CELEX: 32014R0260
Language: ro
Date: 2014-01-24 00:00:00
Title: Regulamentul (UE) nr. 260/2014 al Comisiei din 24 ianuarie 2014 de modificare, în scopul adaptării la progresele tehnice, a Regulamentului (CE) nr. 440/2008 de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH)  Text cu relevanță pentru SEE

19.3.2014   
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Oficial al Uniunii Europene
            
            
               L 81/1
            
         
      REGULAMENTUL (UE) NR. 260/2014 AL COMISIEI
   
   din 24 ianuarie 2014
   de modificare, în scopul adaptării la progresele tehnice, a Regulamentului (CE) nr. 440/2008 de stabilire a metodelor de testare în temeiul Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH)
   (Text cu relevanță pentru SEE)
   COMISIA EUROPEANĂ,
   având în vedere Tratatul privind funcționarea Uniunii Europene,
   având în vedere Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH), de înființare a Agenției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Directivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale Comisiei (1), în special articolul 13 alineatul (3),
   întrucât:
   
               (1)
            
            
               Regulamentul (CE) nr. 440/2008 al Comisiei (2) conține metodele de testare care se aplică pentru determinarea proprietăților fizico-chimice, a toxicității și a ecotoxicității substanțelor, în scopul respectării cerințelor? Regulamentului (CE) nr. 1907/2006.
            
         
               (2)
            
            
               Este necesar să se actualizeze Regulamentul (CE) nr. 440/2008 pentru a include, cu titlu prioritar, metode alternative de testare noi și actualizate adoptate recent de OCDE, cu scopul de a obține o reducere a numărului de animale care urmează să fie utilizate în scopuri experimentale, în conformitate cu Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (3) și cu Directiva 86/609/CEE a Consiliului din 24 noiembrie 1986 privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative ale statelor membre în ceea ce privește protecția animalelor utilizate în scopuri experimentale și în alte scopuri științifice (4).
            
         
               (3)
            
            
               Adaptarea conține două metode pentru determinarea proprietăților fizico-chimice, inclusiv o actualizare a metodei de testare a solubilității în apă și o nouă metodă de testare a coeficientului de partiție, relevante pentru evaluarea substanțelor persistente, bioacumulative și toxice (PBT); patru noi metode și o metodă actualizată pentru determinarea ecotoxicității și a sorții și comportamentului în mediu; nouă metode de determinare a toxicității și a altor efecte asupra sănătății, inclusiv patru metode de testare a toxicității prin inhalare, inclusiv o actualizare a trei metode și o nouă metodă de reducere a numărului de animale utilizate și de îmbunătățire a evaluării efectelor, o actualizare a metodei testului de toxicitate orală cu durată de 28 de zile și cu doze repetate pentru a include parametri pentru evaluarea activității endocrine, o actualizare a metodei de testare a toxicocineticii, relevantă pentru proiectarea și înțelegerea studiilor toxicologice și o actualizare a metodelor de testare a toxicității cronice, a carcinogenității și a testării combinate a toxicității cronice și a carcinogenității.
            
         
               (4)
            
            
               Prin urmare, Regulamentul (CE) nr. 440/2008 ar trebui modificat în consecință.
            
         
               (5)
            
            
               Măsurile prevăzute în prezentul regulament sunt conforme cu avizul Comitetului înființat în temeiul articolului 133 din Regulamentul (CE) nr. 1907/2006,
            
         ADOPTĂ PREZENTUL REGULAMENT:
   Articolul 1
   Anexa la Regulamentul (CE) nr. 440/2008 se modifică în conformitate cu anexa la prezentul regulament.
   Articolul 2
   Prezentul regulament intră în vigoare în a treia zi de la data publicării în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene.
   
      Prezentul regulament este obligatoriu în toate elementele sale și se aplică direct în toate statele membre.
      Adoptat la Bruxelles, 24 ianuarie 2014.
      
         
            Pentru Comisie
         
         
            Președintele
         
         José Manuel BARROSO
         
      
   
   
      (1)  JO L 396, 30.12.2006, p. 1.
   
      (2)  JO L 142, 31.5.2008, p. 1.
   
      (3)  JO L 276, 20.10.2010, p. 33.
   
      (4)  JO L 358, 18.12.1986, p. 1.
   
      ANEXĂ
      Anexa la Regulamentul (CE) nr. 440/2008 se modifică după cum urmează:
      
                  1.
               
               
                  Capitolul A.6 se înlocuiește cu următorul text:
                  „A.6.   SOLUBILITATEA ÎN APĂ
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 105 (1995) a OCDE. Această metodă de testare este o versiune revizuită a Orientării 105 originale, care a fost adoptată în 1981. Nu există nicio diferență de substanță între versiunea curentă și cea din 1981. A fost modificat, în principal, formatul. Revizuirea s-a bazat pe metoda de testare UE «Solubilitatea în apă» (1).
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              2.
                           
                           
                              Solubilitatea în apă a unei substanțe poate fi considerabil afectată de prezența impurităților. Această metodă de testare abordează determinarea solubilității în apă a substanțelor în esență pure care sunt stabile în apă și nu sunt volatile. Pentru determinarea solubilității în apă sunt necesare anumite informații preliminare referitoare la substanța testată, cum ar fi formula structurală, presiunea de vapori, constanta de disociere și hidroliza în funcție de pH.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              În această metodă de testare sunt descrise două metode, cea a eluției pe coloană și metoda flaconului, care acoperă solubilități sub, respectiv peste 10–2 g/l. Este descris, de asemenea, un test preliminar simplu. El permite determinarea cantității adecvate aproximative de probă folosite în testul final, precum și a timpului necesar pentru atingerea saturației.
                           
                        DEFINIȚII ȘI UNITĂȚI
                  
                              4.
                           
                           
                              Solubilitatea în apă a unei substanțe reprezintă concentrația masică de saturație a substanței în apă la o temperatură dată.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Solubilitatea în apă este exprimată ca masa de solut raportată la volumul de soluție. Unitatea SI este kg/m3, dar se poate folosi și g/l.
                           
                        SUBSTANȚE CHIMICE DE REFERINȚĂ
                  
                              6.
                           
                           
                              Nu este necesar să se folosească substanțe chimice de referință în toate cazurile în care se studiază o substanță testată.
                           
                        DESCRIEREA METODELOR
                  
                     Condițiile de testare
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              De preferință, testul se efectuează la 20 ± 0,5 °C. Temperatura aleasă trebuie să fie menținută constantă în toate părțile relevante ale echipamentului.
                           
                        
                     Testul preliminar
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              În cadrul unei proceduri secvențiale, se adaugă volume tot mai mari de apă la temperatura camerei, la aproximativ 0,1 g probă (substanțele testate solide se pulverizează) într-un cilindru gradat de 10 ml cu dop din sticlă. După fiecare adăugare a unei cantități de apă, amestecul este agitat timp de 10 minute și examinat vizual pentru a observa dacă există părți nedizolvate din probă. Dacă, după adăugarea a 10 ml de apă, proba sau părți din ea rămân nedizolvate, experimentul este continuat într-un cilindru gradat de 100 ml. Solubilitatea aproximativă este indicată în tabelul 1, sub volumul de apă adăugată la care are loc dizolvarea completă a probei. În cazul în care solubilitatea este redusă, poate fi necesar un timp îndelungat pentru dizolvarea substanței testate și trebuie să se lase să treacă cel puțin 24 de ore. Dacă după 24 de ore substanța testată nu este încă dizolvată, se lasă mai mult timp (maximum 96 de ore) sau se încearcă diluarea în continuare, pentru a stabili dacă trebuie folosită metoda eluției pe coloană sau metoda flaconului.
                              
