CELEX: 31992L0069
Language: pt
Date: 1992-07-31 00:00:00
Title: Directiva 92/69/CEE da Comissão, de 31 de Julho de 1992, que adapta ao progresso técnico, pela décima sétima vez, a Directiva 67/548/CEE do Conselho relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas

Avis juridique important

|

31992L0069

Directiva 92/69/CEE da Comissão, de 31 de Julho de 1992, que adapta ao progresso técnico, pela décima sétima vez, a Directiva 67/548/CEE do Conselho relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas  

Jornal Oficial nº L 383 de 29/12/1992 p. 0113 - 0115 Edição especial finlandesa: Capítulo 6 Fascículo 6 p. 0003  Edição especial sueca: Capítulo 6 Fascículo 6 p. 0003  L 383A 29/12/1992 P. 0001 - 0235

DIRECTIVA 92/69/CEE DA COMISSÃO  de 31 de Julho de 1992 que adapta ao progresso técnico, pela décima sétima vez, a Directiva 67/548/CEE do Conselho relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosasA COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,Tendo em conta a Directiva 67/548/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 92/32/CEE (2), e, nomeadamente, os seus artigos 28  e 29o,(1) JO n  196 de 16. 8. 1967, p. 1. (2) JO n  L 154 de 5. 6. 1992, p. 1. Considerando que o n  1 do artigo 3  da Directiva 67/548/CEE e o artigo 3  da Directiva 88/379/CEE do Conselho, de 7 de Junho de 1988, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas dos Estados-membros respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem dos preparados perigosos (3), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 90/492/CEE da Comissão (4), prevêem que as propriedades físico-químicas, a toxicidade e a ecotoxicidade das substâncias e preparações devem ser determinadas segundo os métodos especificados no anexo V da Directiva 67/548/CEE;(3) JO n  L 187 de 16. 7. 1988, p. 14. (4) JO n  L 275 de 5. 10. 1990, p. 35. Considerando que o texto do anexo V da Directiva 67/548/CEE se encontra actualmente publicado em duas partes, sendo estas respectivamente o anexo da Directiva 84/449/CEE da Comissão (5) e o anexo da Directiva 88/302/CEE da Comissão (6);(5) JO n  L 251 de 19. 9. 1984, p. 1. (6) JO n  L 133 de 30. 5. 1988, p. 1 e JO n  L 136 de 2. 6. 1988, p. 20. Considerando que, a fim de se ter em conta o desenvolvimento técnico, é necessário rever os métodos de ensaio constantes do anexo da Directiva 84/449/CEE da Comissão;Considerando que, a fim de se ter em conta o desenvolvimento técnico, é igualmente necessário rever o método de ensaio de inibição do crescimento das algas actualmente incluído no anexo da Directiva 88/302/CEE da Comissão e, nesta ocasião, transferi-lo para o anexo da Directiva 84/449/CEE;Considerando que é conveniente reduzir ao mínimo o número de animais utilizados para fins experimentais, em conformidade com a Directiva 86/609/CEE do Conselho, de 24 de Novembro de 1986, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas dos Estados-membros respeitantes à protecção dos animais utilizados para fins experimentais (7);(7) JO n  L 358 de 18. 12. 1986, p. 1. Considerando que as disposições da presente directiva estão em conformidade com o parecer do Comité para a adaptação ao progresso técnico das directivas relativas à eliminação dos entraves técnicos ao comércio de substâncias e preparações perigosas,ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA: Artigo 1  O anexo da Directiva 84/449/CEE é substituído pelo anexo da presente directiva.Artigo 2  O ensaio de inibição do crescimento das algas descrito no anexo da Directiva 88/302/CEE é suprimido.Artigo 3  Os Estados-membros adoptarão, o mais tardar até 30 de Outubro de 1993, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas necessárias para darem cumprimento à presente directiva. Os Estados-membros informarão imediatamente a Comissão desse facto.Quando os Estados-membros adoptarem tais disposições, estas deverão incluir uma referência à presente directiva ou ser acompanhadas dessa referência aquando da sua publicação oficial. As modalidades dessa referência serão adoptadas pelos Estados-membros.Artigo 4  Os Estados-membros são os destinatários da presente directiva.Feito em Bruxelas, em 31 de Julho de 1992. Pela Comissão Karel VAN MIERT Membro da ComissãoANEXO Este anexo será publicado no Jornal Oficial das Comunidades Europeias n  L 383 A.(ver o anúncio no verso da contracapa do presente Jornal Oficial)Anexo da Directiva 92/69/CEE da Comissão, de 31 de Julho de 1992, que adapta ao progresso técnico, pela décima sétima vez, a Directiva 67/548/CEE do Conselho relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (1)  ÍNDICEINTRODUÇÃOPARTE A: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS//5A.1. Temperatura de fusão/congelação//5A.2. Temperatura de ebulição//15A.3. Densidade relativa//21A.4. Pressão de vapor//26A.5. Tensão superficial//47A.6. Solubilidade em água//54A.8. Coeficiente de partição//63A.9. Ponto de inflamação//74A.10. Inflamabilidade (sólidos)//76A.11. Inflamabilidade (gases)//79A.12. Inflamabilidade (contacto com água)//81A.13. Propriedades pirofóricas de sólidos e líquidos//85A.14. Propriedades explosivas//87A.15. Temperatura de auto-ignição (líquidos e gases)//98A.16. Temperatura de auto-ignição relativa para os sólidos//99A.17. Propriedades oxidantes (sólidos)//102PARTE B: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE//107Introdução geral//107B.1. Toxicidade aguda (oral)//110B.1.bis. Toxicidade aguda (oral) método de dose fixa//113B.2. Toxicidade aguda (inalação)//117B.3. Toxicidade aguda (dérmica)//121B.4. Toxicidade aguda (irritação cutânea)//124B.5. Toxicidade aguda (irritação ocular)//127B.6. Sensibilização cutânea//131B.7. Toxicidade (oral) da dose repetida (28 dias)//136B.8. Toxicidade (inalação) da dose repetida (28 dias)//140B.9. Toxicidade (dérmica) da dose repetida (28 dias)//144B.10. Mutagénese (teste citogenético in vitro em células de mamíferos)//148B.11. Mutagénese (teste citogenético in vivo em medula óssea de mamíferos, análise cromossómica)//151B.12. Mutagénese (teste do micronúcleo)//154B.13. Mutagénese (Escherichia coli - teste de reversão)//157B.14. Mutagénese (Salmonella typhimurium - teste de reversão)//160PARTE C: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA ECOTOXICIDADE//163C.1. Toxicidade aguda para os peixes//163C.2. Toxicidade aguda para a Daphnia//172C.3. Teste de inibição para algas//179C.4. Biodegradação: determinação da biodegradabilidade «fácil»//187C.4-A. Ensaio da redução gradual do carbono orgânico dissolvido (COD)//194C.4-B. Teste de despiste da OCDE modificado//197C.4-C. Ensaio da libertação de dióxido de carbono (CO2)//202C.4-D. Ensaio da respirometria manométrica//207C.4-E. Ensaio em frasco fechado//211C.4-F. Ensaio de MCII (Ministério do Comércio Internacional e da Indústria -Japão)//216Anexos//221C.5. Degradação: carência bioquímica de oxigénio//226C.6. Degradação: carência química do oxigénio//227C.7. Degradação: Degradação abiótica: hidrólise em função do pH//229INTRODUÇÃO O presente anexo descreve métodos de ensaio para a determinação de propriedades fisico-químicas, toxicológicas e ecotoxicológicas enumeradas nos anexos VII e VIII da Directiva 79/831/CEE. Esses métodos fundamentam-se nos que são reconhecidos e recomendados pelas instituições internacionais competentes (em particular a OCDE).Nos casos em que esses métodos não se encontram disponíveis adoptaram-se as normas nacionais ou os métodos estabelecidos por consenso científico. De um modo geral, os ensaios deverão ser efectuados com a substância, conforme definido na directiva. Dever-se-á prestar atenção à possível influência de impurezas sobre os resultados de cada ensaio. No caso de os métodos do presente anexo não serem apropriados para a investigação de alguma propriedade, o notificante deverá justificar o método alternativo utilizado.Os ensaios e estudos com animais deverão ser efectuados de acordo com as regulamentações nacionais e deverão levar em consideração os princípios humanos e os progressos internacionais no âmbito do bem-estar animal.Entre métodos de ensaio equivalentes escolher-se-á o método que utiliza o menor número de animais.PARTE A: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS A.1. TEMPERATURA DE FUSÃO/CONGELAÇÃO 1. MÉTODOA maior parte dos métodos descritos baseiam-se na publicação «OECD Test Guideline» (1) (normas de procedimento para testes da OCDE). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas referências (2) e (3).1.1. INTRODUÇÃOOs métodos e dispositivos descritos destinam-se a ser aplicados à determinação da temperatura de fusão de substâncias, sem quaisquer restrições no que diz respeito ao seu grau de pureza.A selecção do método depende da natureza da substância que se pretende testar. Em consequência, o factor limitativo dependerá do facto de a substância poder ser ou não ser facilmente pulverizada, pulverizada com dificuldade, ou não poder ser mesmo pulverizada.Para algumas substâncias considera-se mais apropriado a determinação da temperatura de congelação ou de solidificação, tendo as normas para estas determinações sido englobadas também neste método.No caso de não se poder medir convenientemente nenhum dos parâmetros anteriores devido à existência de propriedades particulares da substância, recomenda-se a determinação de um ponto de fluidez.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESDefine-se a temperatura de fusão como sendo a temperatura para a qual ocorre a transição de fase do estado sólido para o estado líquido à pressão atmosférica, correspondendo essa temperatura ideal, à temperatura de fusão ai de congelação.Uma vez que a transição de fase de diversas substâncias ocorre num intervalo de temperaturas, associa-se-lhe frequentemente um intervalo de fusão.Conversão de unidades (K para  C)t = T   273,15t: temperatura de Celsius, graus Celsius ( C)T: temperatura termodinâmica, Kelvin (K)1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as características de execução do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.Na referência (4) encontram-se enumeradas algumas substâncias de calibração.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIODetermina-se a temperatura (intervalo de temperaturas) da transição de fase do estado sólido para o estado líquido ou do estado líquido para o estado sólido. Na prática, enquanto se aquece/arrefece uma amostra da substância ensaiada à pressão atmosférica, determina-se as temperaturas da fase inicial de fusão/congelação e da fase final de fusão/congelação. Descrevem-se cinco tipos de métodos, designadamente o método capilar, os métodos das fases quentes, as determinações da temperatura de congelação, os métodos de análise térmica e a determinação do ponto de fluidez (desenvolvido para os derivados oleosos do petróleo).Em alguns casos pode ser conveniente medir a temperatura de congelação em vez de se medir a temperatura de fusão.1.4.1. Método capilar1.4.1.1. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com banho líquidoColoca-se uma pequena quantidade da substância finamente triturada num tubo capilar e compacta-se fortemente. Aquece-se o tubo em simultâneo com um termómetro e ajusta-se a subida de temperatura para um valor inferior a 1 K/min durante a fusão efectiva. Determinam-se as temperaturas de fusão inicial e final.1.4.1.2. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com bloco metálicoConforme descrito em 1.4.1.1, com a excepção de o tubo capilar e o termómetro estarem num bloco metálico aquecido e poderem ser observados através de aberturas existentes no bloco.1.4.1.3. Detecção por célula fotoeléctricaA amostra no tubo capilar é aquecida automaticamente num cilindro metálico. Dirige-se um feixe de luz através da substância, passando por uma abertura existente no cilindro, de modo a atingir uma célula fotoeléctrica calibrada com precisão. Quando da fusão, as propriedades ópticas da maior parte das substâncias variam de opacas para transparentes. A intensidade da luz, que atinge a célula fotoeléctrica, aumenta e envia um sinal de paragem para o indicador digital, que procede à leitura da temperatura de um termómetro de resistência de platina localizado na câmara de aquecimento. Este método não é adequado para algumas substâncias fortemente coradas.1.4.2. Fases quentes1.4.2.1. Barra quente de KoflerO método da barra quente de Kofler utiliza duas peças metálicas de condutividade térmica diferente, aquecidas electricamente, sendo a barra concebida de tal modo que o gradiente de temperatura é quase linear segundo o seu comprimento. A temperatura da barra quente pode variar desde 283 até 573 K, existindo um dispositivo especial de leitura da temperatura constituído por um cursor com um ponteiro e uma escala, concebidos especificamente para a barra. No sentido de se determinar uma temperatura de fusão, espalha-se a substância em camada fina directamente sobre a superfície da barra quente. Decorridos alguns segundos surge uma linha acentuada separando as fases fluida e sólida. Lê-se a temperatura na linha divisória ajustando o ponteiro sobre esta linha.1.4.2.2. Microscópio de fusãoExistem diferentes tipos de microscópios de placas quentes, para a determinação das temperaturas de fusão, utilizando-se quantidades muito pequenas de material. Na maior parte dos aparelhos mede-se a temperatura com um termopar sensível mas, por vezes, utilizam-se termómetros de mercúrio. Existe um equipamento típico para a medição da temperatura de fusão pelo método das placas quentes utilizando microscópio, o qual possui uma câmara de aquecimento contendo uma placa metálica, sobre a qual se coloca a amostra numa lâmina. O centro da placa metálica contém um orifício que permite a entrada de luz proveniente do espelho de iluminação do microscópio. Durante a utilização o compartimento é fechado com uma placa de vidro para eliminar o ar da zona da amostra.O aquecimento da amostra é regulado com um reóstato. Para as medições de elevada precisão das substâncias opticamente anisotrópicas, pode utilizar-se luz polarizada.1.4.2.3. Método do meniscoEste método é utilizado especificamente para as poliamidas.A temperatura à qual ocorre o deslocamento de um menisco de óleo de silicone, encerrado entre uma placa quente e um vidro de cobertura da amostra de poliamida testada, é determinada visualmente.1.4.3. Método para determinar a temperatura de congelaçãoColoca-se a amostra num tubo de ensaio especial e leva-se a um aparelho para a determinação da temperatura de congelação. Agita-se a amostra suave e continuamente durante o arrefecimento e mede-se a temperatura em intervalos adequados. Logo que a temperatura permaneça constante durante algumas leituras considera-se que esse valor (corrigido em função do erro do termómetro) é a temperatura de congelação.Deve evitar-se o sobrearrefecimento mantendo-se o equilíbrio entre as fases sólida e líquida.1.4.4. Análise térmica1.4.4.1. Análise térmica diferencial (ATD)Esta técnica regista a diferença de temperaturas existente entre a substância e um material de referência em função da temperatura, enquanto a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afastamento endotérmico (fusão) ou exotérmico (congelação), relativamente à linha de referência do registo de temperatura.1.4.4.2. Calorimetria de exploração diferencial (CED)Esta técnica regista a diferença entre a absorção de energia por uma substância e por um material de referência em função da temperatura, enquanto a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Essa energia é a necessária para estabelecer uma diferença nula de temperatura entre a substância e o material de referência. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afastamento endotérmico (fusão) ou exotérmico (congelação), relativamente à linha de referência do registo de fluxo de calor.1.4.5. Ponto de fluidezEste método foi desenvolvido para ser utilizado com os derivados oleosos do petróleo e é adequado para utilização apenas com substâncias de baixas temperaturas de fusão.Após um aquecimento preliminar procede-se ao arrefecimento da amostra segundo um regime específico e faz-se a observação das suas características de fluidez em intervalos de 3 K. A temperatura mais baixa para a qual se observa movimento da substância, é considerada como ponto de fluidez.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEA aplicabilidade e a precisão dos diversos métodos utilizados para a determinação da temperatura de fusão/intervalo de fusão encontram-se resumidas no quadro seguinte:QUADRO: APLICABILIDADE DOS MÉTODOS>POSIÇÃO NUMA TABELA>>POSIÇÃO NUMA TABELA>>POSIÇÃO NUMA TABELA>>POSIÇÃO NUMA TABELA>1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOSOs procedimentos de quase todos os métodos de ensaio encontram-se descritos em normas internacionais e nacionais (ver apêndice 1).1.6.1. Métodos com tubo capilarQuando submetidas a uma lenta subida de temperatura, as substâncias finamente pulverizadas apresentam normalmente as fases de fusão representadas na figura 1.Figura 1 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Fase A (início da fusão): gotículas finas aderem uniformemente à parede interior do tubo capilar.Fase B aparece um espaço livre entre a amostra e a parede interior devido à contracção da substância fundida.Fase C a amostra contraída inicia a queda sobre o fundo e liquefaz-se.Fase D forma-se um menisco completo à superfície mas uma quantidade apreciável da amostra permanece sólida.Fase E (fase final da fusão): não existem quaisquer partículas sólidas.Durante a determinação da temperatura de fusão procede-se ao registo das temperaturas da fase inicial da fusão e da fase final.1.6.1.1. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão com aparelho de banho líquidoA figura 2 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinação da temperatura de fusão, feito de vidro (JIS K 0064); todas as especificacões são dadas em milímetros.Figura 2 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>A: recipiente de mediçãoB: rolhaC: ventiladorD: termómetroE: termómetro auxiliarF: banho líquidoG: tubo capilar de vidro, de 80 a 100 mm de comprimento, 1,0 ± 0,2 mm de diâmetro interno, 0,2 a 0,3 mm de espessura da paredeH: tubo lateralLíquido do banho: Deve escolher-se um líquido adequado. A escolha do líquido depende da temperatura de fusão que se pretende determinar, por exemplo, escolher-se-á parafina líquida para temperaturas de fusão não superiores a 473 K, óleo de silicone para temperaturas de fusão não superiores a 573 K.Para temperaturas superiores a 523 K pode utilizar-se uma mistura constituída por três partes de ácido sulfúrico e por duas partes de sulfato de potássio (em peso). Deverão ser tomadas precauções adequadas no caso de se utilizar uma mistura deste tipo.Termómetro: Apenas deverão ser utilizados termómetros que satisfaçam as exigências das normas indicadas a seguir ou critérios equivalentes :ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.Procedimento: Pulveriza-se finamente a substância seca utilizando um almofariz e coloca-se no interior do tubo capilar, selado numa das extremidades, de tal modo que a altura do enchimento seja aproximadamente 3 mm após boa compactação. Para se obter uma amostra compacta uniforme o tubo capilar deverá cair verticalmente de uma altura de aproximadamente 700 mm através de um tubo de vidro e sobre um vidro de relógio.Depois de cheio coloca-se o tubo capilar no banho, de tal modo que a parte média da âmpola de mercúrio do termómetro toque no tubo capilar na parte onde se encontra a amostra. Normalmente o tubo capilar é introduzido no aparelho a uma temperatura cerca de 10 K inferior à temperatura de fusão.Aquece-se o líquido do banho de tal modo que o aumento da temperatura seja aproximadamente 3 K/min. O líquido deverá ser agitado. Quando se atingir uma temperatura cerca de 10 K inferior à temperatura de fusão esperada, ajusta-se a subida da temperatura para um valor máximo de 1 K/min.Cálculo: O cálculo da temperatura de fusão efectua-se do modo seguinte:T = TD + 0,00016 (TD   TE) nem que:T = temperatura de fusão corrigida, em KTD = leitura da temperatura no termómetro D, em KTE = leitura da temperatura no termómetro E, em Kn = número de graduações na linha do mercúrio no termómetro D na parte emergente da haste.1.6.1.2. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com bloco metálicoAparelho:Este é constituído por:- um bloco metálico cilíndrico, cuja parte superior é oca e forma um compartimento (ver figura 3),- uma tampa metálica, com duas ou várias aberturas, para permitir a montagem de tubos no bloco metálico,- um sistema de aquecimento para o bloco metálico, que pode ser, por exemplo, uma resistência eléctrica encerrada no bloco,- um reóstato para regular a potência de entrada no caso de se utilizar aquecimento eléctrico,- quatro janelas de vidro resistente ao calor situadas nas paredes laterais do compartimento, dispostas diametralmente segundo ângulos rectos relativamente umas às outras. Em frente de uma destas janelas monta-se um óculo para observação do tubo capilar. As outras três janelas são utilizadas para iluminar o interior do compartimento, por meio de lâmpadas,- um tubo capilar, em vidro resistente ao calor e fechado numa extremidade (ver 1.6.1.1).Termómetro:Ver as normas referidas em 1.6.1.1. Também se podem utilizar dispositivos de medição termoeléctrica, de precisão equivalente.Figura 3 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>1.6.1.3. Detecção por célula fotoeléctricaAparelho e procedimento:O aparelho é constituído por um compartimento metálico com um sistema de aquecimento automático. Procede-se ao enchimento de três tubos capilares conforme descrito em 1.6.1.1, os quais são depois colocados na estufa.Utilizam-se várias variações lineares de temperatura para calibrar o aparelho e ajusta-se electricamente o aumento de temperatura adequado, segundo uma razão linear e constante pré-seleccionada. Os registadores mostram a temperatura efectiva da estufa e a temperatura da substância nos tubos capilares.1.6.2. Fases quentes1.6.2.1. Barra quente de KoflerVer apêndice.1.6.2.2. Microscópio de fusãoVer apêndice.1.6.2.3. Método do menisco (poliamidas)Ver apêndice.O esquema gradual de aquecimento próximo da temperatura de fusão deverá ser inferior a 1 K/min.1.6.3. Métodos para a determinação da temperatura de congelaçãoVer apêndice.1.6.4. Análise térmica1.6.4.1. Análise térmica diferencialVer apêndice.1.6.4.2. Calorimetria de exploração diferencialVer apêndice.1.6.5. Determinação do ponto de fluidezVer apêndice.2. RESULTADOSEm alguns casos é necessário efectuar uma correcção devida ao termómetro.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- método utilizado,- especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e fases de purificação prévias no caso de existirem,- uma estimativa da precisão.Considera-se como temperatura de fusão a média de pelo menos duas medições efectuadas no intervalo de precisão estimado (ver quadros).Se a diferença entre a temperatura na fase inicial e a temperatura na fase final da fusão estiver entre os limites de precisão do método, considera-se como temperatura de fusão o valor observado na fase final da fusão; caso contrário serão indicadas as duas temperaturas.No caso de a substância se decompor ou sublimar antes de atingir a temperatura de fusão, indicar-se-á a temperatura para a qual se observa esse efeito.Todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados deverão ser descritas, especialmente no que diz respeito às impurezas e ao estado físico da substância.4. REFERÊNCIAS(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.ApêndicePara pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as normas seguintes.1. Métodos capilares1.1. Dispositivos de medição da temperatura de fusão com banho líquidoASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicalsBS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting rangeDIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapillarverfahren.JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products1.2. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão com bloco metálicoDIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen KunststoffenISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of «melting point»2. Fases quentes2.1. Barra quente de KoflerANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric power coatings2.2. Microscópio de fusãoDIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen.2.3. Método do menisco (poliamidas)ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of «melting point»ANSI/ASTM Standard specification for acetal resin injection D 2133-66 moulding and extrusion materialsNF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination du «point de fusion» Méthode du ménisque3. Métodos para a deteminação da temperatura de congelaçãoBS 4633 Method for the determination of crystallizing pointBS 4695 Method for Determination of Melting Point of Petroleum Wax (cooling curve)DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und MotorenbenzolenISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la température de figeageDIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von FettsaurenNF T 60-114 Point de fusion des paraffinesNF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)ISO 1392 Method for the determination of the freezing point4. Análise térmica4.1. Análise térmica diferencialASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe4.2. Calorimetria de exploração diferencialASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe5. Determinação do ponto de fluidezNBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du pétrole: point de trouble et point d'écoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipuntASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oilsISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour point.A.2. TEMPERATURA DE EBULIÇÃO 1. MÉTODOA maior parte dos métodos descritos baseia-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas referências (2) e (3).1.1. INTRODUÇÃOOs métodos e dispositivos aqui descritos podem ser aplicados a líquidos e a substâncias de baixo ponto de fusão, desde que não sofram uma reacção química para os valores da temperatura de ebulição (por exemplo: auto-oxidação, rearranjo, degradação, etc.). Os métodos podem ser aplicados a substâncias líquidas puras e impuras.Dá-se maior importância aos métodos que utilizam a detecção por célula fotoeléctrica e aos métodos de análise térmica uma vez que esses métodos permitem a determinação das temperaturas de fusão e também das temperaturas de ebulição. Além disso, as medições podem ser efectuadas automaticamente.O «método dinâmico» possui a vantagem de também poder ser aplicado à determinação da pressão de vapor e de não ser necessário corrigir o valor da temperatura de ebulição para a pressão normal (101,325 kPa) uma vez que a pressão normal pode ser ajustada durante a medição utilizando um manómetro.ObservaçõesA influência das impurezas na determinação da temperatura de ebulição depende bastante da natureza dessas impurezas. No caso de existirem na amostra impurezas voláteis que possam afectar os resultados, a substância deve ser purificada.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESDefine-se a temperatura de ebulição normal como sendo a temperatura para a qual a pressão de vapor de um líquido é de 101,325 kPa.No caso de a temperatura de ebulição não ser medida à pressão atmosférica normal, a dependência da pressão do vapor em função da temperatura pode ser descrita pela equação de Clausius-Clapeyron:log p = 2,3 RTD Hv + const.em que:p = pressão de vapor da substância em PascalÄ Hv = calor de vaporização em J mol 1R = constante universal dos gases perfeitos = 8,314 J mol 1 K 1T = temperatura termodinâmica em KA temperatura de ebulição é especificada tendo em consideração a pressão ambiente durante a medição.ConversõesPressão (unidades: kPa)100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa(«bar» ainda é uma unidade permitida mas não recomendada);133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr(as unidades «mm Hg» e «Torr» não são permitidas).1 atm = atmosfera padrão = 101,325 Pa(a unidade «atm» não é permitida).Temperatura (unidades: K)t = T   273,15t: temperatura de Celsius, graus Celsius ( C)T: temperatura termodinâmica, Kelvin (K)1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão é necessário utilizar as substâncias de referência em todos os casos quando se investiga uma nova substância. Elas deverão servir essencialmente para aferir, periodicamente, o método e para permitir a comparação com resultados obtidos com outros métodos.Nos métodos enumerados no apêndice é possível encontrar algumas substâncias utilizadas para calibração.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOExistem cinco métodos para a determinação da temperatura de ebulição (intervalo de ebulição) que se baseiam na medição da temperatura de ebulição, e existem dois métodos que se baseiam na análise térmica.1.4.1. Determinação utilizando o ebuliómetroOs ebuliómetros foram originariamente desenvolvidos para a determinação do peso molecular por elevação da temperatura de ebulição, mas também são adequados para as medições exactas da temperatura de ebulição. Existe um aparelho muito simples que se encontra descrito na norma ASTM D 1120-72 (ver apêndice). O líquido é aquecido nesse aparelho, sob condições de equilíbrio à pressão atmosférica, até entrar em ebulição.1.4.2. Método dinâmicoEste método implica a medição da temperatura de recondensação do vapor por meio de um termómetro apropriado no refluxo, mantendo-se a ebulição. Neste método é possível variar a pressão.1.4.3. Método da destilação para a determinação da temperatura de ebuliçãoEste método compreende a destilação do líquido, a medição da temperatura de recondensação do vapor e a determinação da quantidade do destilado.1.4.4. Método de SiwoloboffAquece-se uma amostra num tubo de ensaio o qual é emergido num líquido num banho aquecido. Mergulha-se no tubo de ensaio um tubo capilar fechado, contendo uma bolha de ar na parte inferior.1.4.5. Detecção por célula fotoeléctricaUtilizando o princípio de Siwoloboff efectuam-se medições automáticas por célula fotoeléctrica das bolhas ascendentes.1.4.6. Análise térmica diferencialEsta técnica regista a diferença existente entre as temperaturas da substância e do material de referência, em função da temperatura, quando a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afastamento endotérmico (ebulição) em relação à linha de referência do registo de temperaturas.1.4.7. Calorimetria de exploração diferencialEsta técnica regista a diferença de absorção de energia existente entre uma substância e um material de referência, em função da temperatura, quando a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Essa energia representa a energia necessária para estabelecer uma diferença nula de temperatura entre a substância e o material de referência. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma alteração da entalpia, essa alteração é indicada por um afastamento endotérmico (ebulição), em relação à linha de referência do registo do fluxo do calor.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEA aplicabilidade e a precisão dos diferentes métodos utilizados para a determinação da temperatura de ebulição/intervalo de ebulição encontram-se resumidas no quadro 1.>POSIÇÃO NUMA TABELA>1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOSOs procedimentos de alguns destes métodos encontram-se descritos em normas internacionais e nacionais (ver apêndice).1.6.1. EbuliómetroVer apêndice.1.6.2. Método dinâmicoVer o método de ensaio A.4 para a determinação da pressão de vapor.Regista-se a temperatura de ebulição observada para um valor da pressão aplicada de 101,325 kPa.1.6.3. Processo da destilação (intervalo de ebulição)Ver apêndice.1.6.4. Método de SiwoloboffAquece-se a amostra num aparelho para a determinação da temperatura de fusão num tubo de ensaio com um diâmetro de aproximadamente 5 mm (figura 1).A figura 1 representa um tipo de aparelho normalizado para a determinação das temperaturas de fusão e de ebulição (JIS K 0064) (o material é vidro e todas as especificações são em milímetros).Figura 1 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>A: Recipiente de medidaB: RolhaC: RespiradouroD: TermómetroE: Termómetro auxiliarF: Líquido do banhoG: Tubo de ensaio, diâmetro exterior com o máximo de 5 mm; contendo um tubo capilar com o comprimento aproximado de 100 mm, diâmetro interior de aproximadamente 1 mm e espessura da parede compreendida aproximadamente entre 0,2 e 0,3 mmH: Tubo lateralColoca-se no tubo de ensaio um tubo capilar (capilar para a determinação do ponto de ebulição) o qual se encontra fechado a cerca de 1 cm acima da sua extremidade inferior. Adiciona-se a substância que se pretende testar de modo que a parte fechada do capilar fique abaixo da superfície do líquido. O tubo de ensaio que contém o capilar para a determinação do ponto de ebulição, prende-se ao termómetro com uma fita de borracha ou fixa-se lateralmente com um suporte (ver figura 2).Figura 2 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Princípio de SiwoloboffFigura 3 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Princípio modificadoEscolhe-se o líquido do banho de acordo com a temperatura de ebulição. Para temperaturas até 573 K é possível utilizar óleo de silicone. A parafina líquida apenas pode ser utilizada até 473 K. O aquecimento do líquido do banho deve ser ajustado de modo que a subida de temperatura seja de 3 K/minuto inicialmente. O líquido do banho deve ser agitado. Quando a temperatura atinge cerca de 10 K abaixo da temperatura de ebulição esperada, reduz-se o aquecimento de tal modo que o aumento de temperatura não ultrapasse 1 K/minuto. Ao aproximar-se a temperatura de ebulição, observa-se a formação de bolhas que emergem rapidamente do capilar utilizado para a determinação do ponto de ebulição.A temperatura de ebulição é a temperatura para a qual, face a um arrefecimento momentâneo, cessa a corrente de bolhas e o fluido inicia repentinamente a subida no capilar. A leitura correspondente efectuada no termómetro é a temperatura de ebulição da substância.De acordo com o princípio modificado (figura 3) determina-se a temperatura de ebulição num capilar para a determinação da temperatura de fusão. O capilar é distendido até se obter uma ponta fina com cerca de 2 cm de comprimento (a) e aspira-se uma pequena quantidade da amostra. Fecha-se por fusão a extremidade aberta do capilar de tal modo que na extremidade fique uma pequena bolha de ar. Enquanto se aquece o aparelho para a determinação da temperatura de fusão, a bolha de ar expande-se (b). A temperatura de ebulição corresponde à temperatura para a qual o tampão dessa substância atinge o nível da superfície do líquido do banho (c).1.6.5. Detecção por célula fotoeléctricaA amostra é aquecida num tubo capilar no interior de um bloco metálico aquecido.Pelos orifícios existentes no bloco, é enviado um feixe de luz, através da substância para uma célula fotoeléctrica calibrada com precisão.Durante o aumento da temperatura da amostra, emergem bolhas de ar simples provenientes do capilar de ebulição. Ao atingir-se a temperatura de ebulição o número de bolhas aumenta fortemente. Isto provoca uma alteração na intensidade da luz registada pela célula fotoeléctrica, que envia um sinal de paragem transmitido para o indicador que efectua a leitura da temperatura num termometro de resistência de platina localizado no bloco.Este método é especialmente útil, uma vez que permite determinações de valores inferiores à temperatura ambiente e até 253,15 K ( 20  C) sem qualquer modificação no aparelho. Apenas é necessário colocar o instrumento num banho de arrefecimento.1.6.6. Análise térmica1.6.6.1. Análise térmica diferencialVer Apêndice.1.6.6.2. Calorimetria de exploração diferencialVer apêndice.2. RESULTADOSPara pequenos desvios em relação à pressão normal (máximo ± 5 kPa) as temperaturas de ebulição são corrigidas para o valor Tn,pela equação de conversão de Sidney Young:Tn = T + (fT × D p)em que:Ä p = (101,325   p) [atenção ao sinal]p = pressão medida em kPafT = taxa de variação da temperatura de ebulição com a pressão em K/kPa.T = temperatura de ebulição medida em KTn = temperatura de ebulição corrigida para a pressão normal, em KOs factores para a correcção da temperatura, o valor fT e as equações para a sua aproximação estão descritos nas normas internacionais e nacionais anteriormente referidas para diversas substâncias.Por exemplo, o método DIN 53171 refere as seguintes correcções aproximadas para solventes incorporados em tintas:>POSIÇÃO NUMA TABELA>3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- método utilizado,- especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e fases prévias de purificação, se for caso disso,- uma estimativa da precisão.Estabelece-se que a temperatura de ebulição é a média de pelo menos duas medições situadas no intervalo de precisão estimada (ver quadro 1).As temperaturas de ebulição medidas e os seus valores médios deverão ser especificados e os valores da pressão para os quais se efectuaram as medições deverão ser apresentados em kPa. Preferencialmente a pressão deverá ser próxima da pressão atmosférica normal.Todas as informações e notas relevantes para a interpretação de resultados deverão ser apresentadas, especialmente no que diz respeito às impurezas e estado físico da substância.4. REFERÊNCIAS(1)  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C(81) 30 final.(2)  IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II.(3)  R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.ApêndicePara pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as normas seguintes:1. EbuliómetroASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes2. Processo de destilação (intervalo de ebulição)ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum productsBS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristicsDIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestimmung des SiedeverlaufesNF T 20-608 Distillation: détermination du rendement et de l'intervalle de distillation3. Análise térmica diferencial e calorimetria de exploração diferencialASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysisASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysisASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical dataDIN 51005 Thermische Analyse: BegriffeA.3. DENSIDADE RELATIVA 1. MÉTODOOs métodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se na referência (2).1.1. INTRODUÇÃOOs métodos descritos para a determinação da densidade relativa são aplicáveis a substâncias sólidas e a substâncias líquidas, sem qualquer restrição no que diz respeito ao seu grau de pureza. Os diversos métodos utilizáveis encontram-se resumidos no quadro 1.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESA densidade relativa D420 de um sólido ou de um líquido é a razão entre a massa de um determinado volume da substância que se pretende testar, à temperatura de 20  C, e a massa de igual volume de água, à temperatura de 4  C. A densidade relativa não tem dimensões.A densidade, ñ, de uma substância é o quociente entre a massa, m, e o seu volume, v.A densidade, ñ, é dada, em unidades do SI, em kg/m3.1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA (1) (3)Não é necessário utilizar substâncias de referência em todos os casos quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.1.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOSRecorre-se à utilização de quatro classes de métodos.1.4.1. Métodos de flutuação1.4.1.1. Hidrómetro (para substâncias líquidas)É possível efectuar determinações rápidas e suficientemente exactas de densidade utilizando hidrómetros de flutuação, os quais permitem obter a densidade de um líquido a partir da profundidade de imersão por simples leitura de uma escala graduada.1.4.1.2. Balança hidrostática (para substâncias líquidas e sólidas)Pode recorrer-se à diferença entre o peso de uma amostra testada medido ao ar e num líquido adequado (por exemplo água) para se determinar a sua densidade.No caso dos sólidos, a densidade medida é apenas representativa da amostra particular utilizada. Para a determinação da densidade de líquidos pesa-se primeiro ao ar um corpo de volume conhecido, v, e depois pesa-se mergulhado no líquido.1.4.1.3. Método do corpo imerso (para substâncias líquidas) (4)De acordo com este método determina-se a densidade de um líquido a partir da diferença entre os resultados da pesagem do líquido, antes e após a imersão nesse líquido, de um corpo de volume conhecido.1.4.2. Métodos do picnómetroTanto para os sólidos como para os líquidos é possível utilizar picnómetros de configurações diversas e com volumes conhecidos. Calcula-se a densidade a partir da diferença em peso entre o picnómetro cheio e vazio e pelo conhecimento do seu volume.1.4.3. Picnómetro por comparação ao ar (para sólidos)Pode medir-se a densidade de um sólido de qualquer configuração, à temperatura ambiente, utilizando o picnómetro de comparação de gases. Mede-se o volume de uma substância ao ar ou num gás inerte, usando um cilindro de volume calibrado variável. Para se calcular a densidade efectua-se uma medição de massa depois da medição de volume.1.4.4. Densímetro oscilante (5) (6) (7)É possível medir a densidade de um líquido utilizando um densímetro oscilante. Utiliza-se um oscilador mecânico com a forma de um tubo em U o qual se faz vibrar à frequência de ressonância do oscilador, a qual depende da sua massa. A introdução de uma amostra altera a frequência de ressonância do oscilador. O aparelho tem que ser calibrado utilizando duas substâncias líquidas de densidades conhecidas. Essas substâncias deverão ser preferencialmente escolhidas de tal modo que as suas densidades relativas cubram o intervalo que se pretende medir.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEA aplicabilidade dos diversos métodos utilizados para a determinação da densidade relativa encontra-se resumida no quadro.1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOSAs normas apresentadas como exemplos, que devem ser consultadas para obtenção de pormenores técnicos adicionais, estão mencionadas no apêndice.Os testes devem ser efectuados à temperatura de 20  C e deverão ser realizadas pelo menos duas medições.2. RESULTADOSVer normas.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- método utilizado,- especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e fases prévias de purificação, se as houver.A densidade relativa D420 deverá constar do relatório conforme definido em 1.2, em conjunto com o estado físico da substância ensaiada.No relatório devem constar todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado físico da substância.>POSIÇÃO NUMA TABELA>4. REFERÊNCIAS(1)  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.(2)  R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part 1.(3)  IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.(4)  Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.11, 427-430.(5)  Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 1970, vol. 19, 297-302.(6)  Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeugnissen - Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 1975, vol. 37, 717-726.(7)  Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253-255.ApêndicePara obtenção de pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as normas seguintes:1. MÉTODOS DE FLUTUAÇÃO1.1. HIDRÓMETRODIN 12790, ISO 387 Hidrómetro; instruções geraisDIN 12791 Parte I: Hidrómetros de densidade; sua construção, ajustamento e utilização Parte II: Hidrómetros de densidade; dimensões normalizadas, designação Parte III: Utilização e testeISO 649-2 Objectos de vidro laboratoriais: hidrómetros de densidade para fins geraisNF T 20-050 Produtos químicos para utilização industrial - Determinação da densidade de líquidos - Método areométricoDIN 12793 Objectos de vidro laboratoriais: hidrómetros de resolução variável1.2. BALANÇA HIDROSTÁTICAPara as substâncias sólidasISO 1183 Método A: Métodos para a determinação da densidade e para a determinação da densidade relativa de plásticos excluindo os plásticos celulares.NF T 20-049 Produtos químicos para utilização industrial - Determinação da densidade de sólidos que não sejam pós e de produtos celulares - Método da balança hidrostáticaASTM-D-792 Determinação do peso específico e da densidade de plásticos por deslocamentoDIN 53479 Testes de plásticos e de elastómeros; determinação da densidadePara substâncias líquidasISO 901 ISO 758DIN 51757 Testes de óleos minerais e de materiais afins; determinação da densidadeASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 e ASTM D 1481-62ASTM D 1298 Densidade, peso específico ou densidade relativa IPA (indicador de posição atmosférico) do petróleo bruto e de produtos derivados de petróleo líquido pelo método do hidrómetroBS 4714 Densidade, peso específico ou densidade IPA (indicador de posição atmosférico) do petróleo bruto e de produtos derivados de petróleo líquido pelo método do hidrómetro.1.3. MÉTODO DO CORPO IMERSODIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de materiais de revestimentos análogos; determinação da densidade; método do corpo imerso2. MÉTODOS PICNOMÉTRICOS2.1. PARA SUBSTÂNCIAS LÍQUIDASISO 3507 PicnómetrosISO 758 Produtos químicos líquidos; determinação da densidade à temperatura de 20  CDIN 12797 Picnómetro de Gay-Lussac (para líquidos não voláteis que não sejam muito viscosos)DIN 12798 Picnómetro de Lipkin (para líquidos com uma viscosidade cinemática inferior a 100,10 6 m2 s 1 à temperatura de 15  C)DIN 12800 Picnómetro de Sprengel (para líquidos conforme a norma DIN 12798)DIN 12801 Picnómetro de Reischauer (para líquidos com uma viscosidade cinemática inferior a 100,10 6 m2 s 1 à temperatura de 20  C, aplicável em particular também aos hidrocarbonetos e às soluções aquosas e bem assim aos líquidos com uma pressão de vapor superior, aproximadamente 1 bar à temperatura de 90  C)DIN 12806 Picnómetro de Hubbard (para líquidos viscosos de todos os tipos e que não possuam uma pressão de vapor demasiadamente elevada, aplicável particularmente também para tintas, vernizes e betumes)DIN 12807 Picnómetro de Bingham (para líquidos, conforme a norma DIN 12801)DIN 12808 Picnómetro de Jaulmes (em particular para a mistura de etanol e água)DIN 12809 Picnómetro com termómetro incorporado e tubo lateral capilar (para líquidos que não sejam muito viscosos)DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de produtos análogos; determinação da densidade com picnómetroDIN 51757 Ponto 7: Testes de óleos minerais e de materiais afins; determinação da densidadeASTM D 297 Secção 15: Produtos de borracha - análise químicaASTM D 2111 Método C: Compostos orgânicos halogenadosBS 4699 Método para a determinação do peso específico e da densidade de produtos derivados do petróleo (método do picnómetro bicapilar graduado)BS 5903 Método para a determinação da densidade relativa e da densidade de produtos derivados do petróleo recorrendo ao método do picnómetro de capilar fechadoNF T 20-053 Produtos químicos para utilização industrial - Determinação da densidade de sólidos convertidos em pó e de líquidos - Método picnométrico2.2. PARA SUBSTÂNCIAS SÓLIDASISO 1183 Método B: Método para a determinação da densidade e da densidade relativa dos plásticos com exclusão dos plásticos celularesNF T 20-053 Produtos químicos para utilização industrial - Determinação da densidade de sólidos convertidos em pó e de líquidos - Método picnométricoDIN 19683 Determinação da densidade de solos3. PICNÓMETRO POR COMPARAÇÃO AO ARDIN 55990 Parte III: Prüfung von Anstrichstoffen und ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulverlack; Bestimmung der DichteDIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; PrüfungPORgehas. 26-36, arseA.4. PRESSÃO DE VAPOR 1. MÉTODOA maior parte dos métodos descritos baseiam-se na publicação da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas referências (2) e (3).1.1. INTRODUÇÃOConsidera-se útil possuir informações preliminares sobre a estrutura, a temperatura de fusão e a temperatura de ebulição da substância para se efectuar este teste.Não existe nenhum procedimento de medição único aplicável a todo o intervalo de pressões de vapor. Em consequência, recomendam-se diversos métodos utilizáveis para a medição da pressão de vapor para valores compreendidos entre POSIÇÃO NUMA TABELA>1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS1.6.1. Medição dinâmica1.6.1.1. EquipamentoO equipamento típico de medida é constituído por um recipiente de ebulição ao qual está associado um sistema de arrefecimento de vidro ou de metal (figura 1), instrumentos para a medição da temperatura e instrumentos para regular e medir a pressão. Na figura representa-se um equipamento típico de medição de vidro, resistente ao calor e composto por cinco partes:O tubo grande com parede parcialmente dupla, uma junta normalizada, um sistema de arrefecimento, um recipiente de arrefecimento e uma entrada.O cilindro de vidro com uma bomba Cottrell, o qual é montado na secção de ebulição do tubo e possui uma superfície rugosa de vidro fragmentado para evitar ressaltos durante o processo de ebulição.A temperatura é medida com um sensor de temperatura adequado (por exemplo, um termómetro de resistência, ou um termopar) imerso no interior do equipamento até ao ponto de medida (N  5 da figura 1) através de uma entrada adequada (por exemplo, junta normalizada macho.)Efectuam-se as necessárias ligações ao equipamento de regulação e de medição da pressão.A ampola, que funciona como um separador volumétrico, é ligada ao equipamento de medida por meio de um tubo capilar.Aquece-se o recipiente de ebulição utilizando um elemento de aquecimento (por exemplo, um calorífero de cartucho) inserido no equipamento de vidro pela parte inferior. Liga-se a corrente de aquecimento necessária e regula-se através de um termopar.A pressão de vácuo necessária compreendida aproximadamente entre 102 Pa e 105 Pa é produzida com uma bomba de vácuo.Utiliza-se uma válvula adequada para admissão de ar ou de azoto para regular a pressão (intervalo de medição compreendido aproximadamente entre 102 e 105 Pa) e para ventilação.Mede-se a pressão com um manómetro.1.6.1.2. Procedimento de mediçãoMede-se a pressão de vapor determinando a temperatura de ebulição da amostra para diversas pressões específicas compreendidas, rosso modo, entre 103 e 105 Pa. A existência de uma temperatura estável sob uma pressão constante significa que se atingiu a temperatura de ebulição. As substâncias espumosas não podem ser submetidas a este método de medição.Coloca-se a substância num recipiente limpo e seco. É possível que surjam problemas com sólidos não pulverizados mas esta questão pode ser resolvida frequentemente aquecendo a água da manga de arrefecimento. Depois de se ter enchido o recipiente, veda-se o equipamento na flange e eliminam-se os gases da substância. Ajusta-se seguidamente a pressão para o valor mais baixo desejado e liga-se o aquecimento. Simultâneamente liga-se o sensor de temperatura a um registador.Atinge-se o equilíbrio quando se regista uma temperatura de ebulição constante a uma pressão constante. É necessário tomar precauções para evitar a instabilidade durante a ebulição. Além disso pode ocorrer condensação total no sistema de arrefecimento. No caso de se determinar a pressão de vapor de sólidos de baixo ponto de fusão é necessário tomar precauções para evitar o bloqueio do condensador.Depois de se ter registado este ponto de equilíbrio ajusta-se a pressão para um valor superior. Repete-se este processo até se atingir a pressão de 105 Pa (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na totalidade). Para verificação, os pontos de equilíbrio deverão ser repetidos para valores decrescentes da pressão.1.6.2. Medição estática1.6.2.1. EquipamentoO equipamento é constituído por um recipiente para a amostra, um sistema de aquecimento e um sistema de arrefecimento para regular a temperatura da amostra e um aparelho para medição da temperatura. O equipamento incorpora também instrumentos para ajustar e medir a pressão. As figuras 2a e 2b ilustram os princípios básicos envolvidos.A câmara da amostra (figura 2a) é ligada num dos lados a uma válvula própria para alto vácuo. Ao outro lado liga-se um tubo em U contendo um fluido manométrico adequado. Uma das extremidades do tubo em U ramifica-se e vai ligar-se à bomba de vácuo, à botija de azoto ou à válvula de ventilação, e a um manómetro.É possível utilizar um manómetro com um indicador de pressão em vez de um tubo em U (figura 2b).No sentido de se regular a temperatura da amostra coloca-se o recipiente da amostra com a válvula e com o tubo em U ou com o manómetro, num banho que é mantido a uma temperatura constante ± 0,2 K. As medições de temperatura são efectuadas na parede exterior do recipiente que contém a amostra ou no próprio recipiente.Para fazer o vácuo no equipamento utiliza-se uma bomba de vácuo com um sistema de arrefecimento.No método 2a mede-se a pressão de vapor da susbtância indirectamente, utilizando um indicador de zero. Este método leva em consideração o facto de a densidade do fluido no tubo em U se alterar no caso de a temperatura variar muito.Os líquidos a seguir indicados são adequados para utilização como indicadores de zero para o tubo em U, dependendo do intervalo de pressão e do comportamento químico das susbtâncias testadas: mercúrio, óleos de silicone, ftalatos. A substância testada não deve dissolver-se perceptivelmente ou reagir com o fluido do tubo em U.Para o manómetro o mercúrio pode ser utilizado no intervalo compreendido entre a pressão atmosférica normal e 102 Pa, ao passo que os óleos de silicone e os ftalatos são adequados para utilização no intervalo compreendido entre 10 Pa e 102 Pa. Os manómetros de membrana aquecível podem ser utilizados eventualmente para valores inferiores a 10 1 Pa. Existem ainda outros manómetros susceptíveis de serem utilizados para valores inferiores a 102 Pa.1.6.2.2. Procedimentos de mediçãoAntes da medição todos os componentes do equipamento representado na figura 2 devem ser completamente limpos e secos.Para o método 2a, enche-se o tubo em U com o líquido escolhido, o qual deve ser desgaseificado a temperatura elevada, antes de se fazer qualquer leitura.Coloca-se a substância testada no equipamento o qual é depois fechado e reduz-se a temperatura o suficiente para remover os gases. A temperatura deve ser suficientemente baixa para garantir a remoção do ar mas, no caso das amostras com vários componentes, o seu valor não deve alterar a composição do material.Se necessário pode-se estabelecer o equilíbrio mais rapidamente por agitação.A amostra pode ser sobrearrefecida, por exemplo, com azoto líquido (precauções: condensação do ar, fluido da bomba) ou com uma mistura de etanol e gelo seco. Para medições a baixa temperatura utiliza-se um banho de regulação da temperatura ligado a um sistema ultracriogénico.Estando aberta a válvula sobre o recipiente da amostra, aplica-se o sistema de sucção durante diversos minutos para se efectuar a remoção do ar. Depois fecha-se a válvula e reduz-se a temperatura da amostra para o mais baixo nível desejado. Se necessário deverá repetir-se diversas vezes a operação de desgaseificação.Ao aquecer-se a amostra a pressão de vapor aumenta. Isto altera o equilíbrio do fluido no tubo em U. Para se compensar este fenómeno permite-se a entrada de azoto ou de ar no aparelho através de uma válvula, até que o indicador de pressão de fluido marque novamente zero. A pressão necessária para conseguir isto pode ser lida com um manómetro de precisão à temperatura ambiente. Esta pressão corresponde à pressão de vapor da substância para esse valor específico da temperatura medida.O método 2b é idêntico mas a pressão de vapor é lida directamente.A dependência da pressão de vapor em função da temperatura é determinada para pequenos intervalos adequados (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na totalidade) até se alcançar o máximo desejado. Para verificação deverão ser repetidas as leituras com os valores de temperatura a baixar.No caso de os valores obtidos na repetição das leituras não coincidirem com a curva obtida para os valores crescentes da temperatura, pode ser devido às razões seguintes:1. A amostra ainda contém ar (por exemplo, no caso dos materiais de alta viscosidade) ou contém substâncias de baixo ponto de ebulição, as quais são libertadas durante o aquecimento e podem ser removidas por sucção seguindo-se novamente um sobrearrefecimento.2. A temperatura de arrefecimento não é suficientemente baixa. Nesse caso utiliza-se azoto líquido como agente de arrefecimento.Se estivermos perante o caso 1 ou 2, os ensaios deverão ser repetidos.3. A substância sofre uma reacção química no intervalo de temperatura pesquisado (por exemplo, decomposição, polimerização).1.6.3. IsoteniscópioNa referência 7 encontra-se uma descrição completa deste método. Na figura 3 mostra-se o princípio de funcionamento deste dispositivo de medição. Analogamente ao método estático descrito em 1.6.2, o isoteniscópio é apropriado para fazer uma investigação do tipo descrito em sólidos ou líquidos.No caso dos líquidos, a própria substância serve como fluido no manómetro auxiliar. Coloca-se no isoteniscópio uma quantidade do líquido, suficiente para encher a ampola e o segmento curto da secção do manómetro. Liga-se o isoteniscópio a um sistema de vácuo, procede-se à evacuação do isoteniscópio e enche-se depois com azoto. Repete-se duas vezes a evacuação e a purificação do sistema para garantir a remoção do oxigénio residual. Coloca-se o isoteniscópio cheio em posição horizontal de tal modo que a amostra se espalhe segundo uma camada fina na ampola da amostra e na secção do manómetro (parte em U). Reduz-se a pressão do sistema para 133 Pa e aquece-se suavemente a amostra até ela iniciar a ebulição (remoção de gases estáveis dissolvidos). Depois coloca-se o isoteniscópio de tal modo que a amostra regresse à ampola e ao segmento curto do manómetro, ficando os dois assim completamente cheios com líquido. Mantém-se a pressão tal como para a desgaseificação; aquece-se com chama fraca a extremidade de saída da ampola da amostra até que o vapor libertado pela amostra se expanda suficientemente para deslocar parte da amostra da parte superior da ampola e do braço do manómetro para o interior da secção do manómetro do isoteniscópio, originando um espaço livre de azoto e cheio de vapor.Depois coloca-se o isoteniscópio num banho a temperatura constante e ajusta-se a pressão do azoto até que o seu valor seja igual ao da amostra. O equilíbrio entre pressões é indicado pela secção do manómetro do isoteniscópio. Em situação de equilíbrio, a pressão de vapor do azoto é igual à pressão de vapor da substância.No caso dos sólidos, dependendo da pressão e do intervalo de temperaturas, utilizam-se os líquidos manométricos enumerados em 1.6.2.1. O líquido manométrico isento de gases é utilizado para encher uma protuberância existente no segmento longo do isoteniscópio. Depois coloca-se na ampola o sólido que se está a estudar e desgaseifica-se a uma temperatura elevada. Depois disso inclina-se o isoteniscópio de tal modo que o líquido manométrico possa fluir para o interior do tubo em U. A medição da pressão de vapor em função da temperatura efectua-se de acordo com 1.6.2.1.6.4. Método de efusão: balança de pressão de vapor1.6.4.1. EquipamentoEncontram-se descritas na literatura várias versões de equipamento (1). O equipamento aqui descrito ilustra o princípio geral do método (figura 4). A figura 4 mostra os componentes principais do equipamento, consistindo num recipiente de vidro ou de aço inoxidável para alto vácuo, equipamento para produzir e medir pressão de vácuo e componentes incorporados para medir a pressão de vapor numa balança. O equipamento possui os seguintes componentes incorporados:- Um forno evaporador com flange e entrada giratória. O forno evaporador é um recipiente cilíndrico feito, por exemplo, de cobre ou de uma liga quimicamente resistente e de boa condutividade térmica. Também se pode utilizar um recipiente de vidro com uma parede de cobre. O forno possui um diâmetro de aproximadamente 3 a 5 cm e entre 2 e 5 cm de altura. Existem entre uma e três aberturas de dimensões diferentes para a corrente de vapor. O forno é aquecido utilizando uma placa de aquecimento colocada por baixo ou uma espiral de aquecimento em torno da superfície exterior. Para se evitar que o calor seja dissipado na placa de base, liga-se o calorífero à placa de base utilizando um metal de fraca condutividade térmica (níquel/prata ou aço de crómio-níquel) por exemplo, um tubo de níquel/prata ligado a uma entrada rotativa no caso de se utilizar um forno com diversas aberturas. Este sistema possui a vantagem de permitir a introdução de uma barra de cobre. Isto permite o arrefecimento exterior utilizando um banho de arrefecimento.