CELEX: 31990R2676
Language: es
Date: 1990-09-17 00:00:00
Title: Reglamento (CEE) nº 2676/90 de la Comisión, de 17 de septiembre de 1990, por el que se determinan los métodos de análisis comunitarios aplicables en el sector del vino

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31990R2676

Reglamento (CEE) nº 2676/90 de la Comisión, de 17 de septiembre de 1990, por el que se determinan los métodos de análisis comunitarios aplicables en el sector del vino  

Diario Oficial n° L 272 de 03/10/1990 p. 0001 - 0192 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 34 p. 0005  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 34 p. 0005 

REGLAMENTO  (CEE)  No  2676/90  DE  LA  COMISIÓN de 17 de septiembre de 1990 por el que se determinan los métodos de análisis comunitarios aplicables en el sector del vino LA  COMISIÓN  DE  LAS  COMUNIDADES  EUROPEAS,   Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea,   Visto el Reglamento (CEE) no 822/87 del Consejo, de 16 de marzo de 1987, por el que se establece la organización común del mercado vitivinícola (1), modificado por el Reglamento (CEE) no 388/90 (2), y, en particular, su artículo 74,   Considerando que el apartado 1 del artículo 74 del Reglamento (CEE) no 822/87 dispone la adopción de métodos de análisis que permitan determinar la composición de los productos mencionados en el artículo 1 de este Reglamento y de las normas que permitan  establecer si tales productos han sido sometidos a tratamientos que infrijan las prácticas enológicas autorizadas;   Considerando que, si bien la Comunidad no ha establecido todavía los límites, en cifras, de los elementos presentes característicos de la utilización de determinadas prácticas enológicas, ni las tablas para la comparación de los datos analíticos,  procede autorizar a los Estados miembros a determinar los límites;   Considerando que el apartado 1 del artículo 13 del Reglamento (CEE) n o 822/87 prevé un examen analítico que determine, como mínimo, los valores de los elementos característicos del vcprd de que se trate, que figuren entre los enumerados en el Anexo de  este Reglamento;   Considerando que, para controlar las indicaciones recogidas en los documentos relativos a los productos de que se trate, es necesario establecer métodos de análisis uniformes que garanticen la obtención de datos precisos y comparables; que, en  consecuencia, tales métodos deben ser obligatorios para cualquier transacción comercial y cualquier operación de control; que, habida cuenta de las posibilidades limitadas del comercio, es conveniente admitir un número restringido de procedimientos  usuales que permitan una determinación rápida y suficientemente segura de los elementos investigados;   Considerando que es pertinente seleccionar, en la medida de lo posible, aquellos métodos que gocen de reconocimiento general, como los desarrollados en el marco del Convenio internacional de 1954 para la unificación de los métodos de análisis y  evaluación de vinos, publicados por la Oficina Internacional de la Viña y el Vino en la Recopilación de métodos internacionales de análisis de vinos;   Considerando que los métodos de análisis comunitarios aplicables en el sector del vino han sido establecidos por el Reglamento (CEE) no 1108/82 de la Comisión (3); que el progreso científico ha hecho necesario sustituir determinados métodos por otros  más adecuados, modificar algunos e introducir otros nuevos, en particular los que desde entonces han sido aprobados por la Oficina Internacional de la Viña y el Vino; que por razón del gran número y complejidad de dichas adaptaciones, es conveniente  agrupar todos los análisis en un nuevo reglamento y derogar el Reglamento (CEE) no 1108/82;   Considerando que, para garantizar que los resultados obtenidos en aplicación de los métodos de análisis mencionados en el artículo 74 del Reglamento (CEE) no 822/87 son comparables, es conveniente atenerse, respecto a la repetibilidad y  reproductibilidad de esos resultados, a las definiciones de la Oficina Internacional de la Viña y el Vino;   Considerando que, a fin de tener en cuenta el progreso científico, por un lado, y el material técnico de los laboratorios oficiales, por otro, y para que el trabajo de estos laboratorios resulte más eficaz y rentable, procede permitir la aplicación de  métodos de análisis automatizados en determinadas condiciones; que es importante precisar que en caso de litigio los métodos automatizados no podrán reemplazar a los de referencia ni a los usuales;   Considerando que los resultados de la medición de la densidad mediante el método automatizado basado en el principio de un resonador de flexión son, en cuanto a su exactitud, repetibilidad y reproductibilidad, iguales por lo menos a los resultados  obtenidos con los métodos que figuran en el punto 1 del Anexo del presente Reglamento, para medir la masa volúmica o la densidad relativa; que, en virtud de lo dispuesto en el apartado 3 del artículo 74 del Reglamento (CEE) no 822/87, resulta, pues,  indicado considerar el método automatizado como equivalente a los que figuran en el Anexo del presente Reglamento;   Considerando que el procedimiento descrito en el capítulo 25 en el punto 2.2.3.3.2 del Anexo del presente Reglamento para analizar el contenido en dióxido de azufre total de los vinos y de los mostos con un contenido estimado de menos de 50 mg/l produce  una mejor extracción de esta sustancia que el procedimiento descrito en el capítulo 13, punto 13.4 del Anexo del Reglamento (CEE) no 1108/82; que da lugar a resultado más elevado en dióxido de azufre total de los productos analizados que pueden  sobrepasar, especialmente en el caso de ciertos zumos de uvas; que a fin de evitar dificultades para la circulación de los zumos de fruta ya elaborados en el momento de la entrada en vigor del presente Reglamento y en espera que los procedimientos de  elaboración se adaptasen para conseguir una desulfitación más completa de los mostos de uva apagados, es necesario permitir durante un período transitorio que el modo operatorio descrito en el Reglamento antes mencionado se utilice todavía;   Considerando que las medidas previstas en el presente Reglamento se ajustan al dictamen del Comité de gestión del vino,   HA  ADOPTADO  EL  PRESENTE  REGLAMENTO:     Artículo 1   1. Figuran en el Anexo del presente Reglamento los métodos de análisis comunitarios aplicables en el sector del vino que permiten, en las transacciones comerciales y en cualquier operación de control:   - establecer la composición de los productos contemplados en el artículo 1 del Reglamento (CEE) no 822/87,   - comprobar si tales productos han sido sometidos a tratamientos que infrinjan prácticas enológicas autorizadas.   2. Cuando se establezcan métodos de referencia y métodos usuales, los resultados obtenidos con los primeros serán los que prevalezcan.   Artículo 2   Para la aplicación del presente Reglamento:   a) La repetibilidad representa el valor por debajo del cual está situado, con una probabilidad especificada, el valor absoluto de la diferencia de dos resultados individuales obtenidos a partir de medidas efectuadas en las mismas condiciones (mismo  operador, mismo aparato, mismo laboratorio y un corto intervalo de tiempo).   b) La reproductibilidad representa el valor por debajo del cual está situado, con una probabilidad especificada, el valor absoluto de la diferencia de dos resultados individuales obtenidos en condiciones diferentes (operadores diferentes, aparatos  diferentes y/o laboratorios diferentes, y/o épocas diferentes).   El término «resultado individual» es el valor obtenido cuando se aplica, una vez y por completo, el método de ensayo normalizado sobre una sola muestra.   En ausencia de indicación la probabilidad es del 95 %.   Artículo 3   1. Se admitirán métodos de análisis automatizados, bajo la responsabilidad del director de laboratorio, a condición de que la exactitud, la repetibilidad y la reproductibilidad de los resultados sean por lo menos equivalentes a las de los  obtenidos mediante los métodos de análisis que figuran en el Anexo.   En caso de litigio, los métodos que figuran en el Anexo no podrán ser sustituidos por los métodos automatizados.   2. El método automatizado para medir la densidad basado en el principio de un resonador de flexión se considerará como equivalente a los métodos que figuran en el punto 1 del Anexo del presente Reglamento.   Artículo 4   Cuando se haga referencia al agua para las soluciones, diluciones o lavados, se tratará de agua destilada o desmineralizada de pureza al menos equivalente. Todos los productos deberán ser de calidad analítica, salvo que se especifique otra  cosa.   Artículo 5   Queda derogado el Reglamento (CEE) no 1108/82.   No obstante, el apartado 4 del artículo 1 del Reglamento antes citado es aplicable hasta el 31 de diciembre de 1990.   Artículo 6   El presente Reglamento entrará en vigor el día de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.  Será aplicable a partir del 1 de octubre de 1990.   El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.   Hecho en Bruselas, el 17 de septiembre de 1990.   Por la ComisiónRAY MAC SHARRYMiembro de la Comisión      (1)DO no L 84 de 27. 3. 1987, p. 1. (2)DO no L 42 de 16. 2. 1990, p. 9. (3)DO no L 133 de 14. 5. 1982, p. 1.    ANEXO  1. MASA  VOLÚMICA  A  20 °C  Y  DENSIDAD  RELATIVA  A  20 °C 1. DEFINICIONES   La masa volúmica es el cociente de la masa de un determinado volumen de vino o mosto a 20 °C por ese volumen. Se expresa en gramos por mililitro y su símbolo es r2 20 °C.    La densidad relativa a 20 °C o densidad 20 °C/20 °C es la relación, expresada en número decimal, entre la masa de un cierto volumen de vino o de mosto a 20 °C y la masa del mismo volumen de agua a la misma temperatura. Su símbolo es d20 °C20 °C.2.  FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS   La masa volúmica y la densidad relativa a 20 °C se determinan en la muestra de ensayo:    - bien por picnometría: método de referencia,    - bien por areometría o densimetría con balanza hidrostática: métodos usuales.    Nota:En determinaciones muy precisas, debe corregirse la acción del dióxido de azufre sobre la masa volúmica:    r 20 °C = r2 20 °C   0.006 · S,r 20 °C = masa volúmica corregida,r2 20 °C = masa volúmica observada,S = dióxido de azufre total en g/l.3. TRATAMIENTO  PREVIO  DE  LA  MUESTRA   Si el vino o el mosto contiene cantidades importantes de dióxido de carbono, eliminar la mayor cantidad posible agitando 250 ml de vino en un enienmeyer 1 000 ml o filtrando a baja presión sobre 2 g de algodón colocado en un soporte.4. MÉTODO  DE   REFERENCIA  4.1. MaterialMaterial corriente de laboratorio, y en particular:   4.1.1. Picnómetro (1), de vidrio pyrex, con una capacidad de 100 ml aproximadamente y termómetro móvil con esmerilado, graduado en décimas de grado, de 10 ° a 30 °C. Este termómetro debe estar contrastado (figura 1).     FIGURA  1  Picnómetro y su frasco tara     Este picnómetro consta de un tubo lateral de 25 mm de longitud y 1 mm, como máximo, de diámetro interior, terminado en una parte cónica esmerilada. El tubo lateral puede estar cubierto por un «tapón receptor» constituido por un tubo cónico esmerilado  terminado en una parte afilada. Dicho tapón sirve de cámara de dilatación.    Las dos partes esmeriladas del aparato deben estar realizadas con gran cuidado.   4.1.2. Frasco tara, del mismo volumen exterior (con una aproximación de 1 ml) que el picnómetro y de masa igual a la del picnómetro lleno de líquido de densidad 1,01 (solución al 2 % (m/v) de cloruro sódico).    Recipiente termostatado que se ajuste exactamente al cuerpo del picnómetro.   4.1.3. Balanza de dos platos de una capacidad de 300 g por lo menos y una sensibilidad de una décima de miligramo,obalanza monoplato de una capacidad de 200 g por lo menos y una sensibilidad de una décima de miligramo.4.2. Calibrado del picnómetro   El calibrado del picnómetro supone la determinación de las características siguientes:- la tara en vacío,- el volumen a 20 °C,- la masa del agua a 20 °C.4.2.1. Utilización de una balanza de dos platos   Poner el frasco tara en el plato izquierdo de la balanza y el picnómetro limpio, seco y con su «tapón receptor» en el plato derecho, equilibrar colocando al lado del picnómetro masas conocidas de p gramos.    Llenar con cuidado el picnómetro con agua destilada a temperatura ambiente y colocar el termómetro; secar cuidadosamente el picnómetro y colocarlo dentro del recipiente termostatado; agitar por inversión hasta que el termómetro señale una temperatura  constante. Enrasar exactamente hasta el borde superior del tubo lateral. Secar dicho tubo, colocar el tapón receptor; leer la temperatura t °C con cuidado y, en su caso, corregir la inexactitud de la escala del termómetro. Pesar el picnómetro lleno de  agua; se denominará p' a la masa en gramos com la que se consigue el equilibrio.    Cálculos (2)   Tara del picnómetro vacío:Tara en vacío = p + mm = masa de aire contenida en el picnómetrom = 0,0012 (p   p2)   Volumen a 20 °C:V20 °C = (p + m   p2) · FtFt = factor tomado de la tabla I para la temperatura t °CV20 °C debe conocerse con una aproximación de ± 0,001 ml.    Masa de agua a 20 °C:M20 °C = V20 °C · 0,9982030,998203 = masa volúmica del agua a 20 °C.  4.2.2. Utilización de una balanza monoplato   Determinar:- la masa del picnómetro limpio y seco: P,- la masa del picnómetro lleno de agua a t ° C: P1, siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1,- la masa del frasco tara To.    Cálculos  (3)   Tara del picnómetro vacío:Tara en vacío = P- mm = masa de aire contenida en el picnómetrom = 0,0012 (P1 - P)   Volumen a 20 ° C:V20 ° C = [P1 - (P - m)]. FtFt = factor tomado de la tabla I para la temperatura t ° CEl volumen a 20 ° C debe conocerse con una aproximación de ± 0,001 ml.    Masa de agua a 20 ° C:M20 ° C- V20 ° C · 0,9982030,998203 = masa volúmica del agua a 20 ° C.4.3. Procedimiento   4.3.1. Utilización de una balanza de dos platos   Pesar el picnómetro lleno de la muestra preparada para el ensayo (3) siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1. Sea p" la masa en gramos con la que se consigue el equilibrio a t ° C.    Masa del líquido contenido en el picnómetro = p + m- p".   Masa volúmica aparente a t ° C:   Calcular la masa volúmica a 20 ° C utilizando una de las tablas de corrección que figuran a continuación, en función de la naturaleza del líquido estudiado: vino seco (tabla II), mosto natural o concentrado (tabla III), vino dulce (tabla IV).    La densidad 20° C/ 20 ° C del vino se expresa dividiendo la masa volúmica a 20 ° C por 0,998203.4.3.2. Utilización de una balanza monoplato    Pesar el frasco tara; sea su masa T1Calcular dT = T1 - TOMasa del picnómetro vacío en el momento de la medida = P - m + dT   Pesar el picnómetro lleno de la muestra preparada para ensayo siguiendo las indicaciones que figuran en 4.2.1. Sea P2 su masa a t ° C.    Masa del líquido contenido en el picnómetro a t ° C = P2 - (P - m + dT)  Masa volúmica aparente a t ° C:   Calcular la masa volúmica a 20 ° C del líquido estudiado: vino seco, mosto natural o concentrado y vino dulce, tal como se indica en 4.3.1.   La densidad 20 ° C/20 ° C se obtiene dividiendo la masa volúmica a 20 ° C por 0,998203.   4.3.3. Repetibilidad en la masa volúmicaPara los vinos secos y semisecos: r = 0,00010Para los vinos dulces: r = 0,00018  4.3.4. Reproductibilidad en la masa volúmicaPara los vinos secos y semisecos: R = 0,00037Para los vinos dulces: R = 0,000455. Métodos usuales  5.1. Areometría  5.1.1. Aparatos  5.1.1.1. Areómetro   Los areómetros deben cumplir las prescripciones de la ISO en cuanto a sus dimensiones y graduación.    Deben tener un cuerpo cilíndrico y un tallo de sección circular de 3 mm de diámetro, como mínimo. Para los vinos secos, deben estar graduados de 0,983 a 1,003 en milésimas y 1/5 de milésima. Entre una milésima y la milésima siguiente debe haber, como  mínimo, 5 mm. Para medir la densidad de los vinos desalcoholizados, vinos dulces y mostos, se utilizará un juego de 5 areómetros graduados de 1,000 a 1,030; 1,030 a 1,060; 1,060 a 1,090; 1,090 a 1,120; 1,120 a 1,150. Estos aparatos deben estar graduados  en masas volúmicas a 20 ° C, en milésimas y medias milésimas, como mínimo, estando separada cada milésima de la siguiente por 3 mm por lo menos.    Estos areómetros deben estar graduados de forma que la lectura se efectúe en «la parte superior del menisco». La indicación de la graduación en masa volúmica a 20 ° C o en densidad relativa a 20 ° C y de la lectura en la «parte superior del menisco» se  indicará, bien sobre la escala graduada o bien con una banda de papel que irá en el interior del cuerpo cilíndrico.    Estos aparatos deben estar contrastados por un servicio oficial.   5.1.1.2. Termómetro contrastado, graduado de medio grado Celsius, como mínimo.   5.1.1.3. Probeta cilíndrica de 36 mm de diámetro interior y 320 mm de altura, mantenida verticalmente mediante un soporte con tornillos niveladores.5.1.2. Procedimiento  5.1.2.1.Técnica de una medida   Verter, en la probeta 5.1.1.3, 250 ml de muestra preparada para el ensayo (3), introducir el areómetro y el termómetro. Leer el termómetro un minuto después de haber agitado para obtener el equilibrio de temperatura. Retirar el termómetro y leer la  masa volúmica aparente a t ° C sobre el tallo del areómetro tras un minuto de reposo.     Corregir la acción de la temperatura sobre la masa volúmica aparente a t ° C mediante las tablas que se aplican en los casos de vinos secos (tabla V), mostos (tabla VI) y vinos que contienen azúcar (tabla VII).    La densidad 20 ° C/20 ° C se obtiene dividiendo la masa volúmica a 20 ° C por 0,998203.5.2. Densimetría con balanza hidrostática  5.2.1. Material  5.2.1.1. Balanza hidrostática   La balanza hidrostática, de una capacidad máxima de 100 g, por lo menos, debe tener una sensibilidad de una décima de mg.    Debajo de cada plato se fija un flotador de vidrio pyrex que tenga un volumen de 20 ml, como mínimo. Estos dos flotadores idénticos se suspenden de un hilo de diámetro inferior o igual a 0,1 mm.    El flotador suspendido debajo del plato de la derecha debe poder introducirse en una probeta cilíndrica que lleve una marca de nivel. Dicha probeta debe tener un diámetro interior superior en 6 mm, como mínimo, al del flotador. Este último debe poder  introducirse por completo en el volumen de la probeta situada debajo de la marca, debiendo atraversar la superficie del líquido únicamente el hilo de suspensión. La temperatura del líquido contenido en la probeta se medirá mediante un termómetro  graduado en 1/5 de grado.    Una balanza hidrostática monoplato puede igualmente ser utilizada.5.2.2. Procedimiento  5.2.2.1. Calibrado de una balanza hidrostática   Con los dos flotadores suspendidos, se equilibra la balanza colocando sobre el plato de la derecha las masas p.    Se llena la probeta de agua pura hasta la marca, se mide la temperatura t ° C después de agitar y se deja reposar durante 2 o 3 minutos. Se restablece el equilibrio mediante masas que se colocan en el plato de la derecha; se denominará p' a estas  masas.    Volumen del flotador a 20 ° C:V20 ° C = (p' - p) (F + 0,0012)F = factor dado por la tabla I para la temperatura t ° C.  p y V20 son las características del flotador.5.2.2.2. Procedimiento   El flotador de la derecha se sumerge en la probeta llena de vino (o de mosto) hasta la marca. Leer la termperatura t ° C del vino (o del mosto); sean:    p" las masas que restablecen el equilibrio,  r t ° C la masa volúmica aparente:Referir esta masa volúmica a 20 ° C utilizando una de las tablas II, III o IV.  6. Ejemplo de cálculo de la masa volúmica a 20 ° C y de la densidad 20 ° C/20 ° C (método de referencia)  6.1. Picnometría con balanza de dos platos  6.1.1. Determinación de las constantes del picnómetro   1. Pesada del picnómetro limpio y seco:Tara = picnómetro + p p = 104,9454 g   2. Pesada del picnómetro lleno de agua a la temperatura t ° C:Tara = picnómetro + agua + p' p' = 1,2396 g para t = 20,5 ° C.      3. Cálculo de la masa de aire contenida en el picnómetro:m = 0,0012 (p   p2) m = 0,0012 (104,9454   1,2396) m = 0,1244 g.    4. Características que deben anotarseTara del picnómetro vacío, p + m: p + m = 104,9454 + 0,1244 p + m = 105,0698 gVolumen a 20 °C = (p + m   p2) · Ft °CF20,50 °C = 1,001900 V20 °C = (105,0698   1,2396) · 1,001900 V20 °C = 104,0275 mlMasa del agua a 20 °C = V20 °C· 0,998203 M20 °C = 103,8405 g.6.1.2. Determinación de la masa volúmica a 20 °C y de la densidad 20 °C/20 °C de un vino seco:    p" = 1,2622 a 17,80 °Cr17,80 °C = 0,99788 g/ml   La tabla II permite calcular r20 °C a partir de rt °C mediante la relación:   Para t = 17,80 °C y para un grado alcohólico de 11 % vol se encuentra c = 0,546.2. Picnometría con balanza monoplato  6.2.1. Determinación de las constantes del picnómetro   1. Pesada del picnómetro limpio y seco:P = 67,7913 g    2. Pesada del picnómetro lleno de agua a la temperatura t °C:P1 = 169,2715 a 21,65 °C.    3. Cálculo de la masa de aire contenida en el picnómetro:m = 0,0012 (P1   P) m = 0,0012 × 101,4802 m = 0,1218 g   4. Características que deben anotarseTara del picnómetro vacío: P   m P   m = 67,7913   0,1218 P   m = 67,6695 g Volumen a 20 °C = [P1   (P   m)] Ft °C F21,65 °C = 1,002140 V20 °C = (169,2715   67,6695) · 1,002140 V20 °C = 101,8194 mlMasa del agua a 20 °C = V20 °C · 0,998203 M20 °C = 101,6364 g Masa del frasco tara: To To = 171,9160 g.6.2.2. Determinación de la masa volúmica a 20 °C y de la densidad 20 °C/20 °C de un vino seco:    T1 = 171,9178 g dT = 171,9178   171,9160 = + 0,0018 g P   m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g P2 = 169,2799 a 18 °Cr18 °C = 0,99793 g/ml   La Tabla II permite calcular r 20 °C a partir de r t °C mediante la relación   Para t = 18 °C y para un grado alcohólico de 11 % vol, se encuentra c = 0,49     TABLA I  Tabla de factores Fpor los que hay que multiplicar la masa del agua contenida en el picnómetro de vidrio pyrex a t °C, para calcular el volumen del picnómetro a 20 °C   TABLA II  Tabla de correcciones c de temperatura sobre la masa volúmica de vinos secos y vinos secos en los que se ha eliminado el alcohol, medida en un picnómetro de vidrio pyrex a t°C para referir el resultado a 20 °C       TABLA III  Tabla de correcciones c de temperatura sobre la masa volúmica de mostos naturales y concentrados medida a t °C mediante un picnómetro de vidrio pyrex, para referir el resultado a 20 °C     TABLA IV  Tabla de correcciones c de temperatura sobre la masa volúmica de vinos de 13 % vol o más que contengan azúcar residual, medida con un picnómetro de vidrio pyrex a t °C para referir el resultado a 20 °C          TABLA V  Tabla de correcciones c de temperatura sobre la masa volúmica de vinos secos y vinos secos en los que se ha eliminado el alcohol, medida a t °C con un areómetro o un picnómetro de vidrio ordinario, para referir el resultado a 20 °C       TABLA VI  Tabla de correcciones c de temperatura sobre la masa volúmica de mostos naturales y mostos concentrados medida a t °C con un picnómetro o un areómetro de vidrio ordinario, para referir el resultado a 20 °C       TABLA VII  Tabla de correcciones c de temperatura sobre la masa volúmica de vinos de 13 % vol o más que contengan azúcar residual, medida a t °C con un areómetro o un picnómetro de vidrio ordinario, para referir el resultado a 20 °C            2. EVALUACIÓN  MEDIANTE  REFRACTOMERÍA  DEL  CONTENIDO  EN  AZÚCARES  DE  MOSTOS,  MOSTOS  CONCENTRADOS  Y  MOSTOS  CONCENTRADOS  RECTIFICADOS 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   El índice de refracción a 20 °C, expresado de modo absoluto o como porcentaje en masa de sacarosa, se lleva a la tabla correspondiente para obtener el contenido en azúcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo de mosto, mosto concentrado y  mosto concentrado rectificado.2. MATERIAL  2.1. Refractómetro del tipo Abbé   El refractómetro utilizado deberá estar provisto de una escala que indique:- el porcentaje en masa de sacarosa, con precisión de 0,1 %, o bien- el índice de refracción con 4 decimales.    El refractómetro deberá estar provisto de un termómetro, cuya escala estará graduada de +15 °C a +25 °C como mínimo, y de un dispositivo de circulación de agua que permita realizar las mediciones a una temperatura de 20 °C ± 5 °C.    Deberán seguirse estrictamente las instrucciones sobre el manejo de este instrumento, en particular, las concernientes al calibrado y a la fuente luminosa.3. PREPARACIÓN  DE  LA  MUESTRA  3.1. Mostos y mostos concentrados   Puede pasarse el mosto a través de una gasa seca doblada en cuatro y, tras haber eliminado las primeras gotas de filtrado, se efectúa la determinación sobre el producto filtrado.3.2. Mosto concentrado rectificado   Utilizar, según su concentración, el mosto concentrado rectificado o la solución obtenida añadiendo agua a 200 g de mosto concentrado rectificado exactamente pesados hasta que aquélla alcance 500 g.4. PROCEDIMIENTO   Llevar la muestra a una temperatura póxima a 20 °C. Colocar unas gotas de muestra en el prisma inferior del refractómetro procurando que, estando los prismas en estrecho contacto, aquélla cubra uniformemente la superficie de vidrio, y efectuar la  medición con arreglo a las instrucciones de manejo del aparato utilizado.    Medir el porcentaje en masa de sacarosa con una aproximación de 0,1 % o anotar el índice de refracción con 4 decimales.    Efectuar al menos dos determinaciones de cada muestra preparada. Anotar la temperatura t °C.5. CÁLCULOS  5.1. Corrección de temperatura  5.1.1. Aparatos graduados en % en masa de sacarosa. Utilizar la tabla I para la corrección de temperatura.    5.1.2. Aparatos graduados en índices de refracción; llevar el índice medido a t °C a la tabla II para obtener (columna 1) el valor correspondiente del procentaje en masa de sacarosa a t °C. Mediante la tabla I se corregirá este valor expresándolo a 20  °C.5.2. Contenido en azúcares de mostos y mostos concentrados   Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C a la tabla II para obtener el contenido en azúcares invertidos en gramos por litro y en gramos por kilogramo. Se expresará con un decimal.5.3. Contenido en azúcares de mosto concentrado rectificado   Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C a la tabla III para obtener el contenido en azúcares en gramos por litro y en gramos por kilogramo. El contenido en azúcares se expresará en azúcar invertido con 1 decimal.    Si la medición se ha efectuado con el mosto concentrado rectificado diluido, se multiplicará el resultado por el factor de dilución.5.4. Índice de refracción de mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados   Llevar el porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C a la tabla II para obtener el índice de refracción a 20 °C. Se expresará con 4 decimales.  TABLA  I  Corrección que deberá efectuarse cuando el porcentaje en masa de sacarosa sea determinado a una temperatura diferente de 20 °C     Las variaciones de la temperatura con relación a 20 °C no deberán exceder de ±5 °C.   TABLA  II  Tabla del contenido en azúcar  (4) , en gramos por litro y en gramos por kilogramo, de mostos y mostos concentrados, determinado mediante un refractómetro graduado en porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C o en índice de refracción a 20 °C. Figura también la masa volúmica a 20 °C.      TABLA III  Tabla del contenido en azúcar   (5) , en gramos por litro y en gramos por kilogramo, de mostos concentrados rectificados, determinado mediante un refractómetro graduado en porcentaje en masa de sacarosa a 20 °C o en índice de refracción a 20 °C. Figura también la masa volúmica a 20 °C      3. GRADO  ALCOHÓLICO  VOLUMÉTRICO 1. DEFINICIÓN   El grado alcohólico volumétrico es igual al número de litros de etanol contenidos en 100 litros de vino, medidos ambos volúmenes a la temperatura de 20 °C. Su símbolo es «% vol».    Nota:El etanol, sus homólogos y los ésteres de ambos están comprendidos en el grado alcohólico, por encontrarse en el destilado.2. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  2.1. Destilación del vino alcalinizado mediante una suspensión de hidróxido de calcio. Determinación del grado alcohólico en el destilado.   2.2. Método de referencia: determinación de la masa volúmica del destilado por picnometría.2.3. Métodos usuales  2.3.1. Determinación del grado alcohólico del destilado por areometría  2.3.2. Determinación del grado alcohólico del destilado por densimetría con balanza hidrostática  2.3.3. Determinación del grado alcohólico del destilado por refractometría   Nota:Para expresar el grado alcohólico a partir de la masa volúmica del destilado, utilícense las tablas prácticas I, II, III que figuran en el Anexo II de este capítulo. Se han calculado a partir de la tabla alcohólica internacional publicada en 1972  por la Organización internacional de Metrología Legal (OIML) en su Recomendación no 22 y fue adoptada por la OIV (Asamblea general de 1974).En la tabla I (Anexo II) se da la ecuación general por la que se relaciona el grado alcohólico volumétrico y la  masa volúmica de las mezclas hidroalcohólicas en función de la temperatura.3. OBTENCIÓN  DEL  DESTILADO  3.1. Material  3.1.1. Aparato de destilación compuesto por:- un matraz de fondo redondo de 1 litro de capacidad con esmerilado normalizado,- una columna rectificadora de una altura de unos 20 cm o cualquier dispositivo para impedir el arrastre,- una fuente de calor;  debe evitarse toda pirogenación de las materias extractivas mediante un dispositivo adecuado,- un refrigerante terminado en un tubo afilado que conduzca el destilado al fondo del matraz aforado receptor que deberá contener algunos mililitros de agua.   3.1.2. Aparato de arrastre por vapor de agua, formado por:1. un generador de vapor de agua,2. un borboteador,3. una columna rectificadora,4. un refrigerante.    Puede utilizarse cualquier otro modelo de aparato de destilación o cualquier otro aparato de arrastre por vapor de agua siempre que responda al ensayo siguiente:     Destilar 5 veces consecutivas una mezcla hidroalcohólica de 10 % vol. Después de la quinta destilación, el destilado debe presentar un grado alcohólico de 9,9 % vol, como mínimo, es decir, no debe producirse una pérdida de alcohol superior a 0,02 % vol  durante cada destilación.3.2. Reactivos  3.2.1. Suspensión de hidróxido de calcio 2 M   Se obtiene vertiendo, con cuidado, un litro de agua caliente (60-70 °C) sobre 120 g de cal viva CaO.3.3. Preparación de la muestra   En los vinos jóvenes o espumosos debe eliminarse previamente la mayor cantidad posible de dióxido de carbono, agitando 250-300 ml de vino en un erienmeyer de 500 ml.3.4. Procedimiento   Echar en un matraz aforado un volumen de vino de 200 ml.    Anotar la temperatura del vino.    Verterlo en el matraz del aparato de destilación o en el borboteador del aparato de arrastre por vapor de agua. Lavar el matraz aforado cuatro veces con 5 ml de agua que se verterán en el matraz de destilación o en el borboteador. Añadir 10 ml de  hidróxido de calcio (3.2.1) y algunos fragmentos de materia porosa inerte (piedra pómez).    Recoger el destilado en el matraz aforado de 200 ml que ha servido para medir el vino.    Debe recogerse un volumen igual a las tres cuartas partes, aproximadamente, del volumen inicial en el caso de la destilación, o 198-199 ml de destilado en el caso de arrastre por vapor de agua. Completar a 200 ml con agua destilada a una temperatura  idéntica a la temperatura inicial, con una aproximación de ± 2 °C.    Mezciar con precaución, mediante un movimiento circular.    Nota:En el caso de vinos especialmente cargados de iones amoniacales, efectuar una nueva destilación del destilado en las condiciones anteriormente descritas, sustituyendo la suspensión de hidróxido de calcio por 1 ml de ácido sulfúrico al 10 %  (v/v).4. MÉTODO  DE  REFERENCIA   Determinación del grado alcohólico del destilado por picnometría.4.1. Aparatos  4.1.1. Utilizar el picnómetro calibrado como se indica en el capítulo «Masa volúmica».4.2. Procedimiento   Determinar la masa volúmica aparente a T °C del destilado (3.4), como se indica en el capítulo «Masa volúmica», en 4.3.1 y 4.3.2; sea rt dicha masa volúmica.4.3. Expresión de los resultados  4.3.1. Método de cálculo   Expresar el grado alcohólico a 20 °C utilizando la tabla I. En la línea horizontal de la tabla correspondiente a la temperatura T °C expresada en número entero buscar la menor masa volúmica superior a rt. Empléese la diferencia tabular leída debajo de  esta masa volúmica para calcular la masa volúmica r a la temperatura T.    En la línea de la temperatura T, buscar la masa volúmica r2 inmediatamente superior a r y calcular la diferencia entre las dos masas volúmicas r y r2. Esta diferencia se dividirá por la diferencia tabular leída a la derecha de la masa volúmica r2. El  cociente da la parte decimal del grado alcohólico, mientras que la parte entera de dicho grado viene indicada en la cabecera de la columna en que se encuentra la masa volúmica r2.    En el Anexo I de este capítulo figura un ejemplo de cálculo del grado alcohólico.    Nota:Esta corrección de temperatura ha sido programada y, en su caso, puede efectuarse automáticamente.4.3.2. Repetibilidad (r):    r = 0,10 % vol4.3.3. Reproductibilidad (R):    R = 0,19 % vol5. MÉTODOS  USUALES  5.1. Areometría  5.1.1. Aparatos  5.1.1.1. Alcohómetro   El alcohómetro debe ajustarse a las especificaciones de los aparatos de las clases I o II definidas en la recomendación internacional no 44, «Alcohómetros y areómetros para alcohol», de la OIML.   5.1.1.2. Termómetro graduado en grados y décimas de grado de 0 ° a 40 °C, con una aproximación comprobada de 1/20 de grado.   5.1.1.3. Probeta cilíndrica de 36 mm de diámetro y 320 mm de altura, mantenida en posición vertical mediante un soporte con tornillos niveladores.5.1.2.Procedimiento   Verter el destilado (3.4) en la probeta cilíndrica. Mantener la probeta en posición vertical. Introducir el termómetro y el alcohómetro. Efectuar la lectura del termómetro 1 min., después de haber agitado para igualar la temperatura de la probeta, del  termómetro, del alcohómetro y del destilado. Retirar el termómetro y leer el grado alcohólico aparente tras 1 min. de reposo. Realizar por lo menos tres lecturas utilizando una lupa. En el grado aparente medido a t °C debe corregirse la acción de la  temperatura utilizando la tabla II.    Es necesario que la temperatura del líquido no se diferencie en mucho de la temperatura ambiente (5 °C de diferencia, como máximo).5.2. Densimetría con balanza hidrostática  5.2.1. Material   Utilizar la balanza hidrostática como se indica en el capítulo «Masa volúmica».  5.2.2. Forma de operar   Proceder a la determinación de la masa volúmica aparente a t °C del destilado como se indica en el capítulo «Masa volúmica» en 5.2.2.5.2.3. Expresión de los resultados   Expresar el grado alcohólico a 20 °C siguiendo las indicaciones del apartado 4.3.1 y utilizando la tabla I, si el flotador es en vidrio pyrex y la tabla III si el flotador es en vidrio normal.5.3. Refractometría  5.3.1. Material  5.3.1.1. Refractómetro que permita la medida de los índices de refracción comprendidos entre 1,330 y 1,346.    En función del tipo de aparato, las medidas deberán realizarse:- bien a 20 °C, con ayuda de un dispositivo adecuado;- bien a temperatura ambiente t °C, medida con un termómetro que permita determinarla con una aproximación de 0,05 °C, como mínimo. Con  el aparato se facilita una tabla de corrección de temperatura.5.3.2. Procedimiento   La medida del índice de refracción se efectúa en el destilado de vino (3.4), siguiendo el procedimiento prescrito para el tipo de aparato utilizado.5.3.3. Expresión de los resultados   El índice de refracción a 20 °C se lleva a la tabla IV para obtener el grado alcohólico.    Nota:En la tabla IV figura la correspondencia entre los índices de refracción de las mezclas hidroalcohólicas puras y de los destilados de vino. En el caso de destilados de vino, se tienen en cuenta las impurezas del destilado (principalmente alcoholes  superiores). La presencia de metanol se traduce en la disminución del índice de refracción y, por lo tanto, del grado alcohólico.   6. EJEMPLO  DE  CÁLCULO  DEL  GRADO  ALCOHÓLICO  DE  UN  VINO  6.1. Picnometría con balanza de dos platos  6.1.1. Las constantes del picnómetro se deben determinar y calcular como se indica en el punto 6.1.1 del capítulo 1 «Masa volúmica y densidad relativa».6.1.2. Pesada del picnómetro lleno de destiladoEjemplo numéricot °C = 18,90 °C Tara = picnómetro + destilado a t °C + p" t °C corregido = 18,70 °C p" = 2,8074 g   p + m   p" = masa del destilado a t °C 105,0698   2,8074 = 102,2624 g   Masa volúmica aparente a t °C 6.1.3. Cálculo del grado alcohólico          Se utiliza el cuadro de masas volúmicas aparentes de las mezclas hidroalcohólicas a diferentes temperaturas, como se indicó anteriormente En la línea 18 °C de la tabla de masas volúmicas aparentes, la menor masa superior a la masa observada 0,983087 es 0,98398, en la columna 11 Lamasa volúmica a 18 °C es: (98307,6 + 0,7 × 22) 10 5 = 0,98323 0,98398   0,98323 = 0,00075 La parte decimal del grado alcohólico es 75/114 = 0,65 El grado alcohólico es: 11,65 % vol6.2. Picnometría con balanza monoplato  6.2.1. Las constantes del picnómetro se han determinado y calculado en el punto 6.2.1 del capítulo «Masa volúmica y densidad relativa».   