                                 Tabelul 1
                              
                              
                                          ml apă pentru 0,1 g solubil
                                       
                                       
                                          0,1
                                       
                                       
                                          0,5
                                       
                                       
                                          1
                                       
                                       
                                          2
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                       
                                          100
                                       
                                       
                                          > 100
                                       
                                    
                                          Solubilitate aproximativă în g/l
                                       
                                       
                                          > 1 000
                                       
                                       
                                          1 000 până la 200
                                       
                                       
                                          200 până la 100
                                       
                                       
                                          100 până la 50
                                       
                                       
                                          50 până la 10
                                       
                                       
                                          10 până la 1
                                       
                                       
                                          < 1
                                       
                                    
                        
                     Metoda eluției pe coloană
                  
                  
                     Principiu
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Această metodă se bazează pe eluția substanței testate cu apă dintr-o microcoloană încărcată cu un suport inert, acoperită în prealabil în exces cu substanța testată (2). Solubilitatea în apă este dată de concentrația masică a eluatului atunci când aceasta a atins un platou, ca funcție de timp.
                           
                        
                     Aparatură
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Aparatura constă într-o microcoloană (figura 1), menținută la temperatură constantă. Ea este conectată la o pompă de recirculare (figura 2) sau la un vas de nivel (figura 3). Microcoloana conține un suport inert menținut pe poziție de un mic dop din vată de sticlă, care servește, de asemenea, la filtrarea particulelor. Ca suport se pot utiliza mărgelele de sticlă, pământul de diatomee sau alte materiale inerte.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Microcoloana prezentată în figura 1 este adecvată pentru configurația cu pompă de recirculare. Ea are un spațiu liber pentru cinci volume (eliminate la începutul experimentului) și volumul a cinci probe (prelevate pentru analiză în timpul experimentului). Ca alternativă, dimensiunea poate fi redusă dacă se poate adăuga apă în sistem în timpul experimentului pentru a înlocui cele cinci volume inițiale îndepărtate cu impuritățile. Coloana este conectată, prin intermediul unor tuburi dintr-un material inert, la pompa de recirculare, capabilă să asigure un debit de aproximativ 25 ml/h. Pompa de recirculare poate fi, de exemplu, o pompă peristaltică sau cu membrană. Trebuie să se acorde atenție pentru a evita contaminarea și/sau adsorbția în contact cu materialul tuburilor.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              O configurație schematică ce utilizează un vas de nivel este prezentată în figura 3. În această configurație, microcoloana este prevăzută cu un robinet cu o cale. Conectarea la vasul de nivel se face prin intermediul unei îmbinări din sticlă rodată și a unor tuburi dintr-un material inert. Debitul de la vasul de nivel trebuie să fie de aproximativ 25 ml/h.
                              
                                 Figura 1
                              
                              
                                 
                              Dimensiuni, în mm
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Racord pentru îmbinarea din sticlă rodată
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Spațiu liber
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Diametru interior 5
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Diametru exterior 19
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Dop din vată de sticlă
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Robinet
                                       
                                    
                                 Figura 2
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Echilibrare atmosferică
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Debitmetru
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Microcoloană
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Pompă de circulație termostatată
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Pompă de recirculare
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Robinet cu două căi pentru prelevare probe
                                       
                                    
                                 Figura 3
                              
                              
                                 
                              
                                          A.
                                       
                                       
                                          Vas de nivel (de exemplu, balon de 2,5 litri)
                                       
                                    
                                          B.
                                       
                                       
                                          Coloană
                                       
                                    
                                          C.
                                       
                                       
                                          Colector de fracțiuni
                                       
                                    
                                          D.
                                       
                                       
                                          Termostat
                                       
                                    
                                          E.
                                       
                                       
                                          Tub de teflon
                                       
                                    
                                          F.
                                       
                                       
                                          Îmbinare din sticlă rodată
                                       
                                    
                                          G.
                                       
                                       
                                          Conductă de apă (între termostat și coloană, diametrul interior aproximativ 8 mm)
                                       
                                    
                        
                              13.
                           
                           
                              Aproximativ 600 mg din materialul-suport sunt transferate într-un balon de 50 ml cu fund rotund. O cantitate adecvată de substanță testată se dizolvă într-un solvent volatil cu o calitate de reactiv analitic și o cantitate corespunzătoare din această soluție se adaugă la materialul-suport. Solventul este evaporat complet, de exemplu prin folosirea unui evaporator rotativ, deoarece, în caz contrar, saturația cu apă a suportului nu s-ar atinge în timpul etapei de eluție, din cauza partiției la suprafață. Suportul încărcat se lasă să se îmbibe timp de două ore în aproximativ 5 ml de apă, apoi suspensia se adaugă în microcoloană. Ca alternativă, suportul uscat poate fi introdus în microcoloana care a fost deja umplută cu apă și apoi lăsat timp de aproximativ 2 ore, până la atingerea echilibrului.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Încărcarea suportului poate genera probleme, conducând la rezultate eronate, de exemplu dacă substanța testată este depusă ca fază uleioasă. Aceste probleme trebuie să fie examinate și să se consemneze detaliile.
                           
                        
                     Procedura cu pompă de recirculare
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Se pornește circulația prin coloană. Se recomandă utilizarea unui debit de aproximativ 25 ml/h, corespunzând la 10 volume pe oră pentru coloana descrisă. Cel puțin primele cinci volume se elimină, pentru a îndepărta impuritățile solubile în apă. Apoi, pompa de recirculare se lasă să funcționeze până la stabilirea echilibrului, care este definit prin 5 probe succesive ale căror concentrații nu diferă cu mai mult de ± 30 %, în mod aleatoriu. Aceste probe sunt separate între ele prin intervale de timp corespunzătoare trecerii a cel puțin 10 volume. În funcție de metoda analitică folosită, poate fi preferabil să se realizeze o curbă concentrație/timp, pentru a indica atingerea echilibrului.
                           
                        
                     Procedura cu vas de nivel
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Fracțiuni succesive de eluat se colectează și se analizează prin metoda aleasă. Pentru a determina solubilitatea, se folosesc acele fracțiuni din intervalul de eluție mediu, unde concentrațiile sunt constante în limita a ± 30 % pentru cel puțin 5 fracțiuni consecutive.
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Apa dublu distilată este eluentul preferat. Se poate folosi și apă deionizată cu o rezistivitate peste 10 ΜΩcm și un conținut de carbon organic total sub 0,01 %.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              În cadrul ambelor proceduri, o a doua serie se efectuează la jumătate din debitul primei serii. Dacă rezultatele celor două serii sunt în concordanță, testul este satisfăcător. Dacă solubilitatea măsurată este mai mare la debitul mai mic, atunci înjumătățirea debitului va trebui să continue până când se va obține aceiași solubilitate în două serii succesive.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              În ambele proceduri, fracțiunile se verifică pentru a decela prezența de particule coloidale, prin examinarea efectului Tyndall. Prezența unor particule invalidează testul și acesta se repetă după îmbunătățirea acțiunii de filtrare a coloanei.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Se măsoară pH-ul fiecărei probe, preferabil folosind benzi indicatoare speciale.
                           
                        
                     Metoda prin solubilitate în flacon
                  
                  
                     Principiu
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Substanța testată (solidele se pulverizează) se dizolvă în apă la o temperatură puțin mai mare decât temperatura de testare. Când se atinge saturația, amestecul se răcește și se păstrează la temperatura de testare. Ca alternativă, determinarea poate fi efectuată direct la temperatura de testare, dacă se asigură, prin prelevare de probe adecvată, faptul că s-a atins starea de echilibru de saturație. Apoi se determină, printr-o metodă analitică adecvată (3), concentrația masică a substanței testate în soluția apoasă, care nu trebuie să conțină niciun fel de particule nedizolvate.
                           
