CELEX: 31977R0072
Language: el
Date: 1977-01-13 00:00:00
Title: Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 72/77 τής Επιτροπής τής 13ης Ιανουαρίου 1977 περί τροποποιήσεως τού κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 «περί λήψεως καί αναγωγής τών δειγμάτων καθώς καί περί προσδιορισμού τής περιεκτικότητος σέ έλαιο, ξένα σώματα καί υγρασία τών ελαιούχων σπόρων»

Avis juridique important

|

31977R0072

Κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 72/77 τής Επιτροπής τής 13ης Ιανουαρίου 1977 περί τροποποιήσεως τού κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 «περί λήψεως καί αναγωγής τών δειγμάτων καθώς καί περί προσδιορισμού τής περιεκτικότητος σέ έλαιο, ξένα σώματα καί υγρασία τών ελαιούχων σπόρων»  

Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 012 της 15/01/1977 σ. 0011 - 0024 Φινλανδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 7 σ. 0218  Ελληνική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 16 σ. 0215  Σουηδική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 3 τόμος 7 σ. 0218  Ισπανική ειδική έκδοση: Κεφάλαιο 03 τόμος 11 σ. 0104  Πορτογαλική ειδική έκδοση : Κεφάλαιο 03 τόμος 11 σ. 0104 

ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΟΚ) αριθ. 72/77 ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 13ης Ιανουαρίου 1977 περί τροποποιήσεως του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 "περί λήψεως και αναγωγής των δειγμάτων καθώς και περί προσδιορισμού της περιεκτικότητος σε έλαιο, ξένα σώματα και υγρασία  των ελαιούχων σπόρων"Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,  Έχοντας υπόψη:  τη συνθήκη περί ιδρύσεως της Ευρωπαϊκής Οικονομικής Κοινότητος,  τον κανονισμό αριθ. 136/66/ΕΟΚ του Συμβουλίου της 22ας Σεπτεμβρίου 1966 περί δημιουργίας κοινής οργανώσεως αγοράς στον τομέα των λιπαρών ουσιών(1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 1707/73(2), και ιδίως το άρθρο 26 παράγραφος  3,  Εκτιμώντας:  ότι, για να είναι δυνατόν να προσδιορισθεί με ακρίβεια η περιεκτικότητα των κραμβοσπόρων και γογγυλοσπόρων σε ερουκικό οξύ, ενδείκνυται να προβλεφθεί κατάλληλη μέθοδος- ότι, για το λόγο αυτόν, πρέπει να τροποποιηθεί ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 της  Επιτροπής της 23ης Σεπτεμβρίου 1968 περί λήψεως και αναγωγής των δειγμάτων ως και περί προσδιορισμού της περιεκτικότητος σε έλαιο, ξένα σώματα και υγρασία των ελαιούχων σπόρων(3), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από τον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 3025/75(4)- ότι τα προβλεπόμενα στον παρόντα κανονισμό μέτρα είναι σύμφωνα με τη γνώμη της Επιτροπής Διαχειρίσεως Λιπαρών Ουσιών,  ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΟΝ ΠΑΡΟΝΤΑ ΚΑΝΟΝΙΣΜΟ:   Άρθρο 1  Στον κανονισμό (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 προστίθεται το ακόλουθο άρθρο 2 β:  "Ο προσδιορισμός της περιεκτικότητος σε ερουκικό οξύ ο προβλεπόμενος από το άρθρο 4 του κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 282/67 πραγματοποιείται σύμφωνα με την ορισθείσα, στο παράρτημα VI του παρόντος κανονισμού, μέθοδο.  Θεωρούνται ότι έχουν τη μέγιστη περιεκτικότητα σε ερουκικό οξύ την προβλεπομένη από το άρθρο 3 παράγραφος 2 πρώτη περίπτωση του κανονισμού αριθ. 282/67/ΕΟΚ οι κραμβόσποροι και οι γογγυλόσποροι των οποίων το έλαιο, που θα έχει εξαχθεί σύμφωνα προς την  αναφερομένη στο παράρτημα VI μέρος I μέθοδο περιέχει το πολύ μέχρι 15,0% ερουκικό οξύ C22 υπολογιζόμενο σύμφωνα με την αναφερομένη στο παράρτημα VI μέρη II και III μέθοδο."  Άρθρο 2  Ο κανονισμός (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68 συμπληρώνεται με το παράρτημα VI, το κείμενο του οποίου ευρίσκεται στο παράρτημα του παρόντος κανονισμού.   Άρθρο 3  Ο παρών κανονισμός αρχίζει να ισχύει την τρίτη ημέρα από τη δημοσίευσή του στην Επίσημη Εφημερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων.  Ο παρών κανονισμός είναι δεσμευτικός ως προς όλα τα μέρη του και ισχύει άμεσα σε κάθε Κράτος Μέλος.  Έγινε στις Βρυξέλλες, στις 13 Ιανουαρίου 1977.  Για την Επιτροπή Finn GUNDELACH Αντιπρόεδρος  (1) ΕΕ αριθ. 172 της 30.9.1966, σ. 3025/66.  (2) ΕΕ αριθ. Ν 175 της 29.6.1973, σ. 5.  (3) EΕ αριθ. Ν 239 της 28.9.1968, σ. 2.  (4) ΕΕ αριθ. Ν 300 της 20.11.1975, σ. 5.      ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ VI   ΚΟΙΝΟΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΝΑΛΥΣΕΩΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΜΕΝΗ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΟΣ ΣΕ ΕΡΟΥΚΙΚΟ ΟΞΥ ΤΩΝ ΕΛΑΙΟΥΧΩΝ ΣΠΟΡΩΝ ΠΟΥ ΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ ΠΑΡΕΜΒΑΣΕΩΣ  I. Προτετοιμασία των δειγμάτων II. Παρασκευή μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων III. Αεριοχρωματογραφία μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων I. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 1. Η λήψη δειγμάτων σπόρων, η μετατροπή των δειγμάτων εργαστηρίου σε δείγματα αναλύσεως, ο προσδιορισμός της περιεκτικότητος του προϊόντος ως έχει σε έλαιο πραγματοποιούνται σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στα παραρτήματα I, II και V του  κανονισμού (ΕΟΚ) αριθ. 1470/68.  2. Προετοιμασία του δείγματος του ελαίου που εξάγεται από τους σπόρους στους οποίους πραγματοποιήθηκε η δειγματοληψία.  2.1. Δείγμα υγρό απολύτως διαυγές:  Πριν από τη λήψη του προς εξέταση δείγματος, αναδεύουμε προληπτικά.  