- No caso de a tampa do forno de cobre possuir três aberturas de diâmetros diferentes situadas a 90  umas das outras, é possível abranger diversos intervalos de pressão de vapor dentro do intervalo total de medição (aberturas com diâmetros compreendidos aproximadamente entre 0,30 e 4,50 mm). Utilizam-se as aberturas maiores para valores da pressão de vapor menores e vice-versa. Rodando o forno pode seleccionar-se a abertura desejada ou uma posição intermédia da pressão de vapor (abertura do forno/blindagem/campânula de balança) e a corrente de moléculas é libertada ou deflectida pela abertura do forno sobre a balança. No sentido de se medir a temperatura da substância coloca-se num ponto adequado um termopar ou um termómetro de resistência.- Sobre a blindagem existe uma campânula pertencente a uma microbalança altamente sensível (ver adiante). O diâmetro da campânula da balança é de aproximadamente 30 mm. O alumínio revestido a ouro é o material adequado.- Consoante o tipo de balança, assim existem aberturas para o travessão da balança e uma abertura na blindagem para a corrente de moléculas garantindo-se a condensação completa do vapor na campânula da balança. A dissipação do calor para o exterior é garantida, por exemplo, por uma barra de cobre ligada a uma caixa de refrigeração. A barra é aplicada através da placa de base e termicamente isolada desta, por exemplo, com um tubo de aço de crómio-níquel. Mergulha-se a barra num balão de Dewar contendo azoto líquido existente sob a placa da base ou faz-se circular azoto líquido pela barra. Deste modo a caixa de refrigeração é mantida aproximadamente à temperatura de 120  C. A campânula da balança é arrefecida exclusivamente por radiação o que é satisfatório para o intervalo de pressões que se pretende pesquisar (arrefecer aproximadamente 1 hora antes do início das medições).- A balança fica colocada sobre a caixa de refrigeração. As balanças adequadas são, por exemplo, as balanças electrónicas de dois braços altamente sensíveis (8) ou instrumentos de bobina móvel altamente sensíveis (ver «OCDE Test Guideline 104, Edição 12 de Maio de 1981»).- A placa da base incorpora também ligações eléctricas para termopares (ou para termómetros de resistência) e para as resistências de aquecimento.- Uma pressão de vácuo no recipiente utilizando uma bomba de vácuo parcial ou uma bomba de alto vácuo (a pressão de vácuo necessária é de aproximadamente 1 a 2×10 3 Pa, obtida após 2 horas de bombagem). Regula-se a pressão com um manómetro de ionisação adequado.1.6.4.2. Procedimento de mediçãoEnche-se o recipiente com a substância testada e fecha-se a tampa. A blindagem e a caixa de refrigeração deslizam ficando colocados sobre o forno. Fecha-se o aparelho e liga-se as bombas de vácuo. A pressão final antes de se iniciarem as medições deverá ser de aproximadamente 10 4 Pa. O arrefecimento da caixa de refrigeração tem início a 10 2 Pa.Uma vez alcançado o vácuo necessário, inicia-se o processo de calibração para o mais baixo valor da temperatura necessária. Ajusta-se a abertura correspondente na tampa, passando a corrente de vapor directamente através da blindagem por cima da abertura e atinge a campânula da balança arrefecida. A campânula da balança deve ser suficientemente grande para garantir que toda a corrente conduzida através da blindagem a atinja. O jacto da corrente de vapor actua como uma força contra a campânula da balança e as moléculas condensam na sua superfície arrefecida.O jacto e a condensação simultânea produzem um sinal no aparelho de registo. A avaliação dos sinais fornece duas informações:1. No equipamento agora descrito a pressão de vapor é determinada directamente a partir do jacto aplicado à campânula da balança [não é necessário conhecer o peso molecular (2)]. Ao fazer-se a avaliação das leituras deverão ser tomados em consideração factores geométricos tais como a abertura do forno e o ângulo da corrente de vapor.2. Pode medir-se simultâneamente a massa do condensado podendo calcular-se a partir daí a velocidade de evaporação. Também se pode calcular a pressão de vapor a partir da velocidade de evaporação e do peso molecular recorrendo à equação de Hertz (2). p = G2 p RT × 103Mem queG = velocidade de evaporação (kg s 1 m 2)M = massa molar (g mol 1)T = temperatura (K)R = constante universal dos gases perfeitos (J mol 1 K 1)p = pressão de vapor (Pa)Depois de se ter alcançado o vácuo necessário inicia-se a série de medições a partir da mais baixa temperatura de medição desejada.Para as outras medições, aumenta-se a temperatura gradualmente até se atingir o valor da temperatura máxima desejada. Depois arrefece-se novamente a amostra e pode registar-se uma segunda curva de pressão de vapor. Se os valores da segunda experiência não coincidem com os valores obtidos na primeira experiência, então é possível que a substância possa ter sofrido decomposição no intervalo de temperatura que se está a medir.1.6.5. Método de efusão - por perda de peso1.6.5.1. EquipamentoO equipamento de efusão é constituído pelas partes básicas seguintes:- um tanque que pode ser termostatado e esvaziado e no qual estão localizadas as células de efusão,- uma bomba de alto vácuo (por exemplo, uma bomba de difusão ou uma bomba turbomolecular) com manómetro de vácuo,- um sifão, utilizando azoto líquido ou gelo seco.Na figura 5, por exemplo, mostra-se um tanque de alumínio para vácuo, aquecido electricamente, possuindo quatro células de efusão feitas de aço inoxidável. A chapa de aço inoxidável tem uma espessura aproximada de 0,3 mm e possui um orifício de efusão com um diâmetro compreendido entre 0,2 e 1,0 mm, prendendo-se à célula de efusão através de uma tampa roscada.1.6.5.2. Procedimento de mediçãoEnche-se cada célula de efusão com as substâncias de referência e de teste, fixa-se com a tampa roscada o diafragma metálico com o orifício e faz-se a pesagem cada célula com uma precisão da ordem de 0,1 mg. Coloca-se a célula no equipamento controlado por termóstato o qual é depois esvaziado até se obter um valor inferior a um décimo da pressão esperada. Para intervalos definidos de tempo variando entre 5 e 30 horas, introduz-se ar no equipamento e determina-se a perda de massa da célula de efusão fazendo nova pesagem.No sentido de se garantir que os resultados não são influenciados por impurezas voláteis, repete-se a pesagem da célula a intervalos definidos de tempo para verificar se a velocidade de evaporação é constante ao longo de pelo menos dois intervalos de tempo.A pressão de vapor p na célula de efusão é dada por: p =mKAtE2 p R TMem que:p  =  pressão de vapor (Pa)m  =  massa da substância que sai da célula durante o tempo t (kg)t  =  tempo (s)A  =  área da perfuração (m2)K  =  factor de correcçãoR  =  constante universal dos gases perfeitos (J mol 1 K 1)T  =  temperatura (K)M  =  massa molar (kg mol 1)O factor de correcção K depende da razão entre o comprimento e o raio do orifício do cilindro:razão:0,10,20,61,02,0K:0,9520,9090,7710,6720,514A equação anterior pode ser escrita da forma seguinte: p = EmtTM em que: E =1KA2 p R  é a constante da célula de efusão.é a constante da célula de efusão.Esta constante E da célula de efusão pode ser determinada com substâncias de referência (2,9) recorrendo à equação seguinte: E =p (r) tmM (r)Tem que:p(r) = pressão de vapor da substância de referência (Pa)M(r) = massa molar da substância de referência (kg.mol 1)1.6.6. Método da saturação com gás1.6.6.1. EquipamentoPara se efectuar este teste utiliza-se um equipamento típico que é constituído por diversos componentes representados na figura 6a e adiante descritos (1).Gás inerte:O gás portador não deve reagir quimicamente com a substância testada. Normalmente o azoto é suficiente para satisfazer essa finalidade mas, ocasionalmente, podem ser necessários outros gases (10). O gás utilizado deve ser seco (ver figura 6a, n  4 da legenda : sensor de humidade relativa).Controlo de fluxo:É necessário um sistema adequado para o controlo do gás para garantir um fluxo constante e predeterminado através da coluna do saturador.Sistemas de captação para recolha de vapor:Estes sistemas dependem das características da amostra particular e do método de análise escolhido. O vapor deverá ser recolhido em quantidade e de forma que permita a análise posterior. Para algumas substâncias testadas são adequados sistemas de captação contendo líquidos tais como o hexano ou o etilenoglicol. Para outras é preferível aplicar absorventes sólidos.Em alternativa à captação de vapor e análise posterior é possível utilizar diversas técnicas analíticas tais como a cromatografia para se determinar quantitativamente a quantidade de material transportado por uma quantidade conhecida de gás portador. Adicionalmente é possível medir a perda de massa da amostra.Permutador de calor:Para medições a temperaturas diferentes pode ser necessário incorporar no equipamento um permutador de calor.Coluna do saturador:A substância a testar é depositada sob a forma de solução sobre um suporte inerte adequado. Carrega-se a coluna do saturador com o suporte revestido, devendo as dimensões daquela e o débito serem tais que se garanta a saturação completa do gás portador. A coluna do saturador deve ser controlada por termóstato. Para medições de temperaturas superiores à temperatura ambiente deve-se aquecer a região entre a coluna do saturador e o sistema de captação para evitar a condensação da substância a testar.No sentido de reduzir o transporte de massa que ocorre por difusão pode colocar-se um tubo capilar depois da coluna do saturador (figura 6b).1.6.6.2. Procedimento de mediçãoPreparação da coluna do saturador:A uma quantidade adequada de suporte adiciona-se uma solução da substância a testar num solvente facilmente volátil. Dever-se-á adicionar a substância a testar em quantidade suficiente para manter a saturação durante o tempo de duração do teste. Evapora-se o solvente totalmente ao ar ou num evaporador rotativo e carrega-se a coluna do saturador com o material bem misturado. Após o controlo da amostra por termóstato faz-se passar azoto através do equipamento.Medição:Os sistemas de captação ou o detector incorporado são ligados à linha dos efluentes da coluna e procede-se ao registo do tempo. Verifica-se o débito no início e em intervalos regulares durante a experiência, utilizando um contador de bolhas (ou continuamente com um debitómetro).Deve-se medir a pressão à saída do saturador. Isto pode ser feito do modo seguinte:a) Introduzindo um manómetro entre o saturador e os sistemas de captação (isto pode não ser satisfatório devido ao facto de aumentar o espaço morto e a superfície de adsorção); oub) Determinando as quedas de pressão através do sistema de captação particular utilizado em função do débito, numa experiência separada (isto pode não ser muito satisfatório para os sistemas de captação de líquidos).Determina-se em experiências preliminares ou por estimativa o tempo necessário para recolher a quantidade de substância a testar que é necessária para os diversos métodos de análise. Em alternativa, pode utilizar-se uma técnica analítica quantitativa (por exemplo, a cromatografia) para recolha da substância para outras análises. Antes de se calcular a pressão de vapor para uma determinada temperatura é necessário efectuar experiências preliminares para se determinar o débito máximo que saturará completamente o gás portador com o vapor da substância. Esta situação fica garantida no caso de se fazer passar o gás portador através do saturador suficientemente devagar e de tal modo que uma velocidade inferior não origine maior pressão de vapor calculada. O método analítico específico será determinado pela natureza da substância que se pretende testar (por exemplo, gravimetria ou cromatografia gasosa).Determina-se a quantidade de substância transportada por um volume conhecido de gás portador.1.6.6.3. Cálculo da pressão de vaporCalcula-se a pressão de vapor a partir da densidade de vapor, W/V, segundo a equação: p =WV×RTMem que:p  =  pressão de vapor (Pa)W  =  massa da substância de teste evaporada (g)V  =  volume de gás saturado (m3)R  =  constante universal dos gases perfeitos (J mol 1 K 1)T  =  temperatura (K)M  =  massa molar da substância de teste (g mol 1)Os volumes medidos devem ser corrigidos em função das diferenças de pressão e de temperatura existentes entre o debitómetro e o saturador controlado por termóstato. No caso de o debitómetro estar localizado a juzante do sistema de captação de vapor é necessário efectuar correcções que levem em consideração quaisquer ingredientes vaporizados no sistema de captação (1).1.6.7. Rotor giratório (8, 11, 13)1.6.7.1. EquipamentoPode-se recorrer à técnica do rotor giratório utilizando um viscosímetro de rotor giratório conforme se mostra na figura 8. A figura 7 representa squematicamente a disposição experimental.O equipamento de medida típico é constituído por uma cabeça de medição do rotor giratório colocada num invólucro termostatado com graduação de 0,1  C). O dispositivo que contém a amostra é colocado num invólucro termostatado (com graduação de 0,01  C) e todas outros partes do conjunto experimental são mantidas a uma temperatura superior, para evitar a condensação. Por meio de válvulas de alto vácuo, liga-se ao sistema uma bomba de alto vácuo.A cabeça de medição do rotor giratório é constituída por uma esfera de aço (4 a 5 mm de diâmetro) colocada num tubo. A esfera encontra-se suspensa e é estabilizada por um campo magnético, utilizando-se geralmente uma combinação de magnetos permanentes e de bobinas de controlo.A esfera é forçada a girar por acção de campos girantes produzidos pelas bobinas. A existência de bobinas de leitura, que medem a sempre presente magnetização lateral fraca da esfera, permitem efectuar a medição da sua velocidade de rotação.1.6.7.2. Procedimento de mediçãoQuando a esfera atingiu já uma determinada velocidade de rotação v(o) (normalmente cerca de 400 rotações por segundo), interrompe-se o fornecimento de energia e inicia-se a desaceleração devido à fricção com o gás.Mede-se a diminuição da velocidade de rotação em função do tempo. Uma vez que o atrito causado pela suspensão magnética é desprezível quando comparado com a fricção com o gás, a pressão p do gás é dada por: p =p c r rs 10 t× lnv (t)v (o)em que:c   =  velocidade média das moléculas do gásr  =  raio da esferañ  =  densidade absoluta da esferaó  =  coeficiente de transferência do momento tangencial (ó = 1 para uma superfície esférica ideal de uma esfera)t  =  tempov(t) =  velocidade de rotação decorrido o tempo tv(o) =  velocidade de rotação inicialTambém se pode escrever esta equação do modo seguinte: p =p c r r10 s×tn   tn-1tn × tn-1em que tn, tn 1 são os tempos necessários para a ocorrência de um número N determinado de revoluções. Estes intervalos de tempo tn e tn 1 são sequênciais e tn > tn 1.A velocidade média Ec das moléculas de gás é dada por: c  =(8 RTp M)12em que:T  =  temperaturaR  =  constante universal dos gases perfeitosM  =  massa molar2. RESULTADOSA pressão de vapor obtida por quaisquer dos métodos anteriores deverá ser determinada pelo menos para dois valores de temperatura. É preferível fazer determinações para três ou vários valores de temperatura de preferência no intervalo compreendido entre 0 e 50  C, no sentido de se verificar a linearidade da curva de pressão de vapor.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- o método utilizado,- a especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e passos de purificação preliminares, se os houver,- pelo menos dois valores de pressão de vapor e dois valores de temperatura, preferencialmente no intervalo compreendido entre 0 e 50  C,- todos os dados não tratados,- uma curva do tipo log p em função de 1/T,- uma estimativa da pressão de vapor para as temperaturas de 20 ou 25  C.No caso de se observar um fenómeno de transição (variação de estado, decomposição), deverão ser acrescentados os seguintes dados informativos:- natureza da alteração,- temperatura à qual ocorreu essa alteração, à pressão atmosférica,- pressão de vapor para temperaturas 10 e 20  C inferiores à temperatura de transição e para temperaturas 10 e 20  C superiores a essa temperatura (salvo no caso de a transição se efectuar do estado sólido para o estado gasoso).Todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados devem constar do relatório, especialmente no que diz respeito às impurezas e ao estado físico da substância.4. REFERÊNCIAS(1)  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.(2)  Ambrose, D. in B. Le Neindre, B. Vodar, (Eds.): Experimental Thermodynamics, Butterworths, London, 1975, Vol. II.(3)  R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.(4)  Knudsen, M. Ann. Phys. Lpz., 1909, vol. 29, 1979; 1911, vol. 34, 593.(5)  NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 1 to 105 Pa - Static method.(6)  NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10 3 to 1 Pa - Vapour pressure balance method.(7)  ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.(8)  G. Messer, P. Rohl, G. Grosse and W. Jitschin. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1987, vol. 5 (4), 2440.(9)  Ambrose, D.; Lawrenson, I.J.; Sprake, C.H.S. J. Chem. Thermodynamics 1975, vol. 7, 1173.(10) B.F. Rordorf. Thermochimica Acta, 1985, vol. 85, 435.(11) G. Comsa, J.K. Fremerey and B. Lindenau. J. Vac. Sci. Technol., 1980, vol. 17 (2), 642.(12) G. Reich. J. Vac. Sci. Technol., 1982, vol. 20 (4), 1148.(13) J.K. Fremerey. J. Vac. Sci. Technol.(A), 1985, vol. 3 (3),1715.Apêndice 1Método por estimativaINTRODUÇÃOOs valores calculados da pressão de vapor podem ser utilizados:- para se decidir qual dos métodos experimentais é o mais apropriado,- para proporcionar uma estimativa ou um valor limite nos casos em que o método experimental não pode ser aplicado por razões técnicas (incluindo os casos em que a pressão de vapor é muito baixa),- para auxiliar a identificar os casos em que se justifica a omissão da medição experimental devido ao facto de a pressão de vapor ser eventualmente inferior a 10 5 Pa à temperatura ambiente.MÉTODO POR ESTIMATIVAPode avaliar-se a pressão de vapor de líquidos e de sólidos recorrendo à correlação de Watson modificada (a). O único dado experimental necessário é o ponto de ebulição normal. Este método é aplicável para um intervalo de pressões compreendido entre 105 e 10 5 Pa.A informação pormenorizada sobre o método encontra-se descrita no «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (b).PROCEDIMENTO DE CÁLCULODe acordo com (b) calcula-se a pressão de vapor do modo seguinte: ln Pvp  PD HvbD ZbRTb[1  (3   2 TbT-)mT-Tb   2 m (3   2 T-Tb)m-1 ln T-Tb]em que:T  =  temperatura de trabalhoTb  =  ponto de ebulição normalPvp  =  pressão de vapor à temperatura TÄ Hvb =  calor de vaporizaçãoÄ Zb  =  factor de compressibilidade (estimado a 0,97)m  =  factor empírico dependente do estado físico para o valor da temperatura de trabalhoAlém disso temos:D HvbTb = KF (8,75 + R ln Tb)em que KF representa um factor empírico que leva em consideração a polaridade da substância. Na publicação de referência (b) encontram-se enumerados os factores KF para diversos tipos de compostos.É frequente encontrar dados disponíveis de valores de pontos de ebulição para valores de pressão reduzida. Num caso desses, de acordo com (b), calcula-se a pressão de vapor do modo seguinte: ln Pvp  P ln P1 +D Hv1D ZbRT1[1   (3   2 T-T1)m T1-T    2 m (3   2 T-T1)m-1 ln T-T1]em que T1 representa o ponto de ebulição para o valor P1 da pressão reduzida.RELATÓRIONo caso de se utilizar o método por estimativa, o relatório deverá conter documentação compreensiva sobre os cálculos.BIBLIOGRAFIA(a) K.M. Watson, Ind. Eng. Chem., 1943, vol. 35, 398.(b) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt. Handbook of Chemical Property Estimation Methods, Mc Graw-Hill, 1982.Apêndice 2Figura 1 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Aparelho para a determinação da curva de pressão de vapor de acordo com o método dinâmico1 = Termopar2 = Volume de compensação de vácuo3 = Manómetro4 = Vácuo5 = Ponto de medição6 = Sistema de aquecimento : cerca de 150 WFigura 2a >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Aparelho para a determinação da curva de pressão de vapor de acordo com o método estático (utilizando um manómetro de tubo em U)1. Substância a testar6. Banho regulador da temperatura2. Fase de vapor7. Dispositivo de medição de temperatura3. Válvula para alto vácuo8. Bomba de vácuo4. Tubo em U (manómetro auxiliar)9. Ventilação5. ManómetroFigura 2b >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Aparelho para a determinação da curva da pressão de vapor de acordo com o método estático (utilizando um indicador de pressão)1. Substância a testar5. Indicador de pressão2. Fase de vapor6. Banho regulador da temperatura3. Válvula de alto vácuo7. Dispositivo de medição da temperatura4. ManómetroFigura 3 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Isoteniscópio (ver a referência 7)1. Ligação ao sistema de medição e de controlo da pressão2. Tubo com diâmetro exterior (OD) de 8 mm3. Azoto seco no sistema de pressão4. Vapor da amostra5. Ponta pequena6. Amostra de líquidoFigura 4 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Aparelho para a determinação da curva da pressão de vapor de acordo com o método da balança de pressão de vapor1. Substância a testar7. Blindagem (protecção)2. Fase de vapor com corrente de vapor8. Barra de refrigeração ligada à caixa de refrigeração3. Forno de evaporação com entrada giratória9. Campânula da balança3a.Tampa do forno com abertura10. Microbalança4. Aquecimento do forno (refrigeração)11. Ligação ao registador5. Medição da temperatura da amostra12. Ligação à bomba de alto vácuo6. Caixa de refrigeraçãoFigura 5 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Exemplo de um aparelho para evaporação a baixa pressão utilizando o método de efusão, com uma célula de efusão com o volume de 8 cm31. Ligação à bomba de vácuo2. Perfurações para o termómetro de resistência de platina ou para a medição de temperatura e controlo (2)3. Tampa do tanque de vácuo4. Anel do tipo-O5. Tanque de vácuo feito de alumínio6. Dispositivo para instalação e para remoção das células de efusão7. Tampa roscada8. Porca de orelhas (6)9. Parafusos (6)10. Células de efusão feitas de aço inoxidável11. Cargas do calorífero (6)Figura 6a >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Exemplo de um sistema de circulação para a determinação da pressão de vapor pelo método da saturação com gás1 = Regulador de fluxo2 = Permutador de calor3 = Válvulas de agulha4 = Sensor de humidade relativa5 = Colunas de saturação6 = Juntas do tipo PTFE7 = Debitómetro8 = Sistema de captação (absorvedor)9 = Sistema de captação de óleo10 = Borbulhador de vidro calcinadoFigura 6b >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Exemplo de um sistema para a determinação da pressão de vapor pelo método da saturação com gás, com um tubo capilar colocado a seguir ao compartimento de saturação1. Debitómetro térmico6. Compartimento de saturação do gás2. Manómetro7. Capilar3. Compartimento de temperatura controlada8. Recipientes de absorção4. Bobina do termóstato para o gás portador9. Aparelho para a medição de gás10. Sistema de captação frio5. Termómetro (Pt 100)Figura 7 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Exemplo da disposição do conjunto experimental para o método do rotor giratórioAparelho para a determinação da pressão de vaporA. Cabeça do sensor de rotor giratórioB. Célula da amostraC. TermóstatoD. Linha de vácuo (bomba turbo)E. Termóstato atmosféricoFigura 8 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Exemplo de cabeça de medição de rotor giratório1. Esfera2. Extensão tubular esvaziada de 63. Magnetos permanentes (2)4. Bobinas (2) para estabilização vertical5. Bobinas accionadoras (4)6. Flange de ligaçãoA.5. TENSÃO SUPERFICIAL 1. MÉTODOOs métodos descritos baseiam-se nas normas de ensaio da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos na referência (2).1.1. INTRODUÇÃOOs métodos descritos são aplicáveis à medição da tensão superficial em soluções aquosas.Considera-se útil possuir informações preliminares sobre a substância, relativamente a: solubilidade em água, estrutura, propriedades relativas à hidrólise e concentração crítica de formação de micelas, antes de se efectuarem estes testes.Os métodos que se seguem são aplicáveis à maior parte das substâncias químicas, sem qualquer restrição no que diz respeito ao seu grau de pureza.A medição da tensão superficial pelo método do tensiómetro de anel é aplicável apenas a soluções aquosas com uma viscosidade dinâmica inferior a cerca de 200 mPa s.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESDefine-se como tensão superficial a entalpia superficial livre, por unidade de área da superfície.A tensão superficial é dada por:N/m (unidade do SI) oumN/m (subunidade do SI) 1 N/m = 103 dines/cm 1 mN/m = 1 dine/cm no antigo e obsoleto sistema cgs1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.As substâncias de referência que abrangem um intervalo amplo de tensões superficiais, encontram-se enumeradas nas referências (1) e (3).1.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOSOs métodos baseiam-se na medição da força máxima que é necessário exercer verticalmente sobre um colchete ou anel em contacto com a superfície do líquido que se pretende examinar colocado num recipiente, no sentido de o separar dessa superfície, ou sobre uma placa, com uma aresta em contacto com a superfície, no sentido de se remover a película que se formou.As substâncias solúveis em água pelo menos para valores de concentração de 1 mg/l são testadas em solução aquosa para um valor único de concentração.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEEstes métodos são susceptíveis de proporcionar maior precisão do que a eventualmente necessária para a avaliação ambiental.1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOSPrepara-se uma solução da substância em água destilada. A concentração desta solução deve atingir 90% do valor da solubilidade de saturação da substância em água; no caso de esta concentração exceder o valor de 1 g/l, utiliza-se para os testes a concentração de 1 g/l. Não é necessário testar as substâncias cujo valor de solubilidade em água seja inferior a 1 mg/l.1.6.1. Método da placaVer ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da tensão superficial por remoção de películas líquidas).1.6.2. Método do colcheteVer ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da tensão superficial por remoção de películas líquidas).1.6.3. Método do anelVer ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da tensão superficial por remoção de películas líquidas).1.6.4. Método do anel harmonizado pela OCDE1.6.4.1. AparelhoOs tensiómetros comercialmente disponíveis são adequados para esta medição. São constituídos pelos elementos seguintes:- mesa de amostra móvel,- sistema de medição de força,- corpo para medição (anel),- recipiente de medição.1.6.4.1.1. Mesa de amostra móvelUtiliza-se a mesa de amostra móvel como suporte para o recipiente de medição de temperatura controlada que contém o líquido que se pretende testar. A sua montagem faz-se num suporte em conjunto com o sistema de medição de força.1.6.4.1.2. Sistema de medição de forçaO sistema de medição de força (ver a figura) fica colocado sobre a mesa da amostra. O erro de medição de força não deverá exceder ± 10 6 N, correspondente a um erro limite de ± 0,1 mg numa medição de massa. Em muitos casos, a escala dos tensiómetros comercialmente disponíveis é calibrada em mN/m, de modo que a tensão superficial pode ser lida directamente em mN/m, com uma precisão de 0,1 mN/m.1.6.4.1.3. Corpo para a medição (anel)Normalmente o anel é feito de um fio de platina/irídio com a espessura aproximada de 0,4 mm e com um perímetro médio de 60 mm. O anel é suspenso horizontalmente de uma haste metálica, através de um suporte triangular de montagem, que estabelece a ligação ao sistema de medição de força (ver a figura).Figura >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Corpo para a medição(Todas as dimensões estão expressas em milímetros)1.6.4.1.4. Recipiente de mediçãoO recipiente de medição que contém a solução a testar deverá ser um recipiente de vidro termostatizado. Deve ser concebido de tal modo que durante a medição a temperatura da solução líquida que se pretende testar e a fase gasosa sobre a sua superfície permaneçam constantes e impedindo que haja evaporação da amostra. São aceitáveis recipientes cilíndricos de vidro que possuam um diâmetro interno não inferior a 45 mm.1.6.4.2. Preparação do equipamento1.6.4.2.1. LimpezaOs recipientes de vidro devem ser cuidadosamente limpos. Se necessário deverão ser lavados com ácido cromossulfúrico quente e depois lavados com ácido fosfórico xaroposo (83 a 98 % em peso de H3PO4), lavados muito bem com água da torneira e lavados finalmente com água bidestilada até se obter uma reacção neutra, efectuando-se depois a secagem ou a lavagem com um pouco do líquido da amostra que se pretende medir.O anel deve ser primeiro muito bem lavado com água para se fazer a remoção de quaisquer substâncias que sejam solúveis em água, depois mergulhado rapidamente em ácido cromossulfúrico, lavado com água bidestilada até se obter uma reacção neutra e finalmente deverá ser aquecido rapidamente sobre uma chama de metanol.Nota:A contaminação com substâncias que não sejam dissolvidas ou destruídas com o ácido cromossulfúrico ou com o ácido fosfórico, tais como os silicones, deverão ser removidas usando um solvente orgânico adequado.1.6.4.2.2. Calibração do aparelhoA validação do aparelho consiste em verificar o seu zero e em ajustá-lo de tal modo que a indicação do instrumento permita uma determinação segura em mN/m.Montagem:O aparelho deve ser nivelado, por exemplo, por meio de um nível de bolha de ar colocado na base do tensiómetro, ajustando-se os parafusos de nivelamento existentes na base.Ajustamento do zero:Após a montagem do anel no aparelho e antes da imersão no líquido deve ajustar-se o zero do tensiómetro e deve verificar-se o paralelismo do anel com a superfície do líquido. Para satisfazer este objectivo pode utilizar-se como espelho a superfície do líquido.Calibrações:A calibração pode ser efectuada recorrendo a um de dois procedimentos:a) Utilizando uma massa: procedimento que utiliza cavaleiros de massa conhecida compreendida entre 0,1 e 1,0 g colocados sobre o anel. O factor de calibração Öa, pelo qual todas as leituras do instrumento devem ser multiplicadas, determina-se de acordo com a equação (1):fa =  srsa(1)em que:sr = mg2b (mN/m)m  = massa do cavaleiro (g)g  = aceleração da gravidade (981 cm s 2 ao nível do mar) b  = perímetro médio do anel (cm)óa = leitura do tensiómetro após colocação do cavaleiro no anel (mN/m)b) Utilizando água: procedimento que utiliza água pura cuja tensão superficial, por exemplo, à temperatura de 23  C é igual a 72,3 mN/m. Este procedimento é mais rápido do que a calibração com cavaleiros, mas existe sempre o risco de a tensão superficial da água estar falseada por vestígios de contaminação com agentes tensioactivos. O factor de calibração Öb, pelo qual todas as indicações do instrumento deverão ser multiplicadas, determina-se de acordo com a equação (2):fb =  sosg(2)em que:óo  =  valor referido na literatura para a tensão superficial da água (mN/m)óg  =  valor medido da tensão superficial da água (mN/m) ambos à mesma temperatura.1.6.4.3. Preparação de amostrasAs soluções aquosas deverão ser preparadas com as substâncias que se pretende testar, utilizando as necessárias concentrações em água, e não deverão conter quaisquer substâncias não dissolvidas.A solução deve ser mantida a uma temperatura constante (± 0,5  C). Uma vez que a tensão superficial de uma solução no recipiente de medição se altera no decurso do tempo, deverão ser efectuadas diversas medições em momentos diferentes e deverá ser traçada uma curva que represente a tensão superficial em função do tempo. Quando já não ocorrerem mais variações significa que se atingiu um estado de equilíbrio.A contaminação com poeiras e com gases interfere com a medição. Em consequência o trabalho deverá ser efectuado sob uma cobertura de protecção.1.6.5. Condições do testeA medição deverá ser efectuada aproximadamente à temperatura de 20  C e deverá ser controlada entre ± 0,5  C.1.6.6. Realização do testeAs soluções que se pretendem medir devem ser cuidadosamente transferidas para o recipiente de medição, limpo, tomando-se precauções para evitar a formação de espuma, e depois o recipiente de medida deverá ser colocado sobre a mesa do aparelho de teste. A parte superior da mesa com o recipiente de medida deverá ser elevada até que o anel fique imerso sob a superfície da solução que se pretende medir. Depois, a parte superior da mesa deverá ser baixada gradualmente e uniformemente (aproximadamente à velocidade de 0,5 cm/minuto) até que ocorra a separação do anel da superfície no momento em que se atingiu a força máxima. A camada de líquido associada ao anel não deve separar-se do anel. Depois de se terem completado as medições deve imergir-se o anel novamente sob a superfície e devem repetir-se as medições até se atingir um valor constante para a tensão superficial. O momento da transferência da solução para o recipiente de medição deverá ser registado para cada determinação. Deverão ser efectuadas leituras da força máxima necessária para separar o anel da superfície do líquido.2. RESULTADOSPara se calcular a tensão superficial, o valor lido em mN/m no aparelho deverá ser multiplicado primeiro pelo factor de calibração Öa ou Öb (conforme o procedimento de calibração utilizado). Obter-se-á deste modo um valor aproximado, pelo que é necessária correcção posterior.Harkins e Jordan (4) determinaram empiricamente factores de correcção para valores de tensão superficial medidos pelo método do anel, os quais dependem das dimensões do anel, da densidade do líquido e da sua tensão superficial.Uma vez que é trabalhoso determinar o factor de correcção para cada medição individual a partir das tabelas de Harkins e Jordan, para se calcular a tensão superficial de soluções aquosas pode utilizar-se o procedimento simplificado de leitura dos valores de tensão superficial corrigidos directamente a partir da tabela. (Recorrer-se-á à interpolação para leituras compreendidas entre os valores indicados na tabela).>POSIÇÃO NUMA TABELA>Este quadro foi compilado com base na correcção de Harkins-Jordan e é idêntico ao da norma DIN (DIN 53914) para a água e para soluções aquosas (densidade ñ = 1 g/cm3) e destina-se a um anel comercialmente disponível que possui as dimensões R = 9,55 mm (raio médio do anel) e r = 0,185 mm (raio do fio do anel). A tabela proporciona valores corrigidos para as medições de tensão superficial obtidas após calibração com massas ou calibração com água.Em alternativa, sem que haja a calibração precedente, pode calcular-se a tensão superficial de acordo com a fórmula seguinte:s = 4 p Rf × Fem que:F  = força medida no dinamómetro no ponto de ruptura da películaR  = raio do anelf  = factor de correcção (1)3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- método utilizado,- tipo de água ou de solução utilizada,- especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- resultados da medição: tensão superficial (leitura) especificando as duas leituras individuais e a sua média aritmética e bem assim o valor médio corrigido (tomando em consideração o factor relativo ao equipamento e a tabela de correcção,- concentração da solução,- temperatura do teste,- período de vida da solução utilizada; em particular, o tempo decorrido entre a preparação e a medição efectuada na solução,- descrição da dependência temporal da tensão superficial após a transferência da solução para o recipiente de medição,- todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados devem ser descritas, especialmente no que diz respeito a impurezas e estado físico da substância.3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOSConsiderando que a água destilada possui uma tensão superficial de 72,75 mN/m à temperatura de 20  C, as substâncias que apresentem uma tensão superficial inferior a 60 mN/m sob as condições descritas para este método deverão ser consideradas como materiais tensioactivos.4. REFERÊNCIAS(1)  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.(2)  R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV.(3)  Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.(4)  Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.A.6. SOLUBILIDADE EM ÁGUA 1. MÉTODOOs métodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE (1).1.1. INTRODUÇÃOÉ útil possuir informações preliminares sobre a fórmula estrutural, a pressão de vapor, a constante de dissociação e a hidrólise (em função do pH) da substância para se realizar este teste.Não existe um método único susceptível de abranger todas as possibilidades de solubilidade em água.Os dois métodos de teste adiante descritos abrangem a totalidade de possibilidades de solubilidade em água mas não são aplicáveis às substâncias voláteis:- um desses métodos aplica-se a substâncias essencialmente puras, com baixa solubilidade ( 10 2 gramas por litro), e que são estáveis em água, designado por «método do balão».A solubilidade da substância testada em água pode ser consideravelmente afectada pela presença de impurezas.1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADESA solubilidade de uma susbtância em água é especificada pela concentração da massa de saturação dessa substância em água a uma determinada temperatura. A solubilidade em água é especificada em unidades de massa por volume de solução. A unidade do SI é kg/m3 (também se pode utilizar gramas por litro).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as características de execução do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIODever-se-á determinar a quantidade aproximada de amostra e o tempo necessário para conseguir a concentração da massa de saturação, num ensaio preliminar simples.1.4.1. Método de eluição em colunaEste método baseia-se na eluição de uma substância a testar com água numa microcoluna a qual é carregada com um material de suporte inerte tal como esferas de vidro ou areia cobrido com um excesso da substância a testar. Determina-se a solubilidade em água quando a concentração de massa do eluido é constante. Esta situação corresponde a um nível constante de concentração em função do tempo.1.4.2. Método do balãoDe acordo com este método, dissolve-se a substância (os sólidos devem ser pulverizados) em água a uma temperatura ligeiramente superior à temperatura do teste. Ao atingir-se a saturação arrefece-se a mistura e mantém-se à temperatura de ensaio, agitando enquanto for necessário para alcançar o equilíbrio. Em alternativa pode efectuar-se a medição directamente à temperatura de ensaio, desde que se garanta por amostragem adequada que se atingiu o equilíbrio na saturação. Posteriormente determina-se por um método analítico adequado à concentração de massa da substância na solução aquosa, a qual não deve conter quaisquer partículas não dissolvidas.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE1.5.1. RepetitividadePara o método de eluição em coluna pode obter-se um resultado  3% por  C), dever-se-á efectuar ensaios para dois outros valores diferentes de temperatura, pelo menos 10  C acima e abaixo da temperatura escolhida. Neste caso, o controlo de temperatura deverá ser da ordem de ± 0,1  C. A temperatura escolhida deverá ser mantida constante em todas as partes relevantes do equipamento.1.6.2. Teste preliminarA uma quantidade aproximadamente de 0,1 g de amostra (as substâncias sólidas deverão ser pulverizadas) colocada numa proveta graduada de 10 ml, com rolha de vidro, adicionam-se volumes crescentes de água destilada à temperatura ambiente, de acordo com a progressão indicada no quadro a seguir:>POSIÇÃO NUMA TABELA>Após cada adição da quantidade de água indicada, agita-se vigorosamente a mistura durante 10 minutos e verifica-se visualmente a existência de quaisquer partes não dissolvidas da amostra. Se após a adição de 10 ml de água a amostra ou partes dela permanecerem por dissolver, é necessário repetir a experiência numa proveta graduada de 100 ml com maiores volumes de água. Para valores inferiores de solubilidade o tempo necessário para dissolver uma substância pode ser consideravelmente mais longo (dever-se-á esperar pelo menos 24 horas). A solubilidade aproximada é dada na tabela anterior relativamente ao volume de água adicionada para o qual ocorre a dissolução completa da amostra. No caso de a substância continuar aparentemente insolúvel, será necessário esperar mais do que 24 horas (96 horas no máximo) ou deverá ser experimentada outra diluição para determinar se deve ser utilizado o método de eluição em coluna ou o método da solubilidade em balão.1.6.3. Método de eluição em coluna1.6.3.1. Material de suporte, solvente e eluenteO material de suporte para o método de eluição em coluna deverá ser inerte. Os materiais que podem ser utilizados são as esferas de vidro e a areia e deverá ser utilizado um solvente volátil adequado, de qualidade analítica, para se aplicar a substância a testar ao material de suporte. Poder-se-á utilizar como eluente água, bidestilada num aparelho de quartzo ou de vidro.Nota:Não deve ser utilizada água proveniente directamente de um permutador de iões orgânicos.1.6.3.2. Carga do suportePesa-se aproximadamente 600 mg de material de suporte e transfere-se para um balão de fundo redondo de 50 ml.Dissolve-se no solvente escolhido uma quantidade determinada e adequada da substância a testar. Adiciona-se ao material de suporte uma quantidade apropriada desta solução. O solvente deve ser completamente evaporado, por exemplo, num evaporador rotativo; caso contrário não se conseguirá a saturação do suporte com água, devido a efeitos de repartição que ocorrem na superfície do material de suporte.A colocação da carga no material de suporte pode originar problemas (resultados errados) se a substância a testar se depositar como um óleo ou como uma fase cristalina diferente. O problema deverá ser examinado experimentalmente e os pormenores deverão constar do relatório.Deixar que o material de suporte assim carregado fique embebido, durante aproximadamente 2 horas, em cerca de 5 ml de água e depois transfere-se a suspensão para a microcoluna. Em alternativa, o material de suporte carregado e seco pode ser vertido na microcoluna a qual foi previamente cheia com água e depois deixa-se estabelecer o equilíbrio, durante aproximadamente 2 horas.Procedimento de ensaio:A eluição da substância a partir do material de suporte pode ser efectuada recorrendo a uma de duas vias diferentes:- bomba de recirculação (ver figura 1),- reservatório de nível (ver figura 4).1.6.3.3. Método de eluição em coluna com bomba de recirculaçãoAparelhoA figura 1 representa uma disposição esquemática de um sistema típico. A figura 2 representa uma microcoluna adequada embora sejam aceitáveis outras dimensões, desde que fiquem satisfeitos os critérios de reprodutividade e de sensibilidade. A coluna deverá dispor de um espaço superior correspondente a pelo menos cinco vezes o volume base de água e deverá ser capaz de conter um mínimo de cinco amostras. Em alternativa, poder-se-á reduzir as dimensões no caso de se utilizar um solvente de constituição para substituir os cinco volumes de base iniciais removidos com as impurezas.A coluna deverá ser ligada a uma bomba de recirculação susceptível de controlar fluxos aproximadamente à razão de 25 ml/hora. A ligação da bomba é feita com tubos de politetrafluoro-etileno (PTFE) e/ou tubos de vidro. A coluna e a bomba, quando ligadas, deverão permitir a amostragem do efluente e o equilíbrio da parte superior à pressão atmosférica. O material da coluna é suportado com um pequeno tampão (5 mm) de lã de vidro, o qual serve também para filtrar partículas. A bomba de recirculação pode ser, por exemplo, uma bomba peristáltica ou uma bomba de membrana (é necessário tomar precauções para que não haja contaminação e/ou adsorção com o material do tubo).Procedimento de mediçãoInicia-se o fluxo através da coluna. Recomenda-se a utilização de um débito de aproximadamente 25 ml/hora (isto corresponde a 10 volumes de base/hora para a coluna descrita). Os primeiros cinco volumes de base (mínimo) são eliminados para remoção das impurezas solúveis em água. Depois disto deixa-se a bomba de recirculação funcionar até que o equilíbrio fique estabelecido, conforme definido por cinco amostras sucessivas cujas concentrações não difiram mais do que ± 30 % numa observação aleatória. As amostras deverão ser separadas umas das outras por intervalos de tempo correspondentes à passagem do eluente de pelo menos 10 volumes de enchimento da coluna.1.6.3.4. Método de eluição em coluna com reservatório de nivelamentoAparelho (ver figuras 4 e 3)Reservatório de nivelamento: A ligação ao reservatório de nivelamento faz-se utilizando uma junta de vidro esmerilado à qual é ligado um tubo de politetrafluoretileno (PTFE). Recomenda-se a utilização de um débito de aproximadamente 25 ml/hora. As fracções sucessivas de eluido deverão ser recolhidas e analisadas pelo método escolhido.Procedimento de mediçãoUtilizam-se as fracções da zona média da eluição em que as concentrações são constantes (± 30 %) em pelo menos cinco fracções consecutivas, para se determinar a solubilidade em água.Em ambos os casos (utilizando uma bomba de recirculação ou um reservatório de nivelamento) dever-se-á fazer a verificação da presença de matéria coloidal nas fracções, pela observação da existência do efeito de Tyndall (dispersão de luz). A presença dessas partículas invalida os resultados, devendo os testes ser repetidos melhorando a acção de filtração da coluna.Deve registar-se o valor do pH de cada amostra. Dever-se-á efectuar uma segunda experiência à mesma temperatura.1.6.4. Método do balão1.6.4.1. AparelhoNo método do balão é necessário o material seguinte:- instrumentos e utensílios de vidro usais em laboratório,- um dispositivo adequado para a agitação de soluções sob condições de temperatura constante e controlada,- uma centrifugadora (de preferência com controlo termostático), se necessário para as emulsões, e- equipamento para determinação analítica.1.6.4.2. Procedimento de medição A partir dos testes preliminares estima-se a quantidade de material necessário para saturar o volume desejado de água. O volume necessário de água dependerá do método analítico e do intervalo de solubilidade. Pesam-se três porções de aproximadamente cinco vezes a quantidade anteriormente determinada de material, que se introduzem em três recipientes de vidro com rolhas de vidro (por exemplo, tubos de centrifugação, balões). Adiciona-se a cada recipiente o volume escolhido de água e fecham-se hermeticamente. Os recipientes fechados são depois agitados à temperatura de 30  C. (Deve utilizar-se um dispositivo de oscilação ou de agitação susceptível de funcionar a uma temperatura constante, por exemplo, um agitador magnético em banho-maria com termostato). Decorrido o período de um dia remove-se um dos recipientes e reequilibra-se durante 24 horas à temperatura de ensaio com agitação ocasional. O conteúdo do recipiente é depois submetido a centrifugação à temperatura de ensaio e determina-se a concentração do composto na fase aquosa límpida recorrendo a um método analítico adequado. Os outros dois recipientes são tratados de modo análogo, após o equilíbrio inicial à temperatura de 30  C durante dois e três dias, respectivamente. Se os resultados da concentração obtidos pelo menos com os dois últimos recipientes concordarem com a reprodutividade necessária, considera-se que o teste é satisfatório. Todo o teste deverá ser repetido, utilizando períodos de tempo de equilíbrio mais longos, se os resultados obtidos nos recipientes 1, 2 e 3 mostrarem uma tendência para valores crescentes.O procedimento de medição também pode ser efectuado sem pré-incubação à temperatura de 30  C. No sentido de se estimar a velocidade a que se estabelece o equilíbrio de saturação extraem-se amostras até que o tempo de agitação deixe de influenciar a concentração da solução a testar.Deve registar-se o valor do pH de cada amostra.1.6.5. AnáliseÉ preferível um método analítico específico de cada substância para estas determinações uma vez que pequenas quantidades de impurezas solúveis podem originar erros grandes na solubilidade medida. São exemplos desses métodos os seguintes: a cromatografia de gases ou de líquidos, os métodos de titulação, os métodos fotométricos, os métodos voltamétricos.2. RESULTADOS2.1. MÉTODO DA ELUIÇÃO EM COLUNADever-se-á calcular, para cada experiência, o valor médio dos resultados obtidos com pelo menos cinco amostras consecutivas, extraídos do patamar constante de saturação, o mesmo devendo ser feito para o desvio-padrão. Os resultados deverão ser apresentados em unidades de massa por volume de solução.Procede-se à comparação dos valores médios calculados relativamente a dois testes utilizando fluxos diferentes, devendo a sua repetitividade ser menor do que 30 %.2.2. MÉTODO DO BALÃODeverão ser apresentados os resultados individuais para cada um dos três recipientes e, admitindo-se que esses resultados são constantes (repetitividade menor do que 15 %), calcular-se-á a sua média e apresentar-se-á o resultado em unidades de massa por volume de solução. Isto pode exigir a reconversão de unidades de massa em unidades de volume, utilizando-se a densidade no caso da solubilidade ser muito elevada (> 100 gramas por litro).3. RELATÓRIOS3.1. MÉTODO DE ELUIÇÃO EM COLUNAO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- os resultados do teste preliminar,- a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- as concentrações individuais, os débitos e o pH de cada amostra,- as médias e os desvios padrão de pelo menos cinco amostras do patamar constante de saturação para cada experiência,- o valor médio de duas experiências sucessivas e aceitáveis,- a temperatura da água durante o processo de saturação,- o método de análise utilizado,- a natureza do material de suporte utilizado,- o processo de carga do material de suporte,- o solvente utilizado,- a evidência de qualquer instabilidade química da substância durante o teste e o método utilizado,- toda a informação relevante para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e estado físico da substância.3.2. MÉTODO DO BALÃOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- os resultados do teste preliminar,- a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- as determinações analíticas individuais e o valor médio no caso de se determinar mais do que um valor para cada recipiente,- o valor do pH de cada amostra,- a média dos valores para recipientes diferentes, que tenham estado em conformidade,- a temperatura do teste,- o método analítico utilizado,- evidência de qualquer instabilidade química da substância durante o teste e método utilizado,- toda a informação relevante para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado físico da substância.4. REFERÊNCIAS(1)  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.(2)  NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method(3)  NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask methodApêndiceFigura 1 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Método de eluição em coluna com bomba de recirculaçãoFigura 2 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Microcoluna tipo(Todas as dimensões estão em milímetros)Figura 3 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Microcoluna tipo(Todas as dimensões estão em milímetros)Figura 4 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Método de eluição em coluna com reservatório de nivelamento1 = Recipiente de nivelamento (por exemplo, frasco de 2,5 litros)2 = Coluna (ver figura 3)3 = Colector das fracções4 = Termóstato5 = Tubo de teflon6 = Rolha de vidro esmerilado7 = Tubo de água (entre o termóstato e a coluna, diâmetro interno: aproximadamente 8 mm)A.8 COEFICIENTE DE PARTIÇÃO 1. MÉTODOO método do «frasco agitado» descrito baseia-se na norma de ensaio da OCDE (1).1.1. INTRODUÇÃOÉ útil possuir informações preliminares sobre a fórmula estrutural, a constante de dissociação, a solubilidade em água, hidrólise, solubilidade em n-octanol e tensão superficial, da substância sujeita a este teste.As medições deverão ser efectuadas em substâncias ionizáveis apenas na sua forma não ionizada (ácido livre ou base livre) produzida pela utilização de um tampão apropriado cujo pH possua um valor de pelo menos uma unidade de pH abaixo (ácido livre) ou acima (base livre) do valor pK.Este método de ensaio engloba dois procedimentos separados - o método do frasco agitado e a cromatografia líquida de elevado rendimento (mais conhecida por «HPLC» ou High Performance Liquid Chromatography). O primeiro método aplica-se nos casos em que o valor log Poa (ver as definições mais adiante) se encontra no intervalo entre  2 e 4 e o outro método aplica-se nos casos em que aquele valor está compreendido entre 0 e 6. Antes de se executar qualquer dos procedimentos experimentais dever-se-á obter primeiro uma estimativa preliminar do coeficiente de partição.O método do frasco agitado aplica-se apenas a substâncias essencialmente puras solúveis em água e em n-octanol. Não é aplicável aos materiais tensioactivos (para os quais deverá ser obtido o valor calculado ou uma estimativa com base nas solubilidades individuais em n-octanol e em água).O método de HPLC não se aplica a bases e ácidos fortes, a complexos de metais, a materiais tensioactivos ou a substâncias que reajam com o eluente. Para estes materiais deverá ser obtido um valor calculado ou uma estimativa, tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em água.O método de HPLC é menos sensível à presença de impurezas do que o método do frasco agitado. Contudo, em alguns casos as impurezas podem tornar difícil a interpretação de resultados devido ao facto de se tornar incerta a determinação dos picos. Para misturas que originem uma banda não resolvida deverão ser especificados os limites inferior e superior de log P.1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADESDefine-se o coeficiente de partição (P) como sendo a razão entre as concentrações de equilibrio (Ci) de uma substância dissolvida num sistema de duas fases, constituido por dois solventes claramente imiscíveis.No caso do n-octanol e da água temos:Poa = cn-octanolcáguaEm consequência, o coeficiente de partição (P) é o quociente entre duas concentrações e é dado vulgarmente na forma do seu logarítmo de base 10 (log P).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIAMétodo do frasco agitadoNão é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.Método de HPLCNo sentido de se estabelecer uma correlação entre os dados de HPLC medidos para um determinado composto com o seu valor P, torna-se necessário estabelecer um gráfico de calibração de log P em função dos dados cromatográficos utilizando pelo menos 6 pontos de referência. É deixado ao arbítrio do utilizador seleccionar as substâncias de referência apropriadas. Sempre que possível, pelo menos uma substância de referência deverá possuir um valor Poa superior, e outra um valor Poa inferior ao da substância a testar. Para valores de log P inferiores a 4, a calibração pode-se basear nos dados obtidos pelo método do frasco agitado. Para valores de log P superiores a 4, a calibração pode-se basear em valores calibrados e publicados em diversa literatura se esses valores estiverem em conformidade com os valores calculados. Para se conseguir melhor precisão é preferível escolher substâncias de referência cuja estrutura química esteja relacionada com a da substância a testar.Existem disponíveis listagens extensivas de valores de log Poa para muitos grupos de compostos químicos (2)(3). No caso dos dados sobre os coeficientes de partição dos compostos estruturalmente afins não se encontrarem disponíveis, pode-se utilizar então uma calibração mais geral estabelecida com outros compostos de referência.No apêndice 2 apresenta-se uma listagem de substâncias de referência recomendadas e seus valores Poa.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO1.4.1. Método do frasco agitadoNo sentido de se determinar um coeficiente de partição, torna-se necessário conseguir o equilíbrio entre todos os componentes do sistema que actuam entre si e devem-se determinar as concentrações das substâncias dissolvidas nas duas fases. Um estudo publicado na literatura relativa a este assunto indica que é possível utilizar diversas técnicas diferentes para resolução deste problema, isto é, a mistura perfeita das duas fases seguindo-se a sua separação, no sentido de se determinar a concentração de equilíbrio para a substância que se pretende examinar.1.4.2. Método de HPLCEfectua-se o HPLC em colunas analíticas carregadas com uma fase sólida comercialmente disponível contendo hidrocarbonetos de cadeia longa (por exemplo C8, C18) quimicamente ligados à silica. Os compostos químicos injectados nessa coluna movem-se através dela a velocidades diferentes devido aos diferentes graus de partição entre a fase móvel e a fase estacionária do hidrocarboneto. As misturas de compostos químicas são eluídas por ordem da sua hidrofobicidade, sendo eluídos primeiro os compostos químicos solúveis em água e depois os compostos químicos solúveis em óleo, proporcionalmente ao seu coeficiente de partição entre hidrocarboneto e água. Isto permite estabelecer uma relação entre o tempo de retenção numa tal coluna (fase reversa) e o coeficiente de partição entre n-octanol/água. Deduz-se o coeficiente de partição a partir do factor de capacidade k, dado pela expressão:k = tR   toto na qual, tR = tempo de retenção da substância a testar e to = tempo médio que uma molécula de solvente necessita para passar através da coluna (tempo limite).Não são necessários métodos analíticos quantitativos e apenas é necessária a determinação dos tempos de eluição.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE1.5.1. RepetitividadeMétodo do frasco agitadoNo sentido de se garantir a exactidão do coeficiente de partição é necessário efectuar determinações em duplicado sob três condições de ensaio diferentes, podendo consequentemente alterar a quantidade de substância especificada e também a proporção entre os volumes de solvente. Os valores determinados do coeficiente de partição, expressos pelos seus logaritmos, deverão estar compreendidos num intervalo limitado por ± 0,3 unidades logarítmicas.Método de HPLCNo sentido de se aumentar a confiança da medição deverão ser efectuadas determinações em duplicado. Os valores de log P derivados das medições individuais deverão estar dentro de um intervalo limitado por ± 0,1 unidades logaritmicas.1.5.2. SensibilidadeMétodo do frasco agitadoDetermina-se o intervalo de medição do método pelo limite de detecção do procedimento analítico. Isto deverá permitir a determinação de valores log Poa no intervalo compreendido entre  2 e 4 (ocasionalmente, quando houver condições adequadas, este intervalo pode ser dilatado até valores de log Poa próximos de 5), quando a concentração do soluto em qualquer fase não for superior a 0,01 mol por litro.Método de HPLCO método de HPLC permite estimar os coeficientes de partição em termos de log Poa no intervalo 0 a 6.Normalmente o coeficiente de partição de um composto pode ser estimado a menos de ± 1 unidade logarítmica relativamente ao valor obtido pelo método do frasco agitado. Existem correlações típicas que é possível encontrar na literatura (4)(5)(6)(7)(8). Normalmente, pode-se conseguir uma precisão superior quando as curvas de correlação se baseiam em compostos de referência estruturalmente afins (9).1.5.3. EspecificidadeMétodo do frasco agitadoA Lei de Partição de Nernst aplica-se apenas quando os parâmetros temperatura, pressão e pH são constantes para soluções diluídas. Aplica-se estritamente a uma substância pura dispersa entre dois solventes puros. Se houver diversos solutos diferentes numa ou em ambas as fases simultâneamente, isto pode afectar os resultados.A dissociação ou a associação das moléculas dissolvidas provoca desvios em relação à Lei de Partição de Nernst. Esses desvios são indicados pelo facto do coeficiente de partição se tornar dependente da concentração da solução.Devido à existência de múltiplos estados de equilíbrio, este método não deve ser aplicado a compostos ionizáveis sem se aplicar uma correcção. Deve-se tomar em consideração a utilização de soluções tampão em vez de água para esses compostos; o valor do pH da solução tampão deverá ser pelo menos uma unidade de pH afastada do valor pKa da substância e deve-se ter sempre presente a relevância desse valor de pH para o ambiente.