CELEX: 32014R0900
Language: hr
Date: 2014-07-15
Title: Uredba Komisije (EU) br. 900/2014 оd 15. srpnja 2014 . o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku  Tekst značajan za EGP

21.8.2014   
            
            
               HR
            
            
               Službeni list Europske unije
            
            
               L 247/1
            
         UREDBA KOMISIJE (EU) br. 900/2014
   оd 15. srpnja 2014.
   o izmjeni Uredbe (EZ) br. 440/2008 o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) radi prilagodbe tehničkom napretku
   (Tekst značajan za EGP)
   EUROPSKA KOMISIJA,
   uzimajući u obzir Ugovor o funkcioniranju Europske unije,
   uzimajući u obzir Uredbu (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća od 18. prosinca 2006. o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) i osnivanju Europske agencije za kemikalije te o izmjeni Direktive 1999/45/EZ i stavljanju izvan snage Uredbe Vijeća (EEZ) br. 793/93 i Uredbe Komisije (EZ) br. 1488/94, kao i Direktive Vijeća 76/769/EEZ i direktiva Komisije 91/155/EEZ, 93/67/EEZ, 93/105/EZ i 2000/21/EZ (1), a posebno njezin članak 13. stavak 2.,
   budući da:
   
               (1)
            
            
               Uredba Komisije (EZ) br. 440/2008 (2) sadržava ispitne metode za određivanje fizikalno-kemijskih svojstava, toksičnosti i ekotoksičnosti tvari koje se primjenjuju u smislu Uredbe (EZ) br. 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Uredbu (EZ) br. 440/2008 potrebno je ažurirati kako bi se u nju prioritetno uključile nove i ažurirane ispitne metode koje je nedavno donio OECD radi prilagodbe tehničkom napretku i radi smanjenja broja životinja koje se koriste u pokusima u skladu s Direktivom 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća (3). O nacrtu je provedeno savjetovanje sa zainteresiranim stranama.
            
         
               (3)
            
            
               Ta prilagodba tehničkom napretku obuhvaća šest novih ispitnih metoda za utvrđivanje toksičnosti i drugih učinaka na zdravlje, uključujući studiju razvojne neurotoksičnosti, produljenu studiju reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji, transgenske analize mutacije gena glodavaca in vivo, ispitivanje in vitro radi procjene učinaka na sintezu steroidnih hormona te dvije metode in vivo za procjenu estrogenih i (anti)androgenih učinaka.
            
         
               (4)
            
            
               Uredbu (EZ) br. 440/2008 potrebno je stoga na odgovarajući način izmijeniti.
            
         
               (5)
            
            
               Mjere predviđene ovom Uredbom u skladu su s mišljenjem Odbora osnovanog u skladu s člankom 133. Uredbe (EZ) br. 1907/2006,
            
         DONIJELA JE OVU UREDBU:
   Članak 1.
   Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se u skladu s Prilogom ovoj Uredbi.
   Članak 2.
   Ova Uredba stupa na snagu trećeg dana od dana objave u Službenom listu Europske unije.
   
      Ova je Uredba u cijelosti obvezujuća i izravno se primjenjuje u svim državama članicama.
      Sastavljeno u Bruxellesu 15. srpnja 2014.
      
         
            Za Komisiju
         
         
            Predsjednik
         
         José Manuel BARROSO
      
   
   
      (1)  SL L 396, 30.12.2006., str. 1.
   
   
      (2)  Uredba (EZ) br. 440/2008 od 30. svibnja 2008. o utvrđivanju ispitnih metoda u skladu s Uredbom (EZ) br. 1907/2006 Europskog parlamenta i Vijeća o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) (SL L 142, 31.5.2008., str. 1.).
   
      (3)  Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (SL L 276, 20.10.2010., str. 33.).
   
      PRILOG
      Prilog Uredbi (EZ) br. 440/2008 mijenja se kako slijedi:
      Umeću se poglavlja B.53., B.54., B.55., B.56., B.57. i B.58.:
      
         „B.53.   STUDIJA RAZVOJNE NEUROTOKSIČNOSTI
         
         UVOD
         1.   Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 426 (2007). U lipnju 1995. radna skupina OECD-a za reproduktivnu i razvojnu toksičnost raspravljala je u Kopenhagenu o potrebi za ažuriranjem postojećih smjernica OECD-a za ispitivanje reproduktivne i razvojne toksičnosti te razvojem novih smjernica za krajnje točke koje još nisu obuhvaćene (1). Radna skupina preporučila je da se smjernica za ispitivanje razvojne neurotoksičnosti sastavi na temelju smjernice Agencije za zaštitu okoliša SAD-a (USEPA) koja je od tada revidirana (2). U lipnju 1996. u Kopenhagenu je održano drugo savjetovanje na kojem je tajništvo obaviješteno o nacrtu nove smjernice za ispitivanje razvojne neurotoksičnosti, uključujući glavne elemente poput, primjerice, pojedinosti o odabiru životinjskih vrsta, razdoblja doziranja, razdoblja ispitivanja, krajnjih točaka koje treba procijeniti i kriterija za vrednovanje rezultata. Američka smjernica za procjenu rizika od neurotoksičnosti objavljena je 1998. (3). U listopadu 2000. održani su, jedno za drugim, stručno savjetovanje OECD-a i radionica Instituta za znanost o riziku Međunarodnog instituta za znanost o životu (ILSI), a 2005. u Tokiju je održano stručno savjetovanje. Ti su sastanci održani kako bi se raspravljalo o znanstvenim i tehničkim pitanjima povezanima s postojećom smjernicom za ispitivanje te su kod razvoja ove ispitne metode razmotrene preporuke s tih sastanaka (4) (5) (6) (7). Dodatne informacije o provedbi, tumačenju i terminologiji upotrijebljenoj za ovu ispitnu metodu nalaze se u Smjernicama OECD-a br. 43‚Ispitivanje i procjena reproduktivne toksičnosti’ (8) i br. 20‚Ispitivanje neurotoksičnosti’ (9).
         UVODNA RAZMATRANJA
         2.   Poznato je da brojne kemikalije imaju učinke razvojne neurotoksičnosti u ljudi i drugih vrsta (10) (11) (12) (13). Za procjenu i vrednovanje toksičnih svojstava određene kemikalije može biti potrebno utvrđivanje potencijala razvojne neurotoksičnosti. Studije razvojne neurotoksičnosti namijenjene su osiguravanju podataka, uključujući karakterizacije doza-reakcija, o mogućim funkcionalnim i morfološkim učincima na živčani sustav potomaka u razvoju koji mogu nastati zbog izloženosti u maternici i u ranoj fazi života.
         3.   Studija razvojne neurotoksičnosti može se provesti kao zasebna studija, kao dio studije reproduktivne toksičnosti i/ili neurotoksičnosti u odrasloj dobi (primjerice, ispitne metode B.34. (14), B.35. (15), B.43. (16)) ili kao dodatak studiji prenatalne razvojne toksičnosti (primjerice, ispitna metoda B.31. (17)). Ako je studija razvojne neurotoksičnosti dio druge studije ili njezin dodatak, ključno je očuvati cjelovitost obiju vrsta studija. Sva bi ispitivanja trebala biti u skladu s primjenjivim zakonodavstvom ili državnim i institucionalnim smjernicama za upotrebu laboratorijskih životinja u istraživanju (primjerice, 18).
         4.   Prije početka studije ispitni laboratorij trebao bi razmotriti sve dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji. Takve će informacije uključivati identitet i kemijsku strukturu kemikalije, njezina fizikalno-kemijska svojstva, rezultate svih ostalih ispitivanja toksičnosti kemikalije in vitro ili in vivo, toksikološke podatke o strukturno povezanim kemikalijama te planiranu upotrebu (planirane upotrebe) kemikalije. Te su informacije nužne kako bi se svim zainteresiranim stranama dokazalo da je ispitivanje bitno za zaštitu zdravlja ljudi te će pomoći u odabiru odgovarajuće početne doze.
         NAČELO ISPITNE METODE
         5.   Ispitivana kemikalija daje se životinjama tijekom gestacije i laktacije. Ženke se ispituju radi procjene učinaka u ženki koje su skotne i koje doje te radi mogućih usporednih informacija (ženke u usporedbi s potomcima). Potomci se nasumično biraju iz legala radi vrednovanja neurotoksičnosti. Vrednovanje se sastoji od opažanja radi otkrivanja velikih neuroloških abnormalnosti i abnormalnosti u ponašanju, uključujući procjenu fizičkog razvoja, bihevioralnu ontogenezu, motoričku aktivnost, motoričke i osjetilne funkcije te učenje i pamćenje te vrednovanja težine mozga i neuropatologije tijekom postnatalnog razvoja i u odrasloj dobi.
         6.   Ako se ispitna metoda provodi kao zasebna studija, dodatne dostupne životinje u svakoj skupini mogle bi se upotrebljavati za posebne neurobihevioralne, neuropatološke, neurokemijske ili elektrofiziološke postupke kojima se mogu dopuniti podaci dobiveni pregledima koji se preporučuju ovom ispitnom metodom (16) (19) (20) (21). Dopunski postupci mogu biti osobito korisni kada empirijsko opažanje, očekivani učinci ili mehanizam/način funkcioniranja ukazuju na posebnu vrstu neurotoksičnosti. Ti dopunski postupci mogu se upotrebljavati u ženki i u mladunaca. Osim toga, mogu se upotrebljavati i postupci ex vivo ili in vitro sve dok ne utječu na cjelovitost postupaka in vivo.
         PRIPREME ZA ISPITIVANJE
         
            Odabir životinjskih vrsta
         
         7.   Štakor je poželjna ispitna vrsta. Ostale se vrste mogu upotrebljavati prema potrebi. Međutim, treba uzeti u obzir da su gestacijski i postnatalni dani navedeni u ovoj ispitnoj metodi specifični za često upotrebljavane sojeve štakora te bi u slučaju upotrebe drugih vrsta ili neuobičajenog soja trebalo odabrati usporedive dane. Upotrebu druge vrste trebalo bi obrazložiti na temelju toksikoloških, farmakokinetičkih i/ili ostalih podataka. U obrazloženju bi trebalo navesti dostupnost postnatalnih neurobihevioralnih i neuropatoloških procjena specifičnih za vrstu. Ako postoji prethodno ispitivanje koje je izazvalo zabrinutost, trebalo bi razmotriti vrstu/soj koji su izazvali zabrinutost. Zbog različitih atributa učinka različitih sojeva štakora trebali bi postojati dokazi da soj koji je odabran za upotrebu ima odgovarajuću plodnost i reakciju. Trebalo bi dokumentirati pouzdanost i osjetljivost ostalih vrsta kod utvrđivanja razvojne neurotoksičnosti.
         
            Uvjeti smještaja i hranjenja
         
         8.   Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 ± 3 °C. Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50–60 %. Svjetlost bi trebala biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Prije parenja i tijekom trajanja studije moguće je i obrnuti ciklus svjetlosti kako bi se procijenile funkcionalne i bihevioralne krajnje točke tijekom razdoblja tame (pod crvenim svjetlom), odnosno tijekom razdoblja uobičajene aktivnosti životinja (22). Sve promjene ciklusa svjetlo-tama trebale bi uključivati odgovarajuće razdoblje prilagodbe kako bi se životinje prilagodile na novi ciklus. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana s neograničenom količinom vode za piće. Trebalo bi navesti vrstu hrane i vode te bi ih trebalo analizirati s obzirom na kontaminate.
         9.   Životinje se mogu smjestiti odvojeno ili držati u kavezima u malim skupinama istog spola. Postupci parenja trebali bi se odvijati u kavezima koji odgovaraju toj svrsi. Nakon što je očito da je došlo do kopulacije ili najkasnije na 15. dan graviditeta životinje koje su se parile treba smjestiti u posebne kaveze za okot ili materinstvo. Kaveze treba urediti tako da se eventualni učinci držanja u kavezu svedu na minimum. Pred termin parturicije skotnim ženkama treba osigurati odgovarajući i utvrđeni materijal za pravljenje gnijezda. Poznato je da neodgovarajuće rukovanje ili stres tijekom graviditeta može imati nepovoljne ishode, uključujući prenatalni gubitak i izmijenjeni fetalni i postnatalni razvoj. Radi zaštite od fetalnoga gubitka zbog faktora nevezanih uz tretiranje, tijekom graviditeta životinjama treba pažljivo rukovati te treba izbjegavati stres izazvan vanjskim faktorima kao što je prekomjerna buka.
         
            Priprema životinja
         
         10.   Treba upotrebljavati zdrave životinje koje su se prilagodile laboratorijskim uvjetima i koje ranije nisu bile podvrgavane eksperimentalnim postupcima, osim ako je studija dio druge studije (vidjeti stavak 3.). Ispitne životinje treba okarakterizirati u pogledu vrste, soja, spola, mase i starosti. Svakoj životinji treba dodijeliti jedinstveni identifikacijski broj i označiti je njime. Životinje u svim ispitnim skupinama trebale bi u najvećoj mogućoj mjeri biti ujednačene mase i starosti te unutar uobičajenog raspona vrste i soja koji se ispituju. Za svaku visinu doze treba upotrebljavati mlade odrasle ženke koje još nisu imale potomstvo. Potrebno je osigurati izbjegavanje parenja između braće i sestara. Nulti dan gestacije dan je kad se opazi vaginalni čep i/ili sperma. Nakon nabave već gravidnih životinja od dobavljača treba predvidjeti odgovarajuće razdoblje prilagodbe (primjerice 2 do 3 dana). Parene ženke treba nasumično i u najvećoj mogućoj mjeri ravnomjerno rasporediti u kontrole skupine i skupine za tretiranje (npr., preporučuje se stratificirani nasumični postupak kako bi se osigurao ravnomjeran raspored u svim skupinama poput postupka na temelju tjelesne mase). Ženke koje je oplodio isti mužjak treba ujednačeno rasporediti po skupinama.
         POSTUPAK
         
            Broj i spol životinja
         
         11.   Svaka ispitna i kontrolna skupina treba sadržavati dovoljan broj skotnih ženki koje treba izložiti ispitivanoj kemikaliji kako bi se osiguralo da se okoti odgovarajući broj potomaka za vrednovanje neurotoksičnosti. Za svaku visinu doze preporučuje se ukupno 20 legala. Dopušteni su ponovljeni i postupni planovi doziranja skupinama ako se postigne ukupan broj legala po skupini te ako se u obrazloženju ponavljanja upotrebljavaju odgovarajući statistički modeli.
         12.   Na 4. postnatalni dan (PND) ili prije njega (dan okota je nulti postnatalni dan) veličina svakog legla trebala bi se prilagoditi uklanjanjem dodatnih mladunaca slučajnim odabirom kako bi se postigla ista veličina svih legala (23). Veličina legla ne bi trebala premašivati prosječnu veličinu legla za upotrijebljeni soj glodavaca (8–12). Leglo bi po mogućnosti, trebalo imati jednak broj muških i ženskih mladunaca. Selektivno uklanjanje mladunaca, primjerice prema tjelesnoj masi, nije prihvatljivo. Nakon standardizacije legala (izdvajanje) i prije daljnjeg ispitivanja funkcionalnih krajnjih točaka pojedinačne mladunce koji su određeni za ispitivanje prije ili nakon odbijanja od sise trebalo bi jedinstveno identificirati s pomoću neke odgovarajuće humane metode identifikacije mladunaca (primjerice 24).
         
            Raspodjela životinja za funkcionalna i bihevioralna ispitivanja, vrednovanje težine mozga i neuropatološko vrednovanje
         
         13.   Ispitnom metodom omogućeni su različiti pristupi u pogledu raspodjele životinja izloženih in utero i laktacijom za funkcionalna i bihevioralna ispitivanja, spolno sazrijevanje, utvrđivanje težine mozga i neuropatološko vrednovanje (25). Ostala ispitivanja neurobihevioralne funkcije (npr. društveno ponašanje), neurokemije ili neuropatologije mogu se dodavati u pojedinačnim slučajevima sve dok nije narušena cjelovitost izvornih nužnih ispitivanja.
         14.   Mladunci se biraju iz svake skupine koja je primila određenu dozu te se raspoređuju za procjene krajnjih točaka na 4. postnatalni dan ili nakon njega. Mladunce po mogućnosti, treba birati tako da su oba spola iz svakog legla u svakoj skupini koja prima određenu dozu jednako zastupljena u svim ispitivanjima. Kod ispitivanja motoričke aktivnosti isti par muških i ženskih mladunaca treba ispitivati u svim dobima prije odbijanja od sise (vidjeti stavak 35.). Pri svim ostalim ispitivanjima isti ili zasebni parovi muških i ženskih životinja mogu se rasporediti za različita bihevioralna ispitivanja. Različite mladunce će možda trebati rasporediti za ispitivanja kognitivne funkcije u životinja koje se odbijaju od sise i odraslih životinja kako bi se izbjeglo miješanje učinaka dobi i ranijeg treninga na te vrijednosti (26) (27). Nakon odbijanja od sise (21. postnatalni dan) mladunci koji nisu odabrani za ispitivanje mogu se humano usmrtiti. Treba zabilježiti sve promjene u raspodjeli mladunaca. Statistička mjerna jedinica trebala bi biti leglo (ili ženka), a ne mladunac.
         15.   Postoje različiti načini raspodjele mladunaca za preglede prije i nakon odbijanja od sise, kognitivna ispitivanja, patološke preglede itd. (vidjeti sliku 1. za opći plan i Dodatak 1. za primjere raspodjele). Preporučen je minimalan broj životinja u svakoj skupini koja prima određenu dozu za preglede prije i nakon odbijanja od sise kako slijedi:
         
                     Klinička opažanja i tjelesna masa
                  
                  
                     Sve životinje
                  
               
                     Detaljna klinička opažanja
                  
                  
                     20/spol (1/spol/leglo)
                  
               
                     Težina mozga (nakon fiksacije) 11–22. PND
                  
                  
                     10/spol (1/leglo)
                  
               
                     Težina mozga (nefiksiranog) ~ 70. PDN
                  
                  
                     10/spol (1/leglo)
                  
               
                     Neuropatologija (uranjanje ili perfuzijska fiksacija) 11–22. PND
                  
                  
                     10/spol (1/leglo)
                  
               
                     Neuropatologija (perfuzijska fiksacija) 70. PND
                  
                  
                     10/spol (1/leglo)
                  
               
                     Spolno sazrijevanje
                  
                  
                     20/spol (1/spol/leglo)
                  
               
                     Ostale razvojne posebnosti (opcija)
                  
                  
                     Sve životinje
                  
               
                     Bihevioralna ontogeneza
                  
                  
                     20/spol (1/spol/leglo)
                  
               
                     Motorička aktivnost
                  
                  
                     20/spol (1/spol/leglo)
                  
               
                     Motorička i osjetilna funkcija
                  
                  
                     20/spol (1/spol/leglo)
                  
               
                     Učenje i pamćenje
                  
                  
                     10/spol (1) (1/leglo)
                  
               
            Doziranje
         
         16.   Upotrebljavaju se najmanje tri visine doze i paralelna kontrola. Doze različitih visina treba primijeniti u određenim vremenskim razmacima kako bi se dobila gradacija toksičkog učinka. Osim u slučaju ograničenja zbog fizikalno-kemijske prirode ili bioloških svojstava kemikalije, treba odabrati najvišu dozu s ciljem izazivanja određene toksičnosti u majke (npr. kliničkih znakova, smanjenja porasta tjelesne mase (najviše 10 %) i/ili dokaza o toksičnosti na ciljnom organu zbog koje se mora ograničiti doza). Visoka doza može se ograničiti na 1 000 mg/kg/dan tjelesne mase, uz neke iznimke. Primjerice, očekivana izloženost ljudi može ukazati na potrebu za primjenom više doze. U suprotnom, trebalo bi provesti pokusne studije ili preliminarne studije za određivanje raspona kako bi se utvrdila najviša doza koju treba upotrebljavati koja bi trebala izazvati minimalni stupanj toksičnosti u majke. Ako je standardnom studijom razvojne toksičnosti ili pokusnom studijom dokazano da je ispitivana kemikalija razvojno toksična, najviša bi doza trebala biti maksimalna doza kojom se neće izazvati prekomjerna toksičnost u potomaka, smrt in utero ili neonatalna smrt ili malformacije, dostatna za isključivanje smislenog vrednovanja neurotoksičnosti. Najnižom dozom trebalo bi nastojati ne proizvesti nikakav dokaz toksičnosti niti za majku niti za plod u razvoju, uključujući neurotoksičnost. Kako bi se predočile sve reakcije povezane s dozom i doza kod koje nije zamijećen štetni učinak (NOAEL), treba odabrati niz sve nižih doza ili doze blizu granice detekcije kojima bi se omogućilo utvrđivanje referentne doze. Za utvrđivanje sve nižih razina doza često je najbolje doze primijeniti u dva do četiri kraća intervala te je često bolje dodati četvrtu skupinu koja prima određenu dozu nego između dva doziranja imati jako dugi interval (npr. gdje je faktor veći od 10).
         17.   Visine doza treba birati uzimajući u obzir sve postojeće podatke o toksičnosti, kao i dodatne informacije o metabolizmu i toksikinetici ispitivane kemikalije ili srodnih materijala. Te informacije isto tako mogu biti korisne kod dokazivanja primjerenosti režima doziranja. Izravno doziranje mladuncima treba razmotriti na temelju informacija o izloženosti i farmakokinetičkih informacija (28) (29). Prije provođenja studija o izravnom doziranju treba pažljivo razmotriti koristi i nedostatke (30).
         18.   Usporedna kontrolna skupina treba biti placebo kontrolna skupina ili kontrolna skupina tretirana samo nosačem ako se kod primjene ispitivane kemikalije upotrebljava nosač. Svim životinjama treba obično dati isti volumen ispitivane kemikalije ili nosača na temelju tjelesne mase. Ako se radi lakšeg doziranja upotrebljava nosač ili drugi aditiv, treba uzeti u obzir sljedeće karakteristike: učinke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili zadržavanje ispitivane kemikalije, učinke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koji mogu izmijeniti njezine toksične karakteristike te učinke na potrošnju hrane i vode ili nutritivno stanje životinja. Nosač ne bi smio dovesti do učinaka koji bi mogli ometati tumačenje studije i ne bi smio biti neurobihevioralno toksičan te imati učinke na reprodukciju ili razvoj. Pri novim nosačima, osim skupine tretirane nosačem, treba uključiti i kontrolnu skupinu tretiranu placebom. Sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati na jednak način kao sa životinjama u ispitnoj skupini.
         
            Primjena doza
         
         19.   Ispitivana kemikalija ili nosač trebali bi se primijeniti na način koji je najsličniji mogućoj izloženosti ljudi te na temelju dostupnih informacija o metabolizmu i distribuciji pri ispitnim životinjama. Treba općenito upotrebljavati oralni put primjene (npr. sondom, u hrani ili vodi za piće), ali se mogu primijeniti i drugi načini primjene (npr. dermalno, inhalacijom) ovisno o karakteristikama i očekivanim ili poznatim načinima izloženosti ljudi (daljnje smjernice nalaze se u Smjernici 43 (8)). Treba obrazložiti odabrani način primjene. Ispitivanu kemikaliju treba primjenjivati svakog dana po prilici u isto vrijeme.
         20.   Doza koja se daje svakoj životinji u pravilu uobičajeno bi se trebala temeljiti na najnovijem određivanju pojedinačne tjelesne mase. Međutim, pri prilagođavanju doza tijekom posljednjeg tromjesečja graviditeta potreban je oprez. Ako se pri tretiranim ženkama opazi previsoka toksičnost, te životinje treba humano usmrtiti.
         21.   Ispitivana kemikalija ili nosač trebali bi se davati barem jednom dnevno parenim ženkama od trenutka implantacije (6. dan gestacije) i tijekom laktacije (21. PND) tako da mladunci budu izloženi ispitivanoj kemikaliji tijekom prenatalnog i postnatalnog neurološkog razvoja. Dob u kojoj počinje doziranje te trajanje i učestalost doziranja mogu se prilagoditi ako postoje dokazi o planu pokusa koji je relevantniji za izloženost ljudi. Trajanja doziranja trebalo bi prilagoditi za ostale vrste kako bi se osigurala izloženost tijekom svih ranih razdoblja razvoja mozga (odnosno ekvivalentnih prenatalnom i ranom postnatalnom rastu ljudskog mozga). Doziranje može započeti od početka graviditeta (nulti gestacijski dan), iako treba razmotriti potencijal ispitivane kemikalije da uzrokuje predimplantacijski gubitak. Početkom primjene na šesti gestacijski dan taj bi se rizik izbjegao, ali se ne bi tretirale razvojne faze između nultog i šestoga gestacijskog dana. Ako laboratorij kupi već parene životinje, nepraktično je započeti doziranje na nulti gestacijski dan te bi stoga šesti gestacijski dan bio dobar početni dan. Ispitni bi laboratorij trebao odrediti režim doziranja u skladu s relevantnim informacijama o učincima ispitivane kemikalije, ranijim iskustvima i logističkim aspektima, što može uključivati produljenje doziranja nakon odbijanja od sise. Doziranje se ne bi trebalo obaviti na dan parturicije u onih životinja u kojih okot potomaka nije dovršen. Općenito, pretpostavlja se da će do izloženosti mladunaca doći majčinim mlijekom. Međutim, izravno doziranje mladuncima trebalo bi razmotriti u slučajevima nepostojanja dokaza o stalnoj izloženosti potomaka. Dokazi o stalnoj izloženosti mogu se naći, primjerice, u farmakokinetičkim informacijama, toksičnosti u potomaka ili promjenama u biomarkerima (28).
         OPAŽANJA
         
            Opažanja u ženki
         
         22.   Opažanja s obzirom na zdravstveno stanje, uključujući pobolijevanje i smrtnost, trebala bi se provoditi na svim ženkama najmanje jednom dnevno.
         23.   Tijekom razdoblja tretmana i opažanja trebalo bi periodično provoditi detaljnija klinička opažanja (najmanje dvaput tijekom gestacijskog razdoblja doziranja i dvaput tijekom laktacijskog razdoblja doziranja) upotrebom najmanje deset ženski po visini doze. Životinje bi izvan kaveza u kojem inače borave trebali promatrati obučeni tehničari koji nemaju informacija o tretmanu životinja upotrebom standardiziranih postupaka kako bi se ublažili stres u životinja i pristranost promatrača te maksimizirala njihova pouzdanost. Savjetuje se da, po mogućnosti, isti tehničar provodi opažanja u predmetnoj studiji.
         24.   Treba bilježiti pojavu opaženih znakova. Kad god je to moguće, treba zabilježiti i jačinu opaženih znakova. Kliničkim opažanjima treba obuhvatiti, ali ne ih ograničiti na, promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, na pojavu iscjedaka i autonomne aktivnosti (npr. lakrimacija, piloerekcija, veličina zjenica, nepravilnosti u disanju i/ili disanje na usta i svi neuobičajeni znaci uriniranja ili defekacije).
         25.   Isto tako treba zabilježiti i sve neuobičajene reakcije s obzirom na položaj tijela, razinu aktivnosti (npr. povećana ili smanjena upotreba standardnog prostora) i koordinaciju pokreta. Treba zabilježiti i promjene u hodu (npr. šepanje, ataksija), držanju (primjerice, zgrbljenost) i reakciju na manipulaciju, postavljanje ili druge podražaje okoline kao i pojavu kloničnih ili toničnih pokreta, konvulzija ili tremora, stereotipnog ponašanja (npr. prekomjerno njegovanje dlake, neobični pokreti glave, stalno kretanje u krug) ili čudnog ponašanja (npr. griženje ili pretjerano lizanje, samoranjavanje, hodanje unatrag, vokalizacija) ili agresiju.
         26.   Treba zabilježiti znakove toksičnosti, uključujući početni dan, doba dana, stupanj i trajanje.
         27.   Životinje bi trebalo izvagati u trenutku doziranja najmanje jednom tjedno tijekom studije, na dan okota ili oko njega te na 21. PND (odbijanje od sise). Pri studijama u kojima se primjenjuje hranjenje na sondu ženke bi trebalo vagati najmanje dvaput tjedno. Doze bi, prema potrebi, trebalo prilagoditi u trenutku svakog utvrđivanja tjelesne mase. Unos hrane trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno tijekom gestacije i laktacije. Unos vode trebalo bi mjeriti najmanje jednom tjedno ako do izloženosti dolazi opskrbom vodom.
         
            Opažanja u potomaka
         
         28.   Svi bi se potomci trebalo pažljivo promatrati najmanje jednom dnevno radi znakova toksičnosti te pobolijevanja i smrtnosti.
         29.   Tijekom razdoblja tretmana i opažanja trebalo bi provoditi detaljnija klinička opažanja potomaka. Potomke (najmanje jedan mladunac po spolu i po leglu) bi trebali promatrati obučeni tehničari koji nemaju informacija o tretmanu životinja upotrebom standardiziranih postupaka kako bi se ublažila pristranost te maksimizirala pouzdanost promatrača. Savjetuje se da, po mogućnosti, isti tehničar provodi opažanja. Po potrebi bi trebalo pratiti barem krajnje točke opisane u stavcima 24. i 25. za razvojnu fazu koja se promatra.
         30.   Treba zabilježiti sve znakove toksičnosti u potomaka, uključujući početni dan, doba dana, stupanj i trajanje.
         
            Fizičke i razvojne posebnosti
         
         31.   Promjene u razvojnim posebnostima prije odbijanja od sise (npr. odvajanje uške, otvaranje očiju, izbijanje sjekutića) blisko su povezane s tjelesnom masom (30) (31). Tjelesna masa može biti najbolji pokazatelj fizičkog razvoja. Zato se mjerenje razvojnih posebnosti preporučuje samo kad postoje raniji dokazi da će te krajnje točke pružiti dodatne informacije. Trenutak za procjenu tih parametara navodi se u tablici 1. Ovisno o očekivanim učincima i rezultatima početnih mjerenja, može se savjetovati dodavanje dodatnih vremenskih točaka ili obavljanje mjerenja u drugim razvojnim fazama.
         32.   Pri procjeni fizičkog razvoja savjetuje se upotreba postkoitalne dobi umjesto postnatalne dobi (33). Ako se mladunci ispituju na dan odbijanja od sise, preporučuje se da se ispitivanje obavi prije odbijanja od sise kako bi se izbjegao zbunjujući učinak stresa povezanog s odbijanjem od sise. Osim toga, dva dana nakon odbijanja od sise ne bi trebalo obavljati nikakva ispitivanja mladunaca nakon odbijanja od sise.
         
            Tablica 1.
         
         
            Trenutak procjene fizičkih i razvojnih posebnosti te funkcionalnih/bihevioralnih krajnjih točaka
             (2)
         
         
                     Dob
                     Krajnje točke
                  
                  
                     Prije odbijanja od sise (3)
                     
                  
                  
                     Adolescencija (3)
                     
                  
                  
                     Mlada odrasla dob (3)
                     
                  
               
                     
                        Fizičke i razvojne posebnosti
                     
                  
               
                     Tjelesna masa i klinička opažanja
                  
                  
                     jednom tjedno (4)
                     
                  
                  
                     najmanje svaka dva tjedna
                  
                  
                     najmanje svaka dva tjedna
                  
               
                     Težina mozga
                  
                  
                     22. PND (5)
                     
                  
                  
                     na završetku
                  
               
                     Neuropatologija
                  
                  
                     22. PND (5)
                     
                  
                  
                     na završetku
                  
               
                     Spolno sazrijevanje
                  
                  
                     —
                  
                  
                     prema potrebi
                  
                  
                     —
                  
               
                     Ostale razvojne posebnosti (6)
                     
                  
                  
                     prema potrebi
                  
                  
                     —
                  
                  
                     —
                  
               
                     
                        Funkcionalne/bihevioralne krajnje točke
                     
                  
               
                     Bihevioralna ontogeneza
                  
                  
                     Najmanje dvije vrijednosti
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
               
                     Motorička aktivnost (uključujući habituaciju)
                  
                  
                     1–3 puta (7)
                     
                  
                  
                     —
                  
                  
                     jednom
                  
               
                     Motorička i osjetilna funkcija
                  
                  
                     —
                  
                  
                     jednom
                  
                  
                     jednom
                  
               
                     Učenje i pamćenje
                  
                  
                     —
                  
                  
                     jednom
                  
                  
                     jednom
                  
               33.   Trebalo bi utvrditi broj i spol živih mladunaca, npr. vizualnim pregledom ili mjerenjem anogenitalnog razmaka (34) (35), a svaki bi se mladunac iz legla trebao pojedinačno izvagati pri okotu i ubrzo nakon njega, najmanje jednom tjedno tijekom laktacije te najmanje jednom svaka dva tjedna nakon toga. Kod vrednovanja spolnog sazrijevanja za najmanje jednog mužjaka i najmanje jednu ženku po leglu trebalo bi utvrditi dob i tjelesnu masu životinje kad dođe do vaginalne prohodnosti (36) ili razdvajanja prepucija (37).
         
            Bihevioralna ontogeneza
         
         34.   Ontogeneza odabranih ponašanja trebala bi se mjeriti u najmanje jednog mladunca po spolu i po leglu tijekom odgovarajuće dobi, pri čemu se isti mladunci upotrebljavaju svih dana ispitivanja za sva ponašanja koja se procjenjuju. Dani u kojima se obavljaju mjerenja trebali bi biti ravnomjerno raspoređeni tijekom tog razdoblja kako bi se utvrdilo uobičajeno ponašanje ili promjena povezana s tretmanom u ontogenezi tog ponašanja (38). U nastavku su navedeni neki primjeri ponašanja čija se ontogeneza mogla procijeniti: refleks uspravljanja, negativna geotaksija i motorička aktivnost (38)(39)(40).
         
            Motorička aktivnost
         
         35.   Motoričku aktivnost treba pratiti (41) (42) (43) (44) (45) tijekom razdoblja prije odbijanja od sise i odrasle dobi. Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise vidjeti stavak 32. Ispitivanje bi trebalo trajati dovoljno dugo da se pokaže navikavanje tijekom ispitivanja kod netretiranih kontrolnih skupina. Osobito se preporučuje upotreba motoričke aktivnosti za procjenu bihevioralne ontogeneze. Ako se ono upotrebljava kao ispitivanje bihevioralne ontogeneze, tada bi se za ispitivanje trebale upotrebljavati iste životinje kod svih ispitivanja prije odbijanja od sise. Ispitivanje bi trebalo provoditi dovoljno često kako bi se procijenila ontogeneza habituacije tijekom ispitivanja (44). To može značiti tri vremenska razdoblja ili više njih prije dana odbijanja od sise, uključujući i taj dan (npr. 13., 17., 21. PND). Ispitivanje istih životinja ili članova legla trebalo bi se obaviti i u odrasloj dobi blizu završetka studije (npr. 60. do 70. PND). Ispitivanje u dodatnim danima može se obaviti prema potrebi. Motorička aktivnost trebala bi se pratiti automatskim aparatom za bilježenje aktivnosti kojim se može utvrditi povećanje i smanjenje aktivnosti (odnosno osnovna aktivnosti koju uređaj mjeri ne bi smjela biti toliko niska da to spriječi utvrđivanje smanjenja niti toliko visoka da to spriječi utvrđivanje povećanja aktivnosti). Svaki bi se uređaj trebao ispitati standardnim postupcima kako bi se u najvećoj mogućoj mjeri osigurala pouzdanost rada svih uređaja i u sve dane. Tretirane skupine bi u najvećoj mogućoj mjeri trebalo rasporediti na sve uređaje. Svaka bi se životinja trebala ispitivati pojedinačno. Tretirane skupine trebale bi biti raspoređene na sva vremena ispitivanja kako bi se izbjeglo zbunjivanje zbog cirkadijurnih ritmova aktivnosti. Trebalo bi nastojati da varijacije ispitnih uvjeta budu minimalne te da nisu sustavno povezane s tretiranjem. Među varijablama koje mogu utjecati na brojne vrijednosti ponašanja, uključujući motoričku aktivnost, nalaze se razina buke, veličina i oblik ispitnog kaveza, temperatura, relativna vlažnost, svjetlosni uvjeti, mirisi, upotreba kaveza u kojem životinje inače borave ili novog ispitnog kaveza te distrakcije iz okoline.
         
            Motorička i osjetilna funkcija
         
         36.   Motorička i osjetilna funkcija trebala bi se detaljno ispitivati najmanje jednom u adolescentnoj dobi te jednom tijekom razdoblja rane odrasle dobi (npr. 60. do 70. PND). Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise vidjeti stavak 32. Treba provesti dovoljno ispitivanja kako bi se osiguralo odgovarajuće količinsko uzorkovanje osjetilnih modaliteta (npr. somatosenzorni, vestibularni) i motoričkih funkcija (npr. snaga, koordinacija). Neki su primjeri ispitivanja motoričke i osjetilne funkcije refleks pružanja ekstenzora (46), refleks uspravljanja (47) (48), habituacija na iznenadnu buku (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54) i evocirani potencijali (55).
         
            Ispitivanja učenja i pamćenja
         
         37.   Trebalo bi provesti ispitivanje asocijativnog učenja i pamćenja nakon odbijanja od sise (npr. 25. dan ± 2) i u mladih odraslih životinja (60. PND i starijih). Za ispitivanje u vrijeme odbijanja od sise vidjeti stavak 32. Ista ili zasebna ispitivanja mogu se upotrijebiti u ovim dvjema fazama razvoja. Dopušta se određena fleksibilnost kod odabira ispitivanja učenja i pamćenja u štakora koji se odbijaju od sise i odraslih štakora. Međutim, ispitivanja bi trebala biti oblikovana tako da se ispune dva kriterija. Kao prvo, učenje bi se trebalo procjenjivati kao promjena među nekoliko ponovljenih postupaka učenja ili prilikom ispitivanja koja uključuju jedan postupak učenja s upućivanjem na uvjet kojim se kontroliraju neasocijativni učinci iskustva učenja. Kao drugo, ispitivanja bi trebala uključivati neku vrstu mjerne vrijednosti pamćenja (kratkoročnog ili dugoročnog) osim izvornog učenja (stjecanja), ali se ona ne može navesti zbog izostanka mjerne vrijednosti stjecanja dobivene istim ispitivanjem. Ako se ispitivanjima učenja i pamćenja otkrije učinak ispitivane kemikalije, mogu se razmotriti dodatna ispitivanja kako bi se isključila alternativna tumačenja na temelju promjena u osjetilnim, motivacijskim i/ili motoričkim sposobnostima. Uz gornja dva kriterija, preporučuje se odabir ispitivanja učenja i pamćenja na temelju njegove dokazane osjetljivosti na klasu opasnosti kemikalije koja se ispituje, ako su takve informacije dostupne u literaturi. U izostanku takvih informacija primjeri ispitivanja koja bi mogla ispuniti gornje kriterije uključuju pasivno izbjegavanje (43) (56) (57), zakašnjeli dolazak na položaj u odraslih štakora (58) i u mladih štakora (59), olfaktorno kondicioniranje (43) (60), Morrisov vodeni labirint (61) (62) (63), labirint vrste Biel ili Cincinnati (64) (65), labirint s radijalnim kracima (66), labirint u obliku slova T (43) te stjecanje i zadržavanje ponašanja kontroliranog rasporedom (26) (67) (68). Dodatna ispitivanja opisana su u literaturi za štakore koji se odbijaju od sise (26) (27) i odrasle štakore (19) (20).
         
            Pregled post-mortem
         
         38.   Majke se može eutanazirati nakon odbijanja potomaka od sise.
         39.   Neuropatološko vrednovanje potomaka obavit će se s pomoću tkiva životinja koje su humano usmrćene 22. postnatalnog dana ili ranije u razdoblju između 11. i 22. postnatalnog dana, kao i nakon završetka studije. U potomaka usmrćenih do 22. postnatalnog dana trebalo bi vrednovati moždana tkiva, a u životinja usmrćenih po završetku studije tkiva središnjeg i perifernog živčanog sustava. Životinje usmrćene na 22. PND ili ranije mogu se fiksirati uranjanjem ili perfuzijom. Životinje usmrćene nakon završetka studije trebale bi se fiksirati perfuzijom. Svi aspekti pripreme uzoraka tkiva, od perfuzije životinja, preko disekcije uzoraka tkiva, obrada tkiva te bojenje preparata trebali bi se obaviti prema uravnoteženom planu tako da svaka serija uključuje reprezentativne uzorke svake skupine koja je primala određenu dozu. Dodatne smjernice o neuropatologiji nalaze se u OECD-ovoj Smjernici br. 20 (9), vidjeti i (103).
         
            Obrada uzoraka tkiva
         
         40.   Treba zabilježiti sve velike abnormalnosti vidljive u trenutku nekropsije. Uzeti uzorci tkiva trebali bi predstavljati sve glavne regije živčanog sustava. Uzorci tkiva trebali bi se čuvati u odgovarajućem fiksativu i obraditi prema standardiziranim objavljenim histološkim protokolima (69) (70) (71) (103). Uklapanje u parafin prihvatljivo je za tkiva središnjeg i perifernog živčanog sustava, ali upotreba osmija nakon fiksacije, uz uklapanje u epoksi-smolu, može biti primjerena ako je potreban viši stupanj rezolucije (npr. za periferne živce kad se sumnja na perifernu neuropatiju i/ili za morfometrijsku analizu perifernih živaca). Moždano tkivo prikupljeno za morfometrijsku analizu trebalo bi uklopiti u odgovarajući medij na svim visinama doze u isto vrijeme kako bi se izbjegli artefakti skupljanja koji mogu biti povezani s produljenim stajanjem u fiksativu (6).
         
            Neuropatološki pregled
         
         41.   Svrha kvalitativnih pregleda je:
         
                     i.
                  
                  
                     utvrditi regije živčanog sustava pri kojima su uočljivi dokazi neuropatoloških promjena;
                  
               
                     ii.
                  
                  
                     utvrditi vrste neuropatoloških promjena koje su posljedica izloženosti ispitivanoj kemikaliji;
                  
               
                     iii.
                  
                  
                     utvrditi raspon težine neuropatoloških promjena.
                  
               Odgovarajuće osposobljeni patolog trebao bi mikroskopski pregledati reprezentativne histološke sekcije uzoraka tkiva radi dokazivanja neuropatoloških promjena. Svim neuropatološkim promjenama treba dodijeliti subjektivnu ocjenu kojom se opisuje njihova težina. Bojenje hematoksilinom i eozinom može biti dostatno za vrednovanje sekcija mozga životinja koje su humano usmrćene 22. postnatalnog dana ili ranije. Međutim, bojenje mijelina (npr. luxol fast plavom/cresyl ljubičastom) i bojenje srebrom (npr. Bielschowskyjevom ili Bodianovom bojom) preporučuju se kod sekcija tkiva središnjeg i perifernog živčanog sustava životinja usmrćenih nakon završetka studije. U skladu sa stručnom prosudbom patologa i vrstom uočenih promjena druge se boje mogu smatrati primjerenima za identifikaciju i karakterizaciju određenih vrsta promjena (npr. glijalni fibrilarni kiseli protein (GFAP) ili histokemija lektina za procjenu glijalnih i mikroglijalnih promjena (72), fluoro-žad za utvrđivanje nekroze (73) (74) ili srebrno bojenje specifično za neuralnu degeneraciju (75)).
         42.   Morfometričko (količinsko) vrednovanje trebalo bi se obaviti jer ti podaci mogu biti korisni kod utvrđivanja učinka koji je povezan s tretiranjem te tumačenja razlika povezanih s tretiranjem u težini ili morfologiji mozga (76) (77). Uzorci tkiva živčanog sustava trebaju se uzeti i pripremiti kako bi se omogućilo morfometričko vrednovanje. Morfometrička vrednovanja mogu uključivati npr. linearna ili prostorna mjerenja određenih regija mozga (78). Za linearna ili prostorna mjerenja potrebna je upotreba homolognih sekcija koje su pažljivo odabrane na temelju pouzdanih mikroskopskih posebnosti (6). Stereologija se može upotrebljavati za identifikaciju učinaka povezanih s tretiranjem na parametre poput volumena ili broja stanica za specifične neuroanatomske regije (79) (80) (81) (82) (83) (84).
         43.   Mozgove treba pregledati radi dokazivanja svih neuropatoloških promjena povezanih s tretiranjem te treba uzeti odgovarajuće uzorke iz svih glavnih regija mozga (npr. iz olfaktornog bulbusa, cerebralnog korteksa, hipokampusa, bazalnih ganglija, talamusa, hipotalamusa, srednjeg mozga (krova, tegmentuma i moždanih krakova), mosta, produžene moždine, malog mozga) kako bi se osigurao temeljit pregled. Važno je da se sekcije u svih životinja uzimaju u istoj ravnini. U odraslih životinja koje su humano usmrćene nakon završetka studije trebalo bi uzeti uzorak reprezentativnih sekcija leđne moždine i perifernog živčanog sustava. Pregledana područja trebala bi uključivati oko s vidnim živcem i mrežnicu, leđnu moždinu na cervikalnom i lumbarnom zadebljanju, dorzalne i ventralne korjenove, proksimalni ishijadični živac, proksimalni tibijalni živac (na koljenu) i ogranke tibijalnog živca u lisnom mišiću. Sekcije leđne moždine i perifernog živca trebale bi obuhvatiti i poprečne ili dijagonalne i uzdužne sekcije.
         44.   Neuropatološko vrednovanje trebalo bi uključivati pregled radi utvrđivanja naznaka razvojnih oštećenja živčanog sustava (6) (85) (86) (87) (88) (89), uz stanične promjene (npr. neuronska vakuolacija, degeneracija, nekroza) i promjene tkiva (npr. glioza, infiltracija leukocita, nastanak cista). U tom je pogledu važno razlikovati učinke povezane s tretiranjem od uobičajenih razvojnih događaja za koje je poznato da se odvijaju u razvojnoj fazi koja odgovara trenutku usmrćivanja (90). Primjeri znatnih promjena koje ukazuju na razvojni inzult uključuju, ali se ne ograničavaju na:
         
                     —
                  
                  
                     promjene u veličini ili obliku olfaktornog bulbusa, mozga ili malog mozga,
                  
               
                     —
                  
                  
                     promjene u relativnoj veličini različitih regija mozga, uključujući smanjenja ili povećanja veličine regija koje su posljedica gubitka ili postojanosti uobičajeno prolaznih populacija stanica ili aksonalnih projekcija (npr. vanjski zametni sloj cerebeluma, žuljevito tijelo),
                  
               
                     —
                  
                  
                     promjene u proliferaciji, migraciji i diferencijaciji na što upućuju područja prekomjerne apoptoze ili nekroze, nakupine ili raspršene populacije ektopijskih stanica, dezorijentirani ili malformirani neuroni ili promjene u relativnoj veličini različitih slojeva kortikalnih struktura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     promjene u uzorcima mijelinacije, uključujući ukupno smanjenje veličine ili promijenjeno bojenje mijeliniranih struktura,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dokaze hidrocefalusa, osobito povećanje klijetki, stenozu cerebralnog akvedukta i stanjivanje moždanih polutki.
                  
               
            Analiza odnosa doza-reakcija neuropatoloških promjena
         
         45.   Sljedeći se fazni postupak preporučuje za kvalitativnu i kvantitativnu neuropatološku analizu. Kao prvo, sekcije iz skupine koja je primala visoku dozu uspoređuju se sa sekcijama kontrolne skupine. Ako nema dokaza o neuropatološkim promjenama u životinja iz skupine koja je primala visoku dozu, nije potrebna daljnja analiza. Ako postoje dokazi o neuropatološkim promjenama u skupini koja je primala visoku dozu, pregledavaju se životinje iz skupina koje su primale srednju odnosno nisku dozu. Ako se skupina koja je primala visoku dozu uništi zbog smrti ili druge zbunjujuće toksičnosti, trebalo bi analizirati skupine koje su primale visoke odnosno srednje doze radi neuropatoloških promjena. Ako je u skupina koje su primale niže doze uočena neuropatologija, potrebno je obaviti neuropatološku analizu tih skupina. Ako se pri kvalitativnom ili kvantitativnom pregledu utvrde bilo kakve neuropatološke promjene povezane s tretiranjem, na temelju vrednovanja svih životinja iz svih skupina koje su primale određenu dozu trebalo bi utvrditi ovisnost pojave o dozi, učestalost i stupanj težine lezija ili morfometričkih promjena. Tim vrednovanjem treba obuhvatiti sve regije mozga kod kojih su uočeni dokazi o neuropatološkim promjenama. Za svaku vrstu lezija treba opisati obilježja koja se upotrebljavaju za utvrđivanje svih stupnjeva težine, navodeći svojstva za razlikovanje svakog stupnja. Treba zabilježiti učestalost pojave svake vrste lezije i njezin stupanj težine te izvršiti statističku analizu kako bi se ocijenila priroda odnosa doza-reakcija. Preporučuje se upotreba kodiranih mikroskopskih preparata (91).
         PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
         
            Podaci
         
         46.   Podaci bi se trebali dostavljati pojedinačno i sažeti u tablici navođenjem za svaku ispitnu skupinu vrste promjena i broja ženki, potomaka po spolu te legla kod kojih je uočena svaka vrsta promjene. Ako je izvršeno izravno postnatalno izlaganje potomaka, treba zabilježiti način, trajanje i razdoblje izloženosti.
         
            Vrednovanje i tumačenje rezultata
         
         47.   Studija razvojne neurotoksičnosti pružit će informacije o učincima višekratnog izlaganja kemikaliji tijekom razvoja in utero i ranog postnatalnog razvoja. Kako je naglasak stavljen i na opću toksičnost i na krajnje točke razvojne neurotoksičnosti, rezultati studije omogućit će razlikovanje neurorazvojnih učinaka koji se javljaju u izostanku opće toksičnosti u majke i onih koji se javljaju samo kod doza koje su toksične i za majku. Zahvaljujući složenom međuodnosu dizajna studije, statističke analize i biološkog značaja podataka odgovarajuće tumačenje podataka o razvojnoj neurotoksičnosti uključivat će stručno mišljenje (107) (109). Pri tumačenju rezultata ispitivanja treba upotrebljavati pristup koji se temelji na važnosti dokaza (20) (92) (93) (94). Treba raspravljati o uzorcima bihevioralnih ili morfoloških nalaza, ako postoje, kao i dokazima u pogledu doze-reakcije. U tu karakterizaciju treba uključiti podatke iz svih studija relevantnih za vrednovanje razvojne neurotoksičnosti, uključujući epidemiološke studije na ljudima ili izvješća o slučajevima te eksperimentalnih studija na životinjama (npr. toksokinetičke podatke, informacije o odnosu strukture i djelovanja, podatke iz drugih studija toksičnosti). To uključuje i odnos između doza ispitivane kemikalije i prisutnosti ili izostanka, pojave i opsega svih neurotoksičnih učinaka kod svakog spola (20) (95).
         48.   Vrednovanjem podataka treba obuhvatiti i raspravu o biološkoj i statističkoj značajnosti. Statistička analiza trebala bi se smatrati alatom kojim se usmjerava, a ne utvrđuje tumačenje podataka. Izostanak statističke značajnosti ne bi trebao biti jedini razlog za zaključak o izostanku učinka povezanog s tretiranjem, kao što ni statistička značajnost ne bi trebala biti jedino opravdanje za zaključak o učinku povezanom s tretiranjem. Kako bi se spriječili mogući lažno negativni nalazi i inherentne poteškoće pri ‚dokazivanju negativnog nalaza’, trebalo bi razmotriti dostupne pozitivne i povijesne kontrolne podatke, osobito ako nema učinaka povezanih s tretiranjem (102) (106). Vjerojatnost lažno negativnih nalaza trebalo bi razmotriti u smislu ukupnog statističkog vrednovanja podataka (96). Vrednovanje bi trebalo uključivati odnos, ako postoji, između uočenih neuropatoloških i bihevioralnih promjena.
         49.   Sve bi rezultate trebalo analizirati s pomoću statističkih modela koji odgovaraju planu pokusa (108). Odabir parametrijske ili neparametrijske analize treba obrazložiti uzimajući u obzir čimbenike poput prirode podataka (transformirani ili netransformirani) i njihove distribucije, kao i relativne robusnosti odabrane statističke analize. Odabir statističke analize trebao bi se temeljiti na svrsi i dizajnu studije kako bi se pogreške vrste I. (lažno pozitivni nalazi) i vrste II. (lažno negativni nalazi) svele na najmanju moguću mjeru (96) (97) (104) (105). Statističkim modelom razvojnih studija u kojima se upotrebljavaju vrste koje mogu okotiti više mladunaca u kojima se ispituje više mladunaca iz legla trebala bi biti obuhvaćena legla kako bi se spriječio porast stopa pogrešaka vrste I. (98) (99) (100) (101). Statistička mjerna jedinica trebala bi biti leglo, a ne mladunac. Pokusi bi se trebali provoditi tako da se članovi istog legla ne tretiraju kao neovisna opažanja. Sve krajnje točke koje su višekratno izmjerene kod istog predmeta pokusa trebale bi se analizirati s pomoću statističkih modela kojima se uzima u obzir činjenica da te izmjerene vrijednosti nisu neovisne.
         