2.2. Δείγμα υγρό αλλά θολό ή με ίζημα:  Τοποθετούμε το δείγμα σε ένα πυριαντήριο σε 50o C. Όταν το δείγμα αποκτήσει αυτήν τη θερμοκρασία, αναδεύουμε καλά και το αφήνουμε να διαχωρισθεί. Διηθούμε με φίλτρο από χαρτί στο πυριαντήριο, διατηρώντας τη θερμοκρασία στους 30o C.  2.3. Δείγμα στερεό:  Τοποθετούμε το δείγμα στο πυριαντήριο σε θερμοκρασία κατά 10o C ανώτερη από την αναμενόμενη περιοχή τήξεως. Στην συνέχεια εργαζόμαστε όπως στο σημείο 2.1. (αν το τηγμένο δείγμα είναι διαυγές) ή όπως στο σημείο 2.2. (αν το τηγμένο δείγμα είναι θολό ή  περιέχει ίζημα).  II. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΕΘΥΛΙΚΩΝ ΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι περιγραφόμενες μέθοδοι έχουν ως αντικείμενο τη μετατροπή των ζωικών ή φυτικών λιπών καθώς και των λιπαρών οξέων οποιασδήποτε προελεύσεως σε μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων.  Οι μεθυλεστέρες που λαμβάνονται κατ' αυτό τον τρόπο χρησιμοποιούνται σε διάφορες μεθόδους που απαιτούν μία τέτοιου είδους μετατροπή, όπως π.χ. η αεριοχρωματογραφία, η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, η φασματοφωτομετρία υπερύθρου κλπ.  2. ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ Οι περιγραφόμενες μέθοδοι εφαρμόζονται στα ζωικά και φυτικά λίπη. Οι μέθοδοι που περιγράφονται στο σημείο 3 εφαρμόζονται για την παρασκευή μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων που αποτελούνται από 6 ή περισσότερα άτομα C. Παρουσία των λιπαρών οξέων C6 και C8 και  κατά την παρασκευή εστέρων που πρόκειται να υποβληθούν σε αεριοχρωματογραφία, ο διαλύτης δεν πρέπει να απομακρύνεται από το διάλυμα των μεθυλεστέρων.  Η γενική μέθοδος 3.1. δύναται να οδηγήσει σε λανθασμένα αποτελέσματα στις περιπτώσεις παρουσίας:  - ενώσεων με δευτερεύουσες οξυγονούχες ομάδες (υδροξυ , υδροπεροξυ, κετονο , εποξυ )- - ενώσεων με κυκλοπροπανικές και κυκλοπροπενικές ομάδες- - συζυγών πολυακορέστων ενώσεων- - κηρών,  και είναι συνεπώς προτιμότερο να χρησιμοποιείται μία από τις μεθόδους που περιγράφονται στο σημείο 3.2. Ωστόσο, τα λίπη που περιέχουν τέτοιες ομάδες σε πολύ μικρές αναλογίες (π.χ. βαμβακέλαιο) είναι δυνατό να αναλύονται με τη μέθοδο 3.1.  Τα φωσφολιπίδια δύνανται να αναλυθούν μετά τη σαπωνοποίηση και την εστεροποίηση των λιπαρών οξέων.  Τα ασαπωνοποίητα μέρη δεν απομακρύνονται και, αν περιέχονται σε σημαντικές ποσότητες, είναι δυνατό να έχουν επιπτώσεις σε μεταγενέστερες αναλύσεις (σημείωση 1).  3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΜΕ 6 Ή ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΑ ΑΤΟΜΑ ΑΝΘΡΑΚΑ Στο σημείο 3.1. περιγράφεται μία γενική παρασκευής μεθυλεστέρων με τη βοήθεια τριφθοριούχου βορίου, η οποία πρέπει να χρησιμοποιείται κατά προτίμηση. Για τις περιπτώσεις στις οποίες η μέθοδος αυτή δεν είναι δυνατό να εφαρμοσθεί, οι εναλλακτικές μέθοδοι  περιγράφονται στο σημείο 3.2.  3.1. Γενική μέθοδος με χρησιμοποίηση τριφθοριούχου βορίου 3.1.1. Αρχή Σαπωνοποίηση των γλυκεριδίων, στη συνέχεια ελευθέρωση και εστεροποίηση των λιπαρών οξέων, παρουσία τριφθοριούχου βορίου.  3.1.2. Όργανα - φιάλες των 50 έως 100 ml με εσμυρισμένο στόμιο- - ψυκτήρα μήκους 20 ως 30 εκατοστών, με εσμυρισμένο άκρο δυνάμενο να προσαρμοσθεί στη φιάλη- - υλικό ρυθμίσεως βρασμού, απαλλαγμένο από λίπη- - σωληνώσεις για τη διοχέτευση αζώτου- - βαθμονομημένο σιφώνιο, χωρητικότητος τουλάχιστον 10 ml με αναρροφητική διάταξη (poire) ή αυτόματο σιφώνιο- - δοκιμαστικοί σωλήνες με εσμυρισμένο πώμα- - διαχωριστικές χοάνες των 250 ml.  3.1.3. Αντιδραστήρια - Μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου, περίπου 0,5 N:  Διαλύουμε 2 g υδροξειδίου του νατρίου σε 100 ml μεθανόλης με περιεκτικότητα σε νερό μικρότερη από 5% (m/m). Όταν το διάλυμα χρησιμοποιείται επί μακρό χρονικό διάστημα, σχηματίζεται μικρή ποσότητα ανθρακικού νατρίου (λευκό ίζημα) που δεν έχει επίδραση  στην παρασκευή των μεθυλεστέρων- - μεθανολικό διάλυμα τριφθοριούχου βορίου περιεκτικότητος 12 έως 15% (m/m). (Διαλύματα 14 και 50% υπάρχουν στο εμπόριο) (σημείωση 2).  Προσοχή: Το τριφθοριούχο βόριο είναι τοξική ένωση. Για το λόγο αυτόν, δεν συνιστάται να παρασκευάζετε οι ίδιοι το διάλυμα τριφθοριούχου βορίου και μεθανόλης (σημείωση 3)- - επτάνιο χρωματογραφίας (σημειώσεις 2 και 4)- - πετρελαϊκός αιθέρας επαναπεσταγμένος (περιοχή βρασμού 40 60o C), δείκτης βρωμίου κατώτερος από 1, απαλλαγμένος υπό υπόστημα ή εξάνιο (σημείωση 2) - άνυδρο θειικό νάτριο- - κορεσμέο διάλυμα χλωριούχου νατρίου- - ερυθρό του μεθυλίου, σε διάλυμα 0,1% (m/v) εντός αιθανόλης 60% (v/v)- - άζωτο με περιεκτικότητα σε οξυγόνο μικρότερη από 5 mg/kg.  3.1.4. Τρόπος εργασίας Λόγω των τοξικών ιδιοτήτων του τριφθοριούχου βοριού, οι ακόλουθες εργασίες πρέπει κατά το δυνατό να εκτελούνται στον απαγωγό. Όλα τα γυάλινα όργανα πρέπει να πλένονται αμέσως μετά τη χρήση.  Παρουσία ελαίων ή λιπαρών οξέων με 2 ή περισσότερους διπλούς δεσμούς συνιστάται να απομακρύνουμε τον αέρα που περιέχεται στη μεθανόλη και τη φιάλη με διοχέτευση αζώτου επί μερικά λεπτά. Προετοιμάζουμε το δείγμα σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στο  μέρος I: "Προετοιμασία των δειγμάτων". Ακριβής ζύγιση δεν είναι αναγκαία. Μόνο το μέγεθος του δείγματος πρέπει να είναι γνωστό, προκειμένου να προβούμε στην ορθή επιλογή του μεγέθους της φιάλης και της ποσότητος των αντιδραστηρίων σύμφωνα με των  κατωτέρω πίνακα:   "" ID="1">100- 250> ID="2">50> ID="3">4> ID="4">5"> ID="1">250- 500> ID="2">50> ID="3">6> ID="4">7"> ID="1">500- 750> ID="2">100> ID="3">8> ID="4">9"> ID="1">750- 1000> ID="2">100> ID="3">10> ID="4">12"> Στην περίπτωση που οι μεθυλεστέρες πρόκειται να αναλυθούν με αεριοχρωματογραφία, η ποσότητα του δείγματος πρέπει να είναι γύρω στα 350 mg. Αν είναι μικρότερη, πρέπει να προσέξουμε ώστε το λαμβανόμενο δείγμα να είναι αντιπροσωπευτικό (σημείωση 5).  