnými údajmi, ak takéto údaje existujú. S pridávaním ďalších údajov z pokusov k distribúcii kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tejto distribúcie (87) (88). Databáza historických negatívnych kontrol laboratória by mala byť najskôr vytvorená na základe minimálne 10 pokusov, ale radšej by mala zahŕňať aspoň 20 pokusov vykonaných za porovnateľných experimentálnych podmienok. Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (88)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov o pozitívnych a negatívnych kontrolách a preukázať, že metodika je v laboratóriu „pod kontrolou“ (83). Ďalšie odporúčania ako vytárať a využívať historické údaje (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného pokusu) možno nájsť v literatúre (87).
                     Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska konzistentnosti údajov s databázami existujúcich historických kontrol v laboratóriu. Každý väčší nesúlad by mal viesť k zavedeniu novej databázy historických kontrol.
                     Údaje o negatívnych kontrolách by mali zahŕňať výskyt buniek s mikrojadrami z jednej kultúry alebo zo súhrnu kultúr replikátov, ako sa opisuje v bode 28. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí distribúcie databázy historických negatívnych kontrol laboratória (87) (88). V prípade, že údaje o súbežných negatívnych kontrolách nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do distribúcie historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne mimo uvedených medzí a pokiaľ existujú dôkazy o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 50) a dôkazy o tom, že nedošlo k technickému alebo ľudskému zlyhaniu.
                     PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Prezentovanie výsledkov
                     
                     Ak sa použije metóda blokovania cytokinézy, pri hodnotení indukcie mikrojadier sa používajú iba frekvencie dvojjadrových buniek s mikrojadrami (bez ohľadu na počet mikrojadier v bunke). Hodnotenie počtu buniek s jedným mikrojadrom, s dvoma alebo viacerými mikrojadrami sa môže popisovať samostatne a mohlo by poskytnúť užitočné informácie, nie je však povinné.
                     Mali by sa stanoviť súbežné merania cytotoxicity a/alebo cytostázy pre všetky ovplyvnené kultúry a kultúry na negatívnu a pozitívnu kontrolu (16). Pri všetkých ovplyvnených kultúrach a kontrolných kultúrach by sa mali vypočítať hodnoty CBPI alebo RI ako merania oneskorenia bunkového cyklu pri použití metódy blokovania cytokinézy. V prípade, že sa nepoužíva cytoB, mali by sa použiť hodnoty RDP alebo RICC (pozri dodatok 2).
                     Mali by sa uvádzať údaje o jednotlivých kultúrach. Všetky údaje sa dodatočne sumarizujú v tabuľkovej forme.
                     
                        Kritériá prijateľnosti
                     
                     Prijateľnosť testu sa zakladá na týchto kritériách:
                     
                                 —
                              
                              
                                 súbežná negatívna kontrola sa považuje za prijateľnú na účely pridania do historickej databázy negatívnych kontrol laboratória, ako sa opisuje v bode 50,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 súbežné pozitívne kontroly (pozri bod 50) by mali vyvolať reakcie, ktoré sú zlúčiteľné s reakciami uvedenými v historickej databáze pozitívnych kontrol laboratória a v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou by mali viesť k štatisticky významnému nárastu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 mali by byť splnené kritériá bunkovej proliferácie v kontrole rozpúšťadla (pozri body 25 – 27),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pokiaľ jedna podmienka pokusu neviedla k pozitívnym výsledkom, mali by sa otestovať všetky podmienky pokusu (pozri body 36 – 40),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 je analyzovateľný primeraný počet buniek a koncentrácií (body 28 a 44 – 46),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 kritériá výberu najvyššej koncentrácie sú v súlade s kritériami opísanými v bodoch 24 – 31.
                              
                           
                        Hodnotenie a interpretácia výsledkov
                     
                     Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, sa testovaná chemikália pokladá za jasne pozitívnu, ak pri ktorejkoľvek z preskúmaných podmienok pokusu platí, že (pozri body 36 – 39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 aspoň jedna z testovaných koncentrácií vykazuje štatisticky významné zvýšenie v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou (89),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pri hodnotení pomocou vhodného testu trendu je tento nárast aspoň pri jednej testovacej podmienke závislý od dávky (pozri bod 28),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ktorýkoľvek z výsledkov je mimo distribúcie historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia, pozri bod 52).
                              
                           Ak sú splnené všetky tieto kritériá, testovaná chemikália sa pokladá za chemikáliu schopnú vyvolať chromozómové zlomy a/alebo zvýšenie či zníženie ich počtu v tomto testovacom systéme. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno takisto nájsť aj v literatúre (90) (91) (92).
                     Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, sa testovaná chemikália pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných podmienkach pokusu platí, že (pozri body 36 – 39):
                     
                                 —
                              
                              
                                 žiadna z testovaných koncentrácií nevykazuje štatisticky významné zvýšenie v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 hodnotenie pomocou vhodného testu trendu ukáže, že nedochádza k nárastu v závislosti od koncentrácie,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 všetky výsledky sú v rámci rozdelenia historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia, pozri bod 52).
                              
                           Testovaná chemikália sa pokladá za chemikáliu neschopnú vyvolať chromozómové zlomy a/alebo zvýšenie či zníženie ich počtu v tomto testovacom systéme. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno takisto nájsť aj v literatúre (90) (91) (92).
                     Neexistuje požiadavka na potvrdenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie.
                     V prípade, že reakcia nie je jasne negatívna ani jasne pozitívna, ako sa opisuje vyššie v texte, a/alebo s cieľom pomôcť pri stanovení biologickej relevantnosti výsledku by sa údaje mali vyhodnotiť na základe odborného posúdenia a/alebo ďalšieho skúmania. Užitočné by mohlo byť hodnotenie dodatočných buniek (v prípade potreby) alebo zopakovanie pokusu prípadne s použitím pozmenených podmienok pokusu [napr. odstup koncentrácií, iné podmienky metabolickej aktivácie (t. j. koncentrácia S9 alebo pôvod S9)].
                     V zriedkavých prípadoch neumožní súbor údajov ani po ďalšom skúmaní vyvodiť záver o pozitívnom alebo negatívnom výsledku, a preto sa pokus uzavrie ako pokus „s nejasným výsledkom“.
                     Testované chemikálie, ktoré v teste MNvit indukujú mikrojadrá, môžu mať tento účinok preto, že indukujú chromozómový zlom, ich stratu alebo kombináciu oboch javov. Na určenie toho, či je mechanizmus indukcie mikrojadier dôsledkom klastogénneho a/alebo aneugénneho pôsobenia možno použiť ďalšiu analýzu s použitím protilátok kinetochoru, sond in situ so špecifickou väzbou na centroméry alebo iných metód.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita testovanej chemikálie, ak je známa,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             reaktivita testovanej chemikálie s rozpúšťadlom/nosičom alebo médiom na kultiváciu buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle, ak je známa,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadné meranie pH, osmolality a zrazeniny v rastovom médiu, do ktorého bola pridaná testovaná chemikália.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Jednozložková látka:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikácia chemikálie, ako je názov IUPAC alebo názov CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak je to potrebné a uskutočniteľné, atď.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Mnohozložková látka, UVCB a zmesi:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             charakterizovaná pokiaľ možno chemickou identitou (pozri vyššie), kvantitatívnym výskytom a relevantnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami zložiek.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozpúšťadlo:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie výberu rozpúšťadla,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             percentuálny podiel rozpúšťadla v konečnom rastovom médiu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bunky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a zdroj použitých buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vhodnosť použitého typu bunky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií neprítomnosť mykoplazmy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií informácie o dĺžke bunkového cyklu alebo proliferačný index,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ak sa použijú lymfocyty, pohlavie darcov krvi, vek a všetky relevantné informácie o darcovi, informácie o tom či bola použitá celá krv alebo separované lymfocyty, použitý mitogén,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             trvanie bežného bunkového cyklu (pri negatívnej kontrole),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií počet pasážovaní, ak je k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií metódy udržiavania bunkových kultúr,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií modálny počet chromozómov.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testovania
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             identita látky blokujúcej cytokinézu (napr. cytoB), ak sa použije, a jej koncentrácia a trvanie vystavenia buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia testovanej chemikálie vyjadrená ako konečná koncentrácia v rastovom médiu (napr. v μg alebo mg/ml alebo mM rastového média),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie voľby koncentrácií a počtu kultúr vrátane údajov o cytotoxicite a obmedzeniach rozpustnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zloženie média, prípadne koncentrácia CO2, hladina vlhkosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia (a/alebo objem) rozpúšťadla a testovanej chemikálie pridaných do rastového média,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teplota a doba inkubácie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             trvanie ovplyvňovania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             čas odberu po ovplyvňovaní,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadne hustota buniek pri naočkovaní média,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a zloženie použitého systému metabolickej aktivácie [zdroj S9, metóda prípravy zmesi S9, koncentrácia alebo objem zmesi S9 a S9 v konečnom rastovom médiu, kontroly akosti S9, (napr. enzymatická aktivita, sterilita, metabolická schopnosť)],
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             chemikálie na pozitívnu a negatívnu kontrolu, konečné koncentrácie, podmienky a trvanie ovplyvňovania a obdobia obnovy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy prípravy preparátov a použitá technika farbenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritéria hodnotenia buniek s mikrojadrami (výber analyzovateľných buniek a identifikácia mikrojadra),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počty analyzovaných buniek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy merania cytotoxicity,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             akékoľvek doplňujúce informácie týkajúce sa cytotoxicity a použitej metódy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kritériá hodnotenia štúdií ako pozitívne, negatívne alebo s nejasným výsledkom,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použitá(-é) metóda (-y) štatistickej analýzy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v uplatniteľnom prípade metódy, ako je napríklad použitie protilátok proti kinetochoru alebo špecifických pancentromérových sond na určenie toho, či mikrojadrá obsahujú celé alebo fragmentované chromozómy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy použité na určenie pH, osmolality a zrážania.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             vymedzenie buniek prijateľných na analýzu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade bunkových línií pri neprítomnosti cytoB počet ovplyvnených buniek a počet odobratých buniek v prípade každej kultúry,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý spôsob merania cytotoxicity, napr. CBPI alebo RI v prípade metódy blokovania cytokinézy, RICC alebo RPD v prípade, že sa metódy blokovania cytokinézy nepoužijú, prípadne pozorovania, ak existujú (napr. konfluencia buniek, apoptóza, nekróza, počítanie metafáz, frekvencia dvojjadrových buniek),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             známky zrážania a čas ich stanovenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o hodnotách pH a osmolality testovacieho média, ak sú stanovené,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             distribúcia jednojadrových, dvojjadrových a viacjadrových buniek, ak sa používa metóda blokovania cytokinézy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadne počet buniek s mikrojadrami uvedený osobitne pre každú ovplyvnenú kultúru a kontrolnú kultúru a určenie, či ide o dvojjadrové alebo jednojadrové bunky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ak je to možné, závislosť medzi koncentráciou a reakciou,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o súbežných negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrolách (koncentrácie a rozpúšťadlá),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             historické údaje o negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrolách s rozsahmi, priemernými hodnotami a štandardnou odchýlkou a 95 % regulačnými medzami pre rozdelenie, ako aj počet údajov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             štatistické analýzy, hodnoty p, ak existujú.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskusia o výsledkoch
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. (1997). Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 1-4.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Parry, J.M., A. Sors (1993). The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project. Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 3-15.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay. Cytobios, Vol. 43/172-173, pp. 233-246.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2000). Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 167-172.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Fenech, M. (2007). Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols, Vol. 2/5, pp. 1084-1104.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1986). Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation. Mutation Research, Vol. 161/2, pp. 193-198.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., J.D. Tucker (1989). Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 13/1, pp. 34-43.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Eastmond, D.A., D. Pinkel (1990). Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probe. Mutation Research, Vol. 234/5, pp. 9-20.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Miller, B.M. et al. (1991). Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA. Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Farooqi, Z., F. Darroudi, A. T. Natarajan (1993). The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes. Mutagenesis, Vol. 8/4, pp. 329-334.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Migliore, L. et al. (1993). Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe. Mutation Research, Vol. 319/3, pp. 205-213.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Norppa, H., L. Renzi, C. Lindholm (1993). Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization. Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 519-525.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Eastmond, D.A, D.S. Rupa, L.S. Hasegawa (1994). Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes. Mutation Research, Vol. 322/1, pp. 9-20.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Marshall, R.R. et al. (1996). Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy. Mutation Research, Vol. 372/2, pp. 233-245.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Zijno, P. et al. (1996). Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 372/2, 211-219.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Kirsch-Volders et al. (2003). Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research, Vol. 540/2, pp. 153-163.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Chapter B.10 of this Annex: In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2006). SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 13-36.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 Clare, G. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 37-60.
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 Aardema, M.J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 61-87.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 Wakata, A. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 88-124.
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 Oliver, J. et al. (2006). SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 125-152.
                              
                           
                                 24.
                              
                              
                                 Albertini, S. et al. (1997). Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 187-208.
                              
                           
                                 25.
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1997). Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 45-59.
                              
                           
                                 26.
                              
                              
                                 Miller, B. et al. (1998). Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Research, Vol. 410, pp. 81-116.
                              
                           
                                 27.
                              
                              
                                 Kalweit, S. et al. (1999). Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches. Mutation Research, Vol. 439/2, pp. 183-190.
                              
                           
                                 28.
                              
                              
                                 Kersten, B. et al. (1999). The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity. Mutation Research, Vol. 445/1, pp. 55-71.
                              
                           
                                 29.
                              
                              
                                 von der Hude, W. et al. (2000). In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells – results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances. Mutation Research, Vol. 468/2, pp. 137-163.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Garriott, M.L., J.B. Phelps, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 123-134.
                              
                           
                                 31.
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1999). Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU). Mutagenesis, Vol. 14/6, pp. 569-580.
                              
                           
                                 32.
                              
                              
                                 Elhajouji, A., E. Lorge (2006). Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test. Mutation Research, Vol. 607/1, pp. 1-152.
                              
                           
                                 33.
                              
                              
                                 Kirkland, D. (2010). Evaluation of different cytotoxic and cytostatic measures for the in vitro micronucleus test (MNVit): Introduction to the collaborative trial. Mutation Research, Vol. 702/2, pp. 139-147.
                              
                           
                                 34.
                              
                              
                                 Hashimoto K. et al. (2011). Comparison of four different treatment conditions of extended exposure in the in vitro micronucleus assay using TK6 lymphoblastoid cells. Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 59/1, pp. 28-36.
                              
                           
                                 35.
                              
                              
                                 Honma, M., M. Hayashi (2011). Comparison of in vitro micronucleus and gene mutation assay results for p53-competent versus p53-deficient human lymphoblastoid cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 373-384.
                              
                           
                                 36.
                              
                              
                                 Zhang, L.S. et al. (1995). A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test. Mutation Research Letters, Vol. 347/3-4, pp. 105-115.
                              
                           
                                 37.
                              
                              
                                 ECVAM (2006). Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November 2006, k dispozícii na webovej lokalite: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 38.
                              
                              
                                 ESAC (2006). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. K dispozícii na webovej lokalite: http://ecvam.jrc.it/index.htm.
                              
                           
                                 39.
                              
                              
                                 Corvi, R. et al. (2008). ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT). Mutagenesis, Vol 23/4, pp. 271-283.
                              
                           
                                 40.
                              
                              
                                 ILSI paper (draft). Lorge, E., M.M. Moore, J. Clements, M. O'Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, A. Sutter, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Young-Tannir. Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. Mutation Research.
                              
                           
                                 41.
                              
                              
                                 Scott, D. et al. (1991). International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Research, Vol. 257/2, pp. 147-205.
                              
                           
                                 42.
                              
                              
                                 Morita, T. et al. (1992). Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells. Mutation Research, Vol. 268/2, pp. 297-305.
                              
                           
                                 43.
                              
                              
                                 Brusick, D. (1986). Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations. Environmental Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.
                              
                           
                                 44.
                              
                              
                                 Long, L.H. et al. (2007). Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium. Mutation Research, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.
                              
                           
                                 45.
                              
                              
                                 Nesslany, F. et al. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environmental and Molecular Mutation., Vol. 49, pp. 439-452.
                              
                           
                                 46.
                              
                              
                                 Fenech, M., A.A. Morley (1985). Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutation Research, Vol. 147/1-2, pp. 29-36.
                              
                           
                                 47.
                              
                              
                                 Fenech, M. (1997). The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method. Mutation Research, Vol. 392, pp. 11-18.
                              
                           
                                 48.
                              
                              
                                 Payne, C.M. et al. (2010). Hydrophobic bile acid-induced micronuclei formation, mitotic perturbations, and decreases in spindle checkpoint proteins: relevance to genomic instability in colon carcinogenesis. Nutrition and Cancer, Vol. 62/6, pp. 825-840.
                              
                           
                                 49.
                              
                              
                                 Bazin, E. et al. (2010). Genotoxicity of a Freshwater Cyanotoxin,Cylindrospermopsin, in Two Human Cell Lines: Caco-2 and HepaRG. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 51/3, pp. 251-259.
                              
                           
                                 50.
                              
                              
                                 Le Hegarat, L. et al. (2010). Assessment of the genotoxic potential of indirect chemical mutagens in HepaRG cellsby the comet and the cytokinesis-block micronucleus assays. Mutagenesis, Vol. 25/6, pp. 555-560.
                              
                           
                                 51.
                              
                              
                                 Josse, R. et al. (2012). An adaptation of the human HepaRG cells to the in vitro micronucleus assay. Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 295-304.
                              
                           
                                 52.
                              
                              
                                 Ehrlich, V. et al. (2002). Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells. Mutagenesis, Vol. 17/3, pp. 257-260.
                              
                           
                                 53.
                              
                              
                                 Knasmüller, S. et al. (2004). Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge. Toxicology, Vol. 198/1-3, pp. 315-328.
                              
                           
                                 54.
                              
                              
                                 Gibson, D.P. et al. (1997). Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals. Mutation Research, Vol. 392/1-2, pp. 61-70.
                              
                           
                                 55.
                              
                              
                                 Bonassi, S. et al. (2001). HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 37/1, pp. 31-45.
                              
                           
                                 56.
                              
                              
                                 Maron, D.M., B.N. Ames (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.
                              
                           
                                 57.
                              
                              
                                 Ong, T.-m. et al. (1980). Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver. Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.
                              
                           
                                 58.
                              
                              
                                 Elliott, B.M. et al. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, Vol. 7, pp. 175-177.
                              
                           
                                 59.
                              
                              
                                 Matsushima, T. et al. (1976). “A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems”, in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres, F.J. et al. (eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
                              
                           
                                 60.
                              
                              
                                 Johnson, T.E., D. R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996). Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28, pp. 51-59.
                              
                           
                                 61.
                              
                              
                                 UNEP (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). K dispozícii na webovej lokalite: http://www.pops.int/
                              
                           
                                 62.
                              
                              
                                 Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987). Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes. Mutation Research, Vol.190/3, pp. 225-8.
                              
                           
                                 63.
                              
                              
                                 Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982). “CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids”, in Genotoxic Effects of Airborne Agents. Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.
                              
                           
                                 64.
                              
                              
                                 Zamora, P.O. et al. (1983). Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay. Environmental Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.
                              
                           
                                 65.
                              
                              
                                 Asakura, M. et al. (2008). An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay. Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.
                              
                           
                                 66.
                              
                              
                                 Fenech, M. (1993). The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutation Research, Vol. 285/1, pp. 35-44.
                              
                           
                                 67.
                              
                              
                                 Phelps, J.B., M.L. Garriott, W.P. Hoffman (2002). A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity. Mutation Research, Vol. 521/1-2, pp. 103-112.
                              
                           
                                 68.
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2004). Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”. Mutation Research, 564, 97-100.
                              
                           
                                 69.
                              
                              
                                 Lorge, E. et al. (2008). Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects. Mutation Research, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.
                              
                           
                                 70.
                              
                              
                                 Surralles, J. et al. (1995). Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 341/3, pp. 169-184.
                              
                           
                                 71.
                              
                              
                                 Honma, M. (2011). Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test. Mutation Research, Vol. 724, pp. 86-87.
                              
                           
                                 72.
                              
                              
                                 Pfuhler, S. et al. (2011). In vitro genotoxicity test approaches with better predictivity: Summary of an IWGT workshop. Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 101-107.
                              
                           
                                 73.
                              
                              
                                 OECD (2014). Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). ENV/JM/TG(2014)17. K dispozícii na požiadanie.
                              
                           
                                 74.
                              
                              
                                 Morita T., M. Honma, K. Morikawa (2012). Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity. Mutation Research, Vol. 741, pp. 32-56.
                              
                           
                                 75.
                              
                              
                                 Brookmire L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro Chromosome Aberrations Assay. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.
                              
                           
                                 76.
                              
                              
                                 EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances. http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.
                              
                           
                                 77.
                              
                              
                                 Sobol, Z. et al. (2012). Development and validation of an in vitro micronucleus assay platform in TK6 cells. Mutation Research, Vol.746/1, pp. 29-34.
                              
                           
                                 78.
                              
                              
                                 Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983). An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 241-247.
                              
                           
                                 79.
                              
                              
                                 MacGregor, J. T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983). A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.
                              
                           
                                 80.
                              
                              
                                 Bryce, S.M. et al. (2011). Miniaturized flow cytometry-based CHO-K1 micronucleus assay discriminates aneugenic and clastogenic modes of action. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/4, pp. 280–286.
                              
                           
                                 81.
                              
                              
                                 Nicolette, J. et al. (2011). in vitro micronucleus screening of pharmaceutical candidates by flow cytometry in Chinese hamster V79 cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 52/5, pp. 355–362.
                              
                           
                                 82.
                              
                              
                                 Shi, J., R. Bezabhie, A. Szkudlinska (2010). Further evaluation of a flow cytometric in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells: a reliable platform that detects micronuclei and discriminates apoptotic bodies. Mutagenesis, Vol. 25/1, pp. 33-40.
                              
                           
                                 83.
                              
                              
                                 OECD (2014). Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on testing and assessment, No.198, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 84.
                              
                              
                                 Fenech, M. et al. (2003). HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research, Vol. 534/1-2, pp. 65-75.
                              
                           
                                 85.
                              
                              
                                 Elhajouji, A., M. Cunha, M. Kirsch-Volders (1998). Spindle poisons can induce polyploidy by mitotic slippage and micronucleate mononucleates in the cytokinesis-block assay. Mutagenesis, Vol. 13/2, pp. 193-8.
                              
                           
                                 86.
                              
                              
                                 Kirsch-Volders, M. et al. (2011). The in vitro MN assay in 2011: origin and fate, biological significance, protocols, high throughput methodologies and toxicological relevance. Archives of Toxicology, Vol. 85/8, pp. 873-99.
                              
                           
                                 87.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2010). Compilation and use of genetic toxicity historical control Data. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol.723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 88.
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000). Statistical Methods for Quality Improvement. 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.
                              
                           
                                 89.
                              
                              
                                 Hoffman, W.P., M.L. Garriott, C. Lee (2003). “In vitro micronucleus test”, in Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, 2nd ed. Chow, S. (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, pp. 463-467.
                              
                           
                                 90.
                              
                              
                                 Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed. John Wiley & Sons, New York.
                              
                           
                                 91.
                              
                              
                                 Galloway, S.M. et al. (1987). Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals. Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.
                              
                           
                                 92.
                              
                              
                                 Richardson, C. et al. (1989). Analysis of Data from in vitro Cytogenetic Assays. in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
                              
                           
                                 93.
                              
                              
                                 International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Aneugén
                           : akákoľvek chemikália alebo proces, ktoré pri interakcii so zložkami mitotického alebo meiotického aparátu bunkového cyklu vedie k aneuploidii v bunkách alebo organizmoch.
                        
                           
                              Aneuploidia
                           : akákoľvek odchýlka od bežného diploidného (alebo haploidného) počtu chromozómov vo forme jedného alebo viacerých chromozómov, nie však vo forme celého(-ých) súboru(-ov) chromozómov (polyploidia).
                        
                           
                              Apoptóza
                           : programovaná bunková smrť charakterizovaná sériou krokov, ktoré vedú k rozpadu buniek na telieska ohraničené membránou, ktoré sa následne fagocytujú alebo vypudzujú.
                        
                           
                              Proliferácia buniek
                           : zvýšenie počtu buniek v dôsledku mitotického delenia buniek.
                        
                           
                              Centroméra
                           : oblasť DNA chromozómu, v ktorej sa spájajú obe chromatídy a na ktorú sú vedľa seba pripojené oba kinetochory.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Koncentrácie
                           : sú konečné koncentrácie testovanej chemikálie v rastovom médiu.
                        
                           
                              Klastogén
                           : akákoľvek chemikália alebo jav, ktorý spôsobuje štruktúrne chromozómové aberácie v populáciách buniek alebo eukaryotických organizmoch.
                        
                           
                              Cytokinéza
                           : proces delenia buniek, ktorý nasleduje ihneď po mitóze a v ktorom vznikajú dve dcérske bunky – každá s jedným jadrom.
                        
                           
                              Proliferačný index blokovania cytokinézy (CBPI)
                           : pomer druhého delenia buniek v ovplyvnenej populácii vo vzťahu k čistej kontrole (pozri vzorec v dodatku 2).
                        
                           
                              Cytostáza
                           : inhibícia rastu buniek (pozri vzorec v dodatku 2).
                        
                           
                              Cytotoxicita
                           : v prípade testov, na ktoré sa vzťahuje táto testovacia metóda a ktoré sa vykonávajú za prítomnosti cytochalasínu B, sa cytotoxicita označuje ako zníženie proliferačného indexu blokovania cytokinézy (CBPI) alebo indexu replikácie (RI) ovplyvnených buniek v porovnaní s negatívnou kontrolou (pozri bod 26 a dodatok 2).
                        Pri skúškach, na ktoré sa vzťahuje táto testovacia metóda a ktoré sa vykonávajú za neprítomnosti cytochalasínu B, sa cytotoxicita označuje ako zníženie relatívneho zdvojenia populácie (RPD) alebo relatívneho nárastu počtu buniek (RICC) ovplyvnených buniek v porovnaní s negatívnou kontrolou (pozri bod 27 a dodatok 2).
                        
                           
                              Genotoxický
                           : všeobecný výraz, ktorý zahŕňa všetky typy poškodenia DNA alebo chromozómov vrátane zlomov, delécií, aduktov, modifikácií a prepojení nukleotidov, prestavieb, génových mutácií, chromozómových aberácií a aneuploidie. Nie všetky typy genotoxických účinkov majú za následok mutácie alebo trvalé poškodenie chromozómov.
                        
                           
                              Bunky v interfáze
                           : bunky, ktoré nie sú v štádiu mitotického delenia.
                        
                           
                              Kinetochor
                           : štruktúra obsahujúca proteíny, ktorá sa vytvára na centromére chromozómu a ku ktorej sa vlákna deliaceho vretienka pripájajú počas delenia buniek a umožňujú riadny pohyb dcérskych chromozómov k pólom dcérskych buniek.
                        
                           
                              Mikrojadrá
                           : malé jadrá doplňujúce hlavné jadrá buniek a existujúce oddelene od nich, ktoré sa vytvárajú počas telofázy mitózy alebo meiózy z oneskorených chromozómových fragmentov alebo celých chromozómov.
                        
                           
                              Mitóza
                           : rozdelenie bunkového jadra, ktoré sa zvyčajne delí na profázu, prometafázu, metafázu, anafázu a telofázu.
                        
                           
                              Mitotický index
                           : pomer buniek v metafáze vydelený celkovým počtom buniek pozorovaných v populácii buniek; udáva stupeň proliferácie buniek tejto populácie.
                        
                           
                              Mutagénny
                           : produkujúci dedičnú zmenu sekvencie(-í) párov báz DNA v génoch alebo štruktúry chromozómov (chromozómové aberácie).
                        
                           
                              Nondisjunkcia
                           : dej, pri ktorom sa spárované chromatídy riadne neoddelia a nerozdelia do vznikajúcich dcérskych buniek, čo vedie vzniku dcérskych buniek s abnormálnym počtom chromozómov.
                        
                           
                              Stav p53
                           : proteín p53 sa zapája do regulácie bunkového cyklu, apoptózy a opravy DNA. Bunky s nedostatkom funkčného proteínu p53, ktoré nie sú schopné zastaviť bunkový cyklus alebo eliminovať poškodené bunky prostredníctvom apoptózy alebo iných mechanizmov (napr. indukciou opravy DNA) súvisiacich s funkciami p53 ako reakciu na poškodenie DNA, by mali byť teoreticky náchylnejšie na génové mutácie alebo chromozómové aberácie.
                        
                           
                              Polyploidia
                           : numerické chromozómové aberácie v bunkách alebo organizmoch, ktoré zahŕňajú celý(-é) súbor(-y) chromozómov, na rozdiel od jedného chromozómu alebo jednotlivých chromozómov (aneuploidia).
                        
                           
                              Proliferačný index (PI)
                           : metóda merania cytotoxicity bez použitia cytoB (pozri vzorec v dodatku 2).
                        
                           
                              Relatívne zvýšenie počtu buniek (RICC)
                           : metóda merania cytotoxicity bez použitia cytoB (pozri vzorec v dodatku 2).
                        
                           
                              Relatívne zdvojenie populácie (RPD)
                           : metóda merania cytotoxicity bez použitia cytoB (pozri vzorec v dodatku 2).
                        
                           
                              Index replikácie (RI)
                           : pomer bunkových cyklov, ktoré boli dokončené v ovplyvnenej kultúre, vo vzťahu k čistej kontrole počas doby expozície a obnovy (pozri vzorec v dodatku 2).
                        
                           
                              Frakcia pečene S9
                           : supernatant pečeňového homogenátu po 9 000 g odstredení, t. j. surový pečeňový extrakt.
                        
                           
                              Zmes S9
                           : zmes frakcie pečene S9 a kofaktorov nepotrebných pre metabolickú aktiváciu enzýmov.
                        
                           
                              Kontrola rozpúšťadla
                           : všeobecný termín na vymedzenie kontrolných kultúr, ku ktorým sa pridáva len rozpúšťadlo používané na rozpúšťanie testovanej chemikálie.
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.
                        
                           
                              Čistá kontrola
                           : kultúry, ktoré sa neovplyvňujú (t. j. ani testovanou chemikáliou ani rozpúšťadlom), ale sa spracovávajú súbežne rovnakým spôsobom ako kultúry, ku ktorým sa pridáva testovaná chemikália.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           VZORCE NA POSÚDENIE CYTOTOXICITY
                        
                        
                           
                              
                                 Pri použití cytoB
                              
                            by hodnotenie cytotoxicity malo byť založené na proliferačnom indexe blokovania cytokinézy (CBPI) alebo na indexe replikácie (RI) (17) (69). CBPI udáva priemerný počet jadier na bunku a môže sa použiť na výpočet proliferácie buniek. RI udáva relatívny počet bunkových cyklov na bunku počas obdobia vystavenia cytoB v ovplyvnených kultúrach v porovnaní s kontrolnými kultúrami a možno ho použiť na percentuálny výpočet cytostázy:
                        % cytostáza = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
                        a:
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kultúra ovplyvnená testovanou chemikáliou
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontrolná kultúra,
                                 
                              pričom:
                        
                           
                        CBPI zodpovedajúci 1 (všetky bunky sú jednojadrové) sa teda rovná 100 % cytostáze.
                        Cytostáza = 100 – RI
                        
                           
                        
                                    T
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    ovplyvnené kultúry
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kontrolné kultúry
                                 
                              Hodnota RI zodpovedajúca 53 % teda znamená, že v porovnaní s počtami buniek, ktorých delením vznikli v kontrolnej kultúre dvojjadrové a viacjadrové bunky, len 53 % z tohto počtu sa delilo v ovplyvnenej kultúre, t. j. 47 % cytostáza.
                        
                           
                              
                                 Ak sa cytoB nepoužije
                              
                           , odporúča sa vykonať hodnotenie cytotoxicity na základe relatívneho nárastu počtu buniek (RICC) alebo relatívneho zdvojenia populácie (RPD) (69), keďže v oboch prípadoch sa zohľadňuje podiel populácie buniek, ktoré sa delili.
                        
                           
                        
                           
                        kde:
                        
                           Zdvojenie populácie = [log (počet buniek po ovplyvnení ÷ počiatočný počet buniek)] ÷ log 2
                        Preto 53 % RICC alebo RDP indikuje 47 % cytotoxicitu/cytostázu.
                        Pri použití proliferačného indexu (PI) možno cytotoxicitu hodnotiť pomocou počítania počtu klonov obsahujúcich jednu bunku (cl1), 2 bunky (cl2), 3 až 4 bunky (cl4) a 5 až 8 buniek (cl8).
                        
                           
                        PI sa používa ako hodnotný a spoľahlivý parameter cytotoxicity aj pri bunkových líniách kultivovaných in vitro bez použitia cytoB (35) (36) (37) (38) a môže sa pokladať za užitočný doplnkový parameter..
                        V každom prípade by počet buniek pred ovplyvnením mal byť rovnaký ako počet ovplyvnených kultúr a kultúr na negatívnu kontrolu.
                        Zatiaľ čo v minulosti sa RCC (t. j. počet buniek v ovplyvnených kultúrach/počet buniek v kontrolných kultúrach) používal ako parameter cytotoxicity, už sa neodporúča, pretože môže podhodnotiť cytotoxicitu.
                        Pri použití automatizovaných systémov hodnotenia, napríklad prietokovej cytometrie, laserovej skenovacej cytometrie alebo analýzy obrazu, možno počet buniek vo vzorci nahradiť počtom jadier.
                        V kultúrach na negatívnu kontrolu by zdvojenie populácie alebo index replikácie mali byť zlúčiteľné s požiadavkou na odber vzoriek z buniek po ovplyvnení v čase zodpovedajúcom približne 1,5 – 2-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu.
                     “
               
                     15.
                  
                  
                     V časti B sa dopĺňajú tieto kapitoly:
                     „B.59   Kožná senzibilizácia in Chemico: Skúška priamej peptidovej reaktivity (DPRA)
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 442C (2015). Kožný senzibilizátor je látka, ktorá po kontakte s pokožkou vyvoláva alergickú reakciu, ako sa definuje v Globálnom harmonizovanom systéme klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie spojených národov (OSN) (1) a v nariadení Európskej únie (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (nariadenie CLP) (18). Táto testovacia metóda predstavuje postup in chemico (skúška priamej peptidovej reaktivity – DPRA), ktorá sa má použiť na podporu rozlíšenia kožných senzibilizátorov od nesenzibilizujúcich chemikálií v súlade s GHS OSN a CLP.
                     Existuje všeobecná zhoda, pokiaľ ide o kľúčové biologické javy, ktoré vedú ku kožnej senzibilizácii. Súčasné poznatky o chemických a biologických mechanizmoch, ktoré súvisia s kožnou senzibilizáciou, boli zhrnuté v podobe dráhy nepriaznivého účinku (AOP) (2), ktorá začína zmenami na molekulárnej úrovni cez následné pochody až po nepriaznivý účinok, a síce alergickú kontaktnú dermatitídu u ľudí alebo kontaktnú hypersenzitivitu u hlodavcov. V rámci AOP kožnej senzibilizácie je začínajúcou zmenou na molekulárnej úrovni kovalentná väzba elektrofilných látok na nukleofilné centrá v kožných proteínoch.
                     Posúdenie kožnej senzibilizácie zvyčajne zahŕňa použitie laboratórnych zvierat. Klasické metódy založené na morčatách, maximizačný test na morčatách podľa Magnussona a Klingmana (GPMT) a Buehlerov test [(TM B.6 (3)], sú zamerané na štúdium indukčných a elicitačných fáz kožnej senzibilizácie. Uznaný bol takisto test na myšiach, lokálna skúška lymfatických uzlín [LLNA, TM B.42 (4)] a jej dve nerádioaktívne modifikácie, LLNA: DA [TM B.50 (5)] a LLNA: BrdU-ELISA [TM B.51 (6)], z ktorých všetky slúžia výlučne na posúdenie reakcie na indukciu, keďže sú v porovnaní s testami na morčatách výhodnejšie z hľadiska dobrých podmienok zvierat a objektívneho merania indukčnej fázy kožnej senzibilizácie.
                     V poslednej dobe sa mechanisticky založené testovacie metódy in chemico a in vitro pokladajú za vedecky platné testovacie metódy na hodnotenie nebezpečnosti chemikálií z hľadiska kožnej senzibilizácie. Avšak vzhľadom na to, že AOP mechanicky pokrýva každú zo súčasne dostupných testovacích metód bez použitia zvierat len v obmedzenom rozsahu, budú kombinácie metód bez použitia zvierat (in silico, in chemico, in vitro) v rámci integrovaných prístupov k testovaniu a hodnoteniu (Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA) potrebné na to, aby bolo možné súčasné testovanie na zvieratách úplne nahradiť (2) (7).
                     Skúška DPRA je navrhnutá tak, aby preskúmala najprv začínajúcu zmenu na molekulárnej úrovni AOP kožnej senzibilizácie, a síce reaktivitu proteínov, pomocou kvantifikácie reaktivity testovaných chemikálií voči modelovým syntetickým peptidom obsahujúcim lyzín alebo cysteín (8). Percentuálne hodnoty úbytku cysteínových a lyzínových peptidov sa potom použijú na kategorizáciu látky v jednej zo štyroch tried reaktivity na podporu rozlíšenia kožných senzibilizátorov od nesenzibilizujúcich chemikálií (9).
                     Skúška DPRA bola validovaná vo validačnej štúdii pod vedením referenčného laboratória Európskej únie pre alternatívy testovania na zvieratách (EURL ECVAM) a následne v nezávislom partnerskom preskúmaní, ktoré vykonal vedecký poradný výbor (ESAC) EURL ECVAM, a uznaná za vedecky platnú (10) na použitie ako súčasť IATA na podporu rozlíšenia kožných senzibilizátorov od nesenzibilizujúcich chemikálií na účely klasifikácie a označovania nebezpečnosti. Príklady použitia údajov zo skúšky DPRA v kombinácii s inými informáciami sú uvedené v literatúre (11) (12) (13) (14).
                     Definície sa uvádzajú v dodatku I.
                     POČIATOČNÉ ÚVAHY, POUŽITEĽNOSŤ A OBMEDZENIA
                     Korelácia medzi reaktivitou proteínov a potenciálom kožnej senzibilizácie bola spoľahlivo stanovená (15) (16) (17). Keďže proteínová väzba však predstavuje len jeden kľúčový jav, a to napriek začínajúcim zmenám na molekulárnej úrovni AOP kožnej senzibilizácie, samotné informácie o reaktivite proteínov získané na základe testovacích a netestovacích metód nemusia byť dostatočné na vyvodenie záveru o neprítomnosti potenciálu chemikálií spôsobiť senzibilizáciu kože. Údaje získané na základe tejto testovacej metódy by sa preto mali zvážiť v kontexte integrovaných prístupov, ako je IATA, v kombinácii s inými doplňujúcimi informáciami, napr. pochádzajúcimi zo skúšok in vitro, ktorými sa skúmajú iné kľúčové prvky AOP kožnej senzibilizácie, ako aj z netestovacích metód vrátane prevzatých údajov odvodených z chemických analógov.
                     Túto testovaciu metódu možno použiť v kombinácii s inými doplňujúcimi informáciami na podporu rozlíšenia kožných senzibilizátorov (t. j. kategória 1 GHS OSN/CLP) od nesenzibilizujúcich chemikálií v kontexte IATA. Túto testovaciu metódu nemožno používať samostatne, a to ani pri zaraďovaní kožných senzibilizátorov do podkategórií 1A a 1B, ako sa definuje v GHS OSN/CLP, ani pri predpovedaní potenciálu na účely rozhodnutí v súvislosti s posudzovaním bezpečnosti. V závislosti od regulačného rámca však možno pozitívny výsledok získaný na základe testovacej metódy DRPA sám o sebe použiť pri klasifikácii chemikálií do kategórie 1 GHS OSN.
                     V prípade testovacej metódy DPRA sa preukázalo, že ju možno preniesť do laboratórií, ktoré majú skúsenosti s analýzou pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Miera reprodukovateľnosti pri predpokladoch, ktoré možno na základe testovacej metódy očakávať, predstavuje rádovo 85 % v rámci laboratórií a 80 % medzi nimi (10). Výsledky získané vo validačnej štúdii (18) a v uverejnených štúdiách (19) celkovo indikujú, že presnosť DPRA pri odlišovaní senzibilizátorov (t. j. kategória 1 GHS OSN/CLP) od nesenzibilizujúcich chemikálií predstavuje 80 % (N = 157) s citlivosťou 80 % (88/109) a špecifickosťou 77 % (37/48) v porovnaní s výsledkami LLNA. DPRA s väčšou pravdepodobnosťou povedie k podhodnotenému predpokladu v prípade chemikálií, ktoré vykazujú nízky alebo mierny potenciál spôsobiť kožnú senzibilizáciu (t. j. podkategória 1B GHS OSN/CLP), než v prípade chemikálií vykazujúcich vysoký potenciál spôsobiť kožnú senzibilizáciu (t. j. podkategória 1A GHS OSN/CLP) (18) (19). Uvedené hodnoty presnosti DPRA ako samostatnej testovacej metódy sú však len orientačné, keďže testovacia metóda by sa mala hodnotiť v kombinácii s inými zdrojmi informácií v kontexte IATA a v súlade s ustanoveniami bodu 9. Okrem toho by sa pri hodnotení metód na zistenie kožnej senzibilizácie bez použitia zvierat malo zohľadniť to, že test LLNA ani iné testy na zvieratách nemusia v plnej miere odzrkadľovať situáciu u druhov, ktoré sú predmetom záujmu, čiže u ľudí. Na základe celkových dostupných údajov sa preukázalo, že testovaciu metódu DPRA možno použiť v prípade testovaných chemikálií, ktoré predstavujú rôzne organické funkčné skupiny, majú rôzne mechanizmy reakcie, potenciál spôsobiť kožnú senzibilizáciu (ako bolo stanovené v štúdiách in vivo) a rôzne fyzikálno-chemické vlastnosti (8) (9) (10) (19). Celkovo z týchto informácií vyplýva, že testovacia metóda DPRA je užitočná a môže prispieť k zisteniu nebezpečnosti kožnej senzibilizácie.
                     Termín „testovaná chemikália“ sa v tejto testovacej metóde používa na označenie toho, čo sa testuje, a nesúvisí s použiteľnosťou DPRA na testovanie látok a/nebo zmesí. Túto testovaciu metódu nemožno použiť na testovanie zlúčenín kovov, keďže je o nich známe, že reagujú s proteínmi prostredníctvom mechanizmov iných než kovalentnou väzbou. Testovaná chemikália by mala byť rozpustná vo vhodnom rozpúšťadle pri konečnej koncentrácii 100 mM (pozri bod 18). Testované chemikálie, ktoré však nie sú rozpustné pri tejto koncentrácii, možno napriek tomu testovať pri nižších koncentráciách, pri ktorých sú rozpustné. V takom prípade by sa pozitívny výsledok mohol použiť na podporu identifikácie testovanej chemikálie ako kožný senzibilizátor, no z negatívneho výsledku by sa nemal vyvodzovať jednoznačný záver o nedostatočnej reaktivite. V súčasnosti sú dostupné len obmedzené informácie o použiteľnosti DPRA v prípade zmesí známeho zloženia (18) (19). Napriek tomu sa DPRA považuje za technicky použiteľnú v prípade testovania mnohozložkových látok a zmesí známeho zloženia (pozri bod 10). Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom získať údaje na zamýšľaný regulačný účel by sa malo zvážiť, či na tento účel dokáže poskytnúť primerané výsledky, a ak dokáže, mali by sa zvážiť dôvody. Také úvahy nie sú nutné, pokiaľ existuje regulatórna požiadavka na testovanie danej zmesi. V dôsledku vymedzeného molárneho pomeru testovanej chemikálie a peptidu nemožno súčasný prognostický model použiť v prípade komplexných zmesí s neznámym zložením alebo látok neznámeho alebo variabilného zloženia, produktov komplexných reakcií alebo biologických materiálov (t. j. látok UVCB). Na tento účel bude potrebné vyvinúť nový prognostický model založený na gravimetrii. V prípadoch, v ktorých možno predložiť dôkaz o nepoužiteľnosti testovacej metódy pri iných špecifických kategóriách chemikálií, by sa testovacia metóda nemala používať pri týchto špecifických kategóriách chemikálií.
                     Táto testovacia metóda je testovacia metóda in chemico, ktorá nezahŕňa metabolický systém. Pomocou tejto testovacej metódy nemožno zistiť chemikálie, ktoré na preukázanie svojho potenciálu vyvolať kožnú senzibilizáciu (pro-haptény) vyžadujú enzymatickú bioaktiváciu. Uvádza sa, že v niektorých prípadoch sú pomocou tejto testovacej metódy správne zistené chemikálie, ktoré sa stávajú senzibilizátormi po abiotickej transformácii (t. j. pre-haptény) (18). Vzhľadom na uvedenú skutočnosť by sa mali negatívne výsledky získané touto testovacou metódou interpretovať v kontexte stanovených obmedzení a spolu s ostatnými zdrojmi informácií v rámci IATA. V prípade testovaných chemikálií, ktoré sa neviažu kovalentne na peptid, ale podporujú jeho oxidáciu (t. j. dimerizácia cysteínu), by potenciálne mohlo dôjsť k príliš vysokému odhadu úbytku peptidov, čo môže viesť k falošným pozitívnym predpovediam a/alebo k zaradeniu do vyššej triedy reaktivity (pozri body 29 a 30).
                     Ako bolo opísané, DPRA pomáha rozlišovať kožné senzibilizátory od nesenzibilizujúcich chemikálií. Môže však takisto potenciálne prispieť k posúdeniu potenciálu spôsobiť senzibilizáciu (11), ak sa použije v rámci integrovaných prístupov ako IATA. Na to, aby bolo možné určiť, ako výsledky DPRA môžu prispieť k posudzovaniu potenciálu, však bude potrebná ďalšia práca, pokiaľ možno založená na údajoch o týkajúcich sa človeka.
                     PRINCÍP TESTU
                     DPRA je metóda in chemico, ktorá kvantifikuje zvyškovú koncentráciu peptidu obsahujúceho cysteín alebo lyzín po 24-hodinovej inkubácii s testovanou chemikáliou pri teplote 25 ± 2,5 °C. Syntetické peptidy obsahujú fenylalanín na uľahčenie detekcie. Relatívna koncentrácia peptidov sa meria pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) s gradientovou elúciou a detekciou UV pri 220 nm. Následne sa vypočítajú percentuálne hodnoty úbytku cysteínových a lyzínových peptidov a použijú sa v prognostickom modeli (pozri bod 29), čo umožní zaradiť testovanú chemikáliu do jednej zo štyroch tried reaktivity, ktoré sa používajú na podporu rozlíšenia kožných senzibilizátorov od nesenzibilizujúcich chemikálií.
                     Pred rutinným používaním metódy opísanej v tejto testovacej metóde by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť použitím látok na preukázanie spôsobilosti uvedených v dodatku 2.
                     POSTUP
                     Táto testovacia metóda vychádza z protokolu DPRA DB-ALM č. 154 (20), ktorý sa používa pri validačnej štúdii koordinovanej EURL ECVAM. Tento protokol sa odporúča používať pri vykonávaní a používaní tejto metódy v laboratóriu. Ďalej je uvedený opis hlavných zložiek a postupov DPRA. Ak sa použije alternatívne nastavenie HPLC, mala by sa preukázať jeho rovnocennosť s validovaným nastavením opísaným v protokole DB-ALM (napr. testovaním látok na preukázanie spôsobilosti uvedených v dodatku 2).
                     
                        Príprava peptidov obsahujúcich cysteín alebo lyzín
                     
                     Zásobné roztoky cysteínu (Ac-RFAACAA-COOH) a lyzínu (Ac-RFAAKAA-COOH) obsahujúce syntetické peptidy s čistotou vyššou než 85 % a pokiaľ možno v rozmedzí 90 – 95 % by sa mali pripravovať čerstvé bezprostredne pred ich inkubáciou s testovanou chemikáliou. Konečná koncentrácia cysteínových peptidov vo fosfátovom tlmivom roztoku s hodnotou pH 7,5 by mala byť 0,667 mM a konečná koncentrácia lyzínových peptidov v tlmivom roztoku octanu amónneho s hodnotou pH 10,2 by mala byť 0,667 mM. Rýchlosť úkonov HPLC by sa mala nastaviť tak, aby trvanie analýzy HPLC bolo kratšie než 30 hodín. Pri nastavení HPLC použitom vo validačnej štúdii a opísanom v tejto testovacej metóde možno pri jednom výkone HPLC spracovať až 26 analytických vzoriek (ktoré zahŕňajú testovanú chemikáliu, pozitívnu kontrolu a príslušný počet kontrol rozpúšťadla na základe počtu jednotlivých rozpúšťadiel použitých v teste, pričom každé z nich sa testuje trikrát). Pri všetkých replikátoch analyzovaných v rámci jedného testovania by sa mali použiť identické roztoky cysteínových a lyzínových peptidov. Odporúča sa, aby sa pri jednotlivých šaržiach peptidov pred ich použitím overila správna rozpustnosť.
                     
                        Príprava testovanej chemikálie
                     
                     Pred vykonaním skúšky by sa mala posúdiť rozpustnosť testovanej chemikálie vo vhodnom rozpúšťadle podľa postupu rozpúšťania popísaného v protokole DPRA DB-ALM (20). Vo vhodnom rozpúšťadle sa testovaná chemikália rozpustí úplne. Keďže pri DPRA sa testovaná chemikália inkubuje vo veľkom prebytku s cysteínovými alebo lyzínovými peptidmi, na potvrdenie toho, že sa testovaná chemikália (a v prípade testovania mnohozložkovej látky alebo zmesi všetky jej zložky) rozpustila, sa pokladá za postačujúce vykonať vizuálnu kontrolu tvorby číreho roztoku. Vhodnými rozpúšťadlami sú acetonitril, voda, zmes vody s acetonitrilom v pomere 1:1, izopropanol, acetón alebo zmes acetónu s acetonitrilom v pomere 1:1. Iné rozpúšťadlá možno použiť vtedy, ak nemajú vplyv na stabilitu peptidu sledovanú pomocou referenčných kontrol C (t. j. vzorky, ktoré tvorí len peptid rozpustený vo vhodnom rozpúšťadle; pozri dodatok 3). Poslednou možnosťou v prípade, že testovaná chemikália nie je rozpustná v žiadnom z uvedených rozpúšťadiel, je pokúsiť sa ju rozpustiť v 300 μl DMSO a výsledný roztok zriediť s 2 700 μl acetonitrilu, a pokiaľ testovaná chemikália nie je rozpustná v tejto zmesi, treba sa pokúsiť rozpúšťať to isté množstvo testovanej chemikálie v 1 500 μl DMSO a výsledný roztok zriediť s 1 500 μl acetonitrilu. Testovaná chemikália by sa mala vopred odvážiť do sklenených nádobiek a bezprostredne pred testovaním by sa mala rozpustiť vo vhodnom rozpúšťadle, aby sa získalo 10 mM roztoku. V prípade zmesí a viaczložkových látok známeho zloženia, by sa mala stanoviť jediná čistota ako súčet podielov jej zložiek (okrem vody) a jediná jasná molekulová hmotnosť na základe posúdenia jednotlivých molekulových hmotností každej zložky v zmesi (okrem vody) a ich jednotlivých podielov. Výsledná čistota a jasná molekulová hmotnosť by sa potom mali použiť na výpočet hmotnosti testovanej chemikálie, ktorá je potrebná na prípravu 100 mM roztoku. V prípade polymérov, pri ktorých nemožno stanoviť molekulovú hmotnosť hlavnej zložky, možno pri príprave 100 mM roztoku posúdiť molekulovú hmotnosť monoméru (alebo jasnú molekulovú hmotnosť rôznych momomérov tvoriacich polymér). Pri testovaní zmesí, mnohozložkových látok alebo polymérov známeho zloženia by sa však malo zvážiť aj testovanie chemikálie v čistom stave. V prípade kvapalín by sa chemikália v čistom stave mala testovať ako taká bez predchádzajúceho riedenia tak, že sa inkubuje s cysteínovými peptidmi v molárnom pomere 1:10 a lyzínovými peptidmi v molárnom pomere 1:50. V prípade tuhých látok by sa testovaná chemikália mala rozpustiť na svoju maximálnu rozpustnú koncentráciu v tom istom rozpúšťadle, ktoré bolo použité na prípravu roztoku so zdanlivou koncentráciou 100 mM. Následne by sa mala testovať bez ďalšieho riedenia tak, že sa inkubuje s cysteínovými peptidmi v molárnom pomere 1:10 a lyzínovými peptidmi v molárnom pomere 1:50. Na základe súhlasných výsledkov (reaktivita alebo nereaktivita) medzi roztokom so zdanlivou koncentráciou 100 mM a chemikáliou v čistom stave by sa mal dať vyvodiť spoľahlivý záver.
                     
                        Príprava pozitívnej kontroly, referenčných kontrol a koelúcie na kontrolu
                     
                     Cinamaldehyd (CAS číslo 104-55-2; ≥ 95 % potravinárska čistota) by sa mal použiť ako pozitívna kontrola (PC) pri koncentrácii 100 mM v acetonitrile. Možno použiť aj iné vhodné pozitívne kontroly, pokiaľ možno také, ktoré poskytujú hodnoty úbytku stredného rozsahu, ak sú k dispozícii historické údaje, z ktorých možno odvodiť porovnateľné kritériá prijateľnosti daného kola testovania. Do rýchlosti úkonov HPLC by sa navyše mali zaradiť referenčné kontroly (t. j. vzorky obsahujúce len peptidy rozpustené vo vhodnom rozpúšťadle), ktoré sa používajú na overenie vhodnosti systému HPLC pred analýzou (referenčné kontroly A), na overenie stability referenčných kontrol v priebehu času, (referenčné kontroly B) a na overenie toho, že rozpúšťadlo použité na rozpustenie testovanej chemikálie nebude mať vplyv na percentuálny úbytok peptidov (referenčné kontroly C) (pozri dodatok 3). Pri každej chemikálii sa použije vhodná referenčná kontrola na výpočet percentuálneho úbytku peptidov v prípade danej chemikálie (pozri bod 26). Okrem toho by sa do úkonov HPLC mala pri každej testovanej chemikálii, ktorá sa analyzuje, zaradiť koelúcia na kontrolu, ktorá pozostáva len z testovanej chemikálie, na detekciu prípadnej koelúcie testovanej chemikálie s lyzínovým alebo cysteínovým peptidom.
                     
                        Inkubácia testovanej chemikálie s roztokmi cysteínových a lyzínových peptidov
                     
                     Roztoky cysteínových a lyzínových peptidov by sa mali inkubovať v sklenených nádobkách na odber automatickým dávkovačom vzoriek s testovanou chemikáliou v pomere 1:10 pre cysteínové a 1:50 pre lyzínové peptidy. Ak sa hneď po pridaní roztoku testovanej chemikálie k roztoku peptidov spozoruje zrazenina v dôsledku jej nízkej rozpustnosti vo vode, nemožno mať v tomto prípade istotu, aké množstvo testovanej chemikálie zostalo v roztoku a bude môcť reagovať s peptidmi. Preto by sa v takom prípade mohol stále použiť pozitívny výsledok, ale negatívny výsledok je neistý a mal by sa interpretovať s náležitou opatrnosťou (pozri tiež ustanovenia bodu 11 o testovaní chemikálií nerozpustných až do koncentrácie 100 mM). Pred vykonaním analýzy HPLC by sa reakčný roztok mal nechať v tme pri teplote 25 ± 2,5 °C počas 24 ± 2 hodín. Každá testovaná chemikália by sa mala analyzovať trikrát v prípade oboch peptidov. Pred analýzou HPLC sa vzorky musia vizuálne skontrolovať. Ak sa zistí zrazenina alebo oddelenie fáz, možno vzorky odstrediť pri nízkej rýchlosti (100 – 400 x g), aby sa zrazenina z preventívnych dôvodov zatlačila ku dnu nádobky, keďže veľké množstvo zrazeniny môže zapchať trúbky alebo kolóny HPLC. Ak sa zrazenina alebo oddelenie fáz zistí po inkubačnej dobe, môže dôjsť k podhodnotenému odhadu úbytku peptidov a v prípade negatívneho výsledku nemožno s dostatočnou istotou vyvodiť záver o nedostatočnej reaktivite.
                     
                        Príprava štandardnej kalibračnej krivky pre HPLC
                     
                     Mala by sa vytvoriť štandardná kalibračná krivka pre cysteínové, ako aj pre lyzínové peptidy. Štandardy peptidov by sa mali pripraviť v 20 % alebo 25 % roztoku acetonitril: tlmivý roztok s použitím fosfátového tlmivého roztoku (pH 7,5) pre cysteínové peptidy a tlmivého roztoku octanu amónneho (pH 10,2) pre lyzínové peptidy. S použitím štandardov sériového riedenia peptidového zásobného roztoku (0,667 mM) by sa malo pripraviť 6 kalibračných roztokov s rozsahom od 0,534 do 0,0167 mM. Do štandardnej kalibračnej krivky by sa mala zahrnúť aj slepá skúška s riediacim tlmivým roztokom. Vhodné kalibračné krivky by mali mať r2>0,99.
                     
                        Príprava a analýza HPLC
                     
                     Pred vykonaním analýzy by sa mala overiť vhodnosť systému HPLC. Úbytok peptidov sa sleduje pomocou HPLC s pripojeným UV detektorom (detektorom s fotodiódovým poľom alebo absorpčným detektorom s fixnou vlnovou dĺžkou so signálom 220 nm). Do systému HPLC sa nainštaluje vhodná kolóna. Nastavenie HPLC opísané vo validačnej štúdii používa prednostne kolónu Zorbax SB-C-18 s rozmermi 2,1 mm × 100 mm × 3,5 mikrónu. S touto HPLC kolónou s reverznou fázou by mal byť celý systém v rovnovážnom stave pri teplote 30 °C s 50 % fázy A (0,1 obj. % kyseliny trifluóroctovej vo vode) a 50 % fázy B (0,085 obj. % kyseliny trifluóroctovej v acetonitrile) počas aspoň 2 hodín pred spustením. Analýza HPLC by sa mala vykonávať s použitím prietoku 0,35 ml/min a s lineárnym gradientom od 10 % do 25 % acetonitrilu počas 10 minút, s následným prudkým zvýšením na 90 % acetonitrilu s cieľom odstrániť ostatné materiály. Mali by sa injektovať rovnaké objemy každého štandardu, vzorky a kontroly. Kolóna by sa medzi vstreknutiami mala znovu nechať ustáliť pri pôvodných podmienkach počas 7 minút. Ak sa použije iná kolóna HPLC s reverznou fázou, možno bude potrebné upraviť opísané nastavenia parametrov, aby sa zabezpečilo primerané eluovanie a integrácia cysteínových a lyzínových peptidov vrátane injektovaného objemu, ktorý sa môže líšiť podľa použitého systému (zvyčajne v rozmedzí od 3 do 10 μl). Dôležité je, že ak sa použije alternatívne nastavenie HPLC, mala by sa preukázať jeho rovnocennosť s validovaným nastavením, ako sa opisuje vyššie (napr. testovaním látok na preukázanie spôsobilosti uvedených v dodatku 2). Absorbancia sa meria pri 220 nm. Ak sa použije detektor s fotodiódovým poľom, mala by sa zaznamenávať aj absorbancia pri 258 nm. Je potrebné poznamenať, že niektoré dodávky acetonitrilu by mohli mať negatívny dosah na stabilitu peptidov, čo sa musí posúdiť pri používaní novej šarže acetonitrilu. Ako ukazovateľ koelúcie možno použiť pomer plochy píkov pri 220 nm k ploche píkov pri 258 nm. Pri každej vzorke by pomer v rozmedzí 90 % < priemernej hodnoty (19) pomeru plochy v prípade kontrolných vzoriek < 100 % bol dobrou indikáciou toho, že ku koelúcii nedošlo.
                     Môžu sa vyskytnúť testované chemikálie, ktoré by mohli podporovať oxidáciu cysteínových peptidov. Pík dimerizovaného cysteínového peptidu možno sledovať vizuálne. Ak sa zdá, že došlo k dimerizácii, malo by sa to zaznamenať, keďže percentuálny úbytok peptidov môže byť nadhodnotený a viesť tak k falošným pozitívnym predpovediam a/alebo k zaradeniu do vyššej triedy reaktivity (pozri body 29 a 30).
                     Analýzu cysteínových a lyzínových peptidov pomocou metódy HPLC možno vykonávať súbežne (ak sú k dispozícii dva systémy HPLC), alebo v dvoch rôznych dňoch. Ak sa analýza vykonáva v dvoch rôznych dňoch, potom by sa všetky roztoky testovaných chemikálií mali v každý z týchto dní pripraviť čerstvé pre obe skúšky. Analýza by mala byť načasovaná tak, aby sa zaistilo, že vstreknutie prvej vzorky začne 22 až 26 hodín po tom, ako bola testovaná chemikália zmiešaná s roztokom peptidov. Rýchlosť úkonov HPLC by sa mala nastaviť tak, aby trvanie analýzy HPLC bolo kratšie než 30 hodín. Pri nastavení HPLC použitom vo validačnej štúdii a opísanom v tejto testovacej metóde možno pri jednom výkone HPLC spracovať až 26 analytických vzoriek (pozri aj bod 17). Príklad sekvencie analýzy HPLC je uvedený v dodatku 3.
                     PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Vyhodnotenie údajov
                     
                     Koncentrácia cysteínových alebo lyzínových peptidov sa v každej vzorke stanovuje fotometricky pri 220 nm zmeraním plochy píku (plocha pod krivkou) vhodných píkov a výpočtom koncentrácie peptidov pomocou lineárnej kalibračnej krivky odvodenej zo štandardov.
                     Percentuálny úbytok peptidov sa stanovuje v každej vzorke meraním plochy píku, ktorá sa vydelí priemernou hodnotou plochy píku príslušných referenčných kontrol C (pozri dodatok 3) podľa tohto vzorca.
                     
                        
                     
                        Kritériá prijateľnosti
                     
                     Aby sa výkon pokladal za platný, mali by byť splnené tieto kritériá:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 štandardná kalibračná krivka by mala mať r2>0,99.
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 priemerná hodnota percentuálneho úbytku peptidov v prípade troch replikátov na pozitívnu kontrolu s cinamaldehydom by mala byť pri cysteínovom peptide od 60,8 % do 100 % a pri lyzínovom peptide od 40,2 % do 69,0 % a maximálna štandardná odchýlka (SD) pri replikátoch na pozitívnu kontrolu by mala byť < 14,9 % pre percentuálny úbytok cysteínových peptidov a < 11,6 % pre percentuálny úbytok lyzínových peptidov a
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 priemerná hodnota koncentrácie peptidov z referenčných kontrol A by mala byť 0,50 ± 0,05 mM a variačný koeficient (CV) plôch píkov u peptidov pre deväť referenčných kontrol B a C v acetonitrile by mal byť < 15,0 %.
                              
                           Ak nie je splnené jedno alebo viacero kritérií, mal by sa postup zopakovať.
                     Aby sa výsledky s testovanou chemikáliou pokladali za platné, mali by byť splnené tieto kritériá:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 maximálna štandardná odchýlka v prípade replikátov s testovanou chemikáliou by mala byť pre percentuálny úbytok cysteínu < 14,9 % a pre percentuálny úbytok lyzínu < 11,6 %.
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 priemerná hodnota koncentrácie peptidov troch referenčných kontrol C vo vhodnom rozpúšťadle by mala byť 0,50 ± 0,05 mM. Ak tieto kritériá nie sú splnené, údaje by sa mali zamietnuť a postup by sa mal s touto konkrétnou chemikáliou zopakovať.
                              
                           
                        Prognostický model
                     
                     Pre každú testovanú chemikáliu sa vypočíta priemerná hodnota percentuálneho úbytku cysteínu a percentuálneho úbytku lyzínu. Záporný úbytok sa pri výpočte priemernej hodnoty považuje za „0“. Pri použití prognostického modelu cysteín 1:10/lyzín 1:50, ako sa uvádza v tabuľke 1, by sa prahová hodnota 6,38 % priemerného úbytku peptidov mala použiť na podporu rozlíšenia kožných senzibilizátorov od nesenzibilizujúcich chemikálií v rámci IATA. Uplatnenie tohto prognostického modelu pri zaraďovaní testovanej chemikálie do príslušnej triedy reaktivity (t. j. nízka, mierna, vysoká reaktivita) by sa mohlo osvedčiť ako užitočné z hľadiska informácií pre posúdenie potenciálu v rámci IATA.
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Prognostický model cysteín 1:10/lyzín 1:50
                         (20)
                     
                     
                                 Priemerná hodnota úbytku cysteínu a lyzínu
                              
                              
                                 Trieda reaktivity
                              
                              
                                 Predpoklad DPRA (21)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ priemerná hodnota percentuálneho úbytku ≤ 6,38 %
                              
                              
                                 žiadna alebo minimálna reaktivita
                              
                              
                                 negatívna
                              
                           
                                 6,38 % < priemerná hodnota percentuálneho úbytku ≤ 22,62 %
                              
                              
                                 nízka reaktivita
                              
                              
                                 pozitívna
                              
                           
                                 22,62 % < priemerná hodnota percentuálneho úbytku ≤ 42,47 %
                              
                              
                                 mierna reaktivita
                              
                           
                                 42,47 % < priemerná hodnota percentuálneho úbytku ≤ 100 %
                              
                              
                                 vysoká reaktivita
                              
                           Môže sa stať, že testovaná chemikália (látka alebo jedna alebo viacero zložiek mnohozložkovej látky alebo zmesi) pri 220 nm výrazne absorbuje a má ten istý retenčný čas ako peptid (koelúcia). Koelúciu možno vyriešiť miernou úpravou nastavenia HPLC, aby sa viac oddelil elučný čas testovanej chemikálie a peptidu. Ak sa použije alternatívne nastavenie HPLC v snahe vyriešiť koelúciu, mala by sa preukázať jeho rovnocennosť s validovaným nastavením (napr. testovaním látok na preukázanie spôsobilosti uvedených v dodatku 2). Ak nastane koelúcia, pík peptidu nemožno integrovať a výpočet percentuálneho úbytku peptidu nie je možný. Ak dôjde ku koelúcii takýchto testovaných chemikálií s cysteínovými, ako aj lyzínovými peptidmi, mala by sa analýza označiť za analýzu „bez výsledku“. V prípadoch, kedy dochádza ku koelúcii len s lyzínovým peptidom, možno použiť prognostický model cysteín 1:10 uvedený v tabuľke 2.
                     
                        Tabuľka 2
                     
                     
                        Prognostický model cysteín 1:10
                         (22)
                     
                     
                                 Percentuálny úbytok cysteínu (Cys) %
                              
                              
                                 Trieda reaktivity
                              
                              
                                 Predpoklad DPRA (23)
                                 
                              
                           
                                 0 % ≤ percentuálny úbytok Cys ≤ 13,89 %
                              
                              
                                 žiadna alebo minimálna reaktivita
                              
                              
                                 negatívna
                              
                           
                                 13,89 % < percentuálny úbytok Cys ≤ 23,09 %
                              
                              
                                 nízka reaktivita
                              
                              
                                 pozitívna
                              
                           
                                 23,09 % < percentuálny úbytok Cys ≤ 98,24 %
                              
                              
                                 mierna reaktivita
                              
                           
                                 98,24 % < percentuálny úbytok Cys ≤ 100 %
                              
                              
                                 vysoká reaktivita
                              
                           Mohlo by dôjsť k iným prípadom, v ktorých prekrývanie retenčného času medzi testovanou chemikáliou a niektorým z peptidov nie je úplné. V takýchto prípadoch možno percentuálne hodnoty úbytku peptidov odhadnúť a použiť ich v prognostickom modeli cysteín 1:10/lyzín 1:50, no zaradenie testovanej chemikálie do triedy reaktivity nemožno vykonať presne.
                     Jediná analýza HPLC pre cysteínové aj lyzínové peptidy by mala byť pre testovanú chemikáliu postačujúca, ak výsledok nie je jednoznačný. Avšak v prípadoch, keď sa výsledky približujú prahovej hodnote používanej na rozlíšenie medzi pozitívnymi a negatívnymi výsledkami (t. j. hraničné výsledky), môže byť potrebné ďalšie testovanie. Ak sa priemerná hodnota percentuálneho úbytku nachádza v rozpätí od 3 % do 10 % v prípade prognostického modelu pre cysteín 1:10/lyzín 1:50, alebo ak sa percentuálny úbytok cysteínu nachádza v rozmedzí od 9 % do 17 % v prípade prognostického modelu pre cysteín 1:10, malo by sa zvážiť vykonanie druhej analýzy a v prípade nesúhlasných výsledkov medzi prvými dvomi analýzami aj vykonanie tretej analýzy.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jednozložková látka
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         identifikácia chemikálie, ako je názov(-vy) IUPAC alebo CAS, číslo(-a) CAS, kód SMILES alebo InChI, štrukturálny vzorec a/alebo iné identifikátory,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, molekulová hmotnosť a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti v dostupnom rozsahu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čistota, chemická identita nečistôt, ak je to potrebné a prakticky uskutočniteľné, atď.,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prípadná úprava pred testovaním (napr. zahrievanie, drvenie),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovaná(-é) koncentrácia(-e),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Mnohozložková látka, UVCB a zmes:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         charakterizovaná pokiaľ možno napr. chemickou identitou (pozri vyššie), čistotou, kvantitatívnym výskytom a relevantnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami (pozri vyššie) zložiek, v dostupnom rozsahu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti v dostupnom rozsahu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         molekulová hmotnosť alebo jasná molekulová hmotnosť v prípade zmesí/polymérov známeho zloženia alebo iné informácie relevantné na vykonanie štúdie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prípadná úprava pred testovaním (napr. zahrievanie, drvenie),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovaná(-é) koncentrácia(-e),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontroly
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Pozitívna kontrola
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         identifikácia chemikálie, ako je názov(-vy) IUPAC alebo CAS, CAS číslo(-a), kód SMILES alebo InChI, štrukturálny vzorec a/alebo iné identifikátory,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, molekulová hmotnosť a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čistota, chemická identita nečistôt, ak je to potrebné a prakticky uskutočniteľné, atď.,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prípadná úprava pred testovaním (napr. zahrievanie, drvenie),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovaná(-é) koncentrácia(-e),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         odkaz na prípadné historické výsledky pozitívnych kontrol preukazujúcich vhodnosť kritérií prijateľnosti vykonania.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Rozpúšťadlo/nosič
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         použité rozpúšťadlo/použitý nosič a prípadne pomer ich zložiek,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         identifikácia(-e) chemikálie, ako je názov(-vy) IUPAC alebo CAS, CAS číslo(-a) a/alebo iné identifikátory,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čistota, chemická identita nečistôt, ak je to potrebné a prakticky uskutočniteľné, atď.,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, molekulová hmotnosť a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti v prípade iných rozpúšťadiel/nosičov, než sú použité rozpúšťadlá/nosiče uvedené v testovacej metóde, v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         zdôvodnenie výberu rozpúšťadla pre každú chemikáliu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v prípade acetonitrilu výsledky testu dosahu na stabilitu peptidov.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Príprava peptidov, pozitívnej kontroly a testovanej chemikálie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             charakteristika roztokov peptidov (dodávateľ, šarža, presná hmotnosť peptidu, objem pridaný pre zásobný roztok),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             charakteristika roztoku pozitívnej kontroly (presná hmotnosť látky na pozitívnu kontrolu, objem pridaný pre testovací roztok),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             charakteristika roztokov testovanej chemikálie (presná hmotnosť testovanej chemikálie, objem pridaný do testovacieho roztoku).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Nastavenie prístroja HPLC a analýza HPLC
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             typ prístroja HPLC, HPLC a predkolóny, detektor, automatický dávkovač vzoriek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             parametre relevantné pre analýzu HPLC, ako je teplota kolóny, vstrekovacie/vstreknuté objemy, prietok a gradient.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Vhodnosť systému
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             plocha píku peptidov pri 220 nm každého štandardu a replikátu na referenčnú kontrolu A,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             lineárna kalibračná krivka vyjadrená graficky a uvedená hodnota r2,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia peptidu každého replikátu na referenčnú kontrolu A,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             priemerná hodnota koncentrácie peptidov (mM) troch referenčných kontrol A, SD a CV,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia peptidov referenčných kontrol A a C.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Postup analýzy
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Pri referenčných kontrolách:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         plocha píku peptidov pri 220 nm každého replikátu B a C,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         priemerná hodnota plochy píku pri 220 nm deviatich referenčných kontrol B a C v acetonitrile, SD a CV (pre stabilitu referenčných kontrol počas analýzy),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v prípade každého použitého rozpúšťadla priemerná hodnota plochy píku peptidov pri 220 nm troch vhodných referenčných kontrol C (na výpočet percentuálneho úbytku peptidov),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v prípade každého použitého rozpúšťadla hodnota koncentrácie peptidov (mM) troch vhodných referenčných kontrol C,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v prípade každého použitého rozpúšťadla priemerná hodnota koncentrácie peptidov (mM) troch vhodných referenčných kontrol C, SD a CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Pri pozitívnej kontrole:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         plocha píku peptidov pri 220 nm každého replikátu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         percentuálny úbytok peptidov každého replikátu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         priemerná hodnota percentuálneho úbytku peptidov troch replikátov, SD a CV.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Pri každej chemikálii:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vzhľad zrazeniny v reakčnej zmesi (ak sa spozoruje) na konci inkubačnej doby, informácia o tom, či bola zrazenina opäť rozpustená alebo odstredená,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prítomnosť koelúcie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prípadne opis akýchkoľvek relevantných zistení,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         plocha píku peptidov pri 220 nm každého replikátu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         percentuálny úbytok peptidov každého replikátu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         priemerná hodnota percentuálneho úbytku peptidov troch replikátov, SD a CV,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         priemerná hodnota percentuálnych úbytkov lyzínu a cysteínu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         použitý prognostický model a predpoklad DPRA.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovanie spôsobilosti
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             V uplatniteľnom prípade použitý postup na preukázanie spôsobilosti laboratória vykonávať testovaciu metódu (napr. testovaním látok na preukázanie spôsobilosti) alebo na preukázanie opakovateľného vykonávania testovacej metódy v priebehu času.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskusia o výsledkoch
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Diskusia o výsledkoch získaných testovacou metódou DPRA,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             diskusia o výsledkoch testovacej metódy v kontexte IATA, ak sú k dispozície iné relevantné informácie.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition, UN New York and Geneva, 2013. Dostupné na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. Series on Testing and Assessment No. 168, OECD, Paris.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Chapter B.6 of this Annex: Skin Sensitisation.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Chapter B.42 of this Annex: The Local Lymph Node Assay
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Chapter B.50 of this Annex: Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay: DA.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Chaper B.51 of this Annex: Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay BrdU-ELISA
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Adler et al. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85:367-485.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2004). Development of a peptide reactivity assay for screening contact allergens. Toxicological Sciences 81:332-343.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Gerberick et al. (2007). Quantification of chemical peptide reactivity for screening contact allergens: A classification tree model approach. Toxicological Sciences 97:417-427.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 EC EURL-ECVAM (2013). Recommendation on the Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) for skin sensitisation testing. Dostupné na: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Jaworska et al. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. Journal of Applied Toxicology, published online, 14 May 2013, DOI: 10.1002/jat.2869.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Bauch et al. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potential. Regulatory Toxicology and Pharmacology 63: 489-504.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Nukada et al. (2013). Data integration of non-animal tests for the development of a test battery to predict the skin sensitizing potential and potency of chemicals. Toxicology in vitro 27:609 618.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Ball et al. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regulatory Toxicology and Pharmacology 60:389-400.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Landsteiner and Jacobs (1936). Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds. Journal of Experimental Medicine 64:625-639.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Dupuis and Benezra (1982). Allergic contact dermatitis to simple chemicals: a molecular approach. New York & Basel: Marcel Dekker Inc.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Lepoittevin et al. (1998). Allergic contact dermatitis: the molecular basis. Springer, Berlin.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 EC EURL ECVAM (2012). Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) Validation Study Report 74pp. Dostupné na: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/eurl-ecvam-recommendation-on-the-direct-peptide-reactivity-assay-dpra
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Natsch et al. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, published online, 9 April 2013, DOI:10.1002/jat.2868.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) Protocol 154: Direct Peptide Reactivity assay (DPRA) for skin sensitisation testing 17pp. Dostupné na: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Series on Testing and Assessment, No. 34. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris, France.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 FDA (Food and Drug Administration (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation 22pp. Dostupné na: www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidance/ucm070107.pdf – 138
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Presnosť
                           : miera zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referenčnými hodnotami. Týka sa výkonnosti testovacej metódy a jedného z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často používa zameniteľne s pojmom „zhoda“ a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (21).
                        
                           
                              AOP (dráha nepriaznivého účinku)
                           : sled udalostí počnúc chemickou štruktúrou cieľovej chemikálie alebo skupiny podobných chemikálií vyvolaných molekulárnou iniciáciou až po výsledok in vivo (2), ktorý je predmetom záujmu.
                        
                           
                              Kalibračná krivka
                           : vzťah medzi experimentálnou hodnotou reakcie a analytickou koncentráciou (nazývaný aj ako štandardná krivka) známej látky.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Variačný koeficient
                           : týka sa variability, ktorá sa v prípade skupiny údajov z replikátov vypočítava vydelením štandardnej odchýlky od priemeru. Môže sa vynásobiť faktorom 100 a vyjadriť v percentách.
                        
                           
                              Nebezpečenstvo (ohrozenie)
                           : inherentná vlastnosť činidla, prípadne situácia, ktorá môže vyvolať nepriaznivé účinky pri expozícii organizmu, systému alebo (sub)populácie účinkom daného činidla.
                        
                           
                              IATA (integrovaný prístup k testovaniu a hodnoteniu)
                           : štruktúrovaný prístup používaný na identifikáciu (potenciálneho) nebezpečenstva, charakterizáciu nebezpečenstva (z hľadiska potencie) a/alebo hodnotenie bezpečnosti (potenciál/potencia a expozícia) chemikálie alebo skupiny chemikálií, ktorý strategicky integruje a porovnáva všetky relevantné údaje s cieľom informovať regulačný orgán o potenciálnom nebezpečenstve a/alebo riziku a/alebo potrebe vykonania ďalších cielených, t. j. minimálnych testov.
                        
                           
                              Molekulárna iniciácia
                           : chemicky vyvolané narušenie biologického systému na úrovni molekúl, ktoré sa považuje za začiatok AOP.
                        
                           
                              Zmes
                           : zmes alebo roztok zložený z dvoch alebo viacerých látok, ktoré spolu nereagujú (1).
                        
                           
                              Jednozložková látka
                           : látka definovaná svojím kvantitatívnym zložením, v ktorej je hlavná zložka zastúpená v koncentrácii najmenej do 80 hm. %.
                        
                           
                              Viaczložková látka
                           : látka definovaná svojím kvantitatívnym zložením, v ktorej je viac ako jedna hlavná zložka zastúpená v koncentrácii ≥ 10 hm. % a < 80 hm. %. Viaczložková látka je výsledkom výrobného procesu. Rozdiel medzi zmesou a viaczložkovou látkou spočíva v tom, že zmes sa získava zmiešaním dvoch alebo viacerých látok bez toho, aby došlo k chemickej reakcii. Viaczložková látka je výsledkom chemickej reakcie.
                        
                           
                              Pozitívna kontrola
                           : replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému a ovplyvnený látkou, o ktorej je známe, že vyvolá pozitívnu reakciu. Aby bolo možné vyhodnotiť premenlivosť reakcie na pozitívnu kontrolu v čase, veľkosť pozitívnej reakcie by nemala byť extrémne silná.
                        
                           
                              Referenčná kontrola
                           : neovplyvnená vzorka, ktorá obsahuje všetky zložky testovacieho systému, vrátane rozpúšťadla alebo nosiča, ktorá sa spracuje použitím ovplyvnenej testovanej chemikálie a inými kontrolami, aby sa zistila základná reakcia vzoriek upravených testovanou chemikáliou rozpustenou v tom istom rozpúšťadle alebo nosiči. Keď sa táto vzorka testuje so súbežnou negatívnou kontrolou, preukáže sa aj to, či rozpúšťadlo alebo nosič interagujú s testovacím systémom.
                        
                           
                              Relevantnosť
                           : opis vzťahu testu k účinku, ktorý je predmetom záujmu, a zmysluplnosti a užitočnosti testu na konkrétny účel. Ide o mieru, do akej test správne meria alebo predpovedá biologický účinok, ktorý je predmetom záujmu. Relevantnosť zohľadňuje presnosť (zhodu) testovacej metódy (21).
                        
                           
                              Spoľahlivosť
                           : meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda počas istého časového obdobia reprodukovateľne vykonávať v rámci laboratórií a medzi nimi navzájom, pričom sa používa ten istý protokol. Hodnotí sa vypočítaním vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovateľnosti a vnútrolaboratórnej opakovateľnosti (21).
                        
                           
                              Reprodukovateľnosť
                           : zhoda výsledkov získaných testovaním tej istej chemikálie s použitím toho istého skúšobného protokolu (pozri spoľahlivosť) (21).
                        
                           
                              Citlivosť
                           : podiel všetkých pozitívnych/aktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou. Ide o presnosť testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky a musí sa zohľadniť pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (21).
                        
                           
                              Špecifickosť
                           : podiel všetkých negatívnych/neaktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou. Ide o presnosť testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky a musí sa zohľadniť pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (21).
                        
                           
                              Látka
                           : chemické prvky a ich zlúčeniny v prírodnom stave alebo získané pomocou akéhokoľvek výrobného procesu, vrátane všetkých prísad potrebných na uchovanie stability výrobku a všetkých nečistôt pochádzajúcich z použitého postupu, no s vylúčením všetkých rozpúšťadiel, ktoré je možné oddeliť bez toho, aby ovplyvnili stabilitu látky alebo zmenili jej zloženie (1).
                        
                           
                              Vhodnosť systému
                           : stanovenie prístrojových parametrov (napr. citlivosti) analýzou referenčného štandardu pred spustením analytickej dávky (22).
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : pojem „testovaná chemikália“ sa používa ako odkaz na to, čo sa testuje.
                        
                           
                              Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií OSN (ďalej len „GHS OSN“)
                           : systém, ktorým sa navrhuje klasifikácia chemikálií (látok a zmesí) podľa štandardizovaných typov a miery fyzického, zdravotného a environmentálneho nebezpečenstva a označovania pomocou príslušných komunikačných prvkov, ako sú piktogramy, signalizačné výrazy, výstražné upozornenia, bezpečnostné upozornenia a karty bezpečnostných údajov, ktoré obsahujú informácie o ich škodlivých účinkoch z hľadiska ochrany ľudí (vrátane zamestnávateľov, pracovníkov, prepravcov, spotrebiteľov a záchranných zložiek) a životného prostredia (1).
                        
                           
                              UVCB
                           : látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.
                        
                           
                              Platná testovacia metóda
                           : testovacia metóda, ktorá sa na daný účel považuje za dostatočne relevantnú a spoľahlivú a ktorá je založená na vedecky podložených zásadách. Testovacia metóda nie je nikdy platná v absolútnom zmysle, ale len vo vzťahu k vymedzenému účelu (21).
                     
                     
                        Dodatok 2
                        CHEMIKÁLIE NA PREUKÁZANIE SPÔSOBILOSTI
                        
                           Kožná senzibilizácia in chemico: skúška priamej peptidovej reaktivity
                        
                        Pred rutinným použitím tejto testovacej metódy by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť tým, že správne získajú očakávanú prognózu výsledku skúšky priamej peptidovej reaktivity (DPRA) v prípade 10 chemikálií na preukázanie spôsobilosti odporúčaných v tabuľke 1, a získaním hodnôt úbytku cysteínu a lyzínu, ktoré spadajú do príslušného referenčného rozsahu pre 8 z 10 látok na preukázanie spôsobilosti pri každom peptide. Tieto látky na preukázanie spôsobilosti boli vybrané tak, aby reprezentovali rozpätie reakcií na nebezpečenstvo kožnej senzibilizácie. Medzi ďalšie kritériá výberu patrí ich komerčná dostupnosť, dostupnosť kvalitných referenčných údajov in vivo a údajov in vitro získaných z DPRA, ako aj skutočnosť, že boli použité vo validačnej štúdii koordinovanej referenčným laboratóriom Európskej únie pre alternatívy testovania na zvieratách (EURL ECVAM) na preukázanie úspešného zavedenia testovacej metódy laboratóriami zapojenými do štúdie.
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Odporúčané chemikálie na preukázanie technickej spôsobilosti pri skúške priamej peptidovej reaktivity (DPRA)
                        
                        
                                    Chemikálie na preukázanie spôsobilosti
                                 
                                 
                                    CAS č.
                                 
                                 
                                    Fyzikálny stav
                                 
                                 
                                    Prognóza in vivo
                                        (24)
                                    
                                 
                                 
                                    Prognóza DPRA (25)
                                    
                                 
                                 
                                    Rozsah (26) úbytku peptidu cysteín (v %)
                                 
                                 
                                    Rozsah (26) úbytku peptidu lyzín (v %)
                                 
                              
                                    2,4-dinitrochlórbenzén
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor
                                    (extrémny)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    90 – 100
                                 
                                 
                                    15 – 45
                                 
                              
                                    oxazolón
                                 
                                 
                                    15646-46-5
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor
                                    (extrémny)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    60 – 80
                                 
                                 
                                    10 – 55
                                 
                              
                                    formaldehyd
                                 
                                 
                                    50-00-0
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor
                                    (silný)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    30 – 60
                                 
                                 
                                    0 – 24
                                 
                              
                                    benzylidénacetón
                                 
                                 
                                    122-57-6
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor
                                    (mierny)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    80 – 100
                                 
                                 
                                    0 – 7
                                 
                              
                                    farnesal
                                 
                                 
                                    19317-11-4
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor
                                    (slabý)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    15 – 55
                                 
                                 
                                    0 – 25
                                 
                              
                                    2,3-butándión
                                 
                                 
                                    431-03-8
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor
                                    (slabý)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    60 – 100
                                 
                                 
                                    10 – 45
                                 
                              
                                    bután-1-ol
                                 
                                 
                                    71-36-3
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    0 – 7
                                 
                                 
                                    0 – 5,5
                                 
                              
                                    6-metylkumarín
                                 
                                 
                                    92-48-8
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    0 – 7
                                 
                                 
                                    0 – 5,5
                                 
                              
                                    kyselina mliečna
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    0 – 7
                                 
                                 
                                    0 – 5,5
                                 
                              
                                    1-(4-metoxyfenyl)etán-1-ón
                                 
                                 
                                    100-06-1
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    0 – 7
                                 
                                 
                                    0 – 5,5
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           PRÍKLADY SEKVENČNEJ ANALÝZY
                        
                        
                                    
                                       Kalibračné štandardy a referenčné kontroly
                                    
                                 
                                 
                                    STD1
                                    STD2
                                    STD3
                                    STD4
                                    STD5
                                    STD6
                                    tlmivý roztok
                                    referenčná kontrola A, replikát 1
                                    referenčná kontrola A, replikát 2
                                    referenčná kontrola A, replikát 3
                                 
                              
                                    
                                       Kontroly koelúcie
                                    
                                 
                                 
                                    kontrola koelúcie 1 v prípade testovanej chemikálie 1
                                    kontrola koelúcie 2 v prípade testovanej chemikálie 2
                                 
                              
                                    
                                       Referenčné kontroly
                                    
                                 
                                 
                                    referenčná kontrola B, replikát 1
                                    referenčná kontrola B, replikát 2
                                    referenčná kontrola B, replikát 3
                                 
                              
                                    
                                       Prvý súbor replikátov
                                    
                                 
                                 
                                    referenčná kontrola C, replikát 1
                                    aldehyd kyseliny škoricovej, replikát 1
                                    vzorka 1, replikát 1
                                    vzorka 2, replikát 1
                                 
                              
                                    
                                       Druhý súbor replikátov
                                    
                                 
                                 
                                    referenčná kontrola C, replikát 2
                                    aldehyd kyseliny škoricovej, replikát 2
                                    vzorka 1, replikát 2
                                    vzorka 2, replikát 2
                                 
                              
                                    
                                       Tretí súbor replikátov
                                    
                                 
                                 
                                    referenčná kontrola C, replikát 3
                                    aldehyd kyseliny škoricovej, replikát 3
                                    vzorka 1, replikát 3
                                    vzorka 2, replikát 3
                                 
                              
                                    
                                       Referenčné kontroly
                                    
                                 
                                 
                                    referenčná kontrola B, replikát 4
                                    referenčná kontrola B, replikát 5
                                    referenčná kontrola B, replikát 6
                                 
                              
                                    Súčasťou sekvenčnej analýzy by mali byť tieto tri súbory referenčných kontrol (t. j. vzoriek zložených iba z peptidu rozpusteného vo vhodnom rozpúšťadle):
                                    
                                                 
                                             
                                             
                                                Referenčná kontrola A: používa sa na overenie vhodnosti systému vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC).
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Referenčná kontrola B: zaradené na začiatok a koniec sekvenčnej analýzy na overenie stability referenčných kontrol v priebehu analýzy.
                                             
                                          
                                                 
                                             
                                             
                                                Referenčná kontrola C: ako súčasť sekvenčnej analýzy, ktorou sa overí, či rozpúšťadlo použité na rozpustenie testovanej chemikálie neovplyvňuje percento úbytku peptidu.
                                             
                                          
                              
                     B.60   Kožná senzibilizácia in vitro: testovacia metóda „ARE-Nrf2 luciferáza”
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda (TM) zodpovedá usmerneniu OECD na vykonávanie testov (TG) 442D (2015). Pod kožným senzibilizátorom sa rozumie látka, ktorá pri kontakte s pokožkou vyvolá alergickú reakciu podľa definície v Globálnom harmonizovanom systéme klasifikácie a označovania chemických látok (GHS OSN) (1) a nariadení Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (CLP) (27). Táto testovacia metóda je postupom in vitro (analýza ARE-Nrf2 luciferáza) používaným ako pomoc pri rozlišovaní medzi kožnými senzibilizátormi a látkami, ktoré senzibilizáciu nespôsobujú, v súlade s GHS OSN (1) a CLP.
                     V prípade kľúčových biologických udalostí vedúcich ku kožnej senzibilizácii panuje všeobecná zhoda. Súčasné poznatky o chemických a biologických mechanizmoch súvisiacich s kožnou senzibilizáciou boli zhrnuté ako dráha nepriaznivého účinku (adverse outcome pathway – AOP) (2), počnúc molekulárnou iniciáciou cez parciálne udalosti až k nepriaznivému alergickému účinku, t. j. alergickej kontaktnej dermatitíde u ľudí alebo kontaktnej hypersenzitivite u hlodavcov (2) (3). Molekulárna iniciácia znamená kovalentnú väzbu elektrofilných látok s nukleofilnými jadrami kožných proteínov. K druhej kľúčovej udalosti v rámci tejto AOP dochádza v keratínocytoch, pričom zahŕňa zápalové reakcie, ako aj génovú expresiu v súvislosti so špecifickými signálnymi dráhami bunky, akými sú dráhy závislé od sekvencie ARE (antioxidant/electrophile response element). Treťou kľúčovou udalosťou je aktivácia dendritických buniek, ktorá sa zvyčajne posudzuje podľa prejavov špecifických povrchových bunkových markerov, chemokínov a cytokínov. Štvrtou kľúčovou udalosťou je proliferácia T-buniek, ktorá sa nepriamo posudzuje lokálnou skúškou lymfatických uzlín (4) na myšiach a potkanoch.
                     Posudzovanie kožnej senzibilizácie obyčajne zahŕňalo použitie laboratórnych zvierat. Tradičné metódy založené na morčatách, t. j. Magnusson Kligmanov test na morčatách (GPMT) a Buehlerov test [TM B. 6 (5)], sledovali tak indukčnú, ako aj elicitačnú fázu kožnej senzibilizácie. Uznanie si získala aj lokálna skúška lymfatických uzlín (LLNA) [TM B. 42 (4)] u myší a potkanov a jej dve nerádioaktívne modifikácie LLNA: DA [TM B.50 (6)] a LLNA: BrdU-ELISA [TM B.51 (7)], ktorými sa posudzuje výlučne indukčná odozva, pretože sú vhodnejšie ako testy na morčatách tak z hľadiska dobrých životných podmienok zvierat, ako aj objektívneho merania indukčnej fázy kožnej senzibilizácie.
                     Nedávno boli vedecky overené testovacie metódy in chemico a in vitro založené na mechanistických poznatkoch, ktorými sa posudzuje nebezpečnosť chemikálií z hľadiska kožnej senzibilizácie. Aby sa však dali plne nahradiť v súčasnosti používané testy na zvieratách, bude potrebné kombinovať metódy testovania bez použitia zvierat (in silico, in chemico, in vitro) v rámci integrovaných prístupov k testovaniu a hodnoteniu (IATA), vzhľadom na obmedzené mechanistické pokrytie AOP jednotlivých v súčasnosti dostupných metód testovania bez použitia zvierat (2) (3).
                     Navrhuje sa, aby sa táto testovacia metóda (analýza ARE-Nrf2 luciferáza) používala v prípade druhej kľúčovej udalosti podľa bodu 2. Existujú informácie o tom, že kožné senzibilizátory indukujú gény regulované sekvenciou ARE (8) (9). Malé elektrofilné látky ako kožné senzibilizátory môžu vystupovať ako senzorový proteín Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1), napr. kovalentnou modifikáciou jeho cysteínového rezídua, ktorá povedie k jeho oddeleniu od transkripčného faktoru Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2). Oddelený Nrf2 potom môže aktivovať ARE-dependentné gény, ako sú tie, ktoré kódujú detoxifikačné enzýmy druhej fázy (8) (10) (11).
                     V súčasnosti je jedinou takouto testovacou metódou, ktorá zahŕňa skúšku ARE-Nrf2 luciferáza, skúška KeratinoSens™, v prípade ktorej boli dokončené validačné štúdie (9) (12) (13) a následne vykonané nezávislé partnerské preskúmanie referenčným laboratóriom Európskej únie pre alternatívy testovania na zvieratách (EURL ECVAM) (14). KeratinoSens™ bola považovaná za vedecky platnú skúšku, ktorá sa má na účely klasifikácie nebezpečnosti a označovania (14) používať ako súčasť IATA ako pomoc pri rozlišovaní medzi kožnými senzibilizátormi a látkami, ktoré senzibilizáciu nespôsobujú. Laboratóriá ochotné zaviesť túto testovaciu metódu môžu získať rekombinovanú bunkovú líniu používanú pri skúške KeratinoSens™ uzavretím licenčnej zmluvy so spoločnosťou, ktorá túto testovaciu metódu vyvinula (15).
                     Definície sú uvedené v dodatku 1.
                     ÚVODNÉ ÚVAHY, POUŽITEĽNOSŤ A OBMEDZENIA
                     Keďže aktivácia dráhy Keap1-Nrf 2-ARE sa zaoberá len druhou kľúčovou udalosťou v rámci AOP pri kožnej senzibilizácii, informácie z testovacích metód založených na aktivácii tejto dráhy pravdepodobne nebudú stačiť v prípade, že sa na zistenie potenciálu chemikálií spôsobovať kožnú senzibilizáciu použijú samostatne. Preto by sa údaje získané pomocou tejto testovacej metódy mali zvažovať v kontexte integrovaných prístupov, ako napríklad IATA a kombinovať s inými doplňujúcimi informáciami. napr. odvodenými zo skúšok in vitro zameraných na iné kľúčové udalosti v rámci AOP pri kožnej senzibilizácii, ako aj z metód bez testov vrátane údajov prevzatých z chemických analógov. Príklady použitia testovacej metódy „ARE-Nrf2 luciferáza” v kombinácii s ďalšími informáciami sú uvedené v literatúre (13) (16) (17) (18) (19).
                     Táto testovacia metóda sa môže použiť ako pomoc pri rozlišovaní medzi kožnými senzibilizátormi (t. j. kategória 1 GHS OSN/CLP) a látkami, ktoré senzibilizáciu nespôsobujú, v kontexte IATA. Táto testovacia metóda sa nemôže používať samostatne, ani na ďalšiu kategorizáciu kožných senzibilizátorov do podkategórií 1A a 1B podľa GHS OSN/CLP či na predpovedanie potencie pri prijímaní rozhodnutí v rámci posudzovania bezpečnosti. V závislosti od regulačného rámca sa však pozitívny výsledok môže používať samostatne pri klasifikácii chemikálie do kategórie 1 GHS OSN/CLP.
                     Na základe súboru údajov z validačnej štúdie a interného testovania použitého na nezávislé partnerské preskúmanie testovacej metódy sa preukázalo, že skúška KeratinoSens™ sa dá preniesť aj do laboratórií, ktoré majú skúsenosti s bunkovými kultúrami. Miera reprodukovateľnosti v prognózach, ktorú možno od tejto testovacej metódy očakávať, je rádovo 85 % v rámci laboratória a medzi laboratóriami (14). Zvážením všetkých údajov, ktoré boli laboratóriu EURL ECVAM predložené na hodnotenie, ako aj výsledkov partnerského preskúmania tejto testovacej metódy, sa vypočítala presnosť (77 % – 155/201), citlivosť (78 % – 71/91) a špecifickosť (76 % – 84/110) skúšky KeratinoSens™ na účely rozlišovania medzi kožnými senzibilizátormi (t. j. kategóriou 1 GHS OSN/CLP) a látkami, ktoré senzibilizáciu nespôsobujú, v porovnaní s výsledkami LLNA. Tieto čísla sú podobné tým, ktoré boli nedávno uverejnené na základe interného testovania približne 145 látok (s presnosťou 77 %, citlivosťou 79 % a špecifickosťou 72 %) (13). Skúška KeratinoSens™ má tendenciu podhodnocovať prognózy v prípade chemikálií s nízkou až miernou potenciou kožnej senzibilizácie (t. j. podkategória 1B GHS OSN/CLP) v porovnaní s chemikáliami s vysokou potenciou kožnej senzibilizácie (t. j. podkategória 1A GHS OSN/CLP) (13) (14). V konečnom dôsledku z týchto informácií vyplýva užitočnosť skúšky KeratinoSens™ pri identifikácii nebezpečenstva kožnej senzibilizácie. Hodnoty presnosti, ktoré sa tu uvádzajú v prípade skúšky KeratinoSens™ ako samostatnej testovacej metódy, sú len orientačné, keďže táto testovacia metóda by sa mala posudzovať v spojení s inými zdrojmi informácií v rámci IATA a v súlade s ustanoveniami bodu 9 uvedeného vyššie. Okrem toho by sa pri hodnotení metód testovania kožnej senzibilizácie bez použitia zvierat nemalo zabúdať na skutočnosť, že LLNA, ako aj iné testy na zvieratách, nemusia úplne odrážať situáciu pri druhoch, ktoré sú predmetom záujmu, t. j. u ľudí.
                     Pojem „testovaná chemikália” sa v tejto testovacej metóde používa ako odkaz na to, čo sa testuje, a netýka sa použiteľnosti testovacej metódy „ARE-Nrf2 luciferáza” na testovanie látok a/alebo zmesí. Na základe súčasných dostupných údajov sa ukázalo, že skúšku KeratinoSens™ je možné použiť v prípade testovaných chemikálií zahŕňajúcich viacero organických funkčných skupín, reakčných mechanizmov, potencií senzibilizačných účinkov na pokožku (stanovených štúdiami in vivo) a fyzikálno-chemických vlastností (9) (12) (13) (14). Testovali sa najmä jednozložkové látky, hoci obmedzené množstvo údajov existuje aj z testovania zmesí (20). Táto testovacia metóda je napriek tomu technicky použiteľná aj na testovanie viaczložkových látok a zmesí. V prípade zmesí by sa však pred použitím tejto testovacej metódy na generovanie údajov plánovaných na regulačné účely malo zvážiť, či môže poskytnúť adekvátne výsledky na daný účel a ak áno, prečo. Takéto úvahy nie sú potrebné v prípade, že existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi. Okrem toho by sa pri testovaní viaczložkových látok alebo zmesí mala zvážiť možná interferencia medzi cytotoxickými zložkami a pozorovanými reakciami. Táto testovacia metóda sa používa pri testovaných chemikáliách, ktoré sú rozpustné alebo vytvárajú stabilné disperzie (t. j. koloid alebo suspenziu, v ktorej sa testovaná chemikália neusadí alebo neoddelí od rozpúšťadla do rôznych fáz) buď vo vode, alebo DMSO (vrátane všetkých zložiek testovanej chemikálie v prípade testovania viaczložkových látok alebo zmesi). Testované chemikálie, ktoré nespĺňajú tieto podmienky pri najvyššej konečnej koncentrácii 2 000 μM (pozri bod 22), sa môžu stále testovať pri nižších koncentráciách. V takom prípade by sa výsledky, ktoré spĺňajú kritériá pozitivity opísané v bode 39, mohli ďalej použiť na pomoc pri identifikácii testovanej chemikálie ako kožného senzibilizátora, pričom negatívny výsledok získaný pri koncentráciách < 1 000 μM by sa mal považovať za nejednoznačný (pozri model prognózy v bode 39). Vo všeobecnosti boli úspešne testované látky s LogP do 5, pričom silne hydrofóbne látky s LogP nad 7 sú mimo rozsahu známej použiteľnosti tejto testovacej metódy (14). V prípade látok s LogP od 5 do 7 sú dostupné iba obmedzené informácie.
                     Negatívne výsledky by sa mali interpretovať opatrne, pretože látky reagujúce výlučne na rezíduá lyzínu sa môžu pri tejto metóde ukázať ako negatívne. Okrem toho môžu z dôvodu obmedzenej metabolickej kapacity použitej bunkovej línie (21) a experimentálnych podmienok vykazovať negatívne výsledky aj prohaptény (t. j. chemikálie, ktoré musia byť aktivované enzymaticky, napríklad enzýmami P 450) a prehaptény (t. j. chemikálie aktivované autooxidáciou), zvlášť tie s pomalou oxidáciou. Na druhej strane, testované chemikálie, ktoré sa nesprávajú ako senzibilizátory, ale sú chemickými stresormi, môžu vykazovať falošné pozitívne výsledky (14). Okrem toho vysoko cytotoxické testované chemikálie nemožno vždy spoľahlivo posúdiť. Napokon treba uviesť aj to, že testované chemikálie, ktoré interferujú s luciferázou, môžu negatívne ovplyvniť činnosť luciferázy v bunkových testoch, a to buď zdanlivou inhibíciou, alebo zvýšenou luminiscenciou (22). V iných skúškach s reportérovými génmi luciferázy boli napríklad zaznamenané aj interferencie fytoestrogénu v koncentráciách nad 1 μM s luminiscenčnými signálmi z dôvodu nadmernej aktivácie reportérových génov luciferázy (23). Preto treba všetky prejavy luciferázy získané pri vysokých koncentráciách fytoestrogénov alebo podobných chemikálií, ktoré môžu, rovnako ako fytoestrogény, vyvolať nadmernú aktiváciu reportérových génov luciferázy, dôkladne preskúmať (23). V prípade, že existujú dôkazy o nepoužiteľnosti tejto testovacej metódy na iné špecifické kategórie testovaných chemikálií, by sa táto testovacia metóda nemala pri týchto špecifických kategóriách použiť.
                     Okrem pomoci pri rozlišovaní medzi kožnými senzibilizátormi a látkami, ktoré senzibilizáciu nespôsobujú, slúži skúška KeratinoSens™ aj na získavanie informácií o vzťahu medzi koncentráciou a reakciou, ktorý môže prispieť k hodnoteniu potencie senzibilizačných pri použití integrovaných prístupov, ako je napríklad IATA (19). Je však potrebné vyvinúť ďalšie úsilie, aby sa, najlepšie na základe spoľahlivých údajov získaných u ľudí, dalo určiť, akým spôsobom môžu výsledky skúšky KeratinoSens™ prispieť k hodnoteniu potencie (24) a ku kategorizácii senzibilizátorov do podkategórií podľa GHS OSN/CLP.
                     PRINCÍP TESTU
                     Testovacia metóda „ARE-Nrf2 luciferáza” využíva imortalizovanú adherentnú bunkovú líniu získanú z ľudských keratinocytov HaCaT transfektovaných stabilne so zvoleným plazmidom. Táto bunková línia obsahuje gén luciferázy s transkripciou kontrolovanou konštitutívnym promotérom zlúčeným s prvkom ARE z génu o ktorom je známe, že sa vyznačuje zvýšenou reguláciou vyvolanou kontaktnými senzibilizátormi (25) (26). Signalizácia luciferázy je výsledkom aktivácie endogénnych Nrf2 dependentných génov vyvolanej senzibilizátormi, pričom bola preukázaná závislosť signalizácie luciferázy v rekombinantnej bunkovej línii od Nrf2 (27). To umožňuje kvantitatívne merania (luminiscenčnou detekciou) indukcie génu luciferázy použitím dobre známych luminiscenčných substrátov s obsahom luciferázy, ktoré sú ukazovateľom aktivity transkripčného faktora Nrf2 v bunkách následkom expozície účinkom elektrofilných látok.
                     Testované chemikálie sa v skúške KeratinoSens™ považujú za pozitívne, ak vyvolajú takú štatisticky významnú indukciu aktivity luciferázy presahujúcu stanovený limit [t. j. viac ako 1,5-násobne alebo o 50 %) do výšky definovanej koncentrácie, ktorá významne neovplyvní životaschopnosť buniek (t. j. menej ako 1 000 μM a pri koncentrácii, ktorá zaručuje životaschopnosť buniek nad 70 % (9) (12)]. Na tento účel sa stanoví maximálny násobok indukcie aktivity luciferázy v porovnaní s (negatívnou) kontrolou s rozpúšťadlom (Imax). Okrem toho, keďže bunky sú vystavené pôsobeniu série koncentrácií testovaných chemikálií, by sa koncentrácia potrebná na účely štatisticky významnej indukcie aktivity luciferázy, ktorá prekročí limitnú hodnotu (t. j. hodnotu EC1,5) mala interpolovať z krivky závislosti reakcie od dávky (pozri výpočty v bode 32). Nakoniec by sa mali vykonať paralelné merania cytotoxicity, aby sa posúdilo, či sú indukčné hodnoty aktivity luciferázy pod úrovňou cytotoxických koncentrácií.
                     Pred rutinným použitím skúšky ARE-Nrf2 luciferáza, ktorá zodpovedá požiadavkám tejto testovacej metódy, by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť použitím desiatich chemikálií na preukázanie spôsobilosti uvedených v dodatku 2.
                     Normy výkonnosti (28) sú k dispozícii na to, aby uľahčili validáciu nových alebo modifikovaných in vitro testovacích metód „ARE-Nrf2 luciferáza” podobných skúške KeratinoSens™ a umožnili včasnú úpravu tejto testovacej metódy pre ich zaradenie. Vzájomné uznávanie údajov (MAD) podľa dohody OECD je možné garantovať len v prípade testovacích metód validovaných podľa noriem výkonnosti v prípade, že tieto metódy boli preskúmané a zaradené do príslušných usmernení OECD na vykonávanie testov.
                     POSTUP
                     V súčasnosti existuje v rámci tejto testovacej metódy jediná vedecky overená metóda – skúška KeratinoSens™ (9) (12) (13) (14). Ku skúške KeratinoSens™ boli vypracované štandardné prevádzkové postupy a mali by sa používať pri zavádzaní a využívaní tejto testovacej metódy v laboratóriu (15). Laboratóriá ochotné zaviesť túto testovaciu metódu môžu získať rekombinovanú bunkovú líniu používanú pri skúške KeratinoSens™ uzavretím licenčnej zmluvy so spoločnosťou, ktorá túto testovaciu metódu vyvinula. V nasledujúcich bodoch sú opísané základné zložky a postupy pri testovacej metóde ARE-Nrf2 luciferáza.
                     
                        Príprava keratínocytových kultúr
                     
                     Mala by sa použiť transgénová bunková línia so stabilným reportérovým génom luciferázy kontrolovaným prvkom ARE (napr. bunková línia KeratinoSens™). Po prijatí sa bunky namnožia (napr. na 2 až 4 pasáže) a skladujú zmrazené ako homogénny materiál. Bunky z tohto uskladneného materiálu sa namnožia na maximálny počet pasáží (t. j. 25 v prípade KeratinoSens™) a podrobia rutinnému testovaniu použitím vhodného udržiavacieho média (v prípade KeratinoSens™ ide o DMEM s obsahom séra a geneticínu).
                     Na účely testovania by bunky mali byť z 80 – 90 % konfluentné, pričom treba dbať na to, aby nikdy nedošlo k úplnej konfluencii. Deň pred testovaním sa bunky odoberú a rozdelia na platničky s 96 jamkami (v prípade KeratinoSens™ pripadá na jednu jamku 10 000 buniek). Treba dbať na to, aby pri dávkovaní nedošlo k sedimentácii buniek a bunky boli do jednotlivých jamiek rozdelené rovnomerne. V opačnom prípade môžu jednotlivé jamky vykazovať výrazne odlišné hodnoty. Pri každom opakovaní sa na meranie aktivity luciferázy použijú tri replikáty, pričom jeden paralelný replikát sa použije na skúšku životaschopnosti buniek.
                     
                        Príprava testovanej chemikálie a kontrolných látok
                     
                     Testovaná chemikália a kontrolné látky sa pripravujú v deň testovania. V prípade skúšky KeratinoSens™ sa testované chemikálie rozpustia v dimetylsulfoxide (DMSO) na konečnú želanú koncentráciu (napr. 200 mM). Roztoky DMSO možno považovať za samosterilizujúce, preto nie je potrebná žiadna sterilná filtrácia. Testovaná chemikália, ktorá nie je rozpustná v DMSO, sa rozpustí v sterilnej vode alebo kultivačnom médiu a roztoky sa sterilizujú napr. filtráciou. V prípade testovanej chemikálie, ktorá nemá definovanú molekulovú hmotnosť (MH), sa pripraví zásobný roztok s koncentráciou (40 mg/ml alebo 4 hm. %), ktorá je pre skúšku KeratinoSens™ štandardná. Použitie iných rozpúšťadiel ako DMSO, voda alebo kultivačné médium treba náležite zdôvodniť.
                     Zo zásobných roztokov DMSO testovanej chemikálie sa extrakt sériovo riedi použitím DMSO tak, aby sa získalo 12 základných koncentrácií testovanej chemikálie (od 0,098 do 200 mM pri skúške KeratinoSens™). V prípade testovanej chemikálie, ktorá nie je rozpustná v DMSO, dochádza k riedeniu na získanie základných koncentrácií použitím sterilnej vody alebo sterilného kultivačného média. Nezávisle od použitého rozpúšťadla sa základné koncentrácie ďalej 25-krát zriedia v kultivačnom médiu s obsahom séra a nakoniec sa upravia ďalším 4-násobným faktorom riedenia tak, aby bol rozsah konečných koncentrácií testovanej chemikálie pri skúške KeratinoSens™ v rozmedzí od 0,98 do 2 000 μM. Môžu sa použiť aj alternatívne koncentrácie (napr. v prípade cytotoxicity alebo slabej rozpustnosti), ak sa zdôvodnia.
                     Negatívna kontrola (s rozpúšťadlom) používaná pri skúške KeratinoSens™ je DMSO (CAS č. 67-68-5, ≥ 99 % čistoty), ktorá sa dávkuje do šiestich jamiek na každej platničke. Prejde rovnakým riedením ako v prípade základných koncentrácií, ktorý je opísaný v bode 22, a to tak, aby výsledná negatívna kontrola (s rozpúšťadlom) bola 1 %, pričom je o nej známe, že neovplyvňuje životaschopnosť buniek a má rovnakú koncentráciu ako DMSO zistenú v testovanej chemikálii a pozitívnej kontrole. V prípade testovanej chemikálie nerozpustnej v DMSO, ktorá sa riedila vo vode, sa musí koncentrácia DMSO vo všetkých jamkách upraviť na 1 % tak, ako v prípade ostatných testovaných chemikálií a kontrolných látok.
                     Pozitívnou kontrolou používanou pri skúške KeratinoSens™ je aldehyd kyseliny škoricovej (CAS č. 14371-10-9, s čistotou ≥ 98 %), z ktorého sa v DMSO (zásobný roztok s koncentráciou 6,4 mM) pripravia série 5 základných koncentrácií v rozmedzí od 0,4 do 6,4 mM a zriedia postupom opísaným pri základných koncentráciách v bode 22 tak, aby sa konečná koncentrácia pozitívnej kontroly pohybovala od 4 do 64 μM. Môžu sa použiť aj iné pozitívne kontroly, najlepšie také, ktoré umožnia dosiahnuť hodnotu EC1,5 pri strednom rozsahu, ak existujú predchádzajúce údaje, z ktorých sa dajú odvodiť porovnateľné kritériá prijateľnosti vykonania testu.
                     
                        Použitie testovanej chemikálie a kontrolných látok
                     
                     Pri každej testovanej chemikálii a pozitívnej kontrole je potrebné vykonať jeden pokus na odvodenie prognózy (pozitívnej alebo negatívnej), ktorý pozostáva najmenej z dvoch nezávislých opakovaní s každým z troch replikátov (t. j. n = 6). Ak sa výsledky z dvoch nezávislých opakovaní nezhodujú, je potrebné vykonať tretie opakovanie s tromi replikátmi (t. j. n = 9). Každé nezávislé opakovanie sa vykoná v iný deň, s čerstvým zásobným roztokom testovaných chemikálií a s nezávisle odobratými bunkami. Bunky však môžu pochádzať z tej istej pasáže.
                     Po nadávkovaní opísanom v bode 20 sa bunky kultivujú 24 hodín v platničkách s 96 jamkami. Potom sa médium odstráni a nahradí čerstvým kultivačným médiom (v prípade skúšky KeratinoSens™ je to150 μl kultivačného média s obsahom séra bez geneticínu), do ktorého sa pridá 50 μl 25-násobne zriedenej testovanej chemikálie a kontrolných látok. Na každej platničke s jamkami sa nechá aspoň jedna jamka prázdna (bez buniek a bez ovplyvnenia), aby sa skontrolovali pozaďové hodnoty.
                     Ovplyvnené platničky s jamkami sa potom inkubujú 48 hodín pri teplote 37 ± 1 °C za prítomnosti 5 % CO 2 v prípade skúšky KeratinoSens™. Treba dbať na to, aby sa zabránilo vyparovaniu prchavých testovaných chemikálií a krížovej kontaminácii medzi jamkami s testovanými chemikáliami. napr. zakrytím platničiek fóliou pred ich inkubáciou.
                     
                        Merania aktivity luciferázy
                     
                     Na odčítanie správnych hodnôt luciferázy sú kľúčové tri faktory:
                     
                                 —
                              
                              
                                 výber citlivého luminometra,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 použitie misky s dostatočnou výškou, aby sa zabránilo miernej krížovej kontaminácii a
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 použitie substrátu luciferázy s dostatočným svetelným výkonom na zaručenie dostatočnej citlivosti a nízkej variability.
                              
                           Pred testovaním je potrebné skontrolovať vybavenie na vykonanie skúšky opísané v dodatku 3, aby sa zabezpečilo splnenie týchto troch bodov.
                     Po 48-hodinovej expozícii s testovanou chemikáliou a kontrolnými látkami pri skúške KeratinoSens™ sa bunky opláchnu fosfátovým tlmivým fyziologickým roztokom a na účely odčítania luminiscenčných hodnôt sa do každej jamky pridá pri izbovej teplote na 20 minút príslušný lyzačný tlmivý roztok.
                     Platničky s bunkovým lyzátom sa potom umiestnia do luminometra, ktorý je pri skúške KeratinoSens™ naprogramovaný tak, aby: i) do každej jamky pridal substrát luciferázy (t. j. 50 μl), ii) počkal 1 sekundu a iii) na 2 sekundy zlúčil aktivitu luciferázy. Ak sa použijú alternatívne nastavenia, napr. v závislosti od použitého modelu luminometra, mali by sa zdôvodniť. Okrem toho je možné použiť aj luminiscenčný substrát za predpokladu, že bol úspešne vykonaný pokus na kontrolu kvality opísaný v dodatku 3.
                     
                        Hodnotenie cytotoxicity
                     
                     Pri skúške životaschopnosti buniek KeratinoSens™ sa médium po 48 hodinách expozície nahradí čerstvým médiom s obsahom MTT, t. j. 2,5-difenyl-3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)tetrazólium-bromidu alebo tiazolylovej modrej tetrazólium-bromidu; (CAS č. 298-93-1), pričom bunky sa inkubujú 4 hodiny pri teplote 37 °C v prítomnosti 5 % CO2. MTT médium sa potom odstráni a bunky sa cez noc lyzujú (napr. pridaním 10 % roztoku SDS do každej jamky). Po pretrepaní sa fotometrom zmeria absorpcia pri 600 nm.
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Hodnotenie údajov
                     
                     Pri skúške KeratinoSens™ sa vypočítavajú tieto parametre:
                     
                                 —
                              
                              
                                 hodnota maximálneho priemerného násobku indukcie aktivity luciferázy (Imax) pozorovaná pri každej koncentrácii testovanej chemikálie a pozitívnej kontroly;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 hodnota EC1,5 predstavujúca koncentráciu, pri ktorej dochádza k indukcii aktivity luciferázy prekračujúcej limitnú hodnotu 1,5-násobku (t. j. 50 % zvýšenú aktivitu luciferázy) a
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 hodnoty koncentrácie IC50 a IC30 pre 50 % a 30 % zníženie životaschopnosti buniek.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Násobok indukcie aktivity luciferázy sa vypočíta podľa rovnice 1, a celkový maximálny násobok indukcie (Imax) sa vypočíta ako priemer z jednotlivých opakovaní.
                              
                           
                        Rovnica 1:
                     
                     
                        
                     kde
                     
                                 Lsample
                                 
                              
                              
                                 je hodnota luminiscencie odčítaná v jamke s testovanou chemikáliou
                              
                           
                                 Lblank
                                 
                              
                              
                                 je hodnota luminiscencie odčítaná v „slepej“ jamke, t. j. bez buniek a ovplyvnenia
                              
                           
                                 Lsolvent
                                 
                              
                              
                                 je hodnota priemernej luminiscencie odčítaná v jamkách obsahujúcich bunky a (negatívnu) kontrolu s rozpúšťadlom
                              
                           hodnota EC1,5 sa vypočíta lineárnou interpoláciou podľa rovnice 2 a celková hodnota EC1,5 sa vypočíta ako geometrický priemer jednotlivých opakovaní.
                     
                        Rovnica 2:
                     
                     
                        
                     kde
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 je najnižšia koncentrácia v μM s viac ako 1,5-násobnou indukciou
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 je najvyššia koncentrácia v μM s menej ako 1,5-násobnou indukciou
                              
                           
                                 Ia
                                 
                              
                              
                                 je násobok indukcie meraný pri najnižšej koncentrácii s viac ako 1,5-násobnou indukciou (priemer troch jamiek s replikátmi)
                              
                           
                                 Ib
                                 
                              
                              
                                 je násobok indukcie meraný pri najnižšej koncentrácii s menej ako 1,5-násobnou indukciou (priemer troch jamiek s replikátmi)
                              
                           Životaschopnosť sa vypočíta pomocou rovnice 3:
                     
                        rovnica 3:
                     
                     
                        
                     kde
                     
                                 Vsample
                                 
                              
                              
                                 je hodnota absorbancie MTT odčítaná v jamke s testovanou chemikáliou
                              
                           
                                 Vblank
                                 
                              
                              
                                 je hodnota absorbancie MTT odčítaná v „slepej“ jamke, t. j. bez buniek a ovplyvnenia
                              
                           
                                 Vsolvent
                                 
                              
                              
                                 je hodnota priemernej absorbancie MTT odčítaná v jamkách obsahujúcich bunky a (negatívnu) kontrolu s rozpúšťadlom
                              
                           hodnoty IC50 a IC30 sa vypočítajú lineárnou interpoláciou podľa rovnice 4 a celkové hodnoty IC50 a IC30 sa vypočítajú ako geometrický priemer jednotlivých opakovaní.
                     
                        rovnica 4:
                     
                     
                        
                     kde
                     
                                 X
                              
                              
                                 je percento zníženia pri koncentrácii, ktorá sa má vypočítať (50 a 30 v prípade IC50 a IC30)
                              
                           
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 je najnižšia koncentrácia v μM s viac ako x percentným znížením životaschopnosti
                              
                           
                                 Cb
                                 
                              
                              
                                 je najvyššia koncentrácia v μM s menej ako x percentným znížením životaschopnosti
                              
                           
                                 Va
                                 
                              
                              
                                 je percento životaschopnosti pri najnižšej koncentrácii s viac ako x percentným znížením životaschopnosti
                              
                           
                                 Vb
                                 
                              
                              
                                 je percento životaschopnosti pri najvyššej koncentrácii s menej ako x percentným znížením životaschopnosti
                              
                           Pre každú koncentráciu vykazujúcu viac ako 1,5-násobnú indukciu aktivity luciferázy sa vypočíta štatistická významnosť (napr. dvojvýberovým Studentovým t-testom), pričom sa porovnajú hodnoty luminiscencie v prípade troch vzoriek replikátov s hodnotami luminiscencie v jamkách s negatívnou kontrolou s rozpúšťadlom, aby sa zistilo, či je indukcia aktivity luciferázy štatisticky významná (p < 0,05). Najnižšia koncentrácia s viac ako 1,5-násobnou indukciou aktivity luciferázy je hodnota, ktorá určuje hodnotu EC1,5. V každom prípade sa kontroluje, či je táto hodnota nižšia ako hodnota IC30, čo znamená, že ide o menej ako 30 % zníženie životaschopnosti buniek pri rozhodujúcej koncentrácii EC1,5.
                     Odporúča sa údaje vizuálne skontrolovať pomocou grafov. Ak nemožno vyvodiť jednoznačnú krivku závislosti reakcie od dávky, alebo ak má získaná krivka dve fázy (t. j. dvakrát došlo k prekročeniu limitu 1,5), pokus by sa mal zopakovať, aby sa overilo, či sa tak stalo z dôvodu, ktorý je špecifický pre danú testovanú chemikáliu, alebo ide o vedľajší účinok experimentu. Ak je dvojfázová odozva reprodukovateľná v nezávislom pokuse, zaznamená sa nižšia hodnota EC1,5 (t. j. koncentrácia, pri ktorej bol limit 1,5 prekročený po prvýkrát).
                     Vo výnimočných prípadoch, keď dôjde k štatisticky nevýznamnej indukcii prekračujúcej limit 1,5-násobku a následne k zvýšeniu koncentrácie pri štatisticky významnej indukcii, výsledky z opakovania sa považujú za platné a pozitívne, ak sa štatisticky významná indukcia prekračujúca limit 1,5 dosiahla pre necytotoxickú koncentráciu.
                     Nakoniec sa na základe vizuálnej kontroly krivky závislosti reakcie od dávky v prípade testovaných chemikálií vykazujúcich 1,5-násobnú alebo vyššiu indukciu už pri najnižších testovaných koncentráciách 0,98 μM, stanoví hodnota EC1,5, ktorá je nižšia ako 0,98.
                     