            Izvješće o ispitivanju
         
         50.   Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sljedeće informacije:
         
            Ispitivana kemikalija
         
         
                     —
                  
                  
                     fizikalna svojstva, i prema potrebi, fiziokemijska svojstva,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci za identifikaciju, uključujući podrijetlo,
                  
               
                     —
                  
                  
                     čistoća pripravka te poznate i/ili očekivane nečistoć.,
                  
               
            Nosač (prema potrebi)
         
         
                     —
                  
                  
                     obrazloženje za odabir nosača, ako nije riječ o vodi ili fiziološkoj otopini.
                  
               
            Pokusne životinje
         
         
                     —
                  
                  
                     upotrijebljena vrsta i soj te obrazloženje ako se ne radi o štakorima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dobavljač pokusnih životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj, starost na početku ispitivanja i spol životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana, voda itd.,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinačna tjelesna masa životinja na početku ispitivanja.
                  
               
            Uvjeti ispitivanja
         
         
                     —
                  
                  
                     podloge za odabir visine doze,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podloge za način doziranja i vremensko razdoblje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     specifikacije primijenjenih doza, uključujući pojedinosti o nosaču, volumenu i fizičkom obliku primijenjenog materijala,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije/pripravku u hrani, postignutoj koncentraciji, stabilnosti i homogenosti pripravka,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metoda za jedinstvenu identifikaciju ženki i potomaka,
                  
               
                     —
                  
                  
                     detaljan opis postupaka slučajnog odabira za raspodjelu ženki u skupine za tretiranje, za odabir mladunaca za izdvajanje te za raspodjelu mladunaca u ispitne skupine,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     način preračunavanja koncentracije ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće ili inhalatu (ppm) u stvarnu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), prema potrebi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     okolišni uvjeti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (npr. iz slavine, destilirana),
                  
               
                     —
                  
                  
                     datum početka i završetka studije.
                  
               
            Opažanja i ispitni postupci
         
         
                     —
                  
                  
                     detaljan opis postupaka upotrijebljenih za standardizaciju opažanja i postupaka, kao i operativne definicije za bodovanje opažanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     popis svih upotrijebljenih ispitnih postupaka i obrazloženje za njihovu upotrebu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o upotrijebljenim bihevioralnim/funkcionalnim, patološkim, neurokemijskim ili elektrofiziološkim postupcima, uključujući informacije i pojedinosti o automatskim uređajima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     postupci za kalibriranje i osiguranje istovjetnosti uređaja i ujednačavanje skupina za tretiranje u ispitnim postupcima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kratko obrazloženje svih odluka koje uključuju stručno mišljenje.
                  
               
            Rezultati (pojedinačni i sažeti, uključujući srednje vrijednosti i varijance prema potrebi)
         
         
                     —
                  
                  
                     broj životinja na početku i na završetku studije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj životinja i legala upotrijebljenih za svaku ispitnu metodu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     identifikacijski broj svake životinje i leglo iz kojeg potječe,
                  
               
                     —
                  
                  
                     veličina legla i srednja težina pri okotu i po spolu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tjelesna masa i podaci o promjeni tjelesne mase, uključujući tjelesnu masu ženki i potomaka kod usmrćenja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o unosu hrane te, prema potrebi, o unosu vode (npr. ako se ispitivana kemikalija daje s vodom),
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o toksičnoj reakciji po spolu i visini doze, uključujući znakove toksičnosti ili smrtnost, uključujući vrijeme i uzrok smrti, prema potrebi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     priroda, težina, trajanje, dan početka, doba dana te naknadni tijek detaljnih kliničkih opažanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     bodovanje svake razvojne posebnosti (težina, spolno sazrijevanje i bihevioralna ontogeneza) u svim vremenima opažanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     detaljan opis svih bihevioralnih, funkcionalnih, neuropatoloških, neurokemijskih i elektrofizioloških nalaza po spolu, uključujući povećanja i smanjenja u usporedbi s kontrolnim skupinama,
                  
               
                     —
                  
                  
                     nalazi nekropsije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     težina mozga,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sve dijagnoze postavljene na temelju neuroloških znakova i lezija, uključujući prirodne bolesti ili stanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     slike egzemplarnih nalaza,
                  
               
                     —
                  
                  
                     mikroskopske slike za procjenu homologije sekcija upotrijebljenih za morfometriju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o apsorpciji i metabolizmu, uključujući komplementarne podatke iz zasebne toksokinetičke studije, ako su dostupni,
                  
               
                     —
                  
                  
                     statistička analiza rezultata, uključujući statističke modele upotrijebljene za analizu podataka te rezultati neovisno o tome jesu li značajni ili ne,
                  
               
                     —
                  
                  
                     popis osoblja koje je sudjelovalo u studiji, uključujući stručno usavršavanje.
                  
               
            Rasprava o rezultatima
         
         
                     —
                  
                  
                     informacije o dozi-reakciji po spolu i skupini,
                  
               
                     —
                  
                  
                     utjecaj ostalih toksičnih učinaka na zaključak o neurotoksičnom potencijalu ispitivane kemikalije po spolu i skupini,
                  
               
                     —
                  
                  
                     utjecaj toksokinetičkih informacija na zaključke,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sličnosti učinaka s učincima poznatih neurotoksičnih tvari,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci kojima se potvrđuje pouzdanost i osjetljivost ispitne metode (npr. pozitivni i povijesni kontrolni podaci),
                  
               
                     —
                  
                  
                     odnosi, ako postoje, između neuropatoloških i funkcionalnih učinaka,
                  
               
                     —
                  
                  
                     vrijednosti kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL) ili referentna doza za ženke i potomke po spolu i skupini.
                  
               
            Zaključci
         
         
                     —
                  
                  
                     rasprava o sveukupnom tumačenju podataka na temelju rezultata, uključujući zaključak o tome je li razvojna neurotoksičnost posljedica ispitivane kemikalije ili ne te o vrijednostima kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL).
                  
               
            LITERATURA
         
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD (1995.). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenhagen, Danska, od 13. do 14. lipnja 1995.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     US EPA (1998.). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Dostupno na: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     US EPA (1998.). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Dostupno na: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001.). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79. 91.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001.). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101. 111.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001.). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93. 100.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     OECD (2003.). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., SAD, od 23. do 25. listopada 2000.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     OECD (2008.). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Pariz. srpanj 2008. Dostupno na: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     OECD (2003.). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Pariz, rujan 2003. Dostupno na: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990.) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000.) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002.) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188..197.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998.) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Poglavlje B.34. ovog Priloga, Studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Poglavlje B.35. ovog Priloga, Studija reproduktivne toksičnosti na dvije generacije.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Poglavlje B.43. ovog Priloga, Studija neurotoksičnosti kod glodavaca.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Poglavlje B.31. ovog Priloga, Studija prenatalne razvojne toksičnosti.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe. SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
                     
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     WHO (1986.) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Dostupno na: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     WHO (2001.) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Dostupno na: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Chang, L.W., Slikker, W. (1995.) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997.) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499. 509.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997.) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2. 6.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977.) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989.) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118. 136.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979.) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987.) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Zoetis, T., Walls, I. (2003.) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.
                  
               
                  
                     (29)
                  
                  
                     Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005.) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87. 94.
                  
               
                  
                     (30)
                  
                  
                     Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999.) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1. 4.
                  
               
                  
                     (31)
                  
                  
                     ICH (1993.) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.
                  
               
                  
                     (32)
                  
                  
                     Lochry, E.A. (1987.) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433. 439.
                  
               
                  
                     (33)
                  
                  
                     Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998.) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449. 457.
                  
               
                  
                     (34)
                  
                  
                     Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999.) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383. 390.
                  
               
                  
                     (35)
                  
                  
                     Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000.) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350. 365.
                  
               
                  
                     (36)
                  
                  
                     Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985.) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579. - 586.
                  
               
                  
                     (37)
                  
                  
                     Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977.) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298. 303.
                  
               
                  
                     (38)
                  
                  
                     Spear, L.P. (1990.) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489. - 95.
                  
               
                  
                     (39)
                  
                  
                     Altman, J., Sudarshan, K. (1975.) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896. 920.
                  
               
                  
                     (40)
                  
                  
                     Adams, J. (1986.) Methods in Behavioral Teratology. U: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67. 100.
                  
               
                  
                     (41)
                  
                  
                     Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979.) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53. 66.
                  
               
                  
                     (42)
                  
                  
                     Robbins, T.W. (1977.) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, str. 37. 82.
                  
               
                  
                     (43)
                  
                  
                     Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993.) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117. - 129.
                  
               
                  
                     (44)
                  
                  
                     Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985.) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247. - 260.
                  
               
                  
                     (45)
                  
                  
                     Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991.) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599. 609.
                  
               
                  
                     (46)
                  
                  
                     Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997.) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405. 411.
                  
               
                  
                     (47)
                  
                  
                     Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998.) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals. Physiol. Behav., 64:661. 669.
                  
               
                  
                     (48)
                  
                  
                     Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977.) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589. 591.
                  
               
                  
                     (49)
                  
                  
                     Davis, M. (1984.) The mammalian startle response. U: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, str. 287. 351.
                  
               
                  
                     (50)
                  
                  
                     Koch, M. (1999.) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107. 128.
                  
               
                  
                     (51)
                  
                  
                     Crofton, K.M. (1992.) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. U Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, str. 181. 211.
                  
               
                  
                     (52)
                  
                  
                     Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989.) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199. 211.
                  
               
                  
                     (53)
                  
                  
                     Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994.) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25. – 30.
                  
               
                  
                     (54)
                  
                  
                     Ison, J.R. (1984.) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437. – 445.
                  
               
                  
                     (55)
                  
                  
                     Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992.) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. U: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. str. 125. 145.
                  
               
                  
                     (56)
                  
                  
                     Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990.) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321. 332.
                  
               
                  
                     (57)
                  
                  
                     Bammer, G. (1982.) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247. 296.
                  
               
                  
                     (58)
                  
                  
                     Bushnell, P.J. (1988.) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237. 244.
                  
               
                  
                     (59)
                  
                  
                     Green, R.J., Stanton, M.E. (1989.) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98. 105.
                  
               
                  
                     (60)
                  
                  
                     Kucharski, D., Spear, N.E. (1984.) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465. 479.
                  
               
                  
                     (61)
                  
                  
                     Morris, R. (1984.) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47. 60.
                  
               
                  
                     (62)
                  
                  
                     Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989.) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29. 69.
                  
               
                  
                     (63)
                  
                  
                     D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001.) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60. 90.
                  
               
                  
                     (64)
                  
                  
                     Vorhees, C.V. (1987.) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235. 241.
                  
               
                  
                     (65)
                  
                  
                     Vorhees, C.V. (1997.) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387. 399.
                  
               
                  
                     (66)
                  
                  
                     Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988.) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327. 332.
                  
               
                  
                     (67)
                  
                  
                     Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983.) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342. 352.
                  
               
                  
                     (68)
                  
                  
                     Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981.) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338. – 341.
                  
               
                  
                     (69)
                  
                  
                     Fix, A.S, Garman, R.H. (2000.) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122. 131.
                  
               
                  
                     (70)
                  
                  
                     Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994.) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, str. 84. 107.
                  
               
                  
                     (71)
                  
                  
                     Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002.) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.
                  
               
                  
                     (72)
                  
                  
                     Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996.) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291. 304.
                  
               
                  
                     (73)
                  
                  
                     Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000.) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123. 130.
                  
               
                  
                     (74)
                  
                  
                     Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001.) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365. 372.
                  
               
                  
                     (75)
                  
                  
                     De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994.) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545. 561.
                  
               
                  
                     (76)
                  
                  
                     De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005.a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745. 755.
                  
               
                  
                     (77)
                  
                  
                     De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005.b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417. 432.
                  
               
                  
                     (78)
                  
                  
                     Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979.) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129. – 135.
                  
               
                  
                     (79)
                  
                  
                     Howard, C.V., Reed, M.G. (1998.) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.
                  
               
                  
                     (80)
                  
                  
                     Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998.) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305. 310.
                  
               
                  
                     (81)
                  
                  
                     Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993.) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262. 268.
                  
               
                  
                     (82)
                  
                  
                     Schmitz, C. (1997.) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707. 710.
                  
               
                  
                     (83)
                  
                  
                     West, M.J. (1999.) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51. 61.
                  
               
                  
                     (84)
                  
                  
                     Schmitz, C., Hof, P.R. (2005.) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813. – 831.
                  
               
                  
                     (85)
                  
                  
                     Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994.) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113. 121.
                  
               
                  
                     (86)
                  
                  
                     Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995.) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294. 298.
                  
               
                  
                     (87)
                  
                  
                     Jensen KF, Catalano SM. (1998.) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. U: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, str. 3. 41.
                  
               
                  
                     (88)
                  
                  
                     Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999.) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70. 74.
                  
               
                  
                     (89)
                  
                  
                     Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000.) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056. – 1060.
                  
               
                  
                     (90)
                  
                  
                     Friede, R. L. (1989.) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.
                  
               
                  
                     (91)
                  
                  
                     House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992.) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127. 133.
                  
               
                  
                     (92)
                  
                  
                     Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996.) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401. 405.
                  
               
                  
                     (93)
                  
                  
                     US EPA (2005.) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.
                  
               
                  
                     (94)
                  
                  
                     US EPA (1996.) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274. 56322.
                  
               
                  
                     (95)
                  
                  
                     Danish Environmental Protection Agency (1995.) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.
                  
               
                  
                     (96)
                  
                  
                     Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984.). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113. 126.
                  
               
                  
                     (97)
                  
                  
                     Gad, S.C. (1989.) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21 27.
                  
               
                  
                     (98)
                  
                  
                     Abby, H., Howard, E. (1973.) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329. 335.
                  
               
                  
                     (99)
                  
                  
                     Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975.) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165. 172.
                  
               
                  
                     (100)
                  
                  
                     Holson, R.R., Pearce, B. (1992.) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221. 228.
                  
               
                  
                     (101)
                  
                  
                     Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985.) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587. 90.
                  
               
                  
                     (102)
                  
                  
                     Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004.) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345. 352.
                  
               
                  
                     (103)
                  
                  
                     Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006.) A ‚best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296. 313.
                  
               
                  
                     (104)
                  
                  
                     Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992.) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205. 210.
                  
               
                  
                     (105)
                  
                  
                     Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985.) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295. 301.
                  
               
                  
                     (106)
                  
                  
                     Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008.) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266. 287.
                  
               
                  
                     (107)
                  
                  
                     Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008.) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288. 325.
                  
               
                  
                     (108)
                  
                  
                     Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008.) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326. 348.
                  
               
                  
                     (109)
                  
                  
                     Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008.) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349. 381.
                  
               
            Slika 1.
         
         
            Opća shema ispitivanja za funkcionalna/bihevioralna ispitivanja, neuropatološko vrednovanje i težinu mozga. Ovaj se dijagram temelji na opisu iz stavaka 13–15. (PND = postnatalni dan). Primjeri raspodjele životinja nalaze su u Dodatku 1.
         
         
            Dodatak 1.
            
                        1.
                     
                     
                        Primjeri mogućih raspodjela opisani su i prikazani u tablicama u nastavku. Ti su primjeri navedeni kako bi se pokazalo da se raspodjela životinja koje se upotrebljavaju u studiji različitim ispitnim paradigmama može postići na nekoliko različitih načina.
                     
                  
               Primjer 1.
            
            
                     
                        2.
                     
                     
                        Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanje bihevioralne ontogeneze prije odbijanja od sise. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmrćuju 22. postnatalnog dana. Mozgovi se odstranjuju, važu i obrađuju za histopatološko vrednovanje. Osim toga, podaci o težini mozga prikupljaju se upotrebom nefiksiranih mozgova preostalih 10 mužjaka i 10 ženki po visini doze.
                     
                  
                     
                        3.
                     
                     
                        Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za funkcionalna/bihevioralna ispitivanja nakon odbijanja od sise (detaljna klinička opažanja, motorička aktivnost, reakcija na iznenadnu buku i ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih životinja) te procjenu dobi spolnog sazrijevanja. Od tih životinja 10 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ mozak se uklanja i obrađuje za neuropatološko vrednovanje.
                     
                  
                     
                        4.
                     
                     
                        Za ispitivanje kognitivne funkcije u mladih odraslih životinja (npr. 60. do 70. PND) upotrebljava se treća skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po skupini (1 mužjak i 1 ženka po leglu) usmrćuju se na završetku studije, a mozak se odstranjuje i važe.
                     
                  
                     
                        5.
                     
                     
                        Preostalih 20 životinja po spolu i po skupini čuva se za moguća dodatna ispitivanja.
                        
                           Tablica 1.
                        
                        
                                    Br. mladunca (8)
                                    
                                 
                                 
                                    Broj mladunaca raspoređenih za ispitivanje
                                 
                                 
                                    Pregled/ispitivanje
                                 
                              
                                    m
                                 
                                 
                                    ž
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Bihevioralna ontogeneza
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga/neuropatologija/morfometrija na 22. PND
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga na 22. PND
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Detaljna klinička opažanja
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Motorička aktivnost
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Spolno sazrijevanje
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Motorička i osjetilna funkcija
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Učenje i pamćenje (25. PND)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga/neuropatologija/morfometrija u mladih odraslih životinja ~ 70. PND
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Učenje i pamćenje (mlade odrasle životinje)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga u mladih odraslih životinja ~ 70. PND
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    Rezervne životinje kao zamjena ili za dodatna ispitivanja
                                 
                              
                  
               Primjer 2.
            
            
                     
                        6.
                     
                     
                        Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanje bihevioralne ontogeneze prije odbijanja od sise. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i po visini doze (1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmrćuju 11. postnatalnog dana. Mozgovi se odstranjuju, važu i obrađuju za histopatološko vrednovanje.
                     
                  
                     
                        7.
                     
                     
                        Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za preglede nakon odbijanja od sise (detaljna klinička opažanja, motorička aktivnost, procjena dobi spolnog sazrijevanja te motorička i osjetilna funkcija). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ mozak se uklanja, važe i obrađuje za neuropatološko vrednovanje.
                     
                  
                     
                        8.
                     
                     
                        Za ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih i mladih odraslih životinja upotrebljava se 10 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Za ispitivanje kognitivne funkcije na 23. postnatalni dan i u mladih odraslih životinja upotrebljavaju se različite životinje. Na završetku studije 10 životinja po spolu i po skupini koje su ispitivane kao odrasle usmrćuju se, a mozak se odstranjuje i važe.
                     
                  
                     
                        9.
                     
                     
                        Preostalih 20 životinja po spolu i po skupini koje nisu odabrane za ispitivanje usmrćuju se i izlučuju kod odbijanja od sise.
                        
                           Tablica 2.
                        
                        
                                    Br. mladunca (a)
                                 
                                 
                                    Broj mladunaca raspoređenih za ispitivanje
                                 
                                 
                                    Pregled/ispitivanje
                                 
                              
                                    m
                                 
                                 
                                    ž
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Bihevioralna ontogeneza
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga/neuropatologija/morfometrija na 11. PND
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Detaljna klinička opažanja
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Motorička aktivnost
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Spolno sazrijevanje
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Motorička i osjetilna funkcija
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga/neuropatologija/morfometrija u mladih odraslih životinja ~ 70. PND
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž (9)
                                    
                                 
                                 
                                    Učenje i pamćenje (23. PND)
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž (10)
                                    
                                 
                                 
                                    Učenje i pamćenje (mlade odrasle životinje)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    Težina mozga u mladih odraslih životinja
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    —
                                 
                                 
                                    Životinje koje su usmrćene i izlučene 21. postnatalnog dana.
                                 
                              
                  
               Primjer 3.
            
            
                     
                        10.
                     
                     
                        Jedna skupina od 20 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za procjenu težine mozga i neuropatologije na 11. PND. Od tih životinja 10 mladunaca po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) humano se usmrćuju 11. postnatalnog dana, a mozgovi se odstranjuju, važu i obrađuju za histopatološko vrednovanje. Osim toga, podaci o težini mozga prikupljaju se upotrebom nefiksiranih mozgova preostalih 10 mužjaka i 10 ženki po visini doze.
                     
                  
                     
                        11.
                     
                     
                        Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za bihevioralnu ontogenezu (motorička aktivnost), preglede nakon odbijanja od sise (motorička aktivnost i procjena dobi spolnog sazrijevanja) te ispitivanje kognitivne funkcije u adolescentnih životinja.
                     
                  
                     
                        12.
                     
                     
                        Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) upotrebljava se za ispitivanja motoričke i osjetilne funkcije (reakcija na iznenadnu buku) i detaljna klinička opažanja. Od tih životinja 10 životinja po spolu i po visini doze (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) anesteziraju se i fiksiraju perfuzijom na završetku studije (približno 70. PDN). Nakon dodatnog fiksiranja in situ, mozak se uklanja, važe i obrađuje za neuropatološko vrednovanje.
                     
                  
                     
                        13.
                     
                     
                        Druga skupina od 20 životinja po spolu i po visini doze upotrebljava se za ispitivanje kognitivne funkcije u mladih odraslih životinja (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu). Od tih životinja 10 životinja po spolu i po skupini (odnosno 1 mužjak i 1 ženka po leglu) usmrćuju se na završetku studije, a mozak se odstranjuje i važe.
                        
                           Tablica 3.
                        
                        
                                    Br. mladunca (11)
                                    
                                 
                                 
                                    Broj mladunaca raspoređenih za ispitivanje
                                 
                                 
                                    Pregled/ispitivanje
                                 
                              
                                    m
                                 
                                 
                                    ž
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    1
                                 
                                 
                                    5
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga/neuropatologija/morfometrija na 11. PND
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga na 11. PND
                                 
                              
                                    2
                                 
                                 
                                    6
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Bihevioralna ontogeneza (motorička aktivnost)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Motorička aktivnost
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Spolno sazrijevanje
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Učenje i pamćenje (27. PND)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                                    3
                                 
                                 
                                    7
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Reakcija na buku (adolescentne i mlade odrasle životinje)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Detaljna klinička opažanja
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga/neuropatologija/morfometrija u mladih odraslih životinja ~ 70. PND
                                 
                              
                                    4
                                 
                                 
                                    8
                                 
                                 
                                    20 m + 20 ž
                                 
                                 
                                    Učenje i pamćenje (mlade odrasle životinje)
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                    10 m + 10 ž
                                 
                                 
                                    Težina mozga u mladih odraslih životinja
                                 
                              
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                                 
                                     
                                 
                              
                  
         
            Dodatak 2.
            
               Definicije
            
            
               Kemikalija: Tvar ili smjesa
            
               Ispitivana kemikalija: Sve tvari ili smjese koje se ispituju ovom ispitnom metodom
         
         B.54.   UTEROTROPNI BIOTEST KOD GLODAVACA: KRATKOROČNI TEST PROBIRA NA ESTROGENSKA SVOJSTVA
         
         UVOD
         1.   Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 440 (2007.). OECD je 1998. godine pokrenuo aktivnost visokog prioriteta revizije postojećih i razvoja novih smjernica za probir i ispitivanje potencijalnih endokrinih disruptora (1). Jedan je element aktivnosti bio razvoj smjernice za ispitivanje za uterotropni biotest u glodavaca. Uterotropni biotest u glodavaca tada je podvrgnut opsežnom programu validacije, uključujući sastavljanje detaljnog popratnog dokumenta (2) (3) te provođenje opsežnih studija unutar laboratorija i među njima, kako bi se pokazala važnost i obnovljivost biotesta s potentnim referentnim estrogenom, slabim agonistima receptora estrogena, jakim antagonistom receptora estrogena i negativnom referentnom kemikalijom (4) (5) (6) (7) (8) (9). Ova je ispitna metoda B.54. rezultat iskustva stečenog tijekom programa validacije ispitivanja i njegovih rezultata za estrogenske agoniste.
         2.   Uterotropni biotest kratkoročni je test probira nastao u 1930-ima (27) (28) te ga je stručni odbor prvi put standardizirao za probir 1962. (32) (35). On se temelji na povećanju mase maternice ili uterotropnoj reakciji (za recenziju vidjeti 29.). Njime se vrednuje sposobnost kemikalije da potakne biološke aktivnosti konzistentne agonistima i antagonistima prirodnih estrogena (npr. 17ß-estradiol). Međutim, njegova upotreba za utvrđivanje antagonista manje je uobičajena nego za utvrđivanje agonista. Maternica reagira na estrogene na dva načina. Početna je reakcija povećanje mase zbog zadržavanja vode. Ta je reakcija praćena porastom mase zbog rasta tkiva (30). Reakcije maternice u štakora i miševa kvalitativno su usporedive.
         3.   Ovaj biotest služi kao test probira in vivo, a njegova bi se primjena trebala promatrati u kontekstu ‚OECD-ovog konceptualnog okvira za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija’ (Dodatak 2.). U tom se konceptualnom okviru uterotropni biotest nalazi na 3. razini kao test in vivo koji pruža podatke o jedinstvenom endokrinom mehanizmu, odnosno estrogenizaciji.
         4.   Planira se uključivanje uterotropnog biotesta u bateriju testova in vitro i in vivo radi identifikacije kemikalija s potencijalom za interakciju s endokrinim sustavom, što na kraju dovodi do procjena rizika po ljudsko zdravlje i okoliš. U programu validacije OECD-a upotrebljavali su se jaki i slabi agonisti estrogena radi vrednovanja učinka testa pri identifikaciji estrogenskih kemikalija (4) (5) (6) (7) (8). Na taj je način, uz dobru obnovljivost unutar jednog laboratorija i između više njih, dobro predstavljena osjetljivost ispitnog postupka za agoniste estrogena.
         5.   Kad je riječ o negativnim spojevima, samo je jedna ‚negativna’ referentna kemikalija, za koju su uterotropni test, kao i vezivanje receptora in vitro i testovi receptora, pokazali negativnu vrijednost, obuhvaćena programom validacije, ali su ocijenjeni dodatni podaci o ispitivanju koji nisu povezani s programom validacije OECD-a, čime je dodatno potkrijepljena specifičnost uterotropnog biotesta za probir agonista estrogena (16).
         POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
         6.   Agonisti i antagonisti estrogena djeluju kao ligandi za receptore estrogena α i β te mogu aktivirati odnosno inhibirati transkripcijsko djelovanje receptora. To može dovesti do opasnosti po zdravlje, uključujući reproduktivne i razvojne učinke. Stoga postoji potreba za brzom procjenom i vrednovanjem kemikalije kao mogućeg agonista ili antagonista estrogena. Iako informativan, afinitet liganda za receptor estrogena ili transkripcijsku aktivaciju gena izvjestitelja in vitro samo je jedna od nekoliko odrednica moguće opasnosti. Ostale odrednice mogu uključivati metaboličku aktivaciju i deaktivaciju pri ulasku u tijelo, distribuciju u ciljna tkiva i uklanjanje iz tijela, barem djelomično ovisno o načinu primjene i kemikaliji koja se ispituje. To dovodi do potrebe za probirom mogućeg djelovanja kemikalije in vivo u odgovarajućim uvjetima, osim ako se odgovarajuće informacije već nalaze u karakteristikama kemikalije u pogledu apsorpcije – distribucije – metabolizma – eliminacije (ADME). Tkiva maternice na stimulaciju estrogenima odgovaraju brzim i snažnim rastom, posebno u laboratorijskih glodavaca u kojih ciklus estrusa traje približno 4 dana. Vrste glodavaca, osobito štakori, u širokoj su upotrebi i u studijama toksičnosti za karakterizaciju opasnosti. Zato je maternica glodavaca odgovarajući ciljni organ za probir in vivo agonista i antagonista estrogena.
         7.   Ova se metoda temelji na onim protokolima iz OECD-ove validacijske studije za koje je dokazano da su pouzdani i ponovljivi u studijama unutar laboratorija i između njih (5)(7). Trenutačno postoje dvije metode, odnosno metoda na odraslim ženkama kojima su odstranjeni jajnici te metoda na nezrelim životinjama kojima nisu odstranjeni jajnici. OECD-ovim programom validacije ispitivanja dokazano je da obje metode imaju usporedivu osjetljivost i obnovljivost. Međutim, metoda na nezrelim životinjama kojima nisu odstranjeni jajnici, s obzirom na to da imaju netaknutu os hipotalamus-hipofiza-gonade (HPG), nešto je manje specifična, ali je njome obuhvaćen veći raspon ispitivanja u usporedbi s metodom na odraslim ženkama kojima su odstranjeni jajnici, zato što može reagirati na kemikalije koje djeluju na os HPG, a ne samo na receptor estrogena. Os HPG u štakora funkcionalna je na približno 15. dan starosti. Prije toga pubertet se ne može ubrzati tretmanima poput GnRH. Početkom ulaska u pubertet, prije otvaranja vagine, ženka će imati nekoliko tihih ciklusa čije posljedice neće biti otvaranje vagine ili ovulacija, ali će postojati hormonalne fluktuacije. Ako se kemikalijom izravno ili neizravno stimulira os HPG, posljedice će biti preuranjeni pubertet, rana ovulacija i ubrzano otvaranje vagine. Osim kemikalija koje djeluju na os HPG, stimulacija rasta i ubrzanje otvaranja vagine posljedice su nekih vrsta prehrane s višim razinama metabolizirajuće energije, bez estrogenskih obilježja. Takve kemikalije ne bi izazvale uterotropnu reakciju u odraslih životinja kojima su odstranjeni jajnici jer njihova os HPG ne funkcionira.
         8.   Radi dobrobiti životinja prednost bi trebalo dati metodi u kojoj se upotrebljavaju nezreli štakori, uključujući kiruršku pripremu životinja i izbjegavanje mogućeg neupotrebljavanja onih životinja koje pokazuju znakove ulaska u ciklus estrusa (vidjeti stavak 30.).
         9.   Uterotropna reakcija nije posve estrogenskog podrijetla, odnosno kemikalije koje nisu agonisti ili antagonisti estrogena isto tako mogu uzrokovati reakciju. Primjerice, razmjerno visoke doze progesterona, testosterona ili različitih sintetičkih progestina mogu dovesti do stimulativne reakcije (30). Sve reakcije mogu se histološki analizirati u pogledu keratinizacije i kornifikacije vagine (30). Neovisno o mogućem podrijetlu reakcije, radnje radi daljnjeg pojašnjenja obično bi se trebale pokrenuti zbog pozitivnog ishoda uterotropnog biotesta. Dodatni dokazi estrogenizacije mogli bi se pronaći u testovima in vitro, poput testova vezivanja ER-a i testova transkripcijske aktivacije, ili u drugim testovima in vivo poput testa ženskog puberteta.
         10.   Uzimajući u obzir da se uterotropni biotest upotrebljava kao test probira in vivo, primijenjeni validacijski pristup bio je u funkciji dobrobiti životinja i stupnjevane strategije ispitivanja. U tu su svrhu napori bili usmjereni na strogu validaciju obnovljivosti i osjetljivosti za estrogenizaciju – glavni problem za brojne kemikalije, dok su skromni napori bili usmjereni na antiestrogenizacijsku sastavnicu testa. Ispitivan je samo jedan antiestrogen s jakim djelovanjem s obzirom na to da je broj kemikalija s jasnim antiestrogenskim profilom (koji ne ometa određeno estrogensko djelovanje) vrlo ograničen. Zato je ta ispitna metoda ograničena na estrogenski protokol, dok je protokol kojim se opisuje antagonistički način testa obuhvaćen Smjernicom (37). Obnovljivost i osjetljivost testa za kemikalije s isključivo antiestrogenskim djelovanjem bolje će se definirati kasnije, nakon što ispitni postupak bude u rutinskoj upotrebi neko vrijeme te nakon identifikacije više kemikalija ovim načinom djelovanja.
         11.   Potvrđuje se da će svi postupci koji se temelje na životinjama biti u skladu s lokalnim standardima brige za životinje; opisi brige i postupanja utvrđeni u nastavku minimalni su standardi učinka te će biti zamijenjeni lokalnim propisima poput Direktive 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja, koje se koriste u znanstvene svrhe (38). OECD daje daljnje smjernice za humano postupanje sa životinjama (25).
         12.   Kao i u svim testovima u kojima se upotrebljavaju žive životinje, prije početka testa ključno je osigurati da podaci doista budu nužni. Primjerice, u dvama uvjetima podaci mogu biti nužni:
         
                     —
                  
                  
                     visok potencijal izloženosti (1. razina konceptualnog okvira, Dodatak 2.) ili indikacije za estrogenizaciju (2. razina), za ispitivanje mogu li takvi učinci nastati in vivo,
                  
               
                     —
                  
                  
                     učinci kojima se ukazuje na estrogenizaciju na 4. ili 5. razini testova in vivo radi dokazivanja da su učinci bili povezani s estrogenskim mehanizmom koji je nemoguće razjasniti pomoću testa in vivo.
                  
               13.   Definicije upotrijebljene u ovoj ispitnoj metodi navedene su u Dodatku 1.
         NAČELO ISPITIVANJA
         14.   Osjetljivost uterotropnog biotesta oslanja se na sustav ispitivanja životinja u kojem os hipotalamus-hipofiza-jajnici nije funkcionalna, što dovodi do niskih endogenskih razina cirkulacije estrogena. Na taj će se način osigurati mala osnovna masa maternice i najveći raspon reakcije na primijenjene estrogene. Dva stanja osjetljivosti na estrogen u ženki glodavaca ispunjavaju ovaj uvjet:
         
                     i.
                  
                  
                     nezrele ženke nakon odbijanja od sise i prije puberteta; te
                  
               
                     ii.
                  
                  
                     mlade odrasle ženke nakon odstranjivanja jajnika uz dovoljno vremena za vraćanje tkiva maternice.
                  
               15.   Ispitivana kemikalija primjenjuje se svakodnevno oralnom sondom ili potkožnom injekcijom. Graduirane doze ispitivane kemikalije primjenjuju se na najmanje dvije skupine pokusnih životinja za tretiranje (za smjernice vidjeti stavak 33.), upotrebom jedne visine doze po skupini u razdoblju primjene od tri uzastopna dana za metodu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici, odnosno razdoblju primjene od najmanje tri uzastopna dana za metodu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici. Životinje se podvrgavaju nekropsiji približno 24 sata nakon posljednje doze. Za agoniste estrogena procjenjuje se srednja masa maternice tretiranih skupina životinja u odnosu na skupinu na kojoj se primjenjuje nosač radi statistički znatnog povećanja. Statistički znatno povećanje srednje mase maternice u ispitnoj skupini ukazuje na pozitivnu reakciju u ovom biotestu.
         OPIS METODE
         
            Odabir životinjskih vrsta
         
         16.   Mogu se upotrebljavati glodavci koji se obično upotrebljavaju u laboratorijima. Primjerice, sojevi štakora Sprague Dawley i Wistar upotrebljavani su tijekom validacije. Ne bi se trebali upotrebljavati sojevi za koje se zna ili pretpostavlja da imaju manje osjetljive maternice. Laboratorij bi trebao pokazati osjetljivost upotrebom soja prema opisu iz stavaka 26. i 27.
         17.   Štakor i miš rutinski se upotrebljavaju za uterotropni biotest od 1930-ih. OECD-ove validacijske studije provodile su se samo na štakorima, na temelju shvaćanja da se očekuje da su obje vrste istovjetne te bi zato jedna vrsta trebala biti dovoljna za validaciju širom svijeta kako bi se sačuvali resursi i životinje. Štakor je odabrana vrsta u većini studija reproduktivne i razvojne toksičnosti. Uzimajući u obzir postojanje velike historijske baze podataka za miševe, ograničena validacijska studija praćenja provedena je na miševima (16) kako bi se proširio raspon ispitne metode uterotropnog biotesta u glodavaca na upotrebu miševa kao ispitne vrste. U skladu s izvornom namjerom očuvanja resursa i životinja odabran je povezujući pristup s ograničenim brojem ispitivanih kemikalija, sudjelujućih laboratorija i bez kodiranog ispitivanja uzoraka. Tom povezujućom validacijskom studijom utvrđeno je da se, kad je riječ o uterotropnom biotestu na mladim odraslim miševima kojima su odstranjeni jajnici, podaci dobiveni za štakore i miševe u velikoj mjeri podudaraju. U slučajevima kad rezultati uterotropnog biotesta mogu prethoditi dugotrajnoj studiji, u obje se studije mogu upotrebljavati životinje istog soja i istog podrijetla. Povezujući pristup bio je ograničen na odrasle miševe kojima su odstranjeni jajnici pa izvješće ne pruža pouzdan skup podataka za validaciju modela nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici, zbog čega se taj model u miševa ne razmatra u okviru postojeće ispitne metode.
         18.   Zato se u nekim slučajevima mogu upotrebljavati miševi umjesto štakora. Za tu bi vrstu trebalo navesti obrazloženje na temelju toksikoloških, farmakokinetičkih i/ili drugih kriterija. Za miševe bi mogle biti potrebne izmjene protokola. Primjerice, unos hrane u miševa na temelju tjelesne mase veći je nego u štakora te bi zato udjel fitoestrogena u hrani trebao biti niži u miševa nego u štakora (9) (20) (22).
         
            Uvjeti smještaja i hranjenja
         
         19.   Svi bi postupci trebali biti u skladu s lokalnim standardima brige o laboratorijskim životinjama. Ti opisi brige i postupanja minimalni su standardi i zamijenit će se lokalnim propisima poput Direktive 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (38). Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi biti 22 °C (uz približan raspon od ± 3 °C). Relativna vlažnost trebala bi biti barem 30 %, a poželjno je da ne prelazi najviših 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Ciljna relativna vlažnost trebala bi biti od 50–60 %. Svjetlo bi trebalo biti umjetno. Dnevni redoslijed svjetla trebao bi biti 12 sati svjetla, 12 sati tame.
         20.   Laboratorijsku prehranu i vodu za piće trebalo bi osigurati ad libitum. Mlade odrasle životinje mogu se smjestiti pojedinačno ili u kaveze u skupinama do tri životinje. Zbog mladosti nezrelih životinja preporučuje se smještaj prema socijalnoj skupini.
         21.   Poznato je da visoke razine fitoestrogena u laboratorijskoj prehrani povećavaju masu maternice u glodavaca do stupnja koji je dostatan za ometanje uterotropnog biotesta (13) (14) (15). Visoke razine fitoestrogena i metabolizirajuće energije u laboratorijskoj prehrani mogu uzrokovati i preuranjeni pubertet ako se upotrebljavaju nezrele životinje. Prisutnost fitoestrogena ponajprije je posljedica uključivanja soje i alfalfa proizvoda u laboratorijsku prehranu, a dokazano je da koncentracije fitoestrogena variraju od serije do serije standardne laboratorijske prehrane (23). Tjelesna masa važna je varijabla s obzirom na to da je količina konzumirane hrane povezana s tjelesnom masom. Zato stvarne doze fitoestrogena koje se konzumiraju prema istoj prehrani mogu varirati između vrsta i prema dobi (9). U nezrelih ženki štakora unos hrane na temelju tjelesne mase može biti približno dvostruko veći od unosa mladih odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici. U mladih odraslih miševa unos hrane na temelju tjelesne mase može biti približno četverostruko veći od unosa mladih odraslih ženki štakora kojima su odstranjeni jajnici.
         22.   Međutim, rezultati uterotropnog testa (9) (17) (18) (19) ukazuju na to da su ograničene količine prehrambenih fitoestrogena prihvatljive te da se njima ne umanjuje osjetljivost biotesta. Primjerice, prehrambene razine fitoestrogena ne bi trebale premašiti 350 μg ekvivalenata genisteina po gramu laboratorijske prehrane u nezrelih ženki štakora sojeva Sprague Dawley i Wistar (6) (9). Takva bi se prehrana trebala primijeniti i pri ispitivanju mladih odraslih štakora kojima su odstranjeni jajnici jer je unos hrane na temelju tjelesne mase manji u mlade odrasle životinje nego u nezrelih životinja. Ako treba upotrebljavati miševe kojima su odstranjeni jajnici ili štakore koji su osjetljiviji na fitoestrogen, potrebno je razmotriti razmjerno smanjenje razina prehrambenog fitoestrogena (20). Osim toga, razlike u raspoloživoj metaboličkoj energiji iz različitih vrsta prehrane mogu dovesti do vremenskih pomaka za početak puberteta (21) (22).
         23.   Prije studije potreban je pažljiv odabir prehrane bez povišene razine fitoestrogena (za primjer vidjeti (6) (9)) ili metabolizirajuće energije, koji mogu poremetiti rezultate (15) (17) (19) (22) (36). Važna je provjera oba navedena čimbenika osiguranje pravilnog funkcioniranja ispitnog sustava koji laboratorij upotrebljava kako je predviđeno stavcima 26. i 27. Kao zaštitu u skladu s dobrom laboratorijskom praksom potrebno je provesti reprezentativno uzorkovanje svake serije prehrane koja se primjenjuje tijekom studije radi moguće analize udjela fitoestrogena (npr. u slučaju velike kontrolne mase maternice u odnosu na historijske kontrole ili neodgovarajuće reakcije na referentni estrogen, 17 alfa-etinilestradiol). Alikvote treba analizirati kao dio studije ili zamrznuti na – 20 °C, odnosno tako da se spriječi propadanje uzorka prije analize.
         24.   Neke vrste stelje mogu sadržavati prirodne estrogenske ili antiestrogenske kemikalije (npr. poznato je da klip kukuruza utječe na ciklus štakora pa se čini da je antiestrogenski). Odabrana stelja trebala bi sadržavati minimalnu razinu fitoestrogena.
         
            Priprema životinja
         
         25.   Pokusne životinje bez utvrđenih bolesti ili fizičkih abnormalnosti nasumično se raspoređuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Kaveze treba urediti tako da se eventualni učinci držanja u kavezu svedu na minimum. Životinje treba označiti jedinstvenim oznakama. Poželjno je nezrele životinje smjestiti u kaveze sa ženkama ili zamjenskim ženkama do odbijanja od sise tijekom aklimatizacije. Razdoblje aklimatizacije prije početka studije trebalo bi trajati približno 5 dana za mlade odrasle životinje te za nezrele životinje isporučene sa ženkama ili zamjenskim ženkama. Ako se nezrele životinje nabavljaju kao životinje upravo odbijene od sise bez ženki, kraće razdoblje aklimatizacije može biti potrebno jer bi doziranje trebalo započeti neposredno nakon odbijanja od sise (vidjeti stavak 29.).
         POSTUPAK
         
            Provjera osposobljenosti laboratorija
         
         26.   Za provjeru osposobljenosti laboratorija mogu se upotrebljavati dvije različite mogućnosti:
         
                     —
                  
                  
                     periodična provjera koja se temelji na početnoj studiji osnovne pozitivne kontrole (vidjeti stavak 27.). Najmanje svakih 6 mjeseci i u slučaju svake promjene koja može utjecati na provođenje testa (npr. nova formulacija prehrane, promjena osoblja koje obavlja disekcije, promjene soja životinja ili dobavljača itd.) treba provjeriti reakciju ispitnog sustava (životinjski model) pomoću odgovarajuće doze (na temelju studije osnovne pozitivne kontrole iz stavka 27.) referentnog estrogena 17α-etinilestradiola (CAS br. 57-63-6) (EE),
                  
               
                     —
                  
                  
                     upotreba usporednih kontrola uključivanjem u svaki test skupine kojoj se daje odgovarajuća doza referentnog estrogena.
                  
               Ako sustav ne reagira prema očekivanjima, eksperimentalne uvjete treba ispitati i izmijeniti prema potrebi. Preporučuje se da doza referentnog estrogena koju treba upotrijebiti u bilo kojem pristupu bude približno ED70 do 80.
         27.   Studija osnovne pozitivne kontrole – prije nego što laboratorij prvi put provodi studiju na temelju ove ispitne metode, potrebno je dokazati njegovu osposobljenost ispitivanjem reakcije životinjskog modela utvrđivanjem doze reakcije referentnog estrogena 17α-etinilestradiola (CAS br. 57-63-6) (EE) pomoću najmanje četiri doze. Reakcija mase maternice usporedit će se s utvrđenim povijesnim podacima (vidjeti referencu (5)). Ako se pomoću studije osnovne pozitivne kontrole ne dobiju očekivani rezultati, potrebno je ispitati i izmijeniti eksperimentalne uvjete.
         
            Broj i stanje životinja
         
         28.   Sve skupine za tretiranje i kontrolne skupine trebale bi se sastojati od najmanje šest životinja (u protokolu za metodu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici i metodu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici).
         
            Dob nezrelih životinja
         
         29.   U uterotropnim testovima na nezrelim životinjama potrebno je odrediti dan okota. S doziranjem treba započeti dovoljno rano kako bi se osiguralo da po završetku primjene kemikalije još nije došlo do fiziološkog povećanja endogenih estrogena povezanih s pubertetom. S druge strane, postoje dokazi da vrlo mlade životinje mogu biti manje osjetljive. U definiranju optimalne dobi svaki bi laboratorij trebao uzeti u obzir vlastite podatke o sazrijevanju.
         Opće je pravilo da se s doziranjem u štakora može započeti neposredno nakon ranog odbijanja od sise na 18. postnatalni dan (pri čemu je dan okota nulti postnatalni dan). Doziranje u štakora treba okončati na 21. postnatalni dan, a svakako prije 25. postnatalnog dana zato što nakon te dobi os hipotalamus-hipofiza-jajnici postaje funkcionalna, a razine endogenih estrogena mogu početi rasti uz istodobno povećanje osnovne srednje mase maternice te standardnih devijacija skupine (2) (3) (10) (11) (12).
         
            Postupak odstranjivanja jajnika
         
         30.   U ženki štakora i miševa kojima su odstranjeni jajnici (skupine za tretiranje i kontrolne skupine) odstranjivanje jajnika trebalo bi obaviti između šestog i osmog tjedna života. Štakorima je potrebno najmanje 14 dana između odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene kako bi se maternica vratila na minimalnu, stabilnu osnovu. Miševima je potrebno najmanje sedam dana između odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene. S obzirom na to da su male količine tkiva jajnika dovoljne za proizvodnju znatnih cirkulirajućih razina estrogena (3), životinje bi trebalo ispitati prije upotrebe promatranjem vaginalnih stanica epitela najmanje pet uzastopnih dana (npr. od 10. do 14. dana od odstranjivanja jajnika u štakora). Ako se kod njih uoče bilo kakvi dokazi ulaska u ciklus estrusa, životinje ne bi trebalo upotrebljavati. Osim toga, pri nekropsiji treba pregledati ostatke jajnika radi dokaza o prisutnosti tkiva jajnika. U tom slučaju životinju ne bi trebalo upotrebljavati u izračunima (3).
         31.   Postupak odstranjivanja jajnika započinje kad je životinja u ventralnom položaju nakon što je odgovarajuće anestezirana. Rez kojim se otvara dorsolateralni trbušni zid trebao bi se nalaziti približno 1 cm uzdužno od središnje točke između kostalnog ruba rebara i zdjelične kosti te nekoliko milimetara lateralno od lateralnog ruba lumbalnog mišića. Jajnik treba odstraniti iz trbušne šupljine na aseptičnu podlogu. Jajnik treba odvojiti na spoju jajovoda i tijela maternice. Nakon potvrde da nema opsežnog krvarenja, trbušni zid treba zatvoriti šavom, a kožu kopčama ili odgovarajućim šavom. Točke podvezivanja shematski su prikazane na slici 1. Potrebno je upotrebljavati odgovarajuće postoperativne analgetike prema preporuci veterinara s iskustvom u njezi glodavaca.
         
            Tjelesna masa
         
         32.   U metodi odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici, tjelesna masa i masa maternice nisu povezane zato što na masu maternice utječu hormoni poput estrogena, a ne čimbenici rasta kojima se regulira tjelesna masa. Međutim, tjelesna masa povezana je s masom maternice tijekom sazrijevanja kod modela nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici (34). Zato na početku studije variranje tjelesne mase životinja koje se upotrebljavaju u modelu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici treba biti što manje i ne bi trebalo premašiti ± 20 % srednje vrijednosti mase. To znači da bi uzgajivač trebao standardizirati veličinu legla kako bi osigurao da će se potomci različitih životinja majki približno jednako hraniti. Životinje bi trebalo rasporediti u skupine (kontrolne skupine i skupine za tretman) prema slučajnoj distribuciji mase, tako da se srednja tjelesna masa svake skupine statistički ne razlikuje od ostalih skupina. Trebalo bi po mogućnosti izbjegavati raspodjelu članova istog legla u istu skupinu za tretiranje bez povećavanja broja leglā koje treba upotrebljavati za ispitivanje.
         
            Doziranje
         
         33.   Kako bi se utvrdilo može li ispitna kemikalija imati estrogensko djelovanje in vivo, obično su dovoljne dvije skupine kojima se daje određena doza pa je zato taj dizajn poželjan radi dobrobiti životinja. Ako je svrha dobiti krivulju doza reakcija ili ekstrapolirati niže doze, potrebne su barem tri skupine kojima se daje određena doza. Ako je potrebno više informacija osim estrogenske aktivnosti (poput procjene potencije), treba razmotriti drukčiji režim doziranja. Osim tretiranja ispitivanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnim skupinama treba postupati jednako kao sa životinjama u ispitnoj skupini. Ako se u primjeni ispitivane kemikalije upotrebljava nosač, kontrolna skupina trebala bi primiti jednaku količinu nosača kao i tretirane skupine (ili najveći volumen koji je primijenjen na ispitne skupine ako se on razlikuje među skupinama).
         34.   Cilj je u slučaju uterotropnog biotesta odabrati doze kojima se osigurava preživljavanje životinja te koje nisu znatno toksične i opasne za životinje nakon tri uzastopna dana primjene kemikalije do najveće doze od 1 000 mg/kg/d. Sve visine doza treba predložiti i odabrati uzimajući u obzir sve raspoložive podatke o toksičkim i (toksiko-) kinetičkim svojstvima ispitivane kemikalije ili srodnih materijala. Najvišom dozom prvo bi trebalo uzeti u obzir LD50 i/ili informacije o akutnoj toksičnosti kako bi se izbjegla smrt, teška patnja ili opasnost za životinje (24) (25) (26). Najviša bi doza trebala predstavljati maksimalnu dozu tolerancije (MDT), a prihvatljiva bi bila i studija provedena na visini doze kojom je izazvana pozitivna uterotropna reakcija. Veliki intervali (npr. polovične log jedinice odgovaraju progresiji doze od 3,2 ili čak i više do cjelovitih log jedinica) između doziranja općenito su prihvatljivi u svrhu probira. Ako nema odgovarajućih podataka, može se provesti studija utvrđivanja količinskog raspona kako bi se lakše utvrdile doze koje treba primjenjivati.
         35.   U suprotnom, ako se estrogenski potencijal agonista može procijeniti prema podacima in vitro (ili in silico), oni se mogu uzeti u obzir pri odabiru doze. Primjerice, količina ispitivane kemikalije koja bi potaknula uterotropne reakcije jednakovrijedne referentnom agonistu (etinilestradiol) procjenjuje se prema njegovim potencijalima in vitro u odnosu na etinilestradiol. Najviša ispitna doza dobila bi se množenjem te jednakovrijedne doze s odgovarajućim faktorom, npr. 10 ili 100.
         