3.1.4.1. Έλαια και λίπη Τοποθετούμε το δείγμα που παρασκευάσαμε σε μία φιάλη. Προσθέτουμε την ενδεικνυόμενη ποσότητα μεθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου μαζί με υλικό ρυθμίσεως βρασμού. Προσαρμόζουμε τον ψυκτήρα στη φιάλη. Θερμαίνουμε μέχρι βρασμού υπό ανακύκλωση  και μέχρις ότου εξαφανισθούν τα σταγονίδια λίπους (η εργασία αυτή δύναται να διαρκέσει από πέντε ως δέκα λεπτά, αλλά, σε ορισμένες εξαιρετικές περιπτώσεις η διάρκειά της δύναται να υπερβεί τα δέκα λεπτά).  Στο δείγμα που βράζει προσθέτουμε εκ των άνω, μέσω του ψυκτήρα, χρησιμοποιώντας ένα βαθμονομημένο σιφώνιο με διάταξη αναρροφήσεως ή ένα αυτόματο σιφώνιο, την προβλεπόμενη ποσότητα μεθανολικού διαλύματος τριφθοριούχου βορίου. Συνεχίζουμε το βρασμό επί  δύο ακόμη λεπτά. Εκ των άνω, μέσω του ψυκτήρα, προσθέτουμε στο μίγμα που βράζει 2 έως 5 ml επτανίου (σημείωση 4). (Η ποσότητα του επτανίου δεν έχει σημασία για την αντίδραση). Συνεχίζουμε το βρασμό επί ένα ακόμη λεπτό. Αποσύρουμε την πηγή θερμάνσεως και  στη συνέχεια αφαιρούμε τον ψυκτήρα. Προσθέτουμε μερικά ml κορεσμένου διαλύματος χλωριούχου νατρίου και αναδεύουμε πολλές φορές προσεκτικά και με κυκλικές κινήσεις.  Συνεχίζουμε την πρόσθεση χλωριούχου νατρίου μέχρις ότου η στάθμη του υγρού ανέλθει ως τον αυχένα της φιάλης. Μεταφέρουμε περίπου 1 ml της ανώτερης στιβάδας (επτανικό διάλυμα) σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα με εσμυρισμένο πώμα και προσθέτουμε την ποσότητα  ανύδρου θειικού νατρίου, που απαιτείται για την εξάλειψη των ιχνών ύδατος. Σε περίπτωση που η ποσότητα του δείγματος είναι 350 mg, το λαμβανόμενο διάλυμα περιέχει περίπου 5 ως 10% μεθυλεστέρες και δύναται να εισαχθεί απευθείας στη στήλη του  αεριοχρωματογράφου. Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις αραιώνουμε το επτανικό διάλυμα, ώστε να λάβουμε περιεκτικότητα 5 ως 10% σε μεθυλεστέρες (σημείωση 6).  Για να λάβουμε το σύνολο των ξηρών εστέρων, μεταφέρουμε το αλατικό διάλυμα και την επτανική φάση σε μία διαχωριστική χοάνη των 250 ml. Διαχωρίζουμε. Εκχυλίζουμε το αλατικό διάλυμα με 50 ml πετρελαϊκό αιθέρα (περιοχή βρασμού 40 60o C) με εξάνιο.  Επαναλαμβάνουμε την εκχύλιση ακόμη μία φορά. Συγκεντρώνουμε τη φάση του επτανίου και τα δύο εκχυλίσματα και εκπλένουμε σε κάθε περίπτωση με 20 ml νερού μέχρι να εξαφανισθεί η οξύτητα (δείκτης: ερυθρό του μεθυλίου). Ξηραίνουμε με άνυδρο θειικό νάτριο και  εξατμίζουμε το διαλύτη σε λουτρό ύδατος υπό ρεύμα αζώτου (σημειώσεις 6 και 7). Σε περίπτωση δειγμάτων μικροτέρων από 500 mg, οι ποσότητες των διαλυτικών μέσων και του νερού καλό είναι να μειώνονται ανάλογα.  3.1.4.2. Λιπαρά οξέα Σε περίπτωση που το δείγμα αποτελείται αποκλειστικά από λιπαρά οξέα δεν προβαίνουμε σε σαπωνοποίηση.  Εισάγουμε την επιθυμητή ποσότητα των προπαρασκευασμένων λιπαρών οξέων στη φιάλη. Προσθέτουμε την προβλεπομένη ποσότητα μεθανολικού διαλύματος τριφθοριούχου βορίου. Θερμαίνουμε μέχρι βρασμού επί δύο λεπτά. Στη συνέχεια εργαζόμαστε όπως περιγράφεται στο  σημείο 3.1.4.1. αρχίζοντας από τη φράση: "Εκ των άνω, μέσω του ψυκτήρα...".  3.2. Εναλλακτικές μέθοδοι χωρίς χρησιμοποίηση τριφθοριούχου βορίου 3.2.1. Ουδέτερα λίπη (αριθμός οξέων < 2) 3.2.1.1. Αρχή Μεθανόλυση των γλυκεριδίων σε αλκαλικό περιβάλλον.  3.2.1.2. Όργανα - αναδευτήρας ταχείας αναδεύσεως και κατάλληλη θερμαντική διάταξη (π.χ. θερμαινόμενος μαγνητικός αναδευτήρας)- - κωνική ή σφαιρική φιάλη των 100 ml με εσμυρισμένο στόμιο- - σωληνώσεις για τη διοχέτευση του αζώτου- - ψυκτήρας προσαρμοζόμενος στην κωνική ή σφαιρική φιάλη- - υλικό ρυθμίσεως βρασμού, απαλλαγμένο από λίπη- - διαχωριστικές χοάνες των 125 ml- - κωνική φιάλη με στενό στόμιο των 50 ml.  3.2.1.3. Αντιδραστήρια - μεθανόλη με περιεκτικότητα σε νερό μικρότερη από 5% (m/m)- - μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου περίπου 1 N: διαλύουμε 5,6 g υδροξειδίου του νατρίου σε 100 ml μεθανόλης με περιεκτικότητα σε νερό μικρότερη από 5% (m/m)- - επτάνιο χρωματογραφίας (σημειώσεις 2 και 4)- - άνυδρο θειικό νάτριο- - άζωτο με περιεκτικότητα σε οξυγόνο μικρότερη από 5 mg/kg.  3.2.1.4. Τρόπος εργασίας Παρουσία ελαίων που περιέχουν οξέα με περισσότερους από 2 διπλούς δεσμούς, συνιστάται να απομακρύνουμε τον αέρα που περιέχεται στη μεθανόλη και στη φιάλη με διοχέτευση αζώτου επί μερικά λεπτά.  Προετοιμάζουμε το δείγμα σύμφωνα με το μέρος I:  Προετοιμασία των δειγμάτων.  Σε μία κωνική ή σφαιρική φιάλη των 100 ml εισάγουμε περίπου 4g (σημείωση 5) του προπαρασκευασμένου λίπους.  Προσθέτουμε περίπου 40ml μεθανόλης, 0,5ml διαλύματος υδροξειδίου του νατρίου και υλικό ρυθμίσεως βρασμού. Προσαρμόζουμε τον ψυκτήρα ανακυκλώσεως, αναδεύουμε και θερμαίνουμε μέχρι βρασμού. Το διάλυμα πρέπει να γίνει διαυγές. Η αντίδραση περατώνεται  γενικά μετά από πέντε ως δέκα λεπτά. Σε περίπτωση ελαίου του τύπου του κικινελαίου η διαύγεια δεν αποτελεί κριτήριο για την αντίδραση (σημείωση 8).  Ψύχουμε σε ρεύμα νερού και μεταφέρουμε το μίγμα σε μία διαχωριστική χοάνη των 125 ml. Εκπλένουμε τη φιάλη με 20 ml επτανίου (σημείωση 4) και μεταγγίζουμε στη διαχωριστική χοάνη.  Προσθέτουμε περίπου 40 ml νερού, αναδεύουμε και αφήνουμε να γίνει ο διαχωρισμός. Οι εστέρες συγκεντρώνονται στην υπερκείμενη επτανική φάση. Εκπλένουμε για δεύτερη φορά την υδατική φάση με 20 ml επτανίου. Συγκεντρώνουμε τα δύο εκχυλίσματα και τα  εκπλένουμε δύο φορες με 20 ml νερού. Μετά το διαχωρισμό, ξηραίνουμε το διάλυμα των εστέρων με τη βοήθεια ανύδρου θειικού νατρίου, διηθούμε μέσω βάμβακα σε μία κωνική φιάλη και, αν χρειασθεί, εξατμίζουμε σε λουτρό ζέοντος ύδατος και υπό διοχέτευση αζώτου  (σημειώσεις 6 και 7).  