                        Kritériá prijateľnosti
                     
                     Pri použití skúšky KeratinoSens™ by mali byť splnené tieto kritériá prijateľnosti. Po prvé, indukcia aktivity luciferázy získaná s pozitívnou kontrolou – aldehydom kyseliny škoricovej – by mala byť štatisticky významná nad limitom 1,5 (napr. použitím T-testu) aspoň pri jednej z testovaných koncentrácií (od 4 do 64 μM).
                     Po druhé, hodnota EC1,5 by mala byť v rozmedzí dvoch štandardných odchýlok historického priemeru testovacieho zariadenia (napr. medzi 7 μM a 30 μM podľa súboru validačných údajov) a mala by sa pravidelne aktualizovať. Navyše hodnota priemernej indukcie v troch replikátoch v prípade aldehydu kyseliny škoricovej s koncentráciou 64 μM by mala byť medzi 2 a 8. Ak toto kritérium nie je splnené, mala by sa dôkladne skontrolovať závislosť reakcie od dávky aldehydu kyseliny škoricovej, pričom testy možno považovať za prijateľné iba v prípade, že je pri pozitívnej kontrole zrejmá jednoznačná závislosť reakcie od dávky pri rastúcej indukcii aktivity luciferázy.
                     Napokon by sa pri každom opakovaní pozostávajúcom zo 6 jamiek testovaných v triplikátoch mal dosiahnuť priemerný koeficient odchýlky odčítanej hodnoty luminiscencie v prípade negatívne kontroly DMSO (s rozpúšťadlom), ktorý je nižší ako 20 %. Ak sú odchýlky vyššie, výsledky by sa mali zrušiť.
                     
                        Interpretácia výsledkov a model prognózy
                     
                     Prognóza sa pri skúške KeratinoSens™ považuje za pozitívnu, ak sú splnené uvedené 4 podmienky v 2 z 2 alebo v tých istých 2 z 3 opakovaní. Inak sa prognóza považuje za negatívnu (obrázok 1):
                     
                                 1.
                              
                              
                                 hodnota Imax je vyššia ako (>) 1,5-násobok a štatisticky významne odlišná v porovnaní s (negatívnou) kontrolou s rozpúšťadlom (na základe stanovenia dvojvýberovým, nepárovým Studentovým t-testom);
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 životaschopnosť buniek je vyššia ako (>) 70 % pri najnižšej koncentrácii s viac ako 1,5-násobnou indukciou aktivity luciferázy (t. j. pri rozhodujúcej koncentrácii EC1,5);
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 hodnota EC1,5 je nižšia (<) ako 1 000 μM (alebo nižšia ako 200 μg/ml pri testovaných chemikáliách s nedefinovanou MH);
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 celková závislosť reakcie od dávky (alebo dvojfázová reakcia podľa bodu 33) je v prípade indukcie luciferázy jednoznačná.
                              
                           Ak sú pri niektorom z opakovaní splnené všetky tri prvé podmienky, ale nie je možné pozorovať vzťah medzi reakciou a dávkou pri indukcii luciferázy, tak by sa výsledok daného opakovania mal považovať za nejednoznačný a môže byť potrebné ďalšie testovanie (obrázok 1). Navyše aj negatívny výsledok získaný pri koncentráciách < 1 000 μM (alebo < 200 μg/ml v prípade testovaných chemikálií s nedefinovanou MH) by sa mal považovať za nejednoznačný (pozri bod 11).
                     
                        Obrázok 1
                     
                     
                        Model prognózy používaný pri skúške KeratinoSens™. Prognóza KeratinoSens™ by sa mala posudzovať v rámci IATA a v súlade s ustanoveniami bodov 9 a 11.
                     
                     
                        
                     V zriedkavých prípadoch môžu byť testované chemikálie, ktoré indukujú aktivitu luciferázy pri úrovniach veľmi blízkych cytotoxicite, pozitívne pri niektorých opakovaniach pri necytotoxických úrovniach (t. j. rozhodujúca koncentrácia EC1,5 je nižšia (<) ako IC30), ako aj pri iných opakovaniach iba pri cytotoxických úrovniach (t. j. rozhodujúca koncentrácia EC1,5 je vyššia (>) ako IC30). Tieto testované chemikálie sa musia opakovane testovať použitím podrobnejšej analýzy vzťahu medzi reakciou a dávkou s nižším faktorom riedenia (napr. 1,33 alebo √2 (= 1,41) násobné riedenie medzi jamkami), aby sa zistilo, či pri cytotoxických úrovniach došlo k indukcii alebo nie (9).
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jednozložková látka
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Chemická identifikácia, ako napríklad názov, resp. názvy podľa IUPAC alebo CAS, číslo(-a) CAS, kód SMILES alebo InChI, štrukturálny vzorec a/alebo iné identifikátory;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, rozpustnosť v DMSO, molekulová hmotnosť a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čistota, chemická identita nečistôt, ak je potrebná a prakticky realizovateľná atď.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v uplatniteľnom prípade úprava pred testovaním (napr. zahriatie, rozomletie),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovaná koncentrácia, resp. koncentrácie
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Mnohozložková látka, UVCB a zmes:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         pokiaľ možno čo najpodrobnejšia charakterizácia, napr. prostredníctvom chemickej identity (pozri vyššie), čistoty, kvantitatívneho výskytu a relevantných fyzikálno-chemických vlastností (pozri vyššie) zložiek v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, rozpustnosť v DMSO a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         molekulová hmotnosť alebo zjavná molekulová hmotnosť v prípade zmesí/polymérov známeho zloženia alebo iné informácie potrebné na vykonanie štúdie;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v uplatniteľnom prípade úprava pred testovaním (napr. zahriatie, rozomletie),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovaná koncentrácia, resp. koncentrácie
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Kontroly
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Pozitívna kontrola
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Chemická identifikácia, ako napríklad názov, resp. názvy podľa IUPAC alebo CAS, číslo(-a) CAS, kód SMILES alebo InChI, štrukturálny vzorec a/alebo iné identifikátory;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode, rozpustnosť v DMSO, molekulová hmotnosť a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti, v dostupnom rozsahu a podľa potreby;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čistota, chemická identita nečistôt, ak je potrebná a prakticky realizovateľná atď.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v uplatniteľnom prípade úprava pred testovaním (napr. zahriatie, rozomletie);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovaná koncentrácia, resp. koncentrácie;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         v uplatniteľnom prípade odkaz na predchádzajúce výsledky s pozitívnymi kontrolami dokazujúce vhodné kritériá prijateľnosti vykonania testu.
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Negatívna kontrola (nosič)
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Chemická identifikácia, ako napríklad názov, resp. názvy podľa IUPAC alebo CAS, číslo(-a) CAS a/alebo iné identifikátory;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čistota, chemická identita nečistôt, ak je potrebná a prakticky realizovateľná atď.;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzický vzhľad, molekulová hmotnosť a iné relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti v prípade, že sa použijú iné negatívne kontroly/nosiče ako tie uvedené v tejto testovacej metóde, a to v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podmienky skladovania a stability v dostupnom rozsahu;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         odôvodnenie výberu rozpúšťadla pre každú testovanú chemikáliu.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testovacej metódy
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Meno a adresa objednávateľa, testovacieho zariadenia a vedúceho štúdie;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitej testovacej metódy;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             bunková línia, podmienky jej skladovania a zdroj (napr. zariadenie, z ktorého boli získané);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             číslo pasáže a miera konfluencie buniek použitých na testovanie;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda stanovenia počtu buniek používaná na dávkovanie pred testovaním a opatrenia, ktorými sa zaručí rovnomerné rozdelenie buniek (pozri bod 20);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý luminometer (napr. typ/model) vrátane jeho nastavenia, použitého substrátu luciferázy a potvrdenie adekvátnych meraní luminiscencie merania založených na kontrolnom teste opísanom v dodatku 3;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             postup použitý na preukázanie spôsobilosti laboratória vykonávať danú testovaciu metódu (napr. testovaním chemikálií na preukázanie spôsobilosti) alebo na preukázanie reprodukovateľnosti výkonu testovacej metódy aj neskôr.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Postup vykonania testu
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Počet opakovaní a použitých replikátov;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácie testovaných chemikálií, postup ich použitia a použitý čas expozície (ak je iný ako odporúčaný)
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých kritérií hodnotenia a rozhodovania;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých kritérií prijateľnosti štúdie;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis všetkých zmien v postupe vykonania testu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Tabuľkový zápis hodnôt Imax, EC1,5 a životaschopnosti (t. j. hodnôt IC50, IC30) získaných pri testovanej chemikálii a pozitívnej kontrole pri každom opakovaní, ako aj hodnôt priemeru (Imax: priemer; hodnota EC1,5 a hodnoty životaschopnosti: geometrický priemer) a SD vypočítané použitím údajov z každého jednotlivého opakovania a údaj o ratingu testovanej chemikálie podľa modelu prognózy;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koeficient odchýlky získaný odčítaním hodnôt luminiscencie pri negatívnej kontrole pri každom pokuse;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             graf zobrazujúci krivky závislosti reakcie od dávky z hľadiska aktivity luciferázy a životaschopnosti;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v uplatniteľnom prípade opis všetkých relevantných pozorovaní.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozbor výsledkov
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Rozbor dosiahnutých výsledkov pri skúške KeratinoSens™;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             posúdenie výsledkov testovacej metódy v kontexte IATA, ak sú k dispozícii iné relevantné informácie.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Organizácia Spojených národov (OSN) (2013). Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals – GHS), piate prepracované vydanie, OSN New York a Ženeva, 2013. K dispozícii na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 OECD (2012). The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation Initiated by Covalent Binding to Proteins. Part 1: Scientific Evidence. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No. 168. OECD, Paríž.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Adler S., Basketter D., Creton S., Pelkonen O., van Benthem J., Zuang V., Andersen K.E., Angers-Loustau A., Aptula A., Bal-Price A., Benfenati E., Bernauer U., Bessems J., Bois F.Y., Boobis A., Brandon E., Bremer S., Broschard T., Casati S., Coecke S., Corvi R., Cronin M., Daston G., Dekant W., Felter S., Grignard E., Gundert-Remy U., Heinonen T., Kimber I., Kleinjans J., Komulainen H., Kreiling R., Kreysa J., Leite S.B., Loizou G., Maxwell G., Mazzatorta P., Munn S., Pfuhler S., Phrakonkham P., Piersma A., Poth A., Prieto P., Repetto G., Rogiers V., Schoeters G., Schwarz M., Serafimova R., Tähti H., Testai E., van Delft J., van Loveren H., Vinken M., Worth A., Zaldivar J.M. (2011). Alternative (non-animal) methods for cosmetics testing: current status and future prospects-2010. Archives of Toxicology 85, 367-485.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Kapitola B.42 tejto prílohy: Kožná senzibilizácia: lokálna skúška lymfatických uzlín.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Kapitola B.6 tejto prílohy: Kožná senzibilizácia.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Kapitola B.50 tejto prílohy: Kožná senzibilizácia: lokálna skúška lymfatických uzlín: DA.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Kapitola B.51 tejto prílohy: Kožná senzibilizácia: lokálna skúška lymfatických uzlín: BrdU-ELISA.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Natsch A. (2010). The Nrf2-Keap1-ARE Toxicity Pathway as a Cellular Sensor for Skin Sensitizers-Functional Relevance and Hypothesis on Innate Reactions to Skin Sensitizers. Toxicological Sciences 113, 284-292.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Emter R., Ellis G., Natsch A. (2010). Performance of a novel keratinocyte-based reporter cell line to screen skin sensitizers in vitro. Toxicology and Applied Pharmacology 245, 281-290.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Dinkova-Kostova A.T., Holtzclaw W.D., Kensler T.W. (2005). The role of Keap1 in cellular protective responses. Chem. Res. Toxicol. 18, 1779-1791.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Kansanen E., Kuosmanen S.M., Leinonen H., Levonen A.L. (2013). The Keap1-Nrf2 pathway: Mechanisms of activation and dysregulation in cancer. Redox Biol. 1(1), 45-49.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Natsch A., Bauch C., Foertsch L., Gerberick F., Normann K., Hilberer A., Inglis H., Landsiedel R., Onken S., Reuter H., Schepky A., Emter R. (2011). The intra- and inter-laboratory reproducibility and predictivity of the KeratinoSens assay to predict skin sensitizers in vitro: results of a ring-study in five laboratories. Toxicol. In Vitro 25, 733-744.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Natsch A., Ryan C.A., Foertsch L., Emter R., Jaworska J., Gerberick G.F., Kern P. (2013). A dataset on 145 chemicals tested in alternative assays for skin sensitization undergoing prevalidation. Journal of Applied Toxicology, 33, 1337-1352.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 EURL-ECVAM (2014). Recommendation on the KeratinoSens™ assay for skin sensitisation testing, 42 pp. K dispozícii na webovej lokalite: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSens™, 17 pp. K dispozícii na webovej lokalite: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Natsch A., Emter R., Ellis G. (2009). Filling the concept with data: integrating data from different in vitro and in silico assays on skin sensitizers to explore the battery approach for animal-free skin sensitization testing. Toxicol. Sci. 107, 106-121.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Ball N., Cagen S., Carrillo J.C., Certa H., Eigler D., Emter R., Faulhammer F., Garcia C., Graham C., Haux C., Kolle S.N., Kreiling R., Natsch A., Mehling A. (2011). Evaluating the sensitization potential of surfactants: integrating data from the local lymph node assay, guinea pig maximization test, and in vitro methods in a weight-of-evidence approach. Regul. Toxicol. Pharmacol. 60, 389-400.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Bauch C., Kolle S.N., Ramirez T., Eltze T., Fabian E., Mehling A., Teubner W., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. (2012). Putting the parts together: combining in vitro methods to test for skin sensitizing potentials. Regul. Toxicol. Pharmacol. 63, 489-504.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Jaworska J., Dancik Y., Kern P., Gerberick F., Natsch A. (2013). Bayesian integrated testing strategy to assess skin sensitization potency: from theory to practice. J Appl Toxicol. 33, 1353-1364.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 Andres E., Sa-Rocha V.M., Barrichello C., Haupt T., Ellis G., Natsch A. (2013). The sensitivity of the KeratinoSens™ assay to evaluate plant extracts: A pilot study. Toxicology In Vitro 27, 1220-1225.
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 Fabian E., Vogel D., Blatz V., Ramirez T., Kolle S., Eltze T., van Ravenzwaay B., Oesch F., Landsiedel R. (2013). Xenobiotic metabolizin enzyme activities in cells used for testing skin sensitization in vitro. Arch. Toxicol. 87, 1683-1969.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry and Biology 17, 646-657.
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 OECD (2012). BG1Luc Estrogen Receptor Transactivation Test Method for Identifying Estrogen Receptor Agonists and Antagonists. OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457. OECD, Paris.
                              
                           
                                 24.
                              
                              
                                 ECETOC (2003). Contact sensitization: Classification according to potency. European Centre for Ecotoxicology & Toxicology of Chemicals (Technical Report No. 87).
                              
                           
                                 25.
                              
                              
                                 Gildea L.A., Ryan C.A., Foertsch L.M., Kennedy J.M., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2006). Identification of gene expression changes induced by chemical allergens in dendritic cells: opportunities for skin sensitization testing. J. Invest. Dermatol., 126, 1813-1822.
                              
                           
                                 26.
                              
                              
                                 Ryan C.A., Gildea L.A., Hulette B.C., Dearman R.J., Kimber I., Gerberick G.F. (2004). Gene expressing changes in peripheral blood-derived dendritic cells following exposure to a contact allergen. Toxicol. Lett. 150, 301-316.
                              
                           
                                 27.
                              
                              
                                 Emter R., van der Veen J.W., Adamson G., Ezendam J., van Loveren H., Natsch A. (2013). Gene expression changes induced by skin sensitizers in the KeratinoSens™ cell line: Discriminating Nrf2-dependent and Nrf2-independent events. Toxicol. in vitro 27, 2225-2232.
                              
                           
                                 28.
                              
                              
                                 OECD (2015). Performance Standards for assessment of proposed similar or modified in vitro skin sensitisation ARE-Nrf2 luciferase test methods. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment N0 213, OECD, Paris.
                              
                           
                                 29.
                              
                              
                                 OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. OECD Environment, Health and Safety publications, Series on Testing and Assessment No.34. OECD, Paris, France.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 NAFTA (North American Free Trade Agreement) (2012). Technical Working Group on Pesticides – (Quantitative) Structure Activity Relationship ((Q)SAR) Guidance Document. 186 pp. http://www.epa.gov/oppfead1/international/naftatwg/guidance/qsar-guidance.pdf
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Presnosť
                           : Miera zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referenčnými hodnotami. Týka sa výkonnosti testovacej metódy a jedného z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často používa zameniteľne s pojmom „zhoda“ a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (29).
                        
                           
                              AOP (dráha nepriaznivého účinku)
                           : sled udalostí počnúc chemickou štruktúrou cieľovej chemikálie alebo skupiny podobných chemikálií vyvolaných molekulárnou iniciáciou až po výsledok in vivo, ktorý je predmetom záujmu (2).
                        
                           
                              ARE
                           : antioxidačný reakčný element (nazývaný aj EpRE – elektrofilný reakčný element) je reakčný element, ktorý sa v prípade mnohých cytoprotektívnych génov a génov fázy II nachádza v „upstream“ oblasti promótoru. Ak sa aktivuje prostredníctvom Nrf2, napomáha transkripčnú indukciu týchto génov.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Variačný koeficient
                           : týka sa variability, ktorá sa v prípade skupiny opakovaných údajov vypočítava vydelením štandardnej odchýlky od priemeru. Môže sa vynásobiť faktorom 100 a vyjadriť v percentách.
                        
                           
                              EC1,5
                              
                           : interpolovaná koncentrácia v prípade 1,5-násobnej indukcie luciferázy.
                        
                           
                              IC30
                              
                           : koncentrácia vyvolávajúca zníženie životaschopnosti buniek o 30 %.
                        
                           
                              IC50
                              
                           : koncentrácia vyvolávajúca zníženie životaschopnosti buniek o 50 %.
                        
                           
                              Nebezpečenstvo (ohrozenie)
                           : inherentná vlastnosť činidla, prípadne situácia, ktorá môže vyvolať nepriaznivé účinky pri expozícii organizmu, systému alebo (sub)populácie účinkom daného činidla.
                        
                           
                              IATA (integrovaný prístup k testovaniu a hodnoteniu)
                           : štruktúrovaný prístup používaný na identifikáciu (potenciálneho) nebezpečenstva, charakterizáciu nebezpečenstva (z hľadiska potencie) a/alebo hodnotenie bezpečnosti (potenciál/potencia a expozícia) chemikálie alebo skupiny chemikálií, ktorý strategicky integruje a porovnáva všetky relevantné údaje v záujme prijatia právneho rozhodnutia o potenciálnom nebezpečenstve a/alebo riziku a/alebo potrebe vykonania ďalších cielených, t. j. minimálnych testov.
                        
                           
                              Imax
                              
                           : maximálny faktor indukcie aktivity luciferázy v porovnaní s (negatívnou) kontrolou s rozpúšťadlom nameraný pri ktorejkoľvek koncentrácii testovanej chemikálie.
                        
                           
                              Keap1
                           : je senzorový proteín (Kelch-like ECH-associated protein 1), ktorý dokáže regulovať aktivitu Nrf2. Za podmienok bez indukcie vyhľadáva senzorový proteín Keap1 transkripčný faktor Nrf2, pričom dochádza k ubikvitinácii a proteolytickej degradácii v proteazóme. Kovalentná modifikácia rezíduí reakčného cysteínu v proteíne Keap1 spôsobená malými molekulami môže viesť k oddeleniu Nrf2 od Keap1 [8) (10) (11)].
                        
                           
                              Zmes
                           : zmes alebo roztok zložený z dvoch alebo viacerých látok, ktoré spolu nereagujú (1).
                        
                           
                              Jednozložková látka
                           : látka definovaná svojím kvantitatívnym zložením, v ktorej je hlavná zložka zastúpená v koncentrácii najmenej do 80 hm. %.
                        
                           
                              Viaczložková látka
                           : látka definovaná svojím kvantitatívnym zložením, v ktorej je viac ako jedna hlavná zložka zastúpená v koncentrácii ≥ 10 hm. % a < 80 hm. %. Viaczložková látka je výsledkom výrobného procesu. Rozdiel medzi zmesou a viaczložkovou látkou spočíva v tom, že zmes sa získava zmiešaním dvoch alebo viacerých látok bez toho, aby došlo k chemickej reakcii. Viaczložková látka je výsledkom chemickej reakcie.
                        
                           
                              Nrf2
                           : nukleárny faktor [(erythroid-derived 2)-like 2] je transkripčný faktor, ktorý je súčasťou antioxidačnej reakčnej dráhy. Ak Nrf2 nie je ubikvitinovaný, začne sa tvoriť v cytoplazme a presúva sa do jadra, kde sa v prípade mnohých cytoprotektívnych génov spája v „upstream“ oblasti promótoru s ARE a spustí ich transkripciu (8) (10) (11).
                        
                           
                              Pozitívna kontrola
                           : replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému, ktorý je ovplyvnený látkou, o ktorej je známe, že vyvoláva pozitívnu reakciu. Aby bolo možné vyhodnotiť variabilitu spätnej reakcie na pozitívnu kontrolu v čase, nesmie byť jej veľkosť extrémne silná.
                        
                           
                              Relevantnosť
                           : opis vzťahu testu k účinku, ktorý je predmetom záujmu a zmysluplnosti a užitočnosti testu na konkrétny účel. Ide o mieru, do akej test správne meria alebo prognózuje biologický účinok, ktorý je predmetom záujmu. Relevantnosť zohľadňuje presnosť (zhodu) testovacej metódy (29).
                        
                           
                              Spoľahlivosť
                           : meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda počas istého časového obdobia reprodukovateľne vykonávať v rámci laboratórií a medzi nimi navzájom, pričom sa používa ten istý protokol. Hodnotí sa vypočítaním vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovateľnosti a vnútrolaboratórnej opakovateľnosti (29).
                        
                           
                              Reprodukovateľnosť
                           : zhoda výsledkov získaných testovaním tej istej chemikálie s použitím toho istého skúšobného protokolu (pozri spoľahlivosť) (29).
                        
                           
                              Citlivosť
                           : podiel všetkých pozitívnych/aktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou. Ide o presnosť testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky a musí sa zohľadniť pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (29).
                        
                           
                              Kontrola s rozpúšťadlom/nosičom
                           : replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému okrem testovanej chemikálie, ale vrátane použitého rozpúšťadla. Používa sa na zistenie základnej spätnej reakcie vzoriek ovplyvnených testovanou chemikáliou rozpustenou v tom istom rozpúšťadle.
                        
                           
                              Špecifickosť
                           : podiel všetkých negatívnych/neaktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou. Ide o presnosť testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky a musí sa zohľadniť pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (29).
                        
                           
                              Látka
                           : chemické prvky a ich zlúčeniny v prírodnom stave alebo získané pomocou akéhokoľvek výrobného procesu vrátane všetkých prísad potrebných na uchovanie stability výrobku a všetkých nečistôt pochádzajúcich z použitého postupu, no s vylúčením všetkých rozpúšťadiel, ktoré je možné oddeliť bez toho, aby ovplyvnili stabilitu látky alebo zmenili jej zloženie (1).
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : pojem „testovaná chemikália“ sa používa ako odkaz na to, čo sa testuje.
                        
                           
                              Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií OSN (ďalej len „GHS OSN“)
                           : systém, ktorým sa navrhuje klasifikácia chemikálií (látok a zmesí) podľa štandardizovaných typov a miery fyzického, zdravotného a environmentálneho nebezpečenstva a označovania pomocou príslušných komunikačných prvkov, ako sú piktogramy, signalizačné výrazy, výstražné upozornenia, bezpečnostné upozornenia a karty bezpečnostných údajov, ktoré obsahujú informácie o ich škodlivých účinkoch z hľadiska ochrany ľudí (vrátane zamestnávateľov, pracovníkov, prepravcov, spotrebiteľov a záchranných zložiek) a životného prostredia (1).
                        
                           
                              UVCB
                           : látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.
                        
                           
                              Validná testovacia metóda
                           : testovacia metóda, ktorá sa na daný účel považuje za dostatočne relevantnú a spoľahlivú a ktorá je založená na vedecky podložených zásadách. Testovacia metóda nie je nikdy platná v absolútnom zmysle, ale len vo vzťahu k vymedzenému účelu (29).
                     
                     
                        Dodatok 2
                        CHEMIKÁLIE NA PREUKÁZANIE SPÔSOBILOSTI
                        
                           Kožná senzibilizácia in vitro: testovacia metóda „ARE-Nrf2 luciferáza“
                        
                        Pred rutinným použitím tejto testovacej metódy by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť tým, že správne získajú očakávanú prognózu výsledku skúšky KeratinoSens™ v prípade 10 chemikálií na preukázanie spôsobilosti odporúčaných v tabuľke 1 a získaním hodnôt EC1,5 a IC50, ktoré spadajú do príslušného referenčného rozsahu pre najmenej 8 z 10 látok na preukázanie spôsobilosti. Tieto látky na preukázanie spôsobilosti boli vybrané tak, aby reprezentovali rozsah reakcií na nebezpečenstvo kožnej senzibilizácie. Ďalším kritériom výberu bola komerčná dostupnosť, dostupnosť kvalitnej referenčnej vzorky in vivo a kvalitných údajov in vitro zo skúšky KeratinoSens™.
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Odporúčané chemikálie na preukazovanie technickej spôsobilosti pri skúške KeratinoSens™
                        
                        
                                    Chemikálie na preukázanie spôsobilosti
                                 
                                 
                                    CASRN
                                 
                                 
                                    Fyzikálna forma
                                 
                                 
                                    Prognóza in vivo
                                        (28)
                                    
                                 
                                 
                                    KeratinoSens™ Prognóza (29)
                                    
                                 
                                 
                                    EC1.5 (μM ) referenčné pásmo (30)
                                    
                                 
                                 
                                    IC50 (μM ) referenčné pásmo (30)
                                    
                                 
                              
                                    izopropanol
                                 
                                 
                                    67-63-0
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    kyselina salicylová
                                 
                                 
                                    69-72-7
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    kyselina mliečna
                                 
                                 
                                    50-21-5
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    1 000
                                 
                              
                                    glycerol
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    nespôsobuje senzibilizáciu
                                 
                                 
                                    negatívna
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    (E)-3-fenylprop-2-én-1-ol
                                 
                                 
                                    104-54-1
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor (slabý)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    25 – 175
                                 
                                 
                                    > 1 000 
                                 
                              
                                    etylénglykol-dimetakrylát
                                 
                                 
                                    97-90-5
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor (slabý)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    5 – 125
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    benzotiazol-2-tiol
                                 
                                 
                                    149-30-4
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor (mierny)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    25 – 250
                                 
                                 
                                    > 500
                                 
                              
                                    2-bróm-2-(brómmetyl)pentándinitril
                                 
                                 
                                    35691-65-7
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor (silný)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    < 20
                                 
                                 
                                    20 – 100
                                 
                              
                                    bis(4-hydroxy-N-metylanilínium)-sulfát
                                 
                                 
                                    55-55-0
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor (silný)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    20 – 200
                                 
                              
                                    1-chlór-2,4-dinitrobenzén
                                 
                                 
                                    97-00-7
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    senzibilizátor (extrémny)
                                 
                                 
                                    pozitívna
                                 
                                 
                                    < 12,5
                                 
                                 
                                    5 – 20
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           KONTROLA KVALITY MERANÍ LUMINISCENCIE
                        
                        
                           Základný pokus na zaručenie optimálnych meraní luminiscencie pri skúške KeratinoSens™
                        
                        Na získanie spoľahlivých výsledkov z luminometra sú kľúčové tieto tri faktory:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    dostatočná citlivosť poskytujúca stabilné pozadie v kontrolných jamkách;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    bez gradientu na platničke z dôvodu dlhého odčítavania a
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    žiadna svetelná kontaminácia susedných jamiek spôsobená silne aktívnymi jamkami.
                                 
                              Pred testom sa odporúča overiť zloženie kontrolnej štruktúry platničky spôsobom opísaným nižšie (trojnásobnou analýzou), aby sa zaručila primeranosť meraní luminiscencie.
                        
                           Zloženie štruktúry platničky pri prvom cvičnom pokuse
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                              
                                    A
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    B
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    C
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    
                                       D
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 0,98
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1,95
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 3,9
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 7,8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 15,6
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 31,25
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 62,5
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 125
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 250
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 500
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 1000
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       EGDMA 2000
                                    
                                 
                              
                                    E
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    F
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    G
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                              
                                    H
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    DMSO
                                 
                                 
                                    
                                       CA 4
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 8
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 16
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 32
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       CA 64
                                    
                                 
                                 
                                    
                                       slepá
                                    
                                 
                              
                           EGDMA= etylénglykol-dimetakrylát (CAS č.: 97-90-5) je silne induktívna chemikália
                        
                           CA= aldehyd kyseliny škoricovej, pozitívna referenčná vzorka (CAS č.: 104-55-2)
                        
                           Analýza kontroly kvality by mala preukázať:
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    jednoznačný vzťah medzi dávkou a reakciou v riadku D, s hodnotou Imax > 20-násobok nad pozadím (vo väčšine prípadov sa dosahujú hodnoty Imax v rozmedzí od 100 do 300);
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    žiadny vzťah medzi dávkou a reakciou v riadkoch C a E (žiadna z hodnôt indukcie nepresahuje 1,5; ideálne nie viac ako 1,3) vzhľadom na možnú svetelnú kontamináciu, najmä v blízkosti veľmi aktívnych jamiek v riadku EGDMA;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    žiaden štatisticky významný rozdiel medzi riadkami A, B, C, E, F a G. (t. j. žiadne bez gradientu na platničke) a
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    variabilita v ktoromkoľvek z riadkov A, B, C, E, F a G a v jamkách s DMSO v riadku H by mala byť nižšia ako 20 % (t. j. stabilné pozadie).
                                 
                              
                     B.61   Testovacia metóda úniku fluoresceínu na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 460 (2012). Testovacia metóda úniku fluoresceínu (Fluorescein Leakage – FL) je testovacia metóda in vitro, ktorú je za určitých okolností možné a pri určitých obmedzeniach použiť na klasifikáciu chemikálií (látok a zmesí) ako očných žieravín a silne dráždivých látok tak, ako sú definované v Globálnom harmonizovanom systéme klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie spojených národov (OSN) (kategória 1), v nariadení (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (CLP) (31) (kategória 1) a Agentúrou na ochranu životného prostredia USA (EPA) (kategória I) (1) (2). Na účely tejto testovacej metódy sa za silne dráždivé látky považujú chemikálie spôsobujúce po podaní testovanej chemikálie poškodenie očného tkaniva, ktoré je do 21 dní nezvratné, alebo spôsobujúce vážne fyzické zhoršenie zraku, pričom očné žieraviny sú chemikálie, ktoré spôsobujú nezvratné poškodenie očného tkaniva. Tieto chemikálie sú klasifikované GHS OSN v kategórii 1, CLP EÚ v kategórii 1 alebo EPA USA v kategórii I.
                     Zatiaľ čo testovacia metóda FL sa nepovažuje za validnú a plnohodnotnú náhradu testu očí králikov in vivo, odporúča sa používať ako súčasť stratégie viacúrovňového testovania na účely klasifikácie a označovania regulačnými orgánmi. Preto sa FL odporúča ako prvý krok v rámci prístupu zhora nadol na zisťovanie očných žieravín/silne dráždivých látok, konkrétne v prípade obmedzených druhov chemikálií (t. j. látok a zmesí, ktoré sú rozpustné vo vode) (3) (4).
                     V súčasnosti je všeobecne akceptovaný fakt, že v blízkej budúcnosti nebude existovať žiaden test podráždenia očí in vitro, ktorým by bolo možné nahradiť očný test in vivo [TM B.5 (5)] umožňujúci prognózy naprieč celým spektrom dráždivosti v rámci jednotlivých chemických tried. Je však možné, že strategické kombinácie viacerých alternatívnych testovacích metód v rámci (viacúrovňovej) stratégie testovania dokážu očný test in vivo nahradiť (4). Prístup zhora nadol (4) je navrhnutý tak, aby sa použil vo chvíli, keď je možné (na základe dostupných informácií) predpokladať, že daná chemikália bude mať vysokodráždivý potenciál.
                     Na základe modelu prognózy podrobne opísaného v bode 35 dokáže testovacia metóda FL identifikovať chemikálie v určitej sfére použitia ako očné žieraviny/silne dráždivé látky (GHS OSN kategória 1; CLP EÚ, kategória 1; US EPA kategória I) bez ďalšieho testovania. To isté sa predpokladá v prípade zmesí, hoci zmesi neboli pri validácii použité. Preto je možné testovaciu metódu FL použiť na zistenie podráždenia očí/žieravosti chemikálií po tom, čo sa realizovala stratégia postupného testovania v rámci testovacej metódy B.5 (5). Chemikáliu, ktorá nemá prognózu očnej žeriaviny alebo silne dráždivej látky pri testovacej metóde FL, však bude potrebné podrobiť testu jednou alebo viacerými dodatočnými testovacími metódami (in vitro a/alebo in vivo), ktoré sú schopné presne určiť i) chemikálie, ktoré sú ako očné žieraviny/silne dráždivé látky pri metóde FL falošne negatívne in vitro (GHS OSN kategória 1; CLP EÚ, kategória 1; US EPA kategória I); ii) chemikálie, ktoré nie sú klasifikované ako žieravé/dráždivé pre oči (GHS OSN bez kategórie; CLP EÚ bez kategórie; US EPA kategória IV); a/alebo iii) chemikálie, ktoré sú mierne/slabo dráždivé pre oči (GHS OSN kategórie 2A a 2B; CLP EÚ, kategória 2; US EPA kategórie II a III).
                     Účelom tejto metódy je opísať postupy hodnotenia potenciálnej očnej žieravosti alebo silnej dráždivosti testovanej chemikálie, ktorá sa meria jej schopnosťou spôsobiť poškodenie nepriepustnej súvislej monovrstvy epitelu. Integrita medziepitelovej priepustnosti je základnou funkciou epitelov, ktoré nájdeme napríklad v spojivke a rohovke. Medziepitelovú priepustnosť kontroluje niekoľko tesných spojov (zonula occludens). Ukázalo sa, že zvyšovanie priepustnosti epitelu rohovky in vivo súvisí s rozsahom zápalu a poškodenia povrchu, ku ktorým dochádza narastajúcim podráždením očí.
                     V testovacej metóde FL sa toxické účinky po krátkodobej expozícii testovanej chemikálii merajú zvýšením priepustnosti nátrium-fluoresceínu cez monovrstvu epitelu Madinových-Darbyho buniek v psích obličkách (MDCK) kultivovaných na priepustných inzertoch. Pozorované množstvo úniku fluoresceínu je úmerné miere chemicky vyvolaného poškodenia tesných spojov, desmozomálnych spojov a bunkových membrán a môže sa použiť na odhad potenciálnej očnej toxicity testovanej chemikálie. V dodatku 1 je obrázok MDCK buniek pestovaných na inzertnej membráne na účely testovacej metódy FL.
                     Definície sú uvedené v dodatku 2.
                     ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                     Táto testovacia metóda vychádza z protokolu INVITTOX č. 71 (6), ktorý bol hodnotený prostredníctvom medzinárodnej validačnej štúdii realizovanej Európskym centrom pre validáciu alternatívnych metód (ECVAM), v spolupráci s americkým Medziagentúrnym koordinačným výborom pre validáciu alternatívnych metód (ICCVAM) a japonským Centrom pre validáciu alternatívnych metód (JaCVAM).
                     Testovacia metóda FL sa neodporúča na identifikáciu chemikálií, ktoré by sa mali klasifikovať ako slabé/mierne dráždivé alebo chemikálií (látok a zmesí), ktoré by nemali byť klasifikované v kategórií očná dráždivosť (t. j. GHS OSN kategória 2A/2B, resp. bez kategórie; CLP EÚ kategória 2, resp. bez kategórie; US EPA kategórie II/III/IV), ako to vyplýva z validačnej štúdie (3) (7).
                     Táto testovacia metóda sa používa iba v prípade chemikálií (látok a zmesí) rozpustných vo vode. Použitím testovacej metódy FL je možné vo všeobecnosti správne predpovedať potenciál spôsobovať vážne podráždenie očí v prípade chemikálií rozpustných vo vode a/alebo ak toxický účinok nie je ovplyvnený riedením (7). Aby bolo možné charakterizovať chemikáliu ako vo vode rozpustnú v experimentálnych podmienkach, mala by byť rozpustná v sterilnom Hanksovom vyváženom soľnom roztoku (HBSS) s koncentráciou ≥ 250 mg/ml (jedna dávka nad hraničnú hodnotu 100 mg/ml), s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene. Ak je však chemikália rozpustná pri koncentrácii pod 100 mg/ml a pri tejto koncentrácii už spôsobuje 20 % indukciu FL (t. j. FL20 < 100 mg/ml), možno ju stále klasifikovať ako chemikáliu GHS OSN kategórie 1 alebo US EPA kategórie I.
                     Zistené obmedzenia tejto testovacej metódy vylučujú zo sféry jej použitia silné kyseliny a zásady, bunkové fixatíva a vysokoprchavé chemikálie. Tieto chemikálie majú mechanizmy, ktoré sa nemerajú testovacou metódou FL, napr. rozsiahla koagulácia, zmydelnenie alebo špecifické mechanizmy chemickej reaktívnosti. Ostatné zistené obmedzenia tejto testovacej metódy vychádzajú z výsledkov prognostických možností v prípade farebných a viskóznych testovaných chemikálií (7). Predpokladá sa, že oba typy chemikálií sa po krátkodobej expozícii len ťažko odstraňujú z monovrstvy a že prognózy výsledkov tejto testovacej metódy možno vylepšiť zvýšeným počtom použitých cyklov umývania. Chemikálie v tuhej forme rovnomerne rozptýlené v kvapaline majú tendenciu sa vyzrážať, a preto môže byť ťažké stanoviť konečnú koncentráciu v bunkách. Keď sa chemikálie týchto chemických a fyzikálnych tried z databázy vylúčia, presnosť testovacej metódy FL v rámci klasifikačných systémov EÚ, US EPA a GHS OSN sa podstatne zlepší (7).
                     Vzhľadom na účel tejto testovacej metódy (ktorým je identifikovať očné žieraviny/silne dráždivé látky) nie sú miery falošnej negativity (pozri bod 13) rozhodujúce, keďže tieto chemikálie by sa (v závislosti od požiadaviek regulačných orgánov) následne podrobili iným primerane validovaným testom in vitro alebo testom na králikoch použitím stratégie postupného testovania s prihliadnutím na závažnosť dôkazov (5) (pozri tiež body 3 a 4).
                     Ostatné zistené obmedzenia testovacej metódy FL sú založené na miere falošných negatívnych a falošne pozitívnych výsledkov. Ak sa použije ako prvý krok v rámci prístupu zhora nadol s cieľom identifikovať vo vode rozpustné očné žieraviny/silne dráždivé látky a zmesi (GHS OSN kategória 1; CLP EÚ, kategória 1; US EPA kategória I), miera falošnej pozitivity sa v prípade testovacej metódy FL pohybovala od 7 % (7/103; GHS OSN a CLP EÚ) do 9 % (9/99; US EPA) a miera falošnej negativity od 54 % (15/28; US EPA) do 56 % (27/48; GHS OSN a CLP EÚ) v porovnaní s výsledkami in vivo. Chemické skupiny vykazujúce falošné pozitívne a/alebo falošné negatívne výsledky pri testovacej metóde FL tu nie sú definované.
                     Určité technické obmedzenia sú špecifické pre kultúru MDCK buniek. Tesné spoje, ktoré blokujú prechod nátrium-fluoresceinového farbiva monovrstvou, sú čoraz viac oslabované rastúcim počtom bunkových pasáží. Neúplné usporiadanie tesných spojov vedie k zvýšeniu FL v neovplyvnenej kontrole. Preto je dôležité stanoviť najvyššiu prípustnú mieru úniku v neovplyvnených kontrolách (pozri bod 38: 0 % úniku). Pri všetkých testoch in vitro existuje možnosť, že časom dôjde k transformácií buniek, a preto je nevyhnutné stanoviť pri týchto skúškach rozsah počtu pasáží.
                     Existujúce sféry použiteľnosti možno v niektorých prípadoch rozšíriť, ale až po analýze rozšíreného súboru údajov o skúmaných testovaných chemikáliách, najlepšie získaného testovaním (3). Táto testovacia metóda sa bude zodpovedajúcim spôsobom aktualizovať, keďže sa posudzujú nové informácie a údaje.
                     V každom laboratóriu, ktoré prvýkrát túto skúšku zavádza, by sa mali použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 3. Laboratóriá môžu tieto chemikálie použiť na preukázanie svojej technickej spôsobilosti vykonávať testovaciu metódu FL na účely klasifikácie nebezpečenstva podľa právnych predpisov.
                     PRINCÍP TESTU
                     Testovacia metóda FL je skúška in vitro založená na cytotoxicite a funkcii buniek, ktorá sa vykonáva na súvislej monovsrtve trubicovitých epitelových buniek MDCK CB997 pestovaných na polopriepustných inzertoch a predstavujúcich model stavu epitelu rohovky in vivo bez rozmnožovania. Bunková línia MDCK je stabilná a vytvára tesné a desmozomálne spoje podobné tým, ktoré nájdeme na apikálnej strane epitelov spojivky a rohovky. Tesné a desmozomálne spoje in vivo zabraňujú prenikaniu rozpustených látok a cudzorodých materiálov do epitelu rohovky. Strata medziepitelovej nepriepustnosti z dôvodu poškodenia tesných a desmozomálnych spojov je jedným z prvých príznakov chemicky vyvolaného podráždenia očí.
                     Testovaná chemikália sa aplikuje na súvislú vrstvu buniek pestovaných na apikálnej strane inzertu. Obyčajne sa použije krátka, minútová expozícia, aby sa zohľadnila bežná miera klírensu v prípade ľudskej expozície. Výhodou krátkej expozície je, že látky na báze vody a zmesi je možné testovať čisté, ak sa po expozícii dajú ľahko odstrániť. To umožní priamejšie porovnanie výsledkov s chemickými účinkami na ľudí. Testovaná chemikália sa potom odstráni a netoxické, vysoko fluorescenčné nátrium-fluoresceínové farbivo sa na 30 minút pridá na apikálnu stranu monovrstvy. Poškodenie tesných spojov spôsobené testovanou chemikáliou sa určí podľa množstva fluoresceínu, ktorý unikne vrstvou buniek za určitý vopred stanovený čas.
                     Množstvo nátrium-fluoresceínového farbiva, ktoré prenikne monovrstvou a inzertnou membránou do fixného objemu roztoku v jamke (s únikom nátrium-fluoresceínového farbiva), sa určí spektrofluorometrickým meraním koncentrácie fluoresceínu v jamke. Množstvo uniknutého fluoresceínu (FL) sa vypočíta podľa údajov fluorescenčnej intenzity (FI) odčítaných z dvoch kontrol: zo slepej kontroly a z kontroly s maximálnym únikom. V porovnaní s týmito kontrolami sa potom pre každý súbor koncentrácií testovanej chemikálie vyjadrí percento úniku, a teda rozsah poškodenia. Následne sa vypočíta hodnota FL20 (t. j. koncentrácia, ktorá spôsobí 20 % úniku fluoresceínu v porovnaní s hodnotami zaznamenanými na neovplyvnenej súvislej monovrstve a inzertoch bez buniek). Hodnota FL20 (v mg/ml) sa použije v prognostickom modeli na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok (pozri bod 35).
                     Obnoviteľnosť je významnou súčasťou profilu toxicity testovanej chemikálie a takisto sa posudzuje testom podráždenia očí in vivo. Z predbežných analýz vyplynulo, že údaje o obnoviteľnosti (do 72 hodín po expozícii účinkom chemikálie) by mohli zvýšiť prognostický potenciál protokolu 71 INVITTOX, je však potrebné vykonať ďalšie hodnotenie a získať dodatočné údaje, najlepšie ďalším testovaním (6). Táto testovacia metóda sa bude zodpovedajúcim spôsobom aktualizovať, keďže sa posudzujú nové informácie a údaje.
                     POSTUP
                     
                        Príprava bunkovej monovrstvy
                     
                     Monovrstva zložená z buniek MDCK CB997 sa pripraví použitím subkonfluentných buniek pestovaných v kultivačných bankách s DMEM/zmes živín F12 (1x koncentrát s L-glutamínom, 15 mM HEPES, vápnik (v koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a 10 % tepelne inaktivovaný FCS, FBS). Je dôležité poznamenať, že všetky médiá/roztoky používané počas skúšky FL by mali obsahovať vápnik v koncentrácii medzi 1,8 mM (200 mg/l) a 1,0 mM (111 mg/l), aby sa zaručila tvorba a celistvosť tesných spojov. Rozsah počtu bunkových pasáží by sa mal kontrolovať, aby sa zaručila rovnomerná a reprodukovateľná tvorba tesných spojov. Odporúča sa, aby boli bunky v rozmedzí od 3 do 30 pasážovaní po rozmrazení, pretože bunky v tomto rozmedzí pasážovania majú podobnú funkčnosť, čo zvyšuje reprodukovateľnosť výsledkov skúšky.
                     Pred vykonaním testovacej metódy FL sa bunky oddelia od banky trypsinizáciou, centrifugujú sa a primeraný počet buniek sa nasadí do inzertov umiestnených v platničkách s 24 jamkami (pozri dodatok 1). K nasadeniu buniek by sa mali použiť inzerty s priemerom dvanásť mm, s membránou zo zmesi esterov celulózy, s hrúbkou 80 – 150 μm a veľkosťou pórov 0,45 μm. Pri validačnej štúdii boli použité inzerty Millicell-HA 12 mm. Vlastnosti typu inzertu a membrány sú dôležité, pretože môžu ovplyvniť rast buniek a chemické väzby. Určité typy chemikálií sa môžu viazať na inzertnú membránu Millicell-HA, čo môže ovplyvniť interpretáciu výsledkov. Ak sa použijú iné membrány, mali by sa na preukázanie ich rovnocennosti použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti (pozri dodatok 3).
                     Chemické väzby na inzertnú membránu sú bežnejšie v prípade katiónových chemikálií, ako napr. benzalkónium-chlorid, ktoré sú priťahované k nabitej membráne (7). Chemické väzby na inzertnú membránu môže zvyšovať čas chemickej expozície a spôsobiť nadhodnotenie toxického potenciálu chemikálie, no zároveň môžu fyzicky znížiť únik fluoresceínu cez inzert naviazaním farbiva na katiónovú chemikáliu spojenú s inzertnou membránou, čo spôsobí podhodnotenie toxického potenciálu chemikálie. To sa dá ľahko monitorovať vystavením samotnej membrány najvyššej koncentrácii testovanej chemikálie a následne pridaním farbiva s obsahom fluoresceínu sodného pri bežnej koncentrácii na štandardný čas (kontrola bez buniek). Ak dôjde k naviazaniu nátrium-fluoresceínového farbiva, inzertná membrána sa po zmytí testovaného materiálu javí ako žltá. Preto je nevyhnutné poznať väzobné vlastnosti testovanej chemikálie, aby bolo možné interpretovať vplyv chemikálie na bunky.
                     Nasadením buniek do inzertov by sa počas chemickej expozície mala vytvoriť súvislá monovrstva. Do každého inzertu by sa malo pridať 1,6 × 105 buniek (400 μl bunkovej suspenzie s hustotou 4 × 105 buniek/ml). Za týchto podmienok sa súvislá monovrstva v kultúre obyčajne vytvorí po 96 hodinách. Inzerty by sa mali pred nasadením vizuálne skontrolovať tak, aby sa zaručilo, že akékoľvek poškodenie zaznamenané pri vizuálnej kontrole uvedenej v bode 30 bolo spôsobené manipuláciou.
                     Bunkové kultúry MDCK by sa mali uchovávať v inkubátoroch vo zvlhčovanej atmosfére pri 5 % ± 1 % CO2 a 37 ± 1 °C. Bunky by nemali byť kontaminované baktériami, vírusmi, mykoplazmami ani hubami.
                     
                        Aplikácia testovaných a kontrolných chemikálií
                     
                     Pre každú pokusnú skúšku je potrebné pripraviť nový zásobný roztok testovanej chemikálie a použiť ho do 30 minút od prípravy. Testované chemikálie by sa mali pripravovať v HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene, aby sa zabránilo väzbe proteínov zo séra. Pred testom by sa mala skontrolovať rozpustnosť chemikálie pri 250 mg/ml v HBSS. Ak pri tejto koncentrácii vytvorí chemikália do 30 minút stabilnú suspenziu alebo emulziu (t. j. zostane jednotvárna a neusadí sa ani neoddelí do viac ako jednej fázy), je možné aj naďalej použiť HBSS ako rozpúšťadlo. Ak sa však chemikália pri tejto koncentrácii v HBSS nerozpustí, malo by sa zvážiť použitie iných testovacích metód ako FL. Použitie ľahkého minerálneho oleja ako rozpúšťadla v prípadoch, že sa chemikália v HBSS nerozpustí, by sa malo posudzovať s rezervou, keďže nie je k dispozícii dostatok údajov zaručujúcich výkonnosť skúšky FL v týchto podmienkach.
                     Všetky chemikálie, ktoré sa majú testovať, sa pripravia zo zásobného roztoku v sterilnom HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene pri piatich fixných hmotnostných koncentráciách: 1, 25, 100,250 mg/ml ako čistý alebo nasýtený roztok. Pri testovaní chemikálií v tuhej forme by sa mala doplniť aj veľmi vysoká koncentrácia 750 mg/ml. Chemikália s touto koncentráciou sa môže aplikovať na bunky pipetou s priamym posunutím. Ak sa zistí toxicita v rozmedzí od 25 do 100 mg/ml, mali by sa dvakrát otestovať tieto dodatočné koncentrácie: 1, 25, 50, 75 a 100 mg/ml. Hodnota FL20 sa odvodí z týchto koncentrácií za predpokladu, že boli splnené kritériá prijateľnosti.
                     Testované chemikálie sa aplikujú na súvislé monovrstvy buniek po odstránení kultivačného bunkového média a dvojnásobnom premytí sterilným, teplým (37 °C) HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene. Predtým sa vizuálne skontrolovali filtre, aby sa zistili už existujúce poškodenia, ktoré by mohli byť nesprávne pripísané možnej nezlučiteľnosti s testovanými chemikáliami. Pri každom pokuse by sa pri každej koncentrácii testovanej chemikálie a kontrol mali použiť aspoň tri replikáty. Po expozícii trvajúcej 1 minútu pri izbovej teplote by sa testovaná chemikália mala opatrne odstrániť odsatím, monovrstva by sa mala dvakrát premyť sterilným, teplým (37 °C) HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene a ihneď potom sa zmeria únik fluoresceínu.
                     Pri každom pokuse by sa mali súbežne použiť negatívne (NK) a pozitívne kontroly (PK), aby sa preukázalo, že celistvosť monovrstvy (NK) a citlivosť buniek (PK) sú v rámci stanoveného historického rozpätia prijateľnosti. Chemikália navrhovaná ako PK je Brij 35 (CAS č. 9002-92-0) pri 100 mg/ml. Táto koncentrácia by mala spôsobiť približne 30 % únik fluoresceínu (prijateľný rozsah úniku fluoresceínu 20 – 40 %, t. j. poškodenie bunkovej vrstvy). Chemikália navrhovaná ako NK je HBSS (neovplyvnená, slepá kontrola) s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene. Súčasťou každého pokusu by mala byť aj kontrola s maximálnym únikom, aby bolo možné vypočítať hodnoty FL20. Maximálny únik sa stanoví pomocou kontrolného inzertu bez buniek.
                     
                        Stanovenie priepustnosti fluoresceínu
                     
                     Ihneď po odstránení testovaných a kontrolných chemikálií sa do inzertov (napr. Millicell-HA) pridá 400 μl z 0,1 mg/ml roztoku nátrium-fluoresceínu [0,01 hm. % HBSS s obsahom vápnika (pri koncentrácii 1,0 – 1,8 mM) a bez fenolovej červene]. Kultúry sa nechajú odstáť 30 minút pri izbovej teplote. Na konci inkubácie fluoresceínom sa inzerty opatrne vyberú z každej jamky. Vykoná sa vizuálna kontrola všetkých filtrov a zaznamená sa každé poškodenie, ku ktorému mohlo dôjsť pri manipulácii.
                     V roztoku, ktorý zostal v jamkách po odstránení inzertov, sa vyčísli množstvo fluoresceínu, ktoré uniklo cez monovrstvu a inzert. Spektrofluorimetrom sa vykonajú merania pri excitačnej vlnovej dĺžke 485 nm a emisnej vlnovej dĺžke 530 nm. Citlivosť spektrofluorimetra by sa mala nastaviť tak, aby bol čo najvyšší číselný rozdiel medzi maximálnym FL (inzert bez buniek) a minimálnym FL (inzert so súvislou monovrstvou upravenou NK). Vzhľadom na rozdiely v používaných spektrofluorimetroch sa navrhuje, aby sa použila citlivosť, ktorá poskytne intenzitu fluorescencie > 4 000 pri kontrole s maximálnym únikom fluoresceínu. Maximálna hodnota FL by nemala byť vyššia ako 9 999. Maximálna intenzita úniku fluorescencie by mala byť v lineárnom rozsahu použitého spektrofluorimetra.
                     
                        Interpretácia výsledkov a model prognózy
                     
                     Množstvo FL je úmerné chemicky vyvolanému poškodeniu tesných spojov. Percento FL pri každej testovanej koncentrácii chemikálie sa vypočíta z hodnôt FL získaných v prípade danej testovanej chemikálie s prihliadnutím na hodnoty FL z NK (odčítané zo súvislej monovrstvy buniek upravenej NK) a kontroly s maximálnym únikom (odčítané ako množstvo FL cez inzert bez buniek).
                     Priemerná maximálna intenzita úniku fluorescencie = x
                     Priemerná 0 % intenzita úniku fluorescencie (NK) = y
                     Priemerný 100 % únik sa získa odpočítaním priemerného 0 % úniku od priemerného maximálneho úniku,
                     
                        t. j. x – y = z
                     Percento úniku pre každej fixnej dávke sa získa odpočítaním 0 % úniku od priemernej intenzity fluorescencie z troch meraných replikátov (m) a vydelením tejto hodnoty 100 % únikom, t. j. % FL = [(m – y)/z] × 100 %, kde:
                     
                                 m
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 priemerná intenzita fluorescencie z troch replikačných meraní pri danej koncentrácii
                              
                           
                                 % FL
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 percento fluoresceínu, ktoré unikne cez bunkovú vrstvu
                              
                           Na výpočet chemickej koncentrácie spôsobujúcej 20 % FL by sa mala použiť táto rovnica:
                     FLD = [(A – B)/(C – B)] × (MC – MB) + MB
                     
                     kde:
                     
                                 D
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 percento inhibície
                              
                           
                                 A
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % poškodenia (20 % únik fluoresceínu)
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % úniku fluoresceínu < A
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % úniku fluoresceínu > A
                              
                           
                                 MC
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrácia (v mg/ml) pre C
                              
                           
                                 MB
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 koncentrácia (v mg/ml) pre B
                              
                           Hraničná hodnota FL20 na predpovedanie správania chemikálií ako očných žieravín/silne dráždivých látok je:
                     
                                 FL20 (v mg/ml)
                              
                              
                                 GHS OSN C&L
                              
                              
                                 EÚ CLP C&L
                              
                              
                                 US EPA C&L
                              
                           
                                 ≤ 100
                              
                              
                                 kategória 1
                              
                              
                                 kategória 1
                              
                              
                                 kategória I
                              
                           
                                 C&L: klasifikácia a označovanie
                              
                           Testovacia metóda FL sa odporúča len na účely identifikácie vo vode rozpustných očných žieravín a silne dráždivých látok (GHS OSN kategória 1, EÚ CLP kategória 1 a US EPA kategória I) (pozri body 1 a 10).
                     Aby bolo možné identifikovať vo vode rozpustné chemikálie (látky a zmesi) (3) (6) (7) ako „spôsobujúce vážne poškodenie očí” (GHS OSN/EÚ CLP kategória 1) alebo ako „očná žieravina alebo silne dráždivá látka” (US EPA kategória I), testovaná chemikália by mala vykazovať hodnotu FL20 ≤ 100 mg/ml.
                     
                        Prijateľnosť výsledkov
                     
                     Priemerná maximálna hodnota úniku fluoresceínu (x) by mala byť vyššia ako 4 000 (pozri bod 31), priemerný 0 % únik (y) by mal byť ≤ 300 a priemerná hodnota 100 % úniku (z) by mala byť medzi 3 700 a 6 000.
                     Test sa považuje za prijateľný, ak pozitívna kontrola spôsobila 20 % až 40 % poškodenie bunkovej vrstvy (merané ako % úniku fluoresceínu).
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Údaje
                     
                     Pri každom pokuse by sa mali do tabuľky zapísať údaje z jednotlivých jamiek s replikátmi (napr. hodnoty intenzity fluorescencie a vypočítané percentuálne hodnoty FL pre každú testovanú chemikáliu vrátane klasifikácie). Okrem toho je potrebné pri každom pokuse zaznamenať v prípade každého merania replikátov aj priemerné hodnoty ± štandardné odchýlky.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované a kontrolné chemikálie
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Názov chemikálie (chemikálií), ako je štrukturálny názov, ktorý používa služba Chemical Abstracts Service (ďalej len 'CAS'), po ktorom nasledujú iné názvy, ak sú známe;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             číslo CAS chemikálie, ak je známe;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             čistota a zloženie látky alebo zmesi (v hmotnostných percentách), pokiaľ je táto informácia k dispozícii;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzikálno-chemické vlastnosti relevantné na vykonanie štúdie (napr. fyzikálny stav, prchavosť, pH, stabilita, rozpustnosť vo vode, chemická trieda);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             prípadná úprava testovaných/kontrolných chemikálií pred testovaním (napr. zahriatie, rozomletie);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podmienky skladovania.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Zdôvodnenie testovacej metódy a použitý protokol
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Sem by mali zahrnuté úvahy o sfére použiteľnosti a obmedzeniach testovacej metódy.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testu
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Opis použitého systému buniek vrátane osvedčenia o pravosti a stave mykoplazmy bunkovej línie;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobnosti o použitom testovacom postupe;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použitá koncentrácia (koncentrácie) testovanej látky;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dĺžka expozície účinkom testovanej chemikálie;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dĺžka inkubácie fluoresceínom;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis všetkých modifikácií testovacieho postupu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis použitých hodnotiacich kritérií.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odkaz na historické údaje daného modelu (napr. negatívne a pozitívne kontroly, referenčné chemikálie, ak existujú);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informácie o technickej spôsobilosti preukázanej laboratóriom.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Uvedenie údajov týkajúcich sa individuálnych testovaných chemikálií a kontrol pri každom pokuse a meraní každého replikátu (vrátane individuálnych výsledkov, priemerných hodnôt a štatistických odchýlok);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odvodená klasifikácia, resp. klasifikácie s prihliadnutím na použitý model prognózy a/alebo rozhodovacie kritériá;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis ďalších pozorovaných účinkov.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Diskusia o výsledkoch
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Jej súčasťou by mali byť úvahy o nejednoznačných záveroch (bod 35: FL20 > 100 mg/ml) a ďalšom testovaní.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií OSN (Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals – GHS), tretie prepracované znenie, OSN (2009), OSN New York a Ženeva. United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. K dispozícii na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 U.S. EPA (1996), Label Review Manual: 2nd Edition, EPA737-B-96-001, Washington DC: U.S. Environmental Protection Agency.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2009), Statement on the scientific validity of cytotoxicity/cell-function based in vitro assays for eye irritation testing.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Scott, L. et al. (2010), A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches, Toxicol. In Vitro 24, 1-9
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Kapitola B.5 tejto prílohy, Akútna žieravosť/dráždivosť pre oči
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 EC-ECVAM (1999), INVITOX Protocol 71: Fluorescein Leakage Test, Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM). K dispozícii na: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu]
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 EC-ECVAM (2008), Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34. OECD, Paris.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        
                           ZNÁZORNENIE RASTU MDCK BUNIEK NA INZERTNEJ MEMBRÁNE PRI TESTOVACEJ METÓDE FL
                        
                        Súvislá vrstva MDCK buniek vytvorená na polopriepustnej membráne inzertu. Inzerty sa umiestnia do jamiek 24-jamkových platničiek.
                        Obrázok bol prevzatý z: Wilkinson, P.J. (2006), Development of an in vitro model to investigate repeat ocular exposure, Ph.D. dizertačná práca, University of Nottingham, Spojené kráľovstvo.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Presnosť
                           : miera zhody výsledkov testovacej metódy s akceptovanými referenčnými hodnotami. Týka sa výkonnosti testovacej metódy a jedného z aspektov relevantnosti. Tento pojem sa často používa zameniteľne s pojmom „zhoda“ a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              EPA kategória I
                           : chemikálie, ktoré pôsobia ako žieraviny (vyvolávajúce nezvratné poškodenie očného tkaniva), príp. spôsobujú aj postihnutie rohovky alebo podráždenie, ktoré pretrváva viac ako 21 dní (2).
                        
                           
                              EÚ CLP (nariadenie (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí): zavádza v Európskej únii (EÚ) systém klasifikácie chemikálií (látok a zmesí) GHS OSN.
                        
                           
                              Miera falošne negatívnych nálezov
                           : podiel všetkých pozitívnych chemikálií, ktoré boli testovacou metódou nesprávne identifikované ako negatívne. Ide o jeden z ukazovateľov výkonnosti testovacej metódy.
                        
                           
                              Miera falošne pozitívnych nálezov
                           : podiel všetkých negatívnych chemikálií, ktoré boli testovacou metódou nesprávne identifikované ako pozitívne. Ide o jeden z ukazovateľov výkonnosti testovacej metódy.
                        
                           
                              FL20
                              
                           : hodnota, ktorú možno určiť stanovením koncentrácie, pri ktorej testovaná chemikália spôsobí 20 % únik fluoresceínu cez bunkovú vrstvu.
                        
                           
                              Únik fluoresceínu
                           : množstvo fluoresceínu merané spektrofluorometriou, ktoré prejde bunkovou vrstvou.
                        
                           
                              GHS [Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií Organizáciou Spojených národov (OSN)]
                           : systém, ktorým sa navrhuje klasifikácia chemikálií (látok a zmesí) podľa štandardizovaných typov a miery fyzického, zdravotného a environmentálneho nebezpečenstva a označovania pomocou príslušných komunikačných prvkov, ako sú piktogramy, signalizačné slová, výstražné upozornenia, bezpečnostné upozornenia a karty bezpečnostných údajov, ktoré obsahujú informácie o ich škodlivých účinkoch z hľadiska ochrany ľudí (vrátane zamestnávateľov, pracovníkov, prepravcov, spotrebiteľov a záchranných zložiek) a životného prostredia.
                        
                           
                              GHS kategória 1
                           : po aplikácii testovanej chemikálie na predný okraj oka spôsobí poškodenie tkaniva v oku alebo závažné fyzické zhoršenie zraku, ktoré nie je úplne zvratné do 21 dní po aplikácii.
                        
                           
                              Nebezpečenstvo (ohrozenie)
                           : inherentná vlastnosť činidla, prípadne situácia, ktorá môže vyvolať nepriaznivé účinky pri expozícii organizmu, systému alebo (sub)populácie účinkom daného činidla.
                        
                           
                              Zmes
                           : v kontexte GHS OSN ako zmes alebo roztok zložený z dvoch alebo viacerých látok, ktoré spolu nereagujú.
                        
                           
                              Negatívna kontrola
                           : neovplyvnený replikát, ktorý obsahuje všetky zložky testovacieho systému. Táto vzorka sa spracuje vzorkami ovplyvnenými testovanou chemikáliou, ako aj inými kontrolami s cieľom zistiť, či rozpúšťadlo a testovací systém na seba navzájom pôsobia.
                        
                           
                              Bez klasifikácie
                           : chemikálie, ktoré nie sú klasifikované v kategóriách 1, 2A alebo 2B GHS OSN, kategóriách 1 alebo 2 EÚ CLP EÚ alebo v kategóriách I, II alebo III US EPA ako látky dráždivé pre oči.
                        
                           
                              Chemikália žieravá pre oči
                           : a) chemikália, ktorá spôsobuje nezvratné poškodenie očného tkaniva; b) chemikálie klasifikované v kategórii 1 GHS OSN, kategórii 1 EÚ CLP alebo v kategórii I US EPA ako látky dráždivé pre oči.
                        
                           
                              Chemikália dráždivá pre oči
                           : a) chemikália, ktorá po aplikácii na predný okraj oka spôsobí v oku zvratnú zmenu; b) chemikálie klasifikované v kategóriách 2A alebo 2B GHS OSN, kategórii 2 EÚ CLP alebo v kategóriách II alebo III US EPA ako látky dráždivé pre oči.
                        
                           
                              Chemikália silne dráždivá pre oči
                           : a) chemikália, ktorá po aplikácii na predný okraj oka spôsobí poškodenie očného tkaniva, ktoré je do 21 dní po aplikácii nezvratné, príp. spôsobí závažné fyzické zhoršenie zraku; b) chemikálie klasifikované v kategórii 1 GHS OSN, kategórii 1 EÚ CLP alebo v kategórii I US EPA ako látky dráždivé pre oči.
                        
                           
                              Pozitívna kontrola
                           : replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému a ovplyvnený chemikáliou, ktorá bezpečne vyvolá pozitívnu odozvu. Aby bolo možné vyhodnotiť variabilitu odozvy na pozitívnu kontrolu v čase, veľkosť pozitívnej reakcie by nemala byť extrémne silná.
                        
                           
                              Chemikálie na preukázanie spôsobilosti
                           : podsúbor zo zoznamu referenčných chemikálií, ktoré možno použiť na preukázanie spôsobilosti neskúseného laboratória vykonávať validovanú referenčnú testovaciu metódu.
                        
                           
                              Relevantnosť
                           : opis vzťahu testu k účinku, ktorý je predmetom záujmu, a toho, či je tento účinok zmysluplný a užitočný na konkrétny účel. Ide o mieru, do akej test správne meria alebo predpovedá biologický účinok, ktorý je predmetom záujmu. Relevantnosť zohľadňuje presnosť (zhodu) testovacej metódy (8).
                        
                           
                              Spoľahlivosť
                           : meria rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda počas istého časového obdobia reprodukovateľne vykonávať v rámci laboratórií a medzi nimi navzájom, pričom sa používa ten istý protokol. Hodnotí sa vypočítaním vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovateľnosti a vnútrolaboratórnej opakovateľnosti.
                        
                           
                              Náhradný test
                           : test navrhnutý ako náhrada za test, ktorý sa bežne používa a je schválený na identifikáciu nebezpečnosti a/alebo hodnotenie rizika a o ktorom sa rozhodlo, že poskytuje rovnakú alebo zvýšenú úroveň ochrany zdravia ľudí alebo zvierat alebo životného prostredia v porovnaní so schváleným testom pre všetky možné testované situácie a chemikálie.
                        
                           
                              Citlivosť
                           : podiel všetkých pozitívnych/aktívnych chemikálií správne klasifikovaných testom. Ide o presnosť testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky a musí sa zohľadniť pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (8).
                        
                           
                              Vážne poškodenie očí
                           : poškodenie očného tkaniva alebo závažné fyzické zhoršenie zraku, ku ktorému dôjde po aplikácii testovanej chemikálie na predný okraj oka, ktoré nie je úplne zvratné do 21 dní po aplikácii.
                        
                           
                              Kontrola s rozpúšťadlom/nosičom
                           : neovplyvnená vzorka, ktorá obsahuje všetky zložky testovacieho systému vrátane rozpúšťadla alebo nosiča, ktorá sa spracuje ovplyvnenou testovanou chemikáliou a inými kontrolami, aby sa zistila základná odozva vzoriek ovplyvnených testovanou chemikáliou rozpustenou v tom istom rozpúšťadle alebo nosiči. Keď sa táto vzorka testuje so súbežnou negatívnou kontrolou, preukáže sa aj to, či rozpúšťadlo alebo nosič a testovací systém na seba navzájom pôsobia.
                        
                           
                              Špecifickosť
                           : podiel všetkých negatívnych/neaktívnych chemikálií správne klasifikovaných testom. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá poskytuje kategorizačné výsledky. Ide o dôležité hľadisko pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy.
                        
                           
                              Látka
                           : v kontexte GHS OSN sa pod látkou rozumejú chemické prvky a ich zlúčeniny v prírodnom stave alebo získané akýmkoľvek výrobným procesom vrátane všetkých prísad potrebných na zachovanie stálosti výrobku, ako aj všetkých nečistôt vznikajúcich pri použitom procese, ale s vylúčením všetkých rozpúšťadiel, ktoré sa môžu oddeliť bez ovplyvnenia stálosti látky alebo zmeny jej zloženia.
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes testovaná touto testovacou metódou.
                        
                           
                              Stratégia viacúrovňového testovania
                           : stratégia postupného testovania, pri ktorej sa všetky existujúce informácie o testovanej chemikálii kontrolujú v určitom poradí analýzou váhy dôkazov na každej z úrovní, pričom sa zisťuje, či je k dispozícii dostatok informácií na rozhodnutie o klasifikácii nebezpečenstva pred prechodom na ďalšiu úroveň. Ak sa dráždivý potenciál testovanej chemikálie môže stanoviť na základe existujúcich informácií, nevyžaduje sa žiadne ďalšie testovanie. Ak dráždivý potenciál testovanej chemikálie nemožno stanoviť na základe existujúcich informácií, vykonáva sa testovanie metódou postupných krokov na zvieratách, až kým sa nedá urobiť jednoznačná klasifikácia.
                        
                           
                              Validovaná testovacia metóda
                           : testovacia metóda, v súvislosti s ktorou sa ukončili validačné štúdie na stanovenie relevantnosti (vrátane presnosti) a spoľahlivosti pre konkrétny účel. Je dôležité poznamenať, že validovaná testovacia metóda nemusí mať dostatočnú výkonnosť, pokiaľ ide o presnosť a spoľahlivosť, aby bola prijateľná pre navrhovaný účel (8).
                        
                           
                              Analýza váhy dôkazov
                           : proces posudzovania silných a slabých stránok jednotlivých informácií na dosiahnutie a podporu záveru, ktorý sa týka potenciálu nebezpečnosti danej chemikálie.
                     
                     
                        Dodatok 3
                        
                           CHEMIKÁLIE NA PREUKÁZANIE SPÔSOBILOSTI PRI TESTOVACEJ METÓDE FL
                        
                        Pred rutinným použitím tejto testovacej metódy by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť tým, že správne klasifikujú očnú žieravosť v prípade 8 látok odporúčaných v tabuľke 1. Tieto chemikálie boli vybrané tak, aby reprezentovali rozpätie odoziev na lokálne podráždenie/poleptanie oka, ktoré vychádza z výsledkov in vivo testov na očiach králikov [TG 405, TM B.5(5)] (t. j. kategórie 1, 2A, 2B alebo bez klasifikácie podľa GHS OSN). Vzhľadom na validovanú použiteľnosť skúšky FL (t. j. identifikovať výlučne očné žieraviny/silne dráždivé chemikálie) však pri preukazovaní spôsobilosti existujú len dva výsledky testov na účely klasifikácie (je žieravina/silne dráždivá chemikália alebo nie je žieravina/silne dráždivá chemikália). Ďalším kritériom výberu boli parametre ako komerčná dostupnosť chemikálií, dostupnosť kvalitných referenčných údajov in vivo a existencia kvalitných údajov z testovacej metódy FL. Z tohto dôvodu boli chemikálie na preukázanie spôsobilosti vybrané z „Revízneho dokumentu o podrobnostiach skúšky úniku fluoresceínu ako alternatívnej metódy testovania na podráždenie očí (Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing)“ (8), ktorý bol retrospektívne použitý na validáciu testovacej metódy FL.
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Odporúčané chemikálie na preukázanie technickej spôsobilosti pri skúške FL
                        
                        
                                    Chemikália
                                 
                                 
                                    CAS č.
                                 
                                 
                                    Chemická trieda (32)
                                    
                                 
                                 
                                    Fyzikálny stav
                                 
                                 
                                    Klasifikácia in vivo
                                        (33)
                                    
                                 
                                 
                                    Klasifikácia in vitro
                                        (34)
                                    
                                 
                              
                                    benzalkónium-chlorid (5 %)
                                 
                                 
                                    8001-54-5
                                 
                                 
                                    óniová zlúčenina
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    žieravina/silne dráždivá látka
                                 
                              
                                    prometazín, hydrochlorid
                                 
                                 
                                    58-33-3
                                 
                                 
                                    amín/amidín, heterocyklický, organická zlúčenina síry
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    žieravina/silne dráždivá látka
                                 
                              
                                    hydroxid sodný (10 %)
                                 
                                 
                                    1310-73-2
                                 
                                 
                                    zásada
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    žieravina/silne dráždivá látka
                                 
                              
                                    nátrium-dodecyl-sulfát (15 %)
                                 
                                 
                                    151-21-3
                                 
                                 
                                    karboxylová kyselina (soľ)
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    kategória 1
                                 
                                 
                                    žieravina/silne dráždivá látka
                                 
                              
                                    4-(karboxy)benzaldehyd
                                 
                                 
                                    619-66-9
                                 
                                 
                                    karboxylová kyselina, aldehyd
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    kategória 2(A)
                                 
                                 
                                    nie je žieravina/silne dráždivá látka
                                 
                              
                                    dusičnan amónny
                                 
                                 
                                    6484-52-2
                                 
                                 
                                    anorganická soľ
                                 
                                 
                                    v tuhej forme
                                 
                                 
                                    kategória 2(A)
                                 
                                 
                                    nie je žieravina/silne dráždivá látka
                                 
                              
                                    etyl-2-metyl-oxobutanoát
                                 
                                 
                                    609-14-3
                                 
                                 
                                    ketón, ester
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    kategória 2(B)
                                 
                                 
                                    nie je žieravina/silne dráždivá chemikália
                                 
                              
                                    glycerol
                                 
                                 
                                    56-81-5
                                 
                                 
                                    alkohol
                                 
                                 
                                    v kvapalnej forme
                                 
                                 
                                    bez kategórie
                                 
                                 
                                    nie je žieravina/silne dráždivá chemikália
                                 
                              
                                    Skratky: CAS č. = číslo v registri chemických abstraktov (Chemical Abstracts Service).
                                 
                              
                     B.62   Alkalický kométový test in vivo u cicavcov
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 489 (2016). Alkalický kométový test (jednobunková gélová elektroforéza) in vivo (ďalej len „kométový test“) sa používa na zistenie zlomov v reťazcoch DNA buniek alebo jadier izolovaných z viacerých živočíšnych tkanív, prevažne tkanív hlodavcov, ktoré boli vystavené účinkom potenciálne genotoxického materiálu, resp. materiálov. Kométový test bol podrobený revízii a svoje odporúčania k nemu uverejnili viaceré expertné skupiny (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10). Táto testovacia metóda je súčasťou série testovacích metód týkajúcich sa genetickej toxikológie. Existuje dokument OECD, ktorý poskytuje stručné informácie o testovaní genotoxicity, ako aj prehľad nedávnych zmien, ktoré boli urobené v spomínanom usmernení na vykonávanie testov (11).
                     Účelom kométového testu je identifikovať chemikálie, ktoré poškodzujú DNA. V alkalickom prostredí (> pH 13) umožňuje kométový test odhaliť jedno- a dvojvláknové zlomy, ktoré sú napr. výsledkom priamych interakcií s DNA, alkalicky labilné miesta alebo následok prechodných zlomov v reťazcoch DNA spôsobených excíznou opravou DNA. Tieto zlomy môžu byť opravené bez trvalých následkov, môžu byť pre bunky smrteľné alebo môžu priamo súvisieť s mutáciou a spôsobiť trvalé zmeny. Zároveň môžu viesť k chromozomálnym poruchám, ktoré súvisia s mnohými ľudskými ochoreniami vrátane rakoviny.
                     V rokoch 2006 až 2012 prebehol formálny proces validácie kométového testu in vivo u hlodavcov, ktorý koordinovalo japonské Centrum pre validáciu alternatívnych metód (JaCVAM) v spojení s Európskym centrom pre validáciu alternatívnych metód (ECVAM), Medziagentúrnym koordinačným výborom pre validáciu alternatívnych metód (ICCVAM) a Medziagentúrnym centrom NTP pre hodnotenie alternatívnych toxikologických metód (NICEATM) (12). Táto testovacia metóda obsahuje odporúčaný spôsob použitia, ako aj obmedzenia kométového testu, pričom vychádza zo záverečného protokolu (12) použitého pri validačnej skúške a z ďalších relevantných uverejnených i neuverejnených (interných laboratórnych) údajov.
                     Definície kľúčových pojmov sú uvedené v dodatku 1. Je potrebné poznamenať, že na tento test možno použiť mnoho iných platforiem (preparáty, gélové škvrny, 96-jamkové platne atď.). Pre jednoduchosť sa v celom dokumente uvádza pojem „preparát“, zahŕňa však aj všetky ostatné platformy.
                     ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                     Kométový test je metóda, ktorou sa merajú zlomy v reťazcoch DNA eukaryotických buniek. Jednotlivé bunky/jadrá vsadené do agarózy na preparáte sa lyzujú čistiacim prostriedkom a vysokou koncentráciou soli. V tejto fáze rozpadu sa bunkové a jadrové membrány vstrebú, čím sa uvoľnia zvinuté slučky DNA – všeobecne nazývané nukleoidy – a fragmenty DNA. Elektroforézou pri vysokom pH sa dosiahnu štruktúry podobné kométam, ktoré je pri správnom fluorescečnom zafarbení možné pozorovať fluorescenčným mikroskopom; fragmenty DNA sa presúvajú smerom od „hlavy“ ku „chvostu“ podľa toho, aké sú veľké, pričom intenzita chvostu kométy v porovnaní s celkovou intenzitou (hlava a chvost) ukazuje rozsah zlomu DNA (13) (14) (15).
                     Alkalický kométový test in vivo je dôležitý najmä z hľadiska posúdenia genotoxického rizika, keďže odozvy pri tomto teste závisia od ADME in vivo (t. j. absorpcie, distribúcie, metabolizmu a exkrécie), ako aj od opravných procesov v DNA. Tieto sa môžu medzi jednotlivými druhmi, jednotlivými tkanivami a typmi poškodenia DNA líšiť.
                     V snahe splniť požiadavky na dobré životné podmienky zvierat, zvlášť pokiaľ ide o obmedzenie používania zvierat (3 zásady „nahradiť, obmedziť a zjemniť“), je možné tento test zahrnúť aj do iných toxikologických štúdií napr. štúdií toxicity po opakovaných dávkach (10) (16) (17), alebo skombinovať sledovaný parameter s inými sledovanými genotoxickými parametrami ako napr. s in vivo skúškou mikrojadier erytrocytov na cicavcoch (18) (19) (20). Kométový test sa najčastejšie vykonáva na hlodavcoch, hoci bol použitý aj v prípade iných druhov cicavcov a necicavcov. Použitie iného druhu ako hlodavcov treba v jednotlivých prípadoch vedecky a eticky zdôvodniť, pričom sa dôrazne odporúča vykonávať kométový test na nehlodavcoch iba vtedy, ak je súčasťou inej toxikologickej štúdie, a nie samostatným testom.
                     Výber spôsobu expozície a tkaniva, resp. tkanív, ktoré sa majú skúmať, by sa mal stanoviť na základe všetkých dostupných/existujúcich poznatkov o testovanej chemikálii, napr. zamýšľaný/očakávaný spôsob expozície u ľudí, metabolizmus a distribúcia, potenciál vyvolať účinky v mieste kontaktu, štrukturálne riziká, iné údaje o genotoxicite alebo toxicite a účel štúdie. Preto je prípadne možné analyzovať genotoxický potenciál testovaných chemikálií v cieľovom tkanive, resp. tkanivách s karcinogénnymi a/alebo inými toxickými účinkami. Tento test sa považuje za užitočný aj pri ďalšom skúmaní genotoxicity zistenej systémom in vitro. Kométový test in vivo je vhodné vykonávať na skúmanom tkanive v prípade, že možno odôvodnene predpokladať adekvátnu expozíciu skúmaného tkaniva.
                     Tento test bol v doposiaľ najväčšom rozsahu validovaný v somatických tkanivách potkaních samcov kolaboratívnymi štúdiami napr. skúškou JaCVAM (12) a štúdiou Rothfuss et al., 2010 (10). Pri medzinárodnej validačnej skúške JaCVAM sa použili pečeň a žalúdok. Pečeň preto, že ide o najaktívnejší orgán pri metabolizme chemikálií a často aj cieľový orgán karcinogenity. Žalúdok preto, že je po orálnej expozícii obyčajne prvým miestom kontaktu s chemikáliami, hoci za kontaktné tkanivá možno považovať aj iné oblasti gastrointestinálneho traktu, ako napríklad dvanástnik alebo lačník, ktoré sú relevantnejšie pre ľudí ako žľaznatý žalúdok hlodavcov. Treba však dbať na to, aby tieto tkanivá neboli vystavené nadmerne vysokým koncentráciám testovanej chemikálie (21). Túto techniku možno v zásade použiť v prípade akýchkoľvek tkanív, z ktorých sa dajú získať analyzovateľné jednobunkové/jadrové suspenzie. Interné údaje z viacerých laboratórií preukázali jej úspešnú použiteľnosť v prípade mnohých iných tkanív, pričom existuje množstvo publikácií, ktoré potvrdzujú použiteľnosť tejto techniky aj na iné orgány alebo tkanivá ako pečeň a žalúdok, napr. na lačník (22), obličky (23) (24), pokožku (25) (26), močový mechúr (27), (28), pľúca a bunky bronchoalveolárnej laváže (vhodné v prípade štúdií inhalovaných chemikálií) (29) (30), ako aj existenciu skúšok vykonaných na viacerých orgánoch (31) (32).
                     Napriek záujmu skúmať aj genotoxické účinky v zárodočných bunkách treba poznamenať, že štandardný alkalický kométový test opísaný v tejto testovacej metóde sa nepovažuje za vhodný na meranie zlomov v reťazcoch DNA zrelých zárodočných buniek. Keďže v odbornej literatúre týkajúcej sa použitia kométového testu na skúmanie genotoxoticity v zárodočných bunkách (33) sa uvádzajú vysoké a premenlivé pozaďové úrovne poškodenia DNA, pred zaradením kométového testu zrelých zárodočných buniek do tejto testovacej metódy sa za nevyhnutné považujú zmeny v protokole spolu so spresnením normalizačných a validačných štúdií. Navyše odporúčaný režim expozície opísaný v tejto testovacej metóde nie je optimálny a na zaručenie zmysluplnej analýzy zlomov v reťazcoch DNA zrelej spermie by si vyžadoval dlhšie expozície alebo časy odberu vzoriek. Genotoxické účinky merané kométovým testom v bunkách semenníkov v rôznych fázach ich diferenciácie boli už v odbornej literatúre opísané (34) (35). Napriek tomu treba poznamenať, že pohlavná žľaza obsahuje zmes somatických a zárodočných buniek. Preto pozitívne výsledky v celej pohlavnej žľaze (semenníku) nemusia nevyhnutne vyplývať z poškodenia zárodočných buniek, hoci dokazujú, že testovaná chemikália, resp. chemikálie a/alebo ich metabolity sa dostali do pohlavnej žľazy.
                     Pri štandardných experimentálnych podmienkach kométového testu nie je možné spoľahlivo zistiť medzireťazcové krížne väzby. Ak sa však experimentálne podmienky určitým spôsobom upravia, umožní to zistiť medzireťazcové krížne väzby DNA-DNA a DNA-proteín, ako aj iné bázické zmeny napr. oxidované bázy (23) (36) (37) (38) (39). Adekvátna charakterizácia nevyhnutných zmien v protokole si však ešte vyžaduje ďalšie úsilie. Preto detekcia agensov spôsobujúcich medzireťazcové krížne väzby nie je primárnym účelom testu tak, ako je tu opísaný. Tento test nie je ani po úpravách vhodný na detekciu aneugénov.
                     Podľa súčasných poznatkov je v súvislosti s kométovým testom in vivo známych niekoľko ďalších obmedzení (pozri dodatok 3). Očakáva sa, že v budúcnosti dôjde k revízii tejto testovacej metódy, pri ktorej budú prípadne zohľadnené aj získané skúsenosti.
                     Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom generovania údajov plánovaných na regulačné účely by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť adekvátne výsledky na tento účel a ak áno, tak prečo. Takéto úvahy nie sú potrebné v prípade, že existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.
                     PRINCÍP METÓDY
                     Zvieratá sú vystavené účinkom testovanej chemikálie príslušným spôsobom (cestou). Podrobný opis dávkovania a odberu vzoriek je uvedený v bodoch 36 až 40. Vo vybranom čase, resp. časoch odberu vzoriek sa skúmané tkanivá rezom oddelia a pripravia jednobunkové/jadrové suspenzie (v prípade potreby, napr. ak ide o pečeň, je možné vykonať perfúziu in situ), ktoré sa vsadia do mäkkého agaru, aby sa na preparátoch znehybnili. Bunky/jadrá sa upravia lyzačným tlmivým roztokom, aby sa odstránila bunková a/alebo jadrová membrána a vystavia sa pôsobeniu silnej zásady napr. s pH ≥ 13 s cieľom rozpliesť DNA a uvoľniť voľné slučky a fragmenty DNA. DNA jadra v agare sa potom podrobí elektroforéze. Normálne nefragmentované molekuly DNA zostanú na mieste, v ktorom bola DNA jadra v agare, pričom všetky fragmenty DNA a voľné slučky DNA migrujú k anóde. Po elektroforéze sa DNA zobrazí použitím vhodného fluorescenčného zafarbenia. Prípravky by sa mali analyzovať mikroskopom a plnoautomatizovanými alebo poloautomatizovanými systémami analýzy obrazu. Rozsah migrácie DNA počas elektroforézy, ako aj jej dĺžka odrážajú množstvo a veľkosť fragmentov DNA. V kométovom teste je niekoľko sledovaných parametrov. Na posúdenie poškodenia DNA sa odporúča obsah DNA na chvoste (% chvostovej DNA alebo % hustoty na chvoste)(12) (40) (41) (42). Po analýze dostatočného počtu jadier sa údaje analyzujú vhodnými metódami, aby sa posúdili výsledky testu.
                     Treba poznamenať, že možnosti zmeny jednotlivých aspektov metodiky vrátane prípravy vzoriek, podmienok elektroforézy, parametrov vizuálnej analýzy (napr. intenzita zafarbenia, svetelná intenzita žiarovky mikroskopu a použitie mikroskopických filtrov a rozlišovacích schopností kamery) a podmienok okolia (napr. osvetlenie pozadia) boli predmetom skúmania a môžu ovplyvňovať migráciu DNA (43) (44) (45) (46).
                     OVEROVANIE ODBORNEJ SPÔSOBILOSTI LABORATÓRIA
                     Každé laboratórium by malo svoje experimentálne schopnosti na vykonanie kométového testu preukázať tým, že z každého cieľového tkaniva, resp. tkanív každého z použitých druhov dokáže získať jednobunkové alebo jadrové suspenzie dostatočnej kvality. Kvalita prípravkov sa najskôr hodnotí % chvostovej DNA na zvieratách ovplyvnených nosičom, ktoré patria do nižšieho rozsahu reprodukovateľnosti. Súčasné údaje naznačujú, že priemer skupiny, pokiaľ ide o % chvostovej DNA (na základe priemeru mediánov – pozri bod 57, v ktorom sú tieto pojmy vysvetlené) v pečeni potkanov, by nemal podľa možnosti prekročiť 6 %, čo by bolo v súlade s hodnotami z validačnej skúšky JaCVAM (12), ako aj z iných uverejnených a interných údajov. V súčasnosti neexistuje dostatočné množstvo údajov na to, aby bolo možné odporúčať optimálne alebo prijateľné rozpätia aj pre ďalšie tkanivá. To však nevylučuje použitie iných tkanív, ak je toto použitie opodstatnené. V skúšobnom protokole by malo byť uvedené hodnotenie výkonnosti kométového testu v týchto tkanivách v porovnaní s publikovanou odbornou literatúrou alebo na základe interných údajov. Po prvé, je vhodné, aby bolo % chvostovej DNA v kontrolách nízke, aby sa dosiahlo dostatočne dynamické rozpätie na detekciu pozitívneho účinku. Po druhé, každé laboratórium by malo byť schopné reprodukovať očakávané odpovede na priame mutagény a promutagény, a to s rôznymi spôsobmi účinku uvedenými v tabuľke 1 (bod 29).
                     Ak je to vhodné, môžu sa po odôvodnení a preukázaní jednoznačne pozitívnych odoziev v skúmaných tkanivách zvoliť pozitívne látky napr. z validačnej skúšky JaCVAM (12) alebo z iných uverejnených údajov (pozri bod 9). Preukázať by sa mala aj schopnosť detekcie slabých účinkov známych mutagénov, napr. EMS pri malých dávkach, napríklad dosiahnutím vzťahov medzi dávkou a odozvou s príslušnými číslami a intervalmi medzi dávkami. Počiatočné úsilie by malo byť zamerané na získanie odbornej spôsobilosti v prípade najčastejšie používaných tkanív, napr. pečene hlodavcov, kde možno porovnávať s existujúcimi údajmi a očakávanými výsledkami (12). Zároveň je možné získať údaje aj z iných tkanív, napr. žalúdka/dvanástnika/lačníka, krvi atď. Laboratórium musí preukázať odbornú spôsobilosť pri každom individuálnom tkanive a každom druhu, ktorý plánuje skúmať a bude musieť preukázať, že v danom tkanive dokáže získať prijateľnú pozitívnu reakciu so známym mutagénom (napr. EMS).
                     Údaje z nosiča/negatívnej kontroly by sa mali zozbierať preto, aby sa preukázala reprodukovateľnosť odoziev s negatívnymi údajmi a zaručila riadna kontrola technických aspektov, prípadne aby sa navrhla potreba nanovo stanoviť rozsahy historických kontrol (pozri bod 22).
                     Treba poznamenať, že napriek možnosti pitevného odberu viacerých tkanív a ich spracovania na účely kométovej analýzy musí byť laboratórium schopné získať viacero tkanív z jedného zvieraťa, a tým zaručiť, že sa nestratí žiadna z možných lézií DNA, a teda nedôjde k spochybneniu výsledkov kométovej analýzy. Čas medzi usmrtením a odobratím tkanív na spracovanie môže byť rozhodujúci (pozri bod 44).
                     Pri získavaní odbornej spôsobilosti na výkon tohto testu treba dbať na dobré životné podmienky zvierat, a preto je po nadobudnutí zručností vo viacerých aspektoch testu možné používať aj tkanivá zo zvierat použitých na iné testy. V jednotlivých fázach zavádzania novej testovacej metódy v laboratóriu navyše nemusí byť potrebné vykonávať kompletnú štúdiu, preto na nadobudnutie potrebných zručností bude stačiť menej zvierat alebo testovaných koncentrácií.
                     
                        Údaje o historických kontrolách
                     
                     Počas skúmania odbornej spôsobilosti by si laboratórium malo vybudovať historickú databázu, aby mohlo stanoviť rozsahy pozitívnych a negatívnych kontrol a distribúciu príslušných tkanív a druhov. Odporúčania na ukladanie a využívanie historických údajov (t. j. kritériá zaradenia a vylúčenia údajov do/z historických údajov a kritériá prijateľnosti pri danom pokuse) možno nájsť v literatúre (47). Rôzne tkanivá a rôzne druhy, ako aj rôzne nosiče a spôsoby podania môžu poskytovať iné hodnoty % chvostovej DNA získanej z negatívnej kontroly. Preto je dôležité stanoviť rozpätia negatívnych kontrol pre každé tkanivo a každý druh. Laboratóriá by mali používať metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. C-diagramy alebo diagramy Xbar (48)], aby zistili, do akej miery sú ich údaje variabilné a preukázali, že vo svojom laboratóriu majú danú metodiku „pod kontrolou“. Na účely detekcie slabých účinkov (pozri bod 17) môže byť potrebné optimalizovať výber látok vhodných na pozitívne kontroly, rozsahy dávok a experimentálne podmienky (napr. podmienky elektroforézy).
                     Všetky zmeny v skúšobnom protokole by sa mali zvážiť z hľadiska ich súladu s existujúcimi databázami historických kontrol laboratória. Každý výrazný nesúlad by mal viesť k vytvoreniu novej databázy historických kontrol.
                     OPIS METÓDY
                     
                        Prípravky
                     
                     
                        Výber druhov zvierat
                     
                     Bežne sa používajú známe laboratórne rody mladých zdravých dospelých hlodavcov (vo veku 6 až 10 týždňov na začiatku testovania, hoci prijateľné sú aj o niečo staršie zvieratá). Výber druhu hlodavcov by mal byť založený na i) druhoch používaných pri iných štúdiách toxicity (aby bolo možné údaje prepojiť a vykonávať integrované štúdie), ii) druhoch, u ktorých sa počas štúdie karcinogenity objavil nádor (pri skúmaní mechanizmu karcinogenézy) alebo iii) druhoch s metabolizmom najviac podobným metabolizmu ľudí, ak sú známe. Najčastejšie sa pri tomto teste používajú potkany. Môžu sa však použiť aj iné druhy, ak je ich použitie eticky a vedecky opodstatnené.
                     
                        Podmienky umiestnenia a kŕmenia zvierat
                     
                     V prípade hlodavcov by ideálna teplota miestnosti pre pokusné zvieratá mala byť 22 °C (± 3 °C). Relatívna vlhkosť by mala byť v ideálnom prípade 50 – 60 %, minimálne 30 % a najlepšie nie viac ako 70 %, s výnimkou času čistenia miestnosti. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Hlodavce by mali byť umiestnené v malých skupinách (zvyčajne najviac po päť) rovnakého pohlavia, pokiaľ sa nepredpokladá agresívne správanie. Zvieratá môžu byť umiestnené samostatne len vtedy, ak je to vedecky opodstatnené. Pokiaľ je to možné, mali by sa používať pevné podlahy, pretože podlahy z drôteného pletiva môžu spôsobiť vážne poranenia (49). Zvieratá musia mať zabezpečené vhodne stimulujúce prostredie.
                     
                        Príprava zvierat
                     
                     Zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných a testovaných skupín. Označia sa jedinečným identifikátorom a najmenej päť dní pred začiatkom testu sa nechajú aklimatizovať na laboratórne podmienky. Na označenie zvierat jedinečným identifikátorom treba použiť tú najmenej invazívnu metódu. Medzi vhodné metódy označenia patria krúžky, visačky, mikročipy a biometrická identifikácia. Odsekávanie prstov a prepichovanie uší sa v týchto testoch nepovažuje za vedecky opodstatnené. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné následky vyplývajúce z umiestnenia klietok. Na začiatku štúdie by mala hmotnosť zvierat kolísať len minimálne a nemala by presiahnuť ± 20 %.
                     
                        Príprava dávok
                     
                     Testované chemikálie v tuhej forme by sa pred podaním zvieratám mali rozpustiť alebo rozptýliť vo vhodných nosičoch alebo primiešať do krmiva či pitnej vody. Kvapalné testované chemikálie sa môžu podávať priamo alebo rozriedené pred podávaním. V prípade inhalačných expozícií sa testované chemikálie môžu v závislosti od svojich fyzikálnochemických vlastností podávať ako plyn, výpary alebo tuhé/kvapalné aerosóly (50) (51).
                     Ak údaje o stabilite nepreukazujú prijateľnosť uskladnenia a nestanovujú vhodné podmienky skladovania, mali by sa používať čerstvo pripravené testované chemikálie.
                     
                        Podmienky testu
                     
                     
                        Nosič
                     
                     Nosič by nemal vyvolávať toxické účinky v používaných objemoch dávok a nemali by chemicky reagovať s testovanými chemikáliami. Ak sa používajú iné ako dobre známe nosiče, ich použitie by malo byť podporené referenčnými údajmi, ktoré poukazujú na ich kompatibilitu, pokiaľ ide o testované zvieratá, spôsoby podania dávky a sledovaný parameter. Vždy, keď to je možné, odporúča sa najprv zvážiť použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Treba poznamenať, že niektoré nosiče (najmä tie viskózne) môžu vyvolať zápal a zvýšiť tak pozaďové úrovne zlomov v reťazcoch DNA v mieste kontaktu, najmä pri viacnásobnom podaní.
                     
                        Kontroly
                     
                     
                        Pozitívne kontroly
                     
                     V tejto chvíli by sa obyčajne mala do testu zahrnúť skupina minimálne 3 analyzovateľných zvierat jedného pohlavia alebo v prípade použitia oboch pohlaví aj druhého pohlavia (pozri bod 32), ovplyvnených látkou na pozitívnu kontrolu. V budúcnosti možno bude reálne preukázať primeranú odbornú spôsobilosť na zníženie potreby pozitívnych kontrol. V prípade viacerých časov odberu vzoriek (napr. s jediným administratívnym protokolom) stačí pozitívne kontroly zahrnúť iba do jedného z časov odberu, treba však zabezpečiť vyváženosť (pozri bod 48). Súbežne podávané látky na pozitívnu kontrolu nemusia byť podané rovnakou cestou ako testovaná chemikália, je však dôležité, aby sa pri meraní účinkov v mieste kontaktu použila rovnaká cesta. Látky na pozitívnu kontrolu by mali vyvolať zlomy v reťazcoch DNA všetkých skúmaných tkanív v prípade testovanej chemikálie, pričom je pravdepodobné, že zvolenou pozitívnou kontrolou bude mutagén EMS, ktorý spôsobil zlomy v reťazcoch DNA všetkých tkanív, ktoré boli predmetom výskumu. Dávky látok na pozitívnu kontrolu by sa mali zvoliť tak, aby spôsobovali mierne účinky, ktoré umožnia kriticky zhodnotiť výkonnosť a citlivosť testu, a mohli by vychádzať z kriviek závislosti odozvy od dávky stanovených laboratóriom na účely preukázania odbornej spôsobilosti. % chvostovej DNA u súbežných zvierat určených na pozitívnu kontrolu by mali byť v súlade s rozpätím vopred stanoveným laboratórnom pre každé jedno tkanivo a čas odberu vzoriek pri daných druhoch (pozri bod 16). Príklady látok na pozitívnu kontrolu a niektorých ich cieľových tkanív ( u hlodavcov) sú uvedené v tabuľke 1. Vo vedecky opodstatnenom prípade sa môžu zvoliť (aj) iné látky ako tie, ktoré sú uvedené v tabuľke 1.
                     
                        Tabuľka 1
                     
                     
                        Príklady látok na pozitívnu kontrolu a niektorých ich cieľových tkanív
                     
                     Látky a čísla v registri CAS
                     etyl-metánsulfonát (CAS č. 62-50-0) pre všetky tkanivá
                     etyl-nitrózomočovina (CAS č. 759-73-9) v prípade pečene a žalúdka, dvanástnika alebo lačníka
                     metyl-metánsulfonát (CAS č. 66-27-3) v prípade pečene, žalúdka, dvanástnika alebo lačníka, buniek pľúcnej a bronchoalveolárnej laváže (BAL), obličiek, močového mechúra, pľúc, semenníkov a kostnej drene/krvi
                     
                        N-metyl-N′-nitro-N-nitrózoguanidín (CAS č. 70-25-7) v prípade žalúdka, dvanástnika alebo lačníka
                     1,2-dimetylhydrazín, dihydrochlorid (CAS č. 306-37-6) v prípade pečene a čriev
                     
                        N-metyl-N-nitrózomočovina (CAS č. 684-93-5) v prípade pečene, kostnej drene, krvi, obličiek, žalúdka, lačníka a mozgu.
                     
                        Negatívne kontroly
                     
                     Súčasťou každého testu by pri každom čase odberu vzoriek a každom tkanive mala byť skupina zvierat určených na negatívnu kontrolu, ovplyvnených iba nosičom a inak ovplyvnených rovnakým spôsobom ako pokusné skupiny. Percento chvostovej DNA by v prípade zvierat určených na negatívnu kontrolu malo byť v rozsahu pozaďových hodnôt, ktoré laboratórium vopred stanovilo pre každé jedno tkanivo a čas odberu vzoriek u daných druhov (pozri bod 16). Ak neexistujú historické alebo publikované kontrolné údaje, ktoré by preukazovali vyvolanie škodlivých alebo genotoxických účinkov zvoleným nosičom, počtom podaní látky alebo cestou jej podania, mali by sa pred vykonaním úplnej štúdie realizovať prvotné štúdie, ktoré umožnia stanoviť prijateľnosť kontroly s nosičom.
                     POSTUP
                     
                        Počet zvierat a ich pohlavie
                     
                     Hoci je len málo údajov o zvieratách samičieho pohlavia, z ktorých by sa dalo urobiť porovnanie medzi pohlaviami z hľadiska kométového testu, vo všeobecnosti platí, že iné genotoxické odozvy in vivo sú medzi samcami a samicami podobné, a preto je možné väčšinu štúdií vykonávať na oboch pohlaviach. Údaje dokazujúce príslušné rozdiely medzi samcami a samicami (napr. rozdiely v systémovej toxicite, metabolizme, biodostupnosti atď. vrátane napr. štúdie na zistenie rozsahu) hovoria v prospech používania oboch pohlaví. V tomto prípade môže byť vhodné vykonať štúdiu na oboch pohlaviach, napr. ako súčasť štúdie toxicity po opakovaných dávkach. Ak sa použijú obe pohlavia, mohlo by byť vhodné využiť plánovanie pokusov. Podrobnosti o analýze údajov použitím tohto plánovania sú uvedené v dodatku 2.
                     Mali by sa stanoviť veľkosti skupín na začiatku štúdie (a počas získavania odbornej spôsobilosti) s cieľom dosiahnuť minimálne 5 analyzovateľných zvierat jedného pohlavia alebo v prípade použitia oboch pohlaví každého pohlavia, na skupinu (menej v prípade súbežnej pozitívnej kontrolnej skupiny – pozri bod 29). Ak sa vystavenie ľudí chemikáliám môže viazať na pohlavie, ako napríklad pri niektorých farmaceutikách, mal by sa test vykonať na príslušnom pohlaví. Ako pomôcku týkajúcu sa maximálnych typických požiadaviek na zvieratá možno uviesť, že štúdia realizovaná v súlade s parametrami stanovenými v bode 33 s tromi skupinami dávok a súbežnými negatívnymi a pozitívnymi kontrolami (každá skupina zložená z piatich zvierat jedného pohlavia) by si vyžadovala okolo 25 až 35 zvierat.
                     HARMONOGRAM OVPLYVŇOVANIA
                     Zvieratá by mali byť ovplyvnené každý deň v trvaní 2 alebo viac dní (t. j. približne dve alebo viac ošetrení v približne 24-hodinových intervaloch), pričom vzorky sa odoberú raz za 2 – 6 hodín (alebo za Tmax) po poslednom ovplyvnení (12). Akceptujú sa aj vzorky z predĺžených dávkovacích režimov (napr. 28-dňové každodenné dávkovanie). Bola preukázaná úspešná kombinácia kométovej analýzy s testom mikrojadier erytrocytov (10) (19). Dôkladnú pozornosť však treba venovať logistike odberu vzoriek tkanív na účely kométovej analýzy, ako aj požiadavkám na odber vzoriek tkanív na iné typy toxikologických hodnotení. Odber 24 hodín po poslednej dávke, ktorý je typický pre všeobecné štúdie toxicity, nie je vo väčšine prípadov vhodný (pozri bod 40 o čase odberu vzoriek). Použitie iných harmonogramov ovplyvňovania a odberu vzoriek by sa malo zdôvodniť (pozri dodatok 3). Napríklad je možné použiť jedno ovplyvnenie s viacerými odbermi vzoriek, treba však poznamenať, že štúdia s jedným podaním látky si vyžiada viac zvierat, pretože bude potrebných niekoľko časov odberu vzoriek, hoci v niektorých prípadoch to môže byť tá preferovanješia voľba, napr. ak testovaná chemikália po opakovaných podaniach vyvolá nadmernú toxicitu.
                     Bez ohľadu na spôsob vykonania testu sa považuje za prijateľné, ak testovaná chemikália vykazuje pozitívnu odozvu, alebo ak sa v prípade negatívnej štúdie získajú priame alebo nepriame dôkazy podporujúce expozíciu cieľového tkaniva, resp. tkanív, alebo ich toxicitu, prípadne ak sa dosiahne limitná dávka (pozri bod 36).
                     Aby sa uľahčilo podanie veľkého objemu látky, môžu byť testované chemikálie podávané aj v rozdelených dávkach, t. j. dve ovplyvnenia v jeden deň, medzi ktorými neuplynú viac ako 2 až 3 hodiny. Za týchto okolností by sa mal čas odberu vzoriek naplánovať podľa času podania poslednej dávky (pozri bod 40).
                     
                        Úrovne dávok
                     
                     Ak sa vykoná predbežná štúdia na zistenie rozsahu dávky z dôvodu nedostatku adekvátnych údajov dostupných z iných relevantných štúdií, ktoré by pomohli pri výbere dávky, mala by sa vykonať v tom istom laboratóriu použitím toho istého druhu, rodu, pohlavia a tej istej dávkovacej schémy ako v hlavnej štúdii a podľa súčasných prístupov k vykonávaniu štúdie na zistenie rozsahu dávky. Takáto štúdia by sa mala zamerať na identifikáciu maximálnej tolerovanej dávky (MTD) definovanej ako dávka, ktorá v porovnaní s časom trvania štúdie vyvolá mierne toxické účinky (napr. jasné klinické príznaky, ako napríklad nezvyčajné správanie alebo reakcie, mierny úbytok alebo cytotoxicita v cieľovom tkanive), nie však smrť alebo známky bolesti, utrpenia, príp. ťažkosti, ktoré si vyžiadajú usmrtenie. V prípade netoxických testovaných chemikálií, ktoré sú podávané po 14 dňoch, príp. ešte neskôr, je maximálna (limitná) dávka 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň. V prípade časov podania kratších ako 14 dní je maximálna (limitná) dávka 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň. V prípade určitých typov testovaných chemikálií (napr. farmaceutiká na humánne použitie ), ktoré sa riadia osobitnými predpismi, sa môžu tieto limity líšiť.
                     Chemikálie vykazujúce saturáciu toxikokinetických vlastností alebo vyvolávajúce detoxifikačné procesy, ktoré môžu viesť k zníženiu expozície po dlhodobom podávaní, môžu byť výnimkami z kritérií stanovovania dávok a mali by sa hodnotiť jednotlivo.
                     Tak v prípade akútnej, ako aj subakútnej verzie kométového testu by sa okrem maximálnej dávky (MTD – maximálna možná dávka, maximálna expozícia alebo limitná dávka) mala na účely preukázania závislosti odoziev od dávky pre každý čas odberu vzoriek zvoliť klesajúca postupnosť najmenej dvoch dodatočných úrovní dávok s primeraným odstupom (najlepšie oddelených menej ako √10). Prednostne by však použité úrovne dávok mali pokrývať rozsah od maximálnej po malú, resp. žiadnu toxicitu. Ak sa v cieľovom tkanive objavia známky toxicity pri všetkých testovaných úrovniach dávok, odporúča sa vykonať ďalšiu štúdiu s netoxickými dávkami (pozri body 54 – 55). Štúdie, ktoré majú podrobnejšie preskúmať tvar krivky závislosti odozvy od dávky, si môžu vyžadovať dodatočnú skupinu, resp. skupiny dávok.
                     
                        Podávanie dávok
                     
                     Pri plánovaní testu by sa mal zvážiť predpokladaný spôsob expozície ľudí. Preto sa za opodstatnené považuje zvoliť spôsoby vystavenia ako jedlom, pitnou vodou, podkožne, intravenózne, orálne (sondou), inhaláciou, intratracheálne alebo implantáciou. V každom prípade by sa mal zvoliť taký spôsob, ktorým sa zaručí adekvátna expozícia cieľového tkaniva, resp. tkanív. Intraperitoneálna injekcia sa vo všeobecnosti neodporúča, keďže nejde o typický spôsob expozície ľudí, a preto by sa mala použiť iba v konkrétnych odôvodnených prípadoch (napr. ak ide o látky na pozitívne kontroly, na výskumné účely, alebo o lieky, ktoré sú podávané intraperitoneálne). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem nemá byť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných roztokov, keď sa môže použiť 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Požitie väčších objemov ako uvedený objem (pokiaľ to dovoľujú predpisy o dobrých životných podmienkach zvierat) by sa malo zdôvodniť. Všade, kde je to možné, by sa mali dosiahnuť rôzne úrovne dávok, a to upravením koncentrácie v zložení dávky, aby sa pri všetkých úrovniach dávok zabezpečil konštantný objem v pomere k telesnej hmotnosti.
                     
                        Čas odberu vzoriek
                     
                     Čas odberu vzoriek je kritickou premennou, pretože je určený obdobím potrebným na dosiahnutie maximálnej koncentrácie testovanej chemikálie v cieľovom tkanive a vyvolanie zlomov v reťazcoch DNA, avšak skôr, ako sa tieto zlomy odstránia, opravia alebo spôsobia bunkovú smrť. Výskyt niektorých lézií, ktoré spôsobili zlomy v reťazcoch DNA zistené kométovým testom, môže mať veľmi krátke trvanie, a to aspoň v prípade niektorých chemikálií testovaných in vitro (52) (53). Preto by sa v prípade, že sa takéto prechodné lézie DNA objavia, mali prijať opatrenia na zmiernenie ich straty tým, že sa zabezpečí, aby sa odber vzoriek z tkanív vykonal v dostatočnom predstihu, pokiaľ možno skôr, ako nastanú štandardné časy uvedené nižšie. Optimálny čas, resp. časy odberu vzoriek môžu závisieť od chemikálie alebo spôsobu/cesty napr. rýchla expozícia tkaniva s intravenóznym podaním alebo inhalačnou expozíciou. Preto by sa časy odberu vzoriek mali určovať z kinetických údajov, ak sú dostupné [napr. čas (Tmax), za ktorý sa dosiahne najvyššia koncentrácia v plazme alebo tkanive (Cmax), alebo ustálený stav v prípade viacnásobných podaní]. Pri absencii kinetických údajov sa za vhodný kompromis pri meraní genotoxicity považuje odber vzoriek po 2 – 6 hodinách od posledného testovania v prípade dvoch alebo viacerých testovaní, alebo po 2 – 6 a opäť po 16 – 26 hodinách po jednorazovom podaní, pričom však treba dbať na to, aby boli všetky zvieratá pitvané v tom istom čase od poslednej (príp. jedinej) dávky. Na výber vhodných časov odberu vzoriek je možné použiť aj informácie o výskyte toxických účinkov na cieľové orgány (ak sú k dispozícii).
                     
                        Pozorovania
                     
                     Najmenej raz denne, najlepšie v rovnakom čase, resp. časoch a po zohľadnení periódy najvyššej intenzity očakávaných účinkov po dávkovaní (54), by sa mali vykonať a zaznamenať všeobecné klinické pozorovania v súvislosti so zdravím zvierat. Najmenej dvakrát denne je u všetkých zvierat potrebné sledovať chorobnosť a úmrtnosť. Ak ide o dlhšie trvajúce štúdie, všetky zvieratá by sa mali aspoň raz týždenne a potom na konci obdobia testu odvážiť. Spotreba potravy by sa mala merať pri každej výmene potravy a aspoň raz za týždeň. Ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode, mala by sa pri každej výmene vody a aspoň raz za týždeň odmerať spotreba vody. Zvieratá, ktoré nevykazujú smrteľné dávky nadmernej toxicity, by sa mali pred dokončením testovacieho obdobia usmrtiť a vo všeobecnosti sa na účely kométového testu nepoužívať.
                     
                        Odber tkaniva
                     
                     Keďže je možné skúmať indukciu zlomov v reťazcoch DNA (kométy) prakticky v každom tkanive, rozhodnutie o výbere tkaniva, resp. tkanív, ktoré sa majú odobrať, by malo byť jasne vysvetlené a podložené dôvodom vykonania štúdie spolu so všetkými existujúcimi údajmi o ADME, genotoxicite, karcinogenite alebo inej toxicite v prípade testovaných chemikálií, ktoré sú predmetom skúmania. Medzi dôležité faktory, ktoré treba zvážiť, patrí spôsob podania látky (založený na pravdepodobnom spôsobe, resp. spôsoboch expozície ľudí), predpokladaná distribúcia a absorpcia v tkanive, úloha metabolizmu, ako aj možný mechanizmus pôsobenia testovanej chemikálie. Pečeň je najčastejšie skúmaným tkanivom s najväčším počtom údajov. Preto pri absencii akýchkoľvek podkladových informácií, alebo ak sa neurčí žiadne konkrétne tkanivo záujmu, sa odber vzoriek z pečene považuje za opodstatnený, pretože ide o primárne miesto xenobiotického metabolizmu a zároveň orgán, ktorý je často vystavený tak materskej látke, resp. látkam, ako aj metabolitu, resp. metabolitom. V niektorých prípadoch môže byť najlepšie skúmať v mieste priameho kontaktu (napr. v prípade chemikálií podávaných ústne – žľaznatý žalúdok alebo dvanástnik/lačník alebo v prípade inhalovaných chemikálií – pľúca). Na základe špecifických dôvodov vykonávania testu by sa mali vybrať dodatočné alebo alternatívne tkanivá, ale môže byť užitočné preskúmať viaceré tkanivá tých istých zvierat za predpokladu, že laboratórium preukázalo spôsobilosť pracovať s týmito tkanivami a dokáže zvládnuť viacero tkanív naraz.
                     
                        Príprava skúšobných vzoriek
                     
                     V prípade procesov opísaných v týchto bodoch (44 až 49) je dôležité, aby sa všetky roztoky, príp. stabilné suspenzie použili do dátumu exspirácie, alebo aby sa v prípade potreby pripravovali čerstvé. V uvedených bodoch sa uvádza aj to, že časy potrebné na i) odobratie každého tkaniva po pitve, ii) spracovanie každého tkaniva do bunkových/jadrových suspenzií a iii) spracovanie suspenzie a prípravu preparátov sa považujú za kritické premenné (pozri definície v dodatku 1), pričom správna dĺžka času na každý z týchto krokov by sa mala určiť v čase zavádzania metódy a preukazovania spôsobilosti.
                     Zvieratá sa vo vhodnom čase, resp. časoch po poslednom podaní testovanej chemikálie usmrtia v súlade s platnými právnymi predpismi v oblasti dobrých životných podmienok zvierat a so zásadami princípu „nahradiť, obmedziť a zjemniť“. Vybrané tkanivo, resp. tkanivá sa odoberú, oddelia rezom a časť sa použije na kométový test, pričom sa zároveň iná časť z tej istej časti tkaniva odreže a vloží do roztoku formaldehydu alebo vhodného fixačného prostriedku na účely možnej histopatologickej analýzy (pozri bod 55) podľa štandardných metód (12). Tkanivo určené na kométový test sa umiestni do rozmeľovacieho tlmivého roztoku, poriadne sa opláchne studeným rozmeľovacím tlmivým roztokom, aby sa odstránili zvyšky krvi a až do spracovania sa skladuje v ľadovom rozmeľovacom tlmivom roztoku. Môže sa vykonať aj perfúzia in situ, napr. pri pečeni alebo obličkách.
                     Na tému izolácie buniek/jadier existuje mnoho publikovaných metód. Patria medzi ne rozomieľanie tkanív napr. pečene a obličiek, škrabanie mukóznych povrchov v prípade gastrointestinálneho traktu, homogenizácia a enzymatické natrávenie. Predmetom validačnej skúšky JaCVAM bolo iba štúdium izolovaných buniek, preto sa pri zavádzaní metódy a odvolávaní sa na údaje zo skúšky JaCVAM na účely preukázania spôsobilosti uprednostňujú izolované bunky. Ukázalo sa však, že bez ohľadu na to, či sa použijú izolované bunky alebo jadrá, vo výsledku testu nie je žiaden podstatný rozdiel (8). Aj v prípade rôznych metód izolovania buniek/jadier (napr. homogenizácia, rozomieľanie, enzymatické natrávenie a filtrácia cez sito) sa dosiahli porovnateľné výsledky (55). Preto je možné použiť buď izolované bunky alebo izolované jadrá. Laboratórium by malo dôkladne vyhodnotiť a potvrdiť platnosť tkanivových metód izolácie samostatných buniek/jadier. Ako už bolo opísané v bode 40, výskyt niektorých lézií, ktoré spôsobia zlomy v reťazcoch DNA zistené kométovým testom, môže mať len veľmi krátke trvanie (52) (53). Preto je bez ohľadu na použitú metódu prípravy jednobunkovej/jadrovej suspenzie dôležité, aby sa tkanivá spracovali čo najskôr po tom, ako boli zvieratá usmrtené a umiestnené do podmienok, vďaka ktorým sa zníži potreba odstraňovania lézií (napr. uchovávaním tkaniva pri nízkej teplote). Bunkové suspenzie by sa mali až do samotného použitia uchovávať ľadové, aby sa minimalizovali odchýlky medzi vzorkami a dosiahli správne pozitívne a negatívne kontroly.
                     PRÍPRAVA PREPARÁTOV
                     Preparáty by sa mali pripravovať čo najskôr (v ideálnom prípade do jednej hodiny) po preparovaní jednej bunky/jadra, pričom teplota a čas medzi smrťou zvieraťa a prípravou preparátov by mali byť prísne kontrolované a validované v laboratórnych podmienkach. Objem bunkovej suspenzie pridanej do agarózy s nízkym bodom topenia (zvyčajne 0,5 – 1,0 %) na prípravu sklíčok by nemal znížiť percentuálny podiel agarózy s nízkym bodom topenia na menej ako 0,45 %. Optimálna hustota buniek sa stanoví systémom analýzy obrazu používaným na zápis komét.
                     
                        Lýza
                     
                     Aj podmienky lýzy patria ku kritickým premenným veličinám a môžu narúšať zlomy v reťazcoch vyvolané špecifickými typmi modifikácie DNA (niektoré alkylácie DNA a bázické adukty). Preto sa odporúča, aby sa pri všetkých preparátoch v rámci pokusu udržiavali pokiaľ možno konštantné podmienky lýzy. Po príprave by sa preparáty mali aspoň na jednu hodinu (alebo na noc) ponoriť do lyzačného roztoku pri teplote okolo 2 – 8 °C, tlmenom osvetlení, tzv. žlté svetlo (alebo podmienky odolné proti svetlu), aby nedošlo k ich vystaveniu účinkom bieleho svetla, ktoré môže obsahovať zložky UV žiarenia. Po tejto inkubačnej lehote sa preparáty opláchnu, aby sa pred fázou alkalického rozpletania odstránili zvyšky detergentu a soli. Robí sa to čistenou vodou, neutralizačným alebo fosfátovým tlmivým roztokom. Môže sa použiť aj elektroforézny tlmivý roztok. Vďaka tomu sa v elektroforéznej komore zachovajú alkalické podmienky.
                     
                        Rozpletanie a elektroforéza
                     
                     Preparáty sa náhodne umiestnia do zariadenia na ponorkovú elektroforézu obsahujúceho dostatočné množstvo roztoku tak, aby boli povrchy preparátov úplne ponorené (aj hĺbka ponoru by mala byť pri každom pokuse konzistentná). Pri iných typoch elektroforéznych zariadení na účely kométového testu, t. j. s aktívnym chladením, cirkuláciou a vysokokapacitným zdrojom energie, bude mať väčší ponor v roztoku za následok vyšší elektrický prúd, pričom napätie bude naďalej konštantné. Preparáty by sa do elektroforéznej nádoby mali umiestňovať vyváženým spôsobom, aby sa zmiernili účinky akýchkoľvek trendov alebo okrajových účinkov v nádobe a minimalizovali odchýlky medzi jednotlivými dávkami, t. j. pri každej elektroforéze by mal existovať rovnaký počet preparátov z každého skúmaného zvieraťa vrátane vzoriek z rôznych skupín dávok, negatívnych a pozitívnych kontrol. Preparáty by sa mali nechať aspoň 20 minút postáť, aby mohlo dôjsť k rozpleteniu DNA, a potom podrobiť elektroforéze za kontrolovaných podmienok, ktoré umožnia maximalizovať citlivosť a dynamický rozsah testu (napr. dosiahnuť prijateľné úrovne % chvostovej DNA pri negatívnych a pozitívnych kontrolách, ktoré maximalizujú citlivosť). Úroveň migrácie DNA je priamo úmerná tak dĺžke trvania elektroforézy, ako aj potenciálu (V/cm). Podľa skúšky JaCVAM by to mohlo byť 0,7 V/cm pri najmenej 20 minútach. Dĺžka trvania elektroforézy sa považuje za kritickú premennú, pričom čas elektroforézy by mal byť stanovený, aby sa optimalizoval dynamický rozsah. Dlhšie elektroforézne časy (napr. 30 alebo 40 minút na maximalizáciu citlivosti) obyčajne vedú k výraznejším pozitívnym odozvám v prípade známych mutagénov. Dlhšie elektroforézne časy však môžu viesť aj k nadmernej migrácii v kontrolách. Napätie by malo pri každom pokuse zostať konštantné a odchýlky v prípade iných parametrov by mali byť v malom a stanovenom rozsahu napr. pri skúške JaCVAM sa pri 0.7 V/cm dosiahol štartovací prúd 300 mA. Hĺbka tlmivého roztoku by sa mala upraviť tak, aby bolo možné dosiahnuť požadované podmienky a zachovať ju počas celého pokusu. Hodnoty prúdu na začiatku a na konci elektroforézy by sa mali zaznamenať. Optimálne podmienky pre každé skúmané tkanivo by sa preto v príslušnom laboratóriu mali určovať v priebehu počiatočného preukazovania spôsobilosti. Teplota elektroforézneho roztoku počas rozpletania a elektroforézy by mala zostať nízka, obyčajne 2 – 10 °C (10). Teplota elektroforézneho roztoku na začiatku rozpletania, začiatku a konci elektroforézy by sa mala zaznamenať.
                     Po dokončení elektroforézy by sa preparáty mali aspoň 5 minút ponárať/oplachovať neutralizačným tlmivým roztokom. Gély možno zafarbiť a hodnotiť „čerstvé“ (napr. do 1 – 2 dní), príp. ich dehydrovať na účely neskoršieho hodnotenia (napr. do 1 až 2 týždňov po zafarbení) (56). Tieto podmienky by sa však mali validovať v priebehu preukazovania spôsobilosti, pričom by sa mali získať a osobitne uchovať historické údaje týkajúce sa každej z týchto podmienok. V druhom prípade by sa preparáty mali dehydrovať ponorením na najmenej 5 minút do absolútneho etanolu, nechať oschnúť na vzduchu a potom až do hodnotenia skladovať buď pri izbovej teplote, alebo v nádobe v chladničke.
                     