6.2.2. Pesada del picnómetro lleno de destilado:    Peso del frasco tara en el momento de la determinación: T1 = 171,9178 gPicnómetro lleno de destilado a 20,50 °C: P2 = 167,8438 gVariación del empuje del aire: dT= 171,9178   171,9160 = + 0,0018Masa del destilado a 20,50 °C: Lt = 167,8438   (67,6695 + 0,0018) = 100,1725Masa volúmica aparente del destilado:6.2.3. Cálculo del grado alcohólico:           Utilizar la tabla de masas volúmicas aparentes de las mezclas hidroalcohólicas a diferentes temperaturas, como se indicó anteriormente En la línea 20 °C de la tabla de masas volúmicas aparentes, la menor masa superior a la masa observada 0,983825 es 0,98471, en la columna 10 % La masa volúmica a 20 °C es:  (98382,5 + 0,50 × 24) 10 5 = 0,983945 0,98471   0,983945 = 0,000765 La parte decimal del grado alcohólico es: 76,5/119 = 0,64 El grado alcohólico es: 10,64 % vol FÓRMULA  PARA  CALCULAR  LAS  TABLAS  ALCOHÓLICAS  DE  LAS  MEZCLAS  DE  ALCOHOL  ETÍLICO  Y  AGUALa masa volúmica «r», expresada en kilogramos por metro cúbico (kg/m³), de una mezcla de alcohol etílico y agua a la temperatura t, expresada en grados  Celsius, viene dada por la fórmula siguiente, en función de:   - el grado en masa p expresado por un número decimal, (6) - la temperatura t expresada en grados Celsius, (EIPT 68)- los coeficientes numéricos que figuran a continuación.   La fórmula es válida para las temperaturas comprendidas entre  20 °C y +40 °C  Coeficientes numéricos de la fórmula    TABLA  I  GRADO  ALCOHÓLICO  INTERNACIONAL  A  20 °CTabla de masas volúmicas aparentes de mezclas hidroalcohólicas Picnómetro de vidrio pyrexMasas volúmicas a t °, corregidas del empuje del aire                      TABLA  II  GRADO  ALCOHÓLICO  INTERNACIONAL  A  20 °CTabla de correcciones a efectuar sobre el grado alcohólico aparente para corregir la acción de la temperaturaSumar o restar al grado alcohólico aparente a t ° (alcohómetro en vidrio ordinario) la  corrección indicada en esta tabla               TABLA  III  GRADO  ALCOHÓLICO  INTERNACIONAL  A  20 °CTabla de masas volúmicas aparentes de mezclas hidroalcohólicas. Aparatos en vidrio ordinarioMasas volúmicas a t ° corregidas del empuje del aire                  TABLA  IV  Tabla de correspondencia entre los índices de refracción a 20 °C y los grados alcohólicos a 20 °C de las mezclas hidroalcohólicas puras y de destilados     4. EXTRACTO  SECO  TOTAL   Materias secas totales1. DEFINICIÓN   El extracto seco total o materias secas totales es el conjunto de todas las substancias que no se volatilizan en determinadas condiciones físicas. Estas condiciones físicas deben establecerse de tal forma que las substancias que componen el extracto  sufran el mínimo de alteraciones.    El extracto no reductor es el extracto seco total menos los azúcares totales.    El extracto reducido es el extracto seco total menos los azúcares totales que exceden de 1 g/l, el sulfato potásico que exceda de 1 g/l, el manitol, si lo hubiere, y todas las substancias químicas que se hayan añadido al vino.    El resto del extracto el el extracto no reductor menos la acidez fija expresada en ácido tartárico.    El extracto se expresa en gramos por litro y debe determinarse con una aproximación de 0,5 g.2. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Método único: método densimétrico.    El extracto seco total se calcula indirectamente a partir del valor de la densidad del mosto y, tratándose de vino, a partir de la densidad del vino desalcoholizado.    Este extracto se expresa como la cantidad de sacarosa que, disuelta en una cantidad de agua suficiente para obtener un litro, da una solución con la misma densidad que el mosto o que el residuo del vino sin alcohol. En la tabla I figura esa cantidad.3.  PROCEDIMIENTO   La densidad relativa d2020 del vino desalcoholizado (dr) se calcula mediante la fórmula:dr = dv   da + 1,000donde dv = densidad relativa del vino a 20 °C (corregida la acidez volátil) (7);donde da = densidad relativa a 20 °C de la mezcla  hidroalcohólica del mismo grado alcohólico que el vino.    Puede asimismo calcularse dr a partir de las masas volúmicas a 20 °C, rv del vino yra de la mezcla hidroalcohólica del mismo grado, mediante la fórmula:dr = 1,0018 (rv   ra) + 1,000donde el coeficiente 1,0018 puede prácticamente asimilarse a 1 cuando  rv sea inferior a 1,05, siendo este caso el más frecuente.4. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   Llevar la densidad dr2020 del vino desalcoholizado o la densidad d2020 del mosto de uva a la tabla I para obtener el peso de extracto seco total en gramos por litro.    Este peso se expresará con 1 decimal.    El peso del extracto seco total se expresa en g/l con 1 decimal.   TABLA  I  para el cálculo del contenido en extracto seco total (g/l)  TABLA  INTERCALAR    5. Azúcares reductores 1. DEFINICIÓN   Los azúcares reductores están constituidos por el conjunto de los azúcares con función cetónica o aldehídica determinados por su acción reductora sobre la solución cupro-alcalina.2. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  2.1. Defecación  2.1.1. Método de referencia: paso del vino neutralizado y sin alcohol por una columna intercambiadora donde sus aniones son cambiados por iones acúticos, seguido de la defecación por acetato neutro de plomo.   2.1.2. Métodos usuales: se trata el vino con uno de los reactivos siguientes:   2.1.2.1. Acetato neutro de plomo  2.1.2.2. Ferrocianuro de cinc2.2. Determinación  2.2.1. Método único: después de hacer reaccionar el vino o el mosto defecado con una cantidad determinada de solución cupro-alcalina, se determina el exceso de iones cúpricos por yodometría.3. DEFECACIÓN   El líquido en el que se van a determinar los azúcares debe presentar un contenido en azúcares comprendido entre 0,5 y 5 g/l.    Si el vino es seco, hay que evitar diluirlo durante la defecación; si es dulce, hay que diluirlo mientras se le defeca, para conseguir un contenido en azúcares comprendido entre dichos límites, según el cuadro adjunto:                  DenominaciónContenido en azúcares comprendidos entre (g/l)Masa volúmica comprendida entreDilución que se prevé (%)Mostos y mistelas> 125> 1,0381Vinos dulces alcoho-   lizados o no25 y 1251,005 y 1,0384Vinos semisecos5 y 250,997 y 1,00520Vinos  secosmenos de 5<  0,997sin dilución3.1. Método de referencia  3.1.1. Reactivos  3.1.1.1. Solución de ácido clorhídrico (Cl H), 1 M  3.1.1.2. Solución de hidróxido de sodio (Na OH), 1 M  3.1.1.3. Solución de ácido acético (CH3 COOH), 4 M  3.1.1.4. Solución de hidróxido de sodio (Na OH), 2 M  3.1.1.5.  Resina intercambiadora de aniones [tipo Dowex 3 (20 50 mallas) o una resina equivalente].    Preparación de la columna de resina intercambiadora de aniones. En el fondo de la bureta, se coloca un pequeño tapón de lana de vidrio y 15 ml de resina intercambiadora de aniones (3.1.1.5).     Para poder utilizar la resina, se la somete a dos ciclos completos de regeneración, pasando alternativamente soluciones M de ácido clorhídrico (3.1.1.1) y de hidróxido de sodio (3.1.1.2). Después de lavar con 50 ml de agua destilada, se pasa la resina  a un vaso cilíndrico, se añaden 50 ml de solución 4 M de ácido acético (3.1.1.3) y se agita durante 5 minutos. Se vuelve a llenar la bureta y se hacen pasar a través de la columna 100 ml de solución 4 M de ácido acético (3.1.1.3). (Es preferible tener  una reserva de resina conservada en un frasco lleno de solución 4 M de ácido acético.) Se lava la columna con agua destilada hasta que el eluido sea neutro.    Regeneración de la resina. Se hacen pasar 150 ml de solución 2 M de hidróxido sódico para eliminar los ácidos y gran parte de la materia colorante fijada en la resina. Se lava con 100 ml de solución 4 M de ácido acético. Se lava la columna hasta que el  eluido sea neutro.   3.1.1.6. Solución de acetato neutro de plomo (aproximadamente saturada):Acetato neutro de plomo Pb (CH3 COO)2, 3 H2O) 250 g Agua muy caliente csp. 500 mlAgitar hasta dilución.   3.1.1.7. Carbonato de calcio, Ca CO33.1.2. Procedimiento  3.1.2.1. Vinos secos   Se ponen 50 ml de vino en un vaso de precipitado de 10 a 12 cm de diámetro, aproximadamente, y se añaden ½ (n   0,5) ml de solución M de hidróxido de sodio (3.1.1.2) (siendo n el volumen de una solución 0,1 M de hidróxido de sodio utilizado para la  determinación de la acidez total de 10 ml de vino). Se evapora sobre un baño de agua hirviendo, proyectando una corriente de aire caliente hasta que el líquido se reduzca, aproximadamente, a 20 ml.    Hacer pasar este líquido a través de una columna de resina intercambiadora de aniones en forma de acetato (3.1.1.5), a razón de 3 ml cada 2 minutos. El eluido se recoge en un matraz aforado de 100 ml. Lavar 6 veces el vaso y la columna con 10 ml de  agua destilada, añadir, agitando, 2,5 ml de solución saturada de acetato de plomo (3.1.1.6) y 0,5 g de carbonato de calcio (3.1.1.7); agitar varias veces y dejar reposar durante al menos 15 minutos; enrasar con agua. Filtrar.    1 ml de este filtrado corresponde a 0,5 ml de vino.   3.1.2.2. Mostos, mistelas, vinos dulces y vinos semisecos   1.Mostos y mistelasDiluir al 10 % el líquido que debe analizarse; tomar 10 ml de dicha solución.    2. Vinos dulces, alcoholizados o no, cuya masa volúmica esté comprendida entre 1,005 y 1,038. Tomar 20 ml del líquido que deba analizarse, previamente diluido al 20 %.    3. Vinos semisecos,cuya masa volúmica esté comprendida entre 0,997 y 1,005. Tomar 20 ml de vino sin diluir.Hacer pasar el volumen de vino o de mosto indicado anteriormente a través de una columna intercambiadora de aniones en forma de acetato, a razón  de 3 ml cada 2 minutos. Recoger el eluido en un matraz aforado de 100 ml, lavar la columna con agua hasta obtener, aproximadamente, 90 ml de eluido. Añadir 0,5 g de carbonato cálcico, 1 ml de acetato de plomo en solución saturada; agitar y dejar reposar  durante al menos 15 minutos, agitando de vez en cuando; enrasar con agua. Filtrar.    Primer caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,01 ml de mosto o de mistela.Segundo caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,04 ml de vino dulce.Tercer caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,20 ml de vino semiseco.  3.2. Métodos usuales  3.2.1. Defecación con acetato neutro de plomo  3.2.1.1.Reactivos   Solución de acetato neutro de plomo(aproximadamente saturada) (véase 3.1.1).Carbonato de calcio.3.2.1.2. Procedimiento  3.2.1.2.1. Vinos secos   Se ponen 50 ml de vino en un matraz aforado de 100 ml y se añade 1/2 (n 0,5) ml de solución M de hidróxido de sodio, sea n el volumen de solución 0,1 M utilizada para determinar la acidez total de 10 ml de vino. Añadir, agitando, 2,5 ml de solución  saturada de acetato de plomo (3.1.1.6) y 0,5 g de carbonato cálcico (3.1.1.7); agitar varias veces y dejar reposar al menos 15 minutos; enrasar con agua y filtrar.1 ml de este filtrado corresponde a 0,5 ml de vino.3.2.1.2.2. Mostos, mistelas, vinos  dulces y vinos semisecos   En un matraz aforado de 100 ml, colocar un volumen de vino (o de mosto o de mistela) así definido; las diluciones que figuran a continuación se dan a título indicativo:    1. Mostos y mistelas:diluir al 10 % el líquido que deba analizarse. Tomar 10 ml de esta solución.    2. Vinos dulces, alcoholizados o no, cuya masa volúmica esté comprendida entre 1,005 y 1,038. Tomar 20 ml de líquido que deba analizarse previamente diluido al 20 %.    3.Vinos semisecos, cuya masa volúmica esté comprendida entre 0,997 y 1,005. Tomar 20 ml de vino sin diluir.Añadir 0,5 g de carbonato de calcio, 60 ml de agua aproximadamente, y 0,5 1 o 2 ml de acetato de plomo en solución saturada; agitar y dejar  reposar durante al menos 15 minutos, agitando de vez en cuando. Enrasar con agua y filtrar.     Primer caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,01 ml de mosto o mistela.Segundo caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,04 ml de vino dulce.Tercer caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,20 ml de vino semiseco.3.2.2. Defecación con hexacianoferrato (II)  de cinc   Dicho procedimiento de defecación sólo deberá utilizarse para los vinos blancos, vinos dulces poco coloreados y mostos.3.2.2.1. Reactivos  3.2.2.1.1. Solución I de hexacianoferrato (II) de potasio   Hexacianoferrato (II) de potasio [K4 Fe (CN)6,3H2O]  150 g Agua csp 1000 ml  3.2.2.1.2. Solución II de sulfato de cinc:Sulfato de cinc (Zn SO4 · 7 H2O)  300 g Agua csp 1000 ml 3.2.2.2. Procedimiento   En un matraz aforado de 100 ml, poner un volumen de vino (o de mosto o de mistela) así definido; las diluciones que figuran a continuación se dan a título indicativo:    1. Mostos y mistelas:diluir al 10 % el líquido que deba analizarse, tomar 10 ml de dicha solución.    2. Vinos dulces, alcoholizados o no,cuya masa volúmica esté comprendida entre 1,005 y 1,038. Tomar 20 ml de líquido que deba analizarse previamente diluido al 20 %.    3. Vinos semisecos, cuya masa volúmica esté comprendida entre 0,997 y 1,005. Tomar 20 ml de vino sin diluir.    4. Vinos secos. Tomar 50 ml de vino sin diluir.Añadir 5 ml de solución I de hexacianoferrato (II) de potasio(3.2.2.1.1) y 5 ml de solución II de sulfato de cinc (3.2.2.1.2). Mezclar. Enrasar con agua, esperar 10 minutos y filtrar.     Primer caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,01 ml de mosto o de mistela.Segundo caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,04 ml de vino dulce.Tercer caso: 1 ml de filtrado corresponde a 0,20 ml de vino semiseco.Cuarto caso: 1 ml de filtrado corresponde  a 0,50 ml de vino seco.   4. DETERMINACIÓN 4.1. Reactivos  4.1.1. Solución cupro-alcalina:Sulfato de cobre puro (CuSO4 . 5 H2O)  25 g Ácido cítrico (C6 H8 O7 . H2O)  50 g Carbonato de sodio cristalizado (Na2 CO3 . 10 H2O)  388 g Agua csp 1000 mlDisolver el sulfato de cobre en 100 ml de agua, el ácido citrico en 300 ml de agua y el carbonato de sodio en 300 a 400 ml de agua caliente. Mezclar la solución de ácido cítrico y la de carbonato de sodio. Añadir después la solución de  sulfato de cobre y llevar hasta un litro.4.1.2. Solución de yoduro de potasio al 30 %:Yoduro de potasio (Kl)  30 g Agua csp 100 mlConservar en un frasco de vidrio topacio.4.1.3. Ácido sulfúrico al 25 %:Ácido sulfúrico puro (H2SO4) r 20 = 1,84 g/ml  25 g Agua csp 100 mlVerter el ácido en el agua, dejar enfriar y llevar hasta 100 ml.4.1.4. Engrudo de almidón de 5 g/l:    Disolver 5 g de almidón en 500 ml de agua aproximadamente. Llevar a ebullición agitando y mantenerla durante 10 min.; añadir 200 g de cloruro sódico (Cl Na). Llevar hasta un litro una vez que haya enfriado.- Tiosulfato de sodio, solución 0,1 M-  Solución de azúcar invertido de 5 g/l:  esta solución debe utilizarse para verificar la técnica de la determinación.     En un matraz aforado de 200 ml. se echa:Sacarosa pura (C12H22O11) 4,75 g Agua, aproximadamente 100 ml Ácido clorhídrico puro (ClH) r 20 = 1,16 1,19 g/ml)  5 mlPoner el matraz al baño de agua a 60° C durante tiempo suficiente para que la temperatura de la solución alcance 50 ° C, temperatura que se matendrá durante 15 min. Dejar después que el matraz se  enfríe durante 30 min.; seguidamente, enfriarlo por inmersión en un baño de agua fría. Se pasa a un matraz aforado de 1 litro y se enrasa. Esta solución se conserva (esta solución tiene una acidez de 0,06 M, aproximadamente), con una solución de  hidróxido sódico.4.2. Procedimiento   En un erlenmeyer de 300 ml, poner 25 ml de solución cupro-alcalina, 15 ml de agua y 10 ml de solución de defecación. Este volumen de solución azucarada no debe contener más de 60 mg de azúcar invertido.    Añadir algunos granos de piedra pómez. Acoplar al erlenmeyer un refrigerante de reflujo y llevar a ebullición, que deberá alcanzarse en 2 min. Mantener la ebullición durante 10 min. exactamente.    Enfriar inmediatamente bajo un chorro de agua fría. Una vez que se haya enfriado completamente, añadir 10 ml de la solución de yoduro de potasio al 30 % (4.1.2), 25 ml de ácido sulfúrico al 25 % (4.1.3) y 2 ml de engrudo de almidón (4.1.4).   Valorar con la solución 0,1 M de tiosulfato de sodio (4.1.5). Sea n el número de mililitros utilizados.    Por otro lado, realizar una determinación testigo en la que los 10 ml de solución azucarada se sustituyen por 10 ml de agua destilada. Sea n' el volumen de tiosulfato empleado.4.3. Expresión de los resultados  4.3.1. Cálculos   La cantidad de azúcar, expresada en azúcar invertido, contenida en la muestra se da en la tabla adjunta en función del número n' - n de mililitros de tiosulfato utilizados.    Expresar el contenido del vino en gramos de azúcar invertido por litro con 1 decimal, teniendo en cuenta las diluciones efectuadas durante la defecación y el volumen de la muestra.4.3.2. Repetibilidad   r = 0,015 xixi = concentración del azúcar invertido en g/l de la muestra4.3.3. Reproductibilidad   R = 0,058 xixi = concentración del azúcar invertido en g/l de la muestra          6. SACAROSA 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS   I1. Método de detección cualitativa por cromatografia en capa fina. La sacarosa se separa de los otros azúcares por cromatografía en capa fina, con placas de celulosa y se revela con el reactivo urea - ácido clorhídrico en estufa a 105 ° C.    II. Método de detección y determinación por cromatografía líquida de alta resolución. La sacarosa se separa mediante una columna de sílice con alquilamina y se detecta por refractometría. para calcular la cantidad, se establece una comparación con un  patrón externo analizado en las mismas condiciones.    Notas:La autenticidad de un mosto o de un vino puede controlarse mediante el método de RMN del deuterio, descrito para la detección del enriquecimiento de mostos, de mostos concentrados rectificados y de vinos.Para la investigación y la dosificación de  la sacarosa la cromatografía en fase gaseosa descrita en el capítulo 42 letra f) puede igualmente ser utilizada.2. MÉTODO  DE  DETECCIÓN  CUALITATIVA  POR  CROMATOGRAFÍA  EN  CAPA  FINA  2.1. Material  2.1.1. Placas para cromatografía de capa fina de celulosa (véase 2.2.3).   2.1.2. Cubeta de cromatografía  2.1.3. Jeringa micrométrica o micropipeta  2.1.4. Estufa regulable a 105 ° C ± 2 ° C2.2. Reactivos  2.2.1. Carbón activo  2.2.2. Fase móvil: cloruro de metileno - ácido acético (r 20 = 1,05 g/ml) - etanol - metanol - agua (50 : 25 : 9 : 6 : 10).   2.2.3. Revelador:Urea  5 g Ácido clorhídrico 2 M   20 ml Etanol 100 ml  2.2.4. Solución de referenciaGlucosa  35   g Fructosa  35   g Sacarosa   0,5 g Agua csp 1000   ml2.3. Procedimiento  2.3.1. Preparación de la muestra   Cuando el mosto o el vino tenga mucho color, la decoloración se hará mediante tratamiento con carbón activo.    Tratándose de mosto concentrado rectificado, se utilizará la solución cuyo contenido en azúcares sea del 25 % (m/m) (25 ° Brix), preparada tal como se indica en el punto 4.1.2 del    método «Determinación del pH», y se diluirá añadiendo agua a 25 ml de esta solución en un matraz aforado hasta alcanzar 100 ml.2.3.2. Obtención del cromatograma  Depositar a 2,5 cm del borde inferior de la placa:- 10 µl de la muestra- 10 µl de la solución de referencia.    Colocar la placa en la cubeta previamente saturada por los vapores de la fase móvil, y dejar ascender el líquido hasta 1 cm del borde superior. Retirar la placa de la cubeta, secarla con corriente de aire caliente. Repetir dos veces la migración  secando la placa cada vez. Pulverizar uniformemente la placa con 15 ml de revelador y mantenerla en la estufa a 105 ° C durante 5 minutos.2.4. Resultados   La sacarosa y la fructosa aparecen bajo forma de manchas de color azul oscuro sobre fondo blanco; la glucosa da una mancha verdosa menos intensa.3. MÉTODO  DE  DETECCIÓN  Y  DETERMINACIÓN  POR  CROMATOGRAFÍA  LÍQUIDA  DE  ALTA  RESOLUCIÓN   Las condiciones cromatográficas se dan solo a título indicativo.3.1. Material  3.1.1. Cromatógrafo de fase líquida de alta resolución dotado de:    1. Inyector con loop de 10 µl;2. Detector refractómetro diferencial o refractómetro interferómetro;3. Columna grupo AMINO (25 cm de longitud por 4 mm de diámetro interno);4. Precolumna de la misma fase;5. Un dispositivo para mantener aislado o a la  misma temperatura (30 ° C) el conjunto formado por la precolumna y la columna.6. Un registrador o, en su caso, un integrador.7. Flujo de la fase móvil: 1 ml/min.3.1.2. Dispositivo de filtración por membrana (0,45 µm)3.2. Reactivos  3.2.1. Agua bidestilada  3.2.2. Acetonitrilo (CH3CN) de calidad HPLC  3.2.3. Fase móvil: acetonitrilo-agua, previamente filtrados por membrana (0,45 µm), (80 - 20 v/v).Antes de su utilización se deberá desgasificar.   3.2.4. Solución de referencia: solución acuosa de sacarosa de 1,2 g/l. Filtrada por membrana (0,45 µm).  3.3.Procedimiento  3.3.1. Preparación de la muestra   - Vinos y mostos.  Filtrar por membrana (0,45 µm).- Mostos concentrados rectificados. Utilizar la solución obtenida diluyendo el mosto concentrado rectificado al 40 % (m/v), tal como se indica en el punto 5.1.2 del método «Acidez total», y filtrarla por membrana (0,45  µm).3.3.2. Determinación cromatográfica   Inyectar sucesivamente en el cromatógrafo 10 µl de la solución de referencia y 10 µl de la muestra preparada como se indica en el punto 3.3.1. Repetir las inyecciones en el mismo orden.Registrar el cromatograma.El tiempo de retención de la sacarosa es  de unos 10 minutos.3.4. Cálculos   Utilizar para el cálculo el promedio de 2 resultados de la solución de referencia y de la muestra.3.4.1. Vinos y mostos   Calcular el contenido en gramos por litro.3.4.2. Mostos concentrados rectificados   Sea C g/l el contenido en sacarosa de la solución de mosto concentrado rectificado al 40 % (m/v).    Contenido en sacarosa en gramos por kilogramo de mosto concentrado rectificado: 2,5 . C3.5. Expresión de los resultados   El contenido en sacarosa de los vinos, mostos y mostos concentrados rectificados se expresa en gramos por litro (vinos y mostos) y en gramos por kilogramo (mostos concentrados rectificados) con 1 decimal.  >   7. GLUCOSA  Y  FRUCTOSA 1. DEFINICIÓN   La glucosa y la fructosa pueden determinarse por separado mediante un método enzimático, con vistas únicamente a calcular la relación glucosa/fructosa.2. FUNDAMENTO   Se fosforila la glucosa y la fructosa con adenosín-trifostato (ATP) mediante una reacción enzimática catalizada por la hexokinasa (HK), dando como resultado glucosa-6-fosfato (G6P) y fructosa-6-fosfato (F6P):    glucosa + ATP  G6P + ADP   fructosa + ATP  F6P + ADP   En un primer momento, la glucosa-6-fosfato se oxida a gluconato-6-fosfato mediante la nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato (NADP) en presencia de la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH). La cantidad de  nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato reducida (NADPH) que se origina corresponde a la cantidad de glucosa-6-fosfato y, por lo tanto, a la de glucosa.    G6P + NADP+  gluconato-6-fosfato + NADPH + H+   La nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato reducida se determina por su absorción a 340 nm.    Una vez finalizada esta reacción, la fructosa-6-fosfato se transforma en glucosa-6-fosfato por la acción de la fosfoglucosa-isomerasa (PGI)   La glucosa-6-fosfato reacciona nuevamente con la nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato para dar gluconato-6-fosfato y nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato reducida, determinándose esta última.3. APARATOS   - Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 340 nm, máximo de absorción del NADPH. Por tratarse de medidas absolutas (no existe curva de calibrado, sino referencia al coeficiente de extinición del NADPH), deben controlarse las escalas de las  longitudes de onda y de las absorbancias del aparato.En su defecto, utilizar un espectrofotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o 365 nm.- Cubetas de vidrio de 1 cm de recorrido óptico o cubetas de uso único.- Pipetas  para ensayos enzimáticos de 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 ml.4. REACTIVOS  4.1. Solución 1: tampón (trietanolamina 0,3 M; pH = 7,6; 4 10 3 M Mg2+): se disuelven 11,2 g de clorhidrato de trietanolamina (C2H5)3N · HCL) y 0,2 g de Mg SO4 · 7 H2O en 150 ml de agua bidestilada; añadir alrededor de 4 ml de solución 5 M de hidróxido  sódico (NaOH) para obtener un pH igual a 7,6 y llevar a 200 ml.    Esta solución tampón puede conservarse 4 semanas a + 4 °C.   4.2. Solución 2: solución de nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato (11,5 10 3M aproximadamente): se disuelven 50 mg de nicotinamida-adenin-dinucleótido-fosfato disódico en 5 ml de agua bidestilada.     Esta solución se conserva durante 4 semanas a + 4 °C.   4.3. Solución 3: solución de adenosin-52-trifosfato (81 10 3M, aproximadamente): se disuelven 250 mg de adenosin-52-trifosfato disódico y 250 mg de bicarbonato de sodio (Na HCO3) en 5 ml de agua bidestilada.    Esta solución se conserva durante 4 semanas a + 4 °C.   4.4. Solución 4: Hexoquinasa/glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa: mezclar 0,5 ml de hexoquinasa (2 mg de proteína/ml, es decir 280 U/ml) y 0,5 ml de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (1 mg de proteína por ml).    Esta mezcla se conserva durante un año a + 4 °C.   4.5. Solución 5: Fosfoglucosa-isomerasa (2 mg de proteína por ml, es decir 700 U/ml). La suspensión se utiliza sin dilución.    Conservación: un año a + 4 °C.    Nota:El conjunto de los reactivos necesarios para esta determinación es comercializado.5. PROCEDIMIENTO  5.1. Preparación de la muestra   En función de la cantidad estimada de glucosa + fructosa por litro, efectuar las diluciones siguientes:                     Medida a 340 nm y 334 nm365 nmDilución con aguaFactor F de diluciónhasta  0,4 g/l 0,8 g/l--hasta  4,0 g/l 8,0 g/l1 +  9  10hasta 10,0 g/l20,0 g/l1 +  24  25hasta 20,0 g/l40,0 g/l1 +  49  50hasta 40,0 g/l80,0 g/l1 +  99  100por encima de 40,0  g/l80,0 g/l1 + 9991 0005.2. Determinación   Regulando el espectrofotómetro a la longitud de onda de 340 nm, efectuar las medidas con respecto al aire (sin cubeta en el trayecto óptico) o con respecto al agua.Temperatura, 20 a 25 °C.En dos cubetas de 1 cm de trayecto óptico, introducir:     Testigo DeterminaciónSolución 1 (4.1) (a 20 °C) 2,50 ml 2,50 ml Solución 2 (4.2) 0,10 ml 0,10 ml Solución 3 (4.3) 0,10 ml 0,10 ml Muestra que va a determinarse   0,20 ml Agua bidestilada 0,20 ml   Mezclar y, transcurridos 3 min. aproximadamente, leer la absorbancia de las soluciones (A1). Desencadenar la reacción, añadiendo:Solución 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml   Mezclar; esperar 15 min.; medir la absorbancia y verificar el cese de la reacción cuando hayan pasado 2 min. (A2).    Inmediatamente, añadir:Solución 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml    Mezclar; leer al cabo de 10 min.; comprobar el cese de la reacción después de 2 min. (A3).   Determinar las diferencias de absorbancia:A2 A1 correspondiente a la glucosaA3 A2 correspondiente a la fructosatanto para el testigo como para la determinación.    Deducir la diferencia de absorbancia del testigo (D AT) y la de la determinación (D AD) y establecer:para la glucosa: D AG = D AD D ATpara la fructosa: D AF = D AD D AT   Nota:El tiempo necesario para la acción de las enzimas puede variar de un lote a otro. Por lo que, arriba, sólo se da a título indicativo. Se recomienda determinarlo para cada lote.5.3. Expresión de los resultados  5.3.1. Cálculo   La fórmula general para el cálculo de las concentraciones es la siguiente:V = volumen del ensayo (ml) v = volumen de la muestra (ml) PM = masa molecular de la sustancia que va a determinarse d = trayecto óptico de la cubeta (cm) E = coeficiente de absorción del NADPH a 340 nm = 6,3 (mmole 1 · l · cm 1) V = 2,92 ml para la determinación de la glucosa V = 2,94 ml para la determinación de la fructosa v = 0,20 ml PM = 180 d = 1.    Se obtiene:para la glucosa: Cg/l = 0,417 · D AG para la fructosa: Cg/l = 0,420 · D AF   Si al preparar la muestra se ha efectuado una dilución, multiplicar el resultado por el factor F.    Nota:Si las medidas se han tomado a longitudes de onda de 334 o 365 nm, se obtiene:- medida a 334 nm: E = 6,2 (mmole 1 · l · cm 1)para la glucosa: Cg/l = 0,425 · D AG para la fructosa: Cg/l = 0,428 · D AF- medida a 365 nm: E = 3,4 (mmole 1 · l · cm 1)para la glucosa: Cg/l = 0,773 · D AG para la fructosa: Cg/l = 0,778 · D AF5.3.2. Repetibilidad (r)   r = 0,056 xi5.3.3. Reproductibilidad (R)   R = 0,12 + 0,076 xi xi = contenido en glucosa o fructosa en gramos por litro.     8. DETECCIÓN  DEL  AUMENTO  DEL  GRADO  ALCOHÓLICO  NATURAL  DE  MOSTOS,  DE  MOSTOS  DE  UVA  CONCENTRADOS,  DE  MOSTOS  DE  UVA  CONCENTRADOS  RECTIFICADOS  Y  DE  VINOS  POR  APLICACIÓN  DE  LA  RESONANCIA  MAGNÉTICO-NUCLEAR  DEL  DEUTERIO   (RMN-FINS/SNIF-NMR) 1. DEFINICIÓN   Los átomos de deuterio contenidos en los azúcares y el agua de un mosto de uva se redistribuirán tras fermentación en las moléculas I, II, III y IV del vino:CH2D CH2 OH CH3 CHD OH I IICH3 CH2 OD HOD III IV   La adición de azúcares exógenos (chaptalización) antes de la fermentación del mosto repercutirá en la redistribución del deuterio.    En comparación con los valores de los parámetros relativos de un vino testigo natural de la misma región, el aumento artificial del grado alcohólico natural con azúcar exógeno, se traducirá en las variaciones siguientes:                            Parámetros Vino(D/H)I(D/H)II(D/H)QWR- natural    - adición      - azúcar de remolacha      - azúcar de caña      - azúcar de maíz       (D/H)I : relación isotópica de la molécula I(D/H)II : relación isotópica en la molécula II(D/H)QW : relación isotópica del agua del vino.    R = 2(D/H)II/(D/H)I, expresa la distribución relativa del deuterio en las moléculas I y II, R se mide directamente a partir de las intensidades h de las señales, y por tanto R = 3hII/h1.    La medida de (D/H)I caracteriza principalmente la especie vegetal sintetizadora del azúcar y, en menor medida, la geografía del lugar de recolección (naturaleza del agua utilizada durante la fotosíntesis).    (D/H)II representa la climatología del lugar de producción de las uvas (naturaleza del agua de lluvia y condiciones meteorológicas) y, en menor medida, la concentración de azúcar del mosto inicial.    (D/H)QW representa la climatología del lugar de producción y la riqueza en azúcar del mosto inicial.2. FUNDAMENTO   Se efectúa la determinación de los parámetros definidos anteriormente R; (D/H)I; (D/H) II mediante RMN del deuterio en el etanol extraído del vino o de los productos de fermentación del mosto, del mosto concentrado y del mosto concentrado rectificado  que se obtienen en las condiciones dadas. Se completa eventualmente la determinación estableciendo la relación isotópica del agua extraída del vino, (D/H)QW, y la relación isotópica 13C/12C del etanol.    Para la constitución de un banco de datos comunitario:- En el caso de los vinos, la recogida de muestra de control efectuada en las zonas de producción, deberá ir acompañada de tomas de muestra testigo naturales (al menos tres) del mismo origen (lugar  geográfico y milésima); para estas diversas tomas se recogerán siempre tres muestras.- En el caso de mostos, de mostos concentrados y de mostos concentrados rectificados, las muestras testigo (al menos 3) estarán constituidas por mostos naturales del  mismo origen (lugar geográfico y milésima).     Para los controles de los productos elaborados en su propio territorio y a la espera de la constitución de un banco de datos comunitarios, los Estados miembros pueden utilizar transitoriamente un banco de datos nacionales.3. PREPARACIÓN  DE  LA   MUESTRA  PARA  EL  ANÁLISIS  3.1. Extracción del etanol y del agua del vino   Nota:  Se puede utilizar cualquier dispositivo de extracción, con la condición que permita recuperar entre el 98 y 98,5 % del alcohol del vino y que el título másico del destilado se encuentre entre el 92 y el 93 % masa (95 % vol).3.1.1. Material y reactivos   - Aparato para la extracción del etanol (figura 1), que incluye:- calentador eléctrico con regulador de voltaje,- matraz esmerilado de 1 litro;- columna Cadiot de cinta helicoidal (parte móvil de teflón), por ejemplo [Prolabo, ref. 06 (730-194)],-  matraces cónicos esmerilados de 125 ml,- matraces con tapón de plástico de 125 y 60 ml;- Reactivos para la determinación del agua según la técnica de Karl Fischer (por ejemplo Merck 9241 y 9243).3.1.2.Procedimiento  3.1.2.1. Determinar el grado alcohólico del vino, con una precisión superior al 0,05 % en volumen; se denominará este grado gv.3.1.2.2. Extracción  del  etanol   Introducir una muestra homogénea de 500 ml de vino de grado alcohólico gv, en matraz del aparato de destilación con una relación de reflujo constante próxima a 0,9; para recoger el destilado; colocar un matraz cónico esmerilado de 125 ml pesado  previamente. Recoger el destilado con punto de ebullición entre 78,0 y 78,2 °C, aproximadamente de 40 a 60 ml. Cuando la temperatura sobrepase los 78,5 °C, suspender la toma durante 5 minutos.    Cuando la temperatura descienda a 78 °C, volver a recoger el destilado hasta que ascienda a 78,5 °C, repitiendo esta operación hasta que la temperatura, una vez interrumpida la recogida y funcionando en circuito cerrado, no vuelva a bajar. La  destilación completa dura aproximadamente 5 horas. Operando de esta manera puede recuperarse entre el 98 % y el 98,5 % del alcohol total del vino de un destilado con un grado comprendido entre 92 y 93 % masa (95 % vol) grado para el que se han  establecido la condiciones de la RMN descrita, en el apartado 4.    Se pesa el etanol recuperado.    Se conserva en un matraz de 60 ml una toma de muestra homogénea de 60 ml de las partes finales de la destilación; esta toma representará el agua del vino. Eventualmente se determinará su relación isotópica.    Nota:Si se dispone de un espectrómetro dotado de una sonda de 10 mm (véase apartado 4) bastará una toma de muestra homogénea de 300 ml de vino.3.1.2.3. Determinación  del  grado  alcohólico  del  alcohol  extraído   Se determina mediante el método de Karl Fischer el contenido en agua p2 de una muestra de alcohol de aproximadamente 0,5 ml cuyo peso p se conoce exactamente.      Figura 1: Instalación por la extracción del etanol    El grado del etanol en peso vendrá dado por la fórmula3.2.Fermentación de mostos, de mostos concentrados y de mostos concentrados rectificados  3.2.1. Material y reactivos   - Ácido tartárico.- Base de nitrógeno para levadura sin aminoácido DIFCO.- Levaduras secas activas «Saccharomyces cerevisiae».     Si se conoce la relación isotópica del agua del mosto, se pueden reactivar las levaduras previamente a realizar la siembra, durante 15 minutos en el mínimo de agua tibia sin destilar (1 g en 50 ml), de relación isotópica cercana, a la del agua del  mosto.    Si no se conoce la relación isotópica del agua del mosto, es preferible realizar la siembra directamente.    La cantidad de levaduras secas que se deben utilizar es del orden de 1 g esto es, alrededor de 1010 células para 1 litro de mosto.    Recipiente para la fermentación, de una capacidad de 1,5 litro, dotado de un dispositivo que permita manipular al resguardo del aire y condensar los vapores de alcohol, ya que no deberá tolerarse ninguna pérdida de etanol durante la fermentación. El  índice de conversión de los azúcares fermentables en etanol deberá ser superior al 98 %.3.2.2. Procedimiento  3.2.2.1. Mostos   - Mostos frescosColocar 1 litro de mosto, cuya concentración en azúcares fermentables se ha determinado previamente, en el recipiente previsto para la fermentación. Añadir 1 g de levaduras secas previamente reactivadas. Colocar el dispositivo que  permite manipular al abrigo del aire. Llévese la fermentación a una temperatura próxima a los 20 °C hasta que se agoten los azúcares. Tras determinar el grado alcohólico del producto de la fermentación y una vez calculado el índice de conversión de los  azúcares en alcohol, se centrifuga el líquido fermentado y se destila para extraer el etanol.    - Mostos conservados con dióxido de azufreDesulfitar un volumen de mosto algo superior a 1 litro (1,2 litro) haciendo burbujear una corriente de nitrógeno a través del mosto, calentado al baño maría a reflujo hasta 70-80 °C, hasta que el contenido  total de dióxido de azufre sea inferior a 200 mg/l. Procúrese no provocar ninguna concentración de mosto por evaporación de agua, empleando un refrigerante eficaz al respecto.Colocar 1 litro de mosto desulfitado en el recipiente de fermentación y  continuar como se ha indicado para los mostos frescos.Nota: Si se ha utilizado metabisulfito de potasio para sulfitar el mosto, será necesario añadir a este ácido sulfúrico antes de proceder al desulfitado, a razón de 0,25 ml de ácido sulfúrico  concentrado (r 20 = 1,84 g/ml) por gramo de metabisulfito utilizado por litro de mosto.   