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. Estimativa preliminar do coeficiente de partiçãoEfectua-se uma estimativa do coeficiente de partição utilizando preferencialmente um método de cálculo (ver apêndice 1) ou, se for apropriado, recorrendo à razão entre solubilidades da substância a testar nos solventes puros (10).1.6.2. Método do frasco agitado1.6.2.1. Preparaçãon-octanol: a determinação do coeficiente de partição deverá ser efectuada com um reagente de qualidade analítica de elevada pureza.Água: deve-se utilizar água destilada ou bidestilada num aparelho de vidro ou de quartzo. Para os compostos ionizáveis dever-se-á utilizar soluções tampão em vez de água, se tal se justificar.Nota:Não deve ser utilizada água obtida directamente a partir de um permutador iónico.1.6.2.1.1. Pré-saturação dos solventesAntes de se determinar um coeficiente de partição as fases do sistema solvente são mutuamente saturadas por agitação à temperatura da experiência. Para se conseguir isto, é prática corrente agitar dois frascos grandes contendo água ou n-octanol de qualidade analítica, contendo cada um deles uma quantidade suficiente do outro solvente, durante um período de 24 horas, num agitador mecânico, e deixando-os depois em repouso durante um período de tempo suficiente para permitir a separação de fases e para se conseguir um estado de saturação.1.6.2.1.2. Preparação para o ensaioO volume total do sistema bifásico deverá encher quase completamente o recipiente de ensaio. Isto auxiliará a evitar as perdas de material por volatilização. A razão volumétrica e as quantidades de substância a utilizar são fixadas pelos factores seguintes:- avaliação preliminar do coeficiente de partição (ver supra),- a quantidade mínima da substância a testar necessária para o procedimento analítico e- a limitação de uma concentração máxima, em qualquer das fases, no valor de 0,01 mol por litro.Efectuam-se três testes. No primeiro utiliza-se a razão volumétrica calculada entre n-octanol e a água; no segundo divide-se essa razão por dois e no terceiro multiplica-se essa razão por dois (por exemplo, 1:1, 1:2, 2:1).1.6.2.1.3. Substância a testarPrepara-se uma solução em n-octanol pré-saturado com água. A concentração desta solução deverá ser determinada com exactidão antes de se utilizar na determinação do coeficiente de partição. Esta solução deverá ser guardada em condições que assegurem a sua estabilidade.1.6.2.2. Condições de ensaioA temperatura de ensaio deverá ser mantida constante (± 1  C) e estar compreendida no intervalo entre 20 e 25  C.1.6.2.3. Procedimento de medição1.6.2.3.1. Estabelecimento do equilíbrio de partiçãoPara cada uma das condições de ensaio dever-se-á preparar recipientes de ensaio em duplicado, contendo as quantidades necessárias, medidas com exactidão, dos dois solventes em conjunto com a quantidade necessária da solução referida. Deve-se medir o volume das fases de n-octanol. Os recipientes de ensaio deverão ser colocados num agitador adequado ou em alternativa deverão ser agitados manualmente. Quando se usa um tubo de centrifugação, o método recomendado consiste em rodar o tubo rapidamente 180  em torno do seu eixo transversal, de modo que qualquer bolha de ar que esteja presa se movimente através das duas fases. A experiência demonstrou que 50 rotações deste tipo são normalmente suficientes para se estabelecer o equilíbrio de partição. Para melhor garantia, recomenda-se a execução de 100 rotações em 5 minutos.1.6.2.3.2. Separação de fasesSempre que necessário, no sentido de se efectuar a separação de fases, dever-se-á efectuar a centrifugação da mistura. Isto deverá ser feito numa centrifugadora de laboratório mantida à temperatura ambiente ou, no caso de se utilizar uma centrifugadora de temperatura não controlada, os tubos de centrifugação deverão ser mantidos, por razões de equilíbrio, à temperatura de ensaio durante pelo menos 1 hora antes da análise.1.6.2.4. AnálisePara a determinação do coeficiente de partição é necessário determinar as concentrações da substância a testar em ambas as fases. Isto pode ser feito extraindo uma quantidade alíquota de cada uma das duas fases a partir de cada um dos tubos, de cada uma das séries de ensaio, procedendo depois à sua análise de acordo com o procedimento escolhido. Deve-se calcular a quantidade total de substância presente em ambas as fases e efectuar-se-á a comparação com a quantidade de substância originalmente introduzida.Deverá ser extraída uma amostra da fase aquosa recorrendo a um procedimento que minimize o risco de introduzir vestígios de n-octanol: pode-se utilizar uma seringa de vidro com uma agulha removível para extrair uma amostra da fase aquosa. A seringa deverá estar, de início, parcialmente cheia com ar. O ar deverá ser expelido suavemente enquanto se introduz a agulha através da camada de n-octanol. Retira-se com a seringa um volume adequado de fase aquosa. Remove-se a seringa rapidamente da solução e separa-se a agulha. O conteúdo da seringa pode ser utilizado depois como amostra aquosa. A concentração das duas fases separadas deverá ser determinada preferencialmente recorrendo a um método específico da substância. Como exemplos de métodos analíticos considerados apropriados faz-se referência aos seguintes:- métodos fotométricos,- cromatografia gasosa,- cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC).1.6.3. Método de HPLC1.6.3.1. PreparaçãoAparelhoÉ necessário um cromatógrafo líquido equipado com uma bomba de pulsação livre e um dispositivo de detecção adequado. Recomenda-se a utilização de uma válvula de injecção com ciclos de injecção. A presença de grupos polares na fase estacionária pode prejudicar gravemente os resultados da coluna de HPLC. Em consequência, as fases estacionárias deverão possuir uma percentagem mínima de grupos polares (11). Podem-se utilizar colunas pré-carregadas ou cargas de fase reversa de micropartículas disponíveis comercialmente. Pode-se interpor uma coluna de protecção entre o sistema de injecção e a coluna analítica.Fase móvelUtiliza-se metanol e água de qualidade apropriada para HPLC, para a preparação do solvente de eluição, o qual é desgasificado antes da utilização. Deve-se utilizar uma eluição isocrática. Dever-se-á utilizar proporções metanol/água com um teor mínimo de água de 25%. Normalmente, é satisfatória a proporção de 3:1 (v/v) para a mistura de metanol/água para se efectuar a eluição de compostos de log P 6 ao fim de uma hora para um débito de 1 mililitro porminuto. Para os compostos com um valor log P elevado pode ser necessário reduzir o tempo de eluição (e também para os compostos de referência) diminuindo a polaridade da fase móvel ou o comprimento da coluna.As substâncias com muito fraca solubilidade em n-octanol tendem a originar valores de log Poa anormalmente baixos quando se utiliza o método de HPLC; os picos desses compostos acompanham frequentemente a frente do solvente. Isto deve-se provavelmente ao facto de o processo de partição ser muito lento não se atingindo o equilíbrio no tempo normalmente necessário para uma separação por HPLC. Consequentemente, a diminuição do débito e/ou a diminuição da proporção metanol/água pode ser eficaz para se atingir um valor de confiança.Os compostos de ensaio e de referência deverão ser solúveis na fase móvel em concentrações suficientes para permitirem as suas detecções. Apenas em casos excepcionais será aceitável adicionar aditivos à mistura de metanol/água, uma vez que esses aditivos irão modificar as propriedades da coluna. Para as cromatografias com aditivos é obrigatório utilizar uma coluna separada do mesmo tipo. No caso de a mistura metanol/água não ser apropriada é possível utilizar outras misturas de solvente orgânico/água, por exemplo, etanol/água ou acetonitrilo/água.O pH do eluente constitui um parâmetro crítico para os compostos ionizáveis. Aquele valor deverá estar compreendido no intervalo de valores de pH de funcionamento da coluna, sendo esse intervalo normalmente compreendido entre 2 e 8. Recomenda-se a utilização de uma mistura tampão. É necessário tomar precauções para evitar a precipitação de sal e a deterioração da coluna cuja ocorrência é possível com algumas misturas de fase orgânica/tampão. As mediçoes por HPLC com fases estacionárias à base de sílica, para valores de pH superiores a 8, não são aconselháveis uma vez que a utilização de uma fase móvel alcalina pode provocar a deterioração rápida do funcionamento da coluna.SolutosOs compostos de referência deverão possuir a maior pureza possível. Os compostos destinados a serem utilizados para efeitos de ensaio ou calibração são dissolvidos na fase móvel, se possível.Condições de ensaioDurante as medições a temperatura não deverá variar ± 2 K.1.6.3.2. MediçãoCálculo do tempo limite toO tempo limite to pode ser determinado utilizando em alternativa uma série homóloga (por exemplo, n-alquil-metil-cetonas) ou compostos orgânicos não retidos (por exemplo, tioureia ou formamida). Para se calcular o tempo limite to utilizando uma série homóloga, injecta-se um conjunto de pelo menos 7 componentes de uma série homóloga e procede-se à determinação dos respectivos tempos de retenção. Elabora-se um gráfico dos tempos de retenção tr(nc + 1) em função de tr(nc) e procede-se à determinação da ordenada a na origem e do declive b, através da equação de regressão:tr(nc + 1) = a + b tr(nc)(nc = número de átomos de carbono). O tempo limite to é dado pela equação:to = a / (1   b))Gráfico de calibraçãoO passo seguinte consiste em construir a curva de correlação de log k em função de log P para os compostos de referência apropriados. Na prática, efectua-se a injecção simultânea, de um conjunto compreendido entre 5 e 10 compostos de referência padrão cujo valor log P seja próximo do valor esperado e procede-se à determinação dos tempos de retenção, utilizando preferencialmente um integrador de registo ligado ao sistema de detecção. Procede-se ao cálculo dos logaritmos correspondentes dos factores de capacidade, log k, e traça-se uma curva em função do valor log P determinado pelo método do frasco agitado. Efectua-se a calibração a intervalos regulares, pelo menos uma vez diariamente, de modo a poder fazer a compensação das possíveis variações na evolução da coluna.Determinação do factor de capacidade da substância de ensaioInjecta-se a substância de ensaio numa quantidade da fase móvel tão pequena quanto possível. Determina-se o tempo de retenção (em duplicado), permitindo o cálculo do factor k de capacidade. A partir do gráfico de correlação dos compostos de referência, pode-se fazer uma interpolação para determinação do coeficiente de partição da substância de ensaio. Para coeficientes de partição muito baixos ou muito elevados é necessária a extrapolação. Nesses casos particulares é necessário tomar precauções relativamente aos limites de confiança da curva de regressão.2. RESULTADOSMétodo do frasco agitadoPode-se testar a fiabilidade dos valores de P determinados efectuando a comparação das médias das determinações em duplicado com a média geral.3. RELATÓRIOunto à O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- no caso de os métodos não serem aplicáveis (por exemplo, material tensioactivo), apresentar-se-á um valor calculado ou uma estimativa tomando como base as solubilidades individuais em n-octanol e em água,- todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e ao estado físico da substância.Para o caso do método do frasco agitado:- o resultado da estimativa preliminar, se existir,- temperatura da determinação,- dados relativos aos procedimentos analíticos utilizados na determinação das concentrações,- tempo e velocidade de centrifugação, se for caso disso,- concentrações medidas de ambas as fases para cada determinação (significa isto que deverão ser descritas 12 concentrações na totalidade),- o peso da substância de ensaio, o volume de cada fase utilizada em cada recipiente de ensaio e a quantidade total calculada de substância de ensaio presente em cada fase após se atingir o equilíbrio,- para cada conjunto de condições de ensaio deverão ser indicados os valores calculados do coeficiente de partição (P) e o valor médio, devendo-se indicar igualmente a média para todas as determinações. No caso de haver indícios de dependência da concentração relativamente ao coeficiente de partição, esse facto deverá constar do relatório,- deve-se referir o desvio padrão dos valores P individuais relativamente à sua média,- o valor médio de P correspondente a todas as determinações deve ser expresso também na forma logarítmica (base 10),- o valor teórico Poa calculado no caso de se ter feito a determinação desse valor ou quando o valor medido for > 104,- os valores de pH da água utilizada e da fase aquosa durante a experiência,- no caso de se ter recorrido à utilização de tampões, o relatório deverá conter justificação da utilização desses tampões em vez de água, a sua composição, a sua concentração e os valores de pH e também os valores de pH da fase aquosa antes e após a experiência.Para o caso do método de HPLC:- o resultado da estimativa preliminar, se existir,- substâncias de ensaio e de referência e sua pureza,- intervalo de temperaturas das determinações,- os valores de pH para os quais foram feitas as determinações,- pormenores sobre a coluna analítica e sobre a coluna de protecção, fase móvel e meios de detecção,- dados de retenção e valores de log P encontrados na literatura para os compostos de referência utilizados na calibração,- pormenores sobre a linha de regressão ajustada (log k em função de log P),- dados de retenção média e valor de log P interpolado para o composto de ensaio,- descrição do equipamento e condições de funcionamento,- perfil de eluição,- quantidades das substâncias de ensaio e de referência introduzidas na coluna,- tempo limite e método para a sua medição.4. REFERÊNCIAS(1)  OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.(2)  C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.(3)  Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) - Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.(4)  L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemosphere, 1980, vol. 80, 683.(5)  H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, 219 (1981).(6)  B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.(7)  W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.(8)  J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 675.(9)  S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 15, 787.(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, 223-339.(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, vol. 14, 479.(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, Amsterdam, 1977.(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial use - Determination of partition coefficient - Flask shaking method.(15) C.V. Eadsforth and P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459,(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525,(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci Technol., 1974, vol. 8, 1113.(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 382,(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1979.(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Amsterdam, 1984,(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New York, Basel, 1978.(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor, J. Med. Chem., 1976, vol. 19, 615.Apêndice 1Métodos de cálculo/estimaçãoINTRODUÇÃONa publicação «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (a) encontra-se uma introdução geral aos métodos de cálculo, dados e exemplos.É possível utilizar os valores calculados de Poa:- para se decidir qual dos métodos experimentais é apropriado (gama de utilização para o frasco agitado: log Poa:  2 a 4, gama de HPLC: log Poa: 0 a 6),- para selecção das condições de ensaio apropriadas (por exemplo, substâncias de referência para os procedimentos de HPLC, relação volumétrica n-octanol/água para o método do frasco agitado),- como verificação interna laboratorial sobre possíveis erros experimentais,- para se obter um valor estimado de Poa no caso em que os métodos experimentais não podem ser aplicados por razões técnicas.MÉTODO DE ESTIMAÇÃOEstimativa preliminar do coeficiente de partiçãoPode-se estimar o valor do coeficiente de partição conhecendo as solubilidades da substância de ensaio em solventes puros, utilizando a equação:Pestimado = saturação cn-octanolsaturação cáguaMÉTODOS DE CÁLCULOPrincípio dos métodos de cálculoTodos os métodos de cálculo se baseiam na fragmentação formal da molécula em subestruturas adequadas para as quais sejam conhecidos valores dos fragmentos de log Poa. Calcula-se depois o valor log Poa da molécula inteira como sendo a soma dos correspondentes valores dos seus fragmentos mais a soma dos termos de correção, para as interacções intramoleculares.Existem disponíveis listas de constantes dos fragmentos e dos termos de correlação (b)(c)(d)(e). Algumas são actualizadas regularmente (b).Critérios de qualidadeDe um modo geral, a fiabilidade do método de cálculo diminui com a complexidade crescente do composto submetido a estudo. No caso de moléculas simples com baixo peso molecular e com um ou dois grupos funcionais admite-se um desvio compreendido entre 0,1 e 0,3 unidades de log Poa entre os resultados obtidos com diferentes métodos de fragmentação e o valor medido. No caso das moléculas mais complexas a margem de erro pode ser superior. Isto dependerá da fiabilidade e da disponibilidade de constantes dos fragmentos e também da capacidade para identificar interacções intramoleculares (por exemplo, ligações de hidrogénio) e para utilizar correctamente os termos de correcção (este problema pode ser minimizado utilizando a aplicação informática CLOGP-3) (b). No caso dos compostos ionizantes é importante tomar em consideração correctamente a carga e o grau de ionização.Procedimentos de cálculoMétodo ð de HanschA constante do substituinte hidrofóbico original, ð, introduzida por Fujita et al. (f), define-se do modo seguinte:px = log Poa (PhX)   log Poa (PhH)em que Poa (PhX) representa o coeficiente de partição de um derivado aromático e Poa (PhH) representa o coeficiente de partição do composto original(por exemplo: pCl= log Poa (C6H5Cl)   log Poa (C6H6)= 2,84   2,13 = 0,71).De acordo com esta definição o método ð é aplicável essencialmente nos casos de substituição aromática. Os valores  ð para um grande número de substituintes encontram-se em tabelas (b)(c)(d) e são utilizados para o cálculo dos valores log Poa de subestruturas ou moléculas aromáticas.Método de RekkerDe acordo com Rekker (g) o valor de log Poa calcula-se do modo seguinte:log Poa = Siai fi + Sj (termos de interacção)em que fi representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares e ai representa a frequência da sua ocorrência na molécula sujeita a investigação. Os termos de correcção podem ser expressos na forma de um integral múltiplo de uma única constante Cm (designada por «constante mágica»). As constantes dos fragmentos fi e Cm foram determinadas a partir de uma listagem de 1 054 valores experimentais de Poa (825 compostos) utilizando análise de regressão múltipla (c)(h). A determinação dos termos de interacção efectua-se de acordo com regras consagradas descritas na literatura (e)(h)(i).Método de Hansch-LeoDe acordo com Hansch e Leo (c) calcula-se o valor de log Poa de acordo com a equação:log Poa = Siai fi + Sj bj Fjem que fi representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares, Fj representa os termos de correcção e ai e bj representam as correspondentes frequências de ocorrência. Por aproximações sucessivas determinou-se, a partir dos valores experimentais de Poa, uma listagem de valores de fragmentos atómicos e de grupos e uma listagem dos termos de correcção Fj (designados «factores»). Os termos de correcção foram ordenados segundo diversas classes diferentes (a)(c). É relativamente complicado e moroso levar em consideração todas as regras e termos de correcção. Existem disponíveis diversas aplicações informáticas (b).Método combinadoO cálculo dos valores log Poa de moléculas complexas pode ser consideravelmente aperfeiçoado, se a molécula for cindida em subestruturas para as quais se encontrem disponíveis valores fiáveis de log Poa, tanto a partir de tabelas (b)(c) como a partir das medições do próprio investigador. Esses fragmentos (por exemplo, heterociclos, antraquinona, azobenzeno) podem ser combinados depois com os valores ã segundo Hansch ou com as constantes dos fragmentos segundo Rekker ou Leo.Observaçõesi) Os métodos de cálculo apenas podem ser aplicados a compostos parcial ou totalmente ionizados no caso de ser possível tomar em consideração os necessários factores de correcção;ii) No caso de se admitir a existência de ligações intramoleculares entre átomos de hidrogénio é necessário adicionar (a) os correspondentes termos de correcção (aproximadamente + 0,6 a +1,0 unidades log Poa). As indicações para a presença dessas ligações podem ser obtidas a partir de modelos espaciais ou a partir de dados espectroscópicos da molécula;iii) No caso de serem possíveis diversas formas tautoméricas, deve-se utilizar a forma mais provável como base de cálculo;iv) As revisões das listagens de constantes de fragmentos deverão ser acompanhadas cuidadosamente.RelatórioNo caso de se utilizar métodos de cálculo/estimação o relatório do ensaio deverá, se possível, conter a informação seguinte:- descrição da substância (mistura, impurezas, etc.),- indicação de quaisquer possíveis ligações intramoleculares entre átomos de hidrogénio, dissociação, carga e quaisquer outros efeitos extraordinários (por exemplo, tautomerismo),- descrição do método de cálculo,- identificação ou fonte da base de dados,- peculiaridades na escolha dos fragmentos,- documentação compreensiva relativa aos cálculos.BIBLIOGRAFIA(a)  W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.(b)  Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).(c)  C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.(d)  A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.(e)  R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. - Chim. Ther. 1979, vol. 14, 479.(f)  T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.(g)  R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.(h)  C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12 1459.(i)  R.A. Scherrer, ACS - American Chemical Society, Washington D.C., 1984, Symposium Series 255, p. 225.Apêndice 2>POSIÇÃO NUMA TABELA>A.9. PONTO DE INFLAMAÇÃO 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOÉ útil possuir informação preliminar sobre a inflamabilidade da substância antes de se efectuar este ensaio. O procedimento de ensaio aplica-se a substâncias líquidas cujos vapores possam ser inflamados por fontes de ignição. Os métodos de ensaio enumerados neste texto são apenas fiáveis para os intervalos de pontos de inflamação especificados nos métodos individuais.Deve tomar-se em consideração a possibilidade de ocorrência de reacções químicas entre a substância e o suporte da amostra quando se selecciona o método a utilizar.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESO ponto de inflamação é a menor temperatura, corrigida para a pressão de 101,325 kPa, à qual um líquido liberta vapores, sob as condições definidas no método de ensaio, numa quantidade tal que se produz no recipiente de ensaio uma mistura ar/vapor inflamável.Unidades:  Ct = T   273,15(t em  C e T em K)1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, as características de execução do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODOColoca-se a substância no recipiente de ensaio e aquece-se ou arrefece-se até à temperatura de ensaio de acordo com o procedimento descrito no método de ensaio individual. Efectuam-se diversas tentativas para provocar a ignição no sentido de se determinar se a amostra é ou não é inflamável à temperatura de ensaio.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE1.5.1. RepetitividadeA repetitividade varia de acordo com o intervalo de pontos de inflamação e com o método de ensaio utilizado; máximo 2  C.1.5.2. SensibilidadeA sensibilidade depende do método de ensaio utilizado.1.5.3. EspecificidadeA especificidade de alguns métodos de ensaio está limitada a certos intervalos de pontos de inflamação e sujeita a dados associados à substância (v.g. viscosidade elevada).1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. PreparaçõesColoca-se uma amostra da substância de ensaio num aparelho de teste de acordo com 1.6.3.1. e/ou 1.6.3.2.. Por razões de segurança recomenda-se que no caso das substância energéticas ou tóxicas se pratique um método que utilize uma pequena quantidade de amostra, cerca de 2 cm3.1.6.2. Condições de ensaioTanto quanto for possível por razões de segurança, o aparelho deverá ser colocado numa posição livre de correntes de ar.1.6.3. Realização do ensaio1.6.3.1. Método de equilíbrioVer ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.1.6.3.2. Método de não equilíbrioAparelho de Abel:Ver BS 2000 parte 170, NF M07-011, NF T66-009.Aparelho de Abel-Pensky:Ver EN 57, DIN 51755 parte 1 (para temperaturas entre 5 e 65  C), DIN 51755 parte 2 (para temperaturas inferiores a 5  C), NF M07-036.Aparelho de Tag:Ver ASTM D 56.Aparelho de Pensky-Martens:Ver ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF M07-019.Observações:No caso de se verificar que o ponto de inflamação, determinado por um método de não equilíbrio em 1.6.3.2., possui os valores 0 ± 2  C, 21 ± 2  C ou 55 ± 2  C, deve fazer-se a sua confirmação recorrendo a um método de equilíbrio que utilize o mesmo aparelho.Apenas os métodos que possam proporcionar os valores de temperatura do ponto de inflamação podem ser utilizados para uma notificação.Para se determinar o ponto de inflamação de líquidos viscosos (tintas, gomas e análogos) contendo solventes, apenas se pode utilizar aparelhos e métodos de ensaio adequados para a determinação dos pontos de inflamação de líquidos viscosos.Ver ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parte 1.2. RESULTADOS3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- deve especificar-se o método utilizado e bem assim quaisquer desvios possíveis,- os resultados e quaisquer observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.4. REFERÊNCIASNenhuma.A.10. INFLAMABILIDADE (SÓLIDOS) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOConsidera-se útil possuir informações preliminares sobre as propriedades potencialmente explosivas da substância antes de se efectuar este ensaio.Este ensaio apenas deverá ser aplicado a susbtâncias pulverulentas, granuladas ou pastosas.No sentido de não se incluírem todas as substâncias que podem ser inflamadas, mas apenas aquelas que ardem rapidamente ou aquelas cuja combustão é de alguma forma especialmente perigosa, apenas as susbtâncias cuja velocidade de combustão excede um determinado valor limite são consideradas altamente inflamáveis.Pode ser especialmente perigosa, qualquer situação em que a incandescência se propaga através de um metal em pó, devido às dificuldades em extinguir o fogo. Os pós de metais deverão ser considerados altamente inflamáveis se permitirem a propagação da incandescência através da sua massa, num intervalo de tempo específico.1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADESO tempo de combustão exprime-se em segundos.1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão especificadas.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODODispõe-se a substância numa fita inquebrável ou num rastilho de pó com aproximadamente 250 mm de comprimento e efectua-se um ensaio preliminar para se determinar se ao provocar-se a ignição com uma chama de gás existe propagação por combustão rápida ou por combustão lenta. Se ocorrer a propagação da combustão ao longo de 200 mm do rastilho no decurso de um intervalo específico de tempo, efectua-se seguidamente o programa de ensaio total para se determinar a velocidade de combustão.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENão especificados.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. Ensaio preliminarDispõe-se a substância numa fita inquebrável ou num rastilho de pó com aproximadamente 250 mm de comprimento por 20 mm de largura e por 10 mm de altura, sobre uma placa não combustível, não porosa e de fraca condutividade térmica. Aplica-se a uma extremidade do rastilho de pó uma chama de um queimador de gás (diâmetro mínimo de 5 mm) até o pó iniciar a ignição ou durante um período máximo de 2 minutos (5 minutos para pós de metais ou de ligas metálicas). Deve verificar-se se a combustão se propaga ao longo de 200 mm do rastilho no período de tempo do ensaio correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos para os pós de metais). No caso de a substância não se inflamar e não houver propagação de combustão quer por combustão viva quer por combustão lenta ao longo de 200 mm do rastilho de pó no período de ensaio correspondente a 4 minutos (ou 40 minutos), então a substância não deverá ser considerada altamente inflamável e não será necessário mais qualquer ensaio. Se a substância propagar a combustão ao longo de 200 mm do rastilho de pó em menos de 4 minutos ou em menos de 40 minutos no caso dos pós de metais, deve dar-se continuidade ao procedimento a seguir descrito (ponto 1.6.2 e seguintes).1.6.2. Ensaio da velocidade de combustão1.6.2.1. PreparaçãoEnche-se livremente com as substâncias pulverulentas ou granuladas um molde de 250 mm de comprimento com uma secção transversal triangular cuja altura interna é de 10 mm e cuja largura é de 20 mm. De ambos os lados do molde, segundo uma direcção longitudinal, faz-se a montagem de duas placas metálicas que constituem limitações laterais e as quais se projectam 2 mm para além da aresta superior da secção recta triangular (ver figura). Depois deixa-se cair o molde três vezes de uma altura de 2 cm sobre uma superfície sólida. Se necessário completa-se depois o enchimento do molde. Efectua-se depois a remoção das limitações laterais e retira-se o excesso de substância. Na parte superior do molde coloca-se uma placa não combustível, não porosa e de baixa condutividade térmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde.As substâncias pastosas são dispostas sobre uma placa não combustível, não porosa e de baixa condutividade térmica na forma de um cordão de 250 mm de comprimento possuindo uma secção transversal de aproximadamente 1 cm2.1.6.2.2. Condições de ensaioNo caso de se tratar de uma substância sensível à humidade o ensaio deverá ser efectuado tão rapidamente quanto possível após a sua remoção do recipiente.1.6.2.3. Realização do ensaioColoca-se a pilha numa zona de um sistema de exaustão de fumos.A velocidade do ar deverá ser suficiente para evitar que os fumos escapem para o interior do laboratório e não deverá variar durante o ensaio. Em torno do aparelho deverá ser instalada uma blindagem em forma de chaminé.Para iniciar a ignição da pilha numa das suas extremidades utiliza-se uma chama de um queimador de gás (diâmetro mínimo de 5 mm). Depois de a pilha ter ardido numa extensão de 80 mm, mede-se a velocidade de combustão nos 100 mm seguintes. Efectua-se o ensaio seis vezes, utilizando-se de cada vez uma placa fria limpa, a não ser que se observe um resultado positivo mais cedo.2. RESULTADOSO tempo de combustão determinado no ensaio preliminar (1.6.1) e o tempo mais curto de combustão observado nos seis ensaios (1.6.2.3) são relevantes para a avaliação.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- uma descrição da substância que se pretende ensaiar, o seu estado físico incluindo o teor em humidade,- os resultados do ensaio preliminar e do ensaio da velocidade de combustão, se tiverem sido efectuados,- todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOSAs substâncias pulverulentas, granuladas ou pastosas são consideradas altamente inflamáveis no caso de o tempo de combustão em quaisquer ensaios efectuados de acordo com o procedimento de ensaio descrito em 1.6.2. ser inferior a 45 segundos. Os pós de metais ou de ligas metálicas são considerados altamente inflamáveis no caso de poderem ser inflamados e de a chama ou a zona de reacção se propagar a toda a amostra em 10 minutos ou menos.4. REFERÊNCIAS(1) NF T 20-042 (SEPT. 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.Apêndice>INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Molde e acessórios para a preparação da pilha(Todas as dimensões estão em milímetros)A.11 INFLAMABILIDADE (GASES) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOEste método permite determinar se os gases misturados com ar à temperatura ambiente (cerca de 20  C) e à pressão atmosférica são inflamáveis e, em caso afirmativo, qual o intervalo de concentrações. As misturas de concentrações crescentes do gás com ar são expostas a uma faísca eléctrica e observa-se a eventual ocorrência de ignição.1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADESO intervalo de inflamabilidade é o intervalo de concentrações entre os limites inferior e superior de explosão. Os limites inferior e superior de explosão são os limites de concentração do gás inflamável misturado com ar para cujos valores não ocorre a propagação da chama.1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão especificadas.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODOAumenta-se gradualmente a concentração do gás em ar e expõe-se a mistura escalonadamente à acção de uma faísca eléctrica.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENão especificados.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. AparelhoO recipiente de ensaio é um cilindro de vidro colocado em posição vertical, possuindo um diâmetro interno mínimo de 50 mm e uma altura mínima de 300 mm. Os eléctrodos de ignição encontram-se separados por uma distância de 3 a 5 mm e estão colocados 60 mm acima do fundo do cilindro. O cilindro possui uma abertura para a libertação de pressão. O aparelho deve ser protegido por uma blindagem para minimizar quaisquer danos provocados pela explosão.Como fonte de ignição utiliza-se uma faísca de indução com a duração de 0,5 segundo, a qual é gerada por um transformador de alta tensão com uma tensão de saída compreendida entre 10 e 15 kV (potência máxima de entrada da ordem de 300 W). Na referência (2) encontra-se descrito um exemplo de um aparelho adequado.1.6.2. Condições de ensaioO ensaio deve ser efectuado à temperatura ambiente (cerca de 20  C).1.6.3. Realização do ensaioUtilizando bombas doseadoras introduz-se no cilindro de vidro uma concentração conhecida de gás em ar. Provoca-se uma faísca na mistura e verifica-se se ocorre ou não a existência de uma chama que se separa da fonte de ignição e se propaga independentemente. Faz-se variar a concentração do gás por escalões de 1 % em volume até que haja ocorrência de ignição conforme anteriormente descrito.No caso de a estrutura química do gás indicar que poderá ser eventualmente não inflamável e de se poder calcular a composição da mistura estequiométrica com ar, apenas será necessário ensaiar em escalões de 1 % misturas compreendidas no intervalo entre 10 % menos do que a composição estequiométrica e 10 % mais do que essa composição.2. RESULTADOSA ocorrência de propagação da chama é a única informação relevante para a determinação desta propriedade.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- uma descrição, com dimensões, do aparelho utilizado,- a temperatura a que se efectuou o ensaio,- as concentrações de ensaio e os resultados obtidos,- o resultado do ensaio: gás não inflamável ou gás altamente inflamável,- no caso de se ter concluído que o gás é não inflamável, deverá especificar-se então o intervalo de concentrações no qual foi ensaiado em escalões de 1 %,- toda a informação e observações relevantes para a interpretação dos resultados.4. REFERÊNCIAS(1)  NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.(2)  W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Redeker und H.Schacke. «Entwicklung einer Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol 56, 2, 126-127.A.12. INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM ÁGUA) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOEste método de ensaio pode ser utilizado para se determinar se a reacção de uma substância com água ou com ar húmido origina o desenvolvimento de quantidades perigosas de um gás ou de gases que possam ser altamente inflamáveis.O método de ensaio pode ser aplicado tanto a substâncias sólidas como a substâncias líquidas. Este método não é aplicável a substâncias cuja ignição seja espontânea quando em contacto com o ar.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESAltamente inflamável: substâncias que em contacto com água ou com ar húmido libertam gases altamente inflamáveis em quantidades perigosas numa proporção mínima de 1 litro/kg por hora.1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODOEnsaia-se a substância de acordo com os passos sequenciais adiante descritos: se ocorrer ignição em qualquer desses passos não é necessário continuar o ensaio. No caso de se saber já que a substância não reage violentamente com a água, prosseguir com o passo 4 (1.3.4.).1.3.1. Passo 1Coloca-se a substância de ensaio numa tina contendo água destilada à temperatura de 20  C e verifica-se se ocorre ou não o início da combustão do gás libertado.1.3.2. Passo 2Coloca-se a substância de ensaio sobre uma folha de papel de filtro flutuando sobre a superfície da água destilada contida num prato, à temperatura de 20  C, e observa-se se ocorre ou não o início da combustão do gás libertado. O papel de filtro destina-se apenas a manter a substância num determinado local para aumentar as probabilidades de ocorrência de ignição.1.3.3. Passo 3Com a substância de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de diâmetro. Verte-se nessa pilha algumas gotas de água e observa-se se há ou não ocorrência de início de combustão do gás libertado.1.3.4. Passo 4Mistura-se a substância a ensaiar com água destilada à temperatura de 20  C e mede-se a velocidade de libertação de gás durante um período de sete horas, em intervalos de uma hora. Se essa taxa de libertação de gás for errática ou no caso de ser crescente decorridas as sete horas, deverá prolongar-se o tempo de medição até ao máximo de cinco dias. O ensaio pode ser interrompido se em qualquer momento essa taxa exceder 1 litro/kg por hora.1.4. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão especificadas.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENão especificados.1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS1.6.1. Passo 11.6.1.1. Condições de ensaioEfectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20  C).1.6.1.2. Realização do ensaioDeve-se colocar uma pequena quantidade (aproximadamente com 2 mm de diâmetro) da substância de ensaio numa tina contendo água destilada. Deve-se anotar (i) qualquer eventual libertação de gás e (ii) a eventual ocorrência de ignição do gás. No caso de ocorrer ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância uma vez que esta é considerada perigosa.1.6.2. Passo 21.6.2.1. AparelhoUtiliza-se um papel de filtro flutuando sobre a superfície de água destilada contida em qualquer recipiente adequado, por exemplo, um prato de evaporação com o diâmetro de 100 mm.1.6.2.2. Condições de ensaioEfectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20  C).1.6.2.3. Realização do ensaioColoca-se no centro da folha de papel de filtro uma pequena quantidade da substância de ensaio (aproximadamente com 2 mm de diâmetro). Deve-se anotar se ocorre (i) qualquer eventual libertação de gás e (ii) se ocorre ignição desse gás. Se ocorrer a ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância uma vez que esta é considerada perigosa.1.6.3. Passo 31.6.3.1. Condições de ensaioEfectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20  C).1.6.3.2. Realização do ensaioCom a substância de ensaio prepara-se uma pilha com aproximadamente 2 cm de altura e 3 cm de diâmetro com um entalhe na parte superior. Verte-se na perfuração algumas gotas de água e verifica-se (i) se ocorre eventualmente qualquer libertação de gás e (ii) se ocorre ignição desse gás. Se ocorrer ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância uma vez que esta é considerada perigosa.1.6.4. Passo 41.6.4.1. AparelhoO aparelho tem a configuração que se mostra na figura.1.6.4.2. Condições de ensaioProcede-se a uma inspecção da embalagem para verificação da existência de pó (dimensão das partículas INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>AparelhoA.13 PROPRIEDADES PIROFÓRICAS DE SÓLIDOS E LÍQUIDOS 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOO procedimento de ensaio é aplicável a substâncias sólidas ou líquidas as quais, em pequenas quantidades, entram espontaneamente em combustão, decorrido um curto período de tempo após estarem em contacto com o ar à temperatura ambiente (cerca de 20  C).As substâncias que necessitem de estar expostas ao ar durante diversas horas ou dias, à temperatura ambiente ou a temperaturas elevadas, antes que ocorra a ignição, não estão abrangidas por este método.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESConsidera-se que uma substância possui propriedades pirofóricas se entrar em combustão ou se carbonizar sob as condições descritas em 1.6.Pode ser necessário ensaiar também a auto-inflamabilidade de líquidos utilizando o método A.15 relativo à temperatura de auto-ignição (líquidos e gases).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANão especificadas.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODOAdiciona-se a substância, no estado sólido ou no estado líquido, a um veículo inerte e coloca-se em contacto com o ar à temperatura ambiente durante um período de cinco minutos. Se as substâncias líquidas não se inflamarem utiliza-se papel de filtro para as absorver e faz-se a exposição ao ar à temperatura ambiente (cerca de 20  C) durante cinco minutos. No caso de uma substância sólida ou líquida se inflamar, ou no caso de um líquido se inflamar ou carbonizar uma folha de papel de filtro, então considera-se que essa substância é pirofórica.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADERepetitividade: devido à importância que assumem as questões relativas à segurança, um único resultado positivo é suficiente para que essa substância seja considerada pirofórica.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. AparelhoUtiliza-se um vaso de porcelana com cerca de 10 cm de diâmetro e enche-se com terra de diatomáceas até cerca de 5 mm de altura, à temperatura ambiente (cerca de 20  C).Nota:A terra de diatomáceas ou quaisquer outras substâncias inertes comparáveis geralmente disponíveis, deverão ser consideradas como representativas do solo onde a substância de ensaio possa ser derramada em caso de acidente.É necessário papel de filtro seco para ensaiar os líquidos que não se inflamem em contacto com o ar quando estão em contacto com um veículo inerte.1.6.2. Realização do ensaioa) Sólidos pulverulentosDe uma altura de cerca de 1 m deixa-se cair 1 a 2 cm3 da substância pulverulenta que se pretende ensaiar, sobre uma superfície não combustível e verifica-se a eventualidade dessa substância se inflamar durante a queda ou decorridos cinco minutos em repouso.Efectua-se o ensaio seis vezes, salvo no caso de se observar combustão.b) LíquidosVerte-se no vaso de porcelana cerca de 5 cm3 do líquido que se pretende ensaiar e observa-se a eventual inflamação da substância no período de cinco minutos.Se não houver inflamação nos seis ensaios, executam-se os ensaios seguintes:Com o auxílio de uma seringa coloca-se 0,5 ml da amostra de ensaio num papel de filtro recortado e observa-se a eventual ocorrência de inflamação ou de carbonização do papel de filtro nos cinco minutos subsequentes à adição do líquido. Efectua-se o ensaio três vezes, salvo se ocorrer inflamação ou carbonização.2. RESULTADOS2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOSPode interromper-se o processo de ensaio logo que ocorra um resultado positivo em qualquer dos ensaios.2.2. AVALIAÇÃOSe a substância se inflama no período de cinco minutos após ter sido adicionada a um veículo inerte e exposta ao ar, ou se uma substância líquida carboniza ou inflama um papel de filtro no período de cinco minutos após a adição e exposição ao ar, então considera-se que é pirofórica.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- os resultados dos ensaios,- quaisquer obervações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.4. REFERÊNCIAS(1)  NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.(2)  Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.A.14. PROPRIEDADES EXPLOSIVAS 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOO método proporciona um sistema de ensaio para se determinar se uma substância sólida ou pastosa representa perigo de explosão quando submetida ao efeito de uma chama (sensibilidade térmica) ou quando submetida a choque ou fricção (sensibilidade a estímulos mecânicos) e se uma substância líquida representa perigo de explosão quando submetida ao efeito de uma chama ou choque.O método decompõe-se em três partes:a) Um ensaio de sensibilidade térmica (1);b) Um ensaio de sensibilidade mecânica relativamente ao choque (1);c) Um ensaio de sensibilidade mecânica relativamente à fricção (1).O método proporciona dados para se avaliar a possibilidade de se iniciar uma explosão por meio de diversos estímulos comuns. O método não pretende garantir que uma substância seja susceptível de explodir sob quaisquer condições.O método é apropriado para se determinar se uma substância representa perigo de explosão (sensibilidade térmica e mecânica) sob as condições particulares especificadas na directiva. Esse método baseia-se em diversos tipos de aparelhos amplamente utilizados à escala internacional (1) e os quais proporcionam normalmente resultados significativos. Admite-se que o método não é definitivo. É possível utilizar aparelhos alternativos aos especificados desde que sejam internacionalmente aceites e desde que os resultados possam ser adequadamente correlacionados com os que se obtêm com o aparelho especificado.Não é necessário efectuar os ensaios quando existir informação termodinâmica disponível (por exemplo, calor de formação, calor de decomposição) e/ou a ausência de diversos grupos reactivos (2) na fórmula estrutural permitir concluir, para além de quaisquer dúvidas razoáveis, que a substância é incapaz de sofrer decomposição rápida com libertação de gases ou libertação de calor (isto é, o material não representa qualquer risco de explosão). No caso dos líquidos não é necessário qualquer ensaio de sensibilidade mecânica relativamente à fricção.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESExplosivo:Substâncias que possam explodir sob o efeito de uma chama ou que sejam sensíveis ao choque ou à fricção no aparelho especificado (ou que sejam mecanicamente mais sensíveis do que o 1,3-dinitrobenzeno num aparelho alternativo).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIAO 1,3-dinitrobenzeno, produto cristalino técnico, peneirado de modo a poder passar por uma malha de 0,5 mm, no caso do método por fricção e choque.A perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX, hexogéneo, ciclonite - CAS 121-82-4), cuja recristalização é feita a partir de uma solução aquosa de ciclohexanona, peneirada a húmido através de uma malha de 250 ìm e retida num peneiro de malha de 150 ìm, fazendo-se a secagem a 103 ± 2  C (durante 4 horas) para a segunda série de ensaios de fricção e choque.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODOSão necessários ensaios preliminares para se determinar as condições de segurança para a realização dos três ensaios de sensibilidade.1.4.1. Segurança na realização dos ensaios (3)Por razões de segurança, antes de se efectuarem os ensaios principais, submetem-se amostras muito pequenas (cerca de 10 mg) da substância a aquecimento em ambiente não confinado, com uma chama de gás, à acção de choque em qualquer aparelho conveniente e à acção de fricção recorrendo à utilização de um malhete contra uma bigorna ou recorrendo à utilização de qualquer máquina de fricção. O objectivo consiste em determinar se a substância é tão sensível e explosiva que os ensaios de sensibilidade prescritos, particularmente o ensaio de sensibilidade térmica, devam ser efectuados com precauções especiais de modo a evitar ferimentos no operador.1.4.2. Sensibilidade térmicaO método implica o aquecimento da substância num tubo de aço, tapado por placas perfuradas com furos de diferentes diâmetros, no sentido de se determinar se a substância é susceptível de explodir sob condições de aquecimento intenso e confinamento definido.1.4.3. Sensibilidade mecânica (choque)O método consiste em submeter a substância ao choque provocado por uma massa determinada caindo de uma altura determinada.1.4.4. Sensibilidade mecânica (fricção)O método consiste em submeter substâncias sólidas ou pastosas à fricção entre superfícies normalizadas sob condições específicas de carga e de movimento relativo.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENão especificados.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. Sensibilidade térmica (efeito de uma chama)1.6.1.1. AparelhoO aparelho é constituído por um tubo de aço não reutilizável com o seu dispositivo de fecho reutilizável (figura 1), instalado num dispositivo de aquecimento e de protecção. Cada tubo é constituído por folha de aço de estiramento profundo (ver apêndice) e possui um diâmetro interno de 24 mm, um comprimento de 75 mm e paredes com espessura de 0,5 mm. Os tubos possuem uma flange na extremidade aberta para permitir que sejam fechados pelo corpo da placa perfurada. Esse corpo é constituído por uma placa perfurada resistente à pressão, possuindo um furo central, presa firmemente a um tubo por meio de uma peça roscada de duas partes (porca e manga roscada). A porca e a manga roscada são feitas de aço de crómio e manganês (ver apêndice) o qual não produz faíscas até à temperatura de 800  C. As placas perfuradas possuem 6 mm de espessura, são feitas de aço resistente ao calor (ver apêndice) e encontram-se disponíveis com perfurações de diversos diâmetros.1.6.1.2. Condições de ensaioNormalmente ensaia-se a substância tal como é recebida, embora em alguns casos, a substância após trituração seja, por exemplo, comprimida, moldada, aglomerada ou por qualquer outra forma, necessária para o ensaio.No caso dos sólidos determina-se a massa de material a utilizar em cada ensaio recorrendo a um procedimento experimental a seco em dois andares. Enche-se com 9 cm3 de substância um tubo de tara determinada e carrega-se a substância com uma força de 80 N aplicada a toda a secção transversal do tubo. Por razões de segurança ou nos casos em que a forma física da amostra possa ser modificada por compressão, pode recorrer-se a outros procedimentos de enchimento; por exemplo, se a substância for muito sensível à fricção o enchimento pelo método de embuchar não é apropriado. Se o material for compressível adiciona-se mais e carrega-se enchendo-se o tubo até à distância de 55 mm medida a partir da parte superior. Determina-se a massa total utilizada para encher o tubo até àquele nível de 55 mm e adiciona-se mais duas porções carregando-se qualquer delas com a força de 80 N. Depois ou se adiciona mais material ou se retira, conforme necessário, deixando o tubo cheio até ao nível de 15 mm medidos a partir da parte superior. Realiza-se uma segunda experiência a seco, começando com uma quantidade carregada correspondente a um terço da massa total determinada na primeira experiência a seco. Adiciona-se mais duas porções dessas utilizando uma força de 80 N e ajusta-se o nível da substância no tubo até à distância de 15 mm medida desde a parte superior por adição ou por subtração de material conforme necessário. A quantidade de sólido determinada na segunda experiência a seco é utilizada para cada ensaio; o enchimento efectua-se com três quantidades iguais, qualquer delas comprimida até ao volume de 9 cm3 utilizando-se a força que for necessária (isto pode ser facilitado utilizando anéis espaçadores).Os líquidos e os geles são carregados no tubo até à altura de 60 mm tomando-se precauções particulares com os geles para se evitar a formação de espaços ocos. Faz-se deslizar a manga roscada pelo tubo, pela parte de baixo, insere-se a placa perfurada apropriada e aperta-se a porca depois de se ter aplicado um pouco de lubrificante à base de dissulfureto de molibdénio. É essencial verificar que não haja quaisquer vestígios de substância retida entre a flange e a placa, ou nas roscas.O aquecimento é proporcionado por uma chama de gás propano obtido em garrafa de gás industrial, equipada com um regulador de pressão (60 a 70 mbar), o qual passa através de uma válvula calibradora e é distribuído uniformemente (conforme indicado por observação visual das chamas dos queimadores) a quatro queimadores através de um cano distribuidor. Os queimadores estão localizados em torno da câmara de ensaio conforme se mostra na figura 1. Os quatro queimadores conjuntamente possuem um consumo de aproximadamente 3,2 litros de propano por minuto. É possível utilizar outros queimadores e gases combustíveis alternativos mas o regime de aquecimento deve ser conforme especificado na figura 3. Para todos os aparelhos o regime de aquecimento deve ser verificado periodicamente utilizando tubos cheios com ftalato de dibutilo conforme se indica na figura 3.1.6.1.3. Realização dos ensaiosCada ensaio é efectuado até o tubo se fragmentar ou até o tubo ter sido aquecido durante cinco minutos. Um ensaio que tenha como consequência a fragmentação do tubo em três ou mais partes, as quais podem em alguns casos ser unidas umas às outras utilizando estreitas fitas de metal, conforme se ilustra na figura 2, é considerado do tipo explosivo. Um ensaio que tenha como consequência menos fragmentos ou ausência de fragmentação é considerado como sendo do tipo não explosivo.Efectua-se primeiro uma série de três ensaios com uma placa cujo diâmetro do orifício seja de 6,0 mm e se não se obtiver qualquer explosão efectua-se uma segunda série de três ensaios com uma placa cujo diâmetro do orifício seja de 2,0 mm. Se ocorrer uma explosão durante quaisquer das séries de ensaio, não é necessário efectuar mais ensaios.1.6.1.4. AvaliaçãoConsidera-se que o resultado do ensaio é positivo se ocorrer uma explosão em qualquer das anteriores séries de ensaios.1.6.2. Sensibilidade mecânica (choque)1.6.2.1. Aparelho (figura 4)As partes essenciais de um aparelho de martelo cadente típico são um bloco de aço moldado com base, bigorna, coluna, guias, massas cadentes, dispositivo de libertação e um suporte para a amostra. A bigorna de aço de 100 mm (diâmetro)  ×  70 mm (altura) é enroscada à parte superior de um bloco de aço de 230 mm (comprimento)  ×  250 mm (largura)  ×  200 mm (altura) com uma base moldada de 450 mm (comprimento)  ×  450 mm (largura)  ×  60 mm (altura). Num suporte aparafusado à parte posterior do bloco de aço prende-se uma coluna feita de tubo de aço estirado sem juntas. Quatro parafusos prendem o aparelho a um sólido bloco de cimento de 60  ×  60  ×  60 cm de tal modo que as guias são absolutamente verticais e a massa cadente cai livremente. Existem disponíveis para utilização massas de 5 e 10 kg, feitas de aço. A cabeça batente de cada massa é feita de aço duro, HRC 60 a 63, e possui um diâmetro mínimo de 25 mm.A amostra de ensaio é encerrada num dispositivo de choque constituído por dois cilindros de aço coaxiais, um sobre o outro, num guia de aço cilíndrico e oco. Os cilindros de aço deverão possuir um diâmetro de 10 ( 0,003,  0,005) mm e uma altura de 10 mm e deverão possuir superfícies polidas, arestas arredondadas (raio de curvatura de 0,5 mm) e uma dureza de HRC 58 a 65. O cilindro oco deve possuir um diâmetro externo de 16 mm, um furo polido de 10 (+0,005, +0,010) mm e uma altura de 13 mm. O dispositivo de choque é montado numa bigorna intermédia (26 mm de diâmetro e 26 mm de altura) feita de aço e centrada por um anel com perfurações para permitir o escape dos fumos.1.6.2.2. Condições de ensaioO volume da amostra deverá ser de 40 mm3 ou um volume que se ajuste a qualquer aparelho alternativo. As substâncias no estado sólido deverão ser testadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte:a) As substâncias pulverizadas são peneiradas (malha com dimensões de 0,5 mm); toda a substância que passar pelo peneiro é utilizada no ensaio;b) As substâncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma, são partidas em pequenas partes e peneiradas; a fracção peneirada com diâmetros compreendidos entre 0,5 e 1 mm, é usada no ensaio e deverá ser representativa da substância original.As substâncias normalmente fornecidas em pasta deverão ser ensaiadas no estado seco, quando possível, ou depois de remover a quantidade máxima possível de diluente. As substâncias líquidas são ensaiadas com o intervalo de 1 mm entre os cilindros de aço superior e inferior.1.6.2.3. Realização dos ensaiosRealiza-se uma série de seis ensaios deixando cair uma massa de 10 kg, de uma altura de 0,4 m (40 J). Se ocorrer uma explosão durante os seis ensaios para o valor de 40 J deve realizar-se outra série de seis ensaios deixando cair uma massa de 5 kg e de uma altura de 0,15 m (7,5 J). Noutros aparelhos compara-se a amostra com a substância de referência escolhida utilizando um procedimento reconhecido (por exemplo, técnica de sobe-e-desce, etc.).1.6.2.4. AvaliaçãoConsidera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma explosão (o aparecimento súbito de uma chama e/ou uma repercussão é equivalente a uma explosão) pelo menos uma vez em qualquer dos ensaios com o aparelho de choque especificado ou considera-se que a amostra é mais sensível do que o composto 1,3-dinitrobenzeno ou RDX num ensaio de choque alternativo.1.6.3. Sensibilidade mecânica (fricção)1.6.3.1. Aparelho (figura 5)O aparelho de fricção é constituído por uma placa de base de aço moldado sobre a qual se monta o dispositivo de fricção. Este é constituído por uma cavilha de porcelana fixa e por uma placa de porcelana móvel. A placa de porcelana é suportada por uma armação que desliza em duas guias. A armação é ligada a um motor eléctrico através de uma biela de ligação, um ressalto excêntrico e uma engrenagem adequada de tal modo que a placa de porcelana se move, uma vez apenas, para trás e para diante por baixo da cavilha de porcelana numa distância de 10 mm. A carga da cavilha de porcelana é de 120 a 360 newtons, por exemplo.As placas lisas de porcelana são feitas de procelana branca (rugosidade de 9 a 32 ìm) e possuem as dimensões de 25 mm (comprimento)  ×  25 mm (largura)  ×  5 mm (altura). A cavilha cilíndrica de porcelana é feita também de porcelana branca e tem 15 mm de comprimento, possui um diâmetro de 10 mm e na extremidade esférica rugosa possui superfícies com um raio de curvatura de 10 mm.1.6.3.2. Condições de ensaioO volume da amostra deverá ser de 10 mm3 ou um volume ajustado a qualquer aparelho alternativo.As substâncias sólidas são ensaiadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte:a) As substâncias pulverizadas são peneiradas (com malha de 0,5 mm); utiliza-se no ensaio toda a substância que passe através do peneiro;b) As substâncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qualquer outra forma, são partidas em peças pequenas e peneiradas; utiliza-se para o ensaio a fracção peneirada de diâmetro INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Aparelho para o ensaio da sensibilidade térmica (todas as dimensões estão em milímetros)Figura 1a Tubo de aço e acessóriosFigura 1b Dispositivo de aquecimento e protecção(1) tubo(7) 2 cabeças chatas para chave 36(1a) flange exterior(8) caixa à prova de estilhaços(2) manga roscada; rosca de(9) 2 tirantes de suporte para tubo baixa fricção(10) tubo montado(3) placa perfurada a = 2,0 ou(11) posição do queimador posterior: 6,0 mm de diâmetroos outros queimadores estão(4) porca b = 10 mm de diâmetrovisíveis(5) superfície chanfrada(12) jacto orientador(6) 2 cabeças chatas para chave 41Figura 2 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Ensaio de sensibilidade térmicaExemplos de fragmentaçãoFigura 3 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Calibração da taxa de aquecimento para o ensaio da sensibilidade térmicaCurva de temperatura/tempo obtida ao aquecer-se ftalato de dibutilo (27 cm3) num tubo fechado (placa com orifício de 1,5 mm) utilizando gás propano com o débito de 3,2 litros/minuto. Mede-se a temperatura com um termopar de 1 mm de diâmetro feito de crómio/alumínio revestido com aço inoxidável, colocado centralmente 43 mm sob o aro do tubo. A taxa de aquecimento entre 135  C e 285  C deverá estar compreendida entre 185 e 215 K/minuto.Figura 4 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Aparelho para o ensaio de choque (todas as dimensões estão em milímetros)  Figura 4a Martelo cadente, alçado e vista geralFigura 4b Martelo cadente, parte lateral vista lateral,(1) base, 450  ×  450  ×  60(9) martelo cadente (massa cadente)(2) bloco de aço, 230  ×  250  ×  200(10) dispositivo de sustentação e(3) bigorna, 100 de diâmetro  ×  70de libertação(4) coluna(11) placa de fixação(5) componente transversal médio(12) bigorna intermédia (permutável),(6) 2 guias26 de diâmetro  ×  26(7) armário denteado(13) anel de fixação com orifícios(8) escala graduada(14) dispositivo de impacte >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Figura 4Figura 4c Dispositivo para o ensaio de choque de substâncias pulverizadas ou pastas(1) cilindros de aço(2) anel guia para os cilindros de aço(3) anel de fixação com orifícios    a) secção vertical    b) planta(4) anel de borracha(5) substância líquida (40 mm3)(6) espaço livre de líquidoFigura 4d Dispositivo para o ensaio de choque de substâncias líquidas>INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Figura 4e Martelo (massa cadente de 5 kg)>INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>(1) espigão desuspensão(2) marcador de altura(3) sulco de fixação(4) cabeça de impacte cilíndrica(5) lingueta dericocheteFigura 5 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Sensibilidade à fricção: aparelho  Figura 5a Aparelho de fricção:Figura 5b Posição de arranque da alçado e plantacavilha na amostra(1) base de aço(6) suporte da cavilha(2) carro móvel(7) braço de carga(3) placa de porcelana, 25  ×  25  ×  5 mm,(8) contrapeso presa ao carro(9) interruptor(4) cavilha fixa de porcelana,(10) roda para alinhar o carro na 10 mm de diâmetro  ×  15 mmposição de partida(5) amostra de ensaio,(11) saída para o motor eléctrico aproximadamente 10 mm3A.15. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIÇÃO (LÍQUIDOS E GASES) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOAs substâncias explosivas e as substâncias que sofrem ignição espontânea em contacto com o ar à temperatura ambiente não devem ser submetidas a este ensaio. O procedimento de ensaio é aplicável a gases, líquidos e vapores, os quais, na presença de ar, podem ser inflamados por uma superfície quente.A temperatura de auto-ignição pode ser consideravelmente reduzida pela presença de impurezas catalíticas, pela superfície do material ou pelo facto de o recipiente de ensaio ter um volume superior.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESO grau de propensão para a auto-ignição exprime-se em termos de temperatura de auto-ignição. A temperatura de auto-ignição é a menor temperatura para a qual a substância de ensaio se inflama quando misturada com ar sob as condições definidas no método de ensaio.1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIAAs substâncias de referência estão enumeradas nas normas (ver 1.6.3.). Devem servir essencialmente para a calibração do método, de vez em quando, e para permitir a comparação com resultados obtidos com outros métodos.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODOO método permite a determinação da temperatura mínima da superfície interior de um recinto fechado à qual ocorre a ignição de um gás, vapor ou líquido injectados nesse recinto fechado.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEA repetitividade varia de acordo com o intervalo de temperaturas de auto-ignição e com o método de ensaio utilizado.A sensibilidade e a especificidade dependem do método de ensaio utilizado.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. AparelhoO aparelho encontra-se descrito no método referido em 1.6.3.1.6.2. Condições de ensaioO ensaio de uma amostra da substância efectua-se de acordo com o método referido em 1.6.3.1.6.3. Realização do ensaioVer IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.2. RESULTADOSRegista-se a temperatura de ensaio, a pressão atmosférica, a quantidade de amostra utilizada e o intervalo de tempo decorrido até à ocorrência da ignição.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),- a quantidade de amostra utilizada, - a pressão atmosférica,- o aparelho utilizado,- os resultados das medições (temperaturas de ensaio, resultados relativos à ignição, correspondentes intervalos de tempo),- todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.4. REFERÊNCIASNenhuma.A.16. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIÇÃO RELATIVA PARA OS SÓLIDOS 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOAs substâncias explosivas e as substâncias que se inflamam espontaneamente em contacto com o ar à temperatura ambiente não deverão ser submetidas a este ensaio.O objectivo deste ensaio consiste em proporcionar informação preliminar sobre a auto-inflamabilidade de substâncias sólidas a temperaturas elevadas.Se o calor desenvolvido por reacção da substância com oxigénio ou por decomposição exotérmica não for perdido para o meio envolvente com rapidez suficiente, ocorre o fenómeno de auto-aquecimento que conduz à auto-ignição. Em consequência, a auto-ignição ocorre sempre que a razão de produção de calor excede a razão da perda de calor.O procedimento de ensaio é útil como pesquisa preliminar para as substâncias sólidas. Dada a natureza complexa da ignição e da combustão de sólidos, a temperatura de auto-ignição determinada de acordo com este método apenas deverá ser utilizada para efeitos de comparação.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESA temperatura de auto-ignição obtida por este método é a temperatura ambiente mínima expressa em  C à qual se inflamará um determinado volume de substância sob condições definidas.1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODOColoca-se num forno, à temperatura ambiente, um determinado volume de substância a ensaiar; traça-se uma curva temperatura/tempo relativa às condições no centro da amostra, aumentando-se a temperatura do forno até 400  C ou até ao ponto de fusão da substância se for menor, à razão de 0,5  C/minuto. Para os objectivos deste ensaio, a temperatura do forno para a qual a temperatura da amostra é de 400  C por auto-aquecimento, é designada por temperatura de auto-ignição.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. Aparelho1.6.1.1. FornoUtiliza-se um forno de laboratório de temperatura programada (com o volume aproximado de dois litros) equipado com sistema de circulação de ar natural e com sistema para aliviar os efeitos da explosão. No sentido de se evitar um potencial risco de explosão, não se deverá permitir que quaisquer gases de decomposição estabeleçam contacto com os componentes eléctricos do sistema de aquecimento.1.6.1.2. Cubo de rede de arameDe acordo com o diagrama da figura 1 prepara-se uma peça de rede de arame de aço inoxidável com aberturas de 0,045 mm. A rede deverá ser dobrada e presa com arame no interior de cubos abertos por cima.1.6.1.3. TermoparesTermopares adequados.1.6.1.4. RegistadorUtiliza-se qualquer registador de dois canais calibrado de 0 a 600  C ou calibrado para a tensão correspondente.1.6.2. Condições de ensaioAs substâncias são ensaiadas tal qual são recebidas.1.6.3. Realização do ensaioEnche-se o cubo com a substância de ensaio e bate-se suavemente adicionando-se mais substância até o cubo estar completamente cheio. Depois suspende-se o cubo no centro do forno, à temperatura ambiente. Coloca-se um termopar no centro do cubo e coloca-se outro entre o cubo e a parede do forno para registar a temperatura deste.As temperaturas do forno e da amostra são registadas continuamente ao mesmo tempo que a temperatura do forno aumenta até 400  C ou até ao ponto de fusão da substância se for inferior, à razão de 0,5  C/minuto.Ao ocorrer a ignição da substância o termopar da amostra indicará uma subida muito rápida da temperatura, superior à temperatura do forno.2. RESULTADOSA temperatura do forno à qual a temperatura da amostra atinge 400  C por auto-aquecimento é relevante para a avaliação (ver figura 2).3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá, se possível, conter a informação seguinte:- uma descrição da substância a ensaiar,- os resultados da medição incluindo a curva temperatura/tempo,- todas as observações adicionais relevantes para a interpretação dos resultados.4. REFERÊNCIAS(1)  NF T 20-036 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.Figura 1 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Planificação do cubo de ensaio com 20 mm de arestaFigura 2 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Curva típica de temperatura/tempoA.17. PROPRIEDADES OXIDANTES (SÓLIDOS) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOÉ útil possuir informações preliminares sobre quaisquer potenciais propriedades explosivas da substância antes de se efectuar este ensaio.Este ensaio não é aplicável a líquidos, gases, substâncias explosivas ou altamente inflamáveis ou peróxidos orgânicos.Não é necessário efectuar este ensaio no caso de o exame da fórmula estrutural determinar, para além de qualquer dúvida razoável, que a substância é incapaz de reagir exotermicamente com um material combustível.No sentido de se determinar se o ensaio deve ser efectuado com precauções especiais, dever-se-á efectuar um ensaio preliminar.1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESTempo de combustão: é o tempo de reacção, em segundos, necessário para a zona de reacção se deslocar ao longo de uma pilha utilizando o procedimento descrito em 1.6.Velocidade de combustão: expressa em milímetros por segundo.Velocidade máxima de combustão: é o valor máximo das velocidades de combustão obtidas com misturas contendo entre 10 e 90 % em peso do oxidante.1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIAUtiliza-se o nitrato de bário (qualidade analítica) como substância de referência para o ensaio e para o ensaio preliminar.A mistura de referência é uma mistura de nitrato de bário com pó de celulose preparada de acordo com 1.6, a qual possui a velocidade máxima de combustão (normalmente é uma mistura contendo nitrato de bário na proporção de 60 % em peso).1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODOPor razões de segurança efectua-se um ensaio preliminar. Não é necessário mais nenhum ensaio no caso de se verificar claramente no ensaio preliminar que a substância de ensaio possui propriedades oxidantes. Se não for esse o caso, a substância deverá ser então submetida ao ensaio completo.No ensaio completo mistura-se segundo proporções variáveis a substância que se pretende ensaiar e uma substância combustível previamente definida. Depois forma-se uma pilha com cada mistura e procede-se à ignição dessa pilha numa das suas extremidades. A velocidade máxima de combustão determinada é então comparada com a velocidade máxima de combustão da mistura de referência.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADESe necessário é válido qualquer método de trituração e de mistura desde que a diferença entre as velocidades máximas de combustão em seis ensaios separados não se afastem do valor correspondente à média aritmética em mais do que 10 %.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO1.6.1. Preparação1.6.1.1. Substância de ensaioReduz-se a amostra de ensaio a partículas com dimensões INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Molde e acessórios para a preparação da pilha (todas as dimensões estão em milímetros)PARTE B: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE INTRODUÇÃO GERAL: PARTE B A. INTRODUÇÃOVer introdução geralB. DEFINIÇÕESi) A toxicidade aguda consiste nos efeitos adversos que ocorrem num determinado período de tempo (normalmente 14 dias), após administração de uma dose única de uma substância.ii) O valor DL50 (dose letal cinquenta) representa o valor estatístico de uma dose única de uma substância susceptível de provocar a morte em 50% dos animais testados. O valor DL50 exprime-se em termos de peso da substância de ensaio por unidade de peso do animal testado (miligramas por quilograma).iii) O valor CL50 (concentração letal cinquenta) é o valor estatístico da concentração de uma substância susceptível de provocar a morte durante a exposição ou decorrido um determinado período de tempo após a exposição, em 50% dos animais expostos durante um período de tempo específico. O valor CL50 exprime-se em peso da substância de ensaio por volume de ar em condições normais (miligramas por litro).iv) O valor correspondente a «ausência de efeitos adversos» corresponde à dose máxima ou ao nível de exposição, utilizado no ensaio, que não produz quaisquer sinais detectáveis de toxicidade.v) A expressão «toxicidade subcrónica/subaguda» engloba os efeitos adversos que ocorrem nos animais de experiência como resultado de um doseamento diário repetido com uma substância durante uma pequena parte do seu esperado curto período de vida.vi) A expressão «dose máxima tolerada (DMT)» significa a dose mais elevada que revela sinais de toxicidade em animais sem apresentar efeitos relevantes na sobrevivência relativamente ao teste no qual é utilizada.vii) O termo «irritação cutânea» significa a produção de alterações inflamatórias reversíveis que surgem na pele após a aplicação da substância de ensaio.viii) O termo «irritação ocular» significa a produção de alterações reversíveis que surgem nos olhos após a aplicação de uma substância de ensaio à superfície do olho.ix) O termo «sensibilização cutânea» (dermatite alérgica por contacto) significa uma reacção cutânea a uma substância, activada imunologicamente.Definições específicas para a toxicidade por inalação- Um «aerossol» é um conjunto de partículas (sólidas e/ou líquidas) dispersas homogeneamente no ar.- O termo «diâmetro aerodinâmico» significa o diâmetro de uma esfera de densidade unitária (1 g cm 3) que possui a mesma velocidade de sedimentação terminal das partículas em questão.- O «diâmetro aerodinâmico médio de massa» (DAMM) é o diâmetro aerodinâmico calculado que divide a distribuição volumétrica do aerossol a metade quando medido em termos de massa.- O «desvio padrão geométrico» (DPG) é a razão entre os 84 percentis estimados e os 50 percentis e indica o declive da curva de distribuição granulométrica cumulativa das partículas, admitindo-se que essa distribuição seja do tipo log-normal.Definições específicas para o método de dose fixa na determinação da toxicidade oral aguda- A toxicidade evidente refere-se aos efeitos tóxicos observados na sequência da administração da substância a ensaiar, os quais têm uma tal gravidade que a administração da dose imediatamente superior pode dar origem a mortalidade.- A dose descriminativa é a dose mais elevada que, de entre as quatro doses fixas, pode ser administrada sem causar mortes devida à substância (incluindo as sacrificadas).C. MUTAGÉNESE (incluindo o ensaio de despiste prévio de carcinogénese)Para se fazer a avaliação preliminar do potencial mutagénico de uma substância é necessário obter informação sobre duas categorias de pontos conclusivos, designadamente a mutação génica e as aberrações cromossómicas.Estes dois pontos conclusivos são avaliados através dos ensaios seguintes:i) Ensaios sobre a produção de mutações genéticas (pontuais) em células procarióticas tais como Salmonella typhimurium; também são aceitáveis ensaios utilizando Escherichia coli. A escolha entre estes dois organismos de ensaio pode ser determinada pela natureza do composto químico de ensaio.ii) Ensaios sobre a produção de aberrações cromossómicas em células de mamíferos, in vitro; também é aceitável a prática de um procedimento in vivo (o ensaio do micronúcleo ou a análise metafásica das células de medula óssea). No entanto, na ausência de alguma contra-indicação, os métodos in vitro são fortemente preferidos.D. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOExistem limitações à extrapolação dos resultados dos ensaios em animais e in vitro directamente para os seres humanos, devendo tomar-se este facto em consideração quando os ensaios são avaliados e interpretados.Quando se puder dispôr de provas sobre os efeitos adversos nos seres humanos, estas podem ser importantes na determinação dos efeitos potenciais das substâncias químicas sobre a população humana.E. BIBLIOGRAFIAA toxicologia é uma ciência experimental em desenvolvimento existindo literatura abundante para cada tópico. A informação relevante pode ser encontrada em «Test Guidelines» da OCDE.Observações adicionaisCuidados com os animaisAo efectuar-se ensaios de toxicidade é essencial manter o rigoroso controlo das condições ambientais e a utilização de técnicas adequadas de protecção dos animais.i) Condições de alojamentoAs condições ambientais nos compartimentos ou recintos de instalação dos animais experimentais deverão ser apropriadas à espécie submetida ao teste. No caso de ratazanas, ratinhos e porcos-da-India, as condições adequadas são uma temperatura ambiente de 22 ± 3  C com uma humidade relativa de 30 a 70%; no caso dos coelhos a temperatura deverá ser de 20 ± 3  C com uma humidade relativa de 30 a 70%.Algumas técnicas experimentais são particularmente sensíveis aos efeitos de temperatura e, nesses casos, inclui-se na descrição do método de ensaio pormenores sobre as condições apropriadas. Em todas as investigações sobre efeitos tóxicos deverá efectuar-se o controlo e o registo da temperatura e da humidade devendo esses dados constar do relatório final do estudo.No caso de a iluminação ser artificial a sequência é normalmente de 12 horas de luz e de 12 horas de escuridão. Deve efectuar-se o registo dos pormenores do diagrama de iluminação e esses dados deverão constar do relatório final do estudo.Nos relatórios sobre experiências com animais é importante indicar o tipo de gaiola utilizada e o número de animais alojados em cada gaiola, quer durante o tempo de exposição à substância quer durante qualquer período de observação subsequente.ii) Condições de alimentaçãoAs dietas deverão satisfazer todas as necessidades alimentares das espécies submetidas ao teste. No caso de as substâncias de ensaio serem administradas aos animais nas suas dietas, o valor nutritivo pode ser reduzido por interacção entre o fármaco e o constituinte dietético.Ao fazer-se a interpretação dos resultados dos testes deve ser tomada em consideração a possibilidade de ocorrência de uma reacção desse tipo.Os contaminantes dietéticos conhecidos por influenciarem os valores de toxicidade não deverão estar presentes em concentrações que provoquem qualquer interferência.Bem-estar dos animaisAo fazer-se a elaboração dos métodos de ensaio prestou-se a devida consideração ao bem-estar dos animais. Apresenta-se seguidamente alguns exemplos, embora a lista não seja exaustiva. O teor exacto e/ou as condições deverão ser lidos no texto dos métodos:- Para a determinação da toxicidade oral aguda, foi introduzido um método alternativo, o «Procedimento de dose fixa». Este procedimento não utiliza a morte como um objectivo específico. Utiliza menos animais e dá origem a menor sofrimento e dor do que a determinação clássica da toxicidade oral aguda.- O número de animais utilizados é reduzido ao mínimo cientificamente aceitável: são ensaiados apenas cinco animais do mesmo sexo por dose para os métodos B.1 e B.3; são utilizados apenas 10 animais (e apenas 5 para o grupo de controlo negativo) para a determinação da sensibilização cutânea pelo teste de maximização na cobaia (método B.6); o número de animais necessários para o controlo positivo, ao ensaiar a mutagenicidade in vivo é também menor (métodos B.11 e B.12).- A dor e o sofrimento dos animais durante os ensaios são minimizados: os animais que apresentem sinais graves e prolongados de sofrimento e dor podem ter que ser sacrificados ; não é necessário efectuar o doseamento das substâncias reconhecidamente causadoras de dor e sofrimento acentuados, devidos às características corrosivas e irritantes (métodos B.1, B.2 e B.3).- O ensaio com doses injustificadamente elevadas é evitado pela introdução de testes limite, não apenas nos ensaios de toxicidade aguda (métodos B.1, B.2 e B.3) mas também nos ensaios para determinação da mutagenicidade in vivo (métodos B.11 e B.12).- Um programa de ensaios para determinação das características irritantes permite agora que um teste não seja executado ou que seja reduzido à expressão do estudo num único animal, quando puderem ser apresentadas provas suficientes de carácter científico.Essas provas científicas podem basear-se nas propriedades físico-químicas da substância, nos resultados de outros ensaios já efectuados ou nos resultados de ensaios in vitro bem validados. Por exemplo, no caso de se ter efectuado um estudo de toxicidade aguda por via dérmica utilizando a substância na dose do teste limite (método B.3) e não se observar irritação da pele, pode ser desnecessário efectuar mais ensaios sobre irritação cutânea (método B.4); quando os produtos que tenham demonstrado propriedades corrosivas ou irritantes para a pele num estudo de irritação cutânea (método B.4), já não deverão ser realizados os ensaios para se verificar a irritação ocular (método B.5).B.1. TOXICIDADE AGUDA (ORAL) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (A).1.2. DEFINIÇÕESVer a Introdução Geral, Parte B (B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOAtravés de um tubo dirigido ao estômago administra-se oralmente a substância de ensaio em doses graduadas a diversos grupos de animais de experiência, utilizando-se uma dose por grupo. As doses escolhidas podem ter como base os resultados de uma série de ensaios preliminares. Subsequentemente procede-se à observação dos efeitos e da morte. Faz-se a autópsia dos animais mortos durante o ensaio e no final do ensaio faz-se também a autópsia dos animais que sobreviveram ao teste. Este método visa essencialmente efectuar estudos em espécies de roedores.Pode ser necessário aniquilar humanamente os animais que apresentem sinais graves e permanentes de angústia e dor. Não se deve dosear as substâncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angústia devido às suas propriedades corrosivas ou irritantes.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosOs animais são mantidos sob as condições de alojamento e alimentação experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatória de animais adultos jovens e saudáveis que são distribuídos por grupos de tratamento. Sempre que necessário dissolve-se a substância ou prepara-se uma suspensão num veículo adequado. Recomenda-se, sempre que possível, a utilização de uma solução aquosa em primeiro lugar, seguindo-se depois a tentativa de preparar uma solução num óleo vegetal, e depois a possibilidade de preparar uma solução noutros veículos ou de preparar uma suspensão. No caso dos veículos não aquosos as características tóxicas relevantes desses veículos deverão ser conhecidas ou deverão ser determinadas antes ou durante o ensaio. No caso dos roedores, o volume não deverá exceder normalmente 10 ml/kg de peso do corpo excepto no caso das soluções aquosas em que se pode utilizar 20 ml/kg. Deve-se minimizar as variações no volume de ensaio ajustando a concentração de modo a garantir um volume constante para todos os níveis de dosagem.1.6.2. Condições de ensaio1.6.2.1. Animais de experiênciaSalvo no caso de haver contra-indicações o rato constitui a espécie preferencial.Devem utilizar-se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratório. Para cada sexo, no início do ensaio, o intervalo de variação do peso para os animais utilizados não deverá exceder ± 20% do valor médio apropriado.1.6.2.2. Número e sexoUtilizam-se pelo menos cinco roedores para cada dose. Devem ser todos do mesmo sexo. No caso de se utilizar fêmeas estas devem ser nulíparas e não devem estar grávidas. No caso de existir formação disponível demonstrando que um dos sexos é nitidamente mais sensível, deve-se fazer a administração das doses aos animais desse sexo.Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior à dos roedores deve levar-se em consideração a possibilidade de utilizar um menor número de animais. As doses deverão ser seleccionadas cuidadosamente e deverão ser feitos todos os esforços possíveis para não exceder as doses moderadamente tóxicas. Nestes ensaios deve-se evitar a administração de doses letais da substância de ensaio.1.6.2.3. DosesEstas devem ser em número suficiente, pelo menos três, e adequadamente espaçadas para originarem grupos de ensaio com uma diversidade de efeitos tóxicos e de taxas de mortalidade. Os dados deverão ser suficientes para permitirem traçar uma curva dose/resposta e, sempre que possível, determinação aceitável do valor DL50.1.6.2.4. Teste limiteNo caso de se utilizarem roedores pode-se efectuar um teste limite com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso do corpo num grupo de cinco machos e de cinco fêmeas utilizando os procedimentos anteriormente descritos. No caso de se observar mortalidade associada ao composto é necessário considerar a hipótese de realizar um estudo completo.1.6.2.5. Período de observaçãoO período de observação deve ser de pelo menos 14 dias. Contudo o período de duração da observação não deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reacções tóxicas, o momento de aparecimento de sintomas e a duração do período de recuperação; em consequência pode ser prolongado quando se considerar necessário. O momento em que as manifestações de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da morte são importantes, especialmente se existir uma tendência para retardar as mortes.1.6.3. ProcedimentoOs animais deverão observar um período de jejum antes da administração da substância. No caso do rato, os animais não deverão ser alimentados durante a noite; para animais com taxas metabólicas superiores considera-se apropriado um período mais curto de jejum; não há restrições quanto à água. No dia seguinte, os animais devem ser pesados e depois administra-se-lhes a substância de ensaio numa dose única através de um tubo inserido no estômago. Se não for possível administrar uma dose única então essa dose pode ser administrada em fracções menores durante um período de tempo que não exceda 24 horas. Após a administração da substância pode-se efectuar nova retenção dos alimentos durante mais três a quatro horas. No caso de se administrar uma dose em diversas fracções ao longo de um período de tempo, pode ser necessário fornecer aos animais alimentos e água, conforme a duração desse período de tempo.Após a administração fazem-se observações e registam-se sistematicamente, mantendo-se para cada animal registos individuais. As observações deverão ser efectuadas com frequência regular durante o primeiro dia.Deve-se efectuar um exame clínico cuidadoso pelo menos uma vez por cada dia de trabalho, e deverão ser efectuadas outras observações diariamente tomando-se acções apropriadas para minimizar as perdas de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se-á a autópsia ou a refrigeração dos animais encontrados mortos e o isolamento ou o sacrifício dos animais fracos ou moribundos. As observações deverão incluir as modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, bem como a actividade somatomotora e do comportamento. Deve-se prestar particular atenção à observação de tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactidão tão grande quanto possível.Os animais que morrem durante o ensaio e os que sobrevivem até ao fim do ensaio são submetidos a autópsia. Deverão ser registadas todas as modificações patológicas. Sempre que for aconselhável deverão ser preparadas amostras dos tecidos para exame histopatológico.Avaliação da toxicidade no outro sexoDepois de se ter completado o estudo relativamente a um dos sexos, submete-se a ensaio pelo menos um grupo de cinco animais do sexo oposto para se verificar se os animais desse sexo não são nitidamente mais sensíveis à substância de ensaio. Em circunstâncias individuais pode-se justificar a utilização de menos animais. No caso de existir informação adequada disponível suficiente para demonstrar que os animais do sexo testado são nitidamente mais sensíveis, é dispensável proceder a ensaios com animais do outro sexo.2. RESULTADOSOs resultados deverão ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experiência o número de animais no início do teste, o momento da morte de cada animal, o número de animais que evidenciem outras manifestações de toxicidade, a descrição dos efeitos tóxicos e os resultados da autópsia. Os pesos de cada animal deverão ser determinados e registados imediatamente antes da administração da substância de ensaio, decorrida uma semana e no momento da morte. As variações de peso deverão ser calculadas e registadas quando o período de sobrevivência exceder um dia. Procede-se ao registo dos animais que tiverem que ser sacrificados devido à dor e à angústia provocados pela substância, procedendo-se de igual modo para as mortes provocadas pela substância. O valor DL50 pode ser determinado por um método reconhecido. A avaliação dos resultados deverá incluir a relação, se existir, entre a exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e gravidade de todas as anormalidades, incluindo as anomalias de comportamento e clínicas, as lesões graves, as modificações do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos toxicológicos.3. RELATÓRIO3.1. Relatório do ensaioO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- espécies, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.,- condições experimentais,- níveis de dosagem (com veículo no caso deste ser utilizado, e a concentração),- sexo dos animais submetidos à experiência,- quadros com os dados de resposta por sexo e por valores de dosagem (isto é, número de animais que morreram ou que foram sacrificados durante os ensaios, número de animais que apresentam manifestações de toxicidade, número de animais expostos),- momento da morte após a administração da dose, razões e critérios utilizados para o sacrificio dos animais,- todas as observações,- valor DL50 para o grupo do sexo submetido a um estudo completo ao longo do período de 14 dias (especificando-se o método de determinação),- intervalo de confiança a 95 % para o valor DL50 (no caso de ser possível obter esse valor),- curva dose/mortalidade e seu declive (no caso de isto ser possível com o método de determinação),- resultados da autópsia,- quaisquer resultados das observações histopatológicas,- resultados de qualquer ensaio efectuado sobre o outro sexo,- discussão dos resultados (deve prestar-se particular atenção ao efeito que a aniquilação voluntária de animais durante o ensaio pode ter sobre o valor DL50 calculado),- interpretação dos resultados.3.2. Avaliação e interpretaçãoVer introdução geral, parte B (D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (E).B.1 bis. TOXICIDADE AGUDA (ORAL) - MÉTODO DE DOSE FIXA 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOO ensaio de toxicidade oral aguda fornece informações sobre os efeitos adversos que, num reduzido espaço de tempo, se podem seguir à ingestão de uma única dose da substância a ensaiar.O método de dose fixa compreende duas fases.Num estudo preliminar de determinação de amplitude, os efeitos de várias doses administradas oralmente por intubação a animais de um determinado sexo são investigados de forma sequencial. O estudo de determinação de amplitude fornece informação sobre a relação dose-toxicidade, incluindo um cálculo da dose letal mínima. Normalmente não são utilizados mais do que 5 animais nesta primeira fase.No estudo principal, a substância é administrada oralmente por intubação a grupos de 5 animais machos e 5 animais fêmeas com uma das doses pré-determinadas (5, 50, 500 ou 2 000 mg/kg). A dose utilizada é obtida a partir do estudo de determinação de amplitude e é susceptível de dar origem a «toxicidade evidente» (ver 1.2. Definições), mas não a morte.A seguir à administração observam-se os efeitos.Quando a dose inicialmente escolhida dá origem a uma toxicidade evidente mas não a mortalidade devida à substância, não são necessários mais testes.No caso de não se observar uma toxicidade evidente com a dose escolhida, a substância deverá ser ensaiada de novo com a dose mais elevada imediatamente a seguir. Se os animais morrerem, ou se uma grave reacção tóxica tornar necessária a morte compassiva dos animais, a substância deverá ser ensaiada de novo com a dose imediatamente inferior.Este procedimento permite a identificação da «dose discriminativa» (ver 1.2. Definições), isto é, a dose pré-estabelecida mais elevada que pode ser administrada sem dar origem a morte (incluindo as mortes compassivas).Os animais que apresentem graves e prolongados sinais de sofrimento e dor podem ter que ser mortos compassivamente. Não será necessário dosear as substâncias de ensaio quando reconhecidamente causem sofrimento e dor devido às suas caracteristícas corrosivas ou irritantes.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. Preparações1.6.1.1. Animais de experiênciaSalvo contra-indicação, o rato é a espécie preferida.É necessário utilizar estirpes correntes de laboratório Para cada sexo, no início do ensaio, a diferença de peso entre os animais utilizados não deve exceder ± 20 % do valor médio adequado.Os animais são mantidos em condições de alojamento e alimentação adequadas à experiência, durante pelo menos os cinco dias que a antecedem. Numa fase prévia, os animais adultos, jovens e saudáveis, são repartidos ao acaso, uns para o grupo de determinação de amplitude e os restantes para o grupo de estudo principal. Em princípio só deverá ser necessário um grupo de cada sexo no estudo principal.1.6.1.2. Preparação da dose e administraçãoSe necessário, a substância a ensaiar é dissolvida ou colocada em suspensão num veículo apropriado. Recomenda-se a utilização de soluções aquosas sempre que possível ou então pode-se utilizar uma solução em óleo vegetal e eventualmente uma solução com outros veículos, bem como uma suspensão. No que diz respeito aos veículos não aquosos, a sua toxicidade deve ser conhecida ou determinada antes ou durante o ensaio. Normalmente, para os roedores, o volume não deve exceder 10 ml/kg de peso corporal, excepto no caso das soluções aquosas em que se pode utilizar 20 ml/kg. A variação do volume de ensaio deve ser minimizada por ajustamento da concentração, de modo a garantir um volume constante para todas as doses estudadas.Os animais devem estar em jejum antes da administração da substância. No caso do rato, este deve ser privado de alimento durante a noite que precede a administração da substância; a água não será limitada. No dia seguinte, os animais devem ser pesados antes que a substância de ensaio lhes seja administrada por intubação, numa dose única. Se a administração de uma dose única não for possível, a substância pode ser administrada em fracções menores durante um período que não exceda 24 horas. Após a administração da substância, os animais podem ainda ser privados de alimento durante três a quatro horas. Se a dose é administrada por fracções durante um certo período de tempo, pode ser necessário fornecer alimentos e água aos animais em função da duração do tratamento.1.6.2. Técnica1.6.2.1. Estudo de determinação de amplitudeOs efeitos das várias doses são estudados em cada animal. Por norma, serão utilizadas fêmeas sempre que não houver informações suficientes que indiquem serem os machos o sexo mais sensível. A dosagem é sequencial, esperando-se pelo menos 24 horas antes de se efectuar a dosagem no animal seguinte. Durante pelo menos sete dias será feita em todos os animais uma pesquisa cuidadosa de sinais de toxicidade; se ao fim de sete dias persistirem sinais de toxicidade moderada o animal deverá ser observado durante mais sete dias. São as seguintes as doses iniciais consideradas : 5, 50, 500 e 2 000 mg/kg. Se a dose inicial escolhida não der origem a acentuada toxicidade e se a dose imediatamente superior der origem a mortalidade, então será necessário investigar uma ou mais doses intermédias, conforme o caso. Deste modo, deverá ser possível compilar informações sobre o nível ou níveis que dão origem a alguns sinais de toxicidade e à dose mínima causadora de mortalidade.Deverá ser feito um esforço no sentido de escolher a dose inicial com base em provas obtidas com produtos químicos afins. Na falta de tal informação, sugere-se em primeiro lugar a escolha da dose de 500 mg/kg. Se não se observarem sinais de toxicidade com a dose inicial estuda-se a dose imediatamente superior. Se não se verificar mortalidade com 2 000 mg/kg, o estudo de determinação de amplitude está concluído e o estudo principal deverá ser efectuado com esta dose. Se com a dose inicial (por exemplo, 500 mg/kg) se verificarem efeitos acentuados que impliquem a necessidade de sacrificar os animais, será administrada a outro animal a dose imediatamente inferior (por exemplo, 50 mg/kg). Se este último animal sobreviver, poderá então ser necessária a dosagem de outros animais com as doses intermédias adequadas, situadas entre as doses fixas. De um modo geral, não se espera ter de utilizar mais do que cinco animais com este método.1.6.2.2. Estudo principalDeverão ser utilizados pelo menos 10 animais (5 fêmeas e 5 machos) para cada dose a ser investigada. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas.Por princípio o método de dose fixa usa exclusivamente doses moderadamente tóxicas. Deverá ser evitada a administração de doses letais da substância a ensaiar.A dose a ser utilizada no ensaio deverá ser escolhida de entre as quatro doses fixas, nomeadamente 5, 50, 500 ou 2 000 mg/kg de peso corporal. A dose inicialmente escolhida deverá ser de modo a dar origem a toxicidade evidente mas não a mortalidade devida à substância (incluindo as mortes por sacrifício; as mortes acidentais não estão incluídas mas deverão ser registadas). Não são necessários mais ensaios quando a dose der origem a uma toxicidade evidente mas não a mortalidade devida à substância.Quando da administração da dose escolhida não resultar uma toxicidade evidente, a substância deverá ser ensaiada de novo com a dose imediatamente superior. No entanto, os animais deverão ser mantidos em observação até ao fim do respectivo período. Quando uma reacção tóxica grave tornar necessária a morte compassiva dos animais ou quando se observar mortalidade devida à substância, a substância deverá ser ensaiada de novo com a dose imediatamente inferior. Também neste caso, os animais cuja morte compassiva não for necessária deverão ser mantidos em observação durante a totalidade do respectivo período.Uma vez administrada a substância, as observações são efectuadas e registadas de modo sistemático, estabelecendo-se, se possível, uma ficha individual para cada animal.O período de observação deve, no mínimo, estender-se a 14 dias. No entanto, a sua duração não deve ser fixada de forma rígida. Esse período deve ser determinado em função das reacções de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e duração do período de recuperação; pode pois ser prolongado em caso de necessidade. O momento em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem, assim como o momento da morte, são importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a aparecer mais tarde.Deve ser feito um exame clínico cuidadoso, pelo menos duas vezes no dia da dosagem e uma vez em cada um dos dias subsequentes. Os animais que apresentarem sinais óbvios de dor ou graves sinais de sofrimento deverão ser mortos compassivamente. Serão necessárias observações subsequentes durante os primeiros dias após a dosagem se os animais continuarem a manifestar sinais de toxicidade. O ensaio pode ser dado como concluído se houver indício de que a dose inicialmente escolhida era demasiado elevada.A observação deve incidir, entre outras, sobre as alterações na pele e pêlos, olhos, mucosas, aparelho respiratório, aparelho circulatório, sistema nervoso autónomo e central, assim como da actividade somatomotora e do comportamento. Devem ser observados com especial atenção os tremores, convulsões, salivação, diarreias, letargia, sono e coma.O peso individual de cada animal deverá ser determinado no momento que precede a administração da substância, diariamente durante os três dias subsequentes e uma vez por semana depois disso. Os animais que morrem durante a experiência e os que sobrevivem até à sua conclusão são pesados e autopsiados. Devem ser registadas todas as alterações patológicas macroscópicas. Se necessário, retirar tecidos para exames histopatológicos.Conforme os resultados da dose precedente, o estudo de uma segunda ou, em circunstâncias excepcionais, de uma terceira dose, pode ser necessário.No caso de uma substância dar origem a mortalidade com uma concentração de 5 mg/kg de peso corporal (ou quando um estudo de determinação de amplitude indicar que aquela dose dará origem a mortalidade) a toxicidade aguda da substância pode carecer de investigações subsequentes.2. RESULTADOSOs dados do estudo de determinação de amplitude e do estudo principal devem ser resumidos num quadro que indique, para cada dose ensaiada, o número de animais no início do ensaio; o número de animais que apresentam sinais de toxicidade; o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou mortos compassivamente; uma descrição dos efeitos tóxicos e, relativamente ao estudo principal, se foi observada ou não uma toxicidade evidente devida à substância; a evolução de quaisquer efeitos tóxicos e os resultados da autópsia. As alterações dos pesos devem ser calculadas e registadas quando a sobrevivência ultrapassa um dia.Os animais que forem mortos compassivamente devido à dor e ao sofrimento relacionados com a substância, são registados como mortes devidas à substância.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório deve conter, relativamente ao estudo de determinação de amplitude e ao estudo principal, conforme o caso, se possível, as informações seguintes:- espécie, estirpe, origem, ambiente, regime alimentar, etc.,- condições experimentais,- doses (com a indicação das concentrações e, se necessário, do veículo),- resultados completos com todas as doses estudadas,- quadro dos dados, resposta por sexo e por dose (número de animais utilizados e alterações do peso corporal; quando for o caso, número de animais que morreram ou foram mortos durante o ensaio; número de animais que manifestam sinais de toxicidade; natureza, gravidade e duração dos efeitos),- evolução do início dos sinais de toxicidade e respectiva reversibilidade ou não,- o momento em que os animais morreram ou foram mortos, hora da morte após a dosagem, razões e critérios utilizados para a morte compassiva dos animais,- resultados da autópsia,- resultados histopatológicos,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados, incluindo os sinais de toxicidade evidente e a dose descriminativa identificada no ensaio.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO>POSIÇÃO NUMA TABELA>Ver também introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.2. TOXICIDADE AGUDA (INALAÇÃO) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOÉ útil possuir informações preliminares sobre a distribuição granulométrica das partículas, pressão de vapor, ponto de fusão, ponto de ebulição, ponto de inflamação e explosividade (se aplicável) da substância de ensaio.Ver também a introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÕESVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOVários grupos de animais de experiência são expostos, durante um período determinado, a concentrações diferentes de substâncias a testar à razão de uma concentração por grupo. Subsequentemente procede-se à observação dos efeitos e das mortes ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio são submetidos a autópsia e no fim do ensaio os animais sobreviventes são também submetidos a autópsia.Pode ser necessário sacrificar os animais que apresentem manifestações graves e permanentes de angústia e dor. Não se deve dosear as substâncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentuada e angústia devido às suas propriedades corrosivas ou irritantes.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosOs animais são mantidos sob as condições de alojamento e alimentação experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatória de animais adultos jovens e saudáveis que são distribuídos por grupos de tratamento. Não é necessário submetê-los a uma exposição simulada a não ser que tal facto seja indicado pelo tipo de aparelho de exposição que se utiliza.Pode ser necessário micronizar as substâncias de ensaio sólidas no sentido de se conseguir partículas com dimensões apropriadas.Sempre que necessário pode adicionar-se à substância de ensaio um veículo adequado para ajudar a obter uma concentração adequada da substância de ensaio na atmosfera e deverá utilizar-se então um grupo de controlo tratado com veículo. No caso de se utilizar um veículo ou outros aditivos para facilitar a administração da dose, é necessário fazer a sua selecção entre os que não produzem efeitos tóxicos. Pode recorrer-se a dados históricos se for apropriado.1.6.2. Condições de ensaio1.6.2.1. Animais de experiênciaSalvo no caso de haver contra-indicações o rato constitui a espécie preferencial. Devem utilizar-se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratório. Para cada sexo, no início do ensaio, o intervalo de variação do peso para os animais utilizados não deverá exceder ± 20 % do valor médio apropriado.1.6.2.2. Número e sexoUtilizam-se pelo menos 10 roedores (cinco fêmeas e cinco machos) para cada nível de concentração. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas.Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior à dos roedores deve levar-se em consideração a possibilidade de utilizar um menor número de animais. As doses deverão ser seleccionadas cuidadosamente e deverão ser feitos todos os esforços possíveis para não exceder as doses moderadamente tóxicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administração de doses letais da substância de ensaio.1.6.2.3. Concentrações de exposiçãoEstas devem ser em número suficiente, pelo menos três, e adequadamente espaçadas para originarem grupos de ensaio com uma diversidade de efeitos tóxicos e de taxas de mortalidade. Os dados deverão ser suficientes para permitirem traçar uma curva dose/resposta e, sempre que possível, uma determinação aceitável do valor CL50.1.6.2.4. Teste limiteSe uma exposição de cinco machos e de cinco fêmeas dos animais de ensaio a 5 mg por litro de um gás ou de um aerossol constituído por uma substância líquida ou sólida (ou, no caso de isso não ser possível devido às propriedades físicas ou químicas, incluindo as propriedades explosivas da substância de ensaio, a máxima concentração possível) não originar qualquer mortalidade associada ao composto no período de 14 dias após uma exposição de quatro horas, não é necessário efectuar mais nenhum ensaio.1.6.2.5. Tempo de exposiçãoO período de exposição deve ser de quatro horas.1.6.2.6. EquipamentoOs animais deverão ser expostos à substância a testar por meio de um dispositivo de inalação concebido de forma a conseguir-se um fluxo de ar contínuo que assegurará pelo menos 12 renovações de ar por hora e que garanta uma concentração de oxigénio apropriada e uma distribuição uniforme do produto a testar no ar. No caso de se utilizar uma câmara essa será concebida de maneira a obter-se uma superlotação mínima dos animais e uma exposição máxima da substância de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da atmosfera na câmara, o «volume» total dos animais de experiência não deverá ultrapassar 5 % do volume da câmara de ensaio. Pode também recorrer-se a um sistema de exposição oronasal, de cabeça apenas ou de corpo inteiro em câmara individual; os dois primeiros tipos de exposição permitem reduzir a penetração por outras vias.1.6.2.7. Período de observaçãoO período de observação deve ser de pelo menos 14 dias. Contudo o período de duração da observação não deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reacções tóxicas, o momento de aparecimento de sintomas e a duração do período de recuperação; em consequência pode ser prolongado quando se considerar necessário. O momento em que as manifestações de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da morte são importantes, especialmente se existir uma tendência para retardar as mortes.1.6.3. ProcedimentoImediatamente antes da exposição, os animais são pesados e depois são expostos à concentração de ensaio no aparelho especificado durante um período de quatro horas, após equilíbrio da concentração na câmara de ensaio. O tempo para se estabelecer o equilíbrio deve ser curto. A temperatura de ensaio deve ser mantida a 22 ± 3  C. Em condições ideais a humidade relativa deverá ser mantida entre 30 % e 70 %, mas em alguns casos (por exemplo, em ensaios de alguns aerossóis) tal pode ser impraticável. A manutenção de uma pressão ligeiramente negativa no interior da câmara de ensaio (&le; 5 mm de água) evitará a fuga da substância de ensaio para o meio envolvente. Durante o período de exposição não haverá fornecimento de alimentos nem de água. Devem ser utilizados sistemas adequados para gerar e monitorizar a atmosfera de ensaio. O sistema deve garantir que se atinja tão rapidamente quanto possível condições de exposição estáveis. A câmara de ensaio deverá ser concebida e utilizada de tal modo que se mantenha no seu interior uma distribuição homogénea da atmosfera de ensaio.Deverá ser feita a medição ou monitorização de:a) Débito de ar (permanentemente);b) Concentração real da substância a testar medida na zona de respiração, pelo menos três vezes durante a exposição (algumas atmosferas, por exemplo aerossóis em concentrações elevadas, podem necessitar de uma monitorização mais frequente). Durante o período de exposição diária a concentração não variará além de ± 15 % do valor médio. Contudo, no caso de alguns aerossóis, esta precisão pode não ser possível e uma variação maior poderá então ser aceitável. No caso dos aerossois, efectuar-se-á uma análise granulométrica das partículas tantas vezes quantas forem necessárias (pelo menos uma vez por grupo de ensaio);c) Temperatura e humidade, continuamente se for possível.Durante e após a exposição às concentrações são feitas observações e registadas sistematicamente; são feitas fichas individuais para cada animal. As observações deverão ser efectuadas com frequência regular durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame clínico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de trabalho, e deverão ser efectuadas outras observações diariamente tomando-se acções apropriadas para minimizar as perdas de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se-á a autópsia ou a refrigeração dos animais encontrados mortos e efectuar-se-á o isolamento ou o sacrifício dos animais fracos ou moribundos.As observações deverão incluir as modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, bem como a actividade somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular atenção à observação de tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactidão tão grande quanto possível. O peso de cada animal deve ser determinado semanalmente após a exposição e no momento da morte.Os animais que morrem durante o ensaio e os sobreviventes no fim do ensaio são submetidos a autópsia com particular referência para quaisquer modificações no tracto respiratório superior e inferior. Deverão ser registadas todas as modificações patológicas. Sempre que for aconselhável deverão ser preparadas amostras dos tecidos para exame histopatológico.2. RESULTADOSOs resultados deverão ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experiência o número de animais no início do teste, o momento da morte de cada animal, o número de animais que exibem outras manifestações de toxicidade, a descrição dos efeitos tóxicos e os resultados da autópsia. As variações de peso deverão ser calculadas e registadas quando o período de sobrevivência exceder um dia. Procede-se ao registo dos animais que tiverem que ser sacrificados devido à dor e à angústia associadas à substância procedendo-se de igual modo para as mortes associadas ao composto. O valor CL50 pode ser determinado por um método reconhecido. A avaliação dos resultados deverá incluir a relação, se existir, entre a exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e gravidade de todas as anomalias, incluindo as anomalias de comportamento e clínicas, as lesões graves, as modificações do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos toxicológicos.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- espécies, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.;- Condições de ensaio: descrição do aparelho de exposição incluindo projecto, tipo, dimensões, fonte de ar, sistema para gerar aerossois, método de condicionamento do ar e método para alojar animais na câmara de ensaio quando esta é utilizada. Deve fazer-se uma descrição do equipamento para a medição da temperatura, da humidade e das concentrações em aerossol e da distribuição granulométrica.Resultados sobre a exposiçãoEstes resultados deverão ser agrupados em quadros e apresentados com valores médios e com uma medição de variabilidade (por exemplo, desvio padrão) e se possível deverão conter:a) Débitos de ar através do equipamento de inalação;b) Temperatura e humidade do ar;c) Concentrações nominais (quantidade total da substância de ensaio fornecida ao equipamento de inalação dividida pelo volume de ar);d) Natureza do veículo, se for utilizado;e) Concentrações reais na zona de respiração;f) Diâmetro aerodinâmico médio de massa (DAMM) e desvio padrão geométrico (DPG);g) Período de equilíbrio;h) Período de exposição;- apresentação de um quadro com os dados de resposta por sexo e por nível de exposição (isto é, número de animais que morreram ou que foram sacrificados durante o ensaio; número de animais que apresentam manifestações de toxicidade; número de animais expostos),- momento da morte durante ou após a exposição, razões e critérios utilizados para o sacrifício dos animais,- todas as observações,- valor CL50 determinado para cada sexo no fim do período de observação (com especificação do método de cálculo),- intervalo de confiança a 95 % para o valor CL50 (no caso de este poder ser obtido),- curva de dose/mortalidade e seu declive (sempre que permitido pelo método de determinação),- resultados da autópsia,- resultados das observações histopatológicas,- discussão dos resultados (deverá prestar-se particular atenção ao efeito que o sacrifício de animais durante o ensaio pode ter sobre o valor CL50 calculado),- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.3. TOXICIDADE AGUDA (DÉRMICA) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhumas.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOAplica-se a substância de ensaio sobre a pele de diversos grupos de animais de experiência, em doses graduadas, utilizando-se uma dose por grupo. Subsequentemente procede-se à observação dos efeitos e das mortes ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio são submetidos a autópsia e no fim do ensaio os animais sobreviventes são também submetidos a autópsia.Pode ser necessário sacrificar os animais que apresentem manifestações graves e permanentes de angústia e dor. Não se deve dosear as substâncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acentudada e angústia devido às suas propriedades corrosivas ou irritantes.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosOs animais são mantidos nas suas gaiolas sob condições de alimentação e alojamento experimentais durante pelo menos cinco dias antes da experiência. Antes do ensaio os animais adultos jovens e saudáveis são seleccionados aleatoriamente e distribuídos por grupos de tratamento. Aproximadamente 24 horas antes do ensaio deve remover-se o pêlo da região dorsal dos animais, tosquiando-o ou rapando-o. Ao tosquiar ou ao rapar o pêlo é necessário tomar precauções para evitar lesões da pele que possam alterar a sua permeabilidade. A área destinada à aplicação da substância de ensaio não poderá ser inferior a 10 % da superfície corporal. Sempre que se procede ao ensaio de substâncias sólidas, as quais podem ser pulverizadas quando necessário, a substância de ensaio deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. No caso de se utilizar um veículo, deve tomar-se em consideração a influência desse veículo relativamente à penetração da substância de ensaio na pele. Geralmente utilizam-se as substâncias de ensaio líquidas não diluídas.1.6.2. Condições de ensaio1.6.2.1. Animais de experiênciaPode ser utilizado o rato ou o coelho. Podem ser utilizadas outras espécies sendo necessário justificar a sua utilização. Devem utilizar-se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratório. Para cada sexo, no início do ensaio, o intervalo de variação do peso para os animais utilizados não deverá exceder ± 20 % do valor médio apropriado.1.6.2.2. Número e sexoUtilizam-se pelo menos cinco animais para cada dose. Devem ser todos do mesmo sexo. No caso de se utilizar fêmeas estas devem ser nulíparas e não devem estar grávidas. No caso de existir informação disponível demonstrando que um dos sexos é nitidamente mais sensível, deve fazer-se a administração das doses aos animais desse sexo.Nota: Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem superior à dos roedores deve levar-se em consideração a possibilidade de utilizar um menor número de animais. As doses deverão ser seleccionadas cuidadosamente e deverão ser feitos todos os esforços possíveis para não exceder as doses moderadamente tóxicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administração de doses letais da substância de ensaio.1.6.2.3. DosesEstas devem ser em número suficiente, pelo menos três, e adequadamente espaçadas para originarem grupos de ensaio com uma diversidade de efeitos tóxicos e de taxas de mortalidade. Ao tomar-se a decisão sobre as doses deve levar-se em consideração quaisquer efeitos irritantes ou corrosivos. Os dados deverão ser suficientes para permitirem traçar uma curva dose/resposta e, sempre que possível, uma determinação aceitável do valor DL50.1.6.2.4. Teste limitePode efectuar-se um teste limite com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso do corpo num grupo de cinco machos e de cinco fêmeas utilizando os procedimentos anteriormente descritos. No caso de se observar mortalidade associada ao composto é necessário considerar a hipótese de realizar um estudo completo.1.6.2.5. Período de observaçãoO período de observação deve ser de pelo menos 14 dias. Contudo o período de duração da observação não deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reacções tóxicas, o momento de aparecimento de sintomas e a duração do período de recuperação; em consequência pode ser prolongado quando se considerar necessário. O momento em que as manifestações de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da morte são importantes, especialmente se existir uma tendência para retardar as mortes.1.6.3. ProcedimentoOs animais serão colocados em gaiolas individuais. A substância de ensaio será aplicada uniformemente numa área aproximadamente equivalente a 10 % da superfície total do corpo. No caso de substâncias altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor mas a camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme possível.A substância de ensaio deve ser mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de um adesivo antialérgico, durante um período de exposição de 24 horas. A superfície tratada será por sua vez convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substância de ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a substância. Podem ser utilizados aparelhos de contenção para evitar a ingestão da substância mas não se recomenda a imobilização completa.No fim do período de exposição é necessário eliminar todos os resíduos da substância, se possível, utilizando água ou qualquer outro meio adequado para limpeza da pele.As observações devem ser feitas e registadas sistematicamente. São feitas fichas individuais para cada animal. As observações deverão ser efectuadas com frequência regular durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame clínico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de trabalho, e deverão ser efectuadas outras observações diariamente tomando-se acções apropriadas para minimizar as perdas de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se-á a autópsia ou a refrigeração dos animais encontrados mortos e efectuar-se-á o isolamento ou o sacrifício dos animais fracos ou moribundos.As observações deverão incluir as modificações do pêlo, pele tratada, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, bem como a actividade somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se particular atenção à observação de tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactidão tão grande quanto possível. Os animais que morrem durante o ensaio e os que sobrevivem até ao fim do ensaio são submetidos a autópsia. Deverão ser registadas todas as modificações patológicas. Sempre que for aconselhável deverão ser preparadas amostras dos tecidos para exame histopatológico.Avaliação da toxicidade no outro sexoDepois de se ter completado o estudo relativamente a um dos sexos, submete-se a ensaio pelo menos um grupo de cinco animais do sexo oposto para se verificar se os animais desse sexo não são nitidamente mais sensíveis à substância de ensaio. Em circunstâncias individuais pode justificar-se a utilização de menos animais. No caso de existir informação adequada disponível suficiente para demonstrar que os animais do sexo testado são nitidamente mais sensíveis, é dispensável proceder a ensaios com animais do outro sexo.2. RESULTADOSOs resultados deverão ser resumidos em quadros indicando-se para cada grupo de experiência o número de animais no início do teste, o momento da morte de cada animal, o número de animais que exibem outras manifestações de toxicidade, a descrição dos efeitos tóxicos e os resultados da autópsia. Os pesos de cada animal deverão ser determinados e registados imediatamente antes da administração da substância de ensaio, decorrida uma semana e no momento da morte; as variações de peso deverão ser calculadas e registadas quando o período de sobrevivência exceder um dia. Procede-se ao registo dos animais que tiverem que ser sacrificados devido à dor e à angústia provocados pela substância procedendo-se de igual modo para as mortes provocadas pela substância. O valor DL50 pode ser determinado por um método reconhecido.A avaliação dos resultados deverá incluir a relação, se existir, entre a exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e gravidade de todas as anormalidades, incluindo as anomalias de comportamento e clínicas, as lesões graves, as modificações do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos toxicológicos.