                        Metódy merania
                     
                     Kométy by sa mali hodnotiť kvantitatívne pomocou automatických alebo poloautomatických systémov analýzy obrazu. Preparáty sa zafarbia primeraným fluorescenčným farbivom napr. zlatou SYBR, zelenou I (green I), propídium-jodidom alebo etídium-bromidom a merajú pri vhodnom zväčšení (napríklad 200-násobnom) pod epifluorescenčným mikroskopom s vhodnými detektormi alebo na digitálnej kamere (napr. CCD).
                     Bunky možno zaradiť do troch kategórií opísaných v atlase kométových snímok (57), a to hodnotiteľné, nehodnotiteľné a tzv. ježe (hedgehog) (ďalšie podrobnosti sú uvedené v bode 56). Na účely výpočtu % chvostovej DNA by sa mali hodnotiť iba hodnotiteľné bunky (jasne vymedzená hlava a chvost, bez interferencie so susednými bunkami), aby sa zabránilo artefaktom. Frekvenciu výskytu nehodnotiteľných buniek netreba zapisovať do protokolu. Frekvencia výskytu „ježov“ by sa mala určovať na základe vizuálneho hodnotenia (keďže im chýba jasne definovaná hlava, čo sťažuje ich detekciu analýzou obrazu) minimálne 150 buniek na vzorku (ďalšie podrobnosti sú uvedené v bode 56) a zvlášť zapísať.
                     Všetky preparáty určené na analýzu vrátane negatívnych a pozitívnych kontrol by mali byť nezávisle označené kódmi a hodnotené ako „slepé“, aby hodnotiteľ nepoznal spôsob ich ovplyvnenia. Z každej vzorky (jedno tkanivo na zviera) by sa malo analyzovať najmenej 150 buniek (s výnimkou „ježov“ – pozri bod 56). Hodnotenie 150 buniek na zviera s minimálne 5 zvieratami na jednu dávku (menej pri súbežnej pozitívnej kontrole – pozri bod 29) poskytuje podľa analýzy Smith et al., 2008 (5) primeranú štatistickú výpovednú hodnotu. Ak sa používajú preparáty, mohlo by ísť o hodnotenie 2 alebo 3 preparátov na vzorku, ak je v skupine päť zvierat. Pozorovania by sa mali vykonať vo viacerých oblastiach preparátu s hustotou, ktorá zaručí, že nedôjde k prekrývaniu chvostov. Okraje preparátov by sa nemali hodnotiť.
                     Zlomy v reťazcoch DNA možno v kométovom teste merať nezávislými sledovanými parametrami, ako je % objemu chvostovej DNA, dĺžka a tzv. tail moment. Všetky tri merania možno vykonať použitím vhodného systému so softvérom na analýzu obrazu. Na vyhodnotenie a interpretáciu výsledkov (12) (40) (41) (42) sa však odporúča použiť % chvostovej DNA (tiež známe ako % hustoty na chvoste), ktoré je dané hustotou fragmentov DNA na chvoste vyjadrenou ako percento z celkovej hustoty buniek (13).
                     
                        Poškodenie tkaniva a cytotoxicita
                     
                     Pozitívne nálezy v kométovom teste nemusia byť nutne výsledkom genotoxicity, keďže aj toxicita cieľového tkaniva môže mať za následok nárast migrácie DNA (12) (41). A naopak, nízka alebo mierna cytotoxicita je často výsledkom známych genotoxínov (12), z čoho vyplýva, že pri samotnom kométovom teste nie je možné rozlíšiť migráciu DNA vyvolanú genotoxicitou od migrácie vyvolanej cytoxocitou. Ak sú však pozorované nárasty migrácie DNA, odporúča sa preskúmať jeden alebo viacero ukazovateľov cytotoxicity, čo môže pomôcť pri interpretácii zistení. Nárasty migrácie DNA v prítomnosti jasných dôkazov cytotoxicity by sa mali interpretovať opatrne.
                     Bolo navrhnutých mnoho meraní cytotoxicity, spomedzi ktorých sa za najvhodnejší spôsob merania toxicity tkaniva považujú histopatologické zmeny. Pozorované javy, ako je zápal, bunková infiltrácia, apoptózové alebo nekrotické zmeny, sú spájané s nárastom migrácie DNA, no validačná skúška JaCVAM (12) potvrdila, že neexistuje žiadny konečný zoznam histopatologických zmien, ktoré sa vždy spájajú so zvýšenou migráciou DNA. Aj zmeny v klinických chemických ukazovateľoch (napr. AST, ALT) môžu poskytnúť užitočné informácie o poškodení tkaniva, pričom do úvahy je možné vziať aj ďalšie ukazovatele, napr. aktiváciu kaspázy, farbivo TUNEL, farbivo Annexin V atď. Existuje však len obmedzené množstvo publikovaných údajov o použití spomínaných ďalších ukazovateľov v štúdiách in vivo, pričom niektoré sú viac a iné menej spoľahlivé.
                     „Ježe“ (alebo tiež hedgehogs, clouds alebo ghost cells) sú bunky, ktoré vytvárajú mikroskopický obraz pozostávajúci z malých alebo neexistujúcich hláv a veľkých, rozptýlených chvostov, a považujú sa za bunky s ťažkým poškodením, hoci etiológia „ježov“ je neistá (pozri dodatok 3). Pre ich vzhľad sú merania % chvostovej DNA analýzou obrazu nespoľahlivé, preto by sa „ježe“ mali vyhodnocovať osobitne. Výskyt „ježov“ by sa mal zaznamenať a uviesť do protokolu, pričom akýkoľvek relevantný nárast, ktorý sa považuje za následok testovanej chemikálie, by sa mal dôsledne preskúmať a interpretovať. Pri týchto úvahách môžu pomôcť aj poznatky o potenciálnom spôsobe pôsobenia testovanej chemikálie.
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     Zviera je pokusná jednotka, a preto by sa tak údaje o jednotlivých zvieratách, ako aj zhrnutie výsledkov mali uvádzať v tabuľke. Vzhľadom na hierarchickú povahu údajov sa odporúča, aby sa pri každom preparáte určilo priemerné % chvostovej DNA a pri každom zvierati vypočítal priemer stredných hodnôt (12). Potom sa určí priemer z priemerov za jednotlivé zvieratá, aby sa získal priemer za skupinu. Všetky tieto hodnoty by sa mali zapísať do protokolu. Môžu sa použiť aj alternatívne prístupy (pozri bod 53), ak sú vedecky a štatisticky opodstatnené. Štatistické analýzy možno urobiť použitím rôznych prístupov (58) (59) (60) (61). Pri výbere štatistických metód, ktoré sa majú použiť, by sa mala na základe skutočností uvedených v spomínaných odkazoch na literatúru zvážiť potreba transformácie údajov (napr. logaritmicky alebo druhou odmocninou) a/alebo pripočítania malého čísla (napr. 0,001) ku všetkým (dokonca aj nenulovým) hodnotám, aby sa minimalizovali účinky nulových bunkových hodnôt. Podrobnosti o analýze interakcií medzi spôsobom ovplyvnenia a pohlavím zvierat v prípade použitia oboch pohlaví, ako aj následná analýza údajov pri zistení, prípadne nezistení rozdielov, sú uvedené v dodatku 2. V protokole by mali byť uvedené aj údaje o toxicite a klinických príznakoch.
                     
                        Kritériá prijateľnosti
                     
                     Prijateľnosť skúšky je založená na týchto kritériách:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 súbežná negatívna kontrola sa považuje za prijateľnú a môže sa doplniť do databázy historických údajov z negatívnych kontrol laboratória, ako je opísané v bode 16,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 súbežné pozitívne kontroly (pozri bod 29) by mali vyvolať odozvy, ktoré sú zlučiteľné s odozvami získanými v databáze historických údajov z pozitívnych kontrol a v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou predstavujú štatisticky významný nárast,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 bol analyzovaný adekvátny počet buniek a dávok (bod 52 a body 36 – 38),
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 kritériá výberu najvyššej dávky sú v súlade s kritériami opísanými v bode 36.
                              
                           
                        Hodnotenie a interpretácia výsledkov
                     
                     Za predpokladu, že boli splnené všetky kritériá prijateľnosti sa testovaná chemikália považuje za jednoznačne pozitívnu, ak:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 najmenej jedna z testovaných dávok vykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 ide o nárast, ktorý pri hodnotení vhodnou analýzou trendu potvrdí súvislosť s dávkou,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 ktorýkoľvek z výsledkov je mimo distribúcie historických údajov o negatívnych kontrolách pre daný druh, nosič, spôsob (cestu), tkanivo a počet podaní.
                              
                           Keď sú všetky tieto kritériá splnené, testovaná chemikália sa považuje za schopnú spôsobovať zlomy v reťazcoch DNA tkanív skúmaných týmto testovacím systémom. Ak je splnené iba jedno či dve z týchto kritérií, pozri bod 62.
                     Za predpokladu, že boli splnené všetky kritériá prijateľnosti sa testovaná chemikália považuje za jednoznačne negatívnu, ak:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 ani jedna z testovaných koncentrácií nevykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 ide o nárast, ktorý pri hodnotení vhodnou analýzou trendu nepotvrdí súvislosť s koncentráciou,
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 všetky výsledky sú v rámci distribúcie historických údajov o negatívnych kontrolách pre daný druh, nosič, spôsob (cestu), tkanivo a počet podaní,
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 boli preukázané priame alebo nepriame dôkazy podporujúce expozíciu cieľového tkaniva, resp. tkanív, alebo ich toxicitu.
                              
                           V tom prípade sa testovaná chemikália považuje za neschopnú spôsobovať zlomy v reťazcoch DNA tkanív skúmaných týmto testovacím systémom.
                     Neexistuje požiadavka na potvrdenie jednoznačne pozitívnej alebo negatívnej odozvy.
                     Ak odozva nie je ani jednoznačne negatívna, ani jednoznačne pozitívna (t. j. neboli splnené všetky kritériá uvedené v bodoch 59 a 60), v snahe napomôcť dosiahnutiu biologickej relevantnosti výsledku by sa mali údaje vyhodnocovať na základe odborného posudku a/alebo, ak je to vedecky opodstatnené, uskutočniť ďalšie skúmania. Užitočné môže byť aj hodnotenie dodatočných buniek (ak je to vhodné) alebo zopakovanie pokusu najlepšie po optimalizácii experimentálnych podmienok (napr. intervalov dávok, iných spôsobov podania, iných časov odberu vzoriek alebo iných tkanív).
                     V zriedkavých prípadoch, dokonca aj po ďalších skúmaniach, nemusí byť na základe daného súboru údajov možné dospieť k záveru o pozitívnych alebo negatívnych výsledkoch, a preto sa takéto údaje považujú za nejednoznačné.
                     Posúdenie biologickej relevantnosti pozitívneho alebo nejednoznačného výsledku, ako aj informácie o cytotoxicite v cieľovom tkanive, sú povinné (pozri body 54 – 55). Ak sú pozitívne alebo nejednoznačné nálezy pozorované iba za prítomnosti jasných dôkazov cytotoxicity, štúdia by sa mala uzavrieť ako genotoxicky nejednoznačná, pokiaľ neexistuje dostatok informácií, ktoré podporujú konečný záver. V prípadoch negatívneho výsledku štúdie, ktoré svedčia o znakoch toxicity pri všetkých testovaných dávkach, môže byť vhodné vykonať ďalšiu štúdiu s netoxickými dávkami.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, číslo dávky, ak je k dispozícii,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             stabilita testovanej chemikálie, konečný dátum použitia alebo dátum opätovnej analýzy, ak sú známe.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Jednozložková látka:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikácia chemikálie napr. názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt pozorované a ak je to prakticky uskutočniteľné atď.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Viaczložková látka, UVCB a zmes:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             pokiaľ možno charakterizácia chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a relevantných fyzikálno-chemických vlastností zložiek,
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozpúšťadlo/nosič:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             zdôvodnenie výberu rozpúšťadla/nosiča,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis prípravy zloženia dávok,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analytické určenie zložení (napr. stabilita, homogénnosť, nominálne koncentrácie).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované zvieratá:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý druh/kmeň a vedecké a etické odôvodnenie ich výberu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet, vek a pohlavie zvierat,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj, podmienky umiestnenia, potrava, stimulujúce prostredie atď.,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku a konci testu vrátane rozpätia telesnej hmotnosti, priemeru a štandardnej odchýlky pre každú skupinu.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o pozitívnych a negatívnych (rozpúšťadlo/nosič) kontrolách;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             výsledky štúdie na zistenie rozsahu (ak bola uskutočnená),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odôvodnenie výberu veľkosti dávky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o príprave testovanej chemikálie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odôvodnenie spôsobu (cesty) podania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             miesto vpichu (v prípade podkožných alebo intravenóznych štúdií),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy prípravy vzoriek, ak sú k dispozícii, histopatologických analýz, najmä v prípade chemikálie, ktorá vyvolá pozitívnu kométovú odozvu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             odôvodnenie výberu tkaniva,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy overovania, či sa testovaná chemikália dostala do cieľového tkaniva alebo hlavného obehu v prípade negatívnych výsledkov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             skutočná dávka (mg/kg telesnej hmotnosti/deň) testovanej chemikálie vypočítaná z potravy/pitnej vody,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v uplatniteľnom prípade koncentrácia (v ppm) a spotreba,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné údaje o kvalite potravy a vody,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobný opis harmonogramov ovplyvňovania a odoberania vzoriek a odôvodnenie ich výberu (napr. toxikokinetické údaje, ak existujú),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda zmierňovania bolesti, analgézia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda usmrtenia;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             postupy izolácie a uchovávania tkanív;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy prípravy jednobunkových/jadrových suspenzií,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj a čísla dávok všetkých činidiel (ak je to možné),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy hodnotenia cytotoxicity,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podmienky elektroforézy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             techniky zafarbenia a metódy hodnotenia a merania komét.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             všeobecné klinické pozorovania každého zvieraťa pred a počas obdobia testovania, ak sa vykonávalo,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dôkazy o cytotoxicite, ak bola vyvolaná,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade štúdií trvajúcich viac ako jeden týždeň: hmotnosť jednotlivých zvierat v priebehu štúdie vrátane rozpätia telesnej hmotnosti, priemeru a štandardnej odchýlky pre každú skupinu, spotreba potravy,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vzťah medzi dávkou a odozvou, ak evidentne existuje,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pre každé tkanivo/zviera: % chvostovej DNA (alebo iné merania, ak sa zvolili) a stredné hodnoty za preparát, priemerné hodnoty za zviera a priemerné hodnoty za skupinu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             súbežné a historické údaje o negatívnych kontrolách s rozsahmi, priemermi/strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami pri každom posudzovanom tkanive,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             súbežné a historické údaje o pozitívnych kontrolách,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pre tkanivá iné ako pečeň: krivka závislosti odozvy od dávky pri pozitívnej kontrole. Môže ísť o údaje zozbierané počas preukazovania spôsobilosti (pozri body 16 a 17) doplnené príslušným odôvodnením, odkazmi na súčasnú odbornú literatúru a primerané sile a rozptylu odoziev na kontroly v danom tkanive;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             použité štatistické analýzy a metódy, kritériá hodnotenia odoziev ako pozitívnych, negatívnych alebo nejednoznačných,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             frekvencia výskytu „ježov“ v každej skupine a za zviera.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Rozbor výsledkov
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Záver
                                 
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Odkazy
                                 
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Kirkland, D., G. Speit (2008), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens III. Appropriate follow-up testing in vivo, Mutation Research, Vol. 654/2, pp. 114-32.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S. et al. (2005), The in vivo Comet assay: use and status in genotoxicity testing, Mutagenesis, Vol. 20/4, pp. 245-54.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Burlinson, B. (2012), The in vitro and in vivo Comet assays, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 143-63.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Smith, C.C. et al. (2008), Recommendations for design of the rat Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 233-40.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/1, pp. 45-51.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 McKelvey-Martin, V.J. et al. (1993), The single cell gel electrophoresis assay (Comet assay): a European review, Mutation Research, Vol. 288/1, pp. 47-63.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Tice, R.R. et al. (2000), Single cell gel/Comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 206-21.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Singh, N.P. et al. (1988), A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells, Experimental Cell Research, Vol. 175/1, pp. 184-91.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2010), Collaborative study on fifteen compounds in the rat-liver Comet assay integrated into 2- and 4-week repeat-dose studies, Mutation Research, Vol., 702/1, pp. 40-69.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 OECD (2016), Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014 – 2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Olive, P.L., J.P. Banath, R.E. Durand (1990), Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells using the “Comet” assay, Radiation Research, Vol. 122/1, pp. 86-94.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Tice, R.R., G.H. Strauss (1995), The single cell gel electrophoresis/Comet assay: a potential tool for detecting radiation-induced DNA damage in humans, Stem Cells, Vol. 13/1, pp. 207-14.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Collins, A.R (2004), The Comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations, Molecular Biotechnology, Vol. 26/3, pp. 249-61.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-20.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Kushwaha, S. et al. (2010), Evaluation of multi-organ DNA damage by Comet assay from 28 days repeated dose oral toxicity test in mice: A practical approach for test integration in regulatory toxicity testing, Regulatory Toxicology and Pharmacology, Vol. 58/1, pp. 145–54.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Vasquez, M.Z. (2010), Combining the in vivo Comet and micronucleus assays: a practical approach to genotoxicity testing and data interpretation, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 187-99.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Bowen, D.E. (2011), Evaluation of a multi-endpoint assay in rats, combining the bone-marrow micronucleus test, the Comet assay and the flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, Mutation Research, Vol. 722/1, pp. 7-19.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 Recio, L. et al. (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, The Journal of Toxicological Science, Vol. 35/2, pp. 149-62.
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 O'Donovan, M., B. Burlinson (2013), Maximum dose levels for the rodent comet assay to examine damage at the site of contact or to the gastrointestinal tract, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 621-3.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 Hartmann, A. (2004), Use of the alkaline in vivo Comet assay for mechanistic genotoxicity investigations, Mutagenesis, Vol. 19/1, pp. 51-9.
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 Nesslany, F. (2007), In vivo Comet assay on isolated kidney cells to distinguish genotoxic carcinogens from epigenetic carcinogens or cytotoxic compounds, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 630/1, pp. 28-41.
                              
                           
                                 24.
                              
                              
                                 Brendler-Schwaab, S.Y., B.A. Herbold (1997), A new method for the enrichment of single renal proximal tubular cells and their first use in the Comet assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 393/1-2, pp. 175-8.
                              
                           
                                 25.
                              
                              
                                 Toyoizumi, T. et al. (2011), Use of the in vivo skin Comet assay to evaluate the DNA-damaging potential of chemicals applied to the skin, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 726/2, pp. 175-80.
                              
                           
                                 26.
                              
                              
                                 Struwe, M. et al. (2008), Detection of photogenotoxicity in skin and eye in rat with the photo Comet assay, Photochemical and Photobiological Sciences, Vol. 7/2, pp. 240-9.
                              
                           
                                 27.
                              
                              
                                 Wada, K. et al. (2012), A comparison of cell-collecting methods for the Comet assay in urinary bladders of rats, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 742/1-2, pp. 26-30.
                              
                           
                                 28.
                              
                              
                                 Wang, A. et al. (2007), Measurement of DNA damage in rat urinary bladder transitional cells: improved selective harvest of transitional cells and detailed Comet assay protocols, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 51-9.
                              
                           
                                 29.
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), In Vivo Comet Assay Workgroup, part of the Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing. Fourth International Workgroup on Genotoxicity testing: results of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Jackson, P. et al. (2012), Pulmonary exposure to carbon black by inhalation or instillation in pregnant mice: effects on liver DNA strand breaks in dams and offspring, Nanotoxicology, Vol. 6/5, pp. 486-500.
                              
                           
                                 31.
                              
                              
                                 Sasaki, Y.F. et al. (2000), The comet assay with multiple mouse organs: comparison of Comet assay results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from the IARC monographs and U.S. NTP Carcinogenicity Database, Critical Reviews in Toxicology, Vol. 30/6, pp. 629-799.
                              
                           
                                 32.
                              
                              
                                 Sekihashi, K. et al. (2002), Comparative investigations of multiple organs of mice and rats in the Comet assay, Mutation Research, Vol. 517/1-2, pp. 53-74.
                              
                           
                                 33.
                              
                              
                                 Speit, G, M. Vasquez, A. Hartmann (2009), The comet assay as an indicator test for germ cell genotoxicity, Mutation Research, Vol. 681/1, pp. 3-12.
                              
                           
                                 34.
                              
                              
                                 Zheng, H., P.L. Olive (1997), Influence of oxygen on radiation-induced DNA damage in testicular cells of C3H mice, International Journal of Radiation Biology, Vol. 71/3, pp. 275-282.
                              
                           
                                 35.
                              
                              
                                 Cordelli, E. et al. (2003), Evaluation of DNA damage in different stages of mouse spermatogenesis after testicular X irradiation, Journal of Radiation Research, Vol. 160/4, pp. 443-451.
                              
                           
                                 36.
                              
                              
                                 Merk, O., G. Speit (1999), Detection of crosslinks with the Comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 33/2, pp. 167-72.
                              
                           
                                 37.
                              
                              
                                 Pfuhler, S., H.U. Wolf (1996), Detection of DNA-crosslinking agents with the alkaline Comet assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 27/3, pp. 196-201.
                              
                           
                                 38.
                              
                              
                                 Wu, J.H., N.J. Jones (2012), Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline Comet assay, Methods in Molecular Biology, Vol. 817, pp. 165-81.
                              
                           
                                 39.
                              
                              
                                 Spanswick, V.J., J.M. Hartley, J.A. Hartley (2010), Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay, Methods in Molecular Biology, Vol. 613, pp. 267-282.
                              
                           
                                 40.
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S., A.N. Jha (2006), Reliable Comet assay measurements for detecting DNA damage induced by ionizing radiation and chemicals, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 605(1-2), pp. 7-16.
                              
                           
                                 41.
                              
                              
                                 Burlinson, B. et al. (2007), Fourth International Workgroup on Genotoxicity Testing: result of the in vivo Comet assay workgroup, Mutation Research, Vol.627/1, pp. 31-5.
                              
                           
                                 42.
                              
                              
                                 Kumaravel, T.S. et al. (2009), Comet Assay measurements: a perspective, Cell Biology and Toxicology, Vol. 25/1, pp. 53-64.
                              
                           
                                 43.
                              
                              
                                 Ersson, C., L. Möller (2011), The effects on DNA migration of altering parameters in the Comet assay protocol such as agarose density, electrophoresis conditions and durations of the enzyme or the alkaline treatments, Mutagenesis, Vol. 26/6, pp. 689-95.
                              
                           
                                 44.
                              
                              
                                 Møller, P. et al. (2010), Assessment and reduction of Comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 109-11.
                              
                           
                                 45.
                              
                              
                                 Forchhammer, L. et al. (2010), Variation in the measurement of DNA damage by Comet assay measured by the ECVAG inter-laboratory validation trial, Mutagenesis, Vol. 25/2, pp. 113-23.
                              
                           
                                 46.
                              
                              
                                 Azqueta, A. et al. (2011), Towards a more reliable comet assay: Optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions, Mutation Research, Vol. 724/1-2, pp. 41-45.
                              
                           
                                 47.
                              
                              
                                 Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.
                              
                           
                                 48.
                              
                              
                                 Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, John Wiley and Sons, New York 2nd ed.
                              
                           
                                 49.
                              
                              
                                 Appendix A of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS No. 123)
                              
                           
                                 50.
                              
                              
                                 Kapitola B.8 tejto prílohy: Subakútna inhalačná toxicita: 28-dňová štúdia.
                              
                           
                                 51.
                              
                              
                                 Kapitola B.29 tejto prílohy: Subchronická inhalačná toxicita: 90-dňová štúdia.
                              
                           
                                 52.
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1984), Transient DNA lesions induced by benzo[a]pyrene in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 140/2-3, pp. 141-45.
                              
                           
                                 53.
                              
                              
                                 Blakey, D.H., G.R. Douglas (1990), The role of excision repair in the removal of transient benzo[a]pyrene-induced DNA lesions in Chinese hamster ovary cells, Mutation Research, Vol. 236/1, pp. 35-41.
                              
                           
                                 54.
                              
                              
                                 OECD (2002), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 55.
                              
                              
                                 Nakajima, M. (2012), Tissue sample preparation for in vivo rodent alkaline Comet assay, Genes and Environment, Vol. 34/1, pp. 50-4.
                              
                           
                                 56.
                              
                              
                                 Hartmann, A. et al. (2003), Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay, Mutagenesis, Vol.18/1, pp.45–51.
                              
                           
                                 57.
                              
                              
                                 Atlas of Comet Assay Images, Scientist Press Co., Ltd., Tokyo, Japan.
                              
                           
                                 58.
                              
                              
                                 Lovell, D.P., G. Thomas, R. Dubow (1999), Issues related to the experimental design and subsequent statistical analysis of in vivo and in vitro Comet studies, Teratogenesis Carcinogenesis Mutagenesis, Vol. 19/2, pp. 109-19.
                              
                           
                                 59.
                              
                              
                                 Wiklund, S.J., E. Agurell (2003), Aspects of design and statistical analysis in the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 167-75.
                              
                           
                                 60.
                              
                              
                                 Bright, J. et al. (2011), Recommendations on the statistical analysis of the Comet assay, Pharmaceutical Statistics, Vol. 10/6, pp. 485-93.
                              
                           
                                 61.
                              
                              
                                 Lovell, D.P., T. Omori (2008), Statistical issues in the use of the Comet assay, Mutagenesis, Vol. 23/3, pp. 171-82.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Alkalická jednobunková gélová elektroforéza
                           : senzitívna technika detekcie primárneho poškodenia DNA na úrovni jednotlivých buniek/jadier.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Kométa
                           : tvar podobný kométam, ktorý nadobudnú nukleoidy po tom, ako sa vložia do elektroforézneho poľa: hlavu tvorí jadro a chvost vznikne migráciou DNA z jadra pod vplyvom elektrického poľa.
                        
                           
                              Kritická premenná/kritický parameter
                           : ide o protokolovú premennú, v prípade ktorej môže aj nepatrná zmena výrazne ovplyvniť záver skúšky. Kritické premenné môžu byť viazané na konkrétne tkanivo. Kritické premenné by sa nemali meniť, najmä v rámci testu bez toho, aby sa zvážilo, do akej miery ich zmena ovplyvní odozvu na test napr. na základe sily a variability pozitívnych a negatívnych kontrol. V skúšobnom protokole by mal byť uvedený zoznam zmien kritických premenných vykonaných počas testu alebo v porovnaní so štandardným laboratórnym protokolom spolu s odôvodneniami každej zmeny.
                        
                           
                              Hustota na chvoste alebo % chvostovej DNA
                           : Ide o hustotu na chvoste kométy v porovnaní s celkovou hustotou (hlava plus chvost). Vyjadruje percentuálne množstvo zlomov DNA.
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes testovaná touto testovacou metódou.
                        
                           
                              UVCB
                           : látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           FAKTORIÁLNY EXPERIMENT IDENTIFIKÁCIE ROZDIELOV MEDZI POHLAVIAMI V KOMÉTOVOM TESTE IN VIVO
                           
                        
                        
                           Faktoriálny experiment a jeho analýza
                        
                        Pri tomto experimente sa testuje minimálne 5 samcov a 5 samíc pri každej úrovni koncentrácie, čo znamená model s použitím minimálne 40 zvierat (20 samcov a 20 samičiek, plus príslušné pozitívne kontroly).
                        Tento model je jedným z jednoduchších faktoriálnych experimentov a zodpovedá dvojsmernej analýze rozptylu, ktorá má dva zásadné vplyvy, a to na pohlavie a úroveň koncentrácie. Údaje možno analyzovať použitím štandardných štatistických softvérových balíkov napr. SPPS, SAS, STATA, Genstat, ako aj pomocou programu R.
                        Touto analýzou sa variabilita súboru údajov rozdelí na variabilitu medzi pohlaviami, medzi koncentráciami a na variabilitu súvisiacu s interakciou medzi pohlaviami a koncentráciami. Každý z týchto znakov sa testuje v porovnaní s odhadom variability medzi paralelnými zvieratami (replikátmi) v rámci skupín zvierat rovnakého pohlavia pri rovnakej koncentrácii. Podrobné informácie o príslušnej metodike sú dostupné v mnohých bežných štatistických publikáciách (pozri odkazy) a v príručkách ku štatistickým programom.
                        Analýza začína kontrolou znaku interakcie pohlavia a koncentrácie v tabuľke ANOVA (35). Pri absencii významného znaku interakcie sú kombinované hodnoty naprieč pohlaviami alebo úrovňami koncentrácií validnými štatistickými testami variability medzi jednotlivými úrovňami, ktoré sú založené na skúmaní kumulovaného znaku variability v rámci skupiny analýzou ANOVA.
                        Analýza pokračuje rozdelením odhadu variability medzi koncentrácie podľa kontrastov, čo vedie k testovaniu lineárnych a kvadratických kontrastov odoziev naprieč úrovňami koncentrácií. Ak dôjde k významnej interakcii pohlavia a koncentrácie, tento znak možno takisto ďalej rozdeliť na porovnanie interakcií lineárnosti a pohlavia, ako aj kvadratickej interakcie a pohlavia. Tieto znaky vedú k testom, ktoré preukážu, či sú odozvy na koncentrácie paralelné u oboch pohlaví, alebo či obe pohlavia vykazujú odlišné odozvy.
                        Odhad kumulovanej variability v rámci skupiny možno použiť na párové testovanie rozdielov medzi priemernými hodnotami. Tieto porovnania by sa dali urobiť medzi priemernými hodnotami z oboch pohlaví a medzi priemermi za jednotlivú úroveň koncentrácie, ako sú napríklad porovnania s úrovňami pri negatívnych kontrolách. Ak existujú prípady významnej interakcie, je možné porovnávať priemery rozličných koncentrácií v rámci pohlavia alebo priemery za jednotlivé pohlavia pri rovnakej koncentrácii.
                        
                           Odkazy
                        
                        Existuje mnoho štatistických publikácií, ktoré rozoberajú teóriu, model, metodiku, analýzu a interpretáciu faktoriálnych experimentov, od tých najjednoduchších dvojfaktorových analýz k tým zložitejším, ktoré sú opísané v publikácii „Design of Experiment methodology“ (Model experimentálnej metodiky). Tento zoznam nie je úplný. V niektorých knihách sú uvedené vypracované príklady porovnateľných modelov, v niektorých prípadoch s kódom na vykonanie analýzy pomocou rozličných softvérových programov.
                        
                                    1.
                                 
                                 
                                    Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.
                                 
                              
                                    2.
                                 
                                 
                                    Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987) Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    3.
                                 
                                 
                                    Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007) Analysis of Variance and Covariance: How to choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    4.
                                 
                                 
                                    Mead, R. (1990) The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.
                                 
                              
                                    5.
                                 
                                 
                                    Montgomery D.C. (1997) Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                                    6.
                                 
                                 
                                    Winer, B.J. (1971) Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.
                                 
                              
                                    7.
                                 
                                 
                                    Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009) Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           EXISTUJÚCE OBMEDZENIA SKÚŠKY
                        
                        Na základe súčasných poznatkov je v súvislosti s kométovým testom in vivo známych niekoľko obmedzení. Očakáva sa, že ich počet sa bude znižovať, príp. sa s pribúdajúcimi skúsenosťami s používaním testu presnejšie zadefinujú tak, aby bolo možné zodpovedať bezpečnostné otázky z hľadiska predpisov.
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Niektoré typy poškodenia DNA môžu byť krátkodobé, t. j. môžu sa opraviť príliš rýchlo na to, aby sa po 24 hodinách či viac od poslednej dávky dali pozorovať. Neexistuje konkrétny zoznam s typmi krátkodobých poškodení ani s chemikáliami, ktoré môžu tento typ poškodenia spôsobovať, ba dokonca nie je ani známe, za aký čas možno tento druh poškodení zistiť. Optimálny čas, resp. časy odberu vzoriek môžu byť takisto závislé od chemikálie alebo spôsobu jej podania, pričom časy odberu vzoriek by sa mali určovať na základe kinetických údajov (napríklad čas Tmax, za ktorý sa dosiahne hodnota najintenzívnejšej koncentrácie v plazme alebo tkanive), ak sú takéto údaje dostupné. Vo väčšine validačných štúdií podporujúcich túto testovaciu metódu sa uvádza vykonanie pitvy 2 alebo 3 hodiny po podaní konečnej dávky. Väčšina štúdií publikovaných v odbornej literatúre opisuje podanie konečnej dávky medzi 2 až 6 hodinami pred utratením. Preto boli tieto poznatky použité ako základ pre odporúčanie v rámci tejto testovacej metódy, na základe ktorého by sa pri absencii údajov nenaznačujúcich pravý opak, mala konečná dávka podať v určenom časovom intervale medzi 2 a 6 hodinami pred pitvou.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Neexistuje žiadna štúdia s identifikovateľnými údajmi, ktorá by skúmala citlivosť testu na zistenie krátkodobých poškodení DNA po podaní chemikálie potravou alebo pitnou vodou v porovnaní s jej podaním cez sondu. Bolo zistené poškodenie DNA po podaní v krmivách a pitnej vode, ale v porovnaní s ďaleko väčšími skúsenosťami s podávaním cez sondu a intraperitoneálnou injekciou ide len o relatívne malý počet týchto správ. Preto môže byť citlivosť tohto testu v prípade chemikálií spôsobujúcich krátkodobé poškodenia, ktoré sú podávané v krmivách alebo pitnej vode, znížená.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Neboli vykonané žiadne iné medzilaboratórne štúdie ako štúdie tkanív pečene a žalúdka, a preto neexistujú žiadne odporúčania, ako dosiahnuť citlivú a reprodukovateľnú odozvu v iných tkanivách ako tkanive pečene, ako sú napríklad očakávané rozsahy pozitívnych a negatívnych kontrol. Ani v prípade pečene sa však nepodarilo dosiahnuť dohodu o stanovení dolnej hranice negatívnej kontroly.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Napriek tomu, že existuje niekoľko publikácií dokazujúcich nejednoznačný účinok cytotoxicity in vitro, bolo uverejnených len veľmi málo údajov in vivo, a preto nie je možné odporučiť jediné meranie cytotoxicity. Hoci sú so zvýšením migrácie DNA spájané histopatologické zmeny ako zápal, bunková infiltrácia, apoptózové alebo nekrotické zmeny, nemusia vždy vyústiť do pozitívnych nálezov komét, čo potvrdila aj validačná skúška JaCVAM (OECD, 2014), a preto neexistuje žiadny konečný zoznam histopatologických zmien, ktoré by súviseli iba so zvýšenou migráciou DNA. „Ježe“ (hedgehogs, clouds, ghost cells) boli pôvodne navrhnuté ako ukazovatele cytotoxicity, ich etiológia je však nejasná. Existujú údaje, ktoré naznačujú, že ich môže spôsobovať cytotoxicita súvisiaca s chemikáliou, mechanicky/enzymaticky indukované poškodenia, ktoré vznikajú vo fáze prípravy vzorky (Guerard et al., 2014), a/alebo extrémnejší účinok genotoxicity testovanej chemikálie. Z iných údajov vyplýva, že vznikajú z dôvodu rozsiahleho, no pravdepodobne opraviteľného poškodenia DNA (Lorenzo et al., 2013).
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Tkanivá alebo bunkové jadrá možno úspešne zmraziť na účely ďalšej analýzy. To obyčajne umožní zmerať reakciu na nosič a pozitívnu kontrolu ((Recio et al., 2010; Recio et al., 2012; Jackson et al., 2013). V prípade ich použitia by laboratórium malo preukázať schopnosť používať metódy zmrazovania a potvrdiť prijateľné nízke rozsahy % chvostovej DNA v cieľových tkanivách zvierat ošetrených nosičom, ako aj skutočnosť, že pozitívne reakcie je možné naďalej pozorovať. V odbornej literatúre boli opísané rôzne metódy zmrazovania tkanív. V súčasnosti však neexistuje žiadna dohoda o tom, ako tkanivá čo najlepšie zmrazovať a rozmrazovať a akým spôsobom posúdiť, či potenciálna odchýlka reakcie dokáže ovplyvniť citlivosť skúšky.
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Z nedávnych prác je zrejmé, že zoznam kritických premenných sa podľa všetkého zúži a parametre kritických premenných budú presnejšie definované (Guerard et al., 2014).
                                 
                              
                           Odkazy
                        
                        
                                    1.
                                 
                                 
                                    Guerard, M., C. Marchand, U. Plappert-Helbig (2014), Influence of Experimental Conditions on Data Variability in the Liver Comet Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 55/2, pp. 114-21.
                                 
                              
                                    2.
                                 
                                 
                                    Jackson, P. et al. (2013), Validation of use of frozen tissues in high-throughput comet assay with fully-automatic scoring, Mutagenesis, Vol. 28/6, pp. 699-707.
                                 
                              
                                    3.
                                 
                                 
                                    Lorenzo, Y. et al. (2013), The comet assay, DNA damage, DNA repair and cytotoxicity: hedgehogs are not always dead, Mutagenesis, Vol. 28/4, pp. 427-32.
                                 
                              
                                    4.
                                 
                                 
                                    OECD (2014), Reports of the JaCVAM initiative international pre-validation and validation studies of the in vivo rodent alkaline comet assay for the detection of genotoxic carcinogens, Series on Testing and Assessment, Nos. 195 and 196, OECD Publishing, Paris.
                                 
                              
                                    5.
                                 
                                 
                                    Recio L, Hobbs C, Caspary W, Witt KL, (2010), Dose-response assessment of four genotoxic chemicals in a combined mouse and rat micronucleus (MN) and Comet assay protocol, J. Toxicol. Sci. 35:149-62.
                                 
                              
                                    6.
                                 
                                 
                                    Recio, L. et al. (2012), Comparison of Comet assay dose-response for ethyl methanesulfonate using freshly prepared versus cryopreserved tissues, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 53/2, pp. 101-13.
                                 
                              “
               
                     16.
                  
                  
                     V časti C sa kapitola C.13 nahrádza takto:
                     „C.13   Bioakumulácia u rýb: expozícia vo vodnom prostredí a z potravy
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 305 (2012). Hlavný cieľ tejto revízie testovacej metódy je dvojaký. Po prvé, doplniť test bioakumulácie z potravy (36) vhodný na stanovenie bioakumulačného potenciálu látok s veľmi nízkou rozpustnosťou vo vode. Po druhé, vytvoriť takú testovaciu metódu, v rámci ktorej by sa v náležitých prípadoch používalo z dôvodu dobrých životných podmienok zvierat menej rýb a bola by nákladovo efektívnejšia.
                     Od schválenia konsolidovanej testovacej metódy C.13 (1) bolo testovaných množstvo látok a tak sa laboratóriám, ako aj regulačným orgánom podarilo získať dostatočné množstvo poznatkov. To viedlo k presvedčeniu, že zložitosť tohto testu je možné znížiť, ak sú splnené osobitné kritériá (pozri bod 88) a je možné použiť viacúrovňový prístup. Prax tiež ukázala, že výsledky môžu výrazne ovplyvniť biologické faktory ako rast a obsah lipidov v rybách, ktoré môže byť potrebné zohľadniť. Navyše sa zistilo, že testovanie látok s veľmi nízkou rozpustnosťou vo vode sa nemusí dať technicky realizovať. Okrem toho pre látky s veľmi nízkou rozpustnosťou vo vodnom prostredí môže mať expozícia vodou v porovnaní s expozíciou potravou len obmedzený význam. To viedlo k vypracovaniu testovacej metódy, v ktorej sú ryby vystavené účinkom z ich potravy (pozri body 7 – 14 a bod 97 a ďalej). Validácia (kruhovým testom) skúšky expozície z potravy bola vykonaná v roku 2010 (51).
                     Medzi hlavné zmeny patrí:
                     
                                 —
                              
                              
                                 testovanie iba jednej testovanej koncentrácie sa môže považovať za dostatočné, ak je pravdepodobné, že biokoncentračný faktor (BCF) nezávisí od testovanej koncentrácie,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 model testu s minimálnou vodnou expozíciou, pri ktorom je možný obmedzený počet odberu vzoriek skúšobných, ak sú splnené určité kritériá,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 obsah lipidov v rybách by sa mal merať tak, aby bolo možné vyjadriť hodnotu BCF na základe 5 % obsahu lipidov,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 väčší dôraz na odhad kinetického BCF (pokiaľ je možný) popri odhade BCF v ustálenom stave,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pre určité skupiny látok sa navrhuje skúška expozície z potravy v prípade, že sa považuje za vhodnejší ako test vodnej expozície,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 hmotnosť rýb by sa mala merať tak, aby bolo možné opraviť hodnotu BCFk s vzhľadom na rast.
                              
                           Pred uskutočnením ktoréhokoľvek z testov bioakumulácie by mali byť známe tieto informácie o testovanej látke:
                     
                                 a)
                              
                              
                                 citlivosť analytickej metódy merania tkanív a koncentrácií testovanej látky a jej možných metabolitov vo vode a v potrave (pozri bod 65),
                              
                           
                                 b)
                              
                              
                                 rozpustnosť vo vode [TM A.6], (2)]; v snahe získať spoľahlivé hodnoty by sa rozpustnosť mala stanovovať v súlade s tou metódou, ktorá zodpovedá (predpokladanej) škále rozpustnosti. Pri hydrofóbnych látkach je to zvyčajne metóda vypierania z kolóny;
                              
                           
                                 c)
                              
                              
                                 rozdeľovací koeficient n-oktanol – voda, K
                                    OW
                                     (37) [TM A.8 (4), A.24 (5), A.23 (6)], alebo iné vhodné informácie o správaní sa pri rozdeľovaní (napr. sorpcia na lipidy, K
                                    OC); v snahe získať spoľahlivé hodnoty by sa rozpustnosť mala stanovovať v súlade s tou metódou, ktorá zodpovedá (predpokladanému) rozsahu K
                                    OW. Pri hydrofóbnych látkach je to zvyčajne metóda pomalého miešania (6) [TM A.23 (6)];
                              
                           
                                 d)
                              
                              
                                 stabilita látky vo vode (hydrolýza [TM C.7 (7)]);
                              
                           
                                 e)
                              
                              
                                 stabilita látky v potrave (zvlášť v prípade, ak sa zvolí skúška expozície z potravy);
                              
                           
                                 f)
                              
                              
                                 informácie o fototransformácii potrebné na nastavenie podmienok ožarovania v teste (8);
                              
                           
                                 g)
                              
                              
                                 povrchové napätie (t. j. v prípade látok, pri ktorých nie je možné stanoviť log KOW) [TM A.5 (9)];
                              
                           
                                 h)
                              
                              
                                 tlak pár [TM A.4 (10)];
                              
                           
                                 i)
                              
                              
                                 v prípade potreby akékoľvek informácie o biotickom alebo abiotickom odbúravaní vo vode napr. (nie však výlučne) ľahká biodegradovateľnosť [TM C.4 časti II až VII (11), C.29 (12)];
                              
                           
                                 j)
                              
                              
                                 v prípade potreby informácie o metabolitoch: štruktúra, log KOW, tvorba a odbúrateľnosť;
                              
                           
                                 k)
                              
                              
                                 disociačná konštanta kyselín (pK
                                    a) v prípade látok, ktoré by mohli ionizovať. V prípade potreby by sa malo upraviť pH skúšobnej vody tak, aby sa zabezpečilo, že látka bude počas testu v neionizujúcom stave, ak je tento stav zlučiteľný s daným druhom rýb.
                              
                           V tejto testovacej metóde je opísaný postup charakterizácie bioakumulačného potenciálu látok v rybách, a to bez ohľadu na zvolenú metódu expozície alebo spôsob odberu vzoriek. Uprednostňujú sa hlavne modely prietokového testu, pričom prípustné sú aj polostatické modely za predpokladu, že boli splnené kritériá platnosti skúšky (pozri body 24 a 113). V prípade expozície z potravy nie je na udržanie koncentrácií testovanej látky vo vodnom prostredí potrebný prietokový model, ktorý však pomáha udržiavať adekvátne koncentrácie rozpusteného kyslíka, zabezpečovať čistú vodu a odstraňovať rôzne vplyvy, napr. produkty vylučovania.
                     Bez ohľadu na zvolenú testovaciu metódu je v tejto testovacej metóde uvedené dostatočné množstvo podrobností na uskutočnenie testu a súčasne poskytnutý adekvátny priestor na prispôsobenie pokusného modelu podmienkam jednotlivých laboratórií a na rôzne vlastnosti testovaných látok. Test vodnej expozície je najvhodnejšie použiť v prípade stálych organických látok s hodnotami log KOW medzi 1,5 a 6,0 (13), no dá sa použiť aj v prípade vysokohydrofóbnych látok (s log KOW > 6,0), ak sa preukáže stála a celkom rozpustená koncentrácia testovanej látky vo vode. Ak stálu koncentráciu testovanej látky vo vode nie je možné preukázať, štúdia vo vodnom prostredí nemusí byť vhodná, a preto sa môže vyžadovať testovanie látky v potrave rýb (hoci interpretácia a využitie výsledkov skúšky expozície z potravy môžu závisieť od regulačného rámca). Predbežné odhady biokoncentračného faktora (BCF, niekedy označovaný aj ako KB) v prípade organických látok s hodnotami log KOW približne do 9,0 možno získať použitím rovnice od Binteina a kol. (14). Predbežný odhad biokoncentračného faktora môže byť v prípade takýchto vysokohydrofóbnych látok vyšší ako hodnota biokoncentračného faktora v ustálenom stave (BCFSS), ktorá sa má dosiahnuť laboratórnymi pokusmi, zvlášť ak sa na stanovenie predbežného odhadu použije jednoduchý lineárny model. Medzi parametre charakterizujúce bioakumulačný potenciál patrí rýchlostná konštanta vychytávania (k
                        1), rýchlostné konštanty vylučovania vrátane rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2), biokoncentračný faktor v ustálenom stave (BCFSS), kinetický biokoncentračný faktor (BCFK) a potravový biomagnifikačný faktor (BMF) (38).
                     Testované látky označené rádioaktívnym izotopom môžu uľahčiť analýzu vzoriek vody, potravín a rýb a môžu sa použiť pri rozhodovaní o tom, či je potrebné vykonať identifikáciu a kvantifikáciu metabolitov. Ak sa meria iba celkové množstvo rádioaktívnych rezíduí (napríklad po spálení alebo solubilizácii tkaniva), hodnota BCF alebo BMF vychádza z celkového množstva materskej látky spolu so všetkými zadržanými metabolitmi a asimilovaným uhlíkom. Hodnoty BCF alebo BMF založené na celkovom množstve rádioaktívnych rezíduí preto nemožno priamo porovnávať s hodnotami BCF alebo BMF získanými špecifickou chemickou analýzou samotnej materskej látky. Separačné postupy ako TLC, HPLC alebo GC (39) možno použiť pred analýzou v rámci štúdií látok označených rádioaktívnym izotopom s cieľom určiť hodnoty BCF alebo BMF vychádzajúce z materskej látky. Ak sa použije niektorá zo separačných techník, mala by sa vykonať identifikácia a kvantifikácia materskej látky a príslušných metabolitov (40) (pozri bod 65), ak majú hodnoty BCF a BMF vychádzať z koncentrácie materskej látky v rybách, a nie z celkového množstva rezíduí označených rádioaktívnym izotopom. Možná je aj kombinácia štúdie metabolizmu rýb alebo štúdie distribúcie in vivo so štúdiou bioakumulácie na základe analýzy a identifikácie rezíduí v tkanivách. Pravdepodobnosť metabolizmu je možné predpovedať vhodnými nástrojmi (napr. súborom nástrojov OECD QSAR Toolbox (15) a patentovanými programami QSAR).
                     Rozhodnutie o tom, či vykonať skúšku expozície vo vodnom prostredí alebo expozície z potravy a za akých podmienok, by malo vychádzať z faktorov uvedených v bode 3 s prihliadnutím na príslušný regulačný rámec. Napríklad v prípade látok, ktoré majú vysokú hodnotu log KOW, a napriek tomu naďalej vykazujú značnú rozpustnosť vo vode vzhľadom na citlivosť dostupných analytických techník, by sa malo v prvom rade zvážiť vykonanie testu vodnej expozície. Je však možné, že informácie o rozpustnosti vo vode nie sú v prípade týchto typov hydrofóbnych látok definitívne, preto by sa pred prijatím rozhodnutia o tom, ktorú testovaciu metódu použiť, mala preskúmať možnosť pripraviť stále a merateľné koncentrácie rozpustené vo vodnom prostredí (stabilné emulzie nie sú povolené) použiteľné pre štúdiu vodnej expozície (16). K tejto metóde nie je možné vypracovať presne predpísané pokyny k jej používaniu, ktoré by boli založené na rozpustnosti vo vode a hraničných kritériách rozdeľovacieho koeficientu oktanol – voda, keďže aj iné faktory (analytické techniky, degradácia, adsorpcia atď.) môžu mať z uvedených dôvodov značný vplyv na spôsob jej uplatňovania. Avšak hodnota log KOW nad 5 a rozpustnosť vo vode pod ~0,01 – 0,1 mg/l označujú škálu látok, v prípade ktorých by testovanie použitím expozíciou vo vodnom prostredí mohlo byť čoraz ťažšie.
                     Do úvahy by sa mali vziať aj ďalšie faktory, ktoré môžu ovplyvniť výber testu vrátane adsorpčného potenciálu látky vo vzťahu k nosičom a prístrojovému vybaveniu a jej stability vo vodnom roztoku v porovnaní so stabilitou v potrave rýb (17) (18) atď.
                     Informácie o týchto praktických aspektoch môžu byť k dispozícii aj z iných ukončených štúdií vo vodnom prostredí. Ďalšie informácie o hodnotení aspektov týkajúcich sa výkonnosti bioakumulačných štúdií sú k dispozícii v odbornej literatúre (napr. 19).
                     V prípade látok, pri ktorých rozpustnosť alebo udržanie koncentrácií vo vodnom prostredí, ako aj ich analýza neobmedzujú realizáciu metódy vodnej expozície, sa táto metóda uprednostňuje na určenie biokoncentračného potenciálu látky. V každom prípade by sa malo overiť, či je použitá koncentrácia, resp. koncentrácie pri expozícii vo vodnom prostredí v rozsahu rozpustnosti testovaného média. Môžu sa použiť rôzne metódy udržiavania stabilných koncentrácií rozpustenej testovanej látky, napr. použitím zásobných roztokov alebo modelov pasívneho dávkovania (napr. metódou vypierania z kolóny), pokiaľ je možné preukázať udržanie stálych koncentrácií bez toho, aby došlo k zmene testovaného média odporúčaného v bode 27.
                     V prípade vysokohydrofóbnych látok (log KOW > 5 a rozpustnosť pod ~ 0,01 – 0,1 mg/l) môže byť testovanie expozíciou vo vodnom prostredí čoraz ťažšie. Dôvody obmedzení môžu byť napr. neschopnosť udržať dostatočne stálu úroveň koncentrácie vo vodnom prostredí (napr. z dôvodu sorpcie na sklenené expozičné nádoby, príp. rýchleho vychytávania rybami) alebo nedostatočne vysoké úrovne použitých koncentrácií vo vodnom prostredí, ktoré sú v rovnakom rozpätí alebo nižšie ako analytický kvantifikačný limit (41). V prípade týchto vysokohydrofóbnych látok sa odporúča skúška expozície z potravy za predpokladu, že je v súlade s príslušným regulačným rámcom a potrebami hodnotenia rizík.
                     V prípade povrchovo aktívnych látok by sa na základe vlastností látky mala zvážiť realizovateľnosť testu biokoncentrácie vo vodnom prostredí, v opačnom prípade by asi bola vhodnejšia skúška expozície z potravy. Povrchovo aktívne látky sú činidlá, ktoré znižujú povrchové napätie medzi dvoma kvapalinami. Ich amfifilný charakter (t. j. obsah tak hydrofilnej, ako aj hydrofóbnej zložky) spôsobuje, že sa hromadia na rozhraniach, ako napr. voda – vzduch, voda – potrava, ako aj na sklenených stenách, čo znemožňuje presne stanoviť ich koncentráciu vo vodnom prostredí.
                     Skúškou expozície z potravy je možné sa vyhnúť niektorým aspektom expozície v prípade komplexných zmesí obsahujúcich zložky s rozdielnou maximálnou rozpustnosťou vo vode, keďže porovnateľná expozícia účinkom všetkých zložiek zmesi je pravdepodobnejšia ako metóda vo vodnom prostredí (pozri bod 20).
                     Treba však pripomenúť, že skúškou expozície z potravy sa získa skôr biomagnifikačný (BMF) ako biokoncentračný faktor (BCF) (42). Existujú postupy, ktorými je možné získať odhad kinetického biokoncentračného faktora (BCFK) z údajov získaných zo skúšky expozície z potravy (pozri dodatok 8), mali by sa však používať opatrne. Vo všeobecnosti totiž tieto prístupy rátajú s kinetikou prvého rádu a dajú sa použiť iba v prípade určitých skupín zlúčenín. Nie je pravdepodobné, že by sa dali použiť v prípade povrchovo aktívnych látok (pozri bod 12).
                     Minimalistický model skúšky expozície vo vodnom prostredí s menším počtom odberu vzoriek, ktorým sa má znížiť množstvo zvierat a/alebo zdrojov (pozri bod 83 a ďalej), by sa mal použiť len v prípade takých látok, pri ktorých existuje dôvod sa domnievať, že vychytávanie i depurácia budú prebiehať podľa kinetiky prvého rádu (t. j. vo všeobecnosti ide o neionizované organické látky, pozri bod 88).
                     C.13 – I:   Test biokoncentrácie u rýb s expozíciou vo vodnom prostredí
                     
                     PRINCÍP TESTU
                     Test pozostáva z dvoch fáz: z expozičnej (vychytávacej) a post-expozičnej (depuračnej) fázy. Počas vychytávacej fázy sa skupina rýb jedného druhu rýb vystaví účinkom testovanej látky pri jednej alebo viacerých zvolených koncentráciách, a to v závislosti od vlastností testovanej látky (pozri bod 49). Potom sa premiestnia do média bez testovanej látky a začne sa depuračná fáza. Depuračná fáza je vždy povinná, pokiaľ vychytávanie testovanej látky počas vychytávacej fázy nie je významné. Počas oboch fáz testu sa sleduje koncentrácia testovanej látky v/na rybách (alebo v určitých rybích tkanivách). Okrem exponovanej skupiny existuje v rovnakých podmienkach, ale bez testovanej látky, aj kontrolná skupina rýb, ktorá slúži na porovnanie možných nepriaznivých účinkov pozorovaných v priebehu skúšky biokoncentrácie s vhodnou kontrolnou skupinou, ako aj na získanie pozaďových koncentrácií testovanej látky (43).
                     Pri skúške expozície vo vodnom prostredí trvá vychytávacia fáza obyčajne 28 dní. Jej trvanie sa môže v prípade potreby predĺžiť (pozri bod 18), alebo skrátiť, ak sa preukáže, že ustálený stav bol dosiahnutý skôr (pozri dodatok 1, definície a jednotky). Prognózu dĺžky vychytávacej fázy potrebnej na dosiahnutie ustáleného stavu možno vypočítať rovnicami, ktoré sú uvedené v dodatku 5. Depuračná fáza sa začne po tom, ako ryby prestanú byť vystavované účinkom testovanej látky a premiestnia sa do čistej nádoby s rovnakým médiom, ale bez testovanej látky. Všade, kde je to možné, sa vypočíta biokoncentračný faktor podľa možnosti ako pomer koncentrácie v rybách (C
                        f) a vo vode (C
                        w) pri ustálenom stave (BCFSS, pozri definíciu v dodatku 1) a ako kinetický biokoncentračný faktor (BCFK, pozri dodatok 1, definície a jednotky), ktorý sa odhaduje ako pomer rýchlostných konštánt vychytávania (k
                        1) a depurácie (k
                        2) podľa kinetiky prvého rádu (44).
                     Ak sa ustálený stav do 28 dní nedosiahne, tak sa buď vypočíta BCF použitím kinetického prístupu (pozri bod 38), alebo sa môže predĺžiť vychytávacia fáza. Ak by to znamenalo príliš dlhú vychytávaciu fázu, ktorá sa v praxi nedá na dosiahnutie ustáleného stavu uskutočniť, (pozri body 37 a 38, dodatok 5), uprednostní sa kinetický prístup. Alternatívne sa v prípade vysoko hydrofóbnych látok môže zvážiť vykonanie skúšky expozície z potravy (45) za predpokladu, že je táto skúška v súlade s príslušným regulačným rámcom.
                     Na základe modelu, ktorý najlepšie opisuje namerané koncentrácie testovanej látky v rybách a vo vode, sa vypočíta rýchlostná konštanta vychytávania, rýchlostná koncentrácia (vylučovania) depurácie (alebo rýchlostné konštanty v prípade komplexnejších modelov), biokoncentračný faktor (v ustálenom stave a/alebo kinetický) a tam, kde je to možné, aj intervaly spoľahlivosti každého z týchto parametrov (pozri dodatok 5).
                     Nárastom hmotnosti rýb počas skúšky dôjde k zníženiu koncentrácie testovanej látky v rastúcich rybách (tzv. znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu), a tým aj k podhodnoteniu kinetického BCF, ak sa jeho hodnota neupraví o rast (pozri body 72 a 73).
                     BCF je založený na celkovej koncentrácii v rybách (t. j. na celkovej vlhkej hmotnosti rýb). Z osobitných dôvodov sa však môžu v prípadoch dostatočnej veľkosti rýb niekedy použiť určené tkanivá alebo orgány (napríklad sval, pečeň), alebo sa môžu ryby rozdeliť na jedlé (rezy) alebo nejedlé časti (vnútornosti). Pretože pri mnohých organických látkach sa pozoruje jasná súvislosť medzi ich biokoncentračným potenciálom a hydrofóbnosťou, existuje aj príslušná súvislosť medzi obsahom lipidov v testovaných rybách a pozorovanou biokoncentráciou týchto látok. V záujme obmedzenia zdroja tejto variability výsledkov testovania dosahovaných s vysokolipofilnými látkami (t. j. s log KOW > 3) by sa preto biokoncentrácia rýb mala okrem vyjadrenia v podobe hodnoty získanej priamo zo štúdie aj normalizovať, a to podľa rýb s obsahom lipidov 5 % (na základe vlhkej hmotnosti celého tela). Tým sa získa základ, ku ktorému sa budú vzájomne prirovnávať výsledky dosiahnuté s rôznymi látkami a/alebo testovanými druhmi. Hodnota obsahu lipidov 5 % sa všade používa preto, že predstavuje priemerný obsah lipidov u rýb bežne používaných v tejto testovacej metóde (21).
                     INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE
                     Okrem vlastností testovanej látky uvedených v úvode (bod 3) sú ďalšími požadovanými informáciami toxicita u druhov rýb, ktoré sa majú testovať, najlepšie ako asymptotická LC50 (t. j. nezávislá od času) a/alebo odhadovaná toxicita z dlhodobých testov s rybami [napr. testovacie metódy C.47 (22), C.15 (23), C.14 (24)].
                     Na kvantifikáciu látky v testovaných roztokoch a v biologickom materiáli by mala byť k dispozícii primeraná analytická metóda so známou presnosťou a spoľahlivosťou, ako aj s údajmi o príprave a skladovaní vzorky. Okrem toho treba poznať analytický kvantifikačný limit testovanej látky tak vo vode, ako aj v rybích tkanivách. Ak sa ako testovaná látka použije látka označená rádioaktívnym izotopom, mala by mať najvyššiu možnú čistotu (podľa možnosti napr. > 98 %), pričom by malo byť známe aj percento rádioaktivity v súvislosti s nečistotami.
                     PLATNOSŤ TESTU
                     Na účely platnosti testu sa musia dodržať tieto podmienky:
                     
                                  
                              
                              
                                 teplota vody nesmie kolísať viac ako ± 2 °C, pretože veľké odchýlky môžu ovplyvniť biologické parametre vychytávania a depurácie a spôsobovať zvieratám stres,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnúť pod 60 % saturácie,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 koncentrácia testovanej látky v komorách sa musí udržiavať v rozmedzí ± 20 % priemeru hodnôt nameraných počas vychytávacej fázy,
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 koncentrácia testovanej látky je pod hranicou maximálnej rozpustnosti vo vode, ak sa vezme do úvahy účinok, ktorý môže mať testovaná vody na efektívnu rozpustnosť (46),
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 úmrtnosť alebo iné nepriaznivé vplyvy/choroby sú na konci testu v skupinách testovaných i kontrolných rýb nižšie ako 10 %, pri trvaní testu počas niekoľkých týždňov alebo mesiacov by mal byť úhyn alebo iné nepriaznivé javy v prípade obidvoch skupín rýb nižší ako 5 % za týždeň a celkovo nemal by presiahnuť 30 %. Výrazné rozdiely v priemernom raste medzi testovanými a kontrolnými skupinami rýb zo vzorky by mohli byť signálom toxického účinku testovanej látky.
                              
                           REFERENČNÉ LÁTKY
                     Použitie referenčných látok so známym biokoncentračným potenciálom a nízkym metabolizmom by pomohlo pri kontrole experimentálneho postupu, ak sa vyžaduje (napr. ak laboratórium nemá žiadne predchádzajúce skúsenosti s testom alebo došlo k zmene podmienok pokusu).
                     OPIS METÓDY
                     
                        Prístrojové vybavenie
                     
                     Pri všetkých súčastiach zariadení sa treba vyhýbať používaniu materiálov, ktoré sa môžu rozpúšťať, absorbovať a lúhovať a ktoré môžu mať na ryby nepriaznivé účinky. Možno používať bežné nádrže pravouhlého alebo valcovitého tvaru z vhodného materiálu a takej veľkosti, ktorá zodpovedá veľkosti násady rýb (pozri bod 43). Pokiaľ možno, treba sa vyhýbať používaniu hadičiek a rúrok z mäkkých plastov. Mali by sa použiť rúrky z polytetrafluóretylénu, nehrdzavejúcej ocele a/alebo zo skla. Zo skúseností vyplýva, že pri testovaných látkach s vysokým adsorpčným koeficientom (napríklad pri syntetických pyretroidoch) môže byť potrebné používať posilanizované sklo. V takýchto prípadoch by sa toto zariadenie malo po použití zlikvidovať. Je vhodné, aby boli testované systémy ešte pred použitím testovaných organizmov vystavené účinkom koncentrácií testovanej látky, ktorá sa má použiť pri štúdii, a to tak dlho, ako je potrebné na preukázanie udržania stabilných expozičných koncentrácií.
                     
                        Voda
                     
                     Pri testoch sa vo všeobecnosti používa prírodná voda, ktorá by sa mala získavať z nekontaminovaných zdrojov s jednotnou kvalitou. Napriek tomu môže byť na zaručenie rovnakej kvality v čase vhodnejšia rekonštituovaná voda (t. j. demineralizovaná voda s pridanými špecifickými živinami v známych množstvách). Voda na riedenie je voda, ktorá sa zmieša s testovanou látkou pred tým, ako sa pridá do testovacej nádoby (pozri bod 30), a mala by mať takú kvalitu, aby v nej druh rýb, ktorý sa má použiť v teste, mohol prežiť fázy aklimatizácie a testu bez toho, aby vykazoval znaky abnormálneho vzhľadu alebo správania. V ideálnom prípade treba preukázať, že testovaný druh dokáže vo vode na riedenie prežívať, rásť a rozmnožovať sa (napríklad pomocou testu v laboratórnej kultúre alebo testu toxicity pre životný cyklus). Vodu na riedenie treba charakterizovať najmenej z hľadiska pH, tvrdosti, celkového obsahu tuhých látok a celkového organického uhlíka (TOC (47)) a pokiaľ možno aj obsahu amoniaku, dusitanov, ako aj z hľadiska zásaditosti a pri morských druhoch aj slanosti. Hoci parametre, ktoré sú potrebné na zaručenie optimálnych životných podmienok rýb, nie sú celkom známe, v dodatku 2 sú uvedené odporúčané maximálne koncentrácie celého radu parametrov charakterizujúcich sladkú aj morskú vodu.
                     Voda na riedenie by mala mať konštantnú kvalitu počas celého trvania testu. Hodnota pH by sa mala pohybovať v rozmedzí 6,0 až 8,5 na začiatku testu, no počas príslušného testu by nemala kolísať o viac ako ± 0,5 jednotiek pH. Aby voda na riedenie neovplyvňovala neprimeraným spôsobom výsledky testovania (napríklad vytváraním komplexov s testovanou látkou) alebo aby nemala nepriaznivý vplyv na stav násady rýb, je potrebné zabezpečiť v pravidelných intervaloch – aspoň na začiatku a konci testu – odber vzoriek na analýzu. Ak je známe, že voda na riedenie má relatívne konštantnú kvalitu, mala by sa, napr. každé tri mesiace, zisťovať prítomnosť ťažkých kovov (napr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavných aniónov a katiónov (napr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, a SO4
                        2-), pesticídov (napr. celkové organofosforečné a celkové organochlórové pesticídy) celkového organického uhlíka a tuhých suspendovaných látok. Ak sa preukázalo, že kvalita vody na riedenie bola konštantná najmenej jeden rok, spomínané zisťovanie sa môže vykonávať menej často a vo väčších časových rozostupoch (napr. každých šesť mesiacov).
                     Obsah prirodzených tuhých častíc, ako aj celkového organického uhlíka vo vode na riedenie by mal byť čo možno najnižší, aby sa zabránilo absorpcii testovanej látky na organickú hmotu, v dôsledku čoho by sa mohla znížiť jej biologická dostupnosť, ktorá by viedla k podhodnoteniu BCF. Maximálny prípustný obsah tuhých častíc je 5 mg/l (sušina zachytená na 0,45 μm filter) a celkového organického uhlíka 2 mg/l (pozri dodatok 2). V prípade potreby treba vodu na riedenie pred použitím filtrovať. Prírastok obsahu organického uhlíka spôsobený v testovanej vode z testovaných rýb (exkrementy) a zo zvyškov krmiva by sa mal pokiaľ možno minimalizovať (pozri bod 46).
                     
                        Testovacie roztoky
                     
                     Pripravte zásobný roztok testovanej látky s vhodnou koncentráciou. Zásobný roztok treba podľa možnosti pripraviť jednoduchým zmiešaním alebo trepaním testovanej látky vo vode na riedenie. Alternatívne sa môže v niektorých prípadoch použiť dávkovací systém s desorpciou tuhej fázy. Použitie rozpúšťadiel alebo disperzných činidiel (solubilizačných prostriedkov) sa vo všeobecnosti neodporúča (pozri bod 25). Ich použitie však môže byť prijateľné, ak sa má získať zásobný roztok vhodnej koncentrácie; v tom prípade by sa ale malo vyvinúť maximálne úsilie na minimalizáciu ich použitia a zároveň zabránenie prekročenia kritickej hranice koncentrácie micel v nich (v relevantných prípadoch). Medzi rozpúšťadlá, ktoré možno použiť, patria acetón, etanol, metanol, dimetylformamid a trietylénglykol. Ako disperzné činidlá sa používajú Tween 80, 0,01 % metylcelulóza a HCO-40. Koncentrácia rozpúšťadla v konečnom testovacom médiu by mala byť pri všetkých pokusoch rovnaká (t. j. bez ohľadu na koncentráciu testovanej látky) a nemala by prekročiť zodpovedajúce hraničné hodnoty toxicity stanovené pre rozpúšťadlo v testovacích podmienkach. Maximálna koncentrácia je 100 mg/l (alebo 0,1 ml/l). Je nepravdepodobné, že by rozpúšťadlo s koncentráciou 100 mg/l výrazne zmenilo maximálnu koncentráciu rozpustenej testovanej látky, ktorú je možné v danom médiu dosiahnuť (25). Mal by byť známy prírastok z rozpúšťadla (spolu s testovanou látkou) k celkovému obsahu organického uhlíka v testovanej vode. Koncentrácia celkového organického uhlíka v testovacích nádobách by nemala počas celého trvania testu prekročiť koncentráciu organického uhlíka pochádzajúcu z testovanej látky a z rozpúšťadla, prípadne zo solubilizačného prostriedku (48), ak sa použil, a to o viac ako 10 mg/l (± 20 %). Obsah organických látok môže mať významný vplyv na množstvo voľne rozpustenej testovanej látky počas prietokových testov na rybách, zvlášť v prípade vysokolipofilných látok. Mikroextrakcia tuhej fázy (pozri bod 60) môže poskytnúť dôležité informácie o pomere medzi viazanými a voľne rozpustenými zlúčeninami, pričom voľne rozpustené zlúčeniny sú považované za biologicky dostupnú frakciu. Koncentrácia testovanej látky by mala byť nižšia ako je maximálna rozpustnosť testovanej látky v testovacom médiu napriek tomu, že sa použilo rozpúšťadlo alebo solubilizačný prostriedok. Rozpúšťadlá, ktoré ľahko podliehajú biodegradácii, treba používať s opatrnosťou, pretože môžu v prietokových testoch spôsobovať problémy s množením baktérií. Ak sa zásobný roztok nedá pripraviť bez použitia solubilizačného prostriedku, malo by sa zvážiť, či by namiesto štúdie expozície z potravy nebolo vhodné vykonať štúdiu expozície vo vodnom prostredí.
                     Pri prietokových testoch je potrebné použiť systém nepretržitého prívodu a riedenia zásobného roztoku testovanej látky (napríklad meracie čerpadlo, prístroj na proporčné riedenie, saturačný systém) alebo dávkovací systém s desorpciou tuhej fázy, ktorým sa zabezpečí prívod testovacích koncentrácií do testovacích komôr. Ak sa dá, mal by sa objem každej testovacej komory denne aspoň päťkrát vymeniť. Treba uprednostniť prietokový systém, hoci tam, kde to nie je možné (napr. ak by to malo nepriaznivý vplyv na testované organizmy), sa môže pod podmienkou splnenia kritérií platnosti skúšky použiť aj polostatická metóda (pozri bod 24). Prietokovú rýchlosť zásobného roztoku aj vody na riedenie je potrebné skontrolovať 48 hodín pred začatím testu a potom najmenej raz denne počas celého jeho trvania. Pri tom treba skontrolovať aj rýchlosť prietoku cez každú testovaciu komoru a zabezpečiť, aby odchýlky prietoku v rámci komôr i medzi nimi nepresiahli 20 %.
                     
                        Výber druhov
                     
                     Pri výbere druhov sa treba riadiť týmito dôležitými kritériami: musia byť ľahko dostupné, možno ich získať vo vhodnej veľkosti a možno ich bez problémov chovať v laboratóriu. Ďalšie kritériá, ktoré treba pri výbere druhov rýb zohľadniť, sú: rekreačný, komerčný a ekologický význam, ako aj ich porovnateľná citlivosť, ich úspešné použitie v minulosti atď. Odporúčané testovacie druhy sú uvedené v dodatku 3. Možno použiť aj iné druhy, postup testovania však treba upraviť tak, aby sa dosiahli vhodné testovacie podmienky. V tomto prípade je potrebné zaznamenať dôvody, ktoré viedli k výberu iných druhov a experimentálnych metód. Vo všeobecnosti sa použitím menších druhov rýb skráti čas potrebný na dosiahnutie ustáleného stavu, ale možno bude treba viac rýb (vzoriek) na primeranú analýzu obsahu lipidov a koncentrácií testovanej látky v rybách. Porovnanie výsledkov medzi jednotlivými testami a testovanými druhmi môžu ovplyvniť aj rozdiely medzi mladými a staršími rybami v rýchlosti spotreby kyslíka a metabolizme. Treba poznamenať, že druhy rýb testované v (juvenilnej) životnej fáze vyznačujúcej sa rýchlym rastom môžu komplikovať interpretáciu údajov.
                     
                        Chov rýb (na účely skúšky expozície vo vodnom prostredí a expozície z potravy)
                     
                     Zásobná populácia rýb by sa mala aspoň dva týždne aklimatizovať vo vode (pozri bod 28) pri testovacej teplote a dostatočnom prísune potravy (pozri bod 45). Tak voda, ako aj potrava by mali byť zodpovedať typu, ktorý sa použije počas testu.
                     Po 48-hodinovej adaptačnej fáze sa zaznamená úmrtnosť a uplatnia tieto kritériá:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ak úmrtnosť po siedmich dňoch prekračuje 10 % populácie: celá násada sa vyradí,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ak sa úmrtnosť po siedmich dňoch pohybuje od 5 do 10 % populácie: obdobie aklimatizácie sa predĺži o ďalších sedem dní; ak je aj počas týchto siedmich dní úmrtnosť vyššia ako 5 %, celá násada sa vyradí,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 ak je úmrtnosť po siedmich dňoch pod 5 % populácie: násada sa akceptuje.
                              
                           Ryby použité v testoch by mali byť bez zjavných chorôb a abnormalít. Všetky choré ryby treba zlikvidovať. Počas dvoch týždňov predchádzajúcich testu alebo počas testu by ryby nemali byť ošetrované v súvislosti s ochorením.
                     VYKONANIE TESTU
                     
                        Predbežná skúška
                     
                     Môže byť užitočné vykonať predbežný pokus v záujme optimalizácie podmienok hlavného testu ako napr. výber koncentrácie(-í) testovanej látky, dĺžka vychytávacej a depuračnej fázy alebo určenie potreby vykonať celý test, príp. iba jeho časť. Predbežná skúška by sa mala navrhnúť tak, aby bolo možné získať požadované informácie. Možno zvážiť aj to, či bude na stanovenie BCF stačiť minimálny test, alebo treba vykonať úplnú štúdiu (pozri body 83 až 95 o minimálnom teste).
                     
                        Podmienky expozície
                     
                     
                        Dĺžka vychytávacej fázy
                     
                     Prognózu dĺžky vychytávacej fázy možno získať z praktických skúseností (napr. z predchádzajúcej štúdie alebo zo súhrnnej štúdie látok s podobnou štruktúrou) alebo na základe istých empirických vzťahov vychádzajúcich buď z poznatkov o rozpustnosti vo vodnom prostredí alebo o rozdeľovacom koeficiente oktanol/voda testovanej látky (za predpokladu, že sa vychytávanie riadi kinetikou prvého rádu, pozri dodatok 5).
                     Vychytávacia fáza by mala trvať 28 dní, ak sa nepreukáže, že ustálený stav bol dosiahnutý skôr (pozri dodatok 1, definície a jednotky). Ustálený stav nastane, ak sa na grafickom znázornení závislosti obsahu testovanej látky v rybe (Cf) od času stane daná krivka rovnobežnou s osou času a tri po sebe idúce analýzy Cf na vzorkách odobratých minimálne v dvojdňových intervaloch sa od seba neodlišujú o viac ako ± 20 % a ak v čase medzi prvou a poslednou z po sebe idúcich analýz nedošlo k žiadnemu výraznému zvýšeniu hodnoty Cf. Pri analyzovaní hromadných vzoriek sa musia vykonať najmenej štyri po sebe idúce analýzy. Pri testovaných látkach, ktoré sú vychytávané pomaly, je primeranejším intervalom sedem dní. Ak sa ustálený stav do 28 dní nedosiahne, tak sa buď vypočíta BCF použitím iba kinetického prístupu, ktorý nezávisí od dosiahnutia ustáleného stavu, alebo sa môže predĺžiť vychytávacia fáza, pričom až do dosiahnutia ustáleného stavu, alebo počas 60 dní, podľa toho, čo nastane skôr, sa uskutočňujú ďalšie merania. Takisto koncentrácia testovanej látky v rybe musí byť na konci vychytávacej fázy dostatočne vysoká, aby sa zabezpečil spoľahlivý odhad k
                        2 z depuračnej fázy. Ak sa po 28 dňoch nepreukáže žiadne významné vychytávanie, test sa môže ukončiť.
                     
                        Dĺžka depuračnej fázy
                     
                     V prípade látok, ktoré sa riadia kinetikou prvého rádu, na dosiahnutie primeraného zníženia (napríklad 95 %) zaťaženia organizmu testovanou látkou obyčajne postačuje polovičná dĺžka vychytávacej fázy (vysvetlenie k tomu odhadu je uvedené v dodatku 5). Ak je čas potrebný na 95 % vylúčenie testovanej látky z praktického hľadiska pridlhý a je napríklad dva razy dlhší ako trvanie vychytávacej fázy (t. j. viac ako 56 dní), potom možno použiť kratšie obdobie (napríklad kým koncentrácia testovanej látky nebude nižšia ako 10 % koncentrácie v ustálenom stave). Pri látkach s komplexnejšími vzorcami vychytávania a depurácie ako v prípade modelu ryby s jedným kompartmentom, ktorý sa riadi kinetikou prvého rádu, sa však pravdepodobne budú musieť použiť dlhšie depuračné časy. Ak sú takéto komplexné vzorce pozorované a/alebo očakávané, odporúča sa zabezpečenie náležitého skúšobného nastavenia konzultovať s bioštatistikom a/alebo farmakokinetikom. Pri predlžovaní depuračnej fázy sa môže znižovať počet rýb na výber vzorky, pričom na výsledky môžu mať vplyv rozdiely v raste rýb. Toto obdobie bude sprevádzané ďalším obdobím, počas ktorého zostáva koncentrácia testovanej látky v rybách nad úrovňou analytického kvantifikačného limitu.
                     
                        Počty testovaných rýb
                     
                     Počty rýb na každú testovanú koncentráciu voľte tak, aby boli na každom mieste odberu vzoriek k dispozícii najmenej štyri ryby. Ryby by sa mali spájať do skupiny iba v prípade, že ich nemožno analyzovať samostatne. Ak sa chce dosiahnuť vyššia presnosť kreslenia krivky (a vypočítaných parametrov), alebo ak sú potrebné metabolické štúdie (napr. na účely odlíšenia metabolitov od materskej látky pri použití testovaných látok označených rádioaktívnym izotopom), bude musieť byť na každom mieste odberu viac rýb. Obsah lipidov by sa mal stanovovať v rovnakom biologickom materiáli, aký sa použil na stanovenie koncentrácie testovanej látky. Ak to nie je možné, môže byť potrebných viac rýb (pozri body 56 a 57).
                     Ak sa použijú dospelé (t. j. pohlavne zrelé) ryby, nemali by byť pred ani počas testu v štádiu neresenia alebo po nedávnom oplodnení (t. j. po neresení). Malo by sa tiež uviesť, či sú na pokus použité samce, samice alebo obe pohlavia. Pri použití oboch pohlaví by sa mali zaznamenávať rozdiely v raste a obsahu lipidov medzi pohlaviami s cieľom vylúčiť ich markantnosť, a to pred začiatkom expozície, zvlášť vtedy, ak sa predpokladá, že bude nevyhnutné samce a samice rýb umiestniť spoločne na zaručenie stanoviteľnosti koncentrácií látky a/alebo obsahu lipidov.
                     Pri akomkoľvek teste vyberajte ryby podobnej hmotnosti tak, aby hmotnosť najmenšej z nich nebola menšia ako dve tretiny hmotnosti tej najväčšej. Všetky musia mať rovnaký vek a pochádzať z toho istého zdroja. Keďže vek a hmotnosť môžu výrazne ovplyvniť hodnoty BCF (12), mali by sa údaje o nich presne zaznamenať. Odporúča sa krátko pred začatím testu odvážiť časť vzorky populácie rýb, aby sa odhadla priemerná hmotnosť (pozri bod 61).
                     
                        Násada
                     
                     Mal by sa použiť vysoký pomer množstva vody k množstvu rýb tak, aby sa minimalizovalo znižovanie koncentrácie testovanej zlúčeniny vo vode spôsobené pridaním rýb na začiatku testu a aby sa zabránilo poklesu koncentrácie rozpusteného kyslíka. Je dôležité, aby veľkosť násady zodpovedala použitému druhu rýb. V každom prípade sa však odporúča zvyčajná veľkosť násady v rozmedzí 0,1 do 1,0 g ryby (vlhká hmotnosť) na liter vody za deň. Možno použiť aj vyšší pomer množstva vody k množstvu rýb, ak možno zabezpečiť udržiavanie požadovanej koncentrácie testovanej látky v rozmedzí povolených výkyvov ± 20 % a koncentrácia rozpusteného kyslíka pritom neklesne pod 60 % saturácie (pozri bod 24).
                     Pri výbere primeraných režimov nasadzovania vezmite do úvahy bežné prirodzené prostredie daného druhu. Napríklad ryby žijúce pri dne môžu v porovnaní s druhmi žijúcimi pri hladine vyžadovať väčšiu plochu dna nádrže pri rovnakom objeme vody.
                     
                        Kŕmenie
                     
                     Počas aklimatizačnej a testovacej fázy kŕmte ryby vhodnou potravou so známym obsahom lipidov a celkovým obsahom bielkovín v množstve dostatočnom na udržanie rýb v dobrom zdravotnom stave a pri stabilnej telesnej hmotnosti (určitý nárast hmotnosti je povolený). Počas aklimatizačnej a testovacej fázy ich kŕmte denne dávkou stanovenou v závislosti od použitých druhov, experimentálnych podmienok a kalorickej hodnoty potravy (napríklad v prípade pstruha dúhového približne medzi 1 až 2 % telesnej hmotnosti denne). Kŕmne dávky treba zvoliť tak, aby sa zabránilo rýchlemu rastu a prílišnému zvýšeniu obsahu lipidov. V snahe zachovať kŕmne dávky by sa podľa potreby, napr. raz týždenne, malo množstvo krmiva opätovne prepočítať. Na účely takéhoto výpočtu možno hmotnosť rýb nachádzajúcich sa v každej testovacej komore odhadnúť na základe hmotnosti rýb odobratých z danej komory pri poslednom odbere vzoriek. Neodporúča sa váženie rýb, ktoré zostávajú v pokusnej komore.
                     Neskonzumovaná potrava a výkaly by sa mali z testovacej komory denne odsávať, a to krátko po skončení kŕmenia (do 30 minút až jednej hodiny). Testovacie komory by sa počas celého testu mali udržiavať v čo najčistejšom stave, aby sa pokiaľ možno čo najviac minimalizovala koncentrácia organickej hmoty (pozri bod 29), keďže prítomnosť organického uhlíka môže obmedzovať biodostupnosť testovanej látky (12).
                     Keďže mnohé krmivá obsahujú rybiu múčku, malo by sa zabezpečiť, aby krmivo neovplyvňovalo výsledky testu, ani nevyvolávalo nepriaznivé účinky napr. obsahom (zvyškov) pesticídov, ťažkých kovov a/alebo samotnej testovanej látky.
                     
                        Svetlo a teplota
                     
                     Odporúča sa fotoperióda v rozpätí od 12 do 16 hodín, pričom teplota (± 2 °C) by mala byť vhodná pre dané testované druhy (pozri dodatok 3). Mal by byť známy typ osvetlenia a jeho vlastnosti Treba zachovávať opatrnosť z hľadiska možnej fototransformácie testovanej látky pod vplyvom svetelných podmienok štúdie. Treba udržiavať primerané osvetlenie, aby sa ryby nevystavovali účinkom neprirodzených fotoproduktov. V niektorých prípadoch môže byť potrebné používať filter na elimináciu ultrafialového žiarenia s vlnovou dĺžkou nižšou ako 290 nm.
                     
                        Testované koncentrácie
                     
                     Tento test bol pôvodne navrhnutý pre nepolárne organické látky. Očakáva sa, že pri tomto type látok bude stačiť, ak sa ryba vystaví účinkom jedinej koncentrácie, keďže sa neočakávajú žiadne účinky koncentrácie. Príslušný regulačný rámec si však môže vyžadovať dve koncentrácie. Ak sa testujú látky, ktoré nepatria do tejto oblasti, alebo ak sú známe iné znaky možnej závislosti od koncentrácie, test by sa mal uskutočniť s dvomi alebo viacerými koncentráciami. Ak sa testuje iba jedna koncentrácia, malo by sa použitie jednej koncentrácii odôvodniť (pozri bod 79). Testovaná koncentrácia by mala byť zároveň prakticky alebo technicky čo najnižšia (t. j. nie blízko limitu (maximálnej) rozpustnosti).
                     V niektorých prípadoch možno očakávať, že biokoncentrácia látky bude závisieť od koncentrácie vo vode (napr. v prípade kovov, ktorých vychytávanie rybami možno aspoň čiastočne regulovať). V takom prípade treba testovať najmenej dve, no podľa možnosti viac koncentrácií (pozri bod 49), ktoré sú relevantné z hľadiska životného prostredia. Testovanie najmenej dvoch koncentrácií sa odporúča aj pri látkach s testovanými koncentráciami, ktoré musia byť z praktických dôvodov tesne pod hranicou maximálnej rozpustnosti, pretože to pomôže získať prehľad o spoľahlivosti expozičných koncentrácií. Výber testovaných koncentrácií by mal zahŕňať realistické koncentrácie v životnom prostredí, ako aj koncentrácie, ktoré majú pre toto špecifické hodnotenie význam.
                     Koncentrácia, resp. koncentrácie testovanej látky by sa mali vyberať tak, aby boli nižšie ako hodnota ich chronického účinku alebo 1 % ich akútnej asymptotickej hodnoty LC50 a aby boli v rozpätí bežnom pre životné prostredie a minimálne rádovo vyššie ako limit ich kvantifikácie vo vode použitou analytickou metódou. Najvyššiu prípustnú testovanú koncentráciu možno stanoviť aj vydelením hodnoty akútnej 96-hodinovej LC50 príslušným pomerom akútnej/chronickej koncentrácie (napr. v prípade niektorých látok môže byť príslušný pomer okolo tri, inde aj viac ako 100). Ak sa použije druhá koncentrácia, mala by sa od prvej odlišovať o faktor desať. Ak to nedovoľuje kritérium toxicity (ktoré limituje vyššiu testovanú koncentráciu) a analytický limit (ktorý limituje nižšiu testovanú koncentráciu), môže sa použiť aj nižší faktor ako desať a zvážiť použitie testovanej látky označenej rádioaktívnym izotopom (najvyššej čistoty, podľa možnosti napr. > 98 %). Treba dbať na to, aby sa nepoužila koncentrácia prekračujúca maximálnu rozpustnosť testovanej látky v testovanom médiu.
                     
                        Kontroly
                     
                     Okrem sérií testov by sa mala vykonať aj jedna kontrola s vodou na riedenie, alebo v prípade potreby (pozri body 30 a 31) jedna kontrola s obsahom rozpúšťadla.
                     
                        Frekvencia meraní kvality vody
                     
                     Počas testu by sa vo všetkých testovacích a kontrolných nádobách mal zmerať obsah rozpusteného kyslíka, TOC, pH a teplota. Celkovú tvrdosť vody a (v prípade potreby) slanosť treba zmerať v kontrole, resp. kontrolách a v jednej nádobe. Ak sa testujú dve alebo viaceré koncentrácie, uvedené parametre merajte pri vyššej (alebo najvyššej) koncentrácii. Množstvo rozpusteného kyslíka a (v prípade potreby) slanosť by sa v priebehu vychytávacej fázy mali merať minimálne trikrát – na jej začiatku, približne v strede a na konci – a raz týždenne v priebehu depuračnej fázy. TOC by sa mal zmerať na začiatku testu (24 a 48 hodín pred spustením vychytávacej fázy) pred pridaním rýb a najmenej raz týždenne počas vychytávacej i depuračnej fázy. Teplota by sa mala merať a zaznamenávať denne, pH na začiatku a na konci každého obdobia a tvrdosť raz počas každého testu. Aspoň v jednej nádrži by sa malo zabezpečiť kontinuálne meranie teploty.
                     
                        Odber a analýza vzoriek rýb a vody
                     
                     
                        Harmonogram odberu vzoriek rýb a vody
                     
                     Vzorky vody na stanovenie koncentrácie testovanej látky by sa z testovacích nádrží mali odobrať pred pridaním rýb a počas vychytávacej i depuračnej fázy. Vzorky vody by sa z nich mali odobrať pred kŕmením a v rovnakom čase ako vzorky rýb. Na zaručenie stabilných koncentrácií po nasadení rýb môže byť užitočný intenzívnejší odber vzoriek. Koncentrácie testovanej látky by sa mali určiť vo vychytávacej fáze, aby sa overil súlad s validačnými kritériami(bod 24). Ak sa analýzou vzoriek vody na začiatku depuračnej fázy preukáže, že testovaná látka nebola zistená, môže sa tým odôvodniť absencia ďalších meraní testovanej látky v testovanej a kontrolnej vode po zvyšok depuračnej fázy.
                     V súvislosti s testovanou látkou by sa mali vzorky rýb v priebehu vychytávacej fázy odobrať najmenej päťkrát a v priebehu depuračnej fázy najmenej štyrikrát. Keďže v niektorých prípadoch nebude jednoduché vypočítať dostatočne presný odhad hodnoty BCF na základe tohto počtu vzoriek (najmä v prípadoch, ak počas vychytávacej a depuračnej fázy pôjde o inú ako jednoduchú kinetiku prvého rádu), odporúča sa odoberať vzorky v oboch fázach častejšie (pozri dodatok 4).
                     Obsah lipidov by sa mal stanovovať aspoň na začiatku a na konci vychytávacej fázy a na konci depuračnej fázy, a to v rovnakom biologickom materiáli, aký sa použil na stanovenie koncentrácie testovanej látky. Ak to nie je možné, mali by sa odobrať vzorky aspoň z troch nezávislých rýb, aby sa stanovil obsah lipidov v každom z tých troch časov odberu. Počet rýb v každej nádrži by sa mal na začiatku pokusu zodpovedajúcim spôsobom upraviť (49). Ako alternatíva v prípade, že v kontrolnej skupine rýb (t. j. rýb zo zásobnej populácie) nebolo zistené žiadne významné množstvo testovanej látky, sa môže obsah lipidov testovať iba u rýb z kontrolnej skupiny, pričom sa analýza testovanej látky v testovanej skupine, resp. skupinách (a s ňou súvisiace hodnoty rýchlostnej konštanty vychytávania, rýchlostnej konštanty depurácie a BCF) môže upraviť tak, aby počas testu zohľadňovala zmeny obsahu lipidov v kontrolnej skupine (50).
                     Uhynuté alebo choré ryby by sa nemali analyzovať ani na testovanú látku, ani na koncentráciu lipidov.
                     Príklad prijateľného harmonogramu odberu vzoriek je uvedený v dodatku 4. Podobne možno vypočítať aj iné harmonogramy pomocou iných predpokladaných hodnôt KOW, z ktorých sa vypočíta expozičný čas potrebný na dosiahnutie 95 % vychytávania (výpočty sú uvedené v dodatku 5).
                     Odber vzoriek vo fáze vychytávania by mal pokračovať až do dosiahnutia ustáleného stavu (pozri dodatok 1, definície a jednotky), alebo kým sa vychytávacia fáza neukončí iným spôsobom (po 28 alebo 60 dňoch, pozri body 37 a 38). Pred začatím depuračnej fázy by sa mali ryby premiestniť do čistých nádob.
                     
                        Odber a príprava vzoriek
                     
                     Vzorky vody na analýzu by sa mali odoberať napríklad odsávaním pomocou inertnej hadičky zo stredu testovacej komory. Biologicky nedostupná frakcia testovanej látky sa nedá vždy oddeliť od biodostupnej frakcie filtráciou či odstredením. Ak sa použije separačná metóda, mala by sa v skúšobnom protokole vždy odôvodniť alebo validovať vzhľadom na ťažkosti s biodostupnosťou (25). Najmä pri vysokohydrofóbnych látkach (t. j. látky s log KOW > 5) (12) (26), pri ktorých by mohlo dôjsť k ich adsorpcii na mriežku filtra alebo odstreďovacie nádoby, by sa vzorky nemali upravovať uvedenými spôsobmi. Namiesto toho by sa mali prijať opatrenia, ktorými sa zabezpečí, že nádrže zostanú v čo najväčšej miere čisté (pozri bod 46), pričom obsah celkového organického uhlíka by sa mal monitorovať tak vo vychytávacej, ako aj depuračnej fáze (pozri bod 53). Aby sa predišlo prípadným problémom so zníženou biodostupnosťou, mali by sa v prípade málorozpustných a vysokohydrofóbnych látok použiť na odber vzoriek techniky mikroextrakcie tuhej fázy.
                     Ryby z odobratej vzorky by sa mali okamžite usmrtiť tým najvhodnejším a najhumánnejším spôsobom (pri meraniach celých rýb by sa okrem opláchnutia vodou (pozri bod 28) a dôkladného osušenia nemali vykonať žiadne ďalšie postupy). Ryby odvážte a odmerajte ich celkovú dĺžku (51). Pri každej jednej rybe by sa nameraná hmotnosť a dĺžka mala dať do súvislosti s koncentráciou analyzovanej látky (a v prípade potreby aj s obsahom lipidov), napr. označením každej ryby zo vzorky jedinečným identifikátorom.
                     Voda aj ryby by sa mali analyzovať podľa možnosti ihneď po odbere, čím sa predíde degradácii alebo iným stratám a umožní výpočet približných rýchlostných konštánt vychytávania a depurácie v priebehu testu. Okamžitou analýzou sa predíde aj oddialeniu stanovenia dosiahnutia „plató“ (ustáleného stavu).
                     Ak sa analýza neurobí okamžite, vzorky by sa mali vhodným spôsobom uskladniť. Pred začatím štúdie by sa mali získať informácie o správnom spôsobe skladovania v prípade danej testovanej látky – napríklad hlbokým zmrazením, udržiavaním pri teplote 4 °C, extrakciou atď. Dĺžka skladovania by sa mala zvoliť tak, aby látka počas skladovania nedegradovala.
                     
                        Kvalita analytickej metódy
                     
                     Celý postup v zásade závisí od správnosti, presnosti a citlivosti metódy použitej na analýzu testovanej látky. Treba preto experimentálne overiť, či sú správnosť, presnosť a reprodukovateľnosť analýzy látky, ako aj úroveň výťažnosti testovanej látky tak z vody, ako aj z rýb pri danej metóde uspokojivé. Malo to byť súčasťou predbežných testov. Zároveň treba overiť, či testovaná látka nie je prítomná v použitej vode na riedenie. V prípade potreby sa hodnoty koncentrácie testovanej látky vo vode a v rybách získané z testu opravia tak, aby zohľadňovali hodnoty výťažnosti a pozaďové hodnoty z kontrol. So vzorkami rýb aj vody by sa počas celého testovania malo zaobchádzať tak, aby sa minimalizovala kontaminácia a straty (vznikajúce napríklad v dôsledku adsorpcie na zariadenie slúžiace na odber vzoriek).
                     
                        Analýza vzoriek rýb
                     
                     V prípade použitia materiálov označených rádioaktívnym izotopom možno analyzovať celé množstvo označenej látky (t. j. materskú zlúčeninu a jej metabolity) alebo je možné vzorky prečistiť tak, aby sa materská látka dala analyzovať osobitne. Ak má BCF vychádzať z materskej látky, mali by sa minimálne na konci vychytávacej fázy určiť hlavné metabolity (pozri bod 6). Hlavné metabolity sú tie, ktoré predstavujú ≥ 10 % z celkového množstva rezíduí v tkanivách rýb, tie, ktoré predstavujú ≥ 5 % z dvoch za sebou nasledujúcich bodov odberu vzoriek, tie, ktoré vykazujú zvýšené hladiny vo vychytávacej fáze, ako aj tie, pri ktorých je známe toxikologické riziko. Ak hodnota BCF celých rýb vyjadrená z hľadiska celkového množstva rezíduí označených rádioaktívnym izotopom dosiahne ≥ 500, môže byť žiaduce – a v prípade určitých kategórií látok, ako sú pesticídy, sa to dôrazne odporúča – hlavné metabolity identifikovať a kvantifikovať. Kvantifikáciu týchto metabolitov môžu vyžadovať aj niektoré regulačné orgány. Po identifikácii a kvantifikácii degradačných produktov, ktoré predstavujú v rybích tkanivách ≥ 10 % celkového množstva rezíduí označených rádioaktivnym izotopom, sa odporúča aj ich identifikácia a kvantifikácia v testovanej vode. Ak to nie je možné, malo by sa to vysvetliť v protokole.
                     Koncentráciu testovanej látky je zvyčajne potrebné stanoviť v každej jednej odváženej rybe. Ak to nie je možné, môžu sa pri každom odbere vzorky zhromaždiť napriek tomu, že sa tým obmedzia štatistické postupy, ktoré možno použiť pri spracúvaní údajov, a preto by mal byť do testu zaradený adekvátny počet rýb, ktorý umožní plánované zhromažďovanie vzoriek, štatistický postup a výpočet sily testu. Odkazy na literatúru (27) a (28) sa môžu použiť ako úvod k príslušným postupom zhromažďovania vzoriek.
                     BCF by sa mal okrem vyjadrenia v podobe hodnoty vypočítanej priamo zo štúdie (pozri bod 21) aj normalizovať, a to podľa rýb s obsahom lipidov 5 % (podľa vlhkej hmotnosti), okrem prípadov, keď možno tvrdiť, že testovaná látka sa neakumuluje primárne v lipidoch. Ak je to možné, mal by sa obsah lipidov v rybách stanoviť pri každom odbere vzoriek, najlepšie z rovnakého extraktu, ktorý bol pripravený na analýzu testovanej látky, pretože lipidy sa musia často z extraktu odstrániť skôr, ako ich bude možné analyzovať chromatografiou. Analýza testovaných látok si však často vyžaduje špecifické extrakčné postupy, ktoré by mohli byť v rozpore s testovacími metódami na stanovovanie lipidov. V takom prípade (kým nebudú k dispozícii vhodné nedeštruktívne inštrumentálne metódy) sa odporúča použiť inú stratégiu stanovenia obsahu lipidov v rybách (pozri bod 56). Na stanovenie obsahu lipidov by sa mali použiť vhodné metódy (20). Ako štandardnú metódu (30) je možné odporučiť techniku extrakcie chloroformom/metanolom (29), no ako alternatívna technika sa odporúča aj Smedesova metóda (31). Táto metóda je charakterizovaná porovnateľnou účinnosťou extrakcie, vysokou mierou správnosti, používaním menej toxických organických rozpúšťadiel a jednoduchým postupom. Môžu sa použiť aj iné metódy, ktorých správnosť možno spoľahlivo porovnať s odporúčanými metódami, ich použitie však treba riadne odôvodniť. Je dôležité uviesť podrobné informácie o použitej metóde.
                     
                        Meranie rastu rýb
                     
                     Na začiatku testu sa musí jednotlivo odvážiť päť až desať rýb zo zásobnej populácie a zmerať ich celková dĺžka. Môže ísť o tie isté ryby, ktoré sa použili na analýzu lipidov (pozri bod 56). Hmotnosť a dĺžka rýb použitých pre každý prípad odberu vzoriek z testovaných i kontrolných skupín by sa mali merať pred chemickou a analýzou obsahu lipidov. Merania na týchto vzorkách rýb možno použiť na odhad hmotnosti a dĺžky rýb, ktoré zostanú v testovacích a kontrolných nádržiach (pozri bod 45).
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     Vychytávacia krivka testovanej látky by sa mala získať grafickým znázornením koncentrácie v/na rybách (alebo určenom tkanive) počas vychytávacej fázy v závislosti od času na aritmetických osiach. Ak krivka dosiahne plató, t. j. ak sa stane približne asymptotická k časovej osi, potom možno hodnotu BCF v ustálenom stave (BCFSS) vypočítať takto:
                     
                        
                     Vývoj hodnoty Cf môže byť ovplyvnený rastom rýb (pozri body 72 a 73). Priemerná expozičná koncentrácia (CW) je ovplyvňovaná zmenami v čase. Možno očakávať, že časovo vážený priemer koncentrácií je pri štúdiách bioakumulácie presnejší a relevantnejší aj vtedy, keď je odchýlka v primeranom validačnom rozsahu (pozri bod 24). Časovo vážený priemer (TWA) koncentrácie vo vode sa môže vypočítať podľa oddielu 1 v dodatku 5.
                     Kinetický biokoncentračný faktor (BCFK) by sa mal stanoviť ako pomer k
                        1/k
                        2, t. j. rýchlostných konštánt kinetiky prvého rádu. Rýchlostné konštanty k
                        1 a k
                        2, ako aj hodnota BCFK sa môžu vypočítať súčasným dosádzaním hodnôt vychytávacej i depuračnej fázy. Ako alternatíva možno hodnoty k
                        1 a k
                        2 možno určiť aj sekvenčne (opis a porovnanie týchto metód sú uvedené v dodatku 5). Rýchlostná konštanta depurácie (k
                        2) si môže vyžadovať opravu tak, aby zohľadňovala znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu (pozri body 72 a 73). Ak sa vychytávacia a/alebo depuračná krivka zjavne neriadi kinetikou prvého rádu, mali by sa použiť komplexnejšie modely (pozri dodatok 5 a poraďte sa s bioštatistikom a/alebo s farmakokinetikom).
                     
                        Údaje o hmotnosti/dĺžke rýb
                     
                     Vlhká hmotnosť a celková dĺžka jednotlivých rýb pri všetkých intervaloch odberu vzoriek vo vychytávacej a depuračnej fáze sa uvedú do tabuľky zvlášť pre testovanú a zvlášť pre kontrolnú skupinu (vrátane zásobnej populácie určenej na začiatok vychytávania). Pri každej jednej rybe by sa nameraná hmotnosť a dĺžka mali dať do súvislosti s koncentráciou analyzovanej chemikálie napr. označením každej ryby zo vzorky jedinečným identifikátorom. Preferovaným meradlom rastu na účely opravy hodnôt kinetického BCF tak, aby zohľadňovali znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu (metóda opravy údajov na základe znižovania koncentrácie látky vplyvom rastu ryby je uvedená v bode 73 a v dodatku 5), je hmotnosť.
                     
                        Oprava na základe znižovania koncentrácie látky vplyvom rastu a normalizácia lipidov
                     
                     Rast rýb počas depuračnej fázy môže znížiť merané chemické koncentrácie v rybách, a tým spôsobiť, že celková hodnota rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2) bude vyššia ako pri samotných procesoch odbúravania (napr. dýchaním, metabolizmom, vylúčením). Kinetické biokoncentračné faktory by sa mali opraviť tak, aby zohľadňovali znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu. Rast ovplyvňuje aj hodnotu BCFSS, neexistuje však žiadny schválený postup na opravu hodnoty BCFSS podľa rastu. V prípadoch výrazného rastu by sa mala vypočítať aj hodnota BCFK opravená o rast (BCFKg), pretože môže byť vhodnejším meradlom ako biokoncentračný faktor. Obsah lipidov v testovaných rybách (ktorý úzko súvisí s bioakumuláciou hydrofóbnych látok) môže v skutočnosti kolísať tak, že bude potrebné normalizovať stanovený obsah lipidov v rybách (5 % hm.), aby bolo možné zmysluplne získať tak kinetický, ako aj ustálený biokoncentračný faktor, okrem prípadov, keď možno tvrdiť, že testovaná látka sa neakumuluje primárne v lipidoch (napr. niektoré perfluórované látky sa môžu viazať na proteíny). Rovnice a príklady týchto výpočtov sú uvedené v dodatku 5.
                     Na účely opravy hodnoty kinetického BCF tak, aby zohľadňovala znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu, by sa podobne mala opraviť aj rýchlostná konštanta depurácie. Hodnota rýchlostnej konštanty depurácie opravená o rast (k
                        2g) sa vypočíta odpočítaním hodnoty rýchlostnej konštanty rastu (k
                        g, získanej z nameraných údajov o hmotnosti) od celkovej hodnoty rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2). Následne sa vypočíta hodnota kinetického biokoncentračného faktora opravená o rast, a to vydelením hodnoty rýchlostnej konštanty vychytávania (k
                        1) hodnotou rýchlostnej konštanty depurácie opravenej o rast (k
                        2g) (pozri dodatok 5). Tento postup však neplatí vo všetkých prípadoch. Napríklad v prípade látok s veľmi pomalou depuráciou testovaných u rýchlorastúcich rýb môže byť vypočítaná hodnota k
                        2g príliš malá, takže chyba v dvoch rýchlostných konštantách použitých na jej výpočet sa stane kritickou a spôsobí, že v niektorých prípadoch môžu byť odhady k
                        g vyššie ako k
                        2. V alternatívnom postupe, ktorým sa dá vyhnúť potrebe opravovať hodnoty o znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu, sa používajú hmotnostné údaje o depurácii testovanej látky za každú rybu (celú rybu) namiesto bežných hmotnostných údajov o testovanej látke (koncentrácii) na jednotku hmotnosti ryby. To sa dá ľahko dosiahnuť, keďže v skúškach podľa tejto testovacej metódy by sa zaznamenané údaje o koncentrácii v tkanivách mali vzťahovať na individuálne hmotnosti rýb. Jednoduchý návod je uvedený v dodatku 5. Pripomíname, že hodnota k
                        2 by sa mala zaznamenávať aj vtedy, keď sa použije alternatívny postup.
                     Kinetický biokoncentračný faktor a ustálený biokoncentračný faktor by sa mali zaznamenávať aj vo vzťahu k štandardnému 5 % (hm.) obsahu lipidov v rybách, okrem prípadov, keď možno tvrdiť, že testovaná látka sa neakumuluje primárne v lipidoch. Údaje o koncentráciách v rybách alebo o BCF sa normalizujú podľa pomeru medzi 5 % a skutočným (individuálnym) priemerom obsahu lipidov (v % vlhkej hmotnosti) (pozri dodatok 5).
                     Ak boli chemické analýzy a analýzy obsahu lipidov vykonané na tej istej rybe, tak by sa na výpočet hodnoty BCF s normalizovanými lipidmi mali použiť normalizované individuálne údaje o lipidoch v rybách. Ako alternatíva sa v prípade podobného rastu kontrolných a exponovaných rýb môže na opravu o lipidy použiť iba obsah lipidov v rybách z kontrolnej skupiny (pozri bod 56). Metóda výpočtu hodnoty BCF s normalizovanými lipidmi je uvedená v dodatku 5.
                     
                        Interpretácia výsledkov
                     
                     V prípadoch, v ktorých sa koncentrácie testovaných roztokov pohybujú na úrovni blízkej detekčnému limitu analytickej metódy, treba interpretovať výsledky s veľkou opatrnosťou.
                     Priemerný rast v testovanej i kontrolnej skupine by sa v zásade nemali výrazne odlišovať, aby sa vylúčili toxické účinky. Rýchlostné konštanty rastu alebo rastové krivky v oboch skupinách by sa mali vhodným spôsobom porovnať (52).
                     Jasne vymedzené krivky vychytávania a depurácie svedčia o dobrej kvalite údajov o biokoncentrácii. V prípade rýchlostných konštánt by mal výsledok χ2 testu dobrej zhody svedčiť o vhodnosti ]t. j. o malom percente chýb v meraní (32)] bioakumulačného modelu, takže rýchlostné konštanty by sa dali považovať za spoľahlivé (pozri dodatok 5). Ak sa použije viac ako jedna testovaná koncentrácia, mali by byť odchýlky konštánt vychytávania/depurácie medzi testovanými koncentráciami menšie ako 20 % (53). Ak nie sú, môže to svedčiť o závislosti od koncentrácie. Významné rozdiely zistené v rýchlostných konštantách vychytávania/depurácie medzi dvoma použitými testovanými koncentráciami by sa mali zaznamenať a podľa možnosti vysvetliť. Hranica 95 % spoľahlivosti hodnôt BCF sa v prípade dobre navrhnutých štúdií dosahuje vo všeobecnosti ± 20 % vypočítanej hodnoty BCF.
                     Ak sa testujú dve alebo viaceré koncentrácie, na zistenie konzistentnosti výsledkov a prípadnej závislosti od koncentrácie sa použijú výsledky oboch, príp. všetkých koncentrácií. Ak je na účely zníženia počtu použitých zvierat a/alebo zdrojov testovaná iba jedna koncentrácia, malo by sa použitie jednej koncentrácie zdôvodniť.
                     Výsledná hodnota BCFSS je neistá v prípade, že je hodnota BCFK podstatne vyššia ako hodnota BCFSS, keďže to môže svedčiť buď o nedosiahnutí ustáleného stavu, alebo o tom, že znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu a procesy vylučovania neboli zohľadnené. Ak je hodnota BCFSS oveľa vyššia ako hodnota BCFK, mali by sa výpočty rýchlostných konštánt vychytávania a depurácie skontrolovať a prehodnotiť. Iný postup dosadzovania hodnôt by mohol zlepšiť odhadovanú výslednú hodnotu BCFK (pozri dodatok 5).
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Okrem informácií o testovanej látke uvedených v bode 3 by skúšobný protokol mal obsahovať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná látka:
                                 
                                 fyzikálny charakter a v prípade potreby fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             údaje o identifikácii chemikálie napr. názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt pozorované a ak je to prakticky uskutočniteľné atď. (v prípade potreby aj vrátane obsahu organického uhlíka),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade mnohozložkových látok a UVCB (látok neznámeho alebo variabilného zloženia, produktov komplexných reakcií alebo biologických materiálov) pokiaľ možno opis chemickej identity jednotlivých zložiek a pri každej z nich aj jej percentuálny podiel z celkovej hmotnosti látky. Mal by sa stručne opísať spôsob, akým analytická metóda použitá v teste odráža meranie koncentrácie látky. Mali by sa opísať všetky analytické postupy vrátane správnosti metódy, jej detekčného a kvantifikačného limitu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade označenia rádioaktívnym izotopom presnú polohu označeného atómu, resp. atómov a percento rádioaktivity z nečistôt,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informácie o toxicite testovanej látky pre ryby (v ideálnom prípade pre testované druhy). Toxicita by sa mala zaznamenať aj ako hodnota akútnej 96-hodinovej LC50 a hodnoty NOAEC a LOAEC z chronických štúdií (t. j. test v ranom štádiu života alebo test celého životného cyklu, ak sú k dispozícii),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podmienky skladovania testovanej chemikálie alebo testovanej látky a stabilita testovanej chemikálie alebo testovanej látky za daných podmienok skladovania, ak sú pred použitím skladované.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testované druhy:
                                 
                                 vedecký názov, kmeň, pôvod, akékoľvek predbežné ošetrenie, aklimatizácia, vek, pohlavie (v prípade potreby), rozsahy veľkostí (hmotnosti a dĺžky) atď.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             typ použitého testu (napríklad prietokový alebo polostatický), regulárna štúdia alebo minimalizovaný model (vrátane dôvodov a vysvetlenia),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             typ a charakteristiky použitého osvetlenia a fotoperiódy, resp. fotoperiód,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             plán štúdie (napr. počet a veľkosť testovacích komôr, rýchlosť výmeny objemu vody, veľkosť násady, počet replikátov, počet rýb na replikát, počet testovaných koncentrácií, dĺžka vychytávacej a depuračnej fázy, frekvencia odberu vzoriek rýb a vody),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda prípravy zásobných roztokov a frekvencia ich výmeny (ak sa použije rozpúšťadlo, mala by sa uviesť jeho koncentrácia a vplyv na obsah organického uhlíka) alebo opis alternatívneho systému dávkovania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nominálne testované koncentrácie, priemery hodnôt nameraných v testovacích nádržiach a ich štandardné odchýlky a spôsob a frekvencia ich zaznamenávania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             zdroj vody na riedenie, opis jej akejkoľvek predbežnej úpravy, všetky výsledky preukazujúce schopnosť testovaných rýb žiť vo vode, ako aj vlastnosti vody: pH, tvrdosť, teplota, koncentrácia rozpusteného kyslík, hladiny rezíduí chlóru (ak sa merali), celkový organický uhlík, suspendované látky, slanosť testovaného média (v prípade potreby) a všetky ďalšie merania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kvalita vody v testovacej nádrži, pH, tvrdosť, TOC, teplota a koncentrácia rozpusteného kyslíka, použité metódy a frekvencie meraní,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné informácie o režime kŕmenia napr. druh(-y) potravy, zdroj, zloženie (pokiaľ možno aspoň obsah lipidov a proteínov), zvolené kŕmne dávky, podávané množstvo a frekvencia kŕmenia,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informácie o úprave vzoriek rýb a vody vrátane podrobností o príprave, skladovaní, extrakcii a analytických postupoch (a presnosti) v prípade testovanej látky a obsahu lipidov,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metódy použité randomizáciu úpravy a rozdeľovania vzoriek rýb do testovacích nádob,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             dátum vloženia testovaných organizmov do testovaných roztokov a dĺžka testu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             opis štúdií na zistenie rozsahu a ich výsledkov, ak sú k dispozícii.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             výsledky všetkých predbežných štúdií, ktoré sa vykonali,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             úmrtnosť rýb v kontrolnej skupine a v skupine z každej expozičnej komory a všetky pozorované abnormality v správaní,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informácie o všetkých pozorovaných nežiaducich účinkoch,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             úplný opis všetkých postupov použitých na chemickú analýzu vrátane detekčných a kvantifikačných limitov, odchýlok a výťažnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             obsah lipidov v rybách, vrátane použitej metódy, a ak sa vypočíta, aj lipidový normalizačný faktor (L
                                                n, t. j. faktor, ktorý vyjadruje výsledky vo vzťahu k 5 % obsahu lipidov v rybách),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabuľkové údaje o hmotnosti (a dĺžke) rýb spolu s chemickými koncentráciami za každú rybu (v prípade potreby aj s obsahom lipidov) z kontrolnej i exponovanej skupiny (napr. označením každej ryby vo vzorke jedinečným identifikátorom) a výpočty rýchlostnej konštanty, resp. konštánt rastu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabuľkové údaje o koncentráciách testovanej látky v rybách (Cf pre každú rybu zvlášť) a vo vode (Cw) (v prípade potreby aj s priemernými hodnotami za testovanú a kontrolnú skupinu, štandardnými odchýlkami a rozsahmi) za všetky časy odberu vzoriek (Cf vyjadrená v mg/kg vlhkej hmotnosti celej teba alebo jeho konkrétneho tkaniva napr. tukového a Cw v mg/l), hodnoty Cw pre série kontrol (oznámiť treba aj hodnoty pozadia),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             krivky (vrátane všetkých nameraných údajov) zobrazujúce (v prípade potreby sa môžu koncentrácie vyjadriť vo vzťahu k celému telu a obsah lipidov normalizovať k 5 % hmotnosti zvieraťa alebo jeho konkrétneho tkaniva):
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rast, t. j. hmotnosť rýb v závislosti od času alebo prirodzený logaritmus transformácie hmotnosti v čase (vrátane výpočtu rýchlostnej konštanty rastu kg),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vychytávanie a depurácia testovanej látky v rybách (na jednom grafe),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čas, za ktorý sa dosiahol ustálený stav (ak sa dosiahne),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prirodzený logaritmus transformácie koncentrácie v závislosti od času vychytávania (vrátane výpočtu rýchlostnej konštanty vychytávania k
                                                            1),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prirodzený logaritmus transformácie koncentrácie (koncentrácie ln) v závislosti od času depurácie (vrátane výpočtu rýchlostnej konštanty depurácie k
                                                            2) a
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         krivky vychytávacej a depuračnej fázy znázorňujúce údaje a spôsob ich dosadzovania,
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ak sa vizuálnou kontrolou grafu zistia zjavné anomálie, na účely odstránenia neopodstatnených údajov sa môže použiť štatisticky validovaný test na odľahlé hodnoty, pripojí sa zdokumentované odôvodnenie ich vynechania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ustálený biokoncentračný faktor (BCFSS), ak sa dosiahne (takmer) ustálený stav,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kinetický biokoncentračný faktor (BCFK) a výpočet rýchlostných konštánt vychytávania a depurácie k
                                                1 a k
                                                2 spolu s odchýlkami k
                                                2 (smernica a úsek), ak sa použije sekvenčné dosadzovanie hodnôt,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hranica spoľahlivosti, štandardná odchýlka (ak existuje) a metódy analýzy výpočtu/údajov pre každý parameter každej koncentrácie použitej testovanej látky,
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         všetky informácie o metabolitoch testovanej látky označených rádioaktívnym izotopom a o ich akumulovaní,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rýchlostná konštanta, resp. konštanty rastu (vrátane 95 % intervalu(-ov) spoľahlivosti) a výpočet hodnôt rýchlostnej konštanty depurácie (k
                                                            2g), polčasu a BCF (BCFKg) opravených o rast,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čokoľvek nezvyčajné, čo sa počas testu pozorovalo, všetky odchýlky od týchto postupov a všetky iné významné informácie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         súhrnná tabuľka s príslušnými nameranými a vypočítanými údajmi:
                                                         
                                                                     Rýchlostné konštanty vychytávania a depurácie látky a biokoncentračné faktory (BCF)
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        g (rýchlostná konštanta rastu, deň– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        1 (celková rýchlostná konštanta vychytávania, l/kg– 1/deň– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2 (celková rýchlostná konštanta depurácie, deň– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        k
                                                                        2g (celková rýchlostná konštanta depurácie opravená o rast, deň– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        f (chemická koncentrácia v rybách pri ustálenom stave, mg/kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        C
                                                                        w (chemická koncentrácia v rybách vo vode, mg/l– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        L
                                                                        n (lipidový normalizačný faktor):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (3)
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSS (ustálený BCF, l/kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFSSL (ustálený BCF s normalizovanými lipidmi, l/kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (3) ± SD (55)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFK (kinetický BCF, l/kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKg (kinetický BCF opravený o rast, l/kg– 1)
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     
                                                                        t
                                                                        1/2g (polčas opravený o rast, deň):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu (95 % CI) (54)
                                                                     
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKL (kinetický BCF s normalizovanými lipidmi, l/kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu
                                                                  
                                                               
                                                                     BCFKLG (kinetický BCF s normalizovanými lipidmi opravený o rast, l/kg– 1):
                                                                  
                                                                  
                                                                     vložte hodnotu
                                                                  
                                                               Výsledky, ktoré sa pri vývoji predbežnej testovacej metódy a navrhovaní pokusu zaznamenávajú ako „nezistené/nekvantifikované v rámci detekčného/kvantifikačného limitu“ by sa nemali uvádzať, pretože sa ako také nemôžu na výpočet rýchlostných konštánt použiť.
                                                      
                                                   
                                       
                           C.13 – II:   Minimalizovaná skúška expozície rýb vo vodnom prostredí
                     
                     ÚVOD
                     Z pribúdajúcich skúseností s vykonávaním a interpretáciou úplných testov, ktoré nadobudli tak regulačné orgány, ako aj laboratóriá vyplýva, že pri určovaní rýchlostných konštánt vychytávania a depurácie platí, až na niektoré výnimky, kinetika prvého rádu. Preto možno rýchlostné konštanty vychytávania a depurácie určiť s minimálnym počtom odberu vzoriek a pritom vypočítať hodnotu kinetického BCF.
                     Pôvodným zámerom preskúmania alternatívnych návrhov štúdií BCF bolo vymyslieť minimalizovaný test, ktorý by sa používal ako postupový test na vyvrátenie alebo potvrdenie odhadov hodnoty BCF vychádzajúcich z KOW a kvantitatívneho vzťahu štruktúry a aktivity (QSAR), a tým eliminovať potrebu úplnej štúdie v prípade mnohých látok a minimalizovať náklady a používanie zvierat znížením počtu odberov vzoriek a sekvenčných analýz. Cieľom bolo na základe hlavného návrhu predchádzajúcej testovacej metódy umožniť prepojenie výsledkov testu s existujúcimi hodnotami BCF a uľahčiť vykonávanie testov a interpretáciu údajov, a tak získať odhady BCF, ktoré by boli dostatočne správne a presné na účely prijímania rozhodnutí o hodnotení rizík. Aj v tomto prípade platia mnohé z pravidiel uplatňovaných pri úplnom teste, napr. validačné kritériá (pozri bod 24) a zastavenie testu na konci vychytávacej fázy, ak je pozorované nedostatočné vychytávanie (pozri body 16 a 38).
                     Látky, ktoré by boli vhodné na použitie pri minimalizovanom teste, by mali patriť do všeobecnej skupiny, pre ktorú bola táto testovacia metóda vyvinutá, t. j. nepolárne organické látky (pozri bod 49). Ak existuje akýkoľvek náznak, že sa látka, ktorá sa má testovať, môže správať inak (napr. zjavne sa odchýliť od kinetiky prvého rádu), mal by sa na účely regulácie vykonať úplný test.
                     Minimalizovaná skúška obyčajne netrvá kratšie ako štandardný BCF test, nevyžaduje si však toľko odberov vzoriek (vysvetlenie je uvedené v dodatku 6). Depuračná fáza sa však v prípade rýchle sa vylučujúcich látok môže skrátiť, aby sa zabránilo koncentráciám v rybách, ktoré pred koncom testu nedosiahnu detekčný/kvantifikačný limit. Na základe minimalizovaného testu expozície rýb s jednou koncentráciou možno zistiť potrebu uskutočniť úplný test a v prípade, že sú výsledné údaje použité na výpočet rýchlostných konštánt a hodnoty BCF spoľahlivé (pozri bod 93), nemusí sa vykonať úplný test, ak výsledná hodnota BCF ani zďaleka nedosahuje predpísané rizikové hodnoty.
                     V niektorých prípadoch môže byť výhodné použiť návrh minimalizovanej skúšky s viac ako jednou testovanou koncentráciou ako predbežný test na zistenie, či sú odhady hodnôt BCF pre danú látku závislé od koncentrácie. Ak odhady hodnôt BCF z minimalizovanej skúšky vykazujú závislosť od koncentrácie, bude potrebné vykonať úplný test. Ak na základe takejto minimalizovanej skúšky nie sú odhady hodnôt BCF závislé od koncentrácie, no výsledky sa nepovažujú za konečné, potom by sa každý nasledujúci úplný test mohol vykonať s jednou koncentráciou, čím by sa znížil počet použitých zvierat v porovnaní s úplným testom s dvomi (alebo viacerými) koncentráciami.
                     Látky, ktoré by boli vhodné na použitie pri minimalizovanej skúške, by mali:
                     
                                 —
                              
                              
                                 potenciálne vykazovať kinetiku vychytávania a depurácie blížiacu sa kinetike prvého rádu, napr. na základe údajov o podobných látkach nadobudnutých krížovým prístupom (tzv. read-across),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 mať hodnotu log KOW < 6, okrem prípadov, keď sa očakáva rýchly metabolizmus (56),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 byť dostatočne rozpustné vo vode s ohľadom na použitú analytickú techniku (pozri bod 24),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 byť jasne merateľné (t. j. koncentrácie by mali byť vyššie ako ich kvantifikačný limit) tak v rybách, ako aj vo vode, pričom sa odporúča označovanie rádioaktívnymi izotopmi (pozri bod 23) a
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 mať dlhší čas depurácie ako je ich odhadovaný polčas (výpočty sú uvedené v dodatku 5), príp. by sa trvanie depurácie malo primerane upraviť (pozri bod 91). Výnimka z tohto pravidla je povolená, ak sa očakáva rýchly metabolizmus látky.
                              
                           HARMONOGRAM ODBERU VZORIEK PRI ŠTÚDIÁCH S NÁVRHOM MINIMALIZOVANEJ SKÚŠKY
                     
                        Odber vzoriek rýb
                     
                     Odber vzoriek rýb je zredukovaný na štyri miesta odberu vzoriek:
                     
                                 —
                              
                              
                                 uprostred a na konci vychytávacej fázy (odber na konci znamená zároveň začiatok depurácie), napr. po 14 a 28 dňoch (33).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Uprostred depuračnej fázy a na konci štúdie (keď koncentrácia látky dosiahne hodnotu < 10 % maximálnej koncentrácie alebo aspoň došlo k zjavnému prekročeniu polčasu látky), napr. po 7 a 14 dňoch depurácie (33). Ak sa očakáva alebo preukáže rýchla depurácia, môže byť potrebné skrátiť dĺžku depuračnej fázy, aby sa zabránilo koncentráciám v rybách, ktoré nedosiahnu kvantifikačný limit,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 lipidy sa merajú ako pri úplnom teste,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 oprava o rast sa vykoná ako pri úplnom teste.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Hodnota BCF sa vypočíta ako hodnota kinetického BCF.
                              
                           
                        Odber vzoriek vody
                     
                     Pri minimalizovanom návrhu testu sa vzorky odoberajú ako pri úplnom teste (pozri bod 54) alebo aspoň v piatich intervaloch rovnomerne rozdelených počas vychytávacej fázy a týždenne počas depuračnej fázy.
                     