            Razmatranja za utvrđivanje količinskog raspona
         
         36.   Preliminarna studija utvrđivanja količinskog raspona može se, prema potrebi, provesti na nekoliko životinja. U tom pogledu može se upotrijebiti OECD-ova Smjernica br. 19 (25) kojom su definirani klinički znakovi toksičnosti ili opasnosti za životinje. Ako je tijekom te studije utvrđivanja količinskog raspona nakon tri dana primjene to moguće, maternice se mogu odstraniti i izvagati približno 24 sata nakon posljednje doze. Ti bi se podaci potom mogli upotrebljavati u dizajnu glavne studije (za odabir prihvatljivih najviših i nižih doza te preporuku broja skupina za doziranje).
         
            Primjena doza
         
         37.   Ispitivana kemikalija primjenjuje se oralnom sondom ili potkožnom injekcijom. Pri odabiru primjene u obzir treba uzeti dobrobit životinja, kao i toksikološke aspekte poput važnosti načina na koji su ljudi izloženi kemikaliji (npr. oralne sonde za gutanje, potkožne injekcije za udisanje ili dermalnu apsorpciju), fizička/kemijska svojstva ispitnog materijala, osobito postojećih toksikoloških informacija i podataka o metabolizmu i kinetici (npr. potreba za izbjegavanjem metabolizma prvog prolaska, bolja učinkovitost određenim načinom primjene).
         38.   Preporuka je da se, kad god je to moguće, najprije razmotri mogućnost upotrebe vodene otopine/suspenzije. Ali s obzirom na to da je većina liganada estrogena ili njihovih metaboličkih prekursora hidrofobna, najčešći je pristup upotreba uljne otopine/suspenzije (npr. ulje kukuruza, kikirikija, sezama ili masline). Međutim, ta ulja imaju različite udjele kalorija i masti, zbog čega bi nosač mogao utjecati na unos ukupne metabolizirajuće energije (ME), čime bi se mogle izmijeniti izmjerene krajnje točke poput mase maternice, osobito kod metode nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici (33). Zato prije studije treba ispitati sve nosače koje treba upotrebljavati uusporedbi s kontrolama bez nosača. Ispitivana kemikalija može se otopiti u minimalnoj količini 95 %-tnog etanola ili drugih odgovarajućih otapala te razrijediti do konačne radne koncentracije u ispitivanom nosaču. Toksične karakteristike otapala moraju biti poznate te bi ih trebalo ispitivati u zasebnoj kontrolnoj skupini samo za otapalo. Ako se ispitivana kemikalija smatra stabilnom, pri njezinom otapanju mogu se upotrebljavati blago zagrijavanje i žustro mehaničko djelovanje. Trebalo bi utvrditi stabilnost ispitivane kemikalije u nosaču. Ako je ispitivana kemikalija stabilna tijekom trajanja studije, tada se može pripremiti jedan početni alikvot ispitivane kemikalije, a utvrđene razrijeđene doze pripremaju se svakodnevno.
         39.   Tempiranje doziranja ovisit će o upotrijebljenom modelu (vidjeti stavak 29. za model nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici i stavak 30. za model odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici). Nezrelim ženkama štakora ispitivana kemikalija dozira se svakodnevno tri uzastopna dana. Za ženke štakora kojima su odstranjeni jajnici jednako se tako preporučuje trodnevni tretman, ali uz prihvatljiva dulja izlaganja kojima se može poboljšati otkrivanje kemikalija sa slabim učinkom. Ženkama miševa kojima su odstranjeni jajnici trodnevna primjena trebala bi biti dovoljna bez znatnog utjecaja produljenja do sedam dana za jake agoniste estrogena. Međutim, takav odnos nije dokazan u validacijskoj studiji za slabe estrogene (16) pa bi doziranje trebalo produljiti do sedam uzastopnih dana u odraslih miševa kojima su odstranjeni jajnici. Doza bi se trebala davati svakog dana u isto vrijeme. Doze bi trebalo prilagoditi prema potrebi, kako bi se održala stalna visina doze u smislu tjelesne mase životinja (npr. mg ispitivane kemikalije po kg tjelesne mase po danu). Kad je riječ o ispitnom volumenu, njegovu varijabilnost na temelju tjelesne mase trebalo bi umanjiti prilagođavanjem koncentracije otopine za doziranje kako bi se osigurao stalni volumen na temelju tjelesne mase na svim visinama doze i za svaki način primjene.
         40.   U slučaju primjene oralnom intubacijom, ispitivanu kemikaliju treba primijeniti kao jednu dnevnu dozu pomoću želučane sonde ili odgovarajuće intubacijske kanile. Maksimalan volumen tekućine koji se može primijeniti odjednom ovisi o veličini pokusne životinje. Treba slijediti lokalne smjernice o brizi za životinje, ali volumen ne bi trebao premašivati 5 ml/kg tjelesne mase, osim u slučaju vodenih otopina, kada se može upotrijebiti 10 ml/kg tjelesne mase.
         41.   Ako se ispitivana kemikalija primjenjuje potkožnom injekcijom, to treba učiniti u jednoj dnevnoj dozi. Doze bi se trebale primjenjivati u dorzalnoskapularnim ili lumbalnim predjelima sterilnom iglom (npr. veličine 23 ili 25) ili tuberkulinskom špricom. Brijanje mjesta uboda nije obvezno. Treba zabilježiti sve gubitke, curenja na mjestu uboda ili nepotpuno doziranje. Ukupni injektirani volumen po štakoru po danu ne bi trebao premašivati 5 ml/kg tjelesne mase, raspoređeno na dva mjesta uboda, osim u slučaju vodenih otopina, kada se može upotrijebiti 10 ml/kg tjelesne mase.
         
            Opažanja
         
         
            Opća i klinička opažanja
         
         42.   Opća klinička opažanja treba provoditi barem jednom dnevno ili češće ako se uoče znakovi toksičnosti. Poželjno je opažanja provoditi svakodnevno u isto(-a) doba te uzimajući u obzir razdoblje očekivanih vršnih učinaka nakon doziranja. Sve životinje trebalo bi promatrati radi znakova smrti i bolesti te općih kliničkih znakova poput promjena u ponašanju, na koži, dlaci, očima, sluznicama, pojave iscjedaka i izlučevina te autonomne aktivnosti (npr. lakrimacija, piloerekcija, veličina zjenica, nepravilnosti u disanju).
         
            Tjelesna masa i unos hrane
         
         43.   Sve životinje treba svakodnevno vagati do najbližeg 0,1 g, počevši neposredno prije početka tretmana, odnosno kad su životinje raspoređene po skupinama. Dodatno se može izmjeriti i količina hrane unesene tijekom razdoblja tretmana po kavezu vaganjem posuda za hranu. Rezultate o unosu hrane treba izraziti u gramima po štakoru po danu.
         
            Disekcija i vaganje maternice
         
         44.   Štakori će se humano usmrtiti dvadeset i četiri sata nakon posljednjeg tretmana. U idealnim uvjetima redoslijed nekropsije bit će nasumičan prema skupinama kako bi se izbjegla progresija izravno prema gore ili dolje u skupinama za doziranje koja bi mogla suptilno utjecati na podatke. Cilj je biotesta izvagati mokru maternicu i maternicu kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem. Masa mokre maternice uključuje maternicu i udjel luminalne tekućine. Masa maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem mjeri se nakon izražavanja i uklanjanja luminalnog udjela maternice.
         45.   Vagina će se prije disekcije pregledati radi stanja otvorenosti u nezrelih životinja. Postupak disekcije započinje otvaranjem abdominalnog zida na spoju zdjeličnih kostiju. Potom se rog maternice i jajnici, ako postoje, odvajaju od dorsalnog abdominalnog zida. Mokraćni mjehur i mokraćovodi uklanjaju se s ventralne i lateralne strane maternice i vagine. Fibrozna adhezija između rektuma i vagine odvaja se do spoja vaginalnog otvora i može se uočiti koža potrbušnice. Maternica i vagina odvajaju se od tijela incizijom vaginalnog zida neposredno iznad spoja kože potrbušnice kako je prikazano na slici 2. Maternicu treba odvojiti od tjelesnog zida nježnim rezanjem materničnog mezenterija u točki spajanja duž cijele duljine dorsolateralnog aspekta svakog roga maternice. Nakon odstranjivanja iz tijela rukovanje maternicom treba biti dovoljno brzo radi izbjegavanja sušenja tkiva. Gubitak mase zbog isušivanja postaje važniji za mala tkiva poput materničnih (23). Ako postoje, jajnici se uklanjaju kod jajovoda, izbjegavajući gubitak luminalne tekućine iz roga maternice. Ako su životinji odstranjeni jajnici, ostatke jajnika treba pregledati radi prisutnosti bilo kakvog tkiva jajnika. Višak masnog i vezivnog tkiva treba obrezati. Vagina se uklanja iz maternice neposredno ispod cerviksa tako da on ostane na tijelu maternice kako je prikazano na slici 2.
         46.   Svaku maternicu treba smjestiti u spremnik koji je jedinstveno označen i izvagan (npr. u Petrijevu zdjelicu ili plastičnu posudu za vaganje) uz stalnu pažnju radi izbjegavanja sušenja prije vaganja (npr. u spremnik se može staviti filtarski papir blago navlažen fiziološkom otopinom). Maternicu s luminalnom tekućinom izvagat će se do najbližeg 0,1 mg (masa mokre maternice).
         47.   Svaku će se maternicu potom pojedinačno obrađivati kako bi se uklonila luminalna tekućina. Oba će se roga maternice probušiti i poprečno prerezati. Maternica će se smjestiti na blago navlaženi filtarski papir (npr. Whatman br. 3) i nježno pritisnuti drugim komadom blago navlaženog filtarskog papira kako bi se luminalna tekućina u potpunosti uklonila. Maternica bez luminalnog udjela izvagat će se do najbližeg 0,1 mg (masa maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem).
         48.   Masa maternice na završetku studije može se upotrebljavati kako bi se osiguralo da odgovarajuća dob nezrelih netaknutih štakora ne bude premašena. Međutim, u tom su pogledu odlučujući povijesni podaci soja štakora koji laboratorij upotrebljava (vidjeti stavak 56. za tumačenje rezultata).
         
            Neobvezna ispitivanja
         
         49.   Nakon vaganja maternicu se može fiksirati u 10 %-tnom neutralnom puferiranom formalinu radi histolopatološkog pregleda nakon bojanja hematoksilinom i eosinom (HE). I vaginu se može ispitati na taj način (vidjeti stavak 9.). Osim toga, morfometrijsko mjerenje endometrijskog epitela može se obaviti radi količinske usporedbe.
         PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
         
            Podaci
         
         50.   Podaci o studiji trebali bi uključivati:
         
                     —
                  
                  
                     broj životinja na početku testa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj i identitet životinja koje su uginule tijekom testa ili su iz humanih razloga usmrćene te datum i vrijeme smrti ili humanog usmrćivanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj i identitet životinja u kojih su uočeni znakovi toksičnosti te opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme početka, trajanje i težinu svih toksičnih učinaka, te
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj i identitet životinja pri kojima su uočene lezije te opis vrste lezija.
                  
               51.   Podatke o pojedinačnim životinjama treba zabilježiti u slučaju tjelesne mase, mase mokre maternice i mase maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem. Za utvrđivanje je li statistički znatno povećanje (p < 0,05) mase maternice posljedica primjene ispitivane kemikalije treba upotrebljavati jednostrane statističke analize. Treba provesti odgovarajuće statističke analize kako bi se ispitale promjene povezane s tretmanom mase maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem i mase mokre maternice. Primjerice, podaci se mogu vrednovati pomoću analize pristupa kovarijance (ANCOVA) s tjelesnom masom pri nekropsiji kao kovarijablom. Logaritamska transformacija stabiliziranja varijance podataka o maternici može se obaviti prije analize podataka. Test Dunnetta i Hsua primjeren je za usporedbu parova svake skupine za doziranje s kontrolama nosača te za izračun intervala pouzdanosti. Grafovi studentiziranih ostataka mogu se upotrebljavati za otkrivanje mogućih ekstremnih vrijednosti te za procjenu homogenosti varijanci. Ti su se postupci primjenjivali u validacijskom programu OECD-a upotrebom PROC GLM-a u sustavu za statističku analizu (Institut SAS, Cary, NC), verzija 8 (6) (7).
         52.   Završno izvješće uključuje:
         
            Ustanova u kojoj se obavlja ispitivanje
         
         
                     —
                  
                  
                     odgovorne osobe i njihove odgovornosti tijekom studije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podatke iz testa osnovne pozitivne kontrole i podatke o periodičkoj pozitivnoj kontroli (vidjeti stavke 26. i 27.).
                  
               
            Ispitivana kemikalija
         
         
                     —
                  
                  
                     karakterizaciju ispitivane kemikalije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fizikalno stanje i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metodu i učestalost pripreme otopina,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sve podatke o stabilnosti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sve analize otopina za doziranje.
                  
               
            Nosač
         
         
                     —
                  
                  
                     karakterizaciju ispitnog nosača (stanje, dobavljač i serija),
                  
               
                     —
                  
                  
                     obrazloženje odabira nosača (ako nije riječ o vodi).
                  
               
            Ispitne životinje
         
         
                     —
                  
                  
                     vrste i soj te obrazloženje njihova odabira,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dobavljača i njegov posebni objekt,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dob u trenutku isporuke i datum okota,
                  
               
                     —
                  
                  
                     za nezrele životinje, podatak jesu li isporučene sa ženkom ili nadomjesnom ženkom i datum odbijanja od sise,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o postupku aklimatizacije životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj životinja po kavezu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinost i metodu identifikacije pojedinačne životinje i skupine.
                  
               
            Uvjeti testa
         
         
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o postupku nasumičnog odabira, odnosno upotrijebljenoj metodi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podloge za odabir visine doze,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o formulaciji ispitivane kemikalije, njezinim ostvarenim koncentracijama, stabilnosti i homogenosti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije i podloge za odabir puta izlaganja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     prehranu (naziv, vrsta, dobavljač, sastav i razine fitoestrogena ako su poznate),
                  
               
                     —
                  
                  
                     izvor vode (npr. voda iz slavine ili filtrirana voda) te opskrba (cjevčicom iz većeg spremnika, u bocama itd.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     podatke o stelji (naziv, vrsta, dobavljač, sastav),
                  
               
                     —
                  
                  
                     evidenciju o uvjetima smještaja u kavezima, svjetlosnom intervalu, temperaturi prostorije i vlazi, čišćenju prostorije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     detaljan opis postupaka nekropsije i vaganja maternice,
                  
               
                     —
                  
                  
                     opis statističkih postupaka.
                  
               
            Rezultati
         
         
            Za pojedinačne životinje:
         
         
                     —
                  
                  
                     sve dnevne pojedinačne tjelesne mase (od raspodjele u skupine do nekropsije) (do najbližeg 0,1 g),
                  
               
                     —
                  
                  
                     dob svake životinje (u danima, počevši od dana okota kao nultog dana) na početku primjene ispitivane kemikalije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     datum i vrijeme svake primjene doze,
                  
               
                     —
                  
                  
                     izračunani volumen i primjenu doziranja te opažanja o svim gubicima u doziranju tijekom ili nakon primjene,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dnevnu evidenciju stanja životinje, uključujući relevantne simptome i opažanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     uzrok smrti na koji se sumnja (ako je tijekom studije životinja bila pred uginućem ili je uginula),
                  
               
                     —
                  
                  
                     datum i vrijeme humanog usmrćivanja s vremenskim intervalom do zadnjeg doziranja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     masu mokre maternice (do najbližeg 0,1 mg) i sva opažanja gubitaka luminalne tekućine tijekom disekcije i pripreme za vaganje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     masu maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem (do najbližeg 0,1 mg).
                  
               
            Za svaku skupinu životinja:
         
         
                     —
                  
                  
                     srednje dnevne tjelesne mase (do najbližeg 0,1 g) i standardna odstupanja (od raspodjele u skupine do nekropsije),
                  
               
                     —
                  
                  
                     srednje mase mokre maternice i maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem (do najbližeg 0,1 g) i standardna odstupanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dnevni unos hrane (izražen u gramima unesene hrane po životinji), ako se mjeri,
                  
               
                     —
                  
                  
                     rezultate statističkih analiza kojima se uspoređuju mase mokre maternice i maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem tretiranih skupina u odnosu na iste vrijednosti kontrolnih skupina nosača,
                  
               
                     —
                  
                  
                     rezultate statističke analize kojom se uspoređuju ukupna tjelesna masa i porast tjelesne mase tretiranih skupina u odnosu na iste vrijednosti kontrolnih skupina nosača.
                  
               53.   Sažetak važnih smjernica ispitne metode
         
                      
                  
                  
                     
                        Štakori
                     
                  
                  
                     
                        Miševi
                     
                  
               
                     
                        Životinje
                     
                  
               
                     Soj
                  
                  
                     Soj laboratorijskih glodavaca koji se obično upotrebljava
                  
               
                     Broj životinja
                  
                  
                     Najmanje 6 životinja po skupini za doziranje
                  
               
                     Broj skupina
                  
                  
                     Najmanje 2 ispitne skupine (za primjer vidjeti stavak 33.) i negativna kontrolna skupina
                     Za primjer pozitivnih kontrolnih skupina vidjeti stavke 26. i 27.
                  
               
                     
                        Uvjeti smještaja i hranjenja
                     
                  
               
                     To u prostoriji za životinje
                  
                  
                     22 °C ± 3 °C
                  
               
                     Relativna vlažnost
                  
                  
                     50–60 % i ne ispod 30 % ili iznad 70 %
                  
               
                     Dnevni redoslijed svjetla
                  
                  
                     12 sati svjetla, 12 sati tame
                  
               
                     Prehrana i voda za piće
                  
                  
                     Ad libitum
                  
               
                     Smještaj
                  
                  
                     Pojedinačno ili u skupinama do tri životinje (za nezrele životinje preporučuje se smještaj prema socijalnoj skupini)
                  
               
                     Prehrana i stelja
                  
                  
                     Preporučena niska razina fitoestrogena u prehrani i stelji
                  
               
                     
                        Protokol
                     
                  
               
                     Metoda
                  
                  
                     Metoda nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici (poželjna)
                     Metoda odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici
                  
                  
                     Metoda odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici
                  
               
                     Dob doziranja za nezrele životinje
                  
                  
                     Najranije 18. postnatalni dan. Doziranje treba dovršiti prije 25. postnatalnog dana
                  
                  
                     Nije relevantno u području primjene trenutačne ispitne metode
                  
               
                     Dob za odstranjivanje jajnika
                  
                  
                     Između 6. i 8. tjedna starosti.
                  
               
                     Dob doziranja za životinje kojima su odstranjeni jajnici
                  
                  
                     Treba proći najmanje 14 dana između odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene.
                  
                  
                     Treba proći najmanje 7 dana između odstranjivanja jajnika i prvog dana primjene
                  
               
                     Tjelesna masa
                  
                  
                     Variranje tjelesne mase treba biti minimalno i ne smije premašivati ± 20 % srednje mase.
                  
               
                     
                        Doziranje
                     
                  
               
                     Put primjene
                  
                  
                     Oralna sonda ili potkožna injekcija
                  
               
                     Učestalost primjene
                  
                  
                     Jedna dnevna doza
                  
               
                     Volumen za sondu ili injekciju
                  
                  
                     ≤ 5ml/kg tjelesne mase (ili do 10 ml/kg tjelesne mase u slučaju vodenih otopina) (na dva mjesta uboda pri potkožnom putu)
                  
               
                     Trajanje primjene
                  
                  
                     3 uzastopna dana u modelu nezrelih životinja kojima nisu odstranjeni jajnici
                     Najmanje 3 uzastopna dana u modelu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici
                  
                  
                     7 uzastopnih dana u modelu odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici
                  
               
                     Vrijeme nekropsije
                  
                  
                     Približno 24 sata nakon posljednje doze
                  
               
                     
                        Rezultati
                     
                  
               
                     Pozitivna reakcija
                  
                  
                     Statistički znatno povećanje srednje mase maternice (mokre i/ili one kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem)
                  
               
                     Referentni estrogen
                  
                  
                     17α-etinilestradiol
                  
               SMJERNICE ZA TUMAČENJE I PRIHVAĆANJE REZULTATA
         54.   Općenito, test estrogenizacije treba smatrati pozitivnim ako postoji statistički znatno povećanje mase maternice (p < 0,05), barem kod visoke doze u usporedbi s kontrolnom skupinom za otapalo. Pozitivan rezultat dodatno je potkrijepljen demonstracijom biološki vjerojatnog odnosa između doze i opsega reakcije, imajući u vidu da preklapajuća estrogenska i antiestrogenska djelovanja ispitivane kemikalije mogu utjecati na oblik krivulje doza – reakcija.
         55.   Potrebno je paziti da se ne premaši maksimalna doza tolerancije kako bi se omogućilo smisleno tumačenje podataka. U tom pogledu treba pomno procijeniti smanjenje tjelesne mase, kliničke znakove i ostale nalaze.
         56.   Mase maternice kontrolne skupine nosača važne su za prihvaćanje podataka uterotropnog biotesta. Visoke kontrolne vrijednosti mogu narušiti reakciju biotesta i sposobnost otkrivanja vrlo slabih agonista estrogena. U recenzijama literature i podacima dobivenim tijekom validacije uterotropnog biotesta ukazuje se na to da slučajevi srednjih vrijednosti visoke kontrole nastaju spontano, posebno u nezrelih životinja (2) (3) (6) (9). S obzirom na to da masa maternice nezrelih štakora ovisi o brojnim varijablama poput soja ili tjelesne mase, ne može se navesti krajnja gornja granica mase maternice. Primjerice, ako mase maternica kojima je višak tekućine uklonjen upijanjem iznose između 40 i 45 mg, rezultate treba smatrati sumnjivima, a zbog vrijednosti iznad 45 mg test se može ponoviti. Međutim, to treba razmotriti od slučaja do slučaja (3) (6) (8). Pri ispitivanju na odraslim štakorima zbog nepotpunog odstranjivanja jajnika ostat će tkivo jajnika koje može proizvoditi endogeni estrogen te usporiti regresiju mase maternice.
         57.   Čini se da kontrola nosača maternice kojoj je višak tekućine uklonjen upijanjem manja od 0,09 % tjelesne mase u nezrelih štakora i manja od 0,04 % u mladih odraslih ženki kojima su odstranjeni jajnici daju prihvatljive rezultate (vidjeti tablicu 31. (2)). Ako su kontrolne mase maternice veće od navedenih vrijednosti, treba ispitati razne faktore, uključujući dob životinja, pravilno odstranjivanje jajnika, prehrambene fitoestrogene itd. te oprezno upotrebljavati negativan rezultat testa (bez indikacije estrogenskog djelovanja).
         58.   Povijesne podatke za kontrolne skupine nosača treba držati u laboratoriju. Povijesne podatke za reakcije na pozitivne referentne estrogene, poput 17α-etinilestradiola, jednako tako treba držati u laboratoriju. U laboratorijima se jednako tako može ispitivati reakcija na poznate slabe agoniste estrogena. Svi se ti podaci mogu usporediti s dostupnim podacima (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) kako bi se osigurala dovoljna osjetljivost laboratorijskih metoda.
         59.   Tijekom OECD-ove validacijske studije u masa maternica kojima je višak tekućine uklonjen upijanjem uočeno je manje varijabilnosti nego u masa mokrih maternica (6)(7). Međutim, znatna reakcija bilo koje vrijednosti ukazivala bi na to da je ispitivana kemikalija pozitivna na estrogensko djelovanje.
         60.   Uterotropna reakcija nije u potpunosti estrogenskog podrijetla. Međutim, pozitivan rezultat uterotropnog biotesta općenito treba tumačiti kao dokaz estrogenskog potencijala in vivo, zbog čega obično treba pokrenuti radnje radi daljnjih pojašnjenja (vidjeti stavak 9. i ‚OECD-ov konceptualni okvir za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija’, Prilog 2.).
         
            Slika 1.
         
         
            Shematski dijagram kirurškog odstranjivanja jajnika
         
         Postupak počinje otvaranjem dorsolateralnog trbušnog zida u središnjoj točki između kostalnog ruba rebara i zdjelične kosti te nekoliko milimetara lateralno od lateralnog ruba lumbalnog mišića. Treba utvrditi položaj jajnika u trbušnoj šupljini. Potom se jajnici na aseptičnoj podlozi fizički odvajaju od trbušne šupljine, između jajnika i maternice veže se konac radi kontrole krvarenja te se jajnik odvaja incizijom iznad konca na spoju jajovoda i svakog roga maternice. Nakon potvrde da nema znatnog krvarenja, trbušni zid treba zatvoriti šavom, a kožu kopčama ili odgovarajućim šavom. Životinjama treba omogućiti oporavak najmanje 14 dana prije upotrebe kako bi se masa maternice vratila.
         
            Slika 2.
         
         
            Odstranjivanje i priprema tkiva maternice za vaganje.
         
         Postupak započinje otvaranjem abdominalnog zida na spoju zdjeličnih kostiju. Potom se svaki jajnik, ako postoji, i rog maternice odvajaju od dorsalnog abdominalnog zida. Mokraćni mjehur i mokraćovodi uklanjaju se s ventralne i lateralne strane maternice i vagine. Fibrozna adhezija između rektuma i vagine odvaja se do spoja vaginalnog otvora te se može uočiti koža potrbušnice. Maternica i vagina odvajaju se od tijela incizijom vaginalnog zida neposredno iznad spoja kože potrbušnice kako je prikazano na slici. Maternicu treba odvojiti od tjelesnog zida nježnim rezanjem materničnog mezenterija u točki spajanja duž cijele duljine dorsolateralnog aspekta svakog roga maternice. Nakon odstranjivanja iz tijela, višak masnog i vezivnog tkiva treba obrezati. Ako postoje, jajnici se uklanjaju kod jajovoda, izbjegavajući gubitak luminalne tekućine iz roga maternice. Ako su životinji odstranjeni jajnici, ostatke jajnika treba pregledati radi prisutnosti bilo kakvog tkiva jajnika. Vagina se uklanja iz maternice neposredno ispod cerviksa tako da on ostane na tijelu maternice kako je prikazano na slici. Potom se maternica može izvagati.
         
            Dodatak 1.
            DEFINICIJE
            
                         
                     
                     
                        
                           Antiestrogenizacija znači sposobnost kemikalije da suzbije djelovanje estradiola 17ß u organizmu sisavca.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Kemikalija znači tvar ili smjesa.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Dan okota je nulti postnatalni dan.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Doziranje znači općenit pojam koji obuhvaća dozu, učestalost primjene doze i trajanje doziranja.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Doza znači količina primijenjene ispitivane kemikalije. Kod uterotropnog biotesta doza je izražena kao masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase ispitne životinje po danu (npr. mg/kg tjelesne mase/dan)
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Maksimalna doza tolerancije (MDT) znači najviša količina kemikalije koja nakon primjene ne uzrokuje smrt ispitnih životinja (izražena u LD0) (IUPAC, 1993.).
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Estrogenizacija znači sposobnost kemikalije da djeluje poput estradiola 17ß u organizmu sisavca.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           X-ti postnatalni dan znači X-ti dan života nakon dana okota.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Osjetljivost znači udjel svih pozitivnih/aktivnih kemikalija koje su pravilno razvrstane primjenom testa. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Specifičnost znači udjel svih negativnih/neaktivnih tvari koje su pravilno razvrstane primjenom testa. To je mjera točnosti ispitne metode koja daje kategorijske rezultate i važan je čimbenik za ocjenu relevantnosti ispitne metode.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Ispitivana kemikalija znači sve tvari ili smjese koje se ispituju tom ispitnom metodom.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Uterotropni je pojam kojim se opisuje pozitivan utjecaj na rast tkiva maternice.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Validacija znači znanstveni postupak za karakterizaciju operativnih zahtjeva i ograničenja ispitne metode te za demonstraciju njezine pouzdanosti i relevantnosti za određenu svrhu.
                     
                  
         
            Dodatak 2.
            
         NAPOMENE UZ OKVIR
         
                     
                        Napomena 1.:
                     
                  
                  
                     Ulazak na sve razine i izlazak iz njih mogući su te ovise o prirodi postojećih potreba za informacijama za potrebe procjene opasnosti i rizika.
                  
               
                     
                        Napomena 2.:
                     
                  
                  
                     Na 5. razini ekotoksikologija bi trebala uključivati krajnje točke kojima se ukazuje na mehanizme štetnih učinaka i moguću opasnost za stanovništvo.
                  
               
                     
                        Napomena 3.:
                     
                  
                  
                     Ako je višemodalnim modelom obuhvaćeno nekoliko jedinstvenih testova krajnjih točaka, tim će se modelom zamijeniti njihova upotreba.
                  
               
                     
                        Napomena 4.:
                     
                  
                  
                     Procjena svake kemikalije trebala bi se temeljiti na pojedinačnim slučajevima, uzimajući u obzir sve dostupne informacije i imajući u vidu funkciju okvirnih razina.
                  
               
                     
                        Napomena 5.:
                     
                  
                  
                     U ovom trenutku okvir ne treba smatrati sveobuhvatnim. Na 3., 4. i 5. razini njime su obuhvaćeni testovi koji su dostupni ili koji su u postupku validacije. Kad je riječ o potonjem, oni su povremeno obuhvaćeni. Nakon razvoja i validacije oni će se i formalno dodati okviru.
                  
               
                     
                        Napomena 6.:
                     
                  
                  
                     Ne treba smatrati da 5. razina uključuje samo konačne testove. Smatra se da testovi na toj razini doprinose općoj procjeni opasnosti i rizika.
                  
               
            LITERATURA
         
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD (1998.). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, od 10. do 11. ožujka 1998., ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     OECD (2003.). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003.)1.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Owens JW, Ashby J. (2002.). Critical Review and Evaluation of the Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of theValidation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445. – 520.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     OECD (2006.). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006.)33.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. (2001.). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogen icresponses: Phase 1. Environ Health Perspect. 109:785. – 94.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     OECD (2006.). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006.)34.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003.). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: PhaseTwo – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530. – 1549
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003.). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550. – 1558.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003.). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559. – 1567.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983.). Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I125]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582. – 587.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985.). The postnatal ontogeny of rat uterine glandsand age-related effects of 17β-estradiol. Endocrinology 117:2229. – 2237.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001.). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10. – 15.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953.). Estrogenic activity in a commercial animal ration. Science 118:650. – 651.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975.). The chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxicol. 13:425. – 427.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998.). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec.106:369. – 373.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     OECD (2007.). Additional data supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 67.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002.). Estrogenic isoflavones in rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145. – 157.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003.). The influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. FoodChem. Toxicol. 41:1517. – 1525.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002.). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613. – 620.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, Forsythe D. (2003.). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477. – 485.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. (2000.). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343. – 347.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, Forsythe DB. (2002.). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381. – 393.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987.). The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci. 37:596. – 601.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     OECD (2008.). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     OECD (2000.). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 19. ENV/JM/MONO(2000.)7.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     OECD (2001.). Guidance document on acute oral toxicity. OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 24. ENV/JM/MONO(2001.)4.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935.). The estimation of oestrin and of male hormone in oily solution. J. Physiol. 85:320. – 333.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936.). The nature of the estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 19: 33. – 41.
                  
               
                  
                     (29)
                  
                  
                     Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996.). Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288. – 305.
                  
               
                  
                     (30)
                  
                  
                     Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973.). The effects of various steroid on the vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284. – 291.
                  
               
                  
                     (31)
                  
                  
                     OECD (1982.). Organization for Economic Co-operation and Development – Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pariz.
                  
               
                  
                     (32)
                  
                  
                     Dorfman R.I. (1962.). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Academic Press.
                  
               
                  
                     (33)
                  
                  
                     Thigpen J. E. et al. (2004.). Selecting the appropriate rodent diet for endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401. – 416.
                  
               
                  
                     (34)
                  
                  
                     Gray L.E. and Ostby J. (1998.). Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: endocrine versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1-2): 159. – 184.
                  
               
                  
                     (35)
                  
                  
                     Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960.). Estrogen-like activity in vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807. – 1808.
                  
               
                  
                     (36)
                  
                  
                     Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004.). Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410. – 1414.
                  
               
                  
                     (37)
                  
                  
                     OECD (2007.). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.
                  
               
                  
                     (38)
                  
                  
                     Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe. SL L 276, 20.10.2010., str. 33.
                     
                  
               B.55.   HERSHBERGEROV BIOTEST NA ŠTAKORIMA: KRATKOROČNI TEST PROBIRA ZA (ANTI)ANDROGENA SVOJSTVA
         
         UVOD
         1.   Ova ispitna metoda ekvivalentna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 441 (2009.). OECD je 1998. godine započeo aktivnost velikog prioriteta preispitivanja postojećih smjernica i razvoja novih smjernica za probir i ispitivanje tvari potencijalnih endokrinih disruptora (1). Jedan element aktivnosti bio je razviti smjernice ispitivanja za Hershbergerov biotest na štakorima. Nakon nekoliko desetljeća korištenja u farmaceutskoj industriji ovaj je test 1962. godine prvo standardizirao službeni odbor stručnjaka kao alat probira za androgene kemikalije (2). U razdoblju 2001.–2007. Hershbergerov biotest na štakorima bio je podvrgnut opsežnom programu validacije koji je uključivao izradu Osnovnog dokumenta za preispitivanje (Background Review Document) (23), sastavljanje detaljnog dokumenta o metodama (3), izradu smjernica za disekcije (21) i provođenje opsežnih intralaboratorijskih i interlaboratorijskih studija radi dokazivanja pouzdanosti i obnovljivosti biotesta. Te validacijske studije provedene su upotrebom snažnog referentnog androgena (testosteron propionata (TP)), dvaju snažnih sintetskih androgena (trenbolon acetata i metil testosterona), snažnog antiandrogenog lijeka (flutamida), snažnog inhibitora sinteze (finasterida) prirodnog androgena (dihidrotestosterona – DHT), nekoliko slabo antiandrogenih pesticida (linurona, vinklozolina, procimidona, p,p' DDE), snažnog inhibitora 5α-reduktaze (finasterida) i dviju poznatih negativnih kemikalija (dinitrofenola i nonilfenola) (4) (5) (6) (7) (8). Ova ispitna metoda rezultat je dugog povijesnog iskustva s biotestom i iskustva stečenog tijekom programa validacije ispitivanja i njime dobivenih rezultata.
         2.   Hershbergerov biotest kratki je in vivo test probira u kojem se koriste pomoćna tkiva muškog reproduktivnog trakta. Test je uveden 1930-ih godina i izmijenjen 1940-ih godina tako da uključuje mišiće koji reagiraju na androgene u muškom reproduktivnom traktu (2) (9 – 15). 1960-ih godina ocjenjivano je preko 700 mogućih androgena upotrebom standardizirane verzije protokola (2) (14) te je 1960-ih godina upotreba testa i za androgene i za antiandrogene smatrana standardnom metodom (2) (15). Sadašnji biotest temelji se na promjenama mase pet tkiva ovisnih o androgenima kod kastriranih peripubertalnih mužjaka štakora. Njime se ocjenjuje sposobnost kemikalije da izazove biološko djelovanje koje odgovara agonistima androgena, antagonistima androgena ili inhibitorima 5α-reduktaze. Pet ciljnih tkiva ovisnih o androgenima obuhvaćenih ovom ispitnom metodom jesu: ventralna prostata (VP), sjemeni vezikul (SV) (uključujući tekućinu i koagulirajuće žlijezde), levator ani-bulbokavernozni mišić (LABC), parne Cowperove žlijezde (COW) i glans penisa (GP). U kastriranog peripubertalnog mužjaka štakora svih tih pet tkiva reagira na androgene povećanjem apsolutne mase. Kada se ta tkiva stimuliraju na povećanje mase primjenom snažnog referentnog androgena, svih tih pet tkiva odgovara na antiandrogene smanjenjem apsolutne mase. Primarni model za Hershbergerov biotest kirurški je kastrirani peripubertalni mužjak, koji je validiran u fazama 1., 2. i 3. programa validacije Hershbergerova biotesta.
         3.   Hershbergerov biotest upotrebljava se kao mehanistički in vivo test probira za agoniste androgena, antagoniste androgena i inhibitore 5α-reduktaze te njegovu primjenu treba gledati u kontekstu ‚Konceptualnog okvira OECD-a za ispitivanje i ocjenjivanje kemikalija endokrinih disruptora’ (Dodatak 2.). U tom Konceptualnom okviru Hershbergerov biotest sadržan je u razini 3. kao in vivo test kojim se dobivaju podaci o jednom endokrinom mehanizmu, tj. (anti)androgenosti. Namijenjen je da bude uključen u bateriju in vitro i in vivo testova za utvrđivanje kemikalija s potencijalom interakcije s endokrinim sustavom, što u konačnici dovodi do ocjene opasnosti i rizika za zdravlje ljudi ili za okoliš.
         4.   Radi zabrinutosti za dobrobit životinja zbog postupka kastracije, pokušalo se upotrijebiti intaktne (nekastrirane) stimulirane mužjake upravo odbijene od sise kao alternativnog modela za Hershbergerov biotest kako bi se izbjegla kastracija. Ispitna metoda sa stimuliranim mužjacima upravo odbijenima od sise validirana je (24); međutim, tijekom validacijskih studija pokazalo se da verzijom Hershbergerova biotesta uz upotrebu mužjaka upravo odbijenih od sise nije moguće konzistentno utvrditi učinke na masu organa ovisnih o androgenima uz upotrebu slabih antiandrogena kod ispitivanih doza. Stoga ona nije uključena u ovu ispitnu metodu. Međutim, prepoznavajući da njezino korištenje ne pruža samo korist za dobrobit životinja, već da može pružiti i informacije o drugim načinima djelovanja, dostupna je u Smjernici OECD-a 115 (25).
         POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
         5.   Agonisti i antagonisti androgena djeluju kao ligandi za androgene receptore i mogu aktivirati odnosno inhibirati transkripciju gena koji kontrolira taj receptor. Osim toga, neke kemikalije inhibiraju konverziju testosterona u snažniji prirodni androgen dihidrotestosteron u nekim ciljnim tkivima za androgene (inhibitori 5α-reduktaze). Takve kemikalije imaju potencijal uzrokovati štetne učinke po zdravlje, uključujući reproduktivne i razvojne učinke. Stoga postoji regulatorna potreba za brzom ocjenom i vrednovanjem kemikalije kao mogućeg agonista ili antagonista androgena ili inhibitora 5α-reduktaze. Iako informativan, afinitet liganda za androgeni receptor izmjeren vezanjem na receptor ili transkripcijskom aktivacijom gena izvjestitelja in vitro nije jedina determinanta moguće opasnosti. Druge determinante uključuju metaboličku aktivaciju i deaktivaciju nakon ulaska u tijelo, distribuciju kemikalije u ciljna tkiva i izlučivanje iz tijela. Zbog toga se pojavljuje potreba probira na moguće djelovanje kemikalije in vivo pod odgovarajućim uvjetima i izloženosti. In vivo vrednovanje manje je kritično ako su poznata svojstva kemikalije u pogledu Apsorpcije – Distribucije – Metabolizma – Uklanjanja (ADME). Tkiva ovisna o androgenima odgovaraju brzim i snažnim rastom na stimulaciju androgenima, posebno u kastriranih peripubertalnih mužjaka štakora. Glodavci, a osobito štakori, isto se tako široko upotrebljavaju u studijama toksičnosti za karakterizaciju opasnosti. Stoga je verzija testa u kojoj se upotrebljavaju kastrirani peripubertalni štakori primjerena za in vivo probir agonista i antagonista androgena i inhibitora 5α-reduktaze.
         6.   Ova ispitna metoda temelji se na protokolima korištenima u validacijskoj studiji OECD-a koja se pokazala pouzdanom i ponovljivom u intralaboratorijskim i interlaboratorijskim studijama (4) (5) (6) (7) (8). U ovoj ispitnoj metodi prikazani su postupci i s androgenima i s antiandrogenima.
         7.   Iako je bilo određenih varijacija u dozi TP-a upotrijebljenoj za utvrđivanje antiandrogena u programu validacije Hershbergerova biotesta OECD-a u različitim laboratorijima (0,2 u odnosu na 0,4 mg/kg/dnevno, supkutanom injekcijom), postojala je mala razlika između tih dviju varijanata protokola u pogledu sposobnosti utvrđivanja slabog ili snažnog antiandrogenog djelovanja. Međutim, jasno je da doza TP-a ne smije biti ni previsoka kako ne bi blokirala učinke slabih antagonista androgenih receptora (AR) ni tako niska da androgena tkiva pokažu slabu reakciju rasta čak i bez istovremene primjene antiandrogena.
         8.   Reakcija rasta pojedinih tkiva ovisnih o androgenima nije u potpunosti androgenog podrijetla, tj. i druge kemikalije koje nisu agonisti androgena mogu uzrokovati promjenu mase određenih tkiva. Međutim, reakcija istovremenog rasta nekoliko vrsta tkiva potkrepljuje postojanje mehanizma specifičnijeg za androgene. Na primjer, velike doze snažnih estrogena mogu povećati masu sjemenih vezikula; međutim, druga tkiva ovisna o androgenima u testu ne reagiraju na sličan način. Antiandrogene kemikalije mogu djelovati ili kao antagonisti androgenih receptora ili kao inhibitori 5α-reduktaze. Inhibitori 5α-reduktaze imaju promjenjiv učinak zbog toga što se konverzija u snažniji dihidrotestosteron razlikuje s obzirom na vrstu tkiva. Antiandrogeni koji inhibiraju 5α-reduktazu, kao što je finasterid, imaju izraženiji učinak na ventralnu prostatu nego na druga tkiva u usporedbi sa snažnim antagonistom AR-a, kao što je flutamid. Ova razlika u reakciji tkiva može se upotrebljavati za razlikovanje između načina djelovanja posredovanih AR-om i 5α-reduktazom. Osim toga, androgeni receptor evolucijski je povezan s receptorom drugih steroidnih hormona te neki drugi hormoni, kada se primijene u visokim, suprafiziološkim dozama, mogu vezati i antagonizirati učinke poticanja rasta TP-a (13). Nadalje, vjerojatno je i da bi povećani metabolizam steroida i posljedično smanjenje testosterona u serumu mogli smanjiti rast tkiva ovisan o androgenima. Stoga svaki pozitivan rezultat u Hershbergerovu biotestu treba uobičajeno vrednovati primjenom pristupa mase dokaza, uključujući testove in vitro, kao što su testovi vezivanja AR-a i estrogenskih receptora (ER) i odgovarajući testovi transkripcijske aktivacije, ili iz drugih testova in vivo kojima se ispituju slična ciljna tkiva za androgene kao što je test na pubertalnim mužjacima, 15-dnevni test na intaktnim odraslim mužjacima ili 28-dnevne ili 90-dnevne studije s ponovljenim dozama.
         9.   Iskustvo upućuje na to da su ksenobiotski androgeni rjeđi od ksenobiotskih antiandrogena. Stoga je za očekivati da će se Hershbergerov biotest najčešće upotrebljavati za probir antiandrogena. Međutim, bez obzira na to, postupak ispitivanja na androgene mogao bi se preporučiti za steroidne kemikalije ili kemikalije slične steroidima ili za kemikalije za koje pretpostavka mogućih androgenih učinaka proizlazi iz metoda sadržanih u razini 1. ili 2. konceptualnog okvira (Dodatak 2.). Slično tome, štetni učinci povezani s (anti)androgenim profilima mogu se uočiti u testovima razine 5., što dovodi do potrebe za procjenom djeluje li kemikalija endokrinim načinom djelovanja.
         10.   Potvrđeno je da svi postupci u kojima se upotrebljavaju životinje trebaju biti sukladni s lokalnim standardima brige o životinjama; opisi brige i tretmana navedeni u nastavku minimalni su standardi provedbe i bit će zamijenjeni lokalnim propisima kao što je Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (26). OECD je dao dodatne smjernice o humanom postupanju sa životinjama (17).
         11.   Kao i kod svih biotestova u kojima se koriste pokusne životinje, treba pomno razmotriti potrebu za provođenjem ove studije. U osnovi mogu postojati dva razloga za takvu odluku:
         
                     —
                  
                  
                     velik potencijal izloženosti (razina 1. konceptualnog okvira) ili indikacije (anti)androgenosti u testovima in vitro (razina 2.) koji podupiru provedbu istraživanja o tome mogu li se takvi učinci pojaviti in vivo,
                  
               
                     —
                  
                  
                     učinci koji upućuju na (anti)androgenost u in vivo testovima razine 4. ili 5. koji podupiru provedbu istraživanja specifičnog načina djelovanja, tj. kako bi se utvrdilo jesu li učinci posljedica (anti)androgenog mehanizma.
                  
               12.   Definicije koje se upotrebljavaju u ovoj ispitnoj metodi navedene su u Dodatku 1.
         NAČELO TESTA
         13.   Pri Hershbergerovu biotestu osjetljivost se postiže upotrebom mužjaka s minimalnom proizvodnjom androgena. To se postiže upotrebom kastriranih mužjaka pod uvjetom da je nakon kastracije proteklo dovoljno vremensko razdoblje za regresiju ciljnih tkiva na minimalnu i ujednačenu polaznu masu. Tako kod probira potencijalnog androgenog djelovanja postoje niske endogene razine cirkulirajućih androgena, os hipotalamus – hipofiza – gonade nije to u stanju kompenzirati povratnim mehanizmima, sposobnost tkiva na reakciju je maksimizirana te je početna varijabilnost mase tkiva svedena na najmanju moguću mjeru. Kod probira potencijalnog antiandrogenog djelovanja može se postići konzistentniji dobitak na masi tkiva kada se tkiva stimuliraju referentnim androgenom. Posljedično, za Hershbergerov biotest potrebno je samo 6 životinja po skupini koja prima određenu dozu dok se za druge testove s intaktnim pubertalnim ili odraslim mužjacima preporučuje korištenje 15 mužjaka po skupini koja prima određenu dozu.
         14.   Kastraciju peripubertalnih mužjaka štakora treba provoditi na odgovarajući način upotrebom odobrenih anestetika i aseptičnom tehnikom. Prvih nekoliko dana nakon operacije treba primijeniti analgetike kako bi se uklonile postoperacijske tegobe. Kastracija povećava preciznost testa kod određivanja slabih androgena i antiandrogena uklanjanjem kompenzatornih povratnih endokrinih mehanizama prisutnih kod intaktnih životinja koji mogu ublažiti učinke primijenjenih androgena i antiandrogena te uklanjanjem velike interindividualne varijabilnosti razina testosterona u serumu. Stoga se kastracijom smanjuje broj životinja potrebnih za probir na ta endokrina djelovanja.
         15.   Pri probiru potencijalnog androgenog djelovanja ispitivana se kemikalija primjenjuje svakodnevno oralnom intubacijom ili supkutanom (sc) injekcijom tijekom deset uzastopnih dana. Ispitivane kemikalije primjenjuju se na najmanje dvije tretirane skupine pokusnih životinja primjenom jedne doze po skupini. Životinje se podvrgavaju nekropsiji oko 24 sata nakon primjene posljednje doze. Statistički značajno povećanje mase dvaju ili više ciljnih organa u skupina tretiranih ispitivanom kemikalijom u usporedbi s kontrolnom skupinom koja je primala nosač upućuje na to da je ispitivana kemikalija pozitivna na potencijalno androgeno djelovanje (vidjeti stavak 60.). Androgeni, kao što je trenbolon, koji ne mogu biti reducirani 5α – reduktazom, imaju izraženije učinke na LABC i GP u odnosu na TP, ali povećani rast treba se prikazati na svim tkivima.
         16.   Pri probiru potencijalnog antiandrogenog djelovanja ispitivana se kemikalija primjenjuje svakodnevno oralnom intubacijom ili supkutanom injekcijom tijekom deset uzastopnih dana zajedno s dnevnim dozama TP-a (0,2 ili 0,4 mg/kg/dnevno) sc. injekcijom. U programu validacije utvrđeno je da se može koristiti ili 0,2 ili 0,4 mg/kg/dnevno TP-a zbog toga što su obje doze bile učinkovite kod utvrđivanja antiandrogena te stoga za korištenje u testu treba odabrati samo jednu dozu. Graduirane doze ispitivane kemikalije primjenjuju se na najmanje tri tretirane skupine pokusnih životinja primjenom jedne doze po skupini. Životinje se podvrgavaju nekropsiji oko 24 sata nakon primjene posljednje doze. Statistički značajno smanjenje mase dvaju ili više ciljnih organa u skupina tretiranih ispitivanom kemikalijom i TP-om u usporedbi s kontrolnom skupinom koja je primala samo TP upućuje na to da je ispitivana kemikalija pozitivna na potencijalno antiandrogeno djelovanje (vidjeti stavak 61.).
         OPIS METODE
         
            Odabir vrste i soja
         
         17.   Od 1930-ih godina štakori se rutinski upotrebljavaju za Hershbergerov biotest. Iako je biološki vjerojatno da bi i štakori i miševi imali slične reakcije, na temelju 70 godina iskustva s modelom štakora, za Hershbergerov biotest štakor je vrsta izbora. Osim toga, s obzirom na to da podaci dobiveni Hershbergerovim biotestom mogu biti preliminarni podaci za dugoročnu multigeneracijsku studiju, time se omogućuje da se u obje studije upotrebljavaju životinje iste vrste, soja i podrijetla.
         18.   Ovaj protokol omogućuje da laboratoriji odaberu soj štakora koji će se upotrebljavati za test koji bi u pravilu trebao biti soj koji je laboratorij koji sudjeluje u ispitivanju upotrebljavao u prošlosti. Mogu se upotrebljavati uobičajeno korišteni sojevi laboratorijskih štakora; međutim, ne bi trebalo koristiti sojeve koji sazrijevaju znatno kasnije nakon 42. dana starosti s obzirom na to da bi kastracija tih mužjaka u dobi od 42 dana mogla onemogućiti mjerenje glansa penisa, koje se može provesti nakon što se prepucij razdvoji od tijela penisa. Tako ne bi trebalo koristiti sojeve dobivene od štakora Fisher 344, osim u rijetkim slučajevima. Štakori Fisher 344 imaju različito vrijeme spolnog razvoja u usporedbi s drugim češće upotrebljavanim sojevima kao što su sojevi Sprague Dawley ili Wistar (16). Ako se upotrebljava takav soj, štakore treba kastrirati u laboratoriju u nešto starijoj dobi i laboratorij treba moći dokazati osjetljivost upotrebljavanog soja. Laboratorij treba dati jasno obrazloženje za odabir soja štakora. Ako bi test probira mogao biti preliminarni test za studiju s oralnom primjenom ponovljenih doza, reproduktivnu ili razvojnu studiju, ili dugoročnu studiju, u svim studijama treba po mogućnosti upotrebljavati životinje istog soja i podrijetla.
         