                        
                     Aparatură
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Sunt necesare următoarele materiale:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          sticlărie și instrumente obișnuite de laborator;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          un dispozitiv pentru agitarea soluțiilor la temperatură constantă controlată;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          o centrifugă (preferabil termostatată), dacă este necesar în cazul emulsiilor; și
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          echipament de analiză.
                                       
                                    
                        
                     Procedură
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Cantitatea de substanță testată necesară pentru a satura volumul de apă dorit este estimată printr-un test preliminar. Aproximativ de cinci ori din acea cantitate este cântărită în fiecare dintre cele trei vase de sticlă prevăzute cu dopuri de sticlă (de exemplu, eprubete pentru centrifugă, flacoane). În fiecare vas se adaugă un volum de apă, ales în funcție de metoda analitică și de domeniul de solubilitate. Vasele sunt închise etanș și apoi agitate la 30 °C. Se folosește un dispozitiv de agitare sau de amestecare ce poate funcționa la temperatură constantă, de exemplu, un agitator magnetic într-o baie de apă termostatată. După o zi, unul dintre vase este lăsat timp de 24 de ore la temperatura de testare, pentru echilibrare, agitându-l din când în când. Conținutul vasului este apoi centrifugat la temperatura de testare și se determină concentrația de substanță testată în faza apoasă limpede, printr-o metodă analitică adecvată. Celelalte două flacoane sunt tratate similar, după atingerea echilibrului inițial la 30 °C timp de 2, respectiv 3 zile. În cazul în care concentrațiile măsurate cel puțin în ultimele două vase nu diferă cu mai mult de 15 %, testul este considerat satisfăcător. Întregul test se repetă, folosind durate de echilibrare mai lungi, dacă rezultatele de la vasele 1, 2 și 3 prezintă o tendință de creștere a valorilor.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Testul se poate efectua, de asemenea, fără preincubare la 30 °C. Pentru a estima durata necesară stabilirii echilibrului de saturație, se prelevează probe până în momentul în care timpul de agitare nu mai influențează concentrațiile măsurate.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Se măsoară pH-ul fiecărei probe, preferabil folosind benzi indicatoare speciale.
                           
                        
                     Determinări analitice
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Pentru aceste determinări se preferă o metodă analitică specifică substanței, deoarece cantități mici de impurități solubile pot genera erori mari la măsurarea solubilității. Exemple de astfel de metode sunt: cromatografia în fază gazoasă sau lichidă, titrarea, fotometria, voltametria.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                     Metoda eluției pe coloană
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Pentru fiecare serie, se vor calcula valoarea medie și deviația standard obținută de la cel puțin cinci probe consecutive prelevate în zona platoului de saturație. Valorile medii obținute din două teste cu debite diferite nu trebuie să difere cu peste 30 %.
                           
                        
                     Metoda prin solubilitate în flacon
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Se face media rezultatelor individuale de la fiecare dintre cele trei flacoane, care nu trebuie să difere cu mai mult de 15 %.
                           
                        
                     Raport de testare
                  
                  
                     Metoda eluției pe coloană
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să conțină următoarele date:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          rezultatele testului preliminar;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identitatea chimică și impurități (etapă de purificare preliminară, dacă este cazul);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          concentrațiile, debitele și pH-ul pentru fiecare probă;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          mediile și deviațiile standard de la cel puțin cinci probe din zona platoului de saturație pentru fiecare testare;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          media a cel puțin două testări succesive;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura apei în timpul procesului de saturație;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metoda de analiză;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          natura suportului utilizat;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          cantitatea de substanță depusă pe suport;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          solventul folosit;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dovezi despre orice instabilitate chimică a substanței în timpul testării;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate informațiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special referitoare la impurități și starea fizică a substanței testate.
                                       
                                    
                        
                     Metoda prin solubilitate în flacon
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Raportul de testare include următoarele date:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          rezultatele testului preliminar;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identitatea chimică și impurități (etapă de purificare preliminară, dacă este cazul);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          determinările analitice individuale și media lor, acolo unde a fost determinată mai mult decât o valoare pentru fiecare flacon;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH-ul fiecărei probe;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          media valorilor pentru flacoanele diferite aflate în concordanță;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura de testare;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metoda analitică;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dovezi despre orice instabilitate chimică a substanței în timpul testului;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate informațiile relevante pentru interpretarea rezultatelor, în special referitoare la impurități și starea fizică a substanței testate.
                                       
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Directiva 92/69/CEE a Comisiei din 31 iulie 1992 de efectuare a celei de-a șaptezecea adaptări la progresul tehnic a Directivei 67/548/CEE a Consiliului privind apropierea actelor cu putere de lege și a actelor administrative referitoare la clasificarea, ambalarea și etichetarea substanțelor periculoase (JO L 383, 29.12.1992, p. 113).
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985), Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985), Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.”
                           
                        
            
                  2.
               
               
                  Se adaugă capitolul A.23:
                  „A.23.   COEFICIENT DE PARTIȚIE (1-OCTANOL/APĂ): METODA AGITĂRII LENTE
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 123 (2006) a OCDE. Valorile coeficientului de partiție 1-octanol/apă (POW) până la log POW de 8,2 au fost determinate cu precizie prin metoda agitării lente (1). Prin urmare, aceasta este o abordare experimentală adecvată pentru determinarea directă a POW al substanțelor puternic hidrofobe.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Alte metode pentru determinarea coeficientului de partiție 1-octanol/apă (POW) sunt metoda «agitării flaconului» (2) și determinarea POW din comportamentul de retenție HPLC (cromatografie lichidă de înaltă performanță) cu fază inversată (3). Metoda «agitării flaconului» este predispusă la artefacte din cauza transferului micro-picăturilor de octanol în faza apoasă. Odată cu creșterea valorilor POW, prezența acestor picături în faza apoasă duce la o supraestimare crescândă a concentrației substanței testate în apă. Prin urmare, utilizarea sa este limitată la substanțe cu log POW < 4. A doua metodă se bazează pe date solide privind valorile POW determinate direct, pentru calibrarea relației între comportamentul de retenție la HPLC (cromatografie lichidă de înaltă performanță) pentru calibrarea relației între comportamentul de retenție la HPLC și valorile măsurate ale POW. Un proiect de orientare OCDE a fost disponibil pentru determinarea coeficienților de partiție 1-octanol/apă ale substanțelor ionizabile (4), dar acesta nu mai trebuie să fie folosit.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Această metodă de testare a fost elaborată în Olanda. Precizia metodelor descrise aici a fost validată și optimizată într-un studiu de validare cu teste de comparare interlaboratoare la care au participat 15 laboratoare (5).
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                     Semnificație și utilizare
                  
                  
                              4.
                           
                           
                              Pentru substanțe organice inerte s-au identificat relații foarte semnificative între coeficienții de partiție 1 octanol/apă (POW) și bioacumularea lor în pești. În plus, s-a demonstrat că POW este corelat cu toxicitatea pentru pești și cu absorbția substanțelor chimice în solide, cum sunt solurile și sedimentele. O privire de ansamblu extinsă a acestor relații a fost prezentată în referința bibliografică (6).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              S-a stabilit o mare varietate de relații între coeficientul de partiție 1-octanol/apă și alte proprietăți ale substanței relevante pentru toxicologia și chimia mediului. În consecință, coeficientul de partiție 1-octanol/apă a devenit un parametru important în evaluarea riscului prezentat de substanțe chimice pentru mediu, precum și în estimarea evoluției substanțelor chimice în mediu.
                           
                        
                     Domeniu de aplicare
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Experimentul cu agitare lentă este conceput pentru a reduce formarea micropicăturilor din picăturile de 1-octanol în faza apoasă. În consecință, nu intervine supraestimarea concentrației în fază apoasă din cauza moleculelor de substanță testată asociate cu aceste picături. Prin urmare, metoda amestecării lente este adecvată în special pentru determinarea POW la substanțe cu valori ale log POW cel puțin egale cu 5, pentru care metoda agitării flaconului (2) este predispusă să ducă la rezultate eronate.
                           