                        Úpravy návrhu testu
                     
                     Po zohľadnení vlastností testovanej látky, platných prognóz QSAR a špecifického účelu štúdie je možné zvážiť niekoľko úprav návrhu testu:
                     
                                 —
                              
                              
                                 ak sa vyžaduje vyššia presnosť, môže sa vo vzorke na konci vychytávacej fázy použiť viac rýb (6 alebo 8 namiesto 4).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Môže sa pridať skupina rýb navyše, ak depurácia na 14. deň (alebo na predpokladanom konci depuračnej fázy) nestačí na dosiahnutie primeranej depurácie (t. j. > 50 %). Ak je predpokladaná dĺžka depuračnej fázy kratšia alebo dlhšia ako 14 dní, mal by sa prispôsobiť harmonogram odberu vzoriek (t. j. jedna skupina rýb na predpokladanom konci depuračnej fázy a jedna skupina po uplynutí polčasu).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Môžu sa použiť dve testované koncentrácie s cieľom preskúmať možnú závislosť od koncentrácie. Ak výsledky minimalizovanej skúšky vykonanej s dvomi testovanými koncentráciami preukazujú, že hodnota BCF nie je závislá od koncentrácie (t. j. odlišuje sa o menej ako 20 %), môže na úplnú skúšku, ak sa vykoná, stačiť jedna testovaná koncentrácia.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Môže byť pravdepodobné, že modely bioakumulačných procesov, napr. také, ktoré navrhuje Arnot et al. (35), možno použiť ako pomôcku pri plánovaní dĺžky vychytávacej a depuračnej fázy (pozri aj dodatok 5).
                              
                           
                        Výpočty
                     
                     Podstatou použitia tohto prístupu je, že biokoncentračný faktor možno v úplnom teste stanoviť buď ako ustálený biokoncentračný faktor (BCFSS), a to výpočtom pomeru koncentrácie testovanej látky v rybom tkanive ku koncentrácii testovanej látky vo vode, alebo ako výpočet hodnoty kinetického biokoncentračného faktora (BCFK) z pomeru rýchlostnej konštanty vychytávania k
                        1 k rýchlostnej konštante depurácie k
                        2. Hodnota BCFK je platná aj vtedy, ak sa počas vychytávacej fázy nedosiahne ustálená koncentrácia látky, a to za predpokladu, že sa vychytávanie a depurácia riadia približne procesmi kinetiky prvého rádu. Ako absolútne minimum sa na odhad rýchlostných konštánt vychytávania a depurácie vyžadujú dva odbery vzoriek – jeden na konci vychytávacej fázy (t. j. na začiatku depuračnej fázy) a jeden na konci (alebo po dostatočne dlhom trvaní) depuračnej fázy. Na kontrolu kinetiky vychytávania a depurácie sa odporúča uprostred spomínaných dvoch odberov urobiť ešte jeden odber (57). Výpočty sú uvedené v dodatkoch 5 a 6.
                     
                        Interpretácia výsledkov
                     
                     Ak chcete posúdiť platnosť a informačnú hodnotu testu, presvedčte sa, že depuračná fáza presiahla jeden polčas. Okrem toho by sa mala porovnať hodnota BCFKm (kinetický BCF vypočítaný pri minimalizovanom teste) s minimalizovanou hodnotou BCFSS (ide o hodnotu BCFSS vypočítanú na konci vychytávacej fázy za predpokladu dosiahnutia ustáleného stavu. Ide len o predpoklad, pretože počet odberov vzoriek nestačí na jeho potvrdenie). Ak je hodnota BCFKm < minimalizovaná hodnota BCFSS, preferovanou hodnotu by mala byť minimalizovaná hodnota BCFSS. Ak je hodnota BCFKm menšia ako 70 % minimalizovanej hodnoty BCFSS, výsledky nie sú platné a mal by sa vykonať úplný test.
                     Ak je hodnota BCFKm dosiahnutá minimalizovanou skúškou blízko ktorejkoľvek rizikových hodnôt z hľadiska regulácie, mal by sa vykonať úplný test. Ak je výsledok ďaleko od ktorejkoľvek z predpísaných rizikových hodnôt (ďaleko vyšší alebo nižší), úplný test nemusí byť potrebný, príp. sa môže vykonať úplný test s jednou koncentráciou, ak sa to vyžaduje v príslušnom regulačnom rámci.
                     Ak sa po minimalizovanej skúške s jednou koncentráciou zistí, že treba vykonať úplný test, môže sa vykonať s druhou koncentráciou. Ak sú výsledky konzistentné, nemusí sa ďalej vykonať úplný test s odlišnou koncentráciou, pretože sa neočakáva závislosť biokoncentrácie látky od koncentrácie. Ak sa vykonala minimalizovaná skúška s dvomi koncentráciami a jej výsledky nepreukážu závislosť od koncentrácie, celá skúška sa môže vykonať iba s jednou koncentráciou (pozri bod 87).
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol k minimalizovanej skúške by mal obsahovať všetky informácie požadované v prípade úplného testu (pozri bod 81), okrem tých, ktoré nie je možné spracovať (t. j. krivka závislosti času na dosiahnutie ustáleného stavu od ustáleného biokoncentračného faktoru; namiesto ustáleného biokoncentračného faktoru by sa mala uviesť minimalizovaná hodnota BCFSS). Okrem toho by mal obsahovať aj odôvodnenie použitia minimalizovanej skúšky a výslednú hodnotu BCFKm.
                     C.13 – III:   Test biokoncentrácie u rýb s expozíciou z potravy
                     
                     ÚVOD
                     Metóda opísaná v tomto oddiele by sa mala používať v prípade látok, ktoré nie sú vhodné pre metódu expozície vo vodnom prostredí (napr. preto, že nie je možné udržať stabilné, merateľné koncentrácie vo vode alebo dosiahnuť primerané celkové zaťaženie organizmu za 60 dní expozície; pozri predchádzajúce oddiely o metóde expozície vo vodnom prostredí). Treba si však uvedomiť, že konečným parametrom bude pri tejto skúške potravový biomagnifikačný faktor (BMF) a nie biokoncentračný faktor (BCF) (58).
                     V máji 2001 bola na konferencii SETAC Europe v Madride predstavená nová metóda testovania bioakumulácie v prípade slabo rozpustných organických látok (36). Táto práca vychádza z rôznych štúdií bioakumulácie publikovaných v odbornej literatúre a využíva metódu dávkovania potravy obohatenej o testovanú látku (napr. 37). Začiatkom roka 2004 bol pracovnej skupine EÚ PBT spolu s podpornými dokumentmi (39) predložený návrh protokolu (38) merania bioakumulačného potenciálu slabo rozpustných organických látok, ktoré nie sú vhodné pre štandardnú metódu vodnej expozície. Ďalším argumentom v prospech tejto metódy bolo, že k možnej expozícii životného prostredia účinkom týchto slabo rozpustných látok (t. j. s hodnotou log KOW > 5) dochádza prevažne z potravy [pozri (40) (41) (42) (43) (44)]. Preto sa v niektorých predpisoch týkajúcich sa chemikálií uvádzajú aj skúšky expozície z potravy (59). Treba si však uvedomiť, že v rámci tu opísanej metódy je potrebné dôsledne sa vyhýbať expozícii vo vodnej fáze, preto hodnotu BMF z tejto testovacej metódy nemožno priamo porovnať s hodnotou BMF zo skúšok v teréne (kde je možné kombinovať expozíciu vo vodnom prostredí s expozíciou z potravy).
                     Tento oddiel opisovanej testovacej metódy vychádza zo spomínaného protokolu (38) a je novou metódou, ktorá v predchádzajúcej verzii testovacej metódy C.13 nebola uvedená. Tento alternatívny test umožňuje priamo v kontrolovaných laboratórnych podmienkach preskúmať dráhu expozície z potravy.
                     Potenciálni výskumní pracovníci by si mali naštudovať body 1 až 14 tejto testovacej metódy, aby získali informácie o tom, kedy je možné uprednostniť skúšku expozície z potravy pred skúškou expozície vo vodnom prostredí. K dispozícii sú aj informácie o rôznych koncentráciách látok, ktoré by sa mali zvážiť pred vykonaním testu.
                     Použitie látok označených rádioaktívnymi izotopmi možno zvážiť podobne ako pri metóde expozície vo vodnom prostredí (pozri body 6 a 65).
                     Metóda expozície z potravy sa môže použiť na testovanie viac ako jednej látky iba jedným testom, ak sú splnené určité kritériá; tie sú podrobnejšie rozobraté v bode 112. Pre zjednodušenie sa metodika, ktorá je tu opísaná, týka iba testu s jednou testovanou látkou.
                     Skúška expozície z potravy sa v mnohých aspektoch podobá metóde expozície vo vodnom prostredí, s výnimkou zjavného rozdielu v dráhe expozície. Preto sa mnohé aspekty metódy, ktorá je tu opísaná, prekrývajú s metódou expozície vo vodnom prostredí opísanou v predchádzajúcom oddiele. Podľa možnosti sú uvádzané krížové odkazy na príslušné body v predchádzajúcom oddiele, no v záujme prehľadnosti a zrozumiteľnosti nebolo možné sa do istej miery vyhnúť duplicite.
                     PRINCÍP TESTU
                     Je možné použiť prietokové alebo polostatické podmienky (pozri odsek 4); prietokové podmienky sa odporúčajú na obmedzenie potenciálnej expozície testovanej látky z vody z dôvodu akejkoľvek desorpcie z obohatenej potravy alebo výkalov. Test pozostáva z dvoch fáz: vychytávacej (krmivo obohatené o testovanú látku) a depuračnej (čisté, neupravené krmivo) (pozri bod 16). Počas vychytávacej fázy sa „testovanej“ skupine rýb denne podáva presne určená dávka komerčného krmiva so známym zložením, ktoré je obohatené o testovanú látku. V ideálnom stave zožerú ryby všetku podávanú potravu (pozri bod 141). V priebehu depuračnej fázy sa potom ryby kŕmia čistým, neupraveným komerčným krmivom pre ryby. Pokiaľ ide o metódu expozície vo vodnom prostredí, môže sa v prípade potreby použiť viac ako jedna testovaná skupina s viacerými koncentráciami obohatenými o testovanú látku, ale pre väčšinu vysoko hydrofóbnych organických látok stačí jedna testovaná skupina (pozri body 49 a 107). Ak sa použijú polostatické podmienky, mali by sa ryby na konci vychytávacej fázy premiestniť do nového média a/alebo novej testovacej komory (pre prípad, že médium a/alebo testovacie zariadenia používané vo fáze vychytávania boli kontaminované testovanou látkou vyplavovaním). Počas oboch fáz testu sa merajú koncentrácie testovanej látky v rybách. Okrem skupiny rýb, ktorým sa podáva obohatené krmivo (testovaná skupina), je v podobných podmienkach držaná aj kontrolná skupina rýb, ktorá sa kŕmi rovnakým spôsobom, ale bez obohatenia komerčného krmiva pre ryby testovanou látkou. Táto kontrolná skupina umožňuje kvantifikovať pozaďové úrovne testovanej látky v neexponovaných rybách a slúži ako porovnanie akýchkoľvek nežiaducich účinkov vyvolaných pridaním testovanej látky v testovanej skupine, resp. skupinách (60). Zároveň umožňuje porovnať rýchlostné konštanty rastu medzi skupinami ako kontrola, či boli skonzumované rovnaké množstvá podanej potravy (pri vysvetľovaní rozdielov v rýchlostných konštantách rastu by sa mali zvážiť aj rozdiely v chuti jednotlivých druhov krmív; pozri bod 138). Tak vo vychytávacej, ako aj depuračnej fáze je dôležité, aby sa testovaná a kontrolná skupina kŕmili potravou vyváženej výživovej hodnoty.
                     Podľa navrhovateľov metódy je vychytávacia fáza v trvaní 7 až 14 dní vo všeobecnosti postačujúca (38) (39). Takéto trvanie by malo minimalizovať náklady na vykonanie testu, a pritom stále zaručovať dostatočnú expozíciu pri väčšine látok. V niektorých prípadoch je však možné vychytávaciu fázu predĺžiť (pozri bod 127). Počas vychytávacej fázy nemusí koncentrácia látky v rybách dosiahnuť ustálený stav, preto spracovanie údajov a výsledky z tejto metódy obyčajne vychádzajú z kinetickej analýzy rezíduí v tkanivách. [Poznámka: Aj v tomto prípade možno použiť rovnice pre odhad času do dosiahnutia ustáleného stavu ako v skúške expozície vo vodnom prostredí – pozri dodatok 5). Depuračná fáza začína vo chvíli, keď sú ryby po prvýkrát kŕmené neobohatenou potravou a zvyčajne trvá maximálne 28 dní alebo do chvíle, kým už nie je možné testovanú látku kvantifikovať v celej rybe, podľa toho, čo nastane skôr. Depuračná fáza môže byť kratšia, ale aj dlhšia ako 28 dní, podľa toho, ako sa časom menia merané chemické koncentrácie a veľkosť rýb.
                     Touto metódou sa v prípade testovanej látky v rybách môže stanoviť polčas špecifický pre danú látku (t
                        1/2, z rýchlostnej konštanty depurácie k
                        2), asimilačná účinnosť (absorpcia v črevách, a), kinetický potravový biomagnifikačný faktor (BMFK), kinetický potravový biomagnifikačný faktor opravený o rast (BMFKg) a kinetický potravový biomagnifikačný faktor opravený o lipidy (BMFKL) (61) (a/alebo kinetický potravový biomagnifikačný faktor opravený o rast a lipidy, BMFKgL). Tak ako v prípade metódy expozície vo vodnom prostredí, dôjde nárastom hmotnosti rýb počas skúšky k zriedeniu testovanej látky v rastúcich rybách, a tým aj k podhodnoteniu (kinetického) BMF, ak sa jeho hodnota neupraví o rast (pozri body 162 a 163). Navyše, ak sa zistí, že ustálený stav sa dosiahol vo vychytávacej fáze, je možné vypočítať orientačnú hodnotu ustáleného BMF. K dispozícii sú postupy, ktoré umožňujú odhad kinetického biokoncentračného faktora (BCFK) z údajov získaných zo skúšky expozície z potravy (napr. (44) (45) (46) (47) (48). Výhody a nevýhody takýchto prístupov sú opísané v dodatku 8.
                     Táto skúška bola primárne navrhnutá pre slabo rozpustné nepolárne organické látky, ktorých vychytávanie a depurácia v rybách sa približne riadi procesmi kinetiky prvého rádu. V prípade testovanej látky, pri ktorej sa vychytávanie a depurácia neriadia približne procesmi kinetiky prvého rádu, by sa mali použiť komplexnejšie modely (pozri odkazy v dodatku 5) a poradiť sa s bioštatistikom a/alebo s farmakokinetikom.
                     Hodnota BMF sa obyčajne stanovuje analýzou testovanej látky v celých rybách (na báze vlhkej hmotnosti). Ak je to relevantné pre dosiahnutie cieľa štúdie, môžu sa vzorky odoberať aj z istých konkrétnych tkanív (napríklad svalov, pečene) v prípade, že sa ryby rozdelia na jedlé a nejedlé časti (pozri bod 21). Okrem toho je možné odstrániť a samostatne analyzovať gastrointestinálny trakt, aby sa zistil jeho podiel na koncentráciách v celej rybe pri odberoch vzoriek na konci vychytávacej a tesne pred začiatkom depuračnej fázy, alebo ako súčasť prístupu založeného na rovnováhe hmotnosti.
                     Obsah lipidov v celých rybách zo vzorky sa meria tak, aby sa koncentrácie mohli opraviť o lipidy, pričom sa berie do úvahy obsah lipidov v krmive i rybách (pozri body 56 a 57 a dodatok 7).
                     Hmotnosť jednotlivých rýb vo vzorke by sa mala merať a zaznamenať a dať do súvislosti s koncentráciou analyzovanej chemikálie v danej rybe (napr. zaznamenaním jedinečného identifikačného kódu každej ryby zo vzorky), aby sa mohol vypočítať rast, ktorý je možné dosiahnuť počas skúšky. Ak je to možné, mala by sa zmerať aj celková dĺžka rýb (62). Údaje o hmotnosti sú potrebné aj na určenie hodnoty BCF použitím údajov z depuračnej fázy získaných počas skúšky expozície z potravy.
                     INFORMÁCIE O TESTOVANEJ LÁTKE
                     K dispozícii by mali byť informácie o testovanej látke opísané v bodoch 3 a 22. Analytická metóda pre koncentrácie testovanej látky vo vode obyčajne nie je potrebná; povinné sú metódy vhodnej citlivosti na meranie koncentrácií v potrave a tkanivách rýb.
                     Táto metóda sa môže použiť na testovanie viac ako jednej látky iba jedným testom. Testované látky by však mali byť navzájom kompatibilné tak, aby nereagovali a nemenili svoju chemickú identitu po ich pridaní do potravy pre ryby. Cieľom je, aby sa výsledky namerané pri každej testovanej látke príliš nelíšili od výsledkov, ktoré by sa dosiahli individuálnym testom pri každej z testovaných látok. Predbežnou analýzou by sa malo zabezpečiť, aby bolo možné každú látku opätovne získať zo vzorky viacnásobne obohatenej potravy a rybieho tkaniva, a to i) s vysokou výťažnosťou (napr. > 85 % nominálnej hodnoty) a ii) s citlivosťou zodpovedajúcou potrebám testovania. Celková dávka všetkých testovaných látok by nemala presiahnuť kombinovanú koncentráciu, ktorá by mohla vyvolať toxické účinky (pozri bod 51). Pri návrhu skúšky by sa navyše mali vziať do úvahy možné nepriaznivé účinky vyvolané u rýb, ako aj účinky vyplývajúce z možnej interakcie (napr. metabolické účinky), ktoré sú spojené s testovaním viacerých látok súčasne. Testovanie ionizovateľných látok súčasne sa neodporúča. Pokiaľ ide o expozície, táto metóda je vhodná aj pre komplexné zmesi (pozri bod 13, hoci pre analýze platia rovnaké obmedzenia, ako pri akejkoľvek inej metóde).
                     PLATNOSŤ TESTU
                     Ak má byť test platný, musia platiť tieto podmienky (pozri bod 24):
                     
                                 —
                              
                              
                                 odchýlky teploty vody sú menšie ako ± 2 °C tak pri testovanej, ako aj kontrolnej skupine,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnúť pod 60 % hodnoty saturácie vzduchu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 koncentrácia testovanej látky v potrave pre ryby pred vychytávacou fázou a na jej konci je v rozmedzí ± 20 % (podľa minimálne troch vzoriek z oboch časov odberu),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 vysoký stupeň homogénnosti látky v krmive by sa mal preukázať predbežnou analýzou obohatenej potravy, minimálne tri vzorky koncentrácie látky odobraté na začiatku skúšky by sa nemali líšiť viac ako o ± 15 % priemeru,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 v neobohatenej potrave ani v tkanivách rýb z kontrolnej skupiny neboli zistené koncentrácie testovanej látky, alebo sú zastúpené iba v bežných stopových množstvách,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 úmrtnosť alebo iné nepriaznivé účinky/choroby u rýb z testovanej a kontrolnej skupiny sú na konci testu ≤ 10 %, ak sa test z nejakého dôvodu predĺži, nepriaznivé účinky v oboch skupinách sú ≤ 5 % za mesiac a spolu ≤ 30 %. Výrazné rozdiely v priemernom raste medzi testovanými a kontrolnými skupinami rýb zo vzorky by mohli byť signálom toxického účinku testovanej látky.
                              
                           REFERENČNÉ LÁTKY
                     Ak laboratórium predtým túto skúšku nevykonávalo alebo nastali podstatné zmeny (napr. zmena kmeňa rýb alebo ich dodávateľa, iný druh rýb, markantné rozdiely v ich veľkosti, zmeny v potrave pre ryby a v metóde jej obohacovania), odporúča sa vykonať štúdiu technickej spôsobilosti použitím referenčnej látky. Referenčná látka sa používa primárne na zistenie primeranosti spôsobu obohacovania krmiva v záujme maximálnej homogenity a biodostupnosti testovaných látok. Príkladom, ktorý sa použil v prípade nepolárnych hydrofóbnych látok, je hexachlórbenzén (HCB), ale vzhľadom na nebezpečnosť HCB (63) by sa mali zvážiť aj iné látky, pri ktorých existujú spoľahlivé údaje o vychytávaní a biomagnifikácii. Ak sa použije referenčná látka, mali by sa v skúšobnom protokole uviesť základné informácie o nej vrátane názvu, čistoty, čísla CAS, štruktúry, údajov o toxicite (ak sú dostupné) tak, ako v prípade testovanej látky (pozri body 3 a 22).
                     OPIS METÓDY
                     
                        Prístrojové vybavenie
                     
                     Mali by sa používať rovnaké materiály a prístrojové vybavenie ako v prípade skúšky expozície vo vodnom prostredí (bod 26). Mal by sa použiť prietokový alebo statický testovací systém s obnovovaním média a s dostatočným objemom vody na riedenie do testovacích nádrží. Prietokové rýchlosti by sa mali zaznamenať.
                     
                        Voda
                     
                     Mala by sa používať rovnaká testovacia voda ako v prípade skúšky expozície vo vodnom prostredí (body 27 až 29). V opise testovacieho média by sa mali uvádzať jeho vlastnosti, pričom počas testu by jeho kvalita mala byť konštantná. Obsah prirodzených tuhých častíc a celkového organického uhlíka by mal byť pred začiatkom testu čo najmenší (≤ 5 mg/l častíc, ≤ 2 mg/l celkového organicky viazaného uhlíka). TOC je potrebné merať iba pred skúškou v rámci opisu vlastností testovacej vody (pozri bod 53).
                     
                        Krmivo
                     
                     Odporúča sa komerčne dostupná potrava pre ryby (plávajúce a/alebo pomaly klesajúce krmivo v tvare peliet), ktorá obsahuje minimálne bielkoviny a tuky. Potrava by mala mať jednotnú veľkosť peliet, aby sa zvýšila účinnosť expozície z potravy, t. j. aby ryby zjedli väčšie množstvo potravy namiesto toho, aby sa zamerali na väčšie kusy potravy a menšie kusy nechali nepovšimnuté. Veľkosť peliet by mala adekvátne zodpovedať veľkosti rýb na začiatku testu (napr. sa môžu použiť pelety s priemerom okolo 0,6 – 0,85 mm pre ryby s celkovou dĺžkou od 3 do 7 cm a 0,85 – 1,2 mm pre ryby s celkovou dĺžkou od 6 do 12 cm). Veľkosť peliet možno upraviť v závislosti od rastu rýb na začiatku depuračnej fázy. Príklad vhodného zloženia komerčne dostupnej potravy je uvedený v dodatku 7. Pri navrhovaní tejto metódy sa bežne používal test krmív s celkovým obsahom lipidov medzi 15 a 20 % (hm.). V niektorých oblastiach nemusí byť dostupná potrava pre ryby s takou vysokou koncentráciou lipidov. V takýchto prípadoch je možné realizovať štúdie s nižšou koncentráciou lipidov v potrave a v prípade potreby vhodne upraviť kŕmne dávky tak, aby ryby zostali zdravé (na základe výsledkov predbežného testovania). Celkový obsah lipidov v krmive pre testovanú a kontrolnú skupinu je potrebné pred začiatkom skúšky a na konci vychytávacej fázy zmerať a zaznamenať. V skúšobnom protokole by sa mali uviesť údaje poskytnuté dodávateľmi komerčných krmív o ich analýze zameranej na živiny, vlhkosť, vlákninu, popol, a ak je to možné, aj na minerálne látky a rezíduá pesticídov (napr. „bežné“ prioritné znečisťujúce látky).
                     Ak sa potrava obohacuje testovanou látkou, treba sa za každú cenu snažiť o zaručenie jej homogénnosti v celom množstve testovanej potravy. Koncentrácia testovanej látky v potrave určenej pre testovanú skupinu by sa mala zvoliť s ohľadom na citlivosť analytickej techniky, toxicitu testovanej látky (NOEC, ak je známa), ako aj na príslušné fyzikálno-chemické údaje. Ak sa použije referenčná látka, odporúča sa pridať ju pri koncentrácii okolo 10 % koncentrácie testovanej látky (v každom prípade však pri takej nízkej, akú je možné dosiahnuť) na základe analýzy citlivosti (napr. v prípade hexachlórbenzénu obsiahnutého v potrave je akceptovateľná koncentrácia 1 – 100 μg/g; viac informácií o asimilačnej účinnosti HCB sa uvádza v bode 47).
                     Testovanou látkou možno potravu pre ryby obohacovať niekoľkými spôsobmi v závislosti od fyzikálnych vlastností a rozpustnosti (podrobnosti o metódach obohacovania sú uvedené v dodatku 7):
                     
                                 —
                              
                              
                                 ak je látka rozpustná a stabilná v triglyceridoch, mala by sa pred pridaním do rybieho krmiva rozpustiť v malom množstve rybieho oleja alebo jedlého rastlinného oleja. V takom prípade treba dbať na to, aby výsledná dávka nebola príliš bohatá na lipidy z hľadiska prirodzeného obsahu lipidov obohateného krmiva pripočítaním minimálneho známeho množstva oleja potrebného na dosiahnutie správnej distribúcie a homogénnosti testovanej látky v potrave, alebo
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 potrava by mala byť obohatená použitím vhodného organického rozpúšťadla, pokiaľ sa tým neohrozí homogénnosť a biodostupnosť [je možné, že sa v dôsledku vyparovania rozpúšťadla v potrave vytvoria (mikro)kryštály testovanej látky, ktorých výskyt nie je jednoduché dokázať, pozri (49)], alebo
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 neviskózne kvapaliny by sa mali pridávať priamo do potravy pre ryby, ale mali by sa dobre premiešať, aby sa dosiahla homogénnosť a uľahčila vhodná asimilácia. Spôsob miešania by mal zaručovať homogénnosť obohateného krmiva.
                              
                           V niektorých prípadoch, napr. pri menej hydrofóbnych testovaných látkach s väčšou pravdepodobnosťou desorpcie z potravy, môže byť potrebné ponoriť pripravené pelety do malého množstva kukuričného/rybieho oleja (pozri bod 142). V takýchto prípadoch by sa malo podobne postupovať aj v prípade potravy pre kontrolnú skupinu a na účely merania lipidov by sa malo použiť hotové pripravené krmivo.
                     Ak sa použije referenčná látka, mali by byť jej výsledky porovnateľné s údajmi zo štúdií publikovaných v odbornej literatúre, ktoré boli vykonané za podobných podmienok a s porovnateľnou kŕmnou dávkou (pozri bod 45), pričom parametre špecifické pre referenčnú látku by mali spĺňať príslušné kritériá uvedené v bode 113 (odseky 3, 4 a 5).
                     Ak sa ako nosič testovanej látky použije olej alebo nosné rozpúšťadlo, malo by sa rovnaké množstvo toho istého nosiča (bez testovanej látky) zmiešať aj s krmivom pre kontrolnú skupinu, aby sa zachovala rovnocennosť s obohatenou potravou. Je dôležité, aby sa tak vo vychytávacej, ako aj depuračnej fáze testovaná a kontrolná skupina kŕmili potravou rovnocennej výživovej hodnoty.
                     Obohatená potrava by sa mala skladovať v podmienkach, v ktorých sa zachová stabilita testovanej látky v kŕmnej zmesi (napr. chladením) a tieto podmienky uviesť v skúšobnom protokole.
                     
                        Výber druhov rýb
                     
                     Môžu sa použiť rovnaké druhy rýb ako pri skúške expozície vo vodnom prostredí (pozri bod 32 a dodatok 3). Pred uverejnením tejto testovacej metódy sa v štúdiách potravovej bioakumulácie s organickými látkami bežne používa pstruh dúhový (Oncorhynchus mykiss), kapor rybničný (Cyprinus carpio) a čerebľa potočná (Pimephales promelas). Testované druhy by sa pri kŕmení mali správať tak, aby sa dosiahla rýchla konzumácia podanej kŕmnej dávky, čím sa zabezpečí minimalizácia akýchkoľvek faktorov ovplyvňujúcich koncentráciu testovanej látky v potrave (napr. vyplavovanie do vody a možnosť expozície vo vodnom prostredí). Mali by sa použiť ryby v odporúčanom rozpätí veľkosti/hmotnosti (pozri dodatok 3). Ryby by nemali byť príliš malé na to, aby sa dali ľahko individuálne analyzovať. Testované druhy s rýchlym rastom v priebehu životného cyklu môžu komplikovať interpretáciu údajov, a vysoká rýchlosť rastu zase môže ovplyvniť výpočet asimilačnej účinnosti (64).
                     
                        Chov rýb
                     
                     Kritériá prijateľnosti v prípade aklimatizácie, úmrtnosti a ochorení sú rovnaké ako pri skúške expozície vo vodnom prostredí pred vykonaním testu (pozri body 33 až 35).
                     VYKONANIE TESTU
                     
                        Činnosti pred uskutočnením štúdie na vyhľadávanie rozsahu
                     
                     Analytické prípravné práce pred štúdiou sú potrebné, aby sa preukázal výťažok látky z obohatenej potravy/obohateného rybieho tkaniva. Test na vyhľadávanie rozsahu na výber vhodných koncentrácií v potrave nie je vždy nevyhnutný. Aby sa preukázalo, že nie sú pozorované žiadne nepriaznivé účinky, ako aj na posúdenie chute obohatenej potravy, citlivosti metódy analýzy tkaniva rýb a potravy a výberu vhodnej kŕmnej dávky intervalov odberu vzoriek v depuračnej fáze atď., možno vykonať predbežné pokusy s kŕmením, ktoré však nie sú povinné. Predbežná štúdia môže byť užitočná na odhad počtu rýb potrebných na odber vzoriek počas depuračnej fázy. To by mohlo mať za následok podstatné zníženie počtu použitých rýb, najmä v prípade testovaných látok, ktoré sú mimoriadne vnímavé na metabolizmus.
                     
                        Podmienky expozície
                     
                     
                        Dĺžka vychytávacej fázy
                     
                     Vychytávacia fáza v trvaní 7 až 14 dní obyčajne postačuje a počas nej sa denne kŕmi jedna skupina rýb kontrolným krmivom a druhá skupina testovaným krmivom fixnými dávkami stanovenými v závislosti od testovaných druhov zvierat a experimentálnych podmienok, napr. 1 až 2 % telesnej hmotnosti (vlhkej) v prípade pstruha dúhového. Kŕmne dávky treba zvoliť tak, aby sa zabránilo rýchlemu rastu a prílišnému zvýšeniu obsahu lipidov. V prípade potreby možno vychytávaciu fázu predĺžiť na základe praktických skúseností z predchádzajúcich štúdií alebo poznaniu vychytávania/depurácie testovanej (alebo analogickej) látky v rybách. Začiatok skúšky sa definuje ako čas prvého kŕmenia obohatenou potravou. Deň experimentu trvá od chvíle kŕmenia do chvíle krátko pred uplynutím času ďalšieho kŕmenia (napr. jedna hodina). Preto prvý experimentálny deň vychytávania trvá od okamihu prvého kŕmenia obohatenou potravou a končí krátko pred druhým kŕmením obohatenou potravou. V praxi to znamená, že sa vychytávacia fáza skončí krátko pred (napr. jedna hodina) prvým kŕmením potravou neobohatenou o testovanú látku, keďže ryby budú aj v najbližších 24 hodinách stále tráviť obohatenú potravu a absorbovať testovanú látku. Je dôležité zabezpečiť dosiahnutie primerane veľkého (netoxického) celkového zaťaženia organizmu testovanou látkou podľa potrieb analytickej metódy tak, aby bolo v depuračnej fáze možné merať aspoň o rádovo nižší pokles zaťaženia. V osobitných prípadoch predĺženej fázy vychytávania (až na 28 dní) sa môže použiť dodatočný odber vzoriek v snahe získať podrobné informácie o kinetike vychytávania. Počas vychytávania nemusí koncentrácia v rybách dosiahnuť ustálený stav. Podobne ako pri skúške expozície vo vodnom prostredí možno aj tu použiť rovnice na odhad času do dosiahnutia ustáleného stavu, ktoré slúžia ako ukazovateľ pravdepodobného trvania potrebného na dosiahnutie hodnotiteľných koncentrácií rýb (pozri dodatok 5).
                     V niektorých prípadoch je možné, že buď v dôsledku slabej analytickej citlivosti, alebo nízkej asimilačnej účinnosti nebude vychytávanie látky rybami v trvaní 7 až 14 dní stačiť na to, aby použitá koncentrácia v potrave dosiahla takú vysokú koncentráciu v rybách, pri ktorej je možné analyzovať aspoň o rádovo nižší pokles vo fáze depurácie. V takých prípadoch môže byť vhodné predĺžiť počiatočnú fázu kŕmenia na dlhšie ako 14 dní, alebo, zvlášť v prípade vysoko metabolizovateľných látok, zvážiť vyššiu koncentráciu v potrave. Treba však dbať na to, aby celkové zaťaženie organizmu počas vychytávacej fázy zostalo pod úrovňou (odhadovanej) chronickej koncentrácie bez pozorovaného účinku (NOEC) v rybích tkanivách (pozri bod 138).
                     
                        Dĺžka depuračnej fázy
                     
                     Depurácia obyčajne trvá maximálne 28 dní od začiatku kŕmenia testovanej skupiny rýb čistou, neupravenou potravou po skončení fázy vychytávania. Depurácia začína prvým kŕmením „neobohatenou“ potravou a nie hneď po poslednom podaní „obohatenej“ potravy, keďže ryby budú aj v najbližších 24 hodinách stále tráviť potravu a absorbovať testovanú látku, ako sa uvádza v bode126. Preto sa prvá vzorka v depuračnej fáze odoberie krátko pred druhým kŕmením neobohatenou potravou. Depuračná fáza je navrhnutá tak, aby zachytila látky s možným polčasom do 14 dní, čo zodpovedá bioakumulatívnym látkam (65), takže 28 dní znamená dva polčasy týchto látok. V prípadoch látok s veľmi vysokou bioakumuláciou môže byť vhodné depuračnú fázu predĺžiť (ak tak ukáže predbežné testovanie).
                     Ak sa látka vylučuje veľmi pomaly, takže nie je možné presne určiť polčas v depuračnej fáze, môžu tieto informácie aj naďalej stačiť na účely zistenia vysokého stupňa bioakumulácie. Naopak, ak je látka vylučovaná tak rýchlo, že nie je možné spoľahlivo odvodiť koncentráciu v čase nula (koncentrácia na konci vychytávacej/začiatku depuračnej fázy C
                        0,d) ani hodnotu k
                        2, možno urobiť konzervatívny odhad hodnoty k
                        2 (pozri dodatok 7).
                     Ak z analýzy rýb v skorších intervaloch (napr. 7 alebo 14 dní) vyplýva, že sa látka pred uplynutím celého 28 dňového obdobia vylučuje pod úrovňou kvantifikácie, tak sa každý ďalší odber vzoriek preruší a skúška sa ukončí.
                     V niektorých prípadoch nemusí na konci vychytávacej fázy (alebo s druhou depuračnou vzorkou) dôjsť k žiadnemu merateľnému vychytávaniu testovanej látky. Ak možno preukázať, že: i) kritériá platnosti v bode 113 sú splnené a ii) nulové vychytávanie nie je spôsobené iným nedostatkom pri skúške (napr. nedostatočne dlhá fáza vychytávania, nedostatky v spôsobe obohacovania potravy spôsobujúce slabú biodostupnosť, nedostatočná citlivosť analytickej metódy, ryby odmietajúce žrať potravu atď.), je možné štúdiu ukončiť bez toho, aby sa musela zopakovať s dlhšou vychytávacou fázou. Ak sa počas prípravy skúšky ukázalo, že môže nastať tento prípad, odporúča sa pokiaľ možno vykonať analýzu výkalov na nestrávenú testovanú látku ako súčasť prístupu založeného na rovnováhe hmotnosti.
                     
                        Počty testovaných rýb
                     
                     Podobne ako pri skúške expozície vo vodnom prostredí by sa mali vybrať ryby s podobnou hmotnosťou a dĺžkou, pričom najmenšie ryby by nemali vážiť menej ako dve tretiny hmotnosti najväčších (pozri body 40 až 42).
                     Celkový počet rýb použitých v štúdii by sa mal vyberať podľa harmonogramu odberu vzoriek (minimálne jedna vzorka na konci vychytávacej fázy a štyri až šesť vzoriek počas depuračnej fázy v závislosti od dĺžok jednotlivých fáz), pričom sa zohľadňuje citlivosť analytickej techniky, pravdepodobná koncentrácia, ktorá sa dosiahne na konci vychytávacej fázy (na základe predchádzajúcich skúseností) a počas depurácie (ak je na základe predchádzajúcich skúseností možné urobiť odhad). V každom čase odberu vzoriek by sa malo odobrať päť až desať rýb a pred chemickou analýzou, príp. analýzou obsahu lipidov by sa mali odmerať parametre rastu (hmotnosť a celková dĺžka).
                     Vzhľadom na prirodzenú odlišnosť veľkostí, mieru rastu, fyziológiu rýb, ako aj možné rozdiely v množstve podanej potravy, ktorú každá ryba skonzumuje, by sa pri každom odbere vzoriek malo odobrať aspoň päť rýb z testovanej a päť z kontrolnej skupiny, aby bolo možné adekvátne stanoviť priemernú koncentráciu a jej odchýlky. Rozdiely medzi použitými rybami môžu počas skúšky prispievať k výsledným nekontrolovaným odchýlkam viac ako prirodzené odchýlky v použitých analytických metódach, a preto sa v niektorých prípadoch môže použiť až 10 rýb na každú odobranú vzorku. Ak však nie je na začiatku depuračnej fázy možné zmerať pozaďové koncentrácie testovanej látky v rybách z kontrolnej skupiny, môže chemická analýza dvoch až troch „kontrolných“ rýb pri poslednom odbere vzoriek kontroly postačovať iba vtedy, ak sa zvyšok rýb z kontrolnej skupiny pri každom z časov odberu vzoriek naďalej odoberá na účely zisťovania hmotnosti a celkovej dĺžky (aby bol odobraný rovnaký počet vzoriek z testovanej i kontrolnej skupiny na rast). Ryby by sa mali uskladniť, jednotlivo odvážiť (aj keď sa ukáže, že výsledky zo vzorky sa budú musieť následne skombinovať) a odmerať, aby sa zistila ich celková dĺžka.
                     Pri štandardnej skúške napr. s 28 dňovou depuračnou fázou vrátane piatich odberov vzoriek počas depurácie by to malo predstavovať celkom 59 až 120 rýb z testovanej a 50 až 110 z kontrolnej skupiny za predpokladu, že daná metóda analýzy látky umožňuje vykonať analýzu obsahu lipidov na tej istej rybe. Ak nie je možné vykonať analýzu obsahu lipidov na tej istej rybe, na ktorej sa vykonala chemická analýza, a na analýzu obsahu lipidov nie je možné použiť ani ryby z kontrolnej skupiny (pozri bod 56), bude potrebné odobrať ďalších 15 rýb (tri zo zásobnej populácie na začiatku skúšky, po tri z kontrolnej i testovanej skupiny na začiatku depurácie a po tri z kontrolnej a testovanej skupiny na konci pokusu). Príklad harmonogramu odberu vzoriek s počtom rýb sa uvádza v dodatku 4.
                     
                        Násada
                     
                     Podobne ako v prípade skúšky expozície vo vodnom prostredí (body 43 a 44) by sa mal použiť podobne vysoký pomer vody k množstvu rýb. Hoci veľkosť násady z hľadiska pomeru vody k množstvu rýb nemá v tejto skúške vplyv na expozičné koncentrácie, obyčajne sa odporúča veľkosť násady v rozmedzí od 0,1 do 1,0 g rýb (vlhká hmotnosť) na liter vody denne, aby sa zachovali primerané koncentrácie rozpusteného kyslíka a minimalizovalo vystavenie testovaných organizmov stresu.
                     
                        Testovacie krmivo a kŕmenie
                     
                     Počas obdobia aklimatizácie by sa ryby mali kŕmiť primeranou potravou tak, ako je opísané v bode 117. Ak sa skúška vykonáva v prietokových podmienkach, prietok by sa mal v čase kŕmenia rýb prerušiť.
                     Počas skúšky by potrava pre skúšobnú skupinu mala zodpovedať podmienkam opísaným v bodoch 116 až 121. Okrem špecifických faktorov látky by sa chuť potravy mala zohľadňovať aj pri určovaní analytickej citlivosti, očakávanej koncentrácia v potrave v environmentálnych podmienkach a úrovní chronickej toxicity/celkového zaťaženia organizmu a výbere cieľovej koncentrácie obohacovania (aby ryby krmivo neodmietali). Nominálne koncentrácie obohacovania testovanou látkou by sa mali uviesť do protokolu. Na základe skúseností poskytujú koncentrácie obohacovania v rozsahu 1 – 1 000 μg/g dostatočne praktické pracovné rozpätie pri testovaných látkach, ktoré nevykazujú špecifický toxický mechanizmus. V prípade látok s nešpecifikovaným mechanizmom by hladiny rezíduí v tkanivách nemali prekročiť 5 μ/g lipidov, pretože rezíduá prekračujúce túto úroveň môžu vyvolať chronické účinky (19) (48) (50) (66). Pri ostatných látkach treba dbať na to, aby nenastali žiadne nepriaznivé účinky z akumulovanej expozície (pozri bod 127). Platí to najmä v prípade, ak sa testuje viac ako jedna látka súčasne (pozri bod 112).
                     Potrava pre ryby sa môže obohatiť o vhodné množstvo testovanej látky jedným z troch spôsobov opísaných v bode 119 a v dodatku 7. Metódy a postup obohacovania krmiva by mali byť zdokumentované v protokole. Ryby z kontrolnej vzorky sa kŕmia neupravenou potravou, ktorá obsahuje rovnaké množstvo neobohateného olejového nosiča, ak sa použil na obohatenie potravy vo fáze vychytávania, alebo potravou upravenou „čistým“ rozpúšťadlom, ak sa na prípravu potravy pre testovanú skupinu použil nosič s rozpúšťadlom. Upravená a neupravená potrava by sa mala merať analyticky najmenej trikrát na koncentráciu testovanej látky pred začiatkom a na konci vychytávacej fázy. Po expozícii účinkom upraveného krmiva (fáza vychytávania) sa ryby (z obidvoch skupín) kŕmia neupravenou potravou (fáza depurácie).
                     Ryby sa kŕmia fixnou kŕmnou dávkou (v závislosti od druhu, napr. približne 1 – 2 % vlhkej telesnej hmotnosti na deň v prípade pstruha dúhového). Kŕmne dávky treba zvoliť tak, aby sa zabránilo rýchlemu rastu a prílišnému zvýšeniu obsahu lipidov. Presná kŕmna dávka stanovená počas pokusu by sa mala zaznamenať. Počiatočné kŕmenia by malo byť založené na pravidelných meraniach hmotnosti rýb zo zásobnej populácie tesne pred začiatkom skúšky. Množstvo krmiva by sa malo upraviť podľa vlhkých hmotností rýb vo vzorke pri každom odbere vzoriek, aby sa zohľadnil rast počas pokusu. Hmotnosti a dĺžky rýb v testovacích a kontrolných nádržiach možno odhadnúť z hmotností a celkových dĺžok rýb použitých pri každom odbere vzoriek; nevážte a nemerajte ryby, ktoré zostanú v testovacích a kontrolných nádržiach. V priebehu experimentu je dôležité zachovať rovnakú stanovenú dávku krmiva.
                     Kŕmenie by sa malo pozorovať, aby sa zabezpečilo, že ryby viditeľne skonzumujú všetku ponúknutú potravu, čím sa zaručí, že na výpočty sa použijú vhodné miery príjmu potravy. Pri stanovovaní kŕmnej dávky by sa mali zohľadniť pokusy s predbežným kŕmením, príp. predchádzajúce skúsenosti, aby sa zaručilo, že sa skonzumuje všetka potrava z kŕmenia raz denne. Ak ryby potravu dlhodobo nekonzumujú, odporúča sa dávku rozdeliť a časť podať v rámci jedného kŕmenia navyše, ktoré sa pridá na každý experimentálny deň (napr. kŕmenie raz denne sa nahradí kŕmením dvakrát denne s polovičným množstvom krmiva). Ak je to potrebné, malo by sa druhýkrát kŕmiť v pevne stanovenom čase a tak, aby pred odberom vzoriek uplynulo čo najviac času (napr. čas druhého kŕmenia sa stanoví na prvú polovicu experimentálneho dňa).
                     Hoci vo všeobecnosti konzumujú ryby potravu rýchlo, je dôležité zaručiť, že látka bude aj naďalej absorbovaná v potrave. Treba sa snažiť vyhnúť tomu, aby sa testovaná látka v potrave rozptýlila vo vode, čo by spôsobilo expozíciu rýb koncentráciám testovanej látky z vodného prostredia a nie z potravy. To možno dosiahnuť odstránením neskonzumovanej potravy (aj výkalov) z testovacích a kontrolných nádrží do jednej hodiny po kŕmení, najlepšie však do 30 minút. Okrem toho je možné použiť systém, ktorým je voda neustále čistená aktívnym uhlíkovým filtrom, aby sa z nej absorbovali všetky „rozpustené“ kontaminanty. Rýchlemu odplaveniu častíc potravy a rozpustených látok môžu pomôcť prietokové systémy (67). V niektorých prípadoch je možné tento problém odstrániť aj miernou úpravou spôsobu obohacovania potravy (pozri bod 119).
                     
                        Svetlo a teplota
                     
                     Podobne ako pri skúške expozície vo vodnom prostredí (pozri bod 48) sa 12 až 16 hodinová fotoperióda a teplota (± 2 °C) odporúčajú ako vhodné podmienky pre použité testované druhy (pozri dodatok 3). Typ osvetlenia a jeho charakteristiky musia byť známe a zapísané do protokolu.
                     
                        Kontroly
                     
                     Mala by sa použiť jedna kontrolná skupina, v ktorej sú ryby kŕmené rovnakou kŕmnou dávkou ako v testovanej skupine, ale bez prítomnosti testovanej látky v krmive. Ak sa na obohatenie potravy pre testovanú skupinu použije olejový nosič alebo nosič s rozpúšťadlom, mal by sa rovnakým spôsobom upraviť aj potrava pre kontrolnú skupinu, ale bez prítomnosti testovanej látky, aby bola potrava pre testovanú i kontrolnú skupinu rovnaká (pozri body 121 a 139).
                     
                        Frekvencia meraní kvality vody
                     
                     Aj tu platia podmienky opísané v skúške s expozíciou vo vodnom prostredí, s výnimkou toho, že TOC sa musí merať iba pred skúškou ako súčasť určovania vlastností testovanej vody (pozri bod 53).
                     
                        Odber a analýza vzoriek rýb a potravy
                     
                     
                        Analýza vzoriek potravy
                     
                     Vzorky potravy pre testovanú i kontrolnú skupinu by sa mali analyzovať najmenej trikrát na prítomnosť testovanej látky a obsah lipidov, a to minimálne pred začiatkom a na konci vychytávacej fázy. Analytické metódy a postupy na zabezpečenie homogénnosti krmiva by mali byť uvedené v protokole.
                     Vzorky by sa mali na prítomnosť testovanej látky analyzovať stanovenou a platnou metódou. Prípravné práce pred štúdiou sú potrebné na stanovenie kvantifikačného limitu, percenta výťažku, interferencií a analytických odchýlok v zamýšľanej matrici odberu vzoriek. Ak sa testuje materiál označený rádioaktívnym izotopom, mali by sa zohľadňovať rovnaké skutočnosti ako v prípade skúšky expozície vo vodnom prostredí, akurát namiesto analýzy vody sa vykoná analýza potravy (pozri bod 65).
                     
                        Analýza rýb
                     
                     Pri každom odbere vzoriek rýb sa odoberie 5 až 10 rýb z exponovanej a kontrolnej skupiny (v niektorých prípadoch je možné počet rýb z kontrolnej skupiny znížiť, pozri bod 134).
                     Odber vzoriek by mal prebiehať každý experimentálny deň v rovnakom čase (podľa času kŕmenia) a mal by sa načasovať tak, aby sa minimalizovala pravdepodobnosť pretrvávania potravy v črevách v priebehu trvania vychytávacej fázy a na začiatku depuračnej fázy, a tým sa zabránilo falošným prírastkom k celkovým koncentráciám testovanej látky (t. j. ryby vo vzorke by sa mali na konci experimentálneho dňa vybrať, pričom treba pamätať na to, že experimentálny deň začína časom kŕmenia a končí časom ďalšieho kŕmenia, čiže asi o 24 hodín neskôr. Depurácia začína prvým kŕmením neobohatenou potravou, pozri bod 128). Prvá vzorka z depuračnej fázy (odobraná krátko pred druhým kŕmením neobohatenou potravou) je dôležitá, pretože extrapolácia údajov z tohto bodu merania v predchádzajúcom dni slúži na odhad koncentrácie v čase nula (C0,d je koncentrácia v rybách na konci vychytávacej/začiatku depuračnej fázy). Nepovinne sa môže na konci vychytávacej a na 1. a 3. deň depurácie odstrániť a samostatne analyzovať gastrointestinálny trakt rýb.
                     Pri každom odbere vzoriek by sa mali ryby z oboch testovacích nádrží vybrať a malo by sa s nimi zaobchádzať rovnako, ako v prípade skúšky expozície vo vodnom prostredí (pozri body 61 až 63).
                     Koncentrácie testovanej látky v celých rybách (vlhká hmotnosť) sa merajú aspoň na konci vychytávacej a v priebehu depuračnej fázy tak v kontrolných, ako aj pokusných skupinách. Počas depuračnej fázy sa odporúča urobiť štyri až šesť odberov (napr. 1, 3, 7, 14 a 28 dní). Nepovinne sa po 1 – 3 dňoch vychytávania, t. j. stále blízko začiatku expozičného času, môže pridať ďalší odber vzoriek, aby sa určila asimilačná účinnosť z lineárnej fázy vychytávania. Možné sú dve hlavné odchýlky od harmonogramu: i) ak sa na účely prieskumu kinetiky vychytávania predĺži vychytávacia fáza, budú sa počas nej robiť ďalšie odbery vzoriek, takže bude potrebné pridať ďalšie ryby (pozri bod 126); ii) ak sa štúdia na konci vychytávacej fázy ukončí z dôvodu vychytávania, ktoré sa nedá merať (pozri bod 131). Každá jedna ryba odobraná do vzorky sa odváži (a zmeria sa jej celková dĺžka), aby sa mohli určiť rýchlostné konštanty rastu. Koncentrácie látky v špecifických tkanivách rýb (jedlých i nejedlých častiach) možno tiež merať na konci vychytávacej fázy a vo vybraných časoch počas depurácie. Ak sa testuje materiál označený rádioaktívnym izotopom, mali by sa zohľadňovať rovnaké skutočnosti ako v prípade skúšky expozície vo vodnom prostredí, akurát namiesto analýzy vody sa vykoná analýza potravy (pozri bod 65).
                     V prípade pravidelného používania referenčnej látky (pozri bod 25) je vhodnejšie, aby sa koncentrácie merali v testovanej skupine na konci vychytávacej fázy a v každom čase depurácie stanovenom pre danú testovanú látku (na celých rybách); koncentrácie sa musia analyzovať iba v kontrolnej skupine na konci vychytávania (na celých rybách). Za určitých okolností (napr. ak metódy analýzy testovanej a referenčnej látky nie sú kompatibilné, takže na dodržanie harmonogramu odberu vzoriek budú potrebné ďalšie ryby) možno použiť aj iný postup (opísaný ďalej), ako minimalizovať potrebu pridania ďalších rýb. Koncentrácie referenčnej látky sa počas depuračnej fázy merajú iba v 1. a 3. deň a v ďalších dvoch časoch odberu vzoriek vybraných tak, aby bolo možné urobiť spoľahlivé odhady koncentrácie v čase nula (C0,d) a k
                        2 pre referenčnú látku.
                     Ak je to možné, mal by sa stanoviť obsah lipidov v jednotlivých rybách pri každom odbere vzoriek, alebo aspoň na začiatku a na konci vychytávacej a na konci depuračnej fázy. (pozri body 56 a 67). V závislosti od použitej analytickej metódy (pozri bod 67 a dodatok 4) možno použiť tie isté ryby tak na analýzu obsahu lipidov, ako aj určovanie koncentrácie testovanej látky. Táto možnosť sa uprednostňuje v snahe minimalizovať počet rýb. Ak by to však nebolo možné, môže sa použiť rovnaký postup ako pri skúške expozície vo vodnom prostredí (pozri bod 56 pre alternatívne možnosti merania lipidov). Metóda použitá na kvantifikáciu obsahu lipidov by mala byť zdokumentovaná v protokole.
                     
                        Kvalita analytickej metódy
                     
                     Mali by sa vykonávať experimentálne kontroly, aby sa zaručila špecifickosť, správnosť, presnosť a reprodukovateľnosť analytickej techniky špecifickej pre danú látku, ako aj výťažnosť testovanej látky z potravy a rýb.
                     
                        Meranie rastu rýb
                     
                     Na začiatku testu sa musí odvážiť vzorka rýb zo zásobnej populácie (a zmerať ich celková dĺžka). Tieto ryby by mali byť odobrané do vzorky tesne (t. j. jednu hodinu) pred prvým kŕmením obohatenou potravou a zaradené do experimentálneho dňa 0. Počet rýb z tejto vzorky by mal byť minimálne rovnaký ako vo vzorkách počas skúšky. Niektoré z nich môžu byť tie isté ryby, ktoré sa použili na analýzu obsahu lipidov pred začiatkom vychytávacej fázy (pozri bod 153). Pri každom odbere vzoriek sa ryby najskôr odvážia a zmerajú. Pri každej jednej rybe by sa nameraná hmotnosť a dĺžka mala dať do súvislosti s koncentráciou analyzovanej chemikálie (a v prípade potreby aj s obsahom lipidov) napr. označením každej ryby zo vzorky jedinečným identifikátorom. Merania na týchto vzorkách rýb možno použiť na odhad hmotnosti (a dĺžky) rýb, ktoré zostanú v testovacích a kontrolných nádržiach.
                     
                        Experimentálne hodnotenie
                     
                     Prípady mortality by sa mali denne sledovať a zaznamenávať. Sledovať a zaznamenávať by sa mali aj iné nepriaznivé účinky napr. nezvyčajné správanie alebo pigmentácia. Ryby sa považujú za uhynuté, ak nemožno pozorovať žiaden respiračný pohyb ani reakciu na slabý mechanický podnet. Všetky uhynuté alebo zjavne hynúce ryby by sa mali odstrániť.
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     Výsledky skúšky sa používajú na určenie rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2) ako funkcie celkovej vlhkej hmotnosti rýb. Konštanta rýchlosti rastu k
                        g vychádzajúca z priemeru prírastkov hmotnosti rýb sa v prípade potreby počíta a používa na získanie rýchlostnej konštanty vychytávania k
                        2g opravenej vzhľadom na rast. Okrem toho by sa do protokolu mala zapísať aj asimilačná účinnosť (a, absorpcia z čriev), kinetický biomagnifikačný faktor (BMFK) (ak je to potrebné, opravený vzhľadom na rast – BMFKg), jeho hodnota opravená vzhľadom na obsah lipidov (BMFKL alebo BMFKgL, ak je opravená aj vzhľadom na rast) a kŕmna dávka. Ak je možné urobiť odhad času na dosiahnutie ustáleného stavu vo vychytávacej fáze (napr. 95 % ustáleného stavu alebo t
                        95 = 3,0/k
                        2), možno pridať aj odhad hodnoty BMF v ustálenom stave (BMFSS) (pozri body 105 a 106 a dodatok 5), ak hodnota t
                        95 naznačuje, že sa môžu dosiahnuť podmienky ustáleného stavu. Hodnota BMFSS by sa mala opraviť vzhľadom na obsah lipidov tak isto ako hodnota kinetického BMF (BMFK), aby bolo možné získať jeho hodnotu opravenú vzhľadom na obsah lipidov – BMFSSL (upozorňujeme, že neexistuje žiaden schválený postup na opravu ustáleného BMF vzhľadom na rast). Vzorce a príklad výpočtu sú uvedené v dodatku 7. K dispozícii sú postupy, ktoré umožňujú odhad kinetického biokoncentračného faktora (BCFK) z údajov získaných zo skúšky expozície z potravy. Tieto sú opísané v dodatku 8.
                     
                        Údaje o hmotnosti/dĺžke rýb
                     
                     Do tabuľky sa zvlášť pre testovanú a kontrolnú skupinu zapíšu vlhké hmotnosti a dĺžky jednotlivých rýb v každom časovom intervale a za všetky dni odberu vzoriek vo vychytávacej fáze (zásobná populácia na začiatku vychytávania, kontrolná a testovaná skupina na konci vychytávacej fázy a v prípade, že sa uskutoční, tak aj v jej počiatočnej fáze (napr. v 1. až 3. deň vychytávania), ako aj počas depuračnej fázy (napr. dni 1, 2, 4, 7, 14, 28 v kontrolnej i testovanej skupine). Hmotnosť je preferovaným parametrom rastu na účely opravy vzhľadom na znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu. Metóda, resp. metódy používané na opravu údajov vzhľadom na rast sú uvedené v bodoch 162 a 163 a v dodatku 5.
                     
                        Údaje o koncentrácii testovanej látky v rybách
                     
                     Merania rezíduí testovanej látky v jednotlivých rybách (alebo v združených vzorkách rýb, ak jednotlivé merania nie sú možné) vyjadrené ako koncentrácia vo vlhkej hmotnosti (v hm. %) sa zapíšu do tabuľky pre testovanú a kontrolnú skupinu rýb pri každom jednom odbere vzoriek. Ak sa každá vzorka rýb podrobila analýze obsahu lipidov, potom je možné odvodiť a zapísať do tabuľky aj jednotlivé koncentrácie opravené vzhľadom na obsah lipidov vyjadrené ako koncentrácia lipidov (v hm. %).
                     
                                 —
                              
                              
                                 Merania rezíduí testovanej látky v jednotlivých rybách (alebo v združených vzorkách rýb, ak jednotlivé merania nie sú možné, pozri bod 66) počas depuračnej fázy sa prevedú na ich prirodzené logaritmy a zakreslia do grafu v závislosti od času (dňa). Ak sa vizuálnou kontrolou grafu zistia zjavné odľahlé hodnoty, môže sa použiť štatisticky platná skúška na odľahlé hodnoty, ktorou sa odstránia falošné údaje, a pridať odôvodnenie ich vynechania.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Vypočíta sa lineárna zhoda najmenších štvorcov z údajov pre ln (koncentrácia) vo vzťahu k depurácii (deň). Smernica a úsek priamky sa zaznamenajú do protokolu ako celková hodnota rýchlostnej konštanty depurácie (k
                                    2) a prirodzený logaritmus odvodenej hodnoty koncentrácie v čase nula (C
                                    0,d) (podrobnosti sú uvedené v dodatku 5 a dodatku 7). Ak by to nebolo možné z dôvodu nižších koncentrácií ako ich kvantifikačný limit v druhej vzorke z depuračnej fázy, môže sa urobiť konzervatívny odhad hodnoty k
                                    2 (pozri dodatok 7).
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Vypočítajú sa odchýlky od smernice a úseku priamky použitím štandardných štatistických metód a 90 % (alebo 95 %) intervaly spoľahlivosti týchto výsledkov sa vyhodnotia a zapíšu.
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 Vypočíta sa aj priemerná hodnota koncentrácie nameranej v posledný deň vychytávania (koncentrácia nameraná v čase nula C
                                    0,m) a porovná sa s odvodenou hodnotu C
                                    0,d. Ak je odvodená hodnota nižšia ako nameraná, ich rozdiel môže svedčiť o prítomnosti nestrávenej obohatenej potravy v črevách. Ak je odvodená hodnota oveľa vyššia ako nameraná, možno sa domnievať, že hodnota odvodená z lineárnej regresie depuračných údajov nie je správna a mala by sa prehodnotiť (pozri dodatok 7).
                              
                           
                        Rýchlosť depurácie a biomagnifikačný faktor
                     
                     Na výpočet biomagnifikačného faktora z existujúcich údajov by sa najskôr mala získať hodnota asimilačnej účinnosti (absorpcie testovanej látky v črevách α). Na tento účel by sa mala použiť rovnica A7.1 uvedená v dodatku 7, pri ktorej treba poznať odvodenú hodnotu koncentrácie v čase nula depuračnej fázy (C
                        0,d), (celkovú) hodnotu rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2), hodnotu koncentrácie v potrave (C
                        food), rýchlostnú konštantu trávenia potravy (I) a dĺžku vychytávacej fázy (t). Zaznamená sa smernica a úsek lineárneho vzťahu medzi ln (koncentráciou) a časom depurácie ako celková hodnota rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2= smernica) a koncentrácie v čase nula (C
                        0,d = eúsek), ako je opísané vyššie. Mala by sa skontrolovať biologická plauzibilita odvodených hodnôt (napr. asimilačná účinnosť ako zlomok nie je väčšia ako 1). Hodnota (I) sa vypočíta každý deň vydelením hmotnosti potravy hmotnosťou kŕmených rýb (ak sú kŕmené množstvom zodpovedajúcim 2 % telesnej hmotnosti, hodnota (I) bude 0,02). Hodnotu kŕmnej dávky použitú vo výpočte možno bude treba upraviť tak, aby zodpovedala rastu rýb (možno tak urobiť použitím známej rýchlostnej konštanty rastu na odhad hmotnosti rýb pri každom odbere vzoriek počas vychytávacej fázy, pozri dodatok 7). Ak nie je možné hodnoty k
                        2 a C
                        0,d odvodiť, napr. z dôvodu koncentrácií pod limitom detekcie v druhej vzorke z depuračnej fázy, možno urobiť konzervatívny odhad hodnoty k
                        2 a „hornej hranice“ hodnoty BMFk (pozri dodatok 7).
                     Po získaní hodnoty asimilačnej účinnosti (α) sa biomagnifikačný faktor môže vypočítať vynásobením hodnoty α rýchlostnou konštantou trávenia (I) a následným vydelením tohto výsledku (celkovou) hodnotou rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2). Hodnota biomagnifikačného faktora opravená vzhľadom na rast sa vypočíta rovnako, ale s použitím hodnoty rýchlostnej konštanty depurácie opravenej vzhľadom na rast(k
                        2g, pozri body 162 a 163). Alternatívny odhad hodnoty asimilačnej účinnosti je možné urobiť v prípade, že ryby zo vzorky boli podrobené analýze tkaniva v počiatočnej, lineárnej fáze vychytávania, pozri bod 151 a dodatok 7). Táto hodnota predstavuje nezávislý odhad asimilačnej účinnosti pre v podstate neexponovaný organizmus (t. j. u rýb tesne pred začiatkom vychytávacej fázy). Odhad hodnoty asimilačnej účinnosti z údajov v depuračnej fáze sa obyčajne používa na odvodenie hodnoty BMF.
                     
                        Opravy vzhľadom na obsah lipidov a rast
                     
                     Rast rýb počas depuračnej fázy môže znížiť hodnoty nameraných chemických koncentrácií v rybách, a tým spôsobiť, že celková hodnota rýchlostnej konštanty depurácie (k
                        2) bude vyššia ako pri samotných procesoch odbúravania (napr. metabolizmom, vypudením, pozri bod 72). Obsah lipidov v testovaných rybách (ktorý úzko súvisí s bioakumuláciou hydrofóbnych látok) a obsah lipidov v potrave sa môžu v praxi líšiť tak, aby sa ich hodnoty museli opraviť, ak majú byť hodnoty faktorov biomagnifikácie odvodené zmysluplným spôsobom. Hodnota biomagnifikačného faktora by sa mala opraviť vzhľadom na rast (podobne ako hodnota kinetického BCF pri skúške expozície vo vodnom prostredí), ako aj vzhľadom na obsah lipidov v potrave v porovnaní s obsahom lipidov v rybách (korekčný faktor lipidov). Rovnice a príklady týchto výpočtov sú uvedené v dodatku 5, resp. v dodatku 7.
                     Na účely opravy hodnôt vzhľadom na znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu ryby by sa mala vypočítať hodnota rýchlostnej konštanty depurácie opravená o rast (k
                        2g) (pozri rovnice v dodatku 5). Hodnota rýchlostnej konštanty depurácie opravená vzhľadom na rast (k
                        2g) sa potom použije na výpočet hodnoty biomagnifikačného faktora opravenej o rast tak, ako je uvedené v bode 73. Tento postup však v niektorých prípadoch nie je možný. Alternatívny postup, ktorým sa dá vyhnúť potrebe opravovať hodnoty o znižovanie koncentrácie látky vplyvom rastu, používa hmotnostné údaje o depurácii testovanej látky za každú rybu (celú rybu) namiesto bežných hmotnostných údajov o testovanej látke (koncentrácii) na jednotku hmotnosti ryby. To sa dá ľahko dosiahnuť, keďže v skúškach podľa tejto testovacej metódy by sa zaznamenané údaje o koncentrácii v tkanivách mali vzťahovať na individuálne hmotnosti rýb. Jednoduchý návod je uvedený v dodatku 5. Pripomíname, že hodnota k
                        2 by sa mala odhadovať a zaznamenávať aj vtedy, keď sa použije alternatívny postup.
                     Na účely opravy hodnôt vzhľadom na obsah lipidov v potrave a v rybách bez vykonania analýzy obsahu lipidov na všetkých rybách zo vzorky sa odvodia priemerné hodnoty lipidových frakcií (v hm. %) v rybách a potrave (68). Korekčný faktor lipidov (L
                        c) sa potom vypočíta vydelením priemeru lipidových frakcií v rybách priemerom lipidových frakcií v potrave. Hodnota biomagnifikačného faktora, podľa potreby opravená vzhľadom na rast, sa vydelí korekčným faktorom lipidov a získa sa hodnota biomagnifikačného faktora opravená vzhľadom na obsah lipidov.
                     Ak sa chemická analýza a analýza obsahu lipidov pri každom odbere vzoriek vykonajú na tých istých rybách, potom možno na výpočet hodnoty BMF opravenej o obsah lipidov použiť priamo údaje získané z tkanív jednotlivých rýb a opravené vzhľadom na obsah lipidov (pozri bod 37). Z grafu hodnôt koncentrácií opravených o obsah lipidov je možné získať hodnotu C
                        0,d vzhľadom na obsah lipidov a hodnotu k
                        2. Potom je možné vykonať matematickú analýzu použitím rovnice v dodatku 7, pričom hodnota asimilačnej účinnosti (a) sa vypočíta použitím rýchlostnej konštanty trávenia potravy normalizovanej o obsah lipidov (I
                        lipid) a koncentrácie v potrave vzhľadom na obsah lipidov (C
                        food-lipid). Parametre opravené o obsah lipidov sa potom podobne použijú na výpočet BMF (pripomíname, že na výpočet hodnoty BMFKgL opravenej vzhľadom na rast a obsah lipidov by sa oprava rýchlostnou konštantou rastu mala použiť aj v prípade lipidovej frakcie a nie vlhkej hmotnosti rýb).
                     
                        Interpretácia výsledkov
                     
                     Priemerný rast v testovanej i kontrolnej skupine by sa v zásade nemali výrazne odlišovať, aby sa vylúčili toxické účinky. Rýchlostné konštanty rastu alebo rastové krivky v oboch skupinách by sa mali vhodným spôsobom porovnať (69).
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Po ukončení štúdie sa vypracuje záverečný protokol obsahujúci informácie o testovanej látke, testovaných druhoch a podmienkach testu podľa bodu 81 (ako v prípade skúšky expozície vo vodnom prostredí). Okrem toho sa vyžadujú tieto údaje:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná látka:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             akékoľvek informácie o stabilite testovanej látky v pripravenej potrave.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Podmienky testu:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             nominálna koncentrácia látky v potrave, metóda obohacovania, množstvo (lipidového) nosiča použité v procese obohacovania (ak sa použije), merania koncentrácií testovanej látky v obohatenom krmive pre každú analýzu (najmenej trikrát pred začiatkom štúdie a na konci vychytávacej fázy) a priemerné hodnoty,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             druh a kvalita nosiča s olejom alebo rozpúšťadlom (trieda, dodávateľ atď.) používaného na obohacovanie potravy, ak sa použije,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             druh použitej potravy (približná analýza (70), trieda alebo kvalita, dodávateľ atď.), kŕmna dávka v priebehu vychytávacej fázy, množstvo a frekvencia podávanej potravy (vrátane akýchkoľvek jej úprav podľa hmotnosti rýb vo vzorke),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             čas, kedy boli ryby odobraté a usmrtené na účely chemickej analýzy pri každom odbere vzoriek (napr. jednu hodinu pred nasledujúcim dňom kŕmenia).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             výsledky všetkých predbežných prípravných prác,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             informácie o všetkých pozorovaných nežiaducich účinkoch,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             úplný opis všetkých postupov použitých na chemickú analýzu vrátane detekčných a kvantifikačných limitov, odchýlok a výťažku,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             namerané koncentrácie lipidov v potrave (obohatenej i kontrolnej), individuálne hodnoty, priemerné hodnoty a štandardné odchýlky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabuľkové údaje o hmotnosti (a dĺžke) za každú rybu z kontrolnej i exponovanej skupiny (napr. označením každej ryby vo vzorke jedinečným identifikátorom) a výpočty, odvodená hodnota rýchlostnej konštanty, resp. konštánt rastu a 95 % interval(-y) spoľahlivosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabuľkové hodnoty koncentrácií testovanej látky v rybách, priemerné koncentrácie namerané na konci vychytávacej fázy (C
                                                0,m), a odvodená (celková) hodnota rýchlostnej konštanty depurácie (k
                                                2) a koncentrácie v rybách na začiatku depuračnej fázy(C
                                                0,d) spolu s odchýlkami týchto hodnôt (smernica a úsek grafu),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             tabuľkové hodnoty obsahu lipidov (prípadne uvádzané spolu s konkrétnymi koncentráciami látky), priemerné hodnoty dosiahnuté v testovanej a kontrolnej skupine na začiatku skúšky, na konci vychytávania a konci depurácie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             krivky (vrátane všetkých nameraných údajov) zobrazujúce (v prípade potreby sa môžu koncentrácie vyjadriť vo vzťahu k celému telu alebo k jeho konkrétnemu tkanivu) tieto parametre:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rast (t. j. hmotnosť rýb (a dĺžka) v závislosti od času) alebo prirodzený logaritmus transformácie hmotnosti v závislosti od času,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         depurácia testovanej látky v rybách a
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         hodnota koncentrácie transformovanej prirodzeným logaritmom (ln koncentrácia) v porovnaní s časom depurácie (vrátane odvodenej hodnoty rýchlostnej konštanty depurácie k
                                                            2 a hodnoty koncentrácie v rybách odvodenej prirodzeným logaritmom na začiatku depuračnej fázy, C
                                                            0,d),
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ak sa vizuálnou kontrolou grafu zistia zjavné odľahlé hodnoty, môže sa použiť štatisticky platná skúška na odľahlé hodnoty, ktorou sa odstránia neopodstatnené údaje, a pridať odôvodnenie ich vynechania,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             výpočet rýchlostnej konštanty depurácie a hodnoty polčasu opravených vzhľadom na rast,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             výpočet hodnoty asimilačnej účinnosti (α),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             „hrubá“ hodnota potravového BMF, hodnota kinetického BMF opravená o obsah lipidov a rast („hrubá“ a opravená vzhľadom na obsah lipidov podľa vlhkej hmotnosti celej ryby), prípadne hodnota BMF pre jednotlivé tkanivá,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             všetky informácie o metabolitoch testovanej látky označených rádioaktívnym izotopom a o ich akumulovaní,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             čokoľvek nezvyčajné, čo sa počas testu pozorovalo, všetky odchýlky od týchto postupov a všetky iné významné informácie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             súhrnná tabuľka s príslušnými nameranými a vypočítanými údajmi:
                                             
                                                         Rýchlostné konštanty depurácie a biomagnifikačné faktory látky (BMFK)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            g (rýchlostná konštanta rastu, deň– 1):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2 (celková rýchlostná konštanta depurácie, deň– 1):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu (95 % CI)
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            k
                                                            2g (celková rýchlostná konštanta depurácie opravená o rast, deň– 1):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,m (koncentrácia nameraná v čase nula, koncentrácia v rybách na konci vychytávania) (μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            0,d (odvodená hodnota koncentrácie v čase nula v depuračnej fáze, μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I (stanovená rýchlosť trávenia potravy, g potravy/g ryby za deň):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            I
                                                            g (efektívna rýchlosť trávenia potravy opravená vzhľadom na rast, g potravy/g ryby za deň) (72):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            C
                                                            w (chemická koncentrácia v potrave, μg/g):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            α (hodnota asimilačnej účinnosti látky):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFK (hodnota kinetického potravového BMF):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         BMFKg (hodnota kinetického potravového BMF opravená vzhľadom na rast):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu (95 % CI) (71)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            t
                                                            1/2g (hodnota polčasu opravená vzhľadom na rast, udávaná v dňoch):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                                         
                                                            Lc (korekčný faktor lipidov):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu
                                                      
                                                   
                                                         BMFKgL (hodnota kinetického BMF opravená o obsahov lipidov a rast):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu
                                                      
                                                   
                                                         BMFSS-L (hodnota indikatívneho ustáleného BMF opravená vzhľadom na obsah lipidov) (72):
                                                      
                                                      
                                                         vložte hodnotu ± SD (72)
                                                         
                                                      
                                                   
                                       
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Kapitola C.13 tejto prílohy, Biokoncentrácia: prietokový rybí test.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Kapitola A.6 tejto prílohy, Rozpustnosť vo vode
                                 
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Li A, Doucette W.J. (1993), The effect of cosolutes on the aqueous solubilities and octanol/water partition coefficients of selected polychlorinated biphenyl congeners. Environ Toxicol Chem 12: 2031-2035
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozdeľovací koeficient (n-oktanol/voda): metóda trepačkovej banky.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Kapitola A.24 tejto prílohy, Rozdeľovacia konštanta (n-oktanol/voda), metóda HPLC.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Kapitola A.23 tejto prílohy, Rozdeľovací koeficient (1-oktanol/voda): metóda pomalého miešania.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Kapitola C.7 tejto prílohy, Hydrolýza ako funkcia pH.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 (OECD (1997), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Number 7: Guidance Document on Direct Phototransformation of Chemicals in Water OCDE/GD(97)21. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Kapitola A.5 tejto prílohy, Surface Tension of Aqueous Solutions.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Kapitola A.4 tejto prílohy, Tlak pary.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Kapitola C.4 tejto prílohy, Stanovenie “ľahkej” biodegradovateľnosti.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Kapitola C.29 tejto prílohy, Ľahká biodegradovateľnosť – CO2 v hermeticky uzavretých nádobách
                                 
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Connell D.W. (1988), Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102: 117-156.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. K dispozícii na webovej lokalite: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Brown R.S., Akhtar P., Åkerman J., Hampel L., Kozin I.S., Villerius L.A. and Klamer H.J.C. (2001), Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) films. Environ. Sci. Technol. 35: 4097-4102.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Fernandez J.D., Denny J.S. and Tietge J.E. (1998), A simple apparatus for administering 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin to commercially available pelletized fish food. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2058-2062.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N., Whiteman F.W. and Dawson T.D. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: I. Feeding studies with 2,2′, 5,5′-tetrachlorobiphenyl. Toxicol. Sci. 77: 206-218.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Parkerton T.F., Arnot J.A., Weisbrod A.V., Russom C., Hoke R.A., Woodburn K., Traas T., Bonnell M., Burkhard L.P. and Lampi M.A. (2008), Guidance for evaluating in vivo fish bioaccumulation data. Integr. Environ. Assess. Manag. 4: 139-155.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 Verbruggen E.M.J., Beek M., Pijnenburg J. and Traas T.P. (2008). Ecotoxicological environmental risk limits for total petroleum hydrocarbons on the basis of internal lipid concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2436-2448.
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 Schlechtriem C., Fliedner A. and Schäfers C. (2012), Determination of lipid content in fish samples from bioaccumulation studies: Contributions to the revision of OECD Test Guideline 305. Environmental Sciences Europe 2012, 24:13. published: 3 April 2012.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 Kapitola C.47 tejto prílohy, Test toxicity v ranom štádiu vývoja rýb.
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 Kapitola C.15 tejto prílohy, Ryby, krátkodobý test na embryách a vývojovom štádiu plodového vaku.
                              
                           
                                 24.
                              
                              
                                 Kapitola C.14 tejto prílohy, Rastový test mláďat rýb.
                              
                           
                                 25.
                              
                              
                                 OECD (2000), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 23: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures ENV/JM/MONO(2000)6. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 26.
                              
                              
                                 US-EPA (1994), Great Lake water quality initiative technical support document for the procedure to determine bioaccumulation factors 822-R-94-002. US EPA, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington, DC, USA.
                              
                           
                                 27.
                              
                              
                                 US-FDA (1999), Pesticide analytical manual (PAM). Vol.1. US Food and Drug Administration, Rockville, MD, USA.
                              
                           
                                 28.
                              
                              
                                 US-EPA (1974), Section 5, A (1) Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson, J.F., Editor. US-EPA, Research Triangle Park, NC, USA
                              
                           
                                 29.
                              
                              
                                 Bligh E.G. and Dyer W.J. (1959), A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A. and Parrish C.C. (1985), Micromethod for lipids in aquatic invertebrates. Limnol. Oceanogr. 30: 1099-1105.
                              
                           
                                 31.
                              
                              
                                 Smedes F. (1999), Determination of total lipid using non-chlorinated solvents. Analyst. 124: 1711-1718.
                              
                           
                                 32.
                              
                              
                                 OECD (2006), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 54: Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. ENV/JM/MONO(2006)18. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                                 33.
                              
                              
                                 Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                              
                           
                                 34.
                              
                              
                                 Springer T.A. (2009), Statistical Research Related to Update of OECD Guideline 305. Wildlife International, Ltd, Easton, MD, USA.
                              
                           
                                 35.
                              
                              
                                 Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                              
                           
                                 36.
                              
                              
                                 Parkerton T., Letinski D., Febbo E., Davi R., Dzambia C., Connelly M., Christensen K. and Peterson D. (2001), A practical testing approach for assessing bioaccumulation potential of poorly water soluble organic chemicals (presentation). in SETAC Europe 12th Annual Meeting: Madrid, Spain.
                              
                           
                                 37.
                              
                              
                                 Fisk A.T., Cymbalisty C.D., Bergman Ã. and Muir D.C.G. (1996), Dietary accumulation of C12- and C16-chlorinated alkanes by juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ. Toxicol. Chem. 15: 1775-1782.
                              
                           
                                 38.
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Fish, dietary bioaccumulation study – Basic protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 39.
                              
                              
                                 Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                              
                           
                                 40.
                              
                              
                                 Bruggeman W.A., Opperhuizen A., Wijbenga A. and Hutzinger O. (1984), Bioaccumulation of super-lipophilic chemicals in fish, Toxicol. Environ. Chem. 7: 173-189.
                              
                           
                                 41.
                              
                              
                                 Muir D.C.G., Marshall W.K. and Webster G.R.B. (1985), Bioconcentration of PCDDs by fish: effects of molecular structure and water chemistry. Chemosphere. 14: 829-833.
                              
                           
                                 42.
                              
                              
                                 Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                              
                           
                                 43.
                              
                              
                                 Nichols J.W., Fitzsimmons P.N. and Whiteman F.W. (2004), A physiologically based toxicokinetic model for dietary uptake of hydrophobic organic compounds by fish: II. Stimulation of chronic exposure scenarios. Toxicol. Sci. 77: 219-229.
                              
                           
                                 44.
                              
                              
                                 Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                              
                           
                                 45.
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M. and van der Linde A. (1995), Size-dependent bioconcentration kinetics of hydrophobic organic chemicals in fish based on diffusive mass transfer and allometric relationships. Environ. Sci. Technol. 29: 2769-2777.
                              
                           
                                 46.
                              
                              
                                 Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                              
                           
                                 47.
                              
                              
                                 Fisk A.T., Norstrom R.J., Cymbalisty C.D. and Muir D.G.G. (1998), Dietary accumulation and depuration of hydrophobic organochlorines: Bioaccumulation parameters and their relationship with the octanol/water partition coefficient. Environ. Toxicol. Chem. 17: 951-961.
                              
                           
                                 48.
                              
                              
                                 McGrath J.A., Parkerton T.F. and Di Toro D.M. (2004), Application of the narcosis target lipid model to algal toxicity and deriving predicted-no-effect concentrations. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2503-2517.
                              
                           
                                 49.
                              
                              
                                 Poppendieck D.G. (2002), Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Desorption Mechanisms from Manufactured Gas Plant Site Samples. Dissertation. Department of Civil, Architectural and Environmental Engineering, University of Texas, Austin, TX, USA.
                              
                           
                                 50.
                              
                              
                                 McCarty L.S. and Mackay D. (1993), Enhancing ecotoxicological modelling and assessment: body residues and modes of toxic action. Environ. Sci. Technol. 27: 1718-1728.
                              
                           
                                 51.
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 175: Part I – Validation Report of a ring test for the OECD TG 305 dietary exposure bioaccumulation fish test. Part II – Additional Report including comparative analysis of trout and carp results ENV/JM/MONO(2012)20. Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), Paris, France.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE A JEDNOTKY
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Asimilačná účinnosť (α) je mierou relatívneho množstva látky absorbovanej z čriev do organizmu (α je bezjednotková veličina, často sa však vyjadruje ako percentuálny podiel, a nie zlomok).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Bioakumulácia sa vo všeobecnosti označuje ako proces, v ktorom koncentrácia látky v organizme dosiahne úroveň, ktorá presahuje úroveň v respiračnom prostredí (napr. voda v prípade rýb alebo vzduch v prípade cicavcov), v strave alebo v kombinácii prostredia a potravy (1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biokoncentrácia je zvýšenie koncentrácie testovanej látky v organizme alebo na ňom (alebo v jeho špecifickom tkanive) vzhľadom na jej koncentráciu v okolitom prostredí.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biokoncentračný faktor (BCF alebo K
                                       B) v ktoromkoľvek čase počas vychytávacej fázy tohto akumulačného testu predstavuje koncentráciu testovanej látky v rybe/na jej povrchu alebo v jej špecifickom tkanive [C
                                       f v mg/kg] vydelenú koncentráciou tejto látky v okolitom prostredí (C
                                       w v mg/l). BCF sa vyjadruje v l·kg– 1. Venujte pozornosť skutočnosti, že sa neprihliada na korekcie vzhľadom na rast ryby a/alebo štandardný obsah lipidov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biomagnifikácia je zvýšenie koncentrácie testovanej látky v organizme alebo na ňom (alebo v jeho špecifickom tkanive) vzhľadom na jej koncentráciu v potrave.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biomagnifikačný faktor (BMF) je koncentrácia látky u predátora vzhľadom na jej koncentráciu v koristi (alebo potrave) predátora v ustálenom stave. V rámci metódy opísanej v tejto testovacej metóde sa dôsledne zabraňuje expozícii prostredníctvom vodnej fázy, a teda hodnotu BMF z tejto testovacej metódy nemožno priamo porovnávať s hodnotou BMF získanou v terénnej štúdii (v ktorej môže byť expozícia prostredníctvom vody a potravy kombinovaná).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Potravinový biomagnifikačný faktor je termín, ktorý v rámci tejto testovacej metódy slúži na opis výsledku testu expozície prostredníctvom potravy, kde sa dôsledne zabraňuje expozícii prostredníctvom vodnej fázy, a teda hodnotu BMF z tejto testovacej metódy nemožno priamo porovnávať s hodnotou BMF získanou v terénnej štúdii (v ktorej môže byť expozícia prostredníctvom vody a potravy kombinovaná).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Depuračná alebo poexpozičná (eliminačná) fáza je čas, ktorý nasleduje po premiestnení testovaných rýb z prostredia obsahujúceho testovanú látku do prostredia, v ktorom táto látka nie je prítomná, a počas ktorého sa skúma depurácia (alebo čistá eliminácia) danej látky z testovaných rýb (alebo z ich špecifických tkanív).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rýchlostná konštanta depurácie (eliminácie) (k
                                       2) je číselná hodnota definujúca rýchlosť znižovania koncentrácie testovanej látky v testovaných rybách (alebo ich špecifických tkanivách) po premiestnení testovaných rýb z prostredia obsahujúceho testovanú látku do prostredia, ktoré túto látku neobsahuje (k
                                       2 sa vyjadruje v jednotkách deň– 1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rozpustený organický uhlík (DOC) je miera koncentrácie uhlíka pochádzajúceho z rozpustených organických zdrojov v testovanom prostredí.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Expozičná alebo vychytávacia fáza je čas, počas ktorého sú ryby vystavené testovanej látke.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Miera požitia potravy (I) je priemerné množstvo potravy, ktoré každý deň skonzumovala každá z rýb, a to vzhľadom na odhadovanú priemernú celkovú telesnú hmotnosť ryby (vyjadrené v g potravy/g ryby/deň).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Kinetický biokoncentračný faktor (BCF
                                          K
                                       ) je pomer rýchlostnej konštanty vychytávania k
                                       1 a rýchlostnej konštanty depurácie k
                                       2 (t. j. k
                                       1/k
                                       2 – pozri zodpovedajúce definície v tomto dodatku). Táto hodnota by v zásade mala byť porovnateľná s hodnotou BCFSS (pozri už uvedenú definíciu), môžu sa však vyskytnúť odchýlky, a to v prípade neistého ustáleného stavu alebo v prípade, že sa na kinetický BCF uplatnili korekcie vzhľadom na rast.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Lipidový normalizovaný kinetický biokoncentračný faktor (BCFKL) sa normalizuje na rybu s 5 % obsahom lipidov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Lipidový normalizovaný kinetický biokoncentračný faktor korigovaný vzhľadom na rast (BCFKgL) sa normalizuje na rybu s 5 % obsahom lipidov a koriguje sa vzhľadom na rast počas obdobia štúdie, ako sa opisuje v dodatku 5.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Lipidový normalizovaný biokoncentračný faktor pri ustálenom stave (BCFSSL) sa normalizuje na rybu s 5 % obsahom lipidov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Na účely nariadenia REACH sa viaczložková látka definuje ako látka, v ktorej sa vyskytuje viac ako jedna hlavná zložka v koncentrácii od 10 % do 80 hm. %.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rozdeľovacia konštanta oktanol-voda (K
                                       OW) je pomer rozpustnosti látky v n-oktanole a vode v ustálenom stave [Metódy A.8 (2), A.24 (3), A.23 (4)]; vyjadruje sa aj ako P
                                       OW. Logaritmus konštanty K
                                       OW sa používa na vyjadrenie potenciálu látky biokoncentrovať sa vo vodných živočíchoch.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Časticový organický uhlík (POC) je miera koncentrácie uhlíka pochádzajúceho zo organických zdrojov vo forme suspenzie v testovanom prostredí.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Mikroextrakcia na tuhej fáze (SPME) je technika analýzy bez prítomnosti rozpúšťadla vyvinutá pre kvapalné systémy. V tejto metóde je vlákno potiahnuté polymérom vystavené plynnej alebo kvapalnej fáze, ktorá obsahuje predmetný analyt. Vo všeobecnosti je nutné prihliadať na (stanovený) minimálny čas analýzy s cieľom zaistiť rovnovážne podmienky medzi tuhou a kvapalnou fázou vzhľadom na druhy, ktoré sú predmetom testovania. Následne možno stanoviť koncentráciu predmetného analytu buď priamo z vlákna alebo po jeho extrakcii z vlákna do rozpúšťadla v závislosti od konkrétnej techniky stanovovania koncentrácie.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    K dosiahnutiu ustáleného stavu dochádza, keď sa priebeh krivky v grafickom zobrazení závislosti obsahu testovanej látky v rybe (C
                                       f) od času stáva paralelným s časovou osou a tri po sebe idúce analýzy C
                                       f uskutočnené na vzorkách odobratých v minimálne dvojdňových intervaloch sa od seba neodlišujú o viac ako ± 20 % a ak v období medzi prvou a poslednou po sebe nasledujúcou analýzou nedošlo k žiadnemu významnému zvýšeniu C
                                       f. Pri analyzovaní spájaných vzoriek je potrebné vykonať najmenej štyri po sebe idúce analýzy. Pri testovaných látkach s pomalým vychytávaním je primeranejšie uplatňovať sedemdňový interval.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biokoncentračný faktor týkajúci sa ustáleného stavu (BCFSS) sa počas predĺženého obdobia významne nemení, koncentrácia testovanej látky v okolitom prostredí je počas tohto obdobia konštantná (pozri definíciu ustáleného stavu).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Celkový organický uhlík (TOC) je miera koncentrácie uhlíka pochádzajúceho zo všetkých organických zdrojov v testovanom prostredí vrátane častíc a rozpustených zdrojov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rýchlostná konštanta vychytávania (k
                                       1) je číselná hodnota, ktorou sa vymedzuje rýchlosť zvyšovania koncentrácie testovanej látky v/na testovaných rybách (alebo v ich špecifických tkanivách) pri ich expozícii danej látke (k
                                       1 sa vyjadruje v l kg– 1 za deň– 1).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály sú známe ako UVCB.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Chemikália je látka alebo zmes.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                                 
                              LITERATÚRA
                        
                                    1.
                                 
                                 
                                    Gobas F.A.P.C., de Wolf W., Burkhard L.P., Verbruggen E. and Plotzke K. (2009), Revisiting bioaccumulation criteria for POPs and PBT assessments. Integr. Environ. Assess. Manag. 5: 624-637.
                                 
                              
                                    2.
                                 
                                 
                                    Kapitola A.8 tejto prílohy, Rozdeľovacia konštanta (n-oktanol-voda): Metóda trepačkovej banky
                                    
                                 
                              
                                    3.
                                 
                                 
                                    Kapitola A. 24 tejto prílohy, Rozdeľovacia konštanta (n-oktanol-voda), metóda HPLC.
                                 
                              
                                    4.
                                 
                                 
                                    Kapitola A.23 tejto prílohy, Rozdeľovacia konštanta (1-oktanol-voda): Metóda pomalého miešania.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 2
                        
                           NIEKTORÉ CHEMICKÉ CHARAKTERISTIKY VODY NA RIEDENIE
                        
                        
                                    Zložka
                                 
                                 
                                    Koncentračný limit
                                 
                              
                                    tuhé častice
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    celkový organický uhlík
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    neionizovaný amoniak
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    zostatkový chlór
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    celkové organofosfátové pesticídy
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    celkové organochlórované pesticídy a polychlórované bifenyly
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    celkový organický chlór
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    hliník
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    arzén
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    chróm
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    kobalt
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    meď
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    železo
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    olovo
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    nikel
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    zinok
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    kadmium
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    ortuť
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    striebro
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           DRUHY RÝB ODPORÚČANÉ NA TESTOVANIE
                        
                        
                                    Odporúčaný druh
                                 
                                 
                                    Odporúčaný rozsah testovacej teploty (°C)
                                 
                                 
                                    Odporúčaná celková dĺžka testovaného zvieraťa (cm) (74)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Danio rerio
                                        (73)
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Hamilton-Buchanan) danio pruhované
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 0,5
                                 
                              
                                    
                                       Pimephales promelas
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Rafinesque) čerebľa potočná
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Cyprinus carpio
                                    
                                    (Teleostei, Cyprinidae)
                                    (Linnaeus) kapor rybničný
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0 (75)
                                    
                                 
                              
                                    
                                       Oryzias latipes
                                    
                                    (Teleostei, Poecilliidae)
                                    (Temminck and Schlegel) ryžovníčka japonská
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    4,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Poecilia reticulata
                                    
                                    (Teleostei, Poeciliidae)
                                    (Peters) živorodka dúhová
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                                    
                                       Lepomis macrochirus
                                    
                                    (Teleostei Centrarchidae)
                                    (Rafinesque) slnečnica sivomodrá
                                 
                                 
                                    20 – 25
                                 
                                 
                                    5,0 ± 2,0
                                 
                              
                                    
                                       Oncorhynchus mykiss
                                    
                                    (Teleostei Salmonidae)
                                    (Walbaum) pstruh dúhový
                                 
                                 
                                    13 – 17
                                 
                                 
                                    8,0 ± 4,0
                                 
                              
                                    
                                       Gasterosteus aculeatus
                                    
                                    (Teleostei, (Gasterosteidae)
                                    (Linnaeus) pichľavka siná
                                 
                                 
                                    18 – 20
                                 
                                 
                                    3,0 ± 1,0
                                 
                              
                           Menej sa používajú rôzne brakické a morské druhy, napríklad:
                        
                        
                                    sciéna
                                 
                                 
                                    (Leiostomus xanthurus)
                                 
                              
                                    kaprozúbka diamantová
                                 
                                 
                                    (Cyprinodon variegatus)
                                 
                              
                                    menídia pobrežná
                                 
                                 
                                    (Menidia beryllina)
                                 
                              
                                    príbojovka húfna
                                 
                                 
                                    (Cymatogaster aggregata)
                                 
                              
                                    platesa Parophrys vetulus
                                    
                                 
                                 
                                    (Parophrys vetulus)
                                 
                              
                                    hlaváč Leptocottus armatus
                                    
                                 
                                 
                                    (Leptocottus armatus)
                                 
                              
                                    pichľavka siná
                                 
                                 
                                    (Gasterosteus aculeatus)
                                 
                              
                                    morona striebristá
                                 
                                 
                                    (Dicentracus labrax)
                                 
                              
                                    belička európska
                                 
                                 
                                    (Alburnus alburnus)
                                 
                              Sladkovodné ryby uvedené v tabuľke sa ľahko chovajú a/alebo sú široko dostupné počas celého roka, zatiaľ čo dostupnosť morských a brakických druhov je čiastočne obmedzená na príslušné krajiny. V podmienkach so zabezpečením kontroly nad výskytom ochorení a parazitov sa môžu rozmnožovať a chovať buď vo farmových chovoch alebo v laboratóriách, čím sa zabezpečí dobrý zdravotný stav a známy pôvod testovaných zvierat. Tieto ryby sú dostupné v mnohých častiach sveta.
                        LITERATÚRA
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Meyer A., Biermann C.H. and Orti G. (1993), The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: An invitation to the comparative method Proc. R. Soc. Lond. B. 252: 231-236.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 4
                        
                           HARMONOGRAMY ODBEROV VZORIEK PRE TESTY EXPOZÍCIE PROSTREDNÍCTVOM VODNEJ FÁZY A TESTY EXPOZÍCIE PROSTREDNÍCTVOM POTRAVY
                        
                        1.   Teoretický príklad harmonogramu odberov v prípade testu biokoncentrácie látky s log KOW = 4 pri úplnej expozícii prostredníctvom vodnej fázy
                        
                        
                                    Odbery rýb
                                 
                                 
                                    Harmonogram odberov
                                 
                                 
                                    Počet vzoriek vody (76)
                                    
                                 
                                 
                                    Počet rýb na vzorku (76)
                                    
                                 
                              
                                    Minimálna požadovaná frekvencia odberov (dni) (77)
                                    
                                 
                                 
                                    Dodatočné odbery (dni) (77)
                                    
                                 
                              
                                    vychytávacia fáza
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    -1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2 (78)
                                    
                                 
                                 
                                    4 (79)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    0,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,4
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    0,6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    0,9
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    1,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1,7
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    2,4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    3,3
                                 
                                 
                                    (2)
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    4,7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (3 (81))
                                 
                              
                                    depuračná fáza
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Premiestniť ryby do vody bez testovanej látky
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    5,9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    7,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    9,3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    11,2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4)
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                    14,0
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    4 – 8 (80)
                                    
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    17,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (4 + 3 (81))
                                 
                              
                                    SPOLU
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    40 – 72
                                    (48 – 80) (80)
                                    
                                 
                              2.   Teoretický príklad harmonogramu odberov vzoriek v prípade testu bioakumulácie látky prostredníctvom potravy po 10-dňovej vychytávacej fáze 42-dňovej depuračnej fáze.
                        
                        
                                    Odber vzorky
                                 
                                 
                                    Harmonogram odberov
                                 
                                 
                                    Počet vzoriek potravy
                                 
                                 
                                    Počet rýb na vzorku
                                 
                              
                                    Deň v rámci fázy
                                 
                                 
                                    Dodatočné vzorky rýb?
                                 
                                 
                                    Testovaná skupina
                                 
                                 
                                    Kontrolná skupina
                                 
                              
                                    vychytávacia faza
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    možné (82)
                                        (83)
                                    
                                 
                                 
                                    3 – testovaná skupina
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 – kontrolná skupina (82)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (83)
                                    
                                 
                              
                                    1A (84)
                                    
                                 
                                 
                                    1 – 3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    áno (85)
                                    
                                 
                                 
                                    3 – testovaná skupina
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    3 – kontrolná skupina (82)
                                    
                                 
                                 
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    depuračná fáza
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    áno (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    áno (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                    28
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                    42
                                 
                                 
                                    áno (85)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 – 15 (85)
                                    
                                    (13 – 18) (86)
                                    
                                 
                                 
                                    5 – 10
                                    (8 – 13) (86)
                                    
                                 
                              
                                    SPOLU
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    59 – 120
                                    (63 – 126) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                                 
                                    50 – 110
                                    (56 – 116) (85)
                                        (86)
                                    
                                 
                              
                           Poznámka k načasovaniu fáz a odberov vzoriek: Vychytávacia fáza sa začína prvým podaním krmiva s pridanou testovanou látkou. Pokusný deň trvá od jedného kŕmenia až takmer do druhého kŕmenia o 24 hodín neskôr. Prvý odber vzoriek (1 v tabuľke) by sa mal uskutočniť krátko (napríklad jednu hodinu) pred prvým kŕmením. Odber vzoriek v rámci štúdie by sa mal v ideálnom prípade vykonať krátko pred kŕmením uskutočneným v nasledujúci deň (t. j. približne 23 hodín po kŕmení v deň odberu vzoriek). Vychytávacia fáza sa skončí krátko pred prvým podaním krmiva bez pridanej testovanej látky, keď sa začína depuračná fáza (je pravdepodobné, že ryby z testovanej skupiny budú ešte tráviť krmivo s pridanou testovanou látkou v priebehu 24 hodín po poslednom podaní takejto stravy). To znamená, že krátko pred prvým podaním potravy bez pridanej testovanej látky by sa mala odobrať finálna vzorka z vychytávacej fázy a prvá vzorka z depuračnej fázy by sa mala odobrať približne 23 hodín po prvom podaní krmiva pridanej testovanej látky.
                     
                     
                        Dodatok 5
                        
                           VŠEOBECNÉ VÝPOČTY
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Úvod
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Predpoveď trvania vychytávacej fázy
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Predpoveď trvania depuračnej fázy
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Metóda postupného testovania: stanovenie rýchlostnej konštanty depurácie (eliminácie) k
                                       2
                                    
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Metóda postupného testovania: stanovenie rýchlostnej konštanty vychytávania k
                                       1 (výlučne metóda s expozíciou prostredníctvom vody)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Simultánna metóda výpočtu rýchlostnej konštanty vychytávania a rýchlostnej konštanty depurácie (eliminácie) (výlučne metóda s expozíciou prostredníctvom vody)
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Korekcia kinetického BCF a BMF vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu ryby
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Normalizácia lipidov na 5 % obsah lipidov (výlučne metóda expozície prostredníctvom vody)
                                 
                              1.   ÚVOD
                        Model všeobecnej bioakumulácie vo vodnom prostredí v prípade rýb možno charakterizovať na základe procesov vychytávania a eliminácie, pričom sa neberie do úvahy vychytávanie z potravy. Diferenciálna rovnica (dC
                           f/dt) opisujúca mieru zmeny koncentrácie látky v rybe (mg · kg– 1 · deň– 1) je daná týmto vzťahom (1):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.1]
                                 
                              kde:
                        
                                    
                                       k
                                       1
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    rýchlostná konštanta prvého rádu týkajúca sa vychytávania látky rybou (l · kg– 1 · deň– 1).
                                 
                              
                                    
                                       k
                                       2
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    rýchlostná konštanta prvého rádu týkajúca sa depurácie látky z ryby (deň– 1).
                                 
                              
                                    
                                       kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    rýchlostná konštanta prvého rádu týkajúca sa rastu ryby („riedenie vplyvom rastu“) (deň– 1).
                                 
                              
                                    
                                       km
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    rýchlostná konštanta prvého rádu týkajúca sa metabolickej transformácie (deň– 1).
                                 
                              
                                    
                                       ke
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    rýchlostná konštanta prvého rádu týkajúca sa vylúčenia vo forme fekálií (deň– 1).
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    koncentrácia vo vode (mg · l– 1).
                                 
                              
                                    
                                       Cf
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    koncentrácia v rybe (mg · kg– 1 vlhkej hmotnosti).
                                 
                              V prípade bioakumulatívnych látok možno očakávať, že časovo vážený priemer koncentrácií (TWA) je najvýznamnejšou expozičnou koncentráciou vo vode (Cw
                           ) v rámci prípustného rozsahu fluktuácie (pozri bod 24). Odporúča sa vypočítať koncentráciu TWA vo vode podľa postupu uvedeného v dodatku 6 testovacej metódy C.20 (2). Treba poznamenať, že logarimtická (ln) transformácia koncentrácie látky vo vode je vhodná vtedy, keď sa medzi obdobiami obnovy očakáva exponenciálny rozkladný proces, napr. pri polostatickom pláne testu. V prietokovom systéme možno nebude potrebná logaritmická (ln) transformácia expozičných koncentrácií. V prípade odvodených koncentrácií TWA vo vode by sa tieto koncentrácie mali zaznamenať a použiť v ďalších výpočtoch.
                        Pri štandardnom teste BCF na rybách možno vychytávanie a depuráciu charakterizovať na základe dvoch kinetických procesov prvého rádu.
                        
                                    
                                       rýchlosť vychytávania = k
                                       1 × C
                                       w
                                    
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.2]
                                 
                              
                                    
                                       celková rýchlosť eliminácie = (k
                                       2 + k
                                       g + k
                                       m + k
                                       e) × C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.3]
                                 
                              V ustálenom stave za predpokladu zanedbateľného rastu a metabolizmu (t. j. hodnoty k
                           g a k
                           m nemožno odlíšiť od nuly) sa miera vychytávania rovná miere depurácie, a tak z kombinácie rovnice A5.2 a rovnice A5.3 vyplýva takýto vzťah:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.4]
                                 
                              kde:
                        
                                    
                                       C
                                       f-SS
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    koncentrácia v rybe v ustálenom stave (mg · kg– 1 vlhkej hmotnosti).
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       w-SS
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    koncentrácia vo vode v ustálenom stave (mg l– 1).
                                 
                              Pomer k
                           1/k
                           2, známy ako kinetický BCF (BCFK), by sa mal rovnať BCF v ustálenom stave (BCFSS) získanému z pomeru koncentrácie v rybách a koncentrácie vo vode v ustálenom stave. Ak bol však ustálený stav neistý alebo sa na kinetický BCF uplatnili korekcie vzhľadom na rast, môžu sa vyskytnúť odchýlky. No keďže k
                           1 a k
                           2 sú konštanty, na odvodenie BCFK nie je potrebné dosiahnuť ustálený stav.
                        Na základe týchto rovníc prvého rádu obsahuje tento dodatok 5 všeobecné výpočty nevyhnutné pre metódu bioakumulácie na základe expozície prostredníctvom vody, ako aj metódu bioakumulácie na základe expozície prostredníctvom potravy. Oddiely 5, 6 a 8 však majú význam len z hľadiska metódy týkajúcej sa expozície prostredníctvom vody, no uvádzame ich tiež, keďže ide o „všeobecné“ techniky. Vďaka metóde postupného testovania (oddiely 4 a 5) a simultánnej metóde (oddiel 6) možno vypočítať konštanty vychytávania a depurácie, ktoré sa použijú na odvodenie kinetických BCF. Metóda postupného testovania na účely stanovenia hodnoty k
                           2 (oddiel 4) má význam z hľadiska metódy týkajúcej sa expozície prostredníctvom potravy, keďže uvedená hodnota je potrebná na výpočet účinnosti asimilácie, ako aj BMF. V dodatku 7 sa podrobne uvádzajú výpočty, ktoré sú špecifické pre metódu týkajúcu sa expozície prostredníctvom potravy.
                        2.   PREDPOVEĎ TRVANIA VYCHYTÁVACEJ FÁZY
                        Pred vykonaním testu možno na základe empirických vzťahov medzi k
                           2 a rozdeľovacou konštantou n-oktanol-voda (K
                           OW) alebo medzi k
                           1 a BCF odhadnúť hodnotu konštanty k
                           2, a tým aj istú percentuálnu hodnotu času potrebného na dosiahnutie ustáleného stavu. Treba si však uvedomiť, že rovnice uvedené v tomto oddiele platia iba vtedy, keď sa vychytávanie a depurácia riadia kinetikou prvého rádu. Ak zjavne nejde o tento prípad, v prípade, že sú prognózy týkajúce sa vychytávacej fázy žiaduce, odporúčame požiadať o konzultácie odborníkov v oblasti biostatiky a/alebo farmakokinetiky.
                        Odhad hodnoty k
                           2 (deň– 1) možno získať viacerými metódami. V prvom rade možno použiť napríklad tieto empirické vzťahy (87):
                        
                                    log k
                                       2 = 1,47 – 0,414logK
                                       OW
                                    
                                 
                                 
                                    (r2 = 0,95) [(3); [rovnica A5.5]
                                 
                              alebo
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.6]
                                 
                              
                                    kde k
                                       1 = 520 × W
                                       – 0,32 (v prípade látok s log K
                                       OW > 3)
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,85)[(4); [rovnica A5.7]
                                 
                              a
                                       
                                 
                                 
                                    (r
                                       2 = 0,90)[(5); [rovnica A5.8]
                                 
                              
                           W = priemerná hmotnosť ryby ovplyvnenej chemikáliou (v gramoch vlhkej hmotnosti) na konci vychytávacej fázy/začiatku depuračnej fázy (88)
                        
                        Pre ďalšie súvisiace vzťahy pozri (6). Pri odhade k
                           2 môže byť výhodné uplatniť komplikovanejšie modely, ak napríklad existuje pravdepodobnosť, že dôjde k významnému metabolizmu (7) (8). Pri náročnejších modeloch však treba pri interpretácii prognóz postupovať opatrnejšie. Napríklad prítomnosť nitroskupín môže poukazovať na rýchly metabolizmus, no vždy to tak nie je. Používateľ by preto mal pri časovom plánovaní štúdie zvážiť výsledky prognostických metód vzhľadom na chemickú štruktúru a všetky ďalšie relevantné informácie (napríklad predbežné štúdie).
                        Na základe odhadu k
                           2– a za predpokladu, že rast a metabolizmus sú zanedbateľné, možno zo všeobecnej kinetickej rovnice udávajúcej vychytávanie a depuráciu (kinetika prvého rádu) zistiť čas potrebný na dosiahnutie istého percentuálneho podielu ustáleného stavu. Ak počas štúdie dôjde k výraznému rastu, ďalej opísané odhady nebudú spoľahlivé. V takýchto prípadoch je vhodnejšie použiť konštantu k
                           2g korigovanú vzhľadom na rast, ako sa opisuje ďalej v texte (pozri oddiel 7 tohto dodatku):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.9]
                                 
                              alebo v prípade, že koncentrácia C
                           w je konštantná:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.10]
                                 
                              V blízkosti ustáleného stavu (t → ∞) možno rovnicu A5.10 zjednodušiť na vzťah [pozri (9) (10)]:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.11]
                                 
                              alebo
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.12]
                                 
                              Hodnota súčinu BCF × C
                           w sa približuje koncentrácii v rybách pri ustálenom stave (C
                           f-SS). [Poznámka: rovnaký prístup možno uplatniť pri odhade BMF pri ustálenom stave v prípade testu expozície prostredníctvom potravy. V tomto prípade sa vo vyššie uvedených rovniciach nahrádza faktor BCF faktorom BMF a koncentrácia C
                           w sa nahrádza koncentráciou v potrave C
                           food.]
                        Rovnica A5.10 sa dá prepísať ako:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.13]
                                 
                              alebo
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.14]
                                 
                              Z rovnice A5.14 možno predpovedať čas na dosiahnutie určitého percentuálneho podielu ustáleného stavu, keď sa predbežný odhad hodnoty k
                           2 uskutoční na základe rovnice A5.5 alebo rovnice A5.6.
                        Na orientáciu uveďme, že štatisticky optimálna dĺžka trvania vychytávacej fázy na získanie štatisticky prijateľných údajov (BCFK) je čas, za ktorý dosiahne krivka závislosti logaritmu koncentrácie testovanej látky v rybách od lineárneho času aspoň 50 % ustáleného stavu (t. j. 0,69/k
                           2), nie však viac 95 % ustáleného stavu (t. j. 3,0/k
                           2) (11). Výpočet BCFSS možno zrealizovať vtedy, ak akumulácia presahuje 95 % ustáleného stavu.
                        Čas na dosiahnutie 80 % ustáleného stavu je (s využitím rovnice A5.14):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.15]
                                 
                              alebo
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.16]
                                 
                              Obdobne čas na dosiahnutie 95 % ustáleného stavu je:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.17]
                                 
                              Napríklad trvanie vychytávacej fázy (t. j času na dosiahnutie istého percentuálneho podielu ustáleného stavu, napr. t
                           80 alebo t
                           95) v prípade testovanej látky s log K
                           OW = 4 by predstavovalo (s použitím rovnice A5.5, rovnice A5.16 a rovnice A5.17):
                        
                           logk
                           2=1,47 – 0,414 · 4
                        
                           k
                           2 = 0,652 deň– 1
                        
                        
                           
                        alebo 
                        alternatívne, výraz:
                        
                                    
                                       teSS
                                        = 6,54 · 10 – 3 · K
                                       OW + 55,31 (hodín)
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.18]
                                 
                              možno použiť na vypočítanie času potrebného na dosiahnutie efektívneho ustáleného stavu (t
                           eSS) (12). V prípade látky s log K
                           OW = 4 sa dospeje k tomuto výsledku:
                        
                           teSS
                            = 6,54 · 10 – 3 · 104 + 55,31 = 121 hodín
                        
                        3.   PREDPOVEĎ TRVANIA DEPURAČNEJ FÁZY
                        Predpoveď času potrebného na zníženie záťaže organizmu na určitý percentuálny podiel počiatočnej koncentrácie možno získať aj zo všeobecnej rovnice udávajúcej vychytávanie a depuráciu [za predpokladu kinetiky prvého rádu, pozri rovnicu A5.9 (1) (13)].
                        Pokiaľ ide o depuračnú fázu, predpokladá sa, že koncentrácia C
                           w (alebo koncentrácia C
                           food v prípade testu expozície prostredníctvom potravy) sa rovná nule. Rovnicu možno preto zjednodušiť na vzťah:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.19]
                                 
                              alebo
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.20],
                                 
                              kde C
                           f,0 je koncentrácia na začiatku depuračnej fázy.
                        50 % depurácia sa potom dosiahne za čas (t
                           50):
                        
                           
                        alebo
                        
                           
                        Obdobne možno vypočítať, že 95 % depurácia sa dosiahne za:
                        
                           
                        Ak sa v prvom období dosiahne 80 % vychytávanie (1,6/k
                           2) a eliminácia počas depuračnej fázy predstavuje 95 % (3,0/k
                           2), potom depuračná fáza trvá približne dvakrát tak dlho ako vychytávacia fáza.
                        Upozorňujeme, že tieto odhady vychádzajú z predpokladu, že procesy vychytávania a depurácie sa riadia kinetikou prvého rádu. Ak je zrejmé, že nejde o kinetiku prvého rádu, tieto odhady nie sú validné.
                        4.   METÓDA POSTUPNÉHO TESTOVANIA: STANOVENIE RÝCHLOSTNEJ KONŠTANTY DEPURÁCIE (ELIMINÁCIE) K
                           2
                        
                        Pri väčšine údajov týkajúcich sa biokoncentrácie sa predpokladá, že sú „dostatočne uspokojivo“ opísané pomocou modelu pozostávajúceho z dvoch kompartmentov/dvoch parametrov, ako to vyplýva z priamky, ktorá je aproximáciou bodov koncentrácií testovanej látky v rybách [na prirodzenej logaritmickej (ln) stupnici] počas depuračnej fázy.
                        
                           
                        Text obrazu
                        
                           In(concentration)
                           Cf2
                           Cf1
                           t2
                           t1
                           time
                        
                        Treba si uvedomiť, že odchýlky od lineárneho priebehu môžu poukazovať na komplikovanejší priebeh depurácie ako ten, ktorý podlieha kinetike prvého rádu. Pri riešení druhov depurácie, ktoré nepodliehajú kinetike prvého rádu, možno uplatniť grafickú metódu.
                        Na výpočet k
                           2 pri niekoľkých časových bodoch (bodoch odberu vzoriek) uskutočnite lineárnu regresiu prirodzeného logaritmu (koncentrácie) v závislosti od času. Smernica regresnej priamky je odhadom rýchlostnej konštanty depurácie k
                           2
                            (89). Z daného úseku možno jednoducho vypočítať priemernú koncentráciu látky v rybách na začiatku depuračnej fázy (C
                           0,d, čo sa rovná priemernej koncentrácii v rybách na konci vychytávacej fázy) (vrátane tolerancií chyby) (89):
                        
                                    
                                       C
                                       0,d = e
                                       intercept
                                    
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.21]
                                 
                              Keď sú na výpočet k
                           2 k dispozícii len dva časové (odberové) body (ako v minimalizovanom pláne), do uvedenej rovnice dosaďte dané dve priemerné koncentrácie,
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.22],
                                 
                              kde ln(C
                           f1) je prirodzený logaritmus koncentrácie v čase t
                           1 a ln(C
                           f2) je prirodzený logaritmus koncentrácie v čase t
                           2, pričom t
                           2 a t
                           1 sú časy, kedy došlo k odberu predmetných dvoch vzoriek vzhľadom na začiatok depurácie (90).
                        5.   METÓDA POSTUPNÉHO TESTOVANIA: STANOVENIE RÝCHLOSTNEJ KONŠTANTY VYCHYTÁVANIA K
                           1 (VÝLUČNE METÓDA S EXPOZÍCIOU PROSTREDNÍCTVOM VODY)
                        Na zistenie hodnoty k
                           1 na základe súboru postupných časových údajov týkajúcich sa koncentrácie vo vychytávacej fáze použite počítačový program zodpovedajúci tomuto modelu:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.23],
                                 
                              kde k
                           2 vyplýva z predchádzajúceho výpočtu, C
                           f(t) je koncentrácia látky v rybách a C
                           w(t) je koncentrácia látky vo vode v čase t.
                        Keď sú na výpočet k
                           1 k dispozícii len dva časové (odberové) body (ako v minimalizovanom pláne), použite túto rovnicu:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.24],
                                 
                              kde k
                           2 vyplýva z predchádzajúceho výpočtu, C
                           f je koncentrácia látky v rybách na začiatku depuračnej fázy a C
                           w je priemerná koncentrácia látky vo vode počas vychytávacej fázy (91).
                        Na posúdenie správnosti výsledku fitovania možno použiť vizuálnu kontrolu smerníc priamok k
                           1 a k
                           2 vynesených v závislosti od nameraných údajov týkajúcich sa bodov odberu. Ak sa ukáže, že metóda postupného testovania priniesla nedostatočný odhad k
                           1, potom by sa mal uplatniť simultánny prístup k výpočtu konštánt k
                           1 a k
                           2 (pozri oddiel 6 ďalej). Na účely vizuálnej kontroly správnosti výsledku fitovania by sa mali výsledné smernice opäť porovnať so znázornenými nameranými údajmi. Ak je správnosť výsledku fitovania naďalej nedostatočná, môže z toho vyplývať, že nejde o kinetiku prvého rádu, a preto by sa mali využiť iné, zložitejšie modely.
                        6.   SIMULTÁNNA METÓDA VÝPOČTU RÝCHLOSTNEJ KONŠTANTY VYCHYTÁVANIA A RÝCHLOSTNEJ KONŠTANTY DEPURÁCIE (ELIMINÁCIE) (VÝLUČNE METÓDA S EXPOZÍCIOU PROSTREDNÍCTVOM VODY)
                        Na zistenie hodnôt k
                           1 a k
                           2 možno použiť počítačové programy, a to na základe súboru postupných časových údajov týkajúcich sa koncentrácie a s využitím tohto modelu:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    0 < t < t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.25]
                                 
                              
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    
                                       t > t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.26],
                                 
                              kde
                        
                                    
                                       t
                                       c
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    čas na konci vychytávacej fázy.
                                 
                              Tento prístup priamo poskytuje štandardné chyby odhadov konštánt k
                           1 a k
                           2. Ak sa v rovniciach A5.25 a A5.26 k
                           1/k
                           2 nahradí faktorom BCF (pozri rovnicu A5.4), možno odhadnúť aj štandardnú chybu a 95 % interval spoľahlivosti faktoru BCF. Toto je obzvlášť praktické pri porovnávaní rôznych odhadov v dôsledku transformácie údajov. Závislú premennú (koncentráciu látky v rybách) možno fitovať s logaritmickou transformáciou alebo bez nej, pričom možno vyhodnotiť výslednú neistotu BCF.
                        Keďže medzi uvedenými dvoma parametrami k
                           1 a k
                           2 existuje silná korelácia (ak sa odhadujú simultánne), možno by bolo vhodnejšie najprv vypočítať hodnotu k
                           2 výlučne z údajov o depurácii (pozri vyššie);z depuračnej krivky možno vo väčšine prípadov s pomerne vysokou presnosťou odhadnúť konštantu k
                           2. Následne možno z údajov týkajúcich sa vychytávania s použitím nelineárnej regresie vypočítať hodnotu k
                           1
                            (92). Odporúča sa použiť rovnaký postup transformácie údajov ako pri postupnom fitovaní.
                        Na posúdenie správnosti výsledku fitovania možno použiť vizuálnu kontrolu výsledných smerníc znázornených priamok vynesených v závislosti od nameraných údajov týkajúcich sa bodov odberu. Ak sa ukáže, že z tejto metódy vyplynul nedostatočný odhad k
                           1, potom možno uplatniť simultánny prístup k výpočtu konštánt k
                           1 a k
                           2. Na účely vizuálnej kontroly správnosti výsledku fitovania by sa mal fitovaný model opäť porovnať s nameranými údajmi vynesenými do grafu. Potom by sa mali výsledné parametrové odhady konštánt k
                           1, a k
                           2 a výsledný faktor BCF, ako aj s nimi súvisiace štandardné chyby a/alebo intervaly spoľahlivosti porovnať vzhľadom na jednotlivé druhy fitovania.
                        Ak je správnosť výsledku fitovania nedostatočná, môže z toho vyplývať, že nejde o kinetiku prvého rádu, a preto by sa mali využiť iné, zložitejšie modely. Jednou z najčastejších komplikácií je rast rýb počas testu.
                        7.   KOREKCIA KINETICKÉHO BCF A BMF VZHĽADOM NA RIEDENIE LÁTKY VPLYVOM RASTU RYBY
                        V tomto oddiele sa opisuje štandardná metóda korekcie vzhľadom na rast rýb počas testu (tzv. „riedenie látky vplyvom rastu ryby“), ktorá je validná len pri uplatnení kinetiky prvého rádu. V prípade náznakov neuplatňovania kinetiky prvého rádu vám odporúčame, aby ste v záujme riadnej korekcie vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu ryby požiadali o konzultácie odborníka v oblasti biostatiky, prípadne uplatnili hmotnostný prístup opísaný ďalej.
                        Tejto metóde, ktorá je zameraná na korekciu faktorov vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu ryby, chýba v niektorých prípadoch istá presnosť, respektíve niekedy nefunguje (napríklad v prípade látok s veľmi pomalou depuráciou, ktoré sa testujú na rýchlorastúcich rybách, môže byť konštanta k
                           2g, teda odvodená rýchlostná konštanta depurácie korigovaná vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu ryby, veľmi malá, a teda chyba v dvoch rýchlostných konštantách, ktoré sa použili na jej odvodenie, nadobudla kritický charakter, pričom v niektorých prípadoch môžu byť odhady konštanty k
                           g väčšie ako k
                           2). V takýchto prípadoch možno uplatniť alternatívny prístup (t. j. hmotnostný prístup), ktorý funguje aj v prípade, že nejde o kinetiku prvého rádu, vďaka čomu netreba vykonať korekciu. Tento prístup sa uvádza na konci tohto oddielu.
                        
                           Metóda odpočítania rýchlostnej konštanty rastu na účely korekcie vzhľadom na rast
                        
                        Na účely štandardnej metódy sú všetky individuálne údaje týkajúce sa hmotnosti a dĺžky prevedené na prirodzené logaritmy, pričom sú logaritmické údaje, t. j. ln(hmotnosť) alebo ln(1/hmotnosť) znázornené v závislosti od času (deň), a to osobitne v prípade ovplyvňovaných a kontrolných skupín. Rovnaký postup sa uplatňuje v prípade údajov z vychytávacej a depuračnej fázy, ku ktorým sa pristupuje oddelene. Všeobecne platí, že v súvislosti s korekciou vzhľadom na riedenie vplyvom rastu ryby je na odvodenie rýchlostnej konštanty rastu (k
                           g) vhodnejšie použiť hmotnostné údaje z celej štúdie, no zo štatisticky významných rozdielov medzi rýchlostnými konštantami rastu odvodenými pre vychytávaciu a depuračnú fázu môže vyplývať, že by sa mala použiť rýchlostná konštanta depuračnej fázy. Celkové rýchlosti rastu získané zo štúdií vo vodnom prostredí, ktoré sa týkajú testovaných a kontrolných skupín, možno použiť na kontrolu rôznych účinkov v súvislosti s ovplyvňovaním danou chemikáliou.
                        Štandardnými štatistickými postupmi sa vypočíta korelácia lineárnej regresie (lineárna korelácia najmenších štvorcov) pre logaritmus ln(hmotnosť ryby) v závislosti od času (v dňoch) [ako aj pre ln(1/hmotnosť v závislosti od času (v dňoch)] pre každú skupinu (testované a kontrolné skupiny, individuálne údaje, nie denné priemerné hodnoty), a to pre celú štúdiu, pre vychytávaciu fázu a depuračnú fázu. Na účely vyhodnotenia štatistickej významnosti (p = 0,05) rozdielu medzi smernicami (rýchlostné konštanty rastu) sa používa vypočítaný rozptyl smerníc priamok, a to s použitím Studentovho t-testu (alebo analýzy ANOVA v prípade testovania viacerých koncentrácií). Na účely korekcie vzhľadom na rast sa vo všeobecnosti uprednostňujú údaje o hmotnosti. Obdobne sa pristupuje aj k údajom o dĺžke. Môžu sa použiť na porovnanie kontrolných a testovaných skupín v súvislosti s účinkami testovania. Ak neexistuje žiadny štatisticky významný rozdiel v analýze údajov o hmotnosti, údaje z testu a kontroly možno zlúčiť. Okrem toho možno vypočítať celkovú rýchlostnú konštantu rastu ryby za celú štúdiu (k
                           g) ako celkovú smernicu lineárnej korelácie. Ak sa zistia štatisticky významné rozdiely, rýchlostné konštanty rastu sa vykazujú osobitne za každú skupinu rýb a/alebo fázu štúdie. Rýchlostné konštanty každej ovplyvnenej skupiny by sa potom mali použiť na účely korekcie riedenia látky vplyvom rastu rýb v danej skupine. Ak sa zaznamenali štatistické rozdiely medzi rýchlostnými konštantami vychytávacej a depuračnej fázy, mala by sa použiť odvodená rýchlostná konštanta depuračnej fázy.
                        Vypočítanú rýchlostnú konštantu rastu (k
                           g vyjadrenú v dňoch– 1) možno odpočítať od celkovej rýchlostnej konštanty depurácie (k
                           2), na základe čoho sa získa rýchlostná konštanta depurácie k
                           2g.
                        
                                    
                                       k
                                       2
                                       
                                          g
                                        = k
                                       2 – kg
                                       
                                    
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.27]
                                 
                              Rýchlostná konštanta vychytávania sa vydelí rýchlostnou konštantou depurácie korigovanou vzhľadom na rast, na základe čoho sa získa kinetický BCF korigovaný vzhľadom na rast, ktorý sa označuje ako BCFKg (alebo BMFKg).
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.28],
                                 
                              V rovnici A7.5 sa na výpočet BMFKg korigovaného vzhľadom na rast používa rýchlostná konštanta rastu odvodená na účely štúdie s podávaním potravy (pozri dodatok 7).
                        