            Uvjeti smještaja i prehrane
         
         19.   Svi postupci trebali bi biti sukladni s lokalnim standardima brige za laboratorijske životinje. Ovi opisi brige i tretmana minimalni su standardi provedbe i bit će zamijenjeni strožim lokalnim propisima, kao što je Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (26). Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (unutar raspona od oko ± 3 °C). Relativna vlaga treba biti minimalno 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Cilj bi trebao biti relativna vlaga od 50 – 60 %. Osvjetljenje treba biti umjetno. Dnevni redoslijed svjetla treba biti 12 sati svjetla, 12 sati tame.
         20.   Preporučljiv je smještaj u skupinama u odnosu na izolaciju zbog mlade dobi životinja i činjenice da su štakori društvene životinje. Smještanjem dviju ili tri životinja po kavezu izbjegava se prenapučenost i s njom povezan stres koji bi mogao ometati hormonalnu kontrolu razvoja pomoćnog spolnog tkiva. Kaveze treba temeljito očistiti kako bi se uklonili mogući kontaminanti i smjestiti na takav način da se mogući učinci zbog smještaja kaveza svedu na najmanju moguću mjeru. Kavezima odgovarajuće veličine (~2 000 kvadratnih centimetara) sprečava se prenapučenost.
         21.   Svaku životinju treba individualno označiti (npr. oznakom ili markicom na uhu) primjenom humane metode. Metodu identifikacije treba zabilježiti.
         22.   Laboratorijsku hranu i vodu za piće treba osigurati ad libitum. Laboratoriji koji provode Hershbergerov biotest trebali bi upotrebljavati laboratorijsku prehranu koju uobičajeno upotrebljavaju kod rada na ispitivanju kemikalija. U studijama validacije biotesta nisu uočeni učinci ili varijacije koje bi se mogle pripisati prehrani. Upotrijebljenu prehranu treba zabilježiti i zadržati uzorak laboratorijske hrane za moguću buduću analizu.
         
            Kriteriji učinkovitosti za masu organa ovisnih o androgenima
         
         23.   Tijekom validacijske studije nisu postojali dokazi da je smanjenje tjelesne mase utjecalo na povećanje ili smanjenje rasta mase ciljnih tkiva (tj. to treba biti ponderirano u ovoj studiji).
         24.   Među različitim sojevima štakora koji su uspješno upotrijebljeni u programu validacije, mase organa ovisnih o androgenima bile su veće u težih sojeva štakora nego u lakših sojeva. Stoga kriteriji učinkovitosti Hershbergerova biotesta ne obuhvaćaju apsolutne očekivane mase organa za pozitivne i negativne kontrolne skupine.
         25.   Budući da je koeficijent varijacije (CV) za neko tkivo u obrnuto proporcionalnom odnosu sa statističkom snagom, kriteriji učinkovitosti Hershbergerova biotesta temelje se na maksimalnim vrijednostima CV-a za svako tkivo (tablica 1.). CV-ovi se izvode iz validacijskih studija OECD-a. U slučaju negativnih rezultata laboratoriji bi trebali ispitati CV-ove iz kontrolne skupine i skupine koja je tretirana visokom dozom kako bi utvrdili jesu li premašeni maksimalni kriteriji učinkovitosti CV-a.
         26.   Studiju treba ponoviti kada: 1. tri ili više od deset mogućih pojedinačnih CV-ova u kontrolnoj skupini i u skupini koja je tretirana visokom dozom premašuje maksimume utvrđene za studije agonista i antagonista u tablici 1. i 2. najmanje dva ciljna tkiva bila su marginalno neznačajna, tj. ρ vrijednosti bile su između 0,05 i 0,10.
         
            Tablica 1.
         
         
            Maksimalni dopušteni CV-ovi određeni za ciljna pomoćna spolna tkiva za model kastriranih mužjaka u validacijskim studijama OECD-a
             (12)
            .
         
         
                     Tkivo
                  
                  
                     Antiandrogeni učinci
                  
                  
                     Androgeni učinci
                  
               
                     Sjemeni vezikuli
                  
                  
                     40 %
                  
                  
                     40 %
                  
               
                     Ventralna prostata
                  
                  
                     40 %
                  
                  
                     45 %
                  
               
                     LABC
                  
                  
                     20 %
                  
                  
                     30 %
                  
               
                     Cowperove žlijezde
                  
                  
                     35 %
                  
                  
                     55 %
                  
               
                     Glans penisa
                  
                  
                     17 %
                  
                  
                     22 %
                  
               POSTUPAK
         
            Regulatorna sukladnost i laboratorijska verifikacija
         
         27.   Za razliku od uterotrofnog testa (poglavlje B.54. ovog Priloga), za Hershbergerov test nije potrebno dokazivanje kompetencije laboratorija za započinjanje studije zbog toga što se pozitivna (testosteron propionat i flutamid) i negativna kontrola provode istodobno kao sastavni dio testa.
         
            Broj i stanje životinja
         
         28.   Svaka tretirana i kontrolna skupina treba obuhvaćati najmanje 6 životinja. Ovo se odnosi i na androgene i antiandrogene protokole.
         
            Kastracija
         
         29.   Treba postojati početno razdoblje aklimatizacije od nekoliko dana nakon primitka životinja kako bi se osiguralo da su životinje zdrave i da napreduju. Budući da u životinja koje su kastrirane prije 42. dana života ili 42. postnatalnog dana (pnd) ne mora doći do razdvajanja prepucija, životinje treba kastrirati 42. pnd ili kasnije, ne prije. Životinje se kastriraju pod anestezijom zarezivanjem skrotuma i uklanjanjem obaju testisa i epididimisa uz podvezivanje krvnih žila i sjemenovoda. Nakon provjere da nije došlo do krvarenja skrotum treba zatvoriti šavovima ili klipsama. Prvih nekoliko dana nakon operacije životinjama treba davati analgetike kako bi se ublažile postoperacijske tegobe. Ako se kastrirane životinje kupuju od dobavljača, dobavljač treba garantirati dob životinja i stupanj spolne zrelosti.
         
            Aklimatizacija nakon kastracije
         
         30.   Treba nastaviti aklimatizaciju životinja na laboratorijske uvjete kako bi se omogućila regresija mase ciljnih tkiva najmanje sedam dana nakon kastracije. Životinje treba svakodnevno promatrati te ukloniti sve životinje u kojih se pokažu znakovi bolesti ili fizičke abnormalnosti. Tako tretman primjenom doza (za studiju) može započeti već u dobi od 49. pnd, ali ne kasnije od 60. pnd. Dob pri nekropsiji ne smije biti veća od 70. pnd. Ova fleksibilnost omogućuje laboratoriju da učinkovito planira eksperimentalni rad.
         
            Tjelesna masa i randomizacija skupina
         
         31.   Razlike u individualnoj tjelesnoj masi uzrok su varijabilnosti kako unutar skupine, tako i među skupinama životinja. Povećanje varijabilnosti mase tkiva ima za posljedicu povećani koeficijent varijacije (CV) i smanjuje statističku snagu testa (koja se ponekad naziva osjetljivost testa). Stoga varijacije tjelesne mase treba kontrolirati i eksperimentalno i statistički.
         32.   Eksperimentalna kontrola uključuje izazivanje malih varijacija tjelesne mase unutar i među ispitivanim skupinama. Kao prvo, treba izbjegavati neuobičajeno male ili velike životinje i ne uključivati ih u ispitivanu kohortu. Na početku studije varijacija mase životinja ne bi smjela prelaziti ± 20 % srednje mase (npr. 175 g ± 35 g za kastrirane peripubertalne štakore). Kao drugo, životinje treba rasporediti u skupine (kako kontrolne tako i tretirane) randomizacijom distribucije mase, tako da srednja tjelesna masa svake skupine ne bude statistički različita od bilo koje druge skupine. Upotrijebljeni postupak blok randomizacije treba zabilježiti.
         33.   Budući da toksičnost može smanjiti tjelesnu masu tretiranih skupina u odnosu na kontrolnu skupinu, tjelesna masa prvog dana primjene ispitivane kemikalije može se upotrijebiti kao statistička kovarijanta umjesto tjelesne mase kod nekropsije.
         
            Doziranje
         
         34.   Kako bi se utvrdilo može li ispitivana kemikalija imati androgeno djelovanje in vivo, obično su dovoljne dvije skupine koje primaju određenu dozu ispitivane kemikalije uz pozitivnu skupinu i skupinu koja prima nosač (negativnu skupinu) (vidjeti stavak 43.) te je ovaj oblik poželjan zbog razloga dobrobiti životinja. Ako je svrha ili dobiti krivulju doza – reakcija ili ekstrapolirati na niže doze, potrebne su barem tri skupine koje primaju određenu dozu. Ako su potrebne i druge informacije, uz utvrđivanje androgene aktivnosti (kao što je procjena učinkovitosti), treba razmotriti različit režim doziranja. Za ispitivanje na antiandrogene ispitivana se kemikalija primjenjuje zajedno s referentnim androgenim agonistom. Treba upotrebljavati najmanje tri ispitne skupine s različitim dozama ispitivane kemikalije te pozitivnu i negativnu kontrolu (vidjeti stavak 44.). Osim tretmana ispitivanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnoj skupini treba postupati na isti način kao i sa životinjama iz ispitne skupine. Ako se kod primjene ispitivane kemikalije upotrebljava nosač, kontrolna skupina treba primati nosač u najvećem volumenu koji se upotrebljava kod ispitnih skupina.
         35.   Sve visine doza treba predlagati i odabirati uzimajući u obzir sve postojeće dostupne podatke o toksičnosti i (toksiko-) kinetičke podatke za ispitivanu kemikaliju ili srodne materijale. Pri određivanju najviše doze treba prvo uzeti u obzir LD50 i/ili podatke o akutnoj toksičnosti kako bi se izbjeglo ugibanje, jaka patnja ili stres u životinja (17) (18) (19) (20) te, kao drugo, treba uzeti u obzir dostupne podatke o dozama upotrijebljenima u ispitivanjima subkronične i kronične toksičnosti. Općenito, najviša doza ne smije uzrokovati smanjenje konačne tjelesne mase životinja veće od 10 % mase životinja u kontrolnoj skupini. Najviša doza treba biti ili 1. najviša doza kojom se osigurava preživljavanje životinja i koja nema značajnu toksičnost i ne uzrokuje patnju životinja nakon deset uzastopnih dana primjene sve do maksimalne doze od 1 000 mg/kg/dnevno (vidjeti stavak 36.) ili 2. doza koja izaziva (anti)androgene učinke, ovisno o tome koja je niža. Kao probir, prihvatljivi su veliki intervali između doziranja, npr. polovina log jedinice (što odgovara progresiji doze od 3,2) ili čak jedna log jedinica. Ako nisu dostupni odgovarajući podaci, može se provesti studija za utvrđivanje raspona (vidjeti stavak 37.) kao pomoć prilikom određivanja doza koje će se upotrebljavati.
         
            Granična doza
         
         36.   Ako test s graničnom dozom od 1 000 mg/kg tjelesne mase/dnevno i niža doza uz upotrebu opisanih postupaka za ovu studiju ne uspije uzrokovati statistički značajnu promjenu mase reproduktivnih organa, tada se dodatne visine doze mogu smatrati nepotrebnima. Primjenjuje se granična doza osim kada podaci o izloženosti ljudi ne upućuju na potrebu korištenja veće doze.
         
            Razmatranja o utvrđivanju raspona doza
         
         37.   Ako je potrebno, može se provesti preliminarna studija utvrđivanja raspona doza s nekoliko životinja kako bi se odabrale odgovarajuće skupine koje će primati određenu dozu (upotrebom ispitnih metoda akutne toksičnosti (poglavlja B.1.A, B.1.B ovog Priloga (27), OECD TG 425 (19))). U slučaju Hershbergerova biotesta cilj je odabrati doze koje osiguravaju preživljavanje životinja i koje nemaju značajnu toksičnost i ne izazivaju patnju životinja nakon deset uzastopnih dana primjene kemikalije do granične doze od 1 000 mg/kg/dnevno kako je navedeno u stavcima 35. i 36. U tom pogledu može se upotrijebiti jedna Smjernica OECD-a (17) u kojoj su definirani klinički znakovi koji upućuju na toksičnost ili patnju životinja. Ako je izvedivo u okviru ove studije za određivanje raspona doza nakon deset dana primjene kemikalije, ciljni organi mogu se ekscidirati i izvagati otprilike 24 sata nakon primjene posljednje doze. Ti se podaci tada mogu upotrebljavati kao pomoć kod odabira doza za glavnu studiju.
         
            Referentne kemikalije i nosač
         
         38.   Referentni androgeni agonist treba biti testosteron propionat (TP), CAS br. 57-82-5. Referentna doza TP-a može biti ili 0,2 mg/kg – tjelesne mase/dnevno ili 0,4 mg/kg – tjelesne mase/dnevno. Referentni androgeni antagonist treba biti flutamid (FT), CAS br. 1311-84-7. Referentna doza FT-a treba biti 3 mg/kg – tjelesne mase/dnevno, a FT treba primijeniti istodobno s referentnom dozom TP-a.
         39.   Preporučuje se, kad god je to moguće, najprije razmotriti upotrebu vodene otopine/suspenzije. Međutim, s obzirom na to da su brojni androgeni ligandi ili njihovi metabolički prekursori hidrofobni, najuobičajeniji pristup upotreba je otopine/suspenzije u ulju (npr. kukuruznom, kikirikijevu, sezamovu ili maslinovu ulju). Ispitivane kemikalije mogu se otopiti u minimalnoj količini od 95 % etanola ili drugih odgovarajućih otapala i razrijediti do konačne radne koncentracije u ispitnom nosaču. Toksična svojstva otapala trebala bi biti poznata te ih treba ispitati u zasebnoj kontrolnoj skupini koja prima samo otapalo. Ako se ispitivana kemikalija smatra stabilnom, može se upotrijebiti lagano zagrijavanje i snažno mehaničko djelovanje kao pomoć pri otapanju ispitivane kemikalije. Treba utvrditi stabilnost ispitivane kemikalije u nosaču. Ako je ispitivana kemikalija stabilna tijekom trajanja studije, tada se može pripremiti jedan početni alikvot ispitivane kemikalije, a specificirana razrjeđenja doze mogu se pripremati svaki dan pazeći da se izbjegne kontaminacija i kvarenje uzoraka.
         
            Primjena doza
         
         40.   TP treba primjenjivati supkutanom injekcijom, a FT oralnom intubacijom.
         41.   Ispitivana kemikalija primjenjuje se oralnom intubacijom ili supkutanom injekcijom. Prilikom odabira načina primjene treba uzeti u obzir pitanja dobrobiti životinja i fizikalna/kemijska svojstva ispitivane kemikalije. Osim toga, treba uzeti u obzir toksikološke aspekte kao što je relevantnost za način izloženosti ljudi kemikaliji (npr. oralna intubacija kao model za unos na usta, supkutana injekcija kao model za inhalaciju ili apsorpciju kožom) te postojeće toksikološke informacije i podatke o metabolizmu i kinetici (npr. potrebu za izbjegavanjem metabolizma prvog prolaza, bolju učinkovitost kod određenog načina primjene) prije nego što se započne opsežno, dugoročno ispitivanje ako su injekcijom dobiveni pozitivni rezultati.
         42.   Životinjama treba davati kemikaliju istim načinom primjene i u isto vrijeme deset uzastopnih dana u intervalima od otprilike 24 sata. Visinu doze treba svakodnevno podešavati na temelju istovremenoga svakodnevnog mjerenja tjelesne mase. Volumen doze i vrijeme njezine primjene treba bilježiti za svaki dan izlaganja. Treba obratiti pozornost da se ne premaši maksimalna doza navedena u stavku 35. kako bi se omogućilo smisleno tumačenje rezultata. U tom pogledu treba temeljito procijeniti smanjenje tjelesne mase, kliničke znakove i druge nalaze. Kod oralne intubacije treba koristiti želučanu sondu ili odgovarajuću intubacijsku kanilu. Maksimalni volumen tekućine koji se može jednokratno dati ovisi o veličini pokusne životinje. Treba postupati u skladu s lokalnim smjernicama brige o životinjama, ali volumen ne smije premašivati 5 ml/kg tjelesne mase, osim u slučaju vodenih otopina kada se može dati 10 ml/kg tjelesne mase. Kod supkutanih injekcija doze se mogu primjenjivati u dorzoskapularnoj i/ili lumbarnoj regiji sterilnom iglom (npr. profila 23 ili 25) i tuberkulinskom špricom. Brijanje mjesta injektiranja je opcionalno. Sve gubitke, curenje na mjestu injektiranja ili nepotpuno doziranje treba zabilježiti. Ukupni volumen injektiran svakom štakoru dnevno ne smije premašiti 0,5 ml/kg tjelesne mase.
         
            Specifični postupci za androgene agoniste
         
         43.   Kod ispitivanja androgenih agonista nosač je negativna kontrola, a skupina tretirana TP-om pozitivna je kontrola. Biološka aktivnost koja odgovara aktivnosti androgenih agonista ispituje se primjenom ispitivane kemikalije na tretiranim skupinama u odabranim dozama tijekom deset uzastopnih dana. Masa pet pomoćnih spolnih tkiva iz skupine koja je primala ispitivanu kemikaliju uspoređuje se sa skupinom koja je primala nosač kako bi se utvrdilo postoji li statistički značajno povećanje mase.
         
            Specifični postupci za androgene antagoniste i inhibitore 5α-reduktaze
         
         44.   Kod ispitivanja androgenih antagonista i inhibitora 5α-reduktaze skupina tretirana TP-om negativna je kontrola, a skupina kojoj su istodobno davane referentne doze TP-a i FT-a pozitivna je kontrola. Biološka aktivnost koja odgovara aktivnosti androgenih antagonista i inhibitora 5α-reduktaze ispituje se primjenom referentne doze TP-a i primjenom ispitivane kemikalije tijekom deset uzastopnih dana. Masa pet pomoćnih spolnih tkiva iz skupine koja je primala TP zajedno sa skupinama koje su primale ispitivanu kemikaliju uspoređuje se sa skupinom koja je primala samo referentne doze TP-a kako bi se utvrdilo postoji li statistički značajno smanjenje mase.
         OPAŽANJA
         
            Klinička opažanja
         
         45.   Opća klinička opažanja treba provoditi barem jednom tjedno te češće kada se uoče znakovi toksičnosti. Opažanja treba po mogućnosti provoditi u isto vrijeme svaki dan i uzimajući u obzir predviđeno razdoblje vršnih učinaka nakon primjene doze. U svih životinja treba opažati pojavu uginuća, pobola i općih kliničkih znakova kao što su promjene ponašanja, promjene na koži, krznu, očima, sluznicama, pojavu iscjedaka te izlučine i aktivnost autonomnog živčanog sustava (npr. lakrimaciju, piloerekciju, veličinu zjenica, nepravilnosti u disanju).
         46.   Sve uginule životinje treba ukloniti i uništiti bez daljnje analize podataka. Sve slučajeve uginuća životinja prije nekropsije treba uključiti u izvješće studije zajedno sa svim očiglednim razlozima uginuća. Sve umiruće životinje trebale bi biti humano usmrćene. Sve umiruće i kasnije eutanazirane životinje treba uključiti u izvješće studije s očiglednim razlozima za pobol.
         
            Tjelesna masa i potrošnja hrane
         
         47.   Sve životinje treba vagati svakodnevno s točnošću od 0,1 g, s početkom neposredno prije započinjanja tretmana, tj. prilikom raspoređivanja životinja u skupine. Kao opcionalno mjerenje, količina hrane potrošene tijekom razdoblja tretiranja može se mjeriti po kavezu vaganjem hranilica. Rezultate potrošnje hrane treba izraziti u gramima po štakoru dnevno.
         
            Disekcija i mjerenje mase tkiva i organa
         
         48.   Oko 24 sata nakon posljednje primjene ispitivane kemikalije štakore treba eutanazirati i eksangvinirati u skladu s uobičajenim postupcima laboratorija koji provodi ispitivanje te provesti nekropsiju. Metodu humanog usmrćenja treba zabilježiti u laboratorijskom izvješću.
         49.   U idealnom slučaju, redoslijed nekropsija trebao bi biti određen slučajnim odabirom među skupinama kako bi se izbjegla progresija izravno od skupina koje su primale veću dozu prema skupinama koje su primale manju dozu ili obratno koja bi mogla utjecati na podatke. Sve nalaze nekropsije, tj. patološke promjene/vidljive lezije zabilježiti i unijeti u izvješće.
         50.   Treba izmjeriti pet tkiva ovisnih o androgenima (VP, SV, LABC, COW, GP). Ta tkiva treba ekscidirati, pažljivo s njih ukloniti okolna tkiva i masno tkivo te odrediti njihovu svježu (nefiksiranu) masu. Sa svakim tkivom treba postupati s posebnom pažnjom kako bi se izbjegao gubitak tekućine i izbjeglo isušivanje, što može uzrokovati značajne pogreške i varijabilnost tako da se zabilježe manje mase. Neka tkiva mogu biti vrlo mala ili teška za disekciju te će to unijeti varijabilnost. Stoga je važno da osobe koje provode disekciju pomoćnih spolnih tkiva budu upoznate sa standardnim postupcima disekcije tih tkiva. Priručnik sa standardnim operativnim postupkom (SOP) za disekciju na raspolaganju je u OECD-u (21). Pomnjivom obukom u skladu sa smjernicom SOP-a potencijalni uzrok varijacija u studiji smanjit će se na najmanju moguću mjeru. U idealnom slučaju ista osoba trebala bi biti odgovorna za disekciju određenog tkiva kako bi se uklonile interindividualne razlike u obradi tkiva. Ako to nije moguće, nekropsiju treba planirati tako da svaka osoba radi disekciju određene vrste tkiva iz svih tretiranih skupina, a ne da jedna osoba radi disekciju svih tkiva iz kontrolne skupine, dok je druga osoba odgovorna za tretirane skupine. Svako pomoćno spolno tkivo treba izvagati bez bojanja s točnošću od 0,1 mg te zabilježiti masu za svaku životinju.
         51.   Neka tkiva mogu biti vrlo mala ili teška za disekciju te će to unijeti varijabilnost. Prethodni radovi upućuju na raspon koeficijenta varijacija (CVs) za koji se čini da se razlikuje ovisno o kvaliteti rada laboratorija. U nekoliko slučajeva velike razlike u apsolutnoj masi tkiva kao što je VP i COWS uočene su unutar pojedinog laboratorija.
         52.   Opcionalno se može mjeriti masa jetara, bubrega u paru i obiju nadbubrežnih žlijezda u paru. I ovdje s tkiva treba ukloniti sve okolno vezivno i masno tkivo. Jetra treba izvagati i zabilježiti masu s točnošću od 0,1 g, a bubrege u paru i nadbubrežne žlijezde u paru treba izvagati i zabilježiti masu s točnošću od 0,1 mg. Na jetra, bubrege i nadbubrežne žlijezde ne utječu samo androgeni; oni daju i korisne indicije sustavne toksičnosti.
         53.   Mjerenje luteinizirajućeg hormona (LH) u serumu, folikulostimulirajućeg hormona (FSH) i testosterona (T) je opcionalno. Razine testosterona u serumu korisne su za utvrđivanje uzrokuje li ispitivana kemikalija metabolizam testosterona u jetrima, smanjujući razine u serumu. Bez podataka o testosteronu moglo bi se činiti da takav učinak nastaje antiandrogenim mehanizmom. Razine LH-a pružaju informacije o sposobnosti određenog antiandrogena ne samo da smanji masu organa, već i da utječe na funkciju hipotalamus – hipofiza, što u dugoročnim studijama može dovesti do tumora testisa. FSH je važan hormon za spermatogenezu. Mjerenja T4 i T3 isto su tako opcionalna, a ona bi mogla pružiti dodatne informacije o sposobnosti remećenja homeostaze hormona štitne žlijezde. Ako se provode mjerenja hormona, štakore treba anestezirati prije nekropsije i krv uzeti punkcijom srca, a metodu anestezije treba pažljivo odabrati kako ne bi utjecala na mjerenje hormona. Treba zabilježiti metodu pripreme seruma, izvor kompleta za radioimunotest ili druga mjerenja, analitičke postupke te rezultate. Razine LH-a treba navesti kao ng po ml seruma, a T treba isto navesti kao ng po ml seruma.
         54.   Disekcija tkiva opisana je kako slijedi s detaljnim smjernicama za disekciju s fotografijama objavljenima kao dodatni materijali kao dio programa validacije (21). Video s disekcijom isto je tako na raspolaganju na internetskoj stranici Korejske uprave za hranu i lijekove (22).
         
                     —
                  
                  
                     Pri ventralnoj površini životinje prema gore utvrdite je li se prepucij penisa razdvojio od glansa penisa. Ako jest, povucite prepucij i uklonite glans penisa, izmjerite ga (s točnošću od 0,1 mg), i zabilježite masu.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Otvorite abdominalnu kožu i stjenku, otkrivajuću utrobu. Ako se važu opcionalni organi, izvadite i izvažite jetra s točnošću od 0,1 g, uklonite želudac i crijeva, izvadite i izvažite bubrege u paru i nadbubrežne žlijezde u paru s točnošću od 0,1 mg. Ovom disekcijom otkriva se mokraćni mjehur i započinje disekcija ciljnih muških pomoćnih tkiva.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Kako biste disecirali VP, odvojite mokraćni mjehur od sloja ventralnih mišića prerezavši vezivno tkivo po sredini. Odmaknite mokraćni mjehur prema naprijed prema sjemenim vezikulima (SV), otkrivajući lijevi i desni režanj ventralne prostate (koji je pokriven slojem masnog tkiva). Pažljivo odvojite masno tkivo s desnog i lijevog režnja VP-a. Pažljivo odmaknite desni režanj VP-a od uretre i disecirajte režanj iz uretre. Još pridržavajući desni režanj VP-a pažljivo odmaknite lijevi režanj VP-a od uretre i zatim ga disecirajte; izvažite s točnošću od 0,1 mg i zabilježite masu.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Kako biste disecirali SVCG, odmaknite mokraćni mjehur kaudalno, otkrivajući vas deferens i desni i lijevi režanj sjemenih vezikula zajedno s koagulirajućim žlijezdama (SVCG). Spriječite istjecanje tekućine postavljanjem hemostata na bazi SVCG-a, na mjestu na kojem se vas deferens spaja na uretru. Pažljivo disecirajte SVCG, uz postavljeni hemostat uklonite masno tkivo i adnekse, stavite ih u tariranu posudicu za vaganje, skinite hemostat, izvažite s točnošću od 0,1 mg i zabilježite masu.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Kako biste disecirali levator ani i bulbokavernozne mišiće (LABC), mišići i baza penisa su otkriveni. Mišići LA omotani su oko kolona, dok su prednji mišići LA-a i BC-a pričvršćeni na bulbus penisa. Uklanja se koža i adneksi iz perianalne regije koji se prostiru od baze penisa do prednjeg kraja anusa. Mišići BC-a se postupno diseciraju od bulbusa penisa i tkiva. Kolon se prereže na dva dijela te se cijeli LABC može disecirati i ukloniti. S LABC-a treba ukloniti masno tkivo i adnekse, izvagati ih s točnošću od 0,1 mg, i zabilježiti masu.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Nakon što je LABC uklonjen, vidljive su Cowperove ili bulbouretralne žlijezde (COW) na bazi, i lagano dorzalno do, bulbusa penisa. Potrebna je pažljiva disekcija kako bi se izbjeglo zarezivanje tanke kapsule te spriječilo istjecanje tekućine. Izvažite COW u paru s točnošću od 0,1 mg, i zabilježite masu.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Osim toga, ako tijekom nekropsije i disekcije dođe do gubitka tekućine iz bilo koje žlijezde, to treba zabilježiti.
                  
               55.   Ako ocjenjivanje svake kemikalije zahtijeva nekropsiju više životinja nego što je prihvatljivo u jednom danu, započinjanje studije može se provesti u dva stupnja tijekom dvaju uzastopnih dana, što ima za posljedicu provođenje nekropsije i postupaka povezanih s njom tijekom dva dana. Ako se postupak tako stupnjuje, u jednom danu treba obraditi jednu polovinu životinja po tretiranoj skupini.
         56.   Nakon nekropsije trupla treba uništiti na odgovarajući način.
         IZVJEŠĆIVANJE
         
            Podaci
         
         57.   Podatke treba navesti pojedinačno (tj. tjelesnu masu, masu pomoćnih spolnih tkiva, opcionalna mjerenja i druge reakcije i opažanja) te za svaku skupinu životinja (srednju vrijednost i standardne devijacije svih provedenih mjerenja). Podatke treba sažeto prikazati u tabličnom obliku. Podaci trebaju prikazivati broj životinja na početku testa, broj životinja koje su tijekom testa uginule ili pokazivale znakove toksičnosti, opis uočenih znakova toksičnosti, uključujući vrijeme njihove pojave, trajanje i masu.
         58.   Konačno izvješće treba obuhvaćati sljedeće podatke:
         
            Objekt u kojem se provodi ispitivanje
         
         
                     —
                  
                  
                     naziv objekta, lokacija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     voditelj ispitivanja i drugo osoblje sa zaduženjima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     datum početka i završetka studije, tj. prvi dan primjene ispitivane kemikalije odnosno zadnji dan nekropsije.
                  
               
            Ispitivana kemikalija
         
         
                     —
                  
                  
                     podrijetlo, broj lota/serije, identifikacijski podaci, čistoća, puna adresa dobavljača i karakterizacija ispitivane kemikalije ili kemikalija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fizikalna priroda i, prema potrebi, fizikalno-kemijska svojstva,
                  
               
                     —
                  
                  
                     uvjeti skladištenja i metoda i učestalost pripreme razrjeđenja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     svi dobiveni podaci o stabilnosti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sve analize dozirnih otopina/suspenzija.
                  
               
            Nosač
         
         
                     —
                  
                  
                     karakterizacija nosača (identifikacijski podaci, dobavljač i broj serije),
                  
               
                     —
                  
                  
                     obrazloženje za odabir nosača (ako se ne radi o vodi).
                  
               
            Pokusne životinje i postupci držanja životinja
         
         
                     —
                  
                  
                     upotrijebljena vrsta/soj i obrazloženje za odabir,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podrijetlo ili dobavljač životinja, uključujući punu adresu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj i dob isporučenih životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     uvjeti držanja (temperatura, osvjetljenje itd.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     prehrana (naziv, vrsta, dobavljač, broj serije, sadržaj ako je poznat, sadržaj fitoestrogena),
                  
               
                     —
                  
                  
                     stelja (naziv, vrsta, dobavljač, sastav),
                  
               
                     —
                  
                  
                     uvjeti držanja u kavezima i broj životinja po kavezu.
                  
               
            Uvjeti testa
         
         
                     —
                  
                  
                     dob kod kastracije i trajanje aklimatizacije nakon kastracije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinačna masa životinja na početku studije (s točnošću od 0,1 g),
                  
               
                     —
                  
                  
                     postupak randomizacije i evidencija raspodjele u skupne koje primaju nosač, referentnu tvar i ispitivanu kemikaliju te raspodjele u kaveze,
                  
               
                     —
                  
                  
                     srednja vrijednost i standardna devijacija tjelesne mase za svaku skupinu i svaki dan kada je vršeno vaganje tijekom cijele studije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     obrazloženje za odabir doze,
                  
               
                     —
                  
                  
                     način primjene ispitivane kemikalije i obrazloženje za izbor načina izlaganja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ako je provođen test antiandrogenosti, tretman TP-om (doza i volumen),
                  
               
                     —
                  
                  
                     tretman ispitivanom kemikalijom (doza i volumen),
                  
               
                     —
                  
                  
                     vrijeme doziranja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     postupci nekropsije, uključujući način eksangvinacije i anestezije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ako su provođene analize u serumu, treba navesti pojedinosti o metodi. Na primjer, ako se koristi RIA, treba navesti postupak RIA, podrijetlo kompleta za RIA, datume isteka valjanosti kompleta, postupak brojanja scintilacijskim brojačem i standardizaciju.
                  
               
            Rezultati
         
         
                     —
                  
                  
                     svakodnevna opažanja za svaku životinju tijekom primjene doza, uključujući:
                  
               
                     —
                  
                  
                     tjelesnu masu (s točnošću od 0,1 g),
                  
               
                     —
                  
                  
                     kliničke znakove (ako ih je bilo),
                  
               
                     —
                  
                  
                     sva mjerenja ili bilješke o potrošnji hrane,
                  
               
                     —
                  
                  
                     opažanja kod nekropsije za svaku životinju, uključujući:
                  
               
                     —
                  
                  
                     datum nekropsije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ispitnu skupinu iz koje je životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     identifikacijske podatke o životinji,
                  
               
                     —
                  
                  
                     osobu koja je obavila disekciju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     vrijeme u danu kada je provedena nekropsija i disekcija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     dob životinje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     konačnu tjelesnu masu kod nekropsije, uz navođenje svih statistički značajnih povećanja ili smanjenja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     redoslijed eksangvinacije i disekcije životinja kod nekropsije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     masu pet ciljnih tkiva ovisnih o androgenima:
                  
               
                     —
                  
                  
                     ventralne prostate (s točnošću od 0,1 mg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     sjemenih vezikula uključujući koagulirajuće žlijezde, uključujući tekućinu (u paru, s točnošću od 0,1 mg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     kompleksa levator ani plus bulbokavernozni mišić (s točnošću od 0,1 mg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     Cowperove žlijezde (svježe izvagane – u paru, s točnošću od 0,1 mg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     glansa penisa (svježe izvagan s točnošću od 0,1 mg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     masu opcionalnih tkiva, ako se mjerenje provodi:
                  
               
                     —
                  
                  
                     jetara (s točnošću od 0,1 g),
                  
               
                     —
                  
                  
                     bubrega (u paru, s točnošću od 0,1 mg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     nadbubrežnih žlijezda (u paru, s točnošću od 0,1 mg),
                  
               
                     —
                  
                  
                     opće napomene i komentare,
                  
               
                     —
                  
                  
                     analize hormona u serumu, ako se provode,
                     
                                 —
                              
                              
                                 LH u serumu (opcionalno – ng po ml seruma),
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 T u serumu (opcionalno – ng po ml seruma),
                              
                           
               
                     —
                  
                  
                     opće napomene i komentare.
                  
               
            Sažeti prikaz podataka
         
         Podatke treba sažeto prikazati u tabličnom obliku navodeći veličinu uzorka za svaku skupinu, srednju vrijednost i standardnu pogrešku srednje vrijednosti ili standardnu devijaciju. U tablicama treba biti uključena tjelesna masa kod nekropsije, promjene tjelesne mase od početka primjene doza do nekropsije, masa ciljnih pomoćnih spolnih tkiva i sve mase opcionalnih organa.
         
            Diskusija rezultata
         
         
            Analiza rezultata
         
         59.   Treba provesti statističku analizu tjelesne mase i mase organa kod nekropsije u pogledu karakteristika kao što je homogenost varijance uz odgovarajuću transformaciju podataka po potrebi. Tretirane skupine treba usporediti s kontrolnom skupinom upotrebom tehnika kao što je ANOVA nakon koje se provodi usporedba u parovima (npr. Dunnettov jednostrani test) i kriterij za statističku razliku, na primjer, p ≤ 0,05. Treba identificirati skupine koje postižu statističku značajnost. Međutim, treba izbjegavati ‚relativne mase organa’ zbog nevaljanih statističkih pretpostavki na kojima se temelji takvo manipuliranje podacima.
         60.   Za ispitivanje agonizma androgena kontrola treba biti skupina koja je primala samo nosač. Način karakteristike djelovanja ispitne kemikalije može dovesti do različitih relativnih reakcija među tkivima, na primjer trenbolon, koji se ne može reducirati 5 alfa-inhibitorima, ima izraženije učinke na LABC i GP nego TP. Statistički značajno povećanje (p ≤ 0,05) mase bilo koja dva ili više od pet ciljnih tkiva ovisnih o androgenima (VP, LABC, GP, CG i SVCG) treba smatrati pozitivnim rezultatom androgenog agonista, a sva ciljna tkiva trebala bi pokazivati određeni stupanj povećanog rasta. Kombinirana procjena reakcije svih tkiva pomoćnih spolnih organa (ASO) može se postići upotrebom odgovarajuće multivarijacijske analize podataka. To može poboljšati analizu, posebno u slučajevima kada samo jedno tkivo daje statistički značajnu reakciju.
         61.   Za ispitivanje antagonizma androgena kontrola treba biti referentna ispitna skupina koja je primala androgen (samo testosteron propionat). Način karakteristike djelovanja ispitne kemikalije može dovesti do različitih relativnih reakcija među tkivima, na primjer inhibitori 5 α-reduktaze, kao što je finasterid, imaju izrazitije učinke na ventralnu prostatu nego na druga tkiva u usporedbi sa snažnim AR antagonistima, kao što je flutamid. Statistički značajno smanjenje (p ≤ 0,05) mase bilo koja dva ili više od pet ciljnih tkiva ovisnih o androgenima (VP, LABC, GP, CG i SVCG) u vezi s tretmanom samo TP-om treba smatrati pozitivnim rezultatom androgenog antagonista, a sva ciljna tkiva trebala bi pokazivati određeni stupanj smanjenog rasta. Kombinirana procjena reakcije svih ASO tkiva može se postići upotrebom odgovarajuće multivarijacijske analize podataka. To može poboljšati analizu, posebno u slučajevima kada samo jedno tkivo daje statistički značajnu reakciju.
         62.   Podatke treba sažeto prikazati u tabličnom obliku koji uključuje srednju vrijednost, standardnu pogrešku srednje vrijednosti (standardna devijacija isto bi bila prihvatljiva) i veličinu uzorka za svaku skupinu. Treba uključiti i tablice s pojedinačnim podacima. Treba ispitati pojedinačne vrijednosti, srednju vrijednost, vrijednosti SE-a (SD-a) i CV-a za kontrolne podatke kako bi se utvrdilo zadovoljavaju li kriterije prihvatljivosti za sukladnost s očekivanim povijesnim vrijednostima. Na temelju CV-a koji premašuju vrijednosti CV-a navedene u tablici 1. (vidjeti stavke 25. i 26.) za svaku masu organa treba utvrditi postoje li pogreške u bilježenju ili unosu podataka ili postoji li mogućnost da laboratorij još nije ovladao preciznom disekcijom tkiva ovisnih o androgenima te je potrebna dodatna obuka/praksa. Općenito, CV-ovi (standardna devijacija podijeljena sa srednjom masom organa) su reproducibilni od laboratorija do laboratorija i od studije do studije. Prikazani podaci trebali bi uključivati najmanje: ventralnu prostatu, sjemeni vezikul, levator ani plus bulbokavernozni mišić, Cowperove žlijezde, glans penis, jetra te tjelesnu masu i promjenu tjelesne mase od početka primjene doza do nekropsije. Podaci se mogu prikazati i nakon podešavanja kovarijance tjelesne mase, ali to ne smije zamijeniti prikazivanje nepodešenih podataka. Osim toga, ako ne dođe do razdvajanja prepucija (PPS) ni u jednoj od skupina, treba zabilježiti učestalost PPS-a i statistički usporediti s kontrolnom skupinom korištenjem Fisherova egzaktnog testa.
         63.   Pri provjeri točnosti računalno unesenih podataka s originalno zapisanim podacima treba pažljivo proučiti vrijednosti mase organa koje nisu biološki vjerojatne ili variraju više od tri standardne devijacije od srednjih vrijednosti tretiranih skupina te će ih možda biti potrebno odbaciti, s obzirom na to da su to vjerojatno pogreške nastale tijekom bilježenja.
         64.   Usporedba rezultata studije s vrijednostima CV-a OECD-a (u tablici 1.) često je važan korak u interpretaciji valjanosti rezultata studije. U laboratoriju treba čuvati povijesne podatke za kontrolne skupine koje su primale nosač. U laboratoriju treba čuvati i povijesne podatke za reakcije za pozitivne referentne kemikalije, kao što su TP i FT. Laboratoriji mogu i periodično ispitivati reakciju na poznate slabe androgene agoniste i antagoniste i čuvati te podatke. Ti se podaci mogu usporediti s raspoloživim podacima OECD-a kako bi se zajamčilo da metode upotrijebljene u laboratoriju osiguravaju dovoljnu statističku preciznost i snagu.
         
            Dodatak 1.
            DEFINICIJE
            
                         
                     
                     
                        
                           Androgen je termin koji se upotrebljava za opisivanje pozitivnog utjecaja na rast tkiva ovisnih o androgenima
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Antiandrogen znači sposobnost kemikalije da blokira djelovanje TP-a u organizmu sisavaca.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Kemikalija znači tvar ili mješavina.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Datum okota znači postnatalni dan 0.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Doza znači količina primijenjene ispitivane kemikalije. Kod Hershbergerova biotesta doza se izražava kao masa ispitivane kemikalije po jedinici tjelesne mase ispitivane životinje po danu (npr. mg/kg tjelesne mase/dnevno).
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Doziranje je općeniti termin koji obuhvaća dozu, učestalost i trajanje doziranja.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Na umoru je termin koji se upotrebljava za opisivanje životinje u stanju ugibanja, tj. blizu trenutka uginuća.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Postnatalni dan X znači X-ti dan života nakon dana okota.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Osjetljivost znači sposobnost ispitne metode da točno identificira kemikalije koje imaju svojstvo na koje se ispituju.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Specifičnost znači sposobnost ispitne metode da točno identificira kemikalije koje nemaju svojstvo na koje se ispituju.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Ispitivana kemikalija znači svaka tvar ili mješavina koja se ispituje upotrebom ove ispitne metode.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Validacija je znanstveni postupak koji ima za cilj karakterizaciju operativnih zahtjeva i ograničenja ispitne metode te dokazivanja pouzdanosti i relevantnosti za određenu svrhu.
                     
                  
         
            Dodatak 2.
            
         NAPOMENE UZ OKVIR
         
                     
                        Napomena 1.:
                     
                  
                  
                     Moguć je ulazak na svim razinama i izlazak na svim razinama što ovisi o prirodi potreba za postojećim informacijama u svrhe procjene opasnosti i rizika
                  
               
                     
                        Napomena 2.:
                     
                  
                  
                     Na Razini 5., ekotoksikologija bi trebala obuhvaćati krajnje točke koje upućuju na mehanizme štetnih učinaka i potencijalnu štetu za populaciju
                  
               
                     
                        Napomena 3.:
                     
                  
                  
                     Kada multimodalni model obuhvaća nekoliko testova s jednom krajnjom točkom, taj bi model zamijenio upotrebu tih testova s jednom krajnjom točkom
                  
               
                     
                        Napomena 4.:
                     
                  
                  
                     Ocjenjivanje svake kemikalije trebalo bi se temeljiti na pristupu ovisnom o pojedinom slučaju, uzimajući u obzir sve raspoložive informacije, imajući na umu funkciju razina okvira.
                  
               
                     
                        Napomena 5.:
                     
                  
                  
                     Okvir trenutačno ne treba smatrati sveobuhvatnim. Na razinama 3., 4. i 5. on obuhvaća testove koji su ili na raspolaganju ili za koje je validacija u tijeku. U pogledu ovih drugih, oni su uključeni privremeno. Nakon što budu razvijeni i validirani bit će formalno dodani u okvir.
                  
               
                     
                        Napomena 6.:
                     
                  
                  
                     Ne treba smatrati da razina 5. obuhvaća samo definitivne testove. Smatra se da testovi uključeni na toj razini doprinose općoj procjeni opasnosti i rizika.
                  
               
            LITERATURA
         
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD (1998.). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. ožujka 1998., ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Dorfman RI (1962.). Standard methods adopted by official organization. Academic Press, NY.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005.). Hershberger assay to investigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. In: Current Protocols in Toxicology 16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     OECD (2006.). Final OECD report of the initial work towards the validation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 62. ENV/JM/MONO(2006)30.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     OECD (2008.). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5α-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Laboratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 86. ENV/JM/MONO(2008)3.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     OECD (2007.). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 73. ENV/JM/MONO(2007)20.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006.). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265. – 1269.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E (2007.). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671. – 8.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Korenchevsky V (1932.). The assay of testicular hormone preparations. Biochem J 26:413. – 422.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932.). The response of castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J 26:1306. – 1314.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Eisenberg E, Gordan GS (1950.). The levator ani muscle of the rat as an index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38. – 44.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949.). Testosterone and tissue respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113. – 119.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953.). Myotrophic activity of 19-nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175. – 180.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Hilgar AG, Vollmer EP (1964.). Endocrine bioassay data: Androgenic and myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Dorfman RI (1969.). Androgens and anabolic agents. In: Methods in Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151. – 220.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Massaro EJ (2002.). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: Humana Press, str. 38.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     OECD (2000.). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     OECD (1982.). Organization for Economic Co-operation and Development – Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Pariz.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     OECD (2008.). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     OECD (2001.). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Supplemental materials for Owens et al. (2006.). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265. – 1269. See, section II, The dissection guidance provided to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hershberger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     OECD (2008.). Background Review Document on the Rodent Hershberger Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     OECD (2008.). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     OECD (2009.). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. Series on Testing and Assessment, Number 115.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Direktiva 2010/63/EU Europskog parlamenta i Vijeća od 22. rujna 2010. zaštiti životinja koje se koriste u znanstvene svrhe (SL L 276, 20.10.2010., str. 33.).
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     Sljedeća poglavlja ovog Priloga:
                     
                                  
                              
                              
                                 B.1.A, Akutna oralna toksičnost – postupak s fiksnom dozom
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 B.1.B, Akutna oralna toksičnost – metoda klase akutne toksičnosti
                              
                           
               B.56.   Produljena studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji
         
         UVOD
         1.   Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 443 (2012.). Temelji se na prijedlogu Tehničkog odbora za ocjenu sigurnosti poljoprivrednih kemikalija (ACSA) Instituta za znanosti o zdravlju i okolišu (HESI) Međunarodnog instituta za znanost o životu (ILSI) za produljenu studiju reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji za životnu fazu F1 kako je objavljena u Cooper et al., 2006. (1). U dizajn studije uneseno je nekoliko poboljšanja i pojašnjenja kako bi se osigurala fleksibilnost i naglasila važnost započinjanja s postojećim spoznajama uz upotrebu opažanja uživo radi usmjeravanja i prilagodbe ispitivanja. Ovom se ispitnom metodom pruža detaljan opis operativne provedbe produljene studije reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji. Ovom se ispitnom metodom opisuju tri kohorte životinja F1:
         
            1. kohorta: procjenjuju se reproduktivne/razvojne krajnje točke; ova se kohorta može produljiti kako bi uključivala generaciju F2,
         
            2. kohorta: procjenjuje se mogući učinak izloženosti kemikaliji na živčani sustav u razvoju,
         
            3. kohorta: procjenjuje se mogući učinak izloženosti kemikaliji na imunološki sustav u razvoju.
         2.   Odluke o procjenjivanju druge generacije i ispuštanju kohorte za razvojnu neurotoksičnost i/ili kohorte za razvojnu imunotoksičnost trebale bi odražavati postojeće spoznaje o kemikaliji koja se vrednuje, kao i potrebe različitih regulatornih tijela. Svrha je ove ispitne metode pružiti informacije o načinu na koji se studija može provoditi te načinu na koji treba vrednovati svaku kohortu.
         3.   Postupak odlučivanja o internim okidačima za proizvodnju 2. generacije opisuje se u OECD-ovoj Smjernici 117 (39) za ona regulatorna tijela koja ih upotrebljavaju.
         Početna razmatranja i ciljevi
         4.   Glavni je cilj produljene studije reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji vrednovanje specifičnih životnih faza koje nisu obuhvaćene ostalim vrstama studija toksičnosti te ispitivanje učinaka koji mogu nastati kao posljedica prenatalne i postnatalne izloženosti kemikaliji. Kod reproduktivnih krajnjih točaka za otkrivanje učinaka na reproduktivne organe u mužjaka i ženki predviđa se, kao prvi korak te prema dostupnosti, upotreba informacija iz studija s ponovljenim dozama (uključujući studije probira reproduktivne toksičnosti, npr. OECD-ova Smjernica za ispitivanje 422 (32)), ili kratkoročnih testova probira endokrinih disruptora (npr. uterotropni biotest – ispitna metoda B.54. (36) te Hershbergerova testa – ispitna metoda B.55. (37)). To može uključivati spermatogenezu (histopatologiju testisa) u mužjaka te cikluse estrusa, broj folikula/sazrijevanje jajnih stanica i integritet jajnika (histopatologiju) u ženki. Produljena studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji tada služi kao test za reproduktivne krajnje točke za koje je potrebna interakcija mužjaka i ženki, ženki sa zamecima te ženki s potomcima i generacije F1 do završetka spolnog sazrijevanja (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 kojom se potvrđuje ova ispitna metoda (40)).
         5.   Ova je ispitna metoda namijenjena vrednovanju prenatalnih i postnatalnih učinaka kemikalija na razvoj, kao i temeljitom vrednovanju sistemske toksičnosti u ženki koje su skotne i koje doje te u mladih i odraslih potomaka. Očekuje se da će se detaljnim pregledom ključnih razvojnih krajnjih točaka, poput preživljavanja potomaka, neonatalnog zdravlja, razvojnog statusa pri okotu te fizičkog i funkcionalnog razvoja do odrasle dobi, utvrditi specifični ciljni organi u potomaka. Osim toga, studija će pružiti i/ili potvrditi informacije o učincima ispitivane kemikalije na integritet i funkcioniranje reproduktivnih sustava odraslih mužjaka i ženki. Točnije, ali ne isključivo, razmatraju se sljedeći parametri: funkcija gonada, ciklus estrusa, sazrijevanje sperme iz epididimisa, ponašanje prilikom parenja, začeće, skotnost, parturicija i laktacija. Nadalje, s pomoću informacija iz procjena razvojne neurotoksičnosti i razvojne imunotoksičnosti karakterizirat će se mogući učinci u tim sustavima. Podacima iz tih ispitivanja trebalo bi omogućiti utvrđivanje visine doze kod koje se ne uočava štetni učinak (NOAEL), visine doze kod koje se uočava najslabiji učinak (LOAEL) i/ili referentnih doza za različite krajnje točke i/ili ih treba upotrebljavati za karakterizaciju učinaka otkrivenih u ranijim studijama s ponovljenim dozama i/ili bi oni trebali služiti kao smjernica za naknadno ispitivanje.
         6.   Shematski prikaz protokola prikazan je na slici 1. Ispitivana kemikalija primjenjuje se stalno u graduiranim dozama na nekoliko skupina spolno zrelih mužjaka i ženki. Toj roditeljskoj (P) generaciji doza se daje tijekom određenog razdoblja prije parenja (odabir na temelju dostupnih informacija za ispitivanu kemikaliju, ali najmanje dva tjedna) i tijekom dva tjedna razdoblja parenja. Mužjaci P dalje se tretiraju najmanje do odbijanja od sise generacije F1. Njih treba tretirati najmanje 10 tjedana. Njih je moguće i dulje tretirati ako postoji potreba za pojašnjenjem učinaka na reprodukciju. Tretman ženki P nastavlja se tijekom graviditeta i laktacije do usmrćenja nakon odbijanja njihovih legala od sise (odnosno 8 – 10 tjedana tretmana). Potomci F1 nastavljaju se tretirati ispitivanom kemikalijom od odbijanja od sise do odrasle dobi. Ako se procjenjuje druga generacija (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 117 (39)), potomci F1 ostat će u tretmanu do odbijanja generacije F2 ili do završetka studije.
         7.   Na svim životinjama provode se klinička opažanja i patološka ispitivanja kako bi se utvrdili znakovi toksičnosti s posebnim naglaskom na integritet i funkcioniranje muških i ženskih reproduktivnih sustava kao i zdravlje, rast, razvoj i funkciju potomstva. Kod odbijanja od sise odabrani potomci raspoređuju se u posebne podskupine (kohorte 1. – 3., vidjeti stavke 33. i 34. i sliku 1.) radi daljnjih ispitivanja, uključujući spolno sazrijevanje, integritet i funkcioniranje reproduktivnih organa, neurološke i bihevioralne krajnje točke i imunološke funkcije.
         8.   Pri provođenju studije treba slijediti opća načela i razmatranja navedena u OECD-ovoj Smjernici br. 19 o priznavanju, procjeni i korištenju kliničkih znakova kao krajnjih točaka za pokusne životinje koje se upotrebljavaju u ocjenama sigurnosti (34).
         9.   Kada za utvrđivanje učinka ovog novog dizajna studije bude dostupan dovoljan broj studija, ispitna metoda će se revidirati i, prema potrebi, prilagoditi stečenom iskustvu.
         