3.2.2.2. Mostos  concentrados   Colocar en el recipiente de fermentación un volumen V ml de mosto concentrado que contenga una cantidad de azúcares próxima a los 170 g. Completar hasta 1 litro con (1 000 - V) ml de agua con la misma relación isotópica que el agua del mosto natural  testigo. Sembrar de la misma forma que se indica en 3.2.1. Añadir 3 g de base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos DIFCO. Homogeneizar y continuar como se ha descrito antes.3.2.2.3. Mostos  de  uva  concentrados  rectificados   Proceder como se ha descrito en 3..2.2.2 completando hasta 1 litro con (1 000- V) ml de agua con la misma relación isotópica que el agua del mosto natural testigo, en los que se habrán disuelto 3 g de ácido tartárico.    Nota:Apartar un volumen de 50 ml de muestra de mosto o de mosto disulfitado, de mosto concentrado o de mosto concentrado rectificado para efectuar la extracción eventual de agua y la determinación de su relación isotópica (D/H)QW. La extracción del  agua de los mostos podrá efectuarse simplemente por destilación azeotrópica con tolueno.  3.3. Preparación de la muestra de alcohol para su medida por RMN  3.3.1. Reactivos   N, N-tetrametilurea (TMU); utilizar una muestra de TMU de referencia, de relación isotópica D/H conocida y controlada. Podrá obtenerse esta muestra de la Dirección General de Ciencia, Invetigación y Desarrollo, Oficina Comunitaria de Referencia, Rue de  la Loi, 200, B-1049 Bruselas.3.3.2. Procedimiento   - Sonda RMN de 15 mm de diámetro:Verter en un frasco pesado previamente 7 ml de alcohol obtenido según 3.1.2 pesándolo con precisión de 0,1 mg; se denominará a este peso mA; se tomarán a continuación 3 ml del estándar interno (TMU), pesándose con  precisión de 0,1 mg; se denominará a este peso mes. Homogeneizar por agitación.    - Sonda RMN de 10 mm de diámetro:Bastan 3,2 ml de alcohol y 1,3 ml de TMU.  Según el tipo de espectrómetro y de sonda utilizados (véase apartado 4), se añadirá una cantidad suficiente de hexafluorobenceno como sustancia de estabilización campo-frecuencia (lock).                   EspectrómetroSonda10 mm15 mm7,05 T150 µl200 µl9,4 T35 µl50 µl3.4. Preeparación de la muestra de agua para la medición de RMN con vistas a la determinación eventual de su relación isotópica  3.4.1. Reactivos   N, N,-tetrametilurea (TMU): véase 3.3.1.   3.4.2. Procedimiento   Colocar en un frasco ya pesado 3 ml de agua obtenida según 3.1.2 o 3.2 (nota), pesándolo con precisión de 0,1 mg. Se denominará a este peso m2E; se tomará a continuación 4 ml del estándar interno (TMU) pesándose con precisión de 0,1 mg; se denominará a  este peso m2es. Homogeneizar agitando.    Nota:Si el laboratorio dispone de un espectrómetro de masas de proporciones isotópicas, la medición podrá realizarse con este instrumento, a fin de disminuir la utilización del espectrómetro de RMN, ya que, para cada serie de vinos estudiada, es  necesario contrastar la proporción TIV (5.2).4. OBTENCIÓN  DE  LOS  ESPECTROS  RMN ²H  DEL  ALCOHOL  Y  DEL  AGUA.    Determinación de los parámetros isotópicos.4.1. Material   - Espectrómetro de RMN dotado de una sonda específica de deuterio ajustada a la frecuencia característica o del campo Bo (por ejemplo para Bo = 7,05 T, o = 46,5 MHz y para Bo = 9,4 T, o = 61,4 MHz) y que posea un canal de desacoplamiento de protón B2 y  un canal de estabilización campo-frecuencia (lock) a la frecuencia del flúor.     La resolución medida en el espectro, transformada sin multiplicación exponencial (es decir LB = cero O) (figura 2 b) y expresada por la amplitud a media altura de las señales de metilo y metileno del etanol y de la señal de metilo del TMU, deberá ser  inferior a 0,5 Hz. La sensibilidad, medida con un factor de multiplicación exponencial LB = 2 (figura 2 a), deberá ser igual o superior a 150 para la señal de metilo del etanol de un grado de 95 % vol (93,5 % m/m). En estas condiciones, el intervalo de  confianza en la medición de la altura de la señal, calculada para una probabilidad de 97,5 % (test de una cola) y 10 repeticiones del espectro, será de 0,35 %.- Cambiador automático de muestras (eventualmente).- Programa de tratamiento de datos.- Tubos  para muestra de 15 mm o de 10 mm, según las características del espectrómetro.4.2. Regulación del espectrómetro y verificaciones  4.2.1. Regulación   Proceder a las regulaciones habituales de homogeneidades y de sensibilidad según las indicaciones del constructor.4.2.2. Verificación de la validez de las regulaciones   Utilizar etanoles de referencia, designados mediante las letras «C, V y R», de un contenido isotópico diferente pero comprobado con precisión. El significado de estas iniciales es el siguiente: C, alcohol de caña de azúcar o de maíz; V, alcohol de  vino, y R, alcohol de remolacha. Las muestras pueden obtenerse en la Oficina Comunitaria de Referencia.    Según el procedimiento descrito en 4.3, determinar los valores isotópicos de estos alcoholes que se designarán anotando Cmed, Vmed, Rmed (véase 5.3).    Comparar estos valores con los valores de referencia correspondientes dados, que se designarán anotando Ces, Res, Ves (véase 5.3).  Figura 2 aEspectro RMN²H del etanol del vino con referencia interna (TMU: N,N-tetrametilurea)    Figura 2 bEspectro²H del etanol realizado en las mismas condiciones que las de la figura 2 a pero sin multiplicación exponencial (LB = o)    La desviación tipo de repetibilidad obtenida sobre la media de 10 repeticiones de cada espectro deberá ser inferior a 0,01 para la relación R o inferior a 0,3 ppm para (D/H)I y para (D/H)II.    Los valores medios obtenidos para los diferentes parámetros isotópicos [R, (D/H)I, (D/H)II)] deberán situarse dentro de la correspondiente desviación estándar de repetibilidad, ofrecida por la Oficina Comunitaria de Referencia para los parámetros de  los tres alcoholes de referencia. En caso contrario, deberán repetirse las regulaciones.4.3. Condiciones para obtener los espectros RMN   Colocar la muestra de alcohol preparada según 3.3 o la muestra de agua, preparada según 3.4 en un tubo de 10 o 15 mm e introducirla en la sonda.    Las condiciones para obtener espectros RMN son las siguientes:- La temperatura de la sonda (por ejemplo 302 K) deberá ser constante.- Tiempo de adquisición, 6,8 segundos, como máximo, para 1 200 Hz de amplitud espectral (memoria 16 K), es decir,  alrededor de 20 ppm a 61,4 MHz o 27 ppm a 46,1 MHz.- Impulso: 90 °.- Regular el tiempo de adquisición; su valor deberá ser del mismo orden de magnitud que el tiempo de toma de muestras (dwell time).- Detección en cuadratura: fijar el offset 01 entre las  señales de referencia OD y CHD para el etanol y entre HOD y TMU para el agua.- Determinar el valor del offset de desacoplamiento 02 a partir del espectro protónico medido por la bobina de desacoplamiento sobre el mismo tubo. Se obtiene un buen  desacoplamiento cuando 02 se halla situado en el centro del intervalo de frecuencia existente entre los grupos CH3  y CH2 . Utilizar el modo de desacoplamiento mediante banda ancha.    Efectuar para cada espectro un número NS de acumulaciones que baste para obtener la relación señal/ruido que figura en 4.1 y repetir NE = 10 veces esta serie de NS acumulaciones. Los valores de NS dependerán del tipo de espectrómetro y de sonda  utilizados (véase punto 4); se escogerá, por ejemplo:               EspectrómetroSonda10 mm15 mm7,05 TNS = 304NS = 2009,04 TNS = 200NS = 128 5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Etanol   Para cada uno de los 10 espectros (véase el espectro RMN del etanol, figura 2 a), determinar:- CH3CHDOH mes y mA: véase 3.3.2,- gDm, véase 3.1.2.3,- (D/H)es = proporción isotópica del estándar interno (TMU) indicado sobre el frasco. El TMU puede  obtenerse en la Oficina Comunitaria de Referencia.    La utilización de las alturas de las señales en lugar de las superficies medidas con menos precisión supone larguras de picos a media altura iguales, lo que es una aproximación razonable (figura 26).5.2. Agua   Cuando se determina la proporción isotópica del agua por RMN a partir de la mezcla agua-TMU, se utiliza la relación siguiente:donde- m2es y m2E, véase 3.4.2.- (D/H)es = proporción isotópica del estándar interno (TMU) indicada sobre el frasco  suministrado por la Oficina Comunitaria de Referencia (BCR).   5.3. Para cada uno de los parámetros isotópicos, calcular la media de las 10 determinaciones y el intervalo de confianza.    Un programa opcional (por ejemplo, SNIF-NMR) adaptable al calculador del espectrómetro permite efectuar estos cálculos en línea.    Nota: Si, tras la regulación del espectrómetro, subsiste una desviación sistemática entre los valores medios obtenidos para las características isotópicas de los alcoholes de referencia (4.2.2) y los valores indicados por la Oficina Comunitaria de  Referencia, del orden de la desviación-típica, podrá aplicarse la corrección siguiente para obtener el verdadero valor de una muestra X cualquiera.    La interpolación se efectuará tomando los valores de las muestras de referencia que se ajusten al de la muestra X.     Llamemos (D/H)iXmed al valor medido, y (D/H)iXcorr. al valor corregidotendremos:(D/H)iXcorr. = (D/H)iRes + a [(D/H)iXmed   (D/H)iRmed]   Ejemplo:Muestras de referencia suministradas y calibradas por la Oficina Comunitaria de Referencia:(D/H)iVes = 102,0 ppm (D/H)iRes = 91,95 ppmMuestras de referencia medidas por el Laboratorio:(D/H)iVmed = 102,8 ppm (D/H)iRmed = 93,0 ppmMuestra  sospechosa no corregida:(D/H)iXmed = 100,2 ppmSe calcul = 1,0255 y (D/H)iXcorr = 99,3 ppm6. INTERPRETACIÓN  DE  RESULTADOS   Comparar el valor RX obtenido para la relación R de la muestra sospechosa con las relaciones obtenidas para los vinos testigo. Si RX presenta una desviación superior a 2 desviaciones-típicas del valor medio RT obtenido para los vinos testigo, puede  presumirse una adulteración.6.1. Aumento artificial del grado alcohólico natural mediante azúcar de remolacha, azúcar de caña o glucosa de maíz  6.1.1. Vinos   RX es superior a RT: presunción de adición de azúcar de remolacha.  RX inferior a RT: presunción de adición de azúcar de caña o de azúcar de maíz.Obsérvese que (D/H)XII y (D/H)WQX han aumentado.Examinar (D/H)IX habrá presunción de:- azucarado mediante azúcar de remolacha:si el valor (D/H)IX de la muestra sospechosa es  inferior a (D/H)IT, valor medio obtenido de la muestras testigo, en más 1 desviación-típica.- azucarado mediante azúcar de caña o azúcar de maíz;  si el valor (D/H)IX es superior a (D/H)IT en más una desviación-típica.- Cálculo del aumento artificial del grado alcohólico natural A, expresado en % vol de etanol.Aumento mediante azúcar de remolacha:(D/H)IR = 92,5 (8) relación isotópica de la  posición I del alcohol de remolacha.gV = grado alcohólico del vino analizado (X)- Aumento mediante azúcar de caña o de maíz: (D/H)IC = 110,5 (9) relación isotópica de la posición I del alcohol de caña de azúcar o de maíz.gV = grado alcohólico del vino analizado (X).6.1.2.Mostos, mostos concentrados y mostos concentrados rectificados   Los valores de los parámetros isotópicos del alcohol extraído según 3.1 del producto fermentado obtenido (3.2) a partir del mosto, del mosto concentrado o del mosto concentrado rectificado, se examinan de acuerdo con las indicaciones dadas en el punto  6 «interpretación de los resultados», 6.1.1, comparándolos con el alcohol extraído del producto de fermentación de mostos naturales testigo.    El aumento artificial del grado alcohólico natural, A % vol, expresa el volumen de alcohol añadido al producto fermentado. Conocida la dilución eventual efectuada antes de la fermentación (mostos concentrados y mostos concentrados rectificados), y  admitiendo que 16,83 g de azúcar dan 1 % vol del alcohol, calcular la cantidad en masa de azúcar añadida por litro de mosto, de mosto concentrado o de mosto concentrado rectificado.6.2. Aumento artificial del grado alcohólico natural mediante mezcla de  azúcar de remolacha y azúcar de caña o de glucosa de maíz   Las relaciones isotópicas (D/H)I y R están menos modificadas que en el caso del aumento con 1 solo tipo de azúcar.    (D/H)II y (D/H)WQ aumentan.Pueden confirmarse estas adiciones determinando la relación 13C/12C del etanol por espectrometría de masa; en este caso, la relación aumenta.     9. CENIZAS 1. DEFINICIÓN   Se denominan cenizas al conjunto de los productos resultantes de la incineración del residuo de evaporación del vino, llevada a cabo de manera que se obtenga la totalidad de los cationes (excluido el amonio) en forma de carbonato y otras sales  minerales anhidras.2. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Incineración del extracto del vino llevada a cabo entre 500 y 550 °C hasta la combustión total del carbono.3. APARATOS  3.1. Baño de agua a 100 °C.   3.2. Balanza con una sensibilidad de una décima de miligramo.   3.3. Placa calefactora o evaporador de infrarrojos.   3.4. Horno eléctrico con regulación de temperatura.   3.5. Desecador.   3.6. Cápsula de platino de 70 mm de diámetro y de 25 mm de altura, de fondo plano.4. PROCEDIMIENTO   Colocar 20 ml de vino en una cápsula de platino previamente tarada (Po g). Evaporar al baño de agua a 100 °C y calentar el residuo sobre una placa calefactora a 200 °C o bajo el evaporador de infrarrojos hasta la carbonización. Cuando el residuo no  emita vapores, colocar la cápsula en el horno eléctrico a 525 °C ± 25 °C. Después de 15 minutos de carbonización, retirar la cápsula del horno, añadir 5 ml de agua destilada que se evaporan luego al baño de agua o bajo el evaporador de infrarrojos, y  calentar de nuevo a 525 °C durante 10 minutos.    Si la combustión de las partículas de carbono no es total, volver a realizar las operaciones de lavado, evaporación del agua e incineración.    Para los vinos ricos en azúcares, se recomienda añadir al extracto algunas gotas de aceite vegetal puro antes de proceder a la primera incineración, para impedir que se desborde el contenido.    Después de enfriar la cápsula en un desecador, se pesa. Se denominará a este peso P1g.    El peso p en g de las cenizas contenidas será: p = (P1 - Po) g.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Modo de cálculo   El peso P de las cenizas expresado en gramos por litro con dos decimales será: P = 50 · p.     10. ALCALINIDAD  DE  LAS  CENIZAS 1. DEFINICIÓN   Se denomina alcalinidad de las cenizas a la suma de los cationes, distintos del amonio, combinados con los ácidos orgánicos del vino.2. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Valoración por retroceso en presencia de naranja de metilo, de las cenizas solubilizadas en caliente por un exceso conocido de ácido valorado.3. REACTIVOS  Y  MATERIAL  3.1. Solución 0,05 M de ácido sulfúrico (H2SO4)  3.2. Solución 0,1 M de hidróxido sódico (NaOH)  3.3. Solución de naranja de metilo al 0,1 % en agua destilada.   3.4. Baño de agua a 100 °C.4. PROCEDIMIENTO   Añadir a la cápsula de platino que contiene las cenizas de 20 ml de vino, 10 ml de solución 0,05 M de ácido sulfúrico (3.1); colocarla al baño de agua a 100 °C durante 15 min aproximadamente, rascando el residuo con una varilla de vidrio para activar  la disolución. Añadir, a continuación, 2 gotas de solución de naranja de metilo y valorar el exceso de ácido sulfúrico con la solución 0,1 M de hidróxido de sodio (3.2), hasta que el indicador vire al color amarillo.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   Modo de cálculo   La alcalinidad de las cenizas expresada en miliequivalentespor litro con 1 decimal, será:    A = 5 (10-n)n = número de mililitros de hidróxido sódico 0,1 M.      11. CLORUROS 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Los cloruros se determinan directamente en el vino por potenciometría utilizando el electrodo Ag/AgCl.2. MATERIAL 2.1. pH metro con escala de milivoltios graduada al menos de 2 en 2 mV.   2.2. Agitador magnético.   2.3. Electrodo Ag/AgCl con una solución saturada de nitrato potásico como electrolito.   2.4. Microbureta graduada en centésimas de mililitro.   2.5. Cronómetro.3. REACTIVOS  3.1. Solución patrón de cloruros: 2,1027 g de cloruro potásico, KCl (máx. 0,005 % de Br), desecado antes de su empleo por coservación durante algunos días en un desecador se disuelven en agua destilada y se completa a 1 litro 1 ml de esta solución  contiene 1 mg de Cl.   3.2. Solución valorada de nitrato de plata: 4,7912 g de nitrato de plata, AgNo3, para análisis, se disuelven y se enrasan a 1 litro con una solución alcohólica al 10 % (v/v): 1 ml de esta solución corresponde a 1 mg de Cl .   3.3. Ácido nítrico puro al menos del 65 % (densidad (r20 = 1,40 g/ml).4. PROCEDIMIENTO  4.1. 5,0 ml de solución patrón de cloruros se introducen en un vaso de precipitados de 150 ml colocado sobre un agitador magnético, diluidos a 100 ml con agua destilada y acidificados con 1,0 ml de ácido nítrico del 65 % como mínimo. Se sumerje el  electrodo en el vaso de precipitados y se determina añadiendo por medio de la microbureta la solución valorada de nitrato de plata, la agitación debe ser moderada.    Las adiciones efectuadas son inicialmente de 1,00 ml para los cuatro primeros ml, leer los valores correspondientes en milivoltios. Después se adicionan los 2 ml siguientes en fracciones de 0,20 ml. Finalmente se siguen las adiciones por fracciones de  1 ml hasta llegar a un total de 10 ml. Después de cada adición se esperan alrededor de 30 segundos antes de efectuar la correspondiente lectura en milivoltios. Llevar los valores obtenidos sobre papel milimetrado en función de los mililitros de la  solución patrón correspondiente y se determina el potencial del punto de inflexión de la curva obtenida.   4.2. 5 ml de la solución patrón de cloruros se introducen en un vaso de precipitados de 150 ml. Se añaden 95 ml de agua destilada y 1 ml de ácido nítrico del 65 % como mínimo. Se sumerge el electrodo y se valora, agitando, hasta la obtención del  potencial del punto de equivalencia.    Esta determinación se repite hasta que se haya obtenido una buena concordancia de resultados. Se debe efectuar este control antes de cada serie de determinaciones de cloruros en las muestras.   4.3. Se introducen 50 ml del vino a analizar en un vaso de precipitados de 150 ml. Se añaden 50 ml de agua destilada y 1 ml de ácido nítrico del 65 % como mínimo y se valora siguiendo el procedimiento del punto 4.2.5. EXPRESIÓN  DE  RESULTADOS  5.1.  Cálculos   Si n representa el número de mililitros de solución patrón de nitrato de plata, el contenido en cloruros de la muestra analizada es:     20 × n expresado en miligramos de Cl por litro0,5633 × n expresado en miliequivalentes por litro32,9 × n expresado en miligramos de cloruro sódico por litro.5.2. REPETIBILIDAD (r)   r = 1,2 mg Cl por litro,r = 0,03 meq por litro,r = 2,0 mg NaCl por litro.5.3. Reproductibilidad (R)   R = 4,1 mg de Cl por litro,R = 0,12 meq por litro,R = 6,8 mg NaCl por litro.6. Observación: para determinaciones muy precisas   Hay que referirse a la curva de calibrado completa obtenida durante la valoración del patrón de cloruros con la solución patrón de nitrato de plata.    a) Poner 50 ml del vino a analizar en un vaso de precipitados de 150 ml. Añadir 50 ml de agua destilada y 1 ml de ácido nítrico al menos del 65 %. Valorar por medio de la solución de nitrato de plata, procediendo a adiciones de 0,5 ml y anotando los  correspondientes potenciales en milivoltios. De esta primera valoración se deduce el volumen aproximado de solución de nitrato de plata necesario.    b) Comenzar la valoración en las mismas condiciones. Proceder primero con adiciones de 0,5 ml valorando hasta que el volumen empleado sea inferior en 1,5 a 2 ml del volumen empleado en a). Proceder a adiciones de 0,2 ml, continuar las adiciones  lentamente hasta el punto de equivalencia aproximadamente obtenido de una manera simétrica, por adición de 0,2 ml después de 0,5 ml.    El punto final de la valoración y el volumen de nitrato de plata consumido exactamente se obtiene:- Trazando la curva y determinando el punto de equivalencia.- Por cálculo: V = volumen de solución valorada en el punto de equivalencia.V2 = volumen de  solución valorada antes del mayor salto de potencial.D Vi = volumen constante de las fracciones de solución valorada añadidas, o sea 0,2 ml.DD E1 = segunda diferencia de potencial antes de la mayor variación de potencial.DD E2 = segunda diferencia de  potencial después de la mayor variación de potencial.     Ejemplo:                    Volumen solución patrón de AgNO3Potencial EDiferenciaSegunda Diferencia0  204     4 0,2208  0   4 0,4212  2   6 0,6218  0   6 0,8224  0   6 1,0230  2   8 1,2238  4  12 1,4250 10  22 1,6272 22  44 1,8316 10  34 2,0350  8  26 2,2376  6  20 2,4396      En el ejemplo el punto final de la valoración se sitúa entre 1,6 y 1,8 ml; en este intervalo aparece el mayor salto de potencial (D= 44 mV). El volumen de solución valorada en nitrato de plata consumido para determinar los cloruros en la muestra a  analizar es:    12. SULFATOS 1. PRINCIPIO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método de referencia   Precipitación del sulfato de bario y pesada. El fosfato de bario precipitado en las mismas condiciones es eliminado por lavado del precipitado con ácido clorhídrico.    En caso de mostos o vinos ricos en dióxido de azufre, está indicado un desulfitado previo por ebullición al abrigo del aire.1.2. Método rápido de ensayo   Clasificación de los vinos en varias categorías por el método llamado de los límites, basado en la precipitación del sulfato de bario mediante una solución valorada de ion bario.2. MÉTODO  DE  REFERENCIA  2.1. Soluciones (Reactivos)  2.1.1. Ácido clorhídrico, solución 2 M.   2.1.2. Cloruro bárico en solución 200 g/l de BaCl2, 2H2O.2.2. Procedimiento  2.2.1. Caso general   Introducir en un tubo de centrifuga de 50 ml, 40 ml de la muestra a analizar, añadir 2 ml de ácido clorhídrico 2 M y 2 ml de solución de cloruro de bario de 200 g/l. Agitar con una varilla de vidrio, lavar la varilla con un poco de agua destilada y  dejar en reposo durante 5 minutos Centrifugar durante 5 minutos y decantar con precaución el líquido sobrenadante.    Lavar el precipitado de sulfato bárico de la forma siguiente: añadir 10 ml de ácido clorhídrico 2 M poner el precipitado en suspensión y centrifugar durante 5 minutos. Separar con precaución el líquido sobrenadante. Repetir 2 veces el lavado del  precipitado en las mismas condiciones con 15 ml de agua destilada cada vez.    Trasvasar cuantitativamente el precipitado, lavando con agua destilada, a una cápsula de platino tarada y colocada en un baño maría a 100 °C hasta evaporación a sequedad. El precipitado desecado se calcina varias veces brevemente sobre una llama hasta  la obtención de un residuo blanco. Dejar enfriar en un desecador y pesar.    Sea m la masa en miligramos de sulfato de bario obtenida.2.2.2. Caso particular: mostos sulfitados y vino con un contenido elevado de anhídrido sulfuroso.    Proceder a la eliminación del anhídrido sulfuroso.    En un matraz cónico de 500 ml provisto de un embudo de decantación y de un tubo de salida de vapor, introducir 25 ml de agua y 1 ml de ácido clorhídrico puro (densidad 20 ° = 1,15   1,18 g/ml). Hacer hervir para expulsar el aire, e introducir por el  embudo de decantación 100 ml de vino manteniendo la ebullición.    Continuar la ebullición hasta que el volumen del líquido contenido en el matraz se reduzca a unos 75 ml y se trasvasa cuantitativamente, después de enfriar a un matraz aforado de 100 ml. Completar el volumen con agua. Proceder a la valoración de los  sulfatos sobre una muestra de ensayo de 40 ml como se indica en 2.2.1.  2.3. Expresión de los resultados   El contenido en sulfatos expresado en miligramos por litro de sulfato de potasio SO4K2 es:18,67 × m   El contenido en sulfatos de mostos o vino se expresa en miligramos por litro de sulfato de potasio, sin decimales.2.3.2. Repetitividad   Hasta 1 000 mg/l: r = 27 mg/lAlrededor de 1 500 mg/l: r = 41 mg/l2.3.3. Reproductividad   Hasta 1 000 mg/l: R = 51 mg/lAlrededor 1 500 mg/l: R = 81 mg/l3. MÉTODO  RÁPIDO  DE  ENSAYO  3.1. Reactivos  3.1.1. Solución patrón de cloruro bárico   2 804 g de cloruro bárico, BaCl2, 2H2O y 10 ml de ácido clorhídrico (densidad 20 ° = 1,15 = 1,18 g/ml) se disuelven en una cantidad de agua suficiente para obtener 1 litro de disolución, 1 ml de esta solución precipita una cantidad de iones sulfato  equivalente a 2 mg de sulfato potásico.   3.1.2. Ácido sulfúrico (densidad 20 ° = 1,84 g/ml) en solución diluida 1/10 (m/v).3.2. Procedimiento   En tres tubos de ensayo, colocar 10 ml de mosto o vino, añadir al primero 3,5 ml, al segundo 5 ml y al tercero 10 ml de la solución de cloruro de bario. Agitar y llevar a ebullición, dejar reposar de 1 a 2 horas. El líquido de cada tubo, decantado, se  filtra y se divide en dos mitades. En la primera mitad se añaden unas gotas de ácido sulfúrico, en la segunda mitad se añaden unas gotas de la solución de cloruro de bario. Examinar la limpidez o la turbidez de cada tubo. La conclusión se da en la  siguiente tabla.                        VinoCloruro BáricoVino filtrado +Ácido Sulfúrico diluìdoSolución de Cloruro de Bario1er ensayo(ml)(ml)TurbidezLimpidez103,5menos 0,7 g/l K2SO4 Limpidez  Turbidez más de 0,7 g/l K2SO42o ensayo105TurbidezLimpidezmenos de 1 g/l K2SO4 Limpidez  Turbidez más de 1 g/l K2SO43er ensayo1010TurbidezLimpidezmenos de 2 g/l K2SO4 Limpidez  Turbidez más de 2 g/l K2SO4    13. ACIDEZ  TOTAL 1. DEFINICIÓN   La acidez total es la suma de los ácidos valorables cuando se lleva el pH a 7 añadiendo una solución alcalina valorada.    El dióxido de carbono no se incluye en la acidez total.2. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Valoración potenciométrica o valoración en presencia de azul de bromotimol como indicador del final de reacción, mediante comparación con un patrón de coloración.3. REACTIVOS  3.1. Solución tampón de pH 7,0:Fosfato monopotásico (KH2PO4) : 107,3 g Solución M de hidróxido sódico (NaOH) : 500 ml Agua csp : 1 000 ml.    También pueden utilizarse las soluciones comerciales como solución tampón de referencia.   3.2. Solución 0,1 M de hidróxido sódico (NaOH).   3.3. Solución de azul de bromotimol de 4 g/l.     Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S)4 gAlcohol neutro 96 % vol  200 mlUna vez solubilizado, añadir:Agua sin CO²  200 mlSolución M de hidróxido sódicocsp coloración verdeazulada (pH 7)   7,5 mlAgua csp1 000 ml4. APARATOS  4.1. Trompa de vacío.   4.2. Matraz kitasato de 500 ml.   4.3. Potenciómetro con escala graduada en unidades de pH y electrodos. El electrodo de vidrio debe conservarse en agua destilada. El electrodo de calomelanos de cloruro potásico saturado debe conservarse en una solución saturada de cloruro potásico.  Generalmente se emplea un electrodo combinado, que se conserva en agua destilada.   4.4. Vasos de precipitados de 50 ml de capacidad (en caso de vinos) y de 100 ml de capacidad (en caso de mostos concentrados rectificados).5. PROCEDIMIENTO  5.1. Preparación de la muestra  5.1.1. Vino   Eliminación del dióxido de carbono. Colocar aproximadamente 50 ml de vino, en un matraz kitasato; agitar y, al mismo tiempo, hacer el vacío con una trompa de agua. La agitación debe durar de 1 a 2 minutos.  5.1.2. Mosto concentrado rectificado   Verter 200 g de mosto concentrado rectificado, exactamente pesado en un matraz aforado de 500 ml. Enrasar con agua. Homogeneizar.5.2. Valoración potenciométrica  5.2.1. Calibrado del pH-metro   La calibración del pH-metro se efectúa a 20 °C, siguiendo las indicaciones del aparato que se utilice, mediante la solución tampón de pH 7,00 a 20 °C.5.2.2. Técnica de una medida   En un vaso de precipitados (4.4) verter 10 ml, si se trata de vino, o 50 ml, en el caso del mosto concentrado rectificado de muestra preparada, como se indica en (5.1). Añadir 10 ml de agua destilada, aproximadamente, y verter con una bureta la  solución 0,1 M de hidróxido sódico (3.2) hasta que el pH sea igual a 7 a 20 °C. La adición de la solución alcalina debe realizarse lentamente, agitando constantemente la solución. Se denominará n al número de mililitros de NaOH 0,1 M vertidos.5.3.  Valoración con indicador (azul de bromotimol)  5.3.1. Ensayo previo: obtención del patrón de coloración   En un vaso de precipitados (4.4), echar 25 ml de agua destilada y hervida, 1 ml de solución de azul de bromotimol (3.3) y 10 ml si se trata de vino o 50 ml en el caso del mosto concentrado rectificado de muestra preparada como se indica en (5.1).  Añadir la solución 0,1 M de hidróxido de sodio (3.2) hasta obtener una coloración verdeazulada. Añadir 5 ml de la solución tampón pH 7 (3.1).5.3.2. Determinación   En un vaso de precipitados (4.4), echar 30 ml de agua destilada y hervida, 1 ml de solución de azul de bromotimol (3.3) y 10 ml si se trata de vino o 50 ml en el caso del mosto concentrado rectificado de muestra preparada como se indica en (5.1).  Añadir la solución 0,1 M de hidróxido sódico (3.2) hasta obtener una coloración idéntica a la obtenida en el ensayo previo (5.3.1). Se denominará n al número de mililitros de solución de hidróxido sódico 0,1 M utilizados.6. EXPRESIÓN  DE  LOS   RESULTADOS  6.1. Método de cálculo  6.1.1. Vino   La acidez total, expresada en miliequivalentes por litro, será:    A = 10 nSe dará con 1 decimal.La acidez total, expresada en gramos de ácido tartárico por litro, será:    A2 = 0,075 · ASe dará con 1 decimal.6.1.2. Mostos concentrados rectificados   - Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de mosto concentrado rectificado: a = 5 · n - Acidez total expresada en miliequivalentes por kilogramo de azúcares totales:P = contenido en % (m/m) de azúcares totales.  Se dará con 1 decimal.6.2. Repetibilidad (r): para la valoración con indicador (5.3):    r = 0,9 meq por litror = 0,07 g de ácido tartárico por litropara los vinos blancos, rosados y tintos.6.3. Reproductibilidad (R): para la valoración con indicador (5.3)   Para los vinos blancos y rosados:R = 3,6 meq por litroR = 0,3 g de ácido tartárico por litro.    Para los vinos tintos:R = 5,1 meq por litroR = 0,4 g de ácido tartárico por litro.      14. ACIDEZ  VOLÁTIL 1. DEFINICIÓN   La acidez volátil está constituida por los ácidos grasos pertenecientes a la serie acética que se encuentran en los vinos, bien en estado libre, bien en estado salificado.2. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Valoración de los ácidos volátiles separados del vino por arrastre de vapor de agua y rectificación de los vapores.    Previamente, debe eliminarse el dióxido de carbono del vino.    La acidez del dióxido de azufre libre y combinado destilado en dichas condiciones debe restarse de la acidez del destilado.    Debe restarse, asimismo, la acidez del ácido sórbico eventualmente añadido al vino.    Nota:El ácido salicílico que en algunos países se utiliza para estabilizar los vinos antes del análisis, se encuentra en parte en el destilado. Es necesario valorarlo y restarlo de la acidez. El método de esta determinación está en el apartado 7 de  este capítulo.3. REACTIVOS  3.1. Ácido tartárico cristalizado (C4H6O6)  3.2. Solución 0,1 M de hidróxido sódico (NaOH)  3.3. Solución de fenolftaleína al 1 % en alcohol neutro de 96 % vol  3.4. Ácido clorhídrico (r20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diluido 1/4 (v/v)  3.5. Solución 0,005 M de yodo (I2)  3.6. Yoduro potásico cristalizado (Kl)  3.7. Engrudo de almidón de 5 g/l:Diluir 5 g de almidón en 500 ml de agua, aproximadamente. Llevar a ebullición agitando y mantenerla durante 10 minutos; añadir 200 g de cloruro sódico. Una vez frío enrasar hasta 1 litro.   3.8. Solución saturada de borato sódico (Na2B4O7 · 10 H2O) es decir, aproximadamente 55 g/l a 20° C.4. APARATOS  4.1. Aparato de arrastre de vapor de agua, compuesto de:1) Un generador de vapor de agua; el vapor de agua producido debe estar exento de dióxido de carbono.2) Un borboteador.3) Una columna rectificadora.4) Un refrigerante.Este aparato debe responder a  los tres ensayos siguientes:a) Poner en el borboteador 20 ml de agua hervida; recoger 250 ml de destilado y añadirles 0,1 ml de solución 0,1 M de hidróxido sódico (3.2) y 2 gotas de la solución de fenolftaleína (3.3); la coloración rosa debe permanecer  estable durante 10 segundos, por lo menos (vapor de agua exento de dióxido de carbono).b) Poner en el borboteador 20 ml de solución 0,1 M de ácido acético. Recoger 250 ml de destilado. Valorar con la solución 0,1 M de hidróxido sódico (3.2). El volu- men empleado deberá ser igual a 19,9 ml, como mínimo. (Ácido acético arrastrado F 99,5 %.)c) Poner en el borboteador 20 ml de solución M de ácido láctico. Recoger 250 ml de destilado y valorar su acidez con una solución 0,1 M de hidróxido sódico  (3.2).El volumen empleado debe ser inferior o igual a 1,0 ml. (Ácido láctico destilado E 0,5 %.)Todo aparato o técnica que satisfaga estos tres ensayos constituye un aparato o una técnica oficial internacional.   4.2. Trompa de vacío.   4.3. Matraz kitasato.5. PROCEDIMIENTO  5.1. Preparación de la muestra: eliminación del dióxido de carbono.    Poner alrededor de 50 ml de vino en un matraz kitasato; agitar y, al mismo tiempo, hacer el vacío por medio de la trompa de agua. La agitación debe durar de 1 a 2 minutos5.2. Arrastre por vapor deagua   Echar en el borboteador 20 ml de vino desprovisto de carbónico como se indica en (5.1). Añadir 0,5 g de ácido tartárico (3.1) aproximadamente. Recoger, por lo menos, 250 ml de destilado.5.3. Valoración   Valorar con la solución 0,1 M de hidróxido sódico (3.2) en presencia de 2 gotas de solución de fenolftaleína (3.3). Se denominará n ml al volumen utilizado.    Añadir 4 gotas de ácido clorhídrico diluido 1/4 (3.4), 2 ml de engrudo de almidón (3.7) y algunos cristales de yoduro de potasio (3.6). Valorar el dióxido de azufre libre con la solución 0,005 M de yodo (3.5). Se denominará n2 ml al volumen utilizado.     Añadir la solución saturada de borato sódico (3.8) hasta que reaparezca la coloración rosa. Valorar el dióxido de azufre combinado con la solución 0,005 M de yodo (3.5). Se denominará n" ml al volumen utilizado.6. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  6.1. Método de cálculo  La acidez volátil, expresada en miliequivalentes por litro, con 1 decimal, será:A = 5 (n   0,1 n2   0,05 n")   La acidez volátil, expresado en granos de ácido acético por litro, con 2 decimales, será:0,300 (n   0,1 n2   0,05 n")6.2. Repetibilidad (r)   r = 0,7 meq por litror = 0,04 g de ácido acético por litro.6.3. Reproductibilidad (R)   R = 1,3 meq por litroR = 0,08 g de ácido acético por litro.  6.4. Caso de un vino con adición de ácido sórbico   Dado que el ácido sórbico se arrastra por vapor de agua en un 96 % para un volumen de destilado de 250 ml, su acidez debe restarse de la acidez volátil, sabiendo que 100 mg de ácido sórbico corresponden a una acidez de 0,89 miliequivalentes o de 0,053  g de ácido acético y conociendo el contenido en ácido sórbico (mg/l) determinado previamente.7. DETERMINACIÓN  DEL  ÁCIDO  SALICÍLICO  QUE  SE  HALLA  EN  EL  DESTILADO  UTILIZADO  PARA  VALORAR  LA  ACIDEZ  VOLÁTIL  7.1. Fundamento   Una vez efectuada la determinación de la acidez volátil y la corrección del dióxido de azufre, la presencia de ácido salicílico se caracteriza por la aparición, previa acidificación, de una coloración violeta tras haber añadido una sal de hierro III.    La determinación del ácido salicílico que se halla en el destilado se efectuará con un segundo destilado cuyo volumen sea igual al del utilizado para determinar la acidez volátil. En este destilado, el ácido salicílico se determinará mediante un método  colorimétrico de comparación y se restará de la acidez volátil.7.2. Reactivos  7.2.1. Ácido clorhídrico (HCl) (r20 = 1,18 a 1,19 g/ml).   7.2.2. Tiosulfato sódico (Na2S2O3 · 5 H2O) 0,1 M.   7.2.3. Solución de sulfato de hierro III y de amonio (Fe2(SO4)3 · (NH4)2SO4· 24 H2O) al 10 % (m/v).   7.2.4. Solución de salicilato de sodio (Na C7H5O3) 0,01 M que contenga 1,60 g/l.7.3. Procedimiento  7.3.1. Caracterización del ácido salicílico en el destilado de la acidez volátil   Inmediatamente después de haber efectuado la determinación de la acidez volátil y la corrección del dióxido de azufre libre y combinado, verter en el matraz erlenmeyer 0,5 ml de ácido clorhídrico (7.2.1), 3 ml de solución 0,1 M de tiosulfato sódico  (7.2.2) y 1 ml de solución de sulfato de hierro III y de amonio (7.2.3).    En presencia de ácido salicílico, aparece una coloración violeta.7.3.2. Determinación del ácido salicílico   En el matraz erlenmeyer anterior, indicar mediante una señal de referencia el volumen del destilado. Vaciar y enjuagar el matraz.    Someter una nueva toma de ensayo de 20 ml de vino al arrastre por vapor de agua y recoger el destilado en el matraz erlenmeyer hasta la señal de referencia. Añadir 0,3 ml de ácido clorhídrico puro (7.2.1) y 1 ml de solución de sulfato de hierro III y  de amonio (7.2.3). El contenido del matraz erlenmeyer adquiere una coloración violeta.    