                           Hmotnostná metóda na účely korekcie vzhľadom na rast
                        
                        Namiesto už uvedenej „metódy odpočítania rýchlostnej konštanty rastu“ možno ako alternatívu použiť túto metódu, pri ktorej netreba uplatniť korekciu vzhľadom na rast. Základ spočíva vo využívaní údajov o depurácii na hmotnostnom základe (v súvislosti s celou rybou), a teda nie údajov týkajúcich sa koncentrácie.
                        Preveďte koncentrácie látky v tkanive zistené počas depuračnej fázy (hmotnosť testovanej látky na jednotkovú hmotnosť ryby) na hmotnosť testovanej látky/ryba: priraďte koncentrácie a hmotnosti jednotlivých rýb v tabuľkovej forme (napr. pomocou počítačového tabuľkového procesoru) a pre dané meranie vynásobte každú koncentráciu celkovou hmotnosťou ryby s cieľom určiť súbor podielov hmotnostný údaj o testovanej látke/ryba pre všetky vzorky získané počas depuračnej fázy.
                        Vyneste výsledný prirodzený logaritmus hmotnostných údajov o látke v závislosti od času experimentu (depuračná fáza) do grafu ako pri bežnom postupe.
                        V prípade metódy expozície vo vodnom prostredí rutinným spôsobom odvoďte rýchlostnú konštantu vychytávania (pozri oddiely 4 a 6). Pripomíname, že v rovniciach zameraných na fitovanie krivky v súvislosti s konštantou k
                           1 by sa mala použiť „normálna“ hodnota k
                           2. Z vyššie uvedených údajov odvoďte rýchlostnú konštantu depurácie. Pretože výsledná hodnota rýchlostnej konštanty depurácie je nezávislá od rastu, keďže sme ju odvodili na základe hmotnosti vzhľadom na celú rybu, mala by sa označiť ako k
                           2g, a nie ako k
                           2.
                        8.   NORMALIZÁCIA LIPIDOV NA 5 % OBSAH LIPIDOV (VÝLUČNE METÓDA EXPOZÍCIE PROSTREDNÍCTVOM VODY)
                        Ak nemožno potvrdiť, že sa testovaná látka primárne akumuluje v lipidoch (s bielkovinami sa môžu napr. viazať niektoré plnofluórované látky), výsledky BCF (v kinetickom a ustálenom stave) vyplývajúce z testov zameraných na expozíciu prostredníctvom vody by sa mali vykazovať aj vo vzťahu k štandardnému obsahu lipidov v rybách, ktorý predstavuje 5 % vlhkej hmotnosti. Údaje o koncentráciách rýb alebo BCF je potrebné previesť na 5 % obsah lipidov pri vlhkej hmotnosti. Ak sa na meranie koncentrácií látky a obsahu lipidov vo všetkých bodoch odberu vzoriek použili tie isté ryby, v takom prípade je nevyhnutné korigovať každú jednu nameranú koncentráciu látky v rybe vzhľadom na obsah lipidov danej ryby.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.29],
                                 
                              kde
                        
                                    
                                       C
                                       f,L
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    lipidová normalizovaná koncentrácia v rybe (mg kg– 1 vlhkej hmotnosti)
                                 
                              
                                    
                                       L
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    lipidová frakcia (na základe vlhkej hmotnosti)
                                 
                              
                                    
                                       C
                                       f
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    koncentrácia testovanej látky v rybe (mg kg– 1 vlhkej hmotnosti)
                                 
                              Ak sa analýza lipidov neuskutočnila na všetkých rybách vo vzorke, na normalizáciu BCF sa použije priemerná lipidová hodnota. V prípade BCF pri ustálenom stave by sa mala použiť priemerná hodnota zaznamenaná na konci fázy vychytávania v ovplyvnenej skupine. Pri normalizácii kinetického BCF môžu existovať prípady odôvodneného uplatnenia iného prístupu, napríklad vtedy, ak sa počas vychytávacej alebo depuračnej fázy značne zmenil obsah lipidov. Miera kŕmenia, ktorou sa minimalizujú dramatické zmeny obsahu lipidov by sa však mala rutinne používať.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A5.30]
                                 
                              kde
                        
                                    BCFKL
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    lipidový normalizovaný kinetický BCF (L kg– 1)
                                 
                              
                                    
                                       L
                                       n
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    priemerná lipidová frakcia (na základe vlhkej hmotnosti)
                                 
                              
                                    BCFK
                                    
                                 
                                 
                                    =
                                 
                                 
                                    kinetický BCF (L kg– 1)
                                 
                              LITERATÚRA
                        
                                    1.
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems, Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343–2355.
                                 
                              
                                    2.
                                 
                                 
                                    Kapitola C.20 tejto prílohy Reprodukčný test na Daphnia magna.
                                 
                              
                                    3.
                                 
                                 
                                    Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1: 309-320.
                                 
                              
                                    4.
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    5.
                                 
                                 
                                    Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993), Nonlinear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR QSAR Environ. Res. 1: 29-39.
                                 
                              
                                    6.
                                 
                                 
                                    Kristensen P. (1991), Bioconcentration in fish: comparison of BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute, Hørsholm, Denmark.
                                 
                              
                                    7.
                                 
                                 
                                    Arnot J.A., Meylan W., Tunkel J., Howard P.H., Mackay D., Bonnell M. and Boethling R.S. (2009), A quantitative structure-activity relationship for predicting metabolic biotransformation rates for organic chemicals in fish. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1168-1177.
                                 
                              
                                    8.
                                 
                                 
                                    OECD (2011), QSAR Toolbox 2.1. February 2011. K dispozícii na webovej lokalite: http://www.oecd.org/document/54/0,3746,en_2649_34379_42923638_1_1_1_1,00.html.
                                 
                              
                                    9.
                                 
                                 
                                    Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). Bioconcentration of 2,2′,4,4′ tetrachlorobiphenyl in rainbow trout as measured by an accelerated test. T. Am. Fish. Soc. 104: 785-792.
                                 
                              
                                    10.
                                 
                                 
                                    Ernst W. (1985), Accumulation in aquatic organisms, in Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals, Sheeman, P., et al., Editors. John Wiley & Sons Ltd, New York, NY, USA: 243-255.
                                 
                              
                                    11.
                                 
                                 
                                    Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models. Can. J. Chem. Eng. 55: 614-622.
                                 
                              
                                    12.
                                 
                                 
                                    Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
                                 
                              
                                    13.
                                 
                                 
                                    Konemann H. and van Leeuwen K. (1980), Toxicokinetics in fish: Accumulation and elimination of six chlorobenzenes by guppies. Chemosphere. 9: 3-19.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 6
                        
                           ODDIEL VENOVANÝ ROVNICIAM TÝKAJÚCIM SA TESTU ZAMERANÉHO NA EXPOZÍCIU PROSTREDNÍCTVOM VODNEJ FÁZY: MINIMALIZOVANÝ PLÁN TESTU
                        
                        Dôvod tohto prístupu spočíva v tom, že v plnom teste možno biokoncentračný faktor stanoviť buď ako rovnovážny biokoncentračný faktor (BCFSS) na základe výpočtu pomeru koncentrácie testovanej látky v tkanive ryby ku koncentrácii testovanej látky vo vode, alebo ho možno stanoviť na základe výpočtu kinetického biokoncentračného faktoru (BCFK) ako pomer rýchlostnej konštanty vychytávania k
                           1 k rýchlostnej konštante depurácie k
                           2. BCFK je platný aj vtedy, ak sa počas vychytávacej fázy nedosiahne rovnovážna koncentrácia látky za predpokladu, že vychytávanie a depurácia prebiehajú približne podľa kinetiky prvého rádu.
                        Ak sa meranie koncentrácie látky v tkanivách C
                           f1) uskutočňuje v čase, keď sa expozícia končí (t
                           1), a koncentrácia v tkanive (C
                           f2) sa opäť meria až po uplynutí istého obdobia (t
                           2), rýchlostnú konštantu depurácie (k
                           2) možno odhadnúť pomocou rovnice A5.22 uvedenej v dodatku 5.
                        Rýchlostnú konštantu vychytávania k
                           1 potom možno stanoviť algebricky pomocou rovnice A5.23 uvedenej v dodatku 5 (kde C
                           f sa rovná C
                           f1 a t sa rovná t
                           1) (1). Kinetický biokoncentračný faktor v prípade minimalizovaného plánu testu (označený ako BCFKm v záujme jeho odlíšenia od kinetických biokoncentračných faktorov stanovených pomocou iných metód) je teda:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A6.1]
                                 
                              Koncentrácie alebo výsledky by sa mali korigovať vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu ryby a normalizovať na 5 % obsah lipidov v rybe, ako sa opisuje v dodatku 5.
                        Minimalizovaný BCFSS
                            je BCF vypočítaný na konci fázy vychytávania za predpokladu dosiahnutia ustáleného stavu. Možno ho len predpokladať, pretože počet odberových bodov nepostačuje na jeho preukázanie.
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A6.2]
                                 
                              kde
                        
                           
                              C
                              f-minSS
                           = koncentrácia v rybe pri predpokladanom ustálenom stave na konci vychytávania (mg · kg– 1 vlhkej hmotnosti).
                        
                           
                              C
                              w-minSS
                           = koncentrácia vo vode pri predpokladanom ustálenom stave na konci vychytávania (mg · l– 1).
                        LITERATÚRA
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Springer T.A., Guiney P.D., Krueger H.O. and Jaber M.J. (2008), Assessment of an approach to estimating aquatic bioconcentration factors using reduced sampling. Environ. Toxicol. Chem. 27: 2271-2280.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 7
                        
                           ODDIEL VENOVANÝ ROVNICIAM TÝKAJÚCIM SA TESTU ZAMERANÉHO NA EXPOZÍCIU PROSTREDNÍCTVOM POTRAVY
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Príklad množstiev jednotlivých zložiek vhodného komerčného krmiva pre ryby
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Príklady postupov pridávania testovanej látky do potravy
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Výpočet asimilačnej účinnosti a biomagnifikačného faktoru
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Korekcia obsahu lipidov
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Vyhodnotenie rozdielov medzi meranou koncentráciou v čase nula (C
                                       0,m) a odvodenou koncentráciou v čase nula (C
                                       0,d)
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Usmernenia týkajúce sa testovaných látok s veľmi rýchlou depuráciou
                                 
                              1.   PRÍKLAD MNOŽSTIEV JEDNOTLIVÝCH ZLOŽIEK VHODNÉHO KOMERČNÉHO KRMIVA PRE RYBY
                        
                                    hlavná zložka
                                 
                                 
                                    rybia múčka
                                 
                              
                                    celkový obsah proteínu
                                 
                                 
                                    ≤ 55,0 %
                                 
                              
                                    celkový obsah tuku
                                 
                                 
                                    ≤ 15,0 % (93)
                                    
                                 
                              
                                    celkový obsah vlákniny
                                 
                                 
                                    ≥ 2,0 %
                                 
                              
                                    vlhkosť
                                 
                                 
                                    ≥ 12 %
                                 
                              
                                    popol
                                 
                                 
                                    ≥ 8 %
                                 
                              2.   PRÍKLADY POSTUPOV PRIDÁVANIA TESTOVANEJ LÁTKY DO POTRAVY
                        
                           Všeobecné poznámky
                        
                        Kontrolná potrava by sa mala pripravovať úplne rovnako ako potrava s pridanou testovanou chemikáliou, avšak bez testovanej látky.
                        Na kontrolu koncentrácie potravy s pridanou testovanou chemikáliou by sa mali pomocou vhodnej extrakčnej metódy vyextrahovať trojité vzorky dávkového krmiva, pričom by sa v extrahovaných vzorkách mala odmerať koncentrácia testovanej látky alebo rádioaktivita. Mala by sa preukázať vysoká analytická výťažnosť (> 85 %) s nízkou variabilitou medzi jednotlivými vzorkami (tri vzorky koncentrácie látky odobraté na začiatku testu by sa od priemernej hodnoty nemali líšiť o viac ako ± 15 %).
                        Počas testu s expozíciou prostredníctvom potravy by sa v deň 0 a na konci vychytávacej fázy mali na analýzu odobrať tri vzorky potravy na účely stanovenia obsahu testovanej látky v potrave.
                        
                           Príprava krmiva pre ryby s (čistým) kvapalným testovaným materiálom
                        
                        Cieľová nominálna testovacia koncentrácia v ovplyvnenom krmive pre ryby sa stanoví napríklad na 500 μg testovanej látky/g potravy. Príslušné množstvo (podľa molárnej hmotnosti alebo špecifickej rádioaktivity) čistej testovanej látky sa pridá ku krmivu pre ryby so známou hmotnosťou umiestnenému v sklenej nádobe alebo rotačnej odparke. Množstvo krmiva pre ryby by malo postačovať na celú vychytávaciu fázu (s prihliadnutím na potrebu zvýšených množstiev potravy pri každom kŕmení vzhľadom na rast rýb). Krmivo pre ryby by sa malo cez noc pomaly premiešavať s testovanou látkou (napr. v miešacom zariadení typu „roto-rack“ alebo rotáciou v prípade použitia rotačnej odparky). Potrava s pridanou testovanou chemikáliou by mala byť až do použitia uskladnená za podmienok, v ktorých sa zachová stabilita testovanej látky v kŕmnej zmesi (napr. v chladiacom zariadení).
                        
                           Príprava krmiva pre ryby s kukuričným alebo rybím olejom ako nosičom
                        
                        Tuhé testované látky by sa v trecej miske mali rozdrviť na jemný prášok. Kvapalné testované látky možno priamo pridať ku kukuričnému alebo rybiemu oleju. Testovaná látka sa rozpustí v známom množstve kukuričného alebo rybieho oleja (napr. 5 – 15 ml). Olej s príslušnou dávkou sa kvantitatívne prenesie do rotačnej odparky vhodnej veľkosti. Banka použitá na prípravu dávky uvedeného oleja by sa mala dvakrát vypláchnuť malým množstvom oleja, ktoré sa následne pridá do odparky s cieľom zabezpečiť prenos všetkej rozpustenej testovanej látky. V záujme úplného rozpustenia/rozptýlenia látky v oleji (alebo ak sa v štúdii používa viac ako jedna testovaná látka) sa do banky vloží mikromiešadlo, banka sa zazátkuje a zmes sa cez noc rýchlo mieša. Na účely testu sa do odparky pridá primerané množstvo krmiva pre ryby (zvyčajne vo forme peliet) a obsah banky sa homogénne mieša jej nepretržitým otáčaním v trvaní aspoň 30 minút, no pokiaľ možno cez noc. Na zabezpečenie stability testovanej látky v krmive s prídavkom testovanej chemikálie sa toto krmivo až do jeho použitia primerane uskladní (napríklad v chladiacom zariadení).
                        
                           Príprava krmiva pre ryby s organickým rozpúšťadlom
                        
                        Primerané množstvo testovanej látky (podľa molárnej hmotnosti alebo špecifickej rádioaktivity), ktoré postačuje na dosiahnutie cieľovej dávky, sa rozpustí vo vhodnom organickom rozpúšťadle (napríklad v 10 – 40 ml cyklohexánu alebo acetónu, ale prípadne aj vo väčšom objeme v závislosti od množstva potravy, do ktorej sa má pridať testovaná chemikália). Alikvotná časť tohto roztoku alebo celý roztok (pridáva sa po častiach ) sa zmieša s primeraným množstvom krmiva pre ryby postačujúcim na to, aby sa v rámci testu dosiahla požadovaná nominálna úroveň dávky. Krmivo a testovanú látku možno zmiešať v zmiešavacej miske z nehrdzavejúcej ocele, následne možno čerstvo pripravenú dávku krmiva pre ryby v tejto miske dva dní ponechať v laboratórnom digestore (s občasným premiešaním), vďaka čomu sa z nej odparí nadbytočné rozpúšťadlo. Prípadne možno krmivo a testovanú látku zmiešať v rotačnej odparke s nepretržitou rotáciou. Nadbytočné rozpúšťadlo možno v prípade potreby odstrániť prúdom vzduchu alebo dusíkom. Treba dbať na to, aby testovaná látka po odstránení rozpúšťadla nevykryštalizovala. Potrava s pridanou testovanou chemikáliou by mala byť až do použitia uskladnená za podmienok, v ktorých sa zachová stabilita testovanej látky v kŕmnej zmesi (napr. v chladiacom zariadení).
                        3.   VÝPOČET ASIMILAČNEJ ÚČINNOSTI A BIOMAGNIFIKAČNÉHO FAKTORA
                        Na výpočet asimilačnej účinnosti treba najprv odhadnúť celkovú rýchlostnú konštantu depurácie podľa dodatku 5 oddielu 4 (pomocou metódy postupného testovania, t. j. štandardnej lineárnej regresie) s použitím priemerných koncentrácií vzoriek získaných z depuračnej fázy. Rýchlostná konštanta kŕmenia – I a trvanie vychytávania – t sú v rámci tejto štúdie známe parametre. Priemerná nameraná koncentrácia testovanej látky prítomnej v potrave – C
                           food je v štúdii meranou premennou. Koncentrácia testovanej látky v rybách na konci vychytávacej fázy – C
                           0,d sa obvykle odvodzuje z úseku graficky znázorneného priebehu prirodzeného logaritmu ln(koncentrácie) v závislosti od dňa depurácie.
                        Asimilačná účinnosť danej látky (a, absorpcia testovanej látky v črevách) sa vypočíta takto:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.1]
                                 
                              kde
                        
                           
                              C
                              0,d
                           = odvodená koncentrácia látky v rybe v čase „nula“ depuračnej fázy (mg kg– 1);
                        
                           
                              k
                              2
                           = celková (vzhľadom na rast nekorigovaná) rýchlostná konštanta depurácie (deň– 1) vypočítaná podľa rovníc uvedených v dodatku 5 oddiele 3;
                        
                           
                              I
                           = rýchlostná konštanta požitia potravy (g potravy g– 1 ryby deň– 1);
                        
                           
                              C
                              food
                           = koncentrácia v potrave (mg kg– 1 potravy);
                        
                           t= trvanie obdobia kŕmenia (deň)
                        V záujme stanovenia presnej asimilačnej účinnosti bude však treba upraviť rýchlosť kŕmenia I, ktorá sa používa pri výpočte, vzhľadom na rast rýba. Ak v rámci testu počas vychytávacej fázy (v rámci ktorej nedôjde k žiadnej úprave krmivových dávok s cieľom zachovať nastavenú mieru kŕmenia) dochádza k výraznému rastu rýb, vzhľadom na pokračujúcu fázu vychytávania bude efektívna miera kŕmenia v porovnaní s nastavenou mierou nižšia, čo povedie k vyššej „skutočnej“ asimilačnej účinnosti. (Poznamenávame, že táto skutočnosť nemá význam pre celkový výpočet BMF, keďže veličina I sa použitím rovníc A7.1 a A7.4 fakticky vykráti). Priemernú rýchlosť kŕmenia korigovanú vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu – I
                           g možno odvodiť niekoľkými spôsobmi. Priamočiara a striktná metóda spočíva v uplatnení známej rýchlostnej konštanty rastu (k
                           g) na odhadnutie hmotnosti testovaných rýb v časových bodoch počas vychytávacej fázy, t. j.:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.2]
                                 
                              kde
                        
                           
                              W
                              f(t)= priemerná hmotnosť rýb v deň t vychytávania
                        
                           
                              W
                              f,0
                           = priemerná hmotnosť rýb na začiatku experimentu
                        Týmto spôsobom možno odhadnúť (aspoň) priemernú hmotnosť rýb v posledný deň expozície (W
                           f,end-of-uptake). Keďže rýchlosť kŕmenia vychádza z W
                           f,0,efektívnu rýchlosť kŕmenia na každý deň vychytávania možno vypočítať pomocou týchto dvoch hmotnostných hodnôt. V prípade rýchleho rastu počas vychytávacej fázy treba namiesto veličiny I uplatniť rýchlosť kŕmenia korigovanú vzhľadom na rast, a to I
                           g (g potravy g– 1 ra rybu na deň – 1), ktorú možno vypočítať takto:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.3]
                                 
                              Po vypočítaní/vyjadrení asimilačnej účinnosti možno BMF vypočítať vynásobením asimilačnej účinnosti rýchlostnou konštantou kŕmenia I (alebo I
                           g, ak sa použila na výpočet α) a následným vydelením výsledku celkovou rýchlostnou konštantou depurácie k
                           2:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.4]
                                 
                              Rovnakým spôsobom by sa mal vypočítať biomagnifikačný faktor korigovaný vzhľadom na rast, a to pomocou rýchlostnej konštanty depurácie korigovanej vzhľadom na rast (na základe jej odvodenia uvedeného v dodatku 5 oddiele 7). Opäť uvádzame, že ak sa na výpočet α použila veličina I
                           g, mala by sa použiť aj tu namiesto I:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.5]
                                 
                              kde:
                        
                           
                              α
                           = asimilačná účinnosť (absorpcia testovanej látky v črevách);
                        
                           
                              k
                              2
                           = celková (vzhľadom na rast nekorigovaná) rýchlostná konštanta depurácie (deň– 1) vypočítaná podľa rovníc uvedených v dodatku 5 oddiele 3;
                        
                           
                              k
                              2g
                           = rýchlostná konštanta depurácie korigovaná vzhľadom na rast (deň – 1);
                        
                           
                              I
                           = rýchlostná konštanta požitia potravy (g potravy g– 1 ryby deň– 1);
                        Polčas rozpadu korigovaný vzhľadom na rast (t
                           1/2) sa vypočíta takto:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.6]
                                 
                              Odhadnúť možno aj asimilačnú účinnosť látky obsiahnutej v potrave, ak sa počas lineárnej fázy vychytávania (v dňoch 1 až 3) stanovia rezíduá látky v tkanivách. V tomto prípade sa asimilačná účinnosť látky (α) určí takto:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.7]
                                 
                              kde
                        
                           
                              C
                              fish(t)= koncentrácia testovanej látky v rybe v čase t (mg kg– 1 vlhkej hmotnosti)
                        4.   KOREKCIA OBSAHU LIPIDOV
                        Ak sa meranie obsahu lipidov uskutočnilo na tej istej rybe, na ktorej sa vykonala chemická analýza vo všetkých intervaloch odberu vzoriek, potom by sa jednotlivé koncentrácie mali korigovať na základe lipidov, pričom by sa veličiny C
                           0,d a k
                           2 získali z grafického znázornenia prirodzeného logarimtu koncentrácie korigovanej vzhľadom na obsah lipidov v závislosti od depurácie (v dňoch). Asimilačnú účinnosť (rovnica A7.1) potom možno vypočítať na základe lipidov, a to pomocou C
                           food na základe lipidov (t. j. hodnota C
                           food sa vynásobí priemernou frakciou lipidov danej potravy). Z následného výpočtu s použitím rovnice A7.4 a rovnice A7.5 priamo vyplynie BMF korigovaný vzhľadom na obsah lipidov (a korigovaný vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu).
                        V opačnom prípade sa priemer frakcie lipidov (hmotnostný zlomok) obsiahnutých v rybách a potrave vypočítajú v prípade ovplyvňovanej, ako aj kontrolnej skupiny (pokiaľ ide o potravu a ryby v kontrolnej skupine, zvyčajne ide o údaje namerané na začiatku a na konci expozície; pokiaľ ide o ryby v ovplyvňovanej skupine, zvyčajne ide o údaje namerané len na konci expozície). V niektorých štúdiách sa obsah lipidov v rybách môže výrazne zvýšiť. V takýchto prípadoch je vhodnejšie použiť priemernú koncentráciu lipidov v ovplyvňovaných rybách, ktorá sa vypočíta na základe nameraných hodnôt na konci expozície a na konci depurácie. Vo všeobecnosti by sa na odvodenie oboch frakcií lipidov mali použiť len údaje z ovplyvňovanej skupiny.
                        Faktor korekcie vzhľadom na lipidy (Lc
                           ) sa vypočíta takto:
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.8]
                                 
                              kde L
                           fish je priemerná frakcia lipidov v rybách a L
                           food je priemerná frakcia lipidov v potrave.
                        Faktor korekcie vzhľadom na lipidy sa použije na výpočet biomagnifikačného faktora korigovaného vzhľadom na obsah lipidov (BMFL):
                        
                                    
                                       
                                 
                                 
                                    [rovnica A7.9]
                                 
                              5.   VYHODNOTENIE ROZDIELOV MEDZI MERANOU KONCENTRÁCIOU V ČASE NULA (C
                           0,M) A ODVODENOU KONCENTRÁCIOU V ČASE NULA (C
                           0,D)
                        Meraná koncentrácia v čase nula (C
                           0,m) a odvodená koncentrácia v čase nula (C
                           0,d) by sa mali porovnať. Ak sú veľmi podobné, potom by sa na odvodenie depuračných parametrov mal použiť model prvého rádu.
                        V niektorých štúdiách môžu existovať výrazné rozdiely medzi C
                           0,d, teda odvodenou hodnotou v čase nula, a priemernou meranou koncentráciou v čase nula. C
                           0,m (pozri poslednú zarážku bodu 159 tejto testovacej metódy). Ak je hodnota C
                           0,d oveľa nižšia ako hodnota C
                           0,m (C
                           0,d << C
                           0,m), z rozdielu môže vyplývať, že v črevách sú prítomné zvyšky nestrávenej potravy s pridanou testovanou chemikáliou. Ak sa na konci vychytávacej fázy odobrali a uskladnili ďalšie vzorky (celé ryby), túto skutočnosť možno experimentálne otestovať vykonaním samostatnej analýzy odstráneného čreva. V opačnom prípade, ak zo štatisticky reprezentatívneho testu na odľahlé hodnoty použitého na lineárnu regresiu depuračnej fázy vyplýva, že hodnota v prvom bode odberu vzorky v depuračnej fáze je chybne zvýšená, bude potenciálne vhodné uskutočniť lineárnu regresiu na odvodenie k
                           2, avšak s vynechaním prvej depuračnej koncentrácie. V takýchto prípadoch, ak dôjde k značnému zníženiu neistoty lineárnej regresie a je zrejmé, že pre kinetiku v depuračnej fáze v zásade platí kinetika prvého rádu, pri výpočte asimilačnej účinnosti bude možno vhodné použiť výsledné hodnoty C
                           0,d a k
                           2. Pri uvádzaní výsledkov by sa mala táto skutočnosť plne odôvodniť. Okrem toho je možné, že v rámci depuračnej fázy fungovala kinetika iného ako prvého rádu. Ak je táto situácia pravdepodobná (t. j. je zjavné, že údaje transformované prostredníctvom prirodzeného logaritmu predstavujú krivku v porovnaní s priamkou v grafe lineárnej regresie), potom je nepravdepodobné, že výpočty k
                           2 a C
                           0,d budú platné, a teda sa treba poradiť s odborníkom v oblasti bioštatistiky.
                        Ak je hodnota C
                           0,d oveľa vyššia ako nameraná hodnota (C
                           0,d >> C
                           0,m), môže to znamenať, že: v prípade danej látky došlo k veľmi rýchlej depurácii (t. j. v depuračnej fáze sa body odberu veľmi skoro priblížili k limitu kvantifikácie predmetnej analytickej metódy, pozri oddiel 6); došlo k odchýlke od depuračnej kinetiky prvého rádu; došlo k chybe v lineárnej regresii na odvodenie k
                           2 a C
                           0,d; alebo že v rámci štúdie došlo k výskytu problému týkajúceho sa meraných koncentrácií v istých časových bodoch odberu vzoriek. V takýchto prípadoch by sa mal preskúmať graf lineárnej regresie s cieľom zaznamenať vzorky v limite kvantifikácie alebo v jeho blízkosti, a to na účely zistenia extrémnych odľahlých hodnôt alebo zjavného zakrivenia (čo naznačuje kinetiku iného ako prvého rádu), a tieto skutočnosti by sa mali zdôrazniť pri uvádzaní výsledkov. Malo by sa opísať a odôvodniť každé následné prehodnotenie lineárnej regresie zamerané na zlepšenie odhadovaných hodnôt. Ak sa spozorujú značné odchýlky od kinetiky prvého rádu, potom je nepravdepodobné, že výpočty k
                           2 a C
                           0,d budú platné, a teda sa treba poradiť s odborníkom v oblasti bioštatistiky.
                        6.   USMERNENIA TÝKAJÚCE SA TESTOVANÝCH LÁTOK S VEĽMI RÝCHLOU DEPURÁCIOU
                        Ako sa uvádza v bode 129 testovacej metódy, niektoré látky sa môžu depurovať tak rýchlo, že nemožno dospieť k spoľahlivej koncentrácii v čase nula – C
                           0,d ani k hodnote k
                           2, pretože už ani vo vzorkách odobratých veľmi skoro v depuračnej fáze (t. j. počnúc druhou depuračnou vzorkou) sa daná látka viac fakticky nedá namerať (koncentrácie zaznamenané v limite kvantifikácie). Táto situácia bola zaznamenaná počas medzilaboratórnej porovnávacej skúšky vykonanej na podporu tejto testovacej metódy s benzo[a]pyrénom a je zdokumentovaná vo validačnej správe k tejto metóde. V takýchto prípadoch nemožno lineárnu regresiu spoľahlivo uskutočniť, keďže z nej pravdepodobne vyplynie nerealisticky vysoký odhad C
                           0,d, v dôsledku čoho dôjde k zdanlivej asimilačnej účinnosti, ktorá je výrazne vyššia ako 1. V takýchto prípadoch sa dá vypočítať konzervatívny odhad k
                           2 a „horná medza“ BMF.
                        Pomocou uvedených dátových bodov depuračnej fázy, kde sa merala koncentrácia až po prvú nedetegovateľnú koncentráciu a vrátane nej (koncentrácia stanovená v limite kvantifikácie), sa pomocou lineárnej regresie (s použitím údajov o koncentrácii transformovaných prostredníctvom prirodzeného logaritmu v závislosti od času) bude dať odhadnúť hodnota k
                           2. V takýchto prípadoch sa pravdepodobne vyskytnú iba dva dátové body (napr. odbery v dni 1 a 2 depurácie) a následne možno pomocou rovnice A5.22 uvedenej v dodatku 5 odhadnúť hodnotu k
                           2. Tento odhad k2 možno použiť na odhad asimilačnej účinnosti podľa rovnice A7.1, pričom sa v prípade, že hodnota C0,d je podľa odhadu zjavne oveľa vyššia, než aká by sa dala dosiahnuť v teste, hodnota C0,d sa v rovnici nahradí meranou koncentráciou v čase nula (C0,m). Ak hodnota C0,m nebola merateľná, mal by sa použiť limit detekcie v tkanive ryby. Ak z toho v niektorých prípadoch vyplýva hodnota α > 1, potom sa v prípade „najhoršieho scenára“ predpokladá, že hodnota asimilačnej účinnosti je 1.
                        Pomocou rovnice A7.4 možno potom odhadnúť maximálny BMFK, ktorý by sa mal označiť ako hodnota „oveľa menej než“ (<<). Napríklad v prípade štúdie s mierou kŕmenia 3 % a depuračným polčasom kratším ako 3 dni a s uplatnením „najhoršieho scenára“, v rámci ktorého sa α rovná 1, je pravdepodobné, že BMFK bude nižší ako asi 0,13. Vzhľadom na účel tohto odhadu, ako aj na skutočnosť, že hodnoty budú mať konzervatívny charakter, ich nie je potrebné korigovať vzhľadom na riedenie látky vplyvom rastu ryby ani na obsah lipidov v rybách a potrave.
                     
                     
                        Dodatok 8
                        
                           PRÍSTUPY ODHADOVANIA ORIENTAČNÝCH BCF NA ZÁKLADE ÚDAJOV ZÍSKANÝCH V ŠTÚDII ZAMERANEJ NA EXPOZÍCIU PROSTREDNÍCTVOM POTRAVY
                        
                        Metóda s expozíciou prostredníctvom potravy je súčasťou tejto testovacej metódy zameranej na testovanie bioakumulácie látok, ktoré v praxi nemožno testovať pomocou metódy, v ktorej sa využíva expozícia prostredníctvom vodného prostredia. Výsledkom metódy na báze expozície prostredníctvom vodného prostredia je biokoncentračný faktor, kým metóda na báze expozície prostredníctvom potravy zase vedie priamo k informáciám o magnifikačnom potenciáli krmiva. V mnohých systémoch chemickej bezpečnosti sa vyžadujú informácie o vodnej biokoncentrácii (napríklad v súvislosti s posudzovaním rizika či globálnym harmonizovaným systémom klasifikácie). Existuje teda potreba využiť údaje získané v rámci štúdie týkajúcej sa expozície prostredníctvom potravy na účely odhadu biokoncentračného faktora. Daný prístup je porovnateľný s testami vykonanými podľa metódy expozície prostredníctvom vodného prostredia (94). V tomto oddiele sa skúmajú možné prístupy na riešenie nastoleného problému, no uvádzajú sa v ňom aj nedostatky spočívajúce v predmetných odhadoch.
                        V predmetnej štúdii zameranej na expozíciu prostredníctvom potravy sa meria depurácia s cieľom zistiť rýchlostnú konštantu depurácie k
                           2. Ak na základe dostupných údajov o situácii, keď boli ryby vystavené testovanej látke prostredníctvom vodného prostredia, možno odhadnúť rýchlostnú konštantu vychytávania, potom kinetický BCF možno odhadnúť.
                        Odhad rýchlostnej konštanty vychytávania pri expozícii testovanej látke prostredníctvom vodného prostredia závisí od viacerých predpokladov, z ktorých všetky prispejú k neistote daného odhadu. Okrem toho sa pri tomto prístupe k odhadu BCF predpokladá, že celková rýchlosť depurácie (vrátane ovplyvňujúcich faktorov, medzi ktoré patrí napríklad distribúcia látky v organizme a individuálne depuračné procesy) nezávisí od spôsobu expozície, ktorý sa uplatňuje so zámerom vyvolať záťaž organizmu v dôsledku pôsobenia testovanej látky.
                        Hlavné predpoklady obsiahnuté v odhadovacom prístupe možno zhrnúť takto:
                        V prípade konkrétnej látky je depurácia nasledujúca po vychytávaní prostredníctvom potravy rovnaká ako depurácia, ktorá nasleduje po expozícii prostredníctvom vodného prostredia.
                        Vychytávanie z vodného prostredia by sa riadilo kinetikou prvého rádu.
                        V závislosti od metódy použitej na odhad vychytávania:
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    vychytávanie závisí len hmotnosti rýb;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    vychytávanie závisí len od rozdeľovacej konštanty oktanol-voda danej látky;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    vychytávanie závisí od kombinácie hmotnosti rýb a rozdeľovacej konštanty oktanol-voda danej látky;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    len malý vplyv majú faktory, ktoré môžu v praxi ovplyvniť vychytávanie v rámci štúdie zameranej na expozíciu vo vodnom prostredí, ako biodostupnosť látky, adsorpcia na prístroj, molekulárna veľkosť atď.;
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    no predovšetkým:
                                 
                              databáza („cvičný súbor“) používaná pri vývoji metódy odhadu vychytávania má v prípade látky, ktorá je predmetom posudzovania, reprezentatívny charakter.
                        V niekoľkých dostupných literárnych prameňoch sa uvádzajú príklady odvodenia rovníc, v ktorých existuje vzťah medzi vychytávaním látky z vodného prostredia žiabrami rýb a rozdeľovacou konštantou oktanol–voda, hmotnosťou rýb (1) (2) (3) (4), objemom a/alebo obsahom lipidov, priepustnosťou membrány/difúznosťou 5) 6), ventilačným objemom ryby (7) a posudzovaním fugacity/materiálovej bilancie (8) (9) (10). Podrobné posúdenie týchto metód v danom kontexte sa uvádza v publikácii od autorskej dvojice Crookes a Brooke (11). V tejto súvislosti je užitočnou pomôckou aj Barberova publikácia (12) zameraná na modelovanie bioakumulácie na základe vychytávania prostredníctvom potravy, pretože obsahuje údaje vychádzajúce z modelov zameraných na rýchlosť vychytávania testovanej látky žiabrami. Tomuto aspektu bol venovaný aj oddiel sprievodného informačného dokumentu k protokolu o expozícii prostredníctvom potravy z roku 2004 (13).
                        Zdá sa, že pri odvodzovaní týchto modelov sa využívali do istej miery obmedzené databázy. V prípade modelov, pri ktorých sú k dispozícii podrobnosti o databáze použitej pri ich zostavení, je zrejmé, že typy použitých látok majú často podobnú štruktúru alebo triedu (z hľadiska funkčnosti, napr. organochlórové zlúčeniny). Z toho popri zvažovaní takých špecifických testovacích parametrov, ako napríklad konkrétny druh, teplota atď, pramení ďalšia neistota v súvislosti s používaním modelu na účely predpovede rýchlostnej konštanty vychytávania pri inom druhu látky.
                        V preskúmaní dostupných techník (11) zarezonovala skutočnosť, že žiadna metóda nie je „správnejšia“ ako iné. Preto by sa malo jasne odôvodniť použitie konkrétneho modelu. Ak je k dispozícii niekoľko metód, ktorých použitie možno odôvodniť, bolo by rozumné predložiť niekoľko odhadov k
                           1 (a tak aj BCF) alebo škály hodnôt k
                           1 (a BCF) podľa viacerých metód odhadu vychytávania. Vzhľadom na rozdiely v druhoch modelov a súboroch údajov, ktoré sa použili pri ich vypracovaná, by však nebolo vhodné uplatniť priemernú hodnotu získanú na základe rôznorodo odvodených odhadov.
                        Podľa názoru niektorých výskumníkov si takýto druh odhadov BCF vyžaduje korekciu biologickej dostupnosti v záujme zohľadnenia adsorpcie látky na rozpustený organický uhlík (DOC) za podmienok expozície prostredníctvom vodného prostredia, aby sa odhad zosúladil s výsledkami štúdií venovaných expozícii vo vodnom prostredí [napr. (13) (14)]. Táto korekcia však nemusí byť vhodná vzhľadom na nízke úrovne DOC, ktoré sa vyžadujú v prípade odhadu „najhoršieho scenára“ v rámci štúdie expozície prostredníctvom vodného prostredia (t. j. pomer biologicky dostupnej látky a látky meranej v roztoku). V prípade vysokohydrofóbnych látok môže dôjsť k obmedzeniu vychytávania v žiabrach v dôsledku miery pasívnej difúzie v blízkosti povrchu žiabier. V takomto prípade je možné, že korekciou sa zohľadňuje tento účinok, a nie ten, na ktorý bola určená.
                        Odporúčame zamerať sa na metódy, ktoré si vyžadujú vstupy, pri ktorých možno okamžite získať údaje o látkach testovaných podľa tu opísanej štúdie expozície prostredníctvom potravy (t. j. log K
                           OW, hmotnosť ryby). Uplatniť sa dajú aj iné metódy, ktoré si vyžadujú zložitejšie vstupy, no je možné, že pri nich budú potrebné ďalšie testovacie merania alebo podrobné znalostí o testovanej látke alebo druhu rýb, a tie možno nebudú všeobecne k dispozícii. Výber modelu môže okrem toho ovplyvniť aj úroveň validácie a oblasť uplatniteľnosti [na účely preskúmania a porovnania rôznych metód pozri (11)].
                        Treba mať na mysli, že výsledné odhady k
                           1 a BCF sú neisté, a teda je možné, že sa k nim bude musieť pristupovať na základe analýzy váhy dôkazov, pričom bude v záujme celkového vnímania bioakumulačného potenciálu látky potrebné uplatniť odvodený BMF a parametre danej látky (napr. veľkosť molekúl). Interpretácia a použitie týchto parametrov môže závisieť od regulačného rámca.
                        LITERATÚRA
                        
                                    1.
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Pärt P. and Opperhuizen A. (1993), The influence of temperature on the uptake rate constants of hydrophobic compounds determined by the isolated perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 25: 1-14.
                                 
                              
                                    2.
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., Part P. and Opperhuizen A. (1994), Experimentally determined blood and water flow limitations for uptake of hydrophobic compounds using perfused gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): Allometric applications. Aquat. Toxicol. 30: 325-341.
                                 
                              
                                    3.
                                 
                                 
                                    Sijm D.T.H.M., Verberne M.E., de Jonge W.J., Pärt P. and Opperhuizen A. (1995), Allometry in the uptake of hydrophobic chemicals determined in vivo and in isolated perfused gills. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131: 130-135.
                                 
                              
                                    4.
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2003), A review and comparison of models for predicting dynamic chemical bioconcentration in fish. Environ. Toxicol. Chem. 22: 1963-1992.
                                 
                              
                                    5.
                                 
                                 
                                    Opperhuizen A. (1986), Bioconcentration of hydrophobic chemicals in fish, in Aquatic Toxicology and Environmental Fate, STP 921, Poston, T.M. and Purdy, R., Editors. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA, USA: 304-315.
                                 
                              
                                    6.
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2004), A food web bioaccumulation model for organic chemicals in aquatic ecosystems. Environ. Toxicol. Chem. 23: 2343-2355.
                                 
                              
                                    7.
                                 
                                 
                                    Thomann R.V. (1989), Bioaccumulation model of organic chemical distribution in aquatic food chains. Environ. Sci. Technol. 23: 699-707.
                                 
                              
                                    8.
                                 
                                 
                                    Hendriks A.J., van der Linde A., Cornelissen G. and Sijm D.T.H.M. (2001). The power of size. 1. Rate constants and equilibrium ratios for accumulation of organic substances related to octanol-water partition ratio and species weight. Environ. Toxicol. Chem. 20: 1399-1420.
                                 
                              
                                    9.
                                 
                                 
                                    Campfens J. and Mackay D. (1997), Fugacity-based model of PCB bioaccumulation in complex aquatic food webs. Environ. Sci. Technol. 31: 577-583.
                                 
                              
                                    10.
                                 
                                 
                                    Arnot J.A. and Gobas F.A.P.C. (2003), A generic QSAR for assessing the bioaccumulation potential of organic chemicals in aquatic food webs. QSAR Comb. Sci. 22: 337-345.
                                 
                              
                                    11.
                                 
                                 
                                    Crookes M. and Brooke D. (2010), Estimation of fish bioconcentration factor (BCF) from depuration data. Draft Report. Environmental Agency, Bristol, UK.
                                 
                              
                                    12.
                                 
                                 
                                    Barber M.C. (2008), Dietary uptake models used for modelling the bioaccumulation of organic contaminants in fish. Environ. Toxicol. Chem. 27: 755-777
                                 
                              
                                    13.
                                 
                                 
                                    Anonymous (2004), Background document to the fish dietary study protocol, document submitted to the TC-NES WG on PBT.
                                 
                              
                                    14.
                                 
                                 
                                    Gobas F. and Morrison H. (2000), Bioconcentration and biomagnification in the aquatic environment, in Handbook of property estimation methods for chemicals, Boethling, R.S. and Mackay, D., Editors. Lewis Publishers, Boca Racton, FL, USA: 189-231.
                                 
                              “
               
                     17.
                  
                  
                     V časti C sa kapitola C.20 nahrádza takto:
                     „C.20   Reprodukčný test na Daphnia magna
                        
                     
                     ÚVOD
                     Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 211 (2012). Usmernenia OECD na vykonávanie testov sa pravidelne revidujú a aktualizujú vzhľadom na vedecký pokrok. Usmernenie na vykonávanie reprodukčného testu 211 vychádza z časti II usmernenia na vykonávanie testu 202, v ktorej sa uvádza reprodukčný test na Daphnia sp. (1984). Všeobecne sa uznáva, že údaje získané na základe testov vykonaných podľa uvedeného usmernenia TG 202 sa môžu líšiť. Z tohto dôvodu sa v záujme vytvorenia lepšej testovacej metódy vynaložilo značné úsilie zamerané na identifikáciu dôvodov tejto variability. Usmernenie na vykonanie testov 211 vychádza z výsledkov týchto výskumných činností, kruhových testov a validačných štúdií vykonaných v rokoch 1992 (1), 1994 (2) a 2008 (3).
                     Toto sú hlavné rozdiely medzi pôvodnou verziou usmernenia na vykonávanie reprodukčného testu (TG 202, 1984) a jeho druhou verziou (TG 211, 1998):
                     
                                 —
                              
                              
                                 odporúča sa použiť druh Daphnia magna,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 test trvá 21 dní,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pri polostatickom teste sa počet jedincov, ktoré sa majú použiť pri každej testovanej koncentrácii, znížil z aspoň 40 jedincov, podľa možnosti rozdelených do štyroch skupín po desiatich jedincoch, na aspoň 10 jedincov držaných samostatne (hoci v prípade prietokových testov možno použiť rôzne plány testu),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 v súvislosti s testovacím médiom a podmienkami kŕmenia sa sformulovali špecifickejšie odporúčania,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 toto sú hlavné rozdiely medzi druhou verziou usmernenia na vykonávanie reprodukčného testu (TG 211, 1998) a touto verziou:
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 doplnil sa dodatok 7 s cieľom v prípade potreby opísať postupy identifikácie pohlavia novonarodených jedincov; v súlade s predchádzajúcimi verziami tejto testovacej metódy je voliteľným sledovaným parametrom pomer pohlaví,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 hodnota závislej premennej – počet žijúcich potomkov na rodičovského jedinca sa doplnila o ďalšiu závislú premennú týkajúcu sa reprodukcie dafnií, t. j. celkový počet žijúcich potomkov na konci testu na rodičovskú dafniu na začiatku testu, čím sa z analýzy vyradia prípady náhodnej a/alebo mimovoľnej úmrtnosti rodičovských jedincov. Účelom ďalšej závislej premennej je zosúladiť túto závislú premennú s ďalšími reprodukčnými testovacími metódami uskutočňovanými na bezstavovcoch. Okrem toho v súvislosti s touto závislou premennou možno v tejto testovacej metóde odstrániť zdroj chybovosti, a to konkrétne účinok mimovoľnej a/alebo náhodnej úmrtnosti rodičovských jedincov v prípade jej výskytu počas obdobia expozície,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 v prípade ECx (napr. EC10 alebo EC50), ako aj prístupu NOEC/LOEC, sa začlenili aj ďalšie štatistické usmernenia týkajúce plánu testu a spracovania výsledkov,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 zavádza sa limitný test.
                              
                           V dodatku 1 sa uvádzajú definície.
                     PRINCÍP TESTU
                     Prvotným cieľom testu je posúdiť účinok chemikálií na reprodukčný výstup Daphnia magna. Mladé samice uvedeného druhu (rodičovské jedince), ktoré sú na začiatku testu mladšie ako 24 hodín, sú vystavené testovanej chemikálii pridávanej do vody v rôznych koncentráciách. Test trvá 21 dní. Na konci testu sa posúdi celkový počet narodených živých potomkov. Reprodukčný výstup rodičovských jedincov možno vyjadriť rôznymi spôsobmi (napr. počet žijúcich potomstva vyprodukovaného na jedinca za deň od prvého dňa, keď bolo spozorované potomstvo). Vykazovanie reprodukčného výstupu by sa však malo uskutočňovať popri vykazovaní celkového počtu živých mláďat na konci testu. Z dôvodu špecifického plánu polostatického testu v porovnaní s inými testovacími metódami týkajúcimi sa reprodukcie bezstavovcov je zároveň možné stanoviť počet živých potomkov jednotlivých rodičovských jedincov. Na rozdiel od iných testovacích metód týkajúcich sa reprodukcie bezstavovcov možno vďaka tomuto testu zabezpečiť, že ak počas testovacieho obdobia dôjde k náhodnému a/alebo mimovoľnému úhynu rodičovského jedinca, z posudzovaných údajov možno vylúčiť ním vyprodukované potomstvo. Ak sa teda u replikátov vystavených účinkom chemikálie vyskytne rodičovská úmrtnosť, malo by sa zvážiť, či v prípade danej úmrtnosti ide o zvyčajnú reakciu na koncentráciu, napr. v prípade významnej regresie reakcie na koncentráciu testovanej chemikálie s pozitívnym sklonom (na tento účel sa môže použiť štatistický test ako Cochranov a Armitageov test trendu). Ak úmrtnosť nie je reakciou na koncentráciu, potom by sa dané replikáty s rodičovskou úmrtnosťou mali z analýzy výsledkov testu vylúčiť. Ak úmrtnosť je reakciou na koncentráciu, rodičovská úmrtnosť by sa mala pripísať účinku testovanej chemikálie a replikáty by sa z analýzy nemali vylúčiť. Ak rodičovský jedinec uhynie počas testu, t. j. náhodne v dôsledku nesprávneho zaobchádzania alebo nehody, prípadne uhynie mimovoľne v dôsledku nevysvetliteľnej udalosti, ktorá nesúvisela s účinkom testovanej chemikálie, alebo ak vysvitne, že posudzovaný jedinec je samec, potom sa replikát vylúči z analýzy (viac informácií sa uvádza v bode 51). Toxické účinky testovanej chemikálie na reprodukčný výstup sa vyjadrujú buď ako ECx, a to prostredníctvom dosadzovania údajov do vhodného modelu a základe nelineárnej regresie s cieľom odhadnúť koncentráciu, ktorá by spôsobila x % zníženie reprodukčného výstupu, alebo sa vyjadrujú ako hodnota NOEC/LOEC (4). Testované koncentrácie by mali podľa možnosti zahŕňať najnižšiu z použitých účinných koncentrácií (napr. EC10), čo znamená, že táto hodnota sa vypočíta pomocou interpolácie, a nie extrapolácie.
                     Zaznamenať by sa mal aj počet rodičovských jedincov, ktorí prežili, a čas narodenia prvého potomstva. Preskúmať možno aj iné s danou chemikáliou súvisiace účinky na parametre, ako sú napríklad rast (napr. dĺžka) a možná inherentná rýchlosť rastu populácie (pozri bod 44).
                     INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                     Pri výbere vhodných testovacích koncentrácií v reprodukčných testoch môžu byť užitočné výsledky testu akútnej toxicity (pozri kapitolu C.2 tejto prílohy: Test akútnej imobilizácie dafnií Daphnia sp.), ktorý sa uskutočnil s použitím druhu Daphnia magna. Je potrebné poznať rozpustnosť testovanej chemikálie vo vode a jej tlak pary, pričom by k dispozícii mala byť spoľahlivá analytická metóda na kvantifikáciu chemikálie v testovacích roztokoch so známou mierou výťažnosti a kvantifikačným limitom.
                     Medzi informácie o testovanej chemikálii, ktoré môžu byť užitočné pri stanovovaní testovacích podmienok, patrí štruktúrny vzorec, čistota chemikálie, stabilita na svetle, stabilita za podmienok testovania, pKa, Pow a výsledky testov na ľahkú biodegradovateľnosť [pozri kapitolu C.4 (Stanovenie „ľahkej“ biodegradovateľnosti) a kapitolu C.29 (Ľahká biodegradovateľnosť – CO2 v hermeticky uzavretých nádobách) tejto prílohy].
                     PLATNOSŤ TESTU
                     Aby bol test platný, pri kontrole(-ách) by sa mali splniť tieto kritériá na vykonanie testu:
                     
                                 —
                              
                              
                                 úmrtnosť rodičovských jedincov (samice rodu Daphnia) nesmie na konci testu presiahnuť 20 %;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 priemerný počet živých potomkov na jedného rodičovského jedinca, ktoré na konci testu prežili, je ≥ 60.
                              
                           Poznámka: Rovnaké validačné kritérium(20 %) možno uplatniť aj v prípade náhodnej a mimovoľnej rodičovskej úmrtnosti v prípade kontrol, ako aj každej z testovaných koncentrácií.
                     OPIS METÓDY
                     
                        Prístrojové vybavenie
                     
                     Testovacie nádoby a iné prístroje, ktoré prichádzajú do styku s testovacími roztokmi, by mali byť celé zo skla alebo iného chemicky inertného materiálu. Testovacie nádoby sú obvykle sklenené kadičky.
                     Okrem toho budú potrebné niektoré z týchto zariadení alebo všetky uvedené zariadenia:
                     
                                 —
                              
                              
                                 oximeter (s mikroelektródou alebo iným vhodným vybavením na meranie rozpusteného kyslíka vo vzorkách s malým objemom),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 primerané zariadenie na kontrolu teploty,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 pH meter,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 vybavenie na stanovenie tvrdosti vody,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 vybavenie na stanovenie celkového obsahu organického uhlíka (TOC) vo vode alebo zariadenie na stanovenie chemickej spotreby kyslíka (COD),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 primeraný prístroj na kontrolovanie svetelného režimu a meranie intenzity svetla.
                              
                           
                        Testované organizmy
                     
                     Druh, ktorý sa má použiť v teste je Daphnia magna Straus (95).
                     Klony by sa mali podľa možnosti identifikovať na základe genotypov. Z výskumu (1) vyplynulo, že reprodukčná schopnosť klonu A (ktorý pochádza z IRCHA vo Francúzsku) (5), stabilne vyhovuje kritériu validity, ktorým je priemerná hodnota ≥ 60 žijúcich potomkov na rodičovského jedinca, ktorý prežíva, ak je chovaný za podmienok opísaných v tejto testovacej metóde. Akceptovateľné sú však aj iné klony, a to za podmienky, že predmetná kultúra dafnií preukázateľne spĺňa kritériá validity na účely testu.
                     Na začiatku testu by mali byť jedince mladšie ako 24 hodín a nemali by pochádzať z prvého potomstva. Mali by pochádzať zo zdravej populácie (t. j. nemali by vykazovať príznaky stresu, akými sú napríklad vysoká úmrtnosť, prítomnosť samcov a efípií, oneskorené liahnutie prvých potomkov, jedince so zmenou sfarbenia atď.) Zásobná populácia by sa mala držať v chovných podmienkach (svetlo, teplota, médium, kŕmenie a počet jedincov na jednotku objemu) podobných tým, ktoré sa použijú pri teste. Ak sa rastové médium dafnií, ktoré sa má použiť v teste, líši od média, ktoré sa vyskytuje pri bežnej kultúre dafnií, s cieľom zabrániť spôsobovaniu stresu rodičovským jedincom sa odporúča pred testom zaradiť aklimatizačné obdobie trvajúce obvykle okolo troch týždňov (t. j. jedna generácia).
                     
                        Testovacie médium
                     
                     V tomto teste odporúčame použiť plne definované médium. Vďaka tomu sa možno vyhnúť použitiu ťažko charakterizovateľných prídavných látok (napr. rias, pôdnych extraktov), čím sa následne zlepšujú možnosti štandardizácie medzi laboratóriami. Zistilo sa, že na tento účel sú vhodné Elendtove médiá M4 (6) a M7 (pozri dodatok 2). Akceptovateľné sú však aj iné médiá, napr. (7), (8), a to za podmienky, že úžitkovosť kultúry dafnií preukázateľne spĺňa kritériá validity testu.
                     Ak sa používajú médiá, ktoré obsahujú nedefinované prídavné látky, tieto prídavné látky by sa mali jasne špecifikovať, pričom by sa mali v skúšobnom protokole poskytnúť informácie o zložení, a to predovšetkým s prihliadnutím na obsah uhlíka, keďže práve obsah uhlíka môže prispievať k poskytovanej potrave. Odporúča sa, aby sa stanovil celkový obsah organického uhlíka (TOC) a/alebo chemická spotreba kyslíka (COD) v zásobnom roztoku organickej prídavnej látky a aby sa uskutočnil odhad výsledného vplyvu na TOC/COD v testovacom médiu. Ďalej sa odporúča, aby úrovne TOC v médiu (t. j. pred pridaním rias) boli pod 2 mg/l (9).
                     Pri testovaní chemikálií s obsahom kovov je dôležité rozpoznať, že vlastnosti testovacieho média (t. j. tvrdosť, chelačná kapacita) môžu mať súvislosť s toxicitou testovanej chemikálie. Z tohto dôvodu je vhodné úplne definované médium. V súčasnosti sú však jedinými plne definovanými médiami, ktoré sú známe ako vhodné na dlhodobý chov kultúry Daphnia magna, Elendtove médiá M4 a M7. Obidve médiá obsahujú chelatotvorné činidlo EDTA. Zo skúseností vyplýva (2), že ak sa reprodukčný test uskutoční v médiách M4 a M7, „zjavná toxicita“ kadmia je vo všeobecnosti nižšia ako vtedy, ak sa uvedený test uskutoční v médiách, ktoré činidlo EDTA neobsahujú. Preto sa na testovanie chemikálií s obsahom kovov neodporúčajú médiá M4 a M7. Treba sa vyhnúť aj iným médiám s obsahom známych chelatotvorných činidiel. V prípade chemikálií, ktoré obsahujú kovy, sa odporúča použiť alternatívne médium, napríklad sladkú tvrdú vodu, rekonštituovanú v súlade s predpismi organizácie ASTM (9), ktorá neobsahuje žiadne činidlá EDTA. Táto kombinácia sladkej tvrdej vody, rekonštituovanej v súlade s normami organizácie ASTM, a extraktu z rias (10) je pre dlhodobý chov kultúry Daphnie magna (2) vhodná.
                     Koncentrácia rozpusteného kyslíka by na začiatku testu a počas neho mala presahovať 3 mg/l. Hodnota pH by sa mala pohybovať v rozmedzí od 6 do 9 a zvyčajne by sa v žiadnom teste nemala líšiť o viac ako 1,5 jednotiek. Odporúča sa tvrdosť nad 140 mg/l (v podobe CaCO3). Testy na tejto úrovni a vyšších úrovniach preukazujú reprodukčnú schopnosť v súlade s kritériami validity (11) a (12).
                     
                        Testovacie roztoky
                     
                     Testovacie roztoky so zvolenou koncentráciou sa zvyčajne pripravujú zriedením zásobného roztoku. Zásobné roztoky by sa mali pripravovať podľa možnosti bez použitia akýchkoľvek rozpúšťadiel alebo dispergujúcich látok, a to miešaním alebo pretrepávaním testovanej chemikálie v testovacom médiu za použitia mechanických postupov vrátane trepania, miešania alebo utrazvuku, prípadne iných vhodných metód. Pred zavedením testovaných organizmov sa odporúča, aby sa testované systémy vystavili pôsobeniu koncentrácií testovanej chemikálie, ktorá sa má použiť v štúdii, a to tak dlho, ako je to potrebné na preukázanie stabilných expozičných koncentrácií. Ak sa testovaná chemikália ťažko rozpúšťa vo vode, malo by sa postupovať v súlade s postupmi uvedenými v usmernení OECD o zaobchádzaní s problematickými látkami (13). Používaniu rozpúšťadiel alebo dispergujúcich látok by sa síce malo vyhýbať, no v niektorých prípadoch môže byť ich použitie nevyhnutné v záujme vytvorenia zásobného roztoku, ktorý má vhodnú koncentráciu z hľadiska dávkovania.
                     Okrem testovania s testovacími koncentráciami treba testovanie uskutočniť s kontrolou vody na riedenie s vhodným počtom replikátov a v prípade nutnosti aj s kontrolou rozpúšťadla s vhodným počtom replikátov. V teste by sa mali používať len rozpúšťadlá alebo dispergujúce látky, v prípade ktorých sa na základe skúmania potvrdilo, že nemajú žiadne významné alebo majú len minimálne účinky na hodnotu závislej premennej. V bode (13) sa uvádzajú príklady vhodných rozpúšťadiel (napr. acetón, etanol, metanol, dimetylformamid a trietylénglykol) a dispergujúcich látok (napr. Cremophor RH40, metylcelulóza 0,01 % a HCO-40). V prípade použitia rozpúšťadla alebo dispergujúcej látky by ich finálna koncentrácia nemala presahovať 0,1 ml/l (13) a s výnimkou kontrolny vody na riedenie by vo všetkých testovacích nádobách mala byť rovnaká koncentrácia. Je však potrebné usilovať sa o minimalizovanie koncentrácie rozpúšťadla.
                     POSTUP
                     
                        Podmienky expozície
                     
                     
                        Trvanie
                     
                     Test trvá 21 dní.
                     
                        Nasadzovanie
                     
                     Rodičovské jedince sa držia jednotlivo, teda jeden na testovaciu nádobu zvyčajne s objemom 50 až 100 ml (v prípade Daphnia magna). V nádobách možno použiť aj menšie objemy média, a to najmä v prípade menších dafnií, napr. druhu Ceriodaphnia dubia), pokiaľ na testovanie nie je potrebný prietokový model testu.
                     Z hľadiska uspokojenia požiadaviek analytického postupu použitého na stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie možno niekedy budú musieť byť potrebné väčšie objemy, hoci na účely chemickej analýzy je prípustné aj združenie replikátov. Ak sa použijú objemy väčšie ako 100 ml, možno bude treba zvýšiť dávkovanie potravy s cieľom zabezpečiť dafniám primeranú dostupnosť potravy a súlad s validačnými kritériami.
                     
                        Testované jedince
                     
                     V rámci polostatického testu sa pri každej testovanej koncentrácii používa najmenej 10 jednotlivo držaných jedincov a v kontrolných sériách najmenej 10 jednotlivo držaných jedincov.
                     Ukázalo sa, že v prípade prietokových testov je vhodné 40 jedincov rozdeliť do štyroch skupín po 10 na každú testovanú koncentráciu (1). Môže sa použiť aj menší počet jedincov, pričom sa odporúča minimálne 20 jedincov na koncentráciu rozdelených do dvoch alebo viacerých replikátov s rovnakým počtom jedincov (napr. štyri replikáty, každý s piatimi dafniami). Pripomíname, že v rámci testov, pri ktorých sú jedince umiestnené v skupinách, nebude možné zo štatistickej analýzy vylúčiť žiadne potomstvo v prípade mimovoľnej alebo náhodnej rodičovskej úmrtnosti, keď sa už začala reprodukcia, a preto by sa v týchto prípadoch mal reprodukčný výstup vyjadriť ako celkový počet žijúcich potomkov vyprodukovaných na rodiča, ktorý bol prítomný na začiatku testu.
                     Priradenie ovplyvňovaných skupín testovacím nádobám a všetky nasledujúce činnosti by sa mali uskutočňovať v náhodnom slede. Ak by sa takto nepostupovalo, prípadná zaujatosť by sa dala interpretovať ako účinok koncentrácie. Najmä vtedy, ak sa s experimentálnymi jednotkami zaobchádza v poradí podľa ovplyvňovania alebo koncentrácie, mohlo by v dôsledku niektorých časovo závislých účinkov, akými sú únava obsluhy alebo iná chyba, dôjsť pri vyšších koncentráciách k výraznejším účinkom. Okrem toho, ak existuje pravdepodobnosť, že počiatočné alebo environmentálne podmienky testu (napr. umiestnenie v laboratóriu) môžu ovplyvniť výsledky testu, potom by sa malo zvážiť blokové usporiadanie testu.
                     
                        Kŕmenie
                     
                     Pri polostatickom teste by sa kŕmenie malo podľa možnosti vykonávať denne, najmenej však trikrát za týždeň (napr. čo zodpovedá výmenám média). Prihliadať by sa malo na možné riedenie expozičných koncentrácií pridaním potravy, pričom by sa mu malo v maximálnej možnej miere zabrániť prostredníctvom dostatočne koncentrovanej suspenzie rias. Odchýlky od tohto stavu by sa mali zaznamenávať (napr. pri prietokových testoch).
                     Počas testu by mala potrava rodičovských jedincov pozostávať zo živých buniek rias týchto druhov: Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata (predtým Selenastrum capricornutum) a Desmodesmus subspicatus (predtým Scenedesmus subspicatus). Množstvo podávanej potravy by malo vychádzať z množstva organického uhlíka (C) dodaného každému rodičovskému jedincovi. Z výskumu (14) vyplýva, že pokiaľ ide o Daphnia magna, úrovne dávok v rozmedzí 0,1 až 0,2 mg C/dafnia/deň postačujú na dosiahnutie požadovaného množstva živého potomstva, čím sa zabezpečuje splnenie validačných kritérií testu. Danú dávku potravy možno podávať buď počas celého trvania testu v konštantnej miere, alebo si možno zvoliť podávanie potravy v nižšej miere a počas testu túto mieru zvyšovať v záujme zohľadnenia rastu rodičovských jedincov. Aj v tomto prípade by mala daná dávka potravy po celý čas zostať v odporúčanom rozpätí 0,1 až 0,2 mg C/dafnia/deň.
                     Ak sa na účely stanovenia požadovanej úrovne dávky potravy použijú náhradné merania, ako napr. počet buniek rias alebo absorbcia svetla (t. j. z dôvodov praktickosti, pretože meranie obsahu uhlíka je časovo náročné), každé laboratórium by si malo vytvoriť svoj vlastný nomogram súvisiaci s náhradným meraním týkajúcim sa obsahu uhlíka dotknutej kultúry rias (rady týkajúce sa tvorby nomogramov sa uvádzajú v dodatku 3). Nomogram by sa mal kontrolovať najmenej raz do roka a v prípade zmien podmienok týkajúcich sa danej kultúry rias aj častejšie. Zistilo sa, že absorpcia svetla je v porovnaní s počtom buniek vhodnejší náhradný parameter, pokiaľ ide o obsah uhlíka (15).
                     Dafniám by sa mala podávať koncentrovaná suspenzia rias, aby sa minimalizoval objem média s kultúrou rias prenášaného do testovacích nádob. Koncentrovanie rias možno dosiahnuť odstreďovaním v centrifúge, po ktorom nasleduje opätovná suspenzácia v médiu s kultúrou dafnií.
                     
                        Svetlo
                     
                     Svetelné pôsobenie v trvaní 16 hodín s intenzitou nepresahujúcou 15 až 20 μE · m– 2 · s– 1 meranou na hladine vody v nádobe. V prípade prístrojov na meranie svetla, ktoré sú kalibrované v luxoch, rozmedzie 1 000 až 1 500 luxov pre studené biele svetlo takmer zodpovedá odporúčanej intenzite svetla 15 až 120 μE·m– 2 · s– 1.
                     
                        Teplota
                     
                     Teplota testovacieho média by sa mala pohybovať v rozmedzí 18 až 22 °C. Podľa možnosti by sa však v prípade ani jedného testu nemala daná teplota líšiť viac ako o 2 °C v rámci týchto hraničných hodnôt (t. j. 18 až 20, 19 až 21 alebo 20 až 22 °C), ktoré predstavujú denné rozpätie. Možno bude na účely monitorovania teploty vhodné použiť ďalšiu testovaciu nádobu.
                     
                        Prevzdušňovanie
                     
                     Testovacie nádoby by sa počas testu nemali prevzdušňovať.
                     
                        Plán testu
                     
                     
                        Test na zistenie rozsahu
                     
                     V prípade potreby sa vykoná test na zistenie rozsahu, napríklad s piatimi koncentráciami testovanej chemikálie a dvoma replikátmi na každú expozíciu a kontrolu. Pri rozhodovaní o rozsahu koncentrácií, ktoré sa majú použiť na test na zisťovanie rozsahu, môžu byť užitočné aj dodatočné informácie o akútnej toxicite týkajúcej sa druhu Daphnia a/alebo iných vodných organizmov, ktoré vyplývajú z testov s podobnými chemikáliami alebo z literatúry.
                     Test na zistenie rozsahu trvá 21 dní alebo dostatočný čas, v priebehu ktorého možno spoľahlivo predpovedať úrovne účinkov. Na konci testu sa posudzuje reprodukcia dafnií. Mal by sa zaznamenať počet rodičovských jedincov a výskyt potomstva.
                     
                        Hlavný test
                     
                     Zvyčajne by malo byť k dispozícii aspoň päť testovaných koncentrácií vrátane účinnej koncentrácie (napr. e.g. ECx), ktoré by mali byť zoradené do geometrických sérií so separačným faktorom, ktorý podľa možnosti nepresahuje hodnotu 3,2. Na každú testovanú koncentráciu by sa mal používať vhodný počet replikátov (pozri body 24 – 25). Ak sa použije menej ako päť koncentrácií, je potrebné uviesť zdôvodnenie. V testovacom médiu by sa chemikálie nemali testovať nad hranicou ich maximálnej rozpustnosti. Pred vykonaním testu sa odporúča zvážiť štatistickú silu daného plánu testu a použitie vhodných štatistických metód (4). Pri stanovovaní rozsahu koncentrácií treba mať na pamäti:
                     
                                 i)
                              
                              
                                 Pri odhade ECx v súvislosti s účinkami na reprodukciu je vhodné použiť dostatočné koncentrácie s cieľom stanoviť ECx s vhodnou úrovňou spoľahlivosti. Použité testované koncentrácie by mali prednostne zahŕňať hodnotu ECx, aby sa táto hodnotax zistila na základe interpolácie, a nie extrapolácie. Výhodou ďalej uvedených štatistických analýz je skutočnosť, že sa v nich vyskytuje viacero testovaných koncentrácií (napr. 10), menší počet replikátov každej koncentrácie (napr. 5, vďaka čomu sa celkový počet nádob udržiava na konštantnej úrovni) a 10 kontrol.
                              
                           
                                 ii)
                              
                              
                                 Pri odhade LOEC a/alebo NOEC by mala mať najnižšia testovaná koncentrácia natoľko nízku úroveň, aby reprodukčný výstup pri danej koncentrácii nebol výrazne nižší ako výstup z kontroly. Ak to tak nie je, test by sa mal zopakovať so zníženou najnižšou koncentráciou.
                              
                           
                                 iii)
                              
                              
                                 Pri odhade LOEC a/alebo NOEC by mala mať najvyššia testovaná koncentrácia natoľko vysokú úroveň, aby reprodukčný výstup pri danej koncentrácii bol výrazne nižší ako výstup z kontroly. Ak to tak nie je, test by sa mal zopakovať so zvýšenou najvyššou koncentráciou, pokiaľ sa ako najvyššia testovaná koncentrácia v úvodnom teste nepoužila maximálna požadovaná testovaná koncentrácia pre testovanie chronických účinkov (t. j. 10 mg/l).
                              
                           Ak sa v rámci testu na zistenie rozsahu pri najvyššej koncentrácii (napr. pri 10 mg/l) nepozorujú žiadne účinky, alebo ak je vysoko pravdepodobné, že testovaná chemikália bude vykazovať nízku/žiadnu toxicitu vzhľadom na absenciu toxicity vo vzťahu k iným organizmom a/alebo bude vykazovať nízke/žiadne vychytávanie, reprodukčný test možno vykonať ako limitný test s použitím testovanej koncentrácie, a to napr. 10 mg/l, ako aj kontroly. Na účely testovanej, ako aj ovplyvňovanej skupiny, by sa malo použiť desať replikátov. V prípade potenciálnej potreby vykonať limitný test v prietokovom systéme je vhodné použiť menej replikátov. Vďaka limitnému testu sa preukáže, že pri koncentračnom limite nedochádza k žiadnemu štatisticky významnému účinku, no ak dôjde k zaznamenaniu účinkov, zvyčajne je potrebné vykonať úplný test.
                     
                        Kontroly
                     
                     Okrem testovanej série by sa mala zrealizovať jedna kontrolná séria s testovacím médiom a v prípade relevantnosti aj jedna kontrolná séria obsahujúca rozpúšťadlo alebo dispergujúcu látku. V prípade použitia rozpúšťadla alebo dispergujúcej látky by ich koncentrácia mala byť rovnaká ako koncentrácia použitá v nádobách obsahujúcich testovanú chemikáliu. Mal by sa použiť náležitý počet replikátov (pozri body 23 – 24.).
                     Ak sa test realizuje správne, variačný koeficient v blízkosti priemerného počtu žijúcich potomkov vyprodukovaných na jedného rodičovského jedinca v kontrolnej vzorke(-ách) by mal byť ≤ 25 %, pričom by sa mal zaznamenať na účely testovacích plánov, v ktorých sa používajú samostatne držané jedince.
                     
                        Obnova testovacieho média
                     
                     Frekvencia obnovy testovacieho média závisí od stability testovanej chemikálie, mala by sa však uskutočňovať najmenej trikrát za týždeň. Ak je z predbežných testov stability (pozri bod 7) zrejmé, že počas maximálneho obdobia obnovy (t. j. troch dní) je koncentrácia testovanej chemikálie nestabilná (t. j. jej hodnota sa pohybuje mimo rozpätia 80 – 120 % nominálnej hodnoty počiatočnej nameranej koncentrácie alebo klesne pod 80 % tejto koncentrácie), mala by sa zvážiť možnosť častejšej obnovy média alebo použitia prietokového testu.
                     Ak sa pri polostatických testoch realizuje obnova média, pripraví sa druhá séria testovacích nádob, do ktorých sa (napríklad sklenou pipetou s vhodným priemerom) prenesú rodičovské jedince. Objem média preneseného s dafniami by sa mal minimalizovať.
                     
                        Pozorovania
                     
                     Výsledky pozorovaní vykonaných počas testu by sa mali zaznamenať do tabuliek (pozri príklady v dodatkoch 4 a 5). V prípade potreby ďalších meraní (pozri bod 44) sa môžu vyžadovať dodatočné pozorovania.
                     
                        Potomstvo
                     
                     Potomstvo vyprodukované každým rodičovským jedincom by sa malo podľa možnosti odobrať a denne spočítať, a to od výskytu prvého potomka, s cieľom zabrániť potomkom konzumovať potravu určenú pre rodičovského jedinca. Na účel tejto metódy je potrebné zrátať iba počet žijúcich potomkov, zaznamenať však treba aj výskyt nevyliahnutých vajíčok alebo uhynutých potomkov.
                     
                        Úmrtnosť
                     
                     Úmrtnosť u rodičovských jedincov by sa mala zaznamenávať podľa možnosti denne alebo aspoň tak často, ako sa počíta potomstvo.
                     
                        Ďalšie parametre
                     
                     Hoci účelom tejto metódy je v prvom rade posudzovanie účinkov na reprodukčný výstup, možno prostredníctvom nej dostatočne kvantifikovať aj iné účinky, čo poslúži pri štatistickej analýze. Zaznamenávať možno reprodukčný výstup na rodičovského jedinca, ktorý prežil, t. j. počet žijúcich potomkov vyprodukovaných počas testu na preživšieho rodičovského jedinca. Táto hodnota sa môže porovnať s hlavnou závisle premennou (na začiatku testu zmeraný reprodukčný výstup rodičovského jedinca, ktorý počas testu mimovoľne alebo náhodne neuhynul). Ak sa u replikátov vystavených účinkom chemikálie vyskytne rodičovská úmrtnosť, malo by sa zvážiť, či v prípade danej úmrtnosti ide o zvyčajnú reakciu na koncentráciu, napr. v prípade významnej regresie reakcie na koncentráciu testovanej chemikálie s pozitívnym sklonom (na tento účel možno použiť štatistický test ako Cochranov a Armitageov testu trendu). Ak úmrtnosť nie je reakciou na koncentráciu, potom by sa dané replikáty s rodičovskou úmrtnosťou mali z výsledkov testu vylúčiť. Ak úmrtnosť je reakciou na koncentráciu, rodičovská úmrtnosť by sa mala pripísať účinku testovanej chemikálie a replikáty by sa nemali z analýzy výsledku testu vylúčiť. Mimoriadne žiaduce sú merania rastu, keďže prinášajú informácie o možných subletálnych účinkoch, ktoré možno potenciálne využiť popri samotných reprodukčných meraniach; na konci testu sa odporúča meranie dĺžky rodičovských jedincov (t. j. dĺžky tela bez análnej plutvy). Medzi ďalšie merateľné alebo vypočítateľné parametre patrí čas, dokedy sa nenarodí prvé potomstvo (a nasledujúce potomstvá), počet a veľkosť potomstiev na jedinca, počet nevyliahnutých vajíčok, výskyt novonarodených jedincov samčieho pohlavia (OECD 2008) alebo efípií a prípadne inherentný pomer populačného rastu (pozri definície v dodatku 1 a dodatku 7 pre určenie pohlavia novonarodených jedincov).
                     
                        Frekvencia analytických stanovovaní a meraní
                     
                     Koncentrácia kyslíka, teplota, tvrdosť vody a hodnoty pH by sa mali merať aspoň raz týždene v čerstvom, ako aj starom médiu, v kontrole(-ách) a pri najvyššej koncentrácii testovanej chemikálie.
                     Počas testu sa v pravidelných intervaloch stanovujú koncentrácie testovanej chemikálie.
                     Pri polostatických testoch, kde sa očakáva, že koncentrácia testovanej chemikálie zostane v rozmedzí ± 20 % nominálnej hodnoty (t. j. v rozsahu 80 až 120 %, pozri body 6, 7 a 39), sa odporúča, aby sa analyzovala aspoň najvyššia a najnižšia testovaná koncentrácia, teda v momente, keď sa daná chemikália práve pripraví a v čase jej obnovy, a to v priebehu prvého týždňa testu (t. j. analýzy by sa mali vykonať na vzorke z rovnakého roztoku – v čase, keď je čerstvo pripravený a v čase jeho obnovy.) Tieto stanovenia by sa potom mali opakovať aspoň v týždňových intervaloch.
                     V prípade testov, kde sa neočakáva, že koncentrácia testovanej chemikálie zostane v rozmedzí ± 20 % nominálnej hodnoty, je potrebné analyzovať všetky testované koncentrácie, a to v čase, keď sa chemikália čerstvo pripraví a v čase jej obnovy. No v prípade testov, kde meraná počiatočná koncentrácia testovanej chemikálie síce nie je v rozmedzí ± 20 % nominálnej hodnoty, avšak možno dostatočne preukázať, že počiatočné koncentrácie sú opakovateľné a stabilné (t. j. v rozsahu 80 až 120 % počiatočnej koncentrácie), by sa chemické stanovenia mohli znížiť v priebehu testovacích týždňov 2 a 3 na roztoky s najvyššou a najnižšou testovanou koncentráciou. Koncentrácie testovanej chemikálie pred obnovou je v každom prípade potrebné stanoviť len v jednej replikačnej nádobe pri každej testovanej koncentrácii.
                     V prípade použitia prietokového testu je vhodné uplatniť podobný režim odberu vzoriek, ako je režim opísaný pri polostatickom teste (meranie týkajúce sa „starých“ roztokov sa však v tomto prípade neuplatňuje). V záujme zachovania stability testovaných koncentrácií však možno odporučiť, aby sa počas prvého týždňa zvýšil počet odberov (napríklad 3 série meraní). Pri týchto typoch testov by sa mal denne kontrolovať prietok riedidla a testovanej chemikálie.
                     Ak existujú dôkazy o tom, že sa počas testu zachovala uspokojivá koncentrácia testovanej chemikálie v rozmedzí ± 20 % nominálnej koncentrácie alebo počiatočnej meranej koncentrácie, potom výsledky môžu vychádzať z nominálnych hodnôt alebo z počiatočných nameraných hodnôt. Ak je odchýlka od nominálnej alebo nameranej počiatočnej koncentrácie väčšia ako ± 20 percent, výsledky by sa mali vyjadriť ako časovo vážený priemer (pozri usmernenia pre výpočet v dodatku 6).
                     ÚDAJE A PREZENTÁCIA VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     Cieľom tohto testu je stanoviť účinok testovanej chemikálie na reprodukčný výstup. Na každú testovaciu nádobu (t. j. replikát) by sa mal vypočítať celkový počet živých potomkov na rodičovského jedinca. Okrem toho možno vypočítať úroveň reprodukcie na základe produkcie živého potomstva na rodičovského jedinca, ktorý prežil. Ekologicky najvýznamnejšou závisle premennou je však celkový počet živého potomstva vyprodukovaného rodičovským jedincom, ktorý počas testu náhodne (96) alebo mimovoľne (97) neuhynul. Ak počas testu dôjde k náhodnému alebo mimovoľnému úhynu rodičovského jedinca, alebo vysvitne, že ide o jedinca mužského pohlavia, potom sa replikát vylúči z analýzy. Pri analýze sa potom bude vychádzať zo zníženého počtu replikátov. Ak sa u replikátov vystavených účinkom chemikálie vyskytne rodičovská úmrtnosť, malo by sa zvážiť, či v prípade danej úmrtnosti ide o zvyčajnú reakciu na koncentráciu, napr. v prípade významnej regresie reakcie na koncentráciu testovanej chemikálie s pozitívnym sklonom (na tento účel možno použiť štatistický test ako Cochranov a Armitageov testu trendu). Ak úmrtnosť nie je reakciou na koncentráciu, potom by sa dané replikáty s rodičovskou úmrtnosťou mali z výsledkov testu vylúčiť. Ak úmrtnosť je reakciou na koncentráciu, rodičovská úmrtnosť by sa mala pripísať účinku testovanej chemikálie a replikáty by sa nemali z analýzy výsledku testu vylúčiť.
                     Možno teda konštatovať, že ak sa na vyjadrenie daných účinkov využívajú hodnoty LOEC a NOEC alebo ECx, pri výpočte účinku na reprodukciu sa odporúča použiť obe uvedené závisle premenné, t. j.
                     
                                 —
                              
                              
                                 celkový počet živého potomstva vyprodukovaného rodičovským jedincom, ktorý počas testu náhodne alebo mimovoľne neuhynul, a
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 počet žijúceho potomstva vyprodukovaného na preživšieho rodičovského jedinca;
                              
                           a potom použiť ako konečný výsledok najnižšiu hodnotu LOEC a NOEC alebo ECx vypočítanú pomocou ktorejkoľvek z týchto dvoch závisle premenných.
                     Pred použitím štatistickej analýzy, napríklad postupov ANOVA, porovnania ovplyvňovaných skupín s kontrolnou skupinou formou Studentovho t-testu, Dunnettovho testu, Williamsovho testu alebo Jonckheereovho-Terpstrovho zostupného testu sa odporúča, aby sa v záujme splnenia požiadaviek daného štatistického testu v prípade potreby zvážila transformácia údajov. Za neparametrické alternatívy možno považovať Dunnovej test alebo Mannov a Whitneyho test. V prípade priemerných hodnôt jednotlivých ovplyvňovaní sa vypočítajú 95 % intervaly spoľahlivosti.
                     Jedným z validačných kritérií, ktoré by sa malo dokumentovať a zaznamenávať, je počet rodičovských jedincov, ktorí prežili, v neovplyvňovaných kontrolných skupinách. V záverečnej správe by mali byť zaznamenané aj všetky ďalšie škodlivé účinky, napr. abnormálne správanie a toxikologicky významné zistenia.
                     
                        ECx
                        
                     
                     Hodnoty ECx vrátane ich príslušných dolných a horných hraníc spoľahlivosti sa vypočítajú pomocou vhodných štatistických metód (napr. metódy logistickej alebo Weibullovej funkcie, Spearman-Karberovej metódy s orezanými údajmi alebo metódy jednoduchej interpolácie). Na účely výpočtu hodnoty EC10, EC50 alebo akejkoľvek inej hodnoty ECx, by sa mal kompletný súbor údajov podrobiť regresnej analýze.
                     
                        NOEC/LOEC
                     
                     Ak je cieľom štatistickej analýzy určenie hodnoty NOEC/LOEC, na daný účel by sa mali uplatniť vhodné štatistické metódy podľa dokumentu OECD č. 54 o súčasných prístupoch k štatistickej analýze údajov o ekotoxicite: usmernenie týkajúce sa uplatňovania (4). Vo všeobecnosti sa nepriaznivé účinky testovanej chemikálie v porovnaní s kontrolnou skupinou analyzujú pomocou jednostranného testu hypotézy s p ≤ 0,05.
                     Normálnu distribúciu a homogenitu rozptylu možno otestovať pomocou vhodného štatistického testu, napr. Shapiro-Wilkovho testu, resp. Leveneho testu (p ≤ 0,05). Môže sa vykonať jednosmerná analýza ANOVA a následný viacnásobný porovnávací test. Na výpočet významných rozdielov (p ≤ 0,05) medzi kontrolnými skupinami a rôznymi koncentráciami testovanej chemikálie, ak existujú, sa môžu použiť viacnásobné porovnávania (napr. Dunnettov test) alebo zostupné testovania trendov (napr. Williamsov test alebo Jonckheereov-Terpstrov zostupný test) [výber odporúčaného testu podľa usmerňovacieho dokumentu OECD 54 (4)]. Inak možno na stanovenie hodnôt NOEC a LOEC použiť neparametrické metódy (napr. Bonferroniho U-test podľa Holma alebo Jonckheereov-Terpstrov test trendov).
                     
                        Limitný test
                     
                     Ak sa vykonal limitný test (porovnanie kontroly a len jednej ovplyvňovanej skupiny) a boli splnené predpoklady parametrických testovacích postupov (normalita, homogenita), metrické reakcie možno vyhodnotiť pomocou Studentovho testu (t-testu). Ak tieto podmienky nie sú splnené, možno použiť t-test s nerovnomerným rozptylom (napr. Welchov test) alebo neparametrický test, napríklad Mannov a Whitneyho U-test.
                     Na stanovenie významných rozdielov medzi kontrolnými skupinami (kontrolná skupina a kontrolná skupina s rozpúšťadlom alebo dispergujúcou látkou) možno replikáty z každej kontrolnej skupiny otestovať podľa opisu pre limitný test. Ak sa v týchto testoch nezistia významné rozdiely, všetky replikáty kontrolnej skupiny a kontrolnej skupiny s rozpúšťadlom možno spojiť. V opačnom prípade by sa všetky ovplyvňované skupiny mali porovnať s kontrolnou skupinou s rozpúšťadlom.
                     
                        Skúšobný protokol
                     
                     Skúšobný protokol musí obsahovať tieto informácie:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             fyzikálny charakter a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             identifikačné údaje chemikálie vrátane čistoty.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovaný druh:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             klon (či bol geneticky typizovaný), dodávateľ alebo zdroj (ak je známy) a použité kultivačné podmienky. Použitie iného druhu ako Daphnia magna by sa malo zaznamenať a odôvodniť.
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Testovacie podmienky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             použitý testovací postup (t. j. polostatický test alebo prietokový test, objem, nasádzanie dafnií – počet na liter),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             fotoperióda a intenzita svetla,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             plán testu (napr. počet replikátov, počet rodičovských jedincov na replikát),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné informácie o použitom rastovom médiu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade použitia ďalšieho organického materiálu – údaje o zložení, zdroji, spôsobe prípravy, TOC/COD v zásobných roztokoch, odhad výslednej hodnoty TOC/COD v testovacom médiu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podrobné informácie o kŕmení vrátane množstva (v mg C/dafnia/deň) a o harmonograme, napr. druh potravy vrátane, pokiaľ ide o riasy, špecifického názvu (druhu) a kmeňa (ak je známy) a kultivačných podmienok),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             metóda prípravy zásobných roztokov a frekvencia obnovy (v prípade použitia treba uviesť rozpúšťadlo alebo dispergujúcu látku).
                                          
                                       
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Výsledky:
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             výsledky z predbežných štúdií stability testovanej chemikálie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             nominálne testované koncentrácie a výsledky všetkých analýz s cieľom stanoviť koncentráciu testovanej chemikálie v testovacích nádobách (pozri príklad tabuľku v dodatku 5); mala by sa zaznamenať aj miera výťažnosti a kvantifikačný limit,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             kvalita vody v testovacích nádobách (t. j. pH, teplota a koncentrácia rozpusteného kyslíka a TOC a/alebo COD a podľa potreby aj tvrdosť) (pozri príklad tabuľky v dodatku 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             úplná evidencia o počte živých potomkov vyprodukovaných na jedného rodičovského jedinca počas testu (pozri príklad tabuľky v dodatku 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet prípadov úhynu v prípade rodičovských jedincov a deň, keď došlo k uhynutiu (pozri príklad tabuľky v dodatku 4);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             variačný koeficient týkajúci sa kontroly reprodukčného výstupu (na základe celkového počtu žijúcich potomkov na živého rodičovského jedinca na konci testu);
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             graf znázorňujúci závislosť celkového počtu živých potomkov vyprodukovaných na rodičovského jedinca v každom replikáte okrem rodičovských jedincov, pri ktorých existuje pravdepodobnosť, že počas testu náhodne alebo mimovoľne uhynuli, od koncentrácie testovanej chemikálie;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             podľa potreby graf znázorňujúci závislosť celkového počtu živých potomkov vyprodukovaných na rodičovského jedinca, ktorý prežil, v každom replikáte, od koncentrácie testovanej chemikálie;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade potreby najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) pre reprodukciu vrátane opisu používaných štatistických postupov s uvedením, aký rozsah zisteného účinku možno očakávať (ešte pred začatím experimentu sa môže na tento účel vykonať analýza sily), a koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC) pre reprodukciu; informácie o tom, ktorá závisle premenná sa použila na výpočet LOEC a NOEC (buď ako celkový počet živých potomkov na materský organizmus, ktorý počas testu náhodne alebo mimovoľne neuhynuli, alebo ako celkový počet žijúcich potomkov na preživší materský organizmus) a v prípade potreby by sa mali zaznamenať aj LOEC alebo NOEC týkajúce sa úmrtnosti rodičovských jedincov;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             v prípade potreby hodnota ECx týkajúca sa reprodukcie a intervaly spoľahlivosti (napr. 90 % alebo 95 %) a graf vhodného modelu použitého na výpočet, sklon krivky znázorňujúcej závislosť reakcie od koncentrácie s ňou súvisiaca štandardná chyba;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             ďalšie pozorované biologické účinky alebo merania: treba zaznamenať všetky ďalšie biologické pozorované alebo merané účinky (napr. rast rodičovských jedincov) vrátane každého primeraného odôvodnenia;
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vysvetlenie pri všetkých odchýlkach od testovacej metódy.
                                          
                                       
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD Test Guidelines Programme. Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, U.K., 20-21 March 1993.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 OECD (1997). Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.6. OECD, Paris.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 OECD (2008). Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, No.88. OECD, Paris.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment Number 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Straus. Ecotox. and Environ. Safety, 21, 257-265.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Elendt, B.-P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 EPA (2002). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Edition. EPA/821/R-02/012. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Washington, DC. www.epa.gov/waterscience/methods
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Vigano, L. (1991). Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, 775-782.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 ASTM. (2008) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians. In: Annual Book of ASTM Standards; Water and Environmental Technology, vol. 11.04; ASTM E729 – 96 (2007) American Society for Testing and Materials, Philadelphia, PA
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Baird, D.J., et al. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988. (H. Løkke, H. Tyle and F. Bro-Rasmussen. Eds.) p. 144-148.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Parkhurst, B.R., J.L Forte. And G.P. and Wright (1981) Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26: 1-8.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Cowgill, U.M. and Milazzo, D.P. (1990). The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2): 185-196.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. OECD, Paris.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Sims, I.R., S. Watson. and D. Holmes (1993) Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environ. Toxicol. and Chem., 12, 2053-2058.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Sims, I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        Na účely tejto testovacej metódy sa používajú tieto definície:
                        
                           
                              Náhodná úmrtnosť
                           : úmrtnosť, ktorá nesúvisí s pôsobením chemikálie, ale ku ktorej došlo v dôsledku náhodnej udalosti (t. j. príčina je známa).
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              ECx
                           : koncentrácia testovanej chemikálie rozpustenej vo vode, ktorá spôsobí x % zníženie reprodukcie dafnií v rámci vymedzenej dĺžky expozície.
                        
                           
                              Mimovoľná úmrtnosť
                           : úmrtnosť bez známej príčiny, ktorá nesúvisí s pôsobením chemikálie.
                        
                           
                              Inherentná rýchlosť rastu populácie
                           : meranie rastu populácie, ktoré zahŕňa reprodukčný výstup a úmrtnosť špecifickú pre isté obdobie života (1), (2), (3). V prípade populácií v ustálenom stave sa rovná nule. V prípade rastúcich populácií pôjde o kladnú a v prípade zmenšujúcich sa populácií o zápornú hodnotu. Zmenšujúca sa populácia je samozrejme neudržateľná a napokon povedie k vyhynutiu jedincov.
                        
                           
                              Detekčný limit
                           : najnižšia detegovateľná, nie však kvantifikovateľná koncentrácia.
                        
                           
                              Kvantifikačný limit
                           : najnižšia koncentrácia, ktorú možno kvantitatívne zmerať.
                        
                           
                              Najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC)
                           : najnižšia testovaná koncentrácia nameraná v rámci danej dĺžky expozície, pri ktorej sa pozoruje, že chemikália má štatisticky významný účinok na reprodukciu a rodičovskú úmrtnosť (pri p < 0,05) pri porovnaní s kontrolou. Škodlivý účinok všetkých testovaných koncentrácií nad úrovňou LOEC by však mal byť rovnaký alebo väčší ako účinky pozorované pri LOEC. Ak tieto dve podmienky nie sú splnené, je potrebné poskytnúť úplné vysvetlenie, akým spôsobom sa zvolila LOEC (a teda aj NOEC).
                        
                           
                              Úmrtnosť
                           : jedinec sa zaznamená ako uhynutý, keď sa nepohybuje, napr. keď nie je schopný plávať alebo ak sa nepozoruje žiadny pohyb končatín alebo postabdomenu do 15 sekúnd po jemnom potrasení testovacej nádoby. (Ak sa použije iná definícia, mala by sa uviesť spolu s odkazom na ňu.)
                        
                           
                              Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC)
                           : testovaná koncentrácia nameraná v rámci danej dĺžky expozície bezprostredne pod úrovňou LOEC, ktorá pri porovnaní s kontrolou nemá štatisticky významný účinok (p < 0,05).
                        
                           
                              Potomstvo
                           : mladé dafnie vyprodukované rodičovskými jedincami v priebehu testu.
                        
                           
                              Rodičovské jedince
                           : samice dafnií prítomné na začiatku testu, ktorých reprodukčný výstup je predmetom štúdie.
                        
                           
                              Reprodukčný výstup
                           : počet žijúcich potomkov vyprodukovaných na rodičovského jedinca v testovacom období
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : každá látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                        LITERATÚRA
                        
                                    1.
                                 
                                 
                                    Wilson, E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
                                 
                              
                                    2.
                                 
                                 
                                    Poole, R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York, p. 532.
                                 
                              
                                    3.
                                 
                                 
                                    Meyer, J. S., Ingersoll, C. G., McDonald, L.L. and Boyce, M.S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156-1166.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 2
                        
                           PRÍPRAVA PLNE DEFINOVANÝCH ELENDTOVÝCH MÉDIÍ M7 A M4
                        
                        
                           Aklimatizácia na Elendtove médiá M7 a M4
                        
                        V niektorých laboratóriách sa zaznamenali ťažkosti pri priamom prenose dafnií do médií M4 (1) a M7. Na druhej strane sa však dosiahol určitý úspech s postupnou aklimatizáciou, t. j. prenosom z vlastného média do 30 % Elendtovho média, potom do 60 % Elendtovho média a následne do 100 % Elendtovho média. Dĺžka aklimatizačného obdobia môže dosiahnuť až jeden mesiac.
                        
                           Príprava
                        
                        
                           Stopové prvky
                        
                        Vo vode vykazujúcej vhodnú čistotu, napríklad v deionizovanej, destilovanej, prípadne vo vode získanej reverznou osmózou, sa najprv pripravia samostatné zásobné roztoky (I) jednotlivých stopových prvkov. Z týchto rôznych zásobných roztokov (I) sa pripraví druhý osobitný zásobný roztok (II), ktorý obsahuje všetky stopové prvky (kombinovaný roztok), t. j.:
                        
                                    Zásobný roztok (roztoky) I
                                    (jedna látka)
                                 
                                 
                                    Množstvo pridané do vody
                                 
                                 
                                    Koncentrácia (vzhľadom na médium M4)
                                 
                                 
                                    Na prípravu kombinovaného zásobného roztoku II pridajte do vody toto množstvo zásobného roztoku I
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    57 190 
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    MnCl2 · 4 H2O
                                 
                                 
                                    7 210 
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    LiCl
                                 
                                 
                                    6 120 
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    RbCl
                                 
                                 
                                    1 420 
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    SrCl2 · 6 H2O
                                 
                                 
                                    3040
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    NaBr
                                 
                                 
                                    320
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    Mo Na2O4 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    1260
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    CuCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    335
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    0,25
                                 
                              
                                    ZnCl2
                                    
                                 
                                 
                                    260
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    CoCl2 · 6 H2O
                                 
                                 
                                    200
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    KI
                                 
                                 
                                    65
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SeO3
                                    
                                 
                                 
                                    43,8
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    NH4VO3
                                    
                                 
                                 
                                    11,5
                                 
                                 
                                    20 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2EDTA · 2 H2O
                                 
                                 
                                    5 000 
                                 
                                 
                                    2 000 -násobná
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    FeSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    1 991 
                                 
                                 
                                    2 000 -násobná
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    —
                                 
                              
                                    Roztok Na2EDTA, ako aj roztok FeSO4, sa pripravia samostatne, zlejú sa spolu a ihneď sa ošetria v autokláve. Týmto sa získa:
                                 
                              
                                    roztok Fe-EDTA
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    1 000 -násobná
                                 
                                 
                                    20,0
                                 
                                 
                                    5,0
                                 
                              
                           Médiá M4 a M7
                        
                        Médiá M4 a M7 sa pripravia pomocou zásobného roztoku II, makroživín a vitamínov takto:
                        
                                     
                                 
                                 
                                    Množstvo pridané do vody
                                 
                                 
                                    Koncentrácia (vzhľadom na médium M4)
                                 
                                 
                                    Množstvo zásobného roztoku pridané na účely prípravy média
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    ml/l
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    M 4
                                 
                                 
                                    M 7
                                 
                              
                                    zásobný roztok II
                                    (kombinované stopové prvky)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20-násobná
                                 
                                 
                                    50
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    zásobné roztoky s obsahom makroživín (jedna látka)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    293 800 
                                 
                                 
                                    1 000 -násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    246 600 
                                 
                                 
                                    2 000 -násobná
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                                 
                                    0,5
                                 
                              
                                    KCl
                                 
                                 
                                    58 000 
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    64 800 
                                 
                                 
                                    1000-násobná
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                                 
                                    1,0
                                 
                              
                                    Na2SiO3 · 9 H2O
                                 
                                 
                                    50 000 
                                 
                                 
                                    5000-násobná
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                                 
                                    0,2
                                 
                              
                                    NaNO3
                                    
                                 
                                 
                                    2740
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    1430
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    K2HPO4
                                    
                                 
                                 
                                    1840
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    zásobný roztok s obsahom viacerých vitamínov
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                                 
                                    0,1
                                 
                              
                                    zásobný roztok s obsahom viacerých vitamínov sa pripraví pridaním 3 vitamínov do 1 litra vody týmto spôsobom:
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    mg/l
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    hydrochlorid tiamínu
                                 
                                 
                                    750
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    kyanokobalamín (B12)
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    biotín
                                 
                                 
                                    7,5
                                 
                                 
                                    10 000 -násobná
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              Zásobný roztok s obsahom viacerých vitamínov sa skladuje zmrazený v malých alikvótnych množstvách. Vitamíny sa pridávajú do média tesne pred použitím.
                        
                                    
                                       Poznámka:
                                    
                                 
                                 
                                    Zrážaniu solí pri príprave kompletného média sa zabráni pridaním alikvotných množstiev zásobných roztokov do približne 500 až 800 ml deionizovanej vody a potom sa objem doplní na 1 liter.
                                 
                              
                                    
                                       Doplňujúca poznámka:
                                    
                                 
                                 
                                    Prvýkrát boli informácie o médiu M4 uverejnené v publikácii Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           ANALÝZA OBSAHU CELKOVÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKA (TOC) A PRÍPRAVA NOMOGRAMU NA ZISTENIE OBSAHU TOC V KRMIVE S OBSAHOM RIAS
                        
                        Akceptuje sa skutočnosť, že obsah uhlíka v krmive s obsahom rias sa spravidla nemeria priamo, ale na základe korelácií (t. j. nomogramov) s náhradnými meraniami, akými je napr. počet buniek rias alebo absorpcia svetla).
                        TOC by sa mal merať na základe oxidácie pri vysokej teplote, a nie na základe metód oxidácie pomocou UV ožarovania alebo persíranu. (Informácie možno nájsť tu: The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
                        Na účely nomogramu by sa mali riasy odstredením v centrifúge oddeliť od rastového média a následne resuspendovať v destilovanej vode. Trikrát odmerajte náhradný parameter a koncentráciu TOC v každej vzorke. Mali by sa analyzovať slepé vzorky s destilovanou vodou a od koncentrácie s obsahom TOC vo vzorke rias by sa mala odpočítať koncentrácia TOC.
                        Nomogramy by mali mať lineárny charakter v rámci požadovaného rozsahu koncentrácií uhlíka. Ďalej uvádzame príklady.
                        
                                    
                                       Poznámka:
                                    
                                 
                                 
                                    nomogramy by sa nemali používať na účely konverzie; je nevyhnutné, aby si laboratóriá pripravili vlastné nomogramy.
                                 
                              
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Regresia mg/l suchej hmotnosti na mg C/1. Údaje získané z koncentrovaných suspenzií buniek získaných v rámci polokontinuálnej produkcie jednorazovej kultúry rias a podrobených resuspenzácii v destilovanej vode.
                        os x: mg C/1 koncentrovaného krmiva s obsahom rias
                        os y: mg/1 suchej hmotnosti koncentrovaného krmiva s obsahom rias
                        Korekčný koeficient – 0,980
                        
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Regresia počtu buniek na mg C/1. Údaje získané z koncentrovaných suspenzií buniek získaných v rámci semikontinuálnej produkcie jednorazovej kultúry rias a podrobených resuspenzácii v destilovanej vode.
                        os x: mg C/1 koncentrovaného krmiva s obsahom rias
                        os y: Počet buniek/1 koncentrovaného krmiva s obsahom rias
                        Korekčný koeficient – 0,926
                        
                           Chlorella vulgaris var. viridis (CCAP 211/12).
                        Regresia absorpcie na mg C/1 (1 cm kyveta). Údaje získané z koncentrovaných suspenzií buniek získaných v rámci semikontinuálnej produkcie jednorazovej kultúry rias a podrobených resuspenzácii v destilovanej vode.
                        os x: mg C/1 koncentrovaného krmiva s obsahom rias
                        os y: Absorpcia pri 440 nm a riedení koncentrovaného krmiva s obsahom rias v pomere 1/10
                        Korekčný koeficient – 0,998
                     
                     
                        Dodatok 4
                        
                           VZOR TABUĽKY NA ZAZNAMENANIE OBNOVY MÉDIA, ÚDAJOV O FYZIKÁLNOM A CHEMICKOM MONITOROVANÍ, KŔMENÍ, REPRODUKCII DAFNIÍ A ÚMRTNOSTI RODIČOVSKÝCH JEDINCOV
                        
                        
                                    Experiment č.:
                                 
                                 
                                    Dátum začiatku:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Klon:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Médium:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Druh potravy:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Testovaná chemikália:
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Nominálna koncentrácia:
                                 
                              
                                    Deň
                                 
                                 
                                    0
                                 
                                 
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    4
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    9
                                 
                                 
                                    10
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    12
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    14
                                 
                                 
                                    15
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    19
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    21
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    obnova média (označte)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    pH (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    nová
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    O2 (mg/l) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    nová
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    teplota (°C) (*6)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    nová
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    podaná potrava (označte)
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    počet živých potomkov (*7)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    spolu
                                 
                              
                                    nádoba 1
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    6
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    8
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    9
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    10
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    spolu
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    kumulatívna rodičovská úmrtnosť (*8)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        Dodatok 5
                        
                           VZOR TABUĽKY NA ZAZNAMENANIE VÝSLEDKOV CHEMICKEJ ANALÝZY
                        
                        a)   Merané koncentrácie
                        
                        
                                    Nominálna koncentrácia:
                                 
                                 
                                    Vzorka z týždňa 1
                                 
                                 
                                    Vzorka z týždňa 2
                                 
                                 
                                    Vzorka z týždňa 3
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    čerstvá
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                                 
                                    čerstvá
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                                 
                                    čerstvá
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              b)   Merané koncentrácie ako percentuálny podiel nominálnej hodnoty
                        
                        
                                    Nominálna koncentrácia:
                                 
                                 
                                    Vzorka z týždňa 1
                                 
                                 
                                    Vzorka z týždňa 2
                                 
                                 
                                    Vzorka z týždňa 3
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    čerstvá
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                                 
                                    čerstvá
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                                 
                                    čerstvá
                                 
                                 
                                    stará
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                     
                        Dodatok 6
                        
                           VÝPOČET ČASOVO VÁŽENÉHO PRIEMERU
                        
                        
                           Časovo vážený priemer
                        
                        Keďže koncentrácia testovanej chemikálie môže v období medzi obnovami média poklesnúť, je potrebné zvážiť, ktorá koncentrácia by sa mala zvoliť ako reprezentatívna koncentrácia v rámci škály koncentrácií, v ktorých mali možnosť rodičovské dafnie existovať. Tento výber by mal vychádzať z biologických, ako aj štatistických úvah. Ak sa napríklad predpokladá, že na reprodukciu má vplyv najmä najvyššia zistená koncentrácia, potom by sa mala použiť maximálna koncentrácia. Ak sa však za dôležitejší považuje akumulovaný alebo dlhšie trvajúci účinok toxickej látky, vhodnejšie je použiť priemernú koncentráciu. V tomto prípade je uplatniteľným náležitým priemerom časovo vážená priemerná koncentrácia, pretože sa v nej zohľadňujú zmeny v okamžitej koncentrácií v priebehu času.
                        
                           Obrázok 1
                        
                        
                           Príklad časovo váženého priemeru
                        
                        Obrázok 1 znázorňuje príklad (zjednodušeného) testu trvajúceho sedem dní s obnovou média v dňoch 0, 2 a 4.
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Tenká kľukatá línia predstavuje koncentráciu v akomkoľvek časovom bode. Predpokladá sa, že po exponenciálnom rozkladnom procese nasleduje pokles koncentrácie.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    6 znázornených bodov predstavuje pozorované koncentrácie merané na začiatku a na konci každého obdobia obnovy média.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Hrubá pevná čiara indikuje pozíciu časovo váženého priemeru.
                                 
                              Časovo vážený priemer sa vypočíta tak, že plocha pod časovo váženým priemerom sa rovná ploche pod krivkou koncentrácie. Výpočet týkajúci sa spomínaného príkladu sa uvádza v tabuľke 1.
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Výpočet časovo váženého priemeru
                        
                        
                                    Č. obnovy
                                 
                                 
                                    Dni
                                 
                                 
                                    Koncentrácia 0
                                 
                                 
                                    Koncentrácia 1
                                 
                                 
                                    Ln (koncentrácia 0)
                                 
                                 
                                    Ln (koncentrácia 1)
                                 
                                 
                                    Plocha
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,493
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,503
                                 
                                 
                                    13,767
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    2
                                 
                                 
                                    11,000
                                 
                                 
                                    6,037
                                 
                                 
                                    2,398
                                 
                                 
                                    1,798
                                 
                                 
                                    16,544
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    3
                                 
                                 
                                    10,000
                                 
                                 
                                    4,066
                                 
                                 
                                    2,303
                                 
                                 
                                    1,403
                                 
                                 
                                    19,781
                                 
                              
                                    celkový počet dní:
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    celková plocha:
                                 
                                 
                                    50,092
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    časovo vážený priemer:
                                 
                                 
                                    7,156
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Dni je počet dní v období obnovy média
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Koncentrácia 0 je nameraná koncentrácia na začiatku každého obdobia obnovy média
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Koncentrácia 1 je nameraná koncentrácia na konci každého obdobia obnovy média
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ln (konc.0) je prirodzený logaritmus koncentrácie 0
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Ln (konc.1) je prirodzený logaritmus koncentrácie 1
                                 
                              
                           Plocha, je plocha pod exponenciálnou krivkou pre každé obdobie obnovy média. Vypočíta sa takto:
                        
                           
                        Časovo vážený priemer (TW Mean) je celková plocha vydelená celkovým počtom dní.
                        V prípade reprodukčného testu týkajúceho sa dafnií by sa daná tabuľka mala, samozrejme, rozšíriť tak, aby pokryla 21 dní.
                        Je zrejmé, že pokiaľ sa pozorovania uskutočňujú iba na začiatku a konci každého obdobia obnovy média, nie je možné potvrdiť, že daný rozkladný proces má v skutočnosti exponenciálny charakter. Iná krivka by mala za následok iný výpočet plochy. Exponenciálny rozkladný proces však nie je nepravdepodobný a v prípade nedostatku ďalších informácií ide pravdepodobne o najvhodnejšiu krivku.
                        Ak sa na konci obdobia obnovy média chemickou analýzou nepodarí zistiť žiadnu chemikáliu, je potrebné na to upozorniť. Ak nemožno odhadnúť, ako rýchlo sa chemikália stratila z roztoku, je nemožné získať realistickú plochu pod krivkou, a teda nemožno dospieť k primeranej časovo váženému priemeru.
                     
                     
                        Dodatok 7
                        
                           USMERNENIA TYKAJÚCE SA URČENIA POHLAVIA NOVONARODENÝCH JEDINCOV
                        
                        K narodeniu novonarodených jedincov mužského pohlavia môže dôjsť aj v premenlivých environmentálnych podmienkach, akými sú napríklad skrátená fotoperióda, teplota, pokles koncentrácie krmiva a zvýšenie hustoty populácie (Hobaek and Larson, 1990; Kleiven et al., 1992). Produkcia jedincov mužského pohlavia je aj známou odozvou na niektoré regulátory rastu hmyzu (Oda et al., 2005). Zvýšený počet jedincov mužského pohlavia by sa mohol očakávať za podmienok, keď chemické stresové faktory vyvolávajú pokles reprodukčného výstupu u partenogenetických samíc (OECD, 2008). Na základe dostupných informácií nemožno predpovedať, ktorý pomer pohlaví alebo pomer sledovaných parametrov týkajúcich sa reprodukcie bude citlivejší. Existujú však náznaky (odkaz na „validačnú správu“, časť 1), že tento zvýšený počet jedincov mužského pohlavia by mohol byť menej citlivý faktor ako pokles počtu potomkov. Keďže hlavným účelom tejto testovacej metódy je posúdiť počet vyprodukovaných potomkov, sledovanie výskytu jedincov mužského pohlavia nie je povinné. Ak sa tento nepovinný sledovaný parameter vyhodnotí v štúdii, potom by sa malo uplatniť dodatočné testovacie validačné kritérium, teda parameter maximálne 5 % jedincov mužského pohlavia pri kontrolných koncentráciách.
                        Najpraktickejší a najjednoduchším spôsobom rozlišovania pohlaví u dafnií je použiť ich fenotypové charakteristiky, keďže samce a samice sú z genetického hľadiska identické a ich pohlavie je environmentálne podmienené. Samce a samice majú rozdielnu dĺžku a tvar tykadiel prvého páru, ktoré majú samce dlhšie ako samice (obr. 1). Tento rozdiel sa dá rozpoznať ihneď po narodení, hoci vekom pribúdajú ďalšie sekundárne pohlavné znaky (pozri napr. obr. 2 v publikácii Olmstead and LeBlanc, 2000).
                        Na účely morfologického určenia pohlavia treba novonarodené jedince vyprodukované každým testovaným živočíchom preniesť pomocou pipety do Petriho misky s testovacím médiom. Médium je v záujme obmedzenia pohybu živočíchov obmedzené na minimum. Pod stereomikroskopom možno uskutočniť pozorovanie tykadiel prvého páru (× 10 – 60).
                        
                           Obr. 1
                        
                        
                           24 hodín starý samec (vľavo) a samica (vpravo) D. magna. Ako je znázornené na obrázku (v krúžkoch), samce možno od samíc rozlíšiť podľa dĺžky a tvaru tykadiel prvého páru (Tatarazako et al., 2004).
                        
                        ODKAZY
                        Hobaek A and Larson P. 1990. Sex determination in Daphnia magna. Ecology 71: 2255-2268.
                        Kleiven O.T., Larsson P., Hobaek A. 1992. Sexual reproduction in Daphnia magna requires three stimuli. Oikos 65, 197-206.
                        Oda S., Tatarazako N, Watanabe H., Morita M., and Iguchi T. 2005. Production of male neonates in Daphnia magna (Cladocera, Crustacea) exposed to juvenile hormones and their analogs. Chemosphere 61:1168-1174.
                        OECD, 2008. Validation report for an enhancement of OECD TG 211 Daphnia magna reproduction test. OECD Series on Testing and Assessment, Number 88. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
                        Olmstead, A.W., LeBlanc, G.A., 2000. Effects of endocrine-active chemicals on the development characteristics of Daphnia magna. Environmental Toxicology and Chemistry 19:2107-2113.
                        Tatarazako, N., Oda, S., Abe, R., Morita M. and Iguchi T., 2004. Development of a screening method for endocrine disruptors in crustaceans using Daphnia magna (Cladocera, Crustacea). Environmental Science 17, 439-449.
                     “
               
                     18.
                  
                  
                     V časti C kapitole C.29 sa bod 66 nahrádza takto:
                     
                                 „66.
                              
                              
                                 Test sa považuje za platný, ak:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             priemerná percentuálna degradácia v nádobách FC obsahujúcich referenčnú chemikáliu je > 60 % do 14. dňa inkubácie a
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             priemerné množstvo TIC prítomnej v slepých kontrolných nádobách FB na konci testu je < 3 mg C/l.
                                          
                                       Ak tieto limity nie sú splnené, test by sa mal zopakovať s využitím inokula z iného zdroja a/alebo je potrebné preveriť použité postupy. Ak je napríklad problémom vysoká produkcia IC v slepých kontrolných nádobách, treba sa riadiť postupom uvedeným v bodoch 27 až 32.“
                              
                           
               
                     19.
                  
                  
                     V časti C sa dopĺňajú tieto kapitoly:
                     „C.47   Test toxicity v ranom štádiu vývoja rýb
                     
                     ÚVOD
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 210 (2013). Účelom testov v ranom štádiu vývoja rýb je určiť letálne a subletálne účinky chemikálií na testované štádiá a druhy. Poskytujú hodnotné informácie pre odhad chronických letálnych a subletálnych účinkov chemikálie na ďalšie druhy rýb.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Usmernenie na vykonávanie testov 210 vychádza z návrhu Spojeného kráľovstva, o ktorom sa rokovalo na stretnutí expertov OECD, ktoré sa konalo v Medmenhame (Spojené kráľovstvo) v novembri 1988, a ktorý bol ďalej aktualizovaný v roku 2013, aby sa v ňom zohľadnili skúsenosti z používania testu a odporúčania z pracovného seminára OECD o testovaní toxicity na rybách, ktorý sa konal v septembri 2010 (1).
                              
                           PRINCÍP TESTU
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Rané štádiá vývoja rýb sú vystavené sérii koncentrácií testovanej chemikálie rozpustenej vo vode. Uprednostňujú sa prietokové podmienky, ak to však nie je možné, sú prijateľné aj semistatické podmienky. Pokiaľ ide o podrobnosti, treba sa riadiť pokynmi OECD o testovaní toxicity zložitých látok a zmesí vo vodnom prostredí (2). Test sa začne umiestnením oplodnených vajíčok do testovacích komôr a pokračuje sa v ňom počas časového úseku špecifického pre jednotlivé druhy, ktorý je potrebný na to, aby kontrolné ryby dosiahli vývojové štádium mlade. Posúdením letálnych a subletálnych účinkov a ich porovnaním s kontrolnými hodnotami sa určí najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) s cieľom určiť i) koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC) a/alebo ii) hodnotu ECx (napr. EC10, EC20), a to použitím regresného modelu na odhadnutie koncentrácie, ktorá by spôsobila x % zmenu v meranom účinku. Uvedenie príslušných účinných koncentrácií a parametrov môže závisieť od regulačného rámca. Testovacie koncentrácie by mali zahŕňať hodnotu ECx, aby hodnota ECx vychádzala z interpolácie, a nie z extrapolácie (definície nájdete v dodatku 1).
                              
                           INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Testovaná chemikália je to, čo sa testuje. Jej rozpustnosť vo vode (pozri kapitolu A.6 tejto prílohy) a tlak pár (pozri kapitolu A.4 tejto prílohy) by mali byť známe a mala by byť dostupná spoľahlivá analytická metóda na stanovenie množstva chemikálie v testovacom roztoku so známou a udanou presnosťou a kvantifikačným limitom. Výsledky testu akútnej toxicity (pozri kapitolu C.1 alebo C.49 tejto prílohy), pokiaľ možno vykonaného s druhom vybraným pre tento test, môžu poskytnúť užitočné informácie, hoci jeho vykonanie sa nepožaduje.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Ak sa daná testovacia metóda použije na testovanie zmesi, jej zloženie by malo byť čo najviac charakterizované, napr. chemickou identitou jej zložiek, ich kvantitatívnym výskytom a vlastnosťami jednotlivých látok (ako sú vlastnosti uvedené vyššie). Pred použitím testovacej metódy na regulačné testovanie zmesi by sa malo posúdiť, či poskytne prijateľné výsledky z hľadiska zamýšľaného regulačného účelu.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Užitočné informácie zahŕňajú štruktúrny vzorec, čistotu látky, rozpustnosť vo vode, stabilitu vo vode a na svetle, pKa, Pow a výsledky testu na ľahkú biologickú odbúrateľnosť (napr. kapitoly C.4 alebo C.29 tejto prílohy).
                              
                           PLATNOSŤ TESTU
                     
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Ak má byť test platný, musia byť splnené tieto podmienky:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia rozpusteného kyslíka by mala počas testu dosahovať > 60 % hodnoty saturácie vzduchom,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teplota vody by sa medzi testovacími komorami alebo medzi za sebou nasledujúcimi dňami v žiadnom okamihu počas testu nemala líšiť o viac ako ± 1,5 °C a mala by byť v rozsahu teplôt určených pre testované druhy (dodatok 2),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             analytické meranie testovacích koncentrácií je povinné,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             počet všetkých oplodnených vajíčok, ktoré prežili, a počet vyliahnutých lariev, ktoré prežili, v kontrolných skupinách, prípadne v kontrolných skupinách s rozpúšťadlom, by mal byť väčší alebo rovnaký ako limity stanovené v dodatku 2.
                                          
                                       
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Ak sa zistí mierna odchýlka od kritérií platnosti, dôsledky by sa mali posudzovať s ohľadom na spoľahlivosť testovacích údajov a tieto úvahy by mali byť zahrnuté do správy. Mali by sa oznamovať účinky na prežitie, liahnutie alebo rast, ku ktorým dochádza v kontrolnej skupine s rozpúšťadlom, v porovnaní s negatívnou kontrolnou skupinou, a malo by sa o nich diskutovať v súvislosti so spoľahlivosťou testovacích údajov.
                              
                           OPIS METÓDY
                     
                        Testovacie komory
                     
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Možno použiť akékoľvek nádoby zo skla, nehrdzavejúcej ocele alebo iné chemicky inertné nádoby. Keďže je známe, že silikón má silnú schopnosť absorbovať lipofilné látky, používanie silikónových rúrok v prietokových štúdiách a používanie silikónových tesnení v kontakte s vodou by sa malo minimalizovať používaním napr. monoblokových sklenených akvárií. Rozmery nádob by mali byť dostatočne veľké na to, aby umožňovali náležitý rast v kontrolnej skupine, udržiavanie koncentrácie rozpusteného kyslíka (napr. pri malých druhoch rýb sa to dosiahne nádržou s objemom 7 l) a dodržanie kritéria veľkosti násady uvádzaného v bode 19. Žiaduce je, aby bolo umiestnenie skúšobných komôr na testovacej ploche náhodné. Náhodný blokový návrh, v ktorom sa v každom bloku nachádza každá skupina s aplikovanou chemikáliou, sa uprednostňuje pred úplne náhodným dizajnom. Testovacie komory by sa mali chrániť pred nežiaducim rušením. Testovací systém by mal byť kondiciovaný koncentráciami testovanej chemikálie dostatočne dlho, aby sa prejavili stabilné expozičné koncentrácie ešte pred vložením testovaných organizmov.
                              
                           
                        Výber druhov
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Odporúčané druhy rýb sú uvedené v tabuľke 1. Týmto sa nevylučuje použite iných druhov, postup testovania však môže byť potrebné upraviť tak, aby sa dosiahli vhodné testovacie podmienky. V tom prípade treba uviesť dôvody, ktoré viedli k výberu iných druhov, a experimentálnu metódu.
                              
                           
                        Chov generačných rýb
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Podrobnosti o chove generačných rýb za uspokojivých podmienok možno nájsť v dodatku 3 a citovaných odkazoch (3)(4)(5).
                              
                           
                        Manipulácia s oplodnenými vajíčkami, embryami a larvami
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Na začiatku možno oplodnené vajíčka, embryá a larvy vystaviť chemikálii v rámci hlavnej nádoby, a to v menších sklenených nádobách alebo nádobách z nehrdzavejúcej ocele vybavených sieťovinovými stenami alebo koncami, aby sa umožnilo pretekanie testovacieho roztoku cez nádobu. Neturbulentný tok cez tieto malé nádoby možno zabezpečiť ich zavesením na rameno upravené na pohybovanie nádobami nahor a nadol tak, aby organizmy zostali vždy ponorené. Oplodnené vajíčka lososovitých rýb možno umiestniť na inkubačných podložkách alebo sieťkach s dostatočne veľkými okami, aby mohli cez ne larvy po vyliahnutí prepadnúť.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Ak boli na držanie vajíčok v hlavnej testovacej nádobe použité inkubačné vložky na vajíčka, mriežky alebo sieťky, tieto držiaky by sa mali po vyliahnutí lariev odstrániť podľa návodu v dodatku 3 okrem prípadov, keď treba sieťky ponechať na zabránenie úniku lariev. Ak treba larvy preniesť, nemali by sa vystaviť vzduchu a nemali by sa používať sieťky na ich vylovenie z inkubačných vložiek. Načasovanie tohto prenosu sa líši v závislosti od druhu a malo by sa zdokumentovať v správe. Prenos však nemusí byť vždy nevyhnutný.
                              
                           
                        Voda
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Každú vodu, v ktorej testovaný druh vykazuje vyhovujúco dlhotrvajúce prežívanie a rast, možno použiť na testovanie (pozri dodatok 4). Mala by mať konštantnú kvalitu počas celého trvania testu. S cieľom zaistiť, že voda na riedenie neovplyvní výsledky testu neprimeraným spôsobom (napríklad tvorbou komplexov testovanej chemikálie) alebo že nebude mať nepriaznivý vplyv na reprodukčnú úžitkovosť generačných rýb, mali by sa z nej v pravidelných intervaloch odoberať vzorky na analýzu. Ak je známe, že voda na riedenie má relatívne stálu kvalitu, mal by sa v nej napríklad dvakrát ročne merať obsah ťažkých kovov (napr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavných aniónov a katiónov (napr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO4
                                    2-), amoniaku, celkového zvyškového chlóru, pesticídov, celkový obsah organického uhlíka a obsah suspendovaných tuhých látok. Ak je známe, že voda má premenlivú kvalitu, merania sa musia vykonávať častejšie, pričom frekvencia závisí od miery premenlivosti kvality. Niektoré chemické vlastnosti pre prijateľnú vodu na riedenie sú uvedené v dodatku 4.
                              