                        DEFINIȚIE ȘI UNITĂȚI
                  
                              7.
                           
                           
                              Coeficientul de partiție a unei substanțe între apă și un solvent lipofil (1-octanol) caracterizează distribuția la echilibru a substanței chimice între cele două faze. Coeficientul de partiție între apă și 1-octanol (POW) este definit ca raportul între concentrațiile la echilibru ale substanței testate în 1-octanol saturat cu apă (CO) și apă saturată cu 1-octanol (CW).
                              
                                 
                              Ca raport de concentrații, POW este adimensional. Cel mai adesea este prezentat ca logaritm în baza 10 (log POW). POW este dependent de temperatură, iar datele consemnate trebuie să includă temperatura de măsurare.
                           
                        PRINCIPIUL METODEI
                  
                              8.
                           
                           
                              Pentru a determina coeficientul de partiție, apa, 1-octanolul și substanța testată sunt echilibrate între ele la temperatură constantă. Apoi se determină concentrațiile substanței testate în cele două faze.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Dificultățile experimentale asociate cu formarea de micro-picături în cursul experimentului cu agitarea flaconului se pot reduce prin experimentul cu agitație lentă, propus aici. În experimentul cu agitare lentă, apa, 1-octanolul și substanța testată sunt echilibrate într-un reactor termostatat cu amestecare. Schimbul între faze este accelerat prin agitare. Agitarea introduce o turbulență limitată, care îmbunătățește schimbul între 1-octanol și apă fără să se formeze micropicături (1).
                           
                        APLICABILITATEA TESTULUI
                  
                              10.
                           
                           
                              Deoarece prezența altor substanțe în afara substanței testate ar putea influența coeficientul de activitate al substanței testate, substanța trebuie să fie testată în stare pură. Se folosește sortul disponibil comercial cu cea mai mare puritate pentru experimentul privind partiția 1-octanol/apă.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Prezenta metodă se aplică la substanțe pure care nu disociază și nu se asociază și care nu prezintă o activitate de interfață semnificativă. Ea se poate aplica pentru a determina raportul de partiție 1-octanol/apă pentru asemenea substanțe și pentru amestecuri. Când metoda este folosită pentru amestecuri, rapoartele de partiție 1-octanol/apă determinate sunt condiționale și depind de compoziția chimică a amestecului testat și de compoziția electrolitului folosit ca fază apoasă. Cu condiția executării unor etape suplimentare, metoda este aplicabilă și la compuși care disociază sau se asociază (punctul 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Din cauza echilibrelor multiple în apă și 1-octanol implicate în partiția 1-octanol/apă a substanțelor care disociază, de exemplu acizi organici și fenoli, baze organice și substanțe organometalice, raportul de partiție 1-octanol/apă este o constantă condițională care depinde mult de compoziția electrolitului (7) (8). Prin urmare, pentru determinarea raportului de partiție 1-octanol/apă este necesar ca pH-ul și compoziția electrolitului să fie controlate în cadrul experimentului și raportate. La evaluarea acestor rapoarte de partiție trebuie să se aplice o apreciere pe bază de experiență. Folosind valoarea constantei (constantelor) de disociere, trebuie să se aleagă valori adecvate ale pH-ului, astfel încât să se determine un raport de partiție pentru fiecare stare de ionizare. La testarea compușilor organometalici se folosesc soluții tampon care nu formează complecși (8). Luând în considerare cunoștințele existente privind chimia soluțiilor apoase (constante de complexare, constante de disociere), condițiile experimentale trebuie să fie alese astfel încât să se poată estima speciația substanței testate în faza apoasă. Forța ionică trebuie să fie identică în toate experimentele, prin utilizarea unui electrolit de fond.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Dificultățile testării pot rezulta din efectuarea sa pentru substanțe cu solubilitate redusă în apă sau cu POW ridicat, deoarece concentrațiile în apă pot fi atât de reduse încât determinarea lor precisă este dificilă. Această metodă de testare prezintă recomandări pentru abordarea acestei probleme.
                           
                        INFORMAȚII REFERITOARE LA SUBSTANȚA TESTATĂ
                  
                              14.
                           
                           
                              Reactivii chimici trebuie să fie de puritate analitică sau mai mare. Se recomandă utilizarea substanțelor de testare nemarcate, cu o compoziție cunoscută și, de preferință, cu o puritate minimă de 99 % sau a substanțelor de testare marcate radioactiv, cu compoziție și puritate radiochimică cunoscute. La indicatorii cu timpul de înjumătățire scurt trebuie să se aplice corecții de dezintegrare. În cazul substanțelor de testare marcate radioactiv, se folosește o metodă analitică specifică, pentru a asigura că radioactivitatea măsurată este legată direct de substanța testată.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              O estimare a log POW se poate obține cu ajutorul unui software disponibil în comerț pentru estimarea log POW sau folosind raportul dintre solubilitățile în cei doi solvenți.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Înainte de efectuarea unui test cu agitare lentă pentru determinarea POW, trebuie să se cunoască următoarele informații privind substanța testată:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          formula structurală;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          metode analitice adecvate pentru determinarea concentrației substanței în apă și 1-octanol;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          constanta (constantele) de disociere a(le) substanțelor ionizabile [Orientarea 112 a OCDE (9)];
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          solubilitatea în apă (10);
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          hidroliza abiotică (11);
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          biodegradabilitatea rapidă (12);
                                       
                                    
                                          (g)
                                       
                                       
                                          presiunea de vapori (13).
                                       
                                    
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Aparatură și echipament
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Este necesar echipament de laborator standard, care să cuprindă, în special, următoarele:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          agitatoare magnetice și baghete agitatoare acoperite cu teflon, pentru agitarea fazei apoase;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          instrumente analitice, adecvate pentru determinarea concentrării substanței testate în apă, la concentrațiile anticipate;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          vas de agitare cu robinet în partea inferioară. În funcție de estimarea log POW și a limitei de detecție (LOD) a compusului testat, trebuie luată în considerare utilizarea unui vas de reacție cu aceeași geometrie, cu capacitate mai mare de un litru, astfel încât să se poată asigura un volum de apă suficient pentru extracția și analiza chimică. Astfel se vor obține concentrații mai mari în extrasul apos și, implicit, determinarea analitică va fi mai credibilă. În apendicele 1 se prezintă un tabel cu estimări ale volumului minim necesar, valoarea LOD a compusului, valoarea estimată log POW și solubilitatea sa în apă. Tabelul se bazează pe relația între log POW și raportul între solubilitățile în octanol și apă, așa cum se prezintă de către Pinsuwan et al. (14):
                                          
                                             
                                          unde:
                                          
                                              (ca molaritate);
                                          și pe relația indicată de Lyman (15) pentru estimarea solubilității în apă. Solubilitățile în apă calculate cu ecuația din apendicele 1 trebuie considerate ca o primă estimare. Trebuie să se rețină faptul că utilizatorul este liber să estimeze solubilitatea în apă prin intermediul oricărei relații considerată ca reprezentând mai bine relația între caracterul hidrofob și solubilitate. Pentru compuși solizi, se recomandă, de exemplu, includerea punctului de topire în estimarea solubilității. În cazul în care se folosește o ecuație modificată, trebuie stabilit dacă mai este valabilă ecuația pentru calculul solubilității în octanol. În apendicele 2 se prezintă un desen schematic al unui vas de amestecare cu manta din sticlă cu volum de aproximativ 1 litru. Proporțiile vasului prezentat în apendicele 2 s-au dovedit favorabile și trebuie să fie menținute atunci când se utilizează un aparat de dimensiune diferită;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          este esențial un mijloc de menținere a temperaturii constante în timpul experimentului cu agitare lentă.
                                       
                                    
                        
                              18.
                           
                           
                              Vasele sunt confecționate dintr-un material inert, astfel încât adsorbția pe suprafețele vasului să fie neglijabilă.
                           