En un matraz erlenmeyer idéntico al de la señal de referencia, verter agua destilada hasta el mismo nivel que el del destilado. Añadir 0,3 ml de ácido clorhídrico puro (7.2.1), 1 ml de solución de sulfato de hierro III y de amonio (7.2.3). Verter con  una bureta la solución de salicilato sódico 0,01 M (7.2.4) hasta que se obtenga una coloración violeta de la misma intensidad que la del matraz erlenmeyer que contiene el destilado de vino.    Se denominará n" al número de mililitros utilizados.  7.4. Corrección de la acidez volátil   Restar el volumen 0,1 · n4 en ml, del volumen n, en ml de solución de hidróxido sódico 0,1 M utilizado para valorar la acidez del destilado en una determinación distinta de la de la acidez volátil.     15.  ACIDEZ  FIJA 1. FUNDAMENTO   La acidez fija se determina por la diferencia entre la acidez total y la acidez volátil.2. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   La acidez fija se expresa en:- miliequivalentes por litro,- gramos de ácido tartárico por litro.     16. ÁCIDO  TARTÁRICO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método de referencia   El ácido tartárico precipitado en forma de racemato de calcio, se determina gravimétricamente. Esta determinación puede completarse con una determinación volumétrica de comparación. Las condiciones de precipitación: pH, volumen total empleado,  concentración de los iones que precipitan, son tales que el racemato cálcico precipita totalmente mientras que el D( ) tartrato de calcio queda en solución.    Cuando se haya añadido al vino ácido metatartárico (lo que hace que la precipitación del racemato de calcio sea incompleta), deberá hidrolizarse previamente.1.2. Método usual   El ácido tartárico, aislado mediante una columna cambiadora de aniones, se determina por espectrofotometría en el eluido por la coloración roja que da con el ácido vanádico. Este eluido contiene asimismo ácidos láctico y málico, que no interfieren.2.  MÉTODO  DE  REFERENCIA  2.1.Método gravimétrico  2.1.1. Reactivos  2.1.1.1. Solución de acetato cálcico que contenga 10 g/l de calcio:  Carbonato de calcio puro: (Ca CO3)25 gÁcido acético (CH3COOH) (r20 = 1,05 g/ml)40 mlAgua csp 1 l  2.1.1.2. Racemato de calcio cristalizado: (CaC4O6H4 · 4H2O):En un vaso de precipitados de 400 ml introducir 20 ml de una solución de ácido L(+) tartárico de 5 g/l, 20 ml de una solución de D( ) tartrato amónico de 6,126 g/l y 6 ml de la solución de  acetato cálcico de 10 g de calcio por litro (2.1.1.1).Dejar que precipite durante dos horas. Recoger el precipitado en un crisol filtrante de porosidad no 4, lavarlo tres veces con 30 ml de agua destilada. Secar en estufa a 70 °C hasta lograr un peso  constante. Con las cantidades de reactivos empleados, se obtienen aproximadamente 340 mg de racemato de calcio cristalizado, con 4 moléculas de agua.    Conservar en un frasco tapado.    2.1.1.3. Licor de precipitación (pH: 4,75):- Ácido D( ) tartárico  122 mg- Solución de hidróxido de amonio 25 % (r20 = 0,97 g/ml) diluido al 25 % (v/v)   0,3 ml- Solución de acetato de calcio de 10 g de calcio por litro   8,8 ml- Agua csp1 000 ml   Disolver el ácido D( ) tartárico y añadir el hidróxido amónico, llevar el volumen aproximadamente a 900 ml con agua; añadir 8,8 ml de solución de acetato cálcico (2.1.1.1), llevar hasta el litro y ajustar el pH a 4,75 con ácido acético. Al ser el  racemato cálcico ligeramente soluble en este licor, es conveniente añadir 5 mg de racemato de calcio por litro, agitar durante 12 horas (una noche) y filtrar.2.1.2.Procedimiento  2.1.2.1. Vinos a los que no se ha añadido ácido metatartárico   En un vaso de precipitados de 600 ml, echar 500 ml de licor de precipitación y 10 ml de vino. Mezclar y ayudar la precipitación frotando las paredes del vaso con la extremidad de una varilla de vidrio. Dejar precipitar durante 12 horas (una noche).    Filtrar en el crisol filtrante de porosidad no 4 tarado y colocado sobre un kitasato, arrastrando el precipitado. Lavar el vaso donde se ha realizado la precipitación con el filtrado y arrastrar las últimas partículas de precipitado.    Secar en estufa a 70 °C hasta lograr un peso constante. Pesar: se denominará p al peso del racemato de calcio, CaC4O6H4 cristalizado con 4 moléculas de agua.2.1.2.2. Vinos a los que se ha añadido ácido metatartárico   Cuando se trate de un vino al que se haya añadido ácido metatartárico o se suponga que ha habido tal adición, se procederá a la hidrólisis de este ácido en las condiciones siguientes:    En un erlenmeyer de 50 ml, echar 10 ml de vino y 0,4 ml de ácido acético puro (CH3COOH, r20 = 1,05 g/ml). Cerrar el erlenmeyer con un tapón provisto de un escape y llevar a ebullición durante 30 minutos. Una vez frío, pasar el líquido del erlenmeyer a  un vaso de precipitados; enjuagar el erlenmeyer 2 veces con 5 ml de agua y continuar como se indica en el procedimiento anterior.    El ácido metatartárico se expresa como ácido tartárico en el resultado de la determinación.2.1.3. Expresión de los resultados   Una molécula de racemato cálcico corresponde a 1/2 molécula de ácido (L+) tartárico del vino.    La cantidad de ácido tartárico por litro de vino será:    - 384,5 p, expresada en miliequivalentes,    -  28,84 p, expresada en gramos de ácido tartárico,    -  36,15 p, expresada en gramos de tartrato ácido de potasio.     Se dará con un decimal.2.2. Determinación volumétrica de comparación  2.2.1. Reactivos  2.2.1.1. Ácido clorhídrico (CIH) (r20 = 1,18 a 1,19 g/ml) diluido a 1/5 (v/v).   2.2.1.2. Solución de EDTA, 0,05 M:- EDTA (sal disódica bihidratada del ácido etilendiaminotetracético (C10H14N2O8Na2 · 2H2O)  18,61 g- Agua destilada csp:1 000   ml  2.2.1.3. Solución de hidróxido sódico al 40 % (m/v):Hidróxido sódico (NaOH)  40   gAgua destilada csp  100   ml  2.2.1.4. Indicador complexométrico del EDTA. 1 % (m/m):Ácido calcon carbónico o ácido 2-hidroxi-4-sulfo-1-naftilazo-3-naftoico (C21H14N2O7S · 3H2O) 1 gSulfato sódico anhidro (Na2SO4)100 g2.2.2. Procedimiento   Después de pesado se vuelve a colocar el crisol con el precipitado de racemato de calcio en el matraz de vacío y se disuelve el precipitado en 10 ml de ácido clorhídrico diluido (2.2.1.1). Lavar el crisol filtrante con 50 ml de agua destilada.    Añadir 5 ml de hidróxido sódico al 40 % (2.2.1.3) y unos 30 mg del indicador (2.2.1.4). Valorar con EDTA 0,05 M (2.2.1.2). Se denominará n al número de mililitros empleados.2.2.3. Expresión de resultados   La cantidad de ácido tartárico por litro de vino expresado en miliequivalentes es igual a: 5 n.    El resultado se dará con 1 decimal.    La cantidad de ácido tartárico por litro de vino, expresado en gramos de ácido tártrico es igual a: 0,375 n.    El resultado se dará con 1 decimal.    La cantidad de ácido tartárico por litro de vino, expresado en gramos de tartrato ácido de potasio es igual a: 0,470 n.    El resultado se dará con 1 decimal.3. MÉTODO  USUAL  3.1. Reactivos  3.1.1. Para el tratamiento preliminar del vino  3.1.1.1. Ácido acético (CH3COOH, r20 = 1,05 g/ml) diluido al 30 % (v/v).   3.1.1.2. Intercambiador de aniones de fuerte basicidad (por ejemplo, intercambiador de aniones III de Merck de 20 a 50 mallas) en forma de acetato. Preparar una suspensión con el intercambiador (100 g aproximadamente) en 200 ml de ácido acético diluido  al 30 % (3.1.1.1).    Mantener en contacto durante 24 horas, como mínimo, antes de su utilización. Conservar el intercambiador en ácido acético diluido al 30 % para posteriores determinaciones.   3.1.1.3. Ácido acético (CH3COOH, r20 = 1,05 g/ml) diluido al 0,5 % (v/v).   3.1.1.4. Solución de sulfato sódico (Na2SO4) al 7,1 g/100 ml (0,5 M).    Disolver 71 g de sulfato sódico anhidro (Na2SO4) en agua destilada hasta alcanzar un volumen de 1 000 ml.3.1.2. Para la determinación del ácido tartárico  3.1.2.1. Solución de acetato de sodio (NaCH3COO) al 27 % (m/v).    Disolver 270 g de acetato de sodio anhidro (NaCH3COO) en agua destilada hasta alcanzar un volumen de 1 000 ml.   3.1.2.2. Reactivo vanádico   Disolver 10 g de metavanadato amónico (NH4VO3) en 150 ml de solución de hidróxido sódico M (3.1.2.10). Pasar esta solución a un matraz aforado de 500 ml y añadir 200 ml de solución de acetato de sodio al 27 % (3.1.2.1). Enrasar a 500 ml con agua  destilada.   3.1.2.3. Solución de H2SO41M.   3.1.2.4. Solución 0,5 M de H2SO4.   3.1.2.5. Solución 0,05 M de H2SO4.   3.1.2.6. Solución de ácido peryódico 0,05 M.    En un matraz aforado de 1 000 ml, introducir 10,696 g de peryodato sódico (NaIO4), 50 ml de ácido sulfúrico 0,5 M (3.1.2.4) y añadir agua destilada hasta obtener 1 000 ml.   3.1.2.7. Solución de glicerol al 10 % (m/v).    En un matraz aforado de 100 ml poner 10 g de glicerol (C3H8O3) y añadir agua destilada hasta obtener 100 ml.   3.1.2.8. Solución de sulfato sódico al 7,1 g p. 100 ml (véase 3.1.1.4).   3.1.2.9. Solución de ácido tartárico (C4H6O5) de 1 g/l.    En un matraz aforado de 500 ml, poner 0,5 g de ácido tartárico, 6,66 ml de solución de hidróxido sódico M (3.1.2.10) y enrasar a 500 ml con la solución de sulfato de sodio al 7,1 % (3.1.1.4).   3.1.2.10. Solución de hidróxido sódico (NaOH) 1 M.3.2. Aparatos  3.2.1. Columna de vidrio de 300 mm de longitud, aproximadamente, y de 10 a 11 mm de diámetro interior, provista de una llave.   3.2.2. Espectrofotómetro que permita medir la absorbancia a una longitud de onda de 490 nm, con cubetas de 10 mm de recorrido óptico.3.3.Procedimiento  3.3.1. Preparación de la columna intercambiadora de iones Poner en la columna de vidrio un tapón de lana de vidrio por encima de la llave (3.2.1). Impregnar el tapón con agua destilada. Verter en la columna 10 ml de suspensión de inter cambiador de iones en fase de acetato (3.1.1.2). Dejar decantar. Colocar  un tapón de lana de vidrio en la superficie del intercambiador depositado (para evitar que, en posteriores lavados, el intercambiador vuelva a formar una suspensión).    El intercambiador sólo deberá utilizarse una vez.3.3.2. Aislamiento de los ácidos orgánicos   Con la llave abierta, dejar que salga la solución de ácido acético hasta que rebase aproximadamente 2 a 3 mm del tapón de lana de vidrio, colocado por encima del intercambiador.    Añadir 10 ml de solución de ácido acético al 0,5 % (3.1.1.3) y dejar que salga el líquido hasta que llegue al mismo nivel de la vez anterior. Repetir 4 veces más la operación de lavado.    Tras el último lavado, con la llave cerrada, verter sobre el intercambiador 10 ml de vino o de mosto. Dejar salir el vino gota a gota (a razón de 1 gota por segundo) e interrumpir la salida cuando el líquido se halle justo por encima del  intercambiador. Volver a añadir en la columna 10 ml de solución de ácido acético al 0,5 % (3.1.1.3), dejar salir a la misma velocidad que la vez anterior y repetir el lavado otras 7 veces con 10 ml de agua cada vez. En el último lavado, cerrar la llave  en cuanto el nivel del líquido se halle un poco por encima del tapón superior de lana de vidrio.    Eluir los ácidos fijados sobre el intercambiador con la solución de sulfato sódico al 7,1 % (3.1.1.4); recoger el eluido en un matraz aforado de 100 ml hasta el enrase.3.3.3. Determinación del ácido tartárico  3.3.3.1. Vinos a los que no se ha añadido ácido metatartárico.    Introducir 20 ml de eluido en 2 matraces erlenmeyer «a» y «b».    El matraz erlenmeyer «a» sirve para efectuar la determinación, el matraz erlenmeyer «b», en el que el ácido tartárico es destruido por el ácido peryódico, sirve de testigo.    Echar en el matraz erlenmeyer «a»:- 2 ml de H2SO4M (3.1.2.3),- 5 ml de H2SO40,05 M (3.1.2.5),- 1 ml de glicerol al 10 % (3.1.2.7).    Echar en el matraz erlenmeyer «b»:- 2 ml de H2SO4M (3.1.2.3),- 5 ml de solución de ácido peryódico 0,05 M (3.1.2.6).    Esperar 15 minutos. Añadir:- 1 ml de solución de glicerol al 10 % (3.1.2.7) para destruir el exceso de ácido peryódico.    Esperar 2 minutos.    Verter entonces, agitando, primero en el matraz erlenmeyer «b», y acto seguido en el matraz «a», 5 ml de reactivo vanádico (3.1.2.2). Poner en marcha inmediatamente un cronómetro y colocar el contenido de los matraces «a» y «b» en las cubetas del  espectrofotómetro. Al cabo de 90 segundos medir la absorbancia, a 490 nm, del líquido procedente del matraz erlenmeyer «a» (determinación), con relación al testigo (matraz «b»). Si el eluido contiene mucho ácido tartárico y por consiguiente la  absorbancia es muy elevada, diluir el eluido con la solución de sulfato sódico al 7,1 % y proceder a la medida de la solución diluida.  3.3.3.2. Vinos a los que se ha añadido ácido metatartárico.    Cuando se trate de un vino al que se ha añadido ácido metatartárico o se suponga que ha habido tal adición, se procederá a la hidrólisis de ese ácido tal como se indica para el método de referencia.    Una vez frío, se vierte el contenido del matraz erlenmeyer, así como el agua de lavados (2 veces con 5 ml cada vez), en la parte superior de la columna de intercambiador. Continuar como se ha indicado antes.    El ácido metatartárico está incluido como ácido tartárico en el resultado de la determinación.3.3.4. Obtención de la curva patrón   Verter 10, 20, 30, 40 y 50 ml de solución de ácido tartárico de 1 g/l (3.1.2.9) en matraces aforados de 100 ml y enrasar con la solución de sulfato de sodio al 7,1 % (3.1.1.4). Las concentraciones de estas soluciones corresponden en las condiciones de  trabajo a contenidos en el vino de 1, 2, 3, 4 y 5 g de ácido tartárico por litro.    En 2 matraces erlenmeyer «a» y «b», verter 20 ml de estas soluciones y continuar como se ha indicado anteriormente para el eluido de vino.    La representación gráfica de las absorbancias de estas soluciones en función del contenido en ácido tartárico es una recta que se curva ligeramente hacia el punto cero. Si fuera necesario precisar esta parte de la curva, medir soluciones cuyo contenido  sea inferior a 1,0 g/l.3.3.5. Expresión de los resultados   Llevar a la curva patrón la absorbancia resultante de medir el eluido, para obtener el contenido del vino en ácido tartárico expresado en gramos por litro.    El contenido se indicará con 1 decimal.     17. ACIDO  CÍTRICO 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   El ácido cítrico se transforma en oxaloacetato y acetato en una reacción catalizada por la citrato-liasa (CL):citrato  oxaloacetato + acetato   En presencia de malato-deshidrogenasa (MDH) y de lactato-deshidrogenasa (LDH), el oxaloacetato y su derivado de decarboxilación, el piruvato, se reducen en L-malato y L-lactato por la nicotinamida-adenina-dinucleótida reducida (NADH):Oxaloacetato +  NADH + H+  L-malato + NAD+Piruvato + NADH + H+  L-lactato + NAD+   La cantidad de NADH oxidada a NAD+ en estas reacciones es proporcional al citrato presente. La oxidación de la NADH se mide mediante la disminución de su absorbancia a una longitud de onda de 340 nm.2. REACTIVOS  2.1. Tampón pH 7,8 (glicilglicina 0,51 M; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 · 10 3M):disolver 7,13 g de glicilglicina en 70 ml, aproximadamente, de agua bidestilada; ajustar el pH a 7,8 con 13 ml, aproximadamente, de solución de hidróxido de sodio 5 M; añadir 10 ml de solución de  cloruro de cinc Zn Cl2 de 80 mg en 100 ml y enrasar hasta 100 ml con agua bidestilada.    La solución permanecerá estable durante 4 semanas, por lomenos, a + 4 °C.   2.2. Solución de nicotinamida-adenin-dinucleótido reducida (NADH) (aproximadamente 6 · 10 3M); disolver 30 mg de NADH y 60 mg de NaHCO3 con 6 ml de agua bidestilada.   2.3. Solución de malato-deshidrogenasa/lactato-deshidrogenasa (MDH/LDH), (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml): se hace una mezcla de 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml) / 0,4 ml de solución de sulfato de amonio (3,2 M) y 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Esta solución se mantendrá  estable durante 1 año, por lo menos, a + 4 °C.   2.4. Citrato-liasa CL (5 mg de proteína/ml). Disolver 168 mg de liofilizado en 1 ml de agua muy fría. La solución es estable por lo menos durante 1 semana a + 4 °C y durante 4 semanas congelada.    Antes de la determinación, se recomienda proceder a la comprobación de la actividad de la enzima.   2.5. Polivinil polipirrolidona (PVPP) Nota: El conjunto de estos reactivos se comercializan preparados.3. MATERIAL  3.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 340 nm, máximo de absorción de la NADH.    En su defecto, fotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o a 365 nm. Dado que se trata de medidas absolutas de absorbancia (no existe gama de contraste, sino referencia al coeficiente de extinción de la NADH), deben  controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato.   3.2. Cubetas de vidrio de 1 cm de trayecto óptico o cubetas de uso único.   3.3. Micropipetas que permitan tomar volúmenes comprendidos entre 0,02 ml y 2 ml.  4. PREPARACIÓN  DE  LA  MUESTRA   La determinación del citrato se efectúa directamente sobre el vino sin decoloración previa y sin dilución, siempre que el contenido en ácido cítrico sea inferior a 400 mg/l. Si no, proceder a la dilución del vino de forma que la concentración de  citrato se sitúe entre 20 y 400 mg/l (cantidad de citrato en la muestra comprendida entre 5 µg y 80 µg).    En el caso del vino tinto rico en compuestos fenólicos, se recomienda tratarlo previamente con PVPP:    poner en suspensión en el agua alrededor de 0,2 g de PVPP y dejar reposar 15 minutos. Filtrar sobre filtro de pliegues.    Añadir a 10 ml de vino colocado dentro de un erlenmeyer de 50 ml, el PVPP húmedo extraído con la espátula del filtro. Agitar durante 2 a 3 minutos y filtrar.5. PROCEDIMIENTO   Se ajusta la longitud de onda del espectrofotómetro a 340 nm y se realizan las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm, habiendo ajustado el cero de absorbancia con respecto al aire (sin cubetas en el trayecto óptico). Introducir en cubetas de 1 cm:      Testigo MuestraSolución 2.1 1,00 ml 1,00 mlSolución 2.2 0,10 ml 0,10 mlMuestra - 0,20 mlAgua bidestilada 2,00 ml 1,80 mlSolución 2.3 0,02 ml 0,02 ml   Mezclar; transcurridos unos 5 minutos, leer las absorbancias de las soluciones testigo y muestra (A1).    Añadir:Solución 2.4 0,02 ml 0,02 ml   Mezclar; esperar a que finalice la reacción (unos 5 minutos) y leer las absorbancias de las soluciones testigo y muestra (A2).    Determinar las diferencias de absorbancias (A1   A2) del testigo y de la muestra.    Restar la diferencia de absorbancias del testigo de la diferencia de absorbancias de la muestra:DA = DAM   DAT   Nota: El tiempo necesario para la acción de las enzimas puede variar de un lote a otro. Únicamente se ha dado a título indicativo. Se recomienda determinarlo para cada lote.6. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   El contenido en ácido cítrico se expresa en miligramos por litro (mg/l) sin decimales.6.1. Método de cálculo   La concentración en miligramos por litro viene dada por la fórmula general: Según las condiciones operatorias expresadas en el punto 5 serían:V = volumen total en ml (3,14 ml)V = volumen de la muestra en ml (0,2 ml)P M = masa molecular de la sustancia que va a determinarse (ácido cítrico anhidro = 192,1)d = trayecto óptico de  la cubeta en cm (1 cm)e = coeficiente de extinción del NADH:a 340 nm, e = 6,3 mmol 1 · l · cm 1.    Se obtiene:C = 479 · DA   Si al preparar la muestra se ha efectuado una dilución, multiplicar el resultado por el factor de dilución.    Nota:a 334 nm: C = 488 · DA (e= 6,2 mmol 1 · l · cm 1)a 365 nm: C = 887 · DA (e= 3,4 mmol 1 · l · cm 1)6.2. Repetibilidad (r):    Contenido en ácido cítrico inferior a 400 mg/l: r = 14 mg/lContenido en ácido cítrico superior a 400 mg/l: r = 28 mg/l6.3. Reproductibilidad (R):    Contenido en ácido cítrico inferior a 400 mg/l: R = 39 mg/l.Contenido en ácido cítrico superior a 400 mg/l: R = 65 mg/l.     18. ÁCIDO  LÁCTICO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método de referencia:    En presencia de nicotinamida-adenin-dinucleótido (NAD), el ácido láctico total (L-lactato y D-lactato) se oxida a piruvato en una reacción catalizada por L-lactato deshidrogenasa (L-LDH) y D-lactato deshidrogenasa (D-LDH).    El equilibrio de la reacción está desplazado en el sentido del lactato. La eliminación del piruvato del medio de reacción desplaza el equilibrio hacia la formación de piruvato.    En presencia de L-glutamato, el piruvato se transforma en L-alanina en una reacción catalizada por la glutamato-piruvato-transaminasa (GPT)(1) L-lactato + NAD+  piruvato + NADH + H+(2) D-lactato + NAD+  piruvato + NADH + H+(3) Piruvato + L-glutamato   L-alanina + a cetoglutarato   La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a una longitud de onda de 340 nm, es proporcional a la cantidad de lactato presente.    Nota:El ácido L-láctico puede determinarse individualmente mediante las reacciones (1) y (3).    El ácido D-láctico puede determinarse individualmente mediante las reacciones (2) y (3).1.2. Método usual:    El ácido láctico, separado en una columna de resina cambiadora de aniones, es oxidado a etanal y se determina por colorimetría después de reaccionar con nitroprusiato y piperidina.2. MÉTODO  DE  REFERENCIA  2.1. Reactivos  2.1.1. Solución tampón pH 10 (glicilglicina 0,6 moles/l; L-glutamato 0,1 moles/l).    Disolver 4,75 g de glicilglicina, 0,88 g de ácido L-glutámico en unos 50 ml de agua bidestilada; ajustar el pH a 10 con solución de hidróxido de sodio 10 M y llevar a 60 ml con agua bidestilada.    La solución permanece estable por lo menos 12 semanas a + 4 °C.   2.1.2. Solución de nicotinamida-adenin-dinucleótido (NAD) de alrededor de 40 · 10 3 M; disolver 900 mg de NAD en 30 ml de agua bidestilada. La solución permanece estable por lo menos 4 semanas a + 4 °C.   2.1.3. Suspensión de glutamato-piruvato-transaminasa (GPT) de 20 mg/ml. La suspensión es estable por lo menos 1 año a + 4 °C.   2.1.4. Suspensión de L-lactato-deshidrogenasa (L-LDH) de 5 mg/ml. La suspensión es estable por lo menos 1 año a + 4 °C.   2.1.5. Suspensión de D-lactato-deshidrogenasa (D-LDH) de 5 mg/ml. La solución es estable por lo menos 1 año a + 4 °C.    Antes de proceder a la determinación, se recomienda comprobar la actividad de las enzimas.     Nota:El conjunto de estos reactivos se comercializan preparados.2.2. Material  2.2.1. Espectrofotómetro que permita efectuar las medidas de 340 nm, máximo de absorción de la NADH.    En su defecto, fotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas de 334 nm o a 365 nm.    Dado que se trata de medidas absolutas de absorbancia (no se utiliza curva de calibrado sino el coeficiente de extinción de la NADH), deben controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato.   2.2.2. Cubetas de vidrio o desechables de 1 cm de trayecto óptico.   2.2.3. Micropipetas que permitan tomar volúmenes comprendidos entre 0,02 ml y 2 ml.2.3. Preparación de la muestra   Evítese tocar con los dedos la parte del vidrio que entre en contacto con el medio reactivo, ya que podría ser causa de un aporte de ácido L-láctico que falsearía el resultado.    Si la concentración en ácido láctico es inferior a 100 mg/l, la determinación del lactato se efectúa directamente sobre el vino sin decoloración previa ni dilución. Si la concentración del vino en ácido láctico está comprendida entre:100 mg/l y 1 g/l,  diluir 1/10 con agua bidestilada,1 g/l y 2,5 g/l, diluir 1/25 con agua bidestilada,2,5 g/l y 5 g/l, diluir 1/50 con agua bidestilada.2.4. Procedimiento  2.4.1. Determinación del ácido láctico total   La solución tampón debe llevarse a una temperatura entre 20 25° antes de proceder a la dosificación.   Se ajusta la longitud de onda del espectrofotómetro a 340 nm y se realizan las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm de trayecto óptico, habiendo ajustado el cero de absorbancia con respecto al aire (sin cubetas en el trayecto óptico) o con respecto  al agua.    Introducir en las cubetas de 1 cm de trayecto óptico:     Blanco MuestraSolución 2.1.1 1,00 ml 1,00 mlSolución 2.1.2 0,20 ml 0,20 mlAgua bidestilada 1,00 ml 0,80 mlSuspensión 2.1.3 0,02 ml 0,02 mlMuestra - 0,20 ml   Mezclar con un agitador de vidrio o con una varilla de material sintético de punta plana; transcurridos 5 minutos, aproximadamente, medir las absorbancias de las soluciones blanco y muestra (A1).    Añadir 0,02 ml de la solución 2.1.4 y 0,05 ml de la solución 2.1.5, homogeneizar, esperar a que finalice la reacción (unos 30 minutos) y medir las absorbancias de las soluciones blanco y muestra (A2).    Determinar las diferencias de absorbancia (A2   A1) para el blanco y la muestra.     Restar la diferencia de absorbancias del blanco (DAB) de la diferencia de absorbancias de la muestra (DAM).    DA = DAM   DAB2.4.2. Determinación del ácido L-láctico y del ácido D-láctico   La determinación del ácido L-láctico y D-láctico puede realizarse por separado aplicando el procedimiento indicado para el ácido láctico total, pero operando tras haber determinado A1.    Añadir 0,02 ml de la solución 2.1.4, homogeneizar, esperar a que finalice la reacción (alrededor de 20 minutos) y medir las absorbancias de las soluciones blanco y muestra (A2).    Añadir 0,05 ml de solución 2.1.5, homogeneizar, esperar a que finalice la reacción (alrededor de 30 minutos) y medir las absorbancias de las soluciones blanco y muestra (A3).    Determinar las diferencias de absorbancias (A2   A1) para el ácido L-láctico y (A3   A2) para el ácido D-láctico en el caso del blanco y en el caso de la muestra.    Restar la diferencia de absorbancias del blanco de la diferencia de absorbancias de la muestra.    DA = DAM   DAB   Nota: El tiempo necesario para la acción de las enzimas puede variar de un lote a otro. Aquí sólo se ha dado a título indicativo. Se recomienda determinarlo para cada lote. Si se determina únicamente el ácido L-láctico, el tiempo de incubación tras la  adición de la L-lactato-deshidrogenasa puede reducirse a 10 minutos.2.5. Expresión de los resultados   La concentración en ácido láctico se expresa en gramos por litro (g/l) con 1 decimal.   2.5.1. Método de cálculo   La concentración en gramos por litro se calcula con la fórmula general:V = volumen total en mililitros (V = 2,24 ml de ácido L-láctico, V = 2,29 ml de ácido D-láctico y ácido láctico total)v = volumen de la muestra en mililitros (aquí: 0,2 ml)PM = masa  molecular de la sustancia que va a determinarse (aquí: ácido DL-láctico = 90,08).d = trayecto óptico de la cubeta en centímetros (aquí: 1 cm) e= coeficiente de extinción de la NADH a 340 nm e = 6,3 (mmol 1 · l · cm 1)2.5.1.1. Ácido láctico total y ácido D-láctico   C = 0,164 · DA   Si al preparar la muestra se ha efectuado una dilución, multiplicar el resultado por el factor de dilución.    Nota:Medida a 334 nm: C = 0,167 · DA (e= 6,2 mmol 1 · l · cm 1)Medida a 365 nm: C = 0,303 · DA (e= 3,4 mmol 1 · l · cm 1) 2.5.1.2. Ácido L-láctico   C = 0,160 · DA   Si al preparar la muestra se ha efectuado una dilución, multiplicar el resultado por el factor de dilución.    Nota:Medida a 334 nm: C = 0,163 · DA (e= 6,2 mmol 1 · l · cm 1)Medida a 365 nm: C = 0,297 · DA (e= 3,4 mmol 1 · l · cm 1)2.5.2. Repetibilidad (r)   r = 0,02 + 0,07 xi g/l   xi = concentración en ácido láctico de la muestra en gramos por litro.2.5.3. Reproductibilidad(R)   R = 0,05 + 0,125 xi g/l   xi = concentración en ácido láctico de la muestra en gramos por litro.3. MÉTODO  USUAL  3.1.1. Para el tratamiento preliminar del vino   Véase el método del ácido tartárico (3.1.1. Método usual).3.1.2. Para la determinación del ácido láctico  3.1.2.1. Solución 0,1 M de sulfato de cerio IV en ácido sulfúrico 0,35 M.    Disolver en frío 40,431 g de sulfato de cerio IV, Ce (SO4)2, 4H2O, en 350 ml de una solución M de ácido sulfúrico exactamente valorada (3.1.2.4). Llevar a 1 000 ml con agua destilada.   3.1.2.2. Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 2,5 M.   3.1.2.3. Solución de acetato de sodio de 270 g por litro (preparada a partir de acetato de sodio seco Na CH3COO).   3.1.2.4. Solución de ácido sulfúrico (H2SO4) 1 M.   3.1.2.5. Solución de nitroprusiato de sodio [Na2 (Fe (CN)5NO) · 2H2O] al 2 % (m/v).    Conservar en un frasco bien cerrado y en la oscuridad.  Límite de conservación de la solución: 8 días.   3.1.2.6. Solución de piperidina (C5H11N) al 10 % (v/v).   3.1.2.7. Solución de ácido láctico M.    Diluir en 400 ml de agua 100 ml de ácido láctico (C3H6O3). Verter esta solución en una cápsula y calentarla en un baño de agua hirviendo durante 4 horas, completando de vez en cuando el volumen con agua destilada. Llevar a un litro después de haber  enfriado. Valorar el ácido láctico en 10 ml de esta solución con una solución de hidróxido de sodio M (3.1.2.8). Ajustar la solución hasta 1 M de ácido láctico (90 g).   3.1.2.8. Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 1 M.  3.2. Material  3.2.1. Columna de vidrio de una longitud de aproximadamente 300 mm y de un diámetro interno de 10 a 11 mm provista de un regulador de flujo.   3.2.2. Baño de agua termostatado a 65 °C.   3.2.3. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas de absorbancia a una longitud de onda de 570 nm con cubetas de 1 cm de trayecto óptico.3.3.Procedimiento  3.3.1. Preparación de la columna cambiadora de iones   Véase el método «ácido tartárico» (3.3.1. Método usual).3.3.2. Aislamiento de ácidos orgánicos   Véase el método «ácido tartárico» (3.3.2. Método usual).3.3.3. Determinación del ácido láctico   Verter 10 ml de eluido en un tubo de vidrio de 50 ml de capacidad provisto de un tapón esmerilado, añadir 10 ml de solución de sulfato de cerio (3.1.2.1). Agitar; introducir el tubo en un baño de agua con termostato a 65 °C durante exactamente 10  minutos. Al efectuar la inmersión, levantar durante algunos segundos el tapón de vidrio para compensar la presión provocada por el calentamiento; seguidamente, cerrar herméticamente el tubo para evitar la pérdida del etanal formado. Retirar el tubo,  enfriar bajo un chorro de agua para lograr una temperatura aproximada de 20 °C, añadir 5 ml de la solución de hidróxido de sodio 2,5 M (3.1.2.2), mezclar y filtrar.    Extraer una muestra de 15 ml de filtrado y verterla en un matraz de 50 ml, con tapón esmerilado, en el que previamente se habrá vertido una mezcla homogénea de 5 ml de solución de acetato de sodio al 27 % (3.1.2.3) y de 2 ml de ácido sulfúrico M  (3.1.2.4). Añadir 5 ml de la solución de nitroprusiato de sodio (3.1.2.5), mezclar; añadir a continuación 5 ml de la solución de piperidina (3.1.2.6), mezclar rápidamente e introducir de inmediato esta solución en la cubeta del espectrofotómetro. La  coloración resultante, que varía entre el verde y el violeta, se mide 570 nm con respecto al aire (sin cubeta alguna en el trayecto óptico); la coloración aumenta disminuyendo rápidamente a continuación.    Seguir la evolución de la absorbancia correspondiente y escoger como valor definitivo su valor máximo.    Si el eluido contiene demasiado ácido láctico y la absorbancia resulta demasiado alta, diluir el eluido con la solución de sulfato de sodio al 7,1 % (3.1.1) y medir la solución diluida.3.3.4. Obtención de la curva patrón   Introducir 10 ml de la solución de ácido láctico 1 M (3.1.2.7) y 10 ml de solución valorada de hidróxido de sodio 1 M (3.1.2.8) en un matraz aforado de 1 000 ml y enrasar con la solución de sulfato de sodio al 7,1 % (3.1.1). Extraer 5, 10, 15, 20 y 25  ml e introducirlos en matraces aforados de 100 ml. Enrasar con la solución de sulfato de sodio al 7,1 %. Tomar 10 ml de las soluciones obtenidas y determinar en el caso de cada una el valor de la absorbancia siguiendo el procedimiento utilizado para el  eluido y que se describe en el punto 3.3.3.    Estas soluciones corresponden a los eluidos obtenidos a partir de vinos con un contenido de 0,45 - 0,9 - 1,35 - 1,80 y 2,25 g/l de ácido láctico.    La representación gráfica de las absorbancias de estas soluciones en función del contenido en ácido láctico es una recta.  3.4. Expresión de los resultados   Llevar la absorbancia medida en el eluido a la curva patrón para obtener el contenido del vino en ácido láctico en gramos por litro.    Este contenido se expresa con 1 decimal.    Nota:Los vinos con más de 250 mg/l de dióxido de azufre pueden presentar un contenido en ácido etanalsulfúrico que se valora como ácido láctico. En este caso, es preciso corregir el resultado de la determinación con el del obtenido en la operación  complementaria siguiente: mezclar 15 ml de eluido en una probeta, provista de un tapón esmerilado, con 5 ml de acetato de sodio al 27 % y 2 ml de H2SO4 0,775 M (77,5 ml de H2SO4M se enrasa a 100 ml con agua destilada). A continuación, como al determinar  el ácido láctico se añaden 5 ml de nitroprusiato de sodio al 2 % y 5 ml de piperidina al 10 %. Tras haber efectuado la mezcla, medir la absorbancia en las condiciones descritas para la determinación del ácido láctico. Trasladar esta absorbancia a la  curva de calibrado para obtener el valor aparente B del ácido láctico en gramos por litro, debido al ácido etanalsulfónico. Si L' es el contenido aparente del vino en ácido láctico en gramos por litro, el contenido real L en ácido láctico se obtiene  mediante la siguiente fórmula:    L = L'   B · 0,4 (g/l)    19. ÁCIDO  L-MÁLICO 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   En presencia de nicotinamida-adenin-dinucleótido (NAD), el ácido L-málico (L-malato) se oxida en oxaloacetato en una reacción catalizada por la L-malato-deshidrogenasa (L-MDH).    El equilibrio de la reacción está desplazado en el sentido del malato. La eliminación del oxaloacetato del medio reactivo desplaza el equilibrio de la reacción hacia la formación de oxaloacetato. En presencia de L-glutamato, el oxaloacetato se  transforma en L-aspartato, reacción catalizada por el glutamato-oxaloacetato-transaminasa (GOT).    (1) L-malato + NAD+  oxaloacetato + NADH + H+   (2) Oxaloacetato + L-glutamato  L-aspartato + a   cetoglutarato   La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a la longitud de onda de 340 nm, es proporcional a la cantidad de L-malato presente.2. REACTIVOS  2.1. Solución tampón pH 10 (glicilglicina 0,60 M; L-glutamato 0,1 M)   Disolver 4,75 g de glicilglicina y 0,88 g de ácido L-glutámico en unos 50 ml de agua bidestilada; ajustar el pH a 10 con unos 4,6 ml de solución de hidróxido sódico 10 M y llevar hasta 60 ml con agua bidestilada.La solución permanecerá estable por lo  menos 12 semanas a + 4 °C.   2.2. Solución de nicotinamida-adenin-dinucleótido (NAD) de alrededor de 47 · 10 3 M: disolver 420 mg de NAD en 12 ml de agua bidestilada. La solución permanece estable por lo menos 4 semanas a + 4 °C.   2.3. Suspensión de glutamato-oxaloacetato-transaminasa (GOT) de 2 mg/ml. La suspensión es estable por lo menos 1 año a + 1 °C.  2.4. Suspensión de L-malato-deshidrogenasa (L-MDH) de 5 mg/ml. La suspensión es estable por lo menos 1 año a + 4 °C.    Nota: El conjunto de reactivos necesarios se comercializan preparado.3. MATERIAL  3.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 340 nm, máximo de absorción de la NADH.En su defecto, fotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o a 365 nm.    Dado que se trata de medidas absolutas de absorbancia (no se utiliza curva de calibrado, sino el coeficiente de extinción de la NADH), deben controlarse las escalas de las longitudes de onda y de las absorbancias del aparato.   3.2. Cubetas de vidrio o cubetas desechables de 1 cm de trayecto óptico.   3.3. Micropipetas que permitan tomar volúmenes comprendidos ente 0,01 y 2 ml.4. PREPARACIÓN  DE  LA  MUESTRA   Normalmente, la determinación del L-malato se efectúa directamente sobre el vino sin decoloración previa ni dilución, siempre que el contenido en ácido L-málico sea inferior a    350 mg/l (medidas a 365 nm). Si no, proceder a la dilución del vino con agua bidestilada de forma que la concentración en L-malato se sitúe entre 30 y 350 mg/l (cantidad de L-malato en la muestra comprendida entre 3 y 35 µg.    Si la concentración del vino en malato es inferior a 30 mg/l, el volumen de la muestra puede aumentarse hasta 1 ml. En este caso, se reducirá el volumen de agua que debe añadirse para que los volúmenes totales sean iguales en las dos cubetas.5.  PROCEDIMIENTO   Se ajusta la longitud de onda del espectrofotómetro a 340 nm y se realizan las medidas de absorbancia en cubetas de 1 cm de trayecto óptico, habiendo ajustado el cero de absorbancia con respecto al aire (sin cubetas en el trayecto óptico) o con  respecto al agua.    Introducir en las cubetas de 1 cm de trayecto óptico:     Blanco MuestraSolución 2.1 1,00 ml 1,00 mlSolución 2.2 0,20 ml 0,20 mlAgua bidestilada 1,00 ml 0,90 mlSuspensión 2.3 0,01 ml 0,01 mlMuestra - 0,10 ml   Mezclar; transcurridos 3 minutos, aproximadamente, medir las absorbancias de las soluciones blanco y muestra (A1).    Añadir:Solución 2.4 0,01 ml 0,01 ml   Mezclar; esperar a que finalice la reacción (de 5 a 10 minutos) y medir las absorbancias de las soluciones blanco y muestra (A2).    Determinar las diferencias de absorbancia (A2   A1) del blanco (DAB) y de la muestra (DAM).    