                           
                        Testovacie roztoky
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Pri prietokových testoch sa vyžaduje systém, ktorý kontinuálne privádza a riedi zásobný roztok testovanej chemikálie (napr. dávkovacie čerpadlo, proporcionálny zrieďovač, saturačný systém) na prísun série koncentrácií do testovacích komôr. Prietoky zásobných roztokov a vody na riedenie by sa mali kontrolovať v určitých intervaloch počas testu, pričom by sa v priebehu testu nemali meniť o viac ako 10 %. Za vhodný sa považuje prietok zodpovedajúci aspoň piatim objemom testovacej komory za 24 hodín (3). Ak sa však dodrží veľkosť násady stanovená v bode 19, je možný aj nižší prietok napr. 2 – 3 objemy testovacej komory, aby sa zabránilo rýchlemu vymývaniu potravy.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Testovacie roztoky vybraných koncentrácií sa pripravujú riedením zásobného roztoku. Zásobný roztok by sa mal podľa možností pripraviť jednoduchým miešaním alebo trepaním testovanej chemikálie vo vode na riedenie mechanickým prostriedkom (napr. miešadlom a/alebo ultrazvukom). Na dosiahnutie vhodne koncentrovaného zásobného roztoku možno použiť saturačné kolóny (rozpúšťacie kolóny) alebo pasívne dávkovacie metódy (6). Použitie rozpúšťadla ako nosiča sa neodporúča. Ak je však rozpúšťadlo potrebné, mala by sa súbežne testovať kontrolná skupina s rozpúšťadlom, a to s rovnakou koncentráciou rozpúšťadla, aká je v skupinách s aplikovanou chemikáliou. t. j. úroveň rozpúšťadla by mala byť podľa možnosti rovnaká pri všetkých koncentráciách, ako aj v kontrolnej skupine s rozpúšťadlom. Pri niektorých riediacich systémoch to môže byť technicky náročné, pričom v takom prípade by mala byť koncentrácia rozpúšťadla v kontrolnej skupine s rozpúšťadlom totožná s najvyššou koncentráciou rozpúšťadla v skupine s aplikovanou chemikáliou. Pri ťažko testovateľných látkach by sa mal konzultovať usmerňovací dokument OECD č. 23 o testovaní toxicity ťažko testovateľných látok a zmesí vo vodnom prostredí (2). Ak sa používa rozpúšťadlo, výber rozpúšťadla bude daný chemickými vlastnosťami látky. V pokynoch OECD č. 23 sa odporúča maximálna koncentrácia 100 μl/l. Aby sa predišlo možnému účinku rozpúšťadla na ukazovatele (7), odporúča sa udržovať čo najnižšiu koncentráciu rozpúšťadla.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 V prípade semistatického testu možno použiť dva rôzne postupy obnovy. Buď sa nové testovacie roztoky pripravia v čistých nádobách a živé vajíčka a larvy sa opatrne prenesú do nových nádob alebo sa testovacie organizmy nechajú v testovacích nádobách a časť (aspoň dve tretiny) objemu testovacieho roztoku/kontrolného roztoku sa vymení.
                              
                           POSTUP
                     
                        Podmienky expozície
                     
                     
                        Trvanie
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Test by sa mal začať čo najskôr po oplodnení vajíčok a vajíčka by sa podľa možnosti mali ponoriť do testovacích roztokov pred začatím ryhovania blastodisku, alebo čo najskôr po tomto štádiu. Dĺžka testu bude závisieť od použitých druhov. Niektoré odporúčané dĺžky testu sú uvedené v dodatku 2.
                              
                           
                        Nasádzanie
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Počet oplodnených vajíčok na začiatku testu by mal byť dostatočný na to, aby sa splnili štatistické požiadavky. Mali by byť náhodne rozdelené do skupín s aplikovanou chemikáliou a malo by sa použiť najmenej 80 vajíčok rozdelených v rovnakom množstve najmenej do štyroch paralelných testovacích komôr (replikátov) na každú koncentráciu. Veľkosť násady (množstvo biomasy na objem testovacieho roztoku) by mala byť dosť nízka na to, aby sa počas štádia vajíčka a larválneho štádia mohla koncentrácia rozpusteného kyslíka udržiavať na hodnote najmenej 60 % hodnoty saturácie vzduchom bez prevzdušňovania. Pri prietokových testoch sa neodporúča, aby veľkosť násady v ktoromkoľvek okamihu prekročila 0,5 g/l mokrej hmotnosti počas 24 hodín a prekročila 5 g/l roztoku (3).
                              
                           
                        Svetlo a teplota
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Fotoperióda a teplota vody by mali byť vhodné pre dané testované druhy (pozri dodatok 2).
                              
                           
                        Kŕmenie
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Potrava a kŕmenie zohrávajú rozhodujúcu úlohu a je nevyhnutné, aby sa v každom vývojovom štádiu poskytovala správna potrava od vhodného okamihu a v dostatočnom množstve na podporu normálneho rastu. Kŕmenie by malo byť približne rovnaké vo všetkých replikátoch, pokiaľ ho netreba upraviť z dôvodu úmrtnosti. Nadbytočná potrava a výkaly by sa mali podľa potreby odstrániť, aby sa nehromadil odpad. Podrobné kŕmne režimy sú uvedené v dodatku 3, ale s nadobúdaním skúseností sa potrava a kŕmne režimy priebežne vylepšujú s cieľom zvýšiť prežitie a optimalizovať rast. Živá potrava je zdrojom obohatenia prostredia, a preto by sa mala používať namiesto sušenej alebo mrazenej potravy alebo ako jej doplnok, pokiaľ je to vhodné z hľadiska daného druhu a vývojového štádia.
                              
                           
                        Testovacie koncentrácie
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Spravidla sa vyžaduje päť koncentrácií testovanej chemikálie, minimálne so štyrmi opakovaniami (replikátmi) na koncentráciu, s odstupom daným konštantným faktorom nepresahujúcim hodnotu 3,2. Pokiaľ sú dostupné informácie o testovaní akútnej toxicity, podľa možnosti na tom istom druhu, mali by sa zohľadniť pri výbere rozsahu testovacích koncentrácií a/alebo by sa malo zvážiť vykonanie testu na vyhľadávanie rozsahu (1). Pri výbere rozsahu testovacích koncentrácií by sa však mali zohľadniť všetky zdroje informácií vrátane zdrojov, ako je krížové porovnávanie údajov z testovania akútnej toxicity rybích embryí. Tam, kde sa majú stanoviť len empirické NOEC, môže byť ako konečný test prijateľný limitný test alebo rozšírený limitný test s menej ako piatimi koncentráciami. Použije menej ako piatich koncentrácií by sa malo odôvodniť. Koncentrácia testovanej chemikálie vyššia ako 96 hodín LC50 alebo 10 mg/l a tá, ktorá z nich je nižšia, nemusí byť testovaná.
                              
                           
                        Kontroly
                     
                     
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Jedna kontrolná skupina s vodou na riedenie a podľa potreby jedna kontrolná skupina s rozpúšťadlom obsahujúca len samotné rozpúšťadlo ako nosič by sa mali testovať ako doplnok k sériám koncentrácií testovanej chemikálie (pozri bod 16).
                              
                           
                        Frekvencia analytických stanovení a meraní
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Pred spustením expozície by sa bolo treba uistiť, že systém prísunu chemikálie riadne funguje vo všetkých replikátoch (napr. meraním testovacích koncentrácií). Mali by sa určiť požadované analytické metódy vrátane vhodného kvantifikačného limitu (LOQ) a dostatočných znalostí o stabilite látky v testovacom systéme. Počas testu sa koncentrácie testovanej chemikálie stanovujú v pravidelných časových intervaloch s cieľom charakterizovať expozíciu. Potrebných je minimálne päť stanovení. V prietokových systémoch by sa mali aspoň raz za týždeň vykonávať analytické merania testovanej chemikálie v jednom replikáte na koncentráciu so systematickým striedaním replikátov. Ďalšími analytickými stanoveniami sa často zlepší kvalita výsledku testu. Vzorky možno treba filtrovať, aby sa odstránili akékoľvek tuhé častice (napr. použitím filtra s veľkosťou pórov 0,45 μm), alebo odstreďovať, aby sa zaistilo, že sa stanovenia vykonávajú s chemikáliou v skutočnom roztoku. Aby sa znížila adsorpcia testovanej chemikálie, filtre by mali byť pred použitím nasýtené. Keď merané koncentrácie nezostanú na 80 – 120 % nominálnej koncentrácie, účinné koncentrácie by sa mali stanoviť a vyjadriť vo vzťahu k aritmeticky priemernej koncentrácii pre prietokové testy [pozri dodatok 6 testovacej metódy C.20 pre výpočet aritmetického priemeru (8)] a vo vzťahu ku geometrickému priemeru meraných koncentrácií pre semistatické testy [pozri kapitolu 5 v pokynoch OECD o testovaní toxicity zložitých látok a zmesí vo vodnom prostredí (2)].
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Počas testu by sa mal vo všetkých testovacích nádobách aspoň raz týždenne merať rozpustený kyslík, pH a teplota a na začiatku a konci testu by sa mala odmerať salinita a tvrdosť, ak je to opodstatnené. Teplota by sa mala podľa možnosti monitorovať kontinuálne aspoň v jednej testovacej nádobe.
                              
                           
                        Pozorovania
                     
                     26.   
                           Štádium embryonálneho vývoja
                        : na začiatku vystavenia testovanej chemikálii by sa embryonálne štádium malo čo najpresnejšie overiť. Toto overenie možno vykonať na reprezentatívnej vzorke vajíčok vhodne uchovaných a vyčistených.
                     27.   
                           Liahnutie a prežitie
                        : pozorovania liahnutia a prežívania by sa mali vykonávať najmenej raz za deň a údaje by sa mali zaznamenať. Ak sa na vajíčkach v rannom štádiu embryonálneho vývoja spozoruje pleseň (napr. v prvý alebo druhý deň testu), takéto vajíčka by sa mali spočítať a odstrániť. Mŕtve embryá, larvy a mlaď by sa mali odstrániť hneď, ako sa spozorujú, lebo sa môžu rýchlo rozkladať a môže ich narušiť činnosť ostatných rýb. Pri odstraňovaní mŕtvych jedincov treba postupovať mimoriadne opatrne, aby nedošlo k fyzickému poškodeniu susedných vajíčok/lariev. Prejavy úhynu sa líšia podľa druhu a vývojového štádia. Napríklad:
                     
                                 —
                              
                              
                                 u oplodnených vajíčok: predovšetkým v ranných štádiách, výrazná strata priehľadnosti a zmena v zafarbení spôsobené koaguláciou a/alebo zrážaním proteínov, čo vedie k bielemu nepriehľadnému vzhľadu,
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 u embryí, lariev a mladi: nepohyblivosť a/alebo neprítomnosť respiračných pohybov a/alebo neprítomnosť tlkotu srdca a/alebo strata reakcií na mechanické stimuly.
                              
                           28.   
                           Abnormálny vzhľad
                        : počet lariev alebo mlade prejavujúcich abnormality v tvare tela by sa mal zaznamenávať v primeraných časových intervaloch v závislosti od dĺžky trvania testu a charakteru opísaných abnormalít. Treba poznamenať, že abnormálne larvy a mlaď sa vyskytujú prirodzene a v kontrolných skupinách sa pri niektorých druhoch môžu vyskytnúť v počte rádovo niekoľko percent. Ak sa deformácie a súvisiace abnormálne správanie považujú za tak vážne, že organizmus značne trpí a dosiahol bod, z ktorého sa už nezotaví, možno ho odstrániť z testu. Takéto zvieratá by sa mali usmrtiť a v rámci následnej analýzy údajov by sa mali považovať za uhynuté jedince. Pri väčšine druhov odporúčaných v tejto testovacej metóde bol zaznamenaný normálny embryonálny vývoj (9) (10) (11) (12).
                     29.   
                           Abnormálne správanie
                        : abnormality ako hyperventilácia, nekoordinované plávanie, netypická nehybnosť a netypické správanie pri kŕmení by sa mali zaznamenávať v primeraných časových intervaloch v závislosti od dĺžky trvania testu (napr. raz denne pri teplovodných druhoch). Tieto účinky, hoci ich je ťažké kvantifikovať, môžu (ak sú spozorované) pomôcť pri interpretácii údajov o mortalite.
                     30.   
                           Hmotnosť
                        : na konci testu sa všetky živé ryby odvážia aspoň podľa replikátov (s udaním počtu zvierat v replikáte a priemernej hmotnosti na zviera): uprednostňuje sa mokrá hmotnosť (vytreté do sucha), uvádzať však možno aj údaje o suchej hmotnosti (13).
                     31.   
                           Dĺžka
                        : na konci testu sa zmeria dĺžka jednotlivých jedincov. Odporúča sa celková dĺžka, ak sa však vyskytne hnitie chvostovej plutvy alebo erózia plutvy, možno použiť štandardnú dĺžku. Na všetky ryby v rámci daného testu by sa mala použiť rovnaká metóda. Dĺžku jednotlivých jedincov možno merať buď napr. posuvným meradlom, digitálnym fotoaparátom, alebo kalibrovaným okulárovým mikrometrom. Typické minimálne dĺžky sú uvedené v dodatku 2.
                     ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Odporúča sa, aby návrh experimentu a výber štatistického testu poskytovali dostatočnú silu (80 % alebo viac) na detekciu zmien biologického významu v ukazovateľoch, pri ktorých má byť určený NOEC. Uvedenie príslušných účinných koncentrácií a parametrov môže závisieť od regulačného rámca. Ak sa má zaznamenať hodnota ECx, návrh experimentu a výber regresného modelu by mali umožňovať odhad hodnoty ECx, aby i) 95 % interval spoľahlivosti uvádzaný pre hodnotu ECx neobsahoval nulu a nebol príliš široký; ii) 95 % interval spoľahlivosti pre predpokladanú strednú hodnotu pri ECx neobsahoval strednú hodnotu kontrolnej skupiny; iii) medzi regresným modelom a údajmi nebol významný nesúlad. Pri obidvoch prístupoch sa vyžaduje identifikácia percentuálnej zmeny v každom sledovanom ukazovateli, ktorého zistenie alebo odhad sú dôležité. Návrh experimentu by sa mal prispôsobiť tak, aby to bolo možné. Pokiaľ nie sú uvedené podmienky na stanovenie hodnoty ECx splnené, mal by sa uplatniť prístup založený na NOEC. Nie je pravdepodobné, že rovnaká percentuálna zmena bude platiť pre všetky ukazovatele, a nie je pravdepodobné ani to, že sa podarí navrhnúť uskutočniteľný experiment, ktorý bude spĺňať tieto kritériá pre všetky ukazovatele, preto je v záujme správneho naplánovania experimentu dôležité zamerať sa na ukazovatele, ktoré sú dôležité pre daný experiment. Štatistické vývojové diagramy a návod ku každému prístupu sú k dispozícii v dodatkoch 5 a 6 na poskytnutie usmernenia pri spracovaní údajov a pri výbere najvhodnejšieho štatistického testu alebo modelu. Možno použiť aj iné štatistické prístupy za predpokladu, že sú vedecky podložené.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 V každom súbore replikátov bude treba analyzovať variabilitu použitím analýzy rozptylu alebo kontingenčnej tabuľky a na základe tejto analýzy použiť vhodné metódy štatistickej analýzy. Aby bolo možné urobiť viacnásobné porovnanie výsledkov pre jednotlivé koncentrácie a kontroly, odporúča sa step-down Jonckheereho-Terpstrov alebo Williamsov test pre spojité hodnoty a step-down Cochranov-Armitageov test pre diskrétne hodnoty, ktoré zodpovedajú monotónnej koncentračnej závislosti bez extra-binomického rozptylu (14). Ak existuje dôkaz o extrabinomickom rozptyle, odporúča sa Raova-Scottova úprava Cochranovho-Armitageovho testu (15) (16) alebo použitie Wiliamsovho alebo Dunnettovho (po transformácii arkussínusovej odmocniny) alebo Jonckheereho-Terpstrovho testu na jednotlivé replikáty. Ak údaje nezodpovedajú monotónnej koncentračnej závislosti, pre spojité hodnoty môže byť užitočná Dunnettova, Dunnova alebo Mannova-Whitneyho metóda a pre diskrétne hodnoty Fisherov exaktný test (14) (17) (18). Pri použití akejkoľvek štatistickej metódy alebo modelu treba postupovať opatrne, aby sa zaistilo splnenie požiadaviek metódy alebo modelu (napr. odhadne sa variabilita medzi komorami a zohľadní sa pri navrhovaní experimentu a použitom teste alebo modeli). Treba zhodnotiť normalitu údajov, pričom v dodatku 5 sa uvádza, čo by sa malo vykonať s rezíduami z ANOVA. V dodatku 6 sa hovorí o ďalších aspektoch regresného prístupu. Mali by sa zvážiť transformácie na splnenie požiadaviek štatistického testu. Pri transformáciách s cieľom umožniť zavedenie regresného modelu však treba postupovať mimoriadne opatrne, keďže, napríklad, 25 % zmena v netransformovanej reakcii nezodpovedá 25 % zmene v transformovanej reakcii. Vo všetkých analýzach je jednotkou analýzy a experimentálnou jednotkou testovacia komora, nie jednotlivé ryby, čo by sa malo zohľadniť pri testoch hypotéz aj pri regresii (3) (14) (19) (20).
                              
                           
                        Skúšobný protokol
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovaná chemikália:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Jednozložková látka
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti;
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     chemická identifikácia ako názov IUPAC alebo názov CAS, CAS číslo, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt podľa vhodnosti a praktickej realizovateľnosti atď. (prípadne vrátane obsahu organického uhlíka).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Viaczložková látka, UVCB a zmesi:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     čo najviac charakterizované, napr. chemickou identitou (pozri vyššie), kvantitatívnym výskytom a príslušnými fyzikálno-chemickými vlastnosťami zložiek.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovaný druh:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vedecký názov, kmeň, zdroj a spôsob zberu oplodnených vajíčok a následná manipulácia.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Podmienky testovania:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         použitý postup testovania (napr. semistatický alebo prietokový, nasádzanie),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fotoperióda(-y),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         návrh štúdie (napr. počet testovacích komôr a replikátov, počet vajíčok na replikát, materiál a veľkosť testovacej komory (výška, šírka, objem), objem vody na testovaciu komoru),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metóda prípravy zásobných roztokov a frekvencia obnovy (ak bol použitý solubilizačný prostriedok, mal by sa uviesť spolu s jeho koncentráciou),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metóda dávkovania testovanej chemikálie (napr. čerpadlá, riediace systémy),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         miera výťažnosti metódy a nominálne testovacie koncentrácie, kvantifikačný limit, stredné hodnoty meraných hodnôt a ich štandardné odchýlky v testovacích nádobách a metóda, ktorou boli dosiahnuté, a dôkaz, že sa namerané hodnoty týkajú koncentrácií testovanej chemikálie v pravom roztoku,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vlastnosti vody na riedenie: pH, tvrdosť vody, teplota, koncentrácia rozpusteného kyslíka, úroveň zvyškového chlóru (ak bola meraná), celkový obsah organického uhlíka (ak bol meraný), suspendované tuhé látky (ak boli merané), salinita v testovacom prostredí (ak bola meraná) a akékoľvek iné vykonané merania,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kvalita vody v testovacích nádobách: pH, tvrdosť, teplota a koncentrácia rozpustného kyslíka,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podrobné informácie o kŕmení (napr. druh potravy, zdroj, dávkované množstvo a frekvencia).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Výsledky uvádzané jednotlivo (alebo podľa replikátov) a ako priemer a variačný koeficient, podľa potreby, pre tieto ukazovatele:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dôkaz, že v kontrolných skupinách bola splnená norma celkovej prípustnosti prežitia testovaných druhov (dodatok 2),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         údaje o úmrtnosti v každom štádiu (embryo, larva a mlaď) a o kumulovanej úmrtnosti,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dni potrebné na vyliahnutie, počty lariev vyliahnutých každý deň a koniec liahnutia,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         počet zdravých rýb na konci testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         údaje o dĺžke (uviesť buď štandardnú alebo celkovú) a hmotnosti zvierat, ktoré prežili,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         incidencia, opis a počet morfologických abnormalít, ak sa nejaké vyskytli,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         incidencia, opis a počet účinkov na správanie, ak sa nejaké vyskytli,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prístup uplatnený pri štatistickej analýze (regresná analýza alebo analýza rozptylu) a spracovaní údajov (použitý štatistický test alebo model),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koncentráciu bez pozorovaného účinku pre každú posudzovanú reakciu (NOEC),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (pri p = 0,05) pre každú posudzovanú reakciu (LOEC);
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         hodnota ECx pre každú posudzovanú reakciu, v prípade potreby, a intervaly spoľahlivosti (napr. 90 % alebo 95 %) a graf zavedeného modelu použitého na jej výpočet, sklon krivky koncentračnej závislosti, vzorec regresného modelu, odhadované parametre modelu a ich štandardné chyby.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Akákoľvek odchýlka od testovacej metódy.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Diskusia o výsledkoch vrátane akéhokoľvek vplyvu odchýlok od testovacej metódy na výsledok testu.
                                             
                                          
                                       
                                    Tabuľka 1
                                 
                                 
                                    Druhy rýb odporučené na testovanie
                                 
                                 
                                             SLADKOVODNÉ RYBY
                                          
                                          
                                             RYBY Z ÚSTÍ a MORSKÉ RYBY
                                          
                                       
                                             
                                                Oncorhynchus mykiss
                                             
                                             pstruh dúhový
                                          
                                          
                                             
                                                Cyprinodon variegatus
                                             
                                             kaprozúbka diamantová
                                          
                                       
                                             
                                                Pimephales promelas
                                             
                                             čerebľa potočná
                                          
                                          
                                             
                                                Menidia sp.
                                             menídia pobrežná
                                          
                                       
                                             
                                                Danio rerio
                                             
                                             danio pruhované
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                                             
                                                Oryzias latipes
                                             
                                             ryžovníčka japonská
                                          
                                          
                                              
                                          
                                       
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Brauhn, J.L. a R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Brungs, W.A. a B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Chapter C.20 of this Annex, Daphnia magna Reproduction Test.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Hansen, D.J. a P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer a J.L. Hamelink), ASTM STP 634.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Gonzalez-Doncel, M. et al. (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C..
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Oris, J.T., S.C. Belanger, a A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 – 376.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. a A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Rao, J.N.K. a A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Rand, G.M. a S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 McClave, J.T., J.H. Sullivan a J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Vidlicová dĺžka (FL): označuje dĺžku od špičky rypáka po koniec stredných lúčov chvostových plutiev a používa sa pri rybách, pri ktorých je ťažké rozoznať, kde končí chrbtica (www.fishbase.org).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Štandardná dĺžka (SL): označuje dĺžku ryby meranú od špičky rypáka po zadný koniec posledného stavca alebo po zadný koniec stredu bočnej časti hypurálnej kosti. Jednoducho povedané, v tomto rozmere nie je zahrnutá dĺžka chvostovej plutvy (www.fishbase.org).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Celková dĺžka (TL): označuje dĺžku od špičky rypáka po koniec dlhšieho laloka chvostovej plutvy, spravidla meranú s lalokmi stlačenými pozdĺž stredovej čiary. Je to priamočiary rozmer, nemeraný cez zakrivenie tela (www.fishbase.org).
                                    
                                       Obrázok 1
                                    
                                    
                                       Opis rôznych používaných dĺžok
                                    
                                    
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Chemikália: látka alebo zmes
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx: (Účinná koncentrácia pre x % účinok) je koncentrácia, ktorá počas daného trvania expozície vyvolá x % účinok na testované organizmy v porovnaní s kontrolnou skupinou. Napríklad EC50 je koncentrácia, pri ktorej sa odhaduje, že počas vymedzenej doby expozície vyvolá účinok na sledovaný ukazovateľ testu v 50 % exponovanej populácie.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) je najnižšia testovaná koncentrácia testovanej chemikálie, pri ktorej je účinok chemikálie štatisticky významný (pri p < 0,05) v porovnaní s kontrolnou chemikáliou. Škodlivý účinok všetkých testovaných koncentrácií nad LOEC by však mal byť rovnaký alebo väčší ako účinok pozorovaný pri LOEC. Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, treba poskytnúť úplné vysvetlenie spôsobu, akým sa zvolila LOEC (a teda aj NOEC). V dodatkoch 5 a 6 sa uvádza návod.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC) je testovaná koncentrácia chemikálie ihneď pod LOEC, ktorá pri porovnaní s kontrolnou chemikáliou nemá štatisticky významný účinok (p < 0,05) počas daného trvania expozície.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Testovaná chemikália: Každá látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB: látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       IUPAC: Medzinárodná únia pre čistú a aplikovanú chémiu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       SMILES: zjednodušený systém zadávania molekulárnych štruktúr.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 2
                        
                           PODMIENKY A TRVANIE TESTU A KRITÉRIÁ PREŽITIA U ODPORUČENÝCH DRUHOV RÝB
                        
                        
                                    DRUH
                                 
                                 
                                    PODMIENKY TESTU
                                 
                                 
                                    ODPORÚČANÉ TRVANIE TESTU
                                 
                                 
                                    Typická minimálna priemerná celková dĺžka kontrolných rýb na konci štúdie (mm) (98)
                                    
                                 
                                 
                                    PREŽITIE KONTROLNÝCH SKUPÍN (minimum)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Teplota (°C)
                                 
                                 
                                    Salinita (0/00)
                                 
                                 
                                    Fotoperióda (hod.)
                                 
                                 
                                    Úspešné vyliahnutie
                                 
                                 
                                    Počet vyliahnutých lariev, ktoré prežili
                                 
                              
                                    
                                       Sladkovodné:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    pstruh dúhový
                                 
                                 
                                    10 ± 1,5 (99)
                                    
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 – 16 (100)
                                    
                                 
                                 
                                    2 týždne po tom, ako kontrolné skupiny začnú prijímať potravu (alebo 60 dní po vyliahnutí)
                                 
                                 
                                    40
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    čerebľa potočná
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    16
                                 
                                 
                                    32 dní od začiatku testu (alebo 28 dní po vyliahnutí)
                                 
                                 
                                    18
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    danio pruhované
                                 
                                 
                                    26 ± 1,5
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 – 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 dní po vyliahnutí
                                 
                                 
                                    11
                                 
                                 
                                    70 %
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    ryžovníčka japonská
                                 
                                 
                                    25 ± 2
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    12 – 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    30 dní po vyliahnutí
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Ryby z ústí a morské ryby:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    kaprozúbka diamantová
                                 
                                 
                                    25 ± 1,5
                                 
                                 
                                    15 – 35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    12 – 16 (101)
                                    
                                 
                                 
                                    32 dní od začiatku testu (alebo 28 dní po vyliahnutí)
                                 
                                 
                                    17
                                 
                                 
                                    75 %
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    menídia pobrežná
                                 
                                 
                                    22 – 25
                                 
                                 
                                    15 – 35 (102)
                                    
                                 
                                 
                                    13
                                 
                                 
                                    28 dní
                                 
                                 
                                    20
                                 
                                 
                                    80 %
                                 
                                 
                                    60 %
                                 
                              
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           NÁVOD NA KŔMENIE GENERAČNÝCH A TESTOVANÝCH ZVIERAT ODPORÚČANÝCH DRUHOV A NA MANIPULÁCIU S NIMI
                        
                        
                                    DRUH
                                 
                                 
                                    POTRAVA (*9)
                                    
                                 
                                 
                                    ČAS PRENOSU PO VYLIAHNUTÍ
                                 
                                 
                                    ČAS DO PRVÉHO KŔMENIA
                                 
                              
                                    Generačné ryby
                                 
                                 
                                    Novo vyliahnuté larvy
                                 
                                 
                                    Mlaď
                                 
                              
                                    Typ
                                 
                                 
                                    Frekvencia
                                 
                              
                                    
                                       Sladkovodné:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oncorhynchus mykiss
                                       
                                    
                                    pstruh dúhový
                                 
                                 
                                    potrava pre pstruhy
                                 
                                 
                                    žiadna (1)
                                    
                                 
                                 
                                    štartovacia potrava pre pstruhy, BSN
                                 
                                 
                                    2 – 4 kŕmenia denne
                                 
                                 
                                    14 – 16 dní po vyliahnutí alebo pri vyplávaní (nie rozhodujúce)
                                 
                                 
                                    19 dní po vyliahnutí alebo pri vyplávaní
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Pimephales promelas
                                       
                                    
                                    čerebľa potočná
                                 
                                 
                                    BSN, vločkové krmivo, FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48, vločkové krmivo
                                 
                                 
                                    2 – 3-krát denne
                                 
                                 
                                    po vyliahnutí 90 % vajíčok
                                 
                                 
                                    2 dni po vyliahnutí
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Danio rerio
                                       
                                    
                                    danio pruhované
                                 
                                 
                                    BSN, vločkové krmivo
                                 
                                 
                                    Komerčné krmivo pre larvy, prvoky (2), bielkoviny (3)
                                    
                                 
                                 
                                    BSN48, vločkové krmivo,
                                 
                                 
                                    BSN raz denne; vločkové krmivo dvakrát denne
                                 
                                 
                                    po vyliahnutí 90 % vajíčok
                                 
                                 
                                    2 dni po vyliahnutí
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Oryzias latipes
                                       
                                    
                                    ryžovníčka japonská
                                 
                                 
                                    vločkové krmivo
                                 
                                 
                                    BSN, vločkové krmivo (alebo prvoky alebo vírniky)
                                 
                                 
                                    BSN48, vločkové krmivo (alebo vírniky)
                                 
                                 
                                    BSN raz denne; vločkové krmivo dvakrát denne alebo vločkové krmivo a vírniky raz denne
                                 
                                 
                                    neuplatňuje sa
                                 
                                 
                                    6 – 7 dní po vytretí
                                 
                              
                                    
                                       Ryby z ústí a morské ryby:
                                    
                                 
                              
                                    
                                       
                                          Cyprinodon variegatus
                                       
                                    
                                    kaprozúbka diamantová
                                 
                                 
                                    BSN, vločkové krmivo, FBS
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2 – 3 kŕmenia denne
                                 
                                 
                                    neuplatňuje sa
                                 
                                 
                                    1 deň po vyliahnutí/pri vyplávaní
                                 
                              
                                    
                                       Menidia sp.
                                    
                                    menídia pobrežná
                                 
                                 
                                    BSN48, vločkové krmivo
                                 
                                 
                                    BSN
                                 
                                 
                                    BSN48
                                 
                                 
                                    2 – 3 kŕmenia denne
                                 
                                 
                                    neuplatňuje sa
                                 
                                 
                                    1 deň po vyliahnutí/pri vyplávaní
                                 
                              
                              
                     
                        Dodatok 4
                        
                           NIEKTORÉ CHEMICKÉ VLASTNOSTI VODY VHODNEJ NA RIEDENIE
                        
                        
                                    Zložka
                                 
                                 
                                    Hraničná koncentrácia
                                 
                              
                                    Tuhé častice
                                 
                                 
                                    5 mg/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organického uhlíka
                                 
                                 
                                    2 mg/l
                                 
                              
                                    Neionizovaný amoniak
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Zvyškový chlór
                                 
                                 
                                    10 μg/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organofosfátových pesticídov
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organochlórových pesticídov a polychlórovaných bifenylov
                                 
                                 
                                    50 ng/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organického chlóru
                                 
                                 
                                    25 ng/l
                                 
                              
                                    Hliník
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Arzén
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Chróm
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kobalt
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Meď
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Železo
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Olovo
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Nikel
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Zinok
                                 
                                 
                                    1 μg/l
                                 
                              
                                    Kadmium
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Ortuť
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                                    Striebro
                                 
                                 
                                    100 ng/l
                                 
                              
                     
                        Dodatok 5
                        
                           ŠTATITICKÉ USMERNENIE NA STANOVENIE NOEC
                        
                        
                           Všeobecné informácie
                        
                        Jednotkou analýzy je nádrž s replikátom. To znamená, že pre kontinuálne merania, ako je veľkosť, by sa mala vypočítať priemerná alebo mediánová hodnota replikátu a tieto hodnoty replikátu sa stanú údajmi pre analýzu. Mala by sa preukázať sila vykonávaných testov, najlepšie na základe príslušnej historickej databázy pre každé laboratórium. Pre každý ukazovateľ by sa mal poskytnúť účinok na veľkosť, ktorý možno zistiť so 75 – 80 % silou, a to spolu so štatistickým testom, ktorý sa má použiť.
                        Podľa databáz dostupných v čase vypracúvania tejto testovacej metódy sa určí sila, ktorá je možná na základe odporúčaných štatistických postupov. Jednotlivé laboratóriá by mali preukázať svoju schopnosť splniť túto požiadavku na silu buď vykonaním svojej vlastnej analýzy sily alebo preukázaním toho, že variačný koeficient (CV) pre žiadnu reakciu neprekračuje 90. percentil CV použitých pri vypracúvaní usmernení na vykonávanie testov. V tabuľke 1 sú uvedené tieto CV. Ak sú k dispozícii len priemerné alebo mediánové hodnoty replikátu, CV v rámci replikátu možno ignorovať.
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           90. percentil CV pre zvolené sladkovodné druhy
                        
                        
                                    Druh
                                 
                                 
                                    Reakcia
                                 
                                 
                                    CV_medzi replikátmi
                                 
                                 
                                    CV_v rámci replikátov
                                 
                              
                                    Pstruh dúhový
                                 
                                 
                                    dĺžka
                                 
                                 
                                    17,4
                                 
                                 
                                    9,8
                                 
                              
                                    hmotnosť
                                 
                                 
                                    10,1
                                 
                                 
                                    28
                                 
                              
                                    Čerebľa potočná
                                 
                                 
                                    dĺžka
                                 
                                 
                                    16,9
                                 
                                 
                                    13,5
                                 
                              
                                    hmotnosť
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                                 
                                    38,7
                                 
                              
                                    Danio pruhované
                                 
                                 
                                    dĺžka
                                 
                                 
                                    43,7
                                 
                                 
                                    11,7
                                 
                              
                                    hmotnosť
                                 
                                 
                                    11,9
                                 
                                 
                                    32,8
                                 
                              Takmer pri všetkých štatistických testoch používaných na vyhodnocovanie laboratórnych toxikologických štúdií majú dôležitosť porovnania skupín s aplikovanou chemikáliou s kontrolnými skupinami. Preto nie je vhodné pred použitím Dunnettovho alebo Williamsovho testu požadovať významný ANOVA F-test alebo pred použitím Jonckheereho-Terpstrovho, Mannovho-Whitneyho alebo Dunnovho testu požadovať významný Kruskalov-Wallisov test (Hochberg a Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964).
                        Dunnettov test má v sebe zabudovanú úpravu mnohopočetnosti a na jeho mieru falošných pozitívnych a falošných negatívnych nálezov má nepriaznivý vplyv použitie F-testu ako kontrolného testu. Podobne sa step-down Williamsovým a Jonckheereho-Terpstrovým testom trendu používajúcimi v každom kroku úroveň významnosti 0,05 zachováva celková 5 % miera falošných pozitívnych nálezov a túto mieru a silu testov nepriaznivo ovplyvňuje používanie F-testu alebo Kruskalovho-Wallisovho testu ako kontrolného testu. Mannov-Whitneyho a Dunnov test sa musí upraviť na mnohopočetnosť, pričom sa odporúča Bonferroniho-Holmova úprava.
                        Dôkladná diskusia o väčšine odporúčaní k testovaniu hypotéz a overovaniu predpokladov, z ktorých tieto testy vychádzajú, je uvedená v dokumente OECD z roku 2006, kde sa takisto uvádza rozsiahla bibliografia.
                        
                           Spracovanie kontrolných skupín pri použití rozpúšťadla
                        
                        Kontrolná skupina s vodou na riedenie aj kontrolná skupina s rozpúšťadlom by sa mali zahrnúť, ak sa používa rozpúšťadlo. V týchto dvoch kontrolných skupinách sa porovná každá reakcia a, ak sa medzi nimi nezistí žiadny významný rozdiel, skombinujú sa na účely štatistickej analýzy. Inak by sa na stanovenie NOEC alebo odhad ECx mala použiť kontrolná skupina s rozpúšťadlom a kontrolná skupina s vodou sa nepoužije. Pozri obmedzenia v kritériách platnosti (bod 7).
                        Pokiaľ ide o dĺžku, hmotnosť, pomer vyliahnutia vajíčok, úmrtnosti lariev alebo abnormálnych lariev a prvý alebo posledný deň liahnutia alebo vyplávanie, na porovnanie kontrolnej skupiny s vodou na riedenie a kontrolnej skupiny s rozpúšťadlom pri 0,05 hladine významnosti by sa mal použiť T-test alebo Mannov-Whitneyho test, pričom by sa mali ignorovať všetky skupiny s aplikovanou chemikáliou. Výsledky týchto testov by sa mali uviesť.
                        
                           Merania veľkosti (dĺžka a hmotnosť)
                        
                        Hodnoty dĺžky a hmotnosti jednotlivých rýb môžu byť rozložené normálne alebo logaritmicko-normálne. V obidvoch prípadoch majú stredné hodnoty replikátov tendenciu byť rozložené normálne v zmysle centrálnej limitnej vety a potvrdené z údajov z vyše 100 štúdií ELS troch sladkovodných druhov. Alternatívne tam, kde z údajov alebo historických databáz vyplýva logaritmicko-normálne rozdelenie hodnôt veľkostí jednotlivých rýb, možno vypočítať logaritmus priemernej veľkosti jednotlivých rýb replikátov a ako údaje pre analýzu možno potom použiť antilogaritmy týchto logaritmov priemernej hodnoty replikátov.
                        Údaje by sa mali vyhodnotiť z hľadiska konzistencie s normálnym rozložením a homogenitou rozptylu. Na tento účel by sa mali použiť reziduá z modelu ANOVA s koncentráciou ako jedinou vysvetľujúcou triednou premennou. Možno použiť vizuálne stanovenie z korelačných (bodových) grafov a histogramov alebo stonkových a listových (tzv. stem-and-leaf) grafov. Alternatívne možno použiť neformálny test, ako je Shapirov-Wilkov test alebo Andersonov-Darlingov test. Konzistentnosť s homogenitou rozptylu možno posúdiť na základe vizuálneho preskúmania toho korelačného (bodového) grafu alebo formálne z Levenovho testu. Len parametrické testy (napr. Williamsov, Dunnettov) treba vyhodnotiť z hľadiska normality alebo homogenity rozptylu.
                        Mala by sa venovať pozornosť možným extrémnym hodnotám (outlier) a ich účinku na analýzu. Možno použiť Tukeyho test extrémnych hodnôt a vizuálnu kontrolu tých istých už opísaných diagramov reziduí. Treba pripomenúť, že pozorovaniami sú celé replikáty, takže k vypusteniu extrémnej hodnoty z analýzy by sa malo pristúpiť len po dôkladnom zvážení.
                        Štatistické testy, pri ktorých sa používajú charakteristiky návrhu experimentu a biologické očakávania, sú step-down testmi trendu, ako sú Williamsov a Jonckheereho-Terpstrov test. Tieto testy predpokladajú monotónnu koncentračnú závislosť a malo by sa posúdiť, či sú údaje v súlade s týmto predpokladom. To možno vykonať vizuálne z korelačného (bodového) grafu vzťahu medzi priemernými hodnotami replikátov a koncentráciami. Tento korelačný (bodový) graf by bolo vhodné prekryť úsekovým lineárnym grafom spájajúcim priemerné koncentrácie vážené veľkosťou vzorky replikátu. Veľká odchýlka tohto úsekového lineárneho diagramu od monotónnosti by naznačovala možnú potrebu použitia netrendových testov. Alternatívne možno použiť formálne testy. Jednoduchým formálnym testom je vypočítanie lineárnych a kvadratických kontrastov priemerných koncentrácií. Ak je kvadratický kontrast významný a lineárny kontrast nie je významný, naznačuje to možný problém s monotónnosťou, ktorej ďalšie hodnotenie by sa malo uskutočniť na základe diagramov. Ak môžu normalita alebo homogenita rozptylu predstavovať problém, možno tieto kontrasty zostaviť z údajov transformovaných podľa poradia. Možno použiť alternatívne postupy, ako je Bartholomewov test monotónnosti, pridávajú však na zložitosti.
                        
                           Obrázok 2
                        
                        
                           Vývojový diagram NOEC s meraniami veľkosti (dĺžka a hmotnosť)
                        
                        Pokiaľ nie sú údaje v súlade s požiadavkami týchto testov, NOEC sa stanoví uplatnením step-down Williamsovho alebo Jonckheereho-Terpstrovho testu trendu. V dokumente OECD z roku 2006 sa uvádzajú podrobnosti k tomuto postupu. Pre údaje, ktoré nie sú v súlade s požiadavkami na step-down test trendu, možno použiť Dunnettov test alebo Tamhaneho-Dunnettov (T3) test, z ktorých obidva majú zabudované úpravy pre mnohopočetnosť. Tieto testy predpokladajú normalitu a, v prípade Dunnettovho testu, homogenitu rozptylu. Ak nie sú tieto podmienky splnené, možno použiť Dunnov neparametrický test. V dokumente OECD z roku 2006 sa uvádzajú podrobnosti ku všetkým týmto testom. Na obrázku 2 je uvedený prehľad o tom, ako vybrať test.
                        
                           Vyliahnutie vajíčok a prežitie lariev
                        
                        Údaje predstavujú pomery vajíčok, z ktorých sa vyliahnu larvy, alebo lariev, ktoré prežijú v jednotlivých replikátoch. Pri týchto pomeroch by sa mal posúdiť extrabinomický rozptyl, ktorý je pri takýchto nameraných hodnotách bežný, ale nie univerzálny. Vývojový diagram na obrázku 3 poskytuje usmernenie k voľbe testu; podrobné opisy nájdete v texte.
                        Bežne sa používajú dva testy. Sú to Taroneho test C(α) (Tarone, 1979) a chí-kvadrát testy, každý použitý osobitne na každú testovaciu koncentráciu. Ak sa extrabinomický rozptyl zistí čo i len pri jednej testovacej koncentrácii, mali by sa použiť metódy, ktoré ho berú do úvahy.
                        
                           Vzorec 1
                        
                        
                           Taroneho test C(α) (Tarone, 1979)
                        
                        
                           
                        kde ̂ je priemerný pomer pre danú koncentráciu, m je počet nádrží s replikátom, nj
                            je počet subjektov v replikáte j a xj
                            je počet reagujúcich subjektov v danom replikáte, teda nie vyliahnutých alebo mŕtvych. Tento test sa použije na každú koncentráciu osobitne. Tento test možno považovať za upravený chí-kvadrát test, ale obmedzené simulácie sily, ktoré vykonal Tarone, ukázali, že má väčšiu silu ako chí-kvadrát test.
                        
                           Obrázok 3
                        
                        
                           Vývojový diagram NOEC pre vyliahnutie a úmrtnosť lariev
                        
                        Tam, kde neexistuje žiadny významný dôkaz extrabinomického rozptylu, možno použiť step-down Cochranov-Armitageov test. Pri tomto teste sa ignorujú replikáty, takže tam, kde existuje dôkaz o takomto rozptyle, sa odporúča Raova-Scottova úprava Cochranovho-Armitageovho testu, ktorá zohľadňuje replikáty, veľkosti replikátov a extrabinomický rozptyl. Alternatívne testy zahŕňajú step-down Williamsov test, Jonckheereho-Terpstrov test a Dunnettov test, ako sa uvádza pri meraniach veľkosti. Tieto testy sa používajú bez ohľadu na existenciu extrabinomického rozptylu, ale majú o niečo menšiu silu (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996).
                        
                           Prvý alebo posledný deň liahnutia alebo vyplávanie
                        
                        Reakcia je celé číslo udávajúce, ktorý deň došlo k pozorovaniu uvedeného javu v danej nádrži s replikátom. Rozsah hodnôt je všeobecne veľmi obmedzený a často je vysoký pomer viazaných hodnôt, napr. vo všetkých kontrolných replikátoch je pozorovaný ten istý prvý deň liahnutia a možno aj v jednej alebo dvoch nízkych testovacích koncentráciách. Parametrické testy ako Williamsov a Dunnettov nie sú na takéto údaje vhodné. Pokiaľ neexistuje dôkaz o vážnej nemonotónnosti, je na zistenie účinkov testovanej chemikálie veľmi vhodný step-down Jonckheereho-Terpstrov test trendu. Inak možno použiť Dunnov test.
                        
                           Abnormality lariev
                        
                        Reakciou je počet lariev, u ktorých sa zistí nejaká forma abnormality. Táto reakcia má často malý výskyt a spája sa s rovnakými problémami ako prvý deň liahnutia, a takisto niekedy vykazuje nepravidelnosť v koncentračnej závislosti. Ak údaje aspoň zhruba sledujú monotónny tvar koncentrácie, je na zistenie účinkov vhodný step-down Jonckheereho-Terpstrov test trendu. Inak možno použiť Dunnov test.
                        ODKAZY
                        Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken.
                        Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121.
                        Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252.
                        Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491.
                        Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648.
                        Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454.
                        Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York.
                        Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton.
                        Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133.
                        Morgan, B.J.T. (1992). Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585.
                        Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385.
                        Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988). Order restricted statistical inference, Wiley.
                        Tarone, R.E. (1979). Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590.
                        Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117.
                        Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531.
                        Williams D. A. (1975). The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratology, Biometrics 31, 949-952.
                        Williams D.A. (1977). Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14.
                     
                     
                        Dodatok 6
                        
                           ŠTATISTICKÉ USMERNENIE NA STANOVENIE REGRESNÝCH ODHADOV
                        
                        
                           Všeobecné informácie
                        
                        Pozorovania použité na zavedenie modelu sú stredné hodnoty replikátov (dĺžka a hmotnosť) alebo pomery replikátov (počet vyliahnutých vajíčok a úmrtnosť lariev) (OECD, 2006).
                        Všeobecne sa odporúča vážená regresia s použitím veľkosti vzorky replikátu ako váhy. Možno použiť ďalšie systémy váženia, napríklad váženie predpokladanou priemernou reakciou alebo kombináciou tohto systému a veľkosti vzorky replikátu. Váženie recipročnou hodnotou rozptylu vzorky v rámci koncentrácie sa neodporúča (Bunke et al. 1999, Seber a Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003).
                        Pri akejkoľvek transformácii reakcií pred analýzou by sa mala zachovať nezávislosť pozorovaní a hodnoty ECx a jej hranice spoľahlivosti by sa mali vyjadriť v pôvodných meracích jednotkách, nie v transformovaných jednotkách. Napríklad 20 % zmena v logaritme dĺžky nie je ekvivalentná 20 % zmene dĺžky (Lyles et.al 2008, Draper a Smith 1999).
                        Vývojový diagram na obrázku 4 poskytuje prehľad odhadov ECx. Podrobnosti sú opísané v ďalšom texte.
                        
                           Obrázok 4
                        
                        
                           Vývojový diagram odhadov ECx priemernej dĺžky, hmotnosti alebo pomeru vyliahnutých lariev alebo úmrtnosti lariev replikátu, ďalšie podrobnosti nájdete v texte
                        
                        
                           Úvahy v súvislosti s liahnutím vajíčok a úmrtnosťou lariev
                        
                        Pokiaľ ide o liahnutie vajíčok a úmrtnosť lariev, vo všeobecnosti je najlepšie zaviesť klesajúci model, pokiaľ sa nezavádza probitový model podľa ďalej uvedeného opisu. To znamená, že by sa mal vytvoriť model pomeru vajíčok, z ktorých sa nevyliahnu larvy, alebo lariev, ktoré uhynú. Dôvodom je to, že hodnota ECx sa vzťahuje na koncentráciu, pri ktorej dochádza k zmene rovnajúcej sa x % priemernej reakcie kontrolnej skupiny. Ak je v kontrolnej skupine 5 % vajíčok, z ktorých sa nevyliahnu larvy, a ak sa na základe toho vytvorí model nevyliahnutia, potom sa EC20 vzťahuje na koncentráciu, pri ktorej je šanca rovnajúca sa 20 % z 5 % nevyliahnutí lariev v kontrolnej skupine, čo predstavuje zmenu 0,2 * 0,05 = 0,01 alebo 1 percentuálneho bodu do 6 % nevyliahnutia lariev. Takúto malú zmenu nemožno odhadnúť žiadnym zmysluplným spôsobom z dostupných údajov a nie je biologicky významná. Ak sa však vytvára model pomeru vajec, z ktorých sa vyliahnu larvy, pomer kontrolnej skupiny by bol v tomto príklade 95 % a 20 % pokles z priemernej hodnoty kontrolnej skupiny by predstavoval zmenu 0,95 * 0,2 = 0,18, takže z 95 % úspešného vyliahnutia na 77 % (= 95 – 18) úspešné vyliahnutie, pričom túto účinnú koncentráciu možno odhadnúť a má pravdepodobne väčší význam. Nejde o problém s nameranými hodnotami veľkosti, hoci nepriaznivé účinky na veľkosť spravidla znamenajú zníženie veľkosti.
                        
                           Modely pre veľkosť (dĺžku alebo hmotnosť) a úspešné vyliahnutie vajíčok alebo prežitie lariev.
                        
                        Okrem Brainovho-Cousensovho hormetického modelu sa všetky tieto modely opisujú a odporúčajú v dokumente OECD z roku 2006. V súvislosti s modelmi nazývanými OECD 2-5 sa Slobova práca z roku 2002 takisto zaoberá experimentmi na ekotoxicitu. Existuje, samozrejme, mnoho iných modelov, ktoré môžu byť užitočné. Bunke, et al. (1999) uvádzajú početný zoznam modelov, ktoré tu nie sú zahrnuté, a existuje mnoho odkazov na ďalšie modely. Modely uvedené ďalej sa odporúčajú ako zvlášť vhodné v experimentoch na ekotoxicitu a často sa používajú.
                        
                           S 5 testovacími koncentráciami plus kontrolou
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Bruceov-Versteegov model,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    jednoduchý exponenciálny model (OECD 2),
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    exponenciálny model s parametrom tvaru (OECD 3),
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    jednoduchý exponenciálny model s dolnou hranicou (OECD 4).
                                 
                              
                           So 6 testovacími koncentráciami plus kontrolou
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    exponenciálny model s parametrom tvaru a dolnou hranicou (OECD 5),
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Michaelisov-Mentenovej model,
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Hillov model.
                                 
                              Ak existuje vizuálny dôkaz hormézy (nepravdepodobné pri úspešnom vyliahnutí alebo prežití lariev, ale občas ju možno zaznamenať pri pozorovaní veľkosti)
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Brainov-Cousensov hormetický model; Brain a Cousens (1989).
                                 
                              
                           Alternatívne modely pre nevyliahnutie vajíčok a úmrtnosť lariev
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Na stúpajúce modely pre tieto reakcie možno použiť probitové (alebo logistické) modely, ak neexistuje žiadny dôkaz extrabinomického rozptylu a odhad výskytu v kontrole je súčasťou zavedeného modelu. Toto nie je uprednostňovaná metóda, pretože za jednotku analýzy považuje jedinca, nie replikát (Morgan 1992, O'Hara Hines a Lawless 1993, Collett 2002, 2003).
                                 
                              
                           Vhodnosť zavedenia jedného modelu
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Vizuálne porovnajte pozorovaný a predpokladaný percentuálny pokles pri každej testovacej koncentrácii (Motulsky a Christopoulos 2004, Draper a Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Porovnajte strednú kvadratickú chybu regresie s čistou strednou kvadratickou chybou pomocou F-testu (Draper a Smith 1999).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Skontrolujte, či sa každý člen v modeli významne líši od nuly (t. j. určte, či sú všetky členy modelu dôležité), (Motulsky a Christopoulos 2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Diagramy reziduí z regresie oproti testovacej koncentrácii, pokiaľ možno na logaritmickej stupnici (koncentrácia). Tento diagram by nemal mať žiadny vzor, body by mali byť náhodne rozptýlené okolo horizontálnej línie v nulovej výške.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Údaje by sa mali vyhodnotiť z hľadiska normality a homogenity rozptylu rovnako, ako sa uvádza v dodatku 5.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Okrem toho by sa mala posúdiť normalita reziduí v rámci regresného modelu tými istými metódami, ktoré sú uvedené v dodatku 5 pre reziduá z ANOVA.
                                 
                              
                           Porovnajte modely
                        
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Použite Akaikeho AICc kritériá. Menšie hodnoty AICc označujú lepšie zavedené modely a, ak AICc(B) – AICc(A) ≥ 10, model A je takmer určite lepší ako model B (Motulsky a Christopoulos 2004).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Porovnajte tieto dva modely vizuálne na základe toho, ako dobre spĺňajú uvedené kritériá jedného modelu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Odporúča sa princíp úspornosti, na základe ktorého sa použije najjednoduchší model, ktorý primerane dobre zodpovedá údajom (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008).
                                 
                              
                           Kvalita odhadu hodnoty ECx
                           
                        
                        Interval spoľahlivosti (CI) pre hodnotu ECx by nemal byť príliš široký. Na rozhodnutie o tom, aký široký môže byť interval spoľahlivosti, aby bola hodnota ECx stále užitočná, je potrebný štatistický úsudok. Simulácie pre regresné modely prispôsobené údajom o liahnutí a veľkosti ukazujú, že okolo 75 % intervalov spoľahlivosti pre ECx (x=10, 20 alebo 30) zahŕňa nie viac ako dve testovacie koncentrácie. To poskytuje všeobecný návod na to, čo je prijateľné, a praktický návod na to, čo možno dosiahnuť. Mnohí autori tvrdia, že treba uvádzať intervaly spoľahlivosti pre všetky parametre modelu a že široké intervaly spoľahlivosti pre parametre modelov poukazujú na neprijateľné modely (Ott a Longnecker 2008, Alvord a Rossio 1993, Motulsky a Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber a Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005).
                        CI pre ECx (alebo akýkoľvek iný parameter modelu) by nemal obsahovať nulu (Motulsky a Christopoulos 2004). Toto je v regresnom modeli ekvivalent minimálneho významného rozdielu, ktorý sa často cituje v prístupoch k testovaniu hypotéz (napr. Wang et al 2000). Takisto zodpovedá intervalu spoľahlivosti pre stredné reakcie pri LOEC neobsahujúcej priemernú hodnotu kontroly. Treba sa zamyslieť nad tým, či sú odhady parametrov vedecky možné. Napr. ako interval spoľahlivosti pre y0 je ±20 %, žiadny odhad EC10 nie je hodnoverný. Ak model predpokladá 20 % účinok pri koncentrácii C a maximálny pozorovaný účinok pri C a nižších koncentráciách je 10 %, potom hodnota EC20 nie je hodnoverná (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005).
                        Hodnota ECx by si nemala vyžadovať extrapoláciu mimo rozsahu pozitívnych koncentrácií (Draper a Smith 1999, OECD 2006). Napríklad všeobecným návodom by mohlo byť, že hodnota ECx by nemala byť viac než okolo 25 % pod najnižšou testovanou koncentráciou alebo nad najvyššou testovanou koncentráciou.
                        ODKAZY
                        Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993). Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163.
                        Brain P. a Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93 – 96.
                        Bunke, O., Droge, B. a Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240.
                        Collett, D. (2002). Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Collett, D. (2003). Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London.
                        Draper, N.R. a Smith, H. (1999). Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons.
                        Environment Canada (2005). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46
                        Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003). Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York.
                        Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, a C.R. Cooper (2008). Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878 – 886.
                        Morgan, B.J.T. (1992). Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London.
                        Motulsky, H., A. Christopoulos (2004). Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA.
                        O'Hara Hines, R. J. a J. F. Lawless (1993). Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121
                        OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.
                        Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA
                        Ratkowsky, D.A. (1993). Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199.
                        Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003
                        Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312
                        Wang, Q., D.L. Denton, a R. Shukla (2000). Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000.
                     
                     C.48   Krátkodobý reprodukčný test na rybách
                     
                     ÚVOD
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 229 (2012). Potreba vypracovať a validovať test na rybách schopný odhaliť chemikálie s účinkom na endokrinný systém vychádza z obavy, že úroveň týchto chemikálií v životnom prostredí môže mať škodlivé účinky na ľudí aj na voľne žijúce živočíchy v dôsledku pôsobenia týchto chemikálií na endokrinný systém. Organizácia OECD v roku 1998 iniciovala aktivitu s vysokou prioritou s cieľom zrevidovať existujúce usmernenia a vypracovať nové usmernenia na vykonávanie skríningu a testov potenciálnych endokrinných disruptorov. Jednou zložkou tejto aktivity bolo vypracovanie usmernenia na vykonávanie testov pre skríning chemikálií s účinkom na endokrinný systém určitých druhov rýb. Krátkodobý reprodukčný test na rybách podstúpil rozsiahly program validácie pozostávajúci z medzilaboratórnych štúdií s vybranými chemikáliami na preukázanie relevantnosti a spoľahlivosti testu na odhalenie chemikálií, ktoré rôznymi mechanizmami vplývajú na reprodukciu rýb vrátane zmien endokrinného systému (1, 2, 3, 4, 5). Všetky ukazovatele usmernenia OECD na vykonávanie testov boli validované na čerebli potočnej a podmnožina ukazovateľov bola validovaná na ryžovníčke japonskej (medaka) (t. j. vitelogenín a sekundárne pohlavné znaky) a na daniu pruhovanom (t. j. vitelogenín). Validácia bola čiastočne partnersky preskúmaná panelom odborníkov menovaných národnými koordinátormi programu OECD pre usmernenia na vykonávanie testov (6) a nezávislým panelom odborníkov, ktorých si objednala Agentúra Spojených štátov na ochranu životného prostredia (29). Tento test nie je určený na identifikáciu špecifických mechanizmov hormonálneho narušenia, lebo testované zvieratá majú intaktnú os hypotalamus – hypofýza – gonády (HHG), ktorá môže reagovať na ovplyvňujúce chemikálie na rôznych úrovniach.
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Táto testovacia metóda opisuje skríningový test in vivo, v rámci ktorého sa pohlavne dospelí samci a neresiace sa samice rýb držia spolu a vystavia sa pôsobeniu chemikálie počas obmedzenej etapy ich životného cyklu (21 dní). Po skončení 21-dňovej expozície sa u samcov a samíc odmerajú dva biomarkerové ukazovatele ako indikátory endokrinnej aktivity testovanej chemikálie; týmito ukazovateľmi sú vitelogenín a sekundárne pohlavné znaky. Vitelogenín sa meria pri čerebli potočnej, ryžovníčke japonskej a daniu pruhovanom, zatiaľ čo sekundárne pohlavné znaky iba pri čerebli potočnej a ryžovníčke japonskej. Okrem toho sa počas testu denne monitoruje kvantitatívna plodivosť. Gonády sú takisto zachované a na posúdenie reprodukčného zdravia testovaných zvierat a zvýšenie váhy dôkazov iných ukazovateľov možno vyhodnotiť histopatológiu.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Tento biologický test slúži ako skríningový test in vivo a jeho použitie by sa malo posudzovať v kontexte „Koncepčného rámca OECD na testovanie a hodnotenie chemikálií ako endokrinných disruptorov“ (30). V tomto koncepčnom rámci sa krátkodobý reprodukčný test na rybách navrhuje na úrovni 3 ako test in vivo poskytujúci údaje o vybranom endokrinnom mechanizme(-och)/endokrinnej ceste(-ách).
                              
                           POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Vitelogenín (VTG) sa spravidla vytvára v pečeni samíc vajcorodých stavovcov ako reakcia na cirkulujúci endogénny estrogén. Je to prekurzor proteínov vaječného žĺtka a po vzniku v pečeni sa krvným obehom dostáva k vaječníkom, ktoré ho prijmú a modifikujú v procese tvorby vajíčok. Vitelogenín je takmer nezistiteľný v plazme nedospelých samíc a samcov rýb, pretože nemajú dostatok cirkulujúceho estrogénu; ich pečeň je však schopná syntetizovať a vylučovať vitelogenín v prípade stimulácie exogénnym estrogénom.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Meranie vitelogenínu slúži na zisťovanie chemikálií s rôznymi estrogénnymi mechanizmami pôsobenia. Estrogénne chemikálie možno zisťovať meraním indukcie vitelogenínu v telách samcov rýb, čo bolo veľakrát zdokumentované v partnersky preskúmanej vedeckej literatúre [napr. (7)]. Indukcia vitelogenínu sa preukázala aj po vystavení pôsobeniu aromatizovateľných androgénov (8, 9). Zníženie úrovne cirkulácie estrogénu v telách samíc, napríklad v dôsledku inhibície aromatázy konverziou endogénneho androgénu na prírodný estrogén 17β-estradiol, spôsobuje pokles úrovne VTG, čo sa používa na zisťovanie chemikálií s vlastnosťami inhibície aromatázy (10, 11). Biologický význam reakcie vitelogenínu na estrogénne pôsobenie alebo inhibíciu aromatázy je preukázaný a vo veľkej miere zdokumentovaný. Je však možné, že tvorbu VTG v telách samíc môže ovplyvňovať aj všeobecná toxicita a iné ako endokrinné toxické mechanizmy pôsobenia, napríklad hepatotoxicita.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Viaceré metódy merania boli úspešne vyvinuté a štandardizované na bežné použitie. Je tak aj v prípade druhovo špecifických metód enzýmového imunosorbentového stanovenia (ELISA) využívajúcich imunochémiu na kvantifikáciu VTG produkovaného v malých vzorkách krvi alebo pečene odobratých z jednotlivých rýb (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Na meranie VTG sa odoberajú vzorky krvi čereble potočnej, krvi alebo homogenátu hlavy/chvosta dania pruhovaného a pečene ryžovníčky japonskej. V prípade ryžovníčky japonskej existuje dobrá korelácia medzi VTG meraným z krvi a z pečene (19). Dodatok 6 obsahuje odporúčané postupy odberu vzoriek na analýzu VTG. Súpravy na meranie VTG sú bežne dostupné, pričom by tieto súpravy mali byť založené na validovanej druhovo špecifickej metóde ELISA.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Sekundárne pohlavné znaky samcov určitých druhov rýb sú zvonku viditeľné, kvantifikovateľné a citlivé na cirkulujúce úrovne endogénnych androgénov. Týka sa to čereble potočnej a ryžovníčky japonskej, ale nie dania pruhovaného, ktoré nemá kvantifikovateľné sekundárne pohlavné znaky. Samice si udržiavajú schopnosť vývoja samčích sekundárnych pohlavných znakov, ak sú vystavené pôsobeniu androgénnym chemikáliám vo vode. Vo vedeckej literatúre sú k dispozícii viaceré štúdie dokumentujúce tento typ reakcie pri jedincoch druhu čereble potočnej (20) a ryžovníčky japonskej (21). Interpretácia úbytku sekundárnych pohlavných znakov pri samcoch by mala byť opatrná vzhľadom na nízku štatistickú silu a mala by byť založená na odbornom posudku a závažnosti dôkazov. Použitie dania pruhovaného v rámci tohto testu je obmedzené, keďže nemá kvantifikovateľné sekundárne pohlavné znaky citlivé na androgénne účinky chemikálií.
                              
                           
                              
                                 8.
                              
                              
                                 V prípade čereble potočnej je hlavným indikátorom pôsobenia exogénneho estrogénu počet tuberkulov nachádzajúcich sa na rypáku samíc rýb. V prípade ryžovníčky japonskej predstavuje hlavný marker exogénneho pôsobenia androgénnych chemikálií na samice rýb počet papilárnych výbežkov. V dodatkoch 5A a 5B sú uvedené odporúčané postupy, ktoré treba dodržiavať pri hodnotení vývoja pohlavných znakov čereble potočnej, a ryžovníčky japonskej, v uvedenom poradí.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 21-dňový test na rybách zahŕňa vyhodnotenie kvantitatívnej produkcie vajíčok a zachovanie gonád na voliteľné histopatologické vyšetrenie. Niektoré regulačné orgány môžu vyžadovať tento dodatočný ukazovateľ na kompletnejšie vyhodnotenie reprodukčného zdravia testovaných zvierat alebo v prípadoch, keď vitelogenín a sekundárne pohlavné znaky nereagovali na vystavenie chemikálii. Hoci niektoré ukazovatele môžu mať vysokú diagnostickú hodnotu (napr. indukcia VTG u samcov a tvorba tuberkulov u samíc), nie všetky ukazovatele (napr. plodivosť a histopatológia gonád) v teste majú jednoznačne identifikovať špecifické bunkové mechanizmy pôsobenia. Súbor ukazovateľov skôr kolektívne umožňuje vyvodzovanie záverov v súvislosti s možnými narušeniami endokrinného systému, a teda poskytujú usmernenie na ďalšie testovanie. Hoci plodivosť nie je endokrinologicky špecifická, v dôsledku jej preukázanej citlivosti na mnohé známe chemikálie s účinkom na endokrinný systém (5) ju treba zahrnúť ako dôležitý ukazovateľ, pretože keď zostane spoločne s inými ukazovateľmi neovplyvnená, je väčšia istota, že zlúčenina pravdepodobne nemá účinok na endokrinný systém. Keď je však plodivosť ovplyvnená, významne prispeje pri vyvodzovaní záverov o váhe dôkazov. Návod na interpretáciu údajov a na uznanie výsledkov testu je uvedený ďalej v rámci tejto testovacej metódy.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Definície použité v tejto testovacej metóde sú uvedené v dodatku 1.
                              
                           PRINCÍP TESTU
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 V rámci skúšky sa samci a samice rýb v reprodukčnom stave spoločne vystavia pôsobeniu chemikálie v testovacích nádobách. Ich stav dospelosti a reprodukčný stav umožňuje jasné rozlíšenie obidvoch pohlaví, a teda analýzu každého sledovaného ukazovateľa s ohľadom na pohlavie, a zabezpečuje ich citlivosť na exogénne chemikálie. Po ukončení testu sa pohlavie potvrdí makroskopickým skúmaním gonád po ventrálnom otvorení brušnej dutiny nožnicami. Prehľad príslušných podmienok biologickej analýzy je uvedený v dodatku 2. Skúška sa spravidla začína výberom vzorky rýb z populácie, ktorá je v stave neresenia, pričom by sa nemali používať starnúce živočíchy. Usmernenie týkajúce sa veku rýb a ich reprodukčného stavu sa uvádza v časti o výbere rýb. Test sa vykonáva s použitím troch expozičných koncentrácií chemikálie, ako aj s kontrolnou skupinou s vodou a, ak je to potrebné, s kontrolnou skupinou s rozpúšťadlom. Pri daniu pruhovanom sa používajú dve nádoby alebo replikáty na jednu úroveň aplikácie chemikálie (každá nádoba obsahuje 5 samcov a 5 samíc). Pri čerebli potočnej sa používajú štyri nádoby alebo replikáty na jednu úroveň aplikácie chemikálie (každá nádoba obsahuje 2 samcov a 4 samice). Ide o zohľadnenie teritoriálneho správania samcov čereble potočnej pri súčasnom zachovaní dostatočnej sily testu. Pri ryžovníčke japonskej sa používajú štyri nádoby alebo replikáty na jednu úroveň aplikácie chemikálie (každá nádoba obsahuje 3 samcov a 3 samice). Expozícia trvá 21 dní a odber vzoriek rýb sa vykoná v 21. deň expozície. Kvantitatívna plodivosť sa monitoruje denne.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Pre odber vzoriek v 21. deň sa všetky živočíchy humánne usmrtia. Sekundárne pohlavné znaky sa zisťujú pri čerebli potočnej a ryžovníčke japonskej (pozri dodatok 5A a dodatok 5B); na stanovenie VTG v tele dania pruhovaného a čereble potočnej sa odoberú vzorky krvi, pričom alternatívne možno na stanovenie VTG v tele dania pruhovaného odobrať hlavy/chvosty (dodatok 6); na analýzu VTG v tele ryžovníčky japonskej sa odoberie pečeň (dodatok 6); gonády sa fixujú buď v celku alebo rozrezané na možné histopatologické vyhodnotenie (22).
                              
                           AKCEPTAČNÉ KRITÉRIÁ TESTU
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Na to, aby boli výsledky testu prijateľné, musia byť splnené tieto podmienky:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             úmrtnosť v kontrolných skupinách s vodou (alebo s rozpúšťadlom) na konci trvania expozície by nemala prekročiť hodnotu 10 %,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncentrácia rozpusteného kyslíka by mala byť počas trvania expozície aspoň 60 % hodnoty saturácie vzduchom (ASV),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             teplota vody by sa v žiadnom okamihu počas expozície nemala líšiť o viac ako ± 1,5 °C medzi testovacími nádobami a mala by sa udržiavať v rozsahu 2 °C v rámci teplotných rozsahov špecifikovaných pre daný testovaný druh (dodatok 2),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             malo by byť preukázateľné, že koncentrácia testovanej chemikálie v roztoku bola uspokojivo udržiavaná v rozsahu ± 20 % stredných nameraných hodnôt,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             malo by byť preukázané, že ryby sa aktívne neresia vo všetkých replikátoch pred začatím chemickej expozície a v kontrolných replikátoch počas testu.
                                          
                                       
                           OPIS METÓDY
                     
                        Prístrojové vybavenie
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Bežné laboratórne vybavenie, a najmä tieto zariadenia:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             zariadenie na meranie kyslíka a pH meter;
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             zariadenie na stanovenie tvrdosti a alkality vody;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             vhodné zariadenie na reguláciu teploty a podľa možnosti na kontinuálne monitorovanie;
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             nádrže z chemicky inertného materiálu a vhodného objemu vo vzťahu k odporúčanej veľkosti násady a chovnej hustote (pozri dodatok 2);
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             substrát na neresenie pre čerebľu potočnú a danio pruhované (potrebné údaje sú uvedené v dodatku 4);
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             dostatočne presné váhy (t. j. s presnosťou na ±0,5 mg).
                                          
                                       
                           
                        Voda
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Každú vodu, v ktorej testovaný druh vykazuje vyhovujúco dlhotrvajúce prežívanie a rast, možno použiť na testovanie, Mala by mať konštantnú kvalitu počas celého trvania testu. pH vody by mal byť v rozsahu od 6,5 do 8,5, ale počas daného testu by mal byť v rozsahu ± 0,5 jednotky pH. S cieľom zabezpečiť, aby voda na riedenie nemala prílišný vplyv na výsledok testu (napr. tvorbou komplexu testovanej chemikálie), v určitých intervaloch by sa z nej mali odoberať vzorky. Ak je známe, že voda na riedenie má relatívne stálu kvalitu, zisťovanie ťažkých kovov (napr. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd a Ni), hlavných aniónov a katiónov (napr. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-a SO4
                                    2-), pesticídov (napr. celkového obsahu organofosfátových a organochlórových pesticídov), celkového obsahu organického uhlíka a suspendovaných tuhých látok by sa malo vykonávať napríklad každé tri mesiace. Ak sa preukázalo, že kvalita vody je stabilná najmenej počas jedného roka, merania možno vykonávať menej často a časové intervaly medzi nimi možno predĺžiť (napr. na každých šesť mesiacov). Niektoré chemické vlastnosti vody vhodnej na riedenie sú uvedené v dodatku 3.
                              
                           
                        Testovacie roztoky
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Testovacie roztoky vybraných koncentrácií sa pripravujú riedením zásobného roztoku. Zásobný roztok by sa mal podľa možností pripraviť jednoduchým miešaním alebo trepaním testovanej chemikálie vo vode na riedenie mechanickým prostriedkom (napr. miešadlom alebo ultrazvukom). Na dosiahnutie zásobného roztoku vhodnej koncentrácie možno použiť saturačné kolóny (rozpúšťacie kolóny). Použitie rozpúšťadla ako nosiča sa neodporúča. Ak je však rozpúšťadlo potrebné, mala by sa súbežne pripraviť kontrolná skupina s rozpúšťadlom s rovnakou koncentráciou rozpúšťadla, aká je v skupinách s aplikovanou chemikáliou. Pri ťažko testovateľných chemikáliách by mohlo byť rozpúšťadlo technicky najlepším riešením, mal by sa však konzultovať usmerňovací dokument OECD o testovaní toxicity zložitých látok a zmesí vo vodnom prostredí (23). Výber rozpúšťadla bude daný chemickými vlastnosťami látky alebo zmesi. V usmerňovacom dokumente OECD sa odporúča maximálna hodnota 100 μl/l, ktorá by sa mala dodržiavať. Nedávny prieskum (24) však poukázal na ďalšie problémy pri používaní rozpúšťadiel v rámci testovania endokrinného pôsobenia. Preto sa v prípadoch, keď je použitie rozpúšťadla potrebné, odporúča minimalizovať jeho koncentráciu všade tam, kde je to technicky možné (v závislosti od fyzikálno-chemických vlastností testovanej chemikálie).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Používať sa bude prietokový testovací systém. Takýmto systémom sa kontinuálne rozdeľuje a riedi zásobný roztok testovanej chemikálie (napr. dávkovacím čerpadlom, proporcionálnym zrieďovačom, saturačným systémom) s cieľom dodať sériu koncentrácií do testovacích komôr. Prietoky zásobných roztokov a vody na riedenie by sa mali počas testu kontrolovať v určitých intervaloch, najlepšie denne, a ich hodnoty by sa nemali v priebehu celého testu meniť viac ako o 10 %. Pozornosť by sa mala venovať tomu, aby sa nepoužívali potrubia z plastov s nízkym stupňom kvality alebo z iných materiálov, ktoré môžu obsahovať biologicky aktívne chemikálie. Pri výbere materiálu pre prietokový systém by sa mala zvážiť možná adsorpcia testovanej chemikálie na tento materiál.
                              
                           
                        Chov rýb
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Testované ryby by sa mali vyberať z laboratórnej populácie, podľa možnosti z jednej zásoby, ktorá sa aklimatizovala najmenej dva týždne pred testom v podobných podmienkach, pokiaľ ide o kvalitu vody a osvetlenie, aké sa použijú v rámci testu. Je dôležité, aby veľkosť násady a chovná hustota (definície sú uvedené v dodatku 1) boli vhodné pre použitý testovaný druh (pozri dodatok 2).
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Po 48-hodinovej privykacej (adaptačnej) fáze sa zaznamená úmrtnosť a uplatnia sa tieto kritériá:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             úmrtnosť počas siedmich dní prevyšuje 10 % populácie: celá násada sa vyradí,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             úmrtnosť 5 % až 10 % populácie: aklimatizovať ďalších sedem dní; ak je úmrtnosť počas uvedených ďalších siedmich dní vyššia ako 5 %, celá násada sa vyradí,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             úmrtnosť je počas siedmich dní nižšia ako 5 % populácie: násada sa akceptuje.
                                             
                                          
                                       
                           
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Ryby by nemali byť podrobené liečeniu chorôb počas aklimatizácie, v období pred expozíciou, ani počas expozície.
                              
                           
                        Obdobie pred expozíciou a výber rýb
                     
                     
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Odporúča sa, aby sa zvieratá umiestnili do nádob podobných tým, ktoré sa použijú v rámci skutočného testu, na obdobie jedného až dvoch týždňov pred expozíciou. Ryby by sa mali kŕmiť ad libitum počas celého obdobia chovu a počas fázy expozície. Fáza expozície sa začína s pohlavne dimorfnými dospelými rybami z laboratórnej zásoby reprodukčne zrelých zvierat (napr. s jasne viditeľnými sekundárnymi pohlavnými znakmi v prípade čereble potočnej a ryžovníčky japonskej) vo fáze aktívneho neresenia. Tieto údaje slúžia iba ako všeobecné usmernenie (a nemali by sa brať do úvahy izolovane od pozorovania skutočného reprodukčného stavu danej dávky rýb). Čereble potočné by mali byť približne v 20. (± 2) týždni života za predpokladu, že počas celého života boli chované pri teplote 25 ± 2 °C. Ryžovníčky japonské by mali byť približne v 16. (± 2) týždni života za predpokladu, že počas celého života boli chované pri teplote 25 ± 2 °C. Dania pruhované by mali byť približne v 16. (± 2) týždni života za predpokladu, že počas celého života boli chované pri teplote 26 ± 2 °C. Produkcia vajíčok by sa mala v období pred expozíciou posudzovať denne. Pred zahrnutím nádrží s replikátmi do expozičnej fázy testu sa odporúča pozorovať neresenie vo všetkých vo všetkých z nich. Pokiaľ ide o dennú produkciu vajíčok, v tomto štádiu nie je možné poskytnúť kvantitatívne usmernenie, je však pomerne bežné pri každom druhu pozorovať priemerné neresenie > 10 vajíčok/samica/deň. S cieľom zaistiť vyvážené rozloženie replikátov by sa podľa objemu produkcie vajíčok mal použiť náhodný blokový návrh, v rámci ktorého by sa replikáty pridelili na rôzne experimentálne úrovne.
                              
                           PLÁN ŠTÚDIE
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Používajú sa tri koncentrácie testovanej chemikálie, jedna kontrolná skupina (s vodou), a ak je to potrebné, jedna kontrolná skupina s rozpúšťadlom. Údaje možno analyzovať s cieľom určiť štatisticky významné rozdiely medzi reakciami v skupinách s aplikovanou chemikáliou a v kontrolných skupinách. Tieto analýzy skôr poskytnú informáciu o tom, či je potrebné ďalšie dlhodobé testovanie nepriaznivých účinkov chemikálie (a to na prežitie, rozvoj, rast a reprodukciu), než o ich použiteľnosti na účely hodnotenia rizika (25).
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 V prípade dania pruhovaného sa 21. deň testu u samcov a samíc na každej úrovni aplikácie chemikálie (5 samcov a 5 samíc v každom z dvoch replikátov) a v kontrolných skupinách odoberú vzorky na meranie vitelogenínu. V prípade ryžovníčky japonskej sa 21. deň testu u samcov a samíc na každej úrovni aplikácie chemikálie (3 samcov a 3 samíc v každom zo štyroch replikátov) a v kontrolných skupinách odoberú vzorky na meranie vitelogenínu a na preskúmanie sekundárnych pohlavných znakov. V prípade čereble potočnej sa 21. deň expozície u samcov a samíc (2 samcov a 4 samíc v každom zo štyroch replikátov) a v kontrolných skupinách odoberú vzorky na meranie vitelogenínu a na preskúmanie sekundárnych pohlavných znakov. Vyžaduje sa kvantitatívne hodnotenie plodivosti a gonádne tkanivá by sa mali fixovať v celku alebo rozrezané na možné histopatologické vyhodnotenie, v prípade potreby.
                              
                           
                        Výber testovacích koncentrácií
                     
                     
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Na účely tohto testu by sa najvyššia testovacia koncentrácia mala stanoviť vo výške maximálnej tolerovanej koncentrácie (MTC), ktorá sa určí testom na zistenie rozsahu alebo z iných údajov o toxicite, alebo vo výške 10 mg/l, alebo na základe maximálnej rozpustnosti vo vode podľa toho, ktorá hodnota je najnižšia. MTC je definovaná ako najvyššia testovacia koncentrácia chemikálie, ktorá spôsobuje úmrtnosť nižšiu ako 10 %. Pri tomto prístupe sa predpokladá, že existujú empirické údaje o akútnej toxicite alebo iné údaje o toxicite, na základe ktorých je možné odhadnúť hodnotu MTC. Odhad hodnoty MTC môže byť nepresný a spravidla sa vyžaduje určitý odborný posudok.
                              
                           
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Potrebné sú tri testovacie koncentrácie s konštantným faktorom rozstupu nepresahujúcim hodnotu 10 a kontrolná skupina s vodou na riedenie (v prípade potreby aj kontrolná skupina s rozpúšťadlom). Odporúčaná hodnota faktoru rozstupu by mala byť v rozsahu od 3,2 do 10.
                              
                           POSTUP
                     
                        Výber a váženie testovaných rýb
                     
                     
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Je dôležité hneď na začiatku testu minimalizovať variabilitu hmotnosti rýb. Vhodný rozsah veľkostí pre jednotlivé druhy rýb odporučený na tento test je uvedený v dodatku 2. Pre celý súbor rýb použitých v rámci testu platí, že rozsah individuálnych hmotností samcov a samíc na začiatku testu by sa mal držať podľa možnosti v rozsahu ± 20 % aritmetického priemeru hmotnosti jedincov rovnakého pohlavia. Odporúča sa odvážiť aj čiastkovú vzorku zásoby rýb pred testom, aby bolo možné odhadnúť priemernú hmotnosť.
                              
                           
                        Podmienky expozície
                     
                     
                        Trvanie
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Test trvá 21 dní nasledujúcich po období pred expozíciou. Odporúčané obdobie pred expozíciou je jeden až dva týždne.
                              
                           
                        Kŕmenie
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Ryby by sa mali kŕmiť ad libitum vhodnou potravou (dodatok 2) dostatočne často, aby sa udržiaval ich telesný stav. Treba dbať na to, aby sa predišlo rastu mikroorganizmov a zakaleniu vody. Ako všeobecné usmernenie platí, že dennú dávku možno rozdeliť do dvoch alebo troch rovnakých porcií podávaných vo viacerých kŕmeniach za deň, pričom jednotlivé kŕmenia majú byť oddelené najmenej trojhodinovými prestávkami. Jedna väčšia porcia je prijateľná najmä počas víkendov. Ryby by sa nemali kŕmiť počas 12 hodín pred odberom vzoriek/pitvou.
                              
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Potrava pre ryby by sa mala vyhodnotiť z hľadiska prítomnosti kontaminantov, ako sú organochlórové pesticídy, polycyklické aromatické uhľovodíky (PAU), polychlórované bifenyly. Vylúčiť by sa mala potrava so zvýšenou úrovňou fytoestrogénov, ktorá by ovplyvnila reakciu pri teste v dôsledku známych agonistov estrogénu (napr. 17β- estradiol).
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Nezožraná potrava a fekálny materiál by sa mali odstraňovať z testovacích nádob najmenej dvakrát týždenne, napríklad dôkladným vyčistením dna každej nádrže odsávaním.
                              
                           
                        Svetlo a teplota
                     
                     
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Fotoperióda a teplota vody by mali byť vhodné pre dané testované druhy (pozri dodatok 2).
                              
                           
                        Frekvencia analytických stanovení a meraní
                     
                     
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Pred spustením expozície treba zabezpečiť riadne fungovanie systému prísunu chemikálie. Pripraviť by sa mali všetky potrebné analytické metódy vrátane dostatočných vedomostí o chemickej stabilite v testovacom systéme. Počas testu sa koncentrácie testovanej chemikálie určujú v pravidelných intervaloch takto: prietoky riedidla a zásobného roztoku toxickej látky by sa mali kontrolovať podľa možnosti denne, ale minimálne dvakrát za týždeň, a nemali by sa počas celého testu meniť viac ako o 10 %. Odporúča sa merať skutočné koncentrácie testovanej chemikálie vo všetkých nádobách na začiatku testu a potom v týždenných intervaloch.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Odporúča sa, aby výsledky vychádzali z nameraných koncentrácií. Ak bola koncentrácia testovanej chemikálie v roztoku uspokojivo udržiavaná v rozsahu ± 20 % nominálnej koncentrácie počas celého testu, výsledky môžu vychádzať buď z nominálnych, alebo z nameraných hodnôt.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Vzorky je možno potrebné filtrovať (napr. cez filter s veľkosťou pórov 0,45 μm) alebo odstreďovať. V prípade potreby je odstreďovanie odporúčaným postupom. Ak sa však testovaný materiál neadsorbuje na filtri, aj filtrácia je prijateľná.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Počas testu by sa najmenej raz za týždeň mala merať koncentrácia rozpusteného kyslíka, teplota a hodnota pH vo všetkých testovacích nádobách. Najmenej raz za týždeň by sa mala merať celková tvrdosť vody a alkalita v kontrolných nádobách a v jednej nádobe s najvyššou koncentráciou. Teplota by sa mala podľa možnosti monitorovať kontinuálne aspoň v jednej testovacej nádobe.
                              
                           
                        Pozorovania
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 V priebehu alebo na konci testu sa posudzujú viaceré všeobecné (napr. prežitie) a biologické reakcie (napr. úroveň VTG). Vyžaduje sa denné kvantitatívne monitorovanie plodivosti. Meranie a hodnotenie týchto ukazovateľov a ich využitie sú opísané v ďalších bodoch.
                              
                           
                        Prežitie
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Ryby by sa mali počas testovacieho obdobia denne prehliadnuť, každý úhyn by sa mal zaznamenať a uhynutá ryba čo najskôr odstrániť. Mŕtve ryby by sa nemali nahrádzať ani v kontrolných nádobách, ani v nádobách s aplikovanou chemikáliou. Pohlavie rýb, ktoré uhynuli počas testu, by sa malo určiť makroskopickým hodnotením gonád.
                              
                           
                        Správanie a vzhľad
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Akékoľvek abnormálne správanie (v porovnaní s kontrolnými skupinami) by sa malo zaznamenať; môže ísť o príznaky všeobecnej toxicity vrátane hyperventilácie, nekoordinovaného plávania, straty rovnováhy a atypickej nehybnosti alebo atypického kŕmenia. Okrem toho by sa mali zaznamenať aj vonkajšie abnormality (ako napríklad krvácanie, strata farby). Takéto príznaky toxicity by sa mali starostlivo zvážiť pri interpretácii údajov, lebo môžu naznačovať existenciu koncentrácií, pri ktorých biomarkery endokrinného pôsobenia nie sú spoľahlivé. Takéto pozorovania správania môžu poskytovať aj užitočné kvalitatívne informácie na vypracovanie potenciálnych budúcich požiadaviek na vykonávanie testov s rybami. Napríklad, v prípade normálnych samcov a maskulinizovaných samíc čereble potočnej vystavených androgénnemu pôsobeniu bola pozorovaná teritoriálna agresivita; v prípade dania pruhovaného sa po vystavení estrogénnemu alebo antiandrogénnemu pôsobeniu znižuje alebo brzdí charakteristická aktivita pri párení a neresení po navodení svetelných podmienok svitania.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Keďže niektoré aspekty vzhľadu (predovšetkým farba) sa môžu rýchlo zmeniť pri manipulácii, je dôležité, aby sa kvalitatívne pozorovania vykonávali pred vybratím živočíchov z testovacieho systému. Doterajšie skúsenosti s druhom čereble potočnej naznačujú, že niektoré chemikálie s účinkom na endokrinný systém môžu najskôr vyvolať zmeny týchto vonkajších znakov: farba tela (svetlá alebo tmavá), vzorované sfarbenie (prítomnosť zvislých pruhov) a tvar tela (hlavová a prsná oblasť). Pozorovania fyzického vzhľadu rýb by sa preto mali vykonávať v priebehu celého testu a na záver štúdie.
                              
                           
                        Plodivosť
                     
                     
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Denné kvantitatívne pozorovania neresenia by sa mali zaznamenávať podľa replikátov. Produkcia vajíčok by sa mala zaznamenávať ako počet vajíčok/samicu, ktorá prežila/deň podľa replikátov. Vajíčka sa budú z testovacích komôr odstraňovať denne. V prípade čereble potočnej a dania pruhovaného by sa mali substráty na neresenie umiestniť do testovacej komory, aby sa rybám umožnilo neresiť sa v normálnych podmienkach. V dodatku 4 sa uvádzajú ďalšie podrobnosti o odporúčaných substrátoch na neresenie pre danio pruhované (dodatok 4A) a čerebľu potočnú (dodatok 4B). Poskytnutie substrátu na neresenie pre ryžovníčku japonskú sa nepovažuje za nevyhnutné.
                              
                           
                        Humánne usmrcovanie rýb
                     
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 V 21. deň, t. j. po ukončení expozície, by sa ryby mali usmrtiť primeraným množstvom trikaínu [trikaín metán sulfonát, Metacain, MS-222 (CAS 886-86-2)], 100 – 500 mg/l, tlmeného pridaním 300 mg/l NaHCO3 (hydrogenuhličitan sodný, CAS 144-55-8) na zníženie podráždenia slizníc; potom sa odoberú vzorky krvi alebo tkaniva na stanovenie VTG, ako je vysvetlené v časti o vitelogeníne.
                              
                           
                        Pozorovanie sekundárnych pohlavných znakov
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Niektoré chemikálie s účinkom na endokrinný systém môžu vyvolávať zmeny špecializovaných sekundárnych pohlavných znakov (počet tuberkulov u samcov čereble potočnej, papilárnych výbežkov u samcov ryžovníčky japonskej). Najmä chemikálie s určitými mechanizmami pôsobenia môžu vyvolávať abnormálny výskyt sekundárnych pohlavných znakov u zvierat opačného pohlavia; napríklad agonisty androgénových receptorov, ako sú trenbolón, metyltestosterón a dihydrotestosterón, môžu spôsobovať vyvinutie výrazných tuberkulov u samíc čereble potočnej alebo papilárnych výbežkov u samíc ryžovníčky japonskej (11, 20, 21). Uvádza sa takisto, že agonisty estrogénových receptorov môžu znížiť počet tuberkulov a veľkosť záhlavnej časti chrbta u dospelých samcov čereble potočnej (26, 27). Takéto celkové morfologické pozorovania môžu poskytovať užitočné kvalitatívne a kvantitatívne informácie na vypracovanie potenciálnych budúcich požiadaviek na vykonávanie testov s rybami. Počet a veľkosť tuberkulov u čereble potočnej a papilárnych výbežkov u ryžovníčky japonskej možno kvantifikovať priamo alebo praktickejšie na konzervovaných exemplároch. V dodatkoch 5A a 5B sú uvedené odporúčané postupy hodnotenie sekundárnych pohlavných znakov čereble potočnej a ryžovníčky japonskej v uvedenom poradí.
                              
                           
                        Vitelogenín (VTG)
                     
                     
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Krv sa odoberá z chvostovej tepny/žily heparinizovanou mikrohematokritovou kapilárou alebo alternatívne srdcovou punkciou pomocou striekačky. V závislosti od veľkosti rýb sa objem krvi, ktorú je možné odobrať, vo všeobecnosti pohybuje v rozsahu – 60 μl na jedinca čereble potočnej a 5 – 15 μl na jedinca dania pruhovaného. Plazma sa oddelí od krvi odstredením a uchová sa s inhibítorom proteázy pri teplote – 80 °C, pokým nebude analyzovaná na prítomnosť VTG. Alternatívne sa ako zdroj tkaniva na stanovenie VTG použije pečeň v prípade ryžovníčky japonskej a homogenát hlavy/chvosta v prípade dania pruhovaného (dodatok 6). Meranie VTG by malo byť založené na validovanej homologickej metóde ELISA s použitím homologického štandardu VTG a homologických protilátok. Odporúča sa použiť metódu, ktorou možno zistiť množstvo VTG na úrovni niekoľkých ng/ml plazmy (alebo ng/mg tkaniva), čo je úroveň pozadia v tele samcov rýb, ktoré neboli vystavené chemikálii.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Kontrola kvality analýzy VTG sa vykoná s použitím štandardov, slepých vzoriek a aspoň duplicitnej analýzy. Pre každú metódu ELISA by sa mal na určenie minimálneho faktora riedenia vzorky vykonať test na matricový efekt (efekt zriedenia vzorky). Každá platnička ELISA používaná v rámci testov na zistenie VTG by mala obsahovať tieto vzorky na kontrolu kvality: najmenej 6 kalibračných štandardov zahŕňajúcich rozsah očakávaných koncentrácií VTG a najmenej jednu nešpecifickú viazanú testovaciu slepú vzorku (analyzuje sa duplicitne). Absorbancia týchto slepých vzoriek by mala byť nižšia ako 5 % maximálnej absorbancie kalibračného štandardu. Analyzovať sa budú najmenej dve alikvotné časti (paralelné) každého zriedenia vzorky. Paralelné vzorky, ktoré sa líšia o viac ako 20 %, by sa mali opätovne analyzovať.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Korelačný koeficient (R2) pre kalibračné krivky by mal byť väčší ako 0,99. Vysoká korelácia však nie je dostatočná na to, aby sa zaručilo primerané predvídanie koncentrácie vo všetkých rozsahoch. Okrem dostatočne vysokej korelácie pre kalibračnú krivku by koncentrácia každého štandardu, ktorá sa vypočíta z kalibračnej krivky, mala ležať v rozsahu 70 – 120 % nominálnej koncentrácie. Ak sa nominálne koncentrácie odkláňajú od kalibračnej regresnej priamky (napr. pri nižších koncentráciách), môže byť nevyhnutné rozdeliť kalibračnú krivku na nízky a vysoký rozsah, alebo použiť nelineárny model, ktorý primerane zodpovedá údajom o absorbancii. Ak sa krivka rozdelí, obidve jej časti by mali mať R2 > 0,99.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Detekčný limit (LOD) je definovaný ako koncentrácia najnižšieho analytického štandardu a kvantifikačný limit (LOQ) je definovaný ako súčin koncentrácie najnižšieho analytického štandardu a najnižšieho faktora riedenia.
                              
                           
                              
                                 47.
                              
                              
                                 Každý deň, keď sa vykonávajú testy na zistenie VTG, sa bude analyzovať obohatená vzorka s použitím „inter-assay“ referenčného štandardu (dodatok 7). Spolu s výsledkami z každého súboru testov vykonaných v tento deň sa uvádza pomer očakávanej koncentrácie a nameranej koncentrácie.
                              
                           
                        Vyhodnotenie histopatológie gonád
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Vykonanie histopatológie gonád môžu vyžadovať regulačné orgány na preštudovanie cieľového orgánu na osi HHG po vystavení chemikálii. V tomto zmysle sa gonády fixujú buď v celku alebo rozrezané. Keď sa vyžaduje histopatológia, budú sa pri posudzovaní endokrinného pôsobenia testovanej chemikálie hľadať špecifické reakcie na gonádach súvisiace s endokrinným systémom. Tieto diagnostické reakcie v zásade zahŕňajú prítomnosť testikulárnych oocytov, Leydigovej bunkovej hyperplázie, zníženú tvorbu žĺtka, zvýšené množstvo spermatogónií a perifolikulárnu hyperpláziu. Ďalšie lézie gonád, ako je atrézia oocytov, degenerácia semenníkov a zmeny v štádiách, môžu mať rôzne príčiny. V pokynoch k histopatológii rybích gonád sa stanovujú postupy, ktoré sa budú používať pri rozrezaní, fixovaní, narezaní tenkých vrstiev a histopatologickom vyhodnotení gonád (22).
                              
                           ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Vyhodnocovanie reakcií biomarkerov analýzou rozptylu (ANOVA)
                     
                     
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Na zistenie potenciálneho pôsobenia chemikálie sa porovnávajú reakcie v skupinách s aplikovanou chemikáliou a reakcie v kontrolných skupinách pomocou analýzy rozptylu (ANOVA). Ak sa použije kontrolná skupina s rozpúšťadlom, mali by sa pre každý sledovaný ukazovateľ vykonať vhodné štatistické testy na porovnanie kontrolných skupín s vodou na riedenie a kontrolných skupín s rozpúšťadlom. Usmernenia k spôsobu spracovania údajov z kontrolných skupín s vodou na riedenie a kontrolných skupín s rozpúšťadlom v následnej štatistickej analýze možno nájsť v dokumente OECD 2006c (28). Všetky údaje o biologických reakciách by sa mali analyzovať a uvádzať osobitne podľa pohlavia. Ak sa nesplnia požadované predpoklady parametrických metód – iné ako normálne rozdelenie (napr. Shapirov-Wilkov test) alebo heterogénny rozptyl (Barlettov alebo Levenov test), malo by sa zvážiť transformovanie údajov pred vykonaním analýzy ANOVA tak, aby sa dosiahli homogénne rozptyly, alebo vykonanie váženej ANOVA. V prípade nemonotónnej závislosti reakcie od dávky možno použiť Dunnettov test (parametrický) na viacnásobné párové porovnávanie alebo Mannov-Whitneyho test s Bonferroniho úpravou (neparametrický). Ak je závislosť reakcie od dávky približne monotónna, možno použiť iné štatistické testy (napr. Jonckheereho-Terpstrov test trendu alebo Williamsov test). V dodatku 8 je uvedený štatistický vývojový diagram, ktorý má pomôcť pri rozhodovaní o najvhodnejšom štatistickom teste, ktorý sa má použiť. Doplnkové informácie možno získať aj z dokumentu OECD o súčasných prístupoch v štatistickej analýze údajov o ekotoxicite (28).
                              
                           
                        Popis výsledkov testu
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Údaje zo štúdie by mali zahŕňať:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovacie zariadenie:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         zodpovední pracovníci a ich úlohy v rámci štúdie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         každé laboratórium by malo preukázať odbornosť v používaní škály reprezentatívnych chemikálií.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovaná chemikália:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         charakteristika testovanej chemikálie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fyzikálny charakter a dôležité fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metóda a frekvencia prípravy testovacích koncentrácií,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         informácie o stabilite a biodegradovateľnosti.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rozpúšťadlo:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         charakteristika rozpúšťadla (povaha, použitá koncentrácia),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         odôvodnenie výberu rozpúšťadla (ak je iné ako voda).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testované zvieratá:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         druh a kmeň,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dodávateľ a konkrétne zariadenie dodávateľa,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vek rýb na začiatku testu a stav reprodukcie/neresenia,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         údaje o postupe aklimatizácie zvierat,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         telesná hmotnosť rýb na začiatku expozície (z podvzorky populácie rýb).
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Podmienky testovania:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         použitý postup testovania (druh testu, veľkosť násady, chovná hustota atď.),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metóda prípravy zásobných roztokov a prietok,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nominálne testovacie koncentrácie, týždenne merané koncentrácie testovacích roztokov a použitá analytická metóda, stredné namerané hodnoty a štandardné odchýlky v testovacích nádobách a dôkaz o tom, že merania zodpovedajú koncentráciám testovanej chemikálie v skutočnom roztoku,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vlastnosti vody na riedenie (vrátane pH, tvrdosti, alkality, teploty, koncentrácie rozpusteného kyslíka, úrovne zvyškového chlóru, celkového obsahu organického uhlíka, suspendovaných tuhých látok a výsledkov akýchkoľvek iných vykonaných meraní),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kvalita vody v testovacích nádržiach: pH, tvrdosť, teplota a koncentrácia rozpustného kyslíka,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         podrobné informácie o kŕmení [napr. druh potravy, zdroj, dávkované množstvo a frekvencia a analýza príslušných kontaminantov (napr. polychlórované bifenyly, polycyklické aromatické uhľovodíky a organochlórové pesticídy), ak je k dispozícii].
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Výsledky
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dôkaz, že kontrolné skupiny splnili akceptačné kritériá testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         údaje o úmrtnosti vyskytujúcej sa pri každej z testovacích koncentrácií a v kontrolnej skupine,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         používané štatistické analytické techniky, spracovanie údajov a odôvodnenie použitia daných techník,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         údaje o biologických pozorovaniach celkovej morfológie vrátane sekundárnych pohlavných znakov, tvorbe vajíčok a VTG,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         výsledky analýz údajov, najlepšie v tabuľkovej a grafickej forme,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         výskyt akýchkoľvek neobvyklých reakcií rýb a akýchkoľvek viditeľných účinkov vyvolaných testovanou chemikáliou.
                                                      
                                                   
                                       
                           USMERNENIE KINTERPRETÁCII A AKCEPTÁCII VÝSLEDKOV TESTU
                     
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Táto časť obsahuje niekoľko aspektov, ktoré treba brať do úvahy pri interpretácii výsledkov testu pre jednotlivé merané ukazovatele. Výsledky by sa mali interpretovať opatrne, ak sa zdá, že testovaná chemikália má zjavné toxické účinky alebo ovplyvňuje celkový stav testovaného zvieraťa.
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 S cieľom umožniť zmysluplnú interpretáciu údajov by sa pri stanovení rozsahu testovacích koncentrácií malo dbať na to, aby sa neprekročila maximálna tolerovaná koncentrácia. Je dôležité mať najmenej jednu skupinu s aplikovanou chemikáliou, v ktorej nie sú žiadne príznaky toxických účinkov. Príznaky choroby a príznaky toxických účinkov by sa mali dôkladne vyhodnotiť a zaznamenať. Je napríklad možné, že produkciu VTG v telách samíc môže ovplyvňovať aj všeobecná toxicita a neendokrinné toxické mechanizmy pôsobenia, napríklad hepatotoxicita. Interpretáciu účinkov však možno podporiť inými množstvami aplikovanej chemikálie, ktoré si nemožno pomýliť so systémovou toxicitou.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Existuje niekoľko aspektov, ktoré treba brať do úvahy pri akceptácii výsledkov testu. Ako usmernenie platí, že úrovne VTG v kontrolných skupinách samcov a samíc by sa mali odlišovať a mali by ich oddeľovať približne tri rádové hodnoty v prípade čereble potočnej a dania pruhovaného a približne jedna rádová hodnota v prípade ryžovníčky japonskej. Príklady rozsahu hodnôt, ktoré sa vyskytli v kontrolných skupinách a v skupinách s aplikovanou chemikáliou, sú k dispozícii vo validačných správach (1, 2, 3, 4). Vysoké hodnoty VTG kontrolných samcov by mohli ohroziť citlivosť testu a jeho schopnosť odhaliť slabé agonisty estrogénu. Nízke hodnoty VTG samíc v kontrolných skupinách by mohli ohroziť citlivosť testu a jeho schopnosť odhaliť inhibítory aromatázy a antagonisty estrogénu. Na vypracovanie tohto usmernenia sa použili validačné štúdie.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Kvantifikácia tvorby vajíčok podlieha značnej variabilite [variačný koeficient (CV) sa môže pohybovať od 20 do 60 %], ktorá ovplyvňuje schopnosť testu odhaliť významný pokles produkcie vajíčok menší ako 70 % v prípade, že sa CV blíži k 50 % alebo je vyšší. Keď je CV obmedzený na nižšie hodnoty (okolo 20 – 30 %), potom bude mať test prijateľnú silu (80 %) na odhalenie 40 – 50 % poklesu tvorby vajíčok. Plán štúdie použitý pre čerebľu potočnú, zahŕňajúci štyri replikáty na úroveň aplikácie chemikálie, by mal umožniť väčšiu silu vo vzťahu k ukazovateľu plodivosti v porovnaní s plánom testu len s 2 replikátmi.
                              
                           
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Ak laboratórium predtým nevykonávalo tento test alebo nastali podstatné zmeny (napr. zmena kmeňa rýb alebo dodávateľa), je vhodné realizovať štúdiu technickej spôsobilosti. Odporúča sa použitie chemikálií, ktoré zahŕňajú rôzne mechanizmy pôsobenia alebo vplyvu na viaceré ukazovatele testu. V praxi sa každému laboratóriu odporúča, aby si budovalo svoju vlastnú historickú databázu kontrolných údajov pre samcov a samice a aby používalo chemikáliu na pozitívnu kontrolu na estrogénne pôsobenie (napr. 17β-estradiol, 100 ng/l, alebo známe slabé agonisty), ktoré vedie k zvýšeniu množstva VTG u samcov rýb, chemikáliu na pozitívnu kontrolu na inhibíciu aromatázy (napr. fadrozol alebo prochloraz, 300 μg/l), ktorá vedie k zníženiu množstva VTG u samíc rýb, a chemikáliu na pozitívnu kontrolu na androgénne pôsobenie (napr. 17β-trenbolón, 5 μg/l), ktoré vedie k vzniku sekundárnych pohlavných znakov u samíc čereble potočnej a ryžovníčky japonskej. Všetky tieto údaje možno porovnať s dostupnými údajmi z validačných štúdií (1, 2, 3), aby sa zabezpečila spôsobilosť laboratória.
                              
                           
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Vo všeobecnosti by sa meranie VTG malo považovať za pozitívne, ak v porovnaní s kontrolnou skupinou existuje štatisticky významné zvýšenie množstva VTG u samcov (p < 0,05) alebo štatisticky významný pokles u samíc (p < 0,05) aspoň pri najvyššej testovanej dávke a ak sa nevyskytnú príznaky všeobecnej toxicity. Pozitívny výsledok ďalej podporí preukázanie biologicky hodnoverného vzťahu medzi dávkou a reakčnou krivkou. Ako už bolo uvedené, pokles VTG nemusí mať výlučne endokrinný pôvod; pozitívny výsledok by sa však mal vo všeobecnosti interpretovať ako dôkaz endokrinného pôsobenia in vivo a mal by spravidla viesť k opatreniam na ďalšie objasnenie.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Regulačné orgány môžu vyžadovať vyhodnotenie histopatológie gonád s cieľom stanoviť reprodukčné zdravie testovaných zvierat a umožniť posúdenie váhy dôkazov vyplývajúcich z výsledkov testu. Výsledky histopatológie gonád nemusia byť nevyhnutné v prípadoch, keď buď VTG alebo sekundárne pohlavné znaky sú pozitívne (t. j. zvýšenie alebo pokles VTG alebo vznik sekundárnych pohlavných znakov).
                              
                           LITERATÚRA
                     
                                 1.
                              
                              
                                 OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, Paris.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, Paris.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, Paris.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (accessed 18/09/08).
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 US EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 pp.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, Paris.
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Sumpter J.P. a S. Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives; 103 Suppl 7:173-8 Review.
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Pawlowski S., et al. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3): 277 – 91.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Andersen L., et al. (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3 – 4): 343 – 52.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences; 67(1): 121 – 30.
                              
                           
                                 11.
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1):11 – 21.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Parks L.G., et al. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2): 113 – 25.
                              
                           
                                 13.
                              
                              
                                 Panter G.H., et al. (1999). Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG research report reference AQ001. CEFIC, Brussels, Belgium.
                              
                           
                                 14.
                              
                              
                                 Fenske M., et al. (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217 – 232.
                              
                           
                                 15.
                              
                              
                                 Holbech H., et al. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119 – 131
                              
                           
                                 16.
                              
                              
                                 Rose J., et al. (2002). Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17α-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C 131: 531 – 539.
                              
                           
                                 17.
                              
                              
                                 Brion F., et al. (2002). Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699 – 1708.
                              
                           
                                 18.
                              
                              
                                 Yokota H., et al. (2001). Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87–98.
                              
                           
                                 19.
                              
                              
                                 Tatarazako N., et al. (2004). Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50:301-308.
                              
                           
                                 20.
                              
                              
                                 Ankley G.T., et al. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350 – 60.
                              
                           
                                 21.
                              
                              
                                 Seki M, et al (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23(3): 774 – 81.
                              
                           
                                 22.
                              
                              
                                 OECD (2010). Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 123, Paris.
                              
                           
                                 23.
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris
                              
                           
                                 24.
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006a). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92.
                              
                           
                                 25.
                              
                              
                                 Hutchinson T.H., et al. (2006b). Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as „signposts,“ not „traffic lights,“ in risk assessment. Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1:106-14.
                              
                           
                                 26.
                              
                              
                                 Miles-Richardson S.R., et al. (1999). Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129 – 145.
                              
                           
                                 27.
                              
                              
                                 Martinovic D., et al. (2008). Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27, 478-488.
                              
                           
                                 28.
                              
                              
                                 OECD (2006c), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
                              
                           
                                 29.
                              
                              
                                 US EPA (2008), Peer-Review Results for the Fish Short-Term Reproduction Assay, dated 30 January 2008, US Environmental Protection Agency, Washington DC. 110 pp.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 OECD (2012), OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150, OECD, Paris.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        SKRATKY A DEFINÍCIE
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes
                        
                           
                              CV
                           : variačný koeficient
                        
                           
                              ELISA
                           : enzýmové imunosorbentové stanovenie
                        
                           
                              Os HHG (hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG)
                           : os hypotalamus – hypofýza – gonády
                        
                           
                              Veľkosť násady
                           : mokrá hmotnosť rýb na objem vody
                        
                           
                              MTC
                           : maximálna tolerovaná koncentrácia, ktorá predstavuje približne 10 % hodnoty LC50
                        
                        
                           
                              Chovná hustota
                           : je počet rýb na objem vody
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje touto testovacou metódou.
                        
                           
                              VTG
                           : vitelogenín je fosfolipoglykoproteín, slúžiaci ako prekurzor proteínov vaječného žĺtka, ktorý sa normálne vyskytuje v telách pohlavne aktívnych samíc všetkých vajcorodých druhov.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           EXPERIMENTÁLNE PODMIENKY SKRÍNINGU NA ENDOKRINNOM SYSTÉME RÝB
                        
                        
                                    
                                                1.
                                             
                                             
                                                Odporúčaný druh
                                             
                                          
                                 
                                    Čerebľa potočná
                                    (Pimephales promelas)
                                 
                                 
                                    Ryžovníčka japonská
                                    (Oryzias latipes)
                                 
                                 
                                    Danio pruhované
                                    (Danio rerio)
                                 
                              
                                    
                                                2.
                                             
                                             
                                                Typ testu
                                             
                                          
                                 
                                    prietokový
                                 
                                 
                                    prietokový
                                 
                                 
                                    prietokový
                                 
                              
                                    
                                                3.
                                             
                                             
                                                Teplota vody
                                             
                                          
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    25 ± 2 °C
                                 
                                 
                                    26 ± 2 °C
                                 
                              
                                    
                                                4.
                                             
                                             
                                                Kvalita osvetlenia
                                             
                                          
                                 
                                    Žiarivky (širokospektrálne)
                                 
                                 
                                    Žiarivky (širokospektrálne)
                                 
                                 
                                    Žiarivky (širokospektrálne)
                                 
                              
                                    
                                                5.
                                             
                                             
                                                Intenzita svetla
                                             
                                          
                                 
                                    10 – 20 μE/m2/s, 540 – 1 000  luxov alebo 50 – 100 ft-c (úrovne v laboratórnom prostredí)
                                 
                                 
                                    10 – 20 μE/m2/s, 540 – 1 000  luxov alebo 50 – 100 ft-c (úrovne v laboratórnom prostredí)
                                 
                                 
                                    10 – 20 μE/m2/s, 540 – 1 000  luxov alebo 50 – 100 ft-c (úrovne v laboratórnom prostredí)
                                 
                              
                                    
                                                6.
                                             
                                             
                                                Fotoperióda (prechody ako svitanie/súmrak sú voliteľné, ale nepovažujú sa za nutné)
                                             
                                          
                                 
                                    16 hodín svetla a 8 hodín tmy
                                 
                                 
                                    12 – 16 hodín svetla a 12 – 8 hodín tmy
                                 
                                 
                                    12 – 16 hodín svetla a 12 – 8 hodín tmy
                                 
                              
                                    
                                                7.
                                             
                                             
                                                Veľkosť násady
                                             
                                          
                                 
                                    < 5 g/l
                                 
                                 
                                    < 5 g/l
                                 
                                 
                                    < 5 g/l
                                 
                              
                                    
                                                8.
                                             
                                             
                                                Veľkosť skúšobnej komory
                                             
                                          
                                 
                                    10 l (minimálne)
                                 
                                 
                                    2 l (minimálne)
                                 
                                 
                                    5 l (minimálne)
                                 
                              
                                    
                                                9.
                                             
                                             
                                                Objem testovacieho roztoku
                                             
                                          
                                 
                                    8 l (minimálne)
                                 
                                 
                                    1,5 l (minimálne)
                                 
                                 
                                    4 l (minimálne)
                                 
                              
                                    
                                                10.
                                             
                                             
                                                Výmeny objemu testovacích roztokov
                                             
                                          
                                 
                                    minimálne 6 denne
                                 
                                 
                                    minimálne 5 denne
                                 
                                 
                                    minimálne 5 denne
                                 
                              
                                    
                                                11.
                                             
                                             
                                                Vek testovaných organizmov
                                             
                                          
                                 
                                    pozri bod 21
                                 
                                 
                                    pozri bod 21
                                 
                                 
                                    pozri bod 21
                                 
                              
                                    
                                                12.
                                             
                                             
                                                Približná mokrá hmotnosť dospelých rýb (g)
                                             
                                          
                                 
                                    samice: 1,5 ± 20 %
                                    samce 2,5 ± 20 %
                                 
                                 
                                    samice: 0,35 ± 20 %
                                    samce 0,35 ± 20 %
                                 
                                 
                                    samice: 0,65 ± 20 %
                                    samce 0,4 ± 20 %
                                 
                              
                                    
                                                13.
                                             
                                             
                                                Počet rýb na testovaciu nádobu
                                             
                                          
                                 
                                    6 (2 samce a 4 samice)
                                 
                                 
                                    6 (3 samce a 3 samice)
                                 
                                 
                                    10 (5 samci a 5 samíc)
                                 
                              
                                    
                                                14.
                                             
                                             
                                                Počet skupín s aplikovanou chemikáliou
                                             
                                          
                                 
                                    = 3 (plus primerané kontrolné skupiny)
                                 
                                 
                                    = 3 (plus primerané kontrolné skupiny)
                                 
                                 
                                    = 3 (plus primerané kontrolné skupiny)
                                 
                              
                                    
                                                15.
                                             
                                             
                                                Počet nádob na každú úroveň aplikácie chemikálie
                                             
                                          
                                 
                                    najmenej 4
                                 
                                 
                                    najmenej 4
                                 
                                 
                                    najmenej 2
                                 
                              
                                    
                                                16.
                                             
                                             
                                                Počet rýb na každú testovaciu koncentráciu
                                             
                                          
                                 
                                    16 dospelých samíc a 8 samcov (4 samice a 2 samci v každej nádobe s replikátom)
                                 
                                 
                                    12 dospelých samíc a 12 samcov (3 samice a 3 samci v každej nádobe s replikátom)
                                 
                                 
                                    10 dospelých samíc a 10 samcov (5 samíc a 5 samci v každej nádobe s replikátom)
                                 
                              
                                    
                                                17.
                                             
                                             
                                                Kŕmny režim
                                             
                                          
                                 
                                    živé alebo mrazené dospelé jedince alebo nauplia žiabronôžky soľnej dva- alebo trikrát denne (ad libitum), komerčne dostupná potrava alebo kombinácia uvedenej potravy
                                 
                                 
                                    nauplia žiabronôžky soľnej dva- alebo trikrát denne (ad libitum), komerčne dostupná potrava alebo kombinácia uvedenej potravy
                                 
                                 
                                    nauplia žiabronôžky soľnej dva- alebo trikrát denne (ad libitum), komerčne dostupná potrava alebo kombinácia uvedenej potravy
                                 
                              
                                    
                                                18.
                                             
                                             
                                                Prevzdušňovanie
                                             
                                          
                                 
                                    žiadne, pokiaľ koncentrácia rozpusteného kyslíka neklesne pod 60 % hodnoty saturácie vzduchom
                                 
                                 
                                    žiadne, pokiaľ koncentrácia rozpusteného kyslíka neklesne pod 60 % hodnoty saturácie vzduchom
                                 
                                 
                                    žiadne, pokiaľ koncentrácia rozpusteného kyslíka neklesne pod 60 % hodnoty saturácie vzduchom
                                 
                              
                                    
                                                19.
                                             
                                             
                                                Voda na riedenie
                                             
                                          
                                 
                                    s čistým povrchom, studňová alebo rekonštituovaná voda alebo odchlórovaná voda z vodovodu
                                 
                                 
                                    s čistým povrchom, studňová alebo rekonštituovaná voda alebo odchlórovaná voda z vodovodu
                                 
                                 
                                    s čistým povrchom, studňová alebo rekonštituovaná voda alebo odchlórovaná voda z vodovodu
                                 
                              
                                    
                                                20.
                                             
                                             
                                                Obdobie pred expozíciou
                                             
                                          
                                 
                                    odporúča sa 7 – 14 dní
                                 
                                 
                                    odporúča sa 7 – 14 dní
                                 
                                 
                                    odporúča sa 7 – 14 dní
                                 
                              
                                    
                                                21.
                                             
                                             
                                                Trvanie expozície chemikálii
                                             
                                          
                                 
                                    21 dní
                                 
                                 
                                    21 dní
                                 
                                 
                                    21 dní
                                 
                              
                                    
                                                22.
                                             
                                             
                                                Biologické ukazovatele
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                prežitie
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                správanie
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                plodivosť
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                sek. pohlavné znaky
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG:
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                voliteľne histopatológia gonád
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                prežitie
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                správanie
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                plodivosť
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                sek. pohlavné znaky
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG:
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                voliteľne histopatológia gonád
                                             
                                          
                                 
                                    
                                                —
                                             
                                             
                                                prežitie
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                správanie
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                plodivosť
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                VTG:
                                             
                                          
                                                —
                                             
                                             
                                                voliteľne histopatológia gonád
                                             
                                          
                              
                                    
                                                23.
                                             
                                             
                                                Prijateľnosť testu
                                             
                                          
                                 
                                    koncentrácia rozpusteného kyslíka ≥ 60 % saturácie; priemerná teplota 25 ± 2 °C; 90 % prežitie rýb v kontrolných skupinách; merané testovacie koncentrácie v rozsahu 20 % stredných meraných hodnôt pre každú úroveň aplikácie chemikálie
                                 
                                 
                                    koncentrácia rozpusteného kyslíka ≥ 60 % saturácie; priemerná teplota 25 ± 2 °C; 90 % prežitie rýb v kontrolných skupinách; merané testovacie koncentrácie v rozsahu 20 % stredných meraných hodnôt pre každú úroveň aplikácie chemikálie
                                 
                                 
                                    koncentrácia rozpusteného kyslíka ≥ 60 % saturácie; priemerná teplota 26 ± 2 °C; 90 % prežitie rýb v kontrolných skupinách; merané testovacie koncentrácie v rozsahu 20 % stredných meraných hodnôt pre každú úroveň aplikácie chemikálie
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           NIEKTORÉ CHEMICKÉ VLASTNOSTI PRIJATEĽNEJ VODY NA RIEDENIE
                        
                        
                                    ZLOŽKA
                                 
                                 
                                    KONCENTRÁCIA
                                 
                              
                                    Tuhé častice
                                 
                                 
                                    < 20 mg/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organického uhlíka
                                 
                                 
                                    < 2 mg/l
                                 
                              
                                    Neionizovaný amoniak
                                 
                                 
                                    < 1 μg/l
                                 
                              
                                    Zvyškový chlór
                                 
                                 
                                    < 10 μg/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organofosfátových pesticídov
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organochlórových pesticídov a polychlórovaných bifenylov
                                 
                                 
                                    < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Celkový obsah organického chlóru
                                 
                                 
                                    < 25 ng/l
                                 
                              
                     
                        Dodatok 4A
                        
                           NERESOVÝ SUBSTRÁT PRE DANIO PRUHOVANÉ
                        
                        
                           
                              Podložka na neresenie
                           : celosklená nádoba s rozmermi napríklad 22 x 15 x 5,5 cm (dĺžka × šírka × výška) pokrytá odnímateľnou drôtenou mriežkou z nehrdzavejúcej ocele (s veľkosťou ôk 2 mm). Mriežka by mala pokrývať otvor nádoby pod okrajom nádoby.
                        Na mriežku by sa mal upevniť substrát na neresenie. Rybám by mal poskytovať štruktúru, do ktorej môžu preniknúť. Vhodné sú napríklad umelé akváriové rastliny vyrobené zo zeleného plastového materiálu (pozn.: mala by sa zvážiť možná adsorpcia testovanej chemikálie na plastový materiál). Uvedený plastový materiál by sa mal dostatočne dlho lúhovať v dostatočnom objeme teplej vody, aby sa zabezpečilo, že do vody použitej na testovanie sa neprenesú žiadne chemikálie. V prípade použitia sklených materiálov by sa malo zabezpečiť, aby sa ryby pri intenzívnom pohybe nezranili ani nezakliesnili.
                        Vzdialenosť medzi podložkou a sklenými stenami by mala byť najmenej 3 cm, aby sa zabezpečilo, že neresenie sa nevykonáva mimo podložky. Vajíčka neresením prenesené na podložku prepadávajú cez mriežku a 45 – 60 minút po spustení osvetlenia z nich možno odobrať vzorky. Priesvitné vajíčka sú nelepivé a ľahko sa počítajú pomocou transverzálneho svetla. Pri použití piatich samíc na testovaciu nádobu možno počet vajíčok do 20 za deň považovať za nízky, od 20 do 100 za stredný a nad 100 za vysoký. Podložka na neresenie by sa mala odstrániť, vajíčka zozbierať a podložka na neresenie vložiť späť do testovacej nádoby, buď čo najneskôr večer, alebo veľmi skoro ráno. Čas, ktorý uplynie do opätovného vloženia, by nemal presiahnuť jednu hodinu, lebo inak stopa substrátu na neresenie môže vyvolať individuálne párenie a neresenie v nezvyčajnom čase. Ak si situácia vyžaduje neskoršie vloženie podložky na neresenie, malo by sa to urobiť najmenej 9 hodín po spustení osvetlenia. V tomto pokročilom dennom čase sa už neresenie nevyvoláva.
                     
                     
                        Dodatok 4B
                        
                           NERESOVÝ SUBSTRÁT PRE ČEREBĽU POTOČNÚ
                        
                        Do každej testovacej komory sa umiestnia dva alebo tri kombinované plastové/keramické/sklené alebo nerezové oblúkové kryty s podložkami na neresenie (napr. 80 mm dlhý sivý polkruhový žľab uložený na podložke so zvýšeným okrajom a s dĺžkou 130 mm) (pozri obrázok). Riadne vyzreté kryty z PVC alebo keramiky sa ukázali ako vhodné miesto pre neresový substrát (Thorpe et al, 2007).
                        Odporúča sa kryty obrúsiť, aby sa zvýšila ich priľnavosť. Podložka by mala byť prekrytá sieťkou tak, aby sa zabránilo rybám v prístupe k padajúcim vajíčkam, pokiaľ nebola preukázaná účinná lepivosť k neresovému substrátu.
                        Dno je konštruované tak, aby obsahovalo všetky vajíčka, ktoré sa neprilepia k povrchu krytu a spadnú na dno nádoby (alebo vajíčka, ktoré sa uložia priamo na plochú plastovú spodnú časť). Všetky neresové substráty by sa mali pred použitím minimálne 12 hodín lúhovať vo vode na riedenie.
                        Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90 – 98.
                     
                     
                        Dodatok 5 A
                        
                           POSÚDENIE SEKUNDÁRNYCH POHLAVNÝCH ZNAKOV ČEREBLE POTOČNEJ NA ZISTENIE URČITÝCH CHEMIKÁLIÍ S ÚČINKOM NA ENDOKRINNÝ SYSTÉM
                        
                        
                           Prehľad
                        
                        Medzi potenciálne dôležité znaky fyzického vzhľadu dospelých jedincov čereble potočnej pri testovaní endokrinných disruptorov patrí farba tela (t. j. svetlá/tmavá), vzorovanie (t. j. prítomnosť alebo neprítomnosť zvislých pruhov), tvar tela (t. j. tvar hlavovej a prsnej oblasti, brušná distenzia) a špecializované sekundárne pohlavné znaky (t. j. počet a veľkosť tuberkulov, veľkosť záhlavnej časti chrbta a kladielka).
                        Tuberkuly sa nachádzajú na hlave (záhlavná časť chrbta) reprodukčne aktívnych samcov čereble potočnej a ich usporiadanie je obvykle dvojstranne symetrické (Jensen et al. 2001). Kontrolné skupiny samíc a juvenilné samce a samice nevykazujú vznik žiadnych tuberkulov (Jensen et al. 2001). Až osem jednotlivých tuberkulov sa môže nachádzať okolo očí a medzi nozdrami samcov. Najväčší počet tuberkulov, ktoré sú zároveň najväčšie, je umiestnený v dvoch rovnobežných líniách bezprostredne pod nozdrami a nad ústami. V prípade mnohých rýb sa pod dolnou čeľusťou vyskytujú skupiny tuberkulov, pričom tie, ktoré sa nachádzajú najbližšie k ústam sa spravidla vyskytujú ako jediný pár, zatiaľ čo bližšie k brušnej časti to môžu byť skupiny až štyroch tuberkulov. Celkový počet tuberkulov je zriedkavo vyšší ako 30 (v rozsahu 18 – 28; Jensen et al. 2001). Prevládajú (z hľadiska počtu) tuberkuly, ktoré tvoria samostatnú, relatívne okrúhlu štruktúru s výškou približne rovnou polomeru. Väčšina reprodukčne aktívnych samcov má takisto prinajmenšom niekoľko tuberkulov, ktoré sú zväčšené a výrazné natoľko, že sú nerozoznateľné ako jednotlivé štruktúry.
                        Niektoré druhy chemikálií narušujúcich endokrinný systém môžu vyvolávať abnormálny výskyt určitých sekundárnych pohlavných znakov pri živočíchoch opačného pohlavia. Napríklad agonisty androgénových receptorov, ako sú 17α-metyltestosterón alebo 17β-trenbolón, môžu spôsobovať vyvinutie tuberkulov u samíc čereble potočnej (Smith 1974; Ankley et al. 2001; 2003), zatiaľ čo agonisty estrogénových receptorov môžu znížiť počet alebo veľkosť tuberkulov u samcov (Miles-Richardson et al. 1999; Harries et al. 2000).
                        V ďalšej časti sa uvádza opis charakteristiky tuberkulov čereble potočnej na základe postupov používaných Agentúrou Spojených štátov na ochranu životného prostredia v meste Duluth v štáte Minnesota. Špecifické produkty a/alebo zariadenia možno nahradiť porovnateľnými materiálmi, ktoré sú k dispozícii.
                        Prehliadanie sa najlepšie vykonáva osvetlenou lupou alebo svetelným stereoskopickým mikroskopom pri 3-násobnom zväčšení. Ryba sa prehliada zo strany chrbta, natočená prednou časťou dopredu (hlavou k prehliadačovi).
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Ryba sa uloží do malej Petriho misky (napr. s priemerom 100 mm), prednou časťou dopredu a brušnou nadol. Hľadáčik sa zameria tak, aby bola možná identifikácia tuberkulov. Ryba sa jemne a pomaly otáča zo strany na stranu a identifikujú sa oblasti tuberkulov. Tuberkuly sa spočítajú a priradí sa im skóre.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Ryba sa v Petriho miske uloží chrbtovou časťou nadol, prednou dopredu, a vykoná sa prehliadka povrchu brušnej časti hlavy.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Pozorovania každej ryby by sa mali ukončiť do dvoch minút.
                                 