3.2.2. Όξινα λίπη (αριθμός οξέων > 2) και λιπαρά οξέα 3.2.2.1. Αρχή Όξινα λίπη: εξουδετέρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων, μεθανόλυση των γλυκεριδίων σε αλκαλικό περιβάλλον και στη συνέχεια εστεροποίηση σε όξινο περιβάλλον. Λιπαρά οξέα: Εστεροποίηση σε όξινο περιβάλλον.  3.2.2.2. Όργανα - αναδευτήρας ταχείας αναδεύσεως και κατάλληλη θερμαντική διάταξη (π.χ. θερμαινόμενος μαγνητικός αναδευτήρας)- - κωνική ή σφαιρινή φιάλη των 250 ml με εσμυρισμένο στόμιο- - σωληνώσεις για τη διοχέτευση του αζώτου- - ψυκτήρας προσαρμοζόμενος στην κωνική ή σφαιρινή φιάλη- - υλικό ρυθμίσεως βρασμού, απαλλαγμένο από λίπη- - διαχωριστικές χοάνες των 250 ml- - κωνική φιάλη των 100 ml με στενό στόμιο.  3.2.2.3. Αντιδραστήρια - διάλυμα μεθυλικού νατρίου, παρασκευαζόμενο με διάλυση 1 g νατρίου σε 100 ml μεθανόλης με περιεκτικότητα σε νερό μικρότερη από 5% (m/m)- -μεθανολικό διάλυμα ανύδρου υδροχλωρικού οξέος (βλ. 3.2.2.6 παρατηρήσεις α) και β))- - επτάνιο χρωματογραφίας (σημειώσεις 2 και 4)- - άνυδρο θειικό νάτριο- - άζωτο με περιεκτικότητα σε οξυγόνο μικρότερη από 5 mg/kg.  3.2.2.4. Τρόπος εργασίας για τα όξινα λίπη (αριθμός οξέων > 2) Παρουσία ελαίων που περιέχουν οξέα με περισσότερους από 2 διπλούς δεσμούς, συνιστάται να απομακρύνουμε τον αέρα από τη μεθανόλη και από τη φιάλη με διοχέτευση αζώτου επί μερικά λεπτά.  Προετοιμάζουμε το δείγμα σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται στο μέρος I, "Προετοιμασία των δειγμάτων". Τοποθετούμε περίπου 4 g (σημείωση 5) του προπαρασκευασμένου λίπους σε μία κωνική ή σφαιρική φιάλη των 250 ml.  Προσθέτουμε κατόπιν στη φιάλη 40 ml διαλύματος μεθυλικού νατρίου (βλ. 3.2.2.6 παρατήρηση γ)). Προσαρμόζουμε τον ψυκτήρα ανακυκλώσεως, αναδεύουμε και θερμαίνουμε το μίγμα μέχρι βρασμού. Το διάλυμα πρέπει να γίνει διαυγές και συνήθως αυτό συμβαίνει μετά  από περίπου 10 λεπτά. Μετά από 15 λεπτά η αντίδραση έχει ουσιαστικά περατωθεί.  Στη συνέχεια προσθέτουμε στη φιάλη τουλάχιστον 50 ml διαλύματος υδροχλωρικού οξέος και θερμαίνουμε πάλι επί 10 λεπτά μέχρι βρασμού (βλ. παρατήρηση 3.2.2.6 δ)).  Ψύχουμε σε ρεύμα νερού. Στην συνέχεια προσθέτουμε στη φιάλη 100 ml νερού, μεταφέρουμε το μίγμα σε μία διαχωριστική χοάνη των 250 ml και προσθέτουμε 30 ml επτανίου (σημείωση 4). Αναδεύουμε δυνατά και περιμένουμε μέχρι να επέλθει ο πλήρης διαχωρισμός των  δύο φάσεων. Συλλέγουμε την επτανική φάση. Εκπλένουμε την υδατική φάση για δεύτερη φορά με 30 ml επτανίου. Συγκεντρώνουμε τις δύο επτανικές φάσεις και εκπλένουμε επανειλημμένα με νερό μέχρις ουδετέρας αντιδράσεως. Μετά το διαχωρισμό, ξηραίνουμε με θειικό  νάτριο. Διηθούμε μέσω βάμβακος και, αν χρειασθεί, εξατμίζουμε το διαλύτη σε λουτρό ζέοντος ύδατος και υπό διοχέτευση αζώτου, μέχρι 20 ml (σημειώσεις 6 και 7).  3.2.2.5. Τρόπος εργασίας για τα λιπαρά οξέα Για τα λιπαρά οξέα χρησιμοποιούμε την ακόλουθη απλοποιημένη μέθοδο:  Παρουσία λιπαρών οξέων που περιέχουν περισσότερους από 2 διπλούς δεσμούς, συνιστάται να απομακρύνουμε τον αέρα από τη μεθανόλη και τη φιάλη με διοχέτευση αζώτου επί μερικά λεπτά.  Προετοιμάζουμε το δείγμα σύμφωνα με το μέρος I: "Προετοιμασία των δειγμάτων". Τοποθετούμε σε μία φιάλη των 250 ml περίπου 4 g (σημείωση 5) του προπαρασκευασμένου λίπους.  Προσθέτουμε 50 ml διαλύματος υδροχλωρικού οξέος καθώς και υλικό ρυθμίσεως βρασμού, προσαρμόζουμε τον ψυκτήρα και θερμαίνουμε μέχρι βρασμού επί δέκα λεπτά. Ψύχουμε σε ρεύμα νερού. Στη συνέχεια προσθέτουμε στη φιάλη 100 ml νερού και μεταφέρουμε το μίγμα  σε μία διαχωριστική χοάνη των 250 ml, όπου προσθέτουμε 30 ml επτανίου (σημείωση 4). Αναδεύουμε δυνατά και περιμένουμε να επέλθει ο πλήρης διαχωρισμός των δύο φάσεων. Συλλέγουμε την υδατική φάση και εκπλένουμε για δεύτερη φορά με 30 ml επτανίου.  Συγκεντρώνουμε τα δύο επτανικά εκχυλίσματα και εκπλένουμε επανειλημμένα μέχρις ουδετέρας αντιδράσεως. Μετά το διαχωρισμό ξηραίνουμε με θειικό νάτριο. Διηθούμε μέσω βάμβακος και, αν χρειασθεί, εξατμίζουμε το διαλύτη, σε μία κωνική φιάλη εντός λουτρού  ζέοντος ύδατος και υπό διοχέτευση αζώτου, μέχρι 20 ml (σημειώσεις 6 και 7).  3.2.2.6. Παρατηρήσεις:  α) Στο εργαστήριο είναι εύκολο να παρασκευάσουμε μικρές ποσότητες ανύδρου αερίου υδροχλωρίου από το υδροχλωρικό οξύ του εμπορίου (D=1,18) προσθέτοντας σταδιακά πυκνό θειικό οξύ (D=1,84). Το αέριο που ελευθερώνεται ξηραίνεται διοχετευόμενο μέσω θειικού  οξέος. Επειδή η μεθανόλη παρουσιάζει μεγάλη χημική συγγένεια με το αέριο υδροχλώριο, πρέπει να λαμβάνουμε όλα τα αναγκαία μέτρα προστασίας για την πλήρη διάλυσή του, π.χ. διοχετεύουμε το αέριο με τη βοήθεια ενός μικρού ανεστραμμένου χωνίου, που μόλις  εφάπτεται στη στάθμη της μεθανόλης. Είναι εξάλλου δυνατό να παρασκευάσουμε εκ των προτέρων αρκετή ποσότητα μεθανολικού διαλύματος υδροχλωρίου, που διατηρείται άριστα σε φιάλες με εσμυρισμένο πώμα, φυλασσόμενες υπό συνθήκες σκότους.  β) Αντί του μεθανολικού διαλύματος υδροχλωρίου είναι δυνατό να χρησιμοποιήσουμε μεθανολικό διάλυμα θειικού οξέος περίπου 1 N, αλλά η διάρκεια της εστεροποιήσεως πρέπει να είναι τουλάχιστον 20 λεπτά. Επειδή το ίζημα του θειικού νατρίου παρεμποδίζει το  βρασμό, πρέπει να προβαίνουμε σε διήθηση ή να χρησιμοποιούμε το μαγνητικό αναδευτήρα.  γ) Πριν από την εισαγωγή του δείγματος είναι δυνατό να προσθέσουμε 0,4 g νατρίου, ώστε, αν χρειασθεί, να παρασκευάσουμε ταχύτατα διάλυμα μεθυλικού νατρίου.  