                        
                     Pregătirea soluțiilor de testare
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Determinarea POW se face cu cel mai pur sortiment de 1-octanol disponibil în comerț (cel puțin + 99 %). Se recomandă purificarea 1-octanolului prin extracție cu acid, bază și apă și uscare ulterioară. În plus, se poate folosi distilarea pentru purificarea 1-octanolului. Pentru prepararea soluțiilor standard ale substanțelor testate se folosește 1-octanol purificat. Apa care se va folosi pentru determinarea POW este distilată în aparatură din sticlă sau sticlă de cuarț sau obținută dintr-un sistem de purificare sau se poate folosi apă de puritate HPLC. Este necesară filtrarea printr-un filtru de 0,22 μm pentru apa distilată și se includ probe-martor pentru a verifica dacă în extrasele concentrate nu există impurități care ar putea interfera cu substanța testată. În cazul în care se folosește un filtru din fibre de sticlă, el trebuie să fie curățat prin încălzire la 400 °C, timp de cel puțin trei ore.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Ambii solvenți sunt saturați reciproc înainte de experiment, prin echilibrarea lor într-un vas suficient de mare. Acest lucru se realizează prin agitarea lentă a sistemului bifazic timp de două zile.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Se alege o concentrație adecvată a substanței testate și se dizolvă în 1-octanol (saturat cu apă). Coeficientul de partiție 1-octanol/apă trebuie să fie determinat în soluții diluate în 1-octanol și apă. Prin urmare, concentrația substanței testate nu trebuie să depășească 70 % din solubilitatea sa, cu o concentrație maximă de 0,1 M în fiecare fază (1). Soluțiile în 1-octanol folosite pentru experiment trebuie să nu conțină particule solide în suspensie din substanța testată.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              O cantitate adecvată de substanță testată se dizolvă în 1-octanol (saturat cu apă). În cazul în care valoarea estimată pentru log POW este mai mare de 5, trebuie avut grijă ca soluțiile de 1-octanol folosite pentru experiment să nu conțină particule solide în suspensie din substanța testată. În acest scop, pentru substanțe cu o valoare estimată a log POW > 5 se aplică următoarea procedură:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          se dizolvă substanța testată în 1-octanol (saturat cu apă);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          se lasă soluția suficient timp pentru a permite sedimentarea particulelor solide în suspensie. În timpul perioadei de sedimentare, se monitorizează concentrația substanței testate;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          după ce concentrațiile măsurate în soluția 1-octanol au atins valori stabile, soluția stoc se diluează cu un volum adecvat de 1-octanol;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          se măsoară concentrația soluției stoc diluate. În cazul în care concentrația măsurată este în concordanță cu diluția, soluția stoc diluată se poate folosi în experimentul cu agitare lentă.
                                       
                                    
                        
                     Extracția și analiza probelor
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Pentru analiza substanței testate se folosește o metodă analitică validată. Investigatorii trebuie să prezinte dovezi că valorile concentrațiilor în 1-octanol saturat cu apă și în faza apoasă saturată cu 1-octanol în timpul experimentului sunt peste limita metodei de cuantificare a procedurilor analitice folosite. Recuperările analitice ale substanței testate din faza apoasă și faza de 1-octanol trebuie să fie stabilite înainte de experiment în acele cazuri pentru care sunt necesare metode de extracție. Semnalul analitic trebuie să fie corectat pentru probele-martor și trebuie să se evite antrenarea analitului de la o probă la alta.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Este probabil ca înainte de analiză să fie necesară extracția fazei apoase cu un solvent organic și preconcentrarea extrasului, din cauza concentrațiilor relativ scăzute de substanțe testate hidrofobe în faza apoasă. Din același motiv, este necesară reducerea concentrațiilor finale ale probelor-martor. În acest scop, trebuie să se folosească solvenți de mare puritate, preferabil solvenți pentru analiza reziduurilor. În plus, lucrul cu sticlărie curățată în prealabil cu atenție (de exemplu, prin spălare cu solvent sau încălzire la temperatură ridicată) poate contribui la evitarea contaminării încrucișate.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              O valoare estimată a log POW se poate obține cu ajutorul unui program de estimare sau prin apreciere pe bază de experiență. În cazul în care valoarea este mai mare de 6, trebuie să se monitorizeze cu atenție corecțiile pe bază de probe-martor și antrenarea analitului. În mod similar, dacă estimarea log POW depășește valoarea 6, este obligatorie utilizarea unui standard surogat pentru corecția în funcție de recuperare, astfel încât să se poată atinge factori ridicați de preconcentrare. Pe piață sunt disponibile mai multe programe informatice pentru estimarea log POW
                                  (1), de exemplu Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) și ACD log P (19). Descrieri ale metodelor de estimare pot fi găsite în referințele bibliografice (20) (21) (22).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Limitele de cuantificare (LOQ) pentru determinarea substanței testate în 1-octanol și apă se stabilesc cu ajutorul unor metode acceptate. Ca regulă generală, limita de cuantificare a metodei se poate determina drept concentrația în apă sau 1-octanol care produce un raport de 10 între semnal și zgomot. Se alege o metodă adecvată de extracție și preconcentrare și trebuie să se specifice și recuperările analitice. Se alege un factor adecvat de preconcentrare, pentru a obține un semnal de dimensiunea necesară la determinarea analitică.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Pe baza parametrilor metodei analitice și a concentrațiilor anticipate, se determină o dimensiune aproximativă a probei, necesară pentru determinarea precisă a concentrației compusului. Trebuie să se evite utilizarea unor probe de apă care sunt prea mici pentru obținerea unui semnal analitic suficient. De asemenea, trebuie să se evite utilizarea unor probe de apă excesiv de mari, întrucât cantitatea de apă rămasă poate fi insuficientă pentru numărul minim de analize necesare (n = 5). În apendicele 1, volumul minim al probei este indicat în funcție de volumul vasului, LOD a substanței testate și solubilitatea substanței testate.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Cuantificarea substanțelor testate are loc prin compararea cu curbele de calibrare a compusului respectiv. Concentrațiile din probele analizate trebuie să fie încadrate de concentrațiile standardelor.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Pentru substanțe testate cu o valoare estimată a log POW peste 6, un surogat standard trebuie să fie adăugat în proba de apă înainte de extracție, pentru a înregistra pierderile produse în timpul extracției și preconcentrării probelor de apă. Pentru corecția precisă în funcție de recuperare, surogatele trebuie să aibă proprietăți foarte apropiate sau identice cu cele ale substanței testate. De preferință, se folosesc în acest scop analogi ai substanțelor de interes marcați cu izotopi (stabili), (de exemplu, izotopi cu atomii de hidrogen înlocuiți cu deuteriu sau marcați cu 13C). În cazul în care nu este posibilă utilizarea de izotopi stabili, adică 13C sau 2H, trebuie să se demonstreze, pe baza unor date credibile din literatură, că proprietățile fizico-chimice ale surogatului sunt foarte apropiate de cele ale substanței testate. În timpul extracției lichid-lichid a fazei apoase, se pot forma emulsii. Ele pot fi reduse prin adăugare de sare și lăsarea emulsiei să se separe peste noapte. Trebuie să se consemneze metodele folosite pentru extracție și preconcentrarea probelor.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Dacă este necesar, probele extrase din faza 1-octanol pot fi diluate cu un solvent adecvat înainte de analiză. În plus, se recomandă ca standardele surogat pentru corecția în funcție de recuperare să fie utilizate pentru substanțe la care experimentele de recuperare au demonstrat un grad ridicat de variație în experimentele de recuperare (deviația standard relativă > 10 %).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Trebuie să se consemneze detaliile metodei analitice. Acestea includ metoda de extracție, preconcentrare și factorii de diluție, parametrii instrumentelor, procedura de calibrare, domeniul de calibrare, recuperarea analitică a substanței testate din apă, adăugarea de standarde surogat pentru corecția în funcție de recuperare, valorile probelor-martor, limitele de detecție și limitele de cuantificare.
                           