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- espécies, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.,- condições experimentais (incluindo o método de limpeza da pele e tipo de gaze: oclusiva ou não oclusiva),- níveis de dosagem (com veículo no caso deste ser utilizado, e as concentrações),- sexo dos animais submetidos à experiência,- quadros com os dados de resposta por sexo e por valores de dosagem (isto é, número de animais que morreram ou que foram sacrificados durante os ensaios, número de animais que apresentam manifestações de toxicidade, número de animais expostos),- momento da morte após a administração da dose, razões e critérios utilizados para o sacrifício dos animais,- todas as observações,- valor DL50 para o grupo do sexo submetido ao estudo completo ao longo do período de 14 dias (especificando-se o método de determinação),- intervalo de confiança a 95 % para o valor DL50 (no caso de ser possível obter esse valor),- curva dose/mortalidade e seu declive (no caso de isto ser possível com o método de determinação),- resultados da autópsia,- quaisquer resultados das observações histopatológicas,- resultados de qualquer ensaio efectuado sobre o outro sexo,- discussão dos resultados (deve prestar-se particular atenção ao efeito que o sacrifício dos animais durante o ensaio, pode ter sobre o valor DL50 calculado),- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.4. TOXICIDADE AGUDA (IRRITAÇÃO CUTÂNEA) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOConsiderações iniciaisÉ necessário tomar em consideração toda a informação disponível sobre uma substância no sentido de minimizar o ensaio de substâncias sob condições que eventualmente provoquem reacções graves. A informação que se segue é útil para se decidir se deve ser efectuado um ensaio completo, um estudo num único animal ou se não é necessário mais qualquer ensaio.i) Propriedades físico-químicase reactividade química. Pode não ser necessário efectuar qualquer ensaio com substâncias fortemente ácidas ou alcalinas (para valores de pH iguais ou inferiores a 2 ou iguais ou superiores a 11,5, por exemplo) para a determinação de irritação cutânea primária, uma vez que é de esperar a existência de propriedades corrosivas. Deve manter-se uma reserva de compostos alcalinos ou ácidos.ii) Não é necessário efectuar um ensaio completo se houver provas convincentes de efeitos graves em ensaios in vitro bem validados.iii) Resultados de estudos de toxicidade aguda. Se tiver sido efectuado um ensaio de toxicidade aguda por via dérmica com a substância administrada numa dose correspondente ao teste limite (2 000 mg/kg de peso corporal) e não se tiver observado nenhuma irritação, pode ser desnecessário efectuar mais qualquer ensaio para determinação da irritação cutânea. Além disso é desnecessário proceder ao ensaio de materiais para os quais se tenha demonstrado serem altamente tóxicos por via cutânea.Aplica-se à pele de diversos animais de experiência uma dose única da substância que se pretende ensaiar, servindo cada animal como seu próprio controlo. Observa-se e classifica-se a intensidade da irritação decorrido um intervalo de tempo específico e faz-se ainda uma descrição para proporcionar uma avaliação completa dos efeitos. A duração das observações deverá ser suficiente para se avaliar integralmente a reversibilidade dos efeitos observados.Pode ser necessário sacrificar os animais que apresentem manifestações graves e permanentes de angústia e dor.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosAproximadamente 24 horas antes dos ensaio deve remover-se o pêlo da região dorsal dos animais, tosquiando-o ou rapando-o.Ao tosquiar ou ao rapar o pêlo é necessário tomar precauções para evitar lesões da pele que possam alterar a sua permeabilidade. Apenas devem ser utilizados animais com pele saudável intacta.Algumas estirpes de coelhos possuem núcleos densos de pêlo que são mais proeminentes em determinadas épocas do ano. As substâncias de ensaio não deverão ser aplicadas a estas zonas de denso crescimento de pêlo.Sempre que se procede ao ensaio de substâncias sólidas, as quais podem ser pulverizadas quando necessário, a substância de ensaio deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. No caso de se utilizar um veículo, deve tomar-se em consideração a influência desse veículo relativamente à penetração da substância de ensaio na pele. Geralmente utilizam-se as substâncias de ensaio líquidas não diluídas.1.6.2. CONDIÇÕES DE ENSAIO1.6.2.1. Animais de ExperiênciaEmbora seja possível utilizar diversas espécies de mamíferos, o coelho albino constitui a espécie preferida.1.6.2.2. Número de animaisSe os resultados do despiste in vitro ou se outras considerações permitirem suspeitar que a substância pode produzir necrose (isto é, ser corrosiva) deve considerar-se a hipótese de efectuar o ensaio com um único animal. Se os resultados deste ensaio não indicarem corrosividade, o ensaio deverá ser completado utilizando pelo menos mais dois animais.Para o ensaio completo utilizam-se pelo menos três animais adultos saudáveis. Não é necessário dispôr de um grupo de controlo não tratado constituído por outros animais. É possível que seja necessário recorrer a mais animais para esclarecer respostas equívocas.1.6.2.3. DoseSalvo no caso de existirem contra-indicações aplica-se no local de ensaio, 0,5 ml de líquido ou 0,5 g de sólido ou de semi-sólido. As áreas adjacentes de pele não tratada de cada animal servem como elementos de controlo para o ensaio.1.6.2.4. Período de observaçãoA duração do período de observação não deverá ser rigidamente fixa. Deve ser suficiente para permitir avaliar integralmente a reversibilidade ou a irreversibilidade dos efeitos observados, mas normalmente não excederá os 14 dias após a aplicação.1.6.3. ProcedimentoOs animais devem ser colocados em gaiolas individuais. A substância de ensaio deve ser aplicada sobre uma pequena área (aproximadamente 6 cm2) de pele e coberta com um emplastro de gaze, o qual é mantido no seu lugar com um adesivo não alérgico. No caso dos líquidos e de algumas pastas pode ser necessário aplicar primeiro a substância de ensaio sobre o emplastro de gaze e depois aplicar este sobre a pele. O emplastro deverá ser mantido livremente em contacto com a pele por meio de uma cobertura oclusiva ou semioclusiva adequada, durante o período de exposição. Deve evitar-se que o animal tenha acesso ao emplastro para impedir que o animal possa ingerir/inalar a substância de ensaio.No fim do período de exposição a substância de ensaio residual deverá ser removida, sempre que possível, utilizando água ou o solvente apropriado, sem se alterar a resposta efectiva ou a integridade da epiderme.O período de duração da exposição é normalmente de 4 horas.No caso de se suspeitar que a substância possa produzir necrose (isto é, ser corrosiva) a duração da exposição deverá ser reduzida (por exemplo, para uma hora ou para três minutos). Neste tipo de ensaio deve utilizar-se também apenas um animal na primeira experiência e, se não houver qualquer impedimento devido à toxicidade dérmica aguda do composto de ensaio, podem aplicar-se três emplastros simultâneamente a esse animal. O primeiro emplastro é removido decorrido três minutos. No caso de não se observar qualquer reacção cutânea grave remove-se o segundo emplastro decorrida uma hora. Se as observações efectuadas nesta fase indicarem que é necessária uma exposição de quatro horas e que a experiência pode ser humanamente prolongada, remove-se o terceiro emplastro decorridas quatro horas e procede-se à classificação das respostas. Neste caso (isto é, na hipótese de ter sido possível uma exposição de quatro horas), deve completar-se o ensaio utilizando pelo menos mais dois animais, a não ser que se considere desumano prosseguir com tal experiência (por exemplo, no caso de se observar necrose após o período de exposição de quatro horas).No caso de se observar uma reacção cutânea grave (por exemplo necrose) decorridos os três minutos ou decorrido o período de uma hora interrompe-se imediatamente o ensaio.Sob determinadas condições pode ser aconselhável utilizar períodos de exposição mais longos, por exemplo, em função do diagrama de exposição e utilização em seres humanos.1.6.3.1. Observação e classificaçãoDeve fazer-se nos animais a observação de manifestações de eritema e de edema e deve classificar-se a resposta decorridos 60 minutos, e depois decorridas 24, 48 e 72 horas após a remoção do emplastro. A irritação cutânea é classificada e registada de acordo como sistema prescrito no quadro 1. Pode ser necessário efectuar outras observações se a reversabilidade não estiver totalmente completada decorridas 72 horas. Para além da observação de irritação deve apresentar-se também uma descrição completa de quaisquer outras lesões graves tais como a corrosão (destruição irreversível dos tecidos da pele) e também de outros efeitos tóxicos.Para se clarificar reacções duvidosas ou respostas camufladas pela coloração da pele provocada pela substância de ensaio pode recorrer-se à utilização de técnicas, como o exame histopatológico ou a medição da espessura das pregas da pele.2. RESULTADOSOs resultados devem ser resumidos sob a forma de quadros, indicando-se para cada animal as classificações de irritação estabelecidas para o eritema e para o edema ao longo do período de observação. Deve efectuar-se o registo de quaisquer outras lesões graves, descrevendo-se o grau e a natureza da irritação, a reversibilidade ou a corrosão e ainda quaisquer outros efeitos tóxicos observados.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- espécie, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.,- condições de ensaio (incluindo as propriedades físico-químicas da substância, a técnica de preparação e de limpeza da pele, e também o tipo de cobertura: oclusiva ou semioclusiva),- quadro com os resultados da resposta alérgica para cada animal e para cada período de tempo de observação (por exemplo, 1, 24, 48 e 72 horas, etc., após a remoção de emplastro),- a descrição de quaisquer lesões alarmantes observadas, incluindo os fenómenos de corrosão,- descrição e natureza da irritação observada e de quaisquer resultados histopatológicos;- descrição de quaisquer efeitos tóxicos diferentes da irritação dérmica,- discussão dos resultados;- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).Apêndice>POSIÇÃO NUMA TABELA>B.5. TOXICIDADE AGUDA (IRRITAÇÃO OCULAR) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhumas.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOConsiderações iniciaisÉ necessário tomar em consideração toda a informação disponível sobre uma substância no sentido de minimizar o ensaio de substâncias sob condições que eventualmente provoquem reacções graves. Relativamente a este assunto considera-se útil a informação seguinte:i) Propriedades físico-químicas e reactividade química. Pode não ser necessário ensaiar substâncias fortemente ácidas ou alcalinas para as quais em contacto com o olho possa existir um pH igual ou inferior a 2 ou igual ou superior a 11,5, por serem previsíveis lesões graves. Deve manter-se uma reserva de compostos alcalinos ou ácidos.ii) Resultados de estudos alternativos correctamente validados; os produtos para os quais se tenha demonstrado que possuem potenciais propriedades corrosivas ou bastante irritantes não devem ser utilizados nos ensaios de irritação ocular, admitindo-se que essas substâncias provocarão efeitos oculares graves em qualquer ensaio que utilize este método.iii) Os resultados dos estudos sobre a irritação cutânea. Os produtos para os quais se tenha demonstrado serem corrosivos ou gravemente irritantes para a pele num estudo de irritação cutânea não deverão ser utilizados em qualquer ensaio de irritação ocular, admitindo-se que essas substâncias possam provocar efeitos graves nos olhos.A substância de ensaio aplica-se numa dose única a um dos olhos de cada um dos diversos animais da experiência; utiliza-se o olho não tratado como informação de controlo. Avalia-se a intensidade da irritação e classifica-se em intervalos específicos e faz-se uma descrição que proporcione uma avaliação completa dos efeitos. A duração das observações deverá ser suficiente para avaliar a reversibilidade total ou a irreversibilidade dos efeitos observados.Pode ser necessário sacrificar os animais que apresentem manifestações graves e permanentes de angústia e dor.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosAmbos os olhos de cada animal da experiência, previamente seleccionado para ser submetido aos testes, devem ser examinados 24 horas antes do início dos ensaios. Não devem ser utilizados animais que apresentem irritação ocular, defeitos oculares ou lesões córneas pré-existentes.1.6.2. Condições de ensaio1.6.2.1. Animais de experiênciaEmbora se tenha utilizado uma grande diversidade de animais de experiência recomenda-se que os ensaios sejam efectuados utilizando coelhos albinos adultos e saudáveis.1.6.2.2. Número de animaisNo caso de se poder prever a ocorrência de efeitos específicos deve fazer-se o ensaio apenas em um animal. Se os resultados desse ensaio num coelho sugerirem que a substância é fortemente irritante (efeito reversível) ou corrosiva (efeito irreversível) para o olho, utilizando o procedimento descrito, não é necessário efectuar mais qualquer ensaio sobre a irritação ocular noutros animais. Ocasionalmente poder-se-á efectuar outros ensaios noutros animais para se investigarem aspectos específicos.Em casos diferentes do ensaio com apenas um animal dever-se-á utilizar pelo menos três animais. Pode ser necessário utilizar mais animais para clarificar respostas equívocas.1.6.2.3. DosesPara o ensaio de líquidos utiliza-se uma dose de 0,1 ml. Para o ensaio de sólidos, pastas e substâncias constituídas por partículas, a quantidade utilizada deve ter um volume de 0,1 ml ou pesar aproximadamente 0,1 g (deve registar-se sempre o peso). No caso de o material se encontrar no estado sólido ou de granulado, deve ser triturado até se obter um pó fino. O volume das partículas deve ser medido após se ter efectuado uma compactação suave, por exemplo, batendo com o recipiente de medição.No caso das substâncias contidas em bombas de aspersão ou em aerossóis pressurizados, o líquido deve ser expelido e procede-se à recolha de 0,1 ml fazendo-se a instilação no olho, conforme descrito para o caso dos líquidos.1.6.2.4. Período de observaçãoA duração do período de observação não deve ser rigidamente fixa. Deve ser suficiente para se avaliar a reversibilidade ou a irreversibilidade dos efeitos observados, mas normalmente não é necessário que exceda 21 dias após a instilação.1.6.3. ProcedimentosOs animais são introduzidos em gaiolas individuais. A substância de ensaio deverá ser colocada no saco conjuntival de um olho de cada animal depois de se ter afastado suavemente a pálpebra inferior do globo ocular. Depois unem-se suavemente as pálpebras durante aproximadamente um segundo para evitar perdas de material. O outro olho, que não é tratado, serve como controlo.No caso de se admitir que a substância possa provocar dor excessiva pode praticar-se uma anestesia local antes de se instilar a substância de ensaio. O tipo, a concentração e o momento de aplicação da anestesia local deverão ser escolhidos criteriosamente para se garantir que não haja diferenças significativas de reacção à substância de ensaio resultantes da sua utilização. Identicamente deve fazer-se a anestesia do olho de controlo.Os olhos dos animais submetidos à experiência não devem ser lavados no período de 24 horas após a instilação da substância de ensaio. Decorridas 24 horas pode efectuar-se uma lavagem se for considerado apropriado.Para algumas substâncias que demonstrem ser irritantes neste ensaio pode ser indicado efectuar ensaios adicionais utilizando coelhos com olhos lavados imediatamente após a instilação da substância. Neste caso recomenda-se a utilização de três coelhos. Decorrido meio minuto após a instilação procede-se à lavagem dos olhos dos coelhos durante meio minuto utilizando um volume e um débito que não provoquem danos.1.6.3.1. Observação e classificaçãoOs olhos devem ser examinados decorridas 1, 24, 48 e 72 horas. Se não houver provas de lesões oculares decorridas 72 horas pode interromper-se o estudo.Pode ser necessário efectuar uma observação mais prolongada se existir dano persistente da córnea ou se existirem outras irritações oculares, no sentido de se determinar a progressão das lesões e a sua reversibilidade ou irreversibilidade. Para além das observações da córnea, da íris e da conjuntiva deverão ser registadas e descritas quaisquer outras lesões que tenham sido observadas. Para cada exame deve registar-se a classificação da reacção ocular (quadro). (A classificação das respostas oculares é motivo de diversas interpretações. Como auxiliar dos laboratórios de ensaio e dos especialistas que realizam e interpretam as observações pode utilizar-se um guia ilustrado sobre irritação ocular).O exame das reacções pode ser facilitado utilizando uma lupa binocular, uma lanterna de fenda manual, um biomicroscópio ou qualquer outro dispositivo adequado. Após o registo das observações efectuadas decorridas 24 horas pode proceder-se ainda ao exame dos olhos de um ou de todos os coelhos com o auxílio de fluoresceína.2. RESULTADOSOs resultados devem ser resumidos sob a forma de quadros, apresentando para cada animal os diversos graus de irritação nos momentos de observação especificados. Deve apresentar-se uma descrição do grau e natureza da irritação, da presença de lesões graves e de quaisquer efeitos observados diferentes dos efeitos oculares.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- dados relativos ao animal (espécie, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.),- as condições de ensaio (incluindo as propriedades físico-químicas relevantes da substância de ensaio),- um quadro com os dados de resposta irritação/corrosão para cada animal e para cada momento de observação (por exemplo, 1, 24, 48 e 72 horas),- a descrição de quaisquer lesões graves observadas,- uma descrição narrativa do grau e natureza da irritação ou corrosão observadas, incluindo a área da córnea envolvida, e ainda a reversibilidade,- descrição do método utilizado para classificar a irritação decorridas 1, 24, 48 e 72 horas (por exemplo, lâmpada de fenda manual, biomicroscópio, fluoresceína),- descrição de quaisquer efeitos tópicos não oculares observados,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).Apêndice>POSIÇÃO NUMA TABELA>B.6. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOAnotações:A sensibilidade e a capacidade dos testes para se detectar potenciais sensibilizadores da pele humana são considerados factores importantes num sistema de classificação para a toxicidade relevante para a saúde pública.Não existe um método de ensaio único que identifique adequadamente todas as substâncias com potencial para sensibilizar a pele humana e que seja relevante para todas as substâncias.Há factores tais como as características físicas de uma substância, incluindo a sua capacidade para penetrar na pele, que devem ser considerados na selecção de um teste.Os ensaios que utilizam porquinhos da Índia podem ser subdivididos em ensaios do tipo adjuvante nos quais se potencia um estado alérgico dissolvendo ou preparando uma suspensão da substância de ensaio no «adjuvante completo de Freunds» (ACF) e ensaios do tipo não adjuvante.Os ensaios do tipo adjuvante são provavelmente mais exactos na previsão de um eventual efeito de uma substância sensibilizadora da pele em seres humanos do que os métodos que não utilizam o «adjuvante completo de Freunds» e portanto são métodos preferenciais.O teste de maximização em porquinhos da Índia (TMPI) é um ensaio do tipo adjuvante mais amplamente utilizado. Embora seja possível utilizar outros métodos para se detectar o potencial de uma substância para provocar uma reacção de sensibilização cutânea, o TMPI é a técnica de adjuvante preferida.Com muitas classes de produtos químicos, os ensaios do tipo não adjuvante (sendo preferível o ensaio de Buehler) são considerados menos sensíveis.Em alguns casos pode haver boas razões para se escolher o teste de Buehler envolvendo a aplicação tópica em vez da injecção intradermal utilizada no «ensaio de maximização em porquinhos da Índia». Deve apresentar-se a justificação científica no caso de se utilizar o teste de Buehler.Neste método descreve-se o teste de maximização em porquinhos da Índia e o teste de Buehler. É possível utilizar outros métodos desde que sejam convenientemente validados e se apresente a justificação científica.Não obstante os métodos utilizados, deve verificar-se a intervalos regulares (seis meses) a sensibilidade da estirpe de cobaias utilizadas no ensaio de sensibilização cutânea, utilizando um sensibilizante conhecido, suave e moderado e obter um número satisfatório de respostas positivas.Ver também a introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIARecomenda-se a utilização das substâncias a seguir indicadas, diluídas como necessário, e também de quaisquer outras substâncias activas sensibilizantes conhecidas ou da literatura ou que pertençam ao grupo da substância que se pretende ensaiar.- p-fenilenodiamina CAS n  106-50-3- 2,4-dinitro-cloro-benzenoCAS n  97-00-7- dicromato de potássioCAS n  7778-50-9- sulfato de neomicinaCAS n  1405-10-3- sulfato de níquelCAS n  7786-81-41.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS DE ENSAIOApós a exposição inicial a uma substância de ensaio (o período de «indução») os animais são submetidos, aproximadamente duas semanas após o último período de indução, a um «estímulo» para a substância de ensaio no sentido de se verificar se foi induzido um estado de hipersensibilidade. Determina-se a sensibilização examinando a reacção cutânea ao estímulo.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS DE ENSAIO1.6.1. Teste de maximização em porquinhos da Índia (TMPI)1.6.1.1. PreparativosSeleccionam-se aleatoriamente os porquinhos da Índia, albinos, jovens e saudáveis os quais são pelos grupos de tratamento e de controlo. Antes da administração da dose remove-se o pêlo, tosquiando-o e/ou rapando-o, da região dorsal. É necessário tomar cuidado para não danificar a pele.1.6.1.2. Condições de ensaio1.6.1.2.1. Animais de experiênciaUtilizam-se estirpes de porquinhos da Índia albinos vulgarmente utilizadas em laboratório pesando menos do que 500 g.1.6.1.2.2. Número e sexoPodem utilizar-se machos e/ou fêmeas. No caso de se utilizar fêmeas estas devem ser nulíparas e não grávidas. Utiliza-se um número mínimo de 10 animais no grupo tratado e pelo menos cinco animais no grupo de controlo. A utilização de um menor número de animais deve ser justificada. No caso de os resultados serem equívocos, o exame histopatológico pode auxiliar a decidir se o ensaio deve ser repetido utilizando outro conjunto de animais. Quando não for possível concluir se a substância objecto de ensaio é ou não um sensibilizante, é aconselhável efectuar testes adicionais de modo a obter um total de pelo menos 20 animais testados e 10 animais de controlo.1.6.1.2.3. DosesAjusta-se a concentração da substância de ensaio para um valor que produza alguns sinais evidentes de irritação cutânea mas que seja bem tolerado pelos animais em cada fase de indução.A concentração do estímulo deverá situar-se no valor máximo que não produza quaisquer sinais de irritação cutânea em animais não sensibilizados.Estas concentrações podem ser determinadas num estudo-piloto em pequena escala (dois ou três animais).1.6.1.2.4. Período de observaçãoDurante o período de indução efectuam-se observações para confirmação de possíveis efeitos alérgicos. Após a exposição ao estímulo procede-se ao registo das reacções cutâneas, decorridas 24 e 48 horas após a remoção do emplastro.1.6.1.3. ProcedimentoOs animais são pesados antes do início do ensaio e no fim do ensaio. Remove-se o pêlo da região dorsal do quarto anterior. Existem duas fases no procedimento:1.6.1.3.1. InduçãoDia 0 - grupo tratadoAdministra-se na região dorsal do quarto anterior dos animais os seguintes pares de injecções intradérmicas, contendo cada uma 0,1 ml, de tal modo que uma de cada par é aplicada em cada um dos lados da linha média:Injecção 1:0,1 ml de adjuvante completo de Freunds (ACF) misturado com água ou com uma solução salina fisiológica na proporção de 1:1;Injecção 2:0,1 ml de substância de ensaio, num veículo apropriado sempre que necessário;Injecção 3:0,1 ml da substância de ensaio em ACF.Na injecção 3 dissolvem-se as substâncias solúveis em água utilizando 0,05 ml de água e 0,05 ml de ACF não diluído. No caso de ser necessário testar substâncias liposolúveis ou insolúveis, faz-se a sua mistura com ACF não diluído.Na injecção 3 a concentração final da substância de ensaio deverá ser igual à da injecção 2.As injecções 1 e 2 são administradas próximo uma da outra e próximo da cabeça, ao passo que a injecção 3 é administrada na área de ensaio mais próxima da área caudal.Dia 0 - grupo de controloOs pares seguintes de injecções intradérmicas são aplicados nos mesmos locais anteriormente definidos.Injecção 1:0,1 ml de adjuvante completo de Freunds (ACF) misturado com água ou com uma solução salina fisiológica na proporção 1:1;Injecção 2:0,1 ml apenas de veículo;Injecção 3:0,1 ml de veículo em ACF.6o dia - grupos de controlo e grupos tratados.No caso de a substância não constituir um irritante da pele, depois de se tosquiar e/ou rapar pincela-se a área de ensaio com 0,5 ml de laurilsulfato de sódio a 10 % em vaselina, com o objectivo de se provocar uma irritação local.7o dia - grupo tratadoRemove-se novamente o pêlo da área de ensaio. Sobre um papel de filtro (2 × 4 cm) espalha-se a substância de ensaio diluída com um veículo adequado (a escolha do veículo deverá ser justificada; as substâncias sólidas são reduzidas a pó e incorporadas num veículo apropriado; se apropriado, os líquidos podem ser aplicados directamente) e aplica-se à área do ensaio e mantém-se em contacto durante 48 horas utilizando uma cobertura oclusiva.7o dia - grupo de controloLimpa-se novamente o pêlo da área de ensaio. Aplica-se apenas o veículo, por um processo idêntico, à área de ensaio e mantém-se em contacto durante 48 horas utilizando uma cobertura oclusiva.1.6.1.3.2. Estímulo21o diaRemove-se o pêlo dos flancos dos animais tratados e dos animais de controlo. Aplica-se num dos flancos dos animais tratados um emplastro ou compressa contendo a substância de ensaio e aplica-se no outro flanco um emplastro ou compressa utilizando apenas veículo.Os emplastros são mantidos na sua posição de contacto com uma cobertura oclusiva, durante 24 horas.Procede-se de igual modo com o grupo de controlo.23o e 24o dias- decorridas 21 horas após a remoção do emplastro limpa-se a área de estímulo e removem-se os pêlos se necessário,- decorridas três horas (48 horas após o início da aplicação do estímulo) observa-se e regista-se a reacção cutânea,- Decorridas 24 horas após esta observação efectua-se e regista-se uma segunda observação (72 horas).Para clarificação dos resultados obtidos om o primeiro estímulo, deve considerar-se a hipótese de se aplicar um segundo estímulo, se necessário com um novo grupo de controlo tratado com um veículo, aproximadamente uma semana após a aplicação do primeiro.1.6.1.3.3. Observação e classificaçãoTodas as reacções da pele e quaisquer resultados invulgares derivados dos procedimentos de indução e de estimulação deverão ser registados e descritos.É possível utilizar técnicas tais como o exame histopatológico ou a medição da espessura das pregas da pele, para clarificar reacções ou respostas duvidosas camufladas pela coloração da pele provocada pela substância de ensaio.1.6.2. Teste de Buehler1.6.2.1. PreparativosSeleccionam-se aleatoriamente porquinhos da Índia albinos, jovens e saudáveis e faz-se a seu distribuição pelos grupos de tratamento e de controlo. Antes da aplicação da dose remove-se o pêlo, tosquiando e/ou rapando um dos flancos. É necessário tomar precauções para evitar danificar a pele.1.6.2.2. Condições de ensaio1.6.2.2.1. Animais de experimentaçãoUtilizam-se estirpes de porquinhos da Índia albinos correntemente utilizadas em laboratório, pesando menos do que 500 g.1.6.2.2.2. Número e sexoPodem utilizar-se machos e/ou fêmeas. No caso de se utilizar fêmeas estas devem ser nulíparas e não grávidas. O grupo tratado é constituído pelo menos por 20 animais e o grupo de controlo é constituído pelo menos por 10 animais. Deve justificar-se a utilização de um menor número de animais. No caso de os resultados serem equívocos, o exame histopatológico pode auxiliar a decidir se o ensaio deve ser repetido utilizando outro conjunto de animais.1.6.2.2.3. DosesPara cada fase de indução ajusta-se a concentração da substância de ensaio para o valor máximo que possa ser bem tolerado sistematicamente e para o qual, no caso das substâncias irritantes, produz uma irritação entre suave e moderada na maior parte dos animais do ensaio. A concentração do estímulo deve ser o valor máximo que não produz quaisquer sinais de irritação da pele em animais não sensibilizados. Essas concentrações podem ser determinadas através de um estudo feito em pequena escala (dois a três animais).1.6.2.2.4. Período de observaçãoDurante o período de indução as observações da pele são efectuadas para confirmação dos efeitos alérgicos. Após a exposição ao estímulo, procede-se ao registo das reacções cutâneas decorridas 24 e 48 horas após a remoção do emplastro, isto é, respectivamente 30 e 54 horas após o início da aplicação.1.6.2.3. ProcedimentoOs animais são pesados antes do início do ensaio e no fim do ensaio.O procedimento consta de duas fases:1.6.2.3.1. InduçãoDia 0 - grupo tratadoRemove-se o pêlo de um dos flancos (tosquiando-o e/ou rapando-o). Espalha-se sobre um tampão de algodão 0,5 ml da substância de ensaio diluída num veículo adequado (a escolha do veículo deve ser justificada; se apropriado os líquidos podem ser aplicados directamente). Faz-se a aplicação sobre a área de ensaio e mantém-se em contacto com a pele utilizando uma compressa ou emplastro oclusivo e uma cobertura adequada durante seis horas.Dia 0 - grupo de controloRemove-se o pêlo de um dos flancos (tosquiando-o e/ou rapando-o). Aplica-se apenas veículo por um processo idêntico, na àrea de ensaio. Mantém-se o contacto com a pele utilizando uma compressa ou um emplastro oclusivo e uma cobertura adequada durante seis horas.7o e 14o diasEfectua-se a mesma aplicação do dia zero sobre a mesma área de ensaio (com a remoção do pêlo se necessário), nos 7o e 14o dias.1.6.2.3.2. Estímulo28o diaRemove-se o pêlo do outro flanco dos animais de controlo e tratados. Aplica-se no flanco posterior dos animais tratados uma compressa ou emplastro oclusivo contendo 0,5 ml da substância de ensaio com a concentração máxima não irritante. Aplica-se também no flanco anterior uma compressa ou emplastro oclusivo contendo apenas veículo.Mantém-se o contacto dos emplastros oclusivos utilizando uma cobertura adequada durante seis horas.A exposição do grupo de controlo é efectuada de modo idêntico.29o e 30o dias- decorridas 21 horas após a remoção do emplastro limpa-se a área do estímulo, e removem-se os pêlos, se necessário,- decorridas três horas (30 horas após o início da aplicação do estímulo) observa-se e regista-se a reacção cutânea,- decorridas 24 horas após esta observação efectua-se e regista-se uma segunda observação (54 horas).1.6.2.3.3. Observação e classificaçãoTodas as reacções cutâneas e quaisquer resultados invulgares derivados dos procedimentos de indução e de estimulação deverão ser registados e descritos.É possível utilizar técnicas tais como o exame histopatológico ou a medição da espessura das pregas da pele para clarificar reacções ou respostas duvidosas camufladas pela coloração da pele provocada pela substância de ensaio.2. RESULTADOS (TMPI e teste de Buehler)Os resultados deverão ser resumidos em quadros, apresentando-se para cada animal as reacções cutâneas em cada observação.3. RELATÓRIO (TMPI e teste de Buehler)3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO (TMPI e teste de Buehler)O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- a estirpe do porquinho da Índia utilizada,- as condições de ensaio, o veículo e as concentrações da substância de ensaio utilizadas para as induções e para os estímulos,- número, idade e sexo dos animais,- os pesos individuais dos animais no início e no fim do ensaio,- cada observação efectuada em cada animal, incluindo o sistema de classificação no caso de se utilizar algum,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO (TMPI e teste de Buehler)Ver introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.7. TOXICIDADE (ORAL) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÕESVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhumas.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOA substância de ensaio é administrada diariamente por via oral, em doses graduadas, a diversos grupos de animais de experiência, utilizando-se uma dose por grupo durante um período de 28 dias. Durante o período de administração observam-se os animais diariamente para se detectarem manifestações de toxicidade. Faz-se a autópsia dos animais mortos durante o ensaio e no final do ensaio faz-se também a autópsia dos animais que sobreviveram ao teste.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosOs animais são mantidos sob as condições de alojamento e alimentação experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio. Antes dos ensaios procede-se a uma escolha aleatória de animais adultos, jovens e saudáveis e são distribuídos por grupos de tratamento. A substância de ensaio pode ser administrada na dieta, através de um tubo inserido no estômago, em cápsulas, ou na água de beber. A administração das doses a todos os animais deve ser feita pelo mesmo método durante todo o período experimental. No caso de se utilizar um veículo ou outro tipo de aditivos para facilitar a administração das doses, devem ser comprovadamente isentos de efeitos tóxicos. Podem ser utilizados dados de experiências anteriores, se necessário.1.6.2. Condições experimentais1.6.2.1. Animais de experiênciaSalvo contra-indicação, a espécie preferida é o rato. Devem ser utilizados animais jovens e saudáveis de estirpes vulgarmente utilizadas em laboratório, considerando-se ideal começar a administração da substância antes dos ratos atingirem a idade de seis semanas, mas nunca depois de terem atingido as oito semanas de idade.No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá exceder ± 20 % do peso médio apropriado.1.6.2.2. Número e sexoPara cada dose serão utilizados pelo menos 10 animais (cinco fêmeas e cinco machos). As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência, deve acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê vir a sacrificar. Para além destes, poderá haver um grupo satélite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante 28 dias e observado quanto à reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante 14 dias após o tratamento. Utiliza-se também um grupo satélite de 10 animais de controlo (cinco animais de cada sexo).1.6.2.3. DosesSão utilizadas pelo menos três doses diferentes e um controlo. Os animais do grupo de controlo serão tratados da mesma maneira que os animais dos grupos da experiência com a excepção do tratamento com a substância a ensaiar. Se se utilizar um veículo para facilitar a administração, este será administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados e o volume recebido deverá corresponder ao do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada deve produzir efeitos tóxicos mas não provocar nenhuma ou poucas mortes. A dose mais baixa não deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. Se se disposer de informação sobre a exposição humana, a dose mais baixa deverá ser inferior ao seu valor. O ideal seria uma dose intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observável. Se se utilizar várias doses intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos. Nos grupos das doses mais baixa e intermédia, assim como no grupo de controlo, a incidência de mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.Quando a substância de ensaio for incorporada na alimentação pode utilizar-se uma concentração alimentar constante (ppm ou mg/kg de alimento) ou uma dose constante em relação com o peso corporal dos animais; deve ser especificado o método escolhido. No caso de uma substância administrada por entubação, a dose deve ser administrada diariamente, sempre à mesma hora. As doses serão modificadas semanal ou bissemanalmente afim de se manter uma dose constante em relação ao peso corporal do animal.1.6.2.4. Teste-limiteSe já tiver sido efectuado um teste de 28 dias de acordo com o método a seguir descrito, com uma dose de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia ou com uma dose mais elevada em função da possibilidade de uma exposição humana - quando conhecida - que não tenha provocado qualquer efeito tóxico, será inútil prosseguir a experiência. Quando se trata de substâncias pouco tóxicas incorporadas na alimentação é importante assegurar que as quantidades e outras propriedades da substância de ensaio não interferem com as exigências normais da nutrição.1.6.2.5. Período de observaçãoTodos os animais devem ser observados diariamente e registados os sinais de toxicidade bem como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e duração. Deve ser registado o momento da morte e os momentos de aparecimento e desaparecimento das manifestações de toxicidade.1.6.3. ProcedimentoNas condições ideais a substância de ensaio será administrada aos animais sete dias por semana durante um período de 28 dias. Os animais de todos os grupos satélites que forem objecto de observações complementares serão mantidos vivos durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou persistência dos efeitos tóxicos.Durante o período de observação dos animais convém registar todas as alterações da pele e do pêlo, dos olhos e membranas mucosas, assim como dos aparelhos respiratório e circulatório, dos sistemas nervosos autónomo e central, da actividade somatomotora e do comportamento. Deve determinar-se semanalmente o consumo alimentar (e o consumo de água quando a substância de ensaio for administrada na água de beber) e também o peso dos animais.Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possível, causadas por canibalismo, autólise dos tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiência todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apresentem graves sintomas de angústia ou dor deverão ser imediatamente retirados, sacrificados e submetidos a autópsia.Os exames a seguir enunciados deverão ser efectuados no fim do período de ensaio para todos os animais incluindo os controlos:1. Um exame hematológico compreendendo os seguintes testes: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem de leucócitos, fórmula leucocitária, bem como um estudo sobre o potencial de coagulação;2. A determinação de dados bioquímicos do sangue incluindo pelo menos um parâmetro da função hepática e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-pirúvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-oxalo-acética), azoto ureíco, albumina, creatinina plasmática, bilirrubina total e proteínas séricas totais.As outras análises eventualmente necessárias para uma avaliação toxicológica adequada incluem as análises de cálcio, fósforo, cloretos, sódio, potássio, glicose em jejum, análises de lípidos, de hormonas, equilíbrio ácido-básico, meta-hemoglobina, e actividade colinesterásica. Pode recorrer-se a outras análises bioquímicas clínicas sempre que necessário para melhorar a investigação dos efeitos observados.1.6.3.1. AutópsiaTodos os animais submetidos a experiência deverão ser submetidos a uma autópsia geral. Pelo menos o fígado, os rins, as glândulas supra-renais e os testículos deverão ser pesados ainda húmidos, tão cedo quanto possível após a dissecação para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Tanto os orgãos como os tecidos (fígado, rim, baço, testículos, glândulas supra-renais, coração e quaisquer orgãos que apresentem lesões graves ou alterações de volume) deverão ser conservados num meio adequado para um eventual exame histopatológico futuro.1.6.3.2. Exame histopatológicoNo grupo tratado com a dose mais elevada e no grupo de controlo deve efectuar-se o exame histológico dos orgãos e tecidos conservados. Os orgãos e tecidos que apresentem efeitos susceptíveis de serem atribuídos à substância de ensaio administrada na dose mais elevada, deverão ser examinados em todos os grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histológico dos animais de qualquer grupo satélite, com particular enfâse sobre os orgãos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros grupos tratados.2. RESULTADOSOs resultados serão resumidos na forma de quadros indicando, para cada experiência, o número de animais no início do ensaio e o número de animais que apresenta cada tipo de lesão.Todos os resultados observados deverão ser avaliados por um método estatístico apropriado. Pode ser utilizado qualquer método estatístico reconhecido.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- espécie, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.,- condições experimentais,- doses (incluindo o veículo, se utilizado) e concentrações,- resposta tóxica por sexo e por dose,- dose sem efeito, se possível,- momento da morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes no fim da experiência,- efeitos tóxicos ou outros,- momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,- dados relativos à alimentação e peso corporal,- exames hematológicos efectuados e resultados,- provas bioquímicas clínicas utilizadas e seus resultados,- resultados da autópsia,- descrição pormenorizada de todos os resultados histopatológicos,- tratamento estatístico dos resultados, se possível,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.8. TOXICIDADE (INALAÇÃO) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOÉ útil possuir informações preliminares sobre a distribuição granulométrica, a pressão de vapor, o ponto de fusão, o ponto de ebulição, o ponto de inflamação e a explosividade (se aplicável) da substância.Ver também a introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOVários grupos de animais de experiência são expostos diariamente, por um período determinado, a concentrações diferentes das substâncias a ensaiar, à razão de uma concentração por grupo, durante um período de 28 dias. No caso de se utilizar um veículo para auxiliar a obter uma concentração apropriada da substância de ensaio na atmosfera, deve utilizar-se um grupo de controlo para o veículo. Durante o período de administração os animais são observados diariamente para se detectar as manifestações de toxicidade. Os animais que morrem durante a experiência são autopsiados e no fim da experiência os animais sobreviventes são igualmente autopsiados.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosOs animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimentação da experiência pelo menos durante cinco dias antes do ensaio. Antes de se começar o ensaio os animais jovens e saudáveis são distribuídos aleatoriamente pelos grupos submetidos ao tratamento e pelo grupo de controlo. Se necessário pode adicionar-se um veículo à substância de ensaio para se conseguir uma concentração apropriada desta na atmosfera; no caso de se utilizar um veículo ou outros aditivos para facilitar a administração, devem ser comprovadamente não tóxicos. Pode recorrer-se a dados anteriormente publicados, se necessário.1.6.2. Condições da experiência1.6.2.1. Animais de experiênciaSalvo contra-indicação a espécie preferida é o rato. Devem utilizar-se animais jovens e saudáveis de uma estirpe vulgarmente utilizada em laboratório. No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar ± 20 % do peso médio apropriado.1.6.2.2. Número e sexoPara cada grupo de ensaio serão utilizados pelo menos 10 animais (cinco fêmeas e cinco machos). As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência, deve acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê vir a sacrificar. Para além destes, poderá haver um grupo satélite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante 28 dias e observado quanto à reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante 14 dias após o tratamento. Utiliza-se também um grupo satélite de 10 animais de controlo (cinco animais de cada sexo).1.6.2.3. Concentração de exposiçãoSão utilizadas pelo menos três concentrações, com um grupo de controlo ou, se necessário, com um grupo de controlo para o veículo quando este for utilizado (correspondendo à concentração do veículo ao nível de exposição mais elevada). Os animais do grupo de controlo são tratados da mesma forma que os animais dos grupos de experiência com excepção da inalação da substância de ensaio. A concentração mais elevada deverá produzir efeitos tóxicos mas nenhuma ou poucas mortes. A menor concentração não deverá produzir quaisquer manifestações de toxicidade. No caso de se dispôr de informação sobre a exposição humana, a concentração mais baixa será superior a esse valor. O ideal seria a concentração intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observável. No caso de se utilizar várias concentrações intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos. Nos grupos de concentração baixa e intermédia, assim como nos grupos de controlo, a incidência de mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.1.6.2.4. Tempo de exposiçãoA duração da exposição diária deverá ser de seis horas, podendo utilizar-se outros períodos para satisfazer exigências específicas.1.6.2.5. EquipamentoOs animais serão expostos à substância de ensaio por meio de um dispositivo de inalação concebido de forma a conseguir-se um fluxo de ar contínuo que assegurará pelo menos 12 renovações de ar por hora e que garanta uma concentração de oxigénio apropriada e uma distribuição uniforme do produto de ensaio no ar. No caso de se utilizar uma câmara, esta será concebida de maneira a obter-se uma superlotação mínima dos animais e uma exposição máxima à substância de ensaio. Como regra geral, para se assegurar a estabilidade da atmosfera na câmara, o «volume» total dos animais de experiência não deverá ultrapassar 5 % do volume da câmara de ensaio. Pode recorrer-se também a um sistema de exposição oro-nasal, apenas de cabeça ou do corpo inteiro, em câmara individual; os dois primeiros tipos de exposição permitem reduzir a penetração por outras vias.1.6.2.6. Período de observaçãoOs animais da experiência deverão ser observados diariamente para se detectar manifestações de toxicidade durante todo o período de exposição e de recuperação. Proceder-se-á ao registo do momento da morte e bem assim do momento do aparecimento e desaparecimento das manifestações de toxicidade.1.6.3. ProcedimentoOs animais são expostos diariamente à substância de ensaio, cinco a sete dias por semana, durante um período de 28 dias. Os animais dos grupos satélites destinados às observações complementares serão mantidos vivos durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou persistência dos efeitos tóxicos. A temperatura a que se efectua o ensaio deverá ser mantida a 22 ± 3  C.Em condições óptimas, a humidade relativa deverá ser mantida entre 30 % e 70 % mas, nalguns casos, isto pode ser impraticável (por exemplo, nos ensaios com aerossóis). A manutenção de uma pressão ligeiramente negativa no interior da câmara de ensaio (&le; 5 mm de água) evitará a fuga da substância de ensaio para o meio envolvente. Durante a exposição os animais não receberão alimentos nem água.Deverá ser utilizado um sistema de inalação dinâmico com um dispositivo apropriado de controlo analítico da concentração. Recomenda-se a realização de um ensaio preliminar para se determinar as concentrações apropriadas de exposição. O débito de ar deverá assegurar concentrações homogéneas em toda a câmara de exposição. O sistema deverá permitir a obtenção de condições estáveis o mais rapidamente possível.Deverá ser feita a medição ou monitorização de:a) Débito de ar (permanentemente);b) A concentração real da substância de ensaio medida na zona de respiração. Durante o período de exposição diária a concentração não variará além de ± 15 % do valor médio. Contudo, no caso de alguns aerossóis esta precisão pode não ser possível e poderá ser aceitável uma variação maior. Durante toda a duração da experiência as concentrações diárias serão mantidas o mais constantes possível. Para os aerossóis dever-se-á efectuar semanalmente e por grupo de ensaio pelo menos uma análise granulométrica das partículas.c) Temperatura e humidade, continuamente se for possível.Durante e após a exposição às concentrações são feitas observações e registadas sistematicamente; são feitas fichas individuais para cada animal. Todos os animais serão observados diariamente e as manifestações de toxicidade, assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua duração, serão registados. As observações deverão incluir as modificações da pele e do pêlo, dos olhos, das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, da actividade somatomotora e do comportamento. Determinar-se-á semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se também a determinação do consumo alimentar semanal. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possível, causadas por canibalismo, autólise dos tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiência todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apresentem graves sintomas de angústia ou dor deverão ser imediatamente retirados, sacrificados e submetidos a autópsia.Os exames a seguir enunciados deverão ser efectuados no fim do período de ensaio para todos os animais incluindo os controlos:i) Um exame hematológico compreendendo os seguintes testes: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem de leucócitos, fórmula leucocitária, bem como um estudo sobre o potencial de coagulação;ii) A determinação de dados bioquímicos do sangue incluindo pelo menos um parâmetro da função hepática e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-pirúvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-oxalo-acética), azoto ureíco, albumina, creatinina plasmática, bilirubina total e as proteínas séricas totais.As outras análises eventualmente necessárias para uma avaliação toxicológica adequada incluem as análises de cálcio, fósforo, cloretos, sódio, potássio, glicose em jejum, análises de lípidos, de hormonas, equilíbrio ácido-básico, meta-hemoglobina, e actividade colinesterásica.Pode recorrer-se a outras análises bioquímicas clínicas sempre que necessário para melhorar a investigação dos efeitos observados.1.6.3.1. AutópsiaTodos os animais submetidos a experiência deverão ser submetidos a uma autópsia geral. Pelo menos o fígado, os rins, as glândulas supra-renais, pulmões e os testículos deverão ser pesados ainda húmidos, tão cedo quanto possível após a dissecação para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Tanto os orgãos como os tecidos (tracto respiratório, fígado, rim, baço, testículos, glândulas supra-renais, coração e quaisquer orgãos que apresentem lesões graves ou alterações de volume) deverão ser conservados num meio adequado para um eventual exame histopatológico futuro. Os pulmões deverão ser removidos intactos, pesados e tratados com um fixador adequado para se garantir que a estrutura do pulmão é mantida.1.6.3.2. Exame histopatológicoNo grupo tratado com a concentração mais elevada e nos grupos de controlo o exame histológico deverá ser efectuado em orgãos e tecidos conservados. Os orgãos e tecidos que apresentem efeitos susceptíveis de serem atribuídos à substância de ensaio administrada na dose mais elevada deverão ser examinados em todos os grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histológico dos animais de qualquer grupo satélite com particular enfâse sobre os orgãos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros grupos tratados.2. RESULTADOSOs resultados serão resumidos na forma de quadros indicando, para cada experiência, o número de animais no início do ensaio e o número de animais que apresenta cada tipo de lesão.Todos os resultados observados deverão ser avaliados por um método estatístico apropriado. Pode ser utilizado qualquer método estatístico reconhecido.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- Espécie, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.;- Condições experimentais;Descrição do aparelho de exposição incluindo projecto, tipo, dimensões, fonte de ar, sistema gerador de aerossóis, método de condicionamento de ar, tratamento do ar evacuado e, no caso disso, o método de acondicionamento dos animais na câmara de ensaio. Deve apresentar-se uma descrição do equipamento utilizado para medir a temperatura, a humidade, e se necessário, a estabilidade das concentrações do aerossol ou da distribuição granulométrica das partículas.Dados relativos à exposição:Estes dados serão apresentados sob a forma de um quadro indicando os valores médios, assim como uma medida de variação (por exemplo, o desvio-padrão) e dirão respeito:a) Aos débitos de ar através do dispositivo de inalação;b) À temperatura e à humidade do ar;c) Às concentrações nominais (quantidade total da substância de ensaio introduzida no dispositivo de inalação, dividida pelo volume de ar);d) À natureza do veículo, se utilizado;e) Às concentrações reais na zona de respiração;f) Ao diâmetro aerodinâmico médio de massa (DAMM) e ao desvio-padrão geométrico (DPG);- resposta tóxica por sexo e por concentração,- momento da morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes,- descrição dos efeitos tóxicos ou outros; dose que não produz efeito,- momento de observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,- dados relativos à alimentação e peso corporal,- exames hematológicos efectuados e seus resultados,- testes bioquímicos clínicos utilizados e seus resultados,- resultados da autópsia,- descrição pormenorizada de todas as observações histopatológicas,- tratamento estatístico dos resultados sempre que possível,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.9. TOXICIDADE (DÉRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÕESVer introdução geral, parte B (ponto B).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOAdministra-se à pele diariamente a substância de ensaio, em doses graduadas, a diversos grupos de animais de experiência, utilizando-se uma dose por grupo durante um período de 28 dias. Durante o período de administração observa-se os animais diariamente para se detectar manifestações de toxicidade. Faz-se a autópsia dos animais mortos durante o ensaio e no final do ensaio faz-se também a autópsia dos animais que sobreviveram ao teste.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosOs animais são mantidos sob as condições de alojamento e alimentação experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatória de animais adultos, jovens e saudáveis e que são distribuídos por grupos de tratamento. Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapa-se os pêlos da região dorsal dos animais. No caso de se recorrer à tosquia esta deverá ser efectuada aproximadamente 24 horas antes do ensaio. Normalmente é necessário repetir estas operações todas as semanas, devendo tomar-se muito cuidado para não lesar a pele. A área destinada à aplicação da substância de ensaio não poderá ser inferior a 10 % da superfície corporal. O peso do animal deverá ser tomado em consideração na decisão da zona a expor e da dimensão da superfície a tratar. Sempre que se procede ao ensaio de substâncias sólidas, as quais podem ser pulverizadas se necessário, a substância de ensaio deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. As substâncias de ensaio líquidas são geralmente utilizadas sem serem diluídas. Procede-se a uma aplicação diária durante cinco a sete dias por semana.1.6.2. Condições da experiência1.6.2.1. Animais de experiênciaPodem ser utilizados ratos adultos, coelhos ou cobaias. Outras espécies poderão ser utilizadas mas a sua utilização deverá ser justificada.No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar ± 20 % do peso médio apropriado.1.6.2.2. Número e sexoPara cada grupo de ensaio serão utilizados pelo menos 10 animais (cinco fêmeas e cinco machos) com pele saudável. As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a experiência, deve acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê vir a sacrificar. Para além destes, poderá haver um grupo satélite de 10 animais (cinco animais de cada sexo) tratado com a dose mais elevada durante 28 dias e observado quanto à reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante 14 dias após o tratamento. Utiliza-se também um grupo satélite de 10 animais de controlo (cinco animais de cada sexo).1.6.2.3. DosesSão necessárias pelo menos três doses diferentes com um controlo ou com um veículo de controlo no caso de ser utilizado um veículo. O período de exposição deverá ser no mínimo de seis horas por dia. A substância de ensaio será aplicada diariamente à mesma hora e a quantidade a administrar será ajustada regularmente (semanal ou bissemanalmente) de modo a manter-se constante relativamente ao peso corporal do animal. Os animais do grupo de controlo serão tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de experiência, com excepção da aplicação da substância de ensaio. No caso de se utilizar um veículo para facilitar a administração, este será administrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose corresponder à do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada será determinada de forma a produzir efeitos tóxicos mas nunca, ou raramente, a morte do animal. A dose mais baixa não deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. No caso de se dispor de informação sobre a exposição humana, a dose mais baixa deverá exceder esse valor. O ideal seria a dose intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observado. No caso de se utilizar várias doses intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos tóxicos. Nos grupos das doses mais baixa e intermédia, assim como nos grupos de controlo, a incidência da mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.No caso de a aplicação da substância de ensaio provocar uma grave irritação cutânea, dever-se-á reduzir as concentrações, o que poderá originar uma diminuição ou até um desaparecimento dos outros efeitos tóxicos da dose mais elevada. Se as lesões cutâneas forem muito graves, pode tornar-se necessário interromper a experiência e recomeçá-la com concentrações mais fracas.1.6.2.4. Teste limiteSe já tiver sido efectuada uma experiência preliminar com uma dose de 1 000 mg/kg ou com uma dose mais elevada em função da possibilidade de uma exposição humana conhecida, que não tenha provocado quaisquer efeitos tóxicos, será inútil prosseguir a experiência.1.6.2.5. Período de observaçãoOs animais da experiência serão observados diariamente para se detectar manifestações de toxicidade. Proceder-se-á ao registo do momento da morte e do momento do aparecimento e do desaparecimento das manifestações de toxicidade.1.6.3. ProcedimentoOs animais serão colocados em gaiolas individuais. Em condições ideais a substância de ensaio será administrada aos animais sete dias por semana durante um período de 28 dias. Os animais de todos os grupos satélite que forem objecto de observações complementares serão mantidos vivos durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou a persistência dos efeitos tóxicos. O tempo de exposição será pelo menos de seis horas por dia.A substância de ensaio será aplicada uniformemente numa área equivalente a 10 % da superfície total do corpo. No caso de substâncias altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor mas a camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme possível.Durante a exposição a substância de ensaio é mantida em contacto com a pele por meio de uma gaze porosa e de um adesivo antialérgico. A superfície tratada será por sua vez convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substância de ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a referida substância. É possível utilizar aparelhos de contenção para evitar a ingestão da substância, mas não se recomenda a imobilização completa. Como alternativa pode utilizar-se uma «coleira de protecção».No fim do tempo de exposição é necessário, se possível, eliminar todos os resíduos da substância utilizando água ou recorrendo a qualquer outro método adequado para limpeza da pele.Os animais serão observados diariamente, registando-se sempre as manifestações de toxicidade assim como o momento do seu aparecimento, a sua intensidade e a sua duração. Proceder-se-á à observação das modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, assim como da actividade somatomotora e do comportamento. Determinar-se-á semanalmente o peso dos animais. Recomenda-se também que se determine semanalmente o consumo alimentar. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possível, causadas por canibalismo, autólise dos tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiência todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apresentem graves sintomas de angústia ou dor deverão ser imediatamente retirados, sacrificados e submetidos a autópsia.Os exames a seguir enunciados deverão ser efectuados no fim do período de ensaio para todos os animais incluindo os controlos:1. Um exame hematológico compreendendo os seguintes testes: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem de leucócitos, fórmula leucocitária, bem como um estudo sobre o potencial de coagulação.2. A determinação de dados bioquímicos do sangue incluindo pelo menos um parâmetro da função hepática e renal: alanina aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-pirúvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-oxalo-acética), azoto ureíco, albumina, creatinina plasmática, bilirrubina total e as proteínas séricas totais.As outras análises eventualmente necessárias para uma avaliação toxicológica adequada incluem as análises de cálcio, fósforo, cloretos, sódio, potássio, glicose em jejum, análises de lípidos, de hormonas, equilíbrio ácido-básico, meta-hemoglobina, e actividade colinesterásica.Pode recorrer-se a outras análises bioquímicas clínicas sempre que necessário para melhorar a investigação dos efeitos observados.1.6.4. AutópsiaTodos os animais submetidos a experiência deverão ser submetidos a uma autópsia geral. Pelo menos o fígado, os rins, as glândulas supra-renais e os testículos deverão ser pesados ainda húmidos, tão cedo quanto possível após a dissecação para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Todos os orgãos e tecidos, isto é, pele normal e tratada, fígado, rins, baço, testículos, glândulas supra-renais, coração e orgãos alvo (isto é, os orgãos que apresentem lesões graves ou variações de volume) deverão ser conservados num meio adequado para eventual exame histopatológico futuro.1.6.5. Exame histopatológicoNo grupo tratado com a dose mais elevada e no grupo de controlo deve efectuar-se o exame histológico dos orgãos e tecidos conservados. Os orgãos e tecidos que apresentem efeitos susceptíveis de serem atribuídos à substância de ensaio administrada na dose mais elevada deverão ser examinados em todos os grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histológico dos animais de qualquer grupo satélite com particular enfâse sobre os orgãos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros grupos tratados.2. RESULTADOSOs resultados serão resumidos na forma de quadros indicando, para cada experiência, o número de animais no início do ensaio e o número de animais que apresenta cada tipo de lesão.Todos os resultados observados deverão ser avaliados por um método estatístico apropriado. Pode ser utilizado qualquer método estatístico reconhecido.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- dados sobre os animais (espécie, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.),- condições experimentais (incluindo o tipo de cobertura: oclusiva ou não oclusiva),- doses (incluindo o veículo, se utilizado) e concentrações,- dose sem efeito, se possível,- resposta tóxica por sexo e por dose,- momento da morte durante a experiência ou indicação dos animais sobreviventes no fim da experiência,- efeitos tóxicos ou outros,- momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua evolução,- dados relativos à alimentação e peso corporal,- exames hematológicos efectuados e resultados,- provas bioquímicas clínicas utilizadas e seus resultados,- resultados da autópsia,- descrição pormenorizada de todos os resultados histopatológicos,- tratamento estatístico dos resultados, se possível,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.10. MUTAGÉNESE: TESTE CITOGENÉTICO «IN VITRO» EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto C).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOO teste citogenético in vitro é um teste de mutagénese de curto prazo para a detecção de aberrações cromossómicas estruturais em células de mamíferos num meio de cultura. Pode utilizar-se culturas de linhas celulares estabelecidas e também culturas de células primárias. Após exposição às substâncias químicas de ensaio, com e sem um sistema de activação metabólico apropriado, as culturas celulares são tratadas com inibidores do fuso tais como a colchicina a fim de acumular células numa fase da mitose idêntica à metafase (c-metafase). As células são recolhidas em momentos apropriados e fazem-se preparações de cromossomas. Procede-se à coloração das preparações e efectua-se a análise das anormalidades cromossómicas das células da metafase.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. Preparativos1.6.1.1. CélulasUtilizam-se linhas celulares estabelecidas ou culturas de células primárias, por exemplo, células de hamster chinês e linfócitos humanos. As substâncias químicas de ensaio são preparadas num meio de cultura ou dissolvidas em veículos apropriados antes do tratamento das células.1.6.1.2. Sistema de activação metabólicaAs células deverão ser expostas à substância de ensaio na presença e na ausência de um sistema de activação metabólico apropriado. O método mais frequentemente utilizado consiste na adição da fracção pós-mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tratados previamente por indutores enzimáticos e adicionada de cofactores.1.6.2. Condições do ensaioNúmero de culturas:Para cada ponto experimental utilizam-se pelo menos duas culturas.Utilização de controlos negativos e positivos:Utilizam-se como controlos negativos o solvente (no caso de o solvente não ser o meio de cultura ou a água), a mistura de activação da enzima hepática, a mistura de activação da enzima hepática e solvente, e controlos não tratados.Em cada experiência incluiu-se um controlo positivo; quando a mistura de activação da enzima hepática for utilizada para activar a substância química de ensaio, deve utilizar-se como controlo positivo um composto conhecido que proporcione a activação metabólica.Doses:Utilizam-se pelo menos três doses do composto de ensaio, situadas num intervalo mínimo de uma unidade logarítmica. A dose máxima deverá inibir a actividade mitótica em aproximadamente 50 % ou exibir qualquer outra indicação de citotoxicidade. Se não for tóxica, a substância de ensaio deverá ser testada até ao limite de solubilidade ou até à concentração máxima de 5 mg/ml.Condições da cultura:Utiliza-se um meio de cultura apropriado e condições de incubação adequadas (por exemplo, temperatura, recipientes da cultura utilizados, concentrações de CO2 e humidade).1.6.3. Procedimento1.6.3.1. Preparação de culturasLinhas celulares estabelecidas: as células são geradas a partir de culturas «mãe» (por exemplo, por tripsinização ou por agitação), são semeadas em recipientes de cultura com uma densidade apropriada e são incubadas à temperatura de 37  C.Linfócitos humanos: adiciona-se ao meio de cultura sangue humano heparinizado contendo fito-hemaglutinina, soro de vitela fetal e antibióticos e faz-se a incubação à temperatura de 37  C.1.6.3.2. Tratamento das culturas com o composto de ensaioi) Tratamento sem a mistura de activação da enzima hepáticaSempre que possível todos os tratamentos devem durar pelo menos o período de um ciclo celular completo e os sistemas de fixação deverão garantir a análise, após o tratamento, das primeiras mitoses de células tratadas, em diferentes fases do ciclo.No caso de o tratamento não ter uma duração correspondente a um ciclo celular completo os tempos de fixação são escolhidos de modo a fazer a amostragem de células que se encontrem em fases diferentes do ciclo celular durante o tratamento, isto é, G1, S e G2.O composto químico é adicionado às culturas de linhas celulares estabelecidas quando estas se encontram na fase exponencial de crescimento. As culturas de linfócitos humanos são tratadas quando ainda se encontram num estado de semi-sincronização.ii) Tratamento com a mistura de activação da enzima hepáticaPara o tratamento, o composto de ensaio combinado com o sistema de activação deve estar presente durante tanto tempo quanto possível sem exercer sobre as células um efeito tóxico. Se por razões de toxicidade este tratamento não tiver a duração de um ciclo celular completo, os tempos de fixação são escolhidos de modo a permitir a amostragem de células que se encontrem em fases diferentes do ciclo celular durante o tratamento, isto é, G1, S e G2.Colheita de células:As culturas celulares são tratadas com um inibidor do fuso durante um período de tempo apropriado antes da colheita. Cada cultura é colhida e processada separadamente para a preparação dos cromossomas.É necessário efectuar as colheitas em pelo menos dois momentos diferentes. Recomenda-se que um desses momentos seja aproximadamente o correspondente a um ciclo celular e que o outro ocorra mais tarde. Com isto pretende-se garantir que foram abrangidas todas as fases do ciclo celular prevenindo-se o atraso do ciclo celular.1.6.3.3. Preparação dos cromossomasAs preparações de cromossomas implicam o tratamento hipotónico das células, a fixação, o espalhamento sobre as lâminas e a coloração.Análise:Efectua-se a análise das aberrações cromossómicas em pelo menos 100 metafases de boa qualidade, por cultura. As lâminas são codificadas antes da análise. Para os linfócitos humanos apenas são analisadas as metafases que contêm 46 centrómeros.Nas linhagens celulares estabelecidas, só são analisadas as metafases que contêm ± 2 centrómeros do número modal.Para cada dose deve avaliar-se adicionalmente durante o ensaio o índice mitótico ou qualquer outro indicador de citotoxicidade, quando apropriado.2. RESULTADOSOs resultados deverão ser apresentados sob a forma de quadros. Para todas as culturas tratadas e de controlo enumeram-se separadamente as aberrações de tipo cromatídico (lacunas, rupturas, permutas), aberrações de tipo cromossómico (por exemplo, lacunas, rupturas, unidades, anéis, cromossomas dicêntricos, cromossomas policêntricos) e o número de metafases aberrantes (lacunas inclusivas e exclusivas).Os resultados devem ser tratados por métodos estatísticos apropriados.Os resultados dos ensaios devem ser comparados com controlos negativos simultâneos.Efectuam-se pelo menos duas experiências independentes. Contudo pode ser suficiente uma única experiência se houver justificação científica. Não é necessário efectuar a segunda experiência por um processo idêntico ao da experiência inicial. Na realidade pode ser preferível alterar algumas condições de ensaio no sentido de proporcionar dados mais úteis.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- células utilizadas,- condições de ensaio: composição do meio, concentração de CO2, temperatura de incubação, tempo de incubação, doses, tempo de tratamento, duração do tratamento com o inibidor do fuso utilizado e sua concentração, tipo de mistura de activação da enzima hepática utilizada, controlos positivos e negativos,- número de culturas celulares,- número de metafases analisadas (apresentando-se os dados separadamente para cada cultura),- índice mitótico ou qualquer outro indicador de citotoxicidade,- tipo e número de aberrações apresentadas separadamente para cada cultura tratada e de controlo, número modal de cromossomas nas linhas celulares estabelecidas utilizadas,- avaliação estatística,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Ver introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.11. TESTE CITOGENÉTICO «IN VIVO» EM MEDULA ÓSSEA DE MAMÍFEROS, ANÁLISE CROMOSSÓMICA 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto C).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOO teste citogenético in vivo é um teste de mutagénese de curto prazo para a detecção de aberrações cromossómicas estruturais em células de mamíferos num meio de cultura. As aberrações cromossómicas são avaliadas geralmente nas primeiras mitoses após o tratamento. Com os mutagenes químicos a maior parte das aberrações induzidas são do tipo cromatídico.O método utiliza células de medula de mamíferos expostos às substâncias químicas de ensaio por vias apropriadas e os quais são sacrificados em intervalos de tempo sequenciais. Antes de serem sacrificados os animais ainda são tratados com um inibidor do fuso tal como a colchicina para acumular células numa fase da mitose idêntica à metafase (c-metafase). A partir das células efectuam-se preparações cromossómicas secas ao ar livre e depois de coradas procede-se à análise microscópica das aberrações cromossómicas das metafases.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosAs substâncias químicas de ensaio são dissolvidas em solução salina normal. No caso de serem insolúveis nessa solução, dissolve-se ou prepara-se uma suspensão em veículos apropriados.Utilizam-se soluções do composto de ensaio preparadas recentemente. No caso de se utilizar um veículo para facilitar a administração da dose, esse veículo não deve interferir com o composto de ensaio ou produzir efeitos tóxicos.1.6.2. Condições de ensaio1.6.2.1. Animais de experiênciaUtilizam-se espécies de roedores tais como ratos, ratinhos ou hamsteres chineses. Os animais adultos, jovens e saudáveis são distribuídos aleatoriamente pelos grupos de tratamento e de controlo.1.6.2.2. Número e sexoUtilizam-se pelo menos cinco fêmeas e cinco machos por grupo de experimentação e por grupo de controlo. Deste modo, serão sacrificados 10 animais por período e por grupo se o programa experimental incluir diversos períodos de ensaio após o tratamento.Para o grupo de controlo positivo é suficiente um único período de amostragem.1.6.2.3. Via de administraçãoDe um modo geral os compostos de ensaio deverão ser administrados apenas uma vez. Tomando como base a informação toxicológica disponível pode praticar-se um tratamento repetido. Todavia, apenas se pode repetir o tratamento se o composto de ensaio não apresentar efeitos citotóxicos para a medula. As vias habituais de administração são a via oral e a injecção intraperitoneal. Há outras vias de administração que podem ser adequadas.1.6.2.4. Utilização de controlos negativos e positivosUtiliza-se como controlo positivo um composto conhecido que produza aberrações cromossómicas in vivo, incluindo-se na concepção de cada experiência um grupo de controlo negativo (solvente).1.6.2.5. DosesPara o conjunto base utiliza-se uma dose do composto de ensaio sendo essa dose a máxima tolerada ou a que produz alguma indicação de citotoxicidade (por exemplo, inibição parcial da mitose).No caso dos compostos «não tóxicos», a dose máxima (limite) que é necessário investigar após a administração da dose única é de 2 000 mg/kg de peso corporal.No caso de se praticar um tratamento repetido, a dose limite é de 1 000 mg/kg de peso corporal por dia.Podem utilizar-se outras doses quando tal for aconselhável por razões científicas.No caso de o ensaio ser utilizado como método para verificação, dever-se-á utilizar pelo menos mais duas doses.1.6.3. ProcedimentoO ensaio pode ser realizado por dois processos:i) Os animais são tratados uma vez com o composto de ensaio, com a mais elevada dose tolerada. Procede-se a uma primeira colheita de amostras decorridas 24 horas após o tratamento. Se os resultados forem claramente positivos nessa fase, não é necessário fazer mais nenhuma amostragem. Todavia, se os resultados forem negativos ou equívocos, uma vez que a cinética do ciclo celular pode ser influenciada pelo composto químico, faz-se uma amostragem mais cedo e outra mais tarde, espaçadas adequadamente, no intervalo compreendido entre 6 e 48 horas.No caso de se utilizar doses adicionais dever-se-á extrair amostras em intervalos de tempo particularmente sensíveis ou, se tal não for conhecido, decorridas 24 horas após o tratamento.ii) Se a informação farmacocinética e a metabólica prescreverem um tratamento repetido, pode utilizar-se uma dosagem repetida e as amostras deverão ser extraídas no intervalo entre 6 e 24 horas após o último tratamento.Preparação de medula:Antes do sacríficio injectam-se os animais intraperitonealmente com uma dose apropriada do inibidor do fuso para se obter um número adequado de células em c-metafase. Obtém-se a medula de ambos os fémures de animais sacrificados recentemente, por lavagem com uma solução isotónica. Após o tratamento hipotónico apropriado, procede-se à fixação das células e ao seu espalhamento sobre lâminas. Após secagem ao ar faz-se a coloração das lâminas.AnáliseAs lâminas são codificadas antes da análise microscópica. Para a observação das aberrações cromossómicas estruturais analisam-se, por animal, pelo menos 50 metafases de boa qualidade com um número completo de centrómeros. Adicionalmente poder-se-á determinar os índices mitóticos para cada animal.2. RESULTADOSOs resultados são apresentados na forma de um quadro. Para todos os animais tratados e de controlo enumeram-se separadamente as aberrações do tipo cromatídico e de tipo isocromatídico (lacunas, roturas, permutas) e os índices mitóticos, se tiverem sido determinados. Apresentam-se também os valores médios e os desvios-padrão para cada grupo de experiência e de controlo. Os dados devem ser analisados por métodos estatísticos apropriados.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DE ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- espécies, estirpe e idade dos animais utilizados,- número de animais por sexo, no grupo tratado e no do controlo,- condições do ensaio: descrição pormenorizada do programa de tratamento e de amostragem; doses, duração do tratamento com o inibidor do fuso utilizado e sua concentração,- número de metafases analizadas por animal,- índices mitóticos; se tiverem sido determinados,- tipo e número de aberrações apresentadas separadamente para cada animal tratado e de controlo,- sinais de toxicidade no decurso do estudo,- avaliação estatística,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIAVer introdução geral, parte B (ponto E).B.12. MUTAGÉNESE: TESTE DO MICRONÚCLEO 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto C).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOO teste do micronúcleo é um teste de curto prazo em mamíferos in vivo para a detecção de danos cromossómicos ou de danos do aparelho mitótico, provocados por substâncias químicas. A base deste ensaio reside no acréscimo em micronúcleos nos eritrócitos policromáticos de animais tratados, quando comparados com os controlos.Os micronúcleos são formados a partir de fragmentos cromossómicos ou a partir de cromossomas inteiros com atraso na mitose. Quando os eritroblastos se desenvolvem em eritrócitos, o núcleo principal é expelido ao passo que o micronúcleo pode ser mantido no citoplasma. Neste ensaio utilizam-se eritrócitos policromáticos jovens da medula de mamíferos de laboratório expostos às substâncias de ensaio por vias apropriadas. Extrai-se a medula, fazem-se as preparações do exsudado e a sua coloração. Faz-se uma contagem dos micronúcleos dos eritrócitos policromáticos ao microscópio e determina-se a proporção entre eritrócitos policromáticos e normocromáticos.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. PreparativosAs substâncias químicas de ensaio são dissolvidas numa solução isotónica. No caso de serem insolúveis nessa solução serão dissolvidas ou preparar-se-á uma suspensão em veículos apropriados. No caso de se utilizar um veículo, este não deve interferir com o composto de ensaio ou produzir efeitos tóxicos. Normalmente utilizam-se soluções do composto de ensaio preparadas recentemente.1.6.2. Condições de ensaio1.6.2.1. Animais de experiênciaRecomenda-se a utilização de ratinhos mas é possível utilizar outros mamíferos. Os animais adultos, jovens e saudáveis são distribuídos aleatoriamente pelos grupos de tratamento e de controlo.1.6.2.2. Número e sexoUtilizam-se pelo menos cinco fêmeas e cinco machos por grupo de experimentação e por grupo de controlo. Deste modo serão sacrificados 10 animais por período e por grupo se o programa experimental incluir diversos períodos de ensaio após o tratamento. Para o grupo de controlo positivo é suficiente um único período de amostragem.1.6.2.3. Via de administraçãoDe um modo geral os compostos de ensaio deverão ser administrados apenas uma vez. Tomando como base a informação toxicológica disponível pode praticar-se um tratamento repetido. Todavia, apenas se pode repetir o tratamento se o composto de ensaio não apresentar efeitos citotóxicos para a medula. As vias habituais de administração são a via oral e a injecção intraperitoneal. Há outras vias de administração que podem ser adequadas.1.6.2.4. Utilização de controlos negativos e positivosUtilizam-se em cada experiência controlos positivos e negativos (solvente).1.6.2.5. DosesPara o conjunto-base utiliza-se uma dose do composto de ensaio, sendo essa dose a máxima tolerada ou a que produz alguma indicação de citotoxicidade, por exemplo, através de uma alteração na proporção entre eritrócitos policromáticos e normocromáticos.No caso dos compostos «não tóxicos», a dose máxima (limite) que é necessário investigar após a administração da dose única é de 2 000 mg/kg de peso corporal.No caso de se praticar um tratamento repetido, a dose limite é de 1 000 mg/kg de peso corporal por dia.Podem utilizar-se outras doses quando tal for aconselhável por razões científicas.No caso de o ensaio ser utilizado como método para verificação, dever-se-á utilizar pelo menos mais duas doses.1.6.3. ProcedimentoO ensaio pode ser realizado por dois processos:i) Os animais são tratados uma vez com o composto de ensaio. Os momentos de amostragem deverão coincidir com a resposta máxima do ensaio, a qual varia com o composto de ensaio. Em consequência, as amostras de medula são extraídas pelo menos duas vezes depois de terem decorrido pelo menos 12 horas após o tratamento, mas sem exceder o período de 48 horas.No caso de se utilizar doses adicionais dever-se-á extrair amostras em intervalos de tempo particularmente sensíveis ou, se tal não for conhecido, decorridas 24 horas após o tratamento.ii) Se a informação farmacocinética e a metabólica prescreverem um tratamento repetido, pode utilizar-se uma dosagem repetida e as amostras deverão ser extraídas uma vez, depois de terem decorrido pelo menos 12 horas após o último tratamento.Preparação de medulaObtém-se a medula a partir de ambos os fémures de animais sacrificados recentemente por lavagem com soro de vitela fetal. A sedimentação das células é feita por centrifugação e depois elimina-se o sobrenadante. Colocam-se em lâminas gotas da suspensão celular homogénea e faz-se o espalhamento do tipo exsudado. Após a secagem das lâminas ao ar procede-se à sua coloração.Análise:As lâminas são arrefecidas antes da análise microscópica. A pesquisa da incidência de micronúcleos é efectuada através da contagem de pelo menos 1 000 eritrócitos policromáticos por animal.Determina-se para cada animal a proporção entre eritrócitos normocromáticos e policromáticos através da contagem de um número total de 1 000 eritrócitos.2. RESULTADOSOs resultados são apresentados na forma de um quadro. Deste modo, enumera-se separadamente, para cada animal de experiência e de controlo, o número de eritrócitos policromáticos contados, o número de eritrócitos policromáticos com micronúcleos e o valor percentual de células com micronúcleos, determinando-se também a proporção entre eritrócitos normocromáticos e policromáticos. Enumeram-se também os valores médios e os desvios-padrão para cada grupo de experiência e de controlo. Os resultados obtidos são analisados por meio de métodos estatísticos apropriados.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- espécies, estirpe e idade dos animais utilizados,- número de animais por sexo nos grupos de experiência e de controlo,- condições de ensaio: descrição pormenorizada do tratamento e do programa de amostragem, doses, dados sobre toxicidade, controlos negativo e positivo,- critérios para a contagem de micronúcleos,- relação dose/efeito sempre que possível,- manifestações de toxicidade no decurso do estudo,- avaliação estatística,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.13. MUTAGÉNESE: «ESCHERICHIA COLI» - TESTE DE REVERSÃO 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto C).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOO sistema de reversão do triptofano (trp) da Escherichia coli é um ensaio microbiano que mede a reversão trp   . trp+ produzida por substâncias químicas que originam modificações de base no genoma do organismo.As bactérias são expostas às substâncias químicas de ensaio com e sem activação metabólica. Depois de decorrido um período adequado de incubação em meio mínimo, procede-se à contagem de colónias de fenótipos revertidos e faz-se a comparação com o número de fenótipos revertidos espontâneos numa cultura de controlo não tratada e/ou de solvente.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIOUtilizam-se os métodos que se seguem para efectuar o ensaio: 1. o método de pré-incubação; e 2. o método de incorporação directa segundo o qual as bactérias e o agente químico de ensaio são misturados em agar e vertidos sobre a superfície de uma lâmina de agar selectiva.1.6.1. Preparação1.6.1.1. BactériasAs bactérias desenvolvem-se à temperatura de 37  C até ao fim da fase exponêncial ou início da fase estacionária de desenvolvimento. A densidade celular aproximada deve ser de 108 a 109 células por mililitro.1.6.1.2. Activação metabólicaAs bactérias deverão ser expostas à substância de ensaio na presença e na ausência de um sistema de activação metabólico apropriado. O método mais frequentemente utilizado consiste na adição da fracção pós-mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tratados previamente por indutores enzimáticos e adicionada de cofactores.1.6.2. Condições do ensaio1.6.2.1. Estirpes de experiênciaUtilizar-se-ão três estirpes, WP2, WP2 uvr A e WP2 uvr A pKM 101. Devem ser utilizados os métodos reconhecidos para a preparação de culturas «mãe» e para o seu armazenamento. Deve efectuar-se a verificação das necessidades de desenvolvimento e a identidade genética das estirpes, a sua sensibilidade à radiação UV ou à mitomicina C e a resistência da estirpe WP2 uvr A pKM 101 à ampicilina. Essas estirpes deverão também proporcionar fenótipos originais espontâneos com as frequências previsíveis.1.6.2.2. Meios de culturaUtiliza-se um meio apropriado para a expressão e selecção de mutantes em conjunto com agar de cobertura adequado.1.6.2.3. Utilização de controlos negativos e positivosDevem ser efectuados simultâneamente controlos do solvente e dos não tratados. Os controlos positivos devem ser efectuados também para satisfazer dois objectivos:i) Para confirmar a sensibilidade das estirpes bacterianas.Para os ensaios sem activação metabólica podem utilizar-se como controlos positivos o metanosulfonato de metilo, o óxido de 4-nitroquinolina ou etil-nitroso-ureia.ii) Para garantir a actividade dos sistemas de metabolização apropriados.Existe um controlo positivo para a actividade de um sistema de metabolização para todas as estirpes que é o composto 2-amino-antraceno. Sempre que possível deve utilizar-se um controlo positivo pertencente à mesma classe de compostos químicos a que pertence a substância química de ensaio.1.6.2.4. Quantidade de substância de ensaio por lâminaSubmetem-se a ensaio pelo menos cinco quantidades diferentes da substância química de ensaio, com intervalos semilogarítmicos entre lâminas. As substâncias são ensaiadas até ao limite de solubilidade ou de toxicidade. A toxicidade é evidenciada por uma redução do número de fenótipos revertidos espontâneos, uma compensação do recorte de fundo, ou pelo grau de sobrevivência das culturas tratadas. As substâncias químicas não tóxicas deverão ser ensaiadas até 5 mg por placa antes de se considerar negativa a substância de ensaio.1.6.2.5. Condições de incubaçãoAs placas são incubadas por um período de tempo compreendido entre 48 e 72 horas, à temperatura de 37  C.1.6.3. ProcedimentoNo método de incorporação directa na placa sem activação de enzima adicionam-se a substância química de ensaio e 0,1 ml de uma cultura bacteriana recente a 2,0 ml de agar de cobertura. Para os ensaios com activação metabólica, adiciona-se 0,5 ml da mistura de activação da enzima hepática contendo uma quantidade adequada da fracção pós-mitocondrial à cobertura de agar após a adição da substância química de ensaio e das bactérias. Misturam-se os conteúdos de cada tubo e vertem-se sobre a superfície de uma placa de agar selectiva. Deixa-se solidificar o agar de cobertura e procede-se à incubação das placas à temperatura de 37  C durante um período de tempo compreendido entre 48 e 72 horas. No fim do período de incubação faz-se a contagem das colónias de fenótipos revertidos por placa.No caso do método de pré-incubação prepara-se uma mistura da substância química de ensaio, de 0,1 ml de uma cultura bacteriana recente e de uma quantidade adequada de mistura de activação da enzima hepática ou da mesma quantidade de tampão e faz-se a sua pré-incubação antes de se adicionar 2,0 ml de agar de cobertura. Todos os outros procedimentos são idênticos aos descritos para o método de incorporação.A preparação de placas para ambos os métodos é feita pelo menos em triplicado.2. RESULTADOSRegistam-se os números de colónias de fenótipos revertidos por placa, para as séries de controlo e para a tratada. Dever-se-á apresentar as contagens individuais por placa, o número médio de colónias de fenótipos revertidos por placa e os desvios-padrão, tanto para a substância química de ensaio como para os controlos.Os resultados deverão ser analisados utilizando métodos estatísticos apropriados.Devem efectuar-se pelo menos duas experiências independentes. Não é necessário efectuar a segunda experiência por um processo idêntico ao da experiência inicial. Na realidade, pode ser preferível alterar algumas condições de ensaio no sentido de se obter resultados mais úteis.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- bactérias, estirpe utilizada,- condições de ensaio: doses, toxicidade, composição dos meios de cultura, procedimentos de tratamento (pré-incubação, incubação) sistema de activação metabólico, substâncias de referência, controlos negativos,- contagem individual por placa, número médio de colónias de fenótipos revertidos por placa, desvio-padrão, relação dose/efeito sempre que possível,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).B.14. MUTAGÉNESE: «SALMONELLA TYPHIMURIUM» - TESTE DE REVERSÃO 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto A).1.2. DEFINIÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto C).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIANenhuma.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOO sistema de reversão da histidina (his) da Salmonella typhimurium é um ensaio microbiano que mede a reversão his   . his+ provocada por substâncias químicas as quais provocam substituições de base ou mutações por desvio de fase no genoma desse organismo.As bactérias são expostas às substâncias químicas de ensaio com e sem activação metabólica e são colocadas em placas em meio mínimo. Decorrido um período adequado de incubação faz-se a contagem das colónias de fenótipos revertidos e faz-se a comparação com o número de fenótipos revertidos espontâneos numa cultura de controlo não tratada e/ou de solvente.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADENenhum.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. Preparativos1.6.1.1. BactériasAs bactérias desenvolvem-se à temperatura de 37  C até ao fim da fase exponencial ou início da fase estacionária de desenvolvimento. A densidade celular aproximada deve ser de 108 a 109 células por mililitro.1.6.1.2. Activação metabólicaAs bactérias deverão ser expostas à substância de ensaio na presença e na ausência de um sistema de activação metabólico apropriado. O método mais frequentemente utilizado consiste na adição da fracção pós-mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tratados previamente por indutores enzimáticos e adicionada de cofactores.1.6.2. Condições do ensaio1.6.2.1. Estirpes de experiênciaDevem ser utilizadas pelo menos quatro estirpes TA 1535, TA 1537 ou TA 97, TA 98 e TA 100; adicionalmente também é possível utilizar outras estirpes tais como TA 1538 e TA 102. Devem ser utilizados métodos reconhecidos para a preparação e armazenamento de culturas «mãe». É necessário verificar os requisitos para o desenvolvimento e a identidade genética das estirpes, a sua sensibilidade à radiação UV e violeta de cristal, e também a sua resistência à ampicilina. As estirpes deverão proporcionar também fenótipos revertidos espontâneos com as frequências previsíveis.1.6.2.2. Meios de culturaUtiliza-se um meio de cultura selectivo apropriado com um agar de cobertura adequado.1.6.2.3. Utilização de controlos negativos e positivosDevem ser efectuados controlos simultâneos não tratados e de solvente. Os controlos positivos devem ser efectuados também para satisfazer dois objectivos:i) Confirmar a sensibilidade das estirpes bacterianas.É possível utilizar os compostos indicados a seguir para ensaios sem activação metabólica:«Estirpes»«Revertida com»TA 1535, TA 100 Azida de sódioTA 1538, TA 98, TA 972-nitrofluorenoTA 1537 9-aminoacridinaTA 102 hidroperóxido decumenoii) Para garantir a actividade dos sistemas de metabolização apropriados.Existe um controlo positivo para a actividade do sistema de metabolização para todas as estirpes que é o composto 2-amino-antraceno. Sempre que possível deve utilizar-se um controlo positivo pertencente à mesma classe de compostos químicos a que pertence a substância química de ensaio.1.6.2.4. Quantidade de substância de ensaio por lâminaSubmetem-se a ensaio pelo menos cinco quantidades diferentes da substância química de ensaio, com intervalos semilogarítmicos entre lâminas. As substâncias são ensaiadas até ao limite de solubilidade ou de toxicidade. A toxicidade é evidenciada por uma redução do número de fenótipos revertidos espontâneos, uma compensação do recorte de fundo, ou pelo grau de sobrevivência das culturas tratadas. As substâncias químicas não tóxicas deverão ser ensaiadas até 5 mg por placa antes de se considerar negativa a substância de ensaio.1.6.2.5. Condições de incubaçãoAs placas são incubadas por um período de tempo compreendido entre 48 e 72 horas, à temperatura de 37  C.1.6.3. ProcedimentoNo método de incorporação directa na placa sem activação de enzima, adiciona-se a substância química de ensaio e 0,1 ml de uma cultura bacteriana recente a 2,0 ml de agar de cobertura. Para os ensaios com activação metabólica, adiciona-se 0,5 ml da mistura de activação da enzima hepática contendo uma quantidade adequada da fracção pós-mitocondrial à cobertura de agar após a adição da substância química de ensaio e das bactérias. Misturam-se os conteúdos de cada tubo e vertem-se sobre a superfície de uma placa de agar selectiva. Deixa-se solidificar o agar de cobertura e procede-se à incubação das placas à temperatura de 37  C durante um período de tempo compreendido entre 48 e 72 horas. No fim do período de incubação faz-se a contagem das colónias de fenótipos revertidos por placa. No caso do método de pré-incubação prepara-se uma mistura da substância química de ensaio, de 0,1 ml de uma cultura bacteriana recente e de uma quantidade adequada de mistura de activação da enzima hepática ou da mesma quantidade de tampão e faz-se a sua pré-incubação antes de se adicionar 2,0 ml de agar de cobertura. Todos os outros procedimentos são idênticos aos descritos para o método de incorporação.A preparação de placas para ambos os métodos é feita pelo menos em triplicado.2. RESULTADOSRegistam-se os números de colónias de fenótipos revertidos por placa para as séries de controlo e tratada.Dever-se-á apresentar as contagens individuais por placa, o número médio de colónias de fenótipos revertidos por placa e os desvios-padrão, tanto para a substância química de ensaio como para os controlos.Os resultados deverão ser analisados utilizando métodos estatísticos apropriados.Devem efectuar-se pelo menos duas experiências independentes. Não é necessário efectuar a segunda experiência por um processo idêntico ao da experiência inicial. Na realidade, pode ser preferível alterar algumas condições de ensaio no sentido de se obter resultados mais úteis.3. RELATÓRIO3.1. RELATÓRIO DO ENSAIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- bactérias, estirpe utilizada,- condições de ensaio: doses, toxicidade, composição dos meios de cultura, procedimentos de tratamento (pré-incubação, incubação), sistema de activação metabólico, substâncias de referência, controlos negativos,- contagem individual por placa, número médio de colónias de fenótipos revertidos por placa, desvio-padrão, relação dose/efeito sempre que possível,- discussão dos resultados,- interpretação dos resultados.3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃOVer introdução geral, parte B (ponto D).4. REFERÊNCIASVer introdução geral, parte B (ponto E).PARTE C: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA ECOTOXICIDADE C.1. TOXICIDADE AGUDA PARA OS PEIXES 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOO objectivo deste ensaio consiste em determinar a toxicidade letal aguda de uma substância para os peixes de água-doce. Tanto quanto possível é desejável possuir informações sobre a solubilidade na água, a pressão de vapor, a estabilidade química, as constantes de dissociação e a biodegrabilidade da substância para auxiliar a seleccionar o método de ensaio mais apropriado (estático, semiestático ou por escoamento) para garantir concentrações constantes satisfatórias da substância de ensaio durante o período desse ensaio.Ao fazer-se o planeamento do ensaio e a interpretação dos resultados devem tomar-se em consideração as informações adicionais disponíveis (por exemplo, fórmula estrutural, grau de pureza, natureza e percentagem das impurezas significativas, presença e quantidades de aditivos, coeficiente de partição n-octanol/água).1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESA toxicidade aguda é o efeito adverso perceptível induzido num organismo ao fim de um curto período de tempo (alguns dias) de exposição a uma substância. Neste ensaio, exprime-se a toxicidade aguda pelo valor da concentração letal cinquenta (CL50), isto é, a concentração em água que mata 50 % dos peixes que constituem o grupo submetido a ensaio decorrido um período contínuo de exposição o qual deve ser especificado.Todas as concentrações da substância de ensaio são dados em peso por volume (miligramas por litro). As concentrações também podem ser expressas em peso por peso (mg.kg 1).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIAPode fazer-se o ensaio com uma substância de referência para se demonstrar que, sob as condições de ensaio laboratoriais, a resposta das espécies testadas não se modificou significativamente.Para este ensaio não estão especificadas quaisquer substâncias de referência.1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOPode efectuar-se um teste limite para a concentração de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o valor CL50 é superior a esta concentração.Os peixes são expostos à substância de ensaio misturada com água, num determinado intervalo de concentrações, durante um período de 96 horas. Procede-se ao registo do número de mortes em intervalos de 24 horas pelo menos e calcula-se, sempre que possível, as concentrações que matam 50 % dos peixes (CL50) em cada momento de observação.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEOs critérios de qualidade deverão ser aplicados ao teste limite e também no método do teste global.A mortalidade nos controlos não deve exceder o valor de 10 % (ou um peixe no caso de se utilizar menos de dez peixes) no termo do ensaio.A concentração do oxigénio dissolvido deve ser superior a 60 % do valor da saturação com ar.A concentração da substância de ensaio deverá ser mantida a cerca de 80 % do valor da concentração inicial, ao longo do período de duração do ensaio.Para as substâncias que se dissolvem facilmente no meio de ensaio, dando origem a soluções estáveis, isto é, para as substâncias que não são significativamente volatilizáveis, degradáveis, hidrolizáveis ou adsorvidas, pode considerar-se a concentração inicial como equivalente ao valor da concentração nominal. Dever-se-á demonstrar que as concentrações foram mantidas durante todo o ensaio e que os critérios de qualidade foram satisfeitos.Para as substâncias que são:i) fracamente solúveis no meio de ensaio, ouii) susceptíveis de formar emulsões ou dispersões estáveis, ouiii) instáveis em soluções aquosas,pode considerar-se a concentração inicial como sendo a concentração medida na solução (ou, no caso de ser tecnicamente impossível, medida na coluna de água) no início do ensaio. A concentração deverá ser determinada após um período de equilíbrio, mas antes da introdução dos peixes de ensaio.Em quaisquer desses casos é necessário efectuar outras medições durante o ensaio, para se confirmar que as concentrações da exposição e os critérios de qualidade foram respeitados.O valor do pH não deverá variar mais de uma unidade.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIOÉ possível utilizar três tipos de procedimentos:Ensaio estático:Trata-se de um ensaio de toxicidade em que não ocorre qualquer fluxo da solução de ensaio. (As soluções permanecem inalteradas durante o período do ensaio).Ensaio semiestático:Trata-se de um ensaio sem fluxo da solução de ensaio, mas com renovação regular das soluções de ensaio após períodos prolongados (por exemplo, 24 horas).Ensaio por escoamento:Trata-se de um ensaio de toxicidade em que a água é renovada constantemente nas câmaras de ensaio, sendo a substância química de ensaio transportada com a água utilizada para renovar o meio de ensaio.1.6.1. Reagentes1.6.1.1. Soluções das substâncias de ensaioAs soluções de reserva com a concentração pretendida são preparadas dissolvendo a substância em água desionizada ou simplesmente em água, de acordo com o ponto 1.6.1.2.As concentrações escolhidas para o ensaio são preparadas por diluição da solução de reserva. Se se realiza um ensaio com concentrações elevadas, a substância pode ser diluída directamente na água de diluição.Normalmente as substâncias apenas deverão ser testadas até ao limite de solubilidade. Para algumas substâncias (por exemplo, substâncias que possuem fraca solubilidade em água, ou com um valor Pow elevado, ou para aquelas que formam dispersões estáveis em vez de uma verdadeira solução em água), é aceitável efectuar a experiência com uma concentração superior ao limite de solubilidade da substância para garantir a obtenção da máxima concentração solúvel/estável. Todavia é importante que essa concentração não perturbe, por qualquer forma, o sistema de ensaio (por exemplo, formação de uma película da substância sobre a superfície da água evitando a sua oxigenação, etc.).É possível recorrer à dispersão ultrassónica, a solventes orgânicos, a emulsionantes ou a dispersantes para auxiliar a preparação das soluções de reserva de substâncias com fraca solubilidade na água ou para auxiliar a dispersão dessas substâncias no meio de ensaio. Quando se utilizam essas substâncias auxiliares todas as concentrações de ensaio deverão conter a mesma quantidade de substância auxiliar e dever-se-á expor os peixes de ensaio de controlo adicional, a uma concentração da substância auxiliar idêntica à utilizada nas séries de ensaio. A concentração dessas substâncias auxiliares deverá ser mínima e em caso algum deve exceder 100 mg por litro de meio de ensaio.O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do valor de pH. Se houver sinais evidentes de uma alteração nítida dos valores de pH, é aconselhável repetir o ensaio com ajustamento desses valores e efectuar-se o registo dos resultados. Nesse caso ajustar-se-á o valor do pH da solução de reserva para o valor de pH da água de diluição, salvo se houver razões específicas para não se proceder desse modo. Para satisfazer este objectivo é preferível utilizar HCl e NaOH. Este ajustamento do valor do pH deverá ser efectuado de tal modo que a concentração da substância de ensaio na solução de reserva não varie significativamente. No caso de ocorrer qualquer reacção química ou precipitação do composto de ensaio, provocada por esse ajustamento, deve descrever-se tal facto.1.6.1.2. Água de confinação e de diluiçãoUtiliza-se uma fonte de água potável (não contaminada por concentrações potencialmente nocivas de cloro, de metais pesados ou de outras substâncias), água natural de boa qualidade ou água reconstituída (ver apêndice I). É preferível utilizar águas com uma dureza total compreendida entre 10 e 250 mg de CaCO3 por litro e com um valor de pH compreendido entre 6,0 e 8,5.1.6.2. AparelhoTodos os aparelhos devem ser feitos com materiais quimicamente inertes.- sistema de diluição automático (para o ensaio por escoamento),- medidor de oxigénio,- equipamento para a determinação da dureza da água,- aparelho adequado para o controlo de temperatura,- medidor de pH.1.6.3. Peixes de experiênciaOs peixes devem estar em boas condições de saúde e não devem ser portadores de qualquer defeito físico aparente.As espécies utilizadas deverão ser seleccionadas tomando como base critérios práticos tais como a sua fácil disponibilidade ao longo do ano, a facilidade da sua manutenção, a conveniência de os submeter a ensaio, a sua sensibilidade relativa às substâncias químicas, e quaisquer factores económicos, biológicos ou ecológicos significativos. Quando se faz a selecção das espécies de peixes deve ter-se presente a necessidade de efectuar um estudo comparando os resultados obtidos com os resultados existentes relativos à harmonização internacional (referência 1).No apêndice 2 encontra-se uma listagem das espécies de peixes recomendadas para a realização deste ensaio; as espécies preferenciais são o peixe-zebra e a truta-arco-íris.1.6.3.1. ConfinaçãoPreferencialmente os peixes deverão ser provenientes de uma reserva única em que todos possuem a mesma idade e comprimento. Os peixes devem ser confinados durante pelo menos 12 dias nas condições seguintes:Carga:apropriada ao sistema (recirculação ou escoamento) e às espécies de peixes;Água:ver ponto 1.6.1.2;Luz:fotoperíodo diário de 12 a 16 horas;Concentração do oxigénio dissolvido:pelo menos 80 % do valor da saturação com ar;Alimentação:três vezes por semana ou diariamente, cessando 24 horas antes do início do ensaio.1.6.3.2. MortalidadeApós um período de ajustamento de 48 horas procede-se ao registo das mortalidades aplicando os critérios seguintes:- superior a 10 % da população, em sete dias:rejeição de todo o lote,- entre 5 % e 10 % da população:prolonga-se o período de confinação durante mais sete dias. Se não houver mais mortalidades, o lote é aceitável; caso contrário deve ser rejeitado,- menos do que 5 % da população:aceita-se o lote.1.6.4. AdaptaçãoOs peixes devem ser mantidos, nas condições do ensaio relativas à qualidade da àgua e à temperatura, durante pelo menos sete dias antes do início deste.1.6.5. Procedimento de ensaioAntes do ensaio definitivo pode efectuar-se um ensaio preliminar no sentido de se obter informação sobre as concentrações que devem ser utilizadas no ensaio principal.Para além das séries de ensaio efectua-se uma experiência de controlo sem a substância de ensaio, e, se for relevante, efectua-se também uma experiência de controlo contendo a substância auxiliar.Consoante as propriedades físicas e químicas do composto de ensaio, assim será seleccionado um ensaio estático, semiestático ou por escoamento, para satisfazer os critérios de qualidade.Os peixes são expostos à substância de ensaio conforme a seguir descrito:- duração: 96 horas,- número de animais: pelo menos sete para cada concentração,- tanques: com capacidade adequada em relação à carga recomendada,- carga: recomenda-se uma carga máxima de 1,0 g por litro para os ensaios estático e semiestático; para os sistemas de escoamento é aceitável uma carga superior,- concentração de ensaio: utilizar-se-ão pelo menos cinco concentrações afastadas entre si por um factor constante inferior a 2,2, e abrangendo tanto quanto possível o intervalo de mortalidade compreendido entre 0 e 100 %.- água: ver ponto 1.6.1.2,- luz: fotoperíodo diário de 12 a 16 horas,- temperatura: apropriada às espécies (apêndice 2) não variando de ± 1  C para cada ensaio particular,- concentração do oxigénio dissolvido: não inferior a 60 % do valor da saturação com ar, para o valor de temperatura seleccionado,- alimentação: nenhuma.Os peixes são inspeccionados decorridas as duas a quatro horas iniciais e pelo menos em intervalos de 24 horas. Considera-se que os peixes estão mortos se o toque no pedúnculo caudal não produzir qualquer reacção e se não houver movimentos respiratórios visíveis. Regista-se o número de peixes mortos e faz-se a sua remoção.Regista-se também as anomalias visíveis (por exemplo, perda de equilíbrio, alterações do comportamento natatório, função respiratória, pigmentação, etc.).Diariamente proceder-se-á à medição dos valores de pH, do oxigénio dissolvido e da temperatura.Teste-limiteUtilizando o procedimento descrito neste método de ensaio é possível efectuar um teste-limite para a concentração de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o valor CL50 é superior a esta concentração.Se a natureza da substância for tal que não seja possível obter uma concentração de 100 mg por litro, o teste-limite deverá ser efectuado para um valor de concentração igual à solubilidade da substância (ou igual à concentração máxima que forma uma dispersão estável) no meio utilizado (ver também o ponto 1.6.1.1).O teste-limite deverá ser efectuado utilizando sete a dez peixes, utilizando-se o mesmo número nos controlos. (A teoria do binómio estabelece que no caso de se utilizar dez peixes com mortalidade 0, existe um intervalo de confiança de 99,9 % em que o valor CL50 é superior à concentração utilizada no teste-limite. Com sete, oito ou nove peixes, a ausência de mortalidade proporciona um intervalo de confiança de pelo menos 99 % em que o valor CL50 é superior à concentração utilizada).Se houver mortalidade deve efectuar-se um estudo completo. No caso de serem observados efeitos subletais, estes deverão ser registados.2. RESULTADOS E AVALIAÇÃOPara cada período de observações registadas (24, 48, 72 e 96 horas), traça-se a curva da percentagem de mortalidade para cada período de exposição recomendada em função da concentração utilizando papel logarmítmico/probabilidade.Sempre que possível e para cada momento de observação deve estimar-se o valor CL50 e os limites de confiança (p = 0,05), utilizando procedimentos normalizados; esses valores deverão ser aproximados para um ou, no máximo, dois algarismos significativos (exemplos de arredondamento para dois algarismos: de 173,5 para 174; de 0,127 para 0,13; de 1,21 para 1,2).Nos casos em que o declive da curva de resposta concentração/percentagem é muito acentuado para permitir o cálculo do valor CL50, considera-se suficiente uma estimativa gráfica deste valor.No caso de duas concentrações consecutivas, sendo a razão entre elas 2,2, proporcionarem apenas mortalidades de 0 e 100 %, considera-se que esses dois valores são suficientes para indicar o intervalo de localização do valor CL50.No caso de se verificar que a estabilidade ou a homogeneidade da substância de ensaio não pode ser mantida, dever-se-á descrever esse facto e é necessário tomar precauções na interpretação dos resultados.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- informação sobre o peixe de ensaio (designação científica, estirpe, fornecedor, qualquer tratamento prévio, dimensões e número utilizado para cada concentração de ensaio),- fonte da água de diluição e características químicas principais (pH, dureza, temperatura),- no caso de uma substância de fraca solubilidade aquosa, indicar-se-á o método de preparação das soluções de reserva e de ensaio,- concentração de quaisquer substâncias auxiliares,- enumeração das concentrações utilizadas e qualquer informação disponível sobre a estabilidade para essas concentrações da substância química de ensaio, na solução de ensaio,- no caso de se efectuarem análises químicas, indicar os métodos utilizados e os resultados,- resultados do teste-limite, se existirem,- razões para a escolha e pormenores sobre o procedimento de ensaio utilizado (por exemplo, método estático, semiestático, razão entre doses, débito do escoamento, arejamento, número de peixes, etc.),- descrição do equipamento de ensaio,- regime de exposição à luz,- concentrações do oxigénio dissolvido, valor de pH e temperaturas das soluções de ensaio em cada 24 horas,- provas demonstrativas de que os critérios de qualidade foram cumpridos,- um quadro apresentando a mortalidade cumulativa para cada concentração e para o controlo (e, se necessário, para o controlo com a substância auxiliar) em cada um dos momentos de observação recomendados,- gráfico da curva de resposta concentração/percentagem no fim do ensaio,- sempre que possível, os valores CL50 em cada um dos momentos de observação recomendados (com limites de confiança de 95 %),- procedimentos estatísticos para a determinação dos valores CL50,- no caso de se utilizar uma substância de referência, os resultados obtidos,- valor da mais elevada concentração de ensaio que não provoca mortalidade durante o período do ensaio,- valor da mais fraca concentração que provoca 100 % de mortalidade durante o período do ensaio.4. REFERÊNCIAS1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Council C(81) 30 final and updates;2. AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Brachydanio rerio - Static and Flow Through methods - NFT 90-303 June 1985;3. AFNOR - Determination of the acute toxicity of a substance to Salmo gairdneri - Static and Flow Through methods - NFT 90-305 June 1985;4. ISO 7346/1, /2 and /3 - Water Quality - Determination of the acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan - Teleostei, Cyprinidae). Part 1 : Static method. Part 2 : Semi-static method. Part 3 : Flow-through method;5. Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974;6. DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L (15);7. JIS K 0102, Acute toxicity test for fish;8. NEN 6506 - Water - Bepaling van de akute toxiciteit met behulp van Poecilia reticulata, 1980;9. Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975;10. Environmental Protection Agency, Environmental monitoring and support laboratory, Office of Research and Development, EPA-600/4-78-012, January 1978;11. Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, Part IV, 16 March 1979;12. Standard methods for the examination of water and wastewater, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975;13. Commission of the European Communities, Inter-laboratory test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979;14. Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986;15. Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99;16. Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978;17. Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821;18. Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32;19. Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65-84, American Society for Testing and Materials;20. Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.Apêndice 1Água reconstituídaExemplo de uma água adequada para diluiçãoTodas as substâncias químicas devem ser de qualidade analítica.A água deve ser destilada e de boa qualidade, ou desionizada com uma condutividade inferior a 5 ìScm 1.O aparelho para a destilação da água não deve conter quaisquer partes feitas de cobre.Soluções de reservaCaCl2. 2H2O (cloreto de cálcio dihidratado): 11,76 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.MgSO4. 7H2O (sulfato de magnésio heptahidratado): 4,93 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.NaHCO3 (hidrogenocarbonato de sódio): 2,59 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.KCl (cloreto de potássio): 0,23 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.Água de diluição reconstituídaMistura-se 25 ml de cada uma das quatro soluções de reserva e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.Faz-se o arejamento até que a concentração do oxigénio dissolvido seja igual ao valor da saturação com ar.O pH deve ser 7,8 ± 0,2.Se necessário ajusta-se o valor do pH com NaOH (hidróxido de sódio) ou com HCl (ácido clorídrico).A água para diluição assim preparada é colocada à parte durante 12 horas e não deve ser mais arejada.A soma dos iões Ca e Mg nesta solução é de 2.5 mmol por litro. A razão entre os iões Ca:Mg é de 4:1 e entre os iões Na:K é de 10:1. A alcalinidade total desta solução é de 0,8 mmol por litro.Qualquer desvio na preparação da água de diluição não deve modificar a composição ou as propriedades da água.Apêndice 2>POSIÇÃO NUMA TABELA>Obtenção dos peixesOs peixes acima enumerados, são fáceis de criar e amplamente disponíveis ao longo do ano. É fácil cria-los e mantê-los em instalações piscicolas ou em laboratórios, sob condições de controlo de doenças e de parasitas, de tal modo que os animais sejam saudáveis e de origem conhecida. Estes peixes existem em muitas partes do mundo.Apêndice 3 >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Exemplo de concentração: mortalidade percentualExemplo da determinação do valor CL50 utilizando papel log-probitC.2. TOXICIDADE AGUDA PARA DAPHNIA 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOO objectivo deste ensaio consiste em determinar a concentração eficaz média de uma substância (CE50) que provoca a imobilização das Daphnia em água-doce. É desejável que haja, tanto quanto possível, informações sobre a solubilidade em água, a pressão de vapor, a estabilidade química, as constantes de dissociação e a biodegradabilidade da substância, antes de se iniciar o ensaio.Ao fazer-se o planeamento do ensaio e a interpretação dos resultados deve tomar-se em consideração as informações adicionais disponíveis (por exemplo, fórmula estrutural, grau de pureza, natureza e percentagem das impurezas significativas, presença de quantidades de aditivos, coeficiente de partição n-octanol/água).1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESOs requisitos da directiva para o valor CL50 para Daphnia consideram-se satisfeitos com a determinação do valor CE50 conforme descrito neste método de ensaio.Neste ensaio exprime-se a toxicidade aguda como sendo a concentração eficaz média (CE50) para a imobilização. Em termos de valores iniciais, trata-se da concentração que imobiliza 50 % de Daphnia num lote de ensaio ao longo de um período contínuo de exposição, o qual deve ser especificado.Imobilização:Os animais que não forem capazes de nadar decorridos 15 segundos após a agitação suave do recipiente de ensaio são considerados imóveis.Todas as concentrações da substância de ensaio são dadas em peso por volume (miligramas por litro). Esses valores de concentração também podem ser expressos em peso por peso (mg.kg 1).