            Slika 1.
         
         
            Shema produljene studije reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji
         
         OPIS METODE/PRIPREMA ZA ISPITIVANJE
         
            Životinje
         
         
            Odabir vrsta i soja životinja
         
         10.   Odabir vrste za ispitivanje reproduktivne toksičnosti treba pomnjivo razmotriti s obzirom na sve dostupne podatke. Međutim, zbog količine podataka i mogućnosti usporedbe s ispitivanjem opće toksičnosti, štakor je u pravilu poželjna vrsta te se kriteriji i preporuke u ovoj ispitnoj metodi odnose na tu vrstu. Ako se upotrebljavaju druge vrste, treba navesti obrazloženje, a bit će potrebne i primjerene modifikacije protokola. Sojeve slabe plodnosti ili poznate po velikoj učestalosti spontanih razvojnih defekata ne bi trebalo upotrebljavati.
         
            Starost, tjelesna masa i kriterij uključivanja
         
         11.   Treba upotrebljavati zdrave roditeljske životinje koje nisu sudjelovale u ranijim pokusima. Treba proučavati mužjake i ženke koje još nisu imale potomstvo i koje nisu skotne. Životinje P trebale bi biti spolno zrele, jednake mase (po spolu) na početku doziranja, slične starosti (približno 90 dana) kod parenja te bi trebale predstavljati vrstu i soj koji se ispituju. Aklimatizacija životinja treba trajati najmanje 5 dana od dolaska. Životinje se nasumično raspoređuju u kontrolne skupine i skupine za tretiranje tako da srednje vrijednosti tjelesne mase skupina (npr. ± 20 % srednje vrijednosti) budu usporedive.
         
            Uvjeti smještaja i hranjenja
         
         12.   Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 22 °C (± 3 °C). Relativna vlažnost treba biti između 30 % i 70 %, uz idealni raspon od 50 % do 60 %. Raspored umjetnog svjetla treba biti 12 sati svjetla, 12 sati tame. Može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine vode za piće. Treba paziti na udio fitoestrogena u prehrani s obzirom na to da visoka razina fitoestrogena u prehrani može utjecati na neke reproduktivne krajnje točke. Preporučuje se standardizirana prehrana poznate formule sa smanjenim estrogenskim kemikalijama. Na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovarajuća mješavina ispitivane kemikalije ako se ona daje u hrani. Treba potvrditi sadržaj, homogenost i stabilnost ispitivane kemikalije u prehrani. Hranu i vodu za piće treba redovno analizirati s obzirom na kontaminante. Uzorke svake serije hrane upotrijebljene tijekom studije treba sačuvati u odgovarajućim uvjetima (npr. zamrznute na – 20 °C) do dovršetka izvješća u slučaju da je zbog rezultata potrebna daljnja analiza sastava hrane.
         13.   Životinje treba smjestiti u kaveze u malim skupinama istog spola i skupine za tretiranje. Životinje se mogu smjestiti pojedinačno kako bi se izbjegle moguće ozljede (npr. mužjaci nakon razdoblja parenja). Postupci parenja trebali bi se odvijati u odgovarajućim kavezima. Nakon što je došlo do kopulacije, ženke koje se smatra skotnima smješta se odvojeno u kaveze za okot ili materinstvo gdje im je osiguran odgovarajući i utvrđeni materijal za pravljenje gnijezda. Legla se smješta s majkama do odbijanja od sise. Životinje F1 treba smjestiti u male skupine istog spola i skupine za tretiranje od odbijanja od sise do završetka studije. Životinje se mogu zasebno smjestiti ako je to znanstveno opravdano. Razina fitoestrogena u odabranoj stelji treba biti minimalna.
         
            Broj i identifikacija životinja
         
         14.   U pravilu bi se u svakoj ispitnoj i kontrolnoj skupini trebao nalaziti dovoljan broj parova koji će se pariti kako bi se dobilo najmanje 20 skotnih ženki po skupini za doziranje. Cilj je dobiti dovoljno skotnih životinja kako bi se osigurala valjana procjena potencijala kemikalije da utječe na plodnost, skotnost i ponašanje majki životinja generacije P te na rast i razvoj potomstva F1 od začeća do sazrijevanja. Studija nije nužno nevaljana zbog neuspjeha u dobivanju željenog broja skotnih životinja, što treba vrednovati od slučaja do slučaja uzimajući u obzir mogući uzročno-posljedični odnos s ispitivanom kemikalijom.
         15.   Prije početka doziranja svakoj životinji P dodjeljuje se jedinstveni identifikacijski broj. Ako je iz povijesnih podataka laboratorija vidljivo da je moguće da u znatnog broja ženki nema redovnih (četverodnevnih ili peterodnevnih) ciklusa estrusa, prije početka tretmana preporučuje se njihova procjena. Alternativno, veličina skupine može se povećati kako bi se osiguralo da na početku tretmana najmanje 20 ženki u svakoj skupini ima redovne (četverodnevne ili peterodnevne) cikluse estrusa. Svi potomci F1 pri prvom pregledu nultog ili 1. postnatalnog dana dobivaju jedinstvenu identifikaciju. Tijekom studije treba voditi evidenciju o leglu podrijetla za sve životinje F1, a za životinje F2 prema potrebi.
         
            Ispitivana kemikalija
         
         
            Dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji
         
         16.   Revizija postojećih informacija važna je za donošenje odluke o putu primjene, odabiru nosača, odabiru životinjske vrste, odabiru doza i mogućoj izmjeni rasporeda doziranja. Zato kod planiranja produljene studije reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji treba uzeti u obzir sve relevantne dostupne informacije o ispitivanoj kemikaliji, odnosno fizikalno-kemijska, toksikokinetička (uključujući metabolizam specifičan za vrstu), toksikodinamička obilježja, odnose između strukture i aktivnosti, metaboličke postupke in vitro, rezultate ranijih studija toksičnosti i relevantne informacije o strukturalnim analogijama. Privremene informacije o apsorpciji, distribuciji, metabolizmu i eliminaciji (ADME) te bioakumulaciji moguće je izvesti iz kemijske strukture, fizikalno-kemijskih podataka, raspona vezivanja na proteine plazme ili toksikokinetičkih studija, dok rezultati studija toksičnosti pružaju dodatne informacije, npr. o vrijednostima pri kojima nisu uočeni štetni učinci, metabolizmu ili indukciji metabolizma.
         
            Razmatranje toksikokinetičkih podataka
         
         17.   Iako nisu obvezni, toksikokinetički podaci iz ranijih studija za određivanje raspona doze ili ostalih studija iznimno su korisni kod planiranja dizajna studije, odabira visina doze i tumačenja rezultata. Osobito su korisni podaci kojima: 1. se provjerava izloženost ispitivanoj kemikaliji (ili relevantnim metabolitima) fetusa u razvoju i mladunaca, 2. se osigurava procjena interne dozimetrije te 3. se procjenjuje moguća zasićenost kinetičkih postupaka koja ovisi o dozi. Treba razmotriti i dodatne toksikokinetičke podatke, poput profila metabolita, vremenskih tijekova koncentracije itd., ako su dostupni. Tijekom glavne studije mogu se prikupljati i dopunski toksikokinetički podaci ako se time ne ometa prikupljanje i tumačenje krajnjih točaka glavne studije.
         Opća je uputa da bi sljedeći skup toksikokinetičkih podataka bio koristan pri planiranju produljene studije reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji:
         
                     —
                  
                  
                     kasni graviditet (npr. 20. gestacijski dan) – krv majke i krv fetusa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     središnje razdoblje laktacije (10. PND) – krv majke, krv mladunca i/ili mlijeko,
                  
               
                     —
                  
                  
                     rano razdoblje nakon odbijanja od sise (npr. 28. PND) – uzorci krvi životinja koje se odbijaju od sise.
                  
               Pri utvrđivanju određenih analita (npr. roditeljska kemikalija i/ili metaboliti) i sheme uzorkovanja treba biti fleksibilan. Primjerice, broj uzoraka i vrijeme prikupljanja u određenom danu kad se provodi uzorkovanje ovisit će o putu izloženosti i ranijim spoznajama o toksikokinetičkim obilježjima u životinja koje nisu skotne. Kod studija u kojima se primjenjuje normalno hranjenje dovoljno je jedno uzorkovanje u isto vrijeme svih dana, dok prilikom doziranja sondom može biti potrebno više vremena uzorkovanja radi bolje procjene raspona internih doza. Međutim, nije potrebno generirati cijeli vremenski tijek koncentracije bilo kojeg dana uzorkovanja. Po potrebi krv je moguće izvaditi po spolu unutar legala radi analiza fetusa i životinja koje su tek okoćene.
         
            Put primjene
         
         18.   Odabirom puta primjene treba uzeti u obzir putove koji su najrelevantniji za izlaganje ljudi. Iako je dizajniran za primjenu ispitivane kemikalije hranom, protokol se može mijenjati za primjenu drugim putevima (voda za piće, sonda, inhalacija, dermalno) ovisno o karakteristikama kemikalije i potrebnih informacija.
         
            Odabir nosača
         
         19.   Prema potrebi, ispitivana se kemikalija otapa ili suspendira u odgovarajućem nosaču. Preporučuje se, po mogućnosti, prvo razmotriti upotrebu vodene otopine/suspenzije, a zatim otopine/suspenzije u ulju (npr. kukuruznom ulju). Za sve druge nosače osim vode treba poznavati toksične karakteristike nosača. Treba izbjegavati upotrebu nosača koji mogu biti intrinzično toksični (npr. aceton, DMSO). Treba utvrditi stabilnost ispitivane kemikalije u nosaču. Ako se za doziranje upotrebljava nosač ili drugi aditiv, treba uzeti u obzir sljedeće karakteristike: učinke na apsorpciju, distribuciju, metabolizam ili zadržavanje ispitivane kemikalije, učinke na kemijska svojstva ispitivane kemikalije koji mogu izmijeniti njezina toksična obilježja te učinke na unos hrane i vode ili nutritivni status životinja.
         
            Odabir doze
         
         20.   U pravilu bi studija trebala uključivati najmanje tri visine doze i usporednu kontrolu. Pri odabiru odgovarajućih visina doze istraživač bi trebao razmotriti sve dostupne informacije, uključujući informacije o doziranju iz ranijih studija, toksikokinetičke podatke o životinjama koje su skotne i koje nisu skotne, opseg laktacijskog transfera te procjene o izlaganju ljudi. Ako su dostupni toksikokinetički podaci koji ukazuju na zasićenost toksikokinetičkih postupaka koja ovisi o dozi, treba izbjegavati visoke doze kod kojih se zasićenost jasno uočava, naravno uz uvjet da se očekuje da su izlaganja ljudi znatno ispod točke zasićenosti. U takvim bi slučajevima najviša doza za tranziciju u nelinearno toksikokinetičko ponašanje trebala biti u točki infleksije ili neznatno iznad nje.
         21.   U izostanku relevantnih toksikokinetičkih podataka visine doza trebale bi se temeljiti na toksičnim učincima, osim ako su ograničene fizičkom ili kemijskom prirodom kemikalije. Ako se visine doza temelje na toksičnosti, najvišu dozu treba odabrati s ciljem izazivanja određene sistemske toksičnosti, ali ne smrti ili teške patnje životinja.
         22.   Treba odabrati niz sve nižih doza kako bi se dokazali svi učinci povezani s dozom te utvrdile vrijednosti kod kojih nisu uočeni štetni učinci ili doze blizu granice otkrivanja s pomoću kojih bi se izračunala referentna doza za najosjetljivije krajnje točke. Dvostruki ili četverostruki intervali često su optimalni za izbjegavanje velikog raspona doza između vrijednosti kod kojih nisu uočeni štetni učinci i vrijednosti kod kojih je uočena najniža razina štetnog učinka. Često je dodavanje četvrte ispitne skupine poželjnije od upotrebe vrlo velikog intervala (npr. većeg od faktora 10) između doza.
         23.   Osim tretiranja ispitivanom kemikalijom, sa životinjama u kontrolnim skupinama postupa se jednako kao sa životinjama u ispitnoj skupini. Ta bi skupina trebala biti netretirana ili placebo kontrolna skupina ili kontrolna skupina tretirana samo nosačem, ako se kod primjene ispitivane kemikalije upotrebljava nosač. Ako se upotrebljava nosač, kontrolna bi ga skupina trebala primiti u najvećem volumenu koji je upotrijebljen.
         
            Ispitivanje granice
         
         24.   Ako nema dokaza o toksičnosti kod doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase/dan u studijama s ponovljenim dozama ili ako toksičnost ne treba očekivati na temelju podataka o kemikalijama koje su strukturno i/ili metabolički povezane, kojima se ukazuje na sličnost u metaboličkim obilježjima in vivo/in vitro, nije potrebna studija u kojoj se upotrebljava nekoliko visina doza. U takvim bi se slučajevima produljena studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji mogla provesti s pomoću kontrolne skupine i jedne doze od najmanje 1 000 mg/kg tjelesne mase/dan. Međutim, ako se pri toj ograničenoj dozi pronađu dokazi reproduktivne ili razvojne toksičnosti, za utvrđivanje vrijednosti kod kojih nisu uočeni štetni učinci bit će potrebne daljnje studije s nižim dozama. Ta se razmatranja u pogledu ispitivanja granice primjenjuju samo ako izlaganje ljudi ne ukazuje na potrebu za višom dozom.
         POSTUPCI
         
            Izlaganje potomaka
         
         25.   Izlaganje hranom poželjan je način primjene. Ako se provode studije u kojima se primjenjuje hranjenje na sondu, treba napomenuti da će mladunci u pravilu ispitnu kemikaliju primati samo posredno, u mlijeku, sve dok za njih ne započne izravno doziranje nakon odbijanja od sise. Kod studija u kojima se tvar daje u hrani ili vodi za piće, mladunci će dodatno primati ispitivanu kemikaliju izravno kad sami počnu jesti tijekom posljednjeg tjedna razdoblja laktacije. Izmjene dizajna studije treba razmotriti ako je izlučivanje ispitivane kemikalije mlijekom slabo i ako nema dokaza za neprekidno izlaganje potomaka. U tim slučajevima treba razmotriti izravno doziranje mladuncima tijekom razdoblja laktacije na temelju dostupnih toksikokinetičkih informacija, toksičnosti u potomaka ili promjena u biomarkerima (3)(4). Prije provođenja studija s izravnim doziranjem na mladuncima koji sisaju (5) treba pomnjivo razmotriti koristi i nedostatke.
         
            Raspored doziranja i primjena doza
         
         26.   U prethodnim studijama toksičnosti s ponovljenim dozama odgovarajućeg trajanja mogu se pronaći neke informacije o ciklusu estrusa, histopatologiji reproduktivnog trakta u mužjaka i ženki i analizi sperme iz testisa/epididimisa. Trajanje tretmana prije parenja u ponovljenoj studiji reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji zato je usmjereno na otkrivanje učinaka na funkcionalne promjene koje mogu ometati ponašanje kod parenja i fertilizacije. Tretman prije parenja treba trajati dovoljno dugo kako bi se postigli stabilni uvjeti izlaganja u mužjaka i ženki P. U većini se slučajeva dvotjedni tretman prije parenja smatra odgovarajućim u oba spola. U ženki on uključuje 3 do 4 cjelovita ciklusa estrusa i trebao bi biti dovoljan za otkrivanje svih štetnih učinaka na njih. U mužjaka on je ekvivalentan vremenu potrebnome za prijenos spermija u sazrijevanju iz epididimisa te bi se njime trebalo omogućiti otkrivanje posttesikularnih učinaka na spermu (tijekom posljednjih faza spermijacije i sazrijevanja sperme iz epididimisa) kod parenja. Po usmrćenju, kad su na rasporedu testikularna i epididimalna histopatologija i analiza parametara sperme, mužjaci P i F1 bit će izloženi najmanje jednom cjelovitom postupku spermatogeneze ((6) (7) (8) (9) i OECD-ova Smjernica 151 (40)).
         27.   Izlaganje prije parenja u mužjaka moguće je prilagoditi ako su testikularna toksičnost (ometanje spermatogeneze) ili učinci na integritet i funkcioniranje sperme jasno utvrđeni u ranijim studijama. Isto tako, u ženki se različiti scenariji izlaganja prije parenja mogu obrazložiti poznatim učincima ispitivane kemikalije na ciklus estrusa, a time i na seksualnu osjetljivost. U posebnim je slučajevima moguće prihvatiti da se s tretmanom ženki P započelo isključivo nakon dobivanja brisa pozitivnog na spermu (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 (40)).
         28.   Nakon utvrđivanja razdoblja doziranja prije parenja životinje treba tretirati ispitivanom kemikalijom neprekidno svih 7 dana u tjednu do nekropsije. Doziranje se na sve životinje treba primijeniti na isti način. Doziranje se treba nastaviti tijekom dvotjednog razdoblja parenja, a u ženki P tijekom gestacije i laktacije do dana usmrćenja nakon odbijanja od sise. Mužjake treba tretirati na isti način do usmrćenja u vrijeme kad se životinje F1 odbijaju od sise. Kod nekropsije prioritet bi trebale imati ženke na kojima nekropsiju treba izvršiti na isti ili sličan dan laktacije. Nekropsija mužjaka može trajati više dana, ovisno o kapacitetima laboratorija. Osim ako je pokrenuto tijekom razdoblja laktacije, izravno doziranje odabranim mužjacima i ženkama F1 trebalo bi započeti kod odbijanja od sise te bi ga trebalo nastaviti do planirane nekropsije, ovisno o rasporedu kohorti.
         29.   Pri kemikalijama koje se daju u hrani ili vodi za piće važno je osigurati da količine ispitivane kemikalije o kojoj se radi nemaju utjecaja na uobičajen unos hrane ili vode. Ako se ispitivana kemikalija daje u hrani, može se upotrebljavati stalna koncentracija u hrani (ppm) ili stalna visina doze s obzirom na tjelesnu masu životinje, a odabir treba obrazložiti.
         30.   Ako se ispitivana kemikalija primjenjuje sondom, volumen tekućine koja se jednokratno primjenjuje u pravilu ne bi trebao premašivati 1 ml/100 g tjelesne mase (0,4 ml/100 g tjelesne mase maksimum je za ulje poput kukuruzova ulja). Osim kod nadražujućih i nagrizajućih kemikalija, za koje je normalno da u većim koncentracijama izazivaju intenzivnije učinke, variranje ispitnih volumena treba podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod svih visina doze osigurao stalni volumen. Tretman bi trebalo davati svakog dana u isto vrijeme. Dozu za svaku životinju u pravilu treba temeljiti na posljednjoj vrijednosti individualne tjelesne mase te prilagođavati najmanje jednom tjedno u odraslih mužjaka i odraslih ženki koje nisu skotne te svaka dva tjedna u skotnih ženki i životinja F1 ako se primjenjuje ona prije odbijanja od sise i tijekom 2 tjedna od toga. Ako se u toksikokinetičkim podacima ukazuje na niski prijenos ispitivane kemikalije u posteljici, moguće je da dozu koja se primjenjuje sondom tijekom posljednjeg tjedna graviditeta treba prilagoditi kako bi se izbjegla primjena prekomjerno toksične doze na ženku. Ženke na dan parturicije ne treba tretirati sondom ili bilo kojim tretmanom pri kojem je potrebno rukovanje životinjom, a propuštanje primjene ispitivane kemikalije na taj je dan poželjnije od ometanja postupka okota.
         
            Parenje
         
         31.   Svaku ženku P treba smjestiti s jednim nasumično odabranim, nepovezanim mužjakom iz iste skupine za doziranje (uparivanje 1:1) do kopulacije ili do isteka 2 tjedna. Ako nema dovoljno mužjaka, primjerice zbog smrti mužjaka prije uparivanja, tada se mužjaci koji su se već parili mogu upariti (1:1) s drugim ženkama tako da su sve ženke uparene. Danom graviditeta 0 smatra se dan kad je potvrđeno parenje (nađen je vaginalni čep ili sperma). Životinje treba odvojiti čim prije nakon kopulacije. Ako nakon 2 tjedna nije došlo do parenja, životinje treba odvojiti bez daljnje mogućnosti parenja. Parove koji se pare treba jasno identificirati u podacima.
         
            Veličina legla
         
         32.   Četiri dana nakon okota veličina svakog legla može se prilagoditi nasumičnim selekcijskim uklanjanjem dodatnih mladunaca tako da se po jednom leglu po mogućnosti ostavi pet mužjaka i pet ženki. Selektivno uklanjanje mladunaca, primjerice prema tjelesnoj masi, nije prihvatljivo. Kad god je broj muških ili ženskih mladunaca takav da nije moguće imati pet mladunaca svakog spola po leglu, prihvatljivo je djelomično prilagođavanje (npr. šest mužjaka i četiri ženke).
         
            Odabir mladunaca za studije nakon odbijanja od sise (vidjeti sliku 1.)
         
         33.   Pri odbijanju od sise (oko 21. postnatalnog dana) najviše 20 mladunaca iz svih raspoloživih legala po dozi i kontrolnoj skupini bira se za daljnja ispitivanja te čuva do spolnog sazrijevanja (osim ako je potrebno ranije ispitivanje). Mladunci se biraju nasumično, a vidljivo patuljaste životinje (životinje čija je tjelesna masa više od dvije standardne devijacije ispod srednje mase mladunaca iz odgovarajućeg legla) ne treba uključiti jer nije vjerojatno da će one biti reprezentativne za skupinu za tretiranje.
         Na 21. postnatalni dan odabrani mladunci F1 nasumično se raspoređuju u jednu od tri kohorte životinja kako slijedi:
         
            1. kohorta (1.A i 1.B)= ispitivanje reproduktivne/razvojne toksičnosti,
         
            2. kohorta (2.A i 2.B)= ispitivanje razvojne neurotoksičnosti,
         
            3. kohorta= ispitivanje razvojne imunotoksičnosti.
         
            1.A kohorta: Jedan mužjak i jedna ženka po leglu po skupini (20 po spolu po skupini): primarni odabir za primarnu procjenu učinaka na reproduktivne sustave i opće toksičnosti.
         
            1.B kohorta: Jedan mužjak i jedna ženka po leglu po skupini (20 po spolu po skupini): primarni odabir za daljnju procjenu reproduktivnog učinka parenjem životinja F1 kod procjene (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 117 (39)) te za dobivanje dodatnih histopatoloških podataka u slučajevima sumnje na reproduktivne ili endokrine toksične tvari ili ako su rezultati 1.A kohorte dvosmisleni.
         
            2.A kohorta: Ukupno 20 mladunaca po skupini (10 mužjaka i 10 ženki po skupini, jedan mužjak ili jedna ženka po leglu) raspoređuje se za neurobihevioralno ispitivanje, a potom i neurohistopatološku procjenu u odrasloj dobi.
         
            2.B kohorta: Ukupno 20 mladunaca po skupini (10 mužjaka i 10 ženki po skupini, jedan mužjak ili jedna ženka po leglu) raspoređuje se za neurohistopatološku procjenu kod odbijanja od sise (21. ili 22. prenatalni dan). Ako nema dovoljno životinja, poželjno je životinje rasporediti u 2.A kohortu.
         
            3. kohorta: Ukupno 20 mladunaca po skupini (10 mužjaka i 10 ženki po skupini, po mogućnosti, jedno po leglu). Dodatni mladunci iz kontrolne skupine mogu biti potrebni kao pozitivne kontrolne životinje u testu reakcije antitijela ovisnih o T-stanicama (TDAR) na 56. ±3 postnatalni dan.
         34.   Ako u leglu nema dovoljno mladunaca za sve kohorte, 1. kohorta ima prioritet jer se može produljiti radi dobivanja generacije F2. Dodatni mladunci mogu se rasporediti u bilo koju kohortu u posebnom slučaju, npr. ako se sumnja da je kemikalija neurotoksična, imunotoksična ili reproduktivno toksična. Ti se mladunci mogu upotrebljavati za ispitivanja u različitim vremenima ili za vrednovanje dopunskih krajnjih točaka. Mladunci koji nisu raspoređeni u kohorte podvrgavaju se kliničkoj biokemiji (stavak 55.) i makroskopskoj nekropsiji (stavak 68.)
         
            Drugo parenje životinja P
         
         35.   Drugo parenje u pravilu se ne preporučuje za životinje P jer zbog njega dolazi do gubitka važnih informacija o broju mjesta za implantaciju embrija (a time i podataka o razdoblju nakon implantacije i perinatalnom gubitku, pokazatelja mogućeg teratogenog potencijala) za prvo leglo. Potreba za provjerom ili pojašnjenjem učinka kod izloženih ženki bolje bi se zadovoljila produljenjem studije i proširivanjem na parenje generacije F1. Međutim, drugo parenje mužjaka P s netretiranim ženkama uvijek je mogućnost za pojašnjavanje dvosmislenih nalaza ili za daljnju karakterizaciju učinaka na plodnost uočenih kod prvog parenja.
         OPAŽANJA UŽIVO
         
            Klinička opažanja
         
         36.   Pri životinjama P i odabranim životinjama F1, opća klinička opažanja obavljaju se jednom dnevno. U slučaju doziranja sondom, klinička opažanja treba obavljati prije ili nakon doziranja (radi mogućih znakova toksičnosti povezanih s vršnom koncentracijom plazme). Treba bilježiti relevantne promjene ponašanja, znakove otežane ili produžene parturicije i sve znakove toksičnosti. Dvaput dnevno, a tijekom vikenda jednom dnevno, obavlja se opažanje svih životinja s obzirom na tešku toksičnost, morbiditet i mortalitet.
         37.   Osim toga, jednom tjedno obavlja se detaljniji pregled svih životinja P i F1 (nakon odbijanja od sise) koji se može obaviti pri vaganju životinje, čime se umanjuje stres pri rukovanju. Opažanja treba pažljivo obaviti i bilježiti s pomoću sustava vrednovanja koje je utvrdio ispitni laboratorij. Treba poduzeti sve što je potrebno kako bi se osiguralo da odstupanja u uvjetima ispitivanja budu minimalna. Znakovi koji se bilježe trebaju uključivati, ali ne biti ograničeni na, promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, na pojavu iscjedaka, na izlučine i autonomne aktivnosti (lakrimacija (lučenje suza), piloerekcija, veličina zjenica, nepravilnosti u disanju). Treba zabilježiti i promjene u kretanju, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloničnih ili toničnih kretnji, stereotipa (npr. prekomjerno njegovanje dlake, stalno kretanje u krug) ili bizarno ponašanje (npr. samoranjavanje, hodanje unatrag).
         
            Tjelesna masa i unos hrane/vode
         
         38.   Životinje P važu se prvog dana primjene doze, a zatim najmanje jednom tjedno. Osim toga, ženke P važu se tijekom laktacije istih dana kao i mladunci u njihovim leglima (vidjeti stavak 44.) Sve životinje F1 važu se pojedinačno kod odbijanja od sise (21. PND), a zatim najmanje jednom tjedno. Tjelesna masa bilježi se i na dan ulaska u pubertet (dovršetak razdvajanja prepucija ili vaginalna prohodnost). Sve životinje važu se u trenutku usmrćivanja.
         39.   Tijekom studije unos hrane i vode (u slučaju primjene ispitivane kemikalije u vodi za piće) bilježi se najmanje jednom tjedno istih dana kao i tjelesne mase životinja (osim tijekom kohabitacije). Unos hrane svakog kaveza sa životinjama F1 bilježi se jednom tjedno počevši od odabira odgovarajuće kohorte.
         
            Ciklusi estrusa
         
         40.   Privremene informacije o učincima ispitivane kemikalije na ciklus estrusa već se mogu pronaći u ranijim studijama toksičnosti s ponovljenim dozama te se mogu upotrebljavati kod dizajniranja protokola specifičnog za ispitivanu kemikaliju za produljenu studiju reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji. U pravilu će procjena ciklusa estrusa (s pomoću vaginalne citologije) započeti na početku razdoblja tretiranja te se nastaviti do parenja ili kraja dvotjednog razdoblja parenja. Ako je probir ženki za normalni ciklus estrusa obavljen prije tretmana, tada je korisno nastaviti s uzimanjem briseva s početkom tretmana, ali ako postoji dvojba o nespecifičnim učincima na početku tretmana (poput početnog zabilježenog smanjenja unosa hrane), moguće je životinjama dopustiti adaptaciju na tretman do najdulje dva tjedna prije početka dvotjednog razdoblja uzimanja briseva nakon kojeg slijedi uparivanje. Ako se na taj način produljuje razdoblje tretiranja ženki (tj. na četverotjedni tretman prije parenja), tada treba razmotriti nabavu mlađih životinja te produljenje razdoblja tretmana mužjaka prije uparivanja. Ako se uzimaju vaginalne/cervikalne stanice, treba paziti da se ne poremeti mukoza i, kasnije, ne izazove lažna trudnoća (10) (11).
         41.   Vaginalne briseve svih ženki F1 iz 1.A kohorte treba svakodnevno pregledavati nakon početka vaginalne prohodnosti dok se ne zabilježi prvi kornificirani bris kako bi se utvrdio vremenski interval između ta dva događaja. Treba pratiti i cikluse estrusa svih ženki F1 iz 1.A kohorte u razdoblju od dva tjedna, počevši oko 75. postnatalnog dana. Osim toga, ako je potrebno parenje generacije F1, vaginalna citologija u 1.B kohorti slijedit će se od trenutka uparivanja do parenja.
         
            Parenje i graviditet
         
         42.   Osim standardnih krajnjih točaka (npr. tjelesna masa, unos hrane, klinička opažanja uključujući provjere mortaliteta/morbiditeta), bilježe se datumi uparivanja, datum inseminacije i datum parturicije te se računaju prekoitalni interval (od uparivanja do inseminacije) i trajanje graviditeta. Ženke P treba pomnjivo pregledati u vrijeme očekivane parturicije radi znakova distocije. Treba zabilježiti sve znakove abnormalnosti pri izradi gnijezda ili dojenja.
         43.   Dan kad dođe do parturicije nulti je dan laktacije za ženku i nulti postnatalni dan za potomstvo. Alternativno, sve se usporedbe mogu temeljiti i na postkoitalnom vremenu kako bi se izbjeglo miješanje podataka o postnatalnom razvoju zbog razlika u trajanju graviditeta. Međutim, treba zabilježiti i vrijeme u odnosu na parturiciju. To je osobito važno ako ispitivana kemikalija utječe na trajanje graviditeta.
         
            Parametri potomaka
         
         44.   Svako leglo treba pregledati čim prije nakon parturicije (nulti ili 1. postnatalni dan) i utvrditi broj i spol mladunaca, broj mrtvorođenih, broj živorođenih te prisutnost velikih anomalija (vidljive abnormalnosti, uključujući rascjep nepca, potkožna krvarenja, abnormalnu boju ili strukturu kože, pojavu pupčane vrpce, manjak mlijeka u želucu, pojavu suhih sekreta). Osim toga, prvi klinički pregled nakon okota treba uključivati kvalitativnu procjenu tjelesne temperature, stanja aktivnosti i reakcije na rukovanje. Mladunce koji su nultog postnatalnog dana ili kasnije nađeni mrtvi treba pregledati s obzirom na moguće defekte i uzrok smrti. Živi mladunci prebrojavaju se i pojedinačno važu nultog ili 1. postnatalnog dana i redovno nakon toga, npr. barem 4., 7., 14. i 21. postnatalnog dana. Kliničke preglede prema starosti životinja treba ponavljati pri vaganju potomaka ili češće ako su prilikom okota utvrđeni specifični nalazi. Zabilježeni znakovi mogu uključivati, ali ne moraju biti ograničeni na vanjske abnormalnosti, promjene na koži, dlaci, očima, sluznicama, pojavu iscjedaka i izlučina i autonomnu aktivnost. Treba zabilježiti i promjene u hodu, držanju i reakcijama na rukovanje, kao i prisutnost kloničkih ili toničkih pokreta, stereotipa ili bilo kakvog neobičnog ponašanja.
         45.   Treba izmjeriti anogenitalni razmak u svakog mladunca barem jednom od nultog do 4. postnatalnog dana. Tjelesnu masu mladunaca treba utvrditi na dan mjerenja anogenitalnog razmaka, a njega treba ujednačiti prema veličini mladunca (najbolje kubni korijen tjelesne mase (12)). 12. ili 13. postnatalnog dana treba provjeriti postojanje bradavica/areola u mužjaka mladunaca.
         46.   Sve odabrane životinje F1 svakodnevno se pregledavaju radi razdvajanja prepucija na glavici penisa u mužjaka, odnosno vaginalne prohodnosti u ženki prije očekivanog dana pojave tih krajnjih točaka radi utvrđivanja rane pojave spolnog sazrijevanja. Treba zabilježiti sve abnormalnosti genitalnih organa, poput postojane vaginalne niti, hipospadije ili rascjepa penisa. Spolno sazrijevanje životinja F1 uspoređuje se s fizičkim razvojem utvrđivanjem starosti i tjelesne mase kod razdvajanja prepucija na glavici penisa u mužjaka, odnosno vaginalne prohodnosti u ženki (13).
         
            Procjena potencijalne razvojne neurotoksičnosti (2.A i 2.B kohorta)
         
         47.   Za procjene neurotoksičnosti treba upotrebljavati 10 mužjaka i 10 ženki iz 2.A kohorte i 10 mužjaka i 10 ženki iz 2.B kohorte iz svake skupine za tretiranje (za svaku kohortu: 1 mužjak ili 1 ženka po leglu; najmanje 1 mladunac iz svakog legla; nasumično odabrani). Životinje iz 2.A kohorte treba podvrgnuti iznenadnoj buci, funkcionalno-opservacijskoj bateriji, motoričkoj aktivnosti (vidjeti stavke 48. do 50.) i neuropatološkim procjenama (vidjeti stavke 74. do 75.). Treba nastojati osigurati da varijacije ispitnih uvjeta budu minimalne te da nisu sustavno povezane s tretiranjem. Neke varijable koje mogu utjecati na ponašanje jesu razina buke (npr. povremena buka), temperatura, vlažnost, rasvjeta, mirisi, doba dana te distrakcije iz okoline. Rezultate testova neurotoksičnosti treba tumačiti u odnosu na odgovarajuće povijesne kontrolne referentne raspone. Kohortu 2.B treba upotrebljavati za neuropatološku procjenu 21. ili 22. postnatalnog dana (vidjeti stavke 74. do 75.).
         48.   Ispitivanje reakcije na iznenadnu buku treba provesti 24. postnatalnog dana (± 1 dan) na životinjama iz 2.A kohorte. Dan ispitivanja treba ujednačiti s obzirom na skupine za tretiranje i kontrolne skupine. Svaka se sesija sastoji od 50 pokušaja. Kod provođenja ispitivanja reakcije na iznenadnu buku treba odrediti srednju amplitudu reakcije svakog skupa od 10 pokušaja (5 skupova od 10 pokušaja) uz uvjete ispitivanja koji su optimizirani tako da izazovu habituaciju tijekom sesije. Ti bi postupci trebali biti u skladu s ispitnom metodom B.53 (35).
         49.   U odgovarajućem trenutku između 63. i 75. postnatalnog dana životinje se podvrgavaju funkcionalno-opservacijskoj bateriji i automatskom ispitivanju motoričke aktivnosti. Ti bi postupci trebali biti u skladu s ispitnim metodama B.43 (33) i B.53. (35). Funkcionalno-opservacijska baterija uključuje detaljan opis izgleda, ponašanja i funkcionalnog integriteta pokusne životinje. To se procjenjuje opažanjem u kavezu u kojem životinje inače borave, nakon smještaja u standardni prostor radi opažanja (otvoreni prostor) gdje se životinja slobodno kreće i manipulativnim ispitivanjima. Ispitivanje treba provoditi od najmanje interaktivnog prema najviše interaktivnom. Popis mjera navodi se u Dodatku 1. Opažanja svih životinja trebale bi obavljati osposobljene osobe koje nemaju saznanja o statusu tretmana životinja s pomoću standardiziranih postupaka kako bi se njihova varijabilnost svela na najmanju moguću mjeru. Savjetuje se da po mogućnosti ista osoba koja obavlja opažanja vrednuje životinje u određenom ispitivanju. Ako to nije moguće, potreban je neki dokaz o pouzdanosti osoba koje obavljaju opažanje. Za svaki parametar u bihevioralnoj ispitnoj bateriji treba upotrebljavati eksplicitne, operativno definirane raspone i kriterije vrednovanja. Po mogućnosti treba razviti objektivne kvantitativne mjere za opservacijske krajnje točke koje uključuju subjektivno rangiranje. Kod motoričke aktivnosti svaka se životinja pojedinačno ispituje. Ispitivanje bi trebalo trajati dovoljno dugo da se dokaže habituacija između sesija kod kontrolnih skupina. Motoričku aktivnost treba pratiti aparatom za bilježenje automatske aktivnosti kojime bi trebalo biti moguće utvrditi povećanja i smanjenja aktivnosti (odnosno, osnovna aktivnosti koju uređaj mjeri ne bi trebala biti ni toliko niska da bi se spriječilo utvrđivanje smanjenja ni toliko visoka da bi se spriječilo utvrđivanje povećanja aktivnosti). Svaki uređaj treba ispitati standardnim postupcima kako bi se u najvećoj mogućoj mjeri osigurala pouzdanost rada s obzirom na sve uređaje i dane. Skupine za tretiranje u najvećoj bi se mogućoj mjeri trebale ujednačiti s obzirom na sve uređaje. Skupine za tretiranje trebale bi biti uravnotežene s obzirom na vremena ispitivanja kako bi se izbjeglo zbunjivanje zbog cirkadijurnih ritmova aktivnosti.
         50.   Ako se postojećim informacijama ukazuje na potrebu za ostalim funkcionalnim ispitivanjima (npr. senzorno, socijalno, kognitivno), njih treba uključiti bez narušavanja cjelovitosti ostalih evaluacija koje se provode studijom. Ako se ispitivanje provodi na istim životinjama kao i ispitivanje reakcije na iznenadnu buku, funkcionalno-opservacijsku bateriju i ispitivanje motoričke aktivnosti treba planirati tako da se rizik od narušavanja cjelovitosti tih ispitivanja svede na najmanju moguću mjeru. Dopunski postupci mogu biti osobito korisni kada empirijsko opažanje, očekivani učinci ili mehanizam/način funkcioniranja ukazuju na posebnu vrstu neurotoksičnosti.
         
            Procjena potencijalne razvojne imunotoksičnosti (3. kohorta)
         
         51.   Na 56. postnatalni dan (± 3 dana) 10 mužjaka i 10 ženki iz 3. kohorte iz svake skupine za tretiranje (1 mužjak ili 1 ženka po leglu; najmanje 1 mladunac iz svakog legla; nasumično odabrani) treba upotrijebiti u testu reakcije antitijela ovisnih o T-stanicama, odnosno prvotnoj reakciji antitijela IgM na antigen ovisan o T-stanicama, poput crvenih krvnih stanica ovce (SRBC) ili hemocijanina iz puža priljepka (KLH), u skladu s postojećim postupcima ispitivanja imunotoksičnosti (14) (15). Reakciju je moguće procijeniti prebrojavanjem specifičnih stanica koje tvore plak (PFC) i slezeni ili utvrđivanjem titra IgM antitijela specifičnog za SRBC ili KLH u serumu ELISA testom na vrhuncu reakcije. Reakcije su u pravilu na vrhuncu četiri (reakcija PFC) ili pet (ELISA) dana nakon intravenozne imunizacije. Ako se prvotna reakcija antitijela procjenjuje prebrojavanjem stanica koje tvore plak, dopuštena je procjena podskupina životinja u zasebne dane uz uvjet da se imunizacija i usmrćivanje podskupine planiraju tako da se stanice koje tvore plak broje na vrhuncu reakcije, da podskupine sadržavaju jednaki broj muških i ženskih potomaka iz svih skupina za doziranje, uključujući kontrolne, te da se podskupine procjenjuju u približno jednakoj postnatalnoj dobi. Izlaganje ispitivanoj kemikaliji nastavit će se do dana prikupljanja slezena za reakciju stanica koje tvore plak ili seruma za test ELISA.
         
            Nastavak procjene potencijalne reproduktivne toksičnosti (1.B kohorta)
         
         52.   Životinje iz 1.B kohorte prema potrebi se mogu zadržati u tretmanu nakon 90. postnatalnog dana te uzgajati kako bi se dobila generacija F2. Mužjake i ženke iz iste skupine za doziranje treba smjestiti zajedno (uz izbjegavanje uparivanja braće i sestara) do najdulje dva tjedna, počevši od 90. postnatalnog dana ili nakon njega, ali ne dulje od 120. postnatalnog dana. Postupci bi trebali biti slični onima u životinja P. Međutim, na temelju dokaza, usmrćivanje legala 4. postnatalnog dana može biti dovoljno, umjesto praćenja do odbijanja od sise ili nakon njega.
         ZAVRŠNA OPAŽANJA
         
            Klinička biokemija/hematologija
         
         53.   U životinja P treba pratiti sustavne učinke. Po usmrćenju s utvrđenog se mjesta uzimaju uzorci krvi deset nasumično odabranih mužjaka i ženki P po skupini za doziranje koji su postili, pohranjuju u odgovarajućim uvjetima i podvrgavaju djelomičnoj ili potpunoj hematologiji, kliničkoj biokemiji, testu T4 ili TSH ili drugim pregledima u skladu s poznatim profilom učinka ispitivane kemikalije (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 (40)). Treba ispitati sljedeće hematološke parametre: hematokrit, koncentraciju hemoglobina, broj eritrocita, ukupan i diferencijalni broj leukocita, broj trombocita i vrijeme/potencijal zgrušavanja krvi. Pretrage plazme ili seruma trebale bi uključivati: određivanje razine glukoze, ukupnog kolesterola, ureje, kreatinina, ukupnih proteina, albumina i najmanje dva enzima koji su pokazatelji hepatocelularnih učinaka (kao što su alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, alkalna fosfataza, gama glutamil transpeptidaza i sorbitol dehidrogenaza). Mjerenja dodatnih enzima i žučnih kiselina mogu u određenim uvjetima pružiti korisne informacije. Osim toga, svim se životinjama krv može izvaditi i pohraniti za moguću kasniju analizu radi pojašnjavanja dvosmislenih učinaka ili dobivanja podataka o internom izlaganju. Ako se ne planira drugo parenje životinja P, uzorci krvi uzimaju se neposredno prije ili u okviru postupka kod planiranog usmrćivanja. U slučaju zadržavanja životinja uzorke krvi treba prikupiti nekoliko dana prije drugog parenja životinja. Osim ako se postojećim podacima iz studija s ponovljenim dozama ukazuje na to da ispitivana kemikalija ne utječe na parametar, prije usmrćenja treba provesti analizu urina i treba procijeniti sljedeće parametre: izgled, volumen, osmolalnost ili specifičnu težinu, pH, protein, glukozu, krv i krvne stanice, ostatke stanica. Urin se može prikupljati i radi praćenja izlučivanja ispitivane kemikalije i/ili metabolita.
         54.   U životinja F1 treba pratiti i sustavne učinke. Po usmrćenju s utvrđenog se mjesta uzimaju uzorci krvi deset nasumično odabranih mužjaka i ženki iz 1.A kohorte po skupini za doziranje koji su postili, pohranjuju u odgovarajućim uvjetima i podvrgavaju standardnoj kliničkoj biokemiji, uključujući procjenu razina seruma hormona štitnjače (T4 i TSH), hematologiji (ukupni i diferencijalni broj leukocita i broj eritrocita) i procjenama analize urina.
         55.   Prekobrojni se mladunci 4. postnatalnog dana podvrgavaju makroskopskoj nekropsiji te se razmatra mjerenje koncentracija seruma hormona štitnjače (T4). Krv tek okoćenih životinja (4. PND) može se izvaditi po leglima radi biokemijskih analiza ili analiza hormona štitnjače. Za analizu T4 i TSH krv se vadi i životinjama koje su upravo odbijene od sise koje se podvrgavaju makroskopskoj nekropsiji 22. postnatalnog dana (mladunci F1 ne raspoređuju se u kohorte).
         
            Parametri sperme
         
         56.   Parametre sperme treba mjeriti u svih mužjaka generacije P, osim ako postoje podaci kojima se dokazuje da nema utjecaja na parametre sperme u studiji koja traje 90 dana. Ispitivanje parametara sperme treba provesti u svih mužjaka iz 1.A kohorte.
         57.   Po usmrćenju bilježe se mase testisa i epididimisa svih mužjaka P i F1 (1.A kohorta). Barem jedan testis i jedan epididimis čuvaju se radi histopatološkog pregleda. Preostali epididimisi upotrebljavaju se za prebrojavanje zaliha sperme iz repa epididimisa (16)(17). Osim toga, zaliha sperme iz repa epididimisa (ili sjemenovoda) prikuplja se s pomoću metoda kojima se oštećenje za procjenu pokretljivosti i morfologije spreme svodi na najmanju moguću mjeru (18).
         58.   Pokretljivost sperme može se procijeniti neposredno nakon usmrćivanja ili zabilježiti za daljnju analizu. Postotak progresivno pokretljive sperme može se utvrditi subjektivno ili objektivno s pomoću računalne analize pokreta (19) (20) (21) (22) (23) (24). Kod procjene morfologije sperme uzorak sperme iz epididimisa (ili sjemenovoda) treba ispitati kao fiksirane ili mokre pripravke (25) te najmanje 200 spermatozoida po uzorku klasificirati kao normalne (glava i tijelo/rep normalnog su izgleda) ili abnormalne. Primjeri morfoloških anomalija spermatozoida obuhvaćaju fuziju, odvojene glave i deformirane glave i/ili repove (26). Deformirane ili velike glave spermatozoida mogu ukazivati na defekte kod spermijacije.
         59.   Ako se pri nekropsiji zamrzavaju uzorci sperme, fiksiraju brisevi i bilježe slike analize mobilnosti sperme (27), naknadna analiza može se ograničiti na kontrolne mužjake i mužjake kojima se daje visoka doza. Međutim, ako se uoče učinci povezani s tretmanom, treba procijeniti i skupine kojima se daje niža doza.
         
            Makroskopska nekropsija
         
         60.   U vrijeme usmrćenja ili u slučaju preuranjene smrti sve životinje P i F1 podvrgavaju se nekropsiji i makroskopskom pregledu radi otkrivanja svih strukturnih abnormalnosti ili patoloških promjena. Posebnu pozornost treba obratiti na organe reproduktivnog sustava. Mladunce koji su humano usmrćeni, na samrti ili mrtvi treba zabilježiti i, ako nisu macerirani, pregledati s obzirom na moguće patološke promjene i/ili uzrok smrti, i konzervirati.
         61.   U odraslih ženki P i F1 vaginalni bris pregledava se na dan nekropsije kako bi se utvrdila faza ciklusa estrusa i omogućila korelacija s histopatologijom reproduktivnih organa. Maternice svih životinja P (po potrebi i ženku F1) pregledavaju se s obzirom na postojanje i broj mjesta za implantaciju embrija bez narušavanja histopatološke procjene.
         
            Masa organa i čuvanje tkiva – odrasle životinje P i F1
            
         
         62.   Po usmrćenju utvrđuju se tjelesne mase i mokre mase organa navedenih u nastavku svih životinja P i svih odraslih životinja F1 iz relevantnih kohorti (kako se navodi u nastavku) u najkraćem mogućem roku kako bi se izbjeglo sušenje. Te organe potom treba čuvati u odgovarajućim uvjetima. Osim ako je drukčije navedeno, upareni organi mogu se vagati pojedinačno ili zajedno u skladu s tipičnom praksom laboratorija koji provodi ispitivanje.
         
                     —
                  
                  
                     maternica (s jajovodima i cerviksom), jajnici,
                  
               
                     —
                  
                  
                     testisi, epididimisi (cijeli i repovi za uzorke za prebrojavanje sperme),
                  
               
                     —
                  
                  
                     prostata (kombinacija dorsolateralnih i ventralnih dijelova). Pri odvajanju prostate treba paziti kako bi se izbjegla punkcija sjemenih vezikula ispunjenih tekućinom. U slučaju učinka povezanog s tretmanom na ukupnu masu prostate dorsolateralne i ventralne segmente treba pažljivo odvojiti nakon fiksiranja i zasebno izvagati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sjemene vezikule s prednjim režnjem prostate i njihovim fluidima (kao jedna cjelina),
                  
               
                     —
                  
                  
                     mozak, jetra, bubrezi, srce, slezena, timus, hipofiza, tiroidna žlijezda (nakon fiksiranja), nadbubrežna žlijezda i poznati ciljni organi ili tkiva.
                  
               63.   Osim gore navedenih organa, u odgovarajućim uvjetima treba čuvati uzorke perifernih živaca, mišića, leđne moždine, oka i optičkog živca, probavnog trakta, mokraćnog mjehura, pluća, dušnika (s tiroidnom i paratiroidnom žlijezdom), koštane srži, sjemenovoda (u mužjaka), mliječnih žlijezda (u mužjaka i ženki) i vagine.
         64.   Svi organi životinja iz 1.A kohorte važu se i čuvaju za histopatologiju.
         65.   Radi ispitivanja prenatalnih i postnatalnih imunotoksičnih učinaka 10 mužjaka i 10 ženki iz 1.A kohorte iz svake skupine za tretiranje (1 mužjak ili 1 ženka po leglu; najmanje 1 mladunac iz svakog legla; nasumično odabrani) po usmrćenju podvrgnut će se sljedećem:
         
                     —
                  
                  
                     vaganju limfnih čvorova povezanih s putem izlaganja i udaljenima od njega (uz vaganje nadbubrežne žlijezde, timusa i slezene koje je već provedeno u svih životinja iz 1.A kohorte),
                  
               
                     —
                  
                  
                     analizi subpolulacije limfocita u slezeni (T-limfociti CD4+ i CD8+, B-limfociti i prirodno ubojite stanice) na jednoj polovici slezene, dok će se druga čuvati za histopatološku procjenu.
                  
               Analizom subpopulacija limfocita u slezeni u necijepljenih životinja (1.A kohorta) utvrdit će se je li izlaganje povezano s pomakom u imunološkoj stabilnoj distribuciji ‚pomagača’ (CD4+) ili citoksičnih limfocita koje proizvodi timus (CD8+) ili prirodno ubojite (NK) stanica (brze reakcije na neoplastične stanice i patogene).
         66.   Sljedeće organe životinja iz 1.B kohorte treba izvagati, a odgovarajuća tkiva obraditi do faze blokiranja:
         
                     —
                  
                  
                     vagina (neizvagana),
                  
               
                     —
                  
                  
                     maternica s cerviksom,
                  
               
                     —
                  
                  
                     jajnici,
                  
               
                     —
                  
                  
                     testisi (barem jedan),
                  
               
                     —
                  
                  
                     epididimis,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sjemene vezukule s prednjim režnjem prostate,
                  
               
                     —
                  
                  
                     prostata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     hipofiza,
                  
               
                     —
                  
                  
                     identificirani ciljni organi.
                  