                        
                     Desfășurarea testului
                  
                  
                     Rapoarte optime 1-octanol/apă
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              La alegerea volumelor de apă și 1-octanol, se iau în considerare LOQ în 1-octanol și apă, factorii de preconcentrare aplicați probelor de apă, volumele prelevate în 1-octanol și apă și concentrațiile anticipate. Din motive experimentale, volumul de 1-octanol în sistemul cu agitare lentă se alege astfel încât stratul de 1-octanol să fie suficient de gros (> 0,5 cm) pentru a permite prelevarea din faza de 1-octanol fără a-l perturba.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Rapoartele tipice între faze folosite pentru determinările compușilor cu log POW de cel puțin 4,5 sunt 20 până la 50 ml de 1-octanol și 950 până la 980 ml apă într-un vas de un litru.
                           
                        
                     Condițiile de testare
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              În timpul testului, vasul de reacție este termostatat pentru a reduce variația temperaturii sub 1 °C. Testul se efectuează la 25 °C.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Sistemul experimental este protejat față de lumina zilei, fie prin efectuarea experimentului într-o cameră obscură, fie prin acoperirea vasului de reacție cu folie de aluminiu.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Experimentul se realizează într-un mediu fără praf (pe cât posibil).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Sistemul 1-octanol-apă este agitat până ce se atinge echilibrul. Într-un experiment pilot, perioada de echilibrare este evaluată prin efectuarea unui experiment cu agitare lentă și prelevarea periodică de apă și 1-octanol. Prelevările se fac la intervale de minimum cinci ore.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Fiecare determinare a POW trebuie să se facă pe baza a minimum trei experimente independente cu agitare lentă.
                           
                        
                     Determinarea timpului de echilibrare
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Se presupune că echilibrul este atins atunci când o regresie a raportului de concentrație 1-octanol/apă în funcție de timp pe o perioadă de patru intervale de timp generează o pantă care nu este semnificativ diferită de zero la un nivel al p de 0,05. Timpul minim de echilibrare este de o zi, înainte de a putea începe prelevarea. Ca regulă generală, prelevarea substanțelor cu o valoare estimată a log POW sub 5 poate avea loc în timpul celei de-a doua și celei de-a treia zile. Pentru compuși mai hidrofobi poate fi necesar să se prelungească echilibrarea. La un compus cu log POW de 8,23 (deca-clorbifenil) au fost suficiente 144 de ore pentru echilibrare. Echilibrul este evaluat prin intermediul prelevării repetate dintr-un singur vas.
                           
                        
                     Începerea experimentului
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              La începerea experimentului, vasul de reacție se umple cu apă saturată în 1-octanol. Se asigură suficient timp pentru a atingerea temperaturii termostatate.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              În vasul de reacție se adaugă cu atenție cantitatea dorită de substanță chimică testată (dizolvată în volumul necesar de 1-octanol saturat cu apă). Aceasta este o etapă crucială a experimentului, deoarece trebuie să se evite amestecarea turbulentă a celor două faze. În acest scop, faza 1-octanol se poate pipeta lent pe peretele vasului de reacție, aproape de suprafața apei. Astfel, ea se va scurge de-a lungul peretelui de sticlă, formând o peliculă deasupra fazei apoase. Se evită întotdeauna turnarea directă a 1-octanolului în flacon; nu trebuie să se permită căderea picăturilor de 1-octanol direct în apă.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              După începerea agitării, viteza de agitare este crescută lent. În cazul în care motoarele de agitare nu se pot regla corespunzător, se ia în considerare utilizarea unui transformator. Viteza de agitare este reglată astfel încât la interfața între apă și 1-octanol să se creeze un vârtej cu adâncimea de 0,5 până la maximum 2,5 cm. Viteza de agitare trebuie să fie redusă dacă adâncimea vârtejului depășește 2,5 cm; în caz contrar, se pot forma micropicături din picăturile de 1-octanol în faza apoasă, conducând la o supraestimare a concentrației substanței testate în apă. Viteza maximă de agitare cu vârtej de 2,5 cm este recomandată pe baza rezultatelor din studiul de validare cu teste de comparare interlaboratoare (5). Acesta este un compromis între atingerea unei rate de echilibrare rapide și limitarea formării de micropicături de 1-octanol.
                           
                        
                     Prelevarea și tratarea probelor
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Agitatorul trebuie să fie oprit înainte de prelevarea probelor și trebuie să se aștepte până ce mișcarea lichidelor a încetat. După încheierea prelevării, agitatorul se pornește din nou încet, așa cum se descrie mai sus, iar viteza de agitare este crescută treptat.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Faza apoasă este prelevată de la un robinet aflat în partea inferioară a vasului de reacție. Întotdeauna trebuie să se elimine volumul de apă stătută din robinete (aproximativ 5 ml la vasul prezentat în apendicele 2). Apa din robinete nu se agită, astfel încât nu este în echilibru cu volumul principal. Se notează volumul probelor de apă și se asigură că se ia în considerare cantitatea de substanță testată prezentă în apa eliminată, atunci când se stabilește un bilanț masic. Pierderile prin evaporare sunt minimizate lăsând apa să curgă lent în pâlnia de separare, astfel încât să nu se perturbe stratul de apă/1-octanol.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Probele de 1-octanol se obțin prin extragerea unei alicote mici (cca. 100 μl) din stratul de 1-octanol cu o seringă de 100 microlitri fabricată exclusiv din sticlă și metal. Trebuie să se evite perturbarea interfeței. Se înregistrează volumul de lichid prelevat. Este suficientă o alicotă mică, deoarece proba de 1-octanol va fi diluată.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Trebuie să se evite etapele inutile de transfer al probelor. În acest scop, volumul probei se determină gravimetric. În cazul probelor de apă, acesta lucru se poate realiza prin colectarea probei de apă într-o pâlnie separatoare care conține deja volumul necesar de solvent.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                              47.
                           
                           
                              În conformitate cu această metodă de testare, POW este determinat prin efectuarea a trei experimente cu agitare lentă (trei unități experimentale) în cadrul cărora compusul cercetat este supus unor condiții identice. Regresia folosită pentru a demonstra atingerea echilibrului se bazează pe rezultatele a minim patru determinări ale CO/CW la intervale de timp consecutive. Acest lucru permite calcularea varianței ca măsură a incertitudinii valorii medii obținute din fiecare unitate experimentală.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              POW poate fi caracterizat prin varianța datelor obținute din fiecare unitate experimentală. Această informație este folosită pentru a calcula POW ca medie ponderată a rezultatelor unităților experimentale individuale. Pentru aceasta, se folosește ca pondere inversul varianței rezultatelor unităților experimentale. Drept urmare, datele cu o variație mai mare (exprimată ca varianță) și, astfel, cu grad de încredere mai mic, au mai puțină influență asupra rezultatului față de datele cu varianță redusă.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              În mod analog, se calculează deviația standard ponderată. Ea caracterizează repetabilitatea măsurătorii POW. O valoare redusă a deviației standard ponderate indică faptul că determinarea POW a avut o repetabilitate foarte mare în cadrul unui laborator. În continuare se prezintă interpretarea statistică oficială a datelor.
                           
                        
                     Interpretarea rezultatelor
                  
                  
                     Demonstrarea atingerii echilibrului
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Logaritmul raportului între concentrația substanței testate în 1-octanol și apă [log (CO/Cw)] este calculat pentru fiecare moment de prelevare a probelor. Atingerea echilibrului chimic este demonstrată prin reprezentarea grafică a acestui raport în funcție de timp. Un platou în acest grafic, care se bazează pe cel puțin patru momente consecutive, indică faptul că s-a atins echilibrul, iar compusul este dizolvat efectiv în 1-octanol. În caz contrar, trebuie să se continue testul până când patru momente succesive generează o pantă care nu este semnificativ diferită de 0 la un nivel p de 0,05, ceea ce indică faptul că log Co/Cw este independent de timp.
                           