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIAPode fazer-se o ensaio com uma substância de referência para se demonstrar que, sob as condições de ensaio laboratoriais, a resposta das espécies testadas não se modificou significativamente.No apêndice 2 apresenta-se o resumo dos resultados de um ensaio interlaboratorial da CEE, utilizando quatro substâncias diferentes.1.4. PRINCÍPIO DO MÈTODO DE ENSAIOPode efectuar-se um teste-limite para a concentração de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o valor CE50 é superior a esta concentração.As Daphnia são expostas à substância de ensaio misturada na água, em diversas concentrações, durante 48 horas; no caso de se utilizar um ensaio mais curto, a justificação deverá constar do relatório do ensaio.Sob condições idênticas às condições de ensaio, e para um intervalo adequado de concentrações da substância de ensaio, concentrações diferentes da substância de ensaio exercem sobre a capacidade de nadar das Daphnia efeitos com intensidades médias diferentes. As diversas concentrações originam diversas percentagens de Daphnia incapazes de nadar no termo do ensaio. As concentrações que provocam uma imobilização entre 0 e 100 % obtêm-se directamente a partir das observações do ensaio, ao passo que o valor CE50 às 48 horas é determinado por cálculo, se possível.Para este método utiliza-se um sistema estático, pelo que as soluções de ensaio não serão renovadas durante o período de exposição.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEOs critérios de qualidade deverão ser aplicados ao teste-limite e também no método do teste global.A imobilização nos controlos não deve exceder 10 % no termo do ensaio.As Daphnia do ensaio nos grupos de controlo não devem ficar presas à superfície da água.É desejável que a concentração de oxigénio dissolvido nos recipientes de ensaio permaneça acima de 3 mg l 1 durante o decurso do ensaio. Todavia, a concentração do oxigénio dissolvido não deverá ser, em nenhumas circunstâncias, inferior a 2 mg l 1.A concentração da substância de ensaio deverá ser mantida a cerca de 80 % do valor da concentração inicial, ao longo do período de duração do ensaio.Para as substâncias que se dissolvem facilmente no meio de ensaio, dando origem a soluções estáveis, isto é, para as substâncias que não são significativamente volatilizáveis, degradáveis, hidrolizáveis ou adsorvidas, pode considerar-se a concentração inicial como equivalente ao valor da concentração nominal. Dever-se-á demonstrar que as concentrações foram mantidas durante todo o ensaio e que os critérios de qualidade foram satisfeitos.Para as substâncias que são:i) fracamente solúveis no meio de ensaio, ouii) susceptíveis de formar emulsões ou dispersões estáveis, ouiii) instáveis em soluções aquosas,pode considerar-se a concentração inicial como sendo a concentração medida na solução (ou, no caso de ser tecnicamente impossível, medida na coluna de água) no início do ensaio. A concentração deverá ser determinada após um período de equilíbrio, mas antes da introdução dos organismos de ensaio.Em quaisquer desses casos é necessário efectuar outras medições durante o ensaio, para se confirmar que as concentrações da exposição e os critérios de qualidade foram respeitados.O valor do pH não deverá variar mais de uma unidade.1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO1.6.1. Reagentes1.6.1.1. Soluções das substâncias de ensaioAs soluções de reserva com a concentração pretendida são preparadas dissolvendo a substância em água desionizada ou simplesmente em água, de acordo com o ponto 1.6.1.2.As concentrações escolhidas para o ensaio são preparadas por diluição da solução de reserva. Se se realiza um ensaio com concentrações elevadas, a substância pode ser dissolvida directamente na águda de diluição.Normalmente as substâncias apenas deverão ser testadas até ao limite de solubilidade. Para algumas substâncias (por exemplo, substâncias que possuem fraca solubilidade em água, ou um valor Poa elevado, ou para aquelas que formam dispersões estáveis em vez de uma verdadeira solução em água), é aceitável efectuar a experiência com uma concentração superior ao limite de solubilidade da substância para garantir a obtenção da máxima concentração solúvel/estável. Todavia é importante que essa concentração não perturbe, por qualquer forma, o sistema de ensaio (por exemplo, formação de uma película da substância sobre a superfície da água evitando a sua oxigenação, etc.).É possível recorrer à dispersão ultrasónica, aos solventes orgânicos, aos emulsionantes ou dispersantes para auxiliar a fazer a preparação de soluções de reserva das substâncias com fraca solubilidade na água ou para auxiliar a dispersão dessas substâncias no meio de ensaio. Quando se utilizam essas substâncias auxiliares todas as concentrações de ensaio deverão conter a mesma quantidade de substância auxiliar e dever-se-á expor as Daphnia do ensaio de controlo adicional, a uma concentração da substância auxiliar idêntica à utilizada nas séries de ensaio. A concentração dessas substâncias auxiliares deverá ser mínima e em caso algum deve exceder 100 mg por litro de meio de ensaio.O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do valor de pH. Se houver sinais evidentes de uma alteração nítida dos valores de pH, é aconselhável repetir o ensaio com ajustamento desses valores e efectuar-se-á o registo dos resultados. Nesse caso ajustar-se-á o valor do pH da solução de reserva para o valor de pH da água de diluição, salvo se houver razções específicas para não se proceder desse modo. Para satisfazer este objectivo é preferível utilizar HCl e NaOH. Este ajustamento do valor do pH deverá ser efectuado de tal modo que a concentração da substância de ensaio na solução de reserva não varie significativamente. No caso de ocorrer qualquer reacção química ou precipitação do composto de ensaio, provocada por esse ajustamento, deve descrever-se tal facto.1.6.1.2. Água do ensaioUtiliza-se neste ensaio água reconstituída [ver apêndice 1 e referência 2: ISO 6341]. Para se evitar a necessidade de aclimatação antes do ensaio recomenda-se que a água da cultura seja de qualidade idêntica (pH, dureza) à da água utilizada no ensaio.1.6.2. AparelhoUtilizar-se-ão aparelhos e equipamento normais de laboratório. O equipamento que vier a estar em contacto com as soluções de ensaio deverá ser, preferencialmente, de vidro:- medidor de oxigénio (com microelectrodo ou outro equipamento adequado para a medição do oxigénio dissolvido em amostras com fracas concentrações),- aparelho adequado para o controlo de temperatura,- medidor de pH,- equipamento para a determinação da dureza da água.1.6.3. Organismos de ensaioPara o ensaio prefere-se a espécie Daphnia magna embora também se possa utilizar a Daphnia pulex. Os animais de ensaio devem ter uma idade inferior a 24 horas no início do ensaio, devem ter sido criados em laboratório, não devem ter doenças evidentes e devem possuir antecedentes conhecidos (por exemplo, modo como foram criados - quaisquer pré-tratamentos, etc.).1.6.4. Procedimento de ensaioAntes do ensaio definitivo pode efectuar-se um ensaio preliminar para a determinação de concentrações no sentido de se obter informação sobre o intervalo de concentrações que se deve utilizar no ensaio principal.Além das séries de ensaio, faz-se uma experiência de controlo sem a substãncia de ensaio e, se for relevante, também uma experiência de controlo contendo a substância auxiliar.As Daphnia são expostas à substância de ensaio conforme se descreve a seguir:- duração: de preferência 48 horas,- número de animais: pelo menos 20 animais para cada concentração de ensaio divididos preferencialmente em quatro lotes de cinco animais cada um ou em dois lotes de dez animais cada um,- carga: para cada animal deverá ser proporcionado pelo menos 2 ml das soluções de ensaio,- concentração de ensaio: a solução de ensaio deve ser preparada imediatamente antes da introdução das Daphnia, de preferência sem se utilizar qualquer solvente que não seja a água. As concentrações são ajustadas segundo uma série geométrica, de tal modo que a razão entre concentrações não exceda 2,2. Em conjunto com os controlos, devem fazer-se ensaios com concentrações suficientes de modo a proporcionarem uma imobilização entre 0 e 100 % decorridas 48 horas e também que proporcionem imobilizações com intensidades intermédias de modo a permitir calcular o valor CE50 às 48 horas,- água: ver ponto 1.6.1.2,- luz: é facultativa a prática de um ciclo luz/escuridão,- temperatura: a temperatura de ensaio deverá estar compreendida entre 18  C e 22  C, mas para cada um dos ensaios deverá ser constante ± 1,0  C,- arejamento: não se deve fazer borbulhar ar nas soluções de ensaio,- alimentação: nenhuma.No fim do ensaio devem medir-se o pH e a concentração do oxigénio dos controlos e de todas as concentrações de ensaio; o pH das soluções de ensaio não deverá ser modificado.Os compostos voláteis deverão ser testados em recipientes fechados completamente cheios, suficientemente grandes para evitar a falta de oxigénio.A inspecção das Daphnia efectua-se, pelo menos, decorridas 24 horas de exposição e novamente decorridas 48 horas.Teste-limiteUtilizando o procedimento descrito neste método de ensaio é possível efectuar um teste-limite para a concentração de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o valor CE50 é superior a esta concentração.Se a natureza da substância for tal que não seja possível obter uma concentração de 100 mg por litro, o teste limite deverá ser efectuado para um valor de concentração igual ao da solubilidade da substância (ou igual à concentração máxima que forma uma dispersão estável) no meio utilizado (ver também o ponto 1.6.1.1).O teste limite deve ser efectuado utilizando 20 Daphnia, divididas em dois ou quatro lotes, utilizando-se o mesmo número nos controlos. Se houver imobilizações deve efectuar-se um estudo completo.2. RESULTADOS E AVALIAÇÃOPara cada período de registo das observações (24 e 48 horas) traça-se a curva da percentagem de mortalidade em função da concentração, utilizando papel logarítmico/probabilidade.Sempre que possível e para cada momento de observação deve estimar-se o valor CE50 e os limites de confiança (p = 0,05), utilizando procedimentos normalizados; esses valores deverão ser aproximados para um (no máximo dois) algarismos significativos (exemplos de arredondamento para dois algarismos: de 173,5 para 174; de 0,127 para 0,13; de 1,21 para 1,2).Nos casos em que o declive da curva de resposta concentração/percentagem é muito acentuado para permitir o cálculo do valor CE50, considera-se suficiente uma estimativa gráfica deste valor.No caso de duas concentrações consecutivas, sendo a razão entre elas de 2,2, proporcionarem apenas mortalidades de 0 e 100 %, considera-se que esses dois valores são suficientes para indicar o intervalo de localização do valor CE50.No caso de se verificar que a estabilidade ou a homogeneidade da substância de ensaio não pode ser mantida, dever-se-á descrever esse facto e é necessário tomar precauções na interpretação dos resultados.3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- informação sobre os organismos de ensaio (designação científica, estirpe; fornecedor ou origem, qualquer pré-tratamento, método de criação - incluindo a fonte, espécie e quantidade de alimento, frequência de alimentação),- origem da água de diluição e características químicas principais (pH, dureza, temperatura),- no caso de uma substância de fraca solubilidade na água, indicar-se-á o método de preparação da solução de reserva e de ensaio,- concentração de quaisquer substâncias auxiliares,- enumeração das concentrações utilizadas e qualquer informação disponível sobre a estabilidade para essas concentrações da substância química de ensaio, nas soluções de ensaio,- no caso de se efectuarem análises químicas, indicar os métodos utilizados e os resultados,- resultados do teste-limite, se existirem,- descrição do equipamento de ensaio,- regime de exposição à luz,- concentrações do oxigénio dissolvido, valor de pH e temperaturas das soluções de ensaio,- provas demonstrativas de que os critérios de qualidade foram cumpridos,- um quadro apresentando a imobilização cumulativa para cada concentração e para o controlo (e, se necessário, para o controlo com a substância auxiliar) em cada um dos momentos de observação recomendados (24 e 48 horas),- gráfico da curva de resposta concentração/percentagem no fim do ensaio,- sempre que possível, os valores CE50 em cada um dos momentos de observação recomendados (com limites de confiança de 95 %),- procedimentos estatísticos para a determinação dos valores CE50,- no caso de se utilizar uma substância de referência, os resultados obtidos,- valor da mais elevada concentração de ensaio que não provoca imobilização durante o período do ensaio,- valor da mais fraca concentração que provoca 100 % de imobilização durante o período do ensaio.4. REFERÊNCIAS1. OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final and updates.2. International Standard ISO, Water Quality - Determination of inhibition of mobility of Daphnia magna Straus, ISO 6341-19893. AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera - crustacea) NFT 90 301 (January 1983).4. Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten Daphnien-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökotoxikologie, Grundlagen für die ökotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.5. DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (L11).6. Finney, D.J.. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K., 1978.7. Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.8. Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.9. Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.10. Stephan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.11. Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.Apêndice 1Água reconstituídaExemplo de uma água para diluição adequada (de acordo com a norma ISO 6341)Todas as substâncias químicas devem ser de qualidade analítica.A água deve ser destilada e de boa qualidade, ou desionizada com uma condutividade inferior a 5 ìScm 1.O aparelho para a destilição da água não deve conter quaisquer partes feitas de cobre.Soluções de reservaCaCl2. 2 H2O (cloreto de cálcio dihidratado): 11,76 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.MgSO4. 7 H2O (sulfato de magnésio heptahidratado): 4,93 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.NaHCO3 (hidrogenocarbonato de sódio): 2,59 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.KCl (cloreto de potássio): 0,23 g Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.Água para diluição reconstituídaMistura-se 25 ml de cada uma das quatro soluções de reserva e ajusta-se o volume até 1 litro utilizando água.Faz-se o arejamento até que a concentração do oxigénio dissolvido seja igual ao valor da saturação com ar.O pH deve ser 7,8 ± 0,2.Se necessário ajusta-se o valor do pH com NaOH (hidróxido de sódio) ou com HCl (ácido clorídrico).A água para diluição assim preparada é colocada à parte durante 12 horas e não deve ser mais arejada.A soma dos iões Ca e Mg nesta solução é de 2,5 mmol por litro. A razão entre os iões Ca:Mg é de 4:1 e entre os iões Na:K é de 10:1. A alcalinidade total desta solução é de 0,8 mmol por litro.Qualquer desvio na preparação da água de diluição não deve modificar a composição ou as propriedades da água.Apêndice 2Resumo dos resultados de um ensaio interlaboratorial da CEE efectuado em 1978 (citado também na referência 2)Nota: o objectivo deste ensaio consistiu na determinação do valor CE50 às 24 horas.Substâncias utilizadas:1: dicromato de potássio,2: ácido tetrapropilbenzenossulfónico,3: sal de sódio do ácido tetrapropilbenzenossulfónico,4: sal de potássio do ácido tricloro-2,4,5-fenoxiacético.>POSIÇÃO NUMA TABELA>Apêndice 3Exemplo de concentração: percentagem de imobilização >INÍCIO DE GRÁFICO>>FIM DE GRÁFICO>Exemplo de determinação do valor CE50 utilizando papel log-probitC.3. TESTE DE INIBIÇÃO PARA ALGAS 1. MÉTODO1.1. INTRODUÇÃOO objectivo do presente ensaio consiste em determinar os efeitos de uma dada substância sobre o crescimento de espécies de algas verdes unicelulares. Ensaios relativamente curtos (72 horas) permitem avaliar efeitos ao longo de várias gerações. O presente método pode ser adaptado a diferentes espécies de algas unicelulares e, neste caso, deve ser fornecida uma descrição do método utilizado com o relatório do ensaio.O presente método aplica-se mais facilmente a substâncias solúveis em água que, nas condições do ensaio, são susceptíveis de permanecer na água.Pode também ser utilizado para substâncias que não interfiram directamente com a medição do crescimento das algas.É desejável possuir, tanto quanto possível, informações sobre a solubilidade em água, a pressão de vapor, a estabilidade química, as constantes de dissociação e a biodegradabilidade da substância antes de se iniciar o ensaio.Ao fazer-se o planeamento do ensaio e a interpretação dos resultados deve levar-se em consideração todas as informações adicionais (por exemplo, fórmula estrutural, grau de pureza, natureza e percentagem de impurezas significativas, presença e quantidade de aditivos e coeficiente de partição n-octanol/água).1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADESDensidade celular: número de células por mililitro;Crescimento: o aumento da densidade celular ao longo do período de ensaio;Taxa de crescimento: o aumento da densidade celular por unidade de tempo;CE50: de acordo com este método é a concentração da substância de ensaio que provoca uma redução de 50 % quer no crescimento (CbE50) quer na taxa de crescimento (CrE50) em relação ao controlo;CSEO (concentração sem efeito observável): de acordo com este método é a mais elevada concentração de ensaio com a qual não se observou uma inibição significativa do crescimento relativamente ao controlo.Todas as concentrações da substância de ensaio são dadas em peso por volume (miligramas por litro). Essas concentrações também podem ser expressas em peso por peso (mg.kg 1).1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIAPode fazer-se o ensaio com uma substância de referência para se demonstrar que, sob as condições de ensaio laboratoriais, a sensibilidade da espécie de ensaio não se alterou significativamente.No caso de se utilizar uma substância de referência os resultados observados deverão constar do relatório do ensaio. Pode utilizar-se dicromato de potássio como substância de referência, mas a sua cor pode afectar a qualidade e a intensidade da luz que atinge as células e também as determinações espectrofotométricas, se for caso disso. O dicromato de potássio tem sido utilizado em ensaios internacionais interlaboratoriais (ver referência 3 e apêndice 2).1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIOPode efectuar-se um teste limite com a concentração de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o valor CE50 é superior a essa concentração.Expõem-se culturas de algas verdes seleccionadas, em fase de crescimento exponencial, em condições definidas, a diferentes concentrações da substância de ensaio, durante diversas gerações.Faz-se a incubação das soluções de ensaio durante um período de 72 horas, durante o qual se mede a densidade celular em cada solução, pelo menos em cada 24 horas. Determina-se a inibição do crescimento em relação a uma cultura de controlo.1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEOs critérios de qualidade deverão ser aplicados ao teste-limite e também no método do teste global.A densidade celular nas culturas de controlo deverá aumentar pelo menos 16 vezes no período de três dias.A concentração da substância de ensaio deverá ser mantida a mais de 80 % do valor da concentração inicial, ao longo do período de duração do ensaio.Para as substâncias que se dissolvem facilmente no meio de ensaio formando soluções estáveis, isto é, para as substâncias que não são significativamente volatilizáveis, degradáveis, hidrolizáveis ou adsorvidas, pode considerar-se a concentração inicial como equivalente ao valor da concentração nominal. Dever-se-á demonstrar que as concentrações foram mantidas durante todo o ensaio e que os critérios de qualidade foram satisfeitos.Para as substâncias que são:i) fracamente solúveis no meio de ensaio, ouii) susceptíveis de formar emulsões ou dispersões estáveis, ouiii) instáveis em soluções aquosas,deverá considerar-se como concentração inicial o valor da concentração medida no início do ensaio. A concentração deve ser determinada após um período de equilíbrio.Em quaisquer desses casos é necessário efectuar outras medições durante o ensaio, para se confirmar que as concentrações da exposição e os critérios de qualidade foram respeitados.Sabe-se que quantidades significativas da substância de ensaio podem ser incorporadas na biomassa das algas durante o período do ensaio. Em consequência, com o objectivo de se demonstrar compatibilidade com os anteriores critérios de qualidade, dever-se-á tomar em consideração tanto a substância incorporada na biomassa das algas como a substância em solução (ou, se não for tecnicamente possível, medida na coluna de água). Todavia, uma vez que a determinação da concentração da substância na biomassa das algas pode colocar problemas técnicos significativos, pode demonstrar-se a compatibilidade com os critérios de qualidade fazendo uma experiência num vaso de ensaio com o valor mais elevado de concentração da substância mas sem algas e medindo as concentrações na solução (ou, se não for tecnicamente possível, na coluna de água) no início e no termo do período de ensaio.1.6. DESCRIÇÃO DO PROCEDIMENTO DE ENSAIO1.6.1. Reagentes1.6.1.1. Soluções das substâncias de ensaioAs soluções de reserva com a concentração pretendida são preparadas dissolvendo a substância em água desionizada ou simplesmente em água, de acordo com o ponto 1.6.1.2.As concentrações de ensaio escolhidas são preparadas adicionando quantidades aliquotas adequadas às pré-culturas de algas (ver apêndice 1). Normalmente as substâncias apenas deverão ser testadas até ao limite de solubilidade. Para algumas substâncias (por exemplo, substâncias que possuem fraca solubilidade em água, ou um valor Poa elevado, ou para aquelas que formam dispersões estáveis em vez de uma verdadeira solução em água), é aceitável efectuar a experiência com uma concentração superior ao limite de solubilidade da substância para garantir a obtenção da máxima concentração solúvel/estável. Todavia é importante que essa concentração não perturbe, por qualquer forma, o sistema de ensaio (por exemplo, formação de uma película da substância sobre a superfície da água evitando a sua oxigenação, etc.).É possível recorrer à dispersão ultrasónica, aos solventes orgânicos, aos emulsionantes ou dispersantes para auxiliar a preparação de soluções de reserva das substâncias com fraca solubilidade na água ou para auxiliar a fazer a dispersão dessas substâncias no meio de ensaio. Quando se utilizam essas substâncias auxiliares todas as concentrações de ensaio deverão conter a mesma quantidade de substância auxiliar e dever-se-á expor os controlos adicionais a uma concentração da substância auxiliar idêntica à utilizada nas séries de ensaio. A concentração dessas substâncias auxiliares deverá ser mínima e em caso algum deve exceder 100 mg por litro de meio de ensaio.O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do valor de pH. Se houver sinais evidentes de uma alteração nítida dos valores de pH, é aconselhável repetir o ensaio com ajustamento desses valores e efectuar-se-á o registo dos resultados. Nesse caso ajustar-se-á o valor do pH da solução de reserva para o valor de pH da água de diluição, salvo se houver razões específicas para não se proceder desse modo. Para satisfazer este objectivo é preferível utilizar HCl e NaOH. Este ajustamento do valor do pH deverá ser efectuado de tal modo que a concentração da substância de ensaio na solução de reserva não varie significativamente. No caso de ocorrer qualquer reacção química ou precipitação do composto de ensaio, provocada por esse ajustamento, deve descrever-se tal facto.1.6.1.2. Meio de ensaioA água deve ser destilada e de boa qualidade, ou desionizada com uma condutividade inferior a 5 ìScm 1. O aparelho para a destilação da água não deve conter quaisquer partes feitas de cobre.Recomenda-se a utilização do meio a seguir descrito.Faz-se a preparação de quatro soluções de reserva de acordo com o quadro que se apresenta a seguir. As soluções de reserva são esterilizadas por filtração através de membrana ou por tratamento em autoclave e devem ser armazenadas no escuro à temperatura de 4  C. A solução de reserva n 4 deve ser esterilizada apenas por filtração através de membrana. Estas soluções de reserva são diluídas para se obter nas soluções de ensaio as concentrações finais de nutrientes.>POSIÇÃO NUMA TABELA>1.6.2. Aparelho- equipamento normal de laboratório,- frascos de ensaio com um volume adequado (por exemplo, os frascos cónicos de 250 ml são adequados quando o volume da solução de ensaio é de 100 ml). Todos os frascos de ensaio devem ser idênticos no que diz respeito ao material e às dimensões.- aparelho para desenvolver as culturas: um compartimento ou câmara em que seja possível manter a temperatura no intervalo entre 21 e 25  C ± 2  C com iluminação uniforme contínua na banda dos 400 a 700 nm. Se as algas das culturas de controlo tiverem atingido as taxas de crescimento recomendadas, pode considerar-se que as condições para o crescimento, incluindo a intensidade luminosa, são adequadas.Recomenda-se a utilização, ao nível médio das soluções de ensaio, de uma intensidade luminosa no intervalo entre 60 e 120 ìE.m 2.s 1 (35 a 70 × 1018 fotões.m 2.s 1), fazendo-se a medição na banda entre 400 e 700 nm, utilizando um receptor apropriado. Para os instrumentos de medição da luz calibrados em Lux considera-se aceitável o intervalo equivalente entre 6 000 e 10 000 Lx.A intensidade luminosa pode ser obtida utilizando quatro a sete lâmpadas fluorescentes de 30 W geradoras de luz branca universal (a temperatura de cor é aproximadamente 4 000 K), a uma distância de 0,35 m da cultura de algas.- As medições de densidade celular devem ser efectuadas recorrendo a um método de contagem directa das células vivas, por exemplo, um microscópio com câmaras de contagem. Contudo é possível utilizar outros procedimentos (fotometria, turbidimetria, ...) se forem suficientemente sensíveis e no caso de se demonstrar que estão suficientemente bem correlacionados com a densidade celular.1.6.3. Organismos de ensaioSugere-se que a espécie de algas verdes utilizadas seja uma espécie de crescimento rápido conveniente para ser desenvolvida em cultura e para ensaio. Dá-se preferência às espécies seguintes:- Selenastrum capricornutum, v.g. ATCC 22662 ou CCAP 278/4,- Scenedesmus subspicatus, v.g. 86.81 SAG,Nota:ATCC = American Type Culture Collection (U.S.A.)CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.)SAG = Collection of algal culture (Göttingen, F.R.G.)No caso de se utilizar outras espécies deve indicar-se a estirpe.1.6.4. Procedimento de ensaioO intervalo de concentrações no qual é provável a ocorrência de efeitos, determina-se com base em ensaios preliminares para a determinação das concentrações.As duas medições de crescimento (biomassa e taxa de crescimento) podem originar valores altamente discrepantes da inibição do crescimento; deverão ser utilizadas ambas no ensaio preliminar para a determinação de concentrações para se garantir que a progressão geométrica das concentrações permitirá estimar os dois valores CbE50 e CrE50.Densidade celular inicialRecomenda-se que a densidade celular inicial nas culturas de ensaio seja aproximadamente de 104 células/ml para Selenastrum capricornutum e Scenedesmus subspicatus. No caso de se utilizar outras espécies a biomassa deve ser equivalente.Concentrações da substância de ensaioPara o ensaio faz-se a preparação de pelo menos cinco concentrações numa série geométrica cuja razão entre concentrações não exceda 2,2. O menor valor da concentração ensaiada não deverá provocar efeitos observáveis sobre o desenvolvimento das algas. A concentração mais elevada ensaiada deverá inibir o crescimento em pelo menos 50 % relativamente ao controlo e, preferencialmente deverá interromper totalmente o crescimento.Repetições e controlosO ensaio deve incluir três repetições de cada concentração ensaiada. Faz-se a experiência com três controlos sem substância de ensaio e, se for relevante, faz-se a experiência também com três controlos contendo a substância auxiliar. Se se justificar, o ensaio pode ser alterado no sentido de aumentar o número de concentrações e reduzir o número de repetições por concentração.Execução do ensaioPara se prepararem as culturas de ensaio contendo as concentrações desejadas da substância de ensaio e a quantidade desejada de inóculo de algas, adiciona-se quantidades aliquotas das soluções de reserva da substância de ensaio a quantidades adequadas de pré-culturas de algas (ver apêndice 1).Os frascos de ensaio da cultura são agitados e colocados no aparelho destinado à cultura. As células das algas são mantidas em suspensão agitando, mexendo ou fazendo borbulhar ar, no sentido de melhorar as trocas gasosas e reduzir a variação do pH das soluções de ensaio. As culturas deverão ser mantidas a uma temperatura compreendida entre 21  C e 25  C, controlada a ± 2  C.Determina-se a densidade celular em cada frasco de ensaio decorridas pelo menos 24, 48 e 72 horas após o início do ensaio. Utiliza-se o meio de algas filtrado contendo uma concentração apropriada da substância química de ensaio, para se determinar a concentração espontânea quando se recorre a medições da densidade celular diferentes dos métodos de contagem directa.Mede-se o valor do pH no início do ensaio e decorridas 72 horas.O valor do pH dos controlos não deverá variar normalmente mais do que 1,5 unidades durante o ensaio.Ensaio de substâncias voláteisAté ao presente não existe qualquer método geralmente aceite para ensaiar substâncias voláteis. Quando se sabe que uma substância tem tendência para se vaporizar pode recorrer-se à utilização de frascos de ensaio fechados com maior espaço vazio. Deve tomar-se em consideração a possibilidade de haver falta de CO2 quando se calcula o espaço vazio dos balões de ensaio fechados. Foram já propostas variações deste método (ver referência 4).Deve-se procurar determinar a quantidade de substância que permanece nas soluções e aconselha-se extrema precaução na interpretação dos resultados dos ensaios com produtos químicos voláteis quando se utilizam sistemas fechados.Teste-limiteUtilizando o procedimento descrito neste método de ensaio é possível efectuar um teste-limite para a concentração de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar se o valor CE50 é superior a esta concentração.Se a natureza da substância for tal que não seja possível obter uma concentração de 100 mg por litro, o teste limite deverá ser efectuado para um valor de concentração igual à solubilidade da substância (ou igual à concentração máxima que forma uma dispersão estável) no meio utilizado (ver também o ponto 1.6.1.1).O teste-limite deve ser efectuado pelo menos em triplicado, com o mesmo número de controlos. No teste-limite devem ser utilizadas as duas medições do crescimento (biomassa e taxa de crescimento).Se num teste-limite se verificar uma diminuição média igual ou superior a 25 %, tanto para a biomassa como para a taxa de crescimento, entre este teste-limite e o controlo, é necessário efectuar um ensaio completo.2. RESULTADOS E AVALIAÇÃOA densidade celular medida nas culturas do ensaio e de controlo é apresentada em quadros conjuntamente com as concentrações da substância de ensaio e os tempos de medição. O valor médio da densidade celular para cada uma das concentrações da substância de ensaio e para os controlos é representado graficamente em função do tempo (0-72 horas) obtendo-se deste modo curvas de crescimento.Para se determinar a relação concentração/efeito devem ser utilizados os dois métodos adiante descritos. Algumas substâncias podem estimular o crescimento, com baixos valores de concentração. Apenas deverão ser considerados os dados que indicam uma inibição entre 0 e 100 %.2.1. COMPARAÇÃO DAS ÁREAS SOB AS CURVAS DE CRESCIMENTOA área existente entre as curvas de crescimento e a linha horizontal N = N0 pode ser calculada de acordo com a fórmula seguinte: A =N1   N02 × t1 +N1 + N2   2N02 × (t2   t1) + . . . +Nn 1 + Nn   2N02× (tn   tn 1)em queA = área,N0 = número de células/mililitro contadas no instante t0 (início do ensaio),N1 = número de células/mililitro contadas no instante t1,Nn = número de células/mililitro contadas no instante tn,t1 = tempo da primeira medição após o início do ensaio,tn = tempo da medição após o início do ensaio,n = número de medições efectuadas após o início do ensaio.A percentagem de inibição do crescimento celular para cada uma das concentrações da substância de ensaio (IA) calcula-se pela fórmula:IA = Ac   AtAc × 100em queAc = área entre a curva de crescimento no grupo de controlo e a linha horizontal N = N0.At = At = área entre a curva de crescimento para o valor da concentração t e a linha horizontal N = N0.Os valores IA são representados graficamente em papel semilogarítmico ou em papel semilogarítmico-«probit» em função das correspondentes concentrações. Se os pontos forem representados graficamente em papel «probit» traça-se uma recta por estimativa ou através dos dados de regressão calculados por computador.O valor CE50 é estimado a partir da linha de regressão por leitura da concentração que é equivalente a uma inibição de 50 % (IA = 50 %). Para designar o valor obtido por este método de cálculo, sem ambiguidade, propõe-se a utilização do símbolo CbE50. É essencial que o símbolo CbE50 fique associado com o período de exposição apropriado, por exemplo, CbE50 (0-72 horas).2.2. COMPARAÇÃO DAS TAXAS DE CRESCIMENTOA taxa de crescimento específico média (ì) para culturas em crescimento exponencial pode ser calculada do seguinte modo:m = ln Nn   ln N0tn   t0em que t0 representa o instante do início do ensaio.Outro método para se calcular a taxa de crescimento específico média, consiste em determinar o declive da recta de regressão resultante da representação gráfica de ln N em função do tempo.A percentagem de inibição da taxa de crescimento específico para cada uma das concentrações da substância de ensaio (Iìt) calcula-se de acordo com a fórmula seguinte:Imt = mc   mtmc × 100em queìc = taxa de crescimento específico do controloìt = taxa de crescimento específico média para a concentração t de ensaioA percentagem de redução da taxa de crescimento específico média para cada uma das concentrações da substância de ensaio comparada com o valor do controlo é representada graficamente em função do logaritmo da concentração. Os valores CE50 podem ser lidos a partir do gráfico resultante. Para se designar sem ambiguidades o valor CE50 obtido por este método, propõe-se a utilização do símbolo CrE50. Devem ser indicados os instantes de medição, por exemplo, se aquele valor disser respeito aos momentos de observação correspondentes a 0 e 72 horas, o símbolo será CrE50 (0-72 horas).Nota: a taxa de crescimento específico é um valor logarítmico, pelo que pequenas alterações no valor da taxa de crescimento podem conduzir a grandes alterações no valor da biomassa. Por conseguinte os valores CbE e CrE não são numericamente comparáveis.2.3. CÁLCULO DA CSEODetermina-se a concentração sem efeito observável recorrendo a um procedimento estatístico adequado para comparação de amostras múltiplas (por exemplo, análise de variância e teste de Dunnett), utilizando os valores das repetições individuais relativos às áreas sob as curvas de crescimento A (ver ponto 2.1) ou as taxas de crescimento específico ì (ver ponto 2.2).3. RELATÓRIOO relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação seguinte:- substâncias de ensaio: dados relativos à identificação química,- organismos utilizados no ensaio: origem, cultura de laboratório, número da estirpe, método de cultura,- condições do ensaio:- data do início e do termo do ensaio e respectiva duração,- temperatura,- composição do meio,- aparelho para a cultura,- pH das soluções no início e no termo do ensaio (deve ser fornecida uma explicação se forem observados desvios de pH superiores a 1,5 unidades),- veículo e método utilizados para solubilizar a substância de ensaio e concentração do veículo nas soluções de ensaio,- intensidade e natureza da luz,- concentrações ensaiadas (medidas ou nominais).- Resultados:- densidade celular em cada um dos frascos de ensaio para cada um dos pontos de medição e método para a medição da densidade celular,- valores médios da densidade celular,- curvas de crescimento,- representação gráfica da relação concentração/efeito,- valores CE e método para o seu cálculo,- CSEO,- outros efeitos observados.4. REFERÊNCIAS1. OECD, Paris, 1981, Test Guideline 201, Decision of the Council C(81) 30 Final.2. Umweltbundesamt, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag «Hemmung der Zellvermehrung bei der Grunalge Scenedesmus subspicatus», in: Rudolph/Boje: Ökotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.3. ISO 8692 - Water quality - Fresh water algal growth inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum.4. S.Galassi and M.Vighi - Chemosphere, 1981, vol.10, 1123-1126.Apêndice 1Exemplo de um procedimento para a cultura de algasObservações geraisO objectivo de se fazer uma cultura com base no procedimento a seguir descrito consiste em proporcionar culturas de algas para ensaios de toxicidade.Dever-se-ão utilizar métodos adequados para garantir que as culturas de algas não são infectadas com bactérias (ISO 4833). As culturas axénicas podem ser desejáveis mas as culturas de algas de uma única espécie são essenciais.Todas as operações deverão ser efectuadas sob condições estéreis, no sentido de se evitar a contaminação com bactérias ou com outras algas. As culturas contaminadas devem ser rejeitadas.Procedimentos para a obtenção de culturas de algasPreparação das soluções de nutrientes (meio de cultura):O meio de cultura pode ser preparado diluindo as soluções de nutrientes concentradas de reserva. Para um meio sólido adiciona-se 0,8 % de agar. O meio utilizado deve ser estéril. A esterilização em autoclave pode originar a libertação de NH3.Cultura de reserva:As culturas de reserva são pequenas culturas de algas que são regularmente transferidas para um meio fresco afim de servirem de material de ensaio inicial. Se as culturas não forem regularmente utilizadas, são conservadas em tubos de agar inclinados. São transferidas para um meio fresco pelo menos de dois em dois meses.As culturas de reserva são cultivadas em frascos de ensaio contendo o meio adequado (com o volume aproximado de 100 ml). Quando as algas são incubadas à temperatura de 20  C com iluminação contínua é necessário fazer uma transferência semanal.Durante a transferência, uma determinada quantidade de cultura «antiga» é transferida por meio de pipetas esterilizadas para um frasco de ensaio contendo o meio fresco, de modo a que a concentração inicial, para as espécies em crescimento rápido, seja cerca de 100 vezes inferior à verificada na cultura antiga.A taxa de crescimento de uma espécie pode ser determinada a partir da curva de crescimento. Uma vez conhecida, é possível estimar a densidade para a qual a cultura deve ser transferida para o novo meio, o que deve ser feito antes da cultura alcançar a fase de morte.Pré-cultura:Pretende-se que a pré-cultura forneça uma adequada quantidade de algas para a inoculação das culturas de ensaio. A pré-cultura é incubada nas condições do ensaio e utilizada quando ainda se encontra em fase exponencial de crescimento, normalmente após um período de incubação de cerca de três dias. Quando as culturas de algas apresentam células deformadas ou anormais, devem ser rejeitadas.Apêndice 2A norma ISO 8692 - qualidade da água - o ensaio de inibição do crescimento de algas em água-doce com as espécies Scenedesmus subspicatus e Selenastrum capricornutum deu origem aos resultados que a seguir se apresentam, num ensaio interlaboratorial desenvolvido por 16 laboratórios, testando-se o dicromato de potássio).>POSIÇÃO NUMA TABELA>C.4. DETERMINAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE «FÁCIL»PARTE I. CONSIDERAÇÕES GERAISI.1. INTRODUÇÃODescrevem-se seis métodos de ensaio que permitem fazer o despiste da biodegradabilidade fácil de substâncias químicas, num meio aquoso aeróbio:a) Redução gradual do Carbono Orgânico Dissolvido (COD) (método C.4-A);b) Método de despiste da OCDE modificado - redução gradual do COD (método C.4-B);c) Libertação de dióxido de carbono (CO2) (teste de Sturm modificado) (método C.4-C);d) Respirometria manométrica (método C.4-D);e) Frasco fechado (método C.4-E);f) MITI (Ministério do Comércio Internacional e da Indústria - Japão) (método C.4-F);As considerações gerais e também as considerações comuns aos seis testes figuram na parte I do método. Os aspectos específicos de cada método são descritos nas partes II a VII. Os anexos contêm definições, fórmulas e anotações informativas.Um exercício comparativo interlaboratórios organizado pela OCDE, efectuado em 1988, demonstrou que os métodos permitem obter resultados consistentes. Todavia, consoante as características físicas da substância que se pretende testar, assim se dará preferência a um ou outro método.I.2 SELECÇÃO DO MÉTODO APROPRIADONo sentido de se seleccionar o método mais adequado, é essencial dispor de informações sobre a solubilidade, a pressão de vapor e as características de adsorção das substâncias químicas. A estrutura química ou a fórmula química devem ser conhecidas para o cálculo dos valores teóricos e/ou confirmação dos valores medidos dos parâmetros característicos, por exemplo, CTeO, CO2Te, COD, COT, CQO (ver anexos I e II).As substâncias químicas de ensaio que forem solúveis em água na proporção de pelo menos 100 mg/l podem ser avaliadas por todos os métodos, desde que não sejam voláteis e não sejam adsorventes. Para as substâncias químicas que forem pouco solúveis em água, voláteis ou adsorventes, os métodos adequados são indicados no quadro 1. No anexo III é descrito o modo de proceder com as substâncias químicas pouco solúveis em água e com as substâncias químicas voláteis. As substâncias químicas moderadamente voláteis podem ser testadas pelo método de redução gradual do COD, se existir espaço livre suficiente para o gás nos recipientes de ensaio (os quais devem estar adequadamente tapados). Neste caso deve ser efectuado um controlo abiótico que permita detectar eventuais perdas físicas.>POSIÇÃO NUMA TABELA>É necessário dispor de informações sobre a pureza ou sobre as proporções relativas dos componentes principais do material de ensaio para interpretar os resultados obtidos, especialmente quando os resultados são baixos ou marginais.O facto de se dispor de informações sobre a toxicidade da substância química de teste em relação às bactérias (anexo IV) pode ser muito útil, para seleccionar concentrações de ensaio adequadas e pode ser essencial para a interpretação correcta de valores baixos de biodegradação.1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIAPara se controlar o processo testam-se substâncias químicas de referência que satisfaçam os critérios de biodegradabilidade fácil, realizando uma experiência num frasco adequado, em paralelo com os procedimentos normais.As substâncias químicas adequadas são a anilina (recentemente destilada), o acetato de sódio e o benzoato de sódio. Todas estas substâncias químicas de referência degradam-se ao serem submetidas a estes métodos, mesmo quando nenhum inóculo é deliberadamente adicionado.Foi sugerida a utilização de uma substância química de referência que fosse facilmente biodegradável, mas que necessitasse da adição de um inóculo. Foi sugerida a utilização de hidrogenoftalato de potássio mas é necessário obter mais provas de eficácia com esta substância, antes que possa ser aceite como substância de referência.Nos ensaios respirométricos, os compostos que contêm azoto podem afectar o consumo de oxigénio devido à nitrificação (ver anexos II e V).I.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS DE ENSAIOFaz-se a inoculação de uma solução ou suspensão da substância de ensaio num meio mineral e, depois, procede-se à incubação sob condições aeróbias, ao abrigo da luz ou sob luz difusa. A quantidade de COD na solução de ensaio originada pelo inóculo, deverá ser mantida o mais baixo possível relativamente à quantidade de COD originada pela substância de ensaio.Tem-se em conta a actividade endógena do inóculo efectuando ensaios paralelos em branco, com inóculo, mas sem a substância de ensaio, embora a actividade endógena das células na presença da substância, não seja exactamente a mesma que no controlo endógeno. Efectua-se um ensaio em paralelo com a substância de referência, para verificação do processo.Em geral, acompanha-se a degradação determinando parâmetros característicos, tais como o COD, a produção de CO2 e o consumo de oxigénio, efectuando-se medições com suficiente frequência, de modo a identificar o início e o fim da biodegradação. Com os respirómetros automáticos as medições são contínuas. O COD é por vezes medido em conjunto com outro parâmetro mas normalmente isso só sucede no início e no fim do ensaio. Também se pode recorrer a análises químicas específicas para avaliar a degradação primária da substância de ensaio e para se determinar a concentração de quaisquer substâncias intermédias formadas (obrigatório no teste de MITI).Normalmente, o ensaio prolonga-se por 28 dias. Todavia, os ensaios podem ser terminados antes de decorridos 28 dias, isto é, logo que a curva de biodegradação tenha atingido um patamar que envolva pelo menos 3 determinações. Os ensaios também podem ser prolongados para além do período de 28 dias, no caso de a curva mostrar que se iniciou a biodegradação mas que o patamar não foi atingido até ao 28o dia.I.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADEI.5.1. ReprodutibilidadeDevido à natureza da biodegração e das populações bacterianas mistas utilizadas como inóculos, as determinações devem ser efectuadas pelo menos em duplicado.Sabe-se pela experiência que, quanto maior for a concentração de microrganismos adicionados inicialmente ao meio de ensaio, menores serão as diferenças entre repetições. Ensaios interlaboratoriais demonstram também que pode haver grandes diferenças entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes, embora se obtenha, normalmente, uma boa concordância quando se utilizam compostos facilmente biodegradáveis.I.5.2. Validade do ensaioConsidera-se que um ensaio é válido se a diferença entre valores extremos de repetições de desaparecimento da substância química de ensaio, no patamar, no fim do teste ou no final dos 10 dias, for inferior a 20 % e se a percentagem de degradação da substância de referência atingir o nível de biodegradabilidade fácil ao fim de 14 dias. Se qualquer uma destas condições não for satisfeita, o ensaio deve ser repetido. Devido à especificidade dos métodos, os valores baixos não significam necessariamente que a substância de ensaio não seja biodegradável nas condições ambientais, mas significa que serão necessários novos estudos para se provar a biodegradabilidade.Se num ensaio de toxicidade, contendo tanto a substância de ensaio como a substância química de referência, ocorrer uma degradação inferior a 35 % (tomando como base o COD) ou inferior a 25 % (tomando como base CTeO ou CO2Te) decorridos 14 dias, pode admitir-se que as substâncias químicas de ensaio são inibidoras (ver também o anexo IV). As sequências de ensaio deverão ser repetidas, utilizando, se possível, uma concentração inferior da substância química de ensaio e/ou uma concentração superior de inóculo, mas não superior a 30 mg de sólidos/litro.I.6. PREPARAÇÕES E PROCEDIMENTOS GERAISAs condições gerais aplicáveis aos ensaios são resumidas no quadro 2. O equipamento e outras condições experimentais correspondentes especificamente a um determinado ensaio são descritas depois, sob o título desse ensaio.>POSIÇÃO NUMA TABELA>I.6.1. Água de diluiçãoÉ usada água desionizada ou destilada, livre de substâncias tóxicas (por exemplo iões Cu++) em concentrações inibidoras. Não deve conter mais do que 10 % do teor de carbono orgânico introduzido pela substância de ensaio. É necessária uma elevada pureza para a água de ensaio para evitar um elevado número de valores em branco. A contaminação pode resultar de impurezas inerentes e também de resinas de permuta iónica e do material lisado de bactérias e algas. Para cada série de ensaios utiliza-se apenas um lote de água, controlada previamente por análise do COD. Tal controlo não é necessário no teste do frasco fechado, mas o consumo de oxigénio da água deve ser baixo.I.6.2. Soluções de reserva de componentes mineraisPara se preparar as soluções de ensaio recorre-se à utilização de soluções de reserva com concentrações apropriadas de componentes minerais. É possível utilizar as seguintes soluções de reserva (com diversos factores de diluição) para os métodos de redução gradual do COD, despiste da OCDE modificado, libertação de CO2, respirometria manométrica, ensaio em frasco fechado.Os factores de diluição e, no caso do ensaio de MITI, a preparação específica do meio mineral, são indicados sob os títulos dos ensaios específicos.Soluções de reserva:Preparam-se as seguintes soluções de reserva utilizando reagentes da qualidade analítica.a) Dihidrogeno-ortofosfato monopotássico, KH2PO48,50 gMonohidrogeno-ortofosfato dipotássico, K2HPO421,75 gMonohidrogeno-ortofosfato dissódico dihidratado,Na2HPO4 . 2H2O33,40 gCloreto de amónio, NH4Cl0,50 gDissolver em água e ajustar até ao volume de 1 litro. O pH da solução deverá ser 7,4;b) Cloreto de cálcio anidro, CaCl227,50 gou cloreto de cálcio dihidratado, CaCl2 . 2H2O36,40 gDissolver em água e ajustar o volume até 1 litro;c) Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4 . 7H2O22,50 gDissolver em água e ajustar o volume até 1 litro;d) Cloreto de ferro (III) hexahidratado, FeCl3 . 6H2O0,25 gDissolver em água e ajustar o volume até 1 litro.Nota: para não se ter de preparar esta solução imediatamente antes da sua utilização adiciona-se-lhe uma gota de HCl concentrado ou 0,4 g do sal dissódico do ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) por litro.1.6.3. Soluções de reserva das substâncias químicasQuando a solubilidade for superior a 1 g/l, dissolver 1-10 g, por exemplo, conforme for apropriado, da substância química de ensaio ou de referência em água desionizada e ajustar o volume a 1 litro. Caso contrário, preparar soluções de reserva em meio mineral e adicionar a substância química directamente ao meio mineral. Para o caso de substâncias químicas de menor solubilidade veja-se o anexo III; no teste do MITI (método C.4-F) não serão utilizados nem solventes nem agentes emulsionantes.I.6.4. InóculosO inóculo pode ser obtido a partir de uma diversidade de origens: lamas activadas, efluentes de esgotos (não clorados), solos e águas superficiais ou a partir de uma mistura dessas origens. Para os ensaios de redução gradual do COD, de libertação de CO2 e de respirometria manométrica, no caso de se utilizarem lamas activadas estas devem ser obtidas a partir de uma estação de tratamento ou de uma unidade laboratorial que receba essencialmente águas residuais domésticas. Verificou-se que os inóculos provenientes de outras origens provocam uma maior dispersão de resultados. Nos ensaios de despiste da OCDE modificado e de frasco fechado é necessário um inóculo mais diluído, sem partículas de lama, sendo a fonte preferencial um efluente secundário proveniente de uma estação de tratamento de resíduos domésticos ou de uma unidade laboratorial. No caso do ensaio de MITI, o inóculo provém de uma mistura de origens, sendo descrito sob o título do ensaio específico.I.6.4.1. Inóculo de lamas activadasRecolher uma amostra de lamas activadas recentes, provenientes de um tanque de arejamento de uma estação de tratamento de esgotos ou de uma unidade laboratorial que trate essencialmente esgotos domésticos. Remover as partículas grosseiras, se necessário por filtração através de um crivo fino e manter posteriormente as lamas em estado aeróbio.Em alternativa, deixar sedimentar ou centrifugar (por exemplo, a 1 100 g durante 10 minutos) depois a remoção de todas as partículas grosseiras. Rejeitar o sobrenadante. As lamas podem ser lavadas em meio mineral. Preparar uma suspensão das lamas concentradas em meio mineral, para se obter uma concentração de 3-5 g de sólidos em suspensão/l e efectuar o arejamento enquanto for necessário.As lamas devem ser obtidas a partir de uma adequada estação de tratamento. Se as lamas forem obtidas de uma estação de tratamento de grandes caudais ou nas quais se admite a presença de inibidores, devem ser lavadas. Deixar sedimentar ou centrifugar as lamas da nova suspensão após mistura profunda, rejeitar o sobrenadante e preparar outra suspensão das lamas lavadas num novo volume de meio mineral. Repetir este procedimento até se concluir que as lamas não possuem inibidor ou substrato em excesso.Depois de se ter obtido uma nova suspensão, ou quando se utilizam lamas não tratadas, retirar uma amostra imediatamente antes da sua utilização para determinação do resíduo seco correspondente às substâncias sólidas em suspensão.Outra alternativa consiste em homogeneizar as lamas activadas (3-5 g de sólidos em suspensão/l). Tratar as lamas num misturador mecânico durante 2 minutos, a uma velocidade média. Deixar sedimentar a mistura de lamas durante 30 minutos ou durante um período mais longo, se necessário, e decantar o líquido para utilização como inóculo na proporção de 10 ml/l de meio mineral.I.6.4.2. Outras fontes de inóculoEste pode ser obtido a partir de um efluente secundário de uma estação de tratamento ou de uma unidade laboratorial que receba essencialmente resíduos domésticos. Recolher uma amostra fresca e conservá-la aerobicamente durante o transporte. Deixar sedimentar durante uma hora ou filtrar através de papel de filtro para partículas grosseiras e conservar aerobicamente o efluente decantado ou o filtrado, enquanto for necessário. Pode utilizar-se até 100 ml deste tipo de inóculo para cada litro de meio.As águas superficiais constituem uma fonte adicional de inóculo. Nesse caso, recolher uma amostra de uma água superficial adequada, por exemplo, dos rios ou dos lagos e conservá-la em estado aeróbio enquanto for necessário. Se tal se justificar, concentrar o inóculo por filtração ou por centrifugação.I.6.5. Pré-condicionamento dos inóculosOs inóculos podem ser pré-condicionados para as condições experimentais mas não podem ser pré-adaptados à substância química de ensaio. O pré-condicionamento consiste em arejar as lamas activadas em meio mineral ou efluente secundário durante cinco a sete dias, à temperatura de ensaio. Por vezes, o pré-condicionamento melhora a precisão dos métodos de ensaio pelo facto de reduzir os valores dos brancos. É desnecessário pré-condicionar o inóculo para o método de MITI.I.6.6. Controlos abióticosSempre que necessário, verificar a possível degradação abiótica da substância de ensaio, determinando a remoção do COD, o consumo de oxigénio ou a libertação de dióxido de carbono em controlos estéreis que não contenham inóculo. Esterilizar por filtração através de uma membrana (0,2-0,45 micron) ou adicionando uma substância tóxica adequada numa concentração conveniente. Se é usada membrana de filtração, colhem-se as amostras assepticamente para que se mantenha a esterilidade. A menos que se tenha excluído previamente a adsorção da substância de ensaio, os testes para a medição da biodegradação por remoção do COD, especialmente com inóculo de lamas activas, deverão incluir um controlo abiótico, o qual é inoculado e contaminado.I.6.7. Número de frascosO número de frascos numa experiência-tipo é descrito nos títulos de cada ensaio.Podem usar-se os seguintes tipos de frascos: suspensão de ensaio:substância de ensaio e inóculobranco de inóculo:sómente o inóculocontrolo do processo:substância de referência e inóculocontrolo abiótico estéril:substância de ensaio, estéril (ver ponto I.6.6)controlo de adsorção:substância de ensaio, inóculo e agente esterilizantecontrolo de toxicidade:substância de ensaio, substância de referência e inóculoAs determinações na suspensão de ensaio e no branco do inóculo, deverão obrigatoriamente ser feitas em paralelo. É também aconselhável fazer as determinações noutro frasco, em paralelo.Todavia, isto nem sempre é possível. Garantir que são preparadas amostras suficientes ou efectuadas leituras suficientes de modo que possa avaliar-se a remoção percentual no período dos 10 dias.I.7. RESULTADOS E AVALIAÇÃONo cálculo do valor Dt, degradação percentual, utilizam-se os valores médios das medições em duplicado dos parâmetros tanto nos recipientes de ensaio como no branco de inóculo. As fórmulas são apresentadas a seguir, nas secções correspondentes sobre os ensaios específicos. A evolução da degradação é representada graficamente, sendo indicado o período dos 10 dias. Calcular e registar a remoção percentual alcançada no final do período dos 10 dias e o valor no patamar ou no final do ensaio, conforme o caso.Nos ensaios respirométricos os compostos que contêm azoto podem afectar o consumo de oxigénio, devido a fenómenos de nitrificação (ver os anexos II e V).I.7.1. Degradação medida através da determinação do CODPara o cálculo da percentagem de degradação (Dt), é colhida uma amostra num dado momento, o qual deverá ser calculado separadamente para cada um dos frascos que contêm a substância a testar, usando os valores médios das medições em duplicado do COD, com o fim de se poder avaliar a validade do teste (ver ponto I.5.2). Para o cálculo usa-se a seguinte equação:Dt = (1    Ct   Cbt Co   Cbo) × 100em que:Dt = % de degradação no momento t,Co = concentração média inicial de COD no meio de cultura inoculado que contém a substância de ensaio (mg de COD/l),Ct = concentração média de COD no meio de cultura inoculado que contém a substância de ensaio, no momento t (mg de COD/l),Cbo = concentração média inicial de COD no branco de meio mineral inoculado (mg de COD/l),Cbt = concentração média de COD no branco de meio mineral inoculado no momento t (mg de COD/l).Todas as concentrações são medidas experimentalmente.I.7.2. Degradação medida através de análise específicaNo caso de existirem dados analíticos específicos, calcular a biodegradação primária pela fórmula:Dt = Sb   SaSb × 100em que:Dt = % de degradação no momento t, normalmente após 28 dias,Sa = quantidade residual de substância de ensaio no meio inoculado no final do ensaio (mg),Sb = quantidade residual de substância de ensaio no teste em branco que utiliza água/meio a que apenas se adicionou a substância de ensaio (mg).I.7.3. Degradação abióticaQuando é usado um controlo estéril abiótico, usa-se para o cálculo da percentagem de degradação abiótica, a fórmula seguinte:% Degradação abiótica = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 100em que:Cs(o) = concentração COD no controlo estéril no dia zero,Cs(t) = concentração COD no controlo estéril no dia t.I.8. RELATÓRIOO relatório de ensaio deverá conter, se possível, as informações seguintes:- substâncias químicas de ensaio e de referência e o seu grau de pureza,- condições de ensaio,- inóculo: natureza e locais de amostragem, concentração e qualquer tratamento de pré-condicionamento,- proporção e natureza dos resíduos industriais existentes nas águas residuais, se forem conhecidas,- duração e temperatura, do ensaio,- nos casos das substâncias químicas de ensaio pouco solúveis, qual o tratamento efectuado,- método de ensaio aplicado; deverão ser apresentadas e explicadas as razões científicas de qualquer modificação de procedimento,- folha de dados,- qualquer fenómeno de inibição observado,- qualquer degradação abiótica observada,- dados analíticos químicos específicos, se os houver,- dados analíticos químicos sob intermediários, se os houver,- o gráfico da degradação percentual em função do tempo para as substâncias de ensaio e de referência, a fase de latência, a fase de degradação, o período dos 10 dias e o declive, deverão ser claramente indicados (anexo I). Se o teste foi sujeito a um critério de validade, as percentagens médias de degradação nos frascos com a substância de ensaio, podem ser usadas para o gráfico,- a remoção percentual depois do período dos 10 dias, e no patamar ou no final do ensaio.PARTE II. ENSAIO DA REDUÇÃO GRADUAL DO COD (método C.4-A)II.1. PRINCÍPIO DO MÉTODOAo abrigo da luz ou sob luz difusa e à temperatura de 22 ± 2  C faz-se o arejamento de um determinado volume de meio mineral inoculado, contendo uma concentração conhecida da substância de ensaio (10-40 mg COD/l) como única fonte nominal de carbono orgânico.Acompanha-se a degradaçâo por análise frequente do COD ao longo de um período de 28 dias. Calcula-se o grau de biodegradação, exprimindo a concentração de COD removido (corrigida em função do branco de inóculo de controlo) em percentagem da concentração inicialmente presente. O grau de biodegradação primária também pode ser calculado através de uma análise química complementar efectuada no início e no fim da incubação.II.