               Histopatologija na 1.B kohorti obavila bi se u slučaju dvosmislenosti rezultata 1.A kohorte ili u slučajevima sumnje na reproduktivne ili endokrine toksične tvari.
         67.   Kohorte 2.A i 2.B: ispitivanje razvojne neurotoksičnosti (21. ili 22. PND i odrasli potomci). Životinje iz 2.A kohorte usmrćuju se nakon bihevioralnog ispitivanja, bilježi se težina njihovih mozgova te se radi procjene neurotoksičnosti obavlja potpuna neurohistopatologija. Životinje iz 2.B kohorte usmrćuju se 21. ili 22. postnatalnog dana, bilježi se težina njihovih mozgova te se radi procjene neurotoksičnosti obavlja mikroskopski pregled mozga. Perfuzijska fiksacija obvezna je u životinja iz 2.A kohorte, dok u životinja iz 2.B kohorte nije kako je predviđeno ispitnom metodom B.53 (35).
         
            Masa organa i čuvanje tkiva – životinje F1 koje se upravo odbijaju od sise
         
         68.   Mladunci koji nisu raspoređeni u kohorte, uključujući patuljaste životinje, usmrćuju se nakon odbijanja od sise 22. postnatalnog dana, osim ako se rezultatima ne ukazuje na potrebu za daljnjim ispitivanjima uživo. Usmrćeni mladunci podvrgavaju se makroskopskoj nekropsiji, uključujući procjenu reproduktivnih organa kako je opisano u stavcima 62. i 63. Mozak, slezenu i timus najviše deset mladunaca po spolu i skupini iz što je više moguće legala treba izvagati i čuvati u odgovarajućim uvjetima. Osim toga, mliječne žlijezde tih mužjaka i ženki mladunaca mogu se čuvati za daljnju mikroskopsku analizu (13) (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 (40)). Makroabnormalnosti i ciljna tkiva treba sačuvati radi mogućeg histološkog pregleda.
         
            Histopatologija – životinje P
         
         69.   Potpuna histopatologija organa navedenih u stavcima 62. i 63. obavlja se na svim životinjama P iz kontrolne skupine i skupine koja je primala visoku dozu. Treba pregledati i organe svih životinja iz skupina koje su primale nižu dozu u kojih su uočene promjene povezane s tretmanom radi utvrđivanja vrijednosti kod kojih nisu uočeni štetni učinci. Osim toga, reproduktivne organe svih životinja u kojih se sumnja na smanjenu plodnost, npr. u životinja koje se nisu parile, nisu začele, proizvele i okotile zdravo potomstvo, ili u kojih je bilo utjecaja na ciklus estrusa ili broj, pokretljivost ili morfologiju spermatozoida, kao i sve makrolezije treba histopatološki obraditi.
         
            Histopatologija – životinje F1
            
         
         
            Životinje iz 1. kohorte
         
         70.   Potpuna histopatologija organa navedenih u stavcima 62. i 63. obavlja se na svim odraslim životinjama iz 1.A kohorte iz kontrolne skupine i skupine koja je primala visoku dozu. Najmanje jedan mladunac po spolu trebao bi predstavljati svako leglo. Treba pregledati i organe i tkiva svih životinja iz skupina koje su primale nižu dozu u kojih su uočene promjene povezane s tretmanom i sve makrolezije radi utvrđivanja vrijednosti kod kojih nisu uočeni štetni učinci. Radi procjene prenatalnih i postnatalnih učinaka na limfne organe treba procijeniti i histopatologiju na prikupljenim limfnim čvorovima i koštanoj srži 10 mužjaka i 10 ženki iz 1.A kohorte uz već provedenu histopatološku procjenu timusa, slezene i nadbubrežnih žlijezda u svih životinja iz 1.A kohorte.
         71.   Reproduktivna i endokrina tkiva svih životinja iz 1.B kohorte obrađenih do faze blokiranja prema opisu iz stavka 66. treba pregledati radi histopatologije u slučajevima sumnje na reproduktivne ili endokrine toksične tvari. I 1.B kohortu treba podvrgnuti histološkom pregledu ako su rezultati 1.A kohorte dvosmisleni.
         72.   Jajnici odraslih ženki trebali bi sadržavati primordijalne i folikule u rastu, kao i žuta tijela. Zato histopatološki pregled treba usmjeriti na otkrivanje kvantitativne procjene primordijalnih folikula i malih folikula u rastu, kao i žutih tijela u ženki F1. Broj životinja, odabir sekcije jajnika i veličina uzorka sekcije trebali bi statistički odgovarati upotrijebljenom postupku procjene. Prebrojavanje folikula moguće je prvo obaviti na kontrolnim životinjama i životinjama koje su primale visoku dozu, a u slučaju nepovoljnog učinka u potonjih treba razmotriti niže doze. Radi usporedbe tretiranih i kontrolnih jajnika pregled bi trebao obuhvatiti brojanje primordijalnih folikula, kombinirano s malim folikulima u rastu (vidjeti OECD-ovu Smjernicu 151 (40)). Procjenu žutih tijela treba provesti usporedno s ispitivanjem ciklusa estrusa tako da se kod procjene može uzeti u obzir faza ciklusa. Jajovodi, maternica i vagina pregledavaju se radi odgovarajućeg razvoja tipičnog za organe.
         73.   Obavljaju se detaljni histopatološki pregledi testisa na mužjacima F1 kako bi se utvrdili učinci povezani s tretmanom na diferencijaciju i razvoj testisa i na spermatogenezu (38). Po mogućnosti treba pregledati i sekcije rete testisa. Pregledavaju se glava, tijelo i rep epididimisa i sjemenovodi s obzirom na odgovarajući razvoj tipičan za organe, kao i na parametre potrebne za mužjake P.
         
            Životinje iz 2. kohorte
         
         74.   Neurohistopatologija se obavlja u svih životinja koje su primale visoku dozu i kontrolnih životinja iz 2.A kohorte po spolu nakon dovršetka neurobihevioralnog ispitivanja (nakon 75. postnatalnog dana, ali ne dulje od 90. postnatalnog dana). Histopatologija mozga obavlja se u svih životinja koje su primale visoku dozu i kontrolnih životinja iz 2.B kohorte po spolu 21. ili 22. postnatalnog dana. Treba pregledati i organe i tkiva svih životinja iz skupina koje su primale nižu dozu u kojih su uočene promjene povezane s tretmanom radi utvrđivanja vrijednosti kod kojih nisu uočeni štetni učinci. Kod životinja iz 2.A i 2.B kohorte pregledava se više sekcija mozga kako bi se omogućio pregled olfaktornog bulbusa, cerebralnog korteksa, hipokampusa, bazalnih ganglija, talamusa, hipotalamusa, srednjeg mozga (krova, tegmentuma i moždanih krakova), moždanog debla i malog mozga. Samo kod 2.A kohorte pregledavaju se i oči (mrežnica i vidni živac) te uzorci perifernih živaca. Svi neurohistološki postupci trebali bi biti u skladu s ispitnom metodom B.53 (35).
         75.   Morfometričke (količinske) procjene treba obaviti na reprezentativnim regijama mozga (homologne sekcije pažljivo odabrane na temelju pouzdanih mikroskopskih posebnosti), a one mogu uključivati linearna i/ili prostorna mjerenja specifičnih regija mozga. Najmanje tri uzastopne sekcije treba uzeti kod svake posebnosti (razine) radi odabira najviše homogene i reprezentativne sekcije za specifičnu regiju mozga koju treba procijeniti. Neuropatolog bi trebao procijeniti jesu li sekcije pripremljene za mjerenje homologne u odnosu na ostale u uzorku, a time i prikladne za uključivanje s obzirom na to da se osobito linearne mjere mogu promijeniti na relativno kratkoj udaljenosti (28). Nehomologne sekcije ne treba upotrebljavati. Iako je cilj uzorkovati sve životinje predviđene u tu svrhu (10/spol/visina doze), i manje vrijednosti mogu biti odgovarajuće. Međutim, uzorci od manje od šest životinja po spolu i visini doze u pravilu se ne bi smatrali dovoljnima za potrebe ove ispitne metode. Stereologija se može upotrebljavati za identifikaciju učinaka povezanih s tretmanom na parametre poput volumena ili broja stanica za posebne neuroanatomske dijelove. Sve aspekte pripreme uzoraka tkiva, od fiksiranja tkiva, preko disekcije uzoraka tkiva, obrada tkiva te bojenje preparata treba obaviti prema uravnoteženom planu tako da svaka serija uključuje reprezentativne uzorke svake skupine koja je primila određenu dozu. Ako treba koristiti morfometričke ili stereološke analize, tada moždano tkivo treba uklopiti u dogovarajući medij istodobno na svim visinama doze kako bi se izbjeglo skupljanje artefakata povezanih s produljenim čuvanjem u fiksativu.
         IZVJEŠĆIVANJE
         
            Podaci
         
         76.   Podaci se navode pojedinačno i sažeto u obliku tablice. Prema potrebi za svaku ispitnu skupinu i svaku generaciju treba navesti sljedeće podatke: broj životinja na početku ispitivanja, broj životinja koje su pronađene mrtve tijekom ispitivanja ili koje su usmrćene iz humanih razloga, vrijeme svake smrti ili humanog usmrćivanja, broj plodnih životinja, broj skotnih ženki, broj životinja koje su okotile leglo te broj životinja u kojih su uočeni znakovi toksičnosti. Treba navesti i opis toksičnosti, uključujući vrijeme početka, trajanje i težinu.
         77.   Numeričke rezultate treba procijeniti primjerenom i opće prihvaćenom statističkom metodom. Statističke metode treba birati kod dizajna studije, a njima na primjeren način treba obuhvatiti nenormalne podatke (npr. podatke o broju), cenzurirane podatke (npr. ograničeno vrijeme opažanja), neovisnost (npr. učinci na leglo i ponovljene mjere) te nejednake varijance. Općenitim linearnim miješanim modelima i modelima doza-reakcija obuhvaćena je široka klasa analitičkih alata koji mogu biti odgovarajući za podatke dobivene ovom ispitnom metodom. Izvješće bi trebalo sadržavati dovoljno informacija o analitičkoj metodi i računalnom programu koji je upotrijebljen kako bi neovisni revizor/statističar mogao procijeniti/ponovno procijeniti analizu.
         
            Vrednovanje rezultata
         
         78.   Nalaze treba vrednovati s obzirom na uočene učinke, uključujući nekropsiju i mikroskopske nalaze. Vrednovanje uključuje odnos, ili njegov izostanak, između doze i postojanja, pojave i težine abnormalnosti, uključujući makrolezije. Treba vrednovati i ciljne organe, kliničke abnormalnosti, reproduktivno funkcioniranje i funkcioniranje legla, promjene tjelesne mase, mortalitet i sve ostale toksične i razvojne učinke. Posebnu pažnju treba posvetiti promjenama specifičnima za spol. Kod vrednovanja rezultata ispitivanja treba uzeti u obzir fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije i, ako su dostupni, toksikokinetičke podatke, uključujući prijenos u posteljici i izlučivanje mlijeka.
         
            Izvješće o ispitivanju
         
         79.   Izvješće o ispitivanju trebalo bi uključivati sljedeće informacije dobivene u postojećoj studiji na životinjama P, F1 i F2 (prema potrebi):
         
            Ispitivana kemikalija
         
         
                     —
                  
                  
                     sve relevantne dostupne informacije o kemikaliji, toksikokinetičkim i toksikodinamičkim obilježjima ispitivane kemikalije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     identifikacijski podaci,
                  
               
                     —
                  
                  
                     čistoća.
                  
               
            Nosač (prema potrebi)
         
         
                     —
                  
                  
                     obrazloženje za odabir nosača, ako nije riječ o vodi.
                  
               
            Ispitne životinje
         
         
                     —
                  
                  
                     upotrijebljena vrsta/soj,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj, starost i spol životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana, materijal za izradu gnijezda itd.,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinačna tjelesna masa životinja na početku ispitivanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o vaginalnom brisu ženki P prije početka tretmana (ako se podaci tada prikupljaju),
                  
               
                     —
                  
                  
                     evidencije uparivanja generacije P uz navođenje muškog i ženskog partnera kod parenja te uspjeh parenja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     evidencije o leglu podrijetla za odrasle životinje generacije F1.
                  
               
            Ispitni uvjeti
         
         
                     —
                  
                  
                     podloge za odabir visine doze,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o sastavu ispitivane kemikalije/pripremi hrane, postignutim koncentracijama,
                  
               
                     —
                  
                  
                     stabilnost i homogenost pripravka u nosaču ili drugom nosaču (npr. prehrana, voda za piće), u krvi i/ili mlijeku u uvjetima upotrebe i pohranjivanja između upotreba,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     preračunavanje koncentracije (ppm) ispitivane kemikalije u hrani/vodi za piće u postignutu dozu (mg/kg tjelesne mase/dan), ako je primjenljivo,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o kvaliteti hrane i vode (uključujući, po mogućnosti, sastav hrane),
                  
               
                     —
                  
                  
                     detaljan opis postupaka nasumičnog odabira mladunaca za izdvajanje te za raspodjelu mladunaca u ispitne skupine,
                  
               
                     —
                  
                  
                     okolišni uvjeti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     popis osoblja koje je sudjelovalo u studiji, uključujući stručno usavršavanje.
                  
               
            Rezultati (sažetak i pojedinačni podaci po spolu i dozi)
         
         
                     —
                  
                  
                     unos hrane, unos vode ako je dostupan, učinkovitost hrane (porast tjelesne mase po gramu unesene hrane, osim za razdoblje kohabitacije i tijekom laktacije) i unos ispitivane kemikalije (za primjenu hranom/vodom) za životinje P i F1,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o apsorpciji (ako su dostupni),
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o tjelesnoj masi životinja P,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o tjelesnoj masi odabranih životinja F1 nakon odbijanja od sise,
                  
               
                     —
                  
                  
                     vrijeme smrti tijekom studije ili preživljavanje životinja do usmrćenja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     karakter, težina i trajanje kliničkih opažanja (jesu li reverzibilna ili ne),
                  
               
                     —
                  
                  
                     hematologija, analiza urina i podaci o kliničkoj kemiji uključujući TSH i T4,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fenotipska analiza stanica slezene (T-, B-, NK-stanice),
                  
               
                     —
                  
                  
                     celularnost koštane srži,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o toksičnoj reakciji,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj ženki P i F1 s normalnim i abnormalnim ciklusom estrusa i trajanje ciklusa,
                  
               
                     —
                  
                  
                     vrijeme do parenja (interval prije koitusa, broj dana između uparivanja i parenja),
                  
               
                     —
                  
                  
                     toksični ili drugi učinci na reprodukciju, uključujući brojeve i postotke životinja koje su postigle parenje, graviditet, parturiciju i laktaciju, mužjaka koji su uzrokovali graviditet, ženki sa znakovima distocije/produljene ili otežane parturicije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     trajanje graviditeta i parturicije, ako je dostupno,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj implantacija, veličina legla i postotak muških mladunaca,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj i postotak gubitaka nakon implantacije, živorođenih i mrtvorođenih,
                  
               
                     —
                  
                  
                     masa legla i podaci o masi mladunaca (mužjaka, ženki i kombinirano), broj patuljastih životinja ako je utvrđen,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj mladunaca s makroabnormalnostima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     toksični i drugi učinci na potomstvo, postnatalni rast, vitalnost itd.,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o fizičkim posebnostima mladunaca i ostali podaci o postnatalnom razvoju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o spolnom sazrijevanju životinja F1,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o funkcionalnim opažanjima u mladunaca i odraslih životinja, ako je primjenljivo,
                  
               
                     —
                  
                  
                     tjelesna masa u trenutku usmrćenja i podaci o apsolutnoj i relativnoj masi organa za životinje P i F1,
                  
               
                     —
                  
                  
                     nalazi nekropsije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     iscrpan opis svih histopatoloških nalaza,
                  
               
                     —
                  
                  
                     ukupan broj spermatozoida iz repa epididimisa, postotak progresivno pokretljivih spermatozoida, postotak morfološki normalnih spermatozoida i postotak spermatozoida po svakoj identificiranoj anomaliji za mužjake P i F1,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj i faze sazrijevanja folikula iz jajnika ženki P i F1, prema potrebi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     nabrajanje žutih tijela u jajnicima ženki F1,
                  
               
                     —
                  
                  
                     statistička obrada rezultata, prema potrebi.
                  
               
            Parametri 2. kohorte
         
         
                     —
                  
                  
                     detaljan opis postupaka upotrijebljenih za standardizaciju opažanja i postupaka, kao i operativne definicije za bodovanje opažanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     popis svih upotrijebljenih ispitnih postupaka i obrazloženje za njihovu upotrebu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o upotrijebljenim bihevioralnim/funkcionalnim, neuropatološkim i morfometričkim postupcima, uključujući informacije i pojedinosti o automatskim uređajima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     postupci za kalibriranje i osiguranje istovjetnosti uređaja i ujednačavanje skupina za tretiranje u ispitnim postupcima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     kratko obrazloženje svih odluka koje uključuju stručno mišljenje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     detaljan opis svih bihevioralnih/funkcionalnih, neuropatoloških i morfometričkih nalaza po spolu i skupini za doziranje, uključujući povećanja i smanjenja u usporedbi s kontrolnim skupinama,
                  
               
                     —
                  
                  
                     masa mozga,
                  
               
                     —
                  
                  
                     sve dijagnoze postavljene na temelju neuroloških znakova i lezija, uključujući prirodne bolesti ili stanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     slike egzemplarnih nalaza,
                  
               
                     —
                  
                  
                     mikroskopske slike za procjenu homologije sekcija upotrijebljenih za morfometriju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     statistički tretman rezultata, uključujući statističke modele upotrijebljene za analizu podataka te rezultati neovisno o tome jesu li značajni ili ne,
                  
               
                     —
                  
                  
                     utjecaj ostalih toksičnih učinaka na zaključak o neurotoksičnom potencijalu ispitivane kemikalije po spolu i skupini za doziranje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     utjecaj toksikokinetičkih informacija na zaključke,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci kojima se potvrđuju pouzdanost i osjetljivost ispitne metode (npr. pozitivni i povijesni kontrolni podaci),
                  
               
                     —
                  
                  
                     odnosi, ako postoje, između neuropatoloških i funkcionalnih učinaka,
                  
               
                     —
                  
                  
                     vrijednosti kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL) ili referentna doza za ženke i potomke po spolu i skupini za doziranje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     rasprava o ukupnom tumačenju podataka na temelju rezultata, uključujući zaključak o tome je li razvojna neurotoksičnost posljedica kemikalije ili ne te o vrijednostima kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL).
                  
               
            Parametri 3. kohorte
         
         
                     —
                  
                  
                     titri antitijela iz seruma IgM (senzitizacija na SRBC ili KLH), ili IgM PFC jedinice slezenskog IgM (senzitizacija na SRBC),
                  
               
                     —
                  
                  
                     funkcioniranje metode TDAR trebao bi prvi put tijekom postupka optimizacije potvrditi laboratorij koji je započeo ispitivanje, a potom periodički (npr. jednom godišnje) svi laboratoriji,
                  
               
                     —
                  
                  
                     rasprava o ukupnom tumačenju podataka na temelju rezultata, uključujući zaključak o tome je li razvojna imunotoksičnost posljedica ispitivane kemikalije ili ne te o vrijednostima kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL).
                  
               
            Rasprava o rezultatima
         
         
            Zaključci, uključujući vrijednosti kod kojih nisu zamijećeni štetni učinci (NOAEL) na roditelje i potomstvo
         
         Treba dostaviti i sve informacije koje nisu dobivene tijekom studije, ali koje su korisne za tumačenje rezultata (npr. sličnosti učinaka s bilo kojom poznatom toksičnom tvari.
         
            Tumačenje rezultata
         
         80.   Produljena studija reproduktivne toksičnosti na jednoj generaciji pružit će, prema potrebi, informacije o učincima ponavljanog izlaganja nekoj kemikaliji tijekom svih faza reproduktivnog ciklusa. Točnije, studija pruža informacije o reproduktivnom sustavu i o razvoju, rastu i funkcionalnim krajnjim točkama potomaka do 90. postnatalnog dana.
         81.   Tumačenjem rezultata studije treba uzeti u obzir sve dostupne informacije o kemikaliji, uključujući fizikalno-kemijska, toksikokinetička i toksikodinamička svojstva, dostupne relevantne informacije o strukturnim analozima te rezultate ranije provedenih studija toksičnosti s ispitivanom kemikalijom (npr. studije akutne toksičnosti, toksičnosti nakon ponovljene primjene i mehanizma te studije kojima se procjenjuje postoje li bitne kvalitativne i kvantitativne razlike među vrstama s obzirom na metabolička svojstva in vivo/in vitro). Po mogućnosti rezultate makroskopske nekropsije i vaganja organa treba procijeniti u kontekstu opažanja iz drugih studija s ponovljenom dozom. Usporavanja rasta potomaka moguće je razmotriti u odnosu na utjecaj ispitivane kemikalije na sastav mlijeka (29).
         
            2. kohorta (razvojna neurotoksičnost)
         
         82.   Neurobihevioralne i neuropatološke rezultate treba tumačiti u kontekstu svih nalaza na temelju dokaza i stručne prosudbe. Treba raspravljati o uzorcima bihevioralnih i morfoloških nalaza, ako postoje te dokazima u pogledu doze-reakcije. U tu karakterizaciju treba uključiti procjenu razvojne neurotoksičnosti, uključujući epidemiološke studije na ljudima ili izvješća o slučajevima te eksperimentalne studije na životinjama (npr. toksikokinetički podaci, informacije o strukturnoj aktivnosti, podaci iz ostalih studija toksičnosti). Procjenom podataka treba obuhvatiti i raspravu o biološkom i statističkom značaju. Procjena bi trebala uključivati odnos, ako postoji, između uočenih neuropatoloških i bihevioralnih promjena. Za smjernice o tumačenju rezultata razvojne neurotoksičnosti vidjeti ispitnu metodu B.53 (35) i Tyl et al., 2008. (31).
         
            3. kohorta (razvojna imunotoksičnost)
         
         83.   Slabljenje ili poboljšanje imunološke funkcije iz procjene TDAR-a (reakcija antitijela ovisnih o T-stanicama) treba procijeniti u kontekstu svih obavljenih opažanja. Značaj ishoda TDAR-a moguće je potvrditi ostalim učincima na imunološki povezane indikatore (npr. celularnost koštane srži), masa i histopatologija limfnih tkiva, distribucija podsustava limfocita). Učinci utvrđeni TDAR-om mogu biti manje značajni u slučaju ostalih uočenih toksičnosti pri nižim koncentracijama izlaganja.
         84.   Za pomoć pri tumačenju reprodukcije i rezultata neurotoksičnosti (26) treba konzultirati OECD-ovu Smjernicu 43.
         
            LITERATURA
         
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006.), A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology, 36., 69. – 98.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999.), Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets, Lab. Anim. Sci., 49., 530. – 536.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Zoetis, T. and I. Walls (2003.), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005.), Direct Dosing of Preweaning Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group, International Journal of Toxicology, 24., 87. – 94.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999.), Stimulating Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment, Toxicological Sciences, 49., 1. – 4.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995.), Detection of Effects on Male Reproduction – a Literature Survey, Journal of the American College of Toxicologists, 14., 293. – 327.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003.), Some Aspects Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37., 356. – 369.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. Mayahara and Y. Ohno (2000.). Collaborative work to evaluate toxicity on male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies, Journal of Toxicological Sciences, 25., 1. – 21.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Creasy, D.M. (2003.), Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxicologic Pathology, Birth Defects Research, Part B, 68., 408. – 415.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper (2007.), The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84. – 97.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Sadleir, R.M.F.S. (1979.), Cycles and Seasons, in C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds (1999.), Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383. – 390.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977.), Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat, Biological Reproduction, 17., 298. – 303.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Ladics, G.S. (2007.), Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxicity Testing, Methods, 41., 9. – 19.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. Herzyk (2004.), Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation, Toxicology, 197., 23. – 35.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989.), A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat, Fundamental and Applied Toxicology, 12., 92. – 108.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978.), Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats, Journal of Reproduction and Fertility, 54., 103. – 107.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991.), The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology, 5., 39. – 44.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996.), Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report, Reproductive Toxicology, 10., 237. – 244.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992.), Methods for Assessing Rat Sperm Motility, Reproductive Toxicology, 6., 267. – 273.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992.), Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration, Journal of Andrology, 13., 409. – 421.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991.), Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations, Reproductive Toxicology, 5., 449. – 458.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993.), Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. str. 319. – 333.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989.), The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations, Journal of Andrology, 10., 401. – 415.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992.), Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants, Reproductive Toxicology, 6., 491. – 505.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     OECD (2008.), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/JM/MONO(2008)16, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     Working, P.K., M. Hurtt (1987.), Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility, Journal of Andrology, 8., 330. – 337.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006.), A ‚Best Practices’ Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today, Toxicological Pathology, 34., 296. – 313.
                  
               
                  
                     (29)
                  
                  
                     Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de Duffard, and R. Duffard (2006.), Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components, Food Chemicals Toxicology, 44., 8. – 16.
                  
               
                  
                     (30)
                  
                  
                     Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Caviness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007.), Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats, Environmental health perspectives, 115(12), 1717. – 1726.
                  
               
                  
                     (31)
                  
                  
                     Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. Sobotka (2008.), Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints, Neurotoxicology and Teratology, 30: 349. – 381.
                  
               
                  
                     (32)
                  
                  
                     OECD (1996.), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (33)
                  
                  
                     Poglavlje B.43. ovog Priloga, Studija neurotoksičnosti u glodavaca
                  
               
                  
                     (34)
                  
                  
                     OECD (2000.), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (35)
                  
                  
                     Poglavlje B.53. ovog Priloga, Studija razvojne neurotoksičnosti.
                  
               
                  
                     (36)
                  
                  
                     Poglavlje B.54. ovog Priloga, Uterotropni biotest na glodavcima: Kratkoročni test probira na estrogenska obilježja.
                  
               
                  
                     (37)
                  
                  
                     Poglavlje B.55. ovog Priloga, Hershbergerov biotest na glodavcima Kratkoročni test probira na (anti)androgenska svojstva.
                  
               
                  
                     (38)
                  
                  
                     OECD (2009.), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 106, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (39)
                  
                  
                     OECD (2011.), Guidance Document on the Current Implementation of Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (40)
                  
                  
                     OECD (2013.), Guidance Document supporting TG 443: Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OECD, Pariz.
                  
               
            Dodatak 1.
            Vrijednosti i opažanja uključeni u funkcionalno-opservacijsku bateriju (kohorta 2.A)
            
                        Kavez u kojem se drže životinje i otvoreno područje
                     
                     
                        Manipulativni
                     
                     
                        Fiziološki
                     
                  
                        Držanje
                     
                     
                        Lakoća uklanjanja
                     
                     
                        Temperatura
                     
                  
                        Nevoljni klonički i tonički pokreti
                     
                     
                        Lakoća rukovanja
                     
                     
                        Tjelesna masa
                     
                  
                        Zatvaranje kapaka
                     
                     
                        Mišićni tonus
                     
                     
                        Reakcije zjenica
                     
                  
                        Piloerekcija
                     
                     
                        Reakcija na pristupanje
                     
                     
                        Veličina zjenica
                     
                  
                        Slinjenje
                     
                     
                        Reakcija na dodir
                     
                     
                         
                     
                  
                        Izlučivanje suza
                     
                     
                        Reakcija na buku
                     
                     
                         
                     
                  
                        Vokalizacije
                     
                     
                        Reakcija na štipanje repa
                     
                     
                         
                     
                  
                        Kretanje unatrag
                     
                     
                        Reakcija na uspravljanje
                     
                     
                         
                     
                  
                        Abnormalnosti u hodu
                     
                     
                        ,Spuštenost stopala'
                     
                     
                         
                     
                  
                        Uzbuđenje
                     
                     
                        Snaga prednjih udova
                     
                     
                         
                     
                  
                        Stereotipi
                     
                     
                        Snaga stražnjih udova
                     
                     
                         
                     
                  
                        Neobično ponašanje
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Mrlje
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
                        Respiratorne abnormalnosti
                     
                     
                         
                     
                     
                         
                     
                  
         
            Dodatak 2.
            DEFINICIJE
            
               
                  Kemikalija
               : Tvar ili smjesa.
            
               
                  Ispitivana kemikalija
               : Sve tvari ili smjese koje se ispituju tom ispitnom metodom.
         
         B.57.   TEST STEROIDOGENEZE H295R
         
         UVOD
         1.   Ova je ispitna metoda istovjetna Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 456 (2011.). OECD je u 1998. pokrenuo aktivnost visokog prioriteta revizije postojećih i razvoja novih smjernica za ispitivanje za probir i ispitivanje potencijalnih endokrino disruptivnih kemikalija. OECD-ov konceptualni okvir za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija iz 2002. sastoji se od pet razina, pri čemu svaka razina odgovara drugoj razini biološke složenosti (1). U testu steroidogeneze H295R in vitro koji se opisuje ovom ispitnom metodom upotrebljava se stanična linija humanog adrenokarcinoma (stanice NCI-H295R), a on predstavlja 2. liniju ‚testa in vitro kojim se dobivaju mehanički podaci’ koje treba upotrebljavati kod probira i rangiranja. Razvoj i standardizacija testa kao probira za kemijske učinke steroidogeneze, osobito na proizvodnju 17β-estradiola (E2) i testosterona (T), provedeni su u nekoliko faza. Test H295R optimiziran je i validiran (2) (3) (4) (5).
         2.   Cilj je testa steroidogeneze H295R otkriti kemikalije koje utječu na proizvodnju hormona E2 i T. Test H295R namijenjen je otkrivanju ksenobiotika čija su ciljna mjesta endogene komponente koje predstavljaju međustanični biokemijski put koji počinje od niza reakcija od kolesterola do proizvodnje hormona E2 i/ili T. Test H295R nije namijenjen otkrivanju kemikalija koje utječu na steroidogenezu zbog učinaka na os hipotalamus-hipofiza-gonada. Cilj je testa pružiti odgovor DA/NE s obzirom na potencijal kemikalije da potakne ili spriječi proizvodnju hormona T i E2. Međutim, u nekim je slučajevima moguće dobiti kvantitativne rezultate. Rezultati testa izražavaju se kao relativne promjene u proizvodnji hormona u usporedbi s kontrolama otapala. Cilj testa nije pružanje specifičnih mehaničkih podataka o interakciji ispitivane kemikalije i endokrinog sustava. Istraživanja su provedena upotrebom stanične linije za utvrđivanje učinaka na specifične enzime i hormone posrednike poput progesterona (2).
         3.   Definicije i kratice upotrijebljene u ovoj ispitnoj metodi opisuju se u Dodatku. Detaljan protokol, uključujući upute za pripremanje otopina, kultiviranje stanica i provođenje raznih aspekata ispitivanja, dostupan je kao dodaci I–III. OECD-ova dokumenta,Višelaboratorijska validacija testa steroidogeneze H295R radi utvrđivanja modulatora proizvodnje testosterona i estradiola (4).
         POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA
         4.   Pet različitih enzima koji kataliziraju šest različitih reakcija uključeno je u biosintezu spolnog steroidnog hormona. Enzimatska konverzija kolesterola u pregnenolon s pomoću enzima odvajanja bočnog lanca kolesterola (CYP11A) citokroma P450 (CYP) predstavlja prvi korak u nizu biokemijskih reakcija čiji je vrhunac sinteza steroidnih krajnjih proizvoda. Ovisno o redu sljedeće dvije reakcije, steroidogenski put dijeli se na dva puta, put Δ5-hidroksisteroida i put Δ4-ketosteroida koji se približavaju kod proizvodnje androstendiona (slika 1.).
         5.   Androstendion se pretvara u testosteron (T) s pomoću 17β-hidroksisteroid-dehidrogenaze (17β-HSD). Testosteron je i hormon posrednik i krajnji hormonom. U mužjaka se može pretvoriti u dihidrotestosteron (DHT) s pomoću 5α-reduktaze, koja se nalazi u staničnim membranama, jezgrenoj ovojnici i endoplazmatskom retikulumu ciljnih tkiva androgenskog djelovanja poput prostate i sjemenih vezikula. DHT je znatno potentniji kao androgen u usporedbi s testosteronom te se smatra i krajnjim hormonom. Testom H295R ne mjeri se DHT (vidjeti stavak 10.).
         6.   Aromataza (CYP19) jest enzim na steroidogenskom putu kojim se androgenske kemikalije pretvaraju u estrogenske. Njome se testosteron pretvara u 17β-estradiol (E2), a androstendion u estron. Hormoni E2 i T smatraju se krajnjim hormonima steroidogenskog puta.
         7.   Specifičnost djelovanja liaze aromataze CYP17 razlikuje se za supstrate posrednike među vrstama. U ljudi enzim favorizira supstrate puta Δ5-hidroksisteroida (pregnenolon), dok su u štakora poželjniji supstrati na putu Δ4-ketosteroida (progesteron) (19). Takvim razlikama u aktivnosti liaze aromataze CYP17 mogu se objasniti neke razlike u reakciji na kemikalije kojima se mijenja steroidogeneza in vivo prema vrstama (6). Dokazano je da su stanice H295 najsličnije adrenalnoj ekspresiji enzima i uzorku proizvodnje steroida u odraslih ljudi (20), ali je poznato da one izražavaju enzime za putove Δ5-hidroksisteroida i Δ4-ketosteroida za sintezu androgena (7) (11) (13) (15).
         
            Slika 1.
         
         
            Steroidogenski put u stanicama H295R
         
         
            Napomena:
         
         Enzimi su u kurzivu, hormoni su podebljani, a strelice ukazuju na smjer sinteze. Siva pozadina predstavlja putove/proizvode kortikosteroida. Putovi/proizvodi spolnih steroida su zaokruženi. CYP = citokrom P450; HSD = hidroksisteroid-dehidrogenaza; DHEA = dehidroepiandrosteron.
         8.   Stanična linija humanog adrenokarcinoma (H295R) koristan je model in vitro za ispitivanje učinaka na sintezu steroidnih hormona (2) (7) (8) (9) (10). Stanična linija H295R izražava gene koji kodiraju sve gore navedene ključne enzime za steroidogenezu (11) (15) (slika 1.). To je jedinstveno obilježje jer je ekspresija tih gena in vivo specifična za tkivo i razvojnu fazu, uz u pravilu više tkiva i razvojnih faza koji izražavaju sve gene uključene u steroidogenezu (2). Stanice H295R odlikuju se fiziološkim karakteristikama zonski nediferenciranih humanih fetalnih adrenalnih stanica (11). Stanice predstavljaju jedinstveni sustav in vitro s obzirom na to da se odlikuju sposobnošću proizvodnje svih steroidnih hormona koji se nalaze u odraslome adrenalnom korteksu i gonadama, čime se omogućava ispitivanje učinaka na sintezi kortikosteroida i proizvodnju spolnih steroidnih hormona poput androgena i estrogena, iako je test validiran samo za otkrivanje hormona T i E2. Promjene zabilježene ispitnim sustavom u obliku promjene u proizvodnji hormona T i E2 mogu biti posljedica brojnih interakcija ispitivanih kemikalija i steroidogenih funkcija izraženih stanicama H295R. One uključuju modulaciju ekspresije, sintezu ili funkciju enzima uključenih i proizvodnju, transformaciju ili eliminaciju steroidnih hormona (12) (13) (14). Razlozi inhibicije proizvodnje hormona mogu biti izravno konkurentsko povezivanje s enzimom na putu, učinak na sučimbenike poput NADPH-a (nikotinamid adenin dinukleotid fosfat) i cAMP-a (ciklički adenozin monofosfat) i/ili porast metabolizma steroida ili suzbijanje ekspresije gena određenih enzima na putu steroidogeneze. Iako inhibicija može biti funkcija izravnih ili neizravnih postupaka uključenih u proizvodnju hormona, indukcija je u pravilu neizravnog karaktera, poput utjecaja na sučimbenike poput NADPH-a i cAMP-a (kao u slučaju forskolina), smanjenja metabolizma steroida (13) i/ili pospješivanja steroidogenske ekspresije gena.
         9.   Test H295R ima nekoliko prednosti:
         
                     —
                  
                  
                     njime se omogućava otkrivanje povećanja i smanjenja proizvodnje hormona T i E2,
                  
               
                     —
                  
                  
                     njime se dopušta izravna procjena potencijalnog učinka kemikalije na vitalnost/citotoksičnost stanice. To je važno obilježje jer se njime omogućava razlikovanje učinaka koji su posljedica citotoksičnosti i onih koji su posljedica izravne interakcije kemikalija i steroidogenskih putova, što nije moguće u sustavima u kojima se upotrebljavaju eksplantati tkiva koji se sastoje od brojnih vrsta stanica različitih osjetljivosti i funkcionalnosti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     za njegovo provođenje nisu potrebne životinje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     stanična linija H295R komercijalno je dostupna.
                  
               10.   Načelna su ograničenja testa kako slijedi:
         
                     —
                  
                  
                     nepoznat je njegov metabolički kapacitet, ali je vjerojatno vrlo ograničen. Stoga će kemikalije koje treba metabolički aktivirati vjerojatno biti izostavljene iz ovog testa.
                  
               
                     —
                  
                  
                     s obzirom na to da nastaje iz adrenalnog tkiva, H295R se dolikuje enzimima sposobnima za proizvodnju glukokortikoida i mineralnih kortikoida, kao i spolnih hormona. Stoga bi učinci na proizvodnju glukokortikoida i mineralnih kortikoida mogli utjecati na razine hormona T i E2 uočene u testu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     njime se ne mjeri DHT i zato se ne očekuje da se njime otkriju kemikalije koje inhibiraju 5α-reduktazu, za što se može upotrebljavati Hershbergerov test (16),
                  
               
                     —
                  
                  
                     testom H295R neće se otkriti kemikalije koje ometaju steroidogenezu tako da utječu na os hipotalamus-hipofiza-gonada jer se nju može ispitivati samo na netaknutim životinjama.
                  
               NAČELO TESTA
         11.   Namjena je testa otkrivanje kemikalija koje utječu na proizvodnju hormona T i E2. Testosteron je i hormon posrednik na putu proizvodnje hormona E2. Testom se mogu otkriti kemikalije kojima se u pravilu inhibiraju ili induciraju enzimi puta steroidogeneze.
         12.   Test se obično provodi u standardnim uvjetima stanične kulture na pločicama za uzgoj kulture s 24 jažice. Alternativno, za provođenje testa mogu se upotrebljavati i druge veličine pločica. Međutim, uvjete razmnožavanja i pokusa treba odgovarajuće prilagoditi kako bi se kriteriji učinka i dalje primjenjivali.
         13.   Nakon razdoblja aklimatizacije u trajanju od 24 sata na pločicama s višestrukim jažicama, stranice se 48 sati izlaže sedam koncentracija ispitivane kemikalije u najmanje tri primjerka. Otapalo i poznati inhibitor i induktor proizvodnje hormona dodaju se u fiksnoj koncentraciji kao negativne i pozitivne kontrole. Na kraju razdoblja izlaganja iz svake se jažice uklanja medij. Vitalnost stanica u svakoj jažici analizira se neposredno nakon uklanjanja medija. Koncentracije hormona u mediju moguće je izmjeriti raznim metodama, uključujući komercijalno dostupne komplete za mjerenje hormona i/ili instrumentalnim tehnikama poput masene spektrometrije s tekućinskom kromatografijom (LC-MS). Podaci su izraženi kao promjena omjera u odnosu na kontrolu otapala i najnižu koncentraciju s vidljivim učinkom (LOEC). Ako je test negativan, najviša ispitivana koncentracija navodi se kao koncentracija bez vidljivog učinka (NOEC). Zaključke o sposobnosti kemikalije da utječe na steroidogenezu treba temeljiti na najmanje dva neovisna ispitivanja. Prvo ispitivanje može služiti za utvrđivanje raspona, uz naknadnu prilagodbu koncentracija za drugo i treće ispitivanje ako dođe do problema radi topljivosti ili citotoksičnosti ili ako se čini da je djelovanje kemikalije pri kraju raspona ispitivanih koncentracija.
         POSTUPAK U POGLEDU KULTURA
         
            Stanična linija
         
         14.   Stanice NCI-H295R mogu se kupiti od centra American Type Culture Collections (ATCC) nakon potpisa ugovora o prijenosu materijala (14).
         
            Uvod
         
         15.   Zbog promjena kapaciteta za proizvodnju hormona E2 stanica zbog starenja/prolaza (2), stranice prije upotrebe treba kultivirati u skladu s posebnim protokolom te treba zabilježiti broj prolaza od odmrzavanja stanica, kao i broj prolaza kod zamrzavanja stanica i njihova smještaja u spremnik s tekućim dušikom. Prvi broj odnosi se na stvarni broj staničnih prolaza, dok se drugi odnosi na broj prolaza kod zamrzavanja stanica i njihova smještaja u spremnik. Primjerice, stanice koje su smrznute nakon petog prolaza i odmrznute te potom podijeljene tri puta (četiri prolaza, pri čemu su svježe odmrznute stanice prvi prolaz) nakon ponovne kultivacije imale bi oznaku prolaz 4,5. Primjer sheme za označivanje brojevima opisuje se u Dodatku 1. izvješću o validaciji (4).
         16.   Osnovni se medij upotrebljava kao osnova za dopunjene medije i medije za zamrzavanje. Dopunjeni je medij nužna komponenta za kultivaciju stanica. Medij za zamrzavanje posebno je namijenjen zamrzavanju stranica bez posljedica radi dugotrajnog čuvanja. Prije upotrebe treba analizirati nu-serum (ili usporedivi serum jednakih svojstava za koji je dokazano da daje podatke u skladu sa zahtjevima u pogledu provođenja ispitivanja i kontrole kvalitete), koji je sastavni dio dopunjenih medija, radi osnovnih koncentracija hormona T i E2. Priprema tih otopina opisuje se u Dodatku 1. izvješću o validaciji (4).
         17.   Nakon inicijacije stanične kulture H295R iz prvotne ATCC-ove serije, stanice treba uzgajati za pet prolaza (tj. stanice se dijele 4 puta). Stanice petog prolaza potom se zamrzavaju u spremniku s tekućim dušikom. Prije zamrzavanja stanica uzorak prethodnih stanica četvrtog prolaza stavlja se na pločicu za kontrolu kvalitete (vidjeti stavke 36. i 37.) kako bi se potvrdilo jesu li osnovna proizvodnja hormona i reakcija na pozitivne kontrolne kemikalije u skladu s kriterijima kontrole testa kako su definirani u tablici 5.
         18.   Stanice H295R treba kultivirati, zamrznuti i pohraniti u tekućem dušiku kako bi se osiguralo da su one uvijek stanice odgovarajućeg prolaza/starosti za kultivaciju i upotrebu. Najveći broj prolaza nakon uzimanja nove (15) ili zamrznute (16) serije stanica u kulturu koji je prihvatljiv za upotrebu u testu H295R ne smije premašiti deset. Primjerice, prihvatljivi bi prolazi za stanične kulture iz serije zamrznute kod petog prolaza bili 4,5 do 10,5. Za stanice započete iz tih zamrznutih serija treba slijediti postupak iz stavka 19. Te stanice treba kultivirati za najmanje četiri (4) dodatna prolaza (prolaz 4,5) prije njihove upotrebe u ispitivanju.
         
            Započinjanje stanica iz zamrznute zalihe
         
         19.   Postupak za započinjanje stanica iz zamrznute zalihe treba upotrebljavati kad se nova serija stanica vadi iz spremnika s tekućim dušikom radi kultivacije i ispitivanja. Pojedinosti o ovom postupku navedene su u Dodatku III. izvješću o validaciji (4). Stanice se vade iz spremnika s tekućim dušikom, ubrzano odmrzavaju, smještaju u dopunjeni medij u kivetu za centrifugiranje, centrifugiraju na sobnoj temperaturi, ponovno suspendiraju u dopunjenom mediju te premještaju u tikvicu s kulturom. Medij treba promijeniti sljedećeg dana. Stanice H295R kultiviraju se u inkubatoru na 37 °C s 5 %-tnim CO2 u zraku, a medij se obnavlja 2 do 3 puta tjedno. Kad su stanice približno 85 – 90 % konfluentne, treba ih podijeliti. Dijeljenje stanica nužno je radi osiguranja zdravlja i rasta stanica te čuvanja stanica za provođenje biotestova. Stanice se tri puta ispiru fiziološkom otopinom s fosfatnim pulferom (bez Ca2+ Mg2+) i oslobađaju iz tikvice s kulturom dodavanjem odgovarajućeg enzima za odvajanje, npr. tripsina u fiziološku otopinu s fosfatnim pulferom (bez Ca2+ Mg2+). Neposredno nakon odvajanja stanica od tikvice s kulturom treba zaustaviti djelovanje enzima dodavanjem dopunjenog medija u omjeru trostrukog volumena upotrijebljenog za tretman enzimom. Stanice se stavljaju u kivetu za centrifugiranje, centrifugiraju se na sobnoj temperaturi, uklanja se supernatant te se stanični talog ponovno suspendira u dopunjenom mediju. Odgovarajuća količina otopine stanica stavlja se u novu tikvicu s kulturom. Količinu otopine stanica treba prilagoditi tako da su stanice konfluentne u roku od 5 do 7 dana. Preporučeni je omjer potkultivacije 1:3 do 1:4. Pločicu treba pažljivo označiti. Stanice su sada spremne za upotrebu u testu, a višak stanica treba zamrznuti u tekućem dušiku kako je opisano u stavku 20.
         
            Zamrzavanje stanica H295R (priprema stanica za čuvanje u tekućem dušiku)
         
         20.   Kod pripreme stanica H295R za zamrzavanje treba slijediti gore opisani postupak za dijeljenje stanica do koraka za ponovnu suspenziju staničnog taloga s dna kivete za centrifugiranje. Ovdje se stanični talog ponovno suspendira u mediju za zamrzavanje. Otopina se premješta u kriogenu posudu, odgovarajuće označava te 24 sata zamrzava na – 80 °C, nakon čega se kriogena posuda stavlja u spremnik s tekućim dušikom. Pojedinosti o ovom postupku navedene su u Dodatku III. izvješću o validaciji (4).
         
            Nanošenje na pločice i preinkubacija stanica za ispitivanje
         
         21.   Broj potrebnih pločica s 24 jažice pripremljenih kako se navodi u stavku 19. ovisi o broju kemikalija koje treba ispitati i konfluenciji stanica u posudama s kulturom. U pravilu, jedna tikvica s kulturom (75 cm2) 80 – 90 % konfluentnih stanica imat će dovoljno stanica za jednu do 1,5 pločicu (24 jažice) ciljne gustoće od 200 000 do 300 000 stanica po ml medija, što će dovesti do konfluencije od 50 – 60 % u jažicama u 24 sata (slika 2.). To je u pravilu optimalna gustoća stanica za proizvodnju hormona u testu. Pri većim gustoćama mijenjaju se uzorci proizvodnje hormona T i E2. Prije prvog provođenja testa preporučuje se ispitivanje različitih gustoća razmnožavanja između 200 000 i 300 000 stanica po ml te odabir gustoće za konfluenciju od 50 – 60 % u jažici tijekom 24 sata.
         
            Slika 2.
         
         
            Fotomikrograf stanica H295R pri gustoći razmnožavanja od 50 % na pločici s 24 jažice u 24 sata zabilježen na rubu (A) i u središtu (B) jažice.
         
         22.   Medij se pipetom vadi iz tikvice s kulturom, stanice se ispiru tri puta sterilnom fiziološkom otopinom s fosfatnim pulferom (bez Ca2+ Mg2+). Otopina enzima (u fiziološkoj otopini s fosfatnim pulferom (bez Ca2+ Mg2+) dodaje se radi odvajanja stanica od tikvice s kulturom. Nakon odgovarajućeg vremenskog razdoblja za odvajanje stanica treba zaustaviti djelovanje enzima dodavanjem dopunjenog medija u omjeru trostrukog volumena upotrijebljenog za tretman enzimom. Stanice se stavljaju u kivetu za centrifugiranje, uklanja se supernatant te se stanični talog ponovno suspendira u dopunjenom mediju. Gustoća stanica izračunava se s pomoću, primjerice, hemocitometra ili brojača stanica. Otopinu stanica treba razrijediti do željene gustoće za nanošenje na pločice i temeljito promiješati kako bi se osigurala homogenost gustoće stanica. 1 ml otopine stanica po jažici treba nanijeti na pločicu te označiti pločice i jažice. Pločice na koje su nanesene stanice podvrgavaju se inkubaciji u trajanju od 24 sata pri 37 °C s 5 %-tnim CO2 u zraku kako bi se stanice mogle pričvrstiti na jažice.
         ZAHTJEVI U POGLEDU KONTROLE KVALITETE
         23.   Ključno je dodavanje točnih količina otopina i uzoraka u jažice tijekom doziranja jer se na taj način utvrđuju koncentracije koje se upotrebljavaju u izračunima rezultata testa.
         24.   Svaki bi laboratorij prije započinjanja stanične kulture i bilo kakvog naknadnog ispitivanja trebao dokazati osjetljivost svog sustava mjerenja hormona (stavci 29. do 31.).
         25.   Ako se upotrebljavaju testovi mjerenja hormona na temelju antitijela, kemikalije koje treba ispitati prije prvog ispitivanja treba analizirati s obzirom na njihov potencijal narušavanja sustava mjerenja koji se upotrebljava za mjerenje hormona T i E2 kako je navedeno u stavku 32.
         26.   DMSO je preporučeno otapalo za test. Ako se upotrebljava alternativno otapalo, treba utvrditi sljedeće:
         
                     —
                  
                  
                     topljivost ispitivane kemikalije, forskolina i prokloraza u otapalu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     citotoksičnost kao funkciju koncentracije otapala.
                  
               Preporučuje se da najveća dopuštena koncentracija otapala ne premašuje deseterostruku najmanju citotoksičnu koncentraciju otapala.
         27.   Prije prvog ispitivanja laboratorij bi trebao provesti kvalifikacijski pokus kojim dokazuje svoju sposobnost održavanja i postizanja odgovarajućih uvjeta u pogledu stanične kulture i pokusa nužnih za ispitivanje kemikalije kako je opisano u stavcima 33. do 35.
         28.   Pri pokretanju ispitivanja na novoj seriji kontrolnu pločicu treba ispitati prije upotrebe nove serije kako bi se ocijenio učinak stanica kako je opisano u stavcima 36. i 37.
         