                        
                     Calcularea lui log POW
                     
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Valoarea lui log POW pentru unitatea experimentală se calculează ca valoarea medie ponderată a log Co/Cw din porțiunea curbei log Co/Cw în funcție de timp pentru care s-a demonstrat echilibrul. Media ponderată se calculează prin ponderarea datelor cu inversul varianței, astfel încât influența datelor asupra rezultatului final este invers proporțională cu incertitudinea datelor.
                           
                        
                     Valoarea medie a log POW
                     
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Valoarea medie a log POW din diferite unități experimentale este calculată ca media rezultatelor unităților experimentale individuale ponderate cu varianțele respective.
                              Calculul se face astfel:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          log POW,i
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          valoarea log POW a unității individuale experimentale i;
                                       
                                    
                                          log POW,Av
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          valoarea medie ponderată a determinărilor individuale ale log POW;
                                       
                                    
                                          wi
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          ponderea statistică atribuită valorii log POW a unității experimentale i;
                                       
                                    Reciproca varianței log POW,i se folosește ca wi
                                 .
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Eroarea valorii medii a log POW este estimată ca repetabilitatea log Co/Cw determinată în timpul fazei de echilibru în unitățile experimentale individuale. Ea este exprimată ca deviația standard ponderată a log POW,Av (σlog Pow,Av) care, la rândul său, este o măsură a erorii asociate cu log POW,Av. Deviația standard ponderată se poate calcula din varianța ponderată (varlog Pow,Av) astfel:
                              
                                 
                              
                                 
                              Simbolul n reprezintă numărul de unități experimentale.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Raportul de testare conține următoarele date:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      denumirea comună, denumirea chimică, numărul CAS, structura chimică (indicându-se poziția marcării, atunci când se folosesc substanțe marcate radioactiv) și proprietățile fizico-chimice relevante (a se vedea punctul 17);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      puritatea (impuritățile) substanței testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      puritatea de marcare pentru substanțele chimice marcate și activitatea molară (acolo unde este cazul);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      valoarea estimată preliminară a log Pow, precum și metoda folosită pentru determinarea sa.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condiții de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datele la care au fost realizate studiile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura în timpul experimentului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumele de 1-octanol și apă la începutul testului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumele probelor de 1-octanol și apă extrase;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumele de 1-octanol și apă rămase în vasele de reacție;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea vaselor de reacție și a condițiilor de agitare (geometria agitatorului și a vasului de reacție, înălțimea vârtejului în mm și, acolo unde este disponibilă, viteza de agitare) folosite;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele analitice folosite pentru a determina substanța de testare și limita de cuantificare a metodei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      intervalele de prelevare a probelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pH-ul fazei apoase și substanțele tampon folosite când pH-ul este reglat pentru molecule ionizabile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul de duplicate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      repetabilitatea și sensibilitatea metodelor analitice utilizate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile determinate ale substanței testate în 1-octanol și apă ca funcție de timp;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      verificarea bilanțului masic;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura și deviația standard sau domeniul de temperatură în timpul experimentului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      regresia raportului de concentrație în timp;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      valoarea medie a log Pow,Av și eroarea sa standard;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea și interpretarea rezultatelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      exemple de date primare din analize reprezentative (toate datele primare trebuie păstrate în conformitate cu standardele GLP), inclusiv recuperări ale surogatelor și numărul de niveluri folosite în calibrare (împreună cu criteriile pentru coeficientul de corelație al curbei de calibrare) și rezultatele asigurării calității/controlului calității (QA/QC);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      în cazul în care este disponibil: raportul de validare a procedurii de testare (se va indica la referințele bibliografice).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              De Bruijn J.H.M., Busser F., Seinen W., Hermens J. (1989), Determination of octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Capitolul A.8 din prezenta anexă, «Coeficientul de partiție».
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Capitolul A.8 din prezenta anexă, «Coeficientul de partiție».
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              OECD (2000), OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances, Paris.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Tolls J. (2002), Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Boethling R.S., Mackay D. (eds.) (2000), Handbook of property estimation methods for chemicals, Lewis Publishers Boca Raton, F.L., USA.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Schwarzenbach R.P., Gschwend P.M., Imboden D.M. (1993), Environmental Organic Chemistry, Wiley, New York, NY.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Arnold C.G., Widenhaupt A., David M.M., Müller S.R., Haderlein S.B., Schwarzenbach R.P. (1997), Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition, Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              OECD (1981), OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water, Paris.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Capitolul A.6 din prezenta anexă, «Solubilitatea în apă».
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Capitolul C.7 din prezenta anexă, «Degradarea – Degradarea abiotică: Hidroliza ca o funcție a pH-ului».
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Capitolul C.4 din prezenta anexă, părțile II-VII (metodele A-F) «Determinarea biodegradabilității „rapide”».
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Capitolul A.4 din prezenta anexă, «Presiunea de vapori».
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Pinsuwan S., Li A. and Yalkowsky S.H. (1995), Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Lyman W.J. (1990), Solubility in water. În: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman W.J., Reehl W.F., Rosenblatt D.H., Eds. American Chemical Society, Washington, D.C., de la 2-1 la 2-52.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Leo A., Weininger D. (1989), Medchem Software Manual, Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Meylan W. (1993), SRC-LOGKOW for Windows, SRC, Syracuse, N.Y.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Compudrug L. (1992), ProLogP, Compudrug, Ltd, Budapest.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              ACD. ACD logP, Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Lyman W.J. (1990). Octanol/water partition coefficient. În Lyman W.J., Reehl W.F., Rosenblatt D.H., eds., Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Rekker R.F., de Kort H.M. (1979), The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set, Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Jübermann O. (1958), Houben-Weyl, ed., Methoden der Organischen Chemie: 386-390.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     
                        Foaie de calcul pentru calculul volumelor minime de apă necesare pentru detectarea substanțelor testate cu valori diferite ale log POW în faza apoasă
                     
                     Ipoteze:
                     
                                 —
                              
                              
                                 volumul maxim al alicotelor individuale = 10 % din volumul total; 5 alicote = 50 % din volumul total;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 
                                    . În cazul unor concentrații mai mici, sunt necesare volume mai mari;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 volumul folosit pentru determinarea LOD = 100 ml;
                              
                           
                                 —
                              
                              
                                 log Pow în funcție de log Sw și log Pow în funcție de SR (Soct/Sw) sunt reprezentări rezonabile ale relațiilor pentru substanțele testate.
                              
                           
                        Estimarea Sw
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 ecuație
                              
                              
                                 log Sw
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,496
                              
                              
                                 3,133E+00
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 0,035
                              
                              
                                 1,084E+00
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,426
                              
                              
                                 3,750E-01
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –0,887
                              
                              
                                 1,297E-01
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,348
                              
                              
                                 4,487E-02
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –1,809
                              
                              
                                 1,552E-02
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,270
                              
                              
                                 5,370E-03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –2,731
                              
                              
                                 1,858E-03
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 –3,192
                              
                              
                                 6,427E-04
                              
                           
                        Estimarea Soct
                        
                     
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 ecuație
                              
                              
                                 Soct (mg/l)
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 3,763E+04
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 4,816E+04
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 6,165E+04
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 7,890E+04
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,010E+05
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,293E+05
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 1,654E+05
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,117E+05
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 
                                    
                              
                              
                                 2,710E+05
                              
                           
                        
                     
                                 Masa totală a substanței testate
                                 (mg)
                              
                              
                                 Masaoct/Masaapă
                                 
                              
                              
                                 MasaH2O
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 ConcH2O
                                 
                                 (mg/l)
                              
                              
                                 Masaoct
                                 
                                 (mg)
                              