                              
                           Počítanie a klasifikácia tuberkulov
                        
                        Na posúdenie prítomnosti a vyvinutosti tuberkulov u dospelých jedincov čereble potočnej bolo určených šesť špecifických oblastí. Na mapovanie umiestnenia prítomných tuberkulov a ich množstva bola vypracovaná šablóna (pozri koniec tohto dodatku). Počet tuberkulov sa zaznamenáva a ich veľkosť možno v prípade každého organizmu kvantitatívne klasifikovať takto: 0 – neprítomný, 1 – prítomný, 2 – zväčšený a 3 – výrazný (obrázok 1).
                        Kategória 0 – neprítomný, nijaký tuberkul nie je prítomný. Kategória 1 – prítomný, identifikovaný akýkoľvek jednotlivý tuberkul, ktorého výška sa skoro rovná jeho polomeru. Kategória 2 – zväčšený, identifikovaný na základe tkaniva, ktoré vzhľadom pripomína hviezdičku, zvyčajne s veľkou radiálnou základňou s drážkami alebo so žliabkami vychádzajúcimi zo stredu. Vrchná časť tuberkula je často viac vrúbkovaná, ale niekedy môže byť čiastočne zaoblená. Kategória 3 – výrazný, zvyčajne pomerne veľký a zaoblený, s menej rozlíšenou štruktúrou. Tieto tuberkuly niekedy spoločne vytvárajú jednotnú masu v jednej oblasti alebo v kombinácii oblastí (B, C a D, ako je opísané v ďalšej časti). Sfarbenie a tvar sú podobné ako v rámci kategórie 2, ale niekedy sú dosť málo rozlíšiteľné. Použitie tohto systému klasifikácie vo všeobecnosti povedie k celkovému skóre < 50 u bežného kontrolného samca s počtom tuberkulov 18 – 20 (Jensen et al. 2001).
                        
                           Obrázok 1
                        
                        Skutočný počet tuberkulov na tele niektorých rýb môže byť väčší ako počet políčok v šablóne pre určitú klasifikovanú oblasť. V takom prípade je možné vyznačiť ďalšie čísla klasifikácie vpravo alebo vľavo od príslušného políčka. Zobrazenie šablóny preto nemusí byť symetrické. Ďalšou technikou mapovania tuberkulov, ktoré sú umiestnené v pároch alebo spolu vertikálne pozdĺž horizontálnej roviny úst, by mohlo byť dvojité značenie dvoch bodov klasifikácie tuberkulov v jednom políčku.
                        
                           Mapovanie oblastí:
                        
                        
                                     
                                 
                                 
                                    A – tuberkuly nachádzajúce sa okolo očí. Mapujú sa od chrbtovej časti po brušnú časť okolo predného okraja očí. Na telách dospelých kontrolných samcov je spravidla väčší počet, na telách kontrolných samíc nie sú prítomné, na telách samíc vystavených pôsobeniu androgénov sa vo všeobecnosti nachádzajú v páre (jeden pri každom oku) alebo jeden osamotený.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    B-tuberkuly nachádzajúce sa medzi nozdrami (otvormi zmyslových kanálov). Na telách kontrolných samcov sa spravidla vyskytujú v pároch, viac vyvinuté (2 – zväčšené alebo 3 – výrazné). Na telách kontrolných samíc nie sú prítomné, pričom určitý výskyt a stupeň vývoja sa zaznamenal na telách samíc vystavených pôsobeniu androgénov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    C – tuberkuly nachádzajúce sa bezprostredne pred nozdrami, rovnobežne s ústami. Na telách dospelých kontrolných samcov sú vo všeobecnosti zväčšené alebo výrazné. Na telách menej vyvinutých samcov alebo samíc vystavených pôsobeniu androgénov sú prítomné alebo zväčšené.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    D – tuberkuly nachádzajúce sa rovnobežne pozdĺž línie úst. Na telách kontrolných samcov sa vyvíjajú všeobecne podľa klasifikácie. Na telách kontrolných samíc nie sú prítomné, ale na telách samíc vystavených pôsobeniu androgénov sú prítomné.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    E – tuberkuly nachádzajúce sa na dolnej čeľusti, v blízkosti úst, zvyčajne malé a spravidla v pároch. Výskyt je rôzny u kontrolných samcov alebo samcov s aplikovanou chemikáliou a u samíc s aplikovanou chemikáliou.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    F – tuberkuly nachádzajúce sa v brušnej časti priľahlej k oblasti E. Spravidla sú malé a vyskytujú sa v pároch. Prítomné sú u kontrolných samcov a u samíc vystavených pôsobeniu androgénov.
                                 
                              ODKAZY
                        
                                    1.
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Kahl MD, Korte JJ, Makynen ME. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290.
                                 
                              
                                    2.
                                 
                                 
                                    Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Hornung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray EL. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22:1350-1360.
                                 
                              
                                    3.
                                 
                                 
                                    Harries JE, Runnalls T, Hill E, Harris CA, Maddix S, Sumpter JP, Tyler CR. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34:3003-3011.
                                 
                              
                                    4.
                                 
                                 
                                    Jensen KM, Korte JJ, Kahl MD, Pasha MS, Ankley GT. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128:127-141.
                                 
                              
                                    5.
                                 
                                 
                                    Kahl MD, Jensen KM, Korte JJ, Ankley GT. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59:515-523.
                                 
                              
                                    6.
                                 
                                 
                                    Miles-Richardson SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47:129-145.
                                 
                              
                                    7.
                                 
                                 
                                    Smith RJF. 1974. Effects of 17α-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52:1031-1038.
                                 
                              
                           
                        Text obrazu
                        
                           Šablóna tuberkulov:
                           Identifikácia
                           Číselná klasifikácia
                           Dátum
                           1- prítomný
                           Celkové skóre
                           2- zväčšený
                           3- výrazný
                           A
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           B
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           C
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           D
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                           E
                           X1
                           X1
                           F
                           X1
                           X1
                           X1
                           X1
                        
                     
                     
                        Dodatok 5B
                        
                           POSÚDENIE SEKUNDÁRNYCH POHLAVNÝCH ZNAKOV RYŽOVNÍČKY JAPONSKEJ PRI ZISŤOVANÍ URČITÝCH CHEMIKÁLIÍ S ÚČINKOM NA ENDOKRINNÝ SYSTÉM
                        
                        Ďalej sa uvádza opis merania papilárnych výbežkov (*10), ktoré sú sekundárnymi pohlavnými znakmi ryžovníčky japonskej (Oryzias latipes).
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Po vyrezaní pečene (dodatok 6) sa telo vloží do kónickej skúmavky, ktorá obsahuje približne 10 ml 10 % neutrálneho tlmeného formalínu (smerom hore: hlava, smerom dolu: chvost). Ak sa gonáda fixuje inak než 10 % neutrálnym tlmeným formalínom, telo treba rozrezať žiletkou priečnym rezom medzi prednou časťou análnej plutvy a análnym otvorom, pričom treba dbať na to, aby sa nenarušil gonopór ani samotná gonáda (obrázok 3). Kraniálna strana tela ryby sa umiestni do fixačného roztoku na konzervovanie gonád a chvostová strana tela ryby do 10 % neutrálneho tlmeného formalínu, ako už bolo opísané.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Po vložení tela ryby do 10 % neutrálneho tlmeného formalínu sa uchopí predná časť análnej plutvy pinzetou a ohne sa približne na 30 sekúnd, aby sa plutva roztiahla. Pri uchopení análnej plutvy pinzetou uchopte opatrne niekoľko lúčov plutvy v prednej časti, aby sa papilárne výbežky nepoškodili.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Po roztiahnutí análnej plutvy približne na 30 sekúnd sa telo ryby uloží do 10 % neutrálneho tlmeného formalínu pri izbovej teplote až do začiatku merania papilárnych výbežkov (fixovanie pred meraním by malo trvať najmenej 24 hodín).
                                 
                              Meranie
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Po fixovaní tela ryby v 10 % neutrálnom tlmenom formalíne najmenej počas 24 hodín sa telo ryby vyberie z kónickej skúmavky a formalín sa otrie filtračným papierom (alebo papierovou utierkou).
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Ryba sa položí brušnou stranou nahor. Potom sa malými pitevnými nožnicami opatrne odreže análna plutva (odporúča sa odrezať análnu plutvu aj s malou časťou opornej kosti pterygiophore).
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Oddelená análna plutva sa pinzetou uchopí za prednú časť a položí sa na podložné sklíčko s niekoľkými kvapkami vody. Potom sa plutva zakryje krycím sklíčkom. Pri uchopení análnej plutvy pinzetou treba dávať pozor, aby sa papilárne výbežky nepoškodili.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Počet spojených platničiek s papilárnymi výbežkami sa určí prostredníctvom počítacej komôrky pod biologickým mikroskopom (stojanovým alebo inverzným). Papilárne výbežky sa vykazujú, keď je na zadnom okraji spojenej platničky viditeľné malé zoskupenie výbežkov. Do pracovného hárku sa zapíše počet spojených platničiek s papilárnymi výbežkami na každom lúči plutvy (napr. prvý lúč plutvy: 0, druhý lúč plutvy: 10, tretí lúč plutvy: 12 atď.) a súčet týchto počtov sa uvedie do tabuľky programu Excel podľa jednotlivých rýb. V prípade potreby sa urobí fotografia análnej plutvy a počet spojených platničiek s papilárnymi výbežkami sa určí z tejto fotografie.
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Po uskutočnení merania sa análna plutva vloží do kónickej skúmavky opísanej v bode 1 a odloží sa.
                                 
                              
                           Obr. 1.
                        
                        
                           Obrázok znázorňujúci rozdiely medzi pohlaviami, pokiaľ ide o tvar a veľkosť análnej plutvy. A, samec; B, samica. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209 – 218.
                        
                        
                           Obr. 2.
                        
                        
                           A: Výbežky na spojených platničkách lúča análnej plutvy. J.P.: spojená platnička; A.S.: axiálny priestor; P.: výbežok. B: Distálny koniec lúča plutvy. Na úplnom konci lúča plutvy sú actinotrichia (Act.). Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209 – 218.
                        
                        
                           Obr. 3.
                        
                        
                           Fotografia tela ryby, ktorá znázorňuje miesto rezu v prípade, keď sa gonáda fixuje v inom fixačnom roztoku ako 10 % neutrálnom tlmenom formalíne. V takom prípade sa telo rozreže žiletkou medzi prednou časťou análnej plutvy a análnym otvorom (červená čiara), hlavová strana tela ryby sa vloží do fixačného roztoku na konzervovanie gonád a chvostová strana tela ryby sa vloží do 10 % neutrálneho tlmeného formalínu.
                        
                        
                     
                        Dodatok 6
                        
                           ODPORÚČANÉ POSTUPY ODBERU VZORIEK NA ANALÝZU VITELOGENÍNU
                        
                        Malo by sa dbať na to, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii medzi vzorkami VTG samcov a samíc.
                        
                           
                              Postup 1A:   Čerebľa potočná, odber krvi z chvostovej žily/tepny
                        
                        Po anestetizovaní sa chvostový pedunkulus čiastočne oddelí čepeľou skalpela a krv z chvostovej tepny/žily sa odoberie heparinizovanou mikrohematokritovou kapilárou. Po odobratí krvi sa rýchlo izoluje plazma odstreďovaním počas 3 minút pri 15 000 g (alebo alternatívne počas 10 minút pri 15 000 g a teplote 4 °C). V prípade potreby možno po odstredení stanoviť percentuálnu hodnotu hematokritu. Plazma sa odoberie z mikrohematokritovej kapiláry, vloží sa do skúmavky na odstreďovanie spolu s 0,13 jednotky aprotinínu (inhibítor proteázy) a uchová sa pri teplote – 80 °C, kým nebude možné stanoviť VTG. V závislosti od veľkosti čereble potočnej (závisí od pohlavia) sa objem plazmy, ktorú možno odobrať, vo všeobecnosti pohybuje v rozsahu 5 – 60 μl na jednu rybu (Jensen et al. 2001).
                        
                           
                              Postup 1B:   Čerebľa potočná, odber krvi zo srdca
                        
                        Alternatívne možno krv odobrať srdcovou punkciou heparinizovanou striekačkou (1 000 jednotiek heparínu na ml). Krv sa preloží do skúmaviek Eppendorf (uložených na ľade) a potom sa odstredí (5 minút pri 7 000 g a izbovej teplote). Plazma by sa mala preložiť do čistých skúmaviek Eppendorf (v alikvotných množstvách, ak to objem plazmy umožňuje) a rýchlo zmraziť pri – 80 °C, kým sa nevykoná analýza (Panter et al., 1998).
                        
                           
                              Postup 2 A:   Ryžovníčka japonská, vyrezanie pečene
                        
                        
                           Vybratie testovanej ryby zo skúšobnej komory
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Testovaná ryba by sa mala vybrať zo skúšobnej komory malým podberákom. Treba dávať pozor, aby testovaná ryba nespadla do inej skúšobnej komory.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Testované ryby by sa zo skupín mali v zásade vyberať v tomto poradí: kontrolná skupina, kontrolná skupina s rozpúšťadlom (ak je to vhodné), skupina s najnižšou koncentráciou, skupina so strednou koncentráciou, skupina s najvyššou koncentráciou a pozitívna kontrolná skupina. Okrem toho by sa mali z jednej skúšobnej komory najskôr vybrať všetci samci, až potom zostávajúce samice.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Pohlavie každej testovanej ryby sa určí na základe vonkajších sekundárnych pohlavných znakov (napr. tvaru análnej plutvy).
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Testovaná ryba sa vloží do prepravného kontajnera a premiestni sa na pracovisko určené na vyrezanie pečene. Treba skontrolovať správnosť údajov na štítkoch na skúšobnej komore a prepravnom kontajneri, aby sa potvrdilo, že počet rýb, ktoré sa vybrali zo skúšobnej komory, a počet rýb, ktoré v skúšobnej komore zostali, je v súlade s očakávaním.
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Ak pohlavie rýb nemožno určiť na základe ich vonkajšieho vzhľadu, vyberú sa všetky ryby zo skúšobnej komory. V tom prípade by sa pohlavie malo určiť na základe pozorovania gonád alebo sekundárnych pohlavných znakov stereoskopickým mikroskopom.
                                 
                              
                           Vyrezanie pečene
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Testovaná ryba sa preloží z prepravného kontajnera do anestetického roztoku malým podberákom.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Po anestetizovaní sa testovaná ryba pinzetou (spotrebného druhu) uloží na filtračný papier (alebo na papierovú utierku). Rybu treba uchopiť pinzetou za boky hlavy, aby sa zabránilo zlomeniu chvosta.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Voda z povrchu testovanej ryby sa utrie filtračným papierom (alebo papierovou utierkou).
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Ryba sa položí brušnou stranou nahor. Potom sa pitevnými nožnicami urobí malý priečny zárez medzi časťou brucha v blízkosti hlavy a strednou časťou brucha.
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Pitevné nožnice sa vložia do malého rezu a brucho sa rozstrihne pozdĺž stredovej línie od zadného bodu žiabrového krytu po kraniálnu stranu análneho otvoru. Treba dávať pozor, aby sa pitevné nožnice nevložili príliš hlboko a nedošlo k poškodeniu pečene a gonád.
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Ďalšie operácie sa vykonávajú pod stereoskopickým mikroskopom.
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Testovaná ryba sa položí brušnou stranou nahor na papierovú utierku (použiť možno aj sklenenú Petriho misku alebo podložné sklíčko).
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Presnou pinzetou sa rozšíria steny brušnej dutiny a vyberú sa vnútorné orgány. Je takisto prípustné, aby sa v prípade potreby vnútorné orgány vybrali po odstránení jednej bočnej steny brušnej dutiny.
                                 
                              
                                 
                                    9.
                                 
                                 
                                    Ďalšou presnou pinzetou sa odhalí spojená časť pečene a žlčníka. Potom sa uchopí žlčovod a žlčník sa odreže. Treba dávať pozor, aby sa žlčník nepoškodil.
                                 
                              
                                 
                                    10.
                                 
                                 
                                    Uchopí sa pažerák a rovnako sa od pečene oddelí tráviaci trakt. Treba dávať pozor, aby nedošlo k úniku obsahu tráviaceho traktu. Kaudálny tráviaci trakt sa oddelí od análneho otvoru a odstráni z brušnej dutiny.
                                 
                              
                                 
                                    11.
                                 
                                 
                                    Z okrajových častí pečene sa odreže tuková hmota a iné tkanivá. Treba dávať pozor, aby nedošlo k poškrabaniu pečene.
                                 
                              
                                 
                                    12.
                                 
                                 
                                    Pečeň sa uchopí presnou pinzetou za oblasť brány a vyberie sa z brušnej dutiny.
                                 
                              
                                 
                                    13.
                                 
                                 
                                    Pečeň sa uloží na podložné sklíčko. V prípade potreby sa presnou pinzetou odstráni z povrchu pečene akýkoľvek ďalší tuk a cudzie tkanivo (napr. výstelka brucha).
                                 
                              
                                 
                                    14.
                                 
                                 
                                    Hmotnosť pečene sa meria elektronickými analytickými váhami spolu s 1,5 ml mikroskúmavkou predstavujúcou taru. Hodnota sa zaznamená do pracovného hárku (odčítava sa na 0,1 mg). Identifikačné údaje na štítku mikroskúmavky sa potvrdia.
                                 
                              
                                 
                                    15.
                                 
                                 
                                    Mikroskúmavka obsahujúca pečeň sa uzavrie a uloží do chladiaceho boxu (alebo mraziaceho boxu).
                                 
                              
                                 
                                    16.
                                 
                                 
                                    Po vyrezaní jednej pečene treba pitevné nástroje vyčistiť, alebo ich nahradiť čistými.
                                 
                              
                                 
                                    17.
                                 
                                 
                                    Uvedeným postupom sa pečeň odoberie zo všetkých rýb v prepravnom kontajneri.
                                 
                              
                                 
                                    18.
                                 
                                 
                                    Po vyrezaní pečene zo všetkých rýb v prepravnom kontajneri (t. j. všetkých samcov alebo samíc v skúšobnej komore) sa všetky vzorky pečene uložia do stojanu na skúmavky s identifikačným štítkom a vložia sa do mrazničky. Ak sa pečeň dáva na predbežnú úpravu krátko po vyrezaní, vzorky sa na ďalšie pracovisko prenášajú v chladiacom (alebo mraziacom) boxe.
                                 
                              Po vyrezaní pečene je telo ryby k dispozícii na histológiu gonád a meranie sekundárnych pohlavných znakov.
                        
                           Vzorka
                        
                        Ak sa vzorky pečene nepoužijú na predbežnú úpravu krátko po vyrezaní z testovanej ryby, musia sa skladovať pri teplote ≤ – 70 °C.
                        
                           Obrázok 1
                        
                        
                           Nožnicami sa urobí rez tesne pred prsnými plutvami.
                        
                        
                           Obrázok 2
                        
                        
                           Stredová línia brucha sa nožnicami rozstrihne k bodu približne 2 mm od kraniálnej strany análneho otvoru.
                        
                        
                           Obrázok 3
                        
                        
                           Pomocou pinzety sa rozšíria steny brušnej dutiny a odhalí sa pečeň a ďalšie vnútorné orgány.
                        
                        (Alternatívne možno steny brušnej dutiny zboku pripevniť).
                        Šípka ukazuje na pečeň.
                        
                           Obrázok 4
                        
                        
                           Pečeň sa priamo vyreže a pinzetou vyberie.
                        
                        
                           Obrázok 5
                        
                        
                           Pinzetou sa črevá jemne odtiahnu.
                        
                        
                           Obrázok 6
                        
                        
                           Obidva konce čriev a akékoľvek mezenteriálne pripojenia sa nožnicami oddelia.
                        
                        
                           Obrázok 7 (samica)
                        
                        
                           Postup je v prípade samíc rovnaký.
                        
                        
                           Obrázok 8
                        
                        
                           Ukončený postup.
                        
                        
                           
                              Postup 2 B:   Ryžovníčka japonská (Oryzias latipes), predbežná úprava pečene na analýzu vitelogenínu
                        
                        Zo súpravy ELISA sa vyberie fľaša tlmivého roztoku homogenátu a ochladí sa drveným ľadom (teplota roztoku: ≤ 4 °C). Ak sa použije tlmivý roztok homogenátu zo systému EnBio ELISA, nechá sa rozmraziť pri izbovej teplote a potom sa fľaša ochladí drveným ľadom.
                        Vypočíta sa objem tlmivého roztoku homogenátu pre pečeň na základe jej hmotnosti (pridá sa 50 μl tlmivého roztoku homogenátu na 1 mg hmotnosti pečene). Napríklad ak je hmotnosť pečene 4,5 mg, objem tlmivého roztoku homogenátu pre pečeň je 225 μl. Spíše sa zoznam objemov tlmivého roztoku homogenátu pre všetky pečene.
                        
                           Príprava pečene na predbežnú úpravu
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    1,5 ml mikroskúmavka s pečeňou sa z mrazničky vyberie tesne pred predbežnou úpravou.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Predbežná úprava pečene samcov by mala predchádzať predbežnej úprave pečene samíc, aby sa zabránilo kontaminácii vitelogenínom. Okrem toho by sa predbežná úprava skupín mala vykonávať v tomto poradí: kontrolná skupina, kontrolná skupina s rozpúšťadlom (ak je to vhodné), skupina s najnižšou koncentráciou, skupina so strednou koncentráciou, skupina s najvyššou koncentráciou a pozitívna kontrolná skupina.
                                 
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Počet 1,5 ml mikroskúmaviek so vzorkami pečene, ktoré sa v danom čase z mrazničky vyberú, by nemal prekročiť počet, ktorý možno v danom čase odstreďovať.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    1,5 ml mikroskúmavky so vzorkami pečene sa uložia do mraziaceho boxu v poradí podľa čísel vzoriek (pečeň netreba rozmrazovať).
                                 
                              
                           Postup predbežnej úpravy
                        
                        1.   Pridanie tlmivého roztoku homogenátu
                        Podľa zoznamu sa zistí objem tlmivého roztoku homogenátu, ktorý sa má použiť pre konkrétnu vzorku pečene, a mikropipeta sa nastaví na príslušný objem (rozsah objemu: 100 – 1 000 μl). Na mikropipetu sa nasadí čistá špička.
                        Tlmivý roztok homogenátu sa odoberie z reakčnej banky a pridá sa do 1,5 ml mikroskúmavky s pečeňou.
                        Uvedeným postupom sa tlmivý roztok homogenátu pridá do všetkých 1,5 ml mikroskúmaviek s pečeňou. Špičku mikropipety netreba meniť za novú. Ak je však špička kontaminovaná, alebo by mohla byť kontaminovaná, mala by sa vymeniť.
                        2.   Homogenizácia pečene
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Na homogenizátor na mikroskúmavky sa nasadí nový piest na homogenizáciu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Piest sa vloží do 1,5 ml mikroskúmavky. Homogenizátor mikroskúmaviek sa drží tak, aby bola pečeň pritlačená medzi povrch piestu a vnútornú stenu 1,5 ml mikroskúmavky.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Homogenizátor sa uvedie do prevádzky na 10 – 20 sekúnd. Počas prevádzky sa 1,5 ml mikroskúmavka chladí drveným ľadom.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Piest sa vytiahne z 1,5 ml mikroskúmavky a nechá sa v pokoji približne 10 sekúnd. Potom sa vykoná vizuálna kontrola stavu suspenzie.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Ak sa v suspenzii vidno kúsky pečene, operácie 3 a 4 sa zopakujú, tak, aby sa pripravil uspokojivý homogenát pečene.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Suspendovaný homogenát pečene sa chladí v mraziacom boxe až do odstredenia.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Pre každý homogenát sa piest vymení za nový.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Uvedeným postupom sa všetky pečene zhomogenizujú s homogenizačným tlmivým roztokom.
                                 
                              3.   Odstreďovanie suspendovaného homogenátu pečene
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Treba overiť, či je teplota v chladenej komore centrifúgy ≤ 5 °C.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Do chladenej centrifúgy sa vložia 1,5 ml mikroskúmavky so suspendovaným homogenátom pečene (v prípade potreby sa upraví rovnováha).
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Suspendovaný homogenát pečene sa odstreďuje 10 minút pri 13 000 g a teplote ≤ 5 °C. Ak sú však supernatanty dostatočne oddelené, možno odstredivú silu a čas odstreďovania upraviť podľa potreby.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Po odstredení sa skontroluje, či sú supernatanty primerane oddelené (povrchová vrstva: tuk, stredná vrstva: supernatant, spodná vrstva: tkanivo pečene). Ak oddelenie nie je primerané, suspenzia sa opäť odstredí za tých istých podmienok.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Všetky vzorky sa vyberú z chladenej centrifúgy a uložia sa v poradí podľa čísel vzoriek v mraziacom boxe. Treba dať pozor, aby vrstvy oddelené po odstreďovaní znovu neprešli do suspenzie.
                                 
                              4.   Odber supernatantu
                        
                                    —
                                 
                                 
                                    Do stojana na skúmavky sa vložia štyri 0,5 ml mikroskúmavky na uloženie supernatantu.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Z každého supernatantu (oddeleného ako stredná vrstva) sa mikropipetou odoberie 30 μl a prenesie sa do jednej 0,5 ml mikroskúmavky. Treba dať pozor na to, aby sa neodobral tuk z povrchovej vrstvy alebo tkanivo pečene zo spodnej vrstvy.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Supernatant sa odoberie a rozdelí do dvoch ďalších 0,5 ml mikroskúmaviek rovnako, ako už bolo uvedené.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Zvyšok supernatantu sa odoberie mikropipetou (ak je to možné: ≥ 100 μl). Prenesie sa do poslednej 0,5 ml mikroskúmavky. Treba dať pozor na to, aby sa neodobral tuk z povrchovej vrstvy alebo tkanivo pečene zo spodnej vrstvy.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    0,5 ml mikroskúmavka sa uzavrie a na štítok sa napíše objem supernatantu. Bezprostredne potom sa mikroskúmavky ochladia v mraziacom boxe.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Špička mikropipety sa vymení za novú pre každý supernatant. Ak na špičku prilne veľké množstvo tuku, treba ju ihneď vymeniť za novú, aby sa zabránilo kontaminácii pečeňového extraktu tukom.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Všetky odstredené supernatanty sa uvedeným postupom prenesú do štyroch 0,5 ml mikroskúmaviek.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Po prenesení supernatantu do 0,5 ml mikroskúmaviek sa tieto uložia do stojana s identifikačným štítkom a potom sa okamžite zmrazia v mrazničke. Ak sa koncentrácie VTG merajú ihneď po predbežnej úprave, jedna 0,5 ml mikroskúmavka (s 30 μl supernatantu) sa vloží do chladeného stojanu na skúmavky a potom sa premiestni na pracovisko, kde sa vykonáva test ELISA. V takom prípade sa zostávajúce mikroskúmavky uložia do stojanov a zmrazia v mrazničke.
                                 
                              
                                    —
                                 
                                 
                                    Po odbere supernatantu sa zvyšok primerane zlikviduje.
                                 
                              
                           Uskladnenie vzoriek
                        
                        0,5 ml mikroskúmavky so supernatantom homogenátu pečene sa udržiavajú pri teplote ≤ – 70 °C, až kým sa nepoužijú na test ELISA.
                        
                           
                              Postup 3 A:   Danio pruhované, odber krvi z chvostovej žily/tepny
                        
                        Bezprostredne po anestéze sa chvostový pedunkulus priečne nareže a heparinizovanou mikrohematokritovou kapilárou sa odoberie krv z chvostovej tepny/žily. Objem krvi sa pohybuje v rozsahu od 5 do 15 mikrolitrov v závislosti od veľkosti rýb. Do mikrokapiláry sa pridá rovnaký objem tlmivého roztoku aprotinínu (6 mikrogramov/ml vo fosfátovom tlmivom fyziologickom roztoku) a z krvi sa odstreďovaním oddelí plazma (5 minút pri 600 g). Plazma sa odoberie do testovacích skúmaviek a udržiava sa pri teplote –20 °C, až kým sa nezačne analyzovať na prítomnosť VTG alebo iných skúmaných proteínov.
                        
                           
                              Postup 3 B:   Danio pruhované, odber krvi srdcovou punkciou
                        
                        S cieľom zabrániť zrážaniu krvi a degradácii proteínov sa vzorky odoberajú do fosfátového tlmivého fyziologického roztoku (PBS) obsahujúceho heparín (1 000 jednotiek/ml) a inhibítor proteázy aprotinín (2 TIU/ml). Ako zložky tlmivého roztoku sa odporúčajú heparín, amóniová soľ a lyofilizovaný aprotinín. Na odber vzoriek krvi sa odporúča striekačka (1ml) s pevnou tenkou ihlou (napr. Braun Omnikan-F). Striekačka by sa mala vopred naplniť tlmivým roztokom (približne 100 mikrolitrov), aby sa úplne eluovali malé objemy krvi z každej ryby. Vzorky krvi sa odoberajú srdcovou punkciou. Ryba by sa mala najskôr anestetizovať s MS-222 (100 mg/l). Správna hladina anestézie umožňuje používateľovi rozpoznať tlkot srdca dania pruhovaného. Pri punkcii srdca treba držať piest striekačky pod miernym tlakom. Objem krvi, ktorú možno odobrať, sa pohybuje v rozsahu 20 – 40 mikrolitrov. Po srdcovej punkcii by sa mala testovacia skúmavka naplniť zmesou krvi a tlmivého roztoku. Z krvi sa odstreďovaním oddelí plazma (20 minút pri 5 000 g) a mala by sa udržiavať pri teplote –80 °C, až kým sa nezačne analyzovať.
                        
                           
                              Postup 3C:
                              Štandardný operačný postup: Danio pruhované, homogenizácia hlavy a chvosta
                        
                        
                                 
                                    1.
                                 
                                 
                                    Ryba sa anestetizuje a usmrtí v súlade s opisom testu.
                                 
                              
                                 
                                    2.
                                 
                                 
                                    Hlava a chvost ryby sa odrežú podľa obrázka 1.
                                    Dôležité: Všetky pitevné nástroje a doska na rezanie by sa mali medzi narábaním s jednotlivými rybami riadne opláchnuť a vyčistiť (napr. 96 % etanolom), aby sa zabránilo „vitelogenínovému znečisteniu“ neindukovaných samcov od samíc alebo indukovaných samcov.
                                    
                                       Obrázok 1
                                    
                                    
                              
                                 
                                    3.
                                 
                                 
                                    Hlava a chvost každej ryby sa spoločne odvážia s presnosťou na miligramy.
                                 
                              
                                 
                                    4.
                                 
                                 
                                    Po odvážení sa tieto časti vložia do vhodných skúmaviek (napr. 1,5 ml skúmaviek Eppendorf) a zmrazia sa pri teplote –80 °C až do homogenizácie, alebo sa priamo homogenizujú na ľade dvomi plastovými piestami. (Možno použiť aj iné metódy, ak sa vykonávajú na ľade a výsledkom je homogénna hmota). Dôležité: Skúmavky by mali riadne očíslovať tak, aby bolo možné hlavu a chvost ryby priradiť k príslušnej časti tela, ktorá sa použije na histológiu gonád.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    5.
                                 
                                 
                                    Keď sa dosiahne homogénna hmota, pridá sa ľadový homogenizačný tlmivý roztok
                                        (*11) predstavujúci štvornásobok hmotnosti tkaniva. Zmes sa ďalej spracúva piestami, kým nie je homogénna. Dôležitá poznámka: Pre každú jednotlivú rybu sa používajú nové piesty.
                                    
                                 
                              
                                 
                                    6.
                                 
                                 
                                    Vzorky sa uložia na ľad až do odstreďovania pri teplote 4 °C pri 50 000g počas 30 minút.
                                 
                              
                                 
                                    7.
                                 
                                 
                                    Na vloženie dávok 20 μl supernatantu do najmenej dvoch skúmaviek sa použije pipeta. Špička pipety sa prestrčí pod vrstvu tuku na povrchu a opatrne sa odsaje supernatant bez tukových alebo tuhých frakcií.
                                 
                              
                                 
                                    8.
                                 
                                 
                                    Skúmavky sa pred použitím skladujú pri teplote – 80 °C.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 7
                        
                           VZORKY OBOHATENÉ VITELOGENÍNOM A REFERENČNÁ LÁTKA-ŠTANDARD
                        
                        Každý deň, keď sa vykonávajú testy na zistenie VTG, sa bude analyzovať obohatená vzorka pripravená s „inter-assay“ referenčným štandardom. VTG použitý na prípravu referenčnej látky-štandardu musí pochádzať z inej dávky než VTG použitý na prípravu kalibračných štandardov pre vykonávaný test.
                        Obohatená vzorka sa pripraví pridaním známeho množstva štandardu do vzorky plazmy kontrolných samcov. Vzorka sa obohatí tak, aby sa dosiahla koncentrácia VTG 10- až 100-násobná oproti očakávanej koncentrácii vo vzorke kontrolných samcov rýb. Vzorka plazmy kontrolných samcov, ktorá sa obohatí, môže pochádzať od jednej ryby alebo môže byť zmesou od viacerých rýb.
                        Čiastková vzorka neobohatenej vzorky plazmy kontrolných samcov sa bude analyzovať najmenej v dvoch duplicitných súboroch. Obohatená vzorka sa bude takisto analyzovať najmenej v dvoch duplicitných súboroch. Priemerné množstvo vitelogenínu v dvoch neobohatených vzorkách plazmy kontrolných samcov sa pridá k vypočítanému množstvu VTG pridanému na obohatenie vzoriek s cieľom stanoviť očakávanú koncentráciu. Spolu s výsledkami z každého súboru testov vykonaných v daný deň sa uvádza pomer tejto očakávanej koncentrácie a nameranej koncentrácie.
                     
                     
                        Dodatok 8
                        
                           SCHÉMA ROZHODOVANIA PRE ŠTATISTICKÚ ANALÝZU
                        
                        
                     C.49   Test akútnej toxicity na rybích embryách (FET)
                     
                     ÚVOD
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Táto testovacia metóda (ďalej len „TM“) je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (ďalej len „TG“) 236 (2013). Opisuje test akútnej toxicity na rybích embryách (ďalej len „FET“) dania pruhovaného (Danio rerio). Tento test je určený na stanovenie akútnej toxicity chemikálií pre embryonálne štádiá rýb. Test FET je založený na štúdiách a validačných činnostiach vykonaných na daniu pruhovanom (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14). Test FET sa úspešne uplatňuje na širokú škálu chemikálií s rôznym spôsobom účinku, rozpustnosťou, prchavosťou a hydrofóbnosťou (zhrnutých v literatúre pod číslom 15 a 16).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Definície použité v tejto testovacej metóde sú uvedené v dodatku 1.
                              
                           PRINCÍP TESTU
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Čerstvo oplodnené vajíčka dania pruhovaného sa vystavia testovanej chemikálii počas obdobia 96 hodín. Každých 24 hodín sa zaznamenajú až štyri koncové pozorovania ako ukazovatele letality (6): i) koagulácia oplodnených vajíčok; ii) nevytvorenie somitov; iii) neoddelenie chvostového pupeňa od žĺtkového vaku a iv) neprítomnosť srdcového tepu. Na konci obdobia expozície sa stanoví akútna toxicita na základe pozitívneho výsledku v ktoromkoľvek zo štyroch zaznamenaných koncových pozorovaní a vypočíta sa hodnota LC50.
                              
                           ÚVODNÉ ÚVAHY
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Medzi užitočné informácie o špecifických vlastnostiach látky patrí štruktúrny vzorec, molekulová hmotnosť, čistota, stabilita vo vode a na svetle, hodnoty pKa a Kow, rozpustnosť vo vode a tlak pary, ako aj výsledky testu ľahkej biodegradovateľnosti [TM C.4 (17) alebo TM C.29 (18)]. Rozpustnosť a tlak pary možno použiť na výpočet Henryho konštanty, ktorá bude udávať, či môže dôjsť k elimináciám v dôsledku vyparovania testovanej chemikálie. Na kvantifikáciu látky v testovacích roztokoch je potrebné mať spoľahlivú analytickú metódu so známou a uvedenou presnosťou a detekčným limitom.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Ak sa táto testovacia metóda používa na testovanie zmesi, jej zloženie by sa malo stanoviť čo najpodrobnejšie, napr. na základe chemickej identity jej zložiek, ich kvantitatívneho výskytu a špecifických vlastností (pozri bod 4). Pred použitím tejto testovacej metódy na regulačné testovanie zmesi treba zvážiť, či poskytne prijateľné výsledky na určené regulačné účely.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Pokiaľ ide o látky, ktoré môžu byť aktivované prostredníctvom metabolizmu, existujú dôkazy, že embryá dania pruhovaného majú biotransformačné schopnosti (19)(20)(21)(22). Metabolická kapacita embryonálnych rýb však nie je vždy podobná metabolickej kapacite mladých alebo dospelých rýb. Napríklad sa v teste FET nezistil protoxikant alylalkohol (9). Preto ak existujú náznaky, že metabolity alebo iné relevantné produkty transformácie môžu byť toxickejšie než materská zlúčenina, odporúča sa vykonať test aj s týmito metabolitmi/produktmi transformácie a aj tieto výsledky použiť pri formulovaní záverov o toxicite testovanej chemikálie, prípadne vykonať iný test, v ktorom sa podrobnejšie prihliada na metabolizmus.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 V prípade látok s molekulovou hmotnosťou ≥ 3kDa, veľmi objemnou molekulárnou štruktúrou a látok spôsobujúcich oneskorenie liahnutia, ktoré by mohli zabrániť expozícii po vyliahnutí alebo ju znížiť, sa vzhľadom na obmedzenú biologickú dostupnosť látky neočakáva citlivosť embryí, takže môžu byť vhodnejšie iné testy toxicity.
                              
                           PLATNOSŤ TESTU
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Na účely validnosti výsledkov platia tieto kritériá:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             celková miera oplodnenia všetkých odobratých vajíčok v testovanej vzorke by mala byť ≥ 70 %;
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             teplota vody v testovacích komorách by sa počas celého testu mala udržiavať na 26 ± 1 °C;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             celkové prežitie embryí v negatívnej kontrole (voda na riedenie), prípadne v kontrole s aplikáciou rozpúšťadla by malo byť ≥ 90 % až do konca 96-hodinovej expozície;
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             expozícia v pozitívnej kontrole (napr. 4,0 mg/l 3,4-dichlóranilínu pre danio pruhované) by mala viesť k minimálnej úmrtnosti 30 % na konci 96-hodinovej expozície;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             miera liahnutia v negatívnej kontrole (prípadne v kontrole s aplikáciou rozpúšťadla) by mala byť ≥ 80 % na konci 96-hodinovej expozície;
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             na konci 96-hodinovej expozície by mala byť koncentrácia rozpusteného kyslíka v negatívnej kontrole a najvyššia testovaná koncentrácia ≥ 80 % nasýtenia.
                                          
                                       
                           OPIS METÓDY
                     
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Prehľad odporúčaných podmienok chovu a testovacích podmienok sa uvádza v dodatku 2.
                              
                           
                        Testovacie vybavenie
                     
                     
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Potrebné je toto vybavenie:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             akváriá z chemicky inertného materiálu (napr. zo skla) s vhodným objemom vzhľadom na odporúčanú veľkosť násady (pozri časť „Chov generačných rýb“, bod 14);
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             invertovaný mikroskop a/alebo binokulárny mikroskop s možnosťou aspoň 80-násobného zväčšenia. Ak v miestnosti použitej na zaznamenávanie pozorovaní nemožno dosiahnuť teplotu 26 ± 1 °C, je nutné použiť podstavec s krížovým posunom s regulovanou teplotou alebo iné metódy na udržiavanie teploty;
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             testovacie komory, napr. štandardné 24-jamkové platničky s hĺbkou približne 20 mm (pozri časť „Testovacie komory“, bod 11);
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             napr. samolepiaca fólia na zakrytie 24-jamkových platničiek;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             inkubátor alebo klimatizovaná miestnosť s regulovanou teplotou umožňujúce udržiavať teplotu 26 ± 1 °C v jamkách (alebo testovacích komorách);
                                          
                                       
                                             f)
                                          
                                          
                                             pH-meter;
                                          
                                       
                                             g)
                                          
                                          
                                             oximeter;
                                          
                                       
                                             h)
                                          
                                          
                                             zariadenie na stanovenie tvrdosti vody a vodivosti;
                                          
                                       
                                             i)
                                          
                                          
                                             zachytávač vajíčok: podložka na nástroje zo skla, z nehrdzavejúcej ocele alebo iných inertných materiálov, drôtené sito (veľkosť mriežky 2 ± 0,5 mm) z nehrdzavejúcej ocele alebo iného inertného materiálu na ochranu nakladených vajíčok, trecí substrát (napr. imitácie rastlín z inertného materiálu) [TM C.48, dodatok 4a (23)];
                                          
                                       
                                             j)
                                          
                                          
                                             pipety s rozšírenými otvormi na zber vajíčok;
                                          
                                       
                                             k)
                                          
                                          
                                             sklenené nádoby na prípravu rôznych testovaných koncentrácií a vody na riedenie (kadičky, kalibrované odmerné banky, odmerné valce a odmerné pipety) alebo na zber vajíčok dania pruhovaného (napr. kadičky, kryštalizačné misky);
                                          
                                       
                                             l)
                                          
                                          
                                             ak sa na vykonanie testu používajú alternatívne expozičné systémy, napríklad prietokové (24) alebo s pasívnym dávkovaním (25), sú potrebné vhodné priestory a vybavenie.
                                          
                                       
                           
                        Testovacie komory
                     
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Mali by sa použiť sklenené alebo polystyrénové testovacie komory (napr. 24-jamkové platničky s objemom plnenia 2,5 – 5 ml na jednu jamku). V prípade podozrenia na adsorpciu na polystyrén (napr. pri nepolárnych, planárnych látkach s vysokou hodnotou Kow) by sa na zníženie eliminácií v dôsledku adsorpcie mali použiť inertné materiály (sklo) (26). Testovacie komory by sa mali v inkubátore umiestniť náhodne
                              
                           
                        Vlastnosti vody a podmienky testu
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Na dosiahnutie stupňa tvrdosti vody typického pre široké spektrum povrchových vôd sa odporúča chovnú vodu nariediť. Voda na riedenie sa pripravuje z rekonštituovanej vody (27). Výsledný stupeň tvrdosti by mal zodpovedať 100 – 300 mg/l CaCO3, aby sa predišlo nadmernému vyzrážaniu uhličitanu vápenatého. Možno použiť aj inú dobre charakterizovanú povrchovú alebo studňovú vodu. Rekonštituovanú vodu možno upraviť na chovnú vodu s nízkou tvrdosťou riedením deionizovanou vodou až na pomer 1:5 na minimálnu tvrdosť 30 – 35 mg/l CaCO3. Voda sa pred pridaním testovanej chemikálie prevzdušňuje, aby sa dosiahlo nasýtenie kyslíkom. V jamkách by sa počas celého testu mala udržiavať teplota 26 ± 1 °C. Hodnota pH by mala byť v rozsahu od 6,5 do 8,5 a v rámci tohto rozpätia by sa nemala odchyľovať o viac ako 1,5 jednotky počas celého testu. Ak sa očakáva, že hodnota pH nezostane v tomto rozsahu, pred začatím testu by sa malo upraviť pH. Úprava pH by sa mala vykonať tak, aby sa významne nezmenila koncentrácia zásobného roztoku a aby nedošlo k chemickej reakcii alebo zrážaniu testovanej chemikálie. Na korekciu pH v roztokoch obsahujúcich testovanú chemikáliu sa odporúča použiť chlorovodík (HCl) a hydroxid sodný (NaOH).
                              
                           
                        Testovacie roztoky
                     
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Testovacie roztoky vybraných koncentrácií možno pripraviť napríklad zriedením zásobného roztoku. Zásobné roztoky by sa podľa možnosti mali pripraviť jednoduchým zmiešaním alebo pretrepaním testovanej chemikálie vo vode na riedenie mechanickým spôsobom (napr. premiešavaním a/alebo ultrazvukom). Ak sa testovaná chemikália ťažko rozpúšťa vo vode, mali by sa použiť postupy uvedené v usmerňovacom dokumente OECD č. 23 o manipulácii s náročnými látkami a zmesami (28). Používaniu rozpúšťadiel sa treba vyhnúť, ale v niektorých prípadoch môže byť potrebné na vytvorenie vhodne koncentrovaného zásobného roztoku. Ak sa pri príprave zásobného roztoku použije rozpúšťadlo, jeho konečná koncentrácia by nemala byť vyššia ako 100 μl/l a mala by byť rovnaká vo všetkých testovacích nádobách. Ak sa použije rozpúšťadlo, je potrebná dodatočná kontrola s aplikáciou rozpúšťadla.
                              
                           
                        Chov generačných rýb
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Na produkciu vajíčok sa použije neresiaca sa populácia neexponovaných danií pruhovaných divokého typu s dobre zdokumentovanou mierou oplodnenia vajíčok. Ryby by nemali mať žiadne makroskopicky zjavné príznaky infekcií a chorôb a počas 2 mesiacov pred trením by nemali absolvovať žiadne (akútne ani profylaktické) ošetrenie farmaceutikami. Neresiace sa ryby sa udržiavajú v akváriách s odporučenou kapacitou násady 1 l vody na rybu a pevnou fotoperiódou trvajúcou 12 – 16 hodín (29)(30)(31)(32)(33). Potrebné je nastaviť optimálnu rýchlosť filtrácie. Nadmerná rýchlosť filtrácie môže vodu výrazne znehodnotiť, takže sa jej treba vyhnúť. Podmienky kŕmenia sú uvedené v dodatku 2. Treba sa vyhnúť nadmernému kŕmeniu, pravidelne by sa mala monitorovať kvalita vody a čistota akvárií a v prípade potreby je potrebné obnoviť pôvodný stav.
                              
                           
                        Preukázanie odbornosti
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Referenčná chemikália 3,4-dichlóranilín [použitá vo validačných štúdiách (1)(2)] by sa mala podľa možnosti dvakrát ročne otestovať v celom rozsahu reakcie na koncentráciu s cieľom overiť citlivosť použitého kmeňa rýb. V každom laboratóriu, ktoré prvýkrát zavádza túto skúšku, by sa mala použiť referenčná chemikália. Predtým, ako laboratórium predloží údaje na regulačné účely, môže použiť túto chemikáliu na preukázanie svojej technickej spôsobilosti na vykonávanie tejto skúšky.
                              
                           
                        Produkcia vajíčok
                     
                     
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Vajíčka dania pruhovaného možno produkovať metódou trenia v jednotlivých skupinách (v individuálnych trecích nádržiach) alebo masového trenia (v chovných nádržiach). V prípade trenia v skupinách sa samce a samice (napr. v pomere 2:1) v neresiacej sa skupine umiestnia v deň pred testom (pred začiatkom súmraku) na niekoľko hodín do trecích nádrží. Keďže v skupinách dania pruhovaného určených na trenie občas nemusí dôjsť k treniu, odporúča sa súbežne použiť aspoň tri trecie nádrže. S cieľom zabrániť genetickému skresleniu sa odoberú vajíčka od najmenej troch neresiacich sa skupín, následne sa zmiešajú a náhodne vyberú na test.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Na účely zberu vajíčok sa do trecích nádrží alebo chovných nádrží umiestnia zachytávače vajíčok, a to v deň pred testom (pred začiatkom súmraku) alebo v deň testu (pred svitaním) Na zabránenie predácii vajíčok dospelými daniami pruhovanými sa zachytávače vajíčok zakryjú inertným drôteným sitom s vhodnou veľkosťou mriežky (približne 2 ± 0,5 mm). Ak sa to bude považovať za potrebné, k situ sa ako podnet k treniu môžu pripevniť umelé rastliny vyrobené z inertného materiálu (napr. z plastu alebo zo skla) (3)(4)(5)(23)(35). Mali by sa použiť vhodne upravené plastové materiály, ktoré sa nevylúhujú (napr. ftaláty). K páreniu, treniu a oplodneniu dochádza do 30 minút od začiatku svitania, potom možno zachytávače vajíčok so zachytenými vajíčkami opatrne odobrať. Odporúča sa vajíčka po odbere zo zachytávačov vajíčok prepláchnuť rekonštituovanou vodou.
                              
                           
                        Diferenciácia vajíčok
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Pri teplote 26 °C prejdú oplodnené vajíčka prvým ryhovaním po približne 15 minútach, pričom následnými synchrónnymi ryhovaniami sa vytvoria blastoméry so 4, 8, 16 a 32 bunkami (pozri dodatok 3) (35). V týchto fázach možno oplodnené vajíčka jasne identifikovať podľa vývinu blastuly
                              
                           POSTUP
                     
                        Podmienky expozície
                     
                     
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Dvadsať embryí na koncentráciu (jedno embryo na jamku) sa vystaví pôsobeniu testovanej chemikálie. Expozícia by mala byť taká, že sa počas celého testu udrží ± 20 % nominálnej koncentrácie chemikálie. Ak to nie je možné dosiahnuť v statickom systéme, treba použiť polostatické obnovovanie so zvládnuteľným intervalom (napr. obnovenie každých 24 hodín). V týchto prípadoch sa expozičné koncentrácie musia overiť minimálne pri najvyššej a najnižšej testovanej koncentrácii na začiatku a konci každého intervalu expozície (pozri bod 36). Ak nie je možné udržať expozičnú koncentráciu ± 20 % nominálnej koncentrácie, na začiatku a konci každého intervalu expozície sa musia merať všetky koncentrácie (pozri bod 36). Pri obnovovaní treba dbať na to, aby embryá zostali zakryté malým množstvom starého testovacieho roztoku s cieľom zabrániť ich vyschnutiu. Koncepciu testu možno prispôsobiť tak, aby spĺňala požiadavky na testovanie konkrétnych látok [napr. prietokové systémy (24) alebo systémy s pasívnym dávkovaním (25) v prípade ľahko degradovateľných alebo vysokoadsorpčných látok (29), alebo iné systémy v prípade prchavých látok (36)(37)]. V každom prípade treba dbať na minimalizovanie akéhokoľvek stresu embryí. Testovacie komory by sa aspoň počas 24 hodín pred začatím testu mali ošetriť testovacími roztokmi. Podmienky testu sú zhrnuté v dodatku 2.
                              
                           
                        Testované koncentrácie
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Na splnenie štatistických požiadaviek je zvyčajne potrebných päť koncentrácií testovanej chemikálie s odstupom s konštantným faktorom nepresahujúcim 2,2. Ak sa použije menej ako päť koncentrácií, je potrebné uviesť zdôvodnenie. Najvyššia testovaná koncentrácia by ideálne mala vyvolať 100 % letalitu a najnižšia testovaná koncentrácia by ideálne nemala mať žiadne pozorovateľné účinky, ako je uvedené v bode 28. Test na vyhľadávanie rozsahu vykonaný pred konečným testom umožní vybrať vhodný rozsah koncentrácie. Vyhľadávanie rozsahu sa zvyčajne vykonáva s použitím desiatich embryí na koncentráciu. Nasledujúce pokyny sa vzťahujú na vykonanie testu na 24-jamkových platničkách. Ak sa použijú odlišné testovacie komory (napr. malé Petriho misky) alebo ak sa testuje viac koncentrácií, pokyny sa musia príslušne upraviť.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Podrobnosti a obrazové pokyny na rozmiestnenie koncentrácií na 24-jamkových platničkách sú uvedené v bode 27 a v dodatku 4, obrázok 1.
                              
                           
                        Kontroly
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Kontrolné skupiny udržiavané vo vode na riedenie sú potrebné ako negatívne kontroly, ako aj vnútorné kontroly platničiek. Ak sa v rámci vnútornej kontroly platničky pozoruje viac ako 1 mŕtve embryo, platnička sa vylúči, čím sa zníži počet koncentrácií použitých na určenie hodnoty LC50. Ak sa vylúči celá platnička, môže sa znížiť schopnosť vyhodnotiť a rozpoznať pozorované účinky, najmä ak sa vylúči tá platnička, ktorá slúži na kontrolu s aplikáciou rozpúšťadla, alebo platnička, na ktorej sú zároveň postihnuté embryá ovplyvnené chemikáliou. V prvom prípade je nutné test zopakovať. V druhom prípade môže strata celej ovplyvňovanej skupiny (skupín) v dôsledku úmrtnosti vo vnútornej kontrole obmedziť schopnosť vyhodnotiť účinky a stanoviť hodnoty LC50.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Vykoná sa pozitívna kontrola pri pevnej koncentrácii 4 mg/l 3,4-dichlóranilínu s každou vzorkou vajíčok použitou na testovanie.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Ak sa používa rozpúšťadlo, na samostatnej 24-jamkovej platničke sa rozpúšťadlu vystaví doplnková skupina 20 embryí, ktorá predstavuje kontrolu s aplikáciou rozpúšťadla. Na to, aby sa test mohol považovať za prijateľný, by sa malo sa preukázať, že rozpúšťadlo nemá žiadny významný vplyv na čas liahnutia ani prežitie, a nespôsobuje ani iné nepriaznivé účinky na embryá (pozri bod 8c).
                              
                           
                        Začiatok expozície a trvanie testu
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Test sa začne čo najskôr po oplodnení vajíčok a skončí sa po 96 hodinách expozície. Embryá sa ponoria do testovacích roztokov pred začatím ryhovania blastodisku alebo najneskôr do dosiahnutia 16-bunkového štádia. Na to, aby bolo možné začať expozíciu s minimálnym oneskorením, náhodne sa vyberie aspoň dvojnásobný počet vajíčok potrebných na každú ovplyvňovanú skupinu a prenesie sa do príslušných koncentrácií a kontrol (napr. do 100 ml kryštalizačných misiek; vajíčka by mali byť úplne zakryté), a to najneskôr 90 minút po oplodnení
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Životaschopné oplodnené vajíčka by sa mali oddeliť od neoplodnených vajíčok a preniesť na 24-jamkové platničky, ktoré sa predtým 24 hodín pripravovali v podmienkach testu. Následne by sa do 180 minút od oplodnenia mali doplniť 2 ml čerstvo pripraveného testovacieho roztoku na jamku. Prostredníctvom stereomikroskopie (podľa možnosti ≥ 30-násobné zväčšenie) sa vyberú oplodnené vajíčka, v ktorých prebieha ryhovanie a ktoré počas ryhovania nevykazujú žiadne zjavné nepravidelnosti (napr. asymetriu, tvorbu vačkov) ani poškodenia choriónu. Informácie o zbere a oddeľovaní vajíčok nájdete v dodatku 3, obr. 1 a 3 a v dodatku 4, obr. 2.
                              
                           
                        Rozloženie vajíčok na 24-jamkových platničkách
                     
                     
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Vajíčka sa rozložia na jamkové platničky v týchto počtoch (pozri aj dodatok 4, obr. 1):
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             20 vajíčok na jednu platničku pre každú testovanú koncentráciu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 vajíčok na jednu platničku ako kontrola s aplikáciou rozpúšťadla (ak to je potrebné),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             20 vajíčok na jednu platničku ako pozitívna kontrola,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             4 vajíčka vo vode na riedenie ako vnútorná kontrola platničky na každú z uvedených platničiek,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             24 vajíčok vo vode na riedenie na jednu platničku ako negatívna kontrola.
                                          
                                       
                           
                        Pozorovania
                     
                     
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Koncové pozorovania každého testovaného embrya zahŕňajú koaguláciu embryí, nevytvorenie somitov, neoddelenie chvosta a neprítomnosť srdcového tepu (tabuľka 1). Tieto pozorovania slúžia na stanovenie letality: každý kladný výsledok jedného z týchto pozorovaní znamená, že embryo dania pruhovaného je mŕtve. Okrem toho sa každý deň od 48. hodiny zaznamenáva liahnutie v ovplyvňovaných i kontrolných skupinách. Pozorovania sa zaznamenávajú každých 24 hodín až do konca testu.
                                 
                                    Tabuľka 1
                                 
                                 
                                    Koncové pozorovania akútnej toxicity u embryí dania pruhovaného 24 – 96 hodín po oplodnení
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Časy expozície
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             24 hod.
                                          
                                          
                                             48 hod.
                                          
                                          
                                             72 hod.
                                          
                                          
                                             96 hod.
                                          
                                       
                                             Koagulované embryá
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Nevytvorenie somitov
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Neoddelenie chvosta
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                                             Neprítomnosť srdcového tepu
                                          
                                          
                                              
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                          
                                             +
                                          
                                       
                           
                              
                                 29.
                              
                              
                                 
                                    Koagulácia embrya: Koagulované embryá sú mliečnobiele a pod mikroskopom vyzerajú tmavé (pozri dodatok 5, obr. 1). Počet koagulovaných embryí sa stanovuje po 24, 48, 72 a 96 hodinách.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 
                                    Nevytvorenie somitov: Pri teplote 26 ± 1 °C sa u normálne sa vyvíjajúceho embrya dania pruhovaného vytvorí po 24 hodinách približne 20 somitov (pozri dodatok 5, obrázok 2). Normálne vyvinuté embryo vykazuje spontánne pohyby (kontrakcie zo strany na stranu). Spontánne pohyby nasvedčujú vytvoreniu somitov. Neprítomnosť somitov sa zaznamenáva po 24, 48, 72 a 96 hodinách. Nevytvorenie somitov po 24 hodinách môže byť dôsledkom celkového oneskorenia vývinu. Somity by mali byť vyvinuté najneskôr po 48 hodinách. Ak nie, embryá sa považujú za mŕtve.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 
                                    Neoddelenie chvosta: U normálne sa vyvíjajúceho embrya dania pruhovaného sa oddelenie chvosta (pozri dodatok 5, obrázok 3) od žĺtka pozoruje po posteriórnom predĺžení tela embrya. Neprítomnosť oddelenia chvosta sa zaznamenáva po 24, 48, 72 a 96 hodinách.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 
                                    Neprítomnosť srdcového tepu: U normálne sa vyvíjajúceho embrya dania pruhovaného je pri teplote 26 ± 1 °C srdcový tep viditeľný po 48 hodinách (pozri dodatok 5, obrázok 4). Pri zaznamenávaní tohto sledovaného parametra je potrebná mimoriadna obozretnosť, lebo nepravidelný (eratický) srdcový tep by sa nemal zaznamenať ako letálny. Okrem toho sa za letálny nepovažuje viditeľný srdcový tep bez obehu v brušnej aorte. Na zaznamenanie tohto sledovaného parametra by sa embryá bez srdcového tepu mali pozorovať pri aspoň 80-násobnom zväčšení aspoň jednu minútu. Neprítomnosť srdcového tepu sa zaznamenáva po 48, 72 a 96 hodinách.
                              
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Vo všetkých ovplyvňovaných a kontrolných skupinách by sa mala od 48. hodiny zaznamenávať a uvádzať miera liahnutia. Hoci liahnutie nie je finálnym parametrom použitým na výpočet hodnoty LC50, vyliahnutím sa zabezpečí expozícia embrya bez potenciálnej bariérovej funkcie choriónu, čo môže pomôcť pri výklade údajov.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Podrobný opis normálneho vývinu (35) a príklady abnormálneho vývinu embryí dania pruhovaného sú znázornené v dodatkoch 3 a 5.
                              
                           
                        Analytické merania
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Na začiatku a na konci testu sa odmeria pH, celková tvrdosť a vodivosť v kontrole (kontrolách) a pri najvyššej koncentrácii testovanej chemikálie. V polostatických obnovovacích systémoch by sa hodnota pH mala odmerať pred obnovením vody a po ňom. Koncentrácia rozpusteného kyslíka sa meria na konci testu v negatívnych kontrolách a v skupine s najvyššou testovanou koncentráciou so životaschopnými embryami, kde by mala byť v súlade s validačnými kritériami testu (pozri bod 8f). Ak existuje obava, že medzi rôznymi 24-jamkovými platničkami sa líši teplota, odmeria sa v troch náhodne vybraných nádobách. Teplota sa má ideálne zaznamenávať nepretržite počas testu alebo aspoň raz denne.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 V statickom systéme by sa koncentrácia testovanej chemikálie mala merať aspoň v skupine s najvyššou a najnižšou testovanou koncentráciou, ale ideálne vo všetkých ovplyvňovaných skupinách, a to na začiatku a konci testu. V polostatických (obnovovacích) testoch, kde sa očakáva, že koncentrácia testovanej chemikálie zostane v rozmedzí ± 20 % nominálnych hodnôt, sa odporúča analyzovať aspoň skupinu s najvyššou a najnižšou testovanou koncentráciou, a to bezprostredne po príprave a bezprostredne pred obnovením. V testoch, kde sa očakáva, že koncentrácia testovanej chemikálie nezostane v rozmedzí ± 20 % nominálnej hodnoty, sa musia analyzovať všetky testované koncentrácie, a to bezprostredne po príprave a bezprostredne pred obnovením. V prípade nedostatočného objemu na analýzu môže byť užitočné spojiť testovacie roztoky alebo použiť náhradné komory z toho istého materiálu a s tým istým pomerom objemu k ploche povrchu ako 24-jamkové platničky. Dôrazne sa odporúča, aby výsledky vychádzali z nameraných koncentrácií. Ak koncentrácie nezostanú v rozmedzí 80 – 120 % nominálnej koncentrácie, účinné koncentrácie sa majú vyjadriť v pomere ku geometrickému priemeru nameraných koncentrácií. Ďalšie podrobnosti nájdete v kapitole 5 usmerňovacieho dokumentu OECD o testovaní vodnej toxicity náročných látok a zmesí (28).
                              
                           LIMITNÝ TEST
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Pomocou postupov opísaných v tejto testovacej metóde možno vykonať limitný test so 100 mg/l testovanej chemikálie alebo pri limite jej rozpustnosti v testovacom médiu (podľa toho, ktorá hodnota je nižšia) s cieľom preukázať, že hodnota LC50 je vyššia ako táto koncentrácia. Limitný test by sa mal vykonať s použitím 20 embryí v ovplyvňovanej skupine, pozitívnej kontrole a – podľa potreby – v kontrole s aplikáciou rozpúšťadla a s použitím 24 embryí v negatívnej kontrole. Ak percento letality pri testovanej koncentrácii prekročí úmrtnosť v negatívnej kontrole (alebo v kontrole s aplikáciou rozpúšťadla) o 10 %, mala by sa vykonať úplná štúdia. Všetky pozorované účinky by sa mali zaznamenať. Ak úmrtnosť v negatívnej kontrole (alebo v kontrole s aplikáciou rozpúšťadla) prekročí 10 %, test je neplatný a mal by sa zopakovať.
                              
                           ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Spracovanie výsledkov
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 V tomto teste sa na účely štatistickej analýzy jednotlivé jamky považujú za nezávislé replikáty. Percentá embryí, u ktorých je aspoň jedno z koncových pozorovaní pozitívne v čase 48 a/alebo 96 hodín, sa zakreslia do grafu proti testovaným koncentráciám. Na výpočet sklonu krivky, hodnôt LC50 a hraníc spoľahlivosti (95 %) by sa mali použiť vhodné štatistické metódy (38) s prihliadnutím na usmerňovací dokument OECD o súčasných prístupoch k štatistickej analýze údajov o ekotoxicite (39).
                              
                           
                        Správa o teste
                     
                     
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovaná chemikália:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Jednozložkové látky
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď. (vrátane obsahu organicky viazaného uhlíka, ak to je vhodné).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Viaczložkové látky, UVCB a zmesi:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovacie organizmy:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vedecký názov, kmeň, zdroj a metóda zberu oplodnených vajíčok a následnej manipulácie.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Podmienky testu:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         použitý testovací postup (napr. polostatický obnovovací),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         fotoperióda,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koncepcia testu (napr. počet testovacích komôr, druhy kontrol),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         charakteristiky kvality vody na chov rýb (napr. pH, tvrdosť, teplota, vodivosť, rozpustený kyslík),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koncentrácia rozpusteného kyslíka, pH, celková tvrdosť, teplota a vodivosť testovacích roztokov na začiatku a po 96 hodinách,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metóda prípravy zásobných roztokov a testovacích roztokov a frekvencia obnovovania,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         odôvodnenie použitia a výberu rozpúšťadla, ak je iné ako voda,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nominálne testované koncentrácie a výsledky všetkých analýz na stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie v testovacích nádobách, mala by sa oznámiť aj účinnosť obnovy a kvantifikačný limit (LoQ),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dôkaz, že kontroly splnili všeobecné validačné kritériá platnosti pre prežitie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         miera oplodnenia vajíčok,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         miera liahnutia v ovplyvňovaných a kontrolných skupinách.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Výsledky:
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         maximálna koncentrácia nespôsobujúca úmrtnosť počas trvania testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         minimálna koncentrácia spôsobujúca 100 % úmrtnosť počas trvania testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         kumulatívna úmrtnosť pri každej koncentrácii v odporučených časoch pozorovania,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         hodnoty LC50 v čase 96 hodín (a prípadne v čase 48 hodín) pre úmrtnosť s 95 % hranicami spoľahlivosti, ak je to možné,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         graf krivky závislosti úmrtnosti od koncentrácie na konci testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         úmrtnosť v kontrolách (negatívne kontroly, vnútorné kontroly platničiek, ako aj pozitívna kontrola a prípadná použitá kontrola s aplikáciou rozpúšťadla),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         údaje o výsledku každého zo štyroch koncových pozorovaní,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         výskyt a opis morfologických a fyziologických abnormalít, ak sú prítomné (pozri príklady uvedené v dodatku 5, obrázok 2),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         udalosti v priebehu testu, ktoré mohli ovplyvniť výsledky,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         štatistická analýza a spracovanie údajov (probitová analýza, model logistickej regresie a geometrický priemer hodnoty LC50),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         sklon a hranice spoľahlivosti regresie (transformovanej) krivky závislosti veličiny od koncentrácie.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Všetky odchýlky od testovacej metódy a príslušné vysvetlenia.
                                             
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Rozbor a interpretácia výsledkov.
                                             
                                          
                                       
                           LITERATÚRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 OECD (2011) Validation Report (Phase 1) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Series on Testing and Assessment No. 157, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 OECD (2012) Validation Report (Phase 2) for the Zebrafish Embryo Toxicity Test: Part I and Part II (Annexes). Series on Testing and Assessment No. 179, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Böttcher, M., Hollert, H., Kosmehl, T., Lammer, E., Leist, E., Rudolf, M. and Seitz, N. (2005) Towards an alternative for the acute fish LC50 test in chemical assessment: The fish embryo toxicity test goes multi-species-an update. ALTEX 22: 87-102.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO (2007) International Standard Water quality – Determination of the acute toxicity of waste water to zebrafish eggs (Danio rerio). ISO 15088:2007(E) International Organization for Standardization.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Nagel, R. (2002) DarT: The embryo test with the zebrafish (Danio rerio) – a general model in ecotoxicology and toxicology. ALTEX 19: 38-48.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Schulte, C. and Nagel, R. (1994) Testing acute toxicity in embryo of zebrafish, Brachydanio rerio as alternative to the acute fish test – preliminary results. ATLA 22, 12-19.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Bachmann, J. (2002) Development and validation of a teratogenicity screening test with embryos of the zebrafish (Danio rerio). PhD-thesis, Technical University of Dresden, Germany.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Lange, M., Gebauer, W., Markl, J. and Nagel, R. (1995) Comparison of testing acute toxicity on embryo of zebrafish (Brachydanio rerio), and RTG-2 cytotoxicity as possible alternatives to the acute fish test. Chemosphere 30/11: 2087-2102.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Knöbel, M., Busser, F.J.M., Rico-Rico, A., Kramer, N.I., Hermens, J.L.M., Hafner, C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Scholz, S. (2012). Predicting adult fish acute lethality with the zebrafish embryo: relevance of test duration, endpoints, compound properties, and exposure concentration analysis. Environ. Sci. Technol. 46, 9690-9700.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Kammann, U., Vobach, M. and Wosniok, W. (2006) Toxic effects of brominated indoles and phenols on zebrafish embryos. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 51: 97-102.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Groth, G., Kronauer, K. and Freundt, K.J. (1994) Effects of N,N-diemethylformamide and its degradation products in zebrafish embryos. Toxicol. In Vitro 8: 401-406.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Groth, G., Schreeb, K., Herdt, V. and Freundt, K.J. (1993) Toxicity studies in fertilized zebrafish fish eggs treated with N-methylamine, N,N-dimethylamine, 2-aminoethanol, isopropylamine, aniline, N-methylaniline, N,N-dimethylaniline, quinone, chloroacetaldehyde, or cyclohexanol. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 50: 878-882.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Nguyen, L.T. and Janssen, C.R. (2001) Comparative sensitivity of embryo-larval toxicity assays with African catfish (Clarias gariepinus) and zebra fish (Danio rerio). Environ. Toxicol. 16: 566-571.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Cheng, S.H., Wai, A.W.K., So, C.H. and Wu, R.S.S. (2000) Cellular and molecular basis of cadmium-induced deformities in zebrafish embryos. Environ. Toxicol. Chem. 19: 3024-3031.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Belanger, S. E., Rawlings J. M. and Carr G. J. (2013). Use of Fish Embryo Toxicity Tests for the Prediction of Acute Fish Toxicity to Chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry 32: 1768-1783.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Lammer, E., Carr, G. J., Wendler, K., Rawlings, J. M., Belanger, S. E., Braunbeck, T. (2009) Is the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity test? Comp. Biochem. C Toxicol. Pharmacol.: 149 (2), 196-209
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Kapitola C.4 tejto prílohy: Ľahká biodegradovateľnosť.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Kapitola C.29 tejto prílohy: Ľahká biodegradovateľnosť, CO2 vo vzduchotesne uzatvorených nádobách.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2011) Zebrafish (Danio rerio) embryos as a model for testing proteratogens. Toxicology 281: 25-36.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Weigt, S., Huebler, N., Strecker, R., Braunbeck, T., Broschard, T.H. (2012) Developmental effects of coumarin and the anticoagulant coumarin derivative warfarin on zebrafish (Danio rerio) embryos. Reprod. Toxicol. 33: 133-141.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Incardona, J.P, Linbo, T.L., Scholz, N.L. (2011) Cardiac toxicity of 5-ring polycyclic aromatic hydrocarbons is differentially dependent on the aryl hydrocarbon receptor 2 isoform during zebrafish development. Toxicol. Appl. Pharmacol. 257: 242-249.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Kubota, A., Stegeman, J.J., Woodin, B.R., Iwanaga, T., Harano, R., Peterson, R.E., Hiraga, T., Teraoka, H. (2011) Role of zebrafish cytochrome P450 CYP1C genes in the reduced mesencephalic vein blood flow caused by activation of AHR2. Toxicol. Appl. Pharmacol. 253: 244-252.
                              
                           
                                 (23)
                              
                              
                                 Kapitola C.48 tejto prílohy: Skúška krátkodobého rozmnožovania rýb. Pozri dodatok 4a.
                              
                           
                                 (24)
                              
                              
                                 Lammer, E., Kamp, H.G., Hisgen, V., Koch, M., Reinhard, D., Salinas, E.R., Wendlar, K., Zok, S., Braunbeck, T. (2009) Development of a flow-through system for the fish embryo toxicity test (FET) with zebrafish (Danio rerio). Toxicol. in vitro 23: 1436-1442.
                              
                           
                                 (25)
                              
                              
                                 Brown, R.S., Akhtar, P., Åkerman, J., Hampel, L., Kozin, I.S., Villerius, L.A., Klamer, H.J.C., (2001) Partition controlled delivery of hydrophobic substances in toxicity tests using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) ﬁlms. Environ. Sci. Technol. 35, 4097-4102.
                              
                           
                                 (26)
                              
                              
                                 Schreiber, R., Altenburger, R., Paschke, A., Küster, E. (2008) How to deal with lipophilic and volatile organic substances in microtiter plate assays. Environ. Toxicol. Chem. 27, 1676-1682.
                              
                           
                                 (27)
                              
                              
                                 ISO (1996) International Standards. Water quality – Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish [Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)]. ISO 7346-3: Flow-through method. k dispozícii na stránke: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (28)
                              
                              
                                 OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Series on Testing and Assessment No. 23, OECD, Paris.
                              
                           
                                 (29)
                              
                              
                                 Laale, H.W. (1977) The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio, in fisheries research. A literature review. J. Fish Biol. 10: 121-173.
                              
                           
                                 (30)
                              
                              
                                 Westerfield, M. (2007) The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). 5th edition. Eugene, University of Oregon Press, Institute of Neuroscience, USA.
                              
                           
                                 (31)
                              
                              
                                 Canadian Council on Animal Care (2005) Guidelines on: the Care and Use of Fish in Research, Teaching and Testing, ISBN: 0-919087-43-4 http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Fish.pdf.
                              
                           
                                 (32)
                              
                              
                                 Európska komisia (2007) Odporúčanie Komisie 2007/526/EC z 18. júna 2007 o usmerneniach týkajúcich sa umiestnenia zvierat používaných na pokusné a iné vedecké účely a starostlivosti o ne [oznámené pod číslom dokumentu K(2007) 2525] (http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2007:197:0001:0089:SK:PDF).
                              
                           
                                 (33)
                              
                              
                                 Európska únia (2010) Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely (Ú. v. EÚ L 276, 20.10.2010, s. 33).
                                 http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:SK:PDF
                              
                           
                                 (34)
                              
                              
                                 Nagel, R. (1986) Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling (Brachydanio rerio, Ham.-Buch.). J. Appl. Ichthyol. 2: 173-181.
                              
                           
                                 (35)
                              
                              
                                 Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B. and Schilling, T.F. (1995) Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203: 253-310.
                              
                           
                                 (36)
                              
                              
                                 Kapitola C.4 tejto prílohy: Test akútnej imobilizácie dafnií (Daphnia sp.).
                              
                           
                                 (37)
                              
                              
                                 Weil, M., Scholz, S., Zimmer, M., Sacher, F., Duis, K. (2009) Gene expression analysis in zebrafish embryos: a potential approach to predict effect conentrations in the fish early life stage test. Environ. Toxicol. Chem. 28: 1970-1978
                              
                           
                                 (38)
                              
                              
                                 ISO (2006) International Standard. Water quality – Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data ISO TS 20281. k dispozícii na stránke: [http://www.iso.org].
                              
                           
                                 (39)
                              
                              
                                 OECD (2006) Guidance Document on Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No. 54. OECD, Paris.
                              
                           
                                 (40)
                              
                              
                                 Braunbeck, T., Lammer, E., 2006. Detailed review paper “Fish embryo toxicity assays”. UBA report under contract no. 20385422 German Federal Environment Agency, Berlin. 298 pp.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                           
                              Koncový sledovaný parameter
                           : účinok pôsobiaci na úrovni populácie.
                        
                           
                              Blastula
                           : zhluk buniek okolo animálneho pólu, ktorý pokrýva určitú časť žĺtka.
                        
                           
                              Chemikália
                           : látka alebo zmes.
                        
                           
                              Epibólia
                           : rozsiahle šírenie prevažne epidermálnych buniek vo fáze gastrulácie embrya a ich presun z dorzálnej na ventrálnu stranu, v dôsledku čoho sa vrstvy endodermálnych buniek internalizujú procesom podobným invaginácii a žĺtok sa začlení do embrya.
                        
                           
                              Prietokový test
                           : test s neustálym prietokom testovacích roztokov cez testovací systém počas trvania expozície.
                        
                           
                              Vnútorná kontrola platničky
                           : vnútorná kontrola skladajúca sa zo 4 jamiek naplnených vodou na riedenie na každej 24-jamkovej platničke, ktorá slúži na identifikáciu možnej kontaminácie platničiek výrobcom alebo výskumným pracovníkom v priebehu postupu, ako aj všetkých vplyvov platničky, ktoré by potenciálne mohli ovplyvniť výsledok testu (napr. teplotný gradient).
                        
                           
                              IUPAC
                           : Medzinárodná únia pre čistú a aplikovanú chémiu (International Union of Pure and Applied Chemistry)
                        
                           
                              Chovná voda
                           : voda, v ktorej sa chovajú dospelé ryby.
                        
                           
                              Priemerná letálna koncentrácia (LC50)
                           : koncentrácia testovanej chemikálie, ktorá sa odhadne ako letálna pre 50 % testovacích organizmov počas trvania testu.
                        
                           
                              Polostatický obnovovací test
                           : test s pravidelným obnovovaním testovacích roztokov po stanovenom období (napr. každých 24 hodín).
                        
                           
                              SMILES
                           : zjednodušený systém zadávania molekulárnych štruktúr (Simplified Molecular Input Line Entry Specification).
                        
                           
                              Somit
                           : vo vyvíjajúcom sa embryu stavovcov sú somity zhluky mezodermy uložené laterálne od neurálnej trubice, z ktorých sa časom vyvinie koža (dermatóm), kostrové svalstvo (myotóm) a stavce (sklerotóm).
                        
                           
                              Statický test
                           : test, pri ktorom testovacie roztoky zostávajú nezmenené počas celého trvania testu.
                        
                           
                              Testovaná chemikália
                           : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje pomocou tejto testovacej metódy.
                        
                           
                              UVCB
                           : látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.
                     
                     
                        Dodatok 2
                        
                           CHOV, NERESENIE A TYPICKÉ PODMIENKY PRE TESTY AKÚTNEJ TOXICITY NA EMBRYÁCH DANIA PRUHOVANÉHO
                        
                        
                                    
                                       Danio pruhované (Danio rerio)
                                    
                                 
                              
                                    Pôvod druhu
                                 
                                 
                                    India, Barma, Malakka, Sumatra
                                 
                              
                                    Pohlavný dimorfizmus
                                 
                                 
                                    Samice: vyčnievajúce brucho pri nosení vajíčok
                                    Samce: tenšie, oranžové sfarbenie medzi modrými pozdĺžnymi pruhmi (zreteľné najmä na análnej plutve)
                                 
                              
                                    Kŕmny režim
                                 
                                 
                                    Suché vločky (max. 3 % hmotnosti ryby na deň) 3 až 5-krát denne, okrem toho naupliá žiabronôžky (rod Artemia) a/alebo malé dafnie primeranej veľkosti získané z nekontaminovaného zdroja. Kŕmenie živou potravou je zdrojom obohatenia prostredia, preto sa živá potrava má dávať vždy, keď je to možné. Na zaistenie optimálnej kvality vody sa má zvyšná potrava a výkaly odstrániť približne jednu hodinu po kŕmení.
                                 
                              
                                    Približná hmotnosť dospelých rýb
                                 
                                 
                                    Samice: 0,65 ± 0,13 g
                                    Samce: 0,5 ± 0,1 g
                                 
                              
                                    Chov rodičovských rýb
                                 
                                 
                                    Osvetlenie
                                 
                                 
                                    Žiarivky (široké spektrum), 10 – 20 μE/m2/s, 540 – 1 080  luxov alebo 50 – 100 ft-c (úrovne v laboratórnom prostredí), fotoperióda 12 – 16 hod.
                                 
                              
                                    Teplota vody
                                 
                                 
                                    26 ± 1 °C
                                 
                              
                                    Kvalita vody
                                 
                                 
                                    Nasýtenie O2 ≥ 80 %, tvrdosť: napr. ~ 30 – 300 mg/l CaCO3, NO3
                                       –: ≤ 48 mg/l, NH4
                                       + a NO2
                                       –: < 0,001 mg/l, zvyškový chlór < 10 μg/l, celkový obsah organického chlóru < 25 ng/l, pH = 6,5 – 8,5
                                 
                              
                                    Ďalšie kritériá kvality vody
                                 
                                 
                                    Tuhé častice < 20 mg/l, celkový obsah organického uhlíka < 2 mg/l, celkový obsah organofosforových pesticídov < 50 ng/l, celkový obsah organochlórových pesticídov a polychlórovaných bifenylov < 50 ng/l
                                 
                              
                                    Veľkosť nádrže na chov
                                 
                                 
                                    napr. 180 l, 1 ryba/liter
                                 
                              
                                    Čistenie vody
                                 
                                 
                                    Nepretržité (filtrácia pomocou aktívneho uhlia), iné možnosti zahŕňajú kombinácie so polostatickým obnovovacím chovom alebo s prietokovým systémom s priebežným obnovovaním vody
                                 
                              
                                    Odporúčaný pomer samcov a samíc na neresenie
                                 
                                 
                                    2:1 (alebo masové trenie)
                                 
                              
                                    Trecie nádrže
                                 
                                 
                                    napr. 4 l nádrže vybavené dnom s oceľovou mriežkou a umelými rastlinami na stimuláciu trenia, vonkajšie vyhrievané podložky alebo masové trenie v chovných nádržiach
                                 
                              
                                    Štruktúra a vzhľad vajíčok
                                 
                                 
                                    Stabilný chorión (t. j. mimoriadne priehľadné, nelepivé, priemer ~ 0,8 – 1,5 mm)
                                 
                              
                                    Miera trenia
                                 
                                 
                                    Jedna dospelá samica nakladie aspoň 50 – 80 vajíčok za deň. V závislosti od kmeňa môže byť miera trenia podstatne vyššia. Miera oplodnenia by mala byť ≥ 70 %. V prípade ryby, ktorá sa trie prvýkrát, môže byť miera oplodnenia vajíčok v prvých niekoľkých znáškach nižšia.
                                 
                              
                                    Typ testu
                                 
                                 
                                    Statický, polostatický obnovovací, prietokový, teplota 26 ± 1 °C, testovacie komory, ktoré sa 24 hodín prispôsobovali podmienkam testu (napr. 24-jamkové platničky, 2,5 – 5 ml na jednu jamku)
                                 
                              
                     
                        Dodatok 3
                        
                           NORMÁLNY VÝVIN DANIA PRUHOVANÉHO PRI TEPLOTE 26 °C
                        
                        
                     
                        Dodatok 4
                        
                           Obr. 1
                        
                        
                           Usporiadanie 24-jamkových platničiek
                        
                        
                                    1 – 5
                                 
                                 
                                    :
                                 
                                 
                                    päť testovaných koncentrácií/chemikálií;
                                 
                              
                                    nC
                                 
                                 
                                    :
                                 
                                 
                                    negatívna kontrola (voda na riedenie);
                                 
                              
                                    iC
                                 
                                 
                                    :
                                 
                                 
                                    vnútorná kontrola platničky (voda na riedenie);
                                 
                              
                                    pC
                                 
                                 
                                    :
                                 
                                 
                                    pozitívna kontrola (3,4-DCA 4 mg/l);
                                 
                              
                                    sC
                                 
                                 
                                    :
                                 
                                 
                                    kontrola s aplikáciou rozpúšťadla
                                 
                              
                           Obr. 2
                        
                        
                           Diagram testovacieho postupu akútnej toxicity na embryách dania pruhovaného (zľava doprava): produkcia vajíčok, zber vajíčok, predbežná expozícia ihneď po oplodnení v sklenených nádobách, výber oplodnených vajíčok pomocou invertovaného mikroskopu alebo binokulárneho mikroskopu a umiestnenie oplodnených vajíčok do 24-jamkových platničiek pripravených s príslušnými testovanými koncentráciami/kontrolami, n = počet vajíčok potrebných pre každú testovanú koncentráciu/kontrolu (tu 20), hpf = hodiny po oplodnení.
                        
                     
                        Dodatok 5
                        
                           ATLAS SLEDOVANÝCH LETÁLNYCH PARAMETROV PRE TEST AKÚTNEJ TOXICITY NA EMBRYÁCH DANIA PRUHOVANÉHO
                        
                        Tieto koncové sledované parametre poukazujú na akútnu toxicitu a následne na smrť embrya: koagulácia embrya, neoddelenie chvosta, nevytvorenie somitov a neprítomnosť srdcového tepu. Nasledujúce vybrané mikrografy ilustrujú tieto sledované parametre.
                        
                           Obr. 1
                        
                        
                           Koagulácia embrya:
                        
                        pri jasnom osvetlení poľa vidieť na koagulovaných embryách dania pruhovaného rôzne nepriehľadné štruktúry.
                        
                           Obr. 2
                        
                        
                           Nevytvorenie somitov:
                        
                        hoci vývin 24-hodinového embrya dania pruhovaného na obr. a) je spomalený o pribl. 10 hod, vidieť na ňom dobre vyvinuté somity (→), kým na embryu na obr. b) nevidieť žiadne známky tvorby somitov (→). Hoci 48-hodinové embryo dania pruhovaného na obr. c) má výrazný edém žĺtkového vaku (*), vidieť na ňom zreteľne vytvorené somity (→), kým na 96-hodinovom embryu na obr. d) nevidieť žiadne známky tvorby somitov (→). Všimnite si aj zakrivenie chrbtice (skoliózu) a perikardiálny edém (*) na embryu na obr. d).
                        
                           Obr. 3
                        
                        
                           Neoddelenie chvostového pupeňa pri pohľade zboku
                        
                        
                           Obr. 4
                        
                        
                           Neprítomnosť srdcového tepu
                        
                        Neprítomnosť srdcového tepu možno z podstaty veci len ťažko ilustrovať na mikrografe. Neprítomnosť srdcového tepu sa prejavuje tým, že srdce sa nesťahuje (dvojitá šípka). Nehybnosť krvných buniek, napr. v brušnej aorte (→ vo vloženom obrázku) nie je ukazovateľom neprítomnosti srdcového tepu. Všimnite si aj nevytvorenie somitov v tomto embryu (*, homogénny, nesegmentovaný vzhľad svalového tkaniva). Dĺžka pozorovania na zaznamenanie neprítomnosti srdcového tepu by mala byť najmenej jedna minúta s minimálne 80-násobným zväčšením.
                     
                     C.50   Test toxicity pre stolístok klasnatý (Myriophyllum spicatum) v systéme bez sedimentu
                     
                     ÚVOD
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 238 (2014). Je určená na vyhodnotenie toxicity chemikálií pre ponorenú vodnú dvojklíčnolistovú rastlinu stolístok klasnatý (Myriophyllum spicatum) z čeľade zrnulkovité. Vychádza z existujúcej testovacej metódy ASTM (1) upravenej ako testovací systém bez sedimentu (2), ktorý umožňuje odhad vlastnej ekotoxicity testovaných chemikálií (nezávisle od spôsobu distribúcie testovanej chemikálie medzi vodu a sediment). Testovací systém bez sedimentu má nízku analytickú zložitosť (len vodná fáza) a výsledky možno analyzovať spoločne a/alebo porovnaním s výsledkami získanými v teste na Lemna sp. (3). Požadované sterilné podmienky navyše umožňujú udržiavať čo najmenší vplyv mikroorganizmov a rias (príjem/degradácia chemikálie atď.). Týmto testom sa nenahrádzajú iné testy vodnej toxicity, ale mali by sa ním skôr dopĺňať, a tak umožniť úplnejšie posúdenie nebezpečenstva a rizika pre vodné rastliny. Testovacia metóda bola validovaná kruhovým testom (4).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 Uvádzajú sa informácie o testovaní s obnovou (polostatická metóda) a bez obnovy (statická metóda) testovacieho roztoku. V závislosti od cieľov testu a regulačných požiadaviek sa polostatická metóda odporúča použiť napríklad pre látky, ktoré z roztoku rýchlo unikajú v dôsledku odparovania, adsorpcie, fotodegradácie, hydrolýzy, vyzrážania alebo biodegradácie. Ďalšie informácie sú uvedené v literatúre pod číslom (5). Táto testovacia metóda sa vzťahuje na látky, pre ktoré bola táto testovacia metóda validovaná [pozri podrobnosti v správe o kruhovom teste (4)], alebo na prípravky alebo známe zmesi. Ak sa testuje zmes, jej zložky by sa mali v čo najväčšej miere identifikovať a kvantifikovať. Táto testovacia metóda v systéme bez sedimentu pre Myriophyllum spicatum dopĺňa test toxicity pre Myriophyllum spicatum v systéme voda – sediment (6). Pred použitím tejto testovacej metódy na testovanie zmesi na regulačné účely by sa malo posúdiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tieto účely, a ak áno, je nutné to zdôvodniť. Tieto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.
                              
                           PRINCÍP TESTU
                     
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Nepretržite rastúce rastlinné kultúry Myriophyllum spicatum (iba v upravenom Andrewsovom médiu, pozri dodatok 2) sa nechajú rásť ako monokultúry v rôznych koncentráciách testovanej chemikálie počas obdobia 14 dní v testovacom systéme bez sedimentu. Cieľom testu je kvantifikovať účinky chemikálie na vegetatívny rast v tomto období na základe hodnotenia zvolených meraných premenných. Merané premenné sú rast dĺžky výhonku, bočných vetiev a koreňov, ako aj vývoj čerstvej a suchej hmotnosti a nárast počtu praslenov. Okrem toho sa zohľadňujú aj zreteľné kvalitatívne zmeny testovacích organizmov, napríklad deformácia alebo chloróza a nekróza, ktoré sa prejavujú zožltnutím alebo bielym a hnedým sfarbením. Na kvantifikovanie účinkov súvisiacich s chemikáliou sa rast v testovacích roztokoch porovnáva s rastom v kontrolách a stanoví sa koncentrácia spôsobujúca špecifickú x % inhibíciu rastu, ktorá sa vyjadrí ako ECx, pričom „x“ môže mať akúkoľvek hodnotu v závislosti od regulačných požiadaviek, napr. EC10, EC20, EC50. Treba poznamenať, že odhady hodnôt EC10 a EC20 sú spoľahlivé a vhodné len v testoch, v ktorých sú variačné koeficienty pre kontrolné rastliny nižšie ako úroveň účinku, ktorá sa odhaduje, t. j. variačné koeficienty by mali byť < 20 %, aby bolo možné spoľahlivo odhadnúť hodnotu EC20.
                              
                           
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Stanovuje sa priemerná špecifická rýchlosť rastu (odhadnutá z vyhodnotenia dĺžky hlavného výhonku a ďalších troch meraných premenných) a výťažok (odhadnutý z nárastu dĺžky hlavného výhonku a ďalších troch meraných premenných) pre ošetrené a neošetrené rastliny. Špecifická rýchlosť rastu (r) sa následne použije na stanovenie hodnoty ErCx (napr. ErC10, ErC20, ErC50) a výťažok (y) na stanovenie hodnoty EyCx (napr. EyC10, EyC20, EyC50).
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Okrem toho je možné štatisticky stanoviť najnižšiu koncentráciu s pozorovaným účinkom (LOEC) a koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC).
                              
                           INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                     
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Mala by byť k dispozícii analytická metóda s vhodnou citlivosťou na kvantifikáciu testovanej chemikálie v testovacom médiu. Informácie o testovanej chemikálii, ktoré môžu byť užitočné pri stanovovaní testovacích podmienok, zahŕňajú štruktúrny vzorec, čistotu a nečistoty, rozpustnosť vo vode, stabilitu vo vode a na svetle, disociačnú konštantu v kyseline (pKa), rozdeľovaciu konštantu oktanol – voda (Kow), tlak pary a biodegradovateľnosť. Rozpustnosť vo vode a tlak pary je možné použiť na výpočet Henryho konštanty, ktorá bude udávať, či je pravdepodobné, že počas testu dôjde k značným elimináciám testovanej chemikálie. To pomôže pri stanovení, či je potrebné prijať konkrétne opatrenia na kontrolu týchto eliminácií. Ak sú informácie o rozpustnosti a stabilite testovanej chemikálie neurčité, odporúča sa, aby sa vyhodnotili za podmienok testu, t. j. s rastovým médiom, teplotou a režimom osvetlenia použitými v teste.
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Kontrola pH testovacieho média je mimoriadne dôležitá napríklad pri testovaní kovov alebo látok, ktoré sú hydrolyticky nestabilné. Ďalšie informácie o testovaných chemikáliách a ich fyzikálno-chemických vlastnostiach, ktoré sťažujú ich testovanie, sú uvedené v usmerňovacom dokumente OECD (5).
                              
                           PLATNOSŤ TESTU
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Na to, aby bol test platný, musí byť čas zdvojnásobenia dĺžky hlavného výhonku v kontrole kratší ako 14 dní. Pri použití médií a za podmienok testu uvedených v tejto testovacej metóde sa toto kritérium môže splniť s použitím statického alebo polostatického režimu testu.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Priemerný variačný koeficient pre výťažok na základe meraní čerstvej hmotnosti výhonku (teda od začatia testu po skončenie testu) a ďalších meraných premenných (pozri bod 37) v kontrolných kultúrach nepresahuje 35 % medzi replikátmi.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 Viac ako 50 % replikátov z kontrolnej skupiny zostalo sterilných počas obdobia expozície 14 dní, čo znamená, že sú viditeľne bez kontaminácie inými organizmami, ako sú riasy, plesne a baktérie (číry roztok). Poznámka: Usmernenie na posúdenie sterility je uvedené v správe o kruhovom teste (4).
                              
                           REFERENČNÁ CHEMIKÁLIA
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Na overenie testovacieho postupu možno otestovať referenčnú chemikáliu (chemikálie), napríklad 3,5-dichlórfenol použitý v kruhovom teste (4). Priemerné hodnoty EC50 rôznych závislých premenných (pozri body 37 – 41 tejto testovacej metódy) pre 3,5-dichlórfenol sú podľa údajov z kruhového testu medzi 3,2 mg/l a 6,9 mg/l (údaje o intervale spoľahlivosti pre tieto hodnoty nájdete v správe o kruhovom teste). Odporúča sa testovať referenčnú chemikáliu najmenej dvakrát do roka alebo, ak sa testovanie vykonáva zriedkavejšie, súbežne so stanovením toxicity testovanej chemikálie.
                              
                           OPIS METÓDY
                     
                        Testovacie vybavenie
                     
                     
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Všetky zariadenia, ktoré prichádzajú do styku s testovacím médiom, by mali byť vyrobené zo skla alebo z iného chemicky inertného materiálu. Sklené nádoby používané na kultiváciu a testovanie by sa mali očistiť od chemických kontaminantov, ktoré by sa mohli lúhovať do testovacieho média, a mali by byť sterilné. Testovacie nádoby by mali byť dostatočne dlhé na to, aby výhonok v kontrolných nádobách mohol rásť vo vodnej fáze bez toho, aby na konci testu dosiahol povrch testovacieho média. Odporúča sa používať hrubostenné testovacie skúmavky z borokremičitého skla bez obruby s vnútorným priemerom približne 20 mm, dĺžkou približne 250 mm a s hliníkovými uzávermi.
                              
                           
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Keďže upravené Andrewsovo médium obsahuje sacharózu (ktorá stimuluje rast plesní a baktérií), testovacie roztoky sa musia pripravovať v sterilných podmienkach. Všetky tekutiny i zariadenia sa pred použitím sterilizujú. Sterilizácia sa vykonáva vystavením horúcemu vzduchu (210 °C) na 4 hodiny alebo sterilizáciou v autokláve počas 20 minút pri teplote 121 °C. Okrem toho sa bezprostredne pred použitím všetky banky, podnosy, misky atď. a iné vybavenie sterilizujú plameňom na sterilnej pracovnej ploche.
                              
                           
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Kultúry a testovacie nádoby by sa nemali uchovávať spoločne. To sa dá najlepšie dosiahnuť s použitím oddelených environmentálnych rastových komôr, inkubátorov alebo miestností. Osvetlenie a teplota by sa mali dať regulovať a udržiavať na konštantnej úrovni.
                              
                           
                        Testovací organizmus
                     
                     
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Stolístok klasnatý (Myriophyllum spicatum) je ponorená vodná dvojklíčnolistová rastlina. Od júna do augusta vystupujú nad vodnú hladinu nevýrazné ružovobiele kvety. Rastliny sú zakorenené v zemi prostredníctvom systému mohutných pakoreňov a vyskytujú sa na celej severnej pologuli v eutrofických, ale neznečistených a vápenatejších stojatých vodách s bahnitým substrátom. Myriophyllum spicatum uprednostňuje sladkú vodu, ale možno ho nájsť aj v poloslanej vode.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Na test toxicity v systéme bez sedimentu sú potrebné sterilné rastliny. Ak testovacie laboratórium nemá pravidelné kultúry Myriophyllum spicatum, sterilný rastlinný materiál možno získať z iného laboratória, prípadne možno (nesterilný) rastlinný materiál nazbierať v teréne alebo objednať od komerčného dodávateľa. Ak rastliny pochádzajú z terénu, je potrebné naplánovať taxonomické overenie druhu. Ak sa rastliny nazbierajú v teréne alebo objednajú od komerčného dodávateľa, mali by sa sterilizovať (1) a minimálne osem týždňov pred použitím uchovávať v kultúre v rovnakom médiu, aké sa používa na testovanie. Terénne lokality použité na zber počiatočných kultúr nesmú obsahovať zrejmé zdroje kontaminácie. Treba dávať veľký pozor na to, aby sa pri zbere stolístka klasnatého v teréne získal správny druh, a to najmä v regiónoch, kde sa môže krížiť s inými druhmi rodu Myriophyllum. Ak sa materiál získa z iného laboratória, mal by sa takisto uchovávať minimálne tri týždne. V správe je vždy potrebné uviesť zdroj rastlinného materiálu a druh použitý na testovanie.
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Kvalita a uniformita rastlín, ktoré sa používajú na test, budú mať značný vplyv na výsledok testu, preto by sa rastliny mali starostlivo vyberať. Použiť by sa mali mladé, rýchlo rastúce rastliny bez viditeľných lézií alebo straty farby (chlorózy). Podrobnosti o príprave testovacieho organizmu sú uvedené v dodatku 4.
                              
                           
                        Kultivácia
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Na zníženie frekvencie údržby kultúr (napr. v čase, keď sa neplánujú žiadne testy s rodom Myriophyllum) sa kultúry môžu uchovávať pri obmedzenom osvetlení a teplote (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C). Informácie o kultivácii sú uvedené v dodatku 3.
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 Najmenej 14 až 21 dní pred vykonaním testu sa dostatočné množstvo testovacích organizmov asepticky prenesie do čerstvého sterilného média a kultivuje sa 14 až 21 dní za podmienok testu ako predkultúra. Podrobnosti o príprave predkultúry sú uvedené v dodatku 4.
                              
                           
                        Testovacie médium
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Pre druh Myriophyllum spicatum v testovacom systéme bez sedimentu sa odporúča iba jedno živné médium, ktoré je opísané v dodatku 2. Na kultiváciu a testovanie organizmu Myriophyllum spicatum sa odporúča použiť upravené Andrewsovo médium, ktoré je opísané v literatúre pod číslom (1). Upravené Andrewsovo médium sa vyrobí z piatich samostatne pripravených živných zásobných roztokov pridaním 3 % sacharózy. Podrobnosti o príprave média sú uvedené v dodatku 2.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 Na získanie testovacích roztokov je potrebné desaťnásobne koncentrované upravené Andrewsovo médium (príprava riedením podľa potreby). Zloženie tohto média je uvedené v dodatku 2.
                              
                           
                        Testovacie roztoky
                     
                     
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Testovacie roztoky sa zvyčajne pripravujú zriedením zásobného roztoku. Zásobné roztoky testovanej chemikálie sa spravidla pripravujú rozpustením chemikálie v demineralizovanej (teda destilovanej alebo deionizovanej) vode. Pridanie živín sa dosiahne použitím desaťnásobne koncentrovaného upraveného Andrewsovho média.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Zásobné roztoky testovanej chemikálie sa môžu sterilizovať v autokláve pri teplote 121 °C počas 20 minút alebo sterilnou filtráciou za predpokladu, že použitá metóda sterilizácie nevedie k denaturácii testovanej chemikálie. Testovacie roztoky sa môžu pripraviť aj v sterilnej demineralizovanej vode alebo médiu za sterilných podmienok. Pri výbere postupu sterilizácie zásobných roztokov testovanej chemikálie je nutné vziať do úvahy tepelnú stabilitu a adsorpciu na rôznych povrchoch. Z tohto dôvodu sa odporúča, aby sa zásobné roztoky pripravovali za sterilných podmienok, t. j. s použitím sterilného materiálu na rozpustenie testovanej chemikálie v sterilných podmienkach (napr. sterilizácia plameňom, odsávače s laminárnym prúdením atď.) v sterilnej vode. Táto technika prípravy sterilných zásobných roztokov sa vzťahuje na látky i zmesi.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Najvyššia testovaná koncentrácia testovanej chemikálie by spravidla nemala byť vyššia ako jej rozpustnosť vo vode za podmienok testu. Pre testované chemikálie s nízkou rozpustnosťou vo vode môže byť potrebné pripraviť koncentrovaný zásobný roztok alebo disperziu chemikálie s použitím organického rozpúšťadla alebo dispergantu, aby sa umožnilo pridanie presných množstiev testovanej chemikálie do testovacieho média a napomohlo sa jej rozptýlenie a rozpustenie. Použitiu takýchto materiálov sa treba v maximálnej možnej miere vyhýbať. Použitie pomocných rozpúšťadiel alebo dispergantov by nemalo viesť k žiadnej fytotoxicite. Medzi bežne používané rozpúšťadlá, ktoré nespôsobujú fytotoxicitu pri koncentráciách do 100 μl/l, patrí napríklad acetón a dimetylformamid. Ak sa používa rozpúšťadlo alebo dispergant, jeho konečná koncentrácia sa musí zaznamenať a udržiavať na minime (≤ 100 μl/l), pričom by všetky ovplyvňované a kontrolné vzorky mali obsahovať rovnakú koncentráciu rozpúšťadla alebo dispergantu. Ďalšie informácie o použití dispergantov sú uvedené v literatúre pod číslom (5).
                              
                           
                        Testovacie a kontrolné skupiny
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 Pri voľbe vhodných testovaných koncentrácií pomôžu predchádzajúce poznatky o toxicite testovanej chemikálie pre druh Myriophyllum spicatum z testu na vyhľadávanie rozsahu. V konečnom teste toxicity by spravidla malo byť päť (tak ako v teste inhibície rastu druhov rodu Lemna, kapitola C.26 tejto prílohy) až sedem testovaných koncentrácií usporiadaných v geometrickom rade. Mali by sa zvoliť tak, aby hodnoty NOEC a EC50 boli vnútri rozsahu koncentrácií (pozri ďalej). Rozdeľovací koeficient medzi testovanými koncentráciami by podľa možnosti nemal byť vyšší ako 3,2, môže sa však použiť aj vyššia hodnota, ak je krivka závislosti veličiny od koncentrácie plochá. Ak sa použije menej ako päť koncentrácií, je potrebné uviesť zdôvodnenie. Pre každú testovanú koncentráciu by sa malo použiť najmenej päť replikátov.
                              
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Pri stanovovaní rozsahu testovaných koncentrácií (v prípade testu na vyhľadávanie rozsahu a/alebo konečného testu toxicity) je potrebné zvážiť tieto okolnosti:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Na stanovenie hodnoty ECx by testované koncentrácie mali obklopovať hodnotu ECx, aby sa zabezpečila primeraná úroveň spoľahlivosti. Ak sa napríklad odhaduje hodnota EC50, najvyššia testovaná koncentrácia by mala byť vyššia ako hodnota EC50. Ak je hodnota EC50 mimo rozsahu testovaných koncentrácií, príslušné intervaly spoľahlivosti budú veľké a môže sa stať, že nebude možné správne posúdiť vhodnosť modelu na štatistické spracovanie.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Ak je cieľom odhad hodnôt LOEC/NOEC, najnižšia testovaná koncentrácia by mala byť dostatočne nízka na to, aby rast nebol významne nižší než v kontrole. Najvyššia testovaná koncentrácia by okrem toho mala byť dostatočne vysoká na to, aby bol rast významne nižší než v kontrole. Ak to tak nie je, test sa bude musieť zopakovať s použitím iného rozsahu koncentrácií (pokiaľ najvyššia koncentrácia nie je na úrovni limitu rozpustnosti alebo najvyššieho požadovaného koncentračného limitu, napr. 100 mg/l).
                                          
                                       
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Každý test by mal zahŕňať kontroly s rovnakým živným médiom, testovacím organizmom (výber čo najhomogénnejšieho rastlinného materiálu, čerstvé bočné vetvy z predkultúr skrátené na 2,5 cm od základne), podmienkami prostredia a postupmi ako v prípade testovacích nádob, ale bez testovanej chemikálie. Ak sa používa pomocné rozpúšťadlo alebo dispergant, mala by sa pridať ďalšia kontrola s aplikáciou rozpúšťadla/dispergantu v rovnakej koncentrácii ako v nádobách s testovanou chemikáliou. Počet replikátov kontrolných nádob (a v prípade potreby nádob s aplikáciou rozpúšťadla) by mal byť minimálne desať.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Ak sa nevyžaduje stanovenie hodnoty NOEC, koncepcia testu sa môže upraviť tak, že sa zvýši počet koncentrácií a zníži počet replikátov na koncentráciu. Kontrolných replikátov by však v každom prípade malo byť aspoň desať.
                              
                           
                        Expozícia
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Čerstvé bočné vetvy z predkultúr skrátené na 2,5 cm od základne sa náhodne priradia do testovacích nádob za aseptických podmienok. Každá testovacia nádoba by mala obsahovať jednu 2,5 cm bočnú vetvu s apikálnym meristémom na jednom konci. Zvolený rastlinný materiál by mal mať v každej testovacej nádobe rovnakú kvalitu.
                              
                           
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Testovacie nádoby sa v inkubátore musia rozmiestniť náhodne, aby sa minimalizoval vplyv priestorových rozdielov v intenzite svetla alebo teplote. Pri uskutočňovaní pozorovaní je takisto potrebné blokové usporiadanie alebo náhodné premiestňovanie nádob (alebo častejšie premiestňovanie).
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Ak sa v predbežnom teste stability ukáže, že počas trvania testu (14 dní) nie je možné udržať koncentráciu testovanej chemikálie (t. j. meraná koncentrácia klesne pod 80 % nameranej počiatočnej koncentrácie), odporúča sa použiť polostatický režim testu. V takom prípade by sa rastliny mali vystaviť čerstvo pripraveným testovacím a kontrolným roztokom aspoň raz počas testu (napr. na 7. deň). Frekvencia vystavenia čerstvému médiu bude závisieť od stability testovanej chemikálie. V prípade veľmi nestabilných alebo prchavých chemikálií môže byť na zachovanie približne konštantných koncentrácií potrebná vyššia frekvencia.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Expozičný scenár aplikácie na listy (sprejom) sa v tejto testovacej metóde nenachádza.
                              
                           
                        Podmienky testu
                     
                     
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Na zabezpečenie ľahkej intenzity ožiarenia v rozsahu približne 100 – 150 μE m– 2 s– 1 by sa malo použiť teplé a/alebo studené biele fluorescenčné svetlo, ktoré sa meria ako fotosynteticky aktívne žiarenie (400 – 700 nm) v bodoch, ktoré sa nachádzajú v rovnakej vzdialenosti od zdroja svetla ako dno testovacích nádob (ekvivalent približne 6 000 až 9 000 luxov), a pri použití cyklu svetla a tmy 16:8 hod. Metóda detekcie a merania svetla, najmä typ senzora, bude mať vplyv na meranú hodnotu. Guľové senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad a pod rovinou merania) a „kosínusové“ senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad rovinou merania) sa uprednostňujú pred jednosmernými senzormi a poskytnú vyššie hodnoty v prípade viacbodového zdroja svetla takého typu, aký sa uvádza v tejto metóde.
                              
                           
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Teplota v testovacích nádobách by mala byť 23 °C ± 2 °C. V určitých prípadoch je potrebné venovať zvýšenú pozornosť kolísaniu pH, napríklad pri testovaní nestabilných chemikálií alebo kovov. Hodnota pH by mala zostať v rozsahu 6 – 9. Ďalšie informácie sú uvedené v literatúre pod číslom (5).
                              
                           
                        Trvanie
                     
                     
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Test sa skončí 14 dní po premiestnení rastlín do testovacích nádob.
                              
                           
                        Merania a analytické stanovenia
                     
                     
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Na začiatku testu je dĺžka hlavného výhonku testovacieho organizmu 2,5 cm (pozri bod 29). Meria sa pravítkom (pozri dodatok 4) alebo fotografickou a obrazovou analýzou. Dĺžka hlavného výhonku testovacieho organizmu, ktorý sa zdá normálny alebo abnormálny, sa musí stanoviť na začiatku testu, aspoň raz počas 14-dňového obdobia expozície a na konci testu. Poznámka: Ako alternatívu možno v prípade, že nie je k dispozícii obrazová analýza, a za predpokladu, že pracovná plocha sa pred vložením rastlín do testovacích nádob sterilizuje, použiť na odmeranie dĺžky hlavného výhonku na začiatku a počas testu sterilné pravítko. Treba zaznamenávať zmeny vo vývine rastliny, napr. deformácie výhonkov, zmeny vzhľadu, známky nekrózy, chlorózy, rozpadu alebo straty schopnosti plávať na hladine a zmeny v dĺžke a vo vzhľade koreňa. Zaznamenať by sa mali aj významné znaky testovacieho média (napr. prítomnosť nerozpusteného materiálu, rast rias, plesní a baktérií v testovacej nádobe).
                              
                           
                              
                                 37.
                              
                              
                                 Okrem stanovenia dĺžky hlavného výhonku počas testu by sa mali posúdiť aj účinky testovanej chemikálie na tri (alebo viac) z týchto meraných premenných:
                                 
                                             i)
                                          
                                          
                                             celková dĺžka bočných vetiev;
                                          
                                       
                                             ii)
                                          
                                          
                                             celková dĺžka výhonku;
                                          
                                       
                                             iii)
                                          
                                          
                                             celková dĺžka koreňa;
                                          
                                       
                                             iv)
                                          
                                          
                                             čerstvá hmotnosť;
                                          
                                       
                                             v)
                                          
                                          
                                             suchá hmotnosť;
                                          
                                       
                                             vi)
                                          
                                          
                                             počet praslenov.
                                          
                                       
                                             
                                                Poznámka č. 1:
                                             
                                          
                                          
                                             Pri výbere príslušných ďalších mier spomedzi šiestich uvedených premenných by mohli pomôcť pozorovania vykonané počas testu na vyhľadávanie rozsahu.
                                          
                                       
                                             
                                                Poznámka č. 2:
                                             
                                          
                                          
                                             Stanovenie čerstvej a suchej hmotnosti (parametre iv a v) je veľmi žiaduce.
                                          
                                       
                                             
                                                Poznámka č. 3:
                                             
                                          
                                          
                                             Vzhľadom na to, že sacharóza a svetlo (vystavenie koreňov svetlu počas testu) môžu mať vplyv na transportné nosiče auxínu (rastlinný rastový hormón) a že niektoré chemikálie môžu mať auxínový spôsob účinku, je zaradenie sledovaných parametrov koreňa (parameter iii) otázne.
                                          
                                       
                                             
                                                Poznámka č. 4:
                                             
                                          
                                          
                                             Výsledky kruhového testu poukazujú na vysoké variačné koeficienty (> 60 %) pre celkovú dĺžku bočných vetiev (parameter i). Celková dĺžka bočných vetiev je v každom prípade zahrnutá do celkovej dĺžky výhonku (parameter ii), ktorá má prijateľnejšie variačné koeficienty < 30 %.
                                          
                                       
                                             
                                                Poznámka č. 5:
                                             
                                          
                                          
                                             Vzhľadom na uvedené úvahy sa odporúčajú tieto hlavné merané parametre: celková dĺžka výhonku, čerstvá hmotnosť a suchá hmotnosť (parametre ii, iv a v). Použitie parametra vi (počet praslenov) sa necháva na posúdenie výskumného pracovníka.
                                          
                                       
                           
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Dĺžka hlavného výhonku a počet praslenov majú výhodu v tom, že ich možno stanoviť pre každý test a kontrolnú nádobu na začiatku testu, počas neho i na jeho konci fotografickou a obrazovou analýzou, hoci možno použiť aj (sterilné) pravítko.
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Na konci expozície sa môže pravítkom odmerať celková dĺžka bočných vetiev, celková dĺžka koreňa (ako súčet všetkých bočných vetiev alebo koreňov) a celková dĺžka výhonku (ako súčet dĺžky hlavného výhonku a celkovej dĺžky bočných vetiev).
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Čerstvú a/alebo suchú hmotnosť je potrebné stanoviť na začiatku testu zo vzorky predkultúry, ktorá predstavuje materiál použitý na začiatku testu, a na konci testu s použitím rastlinného materiálu z každej testovacej a kontrolnej nádoby.
                              
                           
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Celkovú dĺžku bočných vetiev, celkovú dĺžku výhonku, celkovú dĺžku koreňa, čerstvú hmotnosť, suchú hmotnosť a počet praslenov možno stanoviť takto:
                                 i)   
                                       Celková dĺžka bočných vetiev
                                    : dĺžku bočných vetiev možno stanoviť odmeraním všetkých bočných vetiev pravítkom na konci expozície. Celková dĺžka bočných vetiev je súčet všetkých bočných vetiev pre každú testovaciu a kontrolnú nádobu.
                                 ii)   
                                       Celková dĺžka výhonku
                                    : dĺžku hlavného výhonku možno stanoviť obrazovou analýzou alebo pravítkom. Celková dĺžka výhonku je súčet celkovej dĺžky bočných vetiev a dĺžky hlavného výhonku pre každú testovaciu a kontrolnú nádobu na konci expozície.
                                 iii)   
                                       Celková dĺžka koreňa
                                    : dĺžku koreňa možno stanoviť odmeraním všetkých koreňov pravítkom na konci expozície. Celková dĺžka koreňa je súčet všetkých koreňov pre každú testovaciu a kontrolnú nádobu.
                                 iv)   
                                       Čerstvá hmotnosť
                                    : čerstvú hmotnosť možno stanoviť odvážením testovacích organizmov na konci expozície. Všetok rastlinný materiál z každej testovacej a kontrolnej nádoby sa opláchne destilovanou vodou a osuší celulózovým papierom. Po tejto príprave sa odvážením stanoví čerstvá hmotnosť. Počiatočné množstvo biomasy (čerstvá hmotnosť) sa stanovuje na základe vzorky testovacích organizmov odobratých z rovnakej vzorky, aká sa použila na inokuláciu testovacích nádob.
                                 v)   
                                       Suchá hmotnosť
                                    : po príprave na stanovenie čerstvej hmotnosti sa testovacie organizmy vysušia pri teplote 60 °C na konštantnú hmotnosť. Táto hmotnosť je suchá hmotnosť. Počiatočné množstvo biomasy (suchá hmotnosť) sa stanovuje na základe vzorky testovacích organizmov odobratých z rovnakej vzorky, aká sa použila na inokuláciu testovacích nádob.
                                 vi)   
                                       Počet praslenov
                                    : spočítajú sa všetky prasleny pozdĺž hlavného výhonku.
                              
                           
                        Frekvencia meraní a analytických stanovení
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Ak sa použije statický test, na začiatku a na konci testu by sa mala odmerať hodnota pH každej ovplyvňovanej vzorky. Ak sa použije polostatický test, hodnota pH by sa mala odmerať v každej vzorke „čerstvého“ testovacieho roztoku pred každým obnovením a aj v zodpovedajúcich „použitých“ roztokoch.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 Intenzita svetla by sa mala merať v rastovej komore, inkubátore alebo miestnosti v bodoch v rovnakej vzdialenosti od zdroja svetla ako testovacie organizmy. Merania by sa mali uskutočniť minimálne raz počas testu. Teplota média v náhradnej nádobe udržiavanej v rovnakých podmienkach v rastovej komore, inkubátore alebo miestnosti by sa mala zaznamenať minimálne raz za deň (alebo priebežne pomocou zapisovača údajov).
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Počas testu sa v príslušných intervaloch stanovia koncentrácie testovanej chemikálie (chemikálií). Pri statických testoch je potrebné stanoviť koncentrácie minimálne na začiatku a na konci testu.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Pri polostatických testoch, kde sa očakáva, že koncentrácie testovanej chemikálie (chemikálií) nezostanú v rozsahu ± 20 % nominálnej koncentrácie, je potrebné analyzovať všetky čerstvo pripravené testovacie roztoky a rovnaké roztoky pri každom obnovení. V prípade testov, kde namerané počiatočné koncentrácie testovanej chemikálie (chemikálií) nie sú v rozsahu ± 20 % nominálnej hodnoty, ale kde existujú postačujúce dôkazy na preukázanie, že počiatočné koncentrácie sú opakovateľné a stabilné (t. j. v rozsahu 80 – 120 % počiatočnej koncentrácie), sa však stanovenia chemikálií môžu vykonať iba s najvyššími a najnižšími testovanými koncentráciami. Vo všetkých prípadoch je pred obnovením potrebné stanoviť testované koncentrácie iba v jednej replikačnej nádobe pre každú testovanú koncentráciu (alebo v obsahu nádob združených na základe opakovaní).
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Ak je dokázané, že testovaná koncentrácia je počas testu v dostatočnej miere udržiavaná v rozsahu ± 20 % nominálnej alebo nameranej počiatočnej koncentrácie, analýza výsledkov sa môže zakladať na nominálnych alebo nameraných počiatočných hodnotách. Ak je odchýlka od nominálnej alebo nameranej počiatočnej koncentrácie väčšia ako ± 20 %, analýza výsledkov by sa mala zakladať na geometrickom priemere koncentrácií počas expozície alebo na modeloch opisujúcich pokles koncentrácie testovanej chemikálie (5).
                              
                           
                        Limitný test
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 V určitých situáciách, napr. keď z predbežného testu vyplýva, že testovaná chemikália nemá žiadne toxické účinky pri koncentráciách do 100 mg/l alebo do svojho limitu rozpustnosti v testovacom médiu, alebo v prípade prípravku do jeho limitu dispergovateľnosti, sa môže vykonať limitný test umožňujúci porovnanie reakcií v kontrolnej skupine a jednej ovplyvňovanej skupine (100 mg/l alebo koncentrácia rovná limitu rozpustnosti). Dôrazne sa odporúča, aby sa tento test podporil analýzou expozičnej koncentrácie. Na limitný test sa vzťahujú všetky uvedené podmienky testu a validačné kritériá s tou výnimkou, že počet ovplyvňovaných replikátov by sa mal zdvojnásobiť. Rast v kontrolnej a ovplyvňovanej skupine sa môže analyzovať s použitím štatistického testu na porovnanie priemerov, napr. Studentovho t-testu.
                              
                           ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                        Závisle premenné
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Účelom testu je stanoviť účinky testovanej chemikálie na vegetatívny rast druhu Myriophyllum spicatum. V tejto testovacej metóde sú opísané dve závisle premenné.
                                 a)   
                                       Priemerná špecifická rýchlosť rastu
                                    : táto závisle premenná sa vypočíta na základe zmien logaritmu dĺžky hlavného výhonku a navyše na základe zmien logaritmu iných meraných parametrov, teda celkovej dĺžky výhonku, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počtu praslenov v čase (vyjadrených za deň) v kontrolách a v každej ovplyvňovanej skupine. Poznámka: V prípade meraných parametrov celkovej dĺžky bočných vetiev a celkovej dĺžky koreňa výpočet priemernej špecifickej rýchlosti rastu nie je možný. Na začiatku testu testovací organizmus nemá žiadne bočné vetvy ani korene (na základe prípravy z predkultúry). Výpočet priemernej špecifickej rýchlosti rastu začínajúci od hodnoty nula nie je definovaný.
                                 b)   
                                       Výťažok
                                    : táto závisle premenná sa vypočíta na základe zmien v dĺžke hlavného výhonku a navyše na základe zmien iných meraných parametrov – teda ideálne celkovej dĺžky výhonku, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počtu praslenov a iných parametrov, ak sa to považuje za užitočné – v kontrolách a v každej ovplyvňovanej skupine až do konca testu.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Odhady toxicity by sa mali zakladať na dĺžke hlavného výhonku a ďalších troch meraných premenných (teda ideálne celkovej dĺžke výhonku, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počte praslenov, pozri bod 37 a poznámky 2, 4 a 5 k tomuto odseku), lebo niektoré chemikálie môžu ovplyvniť iné merané premenné oveľa viac ako dĺžku hlavného výhonku. Tento účinok by nebolo možné stanoviť iba na základe výpočtu dĺžky hlavného výhonku.
                              
                           
                        Priemerná špecifická rýchlosť rastu
                     
                     
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Priemerná špecifická rýchlosť rastu za konkrétne obdobie sa vypočíta ako logaritmus nárastu premenných rastu – dĺžky hlavného výhonku a troch ďalších meraných premenných (teda celkovej dĺžky výhonku, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počtu praslenov) – s použitím vzorca uvedeného ďalej pre každý replikát kontroly a ovplyvňované vzorky:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                    μi-j
                                    : priemerná špecifická rýchlosť rastu od času i do času j,
                                 
                                    Ni
                                    : meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe v čase i,
                                 
                                    Nj
                                    : meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe v čase j,
                                 
                                    t: časové obdobie medzi i a j.
                                 Pre každú testovanú a ovplyvňovanú skupinu sa vypočíta priemerná hodnota rýchlosti rastu spolu s odhadmi rozptylu.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Priemerná špecifická rýchlosť rastu by sa mala vypočítať pre celé obdobie testu (čas „i“ v uvedenom vzorci je začiatok testu a čas „j“ je koniec testu). Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolnú vzorku sa vypočíta priemerná hodnota priemernej špecifickej rýchlosti rastu spolu s odhadmi rozptylu. Okrem by sa mala posúdiť fázová rýchlosť rastu, aby sa vyhodnotili účinky testovanej chemikálie, ktoré sa vyskytnú počas obdobia expozície (napr. skontrolovaním logaritmicky transformovaných rastových kriviek).
                              
                           
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Pre každú testovanú koncentráciu (ovplyvňovanú skupinu) sa potom môže vypočítať percentuálna inhibícia rýchlosti rastu (Ir) podľa tohto vzorca:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                    % Ir
                                    : percentuálna inhibícia priemernej špecifickej rýchlosti rastu,
                                 
                                    μC
                                    : priemerná hodnota pre μ v kontrole,
                                 
                                    μT
                                    : priemerná hodnota pre μ v ovplyvňovanej skupine.
                              
                           
                        Výťažok
                     
                     
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Účinky na výťažok sa stanovia na základe meranej premennej dĺžky hlavného výhonku a troch ďalších meraných premenných (teda ideálne celkovej dĺžky výhonku, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počtu praslenov) získaných v každej testovacej nádobe na začiatku a na konci testu. Pre čerstvú hmotnosť a suchú hmotnosť sa počiatočné množstvo biomasy stanoví na základe vzorky testovacích organizmov odobratých z rovnakej vzorky, aká sa použila na inokuláciu testovacích nádob. Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolu sa vypočíta priemerná hodnota výťažku spolu s odhadmi rozptylu. Pre každú ovplyvňovanú skupinu sa môže vypočítať priemerná percentuálna inhibícia výťažku (% Iy) takto:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                    % Iy
                                    : percento zníženia výťažku,
                                 
                                    bC
                                    : rozdiel konečného množstva biomasy a počiatočného množstva biomasy pre kontrolnú skupinu,
                                 
                                    bT
                                    : rozdiel konečného množstva biomasy a počiatočného množstva biomasy v ovplyvňovanej skupine.
                              