Restar la diferencia de absorbancias del blanco de la diferencia de absorbancias de la muestra   DA = DAM   DAB   Nota: El tiempo necesario para la acción de las enzimas puede variar de un lote a otro. Aquí sólo se ha dado a título indicativo. Se recomienda determinarlo para cada lote.6. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   La concentración en ácido L-málico se expresa en gramos por litro (g/l) con 1 decimal.6.1. Método de cálculo   La concentración en gramos por litro se calcula con la fórmula general:V = volumen total en ml (aquí 2,22 ml)v = volumen de la muestra en ml (aquí: 0,1 ml)PM = masa molecular de la sustancia que va a determinarse (aquí: ácido L-málico = 134,09)d =  trayecto óptico de la cubeta en cm (aquí: 1 cm) e= coeficiente de extinción de la NADH a 340 nm e= 6,3 mmol 1 · l · cm 1)   Para el L-malato se obtiene:C = 0,473 · DA g/l   Si al preparar la muestra se ha efectuado una dilución, multiplicar el resultado por el factor de dilución.    Nota:Medida a 334 nm: C = 0,482 xDA Medida a 365 nm: C = 0,876 xDA6.2. Repetibilidad (r)   r = 0,03 + 0,034 xi xi = concentración en ácido málico de la muestra en gramos por litro.6.3. Reproductibilidad(R)   R = 0,05 + 0,071 xi xi = concentración en ácido málico de la muestra en gramos por litro.     20. ÁCIDO  D-MÁLICO (método enzimático) TEST-COMBINACIÓN  PARA  30  MUESTRAS  APROXIMADAMENTE1. FUNDAMENTO   En presencia de D-malato deshidrogenasa decarboxil (D-MDH) el ácido D-málico (D-malato) se oxida a oxalacetato con la nicotinamida-adenin-dinucleotido (NAD).    El oxalacetato formado se transforma en piruvato y ácido carbónico.    D-Malato + NAD+  + Piruvato + CO2 + NADH + H+   La formación de NADH, medida por el aumento de la absorbancia a la longitud de onda de 334, 340 y 365 nm, es proporcional a la cantidad del D-malato presente.2. COMPOSICIÓN  DEL  TEST   a) Frasco no 1 que contiene aproximadamente 30 ml de solución tampón Hepes 4-[2-hidroxietil)-1-piperacinetan-ácido sulfónico], pH = 9 y estabilizadores.b) Frasco no 2 que contiene aproximadamente 210 mg de NAD liofilizado.c) Tres frascos no 3 que  contienen D-MDH liofilizado, cada uno de ellos con aproximadamente 8 U.2.1. Preparación de las soluciones.   2.1.1. Utilizar el contenido del frasco 2a sin diluir.    Termostatizar las soluciones a 20 a 25 °C antes de su empleo.   2.1.2. Disolver el contenido del frasco 2b en 4 ml de agua bidestilada.   2.1.3. Disolver el contenido de uno de los frascos 2c en 0,6 ml de agua bidestilada. Termostatizar la solución a 20 a 25 °C antes de su empleo.2.2. Estabilidad de las solucionnes   El contenido del frasco 2.1.1 se conserva al menos un año a +4 °C.La solución 2.1.2 se conserva aproximadamente tres semanas a +4 °C y 2 meses a  20 °C.La solución 2.1.3 se conserva cinco días a +4 °C.3. MATERIAL  3.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 340 nm, máximo de absorción del NADH y del NADPH.En su defecto, fotómetro de espectro discontinuo que permita efectuar medidas a 334 nm o a 365 nm.   3.2. Cubetas de vidrio o cubetas desechables de 1 cm de trayecto óptico.   3.3. Micropipetas que permitan tomar volúmenes comprendidos entre 0,01 y 2 ml.4. PREPARACIÓN  DE  LA  MUESTRA   La cantidad de D-malato en la cubeta debe estar comprendida entre 2 µg y 50 µg. Si no, diluir la muestra con agua destilada de tal manera que la concentración en malato esté comprendida entre 0,02 y 0,5 g/l si se va a medir a 365 nm o entre 0,02 y 0,3  g/l si la lectura se efectúa a 340 o 334 nm.    Si la diferencia de absorción DA es <  0,100, el volumen de la muestra puede aumentarse hasta 1,80 ml. En este caso, se reducirá el volumen de agua que debe añadirse para que los volúmenes totales sean iguales en las dos cubetas (muestra y testigo).  5. PROCEDIMIENTO   Temperatura: 20 a 25 °C.Volumen de test: 2,95 ml.    Medir frente a aire (sin cubeta en el trayecto óptico) o frente al agua.                         Introducir en las cubetasTestigoMuestraSolución 2.1.11,00 ml1,00 mlSolución 2.1.20,10 ml0,10 mlAgua bidestilada1,80 ml1,70 mlMuestra 0,10 mlMezclar, después de aproximadamente 6 minutos leer las absorbancias de las soluciones (A1). Comenzar la  reacción por adición de:Solución 2.1.30,05 ml0,05 mlMezclar. Al final de la reacción (aproximadamente 20 minutos), leer las absorbancias de las soluciones (A2).   Determinar la diferencia de las absorbancias (A2   A1) del testigo y de la muestra. Restar la diferencia de absorbancia del testigo de la diferencia de absorbancia de la muestra.DA = DM - DAT6. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   La concentración en ácido D-málico se expresa en gramos por litro (g/l) con 1 decimal.6.1. Método de cálculo   La fórmula general para el cálculo de las concentraciones es la siguiente:V = volumen total (ml)v = volumen de la muestra (ml)PM = peso molecular de la sustancia a determinard = espesor de la cubeta (cm)e  = coeficiente de absorción del NADH:   Hg 340 nm = 6,3 (mmol-1 · l · cm-1)Hg 334 nm = 6,18 (mmol-1 · l · cm-1)Hg 365 nm = 3,4 (mmol-1 · l · cm-1)   Se obtiene así para el D-malato:Si se ha efectuado alguna dilución durante la preparación de la muestra, multiplicar el resultado por el factor de dilución F.  6.2. Repetibilidad (r)   r = 0,05 xi6.3. Reproductibilidad   R = 0,1 xi xi = concentración en ácido D-málico en g/l.      21. ÁCIDO  MÁLICO  TOTAL MÉTODO  USUAL1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   El ácido málico aislado mediante una columna de resina cambiadora de aniones, se determina colorimétricamente en el eluido, debido a la coloración amarilla que da con ácido sulfúrico del 96 % y ácido cromotrópico. Las sustancias contenidas en el eluido  interfieren en esta reacción. Pero estas sustancias reaccionan contrariamente al ácido málico, con ácido sulfúrico del 86 % y ácido cromotrópico. Para eliminar esta interferencia, es suficiente restar de la absorbancia obtenida después de la reacción  con el ácido cromotrópico y el ácido sulfúrico del 96 %, la absorbancia obtenida después de la reacción con ácido cromotrópico y ácido sulfúrico del 86 %.2. MATERIAL  2.1. Columna de vidrio de 250 mm de longitud aproximada y 35 mm de diámetro interior, provista de llave.   2.2. Columna de vidrio de 300 mm de longitud aproximada y 10 a 11 mm de diámetro interior, provista de llave.   2.3 Baño de agua a 100 °C.   2.4. Espectrofotómetro que permita hacer lecturas de absorbancia a la longitud de onda de 420 nm con cubetas de 10 mm de trayecto óptico.4. REACTIVOS  3.1. Cambiador de iones de fuerte basicidad (por ejemplo, Merck III).   3.2. Hidróxido sódico al 5 % (m/v).   3.3. Ácido acético al 30 % (m/v).   3.4. Ácido acético al 0,5 % (m/v).   3.5. Solución de sulfato sódico (Na2SO4) al 10 % (m/v).   3.6. Ácido sulfúrico concentrado del 95   97 % (m/m).   3.7. Ácido sulfúrico del 86 % (m/m).   3.8. Solución de ácido cromotrópico al 5 % (m/v).    Esta solución se debe preparar inmediatamente antes de su utilización, disolviendo 500 mg de sal disódica del ácido cromotrópico (C10H6NA2O8S2, 2H2O) en 10 ml de agua.   3.9. Solución de ácido dl-málico de 0,5 g/l.    Disolver 250 mg/l de ácido málico (C4H6O5) en una cantidad suficiente de sulfato sódico al 10 % (3,5) y enrasar en un matraz aforado de 500 ml.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación del cambiador de iones.    Colocar por encima de la llave de la columna de vidrio de 35 × 250 mm un tapón de lana de vidrio impregnado de agua destilada. Echar en la columna el cambiador de iones puesto en suspensión en agua y de forma que quede un espacio libre de 50 mm  aproximadamente por encima de la superficie del intercambiador hasta el extremo superior de la columna. Después de pasar 1 000 ml de agua destilada, llenar la columna con la solución de hidróxido de sodio al 5 % y dejar pasar el líquido hasta,  aproximadamente, 2 a 3 mm por encima de la superficie del cambiador de iones, repetir dos veces más esta operación y dejar en contacto durante una hora. Lavar la columna con 1 000 ml de agua destilada. Seguidamente llenar la columna con la solución de  ácido acético al 30 %, dejar pasar el líquido hasta aproximadamente 2 a 3 mm por encima de la superficie del cambiador de iones, repetir esta operación 2 veces y dejar en contacto al menos durante 24 horas antes de emplearla. Conservar el cambiador de  iones en ácido acético al 30 % para las determinaciones posteriores.4.2. Preparación de la comlumna cambiadora de iones.    Colocar en la columna de vidrio de 11 × 300 mm por encima de la llave un tapón de lana de vidrio, añadir a la columna el cambiador de iones preparado como se ha descrito en 4.1. hasta una altura de 10 cm. Estando la llave abierta, dejar pasar la  solución de ácido acético al 30 % hasta aproximadamente 2 a 3 mm por encima de la superficie del cambiador. Lavar el cambiador con 50 ml de la solución de ácido acético al 0,5 %.4.3. Alslamiento del ácido dl-málico.    Añadir sobre el cambiador preparado como se ha descrito en 4.2 10 ml de vino o de mosto. Dejar pasar el vino gota a gota (flujo medio, una gota por segundo) hasta aproximadamente 2 a 3 mm por encima de la superficie del cambiador de iones. Llevar la  columna, primeramente con unos 50 ml de solución de ácido acético al 0,5 % y después con 50 ml aproximadamente de agua destilada; dejar pasar estos líquidos con la misma velocidad que el vino.    Eluir los ácidos fijados sobre el cambiador de iones, con la solución de sulfato sódico al 10 % con la misma velocidad que las operaciones precedentes (1 gota/segundo), recoger el eluido en un matraz aforado de 100 ml hasta el enrase.   Se puede regenerar el cambiador de iones como se ha descrito en 4.1.4.4. Determinación del ácido málico.    Tomar dos tubos de boca ancha de 30 ml de capacidad con tapón esmerilado «A» y «B». Introducir en cada tubo 1,0 ml de eluido y 1,0 ml de solución de ácido cromotrópico al 5 %. Añadir en el tubo «A» 10,0 ml de ácido sulfúrico al 96 % (medida). Tapar y  agitar para obtener una homogeneidad perfecta sin mojar el esmerilado. Sumergir los tubos durante 10 minutos exactamente en un baño de agua puesto previamente a ebullición. Enfriar los tubos a 20 °C en la oscuridad. Exactamente 90 minutos después del  comienzo del enfriamiento, medir la absorbancia del tubo «B» con relación al testigo (tubo «A») a la longitud de onda de 420 nm en cubetas de 10 mm de trayecto óptico.4.5. Obtención de la curva patrón.    Tomar 5, 10, 15 y 20 ml de la solución de ácido DL-málico de 0,5 g/l, introducirlos en matraces aforados de 50 ml de capacidad, enrasar con la solución de sulfato sódico al 10 %.   Las soluciones así obtenidas corresponden a eluidos obtenidos a partir de vinos que contienen 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 g/l de ácido DL-málico.    Continuar como se indica en 4.4.    Los valores de las absorbancias obtenidos con estas soluciones patrón se representan en función de los contenidos en ácido málico correspondientes, obteniéndos una recta que pasa por el origen.    Dado que la intensidad de la coloración depende mucho de la concentración de ácido sulfúrico, es necesario comprobar la curva de calibrado al menos en un punto en cada serie de medidas para poner de manifiesto un cambio eventual en la concentración del  ácido sulfúrico.  5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  Llevar la absorbancia media para el eluido, sobre la curva de calibrado, para obtener el contenido en ácido DL-málico en gramos por litro. Este contenido se expresa con un decimal. Repetibilidad:    Contenido <  2 g/l : r = 0,1 g/l,Contenido > 2 g/l : r = 0,2 g/l. Reproductibilidad:    R = 0,3 g/l.      22. ÁCIDO  SÓRBICO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método de determinación por espectrofotometría de absorción en el ultravioleta   El ácido sórbico (ácido hexadieno -2,4 oico trans, trans) separado por destilación con arrastre de vapor de agua se determina en el destilado mediante espectrofotometría de absorción en el ultravioleta. Las sustancias que interfieren en la medida de la  absorción en el ultravioleta se eliminan por evaporación a sequedad del destilado de la muestra, ligeramente alcalinizado por una solución de hidróxido de calcio. Los contenidos inferiores a 20 mg/l deben confirmarse por cromatografía en capa fina  (sensibilidad: 1 mg/l).1.2. Método de determinación por cromatografía de gases   El ácido sórbico extraído en éter etílico se determina por cromatografía en fase gaseosa en presencia de un patrón interno.1.3. Método de detección de trazas por cromatografía de capa fina   El ácido sórbico extraído en éter etílico se separa por cromatografía en capa fina y se evalúa su concentración en forma semicuantitativa.2. MÉTODO  DE  DETERMINACIÓN  POR  ESPECTROFOTOMETRÍA  DE  ABSORCIÓN  EN  EL ULTRAVIOLETA  2.1. Reactivos  2.1.1. Ácido tartárico C4H6O6 cristalizado.   2.1.2. Solución de hidróxido de calcio CA (OH)2, aproximadamente 0,02 M.   2.1.3. Solución de referencia de ácido sórbico de 20 mg por litro.    Disolver 20 mg de ácido sórbico C6H8O2 en 2 ml aproximadamente de solución 0,1 M de hidróxido de sodio. Verter en un matraz aforado de 1 000 ml, enrasar con agua. También pueden disolverse 26,8 mg de sorbato de potasio C6H7KO2 en agua y completar con  agua hasta 1 000 ml.2.2. Material  2.2.1. Aparato de destilación con arrastre de vapor de agua (véase «Acidez volátil»).   2.2.2. Baño de agua a 100 °C.   2.2.3. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a una longitud de onda de 256 nm con cubetas de cuarzo de 1 cm de trayecto óptico.2.3.Procedimiento  2.3.1. Destilación   Introducir en el borboteador del aparato de arrastre de vapor de agua 10 ml de vino, añadir 1 a 2 g de ácido tartárico (2.1.1). Recoger 250 ml de destilado.2.3.2. Curva patrón   Preparar mediante diluciones con agua a partir de la solución de referencia (2.1.3) cuatro soluciones de referencia diluidas que contengan respectivamente 0,5; 1; 2,5 y 5 mg de ácido sórbico por litro; medir con el espectrofotómetro sus respectivas  absorbancias a 256 nm respecto al agua destilada. Trazar la curva de absorbancias en función de la concentración de las soluciones. La relación es lineal.2.3.3. Determinación   Introducir en una cápsula de 55 mm de diámetro 5 ml de destilado, añadir 1 ml de solución de hidróxido de calcio (2.1.2) y una gota de solución de sulfato de cobre (2.1.3). Evaporar hasta sequedad en un baño de agua hirviendo.    Recoger el residuo con algunos mililitros de agua destilada, arrastrar cuantitativamente en un matraz aforado de 20 ml y enrasar con el agua de lavado. Medir la absorbancia a 256 nm con el espectrofotómetro en comparación con una solución testigo  obtenida con 1 ml de solución de hidróxido cálcico (2.1.2) y dilución a 20 ml con agua.    Llevar el valor de la absorbancia medida a la recta patrón y deducir la concentración C de la solución en ácido sórbico.    Nota: En la práctica corriente, esta evaporación a sequedad puede no ser necesaria. Medir directamente la absorbancia en el destilado diluido a 1/4 frente a agua destilada.2.4. Expresión de los resultados  2.4.1. Método de cálculo   La concentración en ácido sórbico del vino expresada en miligramos por litro es igual a:100 × C   C = concentración en ácido sórbico de la solución analizada mediante espectrofotometría, expresada en miligramos por litro.3. MÉTODO  DE  DETERMINACIÓN  POR  CROMATOGRAFÍA  EN  FASE  GASEOSA  3.1. Reactivos  3.1.1. Éter etílico (C2H5)2O destilado en el momento de su utilización.   3.1.2. Solución del patrón interno: solución de ácido undecanoico C11H22O2 en etanol al 95 % vol de 1 g por litro.   3.1.3. Solución acuosa de ácido sulfúrico H2SO4 (r 20 = 1,84 g/ml) diluido 1/3 (v/v).3.2. Material  3.2.1. Cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama. Columna de acero inoxidable (4 m × 1/8 de pulgada) previamente tratada con dimetildicloro-silano y rellena con fase estacionaria, compuesta por una mezcla de succinato de  dietilenglicol (5 %) y ácido fosfórico (1 %) (DEGS-H3PO4) o por una mezcla de adipato de dietilenglicol (7 %) y ácido fosfórico (1 %) (DEGA - H3PO4). Soporte sólido de Gaschrom Q 80 a 100 mallas.   Para el tratamiento con dimetilidicloro-silano (DMDCS), hacer pasar por la columna una solución al 2 3 g de DMDCS en tolueno, lavar inmediatamente la columna con metanol y secar haciendo pasar una corriente de nitrógeno, después de exano y de nuevo una  corriente de nitrógeno. Rellenarla a continuación.    Condiciones de trabajo:Temperatura del horno: 175 °C.Temperatura del inyector y del detector: 230 °C.  Gas portador: nitrógeno (flujo7 20 ml/min.).  3.2.2. Microjeringa de 10 microlitros de capacidad graduada en 0,1 microlitros.    Observación:Otros tipos de columnas pueden igualmente permitir una buena separación, por ejemplo la columna capilar (FFAP).    El modo operatorio descrito arriba se da a título de ejemplo.3.3. Modo operatorio  3.3.1. Preparación de la muestra para su análisis   Introducir 20 ml de vino en un tubo de vidrio con una capacidad de unos 40 ml y provisto de un tapón esmerilado. Añadir 2 ml de solución del patrón interno (3.1.2) y 1 ml de solución diluida de ácido sulfúrico (3.1.3).    Tras agitar el tubo invirtiéndolo varias veces, añadir al contenido 10 ml de éter etílico (3.1.1). Extraer el ácido sórbico en la fase orgánica agitando el tubo durante 5 mintos. Dejar decantar.3.3.2. Preparación de la solución de referencia   Seleccionar un vino cuyo cromatograma del extracto etéreo no presente ningún pico en el tiempo de retención correspondiente al ácido sórbico; añadir a este vino ácido sórbico hasta la concentración de 100 mg por litro. Tratar 20 ml de la muestra según  el procedimiento descrito en el apartado 3.3.1.3.3.3. Cromatografía   Inyectar sucesivamente en el cromatógrafo 2 µl de la fase etérea obtenida en el apartado 3.3.2 y 2 µl de la fase etérea obtenida en el apartado 3.3.1.    Registrar los cromatogramas respectivos: comprobar la identidad de los tiempos de retención respectivos del ácido sórbico y del patrón interno. Medir la altura (o el área) de cada uno de los picos registrados.3.4. Expresión de los resultados  3.4.1. Método de cálculo   La concentración de ácido sórbico del vino analizado, expresada en miligramos por litro, es igual a:H = altura del pico del ácido sórbico en la solución de referencia,h = altura del pico del ácido sórbico en la muestra para análisis,I = altura del pico  del patrón interno en la solución de referencia,i = altura del pico del patrón interno en la muestra para análisis.    Nota: la concentración de ácido sórbico puede determinarse del mismo modo a partir de las medidas de la superficie de los picos respectivos.4. MÉTODO  DE  DETECCIÓN  DE  TRAZAS  DE  ÁCIDO  SÓRBICO  MEDIANTE  CROMATOGRAFÍA  DE  CAPA  FINA  4.1. Reactivos  4.1.1. Éter etílico, (C2H5)2O   4.1.2. Solución acuosa de ácido sulfúrico H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml) diluido 1/3 (v/v).   4.1.3. Solución de referencia de ácido sórbico en una mezcla hidroetanólica a 10 % de etanol (vol) aproximadamente con 20 mg por litro.   4.1.4. Fase móvil: hexano - pentano - ácido acético (20:20:3) (C6H14 - C5H12 - CH3COOH, r20 = 1,05 g/ml).4.2. Material  4.2.1. Placas para cromatografía de capa fina listas para su uso de 20 × 20 cm recubiertas de gel de poliamida (espesor : 0,15 mm), al que se añadirá un indicador de fluorescencia.   4.2.2. Cubeta para cromatografía de capa fina.   4.2.3. Micropipeta o microjeringa que permitan obtener volúmenes de 5 microlitros con una aproximación de ± 0,1 microlitros.   4.2.4. Lámpara de ultravioleta (254 nm).4.3. Procedimiento  4.3.1. Preparación de la muestra para análisis   Introducir 10 ml de vino en un tubo de vidrio con una capacidad de unos 25 ml y provisto de un tapón esmerilado. Añadir 1 ml de solución de ácido sulfúrico diluido (4.1.2) y 5 ml de éter etílico (4.1.1). Agitar el tubo invirtiéndolo varias veces. Dejar  decantar.4.3.2. Preparación de las soluciones diluidas de referencia   A partir de la solución 4.1.3, prepara mediante dilución cinco soluciones diluidas de referencia con 2, 4, 6, 8 y 10 mg de ácido sórbico por litro, respectivamente.4.3.3. Cromatografía   Utilizando una microjeringa o una micropipeta, depositar a 2 cm del borde inferior de la placa 5 µl de fase etérea obtenida en 4.3.1 y 5 µl de cada una de las soluciones diluidas de referencia (4.3.2); la distancia entre los puntos será de 2 cm.    Introducir la fase móvil (4.1.4) en la cubeta para cromatografía a una altura de aproximadamente 0,5 cm y dejar que la atmósfera de la cubeta se sature de los vapores de los disolventes. Colocar la placa en la cubeta. Dejar desarrollar el cromatograma  entre 12 y 15 cm (la duración del desarrollo es de unos 30 min.). Secar la placa bajo una corriente de aire frío. Examinar el cromatograma bajo una lámpara ultravioleta a 254 nm.    Las manchas de ácido sórbico, de color violeta oscuro, destacarán sobre el fondo amarillo fluorescente de la placa.4.4. Expresión de los resultados   La comparación entre la intensidad de la mancha de la muestra para análisis y las manchas de las soluciones de referencia permite evaluar de manera semicuantitativa la concentración de ácido sórbico entre 2 y 10 mg por litro. Podrá determinarse una  concentración igual a 1 mg por litro con un depósito de 10 µl de solución de la muestra para análisis.Podrán determinarse concentraciones superiores a 10 mg por litro con un volumen de depósito de la solución para análisis inferior a 5 µl (medido con  una microjeringa).      23. ÁCIDO L-ASCÓRBICO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS   Los métodos que se proponen permiten determinar el ácido L-ascórbico y el ácido dehidroascórbico presentes en vinos o mostos.1.1. Método de referencia (fluorimétrico)   El ácido L-ascórbico se oxida por la acción del carbón activo a ácido dehidroascórbico. Este compuesto forma un compuesto fluorescente por reacción con la ortofenilendiamina (OPDA). La realización de una prueba testigo en presencia de ácido bórico  permite determinar la fluorescencia parásita (mediante la formación de un complejo de ácido bórico - ácido dehidroascórbico) y deducirla de la determinación fluorimétrica.1.2. Método usual (colorimétrico)   El ácido L-ascórbico se oxida con el yodo en ácido dehidroascórbico. Este compuesto se precipita con la 2,4 dinitrofenilhidrazina como bis (2,4 - dinitrofenilhidrazona). Después de una separación por cromatografía en capa fina y solubilización en medio  acético, este compuesto, de color rojo, se determina por espectrofotometría a 500 nm.2. MÉTODO  DE  REFERENCIA (MÉTODO  FLUORIMÉTRICO)  2.1. Reactivos  2.1.1. Solución de dihidrocloruro de ortofenilendiamina (C6H10Cl2N2) a 0,02 g por 100 ml, preparada inmediatamente antes de su empleo.   2.1.2. Solución de acetato de sodio trihidratado (CH3COONa . 3H2O) de 500 g/l.   2.1.3. Solución mixta de ácido bórico y acetato de sodio.Disolver 3 g de ácido bórico H3BO3 en 100 ml de solución de acetato de sodio (2.1.2). Dicha solución debe prepararse inmediatamente antes de su uso.   2.1.4. Solución de ácido acético cristalizable CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml) diluida al 56 % (v/v). ajustada a un pH 1,2, aproximadamente.   2.1.5. Solución de referencia de ácido L-ascórbico de 1 g/l.Disolver en el momento de su uso 50 mg de ácido L-ascórbico C6H8O6, previamente deshidratado en un desecador fuera del alcance de la luz, en 50 ml de solución de ácido acético (2.1.4).   2.1.6. Carbón activo muy puro para análisis (10)Introducir en un matraz erlenmeyer cónico de 2 litros de capacidad 100 g de carbón activo, añadir 500 ml de una solución de ácido clorhídrico (HCl) (r20 = 1,19 g/ml) al 10 p. 100 (v/v). Llevar a  ebullición, filtrar sobre un filtro de vidrio fritado de porosidad 3. Recoger el carbón así tratado en un erlenmeyer de 2 litros de capacidad, añadir 1 litro de agua, agitar y filtrar sobre un filtro de vidrio fritado de porosidad 3. Repetir dos veces  esta operación e introducir el residuo en una estufa regulada a 115 ± 5 °C durante 12 horas (una noche, por ejemplo).2.2. Material y aparatos  2.2.1. Fluorímetro. Emplear un espectrofluorímetro equipado con una lámpara de espectro continuo utilizando la potencia mínima de la misma. Las longitudes de onda de excitación y emisión óptimas se determinarán previamente y dependen del aparato  utilizado. Se puede decir, con carácter indicativo, que la longitud de onda de excitación se sitúa aproximadamente en 350 nm y la de emisión en 430 nm. Cubas con 1 cm de trayecto óptico.    2.2.2. Filtro de vidrio poroso no 3.   2.2.3. Tubos de ensayo (diámetro 7 10 mm).   2.2.4. Agitador para tubos de ensayo.2.3. Procedimiento  2.3.1. Preparación de la muestra de vino o mosto   Poner en un matraz aforado de 100 ml un volumen de vino o mosto y enrasar con la solución de ácido acético al 56 % (2.1.4) con el fin de obtener una solución cuya concentración de ácido L-ascórbico, esté comprendida entre 0 y 60 mg/litro. Homogeneizar  el contenido del matraz aforado por agitación. Añadir 2 g de carbón activo (2.1.6) y dejar en contacto durante 15 minutos agitando de vez en cuando. Filtrar sobre papel de filtro ordinario, eliminando los primeros mililitros de filtrado.    Introducir en dos matraces aforados de 100 ml, 5 ml de filtrado y, respectivamente, 5 ml de solución mixta de ácido bórico y de acetato de sodio (2.1.2) y 5 ml de solución de acetato de sodio (2.1.2). Dejar en contacdo durante 15 min. agitando de vez  en cuando y enrasar con agua destilada.    Extraer 2 ml del contenido de cada uno de los matraces, añadir 5 ml de solución de ortofenilendiamina (2.1.1) y agitar; dejar en reposo en la oscuridad durante 30 minutos para que la reacción tenga lugar y medir con el espectrofluorímetro.2.3.2. Curva  patrón   En tres matraces aforados de 100 ml introducir, respectivamente, 2, 4 y 6 ml de solución de referencia de ácido L-ascórbico (2.1.5), completar hasta 100 ml con la solución de ácido acético (2.1.4) y homogeneizar por agitación. Las soluciones de  referencia preparadas contendrán, respectivamente, 2, 4 y 6 mg/100 ml.    Añadir 2 g de carbón activo (2.1.6) en cada uno de los matraces y dejar en contacto durante 15 minutos, agitando de vez en cuando. Filtrar sobre papel filtro ordinario, eliminando los primeros mililitros. Introducir, respectivamente, 5 ml de cada uno  de los filtrados obtenidos en tres matraces aforados de 100 ml (primera serie) y repetir la operación en una segunda serie de tres matraces aforados. Añadir en cada uno de los matraces de la primera serie (correspondiente al ensayo testigo) 5 ml de  solución mixta de ácido bórico y de acetato de sodio (2.1.3) y en cada uno de los matraces de la segunda serie 5 ml de solución de acetato de sodio (2.1.2).    Dejar en contacto durante 15 minutos, agitando de vez en cuando y completar hasta 100 ml con agua destilada. Extraer 2 ml del contenido de cada uno de los matraces, añadir 5 ml de solución de ortofenilendiamina (2.1.1), agitar y dejar en reposo en la  oscuridad durante 30 minutos para que la reacción tenga lugar y medir a continuación con el espectrofluorímetro.2.3.3.Determinación fluorimétrica   Regular para cada solución de la curva patrón y para la solución del problema el cero de la escala de medidas con la prueba testigo correspondiente. Medir, a continuación, la intensidad de la fluorescencia de cada solución patrón y de la solución del  problema.    Representar la curva patrón; ésta deberá ser lineal y pasar por el origen. Trasladar a esta recta el valor del problema y deducir el contenido C de ácido L-ascórbico + ácido dehidroascórbico de la solución analizada.2.3.4. Expresión de los resultados   La concentración de ácido L-ascórbico + ácido dehidroascórbico en el vino o mosto, expresada en miligramos por litro, será la siguiente:C . F    F = factor de dilución.3. MÉTODO  USUAL  (COLORIMÉTRICO)  3.1. Reactivos  3.1.1. Solución de ácido metafosfórico al 30 % (m/v).Tomar 30 g de ácido metafosfórico (HPO3)n previamente triturado en un mortero. Lavar rápidamente por inmersión y agitación en agua destilada. Disolver el ácido lavado en agua destilada agitando esta  solución en un matraz aforado de 100 ml y enrasar. La solución obtenida contendrá aproximadamente un 30 % (m/v) de ácido metafosfórico.   3.1.2. Solución de ácido metasfosfórico al 3 % (m/v) preparada inmediatamente antes de su empleo por dilución al 1/10 con agua destilada de la solución 3.1.1.   3.1.3. Solución de ácido metafosfórico al 1 % (m/v) preparada inmediatamente antes de su empleo por dilución al 1/30 con agua destilada de la solución 3.1.1.   3.1.4. Suspensión de poliamidaPoner en suspensión 10 g de polvo de poliamida para cromatografía con 60 ml de agua destilada y dejar en contacto durante 2 horas. La cantidad preparada será suficiente para 4 determinaciones.   3.1.5. Tiourea (H2NCSNH2)  3.1.6. Solución de yodo (I2) 0,05 M.   3.1.7. Solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina al 6 % (m/v). Poner en suspensión 6 g de 2,4-dinitrofenilhidrazina (C6H6N4O4) en 50 ml de ácido acético glacial (r20 = 1,05 g/ml); añadir 50 ml de ácido sulfúrico (r20 = 1,84 g/ml); la  2,4-dinitrofenilhidrazina se disuelve por agitación.   3.1.8. Acetato de etilo (C4H8O2) que contenga un 2 % (v/v) de ácido acético glacial (3.1.12).   3.1.9. Cloroformo, CHCl3.   3.1.10. Solución acuosa de almidón al 0,5 % (m/v).     3.1.11. Fase móvil:acetato de etilo50 vol.cloroformo60 vol.ácido acético glacial 5 vol.    Dejar en reposo 12 horas antes de su uso.   3.1.12. Ácido acético glacial, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml).   3.1.13. Solución de ácido L-ascórbico al 0,1 g por 100 ml en solución de ácido metafosfórico al 1 % (3.1.3).3.2. Material y aparatos  3.2.1. Centrifuga y tubos de centrifugación de 50 ml de capacidad con tapones esmerilados.   3.2.2. Baño de agua refrigerada a una temperatura entre 5 y 10 °C.   3.2.3. Baño de agua refrigerada a una temperatura de 20 °C.   3.2.4. Placas para cromatografía en capa fina dispuestas para el uso de 20 × 20 cm, recubiertas de gel de sílice G (espesor de 0,25 o 0,3 mm).    3.2.5. Cubeta para cromatografía.   3.2.6. Micropipeta que permita obtener volúmenes de 0,2 ml.   3.2.7. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas de absorbancia a 500 nm, equipado con cubetas de 1 cm de espesor.3.3.Procedimiento  3.3.1. Oxidación del ácido L-ascórbico en ácido dehidroascórbico   Introducir 50 ml de vino en un matraz aforado de 100 ml, añadir 15 ml de suspensión de poliamida (3.1.4) y enrasar con la solución de ácido metafosfórico al 3 % (3.1.2). Dejar en contacto durante una hora agitando con frecuencia. Filtrar por filtro de  pliegues. Introducir 20 ml de filtrado en un tubo de centrifuga con tapón esmerilado, añadir 1 ml de solución 0,05 M de yodo (3.1.6). Homogeneizar por agitación y, tras 1 minuto, reducir el exceso de yodo con 25 mg de tiourea, aproximadamente.3.3.2.  Formación y extracción de la bis (2.4-dinitrofenilhidrazona) del ácido dicetogulónico)   Colocar el tubo en un baño da agua refrigerada entre 5 y 10 °C, añadir 4 ml de solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina (3.1.7) y homogeneizar el contenido del tubo, evitando que se moje el tapón de vidrio. Mantener el tubo bien cerrado en un baño de agua  a 20 °C durante 16 horas aproximadamente (una noche, por ejemplo).    Añadir al contenido del tubo de centrifugación 15 ml de acetato de etilo (3.1.8), taparlo, agitar durante 30 segundos y centrifugar durante 5 minutos aplicando una fuerza centrífuga de 350 a 400 g. Tomar con la pipeta 10 ml del acetato de etilo de  extracción e introducirlos en un erlenmeyer con tapón esmerilado. Añadir al contenido del tubo de centrifugación 5 ml de acetato de etilo (3.1.8). Agitar durante 30 segundos y centrifugar durante 5 minutos a la misma velocidad. Tomar 5 ml del acetato de  etilo de extracción y añadir al erlenmeyer que contenga los 10 ml de la primera extracción y agitar.3.3.3. Aislamiento de la bis (2.4-dinitrofenilhidrazona) por cromatografía: deberá efectuarse en las 2 horas siguientes a la extracción (3.3.2) Dejando un margen de 2 cm en las partes inferior y lateral de la placa, depositar sobre toda la línea de partida 0,2 ml del extracto de acetato de etilo. Introducir la fase móvil (3.1.11) en la cubeta hasta una altura de 1 cm y dejar que la atmósfera  se sature de los vapores del disolvente. Introducir la placa, dejar migrar el solvente hasta el borde superior de la misma y secarla durante una hora bajo una campana ventilada. Raspar con una espátula, perpendicularmente a la dirección de migración, la  zona de coloración roja característica de la bis (2,4-dinitrofenilhydrazona). Recoger el sustrato sobre una hoja de papel satinado y trasvasarlo cuantitativamente a un erlenmeyer con tapón esmerilado, añadiendo 4 ml de ácido acético (3.1.12). Dejar en  contacto durante 30 minutos agitando con frecuencia. Filtrar con papel filtro de pilegues directamente sobre la cubeta del espectrofotómetro (3.2.7). El filtrado deberá estar perfectamente limpio. Regular el cero de la escala de absorbancias a 500 nm  con el ácido acético (3.1.12) y medir la absorbancia de la solución.3.3.4. Curva patrón   Introducir en 3 matraces aforados de 100 ml 5, 10 y 15 ml, respectivamente, de solución de ácido L-ascórbico (3.1.13), enrasar con la solución de ácido metafosfórico al 1 % (3.1.3). Las soluciones así obtenidas contienen 50, 100 y 150 mg por litro de  ácido ascórbico, respectivamente.    Tratar 50 ml de cada una de estas soluciones según el procedimiento descrito en los apartados 3.3.1, 3.3.2 y 3.3.3. Trazar la curva patrón, que deberá ser lineal y pasar por el origen.3.3.5. Expresión de los resultados   La concentración del vino en ácido L-ascórbico + ácido dehidroascórbico se expresará en miligramos por litro.  3.3.5.1. Cálculo   Llevar a la curva patrón el valor de la absorbancia medida en el apartado 3.3.3 y leer la concentración de ácido ascórbico + ácido dehidroascórbico de la solución analizada.    Nota: Si la concentración de ácido L-ascórbico + ácido dehidroascórbico es superior a 150 mg/litro, reducir el volumen tomado de muestra a 25,20 o 10 ml de vino y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución F.     24. pH 1. FUNDAMENTO   Medida de la diferencia de potencial entre dos electrodos sumergidos en el líquido que se estudia. Uno de los dos electrodos tiene un potencial que es una función definida del pH del líquido, el otro tiene un potencial fijo y conocido y constituye el  electrodo de referencia.2. MATERIAL  Y  APARATOS  2.1. pH metro graduado en unidades de pH que permita efectuar medidas con una aproximación de 0,05 como mínimo.   2.2. Electrodos:   2.2.1. Electrodo de vidrio, que deberá conservarse en agua destilada.   2.2.2. Electrodo de referencia de calomelanos de cloruro potásico saturado, que se conservará en una solución saturada de cloruro potásico.   2.2.3. O electrodo combinado, que deberá conservarse en agua destilada.3. REACTIVOS  3.1. Soluciones tampón:   3.1.1. Solución saturada de tartrato ácido de potasio, al menos de 5,7 g/l de tartrato ácido de potasio (C4H5KO6) a 20 °C. Esta solución puede conservarse hasta 2 meses en presencia de 0,1 g de timol por cada 200 ml).    pH   3,57 a 20 °CpH   3,56 a 25 °CpH   3,55 a 30 °C  3.1.2. Solución 0,05 M de ftalato ácido de potasio. Solución con 10,211 g/l de ftalato ácido de potasio (C8H5KO4) a 20 °C (duración máxima de la solución: 2 meses).pH   3,999 a 15 °CpH   4,003 a 20 °CpH   4,008 a 25 °CpH   4,015 a 30 °C  3.1.3. Solución que contenga:  Fosfato monopotásico KH2PO43,402 gFosfato bipotásico K2H PO44,354 gAgua csp1   l (Duración máxima de la solución: 2 meses)pH   6,90 a 15 °CpH   6,88 a 20 °CpH   6,86 a 25 °CpH   6,85 a 30 °C   Nota: También pueden utilizarse soluciones tampones de referencia comerciales.  4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra para análisis  4.1.1. En el caso del mosto y el vino   Operar directamente sobre los mismos.4.1.2. En el caso del mosto concentrado rectificado   Diluirlo con agua a fin de obtener una concentración de 25 ± 0,5 % (m/m) en azúcares totales (25 ° Brix).    Si P es el contenido en % (m/m) en azúcares totales del mosto concentrado rectificado, pesar una masa igual ay completar con agua hasta 100 g. La conductividad del agua utilizada deberá ser inferior a 2 microsiemens por centímetro.4.2. Puesta a cero  del aparato   Se efectuará antes de cada medida, siguiendo las instrucciones dadas para el aparato utilizado.4.3. Calibrado del pH metro   El calibrado se efectúa a 20 °C siguiendo las indicaciones del aparato utilizado, con las soluciones de pH 6,88 y 3,57 a 20 °C. Utilizar la solución tampón de pH 4,00 a 20 °C para controlar el calibrado de la escala.4.4. Medida   Introducir el electrodo en la muestra analizada, cuya temperatura deberá estar comprendida entre 20 y 25 °C y tan próxima como sea posible a 20 °C. Leer directamente el valor del pH.    Efectúense al menos 2 determinaciones de cada muestra.    Tomar como resultado la media aritmética de ambas determinaciones.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   El pH del mosto, del vino o de la solución al 25 % (m/m) (25 ° Brix) del mosto concentrado rectificado se expresarán con 2 decimales.      