δ) Στην περίπτωση των πολύ όξινων λιπών δημιουργείται, λόγω των σχετικά μεγάλων ποσοτήτων μεθυλικού νατρίου, ίζημα χλωριούχου νατρίου, που, κατά το βρασμό που επακολουθεί, δύναται να προκαλέσει εκτινάξεις του διαλύματος. Είναι δυνατό να προβούμε σε  διήθηση του ιζήματος, αλλά αυτό δεν είναι γενικά αναγκαίο, λόγω της βραχείας διαρκείας της προβλεπομένης θερμάνσεως.  4. ΕΙΔΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ ΜΕ 4 Ή ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΑ ΑΤΟΜΑ ΑΝΘΡΑΚΟΣ 4.1. Αρχή Οι μεθυλεστέρες λαμβάνονται κατόπιν αντιδράσεως του λίπους με μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου, σε ένα ενδιάμεσο στάδιο, πριν από τη σαπωνοποίηση.  4.2. Πεδίο εφαρμογής Η μέθοδος εφαρμόζεται κυρίως για την παρασκευή μεθυλεστέρων που πρόκειται να αναλυθούν με αεριοχρωματογραφία.  Η μέθοδος δεν εφαρμόζεται στα όξινα λίπη (αριθμός οξέων > 2).  4.3. Όργανα - δοκιμαστικοί σωλήνες με εσμυρισμένο πώμα, των 20 ml περίπου- - ογκομετρικές φιάλες των 50 και των 100 ml- - βαθμονομημένα σιφώνια του 1 ml (ή μεγαλύτερα)- - βαθμονομημένες προχοΐδες των 10 ml.  4.4. Αντιδραστήρια - μεθανολικό διάλυμα υδροξειδίου του καλίου, περίπου 2 N: διαλύουμε 11,2 g υδροξειδίου του καλίου σε 100 ml μεθανόλης με περιεκτικότητα σε νερό μικρότερη από 0,5% (m/m)- - επτάνιο χρωματογραφίας (σημειώσεις 2 και 4)- - πρότυπο διάλυμα I: σε μία ογκομετρική φιάλη των 50 ml, ζυγίζουμε 1 g πεντανοϊκού μεθυλίου με ακρίβεια 0,1 mg και προσθέτομε επτάνιο μέχρι τη χαραγή- - πρότυπο διάλυμα II: σε μία ογκομετρική φιάλη των 100 ml, ζυγίζουμε 200 mg πεντανοϊκού μεθυλίου με ακρίβεια 0,1 mg και προσθέτουμε επτάνιο μέχρι τη χαραγή.  4.5. Τρόπος εργασίας Αν αργότερα πρόκειται να πραγματοποιηθεί ο προσδιορισμός με αεριοχρωματογραφία του βουτυρικού οξέος, πρέπει να χρησιμοποιήσουμε ένα πρότυπο διάλυμα: Το πρότυπο διάλυμα I, όταν η περιεκτικότητα σε βουτυρικό οξύ υπερβαίνει το 1% και το πρότυπο διάλυμα II,  όταν η εν λόγω περιεκτικότητα είναι κατώτερη από 1%.  Αν πρόκειται να πραγματοποιηθεί ο προσδιορισμός της συνθέσεως των λιπαρών οξέων με αεριοχρωματογραφία, δεν είναι αναγκαίο να χρησιμοποιήσουμε πρότυπο διάλυμα.  Προετοιμάζουμε το δείγμα σύμφωνα με το μέρος I: "Προετοιμασία των δειγμάτων". Σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα των 20 ml με εσμυρισμένο πώμα, ζυγίζουμε 1 g του προπαρασκευασμένου δείγματος, με ακρίβεια 1 mg. Προσθέτουμε με μία βαθμονομημένη προχοΐδα 10 ml  επτανίου και με ένα βαθμονομημένο σιφώνιο 1,0 ml του αντιστοίχου προτύπου διαλύματος.  Σημείωση:  Αν δεν ζητείται ο προσδιορισμός του βουτυρικού οξέος, δεν είναι αναγκαίο η ακρίβεια της ζυγίσεως να είναι 1 mg και δεν χρειάζεται να προσθέσουμε πρότυπο διάλυμα.  Προσθέτουμε 0,5 ml μεθανολικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου περίπου 2 N και αναμιγνύουμε δια αναταράξεως το περιεχόμενο του δοκιμαστικού σωλήνα μέχρις ότου το διάλυμα γίνει διαυγές. Αυτό χρειάζεται περίπου 20 δευτερόλεπτα. Το διαυγές διάλυμα  γίνεται σχεδόν αμέσως εκ νέου θολό λόγω του αποχωρισμού της γλυκερίνης. Η γλυκερίνη κατασταλάζει.  Διαχωρίζουμε την υπερκείμενη στιβάδα που περιέχει τους μεθυλεστέρες.  5. ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ 1. Όταν τα ασαπωνοποίητα μέρη παρεμποδίζουν την ανάλυση, αραιώνουμε το διάλυμα που λάβαμε μετά τη σαπωνοποίηση και απομακρύνουμε τα ασαπωνοποίητα μέρη εκχυλίζοντας, υπό τις συνήθεις συνθήκες, με διαιθυλεθέρα, εξάνιο ή πετρελαϊκό αιθέρα. Οξινίζουμε το  σαπωνούχο διάλυμα και διαχωρίζουμε τα λιπαρά οξέα. Παρασκευάζουμε τους μεθυλεστέρες των οξέων αυτών σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται στα σημεία 3.1.4.2 ή 3.2.2.5.  2. Κατά την αεριοχρωματογραφία των μεθυλεστέρων είναι δυνατόν ορισμένα αντιδραστήρια, κυρίως τα μεθανολικά διαλύματα τριφθοριούχου βορίου, να προκαλέσουν την εμφάνιση παρασιτικών κορυφών (στην περιοχή C 20-C 22 στην περίπτωση μεθανολικών διαλυμάτων  τριφθοριούχου βορίου). Συνεπώς πρέπει να ελέγχουμε κάθε νέα παρτίδα αντιδραστηρίων. Για τον έλεγχο παρασκευάζουμε μεθυλεστέρες από καθαρό ελαϊκό οξύ, που αμέσως υποβάλλουμε σε ανάλυση με αεριοχρωματογραφία. Αν εμφανισθεί παρασιτική κορυφή, το  αντιδραστήριο που χρησιμοποιήσαμε απορρίπτεται. Κατά την αεριοχρωματογραφία, τα διάφορα αντιδραστήρια δεν πρέπει να δίνουν κορυφές που συμβάλλουν με αυτές των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων.  3. Αν δεν είναι δυνατό να αποφύγουμε την παρασκευή μεθανολικού διαλύματος τριφθοριούχου βορίου από το αέριο τριφθοριούχο βόριο, εργαζόμαστε ως εξής: Ζυγίζουμε μια φιάλη των 2 l που περιέχει 1 l μεθανόλη και στη συνέχεια την ψύχουμε σε λουτρό πάγου. Ενώ  η φιάλη ευρίσκεται εντός του λουτρού, διοχετεύουμε το τριφθοριούχο βόριο, που λαμβάνουμε από μία φιάλη πιέσεως, μέσω ενός γυάλινου σωλήνα, στη μεθανόλη, μέχρι να απορροφηθούν 125 g. Η εργασία αυτή γίνεται στον απαγωγό. Διοχετεύουμε BF3 στον γυάλινο  σωλήνα πριν τον βυθίσουμε στην μεθανόλη και μέχρι να τον αποσύρουμε, προκειμένου να παρεμποδίσουμε την εισροή υγρού στο σύστημα μειώσεως της πιέσεως του αερίου. Το αέριο δεν πρέπει, καθώς εξέρχεται με μεγάλη ταχύτητα από τη φιάλη, να αναδίδει λευκούς  ατμούς. Το αντιδραστήριο είναι σταθερό επί δύο έτη.  4. Αντί του επτανίου (μίγμα καθαρών ισομερών του επτανίου, ελεγμένων με αεριοχρωματογραφία) είναι δυνατό να χρησιμοποιήσουμε εξάνιο, εφ' όσον δεν υπάρχουν λιπαρά οξέα με 20 ή περισσότερα άτομα άνθρακα.  5. Σε περίπτωση που δε διαθέτουμε την προβλεπόμενη ποσότητα δείγματος, είναι δυνατό να χρησιμοποιήσουμε ποσότητα μέχρι 10 mg ή και μικρότερη, υπό την προϋπόθεση ότι θα ελαττώσουμε ανάλογα την ποσότητα των αντιδραστηρίων και τη χωρητικότητα των οργάνων.   