            Učinak sustava mjerenja hormona
         
         
            Osjetljivost, točnost i preciznost metode i unakrsna reaktivnost s matricom uzorka
         
         29.   Svaki laboratorij može za analizu proizvodnje hormona T i E2 stanica H295R upotrebljavati sustav mjerenja hormona po izboru u skladu s kriterijima učinka, uključujući granicu kvantifikacije (LOQ). Nominalno oni iznose 100 pg/ml za hormon T i 10 pg/ml za hormon E2, koji se temelje na osnovnim razinama hormona iz validacijskih studija. Međutim, više ili niže razine mogu biti odgovarajuće ovisno o osnovnim razinama hormona ostvarenima u laboratoriju koji provodi ispitivanje. Prije prve upotrebe pločice za kontrolu kvalitete i početka ispitivanja laboratorij bi trebao analizom dopunjenog medija s dodatkom interne hormonske kontrole dokazati da se hormonskim testom koji treba upotrebljavati mogu mjeriti koncentracije hormona u dopunjenom mediju dovoljno točno i precizno u skladu s kriterijima za kontrolu kvalitete navedenima u tablicama 1. i 5. U dodatni medij treba dodati najmanje tri koncentracije svakog hormona (npr. 100, 500 i 2 500 pg/ml hormona T, odnosno 10, 50 i 250 pg/ml hormona E2; ili je za najniže koncentracije dodatka za hormone T i E2 moguće upotrijebiti najniže moguće koncentracije na temelju graničnih vrijednosti otkrivanja odabranog sustava mjerenja hormona) i analizirati. Izmjerene koncentracije hormona neekstrahiranih uzoraka trebale bi biti unutar 30 % nominalnih koncentracija, a varijacije između ponovljenih mjerenja istog uzorka ne smiju premašivati 25 % (vidjeti i tablicu 8. za dodatne kriterije u pogledu kontrole kvalitete). Ako su ti kriteriji u pogledu kontrole kvalitete ispunjeni, pretpostavlja se da je odabrani test mjerenja hormona dovoljno točan, precizan te da nije unakrsno reaktivan s komponentama u mediju (matrica uzorka) tako da bi se mogao očekivati znatan utjecaj na ishod testa. U tom slučaju nije potrebna ekstrakcija uzoraka prije mjerenja hormona.
         30.   U slučaju da kriteriji u pogledu kontrole kvalitete iz tablica 1. i 8. nisu ispunjeni, može doći do znatnog učinka matrice te treba provesti pokus s pomoću ekstrahiranog medija s dodatkom. Primjer postupka ekstrakcije opisuje se u Dodatku 2. izvješću o validaciji (4). Mjerenja koncentracija hormona u ekstrahiranim uzorcima treba provesti u tri primjerka (17). Ako se može dokazati da nakon ekstrakcije komponente medija ne ometaju metodu otkrivanja hormona kako je definirana kriterijima za kontrolu kvalitete, sva daljnja ispitivanja treba provoditi upotrebljavajući ekstrahirane uzorke. Ako je kriterije za kontrolu kvalitete nemoguće ispuniti nakon ekstrakcije, upotrijebljeni sustav mjerenja hormona ne odgovara svrsi testa steroidogeneze H295R te treba upotrijebiti drugu metodu otkrivanja hormona.
         
            Standardna krivulja
         
         31.   Koncentracije hormona kontrola otapala trebale bi se nalaziti unutar linearnog dijela standardne krivulje. Poželjno je da se vrijednosti kontrola otapala nalaze blizu središta linearnog dijela kako bi se osigurala mogućnost mjerenja indukcije i inhibicije sinteze hormona. Otopine medija (ili ekstrakata) koje treba mjeriti treba odabrati u skladu s tim. Linearni odnos treba utvrditi odgovarajućim statističkim pristupom.
         
            Ispitivanje interferencije kemikalije
         
         32.   Ako će se za mjerenje hormona upotrebljavati testovi na osnovi antitijela poput imunoenzimskih testova (ELISA) i radioimunoloških testova (RIA), svaku kemikaliju prije početka stvarnog ispitivanja kemikalija treba ispitati radi potencijalne interferencije sa sustavom mjerenja hormona koji treba upotrijebiti (Dodatak III. izvješću o validaciji (4)) zato što neke kemikalije mogu ometati navedena ispitivanja (17). Ako interferencija iznosi ≥ 20 % osnovne proizvodnje hormona T i E2 utvrđene analizom hormona, treba provesti ispitivanje interferencije testa hormona kemikalije (kako je opisano u odjeljku 5.0 Dodatka III. izvješću o validaciji (4)) na svima osnovnim otopinama ispitivane kemikalije kako bi se utvrdila granična doza pri kojoj dolazi do znatne interferencije (≥ 20 %). Ako interferencija iznosi manje od 30 %, podaci se mogu ispraviti za interferenciju. Ako interferencija iznosi više od 30 %, podaci su nevažeći te treba odbaciti podatke pri tim koncentracijama. Ako do znatne interferencije ispitivane kemikalije sa sustavom mjerenja hormona dođe kod više necitotoksičnih koncentracija, treba upotrebljavati drugi sustav mjerenja hormona. Kako bi se izbjegla interferencija kontaminirajućih kemikalija, preporučuje se ekstrakcija hormona iz medija s pomoću odgovarajućeg otapala, a moguće se metode nalaze u izvješću o validaciji (4).
         
            Tablica 1.
         
         
            Kriteriji učinka za sustave mjerenja hormona
         
         
                     Parametar
                  
                  
                     Kriterij
                  
               
                     Osjetljivost mjerne metode
                  
                  
                     Granica kvantifikacije (LOQ)
                     T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (18)
                     
                  
               
                     Učinkovitost ekstrakcije hormona (samo u slučaju potrebe)
                  
                  
                     Prosječna brzina obnavljanja (na temelju trostrukih mjera) količina hormona s dodatkom ne smije se razlikovati više od 30 % od dodane količine.
                  
               
                     Interferencija kemikalije (samo sustavi na temelju antitijela)
                  
                  
                     Ne smije doći do znatne (≥ 30 % osnovne proizvodnje hormona odgovarajućeg hormona) unakrsne reaktivnosti niti s jednim hormonom koji proizvode stanice (19)
                         (20)
                     
                  
               
            Ispitivanje osposobljenosti laboratorija
         
         33.   Prije ispitivanja nepoznatih kemikalija laboratorij bi, provođenjem ispitivanja osposobljenosti, trebao dokazati da može postići i održati odgovarajuću staničnu kulturu i ispitne uvjete nužne za uspješno provođenje testa. S obzirom na to da je provođenje testa izravno povezano s osobljem laboratorija koje ga provodi, te postupke treba djelomično ponoviti ako dođe do promjene osoblja.
         34.   To će se ispitivanje osposobljenosti provesti u jednakim uvjetima navedenima u stavcima 38. do 40. izlaganjem stanica sedam rastućih koncentracija jakih, umjerenih i slabih induktora i inhibitora, kao i negativnoj kemikaliji (vidjeti tablicu 2.) Točnije, kemikalije koje treba ispitati uključuju jaki induktor forskolin (br. CAS 66575-29-9), jaki inhibitor prokloraz (br. CAS 67747-09-5), umjereni induktor atrazin (br. CAS 1912-24-9), umjereni inhibitor aminoglutetimid (br. CAS 125-84-8), slabi induktor (proizvodnja hormona E2) i slabi inhibitor (proizvodnja hormona T), bisfenol A (br. CAS 80-05-7) i negativnu kemikaliju humani korionski gonadotropin (HCG) (br CAS 9002-61-3) kako je navedeno u tablici 2. Za sve se kemikalije upotrebljavaju zasebne pločice s pomoću formata navedenih u tablici 6. Jednu pločicu za kontrolu kvalitete kemikalija za ispitivanje osposobljenosti (tablica 4., stavci 36. i 37.) treba uključiti u svakodnevno ispitivanje.
         
            Tablica 2.
         
         
            Kemikalije za ispitivanje osposobljenosti i koncentracije izlaganja
         
         
                     Kemikalija za ispitivanje osposobljenosti
                  
                  
                     Ispitne koncentracije [μM]
                  
               
                     Prokloraz
                  
                  
                     0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10
                  
               
                     Forskolin
                  
                  
                     0 (21), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30
                  
               
                     Atrazin
                  
                  
                     0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
                  
               
                     Aminoglutetimid
                  
                  
                     0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
                  
               
                     Bisfenol A
                  
                  
                     0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
                  
               
                     HCG
                  
                  
                     0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
                  
               Izlaganje stanica H295R kemikalijama za ispitivanje osposobljenosti treba provesti na pločicama s 24 jažice tijekom ispitivanja osposobljenosti laboratorija. Doziranje je u μM za sve doze ispitivane kemikalije. Doze treba primijeniti u DMSO-u pri 0,1 % v/v po jažici. Sve ispitne koncentracije treba ispitati u trostrukim jažicama (tablica 6.). Za svaku se kemikaliju upotrebljava zasebna pločica. Jedna pločica za kontrolu kvalitete uključena je u svakodnevno ispitivanje.
         35.   Analize vitalnosti stanica i hormona treba provoditi kako je predviđeno stavcima 42. do 46. Graničnu vrijednost (najniža koncentracija s vidljivim učinkom, LOEC) i odluku o klasifikaciji treba prijaviti i usporediti s vrijednostima u tablici 3. Podaci se smatraju prihvatljivima ako su u skladu s LOEC-om i klasifikacijom odluke u tablici 3.
         
            Tablica 3.
         
         
            Granične vrijednosti (LOEC-ovi) i klasifikacije odluke za kemikalije za ispitivanje osposobljenosti
         
         
                      
                  
                  
                     Br. CAS
                  
                  
                     LOEC [μM]
                  
                  
                     Klasifikacija odluke
                  
               
                     T
                  
                  
                     E2
                  
                  
                     T
                  
                  
                     E2
                  
               
                     Prokloraz
                  
                  
                     67747-09-5
                  
                  
                     ≤ 0,1
                  
                  
                     ≤ 1,0
                  
                  
                     + (22)(inhibicija)
                  
                  
                     + (inhibicija)
                  
               
                     Forskolin
                  
                  
                     66575-29-9
                  
                  
                     ≤ 10
                  
                  
                     ≤ 0,1
                  
                  
                     + (indukcija)
                  
                  
                     + (indukcija)
                  
               
                     Atrazin
                  
                  
                     1912-24-9
                  
                  
                     ≤ 100
                  
                  
                     ≤ 10
                  
                  
                     + (indukcija)
                  
                  
                     + (indukcija)
                  
               
                     Aminoglutetimid
                  
                  
                     125-84-8
                  
                  
                     ≤ 100
                  
                  
                     ≤ 100
                  
                  
                     + (inhibicija)
                  
                  
                     + (inhibicija)
                  
               
                     Bisfenol A
                  
                  
                     80-05-7
                  
                  
                     ≤ 10
                  
                  
                     ≤ 10
                  
                  
                     + (inhibicija)
                  
                  
                     + (indukcija)
                  
               
                     HCG
                  
                  
                     9002-61-3
                  
                  
                     Nije primjenjivo
                  
                  
                     Nije primjenjivo
                  
                  
                     Negativno
                  
                  
                     Negativno
                  
               
               
            Pločica za kontrolu kvalitete
         
         36.   Pločica za kontrolu kvalitete upotrebljava se za provjeru učinka stanica H295R u standardnim uvjetima kulture te za uspostavu povijesne baze podataka koncentracija hormona u kontrolama otapala, pozitivnih i negativnih kontrola, kao i ostalih vrijednosti kontrole kvalitete tijekom vremena.
         
                     —
                  
                  
                     Učinak stanica H295R treba procjenjivati s pomoću pločice za kontrolu kvalitete za svaku novu ATCC-ovu seriju ili nakon prve upotrebe prethodno zamrznute zalihe stanica, osim ako je ispitivanje osposobljenosti laboratorija (stavci 32. do 34.) provedeno na toj seriji stanica.
                  
               
                     —
                  
                  
                     Pločica za kontrolu kvalitete pruža cjelovitu procjenu uvjeta testa (npr. vitalnost stanica, kontrole otapala, negativne i pozitivne kontrole, kao i varijabilnost unutar testa i između testova) kod ispitivanja kemikalija te bi trebala biti dijelom svakog ispitivanja.
                  
               37.   Ispitivanje kontrole kvalitete provodi se na pločici s 24 jažice te slijedi jednake postupke inkubacije, doziranja, vitalnosti stanica/citotoksičnosti, ekstrakcije i analize hormona opisane u stavcima 38. do 46. za ispitivanje kemikalija. Pločica za kontrolu kvalitete sadržava praznine, kontrole otapala i dvije koncentracije poznatog induktora (forskolin, 1, 10 μM) i inhibitor (prokloraz, 0,1, 1 μM) sinteze hormona E2 i T. Osim toga, MeOH se upotrebljava u odabranim jažicama kao pozitivna kontrola za test vitalnosti/citotoksičnosti. Detaljan opis izgleda pločice naveden je u tablici 4. Kriteriji koje treba ispuniti na pločici za kontrolu kvalitete navedeni su u tablici 5. Minimalnu osnovnu proizvodnju hormona za hormone T i E2 treba postići u kontroli otapala i praznim jažicama.
         
            Tablica 4.
         
         
            Izgled pločice za kontrolu kvalitete za ispitivanje učinka neizloženih stanica H295R i stanica izloženih poznatim inhibitorima (PRO = prokloraz) i stimulatorima (FOR = forskolin) proizvodnje hormona T i E2. Nakon završetka pokusa s izlaganjem i uklanjanja medija, 70 %-tna otopina metanola dodat će se svim jažicama s metanolom kako bi služile kao pozitivna kontrola za citotoksičnost (vidjeti test citotoksičnosti u Dodatku III. izvješću o validaciji (4))
         
         
                      
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
               
                     A
                  
                  
                     Praznina (23)
                     
                  
                  
                     Praznina (23)
                     
                  
                  
                     Praznina (23)
                     
                  
                  
                     Praznina (23)
                     
                     (+ MeOH) (24)
                     
                  
                  
                     Praznina (23)
                     
                     (+ MeOH) (24)
                     
                  
                  
                     Praznina (23)
                     
                     (+ MeOH) (24)
                     
                  
               
                     B
                  
                  
                     DMSO (25)
                     
                     1 μl
                  
                  
                     DMSO (25)
                     
                     1 μl
                  
                  
                     DMSO (25)
                     
                     1 μl
                  
                  
                     DMSO (25)
                     
                     1 μl
                     (+ MeOH) (24)
                     
                  
                  
                     DMSO (25)
                     
                     1 μl
                     (+ MeOH) (24)
                     
                  
                  
                     DMSO (25)
                     
                     1 μl
                     (+ MeOH) (24)
                     
                  
               
                     C
                  
                  
                     FOR 1 μM
                  
                  
                     FOR 1 μM
                  
                  
                     FOR 1 μM
                  
                  
                     PRO 0,1 μM
                  
                  
                     PRO 0,1 μM
                  
                  
                     PRO 0,1 μM
                  
               
                     D
                  
                  
                     FOR 10 μM
                  
                  
                     FOR 10 μM
                  
                  
                     FOR 10 μM
                  
                  
                     PRO 1 μM
                  
                  
                     PRO 1 μM
                  
                  
                     PRO 1 μM
                  
               
            
         
            Tablica 5.
         
         
            Kriteriji učinka pločice za kontrolu kvalitete
         
         
                      
                  
                  
                     T
                  
                  
                     E2
                  
               
                     Osnovna proizvodnja hormona u kontroli otapala
                  
                  
                     ≥ 5 puta granica kvantifikacije
                  
                  
                     ≥ 2,5 puta granica kvantifikacije
                  
               
                     Indukcija (10 μM forskolina)
                  
                  
                     ≥ 1,5 puta kontrole otapala
                  
                  
                     ≥ 7,5 puta kontrole otapala
                  
               
                     Inhibicija (1μM prokloraza)
                  
                  
                     ≥ 0,5 puta kontrole otapala
                  
                  
                     ≥ 0,5 puta kontrole otapala
                  
               POSTUPAK IZLAGANJA KEMIKALIJI
         38.   Preinkubirane stanice uklanjaju se iz inkubatora (stavak 21.) te se prije doziranja pod mikroskopom provjerava jesu li u dobrom stanju (prianjanje, morfologija).
         39.   Stanice se stavljaju u kabinet za biološku sigurnost, uklanja se dopunjeni medij i dodaje se novi dopunjeni medij (1 ml/jažica). DMSO je poželjno otapalo za ovu ispitnu metodu. Međutim, ako postoje razlozi za upotrebu drugih otapala, treba opisati znanstvenu podlogu. Stanice se izlažu ispitivanoj kemikaliji dodavanjem 1 μl odgovarajuće osnovne otopine u DMSO-u (vidjeti Dodatak II. izvješću o validaciji (4)) po 1 ml dopunjenog medija (volumen jažice). Posljedica je toga konačna koncentracija od 0,1 % DMSO-a u jažicama. Kako bi se osiguralo odgovarajuće miješanje, u pravilu je poželjno miješanje odgovarajuće osnovne otopine ispitivane kemikalije u DMSO-u s dopunjenim medijem radi postizanja željene konačne koncentracije za svaku dozu te dodavanje smjese u svaku jažicu neposredno nakon uklanjanja starog medija. Ako se upotrebljava ova mogućnost, koncentracija u jažicama DMSO-a (0,1 %) trebala bi biti jednaka. Jažice s dvije najviše koncentracije vizualno se procjenjuju stereomikroskopom s obzirom na nastanak taloga ili oblaka kao pokazatelja nedovršenog otapanja ispitivane kemikalije. Ako se uoče takvi uvjeti (oblaci, nastanak taloga), pregledavaju se i jažice sa sljedećim nižim koncentracijama itd., a koncentracije koje nisu u potpunosti prešle u otopinu treba isključiti iz daljnje evaluacije i analize. Pločica se vraća u inkubator na 37 °C s 5 %-tnim CO2 u zraku na 48 sati. Izgled pločice s ispitivanom kemikalijom naveden je u tablici 6. Zalihe 1. do 7. predstavljaju smještaj rastućih doza ispitivane kemikalije.
         
            Tablica 6.
         
         
            Shema doziranja za izlaganje stanica H295R ispitivanim kemikalijama na pločici s 24 jažice
         
         
                      
                  
                  
                     1
                  
                  
                     2
                  
                  
                     3
                  
                  
                     4
                  
                  
                     5
                  
                  
                     6
                  
               
                     A
                  
                  
                     DMSO
                  
                  
                     DMSO
                  
                  
                     DMSO
                  
                  
                     4. zaliha
                  
                  
                     4. zaliha
                  
                  
                     4. zaliha
                  
               
                     B
                  
                  
                     1. zaliha
                  
                  
                     1. zaliha
                  
                  
                     1. zaliha
                  
                  
                     5. zaliha
                  
                  
                     5. zaliha
                  
                  
                     5. zaliha
                  
               
                     C
                  
                  
                     2. zaliha
                  
                  
                     2. zaliha
                  
                  
                     2. zaliha
                  
                  
                     6. zaliha
                  
                  
                     6. zaliha
                  
                  
                     6. zaliha
                  
               
                     D
                  
                  
                     3. zaliha
                  
                  
                     3. zaliha
                  
                  
                     3. zaliha
                  
                  
                     7. zaliha
                  
                  
                     7. zaliha
                  
                  
                     7. zaliha
                  
               40.   Nakon 48 sati pločice za izlaganje vade se iz inkubatora te se svaka jažica provjerava pod mikroskopom kako bi se utvrdilo stanje stanica (prianjanje, morfologija, stupanj konfluencije) i znakovi citotoksičnosti. Medij iz svake jažice dijeli se u dvije jednake količine (približno 490 μl svaka) i premješta u dvije zasebne, odgovarajuće označene posude (tj. jedan alikvot kao rezervni uzorak za svaku jažicu). Kako bi se spriječilo isušivanje stanica, medij se uklanja redak po redak ili stupac po stupac i zamjenjuje medijem za test vitalnosti stanica/citotoksičnost. Ako se vitalnost stanica/citotoksičnost ne mjeri odmah, u svaku se jažicu dodaje 200 μl fiziološke otopine s fosfatnim pulferom s Ca2+ i Mg2+. Mediji se zamrzavaju pri – 80 °C do daljnje obrade radi analize koncentracija hormona (vidjeti stavke 44. do 46.) Iako su hormoni T i E2 koji se čuvaju u mediju pri – 80 °C u pravilu stabilni najmanje 3 mjeseca, stabilnost hormona tijekom čuvanja treba dokumentirati unutar svakog laboratorija.
         41.   Neposredno nakon uklanjanja medija vitalnost stanica/citotoksičnost utvrđuje se za svaku pločicu za izlaganje.
         
            Utvrđivanje vitalnosti stanica
         
         42.   Radi utvrđivanja potencijalnog učinka ispitivane kemikalije na vitalnost stanica moguće je upotrijebiti test vitalnost stanica/citotoksičnosti po izboru. Testom bi se trebalo moći doći do podataka o pravoj vrijednosti postotka vitalnih stanica prisutnih u jažici ili treba dokazati da se on može izravno usporediti s (linearnom funkcijom) testa Live/Dead® (vidjeti Dodatak III. izvješću o validaciji (4)). Alternativni test za koji je dokazano da je jednako učinkovit test je MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazol bromid] (18). Procjena vitalnosti stanica s pomoću prethodno navedenih metoda relativna je vrijednost kojom se nužno ne ukazuje na linearne odnose s apsolutnim brojem stanica u jažici. Zato bi analitičar istodobno trebao obaviti subjektivnu procjenu svake jažice i zabilježiti digitalne fotografije kontrole otapala i dvije najviše necitotoksične koncentracije i pohraniti ih za kasniju procjenu stvarne gustoće stanica prema potrebi. Ako se vizualnim pregledom utvrdi ili testom vitalnosti stanica/citotoksičnosti dokaže povećanje broja stanica, to povećanje treba potvrditi. Ako se povećanje broja stanica potvrdi, to treba navesti u izvješću o ispitivanju. Vitalnost stanica izrazit će se u odnosu na prosječnu reakciju u kontrolama otapala, što se smatra 100 % vitalnim stanicama te se izračunava prema potrebi za test vitalnost stanica/citotoksičnosti koji se upotrebljava. Za test MTT moguće je upotrijebiti sljedeću formulu:
         % vitalnih stanica = (reakcija u jažici – prosječna reakcija u jažicama tretiranima metanolom (= 100 % mrtve)) ÷ (prosječna reakcija u jažicama s kontrolom otapala – prosječna reakcija u jažicama tretiranima metanolom (= 100 % mrtve))
         43.   Stanice čija je vitalnost manja od 80 % u odnosu na prosječnu vitalnost u kontrolama otapala (= 100 % vitalnosti) ne treba uključiti u analizu konačnih podataka. Inhibiciju steroidogeneze koja se javlja u prisutnosti gotovo 20 % citotoksičnosti treba detaljno procijeniti kako bi se osiguralo da citotoksičnost nije uzrok inhibicije.
         
            Analiza hormona
         
         44.   Svaki laboratorij za analizu hormona T i E2 može upotrebljavati sustav mjerenja hormona po izboru. Rezervne alikvote medija iz svake skupine za tretiranje moguće je upotrijebiti za pripremu otopina kako bi se koncentracija vratila unutar linearnog dijela standardne krivulje. Kako je navedeno u stavku 29., svaki bi laboratorij trebao dokazati sukladnost svojeg sustava mjerenja hormona (npr. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) s kriterijima za kontrolu kvalitete analizom dopunjenog medija kojem je dodana interna kontrola hormona prije provedbe kontrole kvalitete ili ispitivanja kemikalija. Kako bi se osiguralo da sastavni dijelovi ispitnog sustava ne utječu na mjerenje hormona, hormone treba ekstrahirati iz medija prije mjerenja (vidjeti stavak 30. za uvjete u kojima ekstrakcija jest ili nije potrebna). Preporučuje se da se ekstrakcija obavi nakon postupaka iz Dodatka III. izvješću o validaciji (4).
         45.   Ako se za mjerenje proizvodnje hormona upotrebljava komercijalni komplet za ispitivanje, analizu hormona treba provesti kako je navedeno u uputama koje osigurava proizvođač kompleta. Većina proizvođača ima jedinstveni postupak za analizu hormona. Otopine uzoraka treba prilagoditi tako da se očekivane koncentracije hormona za kontrole otapala nalaze unutar središta linearnog raspona standardne krivulje pojedinačnog testa (Dodatak III. izvješću o validaciji (4)). Vrijednosti izvan linearnog dijela standardne krivulje treba odbaciti.
         46.   Konačne koncentracije hormona izračunavaju se kako slijedi:
         Primjer:
         
                     Ekstrahirano:
                  
                  
                     450 μl
                  
               
                     Rekonstruirano u:
                  
                  
                     250 μl testnog pufera
                  
               
                     Otopina u testu:
                  
                  
                     1:10 (kako bi se uzorak nalazio unutar linearnog raspona standardne krivulje)
                  
               
                     Koncentracija hormona u testu:
                  
                  
                     150 pg/ml (već prilagođeno koncentraciji po ml testiranog uzorka)
                  
               
                     Obnavljanje:
                  
                  
                     89 %
                  
               
                     Konačna koncentracija hormona =
                  
                  
                     (Koncentracija hormona (po ml) ÷ obnavljanje) (faktor razrjeđivanja)
                  
               
                     Konačna koncentracija hormona =
                  
                  
                     (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
                  
               
            Odabir ispitnih koncentracija
         
         47.   Test treba provesti u dva neovisna pokusa. Osim ako su ranije informacije poput informacija o graničnim vrijednostima topljivosti ili citotoksičnosti osnova za odabir ispitnih koncentracija, preporučuje se da se ispitne koncentracije za početni pokus rasporede u intervalima log10, pri čemu je 10-3 M najviša koncentracija. Ako je kemikalija topljiva i nije citotoskična ni kod jedne ispitne koncentracije te ako je prvi pokus bio negativan na sve koncentracije, tada to treba potvrditi u jednom pokusu ili više njih u uvjetima jednakima prvom pokusu (tablica 7.). Ako su rezultati prvog pokusa dvosmisleni (tj. promjena omjera statistički je značajna iz kontrole otapala samo kod jedne koncentracije) ili pozitivni (tj. promjena omjera pri dvije susjedne koncentracije ili više njih statistički je značajna), ispitivanje treba ponoviti kako je navedeno u tablici 7. rafiniranjem odabranih ispitnih koncentracija. Ispitne koncentracije u drugom i trećem pokusu (prema potrebi) treba prilagoditi na temelju rezultata početnog pokusa kojima se izdvajaju koncentracije kojima je postignut učinak rasporedom koncentracije polovičnog logaritma (npr. ako je prvotni pokus od 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM uzrokovao indukcije pri 1 i 10 μM, koncentracije koje se ispituju u drugom pokusu trebale bi biti 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM)), osim ako su za postizanje LOEC-a potrebne niže koncentracije. U potonjem slučaju u drugom pokusu treba s pomoću skale polovičnog logaritma upotrijebiti najmanje pet koncentracija ispod najniže koncentracije ispitivane u prvom pokusu. Ako se prvi pokus ne potvrdi drugim (tj. statistički značaj ne pojavljuje se kod prethodno pozitivno ispitanoj koncentraciji ± 1 pomak koncentracije), treba provesti treći pokus u izvornim uvjetima ispitivanja. Dvosmisleni rezultati u prvom pokusu smatraju se negativnima ako uočeni učinak nije moguće potvrditi u bilo kojem od dvaju naknadnih pokusa. Dvosmisleni rezultati smatraju se pozitivnim reakcijama (pozitivnim učinkom) ako je reakciju moguće potvrditi u barem još jednom pokusu unutar pomaka koncentracije ± 1 (vidjeti odjeljak 55. za postupak tumačenja podataka).
         
            Tablica 7.
         
         
            Matrica odluke za moguće scenarije ishoda
         
         
                     1. pokus
                  
                  
                     2. pokus
                  
                  
                     3. pokus
                  
                  
                     Odluka
                  
               
                     Scenarij
                  
                  
                     Odluka
                  
                  
                     Scenarij
                  
                  
                     Odluka
                  
                  
                     Scenarij
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                     Negativan
                  
               
                     Negativan
                  
                  
                     Potvrditi (26)
                     
                  
                  
                     Negativan
                  
                  
                     Zaustavljanje
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     X
                  
               
                     Negativan
                  
                  
                     Potvrditi (26)
                     
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                     Rafinirati (27)
                     
                  
                  
                     Negativan
                  
                  
                      
                  
                  
                     X
                  
               
                     Dvosmislen (28)
                     
                  
                  
                     Rafinirati (27)
                     
                  
                  
                     Negativan
                  
                  
                     Potvrditi (26)
                     
                  
                  
                     Negativan
                  
                  
                      
                  
                  
                     X
                  
               
                     Dvosmislen (28)
                     
                  
                  
                     Rafinirati (27)
                     
                  
                  
                     Negativan
                  
                  
                     Potvrditi (26)
                     
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                     X
                  
                  
                      
                  
               
                     Dvosmislen (28)
                     
                  
                  
                     Rafinirati (27)
                     
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                      
                  
                  
                      
                  
                  
                     X
                  
                  
                      
                  
               
                     Pozitivan
                  
                  
                     Rafinirati (27)
                     
                  
                  
                     Negativan
                  
                  
                     Potvrditi (26)
                     
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                     X
                  
                  
                      
                  
               
                     Negativan
                  
                  
                     Potvrditi (26)
                     
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                     Rafinirati (27)
                     
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                     X
                  
                  
                      
                  
               
                     Pozitivan
                  
                  
                     Rafinirati (27)
                     
                  
                  
                     Pozitivan
                  
                  
                     Zaustavljanje
                  
                  
                      
                  
                  
                     X
                  
                  
                      
                  
               
            Kontrola kvalitete ispitne pločice
         
         48.   Osim sukladnosti s kriterijima pločice za kontrolu kvalitete, treba ispuniti i ostale kriterije u pogledu kvalitete navedene u tablici 8. koji se odnose na prihvatljivu varijaciju između ponovljenih jažica, ponovljene pokuse, linearnost i osjetljivost sustava mjerenja hormona, varijabilnost između ponovljenih vrijednosti hormona istog uzorka te postotak obnavljanja hormonskih dodataka nakon ekstrakcije medija (prema potrebi; vidjeti stavak 30. o zahtjevima u pogledu ekstrakcije). Podaci bi se trebali kretati unutar prihvatljivih raspona utvrđenih za svaki parametar da bi se razmatrali za daljnju evaluaciju. Ako ti kriteriji nisu ispunjeni, u tabelarni prikaz treba unijeti da za predmetni uzorak nisu ispunjeni kriteriji za kontrolu kvalitete te uzorak treba ponovno analizirati ili izostaviti iz podataka.
         
            Tablica 8.
         
         
            Prihvatljivi rasponi i/ili varijacije (%) za parametre pločica testa H295R.
         
         LOQ: granica kvantifikacije sustava mjerenja hormona. CV: koeficijent varijacije; SC: kontrola otapala; DPM: dezintegracije po minuti
         
                      
                  
                  
                     Usporedba između
                  
                  
                     T
                  
                  
                     E2
                  
               
                     Osnovna proizvodnja hormona u kontrolama otapala
                  
                  
                     Omjer veći od granice kvantifikacije
                  
                  
                     ≥ 5-struko
                  
                  
                     ≥ 2,5-struko
                  
               
                     Pokusi izlaganja – unutar CV-a pločice za SC-ove (ponovljene jažice)
                  
                  
                     Apsolutne koncentracije
                  
                  
                     ≤ 30 %
                  
                  
                     ≤ 30 %
                  
               
                     Pokusi izlaganja – između CV-a pločice za SC-ove (ponovljeni pokusi)
                  
                  
                     Promjena omjera
                  
                  
                     ≤ 30 %
                  
                  
                     ≤ 30 %
                  
               
                     Sustav mjerenja hormona – osjetljivost
                  
                  
                     Vidljivo smanjenje omjera u odnosu na SC-ove
                  
                  
                     ≥ 5-struko
                  
                  
                     ≥ 2,5-struko
                  
               
                     Sustav mjerenja hormona – CV ponovljenog mjerenja za SC-ove (29)
                     
                  
                  
                     Apsolutne koncentracije
                  
                  
                     ≤ 25 %
                  
                  
                     ≤ 25 %
                  
               
                     Ekstrakcija medija – obnavljanje internog standarda 3H (prema potrebi)
                  
                  
                     DPM
                  
                  
                     ≥ 65 % nominalno
                  
               ANALIZA PODATAKA I IZVJEŠĆIVANJE
         
            Analiza podataka
         
         49.   Radi evaluacije relativnog povećanja/smanjenja kemijski izmijenjene proizvodnje hormona rezultate treba svesti na srednju vrijednost kontrole otapala svake ispitne pločice te ih izraziti kao promjene u odnosu na kontrolu otapala u svakoj ispitnoj pločici. Sve podatke treba izraziti kao srednje ± 1 standardno odstupanje.
         50.   U analizu podataka treba uključiti samo podatke o hormonima iz jažica u kojima je citotoksičnost bila manja od 20 %. Relativne promjene treba računati kako slijedi:
         Relativna promjena = (koncentracija hormona u svakoj jažici) ÷ (srednja koncentracija hormona u svim jažicama kontrole otapala).
         51.   Ako se vizualnim pregledom jažice utvrdi ili testom vitalnosti stanica/citotoksičnosti opisanim u stavku 42. dokaže povećanje broja stanica, to povećanje treba potvrditi. Ako se povećanje broja stanica potvrdi, to treba navesti u izvješću o ispitivanju.
         52.   Pretpostavke o normalnosti i homogenosti varijanci treba procijeniti prije provođenja statističkih analiza. Normalnost treba procijeniti s pomoću ploha standardne vjerojatnosti ili druge odgovarajuće statističke metode (npr. Shapiro-Wilkov test). Ako podaci (promjene omjera) nisu normalno distribuirani, treba pokušati transformaciju podataka radi približavanja normalnoj distribuciji. Ako su podaci normalno distribuirani ili blizu normalnoj distribuciji, razlike između skupina koncentracije kemikalije i kontrola otapala treba analizirati s pomoću parametrijskog testa (npr. Dunnettov test) pri čemu je koncentracija neovisna, a reakcija (promjena omjera) ovisna varijabla. Ako podaci nisu normalno distribuirani, treba upotrijebiti neparametarski test (npr. Kruskal-Wallisov test, Steelov Many-one rank test). Razlike se smatraju bitnima pri p ≤ 0,05. Statističke procjene daju se na temelju prosječnih vrijednosti za svaku jažicu koja predstavlja neovisne ponovljene točke podataka. Očekuje se da zbog velikog razmaka između doza u prvom pokusu (skala log10) u brojnim slučajevima neće biti moguće opisati jasne odnose između koncentracije i doze kad se dvije najviše doze nalaze na linearnom dijelu sigmoidne krivulje. Zato će se za prvi pokus i sve ostale komplete podataka u takvom slučaju (npr. kad nije moguće procijeniti maksimalnu efikasnost) primijeniti gore opisana statistika fiksne varijable vrste I.
         53.   Ako se više od dvije točke podataka nalaze na linearnom dijelu krivulje i ako se maksimalne efikasnosti mogu izračunati, kao što se predviđa za neke od drugih sljedova koji se provode prema polulogaritamskom razmaku koncentracija izlaganja, za izračun efikasnih koncentracija (npr. EC50 i EC20) treba upotrebljavati probit, logit ili drugi odgovarajući model regresije.
         54.   Rezultate treba navesti u grafičkom (grafikoni sa stupcima koji predstavljaju standardno odstupanje ± 1) i tabličnom (LOEC/NOEC, smjer učinka i jačina najveće reakcije koja je dio podataka o dozi-reakciji) obliku (vidjeti sliku 3. za primjer). Procjena podataka smatra se valjanom samo ako se temeljila na najmanje dvama neovisno provedenim pokusima. Pokus ili neovisni pokus smatra se neovisnim ako je proveden drugog datuma i upotrebom novog kompleta otopina i kontrola. Raspon koncentracija u drugom i trećem pokusu moguće je prilagoditi na temelju rezultata iz prvog pokusa radi boljeg definiranja raspona doza reakcija koji sadržava LOEC (vidjeti stavak 47.).
         
            Slika 3.
         
         
            Primjer prezentacije i evaluacije podataka dobivenih tijekom provođenja testa H295R u grafičkom i tabličnom obliku.
         
         (Zvjezdice se odnose na statistički značajne razlike od kontrole otapala (p < 0,05). LOEC: najniža koncentracija s vidljivim učinkom; najveća promjena: najveća jačina uočene reakcije pri bilo kojoj koncentraciji u odnosu na prosječnu reakciju kontrole otapala (= 1).)
         
                     Kemikalija
                  
                  
                     LOEC
                  
                  
                     Najveća promjena
                  
               
                     Forskolin
                  
                  
                     0,01
                  
                  
                     0,15-struko
                  
               
                     Letrozol
                  
                  
                     0,001
                  
                  
                     29-struko
                  
               
            Postupak za tumačenje podataka
         
         55.   Ispitivana kemikalija smatra se pozitivnom ako je indukcija omjera statistički različita (p ≤ 0,05) od kontrole otapala pri dvije susjedne koncentracije u najmanje dvama neovisnim pokusima (tablica 7.). Ispitivana kemikalija smatra se negativnom nakon dvaju neovisnih negativnih pokusa ili ako su od tri pokusa dva negativna i jedan dvosmislen ili pozitivan. Ako podaci dobiveni trima neovisnim pokusima nisu u skladu s kriterijima za odlučivanje iz tablice 7., rezultati pokusa ne mogu se tumačiti. Rezultate pri koncentracijama koje premašuju granice topljivosti ili pri citotoksičnim koncentracijama ne treba uključiti u tumačenje rezultata.
         
            Izvješće o ispitivanju
         
         56.   Izvješće o ispitivanju treba sadržavati sljedeće informacije:
         
            Ustanova u kojoj se obavlja ispitivanje
         
         
                     —
                  
                  
                     naziv i lokacija ustanove,
                  
               
                     —
                  
                  
                     voditelj studije i ostalo osoblje i njihovi zadaci,
                  
               
                     —
                  
                  
                     datumi početka i završetka studije.
                  
               
            Ispitivana kemikalija, reagensi i kontrole
         
         
                     —
                  
                  
                     identitet (naziv/br. CAS prema potrebi), podrijetlo, broj lota/serije, čistoća, dobavljač i karakterizacija ispitivane kemikalije, reagensa i kontrola,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fizikalno stanje i relevantna fizikalno-kemijska svojstva ispitivane kemikalije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     uvjeti skladištenja i metoda i učestalost pripreme ispitivanih kemikalija, reagensa i kontrola,
                  
               
                     —
                  
                  
                     stabilnost ispitivane kemikalije.
                  
               
            Stanice
         
         
                     —
                  
                  
                     podrijetlo i vrsta stanica,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj prolaza (identifikator prolaza stanica) stanica upotrijebljenih u ispitivanju,
                  
               
                     —
                  
                  
                     opis postupaka za održavanje staničnih kultura.
                  
               
            Zahtjevi prije ispitivanja (prema potrebi)
         
         
                     —
                  
                  
                     opis i rezultati ispitivanja interferencije metodom kemijskih hormona
                  
               
                     —
                  
                  
                     opis i rezultati mjerenja efikasnosti ekstrakcije hormona,
                  
               
                     —
                  
                  
                     standardne i kalibracijske krivulje za sve analitičke testove koje treba provesti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     granice otkrivanja za odabrane analitičke testove.
                  
               
            Ispitni uvjeti
         
         
                     —
                  
                  
                     sastav medija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     koncentracija ispitivane tvari,
                  
               
                     —
                  
                  
                     gustoća stanica (procijenjene ili izmjerene koncentracije stanica nakon 24 sata i 48 sati)
                  
               
                     —
                  
                  
                     topljivost ispitivane kemikalije (granica topljivosti, ako je utvrđena),
                  
               
                     —
                  
                  
                     vrijeme i uvjeti inkubacije.
                  
               
            Rezultati ispitivanja
         
         
                     —
                  
                  
                     sirovi podaci za svaku jažicu za kontrole i ispitivane kemikalije – svaka ponovljena vrijednost u obliku izvornih podataka instrumenta upotrijebljenog za mjerenje proizvodnje hormona (npr. OD, jedinice fluoroscencije, DPM itd.),
                  
               
                     —
                  
                  
                     validacija normalnosti ili objašnjenje transformacije podataka,
                  
               
                     —
                  
                  
                     srednje reakcije standardnog odstupanja ± 1 za svaku izmjerenu jažicu,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o citotoksičnosti (ispitne koncentracije koje su uzrokovale citotoksičnost),
                  
               
                     —
                  
                  
                     potvrda sukladnost sa zahtjevima za kontrolu kvalitete,
                  
               
                     —
                  
                  
                     relativna promjena u usporedbi s kontrolom otapala ispravljenom zbog citotoksičnosti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     grafikon sa stupcima kojim se prikazuje relativni (promjena omjera) značaj pri svakoj koncentraciji i statistički značaj kako je navedeno u stavcima 49. do 54.
                  
               
            Tumačenje podataka
         
         
                     —
                  
                  
                     primijeni postupak za tumačenje podataka na rezultate i provedi raspravu o nalazima.
                  
               
            Rasprava
         
         
                     —
                  
                  
                     postoje li ikakve naznake iz studije o mogućnosti da na podatke o hormonima T/E2 mogu utjecati neizravni učinci na putove glukokortikoida i mineralnih kortikoida?
                  
               
            Zaključci
         
         
            LITERATURA
         
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     OECD (2002.), OECD-ov konceptualni okvir za ispitivanje i procjenu endokrino disruptivnih kemikalija, Dodatak 2. poglavlju B.54. ovog Priloga.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, R. and Giesy, J.P. (2006.), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114. – 124.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007.), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. Env. Sci. Pollut. Res., 14., 23. – 30.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     OECD (2010.), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MONO(2010)31, Pariz. Dostupno na [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html].
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     OECD (2010.), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/JM/MONO(2010)32, Pariz. Dostupno na: [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html].
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Battelle (2005.), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, dostupno na: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05.pdf]
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004.), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroidogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. Sci., 81., 78. – 89.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. (2002.), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182., 44. – 54.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. (2010.), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model development for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118.: 265. – 272.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010.), Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137. – 1148.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990.), Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid biosynthesis, Cancer Res., 50., 5488. – 5496.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010.), Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line, Chemosphere, 80:578. – 584.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005.), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, Environ. Sci. Technol., 39:2777. – 2785.
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010.), Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. Res., 17:1137. – 1148.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993.), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. Endocrinol. Metab., 77., 731. – 737.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Poglavlje B55. ovog Priloga: Hershbergerov biotest na glodavcima: Kratkoročni test probira na (anti)androgenska obilježja.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Shapiro, R., and Page, L.B. (1976.), Interference by 2,3-dimercapto-1-propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2., 222. – 231.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Mosmann, T. (1983.), Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65., 55. – 63.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999.). Biochemical differences between rat and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species, Biochemistry. 38:1598. – 1606.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006.), Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484– 492.
                  
               
            Dodatak
            DEFINICIJE:
            
                         
                     
                     
                        Konfluentnost se odnosi na pokrivenost ili širenje stanica preko medija kulture ili kroz njega.
                     
                  
                         
                     
                     
                        Kemikalija je tvar ili smjesa.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           CV (coefficient of variation) se odnosi na koeficijent varijacije te se definira kao omjer standardnog odstupanja distribucije od njezine aritmetičke sredine.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           CYP je kratica za citokrom P450 monooksigenazu, obitelj gena i od njih proizvedenih enzima koji sudjeluju u katalizaciji brojnih različitih biokemijskih reakcija, uključujući sintezu i metabolizam steroidnih hormona.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           DPM je dezintegracija po minuti. To je broj atoma u određenoj količini radioaktivnog materijala koji se dezintegriraju u jednoj minuti.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           E2 je 17β-estradiol, najvažniji estrogen u sustavima sisavaca.
                     
                  
                         
                     
                     
                        Stanice H295R stanice su humanog adrenokarcinoma koje se odlikuju fiziološkim karakteristikama zonalno nediferenciranih humanih fetalnih adrenalnih stanica i koje izražavaju sve enzime puta steroidogeneze. One se mogu nabaviti od ATCC-a.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Medij za zamrzavanje upotrebljava se za zamrzavanje i čuvanje smrznutih stanica. On se sastoji od radnog medija s dodatkom nuseruma BD i dimetil sulfoksida.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Linearni raspon je raspon unutar standardne krivulje za sustav mjerenja hormona u kojem su rezultati proporcionalni koncentraciji analita koji se nalazi u uzorku.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           LOQ (limit of quantification) kratica je za granicu kvantifikacije i odnosi se na najnižu količinu kemikalije koju je moguće razlikovati od izostanke te kemikalije (prazna vrijednost) unutar navedene granice pouzdanosti. Za potrebe ove metode granicu kvantifikacije u pravilu definira proizvođač sustava ispitivanja, ako nije drukčije određeno.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           LOEC (lowest observed effect concentration) je najniža koncentracija s vidljivim učinkom, odnosno najniža koncentracija pri kojoj je testna reakcija statistički različita od reakcije kontrole otapala.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           NOEC (no observed effect concentration) najviša je koncentracija bez vidljivog učinka, odnosno najviša koncentracija koja se ispituje ako se testom ne izazove pozitivna reakcija.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Prolaz je broj kojim se označava količina dijeljenja stanica nakon započinjanja kulture iz zamrznute zalihe. Prvom prolazu koji je započet iz zamrznute zalihe dodjeljuje se broj jedan (1). Stanice koje su se podijelile jednom označavaju se oznakom prolaz 2 itd.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           PBS je Dulbeccova fiziološka otopina s fosfatnim pulferom.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Kontrola kvalitete odnosi se na vrijednosti nužne za osiguranje valjanih podataka.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Pločica za kontrolu kvalitete jest pločica s 24 jažice i dvije koncentracije pozitivnih i negativnih kontrola za praćenje učinka nove serije stanica ili za osiguranje pozitivnih kontrola za test pri ispitivanju kemikalija.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Pokus je neovisni pokus koji karakterizira novi komplet otopina i kontrola.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Osnovni medij jest osnova za pripremu ostalih reagensa. On se sastoji od smjese 1:1 Dulbeccova modificiranog Eagleova medija i Hamove F-12 hranjive mješavine (DMEM/F12) u 15 mM HEPES pufera bez fenol crvene ili natrijeva bikarbonata. Natrijev bikarbonat dodaje se kao pufer, vidjeti Dodatak II. izvješću o validaciji (4).
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Dopunjeni medij sastoji se od radnog medija s dodatkom nuseruma BD i ITS+ premium mješavine, vidjeti Dodatak II. izvješću o validaciji (4).
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Steroidogeneza je put sinteze koji vodi od kolesterola do raznih steroidnih hormona. Nekoliko hormona posrednika na putu sinteze steroida, poput progesterona i testosterona, važni su hormoni sami po sebi, ali služe i kao prekursori hormonima u nastavku puta sinteze.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           T se odnosi na testosteron, jedan od dvaju najvažnijih androgena u sustavima sisavaca.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Ispitivana kemikalija je bilo koja tvar ili smjesa koja se ispituje ovom ispitnom metodom.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Ispitna pločica jest pločica na kojoj se stanice H295R izlažu ispitivanoj kemikaliji. Ona sadržava kontrolu otapala i ispitivana kemikalija pri sedam razina koncentracija u tri primjerka.
                     
                  
                         
                     
                     
                        
                           Tripsin 1X razrijeđena je otopina enzima tripsina, serin proteaze gušterače, koji se upotrebljava za skidanje stanica s pločice za kultivaciju stanica, vidjeti Dodatak III. izvješću o validaciji (4).
                     