25. DIÓXIDO  DE  AZUFRE 1. DEFINICIONES   Se denomina dióxido de azufre al dióxido de azufre presente en el mosto o el vino en las formas siguientes: H2SO3, H SO3, cuyo equilibrio es función del pH y de la temperatura:H2SO3  H+ + HSO3H2SO3 representa el dióxido de azufre molecular.    Se denomina dióxido de azufre total al conjunto de las distintas formas de dióxido de azufre presentes en el vino en estado libre o combinado con sus componentes.2. DIÓXIDO  DE  AZUFRE  LIBRE  Y  TOTAL  2.1. Fundamento de los métodos  2.1.1. Método de referencia  2.1.1.1. En el caso del vino y el mosto:    Arrastre del dióxido de azufre con una corriente de aire o de nitrógeno; fijación y oxidación por borboteo en una solución diluida y neutra de peróxido de hidrógeno. Valoración del ácido sulfúrico formado con una solución valorada de hidróxido sódico.     El arrastre en frío (10 °C) garantiza la extracción únicamente del dióxido de azufre libre.    En caliente (100 °C aproximadamente) se extrae el dióxido de azufre total.2.1.1.2. En  el  caso  del  mosto  concentrado  rectificado.    Se extrae el dióxido de azufre total por arrastre en caliente (aproximadamente 100 °C) del mosto concentrado rectificado previamente diluido.2.1.2. Método rápido de ensayo (vinos y mostos)   Determinación del dióxido de azufre libre por valoración yodométrica directa.   Determinación del dióxido de azufre combinado por valoración yodométrica tras hidrólisis alcalina. La suma del dióxido de azufre libre y combinado permite obtener el dióxido de azufre total.2.2. Método de referencia  2.2.1. Material y aparatos  2.2.1.1. El material utilizado debe ajustarse al esquema que figura a continuación, principalmente en lo que se refiere al refrigerante.      Figura 1Las dimensiones están indicadas en milímetros. Los diámetros internos de los 4 tubos concéntricos que constituyen el refrigerante son: 45, 34, 27 y 10 mm.     El tubo de conducción de los gases al borboteador B termina en una pequeña esfera de 1 cm de diámetro que lleva, en su mayor círculo horizontal, 20 agujeros de 0,2 mm de diámetro. También puede terminar en una placa de vidrio fritado que garantice la  formación de gran número de pequeñas burbujas, realizando así un buen contacto entre las fases gaseosa y líquida.    El flujo de gas que debe recorrer el aparato debe ser de 40 l/h aproximadamente. El frasco situado a la derecha del aparato de destina a limitar de 20 a 30 cm de agua la depresión producida por la trompa de agua. Para poder regular dicha depresión de  forma que el caudal sea el correcto, conviene colocar un medidor de flujo de tubo semicapilar entre el borboteador y el frasco.   2.2.1.2. Microbureta2.2.2. Reactivos  2.2.2.1. Ácido fosfórico al 85 % H3PO4 (r20 = 1,71 g/ml).   2.2.2.2. Solución de peróxido de hidrógeno de 9,1 g/l H2O2 (3 volúmenes).   2.2.2.3. Reactivo indicador:  rojo de metilo100 mg,azul de metileno 50 mg,Alcohol de 50 % vol100 ml.   2.2.2.4. Solución de hidróxido d e sodio (NaOH), 0,01 M.   2.2.3. Procedimiento  2.2.3.1. Determinación  del  dióxido  de  azufre  libre   El vino debe mantenerse a 20 °C en un frasco lleno y cerrado durante 2 días antes de la determinación.- En el borboteador B, colocar de 2 a 3 ml de solución de peróxido de hidrógeno (2.2.2.2) y 2 gotas de reactivo indicador; neutralizar la solución de  peróxido de hidrógeno con la solución 0,01 M de hidróxido de sodio (2.2.2.4). Acoplar el borboteador al aparato (2.2.1.1).- En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre, introducir 50 ml de muestra y 15 ml de ácido fosfórico (2.2.2.1). Colocar el  matraz en su lugar.A continuación , hacer borbotear el aire (o el nitrógeno) durante 15 minutos. El dióxido de azufre libre arrastrado se oxida a ácido sulfúrico. Retirar el borboteador del aparato y valorar el ácido formado con la solución de hidróxido  sódico 0,01 M (2.2.2.4).Sea n el número de mililitros utilizados.2.2.3.2. Expresión  de  los  resultados   Dióxido de azufre libre en mg/l sin decimales  2.2.3.2.1. Cálculo   Dióxido de azufre libre en miligramos por litro: 6,4 n.2.2.3.3. Determinación  del  dióxido  de  azufre  total.   2.2.3.3.1. En el caso del mosto concentrado rectificado, utilizar la solución obtenida diluyendo la muestra para analizar al 40 %(m/v) tal y como se indica en el capítulo «Acidez total», en el apartado 5.1.2. En el matraz A de 250 ml del aparato de  arrastre introducir 50 ml de esta solución y 5 ml de ácido fosfórico (2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato 2.2.1.1.   2.2.3.3.2. Vinos y mostos    Muestras en las que se suponga que el contenido en SO2 total sea d 50 mg/l.    En el matraz A de 250 ml del aparato de arrastre introducir 50 ml de muestra y 15 ml de ácido fosfórico (2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato (2.2.1.1).    Sin embargo, hasta el 31 de diciembre de 1992 como fecha límite, para analizar el contenido en dióxido de azufre de los zumos de uva se emplea 5 ml de ácido fósfórico (2.2.2.1) diluido a 25 % (m/V).   2.2.3.3.3. Muestras en las que se suponga que el contenido en SO2 total sea D 50 mg/l.    En el matraz A de 100 ml del aparato de arrastre introducir 20 ml de muestra y 5 ml de ácido fosfórico (2.2.2.1). Acoplar el matraz al aparato (2.2.1.1.).    Introducir en el borboteador B de 2 a 3 ml de solución de peróxido de hidrógeno (2.2.2.2), neutralizarla como se hizo anteriormente, llevar a ebullición el vino contenido en el matraz A con una pequeña llama de 4 a 5 cm de altura que debe tocar  ligeramente el fondo del matraz. No colocar bajo el matraz ninguna tela metálica, sino depositarlo sobre un disco perforado con un agujero de 30 mm de diámetro. Se evita así la pirogenación de las materias extractivas del vino sobre las paredes del  matraz.    Mantener la ebullición durante el paso de la corriente de aire (o de nitrógeno). En 15 minutos el dióxido de azufre total habrá sido arrastrado y oxidado. Valorar el ácido sulfúrico formado con la solución 0,01 M de hidróxido sódico (2.2.2.4).    Sea n el número de mililitros utilizados.2.2.3.4. Expresión de los resultados   El dióxido de azufre total se expresa en miligramos por litro (mg/l) o en miligramos por kilogramo (mg/kg) de azúcares totales sin decimales.   2.2.3.4.1. Cálculo   Vinos y mostosDióxido de azufre total en miligramos por litro:- Muestras con bajo contenido en dióxido de azufre (muestra 50 ml):  6,4 · n- Otras muestras (muestra 20 ml):  16 · n   Mosto concentrado rectificadoDióxido de azufre en miligramos por kilo de azúcares totales (muestra: 50 ml de muestra preparada (2.2.3.3.1):P = contenido en % (m/m) de azúcares totales.   2.2.3.4.2. Repetibilidad (r)Contenido <  50 mg/l (muestra de 50 ml), r = 1 mg/l.Contenido > 50 mg/l (muestra de 20 ml), r = 6 mg/l.   2.2.3.4.3. Reproductibilidad (R)Contenido <  50 mg/l (muestra de 50 ml), R = 9 mg/l.Contenido > 50 mg/l (muestra de 20 ml), R = 15 mg/l2.3. Método rápido de ensayo  2.3.1. Reactivos  2.3.1.1. EDTA (complexona III): sal disódica del ácido etilen diamino tetracético dihidratada (C10H14N2O8Na2·2H2O).    2.3.1.2. Solución 4 M de hidróxido sódico NAOH (160 g/l)  2.3.1.3. Ácido sulfúrico H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml), solución a 1/10 (v/v)  2.3.1.4. Engrudo de almidón, solución de 5 g/l.    Disolver 5 g de almidón en 500 ml de agua aproximadamente. Llevar a ebullición agitando y mantener la ebullición durante 10 minutos; añadir 200 g de cloruro sódico (NaCl). Enrasar hasta un litro después de enfriar.   2.3.1.5. Solución 0,025 M yodo (I2).2.3.2. Material  2.3.2.1. Erlenmeyer de 500 ml  2.3.2.2. Bureta  2.3.2.3. Pipetas de 1, 2, 5 y 50 ml2.3.3. Procedimiento  2.3.3.1. Dióxido de azufre libre   En un erlenmeyer de 500 ml, echar:- 50 ml de vino- 5 ml de engrudo de almidón (2.3.1.4)- 30 mg de EDTA (complexona III) (2.3.1.1.)- 3 ml de H2SO4 al 1/10 v/v (2.3.1.3)   Valorar inmediatamente con yodo 0,025 M (2.3.1.5) hasta que la coloración azul se mantenga claramente durante 10 a 15 segundos. Sea n ml el volumen de yodo utilizado.2.3.3.2. Dióxido de azufre combinado   Añadir 8 ml de solución 4 M de hidróxido sódico (2.3.1.2), agitar una sola vez y dejar 5 minutos en contacto. Verter de un golpe, y agitando enérgicamente el contenido de un pequeño vaso en el que se hayan echado 10 ml de ácido sulfúrico al 1/10 v/v  (2.3.1.3). Valorar inmediatamente con yodo 0,025 M (2.3.1.5). Sea n' el volumen de yodo empleado.    Añadir 20 ml de solución 4 M de hidróxido sódico (2.3.1.2), dejar en contacto 5 minutos después de haber agitado una sola vez. Diluir con 200 ml de agua lo más fría posible.    Agitando enérgicamente, verter de un golpe 30 ml de ácido sulfúrico al 1/10 (2.3.1.3) previamente colocados en una probeta. Valorar el dióxido de azufre liberado con el yodo 0,025 M (2.3.1.5). Sea n" el volumen de yodo empleado.2.3.4. Expresión de los  resultados  2.3.4.1. Cálculo   Dióxido de azufre libre en miligramos por litro: 32 n.    Dióxido de azufre total en miligramos por litro: 32 (n + n' + n").    Observaciones:1. En el caso de los vinos tintos con bajo contenido en SO2, conviene utilizar yodo más diluido que 0,025 M, por ejemplo: 0,01 M. Sustituir el coeficiente 32 por 12,8 en las fórmulas anteriores.  2. En el caso de los vinos tintos, procede iluminar el vino por debajo con un haz de luz amarilla obtenida con una lámpara eléctrica ordinaria y una solución de cromato de potasio, o con una lámpara de vapor de sodio. Es preciso situarse en una cámara  oscura y observar la transparencia del vino, que se hará opaco cuando se produzca el viraje del engrudo.3. Cuando la cantidad de dióxido de azufre encontrada se aproxime o supere el límite legal, es conveniente determinar el dióxido de azufre total por  el método de referencia.4. Cuando se conceda especial importancia a la determinación del dióxido de azufre, se operará de la forma convencional sobre una muestra que se haya mantenido durante 4 días antes del análisis al resguardo del aire y a una  temperatura de 20 °C; la determinación deberá realizarse a esta misma temperatura.5. Dado que el yodo oxida determinadas sustancias en medio ácido, en determinaciones muy precisas será necesario evaluar la cantidad de yodo así utilizado. Para ello, el  dióxido de azufre libre debe combinarse con un exceso de etanal o de propanal, antes de efectuar la valoración con yodo. Añadir, a 50 ml de vino colocados en un erlenmeyer de 300 ml, 5 ml de solución de etanal (C2H4O) de 7 g/l o 5 ml de una solución de  propanal (C3H6O) de 10 g/l.Tapar y dejar reposar durante 30 minutos por lo menos. Añadir 3 ml de ácido sulfúrico al 1/10 (2.3.1.3) y yodo 0,025 M (2.3.1.5) en cantidad suficiente para que vire el engrudo de almidón. Sea n"' el volumen de yodo empleado.  Debe restarse de n (dióxido de azufre libre) y de n + n' + n" (dióxido de azufre total). n4 es generalmente bajo: 0,2 a 0,3 ml de yodo 0,025 M. Si se ha añadido al vino ácido ascórbico, n4 será mucho más elevado y, sabiendo que 1 ml de yodo 0,025 M  oxida 4,4 mg de ácido ascórbico, el valor de n4 permitirá medir, por lo menos aproximadamente, la cantidad de dicho producto. Así, con la medida de n4 se pueden detectar sin dificultad los vinos a los que se les ha añadido ácido ascórbico en cantidad  superior a 20 mg/l y que no se ha transformado en productos de oxidación.3. DIÓXIDO  DE  AZUFRE  MOLECULAR  3.1. Fundamento de método   El porcentaje de dióxido de azufre molecular, H2SO3, en el dióxido de azufre libre se calcula en función del pH, del grado alcohólico y de la temperatura.    Para una temperatura y grado alcohólico determinados:H2SO3  H+ + HSO3I = fuerza iónica,A y B = coeficientes que varían con la temperatura y el grado alcohólico,KT = constante termodinámica de disociación; el valor de pkT viene dado en la tabla 1 en  función del grado alcohólico y de la temperatura,KM = constante mixta de disociación.    Tomando para la fuerza iónica l el valor medio 0,038, en la tabla 2 se dan los valores de pkM en función de la temperatura y del grado alcohólico.    El contenido en dióxido de azufre molecular calculado a partir de la relación (1) viene dado en la tabla 3 en función del pH, de la temperatura y del grado alcohólico.3.2. Cálculo   Conociendo el pH del vino y su grado alcohólico, el porcentaje de dióxido de azufre molecular viene dado en la tabla 3 para la temperatura t °C; sea X %.     Contenido en dióxido de azufre molecular en mg/l:X · CC = contenido en dióxido de azufre libre en mg/l.   TABLA 1Valores de la constante termodinámica pKT   TABLA 2Valores de la constante mixta pKM (l = 0,038)     TABLA 3Dióxido de azufre molecular en porcentaje del dióxido de azufre libre (l = 0,038)     TABLA 3 (continuación)Dióxido de azufre molecular en porcentaje del dióxido de azufre libre (l = 0,038)     26. SODIO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método de referencia: Espectrofotometría de absorción atómica   El sodio se determina directamente en el vino mediante espectrofotometría de absorción atómica, previa adición de un tampón espectral de cloruro de cesio para evitar la ionización del sodio.1.2. Método usual: fotometría de llama   El sodio se determina directamente en el vino diluido al menos a 1/10 por fotometría de llama.2. MÉTODO  DE  REFERENCIA  2.1. Reactivos  2.1.1. Solución de sodio de 1 g/l.    Utilizar una solución estándar de sodio comercial de 1 g/l. Esta solución puede prepararse disolviendo 2,542 g de cloruro sódico (NaCl) desecado, en agua destilada y ajustando el volumen a 1 litro.    Conservar esta solución en un frasco de polietileno.2.1.2. Solución de referencia:   Ácido cítrico (C6H8O7, H2O) 3,5 gSacarosa (C12H22O11) 1,5 gGlicerol (C3H8O3) 5,0 gCloruro de calcio anhidro (Ca Cl2) 50   mgCloruro de magnesio anhidro (Mg Cl2) 50   mgAlcohol absoluto (C2H5OH) 50   mgAgua csp500   ml2.1.3.Solución de cloruro de cesio  al 5 % en cesio.    Disolver 6,33 g de cloruro de cesio (Cs Cl) en 100 ml de agua destilada.2.2. Aparatos  2.2.1. Espectrofotómetro de absorción atómica provisto de un mechero alimentado por aire y acetileno.   2.2.2. Lámpara de cátodo hueco de sodio.2.3. Procedimiento  2.3.1. Preparación de la muestra   Tomar 2,5 ml de vino, echar en un matraz aforado de 50 ml, añadir 1 ml de la solución de cloruro de cesio (2.1.3) y enrasar con agua destilada.  2.3.2. Calibrado   En una serie de matraces aforados de 100 ml introducir 5,0 ml de solución de referencia, echar 0; 2,5; 5; 7,5 y 10 ml de la solución de sodio de 1 g por litro (2.1.1) previamente diluida a 1/100, añadir en todos los matraces 2 ml de la solución de  cloruro de cesio (2.1.3) y enrasar hasta 100 ml con agua destilada.    Las soluciones patrón preparadas tienen un contenido de 0; 0,25; 0,50; 0,75 y 1,00 mg de sodio por litro respectivamente y 1 g de cesio por litro. Estas soluciones deberán conservarse en frascos de polietileno.2.3.3. Determinación   Seleccionar la longitud de onda 589,0 nm. Regular el cero de la escala de absorbancias con la solución de calibrado que contiene 1 g de cesio por litro (2.3.2). Aspirar directamente el vino diluido en el mechero del espectrofotómetro, y seguidamente  hacer lo mismo con las soluciones patrón (2.3.2). Leer las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.2.4. Expresión de los resultados  2.4.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración en sodio de las soluciones patrón.    Llevar a esta curva el valor medio de las absorbancias obtenidas de la muestra y determinar la concentración C de sodio en miligramos por litro.    La concentración de sodio expresada en miligramos por litro de vino sin decimales será:20 · C2.4.2. Repetibilidad: r   r = 1 + 0,024 xi mg/lxi = concentración de sodio en la muestra en mg/l2.4.3. Reproductibilidad: R   R = 2,5 + 0,05 xi mg/lxi = concentración de sodio en la muestra en mg/l.3. MÉTODO  USUAL  3.1. Reactivos  3.1.1. Solución patrón de sodio de 20 mg por litro.   Alcohol absoluto (C2H5OH)  10   mlÁcido cítrico (C6H8O7, H2O)  700   mgSacarosa (C12H22O11)  300   mgGlicerol (C3H8O3)1 000   mgTartrato ácido de potasio (C4H5KO6)  481,3  mgCloruro cálcico anhidro (Ca Cl2)  10   mgCloruro de magnesio anhidro (Mg Cl2)   10   mgCloruro sódico desecado (NaCl)  50,84 mgAgua csp   1   l 3.1.2. Solución de dilución  Alcohol absoluto (C2H5OH)  10   mlÁcido cítrico (C6H8O7, H2O)  700   mgSacarosa (C12H22O11)  300   mgGlicerol (C3H8O3)1 000   mgTartrato ácido de potasio (C4H5KO6)  481,3  mgCloruro cálcico anhidro (Ca Cl2)  10   mgCloruro de magnesio anhidro (Mg Cl2)   10   mgAgua csp   1   l   Para preparar las soluciones 3.1.1 y 3.1.2, disolver el tartrato ácido de potasio en unos 500 ml de agua destilada muy caliente, mezclar la solución con los demás compuestos previamente disueltos en 400 ml de agua destilada y enrasar a 1 litro. Las  soluciones se conservarán en frascos de polietileno, añadiendo 2 gotas de isotiocianato de alilo.3.2. Aparato  3.2.1. Fotómetro de llama alimentado por una mezcla de aire y butano.3.3. Procedimiento  3.3.1. Calibrado   En cinco matraces aforados de 100 ml, echar 5, 10, 15, 20 y 25 ml de la solución de sodio de 20 mg/l (3.1.1) y completar hasta 100 ml con la solución de dilución (3.1.2). Se obtendrán soluciones con un contenido de 1, 2, 3, 4 y 5 mg de sodio por litro,  respectivamente.3.3.2. Determinación   Efectuar las medidas a 589,0 nm. Regular el 100 % de transmisión con agua destilada. Aspirar directamente en el mechero del fotómetro las soluciones patrón (3.3.1), seguidamente hacer lo mismo con el vino diluido a 1/10 con agua destilada y leer los  porcentajes de transmisión. Si fuera necesario, diluir el vino, ya diluido a 1/10, con la solución de dilución (3.1.2).3.4.Expresión de los resultados  3.4.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variaciones del porcentaje de transmisión en función de la concentración de sodio de las soluciones patrón. Llevar a esta curva la transmisión correspondiente a la muestra de vino diluido y determinar la concentración C en sodio. La  concentración en miligramos de sodio por litro será:C· FF = factor de dilución.3.4.2. Repetibilidad: r   (excepto vinos de licor) r = 1,4 mg/lvinos de licor: r = 2,0 mg/l3.4.3. Reproductibilidad: R   R = 4,7 + 0,08 xi mg/lxi = concentración de sodio en la muestra en mg/l.     27. POTASIO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método de referencia   Elpotasio se determina directamente en el vino diluido por espectrofotometría de absorción atómica previa adición de un tampón espectral de cloruro de cesio para evitar la ionización del potasio, especialmente cuando se utiliza la llama  acetileno-aire.1.2. Método usual   El potasio se determina directamente en el vino diluido por fotometría de llama.2. MÉTODO  DE  REFERENCIA  2.1. Reactivos  2.1.1. Solución de potasio de 1 g/l   Utilizar una solución estándar de potasio comercial de 1 g/l. Esta solución puede prepararse disolviendo 4,813 g de tartrato ácido de potasio (C4H5KO6) en agua destilada y ajustando el volumen a 1 litro.   2.1.2. Solución referencia    Ácido cítrico (C6H8O7, H2O) 3,5 gSacarosa (C12H22O11) 1,5 gGlicerol (C3H8O3) 5,0 gCloruro cálcico anhidro (Ca Cl2) 50  mgCloruro de magnesio anhidro (Mg Cl2) 50  mgAlcohol absoluto (C2H5OH) 50  mlAgua csp500  ml2.1.3. Solución de cloruro de cesio al 5 %  en cesio   Disolver 6,330 g de cloruro de cesio (Cs Cl) en 100 ml de agua destilada.2.2. Material  2.2.1. Espectrofotómetro de absorción atómica, equipado con un mechero alimentado por aire y acetileno.   2.2.2. Lámpara de cátodo hueco de potasio.2.3. Procedimiento  2.3.1. Preparación de la muestra   Tomar 2,5 ml de vino (previamente diluido al 1/10), echarlos en un matraz aforado de 50 ml, añadir 1 ml de la solución de cloruro de cesio (2.1.3) y enrasar con agua destilada hasta la marca del aforo.2.3.2. Calibrado   En una serie de matraces aforados de 100 ml introducir 5 ml de solución referencia (2.1.2), echar 0; 2,0; 4,0; 6,0 y 8,0 ml de la solución de potasio de 1 g por litro (2.1.1) previamente    diluida al 1/10, añadir en todos los matraces 2 ml de la solución de cloruro de cesio (2.1.3) y ajustar el volumen a 100 ml con agua destilada. Las soluciones patrón preparadas tienen un contenido de potasio de 0; 2; 4; 6 y 8 mg por litro  respectivamente y 1 g de cesio por litro. Estas soluciones deberán conservarse en frascos de polietileno.2.3.3. Determinación   Seleccionar la longitud de onda 769,9 nm. Regular el cero de la escala de absorbancia con la solución referencia que contiene 1 g de cesio por litro (2.3.2). Aspirar directamente el vino diluido (2.3.1) en el mechero del espectrofotómetro, y  seguidamente hacer lo mismo con las soluciones patrón (2.3.2); tomar las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.2.4. Expresión de los resultados  2.4.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración en potasio de las soluciones patrón. Llevar a esta curva el valor medio de las absorbancias correspondientes a la muestra de vino diluido y determinar la concentración C de  potasio en miligramos por litro.  La concentración de potasio, expresada en miligramos por litro de vino, será:F · CF = factor de dilución (aquí, 200).2.4.2. Repetibilidad: rr = 35 mg/l.   2.4.3. Reproductibilidad: R R = 66 mg/l.2.4.4. Otras expresiones de los resultados   - en miliequivalentes por litro: 0,256 · F · C- en tartrato ácido de potasio en miligramos por litro:4,813 · F · C3. MÉTODO  USUAL:  ESPECTROFOTOMETRÍA  DE  LLAMA  3.1. Reactivos  3.1.1. Solución de referencia de 100 mg de potasio por litro    Alcohol absoluto (C2H5OH)  10  mlÁcido cítrico (C6H8O7, H2O)  700  mgSacarosa (C12H22O11)  300  mgGlicerol (C3H8O3)1 000  mgCloruro de sodio (NaCl)  50,8 mgCloruro cálcico anhidro (Ca Cl2)  10  mgCloruro de magnesio anhidro (Mg Cl2)  10  mgTartrato  ácido de potasio desecado (C4H5KO6)  481,3 mgAgua csp1 000  ml   Disolver el tartrato ácido de potasio en aproximadamente 500 ml de agua destilada muy caliente, mezclar la solución con los demás elementos previamente disueltos en 400 ml de agua destilada y enrasar a 1 litro.  3.1.2. Solución de dilución  Alcohol absoluto (C2H5OH)  10  mlÁcido cítrico (C6H8O7, H2O)  700  mgSacarosa (C12H22O11)  300  mgGlicerol (C3H8O3)1 000  mgCloruro de sodio (NaCl)  50,8 mgCloruro cálcico anhidro (Ca Cl2)  10  mgCloruro de magnesio anhidro (Mg Cl2)  10  mgÁcido  tartárico (C4H6O6)  383  mgAgua csp1 000  ml   Las soluciones se conservarán en frascos de polietileno, añadiendo 2 gotas de isotiocianato de alilo.3.2. Material  3.2.1. Fotómetro de llama alimentado por una mezcla de aire y butano.3.3. Procedimiento  3.3.1. Calibrado   En cuatro matraces aforados de 100 ml, echar 25, 50, 75 y 100 ml de la solución de referencia (3.1.1) y completar hasta 100 ml con la solución de dilución (3.1.2). Se obtendrán soluciones con un contenido de 25, 50, 75 y 100 mg por litro de potasio,  respectivamente.3.3.2. Determinación   Efectuar las medidas a 766 nm. Regular el 100 % de transmisión con agua destilada. Aspirar directamente en el mechero del fotómetro las soluciones patrón (3.3.1), seguidamente hacer lo mismo con el vino diluido al 1/10 con agua destilada y tomar los  porcentajes de transmisión. Si fuera necesario, diluir de nuevo el vino ya diluido a 1/10, con la solución de dilución (3.1.2).3.4. Expresión de los resultados  3.4.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de los porcentajes de transmisión en función de la concentración en potasio de las soluciones patrón. Llevar a esta curva la transmisión obtenida con la muestra de vino diluido y determinar la concentración C en potasio.    La concentración en miligramos de potasio por litro será:C · FF = factor de dilución.3.4.2. Repetibilidad: r   r = 17 mg/l.3.4.3. Reproductibilidad: R   R = 66 mg/l.  3.4.4. Otras expresiones de los resultados:    - en miliequivalentes por litro: 0,0256 · F · C- en tartrato ácido de potasio en miligramos por litro: 4,813 · F · C.    28. MAGNESIO 1. FUNDAMENTO   El magnesio se determina directamente en el vino, convenientemente diluido, por espectrofotometría de absorción atómica.2. REACTIVOS  2.1. Solución patrón concentrada de magnesio con un contenido de 1 g por litro.    Utilizar una solución estándar de magnesio comercial.    Dicha solución podrá prepararse disolviendo 8,3646 g de cloruro de magnesio (MgCl2, 6 H2O) en agua destilada y enrasando el volumen a 1 litro.2.2. Solución patrón diluida de magnesio, con un contenido de 5 mg por litro.    Nota: Conservar las soluciones patrón de magnesio en frascos de polietileno.3. MATERIAL  3.1. Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con un mechero alimentado por aire y acetileno.3.2. Lámpara de cátodo hueco de magnesio.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra   Diluir el vino a 1/100 con agua destilada.4.2. Calibrado   En una serie de matraces aforados de 100 ml, echar 5, 10, 15 y 20 ml de la solución 2.2 y enrasar a 100 ml con agua destilada. Las soluciones preparadas tienen un contenido de magnesio de 0,25, 0,50, 0,75 y 1 mg por litro respectivamente. Estas  soluciones se conservarán en frascos de polietileno.4.3. Determinación   Seleccionar la longitud de onda 285 nm.    Regular el cero de la escala de absorbancias con agua destilada. Aspirar directamente el vino diluido en el mechero del espectrofotómetro, hacerlo a continuación con las soluciones patrón preparadas en 4.2.    Leer las absorbancias; efectuar las determinaciones por duplicado.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración en magnesio de las soluciones patrón.    Llevar a esta curva el valor medio de las absorbancias obtenidas con la muestra de vino diluido y determinar la concentración C en magnesio.     La concentración en magnesio, expresada en miligramos por litro de vino sin decimales, será:100 · C5.2. Repetibilidad: r   r = 3 mg/l.5.3. Reproductibilidad: R   R = 8 mg/l.     29. CALCIO 1. FUNDAMENTO   El calcio se determina directamente en el vino, convenientemente diluido, por espectrofotometría de absorción atómica, previa adición de un tampón espectral.2. REACTIVOS  2.1. Solución patrón de calcio con un contenido de 1 g por litro.    Utilizar una solución estándar de calcio comercial.    Dicha solución podrá prepararse disolviendo 2,5 g de carbonato de calcio (Ca CO3) en la cantidad suficiente de HCl a 1/10 (v/v) para obtener su disolución y enrasando el volumen a 1 litro con agua destilada.2.2. Solución patrón diluida de calcio con un  contenido de 50 mg por litro.    Nota: Conservar las soluciones patrón de calcio en frascos de polietileno.2.3. Solución de cloruro de lantano de 50 g/l en lantano.    Disolver 13,369 g de cloruro de lantano (La Cl3, 7 H2O) en agua destilada; añadir 1 ml de HCL diluido 1/10 (v/v) y enrasar a 100 ml.3. MATERIAL  3.1. Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con un mechero alimentado por aire y acetileno.3.2. Lámpara de cátodo hueco de calcio.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra   En un matraz aforado de 20 ml, echar 1 ml de vino, 2 ml de solución 2.3 y enrasar con agua destilada. El vino diluido a 1/20 contiene 5 g de lantano por litro.    Nota:En el caso de vinos dulces, la concentración de 5 g de lantano por litro será suficiente, siempre que la dilución lleve el contenido en azúcares a menos de 2,5 g por litro. Para concentraciones en azúcares superiores, será necesario aumentar a 10  g por litro el contenido en lantano.4.2. Calibrado   En cinco matraces aforados de 100 ml, echar 0, 5, 10, 15 y 20 ml de la solución 2.2, añadir en todos los matraces 10 ml de la solución 2.3 y enrasar a 100 ml con agua destilada. Las soluciones patrón preparadas tienen un contenido de calcio de 0, 2,5,  5, 7,5 y 10 mg por litro respectivamente y 5 g de lantano por litro. Estas soluciones se conservarán en frascos de polietileno.4.3. Determinación   Seleccionar la longitud de onda 422,7 nm. Regular el cero de la escala de absorbancias con la solución que contiene 5 g de lantano por litro (4.2). Aspirar directamente el vino diluido en el mechero del espectrofotómetro, seguidamente hacer lo mismo  con las soluciones patrón preparadas en 4.2. Leer las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.  5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración en calcio de las soluciones patrón.    Llevar a esta curva el valor medio de las absorbancias obtenidas con la muestra de vino diluido y determinar la concentración C en calcio. La concentración en calcio, expresada en miligramos por litro de vino sin decimales, será:20 · C5.2.  Repetibilidad: r   contenido <  60 mg/l: r = 2,7 mg/lcontenido > 60 mg/l: r = 4 mg/l.5.3.Reproductibilidad: R   R = 0,114 xi   0,5xi = concentración en mg/l de la muestra.     30. HIERRO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS   Método de referencia   El hierro se determina directamente por espectrofotometría de absorción atómica, previa dilución del vino y eliminación del alcohol. Método usual   Después de la mineralización del vino con perhidrol, el hierro que se encuentra en forma de hierro III se reduce al estado de hierro II y se determina por la coloración roja que se produce con la ortofenantrolina.2. MÉTODO  DE  REFERENCIA  2.1. Reactivos  2.1.1. Solución patrón concentrada de hierro III, de 1 g/l.    Utilizar una solución estándar comercial. Esta solución puede prepararse disolviendo 8,6341 g de sulfato de hierro III [FeNH4(SO4)2 · 12H2O] y de amonio en agua destilada ligeramente acidificada con ácido clorhídrico M y enrasando el volumen a 1 litro.    2.1.2. Solución patrón diluida de hierro, de 100 miligramos por litro.2.2. Material  2.2.1. Rotavapor con baño de agua termostatado.   2.2.2. Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con un mechero alimentado con aire y acetileno.   2.2.3. Lámpara de cátodo hueco de hierro.2.3. Procedimiento  2.3.1. Preparación de la muestra   Eliminar el alcohol del vino mediante concentración del volumen de la muestra a su mitad en un rotavapor (50-60 °C). Completarlo a su volumen inicial con agua destilada.    Si fuera necesario, efectuar una dilución previa a la determinación.2.3.2. Calibrado   En una serie de matraces aforados de 100 ml, echar 1, 2, 3, 4 y 5 ml de la solución de hierro de 100 miligramos por litro (2.1.2) y completar hasta 100 ml con agua destilada. Las soluciones preparadas tendrán un contenido de hierro de 1, 2, 3, 4 y 5 mg  por litro.    Estas soluciones se conservarán en frascos de polietileno.2.3.3. Determinación   Seleccionar la longitud de onda 248,3 nm. Regular el cero de la escala de absorbancias con agua destilada. Aspirar directamente la muestra diluida en el mechero del espectrofotómetro, seguidamente hacer lo mismo con las soluciones patrón preparadas en  2.3.2. Leer las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.2.4. Expresión de los resultados  2.4.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración de hierro de las soluciones patrón. Llevar a esta curva el valor medio de la absorbancia obtenida con la muestra de vino diluido y determinar la concentración en hierro C.    La concentración en hierro, expresada en miligramos por litro de vino con 1 decimal, será:C · FF = factor de dilución.3. MÉTODO  USUAL  3.1. Reactivos  3.1.1. Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30 % (m/v) exenta de hierro.   3.1.2. Solución de ácido clorhídrico exento de hierro, 1 M.   3.1.3. Hidróxido de amonio (r20 = 0,92 g/ml).   3.1.4. Piedra pómez tratada con ácido clorhídrico a 1/2 hirviendo y lavada con agua destilada.   3.1.5. Solución de hidroquinona (C6H6O2) al 2,5 %, acidificada con 1 ml de ácido sulfúrico puro (r20 = 1,84 g/ml) para 100 ml de solución. Esta solución se conservará en un frasco topacio en nevera y se sustituirá en cuanto aparezca el más mínimo tono  marrón.   3.1.6. Solución de sulfito de sodio (Na2SO3) al 20 % preparada a partir de sulfito neutro y anhidro.   3.1.7. Solución de ortofenantrolina (C12H8N2 · H2O) al 0,5 % en alcohol de 96 % vol.   3.1.8. Solución de acetato de amonio (CH3 COONH4) al 20 % (m/v).   3.1.9. Solución de hierro III de 1 g de hierro por litro. Utilizar una solución estándar comercial. Esta solución puede prepararse disolviendo 8,6341 g de sulfato de hierro y de amonio [NH4Fe(SO4)2]. 12 H2O en 100 ml de solución 1 M de ácido clorhídrico  (3.1.2) y enrasando el volumen a 1 litro con la solución 1 M de ácido clorhídrico (3.1.2).   3.1.10. Solución patrón de hierro diluida, de 100 miligramos por litro.3.2. Material  3.2.1. Matraz Kjeldahl de 100 ml.   3.2.2. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas a una longitud de onda de 508 nm.3.3. Procedimiento  3.3.1. Mineralización  3.3.1.1. Vino cuyo contenido en azúcares sea inferior a 50 g/l:    Introducir en un matraz de Kjeldahl 25 ml de vino, 10 ml de solución de peróxido de hidrógeno (3.1.1) y algunos granos de piedra pómez (3.1.4). Concentrar el líquido hasta un volumen de 2 a 3 ml.     Una vez frío, añadir al residuo obtenido, sin mojar las paredes del matraz, hidróxido de amonio (3.1.3) en la cantidad necesaria para alcalinizar el medio y precipitar los hidróxidos.    Después de que se enfríe, añadir al líquido alcalino la solución 1 M de ácido clorhídrico (3.1.2) en la cantidad necesaria para disolver el precipitado de los hidróxidos y transvasar la solución obtenida a un matraz aforado de 100 ml. Después de lavar  el matraz de Kjeldahl con la solución M de ácido clorhídrico (3.1.2), enrasar el volumen a 100 ml con la misma solución.3.3.1.2. Mostos y vinos cuyo contenido en azúcares sea superior a 50 g/l:   3.3.1.2.1. Contenido en azúcares comprendido entre 50 y 200 g/l:la muestra de 25 ml de mosto o de vino se tratará con 20 ml de solución de peróxido de hidrógeno (3.1.1).Continuar como se describe en (3.3.1.1).   3.3.1.2.2. Contenido en azúcares superior a 200 g/l:las muestras de mosto o de vino deberán diluirse previamente a 1/2 o incluso a 1/4 y tratarse como se indica en el procedimiento 3.3.1.2.1.3.3.2. Ensayo en blanco   Efectuar un ensayo en blanco con agua destilada empleando el mismo volumen de solución de peróxido de hidrógeno (3.1.1) que el utilizado para la mineralización y siguiendo el protocolo experimental descrito en 3.3.1.1.3.3.3. Determinación   Tomar 20 ml de la solución clorhídrica del producto de mineralización de la muestra (3.3.11) y 20 ml de la solución clorhídrica «ensayo en blanco» (3.3.2) e introducirlos en dos matraces aforados de 50 ml. Añadir en cada matraz 2 ml de la solución de  hidroquinona (3.1.5), 2 ml de la solución de sulfito (3.1.6) y 1 ml de la solución de ortofenantrolina (3.1.7). Dejar reposar durante 15 minutos para favorecer la reducción de Fe III en Fe II. Añadir 10 ml de la solución de acetato de amonio (3.1.8),  completar el volumen hasta 50 ml con agua destilada y agitar los dos matraces aforados. Medir la absorbancia a 508 nm de la solución que va a determinarse regulando el cero de la escala de absorbancias con la solución procedente del ensayo en  blanco.3.3.4. Calibrado   En cuatro matraces aforados de 50 ml, echar 0,5, 1, 1,5 y 2 ml de la solución de 100 mg de hierro por litro (3.1.10) y 20 ml de agua destilada; continuar como se indica en el procedimiento 3.3.3 y medir la absorbancia de cada una de las soluciones  patrón preparadas, que corresponden, respectivamente, a 50, 100, 150 y 200 microgramos de hierro en la muestra.3.4. Expresión de los resultados  3.4.1. Método de cálculo   Trazar la curva de las variaciones de la absorbancia en función de la concentración en hierro de las soluciones patrón. Leer la absorbancia obtenida con la solución problema y determinar la concentración en hierro C contenida en la muestra de 20 ml de  solución clorhídrica de mineralización, es decir en 5 ml de la muestra que va a analizarse.    La concentración de hierro, expresada en miligramos por litro de vino, con 1 decimal, será:200 · C   Si el vino (o el mosto) ha sido diluido, la concentración de hierro expresada en miligramos por litro de vino, con 1 decimal, será:200 · C · FF = factor de dilución.     31. COBRE 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Empleo de la espectrofotometría de absorción atómica.2. MATERIAL  2.1. Cápsula de platino.   2.2. Espectrofotómetro de absorción atómica.   2.3. Lámpara de cátodo hueco de cobre.   2.4. Gas de alimentación: aire, acetileno y/o protóxido de nitrógeno.3. REACTIVOS  3.1. Cobre metálico.   3.2. Ácido nítrico concentrado al 65 % (HNO3, r20 = 1,38 g/ml).   3.3. Ácido nítrico diluido al 1/2 (v/v).3.4. Solución de cobre de 1 g/l   Utilizar una solución estándar de cobre comercial.    Esta solución podrá prepararse pesando 1 000 g de cobre metálico y transfiriendo cuantitativamente en un matraz aforado de 1 000 ml. Añadir ácido nítrico diluido a 1/2 (3.3) en cantidad estrictamente suficiente para disolver el metal, añadir 10 ml de  ácido nítrico concentrado (3.2) y enrasar con agua bidestilada.3.5. Solución de cobre de 100 mg/l.    Tomar 10 ml de la solución 3.4 e introducirlos en un matraz aforado de 100 ml, completando el volumen con agua bidestilada.