6. Οι μεθυλεστέρες πρέπει να αναλύονται όσο το δυνατόν ταχύτερα. Εν ανάγκη, το επτανικό διάλυμα που περιέχει τους μεθυλεστέρες είναι δυνατό να φυλάσσεται σε περιβάλλον αδρανούς αερίου, εντός ψυγείου. Σε περίπτωση αποθηκεύσεως μεγάλης διαρκείας,  συνιστάται η προστασία των μεθυλεστέρων κατά της αυτοξειδώσεως με τη βοήθεια ενός αντιοξειδωτικού μέσου, που προστίθεται στο διάλυμα, σε πυκνότητα τέτοια, που να μην παρεμποδίζει τις μεταγενέστερες αναλύσεις, π.χ. 0,005% (m/v) BHT (2-6-δι-tert-βουτυλο -  4 -μεθυλοφαινόλη). Οι ξηροί μεθυλεστέρες είναι δυνατό να φυλάσσονται, σε περιβάλλον αδρανούς αερίου, σε ψυγείο, εν ανάγκη επί 24 ώρες ή και περισσότερο, εφ' όσον η φύλαξή τους σε καταψύκτη γίνεται σε σωλήνες σφραγισμένους υπό κενό.  7. Υπάρχει κίνδυνος να απωλέσουμε μέρος των περισσότερο πτητικών μεθυλεστέρων, στην περίπτωση που η απομάκρυνση του διαλύτου παρατείνεται επί πολύ ή όταν το ρεύμα αζώτου είναι πολύ ισχυρό.  Στη φασματοφωτομετρία υπερύθρου, η απομάκρυνση του διαλύτη πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πλήρης. Στην αεριοχρωματογραφία, συνιστάται η μη απομάκρυνση του διαλύτη.  8. Στην περίπτωση ελαίων τύπου κικινελαίου, η διαύγεια δεν είναι κριτήριο για την αντίδραση.  III. ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΕΘΥΛΕΣΤΕΡΩΝ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σκοπός της μεθόδου είναι η διατύπωση γενικών οδηγιών για τον αεριοχρωματογραφικό προσδιορισμό της ποιοτικής και ποσοτικής συνθέσεως μιγμάτων μεθυλεστέρων λιπαρών οξέων παρασκευαζομένων σύμφωνα με το μέρος II.  Πολυμερισμένα λιπαρά οξέα δεν είναι δυνατό να αναλυθούν με τη μέθοδο αυτή.  Οι καθοριζόμενες προδιαγραφές αναφέρονται στους συνήθεις αεριοχρωματογράφους με πληρούμενη στήλη και ανιχνευτή ιονισμού φλογός (σημείωση 1).  2. ΟΡΓΑΝΑ 2.1. Αεριοχρωματογράφος Κατάλληλη είναι κάθε συσκευή με την αποδοτικότητα και τη διακριτική ικανότητα, που ορίζονται στο σημείο 4.1.2.  2.1.1. Διάταξη εγχύσεως Η διάταξη εγχύσεως πρέπει να έχει τον μικρότερο δυνατό μη ωφέλιμο όγκο. Αν είναι δυνατό, πρέπει να διατηρείται σε θερμοκρασία κατά 25 εώς 50oC ανώτερη από τη θερμοκρασία της στήλης.  2.1.2. Κλίβανος Ο κλίβανος πρέπει να είναι σε θέση να θερμαίνει τις στήλες τουλάχιστον μέχρι τους 220oC και να διατηρεί την επιθυμητή θερμοκρασία με απόκλιση +- 1oC.  Στην περίπτωση που χρησιμοποιούμε προγραμματισμό, συνιστάται η επιλογή συσκευής με διπλή στήλη.  2.1.3. Στήλη 2.1.3.1. Σωλήνας Ο σωλήνας πρέπει να κατασκευάζεται από υλικό αδρανές ως προς την ουσία που πρόκειται να αναλυθεί: από γυαλί ή, αν δεν είναι δυνατό, από ανοξείδωτο χάλυβα (σημείωση 2). Μήκος: από 1 ως 3 m. Στήλη μικρού σχετικά μήκους χρησιμοποιείται σε περίπτωση  παρουσίας λιπαρών οξέων με μακρά άλυσο (> C20).  Για τον προσδιορισμό οξέων με C4 και C6 συνιστάται η χρησιμοποίηση στήλης μήκους 2m.  Εσωτερική διάμετρος: από 2 έως 4 mm.  2.1.3.2. Πλήρωση Υπόστρωμα: γη διατόμων, που έχει υποστεί πλύση με οξέα και κατεργασία προς υποκατάσταση των ατόμων άνθρακος από άτομα πυριτίου ή άλλο κατάλληλο υπόστρωμα με περιορισμένη διακύμανση του μεγέθους των κόκκων (25 μm στην περιοχή από 125 ως 200 μm). Το μέσο  μέγεθος των κόκκων εξαρτάται από την εσωτερική διάμετρο και το μήκος της στήλης.  Στατική φάση: πολική φάση τύπου πολυεστέρος (π.χ. πολυηλεκτρική διαιθυλενογλυκόλη, πολυηλεκτρική βουτανοδιόλη, πολυαδιπική αιθυλενογλυκόλη κλπ.) ή κάθε άλλη φάση, που πληροί τις ακόλουθες απαιτήσεις. (π.χ. κυανοσιλικόνες κλπ.). Βαθμός διαποτίσεως μεταξύ  5 και 20%. Σε ορισμένες περιπτώσεις διαχωρισμού είναι δυνατόν να χρησιμοποιήσουμε μη πολικές φάσεις.  2.1.3.3. Προετοιμασία της στήλης Μετά την αποσύνδεση, εφ' όσον είναι δυνατή, της στήλης από τον ανιχνευτή, φέρουμε τον κλίβανο της συσκευής σε θερμοκρασία κατά 10oC ανώτερη από τη θερμοκρασία εργασίας και διατηρούμε την έτοιμη στήλη επί τουλάχιστον 16 ώρες, υπό ρεύμα αδρανούς αερίου,  20 60 ml/min στη θερμοκρασία αυτήν και στη συνέχεια επί δύο ώρες στους 195oC.  2.1.4. Ανιχνευτής Ο ανιχνευτής πρέπει, κατά προτίμηση, να δύναται να ρυθμίζεται σε θερμοκρασία υψηλότερη από τη θερμοκρασία της στήλης.  Οι ακόλουθες οδηγίες χρήσεως αναφέρονται στη χρησιμοποίηση ενός ανιχνευτή ιονισμού φλογός (σημείωση 1).  2.2. Σύριγγα Σύριγγα των 10 μl το πολύ, υποδιαιρημένη σε δέκατα μl.  2.3. Καταγραφέας Αν η καταγραφόμενη καμπύλη πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της συνθέσεως του αναλυόμενου δείγματος, ο καταγραφέας πρέπει να είναι ηλεκτρονική διάταξη μεγάλης ακρίβειας, συμβιβαστή προς τη χρησιμοποιούμενη συσκευή:  - ταχύτητα αποκρίσεως κατώτερη από 1,5 sec, κατά προτίμηση 1 sec (ταχύτητα αποκρίσεως είναι ο χρόνος που απαιτείται, ώστε η γραφίδα του καταγραφέα να διατρέξει το διάστημα από 0 ως 90% του πλάτους ενός σήματος που εισάγεται στιγμιαία).  - πλάτος του χαρτιού: τουλάχιστον 25 cm.  - ταχύτητα εκτυλίξεως χαρτιού 25 ως 150 cm/h.  2.4. Ολοκληρωτής ή υπολογιστής (προαιρετικά).  Η χρησιμοποίηση ενός ηλεκτρονικού ολοκληρωτή ή υπολογιστή επιτρέπει τον ταχύ και ακριβή προσδιορισμό. Η διάταξη αυτή πρέπει να είναι γραμμικής αποκρίσεως, επαρκούς ευαισθησίας και ικανοποιητικής ικανότητος διορθώσεως της αποκλίσεως της γραμμής βάσεως.  3. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ - αέριος φορέας: αδρανές αέριο (άζωτο, ήλιο, αργό κλπ.) πολύ καλά ξηραμμένο και με περιεκτικότητα σε οξυγόνο μικρότερη από 10 ppm- - βοηθητικά αέρια: υδρογόνο, καθαρότητος τουλάχιστον 99,9%, απαλλαγμένο από οργανικές ουσίες, ατμοσφαιρικός αέρας ή οξυγόνο απαλλαγμένο απο οργανικές ουσίες-  πρότυπο μίγμα: μίγμα μεθυλεστέρων ή μεθυλεστέρας ελαίου γνωστής συνθέσεως, κατά το δυνατό παρεμφερούς προς το λίπος που πρόκειται να αναλυθεί.  4. ΤΡΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 4.1. Ρύθμιση της συσκευής 4.1.1. Καθορισμός των ευνοϊκοτέρων συνθηκών εργασίας Κατά την επιλογή των συνθηκών εργασίας πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι ακόλουθες μεταβλητές:  μήκος και διάμετρος της στήλης- είδος και ποιότητα της σταθερής φάσεως- θερμοκρασία της στήλης- παροχή του αερίου φορέα- επιθυμητή διακριτική ικανότητα- ποσότητα του δείγματος- διάρκεια της αναλύσεως- Η ποσότητα του δείγματος πρέπει να επιλέγεται κατά τρόπον ώστε η απόκριση του ανιχνευτή και του ηλεκτρομέτρου να είναι γραμμική. Γενικά, οι ακόλουθες τιμές οδηγούν στα επιθυμητά αποτελέσματα και συγκεκριμένα: αριθμός θεωρητικών δακτυλίων τουλάχιστον 2  000 στην περίπτωση του στεατικού μεθυλίου και έκλουση της εν λόγω ουσίας σε 15 min περίπου.   "" ID="1">2 mm> ID="2">15-25 ml/min"> ID="1">3 mm> ID="2">20-40 ml/min"> ID="1">4 mm> ID="2">40-60 ml/min">  "" ID="1">5%> ID="2">175oC"> ID="1">10%> ID="2">180oC"> ID="1">15%> ID="2">185oC"> ID="1">20%> ID="2">185oC"> Εφ' όσον η συσκευή το επιτρέπει, η διάταξη εγχύσεως πρέπει να ευρίσκεται σε θερμοκρασία περίπου 200oC και ο ανιχνευτής στην ίδια ή σε υψηλότερη θερμοκρασία από τη θερμοκρασία της στήλης.  Η παροχή υδρογόνου στον ανιχνευτή ιονισμού φλογός είναι γενικά ίση με το ήμισυ της παροχής του αερίου φορέα. Η παροχή οξυγόνου κατά 5 έως 10 φορές μεγαλύτερη από την παροχή υδρογόνου.  4.1.2. Καθορισμός της αποδοτικότητος και της διακριτικής ικανότητος Αναλύουμε ένα μίγμα στεατικού και ελαϊκού μεθυλίου με την αυτή περίπου αναλογία (π.χ. μεθυλεστέρες του βουτύρου κακάο). Επιλέγουμε την ποσότητα του δείγματος, τη θερμοκρασία της στήλης και την παροχή του φορέα, κατά τρόπο ώστε το μέγιστο της κορυφής του  στεατικού μεθυλίου να καταγράφεται περίπου 15 λεπτά μετά από την κορυφή του διαλύτη και να αντιστοιχεί περίπου στα τρία τέταρτα της ολικής κλίμακας. Ο αριθμός των θεωρητικών δακτυλίων (αποδοτικότητα) υπολογίζεται από τον τύπο: n = 16 ()2 και η διακριτική ικανότητα από τον τύπο:  R =  όπου:  dR1 η απόσταση συγκρατήσεως σε mm, από την εισαγωγή του δείγματος ως το μέγιστο της κορυφής του στεατικού μεθυλίου,  ω1 και ω2 το εύρος σε mm των κορυφών του στεατικού και του ελαϊκού μεθυλίου, μετρούμενο μεταξύ των σημείων τομής των εφαπτομένων στα σημεία καμπής των κορυφών και της γραμμής βάσεως.  Δ Η απόσταση μεταξύ των σχετικών μεγίστων των κορυφών του στεατικού και ελαϊκού μεθυλίου.   Οι συνθήκες εργασίας πρέπει να είναι τέτοιες, ώστε να επιτυγχάνονται τουλάχιστον 2 000 θεωρητικοί δακτύλιοι και διακριτική ικανότητα 1,25 στην περίπτωση του στεατικού μεθυλίου. Πρέπει επίσης να είναι τέτοιες, ώστε το λινολενικό οξύ (C18:3) να  διαχωρίζεται από το αραχιδικό (C20:0) και το γαδελαϊκό οξύ (C20:1).  4.2. Ανάλυση Το δείγμα αποτελείται από 0,1 ως 2 j l του επτανικού διαλύματος, που παρασκευάζεται σύμφωνα με το μέρος II. Στην περίπτωση εστέρων, απαλλαγμένων από το διαλυτικό μέσο, παρασκευάζουμε από αυτούς ένα επτανικό διάλυμα 10% και ενέουμε 0,1 ως 1 μl.  Για τον προσδιορισμό των συστατικών που περιέχονται υπό μορφή ιχνών, είναι δυνατό να αυξήσουμε την ποσότητα του δείγματος (μέχρι το δεκαπλάσιο). Στις συνήθεις περιπτώσεις ισχύουν οι συνθήκες εργασίας που περιγράφονται στο σημείο 4.1.1. Είναι ωστόσο  δυνατό να εργασθούμε σε χαμηλότερες θερμοκρασίες στήλης, στην περίπτωση που πρέπει να προσδιορίσουμε λιπαρά οξέα κατώτερα του C12 ή σε ανώτερη θερμοκρασία στην περίπτωση που πρέπει να προσδιορίσουμε λιπαρά οξέα ανώτερα από C20.  Ενδεχομένως στις δύο αυτές περιπτώσεις, είναι δυνατό να εργασθούμε με προγραμματισμό της θερμοκρασίας. Π.χ. αν το δείγμα περιέχει μεθυλεστέρες λιπαρών οξέων με λιγότερα από 12 άτομα άνθρακος, εγχύουμε το δείγμα σε θερμοκρασία 100oC (ή σε θερμοκρασία 50  60oC, αν περιέχεται βουτυρικό οξύ) και αμέσως μετά συνδέουμε το πρόγραμμα που ρυθμίζει την άνοδο της θερμοκρασίας κατά 4 8oC/min μέχρι να επιτευχθεί η βέλτιστη θερμοκρασία.  Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι δύο μέθοδοι είναι δυνατό να συνδυαστούν: μετά την περάτωση του προγράμματος ρυθμίσεως της θερμοκρασίας, συνεχίζουμε την έκλουση υπό σταθερή θερμοκρασία, μέχρις εκλούσεως όλων των συστατικών. Στην περίπτωση που η συσκευή δεν  επιδέχεται προγραμματισμό της θερμοκρασίας, εργαζόμαστε σε δύο σταθερές θερμοκρασίες μεταξύ των 100 και των 195oC.  Εν ανάγκη, συνιστάται η διεξαγωγή της αναλύσεως επί δύο στατικών φάσεων, διαφορετικής πολικότητος, ώστε να είναι δυνατή η επαλήθευση της απουσίας καλυμμένων κορυφών (π.χ. στην περίπτωση ιχθυελαίων ή στην περίπτωση ταυτόχρονης παρουσίας συζυγών (C18:3  και C20:0 ή C18:3 και C18:2) 5. ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 5.1. Ποιοτική ανάλυση Αναλύουμε ένα πρότυπο μίγμα γνωστής συνθέσεως υπό τις συνθήκες αναλύσεως του δείγματος και προσδιορίζουμε τις αποστάσεις (ή τους χρόνους) συγκρατήσεως για τα λιπαρά οξέα, που περιέχονται σε αυτό. Φέρουμε τις καμπύλες εκφράζοντας το λογάριθμο των  αποστάσεων (ή των χρόνων) συγκρατήσεως συναρτήσει του αριθμού των ατόμων άνθρακος. Υπό ισόθερμες συνθήκες και για εστέρες με ευθύγραμμη άλυσο και τον ίδιο βαθμό ακορεστότητος, οι γραφικές παραστάσεις σε ημιλογαριθμικό χαρτί πρέπει να είναι ευθείες,  σχεδόν παράλληλες.  Κατά την ανάλυση των δειγμάτων, η αναγνώριση των κορυφών γίνεται βάσει αυτών των ευθειών, εν ανάγκη με παρέκταση.  