                  
         B.58.   TRANSGENSKE ANALIZE MUTACIJE GENA SOMATSKIH I SPOLNIH STANICA GLODAVACA
         
         UVOD
         1.   Ova ispitna metoda istovjetna je Smjernici za ispitivanje OECD-a TG 488 (2013.). Ispitne metode EU-a dostupe su za široki raspon in vitro analiza mutacije kojima se mogu otkriti kromosomske i/ili genske mutacije. Postoje ispitne metode za in vivo granične vrijednosti (tj. kromosomske aberacije i neplanirane sinteze DNK-a); međutim, njima se ne mogu mjeriti genske mutacije. Transgenske analize mutacije u glodavaca zadovoljavaju potrebu za praktičnima i široko dostupnima in vivo ispitivanjima mutacija gena.
         2.   Transgenske analize mutacije u glodavaca temeljito su analizirane (24) (33). Obuhvaćaju transgenske štakore i miševe koji imaju više primjeraka kromosomski integriranih prijenosnih vektora plazmida ili faga. Transgeni sadržavaju gene koji daju informacije potrebne za utvrđivanje različitih vrsta mutacija izazvanih in vivo ispitnim kemikalijama.
         3.   Mutacije koje se pojave u glodavca bilježe se regeneriranjem transgena i analizom fenotipa gena koji daje informaciju u bakterijskom domaćinu kojem nedostaje gen koji daje informaciju. Transgenskim analizama mutacije gena u glodavaca mjere se mutacije izazvane u genetski neutralnim genima regeneriranima iz gotovo bilo kojeg tkiva glodavca. Tim se analizama stoga izbjegava mnogo postojećih ograničenja koja se vezuju uz istraživanje in vivo genetskih mutacija endogenih gena (tj. ograničena količina tkiva pogodnog za analizu, negativna/pozitivna selekcija prema mutacijama).
         4.   Dokazna snaga ukazuje na to da transgeni reagiraju na mutagene na sličan način kao endogeni geni, posebno u pogledu otkrivanja supstitucija, pomaka okvira mutacija i manjih brisanja i unošenja baznih parova (24).
         5.   Međunarodnim radionicama o ispitivanju genotoksičnosti (IWGT) podržalo se uključivanje transgenskih analiza mutacije gena za in vivo otkrivanje genskih mutacija i preporučuje se protokol za njihovu primjenu (15) (29). Ova se ispitna metoda temelji na tim preporukama. Daljnja analiza na osnovu koje se podržava korištenje ovog protokola može se pronaći u (16).
         6.   Očekuje se da će u budućnosti biti moguće spojiti transgensku analizu mutacije gena s istraživanjem toksičnosti nakon ponovljene doze (poglavlje B.7. ovog Priloga). Međutim, potrebni su podaci da bi se osiguralo da na osjetljivost transgenske analize mutacije gena ne utječe kraće razdoblje od jednog dana između kraja razdoblja primjene i razdoblja uzimanja uzoraka, kako se upotrebljava u istraživanju o toksikologiji ponavljanih doza, u usporedbi s tri dana koji se upotrebljavaju u transgenskim analizama mutacije gena. Potrebni su i podaci koji dokazuju da na rezultate analize ponavljanih doza negativno ne utječe korištenje transgenskih sojeva glodavaca umjesto tradicionalnih sojeva glodavaca. Kada su ti podaci dostupni, ova se ispitna metoda ažurira.
         7.   Definicije ključnih pojmova nalaze se u Dodatku.
         UVODNA RAZMATRANJA
         8.   Transgenske analize mutacija gena u glodavaca za koje su dostupni odgovarajući podaci koji potkrepljuju njihovu upotrebu u ovoj ispitnoj metodi su: lacZ bakteriofag miša (MutaäMouse); lacZ plazmid miša; gpt delta (gpt i Spi –) miša i štakora; lacI miša i štakora (Big Blue®), kako se provode u standardnim uvjetima. K tome, cII analiza pozitivne selekcije može se upotrebljavati za procjenu mutacija u modelima za miševe Big Blue® i Muta™Mouse. Mutagenost u transgenskim analizama mutacije gena u glodavaca obično se procjenjuje kao učestalost mutacije; međutim, ako je potrebno, molekularnom analizom mutacija mogu se pribaviti dodatni podaci (vidjeti stavak 24.).
         9.   Ovakva in vivo ispitivanja genskih mutacija na glodavcima posebno su relevantna za ocjenjivanje opasnosti od pojave mutagenosti zato što omogućuju sagledavanje faktora in vivo metabolizma, farmakokinetku i procese popravka DNK-a i translezijske sinteze DNK-a, iako oni mogu varirati kod različitih životinjskih vrsta, različitih tkiva, kao i kod različitih vrsta oštećenja DNK-a. Analiza in vivo isto je tako korisna za daljnja istraživanja mutagenih učinaka otkrivenih s pomoću određenog sustava in vitro, i za praćenje rezultata ispitivanja s pomoću drugih in vivo graničnih vrijednosti. Osim toga što se neobvezno povezuje s pojavom raka, mutacija gena bitna je krajnja točka za predviđanje nekancerogenih bolesti temeljenih na mutacijama u somatskim tkivima (12) (13), kao i bolesti koje se prenose zametnom lozom.
         10.   Ako postoje dokazi da ispitivana tvar ili odgovarajući metabolit neće stići ni do jednog ciljnog tkiva, nije primjereno primjenjivati transgenske analize mutacije gena u glodavaca.
         NAČELO ISPITNE METODE
         11.   U analizama opisanima u stavku 8. ciljni je gen bakterijskog ili bakteriofagnog podrijetla, a regeneracija iz genomskog DNK-a glodavca postiže se ugrađivanjem transgena u λ bakteriofagni ili plazmidni prijenosni vektor. Postupak uključuje ekstrakciju genomskog DNK-a iz ciljnog tkiva glodavca, in vitro obradu genomskog DNK-a (tj. pakiranje λ vektora, ili ligaciju i elektroporaciju plazmida za regeneraciju prijenosnog vektora), i naknadno utvrđivanje mutacija u bakterijskim domaćinima u odgovarajućim uvjetima. U analizama se upotrebljavaju neutralni transgeni koji se mogu brzo regenerirati iz većine tkiva.
         12.   Osnovni pokus transgenske analize mutacije gena u glodavaca uključuje tretiranje glodavca određenom kemikalijom tijekom određenog vremenskog razdoblja. Kemikalije se mogu primjenjivati odgovarajuće, uključujući implantaciju (tj. ispitivanje medicinskim napravama). Ukupno razdoblje tijekom kojeg se doza primjenjuje na životinju naziva se razdobljem primjene. Nakon razdoblja primjene slijedi vremensko razdoblje, prije žrtvovanja, tijekom kojeg se kemikalija ne primjenjuje i tijekom kojeg se nepopravljene lezije DNK-a pričvršćuju na stabilne mutacije. U literaturi se to razdoblje različito naziva kao razdoblje tijekom kojeg dolazi do manifestacija, razdoblje fiksiranja ili razdoblje izražavanja; kraj tog razdoblja vrijeme je uzimanja uzoraka (15) (29). Nakon žrtvovanja životinje genomski se DNK izolira iz određenog predmetnog tkiva (ili više tkiva) te pročišćava.
         13.   Podaci u vezi s jednom određenom vrstom životinje iz različitih pakiranja/ligacija obično se agregiraju i učestalost mutacije općenito se procjenjuje upotrebom ukupnog broja između 105 i 107 jedinica koje stvaraju plakove ili jedinica koje stvaraju koloniju. Kod upotrebe pozitivnih metoda selekcije ukupni broj jedinica koje stvaraju plakove utvrđuje se s pomoću odvojenih neselektivnih ploča.
         14.   Metode pozitivne selekcije razvijene su za olakšavanje otkrivanja mutacija u genu gpt (delta gpt miša i štakora, fenotip gpt– (20) (22) (28)) i gena lacZ (Muta™Mouse ili lacZ kod plazmidnog miša (3) (10) (11) (30)); dok se mutacije gena lacI u životinjama Big Blue® otkrivaju neselektivnom metodom kojom se utvrđuju mutanti stvaranjem obojenih (plavih) plakova. Metodologija pozitivne selekcije primjenjuje se i da bi se otkrile točkaste mutacije koje nastaju u genu cII u λ bakteriofagnom prijenosnom vektoru (Big Blue® miš ili štakor i Muta™Mouse (17)) i brisanje mutacija u λ crvenim i gama genima (Spi – selekcija u gpt delta mišu i štakoru (21) (22) (28)). Učestalost mutacije izračunava se diobom broja plakova/plazmida koji sadržavaju mutacije u transgenu, ukupnim brojem plakova/plazmida regeneriranih iz istog uzorka DNK-a. Kod istraživanja transgenskih analiza mutacija gena u glodavaca učestalost mutacije jest parametar izvješćivanja. K tome, učestalost mutacije može se odrediti kao udio stanica koje nose neovisne mutacije; ovaj izračun zahtijeva korekcije u vezi s klonalnim širenjem, sekvenciranjem regeneriranih mutanata (24).
         15.   Mutacije zabilježene u analizama točkastih mutacija lacI, lacZ, cII i gpt sastoje se primarno od zamijenjenih mutacija baznih parova, pomaka okvira mutacija i manjih unošenja/brisanja. Relativni omjer tih vrsta mutacija kod spontanih mutacija sličan je onome koji je utvrđen kod endogenog gena Hprt. Velika brisanja utvrđena su samo kod selekcije Spi – i analiza plazmida lacZ (24). Mutacije koje su zanimljive in vivo su mutacije koje se pojavljuju u miša i štakora. In vitro i ex vivo mutacije koje se mogu pojaviti tijekom regeneriranja faga/plazmida, repliciranja ili popravka, razmjerno su rijetke i mogu se posebno identificirati u nekim sustavima ili izuzeti pozitivnim selekcijskim sustavom bakterijskog domaćina.
         OPIS METODE
         
            Priprema
         
         
            Odabir životinjskih vrsta
         
         16.   Trenutačno je dostupno više modela utvrđivanja transgenskih mutacija gena miša i ti su sustavi upotrijebljeni puno više od transgenskih modela za štakore. Ako je štakor očigledno primjereniji model od miša (tj. kod istraživanja mehanizama kancerogeneze tumora primijećenog isključivo u štakora, za usporedbu s istraživanjem toksičnosti štakora ili za slučajeve kada je metabolizam štakora dokazano usporediviji s ljudskim metabolizmom) treba razmotriti upotrebu transgenskih modela štakora.
         
            Uvjeti smještaja i hranjenja
         
         17.   Temperatura u prostoriji u kojoj se drže pokusne životinje trebala bi biti 22 °C (± 3 °C). Iako bi relativna vlaga trebala biti najmanje 30 %, a poželjno je da ne prijeđe 70 % osim tijekom čišćenja prostorije, cilj bi trebao biti 50 – 60 %. Svjetlost bi trebala biti umjetna, s tim da je redoslijed 12 sati svjetla, 12 sati tame. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana s neograničenom količinom vode za piće. Na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovarajuća mješavina ispitivane kemikalije ako se ona daje u hrani. Životinje treba držati u manjim skupinama (ne više od pet jedinki) istog spola ako se ne očekuje agresivno ponašanje. Ako je to znanstveno opravdano, životinje se mogu držati u zasebnim nastambama.
         
            Priprema životinja
         
         18.   Zdrave mlade seksualno zrele odrasle životinje (starosti 8 – 12 tjedana na početku tretmana) biraju se nasumce i raspodjeljuju u kontrolne skupine i skupine koje će se tretirati. Životinje se označuju jedinstvenim oznakama. Životinje se najmanje pet dana prilagođavaju laboratorijskim uvjetima. Kaveze treba urediti tako da se eventualni učinci držanja u kavezu svedu na minimum. Na početku studije variranje tjelesne mase životinja treba biti što manje i ne smije prelaziti ± 20 % od odgovarajuće srednje vrijednosti mase svakog spola.
         
            Priprema doza
         
         19.   Prije no što se doza daje životinjama, krute ispitivane tvari po potrebi treba otopiti ili suspendirati u odgovarajućim otapalima ili nosačima i razrijediti. Tekuće ispitivane tvari mogu se dozirati izravno ili razrijediti prije doziranja. Za potrebe inhaliranja, kemikalije koje se upotrebljavaju kod ispitivanja mogu se primijeniti u obliku plina, pare ili krutog/tekućeg aerosola, ovisno o njihovim fizičko-kemijskim svojstvima. Ako prema podacima o stabilnosti skladištenje nije prihvatljivo, pripravke ispitivane tvari treba koristiti svježe.
         
            Uvjeti ispitivanja
         
         
            Otapalo/nosač
         
         20.   Pri visinama doza koje se upotrebljavaju, otapalo/nosač ne smije imati toksične učinke i ne smije postojati sumnja da bi mogao kemijski reagirati s ispitivanim tvarima. Ako se upotrebljavaju otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje treba potkrijepiti referentnim podacima koji pokazuju njihovu sukladnost. Kad god je to moguće preporučuje se najprije razmotriti mogućnost primjene vodenog otapala/nosača.
         
            Pozitivna kontrola
         
         21.   Obično treba upotrebljavati paralelne pozitivne kontrolne životinje. Međutim, za laboratorije koji su dokazali tu sposobnost (vidjeti stavak 23.) i rutinski koriste te analize, DNK-ovi iz prethodnih pozitivnih kontrola tretiranih životinja mogu se uključiti sa svakim istraživanjem da bi se potvrdila uspješnost metode. Takav DNK iz prethodnih eksperimenata trebao bi se dobiti iz iste predmetne vrste i tkiva te bi se trebala primjereno pohraniti (vidjeti stavak 36.). Kod primjene paralelnih pozitivnih kontrola nije neophodno primjenjivati ih istim putem kao i kemikaliju koja se upotrebljava za ispitivanje; međutim, pozitivne kontrole trebale bi sa sigurnošću poticati mutacije u jednoj ili više vrsta tkiva na koje se odnosi ta kemikalija. Doze kemikalija pozitivne kontrole trebale bi se odabrati tako da proizvode slabe ili umjerene učinke kojima se kritički procjenjuju rezultati i osjetljivost analize. Primjeri kemikalija pozitivne kontrole i nekih njihovih ciljnih tkiva uključeni su u tablici 1.
         
            Tablica 1.
         
         
            Primjeri kemikalija pozitivne kontrole i nekih njihovih ciljnih tkiva
         
         
                     Kemikalije pozitivne kontrole i br. CAS
                  
                  
                     EINECS naziv i EINECS br.
                  
                  
                     Karakteristike
                  
                  
                     Ciljno tkivo mutacije
                  
               
                     Štakor
                  
                  
                     Miš
                  
               
                     N-etil-N-nitrozourea
                     (CAS br. 759-73-9)
                  
                  
                     N-etil-N-nitrozourea
                     (212 -072 -2)
                  
                  
                     Spoj direktnog djelovanja
                  
                  
                     Jetra, pluća
                  
                  
                     Koštana srž, debelo crijevo, crijevni epitel, crijeva, jetra, pluća, slezena, bubreg, jajne granulozne stanice, zametne stanice mužjaka
                  
               
                     etil-karbamat (uretan)
                     (CAS br. 51-79-6)
                  
                  
                     Uretan
                     (200 -123 -1)
                  
                  
                     Mutagen, treba metabolizam, no proizvodi samo slabe učinke
                  
                  
                      
                  
                  
                     Koštana srž, potrbušnica, tanko crijevo, jetra, pluća, slezena
                  
               
                     2,4 Diaminotoluen
                     (CAS br. 95-80-7)
                  
                  
                     4-metil-m-fenilendiamin
                     (202 -453 -1)
                  
                  
                     Mutagen, treba metabolizam, isto tako pozitivan u analizi Spi-
                  
                  
                     Jetra
                  
                  
                     Jetra
                  
               
                     Benzo[e]piren
                     (CAS br. 50-32-8)
                  
                  
                     benzo[def]krizen
                     (200 -028 -5)
                  
                  
                     Mutagen, treba metabolizam
                  
                  
                     Jetra, trbušna maramica,
                  
                  
                     Koštana srž, dojka, debelo crijevo, potrbušnica, žljezdani želudac, srce, jetra, pluća, zametne stanice mužjaka
                  
               
            Negativne kontrole
         
         22.   Negativne kontrole, koje se tretiraju samo otapalom ili nosačem i koje su osim toga tretirane na jednak način kao i skupine koje se tretiraju, trebale bi biti uključene u svako uzorkovanje. U nedostatku povijesnih ili objavljenih kontrolnih podataka kojima se dokazuje da odabrano otapalo ili nosač nema štetne i mutagenske učinke, netretirane kontrolne skupine isto bi tako trebale biti uključene u svakom uzimanju uzoraka da bi se utvrdila prihvatljivost kontrole nosača.
         
            Provjera osposobljenosti laboratorija
         
         23.   Sposobnost primjene ovih analiza trebala bi se utvrditi dokazivanjem sposobnosti stvaranja očekivanih rezultata na temelju objavljenih podataka (24) za: 1) učestalosti pojave mutanata s kemikalijama pozitivne kontrole (uključujući one sa slabim učincima) kao što su one navedene u tablici 1., ne-mutagenima, i kontrolama nosača; i 2) regeneriranjem transgena iz genomskog DNK-a (tj. učinkovitost pakiranja).
         
            Sekvenciranje mutanata
         
         24.   Za regulatorne primjene sekvenciranje DNK-a mutanata nije neophodno, osobito kada se dobije jasan pozitivan ili negativan rezultat. Međutim, podaci o sekvenciranju mogu biti korisni kada se primijete velike varijacije između pojedinih jedinki. U tim se slučajevima sekvenciranje može upotrebljavati da bi se isključila mogućnost jackpota ili klonalnih manifestacija, identifikacijom omjera jedinstvenih mutanata iz određenog tkiva. Sekvenciranje otprilike 10 mutanata po tkivu po životinji trebalo bi biti dostatno za jednostavno utvrđivanje doprinose li klonalni mutanti učestalosti mutanata; moguće je potrebno sekvenciranje i do 25 mutanata da bi se matematički ispravila učestalost mutanta u pogledu klonaliteta. Sekvenciranje mutanata može se razmatrati i kada se utvrde mala povećanja učestalosti mutanata (tj. povećanja koja prelaze neobrađene kontrolne vrijednosti). Razlike u spektru mutanta između kolonija mutanata u pogledu tretiranih i netretiranih životinja može potaknuti mutagenski učinak (29). Isto tako, spektri mutacija mogu biti korisni za razvoj pretpostavki o mehanizmima. Kada se sekvenciranje uključuje kao dio protokola istraživanja, treba pridati posebnu pažnju osmišljavanju takvih istraživanja, posebno s obzirom na broj mutanata sekvenciranih po uzorku, da bi se ostvarila odgovarajuća pouzdanost u skladu s korištenim statističkim modelom (vidjeti stavak 43.).
         POSTUPAK
         
            Broj i spol životinja
         
         25.   Broj životinja po skupini trebao bi se odrediti unaprijed, da bi se na odgovarajući način osigurala statistička valjanost neophodna za utvrđivanje barem dvostruke učestalosti mutanata. Skupine se prema veličini sastoje od najmanje pet životinja; međutim, ako je statistička valjanost nedovoljna, broj životinja trebao bi se prema potrebi povećati. Obično bi se trebali upotrebljavati mužjaci životinja. Može biti slučajeva kada je opravdano ispitivanje i samo na ženkama; na primjer kod ispitivanja lijekova specifičnih za žene ili kod istraživanja ženskog metabolizma. Ako postoje značajne razlike između spolova u pogledu toksičnosti ili metabolizma, tada su potrebni i mužjaci i ženke.
         
            Razdoblje primjene
         
         26.   Na temelju opažanja prema kojima se mutacije akumuliraju sa svakim tretmanom, potreban je režim ponovljenih doza, uz dnevne tretmane tijekom 28 dana. Takva se primjena smatra prihvatljivom za stvaranje odgovarajuće akumulacije mutacije slabih mutagena i za osiguravanje odgovarajućeg razdoblja izloženosti primjerenog za utvrđivanje mutacija u organima koji se sporo razmnožavaju. Alternativni postupci tretiranja mogu biti odgovarajući za neke procjene i ti alternativni rasporedi doziranja trebali bi biti znanstveno opravdani u protokolu. Tretmani ne bi trebali biti kraći od vremenskog razdoblja koje je potrebno za potpuno uvođenje svih odgovarajućih enzimskih sustava koji sudjeluju u metabolizmu i kraći bi tretmani mogli zahtijevati upotrebu većeg broja uzimanja uzoraka što je odgovarajuće za organe s različitim stopama razmnožavanja. U svakom slučaju, svi dostupni podaci (tj. o općenitoj toksičnosti ili metabolizmu i farmakokinetici) trebali bi se koristiti kod opravdavanja protokola, posebno kada je prisutno odstupanje od prethodno navedenih standardnih preporuka. Iako mogu povećati osjetljivost, razdoblja tretiranja dulja od 8 tjedana treba dodatno pojasniti i opravdati jer dugačka razdoblja tretiranja mogu proizvesti očito povećanje učestalosti mutanata klonalnim širenjem (29).
         
            Visine doza
         
         27.   Visine doza trebale bi se temeljiti na rezultatima istraživanja o utvrđivanju raspona doze kojom se mjeri opća toksičnost koja je provedena istim načinom izlaganja ili na rezultatima istraživanja već prisutne subakutne toksičnosti. Za određivanje raspona doza mogu se upotrebljavati ne-transgenske životinje istog soja glodavaca. U glavnom ispitivanju, da bi se dobili podaci o odgovoru na dozu, cjelokupno istraživanje trebalo bi obuhvatiti negativnu kontrolnu skupinu (vidjeti stavak 22.) i najmanje tri odgovarajuće raspoređene razine doza, osim kada se upotrebljava granična razina doze (vidjeti stavak 28.). Najviša doza trebala bi biti maksimalna tolerirana doza (MTD). MTD se definira kao doza koja uzrokuje takve znakove toksičnosti da je za očekivati da bi više doze pri istom režimu doziranja prouzročile smrt. Kemikalije s posebnim biološkim aktivnostima u ne-toksičnim dozama (kao što su hormoni i mitogeni) i kemikalije koje pokazuju zasićenost toksikokinetičkih svojstava mogu se izuzeti iz kriterija u pogledu određivanja doza i trebale bi se procjenjivati od slučaja do slučaja. Te bi doze trebale obuhvatiti raspon od maksimalne do male ili nikakve toksičnosti.
         
            Granično ispitivanje
         
         28.   Ako eksperimenti s ciljem određivanja raspona doze ili postojeći podaci iz vezanih sojeva glodavaca pokazuju da tretman barem graničnom dozom (vidjeti tekst u nastavku) ne uzrokuje primjetljive toksične učinke i ako se na temelju podataka o strukturno srodnim kemikalijama ne očekuje genotoksičnost, potpuna studija uz primjenu tri razine doza ne smatra se potrebnom. Za razdoblje primjene od 28 dana (tj. 28 dnevnih primjena) granična doza je 1 000 mg/kg tjelesne mase/dnevno. Za razdoblja primjene od 14 dana ili manje, granična doza je 2 000 mg/kg tjelesne mase/dnevno (rasporedi doziranja koji se razlikuju od 28 dnevnih tretmana trebali bi se znanstveno opravdati u protokolu; vidjeti stavak 26.).
         
            Primjena doza
         
         29.   Ispitivana se tvar obično primjenjuje unošenjem s pomoću želučane sonde ili odgovarajuće intubacijske kanile. Općenito, očekivani put ljudske izloženosti trebao bi se uzeti u obzir kod osmišljavanja analiza. Stoga drugi putovi izlaganja (kao što su pitka voda, potkožno, intravenozno, lokalno, inhalacije, primjenom u dušnik, unosom hrane ili implantacijom) mogu biti prihvatljivi kada se mogu opravdati. Intraperitonealna injekcija se ne preporučuje jer nije fiziološki odgovarajući put ljudske izloženosti. Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti sondom ili injekcijom ovisi o veličini pokusne životinje. Taj volumen ne smije prijeći 2 ml/100 g tjelesne mase. Opravdanost primjene većih volumena od navedenog treba dokazati. Osim kod nadražujućih i nagrizajućih tvari, za koje je normalno da u većim koncentracijama izazivaju intenzivnije učinke, variranje ispitnih volumena treba podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod svih visina doze osigurao stalni volumen.
         
            Vrijeme uzorkovanja
         
         
            Somatske stanice
         
         30.   Vrijeme uzimanja uzoraka kritična je varijabla jer je određuje razdoblje potrebno za postojanost mutacija. To razdoblje ovisi o pojedinom tkivu i čini se da je vezano uz vrijeme obrta stanične populacije, pri čemu koštana srž i crijeva najbrže odgovaraju, a jetra je puno sporija. Odgovarajući kompromis za mjerenje učestalosti mutacija kod tkiva koja se razmnožavaju sporo, odnosno brzo, 28 je uzastopnih dnevnih tretmana (kako je navedeno u stavku 26.) i uzorkovanje tri dana nakon konačnog tretmana, iako se maksimalna učestalost mutacije može ne pokazati kod tkiva koja se sporo razmnožavaju u tim uvjetima. Kada su tkiva koja se sporo razmnožavaju od posebne važnosti, tada bi moglo biti primjerenije kasnije razdoblje uzimanja uzoraka od 28 dana nakon razdoblja primjene od 28 dana (16) (29). U takvim slučajevima, kasnije vrijeme uzorkovanja zamjenjuje trodnevno razdoblje uzimanja uzoraka i zahtijeva znanstveno opravdanje.
         
            Zametne stanice
         
         31.   Transgenske analize mutacije u glodavaca primjerene su za istraživanja poticanja mutacije gena u zametnim stanicama mužjaka (7) (8) (27), kod kojih su dobro definirani trenutak i kinetika spermatogeneze (27). Mali brojevi jajnih stanica dostupnih za analizu, čak i nakon superovulacije i činjenica da nema sinteze DNK-a u jajnim stanicama, ograničavaju utvrđivanje mutacije zametne stanice u ženki upotrebom transgenskih analiza (31).
         32.   Vremena uzimanja uzoraka za muške zametne stanice treba odabrati tako da se uzorkuje raspon izloženih vrsta stanica tijekom razvoja zametne stanice te tako da ciljni stupanj tijekom uzimanja uzoraka ostvari dovoljnu izloženost. Vrijeme potrebno za napredovanje zametne stanice u razvoju iz spermatogonijalne matične stanice u zreli spermij koji dolazi do sjemenovoda ili repa epididimisa je ~49 dana u miša (36) i ~70 dana u štakora (34) (35). Nakon razdoblja izloženosti od 28 dana uz daljnja tri dana uzorkovanja akumulirana sperma prikupljena iz sjemenovoda ili repa epididimisa (7) (8) predstavlja populaciju stanica izloženih tijekom otprilike druge polovine spermatogeneze, koja uključuje mejotsko i postmejotsko razdoblje no ne i spermatogonijalno razdoblje ili razdoblje matične stanice. Da bi se na odgovarajući način uzorkovale stanice u sjemenovodu ili repu epididimisa koje su bile spermatogonijalne matične stanice tijekom razdoblja izloženosti, potrebno je dodatno vrijeme uzorkovanja od najmanje sedam tjedana (miševi) ili deset tjedana (štakor) nakon završetka tretmana.
         33.   Stanice koje se istisnu iz sjemenovoda nakon 28 + 3 dnevnog režima sastoje se od miješane populacije obogaćene za sve stupnjeve razvoja zametnih stanica (7) (8). Uzorkovanje tih stanica za potrebe utvrđivanja genskih mutacija ne osigurava dovoljno preciznu procjenu stupnjeva na kojima dolazi do mutacija zametnih stanica kao što se to može dobiti iz uzorkovanja spermija iz sjemenovoda ili repa epididimisa (s obzirom na to da postoji niz vrsta zametnih stanica koje su uzorkovane iz sjemenovoda te će isto tako biti prisutne i određene somatske stanice koje kontaminiraju tu populaciju stanica). Međutim, uzorkovanje stanica iz sjemenovoda pored spermija iz sjemenovoda ili repa epididimisa nakon 28 + 3-dnevnog režima uzorkovanja moglo bi u određenom omjeru obuhvatiti stanice izložene tijekom većine faza razvoja zametne stanice i moglo bi biti korisno za utvrđivanje određenih mutagena zametnih stanica.
         
            Promatranja
         
         34.   Opća klinička opažanja treba provoditi najmanje jednom dnevno, po mogućnosti svaki dan u isto vrijeme, vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon primjene doze. Zdravstveno stanje životinja treba bilježiti. Najmanje dva puta dnevno treba provjeravati ima li slučajeva pobolijevanja ili smrti životinja. Sve životinje treba vagati barem jednom tjedno i prilikom žrtvovanja. Unos hrane treba mjeriti najmanje na tjednoj osnovi. Ako se ispitivana tvar daje s vodom za piće, treba mjeriti i unos vode, i to barem na tjednoj razini. Životinje koje pokazuju nesmrtonosne pokazatelje viška toksičnosti trebale bi se eutanazirati prije dovršetka ispitnog razdoblja (23).
         
            Prikupljanje tkiva
         
         35.   Smisao prikupljanja tkiva treba jasno definirati. Budući da je moguće proučavati poticanje mutacije u gotovo bilo kojem tkivu, odabir tkiva koje je potrebno prikupiti trebao bi se temeljiti na razlogu provođenja istraživanja i bilo kojim postojećim podacima o mutagenosti, kancerogenosti ili toksičnosti za kemikaliju koja se istražuje. Važni čimbenici koje treba uzeti u obzir trebali bi uključivati put primjene (na temelju vjerojatnog ljudskog puta izloženosti ili više njih), predviđeni raspored tkiva i moguće mehanizme djelovanja. U nedostatku bilo kakvih dodatnih podataka treba prikupiti nekoliko relevantnih somatskih tkiva. Ona bi trebala predstavljati brzo i sporo razmnožavajuća tkiva kao i ona tkiva na mjestu dodira. K tome, spermiji iz sjemenovoda ili repa epididimisa i zametne stanice u razvoju iz sjemenovoda (kako je opisano u stavcima 32. i 33.) trebali bi se prikupiti i pohraniti za slučaj da bude potrebna buduća analiza mutagenosti zametnih stanica. Treba zabilježiti mase organa, a za veće organe treba prikupiti isto područje od svih životinja.
         
            Pohranjivanje tkiva i DNK-a
         
         36.   Tkiva (ili homogenati tkiva) bi se trebala pohraniti na ili ispod – 70 °C i upotrebljavati za izoliranje DNK-a u roku od 5 godina. Izolirani DNK, pohranjen u hladnjaku na 4 °C u odgovarajućem puferu trebao bi se upotrijebiti optimalno za analize mutacija u roku od godinu dana.
         
            Odabir tkiva za analizu mutacije
         
         37.   Odabir tkiva trebao bi se temeljiti na razmatranjima kao što su: 1) put primjene ili mjesto prvog kontakta (tj. žljezdani želudac ako je primjena oralna, pluća ako je primjena obavljena inhalacijom, ili koža ako je upotrijebljena površinska primjena); i 2) farmakokinetički parametri primijećeni u općim istraživanjima toksičnosti, koji ukazuju na stanje tkiva, zadržavanje ili akumulaciju, ili ciljnih organa u pogledu toksičnosti. Ako se istraživanja obavljaju nakon istraživanja kancerogenosti, treba uzeti u obzir ciljna tkiva u pogledu kancerogenosti. Odabir tkiva za analizu trebao bi maksimizirati pronalaženje kemikalija koje djeluju izravno kao in vitro mutageni, bilo da se ubrzano metaboliziraju, lako reagiraju ili se slabo apsorbiraju ili oni za koje se ciljno tkivo utvrđuje s pomoću puta primjene (6).
         38.   U nedostatku osnovnih informacija i uzimajući u obzir razmatranja u vezi s mjestom kontakta zbog puta primjene, jetra i barem jedno tkivo koje se brzo dijeli (npr. žljezdani želudac, koštana srž) trebali bi se procijeniti u pogledu mutagenosti. U većini se slučajeva navedeni zahtjevi mogu ostvariti s pomoću analiza dvaju pomno odabranih tkiva, no u nekim je slučajevima potrebno je tri ili više vrsta. Ako postoje razlozi koji se posebno odnose na učinke matičnih stanica, uključujući i pozitivne odgovore na somatske stanice, tkiva zametnih stanica trebala bi se procijeniti u pogledu mutacija.
         
            Metode mjerenja
         
         39.   Za preporučene transgenske modele dostupne su standardne laboratorijske ili objavljene metode za otkrivanje mutacija: lacZ lambde bakteriofaga i plazmida (30); lacI miša (2) (18); gpt delta miša (22); gpt delta štakora (28); cII (17). Modifikacije bi trebale biti opravdane i odgovarajuće dokumentirane. Podaci iz višestrukih pakiranja mogu se agregirati i upotrijebiti da bi se postigao odgovarajući broj plakova ili kolonija. Međutim, potreba za velikim brojem reakcija pakiranja za postizanje odgovarajućeg broja plakova može biti pokazatelj slabe kvalitete DNK-a. U takvim slučajevima podaci bi se trebali oprezno razmatrati jer bi mogli biti nepouzdani. Optimalni broj plakova ili kolonija po uzroku DNK-a ovisi o statističkoj vjerojatnosti utvrđivanja odgovarajućeg broja mutanata prema određenoj spontanoj učestalosti mutacije. Općenito, potreban je minimum od 125 000 do 300 000 plakova kada je spontana učestalost mutacije u rangu 3 × 10–5 (15). U pogledu analize Big Blue® lacI, važno je dokazati da se cijeli raspon mutacije boje fenotipa može utvrditi uključivanjem odgovarajućih kontrola boja paralelno sa svakim plakom. Tkiva i njihovi uzorci (predmeti) trebali bi se obraditi i analizirati upotrebom ujednačenog postupka, u okviru kojeg se istodobno obrađuju predmeti iz kontrolne skupine nosača/otapala, pozitivne kontrolne skupine (ako je upotrijebljena) ili pozitivne kontrolne DNK-a (prema potrebi) i svaka obrađena skupina.
         PODACI I IZVJEŠĆIVANJE
         
            Obrada rezultata
         
         40.   Podatke za pojedinačne životinje treba prikazati u tabličnom obliku. Pokusna jedinica je životinja. Izvješće bi trebalo uključivati ukupni broj jedinica koje stvaraju plakove (PFU) ili jedinica koje stvaraju koloniju (CFU), broj mutanata i učestalost mutacija za svako tkivo svake životinje. Postoje li višestruke reakcije u vezi s pakiranjem/spašavanjem, treba izvijestiti o broju reakcija po uzorku DNK-a. Dok podatke za svaku pojedinu reakciju treba zadržati, potrebno je izvijestiti o ukupnom pfu-u ili cfu-u. Treba izvijestiti o podacima o toksičnosti i kliničkim znakovima u skladu sa stavkom 34. Svi rezultati u vezi sa sekvenciranjem trebali bi se predstaviti za svakog analiziranog mutanta te treba prikazati i vezane izračune o učestalosti mutacije za svaku životinju i tkivo.
         
            Statističko vrednovanje i tumačenje rezultata
         
         41.   Postoji više kriterija za utvrđivanje pozitivnog rezultata, kao na primjer povećanje učestalosti mutacije povezano s dozom ili jasno povećanje učestalosti mutacije utvrđeno kod skupine na koju je primijenjena samo jedna doza, u usporedbi s kontrolnom skupinom otapala/nosača. Treba analizirati barem tri skupine tretirane dozom da bi se prikupili odgovarajući podaci za analizu doze i odgovora. Dok bi biološki značaj rezultata trebao biti od primarne važnosti, mogu se upotrebljavati odgovarajuće statističke metode kao pomoć u procjeni rezultata ispitivanja (4) (14) (15) (25) (26). Upotrijebljena statistička ispitivanja trebala bi obuhvaćati životinju kao eksperimentalnu jedinicu.
         42.   Ispitivana tvar čija ispitivanja ne ispunjavaju gornje kriterije u ovom se sustavu ne smatra mutagenom. Treba zadržati i mogućnost negativne pričuve.
         43.   Za analize sekvenciranja DNK-a dostupno je nekoliko statističkih pristupa za pomoć u tumačenju rezultata (1) (5) (9) (19).
         44.   Razmatranja o tome jesu li primijećene vrijednosti unutar ili izvan povijesnog kontrolnog raspona može pomoći kod usmjeravanja pri procjeni biološkog značaja odgovora (32).
         
            Izvješće o ispitivanju
         
         45.   Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:
         
            Ispitivana kemikalija
         
         
                     —
                  
                  
                     identifikacijski podaci i broj CAS, ako su raspoloživi,
                  
               
                     —
                  
                  
                     izvor, broj lota ako je dostupan,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fizikalna priroda i čistoća,
                  
               
                     —
                  
                  
                     fizikalno-kemijska svojstva relevantna za provođenje istraživanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu, ako je poznata.
                  
               
            Otapalo/nosač
         
         
                     —
                  
                  
                     opravdanost odabira nosača,
                  
               
                     —
                  
                  
                     topljivost i stabilnost ispitivane kemikalije u otapalu/nosaču, ako je poznata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     priprema prehrambenih pripravaka, pitke vode ili inhalacijskih pripravaka,
                  
               
                     —
                  
                  
                     analitička određivanja pripravaka (tj. stabilnost, homogenost, nominalne koncentracije).
                  
               
            Ispitne životinje
         
         
                     —
                  
                  
                     vrste i soj te obrazloženje njihova odabira,
                  
               
                     —
                  
                  
                     broj, starost i spol životinja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podrijetlo, uvjeti smještaja, prehrana itd.,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinačna tjelesna masa životinja na početku ispitivanja, uključujući raspon tjelesnih masa, srednje i standardno odstupanje za svaku skupinu.
                  
               
            Ispitni uvjeti
         
         
                     —
                  
                  
                     podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama (nosač/otapalo),
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci iz ispitivanja za određivanje raspona,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podloge za odabir visine doze,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o pripremi kemikalija za ispitivanje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     pojedinosti o primjeni ispitivane kemikalije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podloge za odabir puta primjene,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metode mjerenja toksičnosti životinje, uključujući, kada je dostupno, histopatološke ili hematološke analize i učestalost kojom je obavljano promatranje i vaganje životinje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metode provjere dosega ispitne kemikalije u ciljno tkivo, ili općenite cirkulacije, ako se dobiju negativni rezultati,
                  
               
                     —
                  
                  
                     stvarna doza (mg/kg tjelesne mase/dan) i faktor za preračunavanje koncentracije ispitivane tvari u hrani/vodi za piće (ppm) u stvarnu dozu i prehrana, ako je primjenjivo,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci o kvaliteti hrane i vode,
                  
               
                     —
                  
                  
                     iscrpni opis tretmana i rasporeda uzimanja uzoraka i opravdanje za odabire,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metoda eutanazije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     postupak izdvajanja i očuvanja tkiva,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metode izoliranja genomskog DNK-a glodavca, spašavanje transgena iz genomskog DNK-a i prenošenje transgenskog DNK-a u bakteriju domaćina,
                  
               
                     —
                  
                  
                     izvor i brojevi lota svih stanica, opreme i reagensa (ako je primjenjivo),
                  
               
                     —
                  
                  
                     metode popisivanja mutanata,
                  
               
                     —
                  
                  
                     metode molekularne analize mutanata i upotreba u ispravljanju za klonalitet i/ili izračunavanje učestalosti mutacija, ako je primjenjivo.
                  
               
            Rezultati
         
         
                     —
                  
                  
                     stanje životinje prije i tijekom razdoblja ispitivanja, uključujući i znakove toksičnosti,
                  
               
                     —
                  
                  
                     mase tijela i organa prije žrtvovanja,
                  
               
                     —
                  
                  
                     za svako tkivo/životinju, broj mutanata, broj procijenjenih plakova ili kolonija, učestalost mutacije,
                  
               
                     —
                  
                  
                     za svaku skupinu tkiva/životinje, broj reakcija pakiranja po uzorku DNK-a, ukupni broj mutanata, prosječna učestalost mutacije, standardno odstupanje,
                  
               
                     —
                  
                  
                     odnos doza i reakcija, ako je moguće,
                  
               
                     —
                  
                  
                     za svako tkivo/životinju, broj neovisnih mutanata i prosječna učestalost mutacije, kada je provedena molekularna analiza mutacija,
                  
               
                     —
                  
                  
                     paralelni podaci i podaci o negativnim kontrolama iz prijašnjih ispitivanja s rasponima, srednjim vrijednostima i standardnim odstupanjima,
                  
               
                     —
                  
                  
                     podaci paralelne pozitivne kontrole (ili neparalelne pozitivne kontrole DNK-a),
                  
               
                     —
                  
                  
                     analitička određivanja, ako su dostupna (tj. koncentracije DNK-a koje se upotrebljavaju u pakiranju, podaci o sekvenciranju DNK-a),
                  
               
                     —
                  
                  
                     primijenjene statističke analize i metode.
                  
               
            Rasprava o rezultatima
         
         
            Zaključak
         
         
            LITERATURA
         
         
                  
                     (1)
                  
                  
                     Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987.), Statistical Test for the Comparison of Samples from Mutational Spectra, J. Mol. Biol., 194: 391. – 396.
                  
               
                  
                     (2)
                  
                  
                     Bielas, J.H. (2002.), A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement, Mutation Res., 518: 107. – 112.
                  
               
                  
                     (3)
                  
                  
                     Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg (1995.), Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations Nature, 377(6550): 657. – 659.
                  
               
                  
                     (4)
                  
                  
                     Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995.), Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 246. – 255.
                  
               
                  
                     (5)
                  
                  
                     Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996.), Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405. – 413.
                  
               
                  
                     (6)
                  
                  
                     Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and V. Thybaud (1999.), Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens, Mutagenesis, 14(1): 141. – 151.
                  
               
                  
                     (7)
                  
                  
                     Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper (1995.), Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7485. – 7489.
                  
               
                  
                     (8)
                  
                  
                     Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997.), Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells, Mutation Res., 388(2. – 3.): 197. – 212.
                  
               
                  
                     (9)
                  
                  
                     Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000.), ‚Bayesian Analysis of Mutational Spectra’, Genetics, 156: 1411. – 1418.
                  
               
                  
                     (10)
                  
                  
                     Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. Lohman, D.L. Knook and J. Vijg (1989.), Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971. – 7975.
                  
               
                  
                     (11)
                  
                  
                     Gossen, J.A. and J. Vijg (1993.), A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host, Biotechniques, 14(3): 326., 330.
                  
               
                  
                     (12)
                  
                  
                     Erikson, R.P. (2003.), Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer, Mutation Res., 543.: 125. – 136.
                  
               
                  
                     (13)
                  
                  
                     Erikson, R.P. (2010.), Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update, Mutation Res., 705.: 96. – 106..
                  
               
                  
                     (14)
                  
                  
                     Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998.), Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 13(3): 249. – 255.
                  
               
                  
                     (15)
                  
                  
                     Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000.), In vivo Transgenic Mutation Assays, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253. – 259.
                  
               
                  
                     (16)
                  
                  
                     Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003.), Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays, Environ. Mol. Mutagen., 41.: 1. – 6.
                  
               
                  
                     (17)
                  
                  
                     Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya and S. Garges (1996.), Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(17): 9073. – 9078.
                  
               
                  
                     (18)
                  
                  
                     Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. Short (1990.), The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212. – 218.
                  
               
                  
                     (19)
                  
                  
                     Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns (2008.), Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis, Carcinogenesis, 29(4): 772. – 778.
                  
               
                  
                     (20)
                  
                  
                     Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni (1996.), A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thioguanine Selections, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465. – 470.
                  
               
                  
                     (21)
                  
                  
                     Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999.), Spi – Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice, Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9. – 15.
                  
               
                  
                     (22)
                  
                  
                     Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000.), Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays, Mutation Res., 455(1. – 2.): 191. – 215.
                  
               
                  
                     (23)
                  
                  
                     OECD (2000.), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (24)
                  
                  
                     OECD (2009.), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 103, ENV/JM/MONO(2009.)7, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (25)
                  
                  
                     Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995.), Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay, Environ. Mol. Mutagen., 25(3): 231. – 245.
                  
               
                  
                     (26)
                  
                  
                     Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and N.J. Gorelick (1997.), Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study, Mutation. Res., 388(2. – 3.): 249. – 289.
                  
               
                  
                     (27)
                  
                  
                     Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk (2006.), Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays, Mutation. Res., 598: 164. – 193.
                  
               
                  
                     (28)
                  
                  
                     Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawamura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010.), Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers, Toxicol. Sci., 114(1): 71. – 78.
                  
               
                  
                     (29)
                  
                  
                     Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003.), In vivo Transgenic Mutation Assays, Mutation Res., 540.: 141. – 151.
                  
               
                  
                     (30)
                  
                  
                     Vijg, J. and G.R. Douglas (1996.), Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo in: G. Pfeifer (ed.), Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Plenum Press, New York, NY, USA, str. 391. – 410.
                  
               
                  
                     (31)
                  
                  
                     Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and G.R. Douglas (2005.), A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells, Mutation Res., 578(1. – 2.): 117. – 123.
                  
               
                  
                     (32)
                  
                  
                     Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud (2011.), Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.
                  
               
                  
                     (33)
                  
                  
                     OECD (2011.), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OECD, Pariz.
                  
               
                  
                     (34)
                  
                  
                     Clermont, Y. (1972.), Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiol. Rev. 52.: 198. – 236.
                  
               
                  
                     (35)
                  
                  
                     Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006.), The Epididymis, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, the Netherlands, str. 1071. – 1148.
                  
               
                  
                     (36)
                  
                  
                     Russell, L.B. (2004.), Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse, Genetica, 122: 25. – 36.
                  
               
            Dodatak
            DEFINICIJE
            
               
                  Razdoblje primjene
               : ukupno razdoblje tijekom kojeg se doza primjenjuje na životinju.
            
               
                  Supstitucija baznog para
               : vrsta mutacije koja uzrokuje zamjenu jedinstvene nukleotidne baze DNK-a drugom nukleotidnom bazom DNK-a.
            
               
                  Kapsid
               : omotač od proteina koji obavija česticu virusa.
            
               
                  Kemikalija
               : tvar ili smjesa.
            
               
                  Klonalno širenje
               : proizvodnja više stanica iz jedne (mutirane) stanice.
            
               
                  Jedinica koja stvara koloniju (CFU)
               : mjera održivog broja bakterija.
            
               
                  Konkatamer
               : duga neprekinuta biomolekula sastavljena od višestrukih identičnih preslika povezanih u seriju.
            
               
                  Cos site
               : 12-nukleotidni segment jednolančanog DNK-a koji postoji na oba kraja bakteriofaga dvolančanoga genoma lambde.
            
               
                  Brisanje
               : mutacija zbog koje genom gubi jedan ili više (slijednih) nukleotida.
            
               
                  Elektroporacija
               : primjena električnih impulsa da bi se povećala nepropusnost staničnih membrana.
            
               
                  Endogeni gen
               : gen koji je svojstven genomu.
            
               
                  Ekstrabinomijalna varijacija
               : veća varijabilnost u ponovljenim procjenama udjela populacije nego što bi se očekivalo da populacija ima binomijalnu distribuciju.
            
               
                  Pomak okvira mutacija
               : genetska mutacija koju uzrokuju unošenja ili brisanja određenog broja nukleotida koji nije jednomjerno djeljiv s tri unutar slijeda DNK-a koji je kodiran za protein/peptid.
            
               
                  Unošenje
               : dodavanje jednog ili više baznih parova nukleotida u slijed DNK-a.
            
               
                  Jackpot
               : velik broj mutanata koji se pojavljuju kolonijalnim širenjem iz jedinstvene mutacije.
            
               
                  Velika brisanja
               : brisanja u DNK-a više od nekoliko kilobaza (koja se učinkovito otkrivaju odabirom Spi – i lacZ plazmidnim analizama.).
            
               
                  Ligacija
               : kovalentno povezivanje dva kraja molekula DNK-a s pomoću ligacije DNK-a.
            
               
                  Mitogen
               : kemikalija koja potiče stanicu na započinjanje stanične podjele te tako potiče mitozu (tj. podjelu stanice).
            
               
                  Neutralni gen
               : gen na koji ne utječu ni pozitivni ni negativni selektivni pritisci.
            
               
                  Pakiranje
               : sinteza infektivnih čestica faga iz pripravka kapsida faga i rubnih proteina i konkatamera faga molekule DNK-a. Obično se upotrebljava da bi se grupirao DNK kloniran na lambda vektor (razdvojena cos sites) u infektivne lambda čestice.
            
               
                  Učinkovitost pakiranja
               : učinkovitost kojom se pakirani bakteriofazi regeneriraju u bakteriji domaćinu.
            
               
                  Jedinica koja stvara plakove (PFU)
               : mjera održivog broja bakteriofaga.
            
               
                  Točkasta mutacija
               : općeniti pojam za mutaciju koja utječe samo na manju sekvencu DNK-a uključujući manja unošenja, brisanja i supstitucije baznih parova.
            
               
                  Pozitivna selekcija
               : metoda kojom se omogućava preživljavanje samo mutanata.
            
               
                  Gen koji daje informacije
               : gen čiji je proizvod mutantskoga gena jednostavno uočljiv.
            
               
                  Vrijeme uzorkovanja
               : kraj vremenskog razdoblja, prije žrtvovanja, tijekom kojeg se kemikalija ne primjenjuje i tijekom kojeg se lezije DNK-a pričvršćuju na stabilne mutacije.
            
               
                  Prijenosni vektor
               : vektor konstruiran tako da se može razmnožavati u dvije različite vrste domaćina; u skladu s time, DNK unesen u prijenosni vektor može se ispitivati ili se njime može upravljati u dvije različite vrste stanica ili dva različita organizma.
            
               
                  Ispitivana kemikalija
               : Sve tvari ili smjese koje se ispituju tom ispitnom metodom.
            
               
                  Transgenski
               : u vezi s ili koji je organizam čiji je genom promijenjen prijenosom gena iz neke druge vrste.
         ”
      
         (1)  Trebalo bi razmotriti ispitivanje znatno većeg broja životinja ovisno o osjetljivosti ispitivanja kognitivne funkcije, npr. do 1 mužjaka i 1 ženke po leglu (za raspodjelu životinja vidjeti Dodatak 1.) (daljnje smjernice o veličini uzorka navedene su u Smjernici OECD-a 43 (8)).
      
         (2)  U ovoj je tablici naveden najmanji broj trenutaka u kojima bi trebalo obaviti mjerenje. Ovisno o očekivanim učincima i rezultatima početnih mjerenja može biti preporučljivo dodavanje dodatnih vremenskih točaka (npr. ostarjele životinje) ili obavljanje mjerenja u drugim razvojnim fazama.
      
         (3)  Preporučuje se da se mladunci ne ispituju tijekom dva dana od odbijanja od sise (vidjeti stavak 32.). Preporučena je dob za ispitivanje tijekom adolescencije: učenje i pamćenje = 25. PND ± 2; motorička i osjetilna funkcija = 25. PND ± 2. Preporučena je dob za ispitivanje mladih odraslih životinja 60. do 70. PND.
      
         (4)  Tjelesna masa trebala bi se mjeriti najmanje dvaput tjedno kod izravnog doziranja mladuncima radi prilagodbe doza u vrijeme brzog porasta tjelesne mase.
      
         (5)  Težina mozga i neuropatologija mogu se prema potrebi procijeniti ranije (npr. 11. PND) (vidjeti stavak 39.).
      
         (6)  Ostale razvojne posebnosti osim tjelesne mase (npr. otvaranje očiju) trebale bi se bilježiti prema potrebi (vidjeti stavak 31.).
      
         (7)  Vidjeti stavak 35.
      
         (8)  U ovom se primjeru legla sastoje od 4 mužjaka + 4 ženke; muški su mladunci označeni brojevima od 1 do 4, a ženke mladunci od 5 do 8.
      
         (9)  U ovom se primjeru legla sastoje od 4 mužjaka + 4 ženke; muški su mladunci označeni brojevima od 1 do 4, a ženke mladunci od 5 do 8.
      
         (10)  Različiti se mladunci upotrebljavaju za kognitivna ispitivanja na 23. PND i u mladih odraslih životinja (npr. parna/neparna legla od ukupno njih 20).
      
         (11)  U ovom se primjeru legla sastoje od 4 mužjaka + 4 ženke; muški su mladunci označeni brojevima od 1 do 4, a ženke mladunci od 5 do 8.
      
         (12)  Prag CV-a za određeno tkivo utvrđen je iz grafikona CV vrijednosti – uređen sekvencijalno od najmanje do najveće – za sve srednje vrijednosti iz svih pokusa provedenih tijekom validacije upotrebom posebnog modela (agonist ili antagonist). Prag CV-a očitan je od točke na kojoj su povećanja između sljedećih najvećih CV-ova u seriji dramatično veća od nekoliko prethodnih CV-ova- ‚prekretnice’. Treba napomenuti da, iako su ovom analizom identificirane relativno pouzdane ‚prekretnice’ za model antagonista u testu, krivulje CV-a za test agonista pokazale su ujednačenije povećanje zbog čega je identifikacija praga CV-a ovom metodom donekle proizvoljna.
      
         (13)  Istraživanja su pokazala da su mliječne žlijezde osjetljiva krajnja točka za estrogensko djelovanje, osobito u njihovoj ranoj dobi. Preporučuje se uključivanje krajnjih točaka kojima su obuhvaćene mliječne žlijezde obaju spolova u ovu ispitnu metodu nakon validacije.
      
         (14)  ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, (http://www.lgcstandards-atcc.org/).
      
         (15)  ‚Nova serija’ odnosi se na svježu seriju stanica dobivenih od ATCC-a.
      
         (16)  ‚Zamrznuta serija’ odnosi se na stanice koje su prije kultivirane i potom zamrznute u laboratoriju koji nije ATCC.
      
         (17)  
      
         Napomena: Ako je potrebna ekstrakcija. za svaki se ekstrakt obavljaju tri ponovljena mjerenja. Svaki će se uzorak ekstrahirati samo jednom.
      
         (18)  
      
         Napomena: Granice mjerne metode temelje se na osnovnim vrijednostima proizvodnje hormona navedenima u tablici 5. i na učinku. Ako je moguće postići veću osnovnu proizvodnju hormona, granica može biti viša.
      
         (19)  Neka antitijela hormona T i E2 mogu unakrsno reagirati s androstendionom, odnosno estronom, u većem postotku. U takvim slučajevima nije moguće točno utvrditi učinke na 17β-HSD. Ipak, podaci mogu pružiti korisne informacije o učincima na proizvodnju estrogena ili androgena općenito. U takvim slučajevima podatke treba izraziti kao reakcije androgena/estrogena, umjesto kao hormone E2 i T.
      
         (20)  To uključuje kolesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoksikortisteron, kortikosteron, aldosteron, 17α-pregnenolon,17α-progesteron, deoksikortizol, kortizol, DHEA, androstenedion, estron.
      
         (21)  Kontrola otapala (DMSO) (0), 1 μl DMSO/jažica
      
         (22)  +, pozitivno
      Nije primjenjivo: Nije primjenjivo jer ne bi trebalo doći ni do kakvih promjena nakon izlaganja necitotoksičnim koncentracijama negativne kontrole.
      
         (23)  Stanicama u praznim jažicama dodaje se samo medij (tj. ne dodaje se otapalo).
      
         (24)  Metanol (MeOH) će se dodati nakon završetka izlaganja i uklanjanja medija iz tih jažica.
      
         (25)  Kontrola otapala DMSO (1 μl/jažica).
      
         (26)  Potvrditi prethodni pokus jednakim dizajnom pokusa.
      
         (27)  Ponoviti test pri rasporedu koncentracije polovičnog logaritma (izdvajanje koncentracije za koju je u prethodnom pokusu utvrđeno da je znatno drukčija.
      
         (28)  Promjena omjera pri jednoj koncentraciji statistički je znatno različita od SC-a.
      
         (29)  Odnosi se na ponovljena mjerenja istog uzorka.