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra y determinación del cobre   En caso necesario, preparar una dilución adecuada con agua bidestilada.4.2. Calibrado   Tomar 0,5, 1, 2 ml de la solución 3.5 (100 mg de cobre por litro) e introducirlos en matraces aforados de 100 ml completando el volumen con agua bidestilada; las soluciones obtenidas contendrán respectivamente 0,5, 1, 2 mg/l de cobre. Con los valores  de absorbancias de estas soluciones, medidas como se especifica en 4.1, trazar la curva de calibrado.4.3. Dosificación   Seleccionar la longitud de onda 324,8 nm. Ajustar a cero la escala de las absorbancias con el agua bidestilada. Aspirar directamente la muestra diluida en el mechero del espectrofotómetro, después sucesivamente las soluciones patrón preparadas en 4.2.  Hallar las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.  5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Modo de cálculo   Construir la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración en hierro de las soluciones patrón.   Trasladar a la curva patrón la absorbancia leída para la muestra de vino diluido y hallar la concentración C en mg/l.    Si F es el factor de dilución el contenido de cobre del vino será en miligramos por litro: F · C y se dará con 2 decimales.    Observaciones:a) Las soluciones para establecer la curva patrón y las diluciones de la muestra deben elegirse en función de la sensibilidad del aparato utilizado y de la concentración del cobre presente en la muestra.    b) Cuando en la muestra hay concentraciones muy bajas de cobre, el procedimiento es el siguiente: echar 100 ml de muestra en una cápsula de platino, evaporar en un baño de agua a 100 °C hasta que adquiera una consistencia de jarabe, añadir, gota a  gota, 2,5 ml de ácido mítrico concentrado (3.2) intentando cubrir todo el fondo de la cápsula. Incinerar con precaución el residuo en una placa calentadora eléctrica o sobre una pequeña llama; introducir a continuación la cápsula en un horno de mufla  regulado a 500 °C ± 25 °C, manteniéndola una hora aproximadamente. Cuando se haya enfriado, humedecer las cenizas con 1 ml de ácido nítrico concentrado (3.2), triturándolas con una pequeña varilla de vidrio, evaporar e incinerar de nuevo como en el caso  anterior. Meter otra vez la cápsula en el horno durante 15 minutos; repetir tres veces, como mínimo, este tratamiento con ácido nítrico concentrado. Solubilizar las cenizas añadiendo en la cápsula 1 ml de ácido nítrico concentrado (3.2) y 2 ml de agua  bidestilada; pasar a un matraz aforado de 10 ml. Lavar la cápsula tres veces con 2 ml de agua bidestilada cada vez y enrasar con agua bidestilada.      32. CADMIO 1. PRINCIPIO  DEL  MÉTODO   El cadmio se dosifica directamente en el vino por espectrofotometria de absorción atómica sin llama.2. MATERIAL   Todo el vidrio debe ser lavado antes de su uso con ácido nítrico concentrado caliente (70 a 80 °C) y enjuagado con agua bidestilada.   2.1. Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con horno de grafito, corrector de ruido de fondo y de un registrador multipotenciométrico.   2.2. Lámpara de cátodo hueco de cadmio.   2.3. Micropipetas de 5 µl provistas de puntas desechables especiales para medidas de absorción atómica.3. REACTIVOS   El agua utilizada debe ser agua bidestilada en un aparato de vidrio borosilicatado o agua de pureza equivalente. Todos los reactivos deben ser de pureza analítica reconocida y, en particular, estar exentos de cadmio.   3.1. Ácido fosfórico del 85 % (r20 = 1,71 g/ml).   3.2. Solución de ácido fosfórico obtenido por dilución de 8 ml de ácido fosfórico a 100 ml con agua.   3.3. Solución 0,02 M de la sal disódica del ácido etilendiaminotetracético (EDTA).   3.4. Solución tampón de pH 9 obtenido disolviendo en un matraz aforado de 100 ml 5,4 g de cloruro amónico en algunos mililitros de agua, se añade 35 ml de solución de hidróxido amónico (r20 = 0,92 g/ml) diluido a 25 % (v/v) y se enrasa con agua.   3.5. Negro de eriocromo T: dilución sólida al 1 % (m/m) en cloruro sódico.   3.6. Sulfato de cadmio (3CdSO4, 8H2O).    La pureza del sulfato de cadmio debe ser comprobada según el siguiente procedimiento:Pesar exactamente 102,6 mg de sulfato de cadmio, arrastrar con agua cuantitativamente a un vaso de precipitado, agitar hasta que se produzca la disolución, añadir 5 ml  de la solución tampón de pH 9, 20 mg, aproximadamente, de negro de eriocromo T. Valorar con la solución de EDTA, hasta que se produzca el virage del indicador al azul.    El volumen de EDTA añadido debe ser igual a 20 ml. Si el volumen difiere poco, corregir adecuadamente la pesada de sulfato de cadmio utilizada para la preparación de la solución de referencia.3.7.Solución de referencia de 1 g por litro de cadmio.    Utilizar una solución estándar del comercio. Esta solución también puede ser obtenida disolviendo 2,2820 g de sulfato de cadmio en agua y enrasando a 1 litro con agua destilada. Conservar esta solución en un matraz de vidrio borosilicatado con tapón  esmerilado.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra   Diluir el vino a 1/2 (v/v) con la solución de ácido fosfórico.  4.2. Preparación de las soluciones de la curva de calibrado.    A partir de la solución de referencia de cadmio, preparar por diluciones sucesivas soluciones de 2,5-5-10-15 microgramos por litro de cadmio.4.3.Determinación  4.3.1. Programa del horno (se propone a título indicativo)   Secado a 100 °C durante 30 segundos.Mineralización a 900 °C durante 20 segundos.Atomización a 2 250 °C de 2 a 3 segundos.Flujo de nitrógeno (gas de transporte): 6 litros por minuto.    Nota:Al final de la operación, subir la temperatura hasta 2 700 °C, para purgar el horno.4.3.2. Medida en absorción atómica.    Seleccionar la longitud de onda a 228,8 nm. Ajustar el cero de la escala de absorbancia con agua bidestilada. Inyectar en el horno, mediante una micropipeta, tres veces 5 µl cada una de las soluciones de la escala de patrones y de la solución de  muestra que se va a analizar. Registrar las absorbancias medidas. Calcular el valor medio de la absorbancia a partir de los resultados relativos de las tres inyecciones.5. EXPRESIÓN  DE  RESULTADOS  5.1. Cálculo   Representar la curva de las absorbancias en función de las concentraciones de cadmio de las soluciones de la escala de patrones. La curva es lineal. Llevar el valor medio de la absorbancia de la muestra a analizar sobre la recta de calibrado,  obteniendo la concentración C de cadmio. La concentración en cadmio expresada en microgramos por litro del vino es igual a:2 C    33. PLATA 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Empleo de la espectrofotometría de absorción atómica, previa mineralización de la muestra.2. MATERIAL  2.1. Cápsula de platino.   2.2. Baño de agua a una temperatura de 100 C.   2.3. Horno regulado de 500 a 525 C.   2.4. Espectrofotómetro de absorción atómica.   2.5. Lámpara de cátodo hueco de plata.   2.6. Gas de alimentación: aire, acetileno.3. REACTIVOS  3.1. Nitrato de plata (AgNO3).   3.2. Ácido nítrico concentrado al 65 % (HNO3), r20 = 1,38 g/ml).   3.3. Ácido nítrico diluido al 1/10 (v/v).3.4. Solución de plata de 1 g/l.    Utilizar una solución estándar de plata comercial. Esta solución puede prepararse disolviendo 1,575 g de nitrato de plata en ácido nítrico diluido y enrasando hasta 1 000 ml con ácido nítrico diluido (3.3).3.5. Solución de plata de 10 mg/l   Se diluyen 10 ml de la solución 3.4 hasta 1 000 ml con ácido nítrico diluido (3.3).4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra   Echar 20 ml de muestra en una cápsula de platino y evaporar a sequedad en un baño de agua en ebullición. Incinerar hasta que se conviertan en cenizas blancas en un horno eléctrico de 500 a 525 C. Recoger las cenizas con 1 ml de ácido nítrico  concentrado (3.2), evaporar en un baño de agua a 100 C, volver a añadir 1 ml de ácido nítrico (3.2) y evaporar. Añadir 5 ml de ácido nítrico diluido (3.3) y calentar ligeramente hasta disolución.4.2. Calibrado   Echar 2, 4, 6, 8, 10 y 20 ml de solución (3.5) de 10 mg por litro de plata en una serie de matraces aforados de 100 ml y enrasar con el ácido nítrico diluido (3.3). Estas soluciones contienen 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1,0 y 2,0 mg/l de plata.4.3.  Determinación   Seleccionar la longitud de onda 328, 1 nm. Ajustar el cero de la escala de absorbancias con el ácido nítrico diluido (3.3). Aspirar directamente el líquido obtenido según 4.1 en el mechero del espectrofotómetro y seguidamente las soluciones patrón.  Anotar las absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración en plata de las soluciones patrón.    Llevar la absorbancia leída para la solución obtenida según 4.1 sobre la curva de calibrado y obtener la concentración Cen mg/l.    El contenido de plata en el vino, expresado en mg/l es: 0,25 °C; este dato se da con 2 decimales.    Nota: Las soluciones de referencia para obtener la curva de calibrado, la cantidad de muestra tomada y el volumen final de líquido, pueden modificarse en función de la sensibilidad del aparato utilizado.     34. CINC 1. FUNDAMENTO   El cinc se determina directamente en el vino desalcoholizado por espectrofotometría de absorción atómica.2. REACTIVOS   El agua utilizada debe ser agua bidestilada en un aparato de vidrio borosilicatado o agua de pureza equivalente.   2.1. Solución patrón de cinc de 1 g por litro.    Utilizar una solución estándar de cinc comercial. Esta solución puede prepararse disolviendo 4,3975 g de sulfato de cinc (Zn SO4, 7H2O) en agua y enrasando el volumen a 1 litro.   2.2. Solución patrón diluida de cinc de 100 miligramos por litro.3. MATERIAL  3.1. Rotavapor con termostato.   3.2. Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con un mechero alimentado con aire y acetileno.   3.3. Lámpara de cátodo hueco de cinc.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra   Eliminar el alcohol del vino mediante concentración al ½ de 100 ml de vino en un rotavapor(temperatura: 50 a 60 C). Completar hasta el volumen inicial de 100 ml con agua bidestilada.4.2. Calibrado   En cuatro matraces aforados de 100 ml, echar 0,5; 1; 1,5 y 2 ml de la solución de cinc de 100 mg/l (2.2) y enrasar a la marca de aforo con agua bidestilada. Las soluciones patrón corresponden respectivamente a 0,5; 1; 1,5 y 2 mg de cinc por litro.4.3.  Determinación   Seleccionar la longitud de onda 213,9 nm. Regular el cero de la escala de absorbancias con agua bidestilada. Aspirar directamente el vino en el mechero del espectrofotómetro, seguidamente hacer lo mismo con las soluciones patrón. Tomar las  absorbancias. Efectuar las determinaciones por duplicado.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Método de cálculo   Trazar la curva de variación de la absorbancia en función de la concentración de cinc de las soluciones patrón. Trasladar el valor medio de las absorbancias obtenidas con el vino y determinar la concentración de cinc en miligramos por litro de vino,  con 1 decimal.     35. PLOMO 1. PRINCIPIO  DEL  MÉTODO   El plomo es medido directamente del vino por espectrofotometría de absorción atómica sin llama.2. MATERIAL   Todo el material de vidrio se lavará con ácido nítrico concentrado caliente (70 a 80 C) y aclarado con agua destilada.   2.1. Espectrofotometría de absorción atómica equipado con horno de grafito, corrector de absorción no específica y registrador multipotenciométrico.   2.2. Lámpara de plomo de cátodo hueco.   2.3. Micropipeta de 5 µl provista de puntas desechables para medidas de absorción atómica.3. REACTIVOS   Todos los reactivos deben ser de pureza analítica reconocida y en particular estar exentos de plomo. El agua utilizada debe ser agua bidestilada en un aparato de vidrio borosilicatado o agua de pureza equivalente.   3.1. Ácido fosfórico 85 % (r20 = 1,71 g/ml).   3.2. Solución de ácido fosfórico obtenida por dilución de 8 ml de ácido enrasados a 100 ml con agua destilada.   3.3. Ácido nítrico (r20 = 1,38 g/ml).   3.4. Solución de plomo a 1 g por litro.    Utilizar una solución estándar comercial. Esta solución puede obtenerse por disolución de 1 600 g de nitrato de plomo II, Pb(NO3)2 en ácido nítrico diluido al 1 % v/v y enrasar a 1 litro. Conservar la solución en matraz de vidrio borosilicatado con  tapón esmerilado.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra   Diluir el vino a ½ o 1/3 con la solución de ácido fosfórico según la concentración esperada de plomo.4.2. Preparación de las soluciones de la escala de patrones.    A partir de la solución de referencia de plomo, preparar por diluciones sucesivas con agua destilada las soluciones patrón que contengan respectivamente 25, 50, 100 y 150 µg de plomo por litro.4.3. Determinación  4.3.1. Programa del horno (propuesto a título indicativo).Secado a 100 C durante 30 segundos.Mineralización a 900 C durante 20 segundos.  Atomización a 2 250 C de 2 a 3 segundos.Flujo del nitrógeno (gas de transporte) 6 litros por minuto.    Nota: Al final de la operación elevar la temperatura a 2 700 C para purgar el horno.4.3.2. Medidas   Seleccionar la longitud de onda a 217 nm. Regular el cero de la escala de absorbancias con agua bidestilada. Inyectar en el horno ya programado, con la ayuda de una micropipeta, tres veces 5 µl de cada una de las soluciones de la escala de patrones y  de la solución de la muestra a analizar. Registrar las medidas de absorbancia. Calcular el valor medio de la absorbancia a partir de los resultados de las tres inyecciones.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS  5.1. Cálculo   Representar la curva de los valores de absorbancia en función de las concentraciones de plomo de las soluciones de la escala de patrones. La variación es lineal. Llevar el valor medio de la absorbancia de la muestra a analizar sobre la recta de  calibrado, sacar la concentración C en plomo de la muestra. La concentración en plomo expresada en microgramos por litro de vino es igual a:C × FF = factor de dilución.     36. FLUORUROS 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   El contenido en fluoruros del vino, con adición de una solución tampón, se determina con ayuda de un electrodo específico con membrana sólida. El potencial medido es proporcional al logaritmo de la actividad de los iones fluoruro en el medio estudiado  según la relación:E = Eo ± S log aFE = potencial del electrodo iónico específico medido con relación al electrodo de referencia en el medio estudiado.Eo = potencial patrón de la célula de medida.S = pendiente del electrodo iónico específico (factor de  Nernst). A 25 C la pendiente teórica es igual a 59,2 mV.aF = actividad de los iones fluoruro en la solución estudiada.2. MATERIAL  2.1. Electrodo con membrana cristalina específica del ion flúor.   2.2. Electrodo de referencia (calomelanos o Ag/AgCl)  2.3. Milivoltímetro (pH-metro con graduación en milivoltios) de precisión 0,1 mV.   2.4. Agitador magnético con placa de aislante para proteger la solución del calor del motor. Imán agitador recubierto de plástico (polietileno o material equivalente).   2.5. Vasos de plástico de 30 o 50 ml y frascos de plástico (polietileno o material equivalente).   2.6. Pipetas de precisión (pipetas graduadas en microlitros u otras equivalentes).3. REACTIVOS  3.1. Solución madre de fluoruro de 1 g/l.    Utilizar una solución comercial estándar de 1 g/l. Esta solución puede prepararse disolviendo 2,210 g de fluoruro sódico (desecado a 105 C durante 3 o 4 horas) en agua destilada. Enrasar con agua destilada a 1 l. La solución se conserva en frasco de  plástico.   3.2. Las soluciones patrón de fluoruro de concentración apropiada se preparan por dilución de la solución madre con agua destilada y conservadas en frascos de plástico. Las soluciones patrón con un contenido en fluoruro del orden de mg/l deben ser  preparadas inmediatamente antes de su empleo.   3.3. Solución tampón pH 5,5.    10 g de ácido ciclohexano-diamino (1,2) tetraacético (CDTA) se disuelven en 50 ml de agua, añadir una solución que contenga 58 g de cloruro sódico y 29,4 g de citrato trisódico en 700 ml de agua destilada. El CDTA se disuelve añadiendo una solución de  hidróxido sódico al 32 % (m/v) (aproximadamente 6 ml).    Añadir 57 ml de ácido acético (densidad r20 = 1,05 g/ml) y ajustar el pH a 5,5 con la solución de hidróxido sódico al 32 % (aproximadamente 45 ml). Dejar enfriar y llevar a 1 l con agua destilada.  4. PROCEDIMIENTO   Observación preliminar:Debe tenerse la precaución de que todas las soluciones conserven durante la medición una temperatura de 25 ± 1 C (una desviación de ± 1 C provoca una modificación de ± 0,2 mV).4.1. Método directo   En un vaso de plástico introducir un volumen de vino y un volumen igual de solución tampón.    Se agita la solución moderadamente. Cuando el aparato de medida esté estable (se obtiene la estabilidad cuando el potencial varíe como máximo de 0,2 a 0,3 mV/3 min), leer el valor del potencial en mV.4.2. Método de adiciones conocidas   Sin interrumpir la agitación, se añade a la muestra a analizar mediante una pipeta de precisión un volumen conocido de solución patrón de fluoruros. Cuando el aparato de medida esté estable, leer el valor del potencial en mV.    Elegir la concentración de la solución patrón de la siguiente forma:a) doblar o triplicar la concentración en fluoruro de la muestra estudiada;b) el volumen del medio estudiado debe permanecer prácticamente constante(aumento de volumen d 1 %).(La  condición b simplifica los cálculos; ver 5.)   La concentración aproximada del medio estudiado se lleva sobre una recta de calibrado trazada en coordenadas semilogarítmicas con las soluciones patrón que contengan 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l de fluoruros.  Observación.Si la concentración aproximada del medio sobrepasa la concentración de las soluciones patrón, diluir la muestra.    Ejemplo:Sea 0,25 mg/l F  la concentración aproximada del medio estudiado (volumen 20 ml); la concentración debe ser aumentada en 0,25 mg/l. Para ello añadir, por ejemplo, a la solución, con la pipeta de precisión adecuada 0,20 ml (= 1 %) de una  solución patrón que contenga 25 mg/l F  o 0,050 ml de una solución patrón de 100 mg/l F .5. CÁLCULOS   El contenido en fluoruros del medio estudiado expresado en miligramos por litro se obtiene mediante la siguiente fórmula:CF = concentración en fluoruro del medio estudiado (mg/l)Ca = concentración de fluoruro añadido en mg/l en el medio estudiado  (Va)Va = volumen en ml de la solución patrón adicionadaVo = volumen inicial del medio estudiado (antes de la adición)DE = diferencia entre los potenciales E1 y E2 obtenidos en 4.1 y 4.2 en mVS = pendiente del electrodo en la solución estudiada.    Si Va es muy próximo a Vo (véase 4.2) la fórmula se simplifica:  El valor obtenido debe multiplicarse por el factor de dilución que proviene de la adición del tampón.     37. DIÓXIDO  DE  CARBONO 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método de referencia  1.1.1. Caso de vinos tranquilos (sobrepresión de CO2 d 0,5 · 105 Pa) (11)   El volumen de vino tomado de la muestra y llevado a una temperatura próxima a los 0 °C se vierte en un exceso suficiente de solución valorada de hidróxido de sodio para lograr un pH de 10 a 11. Se valora con una solución ácida en presencia de anhidrasa  carbónica. El contenido en dióxido de carbono se deduce del volumen empleado para pasar de pH 8,6 (forma carbonato ácido) a 4,0 (ácido carbónico). Una valoración testigo efectuada en las mismas condiciones sobre el vino desprovisto de CO2 permite tener  en cuenta el volumen de solución de hidróxido de sodio consumido por los ácidos del vino.1.1.2. Caso de vinos de aguja y vinos espumosos   Se lleva la muestra de vino que deba analizarse cerca de su punto de congelación. Después de tomar un cierto volumen que servirá de testigo una vez desprovisto de CO2, se alcaliniza el resto de la botella para fijar todo el CO2 en forma de Na2CO3. Se  valora con una solución ácida en presencia de anhidrasa carbónica. El contenido en dióxido de carbono se deduce del volumen de solución ácida empleado para pasar de pH 8,6 (forma carbonato ácido) a pH 4,0 en ácido carbónico. Una valoración testigo  efectuada en las mismas condiciones sobre el vino desprovisto de CO2 permite tener en cuenta el volumen de solución de hidróxido de sodio consumido por los ácidos del vino.1.2. Método usual: en el caso de los vinos de aguja y espumosos   Método manométrico: medida de la sobrepresión de dióxido de carbono directamente en la botella utilizando un afrómetro.2. MÉTODO  DE  REFERENCIA  2.1. Caso de vinos tranquilos (sobrepresión de dióxido de carbono d 0,5 · 105 Pa).2.1.1. Material  2.1.1.1. Agitador magnético.   2.1.1.2. pH-metro.2.1.2. Reactivos  2.1.2.1. Solución de hidróxido de sodio (NaOH), 0,1 M.  2.1.2.2. Solución de ácido sulfúrico (H2SO4), 0,05 M.   2.1.2.3. Solución de 1 g/l de anhidrasa carbónica.2.1.3.Procedimiento   Enfriar la muestra de vino hasta los 0 °C, aproximadamente, así como la pipeta de 10 ml que sirva para la toma de muestra.    Tomar en un vaso de precipitados de 100 ml, 25 ml de solución de hidróxido de sodio (2.1.2.1); añadir 2 gotas de solución acuosa da anhidrasa carbónica (2.1.2.3). Introducir 10 ml de vino con ayuda de la pipeta enfriada a 0 °C.     Poner el vaso de precipitados en el agitador magnético, colocar el electrodo y la varilla magnética y llevar a cabo una agitación moderada.    Cuando el líquido esté a la temperatura ambiente, echar, mediante afusión lenta, la solución de ácido sulfúrico (2.1.2.2) hasta lograr el pH 8,6.    Continuar las afusiones de ácido sulfúrico (2.1.2.2) hasta pH 4,0. Sea n2 ml el volumen utilizado entre el pH 8,6 y 4,0.    Por otro lado, eliminar el CO2 de 50 ml de vino, aproximadamente, agitando bajo vacío durante tres minutos y calentando el matraz en un baño de agua a 25 °C aproximadamente.    Aplicar el procedimiento anterior a 10 ml de vino desprovisto de CO2: sea n2 ml el volumen utilizado.2.1.4. Expresión de los resultados   1 ml de solución valorada de hidróxido de sodio 0,1 M corresponde a 4,4 mg de CO2.    La cantidad de CO2 en gramos por litro de vino se expresa mediante:0,44 (n   n2)con 2 decimales.    Observación: En el caso de vinos con bajo contenido de CO2 (CO2 <  1 g/l), no es necesaria la adición de anhidrasa carbónica para catalizar la hidratación del CO2.2.2. Caso de vinos de aguja y vinos espumosos  2.2.1. Material  2.2.1.1. Agitador magnético.   2.2.1.2. pH-metro.2.2.2. Reactivos  2.2.2.1. Solución de hidróxido de sodio al 50 % (m/m) (NaOH).   2.2.2.2. Solución de ácido sulfúrico (H2SO4), 0,05 M.   2.2.2.3. Solución de 1 g/l de anhidrasa carbónica.2.2.3. Procedimiento   Trazar una marca, al nivel del llenado, sobre la botella de vino que deba analizarse y enfriarla hasta el inicio de la congelación.    Dejar que la botella se caliente ligeramente, agitando hasta que desparezcan los cristales de hielo.    Destapar rápidamente y apartar en una probeta graduada 45 a 50 ml de vino que servirán para la determinación testigo. El volumen exacto de esta toma, v ml, se determinará mediante lectura sobre la probeta, cuando el vino esté a la temperatura ambiente.     Añadir, inmediatamente después de haber efectuado la toma, 20 ml de solución de hidróxido de sodio (2.2.2.1) en la botella para un contenido de 750 ml.    Esperar a que el vino esté de nuevo a temperatura ambiente.     Colocar en un vaso de precipitados de 100 ml, 30 ml de agua destilada hervida y 2 gotas de solución de anhidrasa carbónica (2.2.2.3). Añadir 10 ml de vino alcalinizado.    Poner el vaso en el agitador magnético, colocar el electrodo y la varilla magnética y llevar a cabo una agitación moderada.    Echar, mediante afusión lenta, la solución (2.2.2.2) de ácido sulfúrico hasta lograr el pH 8,6.    Continuar las afusiones de ácido sulfúrico (2.2.2.2) hasta pH 4,0. Sea n ml el volumen utilizado entre pH 8,6 y 4,0.    Por otro lado, eliminar el CO2 de los v ml de vino apartados para la determinación testigo, agitando bajo vacío durante tres minutes y calentando el matraz en un baño de agua a 25 °C aproximadamente. Tomar 10 ml de vino desprovisto de CO2 en 30 ml de  agua destilada hervida, añadir 2 o 3 gotas de solución de hidróxido de sodio (2.2.2.1) para llevar el pH a 10-11. Aplicar después el procedimiento anterior. Sea n2 ml el volumen de ácido sulfúrico 0,05 M empleado.2.2.4. Expresión de los resultados   1 ml de solución de ácido sulfúrico 0,1 M corresponde a 4,4 mg de CO2.    Vaciar la botella del vino alcalinizado y determinar con una aproximación de 1 ml el volumen inicial de vino, llenándola con agua hasta la marca, sea V ml.    La cantidad de CO2 en gramos por litro de vino se expresa mediante:y con 2 decimales.2.3. Cálculo de la sobrepresión   La sobrepresión a 20 °C, Paph20, expresado en pascales, viene dada por la fórmula:Siendo:Q: contenido en gramos de CO2 por litro de vino,A: grado alcohólico del vino a 20 °C,S: contenido en azúcares del vino en gramos por litro,Patm: presión  atmosférica expresada en pascales.3. MÉTODO  USUAL  (VINOS  DE  AGUJA  Y  ESPUMOSOS)  3.1. Material  3.1.1. Afrómetro   Es un aparato que sirve para medir la sobrepresión en las botellas de vinos de aguja y espumosos; tiene distintas presentaciones que dependen del tapón de la botella (cápsula metálica, corona, tapón de corcho o de plástico; véanse figuras 1 y 2).    Están graduados en pascales (abreviatura: Pa) (12). Resulta más práctico utilizar el 105 pascal (105Pa) o el kilopascal (kPa) como unidad.     Pueden ser de distintas clases. La clase de un manómetro es la precisión de la lectura respecto de la escala completa expresada en términos porcentuales (ejemplo «manómetro 1 000 kPa clase 1» significa presión de utilización máxima 1 000 kPa lectura a  ± 10 kPa). La clase 1 se recomienda para lecturas precisas.    Los afrómetros deben verificarse con regularidad (al menos una vez al año).3.2. Procedimiento   La medida debe efectuarse en botellas cuya temperatura esté estabilizada desde, como mímimo, 24 horas antes.Tras haber perforado la cápsula o el tapón, la botella debe agitarse vigorosamente hasta obtener una presión constante para efectuar la lectura.      Figura 1 - Afrómetro para cápsulasFigura 2 - Afrómetro para tapones 3.3. Expresión de los resultados   La sobrepresión a 20 °C (Paph20) se expresa en pascales (Pa) o kilopascales (kPa).    Deberá concordar con la precisión del manómetro (ejemplo: 6,3 105 Pa o 6,3 kPa y no 6,33 105 Pa o 633 kPa para un manómetro 1000 kPa de escala completa y de clase 1).    Cuando la temperatura de medida difiera de 20 °C, resulta conveniente corregir multiplicando la presión medida por el coeficienteindicado en la tabla 1 para volver a la temperatura de 20 °C.4. RELACIÓN  ENTRE  LA  PRESIÓN  Y  LA  CANTIDAD  DE  DIÓXIDO   DE  CARBONO  PRESENTE  EN  UN  VINO  ESPUMOSO (13)   A partir de la sobrepresión a 20 °C (Paph20), se calcula la presión absoluta a 20 °C (Pabs20) de acuerdo con la fórmula:Pabs20 = Patm + Paph20    Patm = presión atmosférica expresada en pascales.    La cantidad de dióxido de carbono contenida en un vino viene dada por las siguientes relaciones:- en litros de CO2 por litro de vino:0,987 · 10 5 Pabs20 (0,86   0,01A) (1   0,00144S)- en gramos de CO2 por litro de vino:1,951 · 10 5 Pabs20 (0,86    0,01A) (1   0,00144S)en las que:A = grado alcohólico del vino a 20 °C.S = contenido en azúcares del vino, expresado en gramos por litro.   TABLA 1Relación entre la sobrepresión Paph20 de vinos de aguja y espumosos a 20 °C a la sobrepresión Papht a una temperatura t     38. CIANO-DERIVADOS 1. FUNDAMENTO  DE  LOS  MÉTODOS  1.1. Método rápido de ensayo: control de los vinos tratados con hexacianoferrato (II) de potasio.    Verificación de la ausencia de precipitado de hexacianoferrato II de hierro III en suspensión en el depósito.    Verificación de la ausencia de formación de hexacianoferrato II de hierro III por adición de una sal de hierro III al vino acidificado.    Verificación de la presencia de hierro que puede precipitarse por adición al vino acidulado de una mezcla de hexacianoferrato II y de hexacianoferrato III alcalinos.1.2. Método usual   Determinación argentimétrica del ácido cianhídrico total liberado por hidrólisis ácida y separado mediante destilación:2. MÉTODO  RÁPIDO  DE  ENSAYO   Control de los vinos tratados con hexacianoferrato II de potasio.2.1. Material   Es preciso disponer de uno de los siguientes aparatos:   2.1.1. Centrifugadora que permita aplicar una fuerza centrífuga de 1 200 a 1 500 g.   2.1.2. Dispositivo de filtración para filtros de membrana (diámetro de los poros 0,45 µm).2.2. Reactivos  2.2.1. Ácido clorhídrico diluido a 1/2 (v/v) obtenido por dilución en volúmenes de ácido clorhídrico (HCl), r20 = 1,18 a 1,19 g/ml) exento de hierro.   2.2.2. Solución de sulfato de hierro III y de amonio Fe2(SO4)3, (NH4)2 SO4, 24H2O, al 15 % (m/v).   2.2.3. Solución de hexacianoferrato II de potasio, K4 [Fe (CN)6], 3H2O, al 10 % (m/v).   2.2.4. Solución de hexacianoferrato III de potasio, K3 [Fe (CN)6], al 10 % (m/v). Preparar inmediatamente antes de su empleo.2.3. Procedimiento  2.3.1. Detección de trazas de hexacianoferrato II de hierro III en suspensión   Tras haber agitado la muestra, introducir 20 ml de vino en un tubo para centrifugar de 30 ml; añadir 1 ml de ácido clorhídrico (2.2.1). Centrifugar durante 15 minutos o filtrar en filtro (diámetro de los poros 0,45 µm). El fondo del tubo para  centrifugar o el filtro deberá estar totalmente exento de partículas azules.2.3.2. Detección de trazas de iones hexacianoferrato II en solución   Añadir 1 gota de una solución de sulfato de hierro III y de amonio (2.2.2) al sobrenadante o al filtrado obtenidos en la prueba 2.3.1. Agitar y dejar reposar al menos 24 horas. Centrifugar 15 minutos o filtrar en filtro (diámetro de los poros 0,45 µm).  El fondo del tubo de centrifuga o el filtro deberá estar totalmente exento de partículas azules de hexacianoferrato II de hierro III.2.3.3. Comprobación de la presencia de iones hierro en el vino   Introducir en un tubo de ensayo 20 ml de vino, 1 ml de ácido clorhídrico (2.2.1), 1 gota de una solución de hexacianoferrato II de potasio (2.2.3) y 1 gota de una solución de hexacianoferrato III de potasio (2.2.4). En menos de 30 minutos deberá  aparecer una coloración o un precipitado de color azul. Tras centrifugación o filtración en filtro (diámetro de los poros 0,45 µm) seguida del lavado del filtro dos veces con 5 ml de agua, deberá observarse un depósito azul en el tubo para centrifugar o  en el filtro.3. MÉTODO  USUAL  3.1. Material  3.1.1. Aparato de destilación constituido por un matraz de fondo redondo de 500 ml unido mediante un tubo esmerilado al extremo superior de un refrigerante en posición vertical con una longitud de 350 mm al menos.    El extremo inferior de este refrigerante llevará una alargadera estrechada en su punta que conduce el destilado hasta el fondo de un matraz de 50 ml que estará totalmente sumergido en agua helada.   3.1.2. Baño de agua con termostato a 100 °C, calentado eléctricamente.3.2. Reactivos  3.2.1. Ácido sulfúrico diluido a 1/5 (v/v).    Mezclar con precaución 200 ml de ácido sulfúrico H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml) con una cantidad de agua suficiente para obtener 1 litro de solución.   3.2.2. Cloruro de cobre II cristalizado, Cu Cl2, 2 H2O.   3.2.3. Solución de rojo de fenol.    Disolver 0,05 g de rojo de fenol en 1,4 ml de una solución 0,1 M de hidróxido de sodio; enrasar a 1 000 ml.   3.2.4. Solución de yoduro de potasio.    Disolver 250 g de yoduro de potasio, KI en una cantidad de agua suficiente para obtener 1 litro de solución.   3.2.5. Solución 0,001 M de nitrato de plata.    Diluir 10 ml de una solución 0,1 M de nitrato de plata, Ag NO3, hasta 1 000 ml tras añadir 0,5 ml de ácido nítrico concentrado (HNO3, r20 = 1,40 g/ml)  3.2.6. Solución de hidróxido de sodio 1 M, que no contenga hierro.3.3. Procedimiento   Introducir 100 ml de vino filtrado (o sin filtrar, si se quiere determinar también el ácido cianhídrico contenido en el posible enturbiamiento azul), añadir aproximadamente 5 mg de cloruro de Cu II (3.2.2) y 10 ml de ácido sulfúrico diluido (3.2.1).  Introducir en el matraz receptor 5 ml de solución de hidróxido de sodio (3.2.6). Destilar hasta que el matraz de 50 ml esté lleno.    Se vierte este destilado en un vaso de precipitados de 400 ml colocado en un baño de agua a 100 °C y para acelerar la evaporación dirigir una fuerte corriente de aire frío a la superficie del líquido alcalino. Hay que reducir el volumen hasta 5 o 7 ml,  lo que require aproximadamente 30 minutos (no reducir nunca el volumen a menos de 5 ml).    En caso necesario, se filtra la solución enfriada recogiendo el filtrado en un tubo de ensayo de 20 mm de diámetro y de 180 mm de longitud o se trasvasa directamente a este tubo. Lavar el vaso de precipitados y, en su caso, el filtro con algunos  mililitros de agua y añadirlos al tubo.    Colocar el tubo de ensayo sobre un fondo negro e iluminarlo lateralmente mediante un haz de luz blanca. El líquido debe estar completamente transparente (14).    Añadir dos gotas de solución de rojo de fenol (3.2.3) para sensibilizar el viraje  (15) y 1 gota de solución de yoduro de potasio (3.2.4). Valorar con la solución 0,001 M de nitrato de plata (3.2.5) hasta que se produzca un ligero enturbiamento, que  sea estable. Sea n el volumen de solución necesario para obtener este resultado.    Preparar, por otra parte, un tubo semejante con 5 ml de solución de hidróxido de sodio (3.2.6), 2 gotas de solución de rojo de fenol (3.2.3)(15), 1 gota de solución de yoduro de potasio (3.2.4) y una cantidad de agua suficiente para obtener un volumen  idéntico al del ensayo anterior. Añadir la solución 0,001 M de nitrato de plata (3.2.5) en cantidad suficiente para obtener el mismo enturbamiento, sea n2 el volumen empleado  (16).3.4. Expresión de los resultados   1 ml de solución 0,001 M de nitrato de plata corresponde a 54 µg de ácido cianhídrico (HCN).    La cantidad de ácido cianhídrico total contenido en 1 l de vino, expresada en miligramos, es: 0,54 (n   n2). Se expresa con 2 decimales.    Sólo deben considerarse como significativos de presencia de compuestos cianhídricos en el vino aquellos ensayos en los que n   n2 sea superior a 0,5 ml.    Cuando n   n2 sea superior a 10 ml, volver a efectuar todas las operaciones utilizando una solución de nitrato de plata 0,01 M.     39. ISOTIOCIANATO  DE  ALILO 1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   El isotiocianato de alilo, presente, en su caso, en el vino es recuperado por destilación y se identifica mediante una técnica de cromatografía en fase gaseosa.2. REACTIVOS  2.1. Etanol absoluto.   2.2. Solución estándar: solución en alcohol absoluto de isotiocianato de alilo con 15 mg/l de principio activo.   2.3. Mezcla refrigerante constituida por etanol y nieve carbónica (temperatura  60 °C)3. MATERIAL  3.1. Aparato de destilación por arrastre mediante corriente de nitrógeno según la figura.   3.2. Envuelta termógena termorregulable.   3.3. Medidor de flujo.   3.4. Cromatógrafo de fase gaseosa con detector fotométrico de llama, provisto de un filtro selectivo para los compuestos azufrados (l = 394 nm), o cualquier otro detector apropiado para esta medida.   3.5. Columna de cromatografía de acero inoxidable, diámetro interno 3 mm, longitud 3 m; rellena de Carbowax 20 M al 10 % sobre chromosorb WHP, 80 a 100 mallas   3.6. Microjeringa de 10 µl.4. PROCEDIMIENTO   Tomar 2 l de vino e introducirlos en el matraz de destilación. Echar algunos ml de etanol (2.1) en los dos tubos de recuperación hasta que se produzca la total inmersión de la parte porosa para la dispersión gaseosa. Enfriar, por la parte exterior, los  dos tubos con la mezcla refrigerante. Comunicar el matraz con los dos tubos receptores y comenzar a enviar dentro del aparato una corriente de nitrógeno de 3 l por hora, aproximadamente. Calentar el vino a 80 °C regulando convenientemente la temperatura  del recinto termógeno y recuperar en total 45 a 50 ml de destilado.    Estabilizar el cromatógrafo; es aconsejable tener las condiciones operatorias siguientes:- temperatura del inyector: 200 °C,- temperatura de la columna: 130 °C,- gas portador helio con un flujo de 20 ml por minuto.    Inyectar con la ayuda de la microjeringa una cantidad de solución estándar tal que el pico correspondiente al isotiocianato de alilo pueda ser fácilmente identificado sobre el cromatograma.    Inyectar, de la misma forma, una parte alícuota de destilado y comprobar la correspondencia entre el tiempo de retención del isotiocianato de alilo y el pico obtenido.    En las condiciones indicadas para el ensayo, ningún compuesto natural del vino produce interferencias correspondientes al tiempo de retención de la substancia investigada.    Aparato de destilación bajo corriente de nitrógeno      40. CARACTERÍSTICAS  CROMÁTICAS 1. VINOS  Y  MOSTOS  1.1. Definiciones   Se consideran características cromáticas de un vino la luminosidad y cromaticidad.    La luminosidad corresponde a la transmitancia y varía en razón inversa a la intensidad colorante del vino.    La cromaticidad corresponde a la longitud de onda dominante (que caracteriza la tonalidad) y a la pureza.    