Οι συνθήκες εργασίας υπό τις οποίες είναι δυνατό να εμφανισθούν "καλυμμένες κορυφές", δηλ. οι συνθήκες υπό τις οποίες η διάκριση μεταξύ δύο συστατικών δεν είναι δυνατή, πρέπει να αποφεύγονται.  5.2. Ποσοτική ανάλυση 5.2.1. Προσδιορισμός της συνθέσεως Πρέπει (εκτός από εξαιρετικές περιπτώσεις) να χρησιμοποιούμε τη μέθοδο εσωτερικής ποσοστώσεως, δηλ. υποθέτουμε ότι στο χρωματογράφημα εμφανίζονται όλα τα συστατικά του δείγματος και ότι συνεπώς το ολικό εμβαδόν των κορυφών αντιπροσωπεύει το 100% των  συστατικών (πλήρης έκλουση).  Αν η συσκευή διαθέτει ολοκληρωτή, χρησιμοποιούμε τις τιμές που παρέχει ο ολοκληρωτής. Στην αντίθετη περίπτωση, υπολογίζουμε το εμβαδόν των επί μέρους κορυφών με τριγωνισμό, πολλαπλασιάζοντας το ύψος της κορυφής επί το εύρος της στο ήμισυ του ύψους και,  αν χρειάζεται, λαμβάνοντας υπόψη τα διαφορετικά επίπεδα ευαισθησίας του ενισχυτή που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της καταγραφής.  5.2.1.1. Γενικές περιπτώσεις Όταν δεν περιέχονται συστατικά κατώτερα από C8 υπολογίζουμε την περιεκτικότητα ενός συστατικού, εκφραζόμενη σε ποσοστό επί τοις εκατό των μεθυλεστέρων, προσδιορίζοντας το ποσοστό επί τοις εκατό που αντιστοιχεί στο λόγο του εμβαδού της εξεταζόμενης  κορυφής προς το ολικό εμβαδόν του συνόλου των κορυφών.  % (m/m) της ενώσεως εκφραζόμενης σε μεθυλεστέρες i =  x 100 όπου Ai = εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στην ένωση i ΣΑi = ολικό εμβαδόν του συνόλου των κορυφών 5.2.1.2. Χρησιμοποίηση συντελεστών διορθώσεως Σε ορισμένες περιπτώσεις, ιδίως παρουσία οξέων κατωτέρων από C8 ή οξέων με δευτεροταγείς ομάδες καθώς και όταν χρησιμοποιούμε ανιχνευτές θερμικής αγωγιμότητος, πρέπει κατά τη μετατροπή των ποσοστών εμβαδού των κορυφών σε ποσοστά βάρους των συστατικών,  να λαμβάνουμε υπόψη συντελεστές διορθώσεως.  Οι συντελεστές διορθώσεως καθορίζονται με τη βοήθεια χρωματογραφήματος, που λαμβάνεται από πρότυπο μίγμα μεθυλεστέρων επακριβώς γνωστής συνθέσεως και υπό τις συνθήκες υπό τις οποίες πραγματοποιείται η ανάλυση του δείγματος.  Για το πρότυπο μίγμα:  % (m/m) της ενώσεως i =  x 100 Bi = βάρος της ενώσεως i στο πρότυπο μίγμα.  ΣΒi = ολικό βάρος των διαφόρων συστατικών του προτύπου μίγματος.  Το χρωματογράφημα του προτύπου μίγματος μιας επιτρέπει να υπολογίσουμε:  %(εμβαδόν/εμβαδόν) της ενώσεως i = x 100 Ci = εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στην ένωση i,  ΣCi= ολικό εμβαδόν του συνόλου των κορυφών,  και συνεπώς:  συντελεστής διορθώσεως Ki = Οι συντελεστές διορθώσεως ανάγονται εν γένει στο συντελεστή διορθώσεως K16=1, οπότε οι σχετικοί συντελεστές διορθώσεως είναι:  Ki = Η περιεκτικότητα του δείγματος σε επί μέρους συστατικά δίδεται σε % (m/m) της ενώσεως i εκφρασμένη σε μεθυλεστέρες: i =x 100 5.2.1.3. Χρησιμοποίηση ενός εσωτερικού προτύπου Σε ορισμένες περιπτώσεις (ιδίως κατά τον προσδιορισμό οξέων C4 και C6 καθώς και κατά τον προσδιορισμό οξέων στις περιπτώσεις που δεν εκλούονται όλα τα λιπαρά οξέα) πρέπει να χρησιμοποιούμε ένα εσωτερικό πρότυπο C5 και C15 ή C17) και συνεπώς πρέπει να  καθορίζουμε τον συντελεστή διορθώσεως του εσωτερικού προτύπου:  % (mm) της ενώσεως i =  x 100 εκφρασμένη σε μεθυλεστέρες όπου:  ms = βάρος του εσωτερικού προτύπου σε mg- m= βάρος του δείγματος σε mg- Ks = συντελεστής διορθώσεως του εσωτερικού προτύπου As = εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στο εσωτερικό πρότυπο- AiAi= εμβαδόν της κορυφής που αντιστοιχεί στην ένωση i.  5.2.2. Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα δίδονται με:  3 σημαντικά ψηφία στις περιπτώσεις τιμών ανώτερων από 10%- 2 σημαντικά ψηφία στις περιπτώσεις τιμών από 1 ως 10%- 1 σημαντικό ψηφίο στις περιπτώσεις τιμών κατωτέρων από 1%- δηλ. σε κάθε περίπτωση με ένα δεκαδικό ψηφίο.  5.2.3. Επαναληψιμότητα Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων δύο αναλύσεων που πραγματοποιούνται την ίδια ημέρα, με την ίδια συσκευή, από το ίδιο πρόσωπο, επί των ιδίων εστέρων και για συστατικά που περιέχονται σε ποσοστό μεγαλύτερο από 5%, δεν πρέπει να υπερβαίνει το 3% όταν  εκφράζεται ως σχετική απόκλιση επί της λαμβανομένης τιμής και το 1% όταν εκφράζεται ως απόλυτη διαφορά. Για τα συστατικά που περιέχονται σε ποσοστό μικρότερο από 5%, η επαναληψιμότητα, εκφραζόμενη ως σχετική απόκλιση καθίσταται με ταχύ ρυθμό, λιγότερο  καλή, όσο ελαττώνεται η περιεκτικότητα.  5.2.4. Αναπαραγωγιμότητα- Η διαφορά μεταξύ των αποτελεσμάτων, που λαμβάνονται από δύο διαφορετικά εργαστήρια, για συστατικά που περιέχονται σε ποσοστό μεγαλύτερο από 5%, δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10%, όταν εκφράζεται ως σχετική απόκλιση επί της λαμβανομένης τιμής και το 3%,  όταν εκφράζεται ως απόλυτη διαφορά.  6. ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ 1. Είναι δυνατό να χρησιμοποιήσουμε συσκευή αεριοχρωματογραφίας με ανιχνευτή θερμικής αγωγιμότητος. Οι περιγραφόμενες συνθήκες πρέπει τότε να τροποποιηθούν ως εξής:  Στήλη: μήκος 2 ως 4 m, εσωτερική διάμετρος 4 mm- Υπόστρωμα: μέγεθος κόκκων μεταξύ 160 και 200 μm- Βαθμός διαποτίσεως: 15 ως 25%- Αέριος φορέας: ήλιο ή, ελλείψει ηλίου, υδρογόνο με περιεκτικότητα σε οξυγόνο, όσο το δυνατό χαμηλότερη- δεν χρειάζονται βοηθητικά αέρια- Θερμοκρασία της στήλης: από 150 ως 200oC.  Παροχή του αερίου φορέα: γενικά από 60 ως 80 ml/min Εγγυόμενες ποσότητες: γενικά από 0,5 ως 2μl Κατά την ποσοτική ανάλυση πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι συντελεστές διορθώσεως, που περιγράφονται στο σημείο 5.2.1.2.  2. Όταν περιέχονται πολυακόρεστα συστατικά με περισσότερους από 3 διπλούς δεσμούς, η στήλη από ανοξείδωτο χάλυβα είναι δυνατό να προκαλέσει την αποικοδόμησή τους.