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODOII.2.1. Equipamentoa) Frascos cónicos, por exemplo, com capacidade entre 250 ml e 2 l, consoante o volume necessário para a análise do COD;b) Máquina agitadora - para os frascos cónicos, com controlo automático de temperatura ou, em alternativa, utilizada a uma temperatura ambiente constante, e com potência suficiente para manter condições aeróbias em todos os frascos;c) Equipamento de filtração, com membranas adequadas;d) Analisador de COD;e) Equipamento para determinar o oxigénio dissolvido;f) Centrifugadora.II.2.2. Preparação do meio mineralPara a preparação da solução de reserva, ver ponto I.6.2.Misturar 10 ml de solução (a) com 800 ml de água de diluição, adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com água de diluição.II.2.3. Preparação e pré-condicionamento do inóculoO inóculo pode ser obtido de várias origens: lamas activadas; efluentes de esgotos; águas de superfície; solos ou misturas destes.Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e I.6.5.II.2.4. Preparação dos frascosA título de exemplo, introduzir quantidades de 800 ml de meio mineral em frascos cónicos com a capacidade de 2 litros e adicionar volumes suficientes das soluções de reserva que contêm as substâncias de ensaio e de referência a frascos separados, para se obter uma concentração de substância química equivalente a 10-40 mg de COD/l. Controlar os valores do pH e ajustá-los, se necessário, para 7,4. Inocular os frascos com lamas activadas ou com outra fonte de inóculos (ver ponto I.6.4), para se obter uma concentração final não superior a 30 mg de sólidos em suspensão/l. Preparar também os controlos de inóculo em meio mineral mas sem a substância química de ensaio ou de referência.Se necessário, utilizar um recipiente para verificação do possível efeito inibidor da substância química de ensaio, inoculando uma solução que contenha, num meio mineral, concentrações comparáveis das substâncias químicas de ensaio e de referência.Ainda no caso de ser necessário, preparar outro frasco estéril para verificar se a substância química de ensaio se degrada abioticamente, utilizando uma solução não inoculada contendo a substância química (ver ponto 1.6.6).Para além disso, no caso de se suspeitar que a substância química de ensaio é significativamente adsorvida pelo vidro, lamas, etc., efectuar uma avaliação preliminar para se determinar o grau provável da adsorção e, consequentemente, se determinar se o ensaio é adequado à substância química (ver quadro I). Preparar um frasco com a substância de ensaio, o inóculo e o agente esterilizante.Ajustar os volumes em todos os frascos a 1 litro, utilizando meio mineral e, depois de se misturar, retirar uma amostra de cada frasco para determinar a concentração inicial de COD (ver anexo II.4). Tapar as aberturas dos frascos, por exemplo com folha de alumínio, de modo a permitir a permuta livre de ar entre o frasco e a atmosfera envolvente. Colocar depois os recipientes na máquina agitadora e iniciar o ensaio.II.2.5. Número de frascos numa experiência-tipoDe preferência:Frascos 1 e 2: suspensão de ensaio;Frascos 3 e 4: branco do inóculo;Frasco 5: controlo;Se necessário, ainda:Frasco 6: controlo abiótico estéril;Frasco 7: controlo da adsorção;Frasco 8: controlo da toxicidade.Ver ponto I.6.7.II.2.6. Realização do ensaioAo longo do ensaio, determinar as concentrações de COD em cada frasco em duplicado, a intervalos de tempo conhecidos suficientemente frequentes que permitam determinar o início do período dos 10 dias e a remoção percentual no final do período dos 10 dias. Utilizar apenas o volume mínimo de suspensão de ensaio necessário para cada determinação.Antes da colheita de amostras, repor as perdas dos frascos por evaporação, adicionando água de diluição (ponto I.6.1) na quantidade requerida, se for necessário. Homogeneizar o meio de cultura antes de se retirar a amostra e garantir que o material aderente às paredes dos recipientes é dissolvido ou se mantém em suspensão antes da colheita de amostras. Filtrar através de membranas ou centrifugar (ver anexo II.4), imediatamente após a colheita de amostras. Analisar no mesmo dia as amostras filtradas ou centrifugadas ou, caso contrário, armazená-las à temperatura de 2-4  C durante um período máximo de 48 horas, ou a uma temperatura inferior a  18  C no caso de um período mais longo.II.3. RESULTADOS E RELATÓRIOII.3.1. Tratamento dos resultadosCalcular a percentagem de degradação no momento t conforme referido no ponto I.7.1 (determinação do COD) e, facultativamente, conforme referido no ponto I.7.2 (análise específica).Registar todos os resultados nas folhas de dados fornecidas.II.3.2. Validade dos resultadosVer ponto I.5.2.II.3.3. RelatórioVer ponto I.8.II.4. FOLHA DE DADOSComo exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:ENSAIO DE REDUÇÃO GRADUAL DO COD1. LABORATÓRIO2. DATA DO INIÍCIO DO ENSAIO3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIONome:Concentração da solução de reserva: ... mg/l da substânciaConcentração inicial no meio, to: ... mg/l da substância4. INÓCULOOrigem:Tratamento efectuado:Pré-condicionamento, se o houver:Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura reaccional: mg/l5. DETERMINAÇÕES DE CARBONOAnalisador de carbono ...>POSIÇÃO NUMA TABELA>6. AVALIAÇÃO DOS DADOS BÁSICOS>POSIÇÃO NUMA TABELA>7. CONTROLO ABIÓTICO (facultativo)>POSIÇÃO NUMA TABELA>% de degradação abiótica = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 1008. ANÁLISE QUÍMICA ESPECÍFICA (facultativa)>POSIÇÃO NUMA TABELA>PARTE III. TESTE DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO (método C.4-B)III.1. PRINCÍPIO DO MÉTODOUtilizando 0,5 ml de efluente por litro de meio faz-se a inoculação de um determinado volume de meio mineral, contendo uma concentração conhecida da substância de ensaio (10-40 mg de COD/l) como única fonte nominal de carbono orgânico. Faz-se o arejamento da mistura ao abrigo da luz ou sob luz difusa, à temperatura de 22 ± 2  C.Acompanha-se a degradação por análise frequente do COD ao longo de um período de 28 dias. Calcula-se o grau de biodegradação, exprimindo a concentração de COD removido (corrigida em função do branco de inóculo de controlo) em percentagem da concentração inicialmente presente. O grau de biodegradação primária também pode ser calculado através de uma análise química complementar efectuada no início e no fim da incubação.III.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODOIII.2.1. Equipamentoa) Frascos cónicos, por exemplo, com capacidade entre 250 ml e 2 l, consoante o volume necessário para a análise do COD;b) Máquina agitadora - para os frascos cónicos, com controlo automático de temperatura ou, em alternativa, utilizada a uma temperatura ambiente constante, e com potência suficiente para manter condições aeróbias em todos os frascos;c) Equipamento de filtração, com membranas adequadas;d) Analisador de COD;e) Equipamento para determinar o oxigénio dissolvido;f) Centrifugadora.III.2.2. Preparação do meio mineralPara a preparação da solução de reserva, ver ponto I.6.2.Misturar 10 ml de solução (a) com 800 ml de água de diluição, adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com a água de diluição.Neste método utiliza-se como inóculo apenas 0,5 ml de efluente/litro pelo que pode ser necessário reforçar o meio com oligoelementos e factores de crescimento. Esta operação efectua-se adicionando 1 ml de cada uma das soluções a seguir indicadas por litro de meio final.Solução de oligoelementos:Sulfato de manganês tetrahidratado, MnSO4 . 4H2O 39,9 mgÀcido bórico, H3BO3 57,2 mgSulfato de zinco heptahidratado, ZnSO4 . 7H2O 42,8 mgHeptamolibdato de amónio, (NH4)6 Mo7O24 34,7 mgQuelato de Fe (FeCl3 - ácido etilenodiaminatetracético) 100,0 mgDissolver e ajustar o volume a 1 000 ml com água de diluição.Solução vitamínica:Extrato de levedura 15,0 mgDissolver o extrato de levedura em 100 ml de água. Esterilizar, fazendo passar através de uma membrana de 0,2 micron ou preparar de fresco.III.2.3. Preparação e pré-condicionamento do inóculoO inóculo é derivado de um efluente secundário de uma estação de tratamento ou laboratório, que recebe predominantemente esgotos domésticos. Ver pontos I.6.4.2 e I.6.5.Utiliza-se 0,5 ml por litro de meio mineral.III.2.4. Preparação dos frascosA título de exemplo, introduzir quantidades de 800 ml de meio mineral em frascos cónicos com a capacidade de 2 litros e adicionar volumes suficientes das soluções de reserva que contêm as substâncias de ensaio e de referência a frascos separados, para se obter uma concentração de substância química equivalente a 10-40 mg de COD/l. Controlar o valor do pH e ajustá-lo, se necessário, para 7,4. Inocular os frascos com efluente de águas residuais para se obter uma concentração de 0,5 ml/litro (ver ponto I.6.4.2). Preparar também os controlos de inóculo em meio mineral mas sem a substância química de ensaio ou de referência.Se necessário, utilizar um recipiente para verificação do possível efeito inibidor da substância química do ensaio, inoculando uma solução que contenha, num meio mineral, concentrações comparáveis das substâncias químicas de ensaio e de referência.Ainda se necessário, preparar outro frasco estéril para verificar se a substância química de ensaio se degrada abioticamente, utilizando uma solução não inoculada contendo a substância química (ver ponto 1.6.6).Para além disso, no caso de se suspeitar que a substância química de ensaio é significativamente adsorvida pelo vidro, lamas, etc., efectuar uma avaliação preliminar para se determinar o grau provável de adsorção e, consequentemente, se determinar se o ensaio é adequado à substância química (ver quadro I). Preparar um frasco com a substância de ensaio, o inóculo e o agente esterilizante.Ajustar os volumes em todos os frascos a 1 litro, utilizando meio mineral, e, depois de se misturar, retirar uma amostra de cada frasco para determinar a concentração inicial de COD (ver anexo II.4). Tapar as aberturas dos frascos, por exemplo com folha de alumínio, de modo a permitir a permuta livre de ar entre o frasco e a atmosfera envolvente. Colocar depois os recipientes na máquina agitadora e iniciar o ensaio.III.2.5. Número de frascos numa experiência-tipoDe preferência:Frascos 1 e 2: suspensão de ensaio,Frascos 3 e 4: branco do inóculo,Frasco 5: controlo;Se necessário, ainda:Frasco 6: controlo abiótico estéril,Frasco 7: controlo da adsorção,Frasco 8: controlo da toxicidade.Ver ainda o ponto I.6.7.III.2.6. Realização do ensaioAo longo do ensaio, determinar as concentrações de COD em cada frasco em duplicado, a intervalos de tempo conhecidos suficientemente frequentes que permitam determinar o início do período dos 10 dias e a remoção percentual no final do período dos 10 dias. Utilizar apenas o volume mínimo de suspensão de ensaio necessário para cada determinação.Antes da colheita de amostras, repor as perdas dos frascos por evaporação, adicionando água de diluição (ponto I.6.1) na quantidade requerida, se for necessário. Homogeneizar o meio de cultura antes de se retirar a amostra e garantir que o material aderente às paredes dos recipientes é dissolvido ou se mantém em suspensão antes da colheita de amostras. Filtrar através de membranas ou centrifugar (ver anexo II.4), imediatamente após a colheita de amostras. Analisar no mesmo dia as amostras filtradas ou centrifugadas ou, caso contrário, armazená-lasà temperatura de 2  C durante um período máximo de 48 horas, ou a uma temperatura inferior a  18  C no caso de um período mais longo.III.3. RESULTADOS E RELATÓRIOIII.3.1. Tratamento dos resultadosCalcular a percentagem de degradação no momento t conforme referido no ponto I.7.1 (determinação do COD) e, facultativamente, conforme referido no ponto I.7.2 (análise específica).Registar todos os resultados nas folhas de dados fornecidas.III.3.2. Validade dos resultadosVer ponto I.5.2.III.3.3. RelatórioVer ponto I.8.III.4. FOLHA DE DADOSComo exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:ENSAIO DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO1. LABORATÓRIO2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIONome:Concentração da solução de reserva: mg/l da substânciaConcentração inicial no meio, to:mg/l da substância4. INÓCULOOrigem:Tratamento efectuado:Pré-condicionamento, se o houver:Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura reaccional: mg/l5. DETERMINAÇÕES DE CARBONOAnalisador de carbono:>POSIÇÃO NUMA TABELA>6. AVALIAÇÃO DOS DADOS BÁSICOS>POSIÇÃO NUMA TABELA>7. CONTROLO ABÓTICO (facultativo)>POSIÇÃO NUMA TABELA>% de degradação abiótica = Cs(o)   Cs(t)Cs(o) × 1008. ANÁLISE QUÍMICA ESPECÍFICA (facultativa)>POSIÇÃO NUMA TABELA>PARTE IV. ENSAIO DA LIBERTAÇÃO DE CO2 (método C.4-C)IV.1. PRINCÍPIO DO MÉTODOÁs escuras ou sob luz difusa faz-se passar um caudal controlado de ar isento de dióxido de carbono, para o arejamento de um volume determinado de meio mineral inoculado, contendo uma concentração conhecida da substância química de ensaio (10-20 mg de COD ou de COT/l) como única fonte nominal de carbono orgânico. Acompanha-se a degradação ao longo de 28 dias, determinando o dióxido de carbono produzido, o qual é retido em hidróxido de bário ou em hidróxido de sódio e é medido por titulação do hidróxido residual ou na forma de carbono inorgânico. A quantidade de dióxido de carbono produzido pela substância química de ensaio (corrigida em função dos valores obtidos a partir do branco de inóculo) exprime-se em percentagem do valor CO2Te. O grau de biodegradação também pode ser calculado por uma análise complementar do COD efectuada no início e no fim da incubação.IV.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODOIV.2.1. Equipamentoa) Frascos de 2-5 litros, cada um deles munido de um tubo de arejamento que atinge as proximidades do fundo do recipiente e com uma abertura de saída;b) Agitadores magnéticos, quando se fizer a avaliação de substâncias químicas pouco solúveis;c) Frascos de absorção de gás;d) Dispositivo para controlar e medir o fluxo de ar;e) Equipamento para remoção do dióxido de carbono, para obtenção de ar isento de dióxido de carbono; em alternativa, utilizar uma mistura de oxigénio isento de CO2 e de azoto isento de CO2, provenientes de garrafas, nas proporções correctas (20 % de O2: 80 % de N2);f) Dispositivo para a determinação do dióxido de carbono, recorrendo a titulação (volumetria) ou utilizando algum tipo de analisador do carbono inorgânico;g) Dispositivo de filtração por membranas (facultativo);h) Analisador de COD (facultativo).IV.2.2. Preparação do meio mineralPara a preparação das soluções de reserva ver ponto I.6.2.Misturar 10 ml de solução (a) com 800 ml de água de diluição, adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com água de diluição.IV.2.3. Preparação e pré-condicionamento do inóculoO inóculo pode ser obtido de várias origens: lamas activadas; efluentes de esgotos; águas de superfície; solos ou misturas destes.Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e I.6.5.IV.2.4. Preparação dos frascosA título de exemplo, os volumes e massas a seguir indicados representam valores para frascos de 5 litros que contenham 3 litros de suspensão. No caso de se utilizarem volumes menores, modificar os correspondentes valores em conformidade mas garantir que o dióxido de carbono formado possa ser medido com exactidão.A cada frasco de 5 litros adicionar 2 400 ml de meio mineral. Adicionar um volume adequado das lamas activadas preparadas (ver ponto I.6.4.1 e I.6.5) para se obter uma concentração de substâncias sólidas em suspensão não superior a 30 mg/l, no volume final de 3 l de mistura inoculada. Em alternativa, diluir primeiro as lamas preparadas, de modo a obter-se uma suspensão de 500-1 000 mg/l em meio mineral, antes de se adicionar uma alíquota ao conteúdo do balão de 5 litros, de modo a obter-se uma concentração de 30 mg/l; esta operação garante uma grande precisão. É possível utilizar outras fontes de inóculo (ver ponto I.6.4.2).Arejar estas misturas inoculadas, utilizando ar isento de CO2, durante a noite, para purgar o dióxido de carbono do sistema.Adicionar a substância de ensaio e a substância de referência, separadamente, a partir de volumes conhecidos das soluções de reserva, a frascos idênticos repetidos, para se obterem concentrações, modificadas pelas substâncias químicas adicionadas, de 10 a 20 mg de COD ou de COT/l; não adicionar substâncias químicas a alguns dos frascos para serem utilizados como controlos do inóculo. Adicionar as substâncias químicas de ensaio pouco solúveis directamente aos frascos, tomando como base a sua massa ou volume, ou proceder conforme descrito no anexo III.Se necessário, utilizar um frasco para verificar o possível efeito inibidor da substância química de ensaio, adicionando as substâncias químicas de ensaio e de referência nas mesmas concentrações dos outros frascos.Se necessário, utilizar também um frasco estéril para verificar se a substância química de ensaio se degrada abioticamente, utilizando uma solução não inoculada da substância química (ver ponto I.6.6.). Esterilizar adicionando uma substância tóxica numa concentração adequada.Ajustar os volumes das suspensões em todos os frascos a 3 litros, adicionando meio mineral previamente arejado com ar isento de CO2. Facultativamente, podem retirar-se amostras para análise do COD (ver anexo II.4) e/ou para análises específicas. Ligar os recipientes de absorção às saídas de ar dos frascos.No caso de se utilizar hidróxido de bário, ligar em série três frascos de absorção, contendo cada um 100 ml de uma solução de hidróxido de bário 0,0125 M, a cada frasco de 5 litros. A solução deve estar isenta de sulfatos e carbonatos precipitados e a sua concentração deve ser determinada imediatamente antes da utilização. No caso de se utilizar hidróxido de sódio, ligar dois frascos colectores, actuando o segundo como elemento de controlo para demonstrar que todo o dióxido de carbono foi absorvido no primeiro. Nos frascos de absorção as rolhas de frascos de soro são adequadas. Adicionar 200 ml de uma solução de hidróxido de sódio 0,05 M a cada frasco, quantidade que é suficiente para absorver a quantidade total de dióxido de carbono libertado até à degradação completa da substância química de ensaio. A solução de hidróxido de sódio, ainda que recentemente preparada, conterá vestígios de carbonatos; efectua-se a correcção correspondente, deduzindo os carbonatos do branco.IV.2.5. Número de frascos numa experiência-tipoBalão 1 e 2: suspensão de ensaio;Balão 3 e 4: branco do inóculo;Frasco 5: controlo;De preferência e se necessário, ainda:Frasco 6: controlo abiótico estéril;Frasco 7: controlo da toxicidade.Ver também ponto I.6.7.IV.2.6. Realização do ensaioIniciar o ensaio fazendo borbulhar ar isento de CO2 nas suspensões, com um caudal de 30-100 ml/minuto. Retirar periodicamente amostras do absorvente do dióxido de carbono, para análise do teor de CO2. Durante os primeiros 10 dias recomenda-se que as análises sejam feitas de dois em dois ou de três em três dias e, depois, de cinco em cinco dias até ao 28o dia, de modo que seja possível identificar o período dos 10 dias.Ao 28o dia, retirar amostras (facultativo) para análise do COD e/ou análises específicas, medir o pH das suspensões e adicionar a cada frasco 1 ml de ácido clorídrico concentrado; arejar os frascos durante a noite para remoção do dióxido de carbono existente nas suspensões de ensaio. No 29o dia efectuar a última análise do dióxido de carbono libertado.Nos dias das medições de CO2, desligar o dispositivo de absorção de hidróxido de bário mais próximo do frasco e fazer a titulação da solução de hidróxido, utilizando HCl 0,05 M e fenolftaleína como indicador. Deslocar os outros dispositivos de absorção para uma posição mais próxima do frasco e colocar um novo dispositivo de absorção, contendo 100 ml de hidróxido de bário 0,0125 M recente, na extremidade mais afastada da série. Efectuar as titulações conforme necessário, por exemplo, quando se observar uma precipitação substancial no primeiro frasco de absorção e antes que seja evidente qualquer precipitação no segundo ou logo que aí se note uma precipitação fraca. Em alternativa, utilizando NaOH como absorvente, retirar com uma seringa uma pequena amostra (depende das características do analisador de carbono utilizado) da solução de hidróxido de sódio do dispositivo de absorção mais próximo do frasco. Injectar a amostra na zona correspondente ao CI do analisador de carbono para analisar directamente o dióxido de carbono libertado.Analisar o teor no segundo frasco de absorção apenas no final do ensaio para corrigir qualquer passagem de dióxido de carbono.IV.3. RESULTADOS E RELATÓRIOIV.3.1. Tratamento dos resultadosA quantidade de CO2 retida num dispositivo de absorção, quando titulada, é dada por:mg CO2 = (100 × CB  0,5 × V × CA) × 44em que:V = volume de HCl utilizado na titulação dos 100 ml existentes no dispositivo de absorção (ml),CB = concentração da solução de hidróxido de bário (M),CA = concentração da solução de ácido clorídrico (M),se CB for 0,0125 M e CA for 0,05 M, a titulação, para 100 ml de hidróxido de bário, será de 50 ml, e a massa de CO2 será dada por:0,052 × 44 × ml de HCl titulado = 1,1 × ml de HClSendo assim, no caso presente, para se converter o volume de HCl titulado em mg de CO2 produzido, utiliza-se o factor 1,1.Calcular a massa do CO2 produzido a partir do inóculo isolado e a partir do inóculo e da substância química de ensaio, utilizando os respectivos valores de titulação, correspondendo a diferença à massa de CO2 produzido apenas a partir da substância química de ensaio.Por exemplo, se o inóculo isoladamente conduzir a uma titulação de 48 ml e o inóculo e a substância química de ensaio conduzirem a uma titulação de 45 ml, então:CO2 proveniente do inóculo = 1,1 × (50-48) = 2,2 mgCO2 proveniente do inóculo e da substância química de ensaio = 1,1 × (50-45) = 5,5 mgpelo que a massa do CO2 produzido a partir da substância química de ensaio será de 3,3 mg.A percentagem de biodegradação calcula-se pela expressão:% de degradação = CO2Te × mg de substância química de ensaio adicionadamg de CO2 produzido × 100ou% de degradação = mg de COT adicionado no ensaio × 3,67mg de CO2 produzido × 100sendo o valor 3,67 o factor de conversão (44/12) de carbono em dióxido de carbono.Obtém-se a percentagem de degradação decorrido qualquer intervalo de tempo, somando as percentagens de CO2Te, cujo cálculo foi efectuado em cada um dos dias até ao momento em que se faz a medição.Para os dispositivos de absorção de hidróxido de sódio, calcular a quantidade de dióxido de carbono produzida, expressa em CI (mg), multiplicando a concentração de CI no absorvente pelo volume desse absorvente.Calcular a percentagem de degradação pela expressão:% de CO2Te = mg de COT adicionado como substância química de ensaiomg de CI do frasco de ensaio   mg de CI do branco × 100Calcular as variações de COD (facultativo) conforme descrito no ponto I.7. Registar este e todos os outros resultados na folha de dados fornecida.IV.3.2. Validade dos resultadosO teor de CI da suspensão da substância química de ensaio em meio mineral, no início do ensaio, deve ser inferior a 5 % do valor do CT, e a libertação total de CO2 no branco de inóculo, no final do ensaio, não deve normalmente exceder 40 mg/l de meio. No caso de serem obtidos valores superiores a 70 mg de CO2/l, deverá fazer-se uma análise crítica dos resultados e da técnica experimental.Ver também o ponto I.5.2.IV.3.3. RelatórioVer ponto I.8.IV.4. FOLHA DE DADOSComo exemplo de uma folha de dados apresenta-se a seguinte.ENSAIO DA LIBERTAÇÃO DE DIÓXIDO DE CARBONO1. LABORATÓRIO2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIONome:Concentração da solução de reserva: mg/l da substânciaConcentração inicial no meio: mg/l da substânciaC total adicionado ao frasco: mg de C CO2Te: mg de CO24. INÓCULOOrigem:Tratamento efectuado:Pré-condicionamento, se o houver:Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura reaccional: mg/l5. PRODUÇÃO DE DIÓXIDO DE CARBONO E DEGRADABILIDADEMétodo: Ba(OH)2 / NaOH / outro ...>POSIÇÃO NUMA TABELA>6. ANÁLISE DO CARBONO (facultativa)Analisador de carbono:>POSIÇÃO NUMA TABELA>% de COD removido = 1    Ct    Cb(t) Co   Cb(o) × 1007. DEGRADAÇÃO ABIÓTICA (facultativo)% de degradação abiótica = formação de CO2 em frasco estéril decorridos 28 dias (mg)CO2Te (mg) × 100PARTE V. ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMÉTRICA (método C.4-D)V.1. PRINCÍPIO DO MÉTODOAgita-se um volume determinado de meio mineral inoculado, contendo uma concentração conhecida da substância química de ensaio (substãncia de ensaio na concentração de 100 mg/l, para dar pelo menos 50-100 mg de CTeO/l) como única fonte nominal de carbono orgãnico, num frasco fechado, a uma temperatura constante (± 1  C ou mais precisa), durante um período de 28 dias. Determina-se o consumo de oxigénio, medindo a quantidade de oxigénio (produzido electroliticamente) necessária para manter constante o volume de gás no frasco do respirómetro, ou, em alternativa, recorrendo à variação de volume ou de pressão (ou a uma combinação de ambas) no aparelho. O dióxido de carbono libertado é absorvido por uma solução de hidróxido de potássio ou por outro absorvente adequado. A quantidade de oxigénio consumida pela substãncia química de ensaio (corrigida em função do consumo paralelo do branco de inóculo) exprime-se em percentagem de CTeO ou CQO. Facultativamente, a biodegradação primária também pode ser calculada através de uma análise específica suplementar, efectuada no início e no fim da incubação, e a biodegradação total por análise do COD.V.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODOV.2.1. Equipamentoa) Respirómetro adequado;b) Controlo de temperatura, a ± 1  C ou mais precisa;c) Dispositivo de filtração por membranas (facultativo);d) Analisador de carbono (facultativo).V.2.2. Preparação do meio mineralPara a preparação das soluções de reserva ver ponto I.6.2.Misturar 10 ml da solução (a) com 800 ml de água de diluição, adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com água de diluição.V.2.3. Preparação e pré-condicionamento do inóculoO inóculo pode ser obtido de várias origens: lamas activadas; efluentes de esgotos; águas de superfície; solos ou misturas destes.Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e I.6.5.V.2.4. Preparação dos frascosPreparar soluções das substâncias químicas de ensaio e de referência, em lotes separados, em meio mineral, com uma concentração, em geral, de 100 mg de substância química/l, para dar pelo menos 50-100 mg de CTeO/l, utilizando as soluções de reserva.Calcular o valor de CTeO com base na formação de sais de amónio, a não ser que se preveja a existência de nitrificação, caso em que o cálculo deverá basear-se na formação de nitrato (ver anexo II.2).Determinar os valores do pH e, se necessário, ajustá-los a 7,4 ± 0,2.As substâncias pouco solúveis devem ser adicionadas numa fase posterior (ver adiante).No caso de se pretender determinar a toxicidade da substância química de ensaio, preparar outra solução em meio mineral, contendo as substâncias químicas de ensaio e de referência em concentrações idênticas às das soluções individuais.Se for necessário efectuar a medição do consumo físico-químico de oxigénio, preparar uma solução da substância química de ensaio, normalmente na concentração de 100 mg de CTeO/l, previamente esterilizada por adição de uma substância tóxica adequada (ver I.6,6).Introduzir o volume necessário das soluções das substâncias de ensaio e de referência nos frascos correspondentes, pelo menos em duplicado. Adicionar a outros frascos apenas meio mineral (para os controlos de inóculo) e, se necessário, a solução mista das substâncias químicas de ensaio/referência e a solução estéril.Se a substância química de ensaio for pouco solúvel, adicioná-la directamente nesta fase, tomando como base a massa ou o volume, ou proceder conforme descrito no anexo III. Adicionar hidróxido de potássio, grânulos de soda ou outro absorvente aos compartimentos do dispositivo de absorção de CO2.V.2.5. Número de frascos numa experiência-tipoDe preferência:Frascos 1 e 2: suspensão de ensaio;Frascos 3 e 4: branco do inóculo;Frasco 5: controlo;Se necessário, ainda:Frasco 6: controlo abiótico estéril;Frasco 7: controlo da toxicidade.Ver também o ponto I.6.7.V.2.6. Realização do ensaioDeixar que os recipientes atinjam a temperatura desejada e inocular os recipientes adequados com as lamas activadas preparadas ou com outra fonte de inóculo, para se obter uma concentração de substâncias sólidas em suspensão não superior a 30 mg/l. Montar o equipamento, iniciar a agitação, verificar a estanquicidade e começar a medir o consumo de oxigénio. Normalmente, não é necessária maior atenção do que efectuar as leituras necessárias e efectuar verificações diárias para se poder actuar no sentido de se manter a temperatura correcta e uma agitação adequada.Calcular o consumo de oxigénio a partir das leituras efectuadas a intervalos de tempo regulares e frequentes,utilizando os métodos fornecidos pelo fabricante do equipamento. No final da incubação, normalmente decorridos 28 dias, medir o valor do pH do conteúdo dos frascos, especialmente no caso de os consumos de oxigénio serem baixos ou superiores ao valor da CTeONH4 (para os compostos que contêm azoto).Se necessário, retirar amostras dos frascos do respirómetro, na fase inicial e na fase final, para análise do COD ou da substância química específica (ver anexo II.4). No momento da recolha da amostra inicial, garantir que se conhece o volume da suspensão de ensaio que permanece no frasco. Quando o oxigénio é consumido por uma substância de ensaio que contenha azoto, determinar o acréscimo da concentração de nitrito e de nitrato ao longo de 28 dias e calcular a correcção decorrente do oxigénio consumido por nitrificação (anexo V).V.3. RESULTADOS E RELATÓRIOV.3.1. Tratamento dos resultadosDividir o consumo de oxigénio (mg) da substância química de ensaio decorrido um determinado período (corrigido em função do branco de inóculo de controlo correspondente ao mesmo período) pela massa da substância química de ensaio utilizada. Deste modo, obtém-se o valor CBO, expresso em mg de oxigénio/mg de substância química de ensaio, ou seja:CBO = mg O2 consumido pela subst. de ensaio   mg O2 consumido pelo brancomg de substância de ensaio no frascoCBO = mg de O2 por mg de substância de ensaio no frascoCalcula-se a percentagem de biodegradação pela expressão:% de biodegradação = % de CTeO =  CBO (mg O2/mg de substância química)CTeO (mg O2/mg de substância química) × 100,ou pela expressão% CQO =  CBO (mg O2/mg de substância química) CQO (mg O2/mg de substância química) × 100Note-se que estes dois métodos não conduzirão necessariamente ao mesmo valor, sendo preferível utilizar o primeiro.Utilizar o valor apropriado da CTeO (NH4 ou NO3), consoante se conheça ou se preveja a ocorrência da nitrificação (anexo II.2). Se ocorrer nitrificação mas esta não for completa, calcular a correcção decorrente do oxigénio consumido por nitrificação, a partir das variações na concentração de nitrito e nitrato (anexo V).Quando se fazem determinações facultativas de carbono orgãnico e/ou de substâncias químicas específicas, calcular a percentagem de degradação conforme descrito no ponto I.7.Registar todos os resultados nas folhas de dados anexas.V.3.2. Validade dos resultadosO consumo de oxigénio pelo branco de inóculo é, normalmente, de 20-30 mg de O2/l e não deverá ser superior a 60 mg/l em 28 dias. Os valores superiores a 60 mg/l exigem uma análise crítica dos resultados e das técnicas experimentais. Se o valor do pH estiver fora do intervalo 6-8,5 e se o consumo de oxigénio pela substância química de ensaio for inferior a 60 %, o ensaio deve ser repetido com uma concentração inferior de substância química de ensaio.Ver tembém o ponto I.5.2.V.3.3. RelatórioVer ponto I.8.V.4. FOLHA DE DADOSComo exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMÉTRICA1. LABORATÓRIO2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIONome:Concentração da solução de reserva: ... mg/lConcentração inicial no meio, Co: ...mg/lVolume no frasco de ensaio (V): ...mlCTeO ou CQO: ...mg O2/mg de substância de ensaio (NH4, NO3)4. INÓCULOOrigem: ...Tratamento efectuado: ...Pré-condicionamento, se o houver: ...Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura reaccional: ...mg/l5. CONSUMO DE OXIGÉNIO: BIODEGRADABILIDADE>POSIÇÃO NUMA TABELA>6. CORRECÇÃO PARA A NITRIFICAÇÃO (ver Anexo V)>POSIÇÃO NUMA TABELA>7. ANÁLISE DO CARBONO (facultativa)Analisador de carbono: ...>POSIÇÃO NUMA TABELA>% de COD removido = 1    Ct   Cblt Co   Cblo × 1008. SUBSTÂNCIA QUÌMICA ESPECÍFICA (facultativo)Sb = concentração no controlo físico-químico (estéril) decorridos 28 dias,Sa = concentração no frasco inoculado decorridos 28 dias,% de biodegradação = Sb   SaSb × 1009. DEGRADAÇÃO ABIÒTICA (facultativo)a = consumo de oxigénio em frascos estéreis decorridos 28 dias, (mg)consumo de oxigénio por mg de substância química de ensaio = CoVa(ver secções 1 e 3),% de degradação abiótica = CoV × CTeOa × 100PARTE VI. ENSAIO EM FRASCO FECHADO (método C.4-E)VI.1. PRINCÍPIO DO MÉTODOFaz-se a inoculação da solução da substância química de ensaio em meio mineral, normalmente na concentração de 2-5 mg/l, utilizando um número relativamente pequeno de microrganismos provenientes de uma população mista e mantém-se em frascos fechados, completamente cheios, ao abrigo da luz e a uma temperatura constante. Acompanha-se a degradação pela análise do oxigénio dissolvido ao longo de um período de 28 dias. A quantidade de oxigénio consumido pela substância química de ensaio, corrigida em função do consumo paralelo do branco de inóculo, exprime-se em percentagem dos valores CTeO ou CQO.VI.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODOVI.2.1. Equipamentoa) Frascos para CBO com rolhas de vidro, por exemplo, com a capacidade de 250-300 ml;b) Banho ou incubador, para manter os frascos a uma temperatura constante (± 1  C ou mais precisa), ao abrigo da luz;c) Frascos de vidro grandes (2-5 l) para a preparação dos meios e para enchimento dos frascos para CBO;d) Eléctrodo de oxigénio e medidor, ou equipamento e reagentes para a titulação de Winkler.VI.2.2. Preparação do meio mineralPara a preparação da solução de reserva ver ponto I.6.2.Misturar 1 ml das soluções (a) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com água de diluição.VI.2.3. Preparação do inóculoO inóculo é normalmente obtido dum efluente secundário duma estação de tratamento ou duma unidade laboratorial, que recebe predominantemente esgotos domésticos. Uma origem alternativa para o inóculo é a água de superfície. Usa-se normalmente de uma gota (0,05 ml) a 5 ml de filtrado por litro de meio. Podem ser necessárias várias tentativas para se descobrir o volume óptimo de dado efluente (ver pontos I.6.4.2 e I.6.5).VI.2.4. Preparação dos frascosArejar fortemente o meio mineral durante pelo menos 20 minutos. Efectuar cada série de ensaios com meio mineral proveniente do mesmo lote. De um modo geral, o meio estará pronto para utilização depois de ter estado em repouso durante 20 horas, à temperatura de ensaio. Determinar a concentração do oxigénio dissolvido para efeitos de controlo; esse valor deve ser de aproximadamente 9 mg/l à temperatura de 20  C. Efectuar todas as operações de transferência e de enchimento de meio saturado com ar sem formação de bolhas, por exemplo, utilizando sifões.Paralelamente, preparar outros grupos de frascos para CBO, para a determinação das substâncias químicas de ensaio e de referência em séries experimentais simultâneas. Preparar um número suficiente de frascos para CBO, incluindo os brancos de inóculo, de modo que possam efectuar-se as medições de consumo de oxigénio, pelo menos em duplicado, com os intervalos de ensaio desejados, por exemplo, decorridos 0, 7, 14, 21 e 28 dias. Para se assegurar a identificação do período dos 10 dias, podem ser necessários mais frascos.Adicionar meio mineral completamente arejado aos frascos grandes de modo que estes fiquem cheios até um terço. Adicionar depois quantidade suficiente das soluções de reserva da substância química de ensaio e da substância química de referência a frascos grandes distintos, de modo que a concentração final das substâncias químicas não seja normalmente superior a 10 mg/l. Não adicionar nenhuma substância química ao branco de controlo do meio, contido noutro frasco grande.Para não se limitar a actividade do inóculo, garantir que a concentração do oxigénio dissolvido não desça abaixo de 0,5 mg/l nos frascos para CBO. Isto limita a concentração da substância química de ensaio a cerca de 2 mg/l. Contudo, nos casos de compostos dificilmente degradáveis e dos que têm um valor de CTeO baixo, pode prever-se 5-10 mg/l. Em alguns casos, é aconselhável efectuar uma série de experiências paralelas, com a substância química de ensaio em duas concentrações diferentes, por exemplo, 2 e 5 mg/l. Normalmente, calcula-se o valor da CTeO com base na formação de sais de amónio mas, se se souber que há nitrificação ou se esta for previsível, efectua-se o cálculo com base na formação de nitrato (CTeONO3: ver anexo II.2). Todavia, havendo nitrificação mas não sendo esta completa, efectua-se a correcção em função das variações da concentração de nitrito e de nitrato, determinadas por análise (ver anexo V).No caso de se pretender investigar a toxicidade da substância química de ensaio (por exemplo, no caso de se ter verificado previamente um fraco valor de biodegradabilidade), é necessária outra série de frascos.Preparar outro frasco grande para meio mineral arejado (cheio até um terço do seu volume), mais a substância química de ensaio e a substância química de referência com os valores finais de concentração, normalmente idênticos aos dos outros frascos grandes.Inocular as soluções dos frascos grandes com efluente secundário (uma gota, ou cerca de 0,05 ml, até 5 ml/l) ou de outra origem, tal como a água dos rios (ver ponto I.6.4.2). Finalmente, ajustar o volume das soluções com meio mineral arejado, utilizando um tubo que atinja o fundo do frasco de modo a obter-se uma mistura adequada.VI.2.5. Número de frascos numa experiência-tipoNuma experiência-tipo utilizam-se os frascos seguintes:pelo menos 10 contendo a substância química de ensaio e o inóculo (suspensão de ensaio),pelo menos 10 contendo apenas inóculo (branco de inóculo),pelo menos 10 contendo a substância química de referência e o inóculo (controlo),e, se necessário, seis frascos contendo a substância química de ensaio, a substância química de referência e o inóculo (controlo de toxicidade). Contudo, para se assegurar a identificação do período dos 10 dias, será necessário utilizar o dobro dos frascos.VI.2.6. Realização do ensaioDistribuir imediatamente cada solução preparada pelo respectivo grupo de frascos para CQO, utilizando um tubo que mergulhe até um quarto do fundo (e não no fundo) do frasco grande, de modo que todos os frascos para CQO fiquem completamente cheios. Bater suavemente para remover quaisquer bolhas de ar. Verificar, logo no momento inicial, a existência de oxigénio dissolvido nos frascos, recorrendo a análises, pelos métodos de Winkler ou do eléctrodo. O conteúdo dos frascos pode ser conservado para análise posterior pelo método de Winkler, adicionando sulfato de manganês (II) e hidróxido de sódio (o primeiro é o reagente de Winkler). Armazenar os frascos cuidadosamente tapados, contendo o oxigénio retido na forma de óxido de manganês (III) hidratado, que é castanho, ao abrigo da luz e à temperatura de 10  C-20  C, durante um período inferior a 24 horas, antes de continuar com os outros passos do método de Winkler. Rolhar os restantes frascos em duplicado, garantindo que não contêm bolhas de ar, e incubar à temperatura de 20  C, ao abrigo da luz. Cada série deve ser acompanhada por uma outra série paralela completa, para as determinações no branco de meio inoculado. De cada série, retirar pelo menos dois frascos idênticos para análise do oxigénio dissolvido, a intervalos de tempo regulares, (pelo menos semanalmente) durante os 28 dias de incubação.A amostragem semanal deve permitir avaliar a remoção percentual num período de 14 dias, ao passo que as amostras recolhidas cada três, quatro dias devem permitir identificar o período dos 10 dias, o que exigirá o dobro dos frascos.Para as substâncias de ensaio que contêm azoto, devem ser feitas correcções que dêem conta do consumo de oxigénio provocado por qualquer fenómeno de nitrificação que possa ocorrer. Para efectuar esta operação, recorrer ao método do eléctrodo de O2 para a determinação da concentração do oxigénio dissolvido e, depois, retirar uma amostra do frasco para a CBO, para a análise de nitrito e de nitrato. A partir do acréscimo na concentração de nitrito e de nitrato, calcular o oxigénio utilizado (ver anexo V).VI.3. RESULTADOS E RELATÓRIOVI.3.1. Tratamento dos resultadosCalcular primeiro a CBO que se manifesta após cada período, subtraindo a redução de oxigénio (mg de O2/l) no branco de inóculo do valor determinado para a substância química de ensaio. Dividir esta redução corrigida pela concentração (mg/l) da substância química de ensaio, para se obter o valor CBO específico, em miligrama de oxigénio por miligrama de substância química de ensaio. Calcular a percentagem de biodegradabilidade, dividindo o valor CBO específico pelo valor CTeO específico (calculado em conformidade com o anexo II.2) ou pelo valor CQO (determinado por análise, ver anexo II.3) ou seja:CBO = mg O2 consumido pela subst. de ensaio   mg O2 consumido pelo brancomg de substância de ensaio no frascoCBO = mg de O2 por mg de substância de ensaio% de degradação =  CBO (mg O2/mg de substância de ensaio) CTeO (mg O2/mg de substância de ensaio) × 100ou% de degradação =  CBO (mg O2/mg de substância de ensaio) CQO (mg O2/mg de substância de ensaio) × 100Note-se que estes dois métodos não conduzirão necessariamente ao mesmo valor, sendo preferível utilizar o primeiro.Para as substâncias de ensaio que contêm azoto, utilizar os valores CTeO adequados (NH4 ou NO3) conforme exista ou se admita que possa ocorrer nitrificação (anexo II.2). Se houver nitrificação, não sendo esta completa, calcular a correcção decorrente do oxigénio consumido por nitrificação, a partir da variação na concentração de nitrito e de nitrato (anexo V).VI.3.2. Validade dos resultadosA redução do oxigénio no branco de inóculo não deve exceder 1,5 mg de oxigénio dissolvido/l decorridos 28 dias. Valores superiores a esse exigem uma análise cuidadosa das técnicas experimentais. A concentração de oxigénio residual nos frascos de ensaio não deverá descer abaixo de 0,5 mg/litro em nenhuma ocasião. Esses níveis baixos de oxigénio apenas são válidos se o método utilizado para a determinação do oxigénio dissolvido permitir medir tais níveis com exactidão.Ver também o ponto I.5.2.VI.3.3. RelatórioVer I.8.VI.4. FOLHA DE DADOSComo exemplo de folha de dados apresenta-se a que se segue.ENSAIO DO FRASCO FECHADO1. LABORATÓRIO2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIONome: ...Concentração da solução de reserva: ... mg/lConcentração inicial no frasco: ... mg/lCTeO ou CQO: mg O2/mg de de substância de ensaio4. INÓCULOOrigem: ...Tratamento efectuado: ...Pré-condicionamento, se o houver: ...Concentrações das substâncias sólidas em suspensão na mistura reaccional: ... ml/15. DETERMINAÇÕES DO ODMétodo: Winkler/eléctrodo.>POSIÇÃO NUMA TABELA>6. CORRECÇÃO DEVIDA A NITRIFICAÇÃO (ver anexo V)>POSIÇÃO NUMA TABELA>7. REDUÇÃO DO OD: % DE DEGRADAÇÃO>POSIÇÃO NUMA TABELA>mto = valor no frasco de ensaio no tempo 0,mtx = valor no frasco de ensaio no tempo x,mbo = valor médio do branco no tempo 0,mbx = valor médio do branco no tempo x,Aplicar também a correcção decorrente da nitrificação, com base em iii)+vi) da secção 6.8. REDUÇÕES DE OD NO BRANCOConsumo de oxigénio no branco: (mbo   mb28) mg/l. Este consumo é importante para a validade do ensaio. Deve ser inferior a 1,5 mg/l.PARTE VII. ENSAIO DE MITI (método C.4-F)VII.1. PRINCÍPIO DO MÉTODOMede-se automaticamente a absorção de oxigénio por uma solução ou suspensão agitada, contendo a substância química de ensaio num meio mineral, inoculada com microrganismos inadaptados e especialmente desenvolvidos, durante um período de 28 dias, num respirómetro encerrado, ao abrigo da luz e à temperatura de 25 ± 1  C. A absorção do dióxido de carbono libertado faz-se com cal sódica. Exprime-se a biodegradabilidade pela percentagem do consumo de oxigénio (corrigida em função do consumo do branco) em relação ao consumo teórico (CTeO). Calcula-se também a percentagem de biodegradabilidade primária, a partir de uma análise química específica complementar, efectuada no início e no fim da incubação, por exemplo, por análise do COD.VII.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODOVII.2.1. Equipamentoa) Medidor de CBO electrolítico automático ou respirómetro, normalmente equipado com seis frascos de 300 ml cada um e também equipado com recipientes para o absorvente de CO2;b) Sala de temperatura constante e/ou banho à temperatura de 25 ± 1  C ou mais precisa;c) Dispositivo de filtração por membranas (facultativo);d) Analisador de carbono (facultativo).VII.2.2. Preparação do meio mineralPreparar as seguintes soluções de reserva, utilizando reagentes de qualidade analítica e água (ponto I.6.1):a) Dihidrogeno-ortofosfato monopotássico, KH2PO4 8,50 gMonohidrogeno-ortofosfato dipotássico, K2HPO4 21,75 gMonohidrogeno-ortofosfato dissódico dodecahidratado, Na2HPO4 12 H2O 44,60 gCloreto de amónio, NH4Cl 1,70 gDissolver em água e ajustar o volume a 1 litro.O valor do pH da solução deve ser de 7,2;b) Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4 7 H2O 22,50 gDissolver em água e ajustar o volume a 1 litro;c) Cloreto de cálcio anidro, CaCl2 27,50 gDissolver em água e ajustar o volume a 1 litro;d) Cloreto de ferro (III) hexahidratado, FeCl3. 6 H2O 0,25 gDissolver em água e ajustar o volume a 1 litro.Retirar 3 ml de cada uma das soluções a), b), c) e d) e ajustar o volume a 1 litro.VII.2.3. Preparação do inóculoRecolher amostras recentes em pelo menos dez locais, sobretudo em áreas onde sejam utilizados e descarregados diversos produtos químicos. Em locais tais como as estações de tratamento de águas residuais, estações de tratamento de esgotos industriais, rios, lagos, mar, recolher 1 litro de amostras de lamas, solo superficial, água, etc., e misturar tudo muito bem. Após a remoção dos materiais flutuantes, deixar repousar e ajustar o pH do sobrenadante a 7 ± 1, utilizando hidróxido de sódio ou ácido fosfórico.Utilizar um volume adequado de sobrenadante filtrado para encher um recipiente próprio para lamas activadas com dispositivo de enchimento e esvaziamento. Arejar o líquido durante cerca de 23,5 horas. Trinta minutos após a interrupção do arejamento, rejeitar cerca de um terço do volume total do sobrenadante e adicionar igual volume de uma solução (pH 7) contendo glucose, peptona e ortofosfato monopotássico de concentração 0,1 % em qualquer destes componentes, ao material sedimentado, e recomeçar o processo de arejamento. Repetir este procedimento uma vez por dia. A unidade de lamas deve operar de acordo com as seguintes boas práticas: os efluentes deverão ser límpidos, a temperatura deverá ser mantida a 25 ± 2  C e o pH deverá ser 7 ± 1, a sedimentação das lamas deverá ser boa, arejamento suficiente para manter a mistura permanentemente em condições aeróbias, presença de protozoários, devendo testar-se a actividade das lamas por comparação com uma substância de referência, pelo menos cada três meses. Não utilizar lamas como inóculo sem que tenha decorrido pelo menos um mês de operação, mas não mais do que quatro meses. Seguidamente, colher amostras em pelo menos 10 locais a intervalos regulares, uma vez em cada três meses.Para se manter a mesma actividade nas lamas frescas e nas antigas, misturar o sobrenadante filtrado de lamas activadas em utilização com igual volume de sobrenadante filtrado de uma mistura recentemente obtida a partir de dez origens e fazer a cultura do caldo combinado conforme anteriormente descrito. Recolher as lamas para utilização como inóculo decorridas 18-24 horas sobre a alimentação da unidade de lamas.VII.2.4. Preparação dos frascosPreparar os seis frascos seguintes:N  1: substância química de ensaio em água de diluição, a 100 mg/lNos 2, 3 e 4: substância química de ensaio em meio mineral, a 100 mg/lN  5: substância química de referência (por exemplo, anilina) em meio mineral, a 100 mg/lN  6: apenas meio mineralAdicionar directamente as substâncias químicas de ensaio pouco solúveis, com base na sua massa ou volume ou proceder conforme descrito no anexo III, com a excepção de não ser conveniente utilizar nem solventes nem agentes emulsionantes. Adicionar o absorvente de CO2 a todos os frascos, colocando-o nos recipientes especiais existentes. Ajustar o valor do pH a 7,0, nos frascos nos 2, 3 e 4.VII.2.5. Realização do ensaioInocular os frascos nos 2, 3 e 4 (suspensões de ensaio), n  5 (controlo de actividade) e n  6 (branco de inóculo) com um pequeno volume de inóculo, para se obter uma concentração de sólidos em suspensão de 30 mg/l. Não se adiciona nenhum inóculo ao frasco n  1, que serve como controlo abiótico. Montar o equipamento, verificar a sua estanquicidade, pôr os agitadores em movimento e começar a medição do consumo de oxigénio ao abrigo da luz. Verificar diariamente a temperatura. Os agitadores e o registador coulombimétrico do consumo de oxigénio, e registar quaisquer modificações de cor no conteúdo dos frascos. Fazer a leitura dos consumos de oxigénio referentes aos seis frascos directamente, por um método apropriado, por exemplo a partir dos seis gráficos do registador das curvas de CBO. No final da incubação, normalmente decorridos 28 dias, medir o valor do pH do conteúdo dos frascos e determinar a concentração residual da substância química de ensaio e de qualquer produto intermediário e, no caso de substâncias solúveis na água, a concentração do COD (anexo II.4). Tomar precauções especiais no caso das substâncias químicas voláteis. No caso de se prever nitrificação, determinar a concentração de nitrato e de nitrito, se possível.VII.3. RESULTADOS E RELATÓRIOVII.3.1. Tratamento dos resultadosDividir o consumo de oxigénio (mg) da substância química de ensaio, correspondente a um determinado período, pela massa da substância química de ensaio utilizada, corrigindo aquele com o valor referente ao branco de inóculo de controlo correspondente ao mesmo período. Obtém-se assim a CBO, expressa em mg de oxigénio/mg de substância química de ensaio, ou seja:CBO = mg O2 consumido pela subst. de ensaio   mg O2 consumido pelo brancomg de substância de ensaio no frascoCBO = mg de O2/mg de substância de ensaioDeste modo, obtém-se a percentagem de biodegradação pela expressão:% de biodegradação = % CTeO =   CBO (mg O2/mg de substância química)  CTeO (mg O2/mg de substância química) × 100Para misturas, calcular a CTeO por análise elementar, tal como para um composto único. Utilizar o valor de CTeO adequado (CTeONH4 ou CTeONO3) consoante não haja nitrificação ou esta seja completa (anexo II.2). Todavia, se houver nitrificação mas se esta for incompleta, efectuar uma correcção decorrente do oxigénio consumido por nitrificação, calculado a partir das variações nas concentrações de nitrito e de nitrato (anexo V).Calcular a percentagem de biodegradação primária a partir das perdas da substância química específica (original) (ver ponto I.7,2).Dt = Sb   SaSb × 100 %Se tiver havido uma perda de substância química de ensaio no frasco n  1, medir a variação físico-química, registar esse facto e utilizar a concentração da substância química de ensaio (Sb) decorridos 28 dias, nesse frasco, para calcular a percentagem de biodegradação.No caso de se efectuarem determinações de COD (facultativas), calcular a percentagem de biodegradação final pela expressão:Dt = 1    Ct    Cbt Co   Cbo × 100 %conforme descrito no ponto I.7.1. Se tiver havido uma perda de COD no frasco n  1, ao medir-se a remoção por via físico-química, deve utilizar-se a concentração de COD nesse frasco para calcular a percentagem de biodegradação.Registar todos os resultados na folha de dados anexa.VII.3.2. Validade dos resultadosO oxigénio consumido pelo branco de inóculo é, normalmente, de 20-30 mg de O2/l e não deverá ser superior a 60 mg/l em 28 dias.Os valores superiores a 60 mg/l exigem uma análise crítica dos resultados e das técnicas experimentais. No caso de o valor do pH estar fora do intervalo 6-8,5 e se o oxigénio consumido pela substância de ensaio for inferior a 60 %, o ensaio deverá ser repetido com uma concentração inferior de substância química de ensaio.Ver também o ponto I.5.2.Se a percentagem de degradação da anilina, calculada a partir do consumo de oxigénio, não exceder 40 % , decorridos sete dias, e 65 %, decorridos catorze dias, o ensaio não deve ser considerado válido.VII.3.3. RelatórioVer ponto I.8.VII.4. FOLHA DE DADOSComo exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte.ENSAIO DO MITI (I)1. LABORATÓRIO2. DATO DO INÍCIO DO ENSAIO3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIONome:Concentração da solução de reserva: mg/l da substânciaConcentração inicial no meio, Co: mg/l da substânciaVolume da mistura reaccional: mlCTeO: mg O2/l4. INÒCULOLocais de colheita das amostras de lama:1. ...2. ...3. ...4. ...5. ...6. ...7. ...8. ...9. ...10. ...Concentração de sólidos em suspensão nas lamas activadas depois de aclimatização com águas residuais sintéticas = mg/l,Volume de lamas activadas por litro de meio final = ml,Concentração de lamas no meio final = mg/l.5. CONSUMO DE OXIGÉNIO: BIODEGRADABILIDADETipo de respirómetro utilizado:>POSIÇÃO NUMA TABELA>6. ANÁLISE DE CARBONO (optional)Analisador de carbono:>POSIÇÃO NUMA TABELA>% de COD removido: a   (b   c)a × 1007. DADOS ANALÍTICOS ESPECÍFICOS DA SUBSTÂNCIA QUÍMICA>POSIÇÃO NUMA TABELA>% de degradação = Sb   SaSb × 100Calcular a percentagem de degradação para os frascos a1, a2 e a3, respectivamente.8. OBSERVAÇÕESDeve anexar-se a curva de CBO em função do tempo, se existir.ANEXO I ABREVIATURAS E DEFINIÇÕESOD: O oxigénio dissolvido (mg/l) é a concentração do oxigénio dissolvido numa amostra aquosa.CBO: A carência bioquímica de oxigénio (g) é a quantidade de oxigénio consumida pelos microrganismos ao metabolizarem um composto de ensaio; também se exprime em g de oxigénio consumido por g de composto de ensaio (ver método C.5).CQO: A carência química de oxigénio (g) é a quantidade de oxigénio consumida durante a oxidação de um composto de ensaio com dicromato ácido a quente; permite medir a quantidade de matérias oxidáveis presentes; também se exprime em g de oxigénio consumido por g de composto de ensaio (ver método C.6).COD: O carbono orgânico dissolvido é o carbono orgânico presente na solução ou que passa através de um filtro de 0,45 microns ou que permanece no sobrenadante após centrifugação a 40 000 m.s 2 (± 4 000 g) durante 15 minutos.CTeO: A carência teórica de oxigénio (mg) é a quantidade de oxigénio necessária para oxidar completamente uma substância química; calcula-se a partir da fórmula molecular (ver anexo II.2) e também se exprime em mg de oxigénio necessário por mg de composto de ensaio.CO2Te: O dióxido de carbono teórico (mg) é a quantidade calculada do dióxido de carbono que seria produzido a partir do teor de carbono medido ou conhecido do composto de ensaio, quando totalmente mineralizado; também se exprime em mg de dióxido de carbono libertado por mg de composto de ensaio.COT: O carbono orgânico total de uma substância é a soma do carbono orgânico em solução e em suspensão.CI: Carbono inorgânico.CT: Carbono total, é a soma do carbono orgânico e inorgânico presente na amostra.Biodegradação primária:é a alteração da estrutura química de uma substância efectuada por acção biológica, tendo como resultado a perda de propriedades específicas dessa substância.Biodegradação total (aeróbia):é o nível de degradação alcançado quando o composto de ensaio é totalmente utilizado pelos microrganismos, produzindo dióxido de carbono, água, sais minerais e novos constituintes celulares microbianos (biomassa).Facilmente biodegradável:é uma classificação arbitrária para as substâncias químicas que passaram nos diversos ensaios específicos de despiste da biodegradabilidade total; dado que esses ensaios são tão exigentes, assumiu-se que essas substâncias serão biodegradadas fácil e completamente em ambiente aquático, sob condições aeróbias.Intrinsecamente biodegradável:é uma classificação de substâncias químicas relativamente às quais existem provas inequívocas de biodegradação (primária e total) num qualquer ensaio reconhecido de biodegradabilidade.Tratáveis:é a possibilidade de certos compostos serem removidos durante o tratamento biológico de águas residuais sem afectarem desfavoravelmente o funcionamento normal do processo de tratamento. De um modo geral, os compostos facilmente biodegradáveis são tratáveis mas o mesmo não sucede com todos os compostos intrinsecamente biodegradáveis. Também podem ser utilizados processos abióticos.Tempo de latência:é o tempo decorrido desde a inoculação, num ensaio de redução gradual, até que a percentagem de degradação tenha aumentado pelo menos até 10 %. O tempo de latência é normalmente bastante variável e pouco reprodutível.Tempo de degradação:é o tempo decorrido desde o final do tempo de latência até ao momento em que se atinge 90 % do nível máximo de degradação.Período dos dez dias:é o período de dez dias que se segue imediatamente a um nível de degradação de 10 %.ANEXO II CÁLCULO E DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CARACTERÍSTICOS ADEQUADOSConsoante o método escolhido, assim serão necessários determinados parâmetros característicos. Na secção seguinte descreve-se o modo de obter esses valores. A utilização desses parâmetros foi descrita em cada um dos métodos.1. Teor de carbonoCalcula-se o teor de carbono a partir da composição elementar conhecida ou determina-se por análise elementar da substância de ensaio.2. Carência teórica de oxigénio (CTeO)A carência teórica de oxigénio (CTeO) pode ser calculada se for conhecida a composição elementar ou pode ser determinada por análise elementar. Para o seguinte composto genéricoCcHhClclNnNanaOoPpSs será:sem nitrificação,CTeONH4 = 16 (2 c + 1/2 (h   cl   3 n) + 3 s + 5/2 p + 1/2 na   o)Massa molecular mg/mgou, com nitrificação,CTeONO3 = 16 (2 c + 1/2 (h   cl) + 5/2 n + 3 s + 5/2 p + 1/2 na   o)Massa molecular mg/mg3. Carência química de oxigénio (CQO)A carência química de oxigénio (CQO) determina-se em conformidade com o método C.6.4. Carbono orgânico dissolvido (COD)Por definição, o carbono orgânico dissolvido (COD) é o carbono orgânico de qualquer substância química ou de qualquer mistura em água que não é retido por um filtro de 0,45 microns.Retiram-se amostras dos recipientes de ensaio e filtram-se imediatamente no equipamento de filtração, utilizando um filtro de membrana adequado. Os primeiros 20 ml (esta quantidade pode ser reduzida quando se utilizam filtros pequenos) de filtrado são rejeitados. Retêm-se volumes de 10-20 ml ou inferiores, se forem injectados (volume dependente da quantidade necessária para o analisador de carbono), para análise de carbono. Determina-se a concentração de COD por meio de um analisador de carbono orgânico capaz de medir com exactidão uma concentração de carbono equivalente ou inferior a 10 % da concentração do COD inicial utilizada no ensaio.As amostras filtradas que não possam ser analisadas no próprio dia do trabalho, podem ser conservadas num frigorífico à temperatura de 2-4  C, durante 48 horas, ou a temperaturas inferiores a  18 C durante períodos mais longos.Observações:Os filtros de membrana são frequentemente impregnados com agentes tensioactivos para hidrofilização. Deste modo, o filtro pode conter até alguns mg de carbono orgânico solúvel que pode interferir com as determinações de biodegradabilidade. Os agentes tensioactivos e outros compostos orgânicos solúveis são removidos dos filtros por fervura em água desionisada durante três períodos de uma hora. Depois, os filtros podem ser mantidos em água durante uma semana. No caso de se utilizarem embalagens de filtros descartáveis, cada lote deve ser verificado para se confirmar que não liberta carbono orgânico solúvel.A substância química de ensaio pode ser retida por adsorção, dependendo do tipo de filtro de membrana. Por esse motivo, é aconselhável garantir que a substância química de ensaio não é retida pelo filtro.Em vez da filtração, pode recorrer-se a centrifugação a 40 000 m.s 2 (4 000 g), durante 15 minutos, para diferenciar o COD do COT. Este método não é fiável para uma concentração inicial POSIÇÃO NUMA TABELA>Borax (0,05 mol.l 1) + NaOH (0,1 mol.l 1)>POSIÇÃO NUMA TABELA>