Convencionalmente y por razones de comodidad, las características cromáticas de los vino tintos y rosados podrían ser definidas por la intensidad colorante y la tonalidad, de acuerdo con un procedimiento que se ha adoptado como método usual.1.2.  Fundamento de los métodos  1.2.1. Método de referencia   Método espectrofotométrico que permite el cálculo de los valores triestimulares y de los coeficientes tricromáticos necesarios para especificar el color en los términos de la Comisión Internacional del Alumbrado (CIE).1.2.2 Método usual (aplicable a  vinos tintos y rosados)   Método espectrofotométrico de acuerdo con el cual las características cromáticas se expresan convencionalmente como se indica a continuación:    la intensidad viene dada por la suma de las absorbancias en cubetas de 1 cm de trayecto óptico para las radiaciones de longitudes de onda iguales a 420, 520 y 620 nm,    la tonalidad se expresa por la relación entre la absorbancia a 420 nm y la absorbancia a 520 nm.1.3. Método de referencia  1.3.1. Material  1.3.1.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas entre 300 y 700 nm.   1.3.1.2. Cubetas de vidrio, disponibles por parejas, de un trayecto óptico b, igual a 0,1; 0,2; 0,5; 1,2 y 4 cm.1.3.2. Procedimiento  1.3.2.1. Preparación  de  la  muestra   Si el vino está turbio, debe clarificarse por centrifugación o por filtración a través de una membrana.    En los vinos jóvenes o espumosos debe eliminarse la mayor cantidad posible de dióxido de carbono mediante agitación al vacío.1.3.2.2. Medidas   El trayecto óptico b de las cubetas utilizadas debe elegirse de forma que la absorbancia medida esté comprendida entre 0,3 y 0,7.    A título indicativo, se aconseja utilizar cubetas de 2 cm (o 4 cm) de trayecto óptico para los vinos blancos, 1 cm para vinos rosados y 0,1 cm (o 0,2 cm) para los vinos tintos.    Efectuar las medidas espectrofotométricas utilizando como líquido de referencia agua destilada en una cubeta del mismo trayecto óptico b, para regular el cero de la escala de absorbancias a las longitudes de onda 445, 495, 550 y 625 nm.    Tomar, para el trayecto óptico b, las cuatro absorbancias obtenidas para el vino A445, A495, A550 y A625 (con 3 decimales).1.3.3. Cálculos   Tomar los valores de las absorbancias para b expresados en cm de trayecto óptico y buscar en la tabla I las transmitancias (T %) correspondientes, es decir: T445, T495, T550, T625.    - Calcular los valores triestimulares X, Y y Z, expresados en fracciones decimales:X = 0,42 · T625 + 0,35 · T550 + 0,21 · T445Y = 0,20 · T625 + 0,63 · T550 + 0,17 · T495Z = 0,24 · T495 + 0,94 · T445- Calcular las coordenadas del color x e y:1.3.4.  Expresión de los resultados  1.3.4.1. La luminosidad relativa viene dada por el valor de Y expresado en porcentaje. (En el caso del negro Y % = 0, en el caso del incoloro Y % = 100.)   1.3.4.2. La cromaticidad se expresa por la longitud de onda dominante y la pureza.    Para su determinación hay que recurrir al diagrama de cromaticidad, delimitado por el spectrum locus, que se da en la figura 1. En él se indica el punto 0 que corresponde a la fuente de luz blanca utilizada, representada por el iluminante estándar C de  coordenadas XO = 0,3101 e YO = 0,3163, correspondiente a la luz de un día medianamente claro.    - Longitud de onda dominanteSituar en el diagrama el punto C de coordenadas x e y. Cuando el punto C se sitúe fuera del triángulo AOB, trazar la recta de unión entre el punto O y el punto C y prolongarla; cortará el spectrum locus en un punto S que  corresponde a la longitud de onda dominante.Cuando el punto C se encuentre dentro del triángulo AOB, trazar una recta desde C hasta O; cortará el spectrum locus en un punto que corresponde a la longitud de onda del color complementario del vino. Dicha  longitud de onda se expresa por su valor seguido de la letra C.- PurezaCuando el punto C se encuentra fuera del triángulo AOB, la pureza se expresa en porcentaje mediante la relación:Cuando el punto C está dentro del triángulo AOB, la pureza se expresa  en porcentaje mediante la relación: (17)  Siendo P el punto en que la recta OC corta la línea de los púrpuras.La pureza también puede conocerse directamente a partir de los diagramas de cromaticidad conociendo x e y (figuras 2, 3, 4, 5 y 6).   1.3.4.3. Resultados   La luminosidad, la cromaticidad (expresada por la longitud de onda dominante) y la pureza definen por completo el color de un vino.    Deben indicarse en el boletín de análisis con el valor del trayecto óptico al que se hayan efectuado las medidas.1.4. Método usual  1.4.1. Material  1.4.1.1. Espectrofotómetro que permita medidas entre 300 y 700 nm.   1.4.1.2. Cubetas de vidrio, disponibles en parejas, de trayecto óptico b, igual a 0,1; 0,2; 0,5 y 1 cm.1.4.2. Tratamiento previo de la muestra   Si el vino está turbio, debe clarificarse por centrifugación o por filtración a través de una membrana.    En los vinos jóvenes o espumosos debe eliminarse la mayor cantidad posible de dióxido de carbono mediante agitación al vacío.1.4.3. Procedimiento   El trayecto óptico b de la cubeta de medida debe elegirse de forma que la absorbancia A esté comprendida entre 0,3 y 0,7.    Efectuar las medidas espectrofotométricas utilizando como líquido de referencia agua destilada en una cubeta del mismo trayecto óptico b, para regular el cero de la escala de absorbancias a las longitudes de onda 420, 520 y 620 nm.1.4.4. Expresión de  los resultados  1.4.4.1. Cálculos   Calcular las absorbancias en cubetas de 1 cm de trayecto óptico para las 3 longitudes de onda, dividiendo entre b, expresado en cm, las absorbancias halladas, es decir, A420; A520 y A620.    Convencionalmente, la intensidad viene dada por:l = A420 + A520 + A620Se expresa con 3 decimales.    Convencionalmente, la tonalidad viene dada por:Se expresa con 3 decimales.   TABLA I   Transformación de las absorbancias en transmitancias (T %)   Instrucciones de uso:Leer la primera cifra decimal del valor de la absorbancia en la columna vertical 1 y la segunda cifra decimal en la línea horizontal 2.    Tomar la cifra situada en su intersección. Para obtener la transmitancia, esta cifra deberá dividirse entre 10 si la absorbancia tiene un valor inferior a 1, entre 100 si está comprendida entre 1 y 2 y entre 1 000 si está comprendida entre 2 y 3.    Nota:La cifra situada en el ángulo superior derecho de cada casilla permite tener en cuenta, por interpolación, la tercera cifra decimal del valor de la absorbancia.      Ejemplo:Absorbancia óptica:  0,47 1,47 2,47 3,47T %: 33,9 % 3,4 % 0,3 % 0 %Las transmitancias T % se expresarán con una aproximación de 0,1 %.     Figura 1Diagrama de cromaticidad en el que se representa la localización de todos los colores del espectro     Figura 2Diagrama de cromaticidad para los vinos tintos limpios y los vinos tintos de tela de cebolla      Figura 3Diagrama de cromaticidad para los vinos tintos limpios y los vinos tintos de tela de cebolla      Figura 4Diagrama de cromaticidad para los vinos tintos limpios y los vinos tintos púrpura      Figura 5Diagrama de cromaticidad para los vinos tintos limpios y los vinos tintos púrpura      Figura 6Diagrama de cromaticidad para los vinos tintos tela de cebolla y los vinos tintos púrpura  2. MOSTO  CONCENTRADO  RECTIFICADO  2.1. Fundamento   Medida de la absorbancia, a 425 nm en cubetas de 1 cm de espesor, del mosto concentrado rectificado cuya concentración en azúcares se haya reducido al 25 % (m/m) (25° Brix).2.2. Material  2.2.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas entre 300 y 700 nm.   2.2.2. Cubetas de vidrio con un trayecto óptico de 1 cm.   2.2.3. Filtro con membrana y de una porosidad de 0,45 µm.2.3. Procedimiento  2.3.1. Preparación de la muestra   Utilizar una solución cuyo valor en azúcares sea del 25 % (m/m) (25° Brix) y que se habrá preparado del modo indicado en el capítulo «pH» (4.1.2). Filtrarla en un filtro con membrana de una porosidad de 0,45 µm.2.3.2. Determinación de la absorbancia   Regular la absorbancia cero para la longitud de onda 425 nm en una cubeta de 1 cm de trayecto óptico que contenga agua destilada.    Determinar la absorbancia A a esta longitud de onda de la solución al 25 % de azúcares (25° Brix) obtenida en el apartado 2.3.1 y colocada en una cubeta de 1 cm de trayecto óptico.2.4.Expresión de los resultados   La absorbancia a 425 nm del mosto concentrado rectificado en solución al 25 % (m/m) de azúcares (25° Brix) se expresará con 2 decimales.     41. ÍNDICE  DE  FOLIN-CIOCALTEU 1. DEFINICIÓN   El índice de Folin-Ciocalteu es el resultado de la aplicación del método que se describe a continuación.2. FUNDAMENTO   El conjunto de los compuestos fenólicos del vino se oxida por el reactivo Folin-Ciocalteu. Este último está constituido por una mezcla de ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) y ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40) que se reduce, por la oxidación de los  fenoles, en una mezcla de óxidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23).    La coloración azul producida posee una absorción máxima en torno a 750 nm. Es proporcional al porcentaje de compuestos fenólicos.3. REACTIVOS   Los reactivos deben ser de calidad analítica. El agua utilizada será agua destilada o agua de pureza equivalente.3.1. Reactivo de Folin-Ciocalteu   Este reactivo se encuentra en el comercio listo para su empleo. Puede prepararse de la forma siguiente: disolver en 700 ml de agua destilada 100 g de tungstato de sodio Na2WO4 · 2H2O y 25 g de molibdato de sodio Na2MoO4 · 2H2O; añadir 50 ml de ácido  fosfórico al 85 % (r20 = 1,71 g/ml), 100 ml de ácido clorhídrico concentrado (r20 = 1,19 g/ml). Llevar a ebullición bajo reflujo durante 10 horas, añadir a continuación 150 g de sulfato de litio, algunas gotas de bromo y hervir de nuevo durante 15  minutos. Enfriar y completar hasta 1 litro con agua destilada.   3.2. Carbonato de sodio (Na2CO3) anhidro en solución al 20 % (m/v).4. MATERIAL   Material corriente de laboratorio, y en particular:   4.1. Matraces aforados de 100 ml.   4.2. Espectrofotómetro que permita trabajar a 750 nm.5. PROCEDIMIENTO  5.1. Caso de los vinos tintos   En un matraz aforado de 100 ml (4.1), introducir respetando el orden siguiente: 1 ml de vino diluido al 1/5,50 ml de agua destilada, 5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu (3.1),20 ml de solución de carbonato de sodio (3.2).    Enrasar a 100 ml con agua destilada.    Agitar para homogeneizar. Esperar 30 minutos, para que se estabilice la reacción. Determinar la absorbancia a 750 nm con una cubeta de 1 cm con relación a un testigo preparado con agua destilada en lugar del vino.    Si la absorbancia leída no está próxima a 0,3, hay que modificar la dilución del vino para obtener dicha absorbancia.  5.2. Caso de los vinos blancos   Operar de la misma forma con 1 ml de vino sin diluir.5.3. Caso del mosto concentrado rectificado  5.3.1. Preparación de la muestra   Utilizar una solución cuyo contenido en azúcares sea del 25 % (m/m) (25 ° Brix), preparada del modo indicado en el capítulo «pH» (4.1.2).5.3.2. Medida   Proceder como en el caso de los vinos tintos (5.1) en 5 ml de muestra preparada de acuerdo con el apartado 5.3.1, midiendo la absorbancia en relación con un testigo preparado con 5 ml de solución de azúcar invertido al 25 % (m/m).6. EXPRESIÓN  DE  LOS   RESULTADOS  6.1. Método de cálculo   El resultado se expresa en forma de un índice obtenido al multiplicar la absorbancia por 100 en el caso de los vinos tintos diluidos al 1/5 (o por el factor correspondiente a la dilución empleada) y por 20 en el caso de los vinos blancos. En el caso de  mostos concentrados rectificados, la absorbancia hay que multiplicarla por 16.6.2. Repetibilidad   La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas simultáneamente o inmediatamente una después de otra por el mismo analista no debe ser superior a 1.    La buena repetibilidad de los resultados depende de la utilización de un instrumental (matraces aforados y cubetas del espectrofotómetro) rigurosamente limpio.     42. MÉTODOS  DE  ANÁLISIS  ESPECÍFICOS  PARA  MOSTOS  DE  UVA  CONCENTRADOS  RECTIFICADOS a) CATIONES  TOTALES  1. FUNDAMENTO   Se trata la muestra con un intercambiador de cationes de elevada acidez. Se intercambian los cationes por H+. Se expresan mediante la diferencia la acidez total del efluente y la de la muestra.2. MATERIAL  2.1. Columna de vidrio de aproximadamente 300 mm de longitud y 10 a 11 mm de diámetro interno, provista de un grifo.   2.2. pH metro graduado, como mínimo, en décimas de unidades pH  2.3. Electrodos- electrodo de vidrio, que deberá conservarse en agua destilada,- electrodo de referencia de cloruro mercúrico de cloruro de potasio saturado, que deberá conservarse en una solución saturada de cloruro de potasio,- electrodo combinado,  que deberá conservarse en agua destilada.3. REACTIVOS  3.1. Cambiador de cationes de acidez elevada, de forma H+, preparada previamente a su empleo, manteniéndola en agua, al menos durante una noche para que se hinche.   3.2. Solución 0,1 M de hidróxido de sodio.   3.3. Papel indicador de pH.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra   Utilizar la solución que se haya obtenido diluyendo el mosto concentrado rectificado al 40 % (m/v), tal y como se indica en el capítulo «Acidez total» (5.1.2).4.2. Preparación de la columna intercambiadora de iones   Introducir en la columna 10 ml, aproximadamente, de cambiador de iones en forma H+ previamente hinchado; lavar la columna con agua destilada hasta eliminar la acidez, que se controlará con el papel indicador.4.3. Cambio de iones   Hacer pasar por la columna 100 ml de la solución de mosto concentrado rectificado, preparada del modo indicado en el apartado 4.1, a razón de una gota por segundo. Recoger el efluente en un vaso de precipitados. Lavar la columna con 50 ml de agua  destilada. Valorar la acidez del efluente (incluida el agua de lavado) con la solución 0,1 M de hidróxido de sodio hasta que se alcance un pH de 7 a 20 °C. La adición de licor alcalino deberá efectuarse lentamente, agitando continuamente la solución.    Sea n ml el volumen de solución 0,1 M de hidróxido de sodio empleado.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   Los cationes totales se expresan en miliequivalentes por kilo de azúcares totales con 1 decimal.  5.1. Cálculos   - Acidez del efluente expresada en miliequivalentes por kilo de mosto concentrado rectificado:E = 2,5 · n- Acidez total del mosto concentrado rectificado en miliequivalentes por kilo (véase «Acidez total» 6.1.2): a- Cationes totales en miliequivalentes  por kilo de azúcares totales:P = contenido % (m/m) en azúcares totales.b) CONDUCTIVIDAD  1. FUNDAMENTO   Medida de la conductividad eléctrica de una columna de líquido, delimitada por dos electrodos de platino (que se mantendrán paralelos), que constituye una de las ramas de un puente de Wheatstone.    La conductividad varía con la temperatura y se expresará a 20 °C.2. MATERIAL  2.1. Conductímetro que permita efectuar medidas de conductividad en un sector comprendido entre 1 y 1 000 microsiemens por cm.   2.2. Baño de agua que permita alcanzar una temperatura de aproximadamente 20 °C (20 ± 2 °C).3. REACTIVOS  3.1. Agua desmineralizada de conductividad específica inferior a 2 microsiemens por cm a 20 °C.   3.2. Solución de cloruro de potasio de referencia.    Disolver en agua desmineralizada (3.1) 0,581 g de cloruro de potasio, KCl, previamente secado hasta obtener una masa constante a la temperatura de 105 °C. Completar hasta 1 litro con agua desmineralizada (3.1). Esta solución posee una conductividad de  1 000 microsiemens por cm a 20 °C. Su período de conservación se limita a 3 meses.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Preparación de la muestra para análisis   Utilizar una solución con un contenido de azúcares totales del 25 % (m/m) (25 ° Brix), tal y como se indica en el capítulo «pH» (4.1.2).4.2. Determinación de la conductividad   Poner la muestra para análisis a una temperatura de 20 °C mediante inmersión en un baño de agua. Comprobar la temperatura con una aproximación de 0,1 °C.    Lavar dos veces la célula de medida del conductímetro con la solución que vaya a analizarse.    Medir la conductividad expresada en microsiemens por centímetro.  5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   La conductividad se expresa en microsiemens por centímetro (µ5 cm-1) a 20 °C sin decimales para la solución al 25 % (m/m) (25 °C Brix) de mosto concentrado rectificado.5.1. Cálculos   En caso de que el aparato no cuente con un compensador de temperatura, corregir la conductividad que se haya medido mediante la tabla I. Si la temperatura es inferior a 20 °C, añadir la corrección; si la temperatura es superior a 20 °C, restar la  corrección.   TABLA  I   Correcciones de conductividad para temperaturas distintas de 20 °C en microsiemens cm-1                     ConductividadTemperaturas20.2 19.820.4 19.620.6 19.420.8 19.221.0 19.021.2 18.821.4 18.621.6 18.421.8 18.222.0 (1) 18.0 (2) 0000 0 0 0 0 0 0 0 50001 1 1 1 1 2 2 2100011 2 2 3 3 3 4 4150112 3 3 4 5 5 6 7200123 3 4 5 6 7 8 9250123 4 6 7 8 91011300134 5 7 8 9111213350135 6 8 911121415400235 7 91112141618450236 8101214161820500247  91113151820225502571012141719222460035811131618212426(¹) Restar la corrección (²) Sumar la correcciónc) HIDROXIMETILFURFURAL  1. FUNDAMENTO  1.1. Método colorimétrico   Los aldehídos derivados del furano, de los cuales el principal es el hidroximetilfurfural, reaccionan con el ácido barbitúrico y la paratoluidina, obteniéndose un compuesto rojo que se determina por colorimetría a 550 nm.1.2. Método por cromatografía  líquida de alta resolución   Separación en columna de fase inversa y determinación a 280 nm.2. MÉTODO  COLORIMÉTRICO  2.1. Material  2.1.1. Espectrofotómetro que permita efectuar medidas entre 300 y 700 nm.   2.1.2. Cubeta de vidrio de trayecto óptico igual a 1 cm de espesor.  2.2. Reactivos  2.2.1. Ácido barbitúrico en solución al 0,5 % (m/v).    Disolver 500 mg de ácido barbitúrico, C4O3N2H4, en agua destilada calentándolo ligeramente en un baño de agua a 100 °C; enrasar hasta 100 ml con agua destilada. La solución se conserva aproximadamente una semana.2.2.2. Paratoluidina en solución al 10 %  (m/v).    Introducir 10 g de paratoluidina, C6H4(CH3) NH2, en un matraz aforado de 100 ml; añadir 50 ml de isopropanol, CH3CH(OH)CH3 y 10 ml de ácido acético glacial, CH3COOH (r20 ° = 1,05 g/ml); completar hasta 100 ml con isopropanol. Esta solución debe  prepararse diariamente.2.2.3. Etanal (CH3CHO) en solución acuosa al 1 % (m/v).    Deberá prepararse inmediatamente antes de su empleo.2.2.4. Hidroximetilfurfural, C6O3H6, en solución acuosa de 1 g/l.    Preparar en diluciones sucesivas, soluciones con 5, 10, 20, 30 y 40 mg/l. La solución de 1 g/l y sus diluciones deberán estar preparadas.2.3. Procedimiento  2.3.1. Preparación de la muestra  Utilizar la solución obtenida diluyendo el mosto concentrado rectificado al 40 % (m/v), tal y como se indica en el capítulo «Acidez total» (5.1.2). Efectuar la determinación con 2 ml de esta solución.2.3.2. Determinación colorimétrica   Introducir 2 ml de muestra preparada del modo que se indica en el apartado 2.3.1 en dos erlenmeyer a y b de 25 ml provistos de tapones esmerilados. Verter en cada erlenmeyer 5 ml de solución de paratoluidina (2.2.2); mezclar. Añadir en el erlenmeyer  b(testigo) 1 ml de agua destilada y, en el erlenmeyer a(medida), 1 ml de solución de ácido barbitúrico (2.2.1). Agitar para homogeneizar. Transvasar el contenido de los erlenmeyer en las cubetas de 1 cm de trayecto óptico del espectrofotómetro. Regular  el cero de la escala de absorbancia con el contenido del erlenmeyer b para una longitud de onda 550 nm y determinar la absorbancia del contenido del erlenmeyer a; tomar su valor máximo A, que se alcanzará entre 2 y 5 minutos.    Las muestras cuyo contenido en hidroximetilfurfural sea superior a 30 mg/l deberán diluirse antes del análisis.2.3.3. Curva patrón   Introducir en dos erlenmeyer a y b de 25 ml, 2 ml de cada una de las soluciones de hidroximetilfurfural de 5, 10, 20, 30 y 40 mg/l (2.2.4) y aplicarles el procedimiento descrito en el apartado 2.3.2.    La representación gráfica de las absorbancias en función de los contenidos en miligramos por litro en hidroximetilfurfural de las soluciones patrón deberá ser una recta que pasa por el origen.2.4. Expresión de los resultados   El contenido en hidroximetilfurfural del mosto concentrado rectificado se expresará en miligramos por kilogramo de azúcares totales.  2.4.1. Método de cálculo   El contenido C mg/l en hidroximetilfurfural de la muestra para análisis se obtendrá llevando a la curva patrón la absorbancia A determinada en esta muestra.    El contenido en hidroximetilfurfural expresado en miligramos por kilogramo de azúcares totales es igual a:P = contenido % (m/m) en azúcares totales del mosto concentrado rectificado.   3. MÉTODO  POR  CROMATOGRAFÍA  LÍQUIDA  DE  ALTA  RESOLUCIÓN  3.1. Material  3.1.1. Cromatógrafo de fase líquida de alta resolución equipado con:    - un inyector con loop de 5 o 10 µl,- un detector, espectrofotómetro que permita efectuar medidas a 280 nm,- una columna de sílica dopada con octadecil (por ejemplo: Bondapak C18 Corasil, Waters Ass.),- un registrador y, en su caso, un integrador,-  flujo de la fase móvil: 1,5 ml/min.3.1.2. Equipo de filtración de muestra y disolventes para eliminar partículas superiores a 0,45 µm  3.2. Reactivos  3.2.1. Agua bidestilada.   3.2.2. Metanol, CH3OH destilado o de calidad HPLC.   3.2.3. Ácido acético, CH3COOH (r20 = 1,05 g/ml).   3.2.4. Fase móvil: agua-metanol (3.2.2) ácido acético (3.2.3) previamente filtrado (0,45 µm), (40, 9, 1 v/v).    Esta fase móvil deberá prepararse diariamente y desgasificada antes de su uso.   3.2.5. Solución de referencia de hidroximetilfurfural de 25 mg/l (m/v).    Introducir en un matraz aforado de 100 ml 25 mg exactamente pesados de hidroximetilfurfural C6H3O6, y completar el volumen con metanol (3.2.2). Diluir esta solución al 1/10 con metanol (3.2.2) y filtrarla con una membrana (0,45 µm).    Esta solución se conservará de 2 a 3 meses si se introduce en un frasco de vidrio topacio herméticamente cerrado y se mantiene refrigerada.3.3. Procedimiento  3.3.1. Preparación de la muestra   Utilizar la solución que se haya obtenido diluyendo el mosto concentrado rectificado al 40 % (m/v) del modo indicado en el capítulo «Acidez total» (5.1.2) y filtrarla con una membrana (0,45 µm).  3.3.2.Determinación cromatográfica   Inyectar en el cromatógrafo 5 (o 10) µl de la muestra preparada del modo indicado en el apartado 3.3.1 y 5 (o 10) µl de solución de referencia de hidroximetilfurfural (3.2.5). Registrar el cromatograma.    El período de retención del hidroximetilfurfural se aproxima a 6 o 7 minutos.3.4. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   El contenido en hidroximetilfurfural del mosto concentrado rectificado se expresa en miligramos por kilogramo de azúcares totales.3.4.1. Modo de cálculo   Sea C mg/l el contenido en hidroximetilfurfural de la solución de mosto concentrado rectificado al 40 % (m/v).    El contenido en hidroximetilfurfural en miligramos por kilogramo de azúcares totales viene expresado por:P = contenido % (m/m) en azúcares totales del mosto concentrado rectificado.d) METALES  PESADOS  1. FUNDAMENTOS  I. Método rápido de evaluación de metales pesados.    La presencia de los metales pesados se pone de manifiesto en el mosto concentrado rectificado convenientemente diluido por la coloración que da la formación de sulfuros. Se evalúan comparándolos a una solución patrón de plomo correspondiente al  contenido máximo admisible.II. Determinación del contenido en plomo por espectrofotometría de absorción atómica.    El quelato que se obtiene del plomo con pirrolidinditiocarbamato de amonio se extrae con metilisobutilcetona, cuya absorbancia se mide a 283,3 nm. El contenido en plomo se determina por el método de adición.2. MÉTODO  RÁPIDO  DE  EVALUACIÓN  DE   METALES  PESADOS  2.1. Reactivos  2.1.1. Ácido clorhídrico diluido al 70 % (m/v)   Tomar 70 g de ácido clorhídrico (HCl), (r = 1,16   1,19 g/ml) y completar hasta 100 ml con agua.2.1.2. Ácido clorhídrico diluido al 20 % (m/v)   Tomar 20 g de ácido clorhídrico (HCl) (r = 1,16   1,19 g/ml) y completar hasta 100 ml con agua.2.1.3. Amoníaco diluido   Tomar 14 g de amoníaco, NH3 (r = 0,931   0,934 g/ml) y completar hasta 100 ml con agua.  2.1.4. Solución tampón pH 3,5   Disolver 25 g de acetato de amonio (CH3COONH4) en 25 ml de agua y añadir 30 ml de ácido clorhídrico diluido (2.1.1). Ajustar el pH en caso necesario con ácido clorhídrico diluido (2.1.2) o amoníaco diluido (2.1.3) y completar hasta 100 ml con  agua.2.1.5. Solución de tioacetamida, (C2H5NS), al 4 % (m/v).   2.1.6. Solución de glicerol (C3H8O3) al 85 % (m/v)(nD20 °C = 1,449   1,455).2.1.7. Reactivo de tioacetamida   Añadir a 0,2 ml de solución de tioacetamida (2.1.5) 1 ml de una mezcla de 5 ml de agua, 15 ml de hidróxido de sodio en solución 1 M y 20 ml de glicerol (2.1.6). Calentar en un baño de agua a 100 °C durante 20 segundos. Preparar inmediatamente antes de  su empleo.2.1.8. Solución de plomo de 0,002 g/l   Preparar una solución de 1 g/l de plomo disolviendo en agua 0,400 g de nitrato de plomo, Pb (NO3)2 y completar hasta 250 ml con agua. Diluir con agua esta solución en el momento de su uso al 2  (v/v) para obtener una solución de 0,002 g/l.2.2.  Procedimiento   Disolver una muestra de 10 g de mosto concentrado rectificado en 10 ml de agua. Añadir 2 ml de solución tampón pH 3,5 (2.1.4) y mezclar. Añadir 1,2 ml de reactivo de tioacetamida (2.1.7) y mezclar inmediatamente. Preparar el testigo en las mismas  condiciones utilizando 10 ml de solución de 0,002 g/l de plomo (2.1.8).    Transcurridos 2 minutos, la posible coloración marrón de la solución de mosto concentrado rectificado no deberá ser más intensa que la del testigo.2.3. Cálculos   El ensayo testigo corresponde en las condiciones de funcionamiento a un contenido máximo admisible de metales pesados expresados en plomo de 2 mg/kg de mosto concentrado rectificado.3. DETERMINACIÓN  DEL  CONTENIDO  EN  PLOMO  POR ESPECTROFOTOMETRÍA  DE  ABSORCIÓN  ATÓMICA  3.1. Material  3.1.1. Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con un mechero alimentado por aire y acetileno.   3.1.2. Lámpara de cátodo hueco de plomo.3.2. Reactivos  3.2.1. Ácido acético diluido.    Tomar 12 g de ácido acético glacial (r20 = 1,05 g/ml) y completar hasta 100 ml con agua.   3.2.2. Solución de pirrolidinditiocarbamato de amonio C5H12 N2S2 al 1 % (m/v).   3.2.3. Metilisobutilcetona (CH3)2 CHCH2COCH3.    3.2.4. Solución de plomo de 0,010 g/l de plomo.    Diluir al 1 % (v/v) la solución de plomo de 1 g/l (2.1.8).3.3. Procedimiento  3.3.1. Solución para análisis   Disolver 10 g de mosto concentrado rectificado en una mezcla de volúmenes iguales de ácido acético diluido (3.2.1) y agua y completar hasta 100 ml con esta mezcla.    Añadir 2 ml de solución de pirrolidinditiocarbamato de amonio (3.2.2) y 10 ml de metilisobutilcetona (3.2.3). Agitar al abrigo de la luz viva durante 30 segundos. Dejar que se separen las dos capas. Utilizar la capa de metilisobutilcetona.3.3.2.  Soluciones de referencia   Preparar 3 soluciones de referencia que contengan, además de los 10 g de mosto concentrado rectificado, 1, 2 y 3 ml de la solución de plomo de 0,010 g/l (3.2.4), respectivamente. Seguir el mismo procedimiento que con la solución para análisis.3.3.3.  Testigo   Preparar un testigo siguiendo los mismos pasos que en el apartado 3.3.1 con la solución para análisis, pero sin añadir mosto concentrado rectificado.3.3.4.Determinación   Seleccionar la longitud de onda 283,3 nm.    Pulverizar en la llama la metilisobutilcetona procedente del ensayo testigo y regular la absorbancia a cero.    Operando sobre sus solventes de extracción respectivos, determinar las absorbancias correspondientes a la solución para análisis y a las soluciones de referencia.3.4. Expresión de los resultados   Expresar el contenido en plomo en miligramos por kilogramo de mosto concentrado rectificado con 1 decimal.3.4.1. Cálculos   Trazar una curva que represente la variación de las absorbancias en función de la concentración del plomo añadido a las soluciones de referencia, correspondiendo la concentración cero a la solución para análisis.    Extrapolar la recta que une los puntos hasta que alcance el eje de las concentraciones de la parte negativa. La distancia entre este punto y el origen representa la concentración en plomo de la solución para análisis.e) DETERMINACIÓN  QUÍMICA  DEL   ETANOL   Este método de análisis se utiliza para determinar el grado alcohólico de líquidos con poco contenido de alcohol, como el mosto, el mosto concentrado y el mosto concentrado rectificado.  1. FUNDAMENTO   Destilación simple del líquido. Oxidación del etanol del destilado mediante el dicromato de potasio. Valoración del exceso de dicromato mediante una solución de hierro II.2. MATERIAL  2.1. Utilizar el aparato de destilación que se describe en el apartado 3.2 del capítulo «Grado alcohólico».3. REACTIVOS  3.1. Solución de dicromato de potasio   Disolver 33,600 g de dicromato de potasio (K2Cr2O7) en una cantidad de agua suficiente para obtener 1 litro a 20 °C.    Un mililitro de esta solución oxida 7,8924 mg de alcohol.3.2. Solución de sulfato de hierro II y amonio   Disolver 135 g de sulfato de hierro II y de amonio, Fe (NH4)2 (SO4)2 · 6H2O en una cantidad suficiente de agua, añadir 20 ml de ácido sulfúrico concentrado, H2SO4 (r = 1,84 g/ml) y enrasar a 1 litro. Esta solución se oxida lentamente. Cuando está  recientemente preparada, un volumen de esta solución corresponde a medio volumen de la solución de dicromato potásico.3.3. Solución de permanganato de potasio   Disolver 1,088 g de permanganato de potasio, KMnO4, en una cantidad de agua suficiente para obtener 1 litro.3.4. Ácido sulfúrico diluido al 1/2 (v/v)   Añadir a 500 ml de agua, lentamente y agitando, 500 ml de ácido sulfúrico, H2SO4 (r20 = 1,84 g/ml).3.5. Reactivo de ortofenantrolina ferrosa   Disolver 0,695 g de sulfato ferroso, FeSO4, 7 H2O en 100 ml de agua, añadir 1,485 g de monohidrato de ortofenantrolina C12H8N2, H2O. Calentar para favorecer la solución. Esta disolución es de color rojo intenso y se conserva muy bien.4. PROCEDIMIENTO  4.1. Destilación   Introducir en el matraz de destilación 100 g de mosto concentrado rectificado y 100 ml de agua. Recoger el destilado en un matraz aforado de 100 ml y enrasar con agua.4.2. Oxidación   En un frasco de 300 ml con tapón esmerilado, cuyo cuello termine en una parte ensanchada, la cual permite lavar el cuello sin que se produzcan pérdidas, introducir 20 ml de solución valorada de dicromato de potasio y 20 ml de ácido sulfúrico diluido al  1/2 (v/v) (3.4) y agitar. Añadir 20 ml de destilado. Tapar el frasco, agitar y esperar al menos 30 minutos agitando de vez en cuando (frasco «muestra»).     Valorar la solución de sulfato de hierro II y amonio (3.2) en relación con la solución de dicromato de potasio introduciendo en un frasco idéntico las mismas cantidades de reactivos, pero sustituyendo los 20 ml de destilado por 20 ml de agua destilada  (frasco «testigo»).4.3. Valoración   Añadir 4 gotas de reactivo de ortofenantrolina (3.5) al contenido del frasco «muestra». Valorar el exceso de dicromato introduciendo la solución de sulfato de hierro II (3.2) y amonio. Dejar de añadir solución ferrosa cuando el medio pase de color  azul-verdoso a marrón.    A fin de precisar el viraje, pasar del marrón al azul-verdoso con la solución de permanganato de potasio (3.3). Restar la décima parte del volumen empleado de esta solución del volumen de solución de sulfato de hierro II vertido, sea n esta diferencia.     Seguir el mismo procedimiento con el frasco «testigo». Sea n2 la diferencia.5. EXPRESIÓN  DE  LOS  RESULTADOS   El etanol se expresa en gramos por kilo de azúcares totales con 1 decimal.5.1. Método de cálculo   n2 ml de solución ferrosa reducen 20 ml de solución de dicromato, que oxidan 57,85 mg de etanol puro.    Un mililitro de solución de hierro II tiene el mismo poder reductor que:n2   n ml de solución de hierro II tienen el mismo poder reductor que:Etanol en g/kg de mosto concentrado rectificado:Etanol en g/kg de azúcares totales:siendo P = contenido %  (m/m) en azúcares totales.f) MESO-INOSITOL,  SCYLO-INOSITOL  Y  SACAROSA  1. FUNDAMENTO  DEL  MÉTODO   Cromatografía en fase gaseosa de derivados silanizados 2. REACTIVOS  2.1. Patrón interno: xilitol (solución acuosa aproximadamente de 10 g/l adicionada de una punta de espátula de azida sódica)  2.2. Bistrimetilsililtrifluoroacetamida - BSTFA - (C8H18F3NOSi2)  2.3. Trimetilclorosilano (C3H9 Cl Si)  2.4. Piridina p. a. (C5H5N)  2.5. Meso-inositol (C6H12O6)3. MATERIAL  3.1. Cromatógrafo de gases, equipado con:   3.2. Columna capilar (por ejemplo, sílice fundida, OV 1, espesor de 0,15 µ, longitud 25 m, diámetro interior 0,3 mm)   Condiciones operatorias:- gas portador: hidrógeno y helio,- caudal del gas portador: 2 ml/minuto aproximadamente,- temperatura del inyector y del detector: 300° C,- programación de temperatura: 1 minuto a 160° C, 4° C/minuto hasta 260° C, isoterma a  260° C durante 15 minutos,- relación de split: 1 a 20.   3.3. Integrador  3.4. Microjeringa de 10 µl  3.5. Micropipetas de 50, 100 y 200 µl  3.6. Viales de 2 ml con tapón de teflón  3.7. Estufa4. PROCEDIMIENTO   Poner alrededor de 5 g de MCR (mosto concentrado rectificado), pesado exactamente, en un matraz de 50 ml, añadir 1 ml de solución patrón de xilitol y enrasar con agua. Después de homogeneizar la muestra, tomar 100 µl de solución e introducir en un  vial, secar con una ligera corriente de aire después de haber añadido 100 µl de etanol absoluto para facilitar la evaporación. Disolver cuidadosamente el residuo en 100 µl de piridina (2.4) añadir 100 µl de bistrimetilsililtrifluoroacetamida (2.2) y 10  µl de trimetilclorosilano (2.3), cerrar el vial con el tapón de teflón y colocar en estufa a 60° C durante una hora. Tomar 0,5 µl de líquido claro inyectando con «aguja vacía y caliente» según la relación de split antes mencionada.5. CÁLCULO  DE  LOS   FACTORES  DE  RESPUESTA  5.1. Preparar una solución que contenga:60 g/l de glucosa, 60 g/l de fructosa, 1 g/l de meso-inositol y 1 g/l de sacarosa.Pesar 5 g de esta solución y proceder según el punto 4. A partir del cromatograma obtenido, calcular los factores de respuesta del  meso-inositol y de la sacarosa en relación al xilitol.  Para el scylo-inositol, que no se comercializa y cuyo tiempo de retención está comprendido entre el último pico de las formas anoméricas de la glucosa y del mesro-inositol (véase figura adjunta), utilizar el mismo factor de respuesta que del  meso-inositol.6. EXPRESIÓN  DE  RESULTADOS  6.1. El meso-inositol y el scylo-inositol se expresan en miligramos por kilogramo de azúcares totales. La sacarosa se expresa en gramos por kilogramo de mosto.     Figura: Cromatograma del meso-inositol, del scylo-inositol y de la sacarosa por cromatografía gaseosa.   (1)Puede utilizarse cualquier picnómetro de características equivalentes. (2)En el punto 6 de este capítulo figura un ejemplo numérico. (3)En el punto 6 de este capítulo figura un ejemplo numérico. (4)El contenido en azúcares está expresado en  azúcar invertido. (5)El contenido en azúcares está expresado en azúcar invertido. (6)Ejemplo: para un grado en masa de 12 %: p = 0,12. (7)Antes de hacer este cálculo, la densidad relativa (o la masa volúmica) del vino, medida como se indica  anteriormente, debe ser corregida de la acción de la acidez volátil según la fórmula:  dv = d2020   0,0000086 a ó rv = r20   0,0000086 a siendo a la cantidad de acidez volátil en miliequivalentes por litro. (8)Estos valores se dan a la espera de la constitución de un banco de datos comunitario. (9)Estos valores se dan a la espera de la  constitución de un banco de datos comunitario. (10)Una de las denominaciones comerciales de este producto es «norite». (11)105 pascal (Pa) = 1 bar. (12)1 pascal (Pa) = 1 N/m² = 10 5bares. (13)No se tiene en cuenta la presencia de otros gases (O2, N2,  etc.) en cantidades tan bajas que no tengan influencias sobre la sobrepresión. (14)Algunos vinos, como los vinos de licor, etc., producen un destilado que no es límpido a pesar de la filtración; debe, entonces, colocarse este destilado concentrado en un  matraz de destilación de 200 ml, añadir agua hasta obtener 30 ml y destilarlo cuando aún es alcalino, tirando el primer destilado de volumen igual a 15 ml aproximadamente. Enfriar el contenido del matraz, acidificar con 5 ml, aproximadamente, de ácido  sulfúrico diluido y volver a destilar, recogiendo el destilado sobre 5 ml de líquido. Entonces está límpido. (15)Esta adición es facultativa, algunas personas observan mejor la aparición del enturbiamiento en una solución rosa que en una solución  incolora. (16)n2 es igual a 0,05 o 0,1 ml, si el volumen de agua empleado es inferior a 10 ml. Para obtener un viraje sensible, es necesario que ese volumen sea lo menor posible, evitando en lo posible toda causa de dilución, durante la operación  principal. (17)Esta distancia debe medirse en el sentido OC.