                           
                        Čas zdvojnásobenia
                     
                     
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Na stanovenie času zdvojnásobenia (Td) dĺžky hlavného výhonku a dodržania tohto validačného kritéria (pozri bod 8) sa použije tento vzorec s údajmi, ktoré sa získali z kontrolných nádob:
                                 Td = ln 2/μ
                                 kde μ je priemerná špecifická rýchlosť rastu stanovená postupom opísaným v bodoch 50 – 52.
                              
                           
                        Zakreslenie kriviek závislosti veličiny od koncentrácie
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Je potrebné zostrojiť krivky závislosti veličiny od koncentrácie pre vzťah medzi priemernou percentuálnou inhibíciou závisle premennej (Ir alebo Iy vypočítané podľa bodu 53) a logaritmom koncentrácie testovanej chemikálie.
                              
                           
                        Odhad hodnoty ECx
                        
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Odhady hodnoty ECx by sa mali zakladať na hodnotách priemernej špecifickej rýchlosti rastu (ErCx) a výťažku (EyCx), z ktorých každá by sa zase mala zakladať na dĺžke hlavného výhonku, prípadne na ďalších meraných premenných (teda ideálne celkovej dĺžke výhonku, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počte praslenov). Dôvodom je skutočnosť, že existujú chemikálie, ktoré rozdielne vplývajú na dĺžku hlavného výhonku a iné merané premenné. Požadovanými parametrami toxicity sú teda štyri hodnoty ECx pre každú vypočítanú úroveň inhibície x: ErCx (dĺžka hlavného výhonku); ErCx (ideálne celková dĺžka výhonku, čerstvá hmotnosť, suchá hmotnosť alebo počet praslenov), EyCx (dĺžka hlavného výhonku) a EyCx (t. j. ideálne celková dĺžka výhonku, čerstvá hmotnosť, suchá hmotnosť alebo počet praslenov).
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Treba si uvedomiť, že hodnoty ECx vypočítané s použitím týchto dvoch závisle premenných nie sú porovnateľné a tento rozdiel treba zohľadniť pri použití výsledkov testu. Hodnoty ECx založené na priemernej špecifickej rýchlosti rastu (ErCx) budú vo väčšine prípadov vyššie ako výsledky založené na výťažku (EyCx) – ak boli dodržané podmienky tejto testovacej metódy – vzhľadom na matematický základ príslušných metód. Tento rozdiel by sa nemal vysvetľovať ako rozdiel v citlivosti medzi týmito dvoma závisle premennými, ale len tak, že hodnoty sa odlišujú matematicky.
                              
                           
                        Štatistické postupy
                     
                     
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Cieľom je získať kvantitatívny vzťah medzi koncentráciou a závisle premennou pomocou regresnej analýzy. Možno použiť váženú lineárnu regresiu po vykonaní linearizujúcej transformácie údajov reakcie, napríklad s použitím probitového, logitového alebo Weibullovho modelu (7), ale uprednostňujú sa techniky nelineárnej regresie, ktorými sa lepšie spracujú nevyhnutné nepravidelnosti údajov a odchýlky od hladkých rozdelení. Tieto nepravidelnosti, ak sa blížia k nulovej alebo úplnej inhibícii, sa transformáciou môžu zväčšiť a ovplyvniť analýzu (7). Treba si uvedomiť, že štandardné metódy analýzy s použitím probitovej, logitovej alebo Weibullovej transformácie sú určené na použitie na kvantálne údaje (napr. o úmrtnosti alebo prežití) a mali by sa upraviť tak, aby sa prispôsobili údajom o rýchlosti rastu alebo výťažku. Osobitné postupy na stanovenie hodnôt ECx z kontinuálnych údajov možno nájsť v literatúre pod číslami (8) (9) a (10).
                              
                           
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Pre každú závisle premennú, ktorá sa má analyzovať, sa na výpočet bodových odhadov hodnôt ECx použije vzťah medzi koncentráciou a reakciou na ňu. Ak je to možné, je potrebné stanoviť 95 % hranice spoľahlivosti pre každý odhad. Dobrú zhodu údajov týkajúcich sa reakcie s regresným modelom je potrebné vyhodnotiť graficky alebo štatisticky. Regresná analýza by sa mala vykonať s použitím reakcií jednotlivých replikátov, nie priemerných hodnôt ovplyvňovanej skupiny.
                              
                           
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Odhady hodnoty EC50 a hranice spoľahlivosti sa môžu získať aj s použitím lineárnej interpolácie metódou „bootstrap“ (10), ak sú dostupné regresné modely/metódy nevhodné pre dané údaje.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Na účely odhadu hodnôt LOEC, a teda aj NOEC, je potrebné porovnať priemerné hodnoty ovplyvňovaných skupín metódami analýzy rozptylu (ANOVA). Priemerná hodnota pre každú koncentráciu sa potom porovná s priemernou hodnotou kontroly s použitím príslušnej metódy mnohonásobného porovnania alebo testovania trendov. Môže sa použiť Dunnettov alebo Williamsov test (12) (13) (14) (15) (16). Treba posúdiť, či je dodržaný predpoklad homogenity rozptylov pre analýzu ANOVA. Toto posúdenie sa môže vykonať graficky alebo formálnym testom (15). Vhodné testy sú Levenov alebo Bartlettov test. Nesplnenie predpokladu homogenity rozptylov je niekedy možné korigovať logaritmickou transformáciou údajov. Ak je heterogenita rozptylov extrémna a nie je možné ju korigovať transformáciou, treba uvažovať o analýze metódami, ako sú napríklad Jonckheerov-Terpstrove testy trendu. Ďalšie informácie o stanovení hodnoty NOEC možno nájsť v literatúre pod číslom (10).
                              
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Najnovší vývoj vo vede vedie k odporúčaniu upustiť od koncepcie NOEC a nahradiť ju bodovými odhadmi hodnoty ECx na základe regresie. Príslušná hodnota x pre tento test s rodom Myriophyllum nebola stanovená. Vhodný sa však zdá rozsah 10 – 20 % (v závislosti od zvolenej závisle premennej), pričom ideálne by sa mali uvádzať hodnoty EC10 i EC20 a ich hranice spoľahlivosti.
                              
                           
                        Prezentovanie výsledkov
                     
                     
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Správa o teste obsahuje tieto informácie:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovaná chemikália:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Jednozložkové látky:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď. (vrátane obsahu organicky viazaného uhlíka, ak to je vhodné).
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Viaczložkové látky, UVCB alebo zmesi:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovací druh
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vedecký názov a zdroj.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Podmienky testu
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         použitý testovací postup (statický alebo polostatický),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dátum začiatku testu a jeho dĺžka,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovacie médium,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         opis návrhu pokusu: testovacie nádoby a veká, objemy roztokov, dĺžka hlavného výhonku na testovaciu nádobu na začiatku testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testované koncentrácie (nominálne a merané podľa potreby) a počet replikátov na koncentráciu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metódy prípravy zásobných a testovacích roztokov vrátane prípadného použitia rozpúšťadiel alebo dispergantov,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         teplota počas testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         zdroj svetla, intenzita a homogenita svetla,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         hodnoty pH testovacieho a kontrolného média,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metóda analýzy testovanej chemikálie s príslušným údajmi posúdenia kvality (validačné štúdie, štandardné odchýlky alebo hranice spoľahlivosti analýz),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metódy stanovenia dĺžky hlavného výhonku a iných meraných premenných, napr. celkovej dĺžky bočných vetiev, celkovej dĺžky výhonku, celkovej dĺžky koreňa, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti a počtu praslenov,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         stav kultúry (sterilná alebo nesterilná) v každej testovacej a kontrolnej nádobe pri každom pozorovaní,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         všetky odchýlky od tejto testovacej metódy.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Výsledky
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         Nespracované údaje: dĺžka hlavného výhonku a iné merané premenné v každej testovacej a kontrolnej nádobe pri každom pozorovaní a analýze,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         priemery a štandardné odchýlky pre každú meranú premennú,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         krivky rastu pre každú meranú premennú,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vypočítané hodnoty závisle premenných pre každý ovplyvňovaný replikát s priemernými hodnotami a variačným koeficientom pre replikáty,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grafické znázornenie vzťahu koncentrácie a účinku,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         odhady sledovaných parametrov toxicity pre závisle premenné, napr. EC50, EC10, EC20, a príslušné intervaly spoľahlivosti, hodnoty LOEC a/alebo NOEC (ak sa vypočítavajú) a štatistické metódy použité na ich stanovenie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ak sa použila metóda ANOVA, veľkosť účinku, ktorý možno zistiť (napr. najmenej významný rozdiel),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         každá stimulácia rastu zistená v akejkoľvek ovplyvňovanej vzorke,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         všetky viditeľné znaky fytotoxicity, ako aj pozorovania testovacích roztokov,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rozbor výsledkov vrátane prípadného vplyvu odchýlok od tejto testovacej metódy na výsledok testu.
                                                      
                                                   
                                       
                           LITERATÚRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 ASTM Designation E 1913-04, Standard Guide for Conducting Static, Axenic, 14-Day Phytotoxicity Tests in Test Tubes with the Submersed Aquatic Macrophyte, Myriophyllum sibiricum Komarov.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Maletzki, D. et al. (2010), Myriophyllum spicatum als ökotoxikologischer Testorganismus: Methodenentwicklung eines sedimentfreien Testsystems und erste Ergebnisse mit 3,5-Dichlorphenol, Umweltwiss Schadst Forsch, No. 22, pp. 702–710.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 
                                    Kapitola C.26 tejto prílohy: Druhy rodu Lemna, test inhibície rastu.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 OECD (2014), “Myriophyllum spicatum Toxicity Test: Results of an inter-laboratory ring test using a sediment-free test system”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series Testing and Assessment, No. 205, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Kapitola C.51 tejto prílohy: Test toxicity pre Myriophyllum spicatum v systéme voda – sediment
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science & Technology, Vol. 18/9, 713-718.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, pp. 1485-1494.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 OECD (2006), “Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88, US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp. 93-96.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        DEFINÍCIE
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biomasa je čerstvá a/alebo suchá hmotnosť živej hmoty nachádzajúcej sa v populácii. V tomto teste je biomasa súhrn hlavného výhonku, všetkých bočných vetiev a všetkých koreňov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Chemikália je látka alebo zmes.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Chloróza je zmena farby testovacieho organizmu, najmä praslenov, zo zelenej na žltkastú.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx je koncentrácia testovanej chemikálie rozpustenej v testovacom médiu, ktorej dôsledkom je x % (napr. 50 %) zníženie rastu rastliny druhu. Myriophyllum spicatum v rámci stanoveného obdobia expozície (je potrebné výslovne uviesť, ak sa odchyľuje od celkového alebo bežného trvania testu). Na jednoznačné označenie hodnoty EC odvodenej od rýchlosti rastu alebo výťažku sa používa symbol „ErC“ pre rýchlosť rastu a symbol „EyC“ pre výťažok, potom nasleduje použitá meraná premenná, napr. „ErC“ (dĺžka hlavného výhonku).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rast je nárast meranej premennej, napr. dĺžky hlavného výhonku, celkovej dĺžky bočných vetiev, celkovej dĺžky výhonku, celkovej dĺžky koreňa, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počtu praslenov, počas obdobia testu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rýchlosť rastu (priemerná špecifická rýchlosť rastu) je logaritmický nárast meranej premennej počas obdobia expozície. Poznámka: Závisle premenné súvisiace s rýchlosťou rastu sú nezávislé od trvania testu, pokiaľ je rastový model nevystavených kontrolných organizmov exponenciálny.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) je najnižšia testovaná koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje štatisticky významný účinok chemikálie na zníženie rastu (pri p < 0,05) v porovnaní s kontrolou v rámci daného obdobia expozície. Škodlivý účinok všetkých testovaných koncentrácií vyšších ako hodnota LOEC by však mal byť rovnaký alebo väčší ako účinky pozorované pri hodnote LOEC. Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, je potrebné poskytnúť úplné vysvetlenie, akým spôsobom sa zvolila hodnota LOEC (a teda aj NOEC).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Merané premenné sú všetky druhy premenných, ktoré sa merajú na vyjadrenie sledovaného parametra testu s použitím jednej alebo viacerých závisle premenných. V tejto testovacej metóde sú merané premenné dĺžka hlavného výhonku, celková dĺžka bočných vetiev, celková dĺžka výhonku, celková dĺžka koreňa, čerstvá hmotnosť, suchá hmotnosť a počet praslenov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Monokultúra je kultúra s jedným druhom rastliny.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Nekróza je odumreté (t. j. biele alebo tmavohnedé) tkanivo testovacieho organizmu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC) je testovaná koncentrácia bezprostredne pod úrovňou hodnoty LOEC.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Závisle premenná je premenná slúžiaca na odhadnutie toxicity, ktorá bola odvodená z akejkoľvek meranej premennej opisujúcej biomasu rôznymi metódami výpočtu. V tejto testovacej metóde sú závisle premennými rýchlosť rastu a výťažok, ktoré sú odvodené z meraných premenných, ako sú dĺžka hlavného výhonku, celková dĺžka výhonku, čerstvá hmotnosť, suchá hmotnosť alebo počet praslenov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Polostatický (obnovovací) test je test, v ktorom sa testovací roztok počas testu pravidelne vymieňa v stanovených intervaloch.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Statický test je testovacia metóda bez obnovy testovacieho roztoku počas testu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sledovaný parameter testu je všeobecný faktor, ktorý sa v dôsledku testovanej chemikálie bude meniť v porovnaní s kontrolou ako cieľ testu. V prípade tejto testovacej metódy je sledovaným parametrom testu inhibícia rastu, ktorá sa dá vyjadriť rôznymi závisle premennými založenými na jednej alebo viacerých meraných premenných.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Testovacie médium je kompletné syntetické rastové médium, v ktorom rastú testovacie rastliny vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie. Testovaná chemikália sa v testovacom médiu spravidla rozpustí.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB je látka neznámeho alebo variabilného zloženia, produkt komplexných reakcií alebo biologický materiál.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Výťažok je rozdiel hodnoty meranej premennej, ktorá vyjadruje množstvo biomasy, na konci obdobia expozície a hodnoty meranej premennej na začiatku obdobia expozície. Poznámka: Ak je rastový model nevystavených organizmov exponenciálny, závisle premenné založené na výťažku sa budú s dĺžkou trvania testu znižovať.
                                 
                              
                     
                        Dodatok 2
                        
                           UPRAVENÉ ANDREWSOVO MÉDIUM NA ZÁSOBNÚ KULTÚRU A PREDKULTÚRU
                        
                        Z piatich samostatne pripravených živných zásobných roztokov sa pripraví upravené Andrewsovo médium potrebné na zásobnú kultúru a predkultúru pridaním 3 % sacharózy.
                        
                           Tabuľka 1
                        
                        
                           Zloženie Andrewsovho živného roztoku: (označenie ASTM E 1913-04)
                        
                        
                                    Výroba živných zásobných roztokov
                                 
                                 
                                    Výroba živného roztoku
                                 
                              
                                    Zásobný roztok
                                 
                                 
                                    Chemikália
                                 
                                 
                                    Počiatočná hmotnosť na 1 000  ml
                                 
                                 
                                    ml na 5 l živného roztoku
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    KCl
                                 
                                 
                                    74,6 mg
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    KNO3
                                    
                                 
                                 
                                    8,08 g
                                 
                              
                                    Ca(NO3)2 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    18,88 g
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    MgSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    9,86 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    Pozri zásobný roztok 3.1 ďalej.
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    KH2PO4
                                    
                                 
                                 
                                    2,72 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    5
                                 
                                 
                                    FeSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,278 g
                                 
                                 
                                    50
                                 
                              
                                    Na2EDTA × 2 H2O
                                 
                                 
                                    0,372 g
                                 
                              Zásobné roztoky možno uchovávať v chladničke 6 mesiacov (pri teplote 5 – 10 °C). Jedine zásobný roztok č. 5 má nižší čas použiteľnosti (dva mesiace).
                        
                           Tabuľka 2
                        
                        
                           Výroba zásobného roztoku 3.1 na prípravu zásobného roztoku 3
                        
                        
                                    Chemikália
                                 
                                 
                                    Počiatočná hmotnosť g/100 ml
                                 
                              
                                    MnSO4 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,223
                                 
                              
                                    ZnSO4 × 7 H2O
                                 
                                 
                                    0,115
                                 
                              
                                    H3BO3
                                    
                                 
                                 
                                    0,155
                                 
                              
                                    CuSO4 × 5 H2O
                                 
                                 
                                    0,0125
                                 
                              
                                    (NH4)6Mo7O24 × 4 H2O
                                 
                                 
                                    0,0037
                                 
                              Po vytvorení zásobného roztoku 3.1 (tabuľka 2) tento roztok hlboko zmrazte v alikvotných častiach po približne 11 ml (pri teplote aspoň – 18 °C). Hlboko zmrazené časti majú čas použiteľnosti päť rokov.
                        Na výrobu zásobného roztoku 3 rozmrazte zásobný roztok 3.1, prelejte z neho 10 ml do 1 l kalibrovanej odmernej banky a pridajte ultračistú vodu až po mierku banky.
                        Na získanie upraveného Andrewsovho média nalejte približne 2 500 ml ultračistej vody do 5 l kalibrovanej odmernej banky. Pridajte 50 ml z každého zásobného roztoku, doplňte ultračistú vodu do 90 % kalibrovanej odmernej banky a upravte hodnotu pH na 5,8.
                        Potom pridajte 150 g rozpustenej sacharózy (3 % na 5 l) a doplňte do kalibrovanej odmernej banky ultračistú vodu až po mierku. Nakoniec sa živný roztok naplní do 1 l Schottových baniek a sterilizuje v autokláve pri teplote 121 °C počas 20 minút.
                        Takto získaný živný roztok možno uchovávať sterilný v chladničke (pri teplote 5 – 10 °C) tri mesiace.
                        
                           Upravené Andrewsovo médium na test toxicity v systéme bez sedimentu
                        
                        Z piatich živných zásobných roztokov uvedených v tabuľkách 1 a 2 sa pripraví desaťkrát koncentrované upravené Andrewsovo médium potrebné na získanie testovacích roztokov pridaním 30 % sacharózy. Na jeho získanie nalejte približne 100 ml ultračistej vody do 1 l kalibrovanej odmernej banky. Pridajte 100 ml z každého zásobného roztoku a upravte hodnotu pH na 5,8. Potom pridajte 30 % rozpustenú sacharózu (300 g na 1 000 ml) a doplňte do kalibrovanej odmernej banky ultračistú vodu až po mierku.
                        Nakoniec sa živný roztok naplní do 0,5 l Schottových baniek a sterilizuje v autokláve pri teplote 121 °C počas 20 minút.
                        Takto získaný desaťkrát koncentrovaný upravený živný roztok možno uchovávať sterilný v chladničke (pri teplote 5 – 10 °C) tri mesiace.
                     
                     
                        Dodatok 3
                        
                           UDRŽIAVANIE ZÁSOBNEJ KULTÚRY
                        
                        V tomto dodatku 3 je opísaná zásobná kultúra druhu Myriophyllum spicatum L (103), ponorenej vodnej dvojklíčnolistovej rastliny z čeľade zrnulkovité. Od júna do augusta vystupujú nad vodnú hladinu nevýrazné ružovobiele kvety. Rastliny sú zakorenené v zemi prostredníctvom systému mohutných pakoreňov a vyskytujú sa na celej severnej pologuli v eutrofických, ale neznečistených a vápenatejších stojatých vodách s bahnitým substrátom. Myriophyllum spicatum uprednostňuje sladkú vodu, ale možno ho nájsť aj v poloslanej vode.
                        Na zásobnú kultúru bez sedimentu v laboratórnych podmienkach sú potrebné sterilné rastliny. Sterilné rastliny sú k dispozícii od ekotoxikologického laboratória nemeckej Spolkovej agentúry pre životné prostredie (Umweltbundesamt).
                        Alternatívne možno testovacie organizmy pripraviť z nesterilných rastlín v súlade s označením ASTM E 1913-04. V ďalšej časti textu nájdete úryvok zo štandardného usmernenia ASTM s postupom kultivácie rastliny druhu Myriophyllum sibiricum nazbieranej v teréne:
                        
                           „Ak chcete použiť nesterilné rastliny nazbierané v teréne, nazbierajte zimné výhonky M. sibiricum na jeseň. Umiestnite zimné výhonky do 20 l akvária obsahujúceho 5 cm vrstvu sterilného sedimentu, ktorá je pokrytá kremičitým pieskom alebo napríklad produktom Turface® a 18 l reagenčnej vody. Akvárium prevzdušňujte a udržiavajte pri teplote 15 °C a rýchlosti toku častíc 200 až 300 μmol m– 2 s– 1 počas 16 hodín denne. Rastlinnú kultúru v akváriu možno udržiavať ako rezervný zdroj rastlín pre prípad zničenia sterilných rastlinných kultúr mechanickou poruchou rastovej komory, kontamináciou alebo z iného dôvodu. Rastliny pestované v akváriu nie sú sterilné a sterilné kultúry nemožno udržiavať v kultivačnom systéme na produkciu vzoriek. Na účely sterilizácie kultúry sa rastliny vyberú z akvária a oplachujú v tečúcej deionizovanej vode približne 0,5 hodiny. Rastliny sa dezinfikujú za aseptických podmienok v komore s laminárnym prúdením vzduchu počas menej ako 20 minút (kým väčšina rastlinného tkaniva nie je odfarbená a len rastúci vrchol je stále zelený) v 3 % (w/v) roztoku chlórnanu sodného obsahujúcom 0,01 % vhodného surfaktantu. Premiešajte dezinfekčný prostriedok a rastlinný materiál. Segmenty s viacerými kolienkami sa prenesú do sterilných kultivačných skúmaviek obsahujúcich 45 ml sterilizovaného upraveného Andrewsovho média, ktoré sa uzavrú bežnými uzávermi kultivačných skúmaviek. Do každej testovacej komory sa umiestni len jeden segment rastliny. Na zabezpečenie uzavretia kultivačnej nádoby sa použije laboratórna tesniaca fólia. Keď sa vytvorila sterilná kultúra, segmenty rastliny obsahujúce viaceré kolienka by sa každých desať až dvanásť dní mali prenášať do nových testovacích komôr s čerstvým tekutým živným médiom. Ako sa preukázalo kultiváciou na agarových miskách, rastliny musia zostať sterilné osem týždňov predtým, ako možno začať s testovaním.“
                        
                        Keďže upravené Andrewsovo médium obsahuje sacharózu (ktorá stimuluje rast plesní a baktérií), všetok materiál, roztoky a rastové médiá sa musia pripravovať v sterilných podmienkach. Všetky tekutiny i zariadenia sa pred použitím sterilizujú. Sterilizácia sa vykonáva vystavením horúcemu vzduchu (210 °C) na 4 hodiny alebo sterilizáciou v autokláve počas 20 minút pri teplote 121 °C. Okrem toho sa bezprostredne pred použitím všetky banky, podnosy, misky atď. a iné vybavenie sterilizujú plameňom na sterilnej pracovnej ploche.
                        Zásobné kultúry sa môžu uchovávať pri zníženom osvetlení a teplote (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C) aj počas dlhšieho obdobia bez toho, aby sa museli znova pripravovať. Rastové médium pre rastliny rodu Myriophyllum má byť rovnaké ako to, ktoré sa používa na testovanie, ale na zásobné kultúry sa môžu použiť aj iné médiá bohaté na živiny.
                        Segmenty rastliny sa rozložia axenicky do niekoľkých 500 ml Erlenmeyerových baniek naplnených 450 ml upraveného Andrewsovho média, resp. a/alebo 2 000 ml Fernbachových baniek naplnených 1 000 ml upraveného Andrewsovho média. Banky sa potom axenicky uzatvoria celulózovou zátkou.
                        Okrem toho je bezprostredne pred použitím absolútne nevyhnutné vybavenie dôkladne sterilizovať plameňom na sterilnej pracovnej ploche. V závislosti od počtu a veľkosti sa rastliny premiestňujú do čerstvého živného roztoku približne každé tri týždne.
                        Na túto obnovenú kultúru možno použiť vrcholy i segmenty strednej časti stonky. Počet a veľkosť premiestnených rastlín (alebo segmentov rastlín) závisia od toho, koľko rastlín je potrebných. Môžete napríklad preniesť päť segmentov výhonku do jednej Fernbachovej banky a tri segmenty výhonku do jednej Erlenmeyerovej banky, každý s dĺžkou 5 cm. Všetky časti s koreňmi, kvitnúce, mŕtve alebo inak podozrivé časti zlikvidujte.
                        
                           Obrázok 1
                        
                        
                           Narezanie rastlín na zásobnú kultúru a predkultúru po 3 týždňoch kultivácie.
                        
                        Kultivácia rastlín sa má vykonať v 500 ml Erlenmeyerových bankách a 2 000 ml Fernbachových bankách v chladiacom inkubátore pri teplote 20 ± 2 °C s nepretržitým svetlom s intenzitou približne 100 – 150 μE m– 2 s– 1 alebo 6 000 – 9 000 luxov (vyžarovaným osvetlením komory s teplotou farby „teplé biele svetlo“).
                        
                           Obrázok 2
                        
                        
                           Kultivácia rastlín v chladiacom inkubátore s osvetlením komory.
                        
                        Mali by sa použiť chemicky čisté (umyté v kyseline) a sterilné sklenené kultivačné nádoby a techniky aseptickej manipulácie. V prípade kontaminácie zásobnej kultúry, napr. riasami, plesňami a/alebo baktériami, by sa mala pripraviť nová kultúra alebo by sa na obnovu danej kultúry mala použiť zásobná kultúra z iného laboratória.
                     
                     
                        Dodatok 4
                        
                           UDRŽIAVANIE PREDKULTÚRY A PRÍPRAVA TESTOVACIEHO ORGANIZMU NA TESTOVANIE
                        
                        Na získanie predkultúry narežte výhonky zo zásobnej kultúry na segmenty po dvoch praslenoch a vložte segmenty do Fernbachových baniek naplnených upraveným Andrewsovým médiom (s 3 % sacharózou). Každá banka môže obsahovať až 50 segmentov výhonkov. Treba však dbať na to, aby segmenty boli životaschopné a nemali žiadne korene a bočné vetvy ani ich pupene (pozri obrázok 1 v dodatku 3).
                        Organizmy v predkultúre sa kultivujú 14 až 21 dní v sterilných podmienkach v environmentálnej komore so striedavými fázami svetla/tmy 16/8 hodín. Intenzita svetla má byť v rozsahu 100 – 150 μE m– 2 s– 1. Teplota v testovacích nádobách má byť 23 ± 2 °C.
                        Keďže upravené Andrewsovo médium obsahuje sacharózu (ktorá stimuluje rast rias, plesní a baktérií), roztoky testovanej chemikálie by sa mali pripravovať a kultivovať v sterilných podmienkach. Všetky tekutiny i zariadenia sa pred použitím sterilizujú. Sterilizácia sa vykonáva vystavením horúcemu vzduchu (210 °C) na 4 hodiny alebo sterilizáciou v autokláve počas 20 minút pri teplote 121 °C. Okrem toho sa bezprostredne pred použitím všetky banky, podnosy, misky atď. a iné vybavenie sterilizujú plameňom na sterilnej pracovnej ploche.
                        Výhonky sa axenicky vyberú z baniek s predkultúrou, pričom sa vyberie materiál, ktorý je čo najhomogénnejší. Každé testovanie si vyžaduje aspoň 60 testovacích organizmov (testovanie s ôsmimi koncentráciami testovanej chemikálie). Na testovanie vyberte z predkultúr čerstvé bočné vetvy, skráťte ich na 2,5 cm od základne (merané pomocou pravítka) a preneste ich do kadičky obsahujúcej sterilné upravené Andrewsovo médium. Tieto čerstvé bočné vetvy sa môžu použiť na test toxicity pre Myriophyllum spicatum v systéme bez sedimentu.
                        
                           Obrázok 2
                        
                        
                           Narezanie rastlín z predkultúry na účely testu toxicity pre Myriophyllum spicatum v systéme bez sedimentu.
                        
                        
                     C.51   Test toxicity pre Myriophyllum spicatum v systéme voda – sediment
                     
                     ÚVOD
                     
                              
                                 1.
                              
                              
                                 Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 239 (2014). Testovacie metódy sú už k dispozícii pre plávajúce jednoklíčnolistové vodné rastliny druhov rodu Lemna (1) a pre druhy rias (2). Tieto metódy sa bežne používajú na získavanie údajov o rizikách testovaných chemikálií, najmä chemikálií s herbicídnymi účinkami, na necieľové vodné druhy rastlín. V niektorých prípadoch však môžu byť potrebné údaje o ďalších makrofytných druhoch. V najnovšom usmernení uverejnenom zo semináru o posúdení rizík pesticídov pre vodné makrofyty (Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides – AMRAP) Spoločnosti pre environmentálnu toxikológiu a chémiu (Society of Environmental Toxicology and Chemistry – SETAC) sa navrhlo, aby v prípade, že je známe, že druhy rodu Lemna a riasy nie sú citlivé na spôsob účinku testovaných chemikálií, alebo ak existujú obavy z rozdeľovania do sedimentu vedúcemu k expozícii prostredníctvom koreňovej absorpcie, bolo možné vyžadovať údaje pre zakorenené druhy makrofytov (3). Na základe súčasného poznania a skúseností boli ako uprednostňované druhy v prípadoch, keď sa vyžadujú údaje pre ponorené zakorenené dvojklíčnolistové druhy, vybrané druhy rodu Myriophyllum (4) (5) (6). Týmto testom sa nenahrádzajú iné testy vodnej toxicity, ale mali by sa ním skôr dopĺňať, a tak umožniť úplnejšie posúdenie nebezpečenstva a rizika pre vodné rastliny. Testovacia metóda v systéme voda – sediment pre druh Myriophyllum spicatum dopĺňa test toxicity pre Myriophyllum spicatum v systéme bez sedimentu (7).
                              
                           
                              
                                 2.
                              
                              
                                 V tomto dokumente sa opisuje testovacia metóda, ktorá umožňuje vyhodnotiť účinky testovanej chemikálie na zakorenený vodný rastlinný druh Myriophyllum spicatum rastúci v systéme voda – sediment. Testovacia metóda je čiastočne založená na existujúcich metódach (1) (2) (8) a zohľadňuje sa v nej najnovší výskum súvisiaci s posúdením rizika pre vodné rastliny (3). Metóda voda – sediment bola validovaná medzinárodným kruhovým testom vykonaným na druhoch rodu Myriophyllum pestovaných v statických podmienkach, ktoré boli vystavené testovanej chemikálii aplikovanej prostredníctvom vodného stĺpca (9). Testovací systém sa však ľahko prispôsobí tak, aby umožnil expozíciu prostredníctvom obohateného sedimentu alebo expozíciu prostredníctvom vodnej fázy v polostatických scenároch alebo scenároch s pulzujúcim dávkovaním, hoci tieto scenáre neboli formálne podrobené kruhovému testu. Okrem toho možno použiť všeobecnú metódu pre iné zakorenené, ponorené a emerzné druhy vrátane iných druhov rodu Myriophyllum (napr. Myriophyllum aquaticum) a druhu Glyceria maxima (10). V prípade alternatívnych druhov môžu byť potrebné úpravy testovacích podmienok, koncepcie a trvania testu. Predovšetkým je potrebné lepšie vymedziť vhodné postupy pre druh Myriophyllum aquaticum. Tieto možnosti nie sú podrobne opísané v tejto testovacej metóde, v ktorej sa opisuje štandardný prístup expozície druhu Myriophyllum spicatum v statickom systéme prostredníctvom vodnej fázy.
                              
                           
                              
                                 3.
                              
                              
                                 Táto testovacia metóda sa vzťahuje na látky, pre ktoré bola táto testovacia metóda validovaná [pozri podrobnosti v správe o kruhovom teste (9)], alebo na prípravky alebo známe zmesi. Test na druhoch rodu Myriophyllum možno vykonať na splnenie požiadavky na údaje stupňa 1, ktorá vyplýva z potenciálu testovanej chemikálie oddeľovať sa do sedimentu alebo zo spôsobu účinku/problémov so selektívnosťou. Laboratórny test na druhoch rodu Myriophyllum sa môže vyžadovať aj ako súčasť stratégie vyššieho stupňa na riešenie obáv v súvislosti s rizikom pre vodné rastliny. Od konkrétneho dôvodu na vykonanie testu bude závisieť spôsob expozície (t. j. prostredníctvom vody alebo sedimentu). Pred použitím tejto testovacej metódy na testovanie zmesi na regulačné účely by sa malo posúdiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tieto účely, a ak áno, je nutné to zdôvodniť. Tieto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.
                              
                           PRINCÍP TESTU
                     
                              
                                 4.
                              
                              
                                 Test je určený na vyhodnotenie účinkov chemikálií na vegetatívny rast rastlín rodu Myriophyllum rastúcich v štandardizovanom médiu (voda, sediment a živiny). Na tieto účely sa vrcholy výhonkov zdravých nekvitnúcich rastlín zasadia do štandardizovaného umelého sedimentu, do ktorého sa doplnia ďalšie živiny na zabezpečenie primeraného rastu rastlín, a potom sa udržiavajú v Smartovom a Barkovom médiu (dodatok 1). Po období založenia, počas ktorého sa vytvorí koreň, sa rastliny vystavia sérii testovaných koncentrácií pridaných do vodného stĺpca. Alternatívne možno simulovať expozíciu prostredníctvom sedimentu obohatením umelého sedimentu testovanou chemikáliou a presadením rastlín do tohto obohateného sedimentu. V oboch prípadoch sa rastliny následne udržiavajú v kontrolovaných podmienkach prostredia počas 14 dní. Účinky na rast sa stanovia z kvantitatívneho vyhodnotenia dĺžky, čerstvej hmotnosti a suchej hmotnosti výhonku, ako aj z kvalitatívnych pozorovaní príznakov, ako je chloróza, nekróza a deformity rastu.
                              
                           
                              
                                 5.
                              
                              
                                 Na kvantifikovanie účinkov súvisiacich s chemikáliou sa rast v testovacích roztokoch porovnáva s rastom v kontrolách a stanoví sa koncentrácia spôsobujúca špecifickú x % inhibíciu rastu, ktorá sa vyjadrí ako ECx, pričom „x“ môže mať akúkoľvek hodnotu v závislosti od regulačných požiadaviek, napr. EC10, EC20, EC50. Treba poznamenať, že odhady hodnôt EC10 a EC20 sú spoľahlivé a vhodné len v testoch, v ktorých sú variačné koeficienty pre kontrolné rastliny nižšie ako úroveň účinku, ktorá sa odhaduje, t. j. variačné koeficienty by mali byť < 20 %, aby bolo možné spoľahlivo odhadnúť hodnotu EC20.
                              
                           
                              
                                 6.
                              
                              
                                 Stanovuje sa priemerná špecifická rýchlosť rastu (odhadnutá z vyhodnotenia dĺžky výhonku, čerstvej hmotnosti výhonku a suchej hmotnosti výhonku) a výťažok (odhadnutý z nárastu dĺžky výhonku, čerstvej hmotnosti výhonku a zo suchej hmotnosti výhonku) pre ošetrené a neošetrené rastliny. Špecifická rýchlosť rastu (r) sa následne použije na stanovenie hodnoty ErCx (napr. ErC10, ErC20, ErC50) a výťažok (y) na stanovenie hodnoty EyCx (napr. EyC10, EyC20, EyC50).
                              
                           
                              
                                 7.
                              
                              
                                 Ak je to potrebné, z odhadov priemernej špecifickej rýchlosti rastu a výťažku je možné štatisticky stanoviť najnižšiu koncentráciu s pozorovaným účinkom (LOEC) a koncentráciu bez pozorovaného účinku (NOEC).
                              
                           INFORMÁCIE O TESTOVANEJ CHEMIKÁLII
                     
                              
                                 8.
                              
                              
                                 Na kvantifikáciu chemikálií v testovacom médiu by mala byť k dispozícii analytická metóda s vhodnou citlivosťou.
                              
                           
                              
                                 9.
                              
                              
                                 Informácie o testovanej chemikálii, ktoré môžu byť užitočné pri stanovovaní podmienok testu, zahŕňajú štruktúrny vzorec, zloženie v prípade viaczložkových látok, UVCB, zmesí alebo prípravkov, čistotu, rozpustnosť vo vode, stabilitu vo vode a na svetle, disociačnú konštantu v kyseline (pKa), rozdeľovaciu konštantu oktanol – voda (Kow), hodnotu Kd pre sedimenty, ak je k dispozícii, tlak pary a biodegradovateľnosť. Rozpustnosť vo vode a tlak pary je možné použiť na výpočet Henryho konštanty, ktorá bude udávať, či je pravdepodobné, že počas testu dôjde k značným elimináciám testovanej chemikálie. Ak je pravdepodobné, že dôjde elimináciám testovaných chemikálií, je nutné ich kvantifikovať a zdokumentovať následné kroky na ich kontrolu. Ak sú informácie o rozpustnosti a stabilite testovanej chemikálie (chemikálií) neurčité, odporúča sa, aby sa tieto vlastnosti vyhodnotili za podmienok testu, t. j. s rastovým médiom, teplotou a režimom osvetlenia použitými v teste. Poznámka: Ak sa testujú peroxidujúce herbicídy závislé od svetla, použité laboratórne osvetlenie by malo obsahovať svetlo rovnocenné slnečnému ultrafialovému svetlu zo slnečného žiarenia.
                              
                           
                              
                                 10.
                              
                              
                                 V testovacom médiu by sa mala odmerať a podľa potreby upraviť hodnota pH. Kontrola pH testovacieho média je mimoriadne dôležitá napríklad pri testovaní kovov alebo chemikálií, ktoré sú hydrolyticky nestabilné. Ďalšie informácie o testovaných chemikáliách a ich fyzikálno-chemických vlastnostiach, ktoré sťažujú ich testovanie, sú uvedené v usmerňovacom dokumente OECD (11).
                              
                           PLATNOSŤ TESTU
                     
                              
                                 11.
                              
                              
                                 Na to, aby výsledky testu boli platné, sa priemerná celková dĺžka výhonku a priemerná celková čerstvá hmotnosť výhonku kontrolných rastlín musia počas vychytávacej fázy testu aspoň zdvojnásobiť. Kontrolné rastliny navyše nesmú prejavovať žiadne viditeľné príznaky chlorózy a mali by byť viditeľne bez kontaminácie inými organizmami, ako sú riasy a/alebo bakteriálny povlak na rastlinách, na povrchu sedimentu a v testovacom médiu.
                              
                           
                              
                                 12.
                              
                              
                                 Priemerný variačný koeficient pre výťažok na základe meraní čerstvej hmotnosti výhonku (teda od začatia testu po skončenie testu) v kontrolných kultúrach nepresahuje 35 % medzi replikátmi.
                              
                           REFERENČNÁ CHEMIKÁLIA
                     
                              
                                 13.
                              
                              
                                 Na overenie spoľahlivosti testovacieho postupu v čase možno otestovať referenčnú chemikáliu (chemikálie), napríklad 3,5-dichlórfenol použitý v kruhovom teste (9). Údaje z kruhového testu naznačujú, že priemerné hodnoty EC50 rôznych závisle premenných pre 3,5-DCP boli medzi 4,7 a 6,1 mg/l (podrobnosti o očakávanom intervale spoľahlivosti okolo týchto hodnôt nájdete v správe o kruhovom teste). Odporúča sa testovať referenčnú chemikáliu najmenej dvakrát do roka alebo, ak sa testovanie vykonáva zriedkavo, súbežne s konečnými testami toxicity. Usmernenie o očakávaných hodnotách EC50 pre 3,5-DCP sa nachádza v štatistickej správe o medzinárodnom kruhovom teste (9).
                              
                           OPIS METÓDY
                     
                        Testovacie vybavenie
                     
                     
                              
                                 14.
                              
                              
                                 Test sa má vykonať v kontrolovaných podmienkach prostredia, t. j. v rastovej komore, rastovej miestnosti alebo laboratóriu, s regulovanou dĺžkou dňa, osvetlením a teplotou (pozri oddiel „Podmienky testu“, body 56 – 58). Zásobné kultúry by sa mali udržiavať oddelene od testovacích nádob.
                              
                           
                              
                                 15.
                              
                              
                                 Štúdia by sa mala vykonať s použitím sklenených testovacích nádob, ako sú akváriá alebo kadičky. Zvyčajne sa používajú 2 l sklenené kadičky (s výškou približne 24 cm a priemerom 11 cm). Vhodné však môžu byť aj iné (t. j. väčšie) nádoby za predpokladu, že umožnia dostatočnú hĺbku vody na neobmedzený rast a ponorenie rastlín počas celého trvania testu.
                              
                           
                              
                                 16.
                              
                              
                                 Ako nádoby na zasadenie rastlín do sedimentu možno použiť plastové alebo sklenené kvetináče (priemer približne 9 cm, výška 8 cm a objem 500 ml). Alternatívne možno použiť sklenené kadičky, ktoré sa v niektorých prípadoch uprednostňujú (napr. na testovanie hydrofóbnych chemikálií alebo chemikálií s vysokou hodnotou Kow).
                              
                           
                              
                                 17.
                              
                              
                                 Výber veľkosti kvetináča/kadičky treba zvažovať spolu s výberom testovacích nádob a uprednostňovanej koncepcie testu (pozri ďalej). Ak sa používa koncepcia testu A (jeden výhonok na kvetináč a tri kvetináče na nádobu), môžu byť potrebné menšie kvetináče alebo väčšie nádoby. Ak sa používa koncepcia testu B (tri výhonky na kvetináč a jeden kvetináč na nádobu), mali by byť vhodné uvedené veľkosti kvetináčov a nádob. Vo všetkých prípadoch by mala byť minimálna hĺbka nadložnej vody 12 cm nad povrchom sedimentu a mal by sa zaznamenať pomer plochy povrchu/objemu sedimentu k ploche povrchu/objemu vody.
                              
                           
                        Testovací organizmus
                     
                     
                              
                                 18.
                              
                              
                                 Všeobecné prístupy opísané v tejto testovacej metóde sa môžu použiť na testovanie rôznych druhov vodných rastlín. Podmienky uvedené v tejto testovacej metóde však boli prispôsobené na testovanie druhu stolístka Myriophyllum spicatum. Tento druh patrí do čeľade dvojklíčnolistových rastlín Haloragaceae (zrnulkovité).
                              
                           
                              
                                 19.
                              
                              
                                 
                                    Myriophyllum spicatum (stolístok klasnatý) je ponorený zakorenený druh, ktoré znáša celý rad podmienok a vyskytuje sa v stojatých i tečúcich vodách. M. spicatum je viacročná rastlina, ktorá počas zimy prežíva len ako koreň. Rastliny zvyčajne kvitnú a voľne šíria semená, hoci často je hlavnou metódou kolonizácie vegetatívne rozmnožovanie prostredníctvom pazušných pupeňov alebo úlomkov stonky, ktoré sa oddeľujú prirodzene alebo po narušení.
                              
                           
                        Kultivácia testovacieho organizmu
                     
                     
                              
                                 20.
                              
                              
                                 Rastliny možno získať z prirodzených populácií alebo od dodávateľov vodných rastlín. V oboch prípadoch by sa zdroj rastlín mal zdokumentovať a mala by sa overiť totožnosť druhu. Treba dávať veľký pozor na to, aby sa pri zbere Myriophyllum spicatum v teréne získal správny druh, a to najmä v regiónoch, kde sa môže krížiť s inými druhmi rodu Myriophyllum. V prípade pochybností sa odporúča použiť overené laboratórne kultúry zo známych zdrojov. V teste by sa nemali použiť rastliny, ktoré boli vystavené akýmkoľvek chemickým kontaminantom alebo nazbierané na lokalitách so známou kontamináciou.
                              
                           
                              
                                 21.
                              
                              
                                 V regiónoch, kde druh M. spicatum nie je ľahko dostupný počas zimných mesiacov, môže byť potrebné dlhodobé udržiavanie zásobných kultúr v skleníku alebo v laboratórnych podmienkach. Zásobné kultúry by mali udržiavať za podobných podmienok, ako sú podmienky testu, možno však znížiť intenzitu ožiarenia a teplotu, aby sa znížila frekvencia údržby kultúry (napr. v čase, keď sa neplánujú žiadne testy s rodom Myriophyllum). Odporúča sa použiť väčšie akvária a kvetináče, ako by sa použili v testoch, aby rastliny mali dosť miesta na rozrastanie. Zloženie sedimentových a vodných médií by malo byť rovnaké, ako by sa použilo v testoch, možno však použiť aj alternatívne metódy hnojenia sedimentu (napr. komerčné hnojivá s pomalým uvoľňovaním).
                              
                           
                              
                                 22.
                              
                              
                                 Zásobné rastliny by mali byť viditeľne bez kontaminácie inými organizmami vrátane slimákov, vláknitých rias, plesní a hmyzu, napr. vajíčok alebo lariev mole Paraponyx stratiotata a lariev alebo dospelých jedincov druhu Eubrychius velutus z čeľade nosáčikovité. Na odstránenie viditeľnej kontaminácie môže byť potrebné prepláchnuť rastlinný materiál v čerstvej vode. Okrem toho sa treba pokúsiť minimalizovať rozvoj jednobunkových rias a bakteriálnej kontaminácie, hoci úplná sterilnosť rastlinného materiálu nie je nutná. Zásobné kultúry by sa mali monitorovať a podľa potreby presadiť, aby nedošlo k rozvoju riasovej a bakteriálnej kontaminácie. Ak sa vyskytne problém riasovej alebo bakteriálnej kontaminácie, môže pomôcť prevzdušňovanie zásobných kultúr.
                              
                           
                              
                                 23.
                              
                              
                                 Vo všetkých prípadoch sa rastliny pred použitím v teste dostatočne dlho (> 2 týždne) kultivujú/aklimatizujú za podmienok, ktoré sú podobné, ale nie nevyhnutne rovnaké ako pri teste.
                              
                           
                              
                                 24.
                              
                              
                                 Kvitnúce zásobné kultúry sa v teste nemajú používať, lebo počas kvitnutia a po ňom vo všeobecnosti klesá rýchlosť vegetatívneho rastu.
                              
                           
                        Sediment
                     
                     
                              
                                 25.
                              
                              
                                 V tomto teste sa odporúča použiť nasledujúci pripravený sediment založený na umelom sedimente použitom v testovacej metóde C.28 tejto prílohy (8). Sediment sa pripravuje podľa metódy TM C.28 s výnimkou pridania živín, ako sa uvádza ďalej:
                                 
                                             a)
                                          
                                          
                                             4 – 5 % rašeliny (suchá hmotnosť, 2 ± 0,5 % organického uhlíka) s pH čo najbližšie k 5,5 až 6,0, pričom dôležité je použiť rašelinu v práškovej forme, jemne rozdrvenú (veľkosť častíc podľa možnosti < 1 mm) a sušenú len na vzduchu;
                                          
                                       
                                             b)
                                          
                                          
                                             20 % (suchá hmotnosť) kaolínu (obsah kaolinitu podľa možnosti nad 30 %);
                                          
                                       
                                             c)
                                          
                                          
                                             75 – 76 % (suchá hmotnosť) kremenného piesku (mal by prevládať jemný piesok s viac ako 50 % častíc s veľkosťou od 50 do 200 μm);
                                          
                                       
                                             d)
                                          
                                          
                                             pridá sa také množstvo vodného živného média, aby konečná vzorka sedimentu obsahovala po 200 mg/kg suchého sedimentu chloridu amónneho i fosforečnanu sodného a aby obsah vlhkosti konečnej zmesi bol v rozsahu 30 – 50 %;
                                          
                                       
                                             e)
                                          
                                          
                                             pridá sa uhličitan vápenatý chemicky čistej kvality (CaCO3), aby sa pH konečnej zmesi sedimentu upravilo na 7,0 ± 0,5.
                                          
                                       
                           
                              
                                 26.
                              
                              
                                 Zdroj rašeliny, kaolínu a piesku by mal byť známy a zdokumentovaný. Ak je pôvod neznámy alebo vyvoláva určité obavy, je potrebné skontrolovať, či sú príslušné zložky bez chemickej kontaminácie (napr. ťažkými kovmi, organochlórovými zlúčeninami, organofosforovými zlúčeninami).
                              
                           
                              
                                 27.
                              
                              
                                 Suché zložky sedimentu by sa mali homogénne zmiešať a následne sa do sedimentu dôkladne primieša vodný živný roztok. Vlhký sediment je potrebné pripraviť aspoň dva dni pred použitím, aby sa dôkladne zvlhčila rašelina a aby sa zabránilo vyplávaniu hydrofóbnych častíc rašeliny na povrch, keď sa sediment prekryje médiom. Vlhký sediment možno pred použitím skladovať v tme.
                              
                           
                              
                                 28.
                              
                              
                                 Na účely testu sa sediment prenesie do nádob vhodnej veľkosti, napríklad do kvetináčov s takým priemerom, aby sa zmestili do sklenených nádob (povrch sedimentu by mal pokrývať približne 70 % alebo viac povrchu nádoby). Ak má nádoba na dne otvory, na udržanie sedimentu vnútri nádoby možno na dno nádoby umiestniť kúsok filtračného papiera. Kvetináče sa naplnia sedimentom tak, aby bol povrch sedimentu rovný. Ten sa potom pokryje tenkou vrstvou (~ 2 až 3 mm) inertného materiálu, napríklad piesku alebo jemnej záhradníckej drviny (alebo rozdrvených koralov), aby sa sediment udržal na mieste.
                              
                           
                        Testovacie médium
                     
                     
                              
                                 29.
                              
                              
                                 Na kultiváciu a testovanie druhu Myriophyllum spicatum sa odporúča použiť Smartovo a Barkovo médium (12). Príprava tohto média je opísaná v dodatku 1. Hodnota pH média (vodnej fázy) by na začiatku testu mala byť medzi 7,5 a 8,0, aby sa dosiahol optimálny rast rastlín.
                              
                           
                        Návrh experimentu
                     
                     
                              
                                 30.
                              
                              
                                 Test by mal zahŕňať minimálne šesť replikačných testovacích nádob pre kontroly bez ovplyvňovania chemikáliou a minimálne štyri replikačné testovacie nádoby pre každú z minimálne piatich úrovní koncentrácie.
                              
                           
                              
                                 31.
                              
                              
                                 Ak sa nevyžaduje stanovenie hodnoty NOEC, koncepcia testu sa môže upraviť tak, že sa zvýši počet koncentrácií a zníži počet replikátov na koncentráciu.
                              
                           
                              
                                 32.
                              
                              
                                 Každá testovacia nádoba predstavuje replikát obsahujúci tri výhonky. Existujú dve možnosti pestovania troch výhonkov v každej testovacej nádobe:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             koncepcia testu A: jeden výhonok na kvetináč a tri kvetináče na nádobu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             koncepcia testu B: tri výhonky na kvetináč a jeden kvetináč na nádobu,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             alternatívne koncepcie testu s jedným výhonkom na kvetináč na testovaciu nádobu sú prijateľné za predpokladu, že replikácia sa upraví podľa potreby tak, aby sa dosiahli požadované validačné kritériá.
                                          
                                       
                           
                              
                                 33.
                              
                              
                                 Jednotlivé testovacie nádoby by sa mali náhodne priradiť ovplyvňovaným skupinám. Testovacie nádoby sa musia v oblasti testu rozmiestniť náhodne, aby sa minimalizoval vplyv priestorových rozdielov v intenzite svetla alebo teplote.
                              
                           
                        Koncentrácie testovanej chemikálie a kontrolné skupiny
                     
                     
                              
                                 34.
                              
                              
                                 Koncentrácie by za normálnych okolností mali byť usporiadané v geometrickom rade. Rozdeľovací koeficient medzi testovanými koncentráciami by nemal byť vyšší ako 3,2. Pri voľbe vhodných testovaných koncentrácií pomôžu predchádzajúce poznatky o toxicite testovanej chemikálie z testov na vyhľadávanie rozsahu.
                              
                           
                              
                                 35.
                              
                              
                                 Na stanovenie hodnoty ECx by testované koncentrácie mali obklopovať hodnotu ECx, aby sa zabezpečila primeraná úroveň spoľahlivosti. Ak sa napríklad odhaduje hodnota EC50, najvyššia testovaná koncentrácia by mala byť vyššia ako hodnota EC50. Ak je hodnota EC50 mimo rozsahu testovaných koncentrácií, príslušné intervaly spoľahlivosti budú veľké a môže sa stať, že nebude možné správne posúdiť vhodnosť modelu na štatistické spracovanie. Použitím viacerých testovaných koncentrácií sa zlepší interval spoľahlivosti okolo výslednej hodnoty ECx.
                              
                           
                              
                                 36.
                              
                              
                                 Na stanovenie hodnôt LOEC/NOEC (voliteľné sledované parametre) by najnižšia testovaná koncentrácia mala byť dostatočne nízka na to, aby sa rast významne nelíšil od rastu kontrolných rastlín. Najvyššia testovaná koncentrácia okrem toho by mala byť dostatočne vysoká na to, aby bol rast významne nižší než v kontrole. Štatistická spoľahlivosť koncepcie s použitím koncentrácie bez účinku/testu ANOVA sa posilní použitím väčšieho počtu replikátov.
                              
                           
                        Limitný test
                     
                     
                              
                                 37.
                              
                              
                                 V prípadoch, keď z testu na vyhľadávanie rozsahu vyplýva, že testovaná chemikália nemá nepriaznivé účinky pri koncentráciách do 100 mg/l alebo do svojho limitu rozpustnosti v testovacom médiu, alebo v prípade prípravku do limitu dispergovateľnosti, sa môže vykonať limitný test umožňujúci porovnanie reakcií v kontrolnej skupine a v jednej ovplyvňovanej skupine – 100 mg/l alebo koncentrácia rovná limitu rozpustnosti, alebo 1 000 mg/kg suchého sedimentu. Tento test by sa mal riadiť všeobecnými zásadami štandardného testu reakcie na dávku s výnimkou toho, že sa odporúča zvýšiť minimálny počet replikátov na šesť testovacích nádob pre každú kontrolu a koncentráciu. Rast v kontrolnej a ovplyvňovanej skupine sa môže analyzovať s použitím štatistického testu na porovnanie priemerov, napr. Studentovho t-testu.
                              
                           
                        Testovacie roztoky
                     
                     
                              
                                 38.
                              
                              
                                 Testovacie roztoky sa zvyčajne pripravujú zriedením zásobného roztoku, ktorý sa pripraví rozpustením alebo disperziou testovanej chemikálie v Smartovom a Barkovom médiu s použitím demineralizovanej (teda destilovanej alebo deionizovanej) vody (pozri dodatok 1).
                              
                           
                              
                                 39.
                              
                              
                                 Najvyššia testovaná koncentrácia by za normálnych okolností nemala prekročiť rozpustnosť testovanej chemikálie vo vode alebo v prípade prípravkov dispergovateľnosť za podmienok testu.
                              
                           
                              
                                 40.
                              
                              
                                 Pre testované chemikálie s nízkou rozpustnosťou vo vode môže byť potrebné pripraviť koncentrovaný zásobný roztok alebo disperziu chemikálie s použitím organického rozpúšťadla alebo dispergantu, aby sa umožnilo pridanie presných množstiev testovanej chemikálie do testovacieho média a napomohlo sa jej rozptýlenie a rozpustenie. Použitiu takýchto rozpúšťadiel alebo dispergantov sa treba v maximálnej možnej miere vyhýbať. Použitie pomocných rozpúšťadiel alebo dispergantov by nemalo viesť k žiadnej fytotoxicite. Medzi bežne používané rozpúšťadlá, ktoré nespôsobujú fytotoxicitu pri koncentráciách do 100 μl/l, patrí napríklad acetón a dimetylformamid. Ak sa používa rozpúšťadlo alebo dispergant, jeho konečná koncentrácia by sa mala zaznamenať a udržiavať na minime (≤ 100 μl/l). Za týchto okolností by všetky ovplyvňované skupiny a kontroly (s aplikáciou rozpúšťadla) mali obsahovať rovnakú koncentráciu rozpúšťadla alebo dispergantu. Súčasťou testu sú aj neošetrené kontrolné replikáty, ktoré neobsahujú rozpúšťadlo ani dispergant. Ďalšie informácie o použití dispergantov sú uvedené v usmerňovacom dokumente OECD (11).
                              
                           TESTOVACÍ POSTUP
                     
                              
                                 41.
                              
                              
                                 Testovací postup sa líši podľa spôsobu aplikácie testovanej chemikálie (t. j. prostredníctvom vodnej alebo sedimentovej fázy). Pri výbere režimu expozície použitého v teste (teda statického alebo statického obnovovacieho systému, obohatenej vody alebo obohateného sedimentu) by sa malo zvážiť pravdepodobné správanie testovanej chemikálie v systéme voda – sediment. Testy s obohateným sedimentom sa v niektorých prípadoch môžu uprednostniť pre chemikálie, ktoré sa pravdepodobne výrazne rozdeľujú do sedimentu.
                              
                           
                        Fáza založenia
                     
                     
                              
                                 42.
                              
                              
                                 Zdravé vrcholy/špičky výhonkov, teda bez vedľajších výhonkov, sa narežú z kultivačných rastlín na dĺžku výhonku 6 cm (± 1 cm). V prípade koncepcie testu A (jeden výhonok na kvetináč a tri kvetináče na nádobu) sa do každého kvetináča zasadí vrchol z jedného výhonku. V prípade koncepcie testu B (tri výhonky na kvetináč a jeden kvetináč na nádobu) sa do každého kvetináča obsahujúceho sediment zasadí štyri až päť vrcholov výhonkov.
                              
                           
                              
                                 43.
                              
                              
                                 V oboch prípadoch sa mali výhonky zasadiť do nadbytočných kvetináčov, aby bolo na začiatku testu možné vybrať uniformné rastliny a aby sa získali náhradné rastliny, ktoré sa použijú na kontrolu rastu koreňa bezprostredne pred ošetrením a na účely merania biomasy a dĺžky výhonku v 0. deň.
                              
                           
                              
                                 44.
                              
                              
                                 Výhonky sa vkladajú tak, aby približne tri centimetre zahŕňajúce aspoň dve kolienka boli pod povrchom sedimentu.
                              
                           
                              
                                 45.
                              
                              
                                 Kvetináče sa potom prenesú do testovacích nádob s rovnakými podmienkami prostredia ako vo vychytávacej fáze a udržiavajú sa sedem dní v Smartovom a Barkovom médiu, aby sa vyvolal vývin koreňa.
                              
                           
                              
                                 46.
                              
                              
                                 Po uplynutí tohto obdobia sa má niekoľko rastlín v náhradných kvetináčoch vybrať na účely kontroly rastu koreňa. Ak rast koreňa nie je viditeľný (t. j. nie sú viditeľné špičky koreňa), fáza založenia by sa mala predĺžiť, kým nebude rast koreňa viditeľný. Tento krok sa odporúča, aby sa zabezpečil aktívny rast rastlín v čase začatia testu.
                              
                           
                        Výber uniformného rastlinného materiálu
                     
                     
                              
                                 47.
                              
                              
                                 V prípade koncepcie testu A (jeden výhonok na kvetináč a tri kvetináče na nádobu) sa pred začiatkom testu vyberú uniformné kvetináče. V prípade koncepcie testu B (tri výhonky na kvetináč a jeden kvetináč na nádobu) sa odstránia nadbytočné rastliny, aby zostali tri rastliny s uniformnou veľkosťou a vzhľadom.
                              
                           
                        Expozícia prostredníctvom vodnej fázy
                     
                     
                              
                                 48.
                              
                              
                                 Vybrané uniformné kvetináče sa umiestnia do testovacích nádob v súlade s návrhom experimentu. Do testovacích nádob sa potom pridá Smartovo a Barkovo médium. Treba dbať na to, aby sa nenarušil sediment. Na tieto účely sa médium môže pridávať pomocou lievika alebo plastového kotúča, ktorým sa zakryje sediment pri nalievaní média do testovacích nádob, pričom kotúč sa ihneď potom musí odstrániť. Alternatívne sa kvetináče môžu umiestniť do testovacích nádob až po pridaní média. V oboch prípadoch možno na začiatku vychytávacej fázy použiť čerstvé médiá, ak je to potrebné na minimalizáciu potenciálneho hromadenia rias a baktérií alebo na účely prípravy jednotných vzoriek testovacieho roztoku pre všetky replikáty.
                              
                           
                              
                                 49.
                              
                              
                                 Pred pridaním média alebo po ňom sa odmeria dĺžka výhonku nad sedimentom.
                              
                           
                              
                                 50.
                              
                              
                                 Príslušné množstvá testovanej chemikálie možno pridať do testovacieho média predtým, ako sa pridá do testovacích nádob. Alternatívne sa testovaná chemikália môže pridať do média až po jeho pridaní do testovacích nádob. V takom prípade treba dbať na to, aby sa testovaná látka homogénne distribuovala v celom testovacom systéme bez toho, aby sa narušil sediment.
                              
                           
                              
                                 51.
                              
                              
                                 Vo všetkých prípadoch sa na začiatku testu zaznamená vzhľad testovacieho média (napr. číry, zakalený atď.).
                              
                           
                        Expozícia prostredníctvom sedimentu
                     
                     
                              
                                 52.
                              
                              
                                 Obohatené sedimenty vybranej koncentrácie sa pripravujú pridaním roztoku testovanej chemikálie priamo do čerstvého sedimentu. Zásobný roztok testovanej chemikálie rozpustenej v deionizovanej vode sa zmieša s pripraveným sedimentom pomocou valcového mlyna, stroja na miešanie krmív alebo ručným miešaním. Ak je testovaná chemikália slabo rozpustná vo vode, možno ju rozpustiť v čo najmenšom objeme vhodného organického rozpúšťadla (napr. hexánu, acetónu alebo chloroformu). Tento roztok sa následne zmieša s približne 10 g jemného kremenného piesku na jednu testovaciu nádobu. Rozpúšťadlo sa nechá odpariť a piesok sa potom zmieša s vhodným množstvom sedimentu na danú testovaciu kadičku. Na rozpustenie, disperziu alebo emulgovanie testovanej chemikálie možno použiť iba látky, ktoré sú ľahko prchavé. Treba mať na zreteli, že pri konečnej príprave sedimentu je nutné zohľadniť objem/hmotnosť piesku obohateného testovanou chemikáliou (sediment sa teda musí pripraviť s menším množstvom piesku). Treba zabezpečiť, aby sa testovaná chemikália pridávaná do sedimentu v sedimente dôkladne a rovnomerne distribuovala.
                              
                           
                              
                                 53.
                              
                              
                                 Obohatený sediment sa naplní do kvetináčov (ako je opísané vyššie). Vybrané uniformné rastliny s dostatočným koreňovým systémom sa vyberú z kvetináčov použitých počas fázy založenia a presadia sa do obohateného sedimentu, ako je opísané vyššie.
                              
                           
                              
                                 54.
                              
                              
                                 Kvetináče sa umiestnia do testovacích nádob v súlade s návrhom experimentu. Potom sa opatrne pridá Smartovo a Barkovo médium (pomocou lievika) tak, aby sa nenarušil sediment. Odmeria sa dĺžka výhonku nad sedimentom, a to pred pridaním média alebo po ňom.
                              
                           
                        Udržiavanie výšky hladiny vody počas trvania testu
                     
                     
                              
                                 55.
                              
                              
                                 Musí sa zaznamenať konečný objem vody a na každú testovaciu nádobu sa musí vyznačiť výška hladiny vody. Ak sa počas testu odparí viac ako 10 % vody, výška hladiny vody by sa mala upraviť destilovanou vodou. V prípade potreby možno kadičky voľne zakryť priehľadnými krytmi, napríklad priehľadnými plastovými viečkami, aby sa minimalizovalo odparovanie a kontaminácia spórami rias.
                              
                           
                        Podmienky testu
                     
                     
                              
                                 56.
                              
                              
                                 Na zabezpečenie intenzity ožiarenia v rozsahu približne 140 (± 20) μE · m– 2 s– 1 sa používa teplé a/alebo studené biele fluorescenčné svetlo, ktoré sa meria ako fotosynteticky aktívne žiarenie (400 – 700 nm) na povrchu vody a s použitím pomeru svetlo:tma 16:8 hod. Prípadné odchýlky od zvolenej intenzity ožiarenia oblasti testu by nemali presiahnuť rozmedzie ± 15 %.
                              
                           
                              
                                 57.
                              
                              
                                 Teplota v testovacích nádobách je 20 ± 2 °C.
                              
                           
                              
                                 58.
                              
                              
                                 Hodnota pH kontrolného média by sa počas testu nemala zvýšiť o viac ako 1,5 jednotky. Odchýlka o viac ako 1,5 jednotky by však nespôsobila neplatnosť testu, ak možno preukázať, že sú splnené vopred stanovené validačné kritériá.
                              
                           
                        Trvanie testu
                     
                     
                              
                                 59.
                              
                              
                                 Obdobie expozície trvá 14 dní.
                              
                           
                        Merania a analytické stanovenia
                     
                     
                              
                                 60.
                              
                              
                                 Po fáze založenia a bezprostredne pred ošetrením (teda v 0. deň) sa vyberú náhradné rastliny z piatich náhodne vybraných kvetináčov v prípade koncepcie s troma rastlinami na kvetináč alebo 15 kvetináčov v prípade koncepcie s jednou rastlinou na kvetináč na účely vyhodnotenia dĺžky a čerstvej a suchej hmotnosti výhonkov, ako je opísané ďalej.
                              
                           
                              
                                 61.
                              
                              
                                 Vykonajú sa tieto hodnotenia rastlín prenesených do vychytávacej fázy (tabuľka 1):
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             hodnotenia dĺžky hlavného výhonku, počtu bočných výhonkov a dĺžky bočných výhonkov sa zaznamenajú aspoň na konci obdobia expozície (napr. v 14. deň),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             vizuálne hodnotenia zdravia rastlín sa zaznamenajú aspoň trikrát počas obdobia expozície (napr. v 0., 7. a 14. deň),
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             hodnotenia čerstvej a suchej hmotnosti výhonku sa vykonajú na konci testu (t. j. v 14. deň).
                                          
                                       
                           
                              
                                 62.
                              
                              
                                 Dĺžka výhonku sa stanoví pomocou pravítka. Ak sú prítomné bočné výhonky, odmeria sa aj ich počet a dĺžka.
                              
                           
                              
                                 63.
                              
                              
                                 Vizuálne hodnotenie zdravia rastlín sa vykoná tak, že sa zaznamená vzhľad rastlín a celkový stav testovacieho média. Majú sa zaznamenať tieto pozorovania:
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             nekróza, chloróza alebo iná zmena farby, napríklad nadmerné sčervenanie oproti kontrolným rastlinám,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             rozvoj bakteriálnej alebo riasovej kontaminácie,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             abnormality rastu, napríklad zakrpatenie, zmena dĺžky medzi kolienkami, deformované výhonky/listy, rozrastanie bočných výhonkov, strata listov, strata turgoru a fragmentácia stonky,
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             pri skončení testu sa vykoná vizuálne hodnotenie zdravia koreňa: z koreňov sa dôkladne omyje sediment, aby bolo možné pozorovať koreňový systém. Navrhovaný rozsah hodnotenia v porovnaní s kontrolnými rastlinami:
                                             
                                                         1.
                                                      
                                                      
                                                         neprítomné korene;
                                                      
                                                   
                                                         2.
                                                      
                                                      
                                                         málo koreňov;
                                                      
                                                   
                                                         3.
                                                      
                                                      
                                                         stredný vývin koreňa;
                                                      
                                                   
                                                         4.
                                                      
                                                      
                                                         veľmi dobrý vývin koreňa, podobný ako v kontrolách.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                              
                                 64.
                              
                              
                                 Na začiatku a na konci testu sa vykoná hodnotenie čerstvej hmotnosti tak, že výhonok sa odreže na úrovni sedimentu a pred vážením sa otrie do sucha. Treba dbať na to, aby sa odstránili častice sedimentu, ktoré môžu priľnúť k spodku výhonku. Výhonky sa potom umiestnia do sušiacej pece pri teplote približne 60 °C a vysušia sa na konštantnú hmotnosť, potom sa znova odvážia a zaznamená sa suchá hmotnosť.
                              
                           
                              
                                 65.
                              
                              
                                 Tabuľka 1 obsahuje zhrnutie minimálnych biologických hodnotení vyžadovaných počas trvania testu.
                                 
                                    Tabuľka 1
                                 
                                 
                                    Harmonogram hodnotení
                                 
                                 
                                             Deň po ovplyvnení
                                             (DAT)
                                          
                                          
                                             
                                                Myriophyllum spicatum
                                             
                                          
                                       
                                             Dĺžka výhonku, dĺžka a počet bočných výhonkov
                                          
                                          
                                             Vizuálne hodnotenie výhonkov
                                          
                                          
                                             Čerstvá a suchá hmotnosť výhonkov,
                                             vizuálne hodnotenie výhonkov
                                          
                                          
                                             pH
                                             O2
                                             
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             —
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                          
                                             A
                                          
                                       
                                             
                                                         A
                                                      
                                                      
                                                         :
                                                      
                                                      
                                                         znamená, že pri týchto príležitostiach sú hodnotenia povinné.
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         :
                                                      
                                                      
                                                         znamená, že merania nie sú povinné.
                                                      
                                                   
                                       
                           
                        Frekvencia meraní a analytických stanovení
                     
                     
                              
                                 66.
                              
                              
                                 Teplota média v doplnkovej nádobe udržiavanej v rovnakých podmienkach v rastovej komore, inkubátore alebo miestnosti by sa mala zaznamenať minimálne raz za deň (alebo priebežne pomocou zapisovača údajov).
                              
                           
                              
                                 67.
                              
                              
                                 Hodnota pH a koncentrácia rozpusteného kyslíka v testovacom médiu treba skontrolovať na začiatku testu, aspoň raz počas testu a na konci testu vo všetkých replikačných nádobách. Merania by sa pri každej príležitosti mali vykonávať v rovnakom čase počas dňa. Ak sa na prípravu všetkých replikátov pre každú testovanú koncentráciu používajú spoločné roztoky, potom je prijateľné jedno meranie každého spoločného roztoku v 0. deň.
                              
                           
                              
                                 68.
                              
                              
                                 Intenzita ožiarenia by sa mala merať v rastovej komore, inkubátore alebo miestnosti v bodoch zodpovedajúcich výške hladiny vody. Merania by sa mali uskutočniť minimálne raz na začiatku alebo počas testu. Metóda detekcie a merania svetla, najmä typ senzora, ovplyvní meranú hodnotu. Guľové senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad a pod rovinou merania) a „kosínusové“ senzory (ktoré reagujú na svetlo zo všetkých uhlov nad rovinou merania) sa uprednostňujú pred jednosmernými senzormi a poskytnú vyššie hodnoty v prípade viacbodového zdroja svetla takého typu, aký sa uvádza v tejto metóde.
                              
                           
                        Analytické merania testovanej chemikálie
                     
                     
                              
                                 69.
                              
                              
                                 Na zabezpečenie správnej aplikácie testovanej chemikálie je nutné vykonať analytické merania koncentrácie testovanej chemikálie.
                              
                           
                              
                                 70.
                              
                              
                                 Pre všetky testované koncentrácie je bezprostredne po začatí testu (t. j. v deň aplikácie v prípade stabilných testovaných chemikálií alebo jednu hodinu po aplikácii v prípade nestabilných chemikálií) a pri skončení testu potrebné odobrať vzorky vody na analýzu testovanej chemikálie.
                              
                           
                              
                                 71.
                              
                              
                                 Na začiatku a na konci testu je potrebné stanoviť koncentrácie v sedimente a v pórovej vode sedimentu aspoň pri najvyššej testovanej koncentrácii, pokiaľ nie je známe, že testované chemikálie sú stabilné vo vode (> 80 % nominálnej hodnoty). Merania v sedimente a pórovej vode nemusia byť potrebné, ak sa rozdeľovanie testovanej chemikálie medzi vodu a sediment jednoznačne určilo v štúdii voda/sediment pri porovnateľných podmienkach (napr. pomer sedimentu k vode, metóda aplikácie, druh sedimentu).
                              
                           
                              
                                 72.
                              
                              
                                 Odobratím sedimentu na začiatku testu by sa pravdepodobne narušil testovací systém. Preto môžu byť na uľahčenie analytických stanovení na začiatku a na konci testu potrebné ďalšie testovacie nádoby s ovplyvnenými vzorkami. Podobne, ak sa považujú za nevyhnutné priebežné hodnotenia (na 7. deň) a analýzy si vyžadujú veľké vzorky sedimentu, ktoré sa nedajú ľahko odobrať z testovacieho systému, analytické stanovenia by sa mali robiť s použitím ďalších testovacích nádob so vzorkami ošetrenými rovnakým spôsobom ako vzorky použité na biologické hodnotenia.
                              
                           
                              
                                 73.
                              
                              
                                 Na izolovanie intersticiálnej vody sa odporúča centrifugácia s nastavením napríklad 10 000 g a pri teplote 4 °C počas 30 minút. Ak sa však preukáže, že testovaná chemikália sa neabsorbuje na filtroch, môže byť prijateľná aj filtrácia. V niektorých prípadoch nemusí byť možné analyzovať koncentrácie v pórovej vode, ak je vzorka príliš malá.
                              
                           
                              
                                 74.
                              
                              
                                 V poloatatických testoch (t. j. expozícia prostredníctvom vodnej fázy), v ktorých sa očakáva, že koncentrácia príslušnej testovanej chemikálie (chemikálií) nezostane počas trvania testu v rozmedzí 20 % od nominálnej koncentrácie bez obnovenia testovacích roztokov, by sa pri každom obnovení mali odobrať použité a čerstvo pripravené testovacie roztoky na analýzy koncentrácie testovanej chemikálie.
                              
                           
                              
                                 75.
                              
                              
                                 V prípadoch, keď nameraná počiatočná koncentrácia testovanej chemikálie nie je v rozmedzí 20 % od nominálnej hodnoty, ale keď existujú postačujúce dôkazy na preukázanie, že počiatočné koncentrácie sú opakovateľné a stabilné (t. j. v rozsahu 80 – 120 % počiatočnej koncentrácie), sa stanovenia chemikálie môžu vykonať iba s najvyššími a najnižšími testovanými koncentráciami.
                              
                           
                              
                                 76.
                              
                              
                                 Vo všetkých prípadoch sa stanovenie koncentrácie testovanej chemikálie musí vykonať iba v jednej replikačnej nádobe pri každej testovanej koncentrácii. Alternatívne sa testovacie roztoky všetkých replikátov pre každú koncentráciu môžu na účely analýzy zlúčiť.
                              
                           
                              
                                 77.
                              
                              
                                 Ak je dokázané, že koncentrácia testovanej chemikálie sa počas testu udržiavala v rozmedzí 20 % od nominálnej alebo nameranej počiatočnej koncentrácie, analýza výsledkov a následné odvodenie sledovaných parametrov sa môžu zakladať na nominálnych alebo nameraných počiatočných hodnotách.
                              
                           
                              
                                 78.
                              
                              
                                 V týchto prípadoch by účinné koncentrácie mali vychádzať z nominálnej alebo nameranej koncentrácie vo vode na začiatku testu.
                              
                           
                              
                                 79.
                              
                              
                                 Ak sa však dokáže, že koncentrácia počas testu klesla (t. j. nie je udržiavaná v rozmedzí 20 % od nominálnej alebo nameranej pôvodnej koncentrácie v ošetrenej vzorke), analýza výsledkov by mala byť založená na geometrickom priemere koncentrácií počas expozície alebo na modeloch opisujúcich pokles koncentrácie testovanej chemikálie v ošetrenej vzorke (11).
                              
                           HODNOTENIE ÚDAJOV
                     
                              
                                 80.
                              
                              
                                 V prípadoch, keď sa vyžaduje použitie rozpúšťadla/dispergantu, možno údaje o kontrolách s aplikáciou rozpúšťadla a neošetrených kontrolách spojiť na účely štatistických analýz za predpokladu, že reakcie v kontrolách s aplikáciou rozpúšťadla a kontrolách bez ovplyvnenia chemikáliou sa štatisticky významne nelíšia.
                              
                           
                        Závisle premenné
                     
                     
                              
                                 81.
                              
                              
                                 Účelom tohto testu je stanoviť účinky testovanej chemikálie na vegetatívny rast testovacieho druhu s použitím dvoch závisle premenných: priemernej špecifickej rýchlosti rastu a výťažku, a to takto:
                              
                           
                        Priemerná špecifická rýchlosť rastu
                     
                     
                              
                                 82.
                              
                              
                                 Táto závisle premenná je založená na zmenách logaritmov celkovej dĺžky výhonku, celkovej čerstvej hmotnosti výhonku a celkovej suchej hmotnosti výhonku v čase v kontrolách a v každej ovplyvňovanej skupine. Táto premenná sa vypočítava pre každý replikát každej kontrolnej a ovplyvňovanej skupiny. Priemerná dĺžka a hmotnosť troch rastlín na testovaciu nádobu (replikát) a následne aj miera rastu pre každý replikát sa vypočítajú pomocou tohto vzorca:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             μi-j
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             priemerná špecifická rýchlosť rastu od času i do času j,
                                          
                                       
                                             Ni
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe v čase i,
                                          
                                       
                                             Nj
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             meraná premenná v testovacej alebo kontrolnej nádobe v čase j,
                                          
                                       
                                             t
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             časové obdobie medzi i a j.
                                          
                                       
                           
                              
                                 83.
                              
                              
                                 Z reakcií replikátov sa vypočíta priemerná hodnota pre rýchlosť rastu spolu s odhadmi rozptylu pre každú ovplyvňovanú a kontrolnú skupinu.
                              
                           
                              
                                 84.
                              
                              
                                 Priemerná špecifická rýchlosť rastu by sa mala vypočítať pre celé obdobie testu (čas „i“ v uvedenom vzorci je začiatok testu a čas „j“ je koniec testu). Pre každú testovanú koncentráciu a kontrolnú vzorku sa vypočíta priemerná hodnota priemernej špecifickej rýchlosti rastu spolu s odhadmi rozptylu.
                              
                           
                              
                                 85.
                              
                              
                                 Pre každú testovanú koncentráciu (ovplyvňovanú skupinu) sa potom môže vypočítať percentuálna inhibícia rýchlosti rastu (Ir) podľa tohto vzorca:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             % Ir
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             percentuálna inhibícia priemernej špecifickej rýchlosti rastu,
                                          
                                       
                                             μC
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             priemerná hodnota pre μ v kontrole,
                                          
                                       
                                             μT
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             priemerná hodnota pre μ v ovplyvňovanej skupine.
                                          
                                       
                           
                        Výťažok
                     
                     
                              
                                 86.
                              
                              
                                 Táto závisle premenná je založená na zmenách celkovej dĺžky výhonku, celkovej čerstvej hmotnosti výhonku a celkovej suchej hmotnosti výhonku v čase v kontrolách a v každej ovplyvňovanej skupine. Pre každú ovplyvňovanú skupinu sa môže vypočítať priemerná percentuálna inhibícia výťažku (% Iy) takto:
                                 
                                    
                                 kde:
                                 
                                             % Iy
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             percento zníženia výťažku,
                                          
                                       
                                             bC
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             rozdiel konečného množstva biomasy a počiatočného množstva biomasy pre kontrolnú skupinu,
                                          
                                       
                                             bT
                                             
                                          
                                          
                                             :
                                          
                                          
                                             rozdiel konečného množstva biomasy a počiatočného množstva biomasy v ovplyvňovanej skupine.
                                          
                                       
                           
                        Zakreslenie kriviek závislosti veličiny od koncentrácie
                     
                     
                              
                                 87.
                              
                              
                                 Je potrebné zostrojiť krivky závislosti veličiny od koncentrácie pre vzťah medzi priemernou percentuálnou inhibíciou závisle premennej (Ir alebo Iy) vypočítanou podľa postupu uvedeného vyššie a logaritmom koncentrácie testovanej chemikálie.
                              
                           
                        Odhad hodnoty ECx
                        
                     
                     
                              
                                 88.
                              
                              
                                 Odhady hodnoty ECx (napr. EC50) by sa mali zakladať na hodnotách priemernej špecifickej rýchlosti rastu (ErCx) a výťažku (EyCx), z ktorých každá by sa mala zakladať na celkovej čerstvej hmotnosti výhonku, celkovej suchej hmotnosti výhonku a celkovej dĺžke výhonku).
                              
                           
                              
                                 89.
                              
                              
                                 Treba si uvedomiť, že hodnoty ECx vypočítané s použitím týchto dvoch závisle premenných nie sú porovnateľné a tento rozdiel treba zohľadniť pri použití výsledkov testu. Hodnoty ECx založené na priemernej špecifickej rýchlosti rastu (ErCx) budú vo väčšine prípadov vyššie ako výsledky založené na výťažku (EyCx) – ak boli dodržané podmienky tejto testovacej metódy – vzhľadom na matematický základ príslušných metód. Tento rozdiel by sa nemal vysvetľovať ako rozdiel v citlivosti medzi týmito dvoma závisle premennými, ale len tak, že hodnoty sa odlišujú matematicky.
                              
                           
                        Štatistické postupy
                     
                     
                              
                                 90.
                              
                              
                                 Cieľom je získať kvantitatívny vzťah medzi koncentráciou a závisle premennou pomocou regresnej analýzy. Možno použiť váženú lineárnu regresiu po vykonaní linearizujúcej transformácie údajov reakcie, napríklad na probitové, logitové alebo Weibullove jednotky (13), ale uprednostňujú sa techniky nelineárnej regresie, ktorými sa lepšie spracujú nevyhnutné nepravidelnosti údajov a odchýlky od hladkých rozdelení. Tieto nepravidelnosti, ak sa blížia k nulovej alebo úplnej inhibícii, sa transformáciou môžu zväčšiť a ovplyvniť analýzu (13). Treba si uvedomiť, že štandardné metódy analýzy s použitím probitovej, logitovej alebo Weibullovej transformácie sú určené na použitie na kvantálne údaje (napr. o úmrtnosti alebo prežití) a mali by sa upraviť tak, aby sa prispôsobili údajom o rýchlosti rastu alebo výťažku. Osobitné postupy na stanovenie hodnôt ECx z kontinuálnych údajov možno nájsť v literatúre pod číslami (14) (15) (16) (17).
                              
                           
                              
                                 91.
                              
                              
                                 Pre každú závisle premennú, ktorá sa má analyzovať, sa na výpočet bodových odhadov hodnôt ECx použije vzťah medzi koncentráciou a reakciou na ňu. Stanovia sa 95 % hranice spoľahlivosti pre každý odhad a vyhodnotí sa dobrá zhoda údajov reakcie s regresným modelom, a to buď graficky, alebo štatisticky. Regresná analýza by sa mala vykonať s použitím reakcií jednotlivých replikátov, nie priemerných hodnôt ovplyvňovanej skupiny.
                              
                           
                              
                                 92.
                              
                              
                                 Odhady hodnoty EC50 a hranice spoľahlivosti sa môžu získať aj s použitím lineárnej interpolácie metódou „bootstrap“ (18), ak sú dostupné regresné modely/metódy nevhodné pre dané údaje.
                              
                           
                              
                                 93.
                              
                              
                                 Na účely odhadu hodnôt LOEC, a teda aj NOEC, je potrebné porovnať priemerné hodnoty ovplyvňovaných skupín metódami analýzy rozptylu (ANOVA). Priemerná hodnota pre každú koncentráciu sa potom porovná s priemernou hodnotou kontroly s použitím príslušnej testovacej metódy (napr. Dunnettovho alebo Williamsovho testu) (19) (20) (21) (22). Treba posúdiť, či je dodržaný predpoklad normálneho rozdelenia (ND) a homogenity rozptylov (VH) pre analýzu ANOVA. Toto hodnotenie by sa malo vykonať pomocou Shapirovho-Wilksovho testu (ND) alebo Levenovho testu (VH). Nesplnenie predpokladu ND a homogenity rozptylov je niekedy možné korigovať logaritmickou transformáciou údajov. Ak je heterogenita rozptylov a/alebo odchýlka od ND extrémna a nie je možné ju korigovať transformáciou, je nutné uvažovať o analýze metódami, ako sú napríklad Bonferroniho-Welchov t-test, Jonckheereho-Terpstrov test trendu a Bonferroniho mediánový test. Ďalšie informácie o stanovení hodnoty NOEC možno nájsť v literatúre pod číslom (16).
                              
                           
                        PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV
                     
                     
                              
                                 94.
                              
                              
                                 Správa o teste obsahuje tieto informácie:
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovaná chemikália:
                                             
                                             
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Jednozložkové látky:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,
                                                                  
                                                               
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď.,
                                                                  
                                                               
                                                   
                                                          
                                                      
                                                      
                                                         Viaczložkové látky, UVCB a zmesi:
                                                         
                                                                     —
                                                                  
                                                                  
                                                                     charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek.
                                                                  
                                                               
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Testovací druh
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vedecký názov a zdroj.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Podmienky testu
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         trvanie a podmienky fázy založenia,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         použitý testovací postup (statický, polostatický, pulzujúci),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         dátum začiatku testu a jeho dĺžka,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testovacie médium, t. j. sediment a kvapalné živné médium,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         opis návrhu experimentu: rastová komora/miestnosť alebo laboratórium, testovacie nádoby a veká, objemy roztokov, dĺžka a hmotnosť testovacích rastlín na testovaciu nádobu na začiatku testu, pomer povrchu sedimentu k povrchu vody, pomer objemu sedimentu k objemu vody,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testované koncentrácie (nominálne a merané podľa potreby) a počet replikátov na koncentráciu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metódy prípravy zásobných a testovacích roztokov vrátane prípadného použitia rozpúšťadiel alebo dispergantov,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         teplota počas testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         zdroj svetla, intenzita ožiarenia (μE · m– 2 s– 1),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         hodnoty pH testovacích a kontrolných médií, ako aj vzhľad testovacích médií na začiatku a na konci testu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         koncentrácie kyslíka,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metóda analýzy s príslušnými údajmi posúdenia kvality (validačné štúdie, štandardné odchýlky alebo hranice spoľahlivosti analýz),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         metódy stanovenia meraných premenných, napr. dĺžky, suchej hmotnosti, čerstvej hmotnosti,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         všetky odchýlky od tejto testovacej metódy.
                                                      
                                                   
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             
                                                Výsledky
                                             
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         nespracované údaje: dĺžka výhonku a hmotnosť výhonku pre rastliny/kvetináče a iné merané premenné v každej testovacej a kontrolnej nádobe pri každom pozorovaní a analýze podľa harmonogramu hodnotenia uvedeného v tabuľke 1,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         priemery a štandardné odchýlky pre každú meranú premennú,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rastové krivky pre každú koncentráciu,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         čas zdvojnásobenia/rýchlosť rastu v kontrole na základe dĺžky a čerstvej hmotnosti výhonku vrátane variačného koeficientu pre výťažok čerstvej hmotnosti,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         vypočítané hodnoty závisle premenných pre každý ovplyvňovaný replikát s priemernými hodnotami a variačným koeficientom pre replikáty,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         grafické znázornenie vzťahu koncentrácie a účinku,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         odhady sledovaných parametrov toxicity pre závisle premenné, napr. EC50, a príslušné intervaly spoľahlivosti, hodnoty LOEC a/alebo NOEC (ak sa vypočítavajú) a štatistické metódy použité na ich stanovenie,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ak sa použila metóda ANOVA, veľkosť účinku, ktorý možno zistiť (napr. najmenej významný rozdiel),
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         každá stimulácia rastu zistená v akejkoľvek ovplyvňovanej vzorke,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         všetky viditeľné znaky fytotoxicity, ako aj pozorovania testovacích roztokov,
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         rozbor výsledkov vrátane prípadného vplyvu odchýlok od tejto testovacej metódy na výsledok testu.
                                                      
                                                   
                                       
                           LITERATÚRA
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Kapitola C.26 tejto prílohy: Druhy rodu Lemna, test inhibície rastu.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Kapitola C.3 tejto prílohy: Sladkovodné riasy a sinice, test inhibície rastu.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Maltby, L. et al. (2010), Aquatic Macrophyte Risk Assessment for Pesticides, Guidance from the AMRAP Workshop in Wageningen (NL), 14-16 January 2008.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Arts, G.H.P. et al. (2008), Sensitivity of submersed freshwater macrophytes and endpoints in laboratory toxicity tests, Environmental Pollution, Vol. 153, pp. 199-206.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 ISO 16191:2013 Water quality – Determination of the toxic effect of sediment on the growth behaviour of Myriophyllum aquaticum.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Knauer, K. et al. (2006), Methods for assessing the toxicity of herbicides to submersed aquatic plants, Pest Management Science, Vol. 62/8, pp. 715-722.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Kapitola C.50 tejto prílohy: Test toxicity pre Myriophyllum spicatum v systéme bez sedimentu.
                              
                           
                                 (8)
                              
                              
                                 Kapitola C.28 tejto prílohy: Test toxicity chironomidae v systéme sediment – voda za použitia obohatenej vody.
                              
                           
                                 (9)
                              
                              
                                 Ratte, M., H. Ratte (2014), “Myriophyllum Toxicity Test: Result of a ring test using M. aquaticum and M. spicatum grown in a water-sediment system”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 206, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (10)
                              
                              
                                 Davies, J. et al. (2003), Herbicide risk assessment for non-target aquatic plants: sulfosulfuron – a case study, Pest Management Science, Vol. 59/2, pp. 231 – 237.
                              
                           
                                 (11)
                              
                              
                                 OECD (2000), “Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 23, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (12)
                              
                              
                                 Smart, R.M., J.W. Barko (1985), Laboratory culture of submersed freshwater macrophytes on natural sediments, Aquatic Botany, Vol. 21/3, pp. 251-263.
                              
                           
                                 (13)
                              
                              
                                 Christensen, E.R., N. Nyholm (1984), Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves, Environmental Science Technology, Vol. 18/9, pp. 713-718.
                              
                           
                                 (14)
                              
                              
                                 Nyholm, N. et al. (1992), Statistical treatment of data from microbial toxicity tests, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/2, pp. 157-167.
                              
                           
                                 (15)
                              
                              
                                 Bruce, R.D., D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 11/10, 1485-1494.
                              
                           
                                 (16)
                              
                              
                                 OECD (2006), “Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 54, OECD Publishing, Paris.
                              
                           
                                 (17)
                              
                              
                                 Brain, P., R. Cousens (1989), An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses, Weed Research, Vol. 29/2, pp/93-96.
                              
                           
                                 (18)
                              
                              
                                 Norberg-King, T.J. (1988), An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach, National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.
                              
                           
                                 (19)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of the American Statistical Association, Vol. 50/272, pp. 1096-1121.
                              
                           
                                 (20)
                              
                              
                                 Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, Vol. 20/3, pp. 482-491.
                              
                           
                                 (21)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, Vol. 27/1, pp. 103-117.
                              
                           
                                 (22)
                              
                              
                                 Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, Vol. 28/2, pp. 519-531.
                              
                           
                        Dodatok 1
                        
                           ZLOŽENIE SMARTOVHO A BARKOVHO MÉDIA
                        
                        
                                    Zložka
                                 
                                 
                                    Množstvo reagentu pridané do vody (*12) (mg/l)
                                 
                              
                                    CaCl2 · 2 H2O
                                 
                                 
                                    91,7
                                 
                              
                                    MgSO4 · 7 H2O
                                 
                                 
                                    69,0
                                 
                              
                                    NaHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    58,4
                                 
                              
                                    KHCO3
                                    
                                 
                                 
                                    15,4
                                 
                              
                                    pH (rovnováha vzduchu)
                                 
                                 
                                    7,9
                                 
                              
                     
                        Dodatok 2
                        DEFINÍCIE
                        
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Biomasa je čerstvá a/alebo suchá hmotnosť živej hmoty nachádzajúcej sa v populácii. V tomto teste je biomasa súhrn hlavného výhonku, všetkých bočných vetiev a všetkých koreňov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Chemikália je látka alebo zmes.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Chloróza je zmena farby testovacieho organizmu, najmä praslenov, zo zelenej na žltkastú.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       ECx je koncentrácia testovanej chemikálie rozpustenej v testovacom médiu, ktorej dôsledkom je x % (napr. 50 %) zníženie rastu rastliny druhu. Myriophyllum spicatum v rámci stanoveného obdobia expozície (je potrebné výslovne uviesť, ak sa odchyľuje od celkového alebo bežného trvania testu). Na jednoznačné označenie hodnoty EC odvodenej od rýchlosti rastu alebo výťažku sa používa symbol „ErC“ pre rýchlosť rastu a symbol „EyC“ pre výťažok, potom nasleduje použitá meraná premenná, napr. „ErC“ (dĺžka hlavného výhonku).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rast je nárast meranej premennej, napr. dĺžky hlavného výhonku, celkovej dĺžky bočných vetiev, celkovej dĺžky výhonku, celkovej dĺžky koreňa, čerstvej hmotnosti, suchej hmotnosti alebo počtu praslenov, počas obdobia testu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Rýchlosť rastu (priemerná špecifická rýchlosť rastu) je logaritmický nárast meranej premennej počas obdobia expozície. Poznámka: Závisle premenné súvisiace s rýchlosťou rastu sú nezávislé od trvania testu, pokiaľ je rastový model nevystavených kontrolných organizmov exponenciálny.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Najnižšia koncentrácia s pozorovaným účinkom (LOEC) je najnižšia testovaná koncentrácia, pri ktorej sa pozoruje štatisticky významný účinok chemikálie na zníženie rastu (pri p < 0,05) v porovnaní s kontrolou v rámci daného obdobia expozície. Škodlivý účinok všetkých testovaných koncentrácií vyšších ako hodnota LOEC by však mal byť rovnaký alebo väčší ako účinky pozorované pri hodnote LOEC. Ak nie sú splnené tieto dve podmienky, je potrebné poskytnúť úplné vysvetlenie, akým spôsobom sa zvolila hodnota LOEC (a teda aj NOEC).
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Merané premenné sú všetky druhy premenných, ktoré sa merajú na vyjadrenie sledovaného parametra testu s použitím jednej alebo viacerých závisle premenných. V tejto testovacej metóde sú merané premenné dĺžka hlavného výhonku, celková dĺžka bočných vetiev, celková dĺžka výhonku, celková dĺžka koreňa, čerstvá hmotnosť, suchá hmotnosť a počet praslenov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Monokultúra je kultúra s jedným druhom rastliny.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Nekróza je odumreté (t. j. biele alebo tmavohnedé) tkanivo testovacieho organizmu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Koncentrácia bez pozorovaného účinku (NOEC) je testovaná koncentrácia bezprostredne pod úrovňou hodnoty LOEC.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Závisle premenná je premenná slúžiaca na odhadnutie toxicity, ktorá bola odvodená z akejkoľvek meranej premennej opisujúcej biomasu rôznymi metódami výpočtu. V tejto testovacej metóde sú závisle premennými rýchlosť rastu a výťažok, ktoré sú odvodené z meraných premenných, ako sú dĺžka hlavného výhonku, celková dĺžka výhonku, čerstvá hmotnosť, suchá hmotnosť alebo počet praslenov.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Polostatický (obnovovací) test je test, v ktorom sa testovací roztok počas testu pravidelne vymieňa v stanovených intervaloch.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Statický test je testovacia metóda bez obnovy testovacieho roztoku počas testu.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Sledovaný parameter testu je všeobecný faktor, ktorý sa v dôsledku testovanej chemikálie bude meniť v porovnaní s kontrolou ako cieľ testu. V prípade tejto testovacej metódy je sledovaným parametrom testu inhibícia rastu, ktorá sa dá vyjadriť rôznymi závisle premennými založenými na jednej alebo viacerých meraných premenných.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Testovacie médium je kompletné syntetické rastové médium, v ktorom rastú testovacie rastliny vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie. Testovaná chemikália sa v testovacom médiu spravidla rozpustí.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       UVCB je látka neznámeho alebo variabilného zloženia, produkt komplexných reakcií alebo biologický materiál.
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                    
                                       Výťažok je rozdiel hodnoty meranej premennej, ktorá vyjadruje množstvo biomasy, na konci obdobia expozície a hodnoty meranej premennej na začiatku obdobia expozície. Poznámka: Ak je rastový model nevystavených organizmov exponenciálny, závisle premenné založené na výťažku sa budú s dĺžkou trvania testu znižovať.
                                 
                              “
               
            (1)  Žiadna hodnota pri 20 °C nie je k dispozícii, ale možno predpokladať, že variabilita výsledkov merania je vyššia než teplotná závislosť, ktorú možno očakávať.
         
            (2)  Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES. Ú. v. EÚ L 304, 22.11.2007, s. 1.
         
            (3)  Výbor pre overovanie alternatívnych metód „US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods“.
         
            (*1)  Mala by sa zaznamenať oblasť zakalenia rohovky
         
            (4)  Na použitie integrovanej stratégie testovania podráždenia oka podľa REACH pozri aj Usmernenie ECHA k požiadavkám na informácie a k hodnoteniu chemickej bezpečnosti, kapitola R.7a: Usmernenia ku konkrétnemu sledovanému parametru http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf
         
            (5)  Štatistici, ktorí si zvolia vzorový postup, ako napríklad použitie všeobecných lineárnych modelov (General Linear Models, GLM), môžu vykonať analýzu odlišným, no porovnateľným spôsobom, nemusia však nevyhnutne vychádzať z tabuľky ANOVA, ktorá pochádza z obdobia, kedy sa pri výpočte štatistík vypracúvaných v období pred počítačovou érou uplatňovali algoritmické postupy.
         
            (6)  Štatistici, ktorí si zvolia vzorový postup, ako napríklad použitie všeobecných lineárnych modelov (General Linear Models, GLM), môžu vykonať analýzu odlišným, no porovnateľným spôsobom, nemusia však nevyhnutne vychádzať z tabuľky ANOVA, ktorá pochádza z obdobia, kedy sa pri výpočte štatistík vypracúvaných v období pred počítačovou érou uplatňovali algoritmické postupy.
         
            (7)  Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006, Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1.
         
            (8)  Chemické triedy boli stanovené pre každú testovanú chemikáliu s použitím štandardnej klasifikačnej schémy na základe klasifikačného systému National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) (dostupné na http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (9)  Na základe výsledkov očného testu na králikoch in vivo (OECD TG 405) (17) a s použitím GHS OSN (4).
         
            (10)  Klasifikácia v kategóriách 2A alebo 2B závisí od interpretácie kritéria GHS OSN pre rozlišovanie medzi týmito dvoma kategóriami, t. j. 1 z 3 v. 2 z 3 zvierat s účinkami v deň 7 potrebnými na klasifikáciu v kategórii 2A. Do štúdie in vivo boli zahrnuté 3 zvieratá. Všetky sledované parametre s výnimkou začervenania spojoviek v prípade jedného zvieraťa sa do dňa 7 alebo skôr vrátili na nulovú hodnotu. Toto jedno zviera, ktoré sa do dňa 7 v plnej miere nezotavilo, vykazovalo (v deň 7) začervenanie spojoviek s hodnotou 1, ktorá sa v deň 10 úplne vrátila na pôvodnú hodnotu.
         
            (11)  Uvedené rozmery vychádzajú z držiaka rohovky, ktorý sa používa v prípade kráv vo veku od 12 do 60 mesiacov. V prípade, že sa používajú zvieratá vo veku 6 až 12 mesiacov, držiak by sa musel navrhnúť tak, aby každá komora obsiahla objem 4 ml a aby každá vnútorná komora mala priemer 1,5 cm a hĺbku 2,2 cm. Pri novom návrhu držiaka rohovky je veľmi dôležité, aby pomer vystavenej plochy povrchu rohovky k objemu zadnej komory bol taký istý ako tento pomer v prípade tradičného držiaka rohovky. Je to potrebné na to, aby sa zabezpečilo správne určenie hodnôt priepustnosti na výpočet IVIS podľa navrhnutého vzorca.
         
            (12)  Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 z o16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006, Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1.
         
            (*2)  Najvyššia priemerná hodnota nameraná v ktoromkoľvek časovom bode
         
            (*3)  Maximálna priemerná hodnota pozorovaná v ktoromkoľvek časovom bode (založená na hodnotách zákalu uvedených v tabuľke 1).
         
            (*4)  Na základe hodnôt uvedených v tabuľke 2.
         
            (*5)  Výskyt uvedených kombinácií je menej pravdepodobný.
         
            (13)  Chemické triedy boli stanovené pre každú testovanú chemikáliu s použitím štandardnej klasifikačnej schémy na základe klasifikačného systému National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) (dostupné na http//www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (14)  Na základe výsledkov in vivo očného testu na králikoch (OECD TG 405) a s použitím GHS OSN (4)(6).
         
            (15)  Na základe výsledkov testovacej metódy izolovaného kuracieho oka, ako sa uvádza v tabuľke 6.
         
            (16)  Kombinácia výsledkov testovacej metódy izolovaného kuracieho oka, iných ako sú výsledky uvedené v tabuľke 6 týkajúce sa identifikácie chemikálií bez kategórie v zmysle GHS OSN a chemikálií kategórie 1 GHS OSN (pozri tabuľku 6).
         
            (17)  Klasifikácia v kategóriách 2A alebo 2B závisí od interpretácie kritéria GHS OSN pre rozlišovanie medzi týmito dvoma kategóriami, t. j. 1 z 3 v. 2 z 3 zvierat s účinkami v deň 7, potrebného na klasifikáciu v kategórii 2A. Do štúdie in vivo boli zahrnuté 3 zvieratá. Všetky sledované parametre s výnimkou začervenania spojoviek v prípade jedného zvieraťa sa do dňa 7 alebo skôr vrátili na nulovú hodnotu. Toto jedno zviera, ktoré sa do dňa 7 v plnej miere nezotavilo, vykazovalo (v deň 7) začervenanie spojoviek s hodnotou 1, ktoré sa v deň 10 vrátilo na pôvodnú hodnotu.
         
            (18)  Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 No 1907/2006, Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1.
         
            (19)  Priemerná hodnota v celom dokumente znamená aritmetický priemer.
         
            (20)  Tieto číselné údaje sa vzťahujú na štatisticky vygenerované prahové hodnoty a nesúvisia s presnosťou merania.
         
            (21)  Predpoklad DPRA by sa mal zvážiť v rámci IATA a v súlade s ustanoveniami bodov 9 a 12.
         
            (22)  Tieto číselné údaje sa vzťahujú na štatisticky vygenerované prahové hodnoty a nesúvisia s presnosťou merania.
         
            (23)  Predpoklad DPRA by sa mal zvážiť v rámci IATA a v súlade s ustanoveniami bodov 9 a 12.
         
            (24)  Prognózy nebezpečnosti a (potencie) in vivo vychádzajú z údajov LLNA (19). Potencia in vivo je odvodená pomocou kritérií navrhnutých ECETOC (23).
         
            (25)  Prognóza DPRA by sa mala zvážiť v rámci IATA a v súlade s ustanoveniami bodov 9 a 11.
         
            (26)  Rozsahy určené na základe minimálne 10 hodnôt úbytku vytvorených 6 nezávislými laboratóriami.
         
            (27)  Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
         
            (28)  Prognózy nebezpečnosti (a potencie) in vivo vychádzajú z údajov LLNA (13). Potencia in vivo je odvodená pomocou kritérií navrhnutých ECETOC (24).
         
            (29)  Prognóza KeratinoSens™ by sa mala posudzovať v rámci IATA a v súlade s ustanoveniami bodov 9 a 11 tejto testovacej metódy.
         
            (30)  Na základe hodnôt pozorovaných v minulosti (12).
         
            (31)  Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene, doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006 (Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1).
         
            (32)  Chemické triedy boli priradené každej testovanej chemikálii použitím štandardného postupu klasifikácie podľa klasifikačného systému National Library of Medicine Medical Subject Headings – MeSH (dostupnom na http://www.nlm.nih.gov/mesh).
         
            (33)  Na základe výsledkov in vivo testu na očiach králikov (OECDTG 405, TM B.5) a použitím GHS OSN a EÚ CLP.
         
            (34)  Na základe výsledkov zo skúšky FL [protokol INVITTOX č. 71(6)]
         
            (35)  Štatistici používajúci metódu modelovania, akou sú napríklad všeobecné lineárne modely (General Linear Model – GLM), môžu pristupovať k analýze iným, no porovnateľným spôsobom, hoci nemusia nevyhnutne vypracovať tradičnú tabuľku ANOVA, ktorej pôvod siaha k algoritmickým prístupom používaným na výpočet štatistických údajov z obdobia pred nástupom počítačov.
         
            (36)  Definície a jednotky sú uvedené v dodatku 1.
         
            (37)  Niekedy sa označuje aj ako P
            OW; stanovuje sa metódou trepačkovej banky opísanou v TM A.8 (3), metódou HPLC opísanou v TM.24 (4) a metódou pomalého miešania opísanou v TM A.23 (5). Na stanovenie log KOW sa niekedy používa technika generátorových kolón. Existuje istý počet štúdií, v ktorých je táto technika použitá, najmä v prípade chlórovaných bifenylov a dibenzodioxínov (napr. Li and Doucette, 1993) (3). V prípade látok, ktoré môžu ionizovať, by mala log KOW platiť pre neionizovanú formu.
         
            (38)  Definície a jednotky sú uvedené v dodatku 1.
         
            (39)  TLC: chromatografia na tenkej vrstve, HPLC: vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, GC: plynová chromatografia.
         
            (40)  V niektorých regulačných rámcoch môže byť povinné uskutočniť analýzu metabolitov za predpokladu splnenia určitých podmienok (pozri bod 65).
         
            (41)  Vo všeobecnosti by koncentrácie vo vode merané vo fáze vychytávania mali byť aspoň o rádovú hodnotu vyššie ako kvantifikačný limit, aby bolo možné zmerať viac ako jeden polčas záťaže organizmu v depuračnej fáze štúdie.
         
            (42)  Definície a jednotky sú uvedené v dodatku 1.
         
            (43)  Pri väčšine testovaných látok by v ideálnom prípade mala byť voda s kontrolnou skupinou bez nálezov. Pozaďové koncentrácie by mali byť relevantné iba v prípade prirodzene zastúpených materiálov (napr. niektorých kovov) a látok, ktoré sú v životnom prostredí všadeprítomné.
         
            (44)  V prípade zjavného nedodržania kinetiky prvého rádu treba použiť komplexnejšie modely (pozri odkazy na literatúru v dodatku 5) a poradiť sa s bioštatistikom.
         
            (45)  Pri skúške biokoncentrácie sa vychytávanie môže nízkymi expozičnými koncentráciami z dôvodu nízkej rozpustnosti vo vode obmedziť, kým skúškou expozície z potravy možno dosiahnuť ďaleko vyššie expozičné koncentrácie.
         
            (46)  V prípade mnohozložkových látok, UVCB a zmesí by sa pri určovaní vhodných expozičných koncentrácií mala zvážiť rozpustnosť každej zo zastúpených zložiek vo vode.
         
            (47)  TOC sa skladá z organického uhlíka z častíc a rozpusteného organického uhlíka, t. j. TOC = POC + DOC.
         
            (48)  Napriek tomu, že sa takéto použitie vo všeobecnosti neodporúča, tak v prípade, že sa použije rozpúšťadlo alebo solubilizačný prostriedok, mal by sa pri zisťovaní koncentrácie organického uhlíka v testovacích nádobách sčítať organický uhlík pochádzajúci z činidla s organickým uhlíkom z testovanej látky.
         
            (49)  Ak sa obsah lipidov neanalyzuje u tých istých rýb ako testovaná látka, ryby by mali mať aspoň podobnú hmotnosť a (v prípade potreby) aj rovnaké pohlavie.
         
            (50)  Táto alternatíva platí iba vtedy, ak sú ryby zo všetkých testovaných skupín držané v skupinách podobných veľkostí, sú odobrané rovnakým postupom a kŕmené rovnakým spôsobom. Tým sa zabezpečí, že rast rýb vo všetkých testovaných skupinách bude v prípade testovaných koncentrácií pod úrovňou toxicity podobný. Ak je rast podobný, možno očakávať, že podobný bude aj obsah lipidov. Rozdielny rast v kontrolnej skupine by znamenal účinok látky a štúdia by sa stala neplatnou.
         
            (51)  Okrem hmotnosti by sa mala zaznamenať aj celková dĺžka, pretože porovnanie prírastku dĺžky počas testu je dobrým ukazovateľom toho, či nedošlo k nežiaducemu účinku.
         
            (52)  Môže sa vykonať t-skúška rýchlostných konštánt rastu na porovnanie rozdielov rastu medzi kontrolnou a testovanou skupinou, alebo F-skúška v prípade analýzy rozptylu. V prípade potreby môže použitie F-skúšky alebo skúšky miery pravdepodobnosti pomôcť pri výbere vhodného modelu rastu (OECD, monografia 54 (32).
         
            (53)  Tieto percentá naznačujú, že analytické metódy sú spoľahlivé a polčas je < 14 dní. Ak majú analytické metódy menšiu spoľahlivosť, alebo ak je polčas (podstatne) vyšší, budú aj tieto čísla vyššie.
         
            (54)  
         
            CI: interval spoľahlivosti (ak sa dá odhadnúť)
         
            (55)  
         
            SD: štandardná odchýlka (ak sa dá odhadnúť)
         
            (56)  Minimalizovaná skúška sa v skutočnosti môže použiť aj na preukázanie rýchleho metabolizmu, ak je známe, že rýchly metabolizmus môže byť pravdepodobný.
         
            (57)  Ak sa meria iba pri dvoch odberoch, môžu sa odhady hranice spoľahlivosti hodnoty BCFKm dosiahnuť použitím metód opakovaných výberov (bootstrap). Ak sú dostupné aj údaje z odberu uprostred, hranice spoľahlivosti hodnoty BCFKm sa môžu vypočítať tak ako v úplnom teste.
         
            (58)  Definície a jednotky sú uvedené v dodatku 1.
         
            (59)  Na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) (Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1) je táto otázka predmetom dokumentu „Usmernenie k informačným požiadavkám a posudzovaniu chemickej bezpečnosti“, kapitola R.7c, R.7.10.3.1, s. 13; kapitola R.7.10.4.1, s. 31-32 a obrázok R7.10-2, s. 50.
         
            (60)  Pri väčšine testovaných látok by v ideálnom prípade mala byť voda s kontrolnou skupinou bez nálezov. Pozaďové koncentrácie by mali byť relevantné iba v prípade prirodzene zastúpených materiálov (napr. niektorých kovov) a látok, ktoré sú v životnom prostredí všadeprítomné.
         
            (61)  Keďže BMF je definovaný ako pomer medzi koncentráciou látky v organizme k ustálenej koncentrácii látky obsiahnutej v potrave podávanej organizmu, a to pri zohľadnení lipidov opravou hodnoty BMF o obsah lipidov v organizme a v potrave, tento postup sa preto presnejšie označuje ako „oprava“. Ide o iný postup ako „normalizácia“ stanoveného obsahu lipidov v organizme, ktorá platí pre test biokoncentrácie s expozíciou vo vodnom prostredí.
         
            (62)  Celková dĺžka by sa mala počas skúšky zaznamenávať aj preto, že je dobrým ukazovateľom výskytu nežiaduceho účinku.
         
            (63)  HCB je uvedený v prílohách A a C k Štokholmskému dohovoru a v prílohách I a III k nariadeniu (ES) č. 850/2004 o perzistentných organických znečisťujúcich látkach (Ú. v. EÚ L 158, 30.4.2004, s. 7).
         
            (64)  Z dôvodu rýchleho rastu vo vychytávacej fáze bude skutočná kŕmna dávka nižšia ako tá na začiatku testu.
         
            (65)  V skúške expozície vo vodnom prostredí by 14 dňový polčas zodpovedal hodnote BCF okolo 10 000 l/kg u rýb s hmotnosťou 1 g pri rýchlosti vychytávania 500 l/kg za deň [podľa rovnice publikovanej Sijm a kol. (46)].
         
            (66)  Keďže skutočné vnútorné koncentrácie možno určiť až po vykonaní skúšky, je potrebné urobiť odhad očakávanej vnútornej koncentrácie (napr. na základe očakávanej hodnoty BMF a koncentrácie v potrave, pozri rovnicu A5.8 v dodatku 5).
         
            (67)  Prítomnosť testovanej látky v testovacom médiu v dôsledku jej vylučovania rybami alebo vyplavovaním z potravy nie je možné úplne vylúčiť. Jednou z možností je preto merať koncentráciu látky vo vode na konci vychytávacej fázy, najmä ak sa použije polostatický systém, aby sa zistilo, či nedošlo k expozícii vo vodnom prostredí.
         
            (68)  Tento postup je špecifický pre štúdie expozície z potravy a líši sa od postupu pri skúške expozície vo vodnom prostredí. Preto sa namiesto pojmu „normalizácia“ používa pojem „oprava“, aby sa predišlo ich zámene, pozri aj poznámku pod čiarou (37).
         
            (69)  Môže sa vykonať t-skúška rýchlostných konštánt rastu na porovnanie rozdielov rastu medzi kontrolnou a testovanou skupinou, alebo F-skúška v prípade analýzy rozptylu. V prípade potreby môže použitie F-skúšky alebo skúšky miery pravdepodobnosti pomôcť pri výbere vhodného modelu rastu (OECD, monografia 54 (32).
         
            (70)  Metódy analýzy potravín na bielkoviny, tuky, obsah hrubej vlákniny a popola; tieto informácie obyčajne poskytuje dodávateľ krmív.
         
            (71)  
         
            CI: interval spoľahlivosti (ak sa dá zistiť)
         
            (72)  
         
            SD: štandardná odchýlka (ak sa dá zistiť)
         
            (73)  Meyer et al. (1)
         
            (74)  Treba poznamenať, že v samotnom teste sa ako meradlo rýchlostnej konštanty zmien veľkosti a rastu uprednostňuje hmotnosť. Uznáva sa však, že praktickejšou mierou je dĺžka, ak je nutné na začiatku experimentu uskutočniť výber ryby na základe pohľadu (t. j. z danej zásoby populácie).
         
            (75)  Toto dĺžkové rozpätie sa uvádza v testovacích metódach pre nové chemické látky atď. na základe japonského zákona o kontrole chemických látok (CSCL).
         
            (76)  Čísla v zátvorkách udávajú počet vzoriek (vody, rýb), ktoré sa majú odobrať v prípade dodatočného odoberania vzoriek.
         
            (77)  Hodnota k2 odhadnutá pred testovaním pre látky s log K
            OW rovným 4,0 je 0,652 dňa– 1. Celkové trvanie experimentu je 3 × t
            SS = 3 × 4,6 dňa, t. j. 14 dní. Spôsob odhadu t
            SS je uvedený v dodatku 5.
         
            (78)  Vodu odoberajte až po pridaní najmenej troch „objemov testovacej komory“.
         
            (79)  Tieto ryby sa odoberajú zo zásobnej populácie.
         
            (80)  Ak je potrebná väčšia presnosť alebo metabolické štúdie, ktoré si vyžadujú väčšie množstvo rýb, dané ryby by sa mali odoberať špecificky na konci vychytávacej a depuračnej fázy (pozri bod 40).
         
            (81)  Je možné, že na účely analýzy obsahu lipidov budú potrebné aspoň 3 ďalšie ryby, ak nie je možné použiť tie isté ryby, ktoré sa odobrali na účely stanovenia koncentrácií testovanej látky na začiatku testu, na konci vychytávacej fázy a na konci depuračnej fázy. Poznamenávame, že v mnohých prípadoch by malo byť možné používať iba uvedené 3 kontrolné ryby (pozri bod 56).
         
            (82)  Na účely stanovenia koncentrácií testovanej látky a obsahu lipidov sa analyzovali 3 vzorky krmiva z kontrolnej, ako aj testovanej skupiny.
         
            (83)  Ryby sa odoberajú zo zásobnej populácie čo najskôr na začiatku štúdie; na účely stanovenia obsahu lipidov by sa mali na začiatku testu odobrať zo zásobnej populácie aspoň 3 ryby.
         
            (84)  (Nepovinné) Vďaka odberom v ranom štádiu vychytávacej fázy sa získajú údaje slúžiace na výpočet asimilácie testovanej látky prostredníctvom potravy, ktoré možno porovnať s asimilačnou účinnosťou vypočítanou na základe údajov týkajúcich sa depuračnej fázy.
         
            (85)  Analýze špecifických tkanív možno podrobiť 5 ďalších rýb.
         
            (86)  Je možné, že na účely analýzy obsahu lipidov budú potrebné aspoň 3 ďalšie ryby, ak nie je možné použiť tie isté ryby, ktoré sa odobrali na účely stanovenia koncentrácií testovanej látky na začiatku testu, na konci vychytávacej fázy a na konci depuračnej fázy. Poznamenávame, že v mnohých prípadoch by malo byť možné používať iba uvedené 3 kontrolné ryby (pozri body 56 a 153).
         
            (87)  Ako pri všetkých empirických vzťahoch by sa malo overiť, či testovaná látka patrí do oblasti uplatniteľnosti daného vzťahu.
         
            (88)  Hmotnosť rýb na konci vychytávacej fázy možno odhadnúť na základe údajov z predchádzajúcej štúdie alebo na základe poznatkov týkajúcich sa pravdepodobného zvýšenia veľkosti testovaných druhov z typickej hmotnosti na začiatku testovania a v priebehu typického trvania fázy vychytávania (napr. 28 dní).
         
            (89)  Vo väčšine programov, v ktorých je možná lineárna regresia, sa udávajú aj štandardné chyby a interval spoľahlivosti (CI) odhadov, napr. v programe Microsoft Excel sa využíva súbor nástrojov na analýzu údajov.
         
            (90)  Na rozdiel od metódy lineárnej regresie sa na základe tohto vzorca nevypočíta štandardná chyba pre konštantu k 2.
         
            (91)  Na rozdiel od postupu lineárneho fitovania sa na základe tejto metódy zvyčajne nezistí štandardná chyba ani interval spoľahlivosti pre odhadovanú konštantu k1.
         
            (92)  Treba si uvedomiť si, že neistota odhadu konštanty k2 sa pri modeli bioakumulácie nevyužíva správne, keď sa tento model v zásade považuje za konštantný pri fitovaní konštanty k1 v rámci metódy postupného fitovania. Výsledná neistota BCF sa preto bude pri simultánnej metóde a metóde postupného fitovania líšiť.
         
            (93)  Je možné, že v niektorých regiónoch sa dá získať len krmivo pre ryby s koncentráciu lipidov, ktorá zďaleka nedosahuje túto hornú hranicu. V takých prípadoch by sa v štúdii malo použiť krmivo v dodávanej forme, s nižšou koncentráciou lipidov, pričom by sa kŕmna dávka mala primerane upraviť s cieľom zachovať zdravie rýb. Obsah lipidov v potrave by sa nemal umelo zvyšovať pridávaním oleja.
         
            (94)  Pokiaľ ide o veľmi hydrofóbne látky, je pravdepodobné, že vo voľnej prírode dochádza k najzávažnejším expozíciám vo vodnom prostredí najmä v dôsledku ich požitia. Preto odhad BCF striktne nereprezentuje bioakumulačný potenciál takejto látky.
         
            (95)  Použiť sa môžu aj iné druhy dafnií za podmienky, že spĺňajú príslušné validačné kritériá (v rámci kontrol by kritérium validity týkajúce sa reprodukčného výstupu malo platiť pre všetky pre druhy dafnií.) V prípade použitia iných druhov čeľade dafniovité by sa mal daný druh jasne identifikovať a jeho použitie opodstatniť.
         
            (96)  Náhodná úmrtnosť: úmrtnosť, ktorá nesúvisí s pôsobením chemikálie, ale k nej došlo v dôsledku náhodnej udalosti (t. j. príčina je známa)
         
            (97)  Mimovoľná úmrtnosť: úmrtnosť bez známej príčiny, ktorá nesúvisí s pôsobením chemikálie
         
            (*6)  Označte, ktorá nádoba sa použila na experiment
         
            (*7)  Do príslušnej kolónky zaznamenajte pod značkou „AB“ počet nevyliahnutých vajíčok
         
            (*8)  Do príslušnej kolónky zaznamenajte pod značkou „M“ úmrtnosť všetkých rodičovských jedincov
         
            (98)  Typická minimálna priemerná celková dĺžka nie je kritériom validity, ale odchýlky pod uvedenou hodnotou by sa mali dôkladne preskúmať vo vzťahu k citlivosti testu. Minimálna priemerná celková dĺžka je odvodená z výberu aktuálne dostupných údajov.
         
            (99)  Konkrétny kmeň testovaného pstruha dúhového si môže vyžadovať použitie iných teplôt. Chov generačných rýb sa musí držať pri rovnakej teplote ako násada, ktorá sa má použiť na vajíčka. Po získaní vajíčok od komerčného chovateľa je po príchode potrebná krátka adaptácia (napr. 1 – 2 hod.) na testovaciu teplotu.
         
            (100)  Tma pre larvy až do jedného týždňa po vyliahnutí okrem vykonávania kontroly, následne tlmené osvetlenie počas celého testu (12 – 16-hodinová fotoperióda) (4).
         
            (101)  Pri akýchkoľvek podmienkach testu by mal byť režim osvetlenia konštantný.
         
            (102)  V prípade akéhokoľvek testu sa to vykoná do ± 20/00.
         
            (*9)  Potrava by sa mala podávať až do nasýtenia. Nadbytočná potrava a výkaly by sa mali podľa potreby odstrániť, aby sa nehromadil odpad.
         
                     FBS
                  
                  
                     mrazené žiabronôžky soľné; dospelé jedince Artemia sp.
                  
               
                     BSN
                  
                  
                     nauplia žiabronôžok soľných; novo vyliahnuté
                  
               
                     BSN48
                  
                  
                     nauplia žiabronôžok soľných; 48 hodín staré
                  
               
            (1)  larvy so žĺtkovým vakom si nevyžadujú žiadnu potravu
         
            (2)  filtrované zo zmiešanej kultúry
         
            (3)  granule z fermentačného procesu
         
            (*10)  Papilárne výbežky sa spravidla vyskytujú len u dospelých samcov a nachádzajú sa na lúčoch análnej plutvy od druhého po siedmy alebo ôsmy, počítajúc od zadného konca análnej plutvy (obrázok 1 a 2). Výbežky sa však len zriedka vyskytujú na prvom lúči od zadného konca análnej plutvy. Tento štandardný operačný postup sa vzťahuje na meranie výbežkov na prvom lúči plutvy (poradové číslo lúča análnej plutvy sa v rámci tohto štandardného operačného postupu vzťahuje na poradie od zadného konca análnej plutvy).
         
            (*11)  Homogenizačný tlmivý roztok:
         
                     —
                  
                  
                     (50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % zmes inhibítora proteázy (Sigma)): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl zmes inhibítora proteázy.
                  
               
                     —
                  
                  
                     TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN) napríklad od Bie & Berntsen, Dánsko.
                  
               
                     —
                  
                  
                     zmes inhibítora proteázy: od Sigma (pre tkanivá cicavcov), číslo výrobku P 8340.
                  
               
            POZNÁMKA: Homogenizačný tlmivý roztok by sa mal použiť v deň, keď bol pripravený. Počas použitia musí byť uložený na ľade.
         
            (103)  Carl von Linné (* 23. mája 1707, Råshult /Älmhult; † 10. januára1778, Uppsala).
         
            (*12)  demineralizovaná (t. j. destilovaná alebo deionizovaná) voda