                              
                                 Concoct
                                 
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 1 319
                              
                              
                                 526
                              
                              
                                 2,5017
                              
                              
                                 2,6333
                              
                              
                                 1 317
                              
                              
                                 26 333
                              
                           
                                 1 686
                              
                              
                                 1 664
                              
                              
                                 1,0127
                              
                              
                                 1,0660
                              
                              
                                 1 685
                              
                              
                                 33 709
                              
                           
                                 2 158
                              
                              
                                 5 263
                              
                              
                                 0,4099
                              
                              
                                 0,4315
                              
                              
                                 2 157
                              
                              
                                 43 149
                              
                           
                                 2 762
                              
                              
                                 16 644
                              
                              
                                 0,1659
                              
                              
                                 0,1747
                              
                              
                                 2 762
                              
                              
                                 55 230
                              
                           
                                 3 535
                              
                              
                                 52 632
                              
                              
                                 0,0672
                              
                              
                                 0,0707
                              
                              
                                 3 535
                              
                              
                                 70 691
                              
                           
                                 4 524
                              
                              
                                 1664 36
                              
                              
                                 0,0272
                              
                              
                                 0,0286
                              
                              
                                 4 524
                              
                              
                                 90 480
                              
                           
                                 5 790
                              
                              
                                 5263 16
                              
                              
                                 0,0110
                              
                              
                                 0,0116
                              
                              
                                 5 790
                              
                              
                                 115 807
                              
                           
                                 7 411
                              
                              
                                 1 664 357
                              
                              
                                 0,0045
                              
                              
                                 0,0047
                              
                              
                                 7 411
                              
                              
                                 148 223
                              
                           
                                 9 486
                              
                              
                                 5 263 158
                              
                              
                                 0,0018
                              
                              
                                 0,0019
                              
                              
                                 9 486
                              
                              
                                 189 713
                              
                           
                        Calculul volumelor
                     
                     
                        Volum minim necesar pentru faza H2O la fiecare concentrație LOD
                     
                     
                                 log Kow
                                 
                              
                              
                                 LOD (micrograme/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,38
                              
                              
                                 3,80
                              
                              
                                 38
                              
                              
                                 380
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,94
                              
                              
                                 9,38
                              
                              
                                 94
                              
                              
                                 938
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 232
                              
                              
                                 2 318
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,57
                              
                              
                                 5,73
                              
                              
                                 57,26
                              
                              
                                 573
                              
                              
                                 5 726
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,41
                              
                              
                                 14,15
                              
                              
                                 141
                              
                              
                                 1 415
                              
                              
                                 14 146
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 3,50
                              
                              
                                 34,95
                              
                              
                                 350
                              
                              
                                 3 495
                              
                              
                                 34 950
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 8,64
                              
                              
                                 86,35
                              
                              
                                 864
                              
                              
                                 8 635
                              
                              
                                 86 351
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 21,33
                              
                              
                                 213
                              
                              
                                 2 133
                              
                              
                                 21 335
                              
                              
                                 213 346
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 52,71
                              
                              
                                 527
                              
                              
                                 5 271
                              
                              
                                 52 711
                              
                              
                                 527 111
                              
                           
                                 Volum folosit pentru LOD (I)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                        Legendă pentru calcule
                     
                     Reprezintă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 1 litru;
                     Reprezintă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 2 litri.
                     Reprezintă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 5 litri.
                     Reprezintă < 10 % din volumul total al fazei apoase, vas de echilibrare de 10 litri.
                     Depășește 10 % chiar și din vasul de echilibrare de 10 litri.
                     
                        Prezentare a volumelor necesare, ca funcție de solubilitate în apă și Log Pow
                        
                     
                     Volum minim necesar pentru faza H2O la fiecare concentrație LOD (ml)
                     
                                 log Pow
                                 
                              
                              
                                 Sw (mg/l)
                              
                              
                                 LOD (micrograme/l)→
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,00
                              
                              
                                 10
                              
                           
                                 4
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,01
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,24
                              
                              
                                 2,38
                              
                              
                                 23,80
                              
                              
                                 237,97
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 3
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,04
                              
                              
                                 0,40
                              
                              
                                 3,97
                              
                              
                                 39,66
                              
                              
                                 396,62
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,12
                              
                              
                                 1,19
                              
                              
                                 11,90
                              
                              
                                 118,99
                              
                              
                                 1 189,86
                              
                           
                                 4,5
                              
                              
                                 5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,02
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                 0,51
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,84
                              
                              
                                 508,42
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,10
                              
                              
                                 1,02
                              
                              
                                 10,17
                              
                              
                                 101,68
                              
                              
                                 1 016,83
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,20
                              
                              
                                 2,03
                              
                              
                                 20,34
                              
                              
                                 203,37
                              
                              
                                 2 033,67
                              
                           
                                 5
                              
                              
                                 1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,09
                              
                              
                                 0,87
                              
                              
                                 8,69
                              
                              
                                 86,90
                              
                              
                                 869,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,17
                              
                              
                                 1,74
                              
                              
                                 17,38
                              
                              
                                 173,80
                              
                              
                                 1 738,02
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,375
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,23
                              
                              
                                 2,32
                              
                              
                                 23,18
                              
                              
                                 231,75
                              
                              
                                 2 317,53
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,43
                              
                              
                                 4,35
                              
                              
                                 43,45
                              
                              
                                 434,51
                              
                              
                                 4 345,05
                              
                           
                                 5,5
                              
                              
                                 0,4
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,19
                              
                              
                                 1,86
                              
                              
                                 18,57
                              
                              
                                 185,68
                              
                              
                                 1 856,79
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,37
                              
                              
                                 3,71
                              
                              
                                 37,14
                              
                              
                                 371,36
                              
                              
                                 3 713,59
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,74
                              
                              
                                 7,43
                              
                              
                                 74,27
                              
                              
                                 742,72
                              
                              
                                 7 427,17
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,49
                              
                              
                                 14,85
                              
                              
                                 148,54
                              
                              
                                 1 485,43
                              
                              
                                 14 854,35
                              
                           
                                 6
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 0,63
                              
                              
                                 6,35
                              
                              
                                 63,48
                              
                              
                                 634,80
                              
                              
                                 6 347,95
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,05
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 1,27
                              
                              
                                 12,70
                              
                              
                                 126,96
                              
                              
                                 1 269,59
                              
                              
                                 12 695,91
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,54
                              
                              
                                 25,39
                              
                              
                                 253,92
                              
                              
                                 2 539,18
                              
                              
                                 25 391,82
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 5,08
                              
                              
                                 50,78
                              
                              
                                 507,84
                              
                              
                                 5 078,36
                              
                              
                                 50 783,64
                              
                           
                                 6,5
                              
                              
                                 0,025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 2,17
                              
                              
                                 21,70
                              
                              
                                 217,02
                              
                              
                                 2 170,25
                              
                              
                                 21 702,46
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 4,34
                              
                              
                                 43,40
                              
                              
                                 434,05
                              
                              
                                 4 340,49
                              
                              
                                 43 404,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 9,04
                              
                              
                                 90,43
                              
                              
                                 904,27
                              
                              
                                 9 042,69
                              
                              
                                 90 426,93
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 18,09
                              
                              
                                 180,85
                              
                              
                                 1 808,54
                              
                              
                                 18 085,39
                              
                              
                                 180 853,86
                              
                           
                                 7
                              
                              
                                 0,006
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 7,73
                              
                              
                                 77,29
                              
                              
                                 772,89
                              
                              
                                 7 728,85
                              
                              
                                 77 288,50
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,003
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 15,46
                              
                              
                                 154,58
                              
                              
                                 1 545,77
                              
                              
                                 15 457,70
                              
                              
                                 154 577,01
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0015
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 23,19
                              
                              
                                 231,87
                              
                              
                                 2 318,66
                              
                              
                                 23 186,55
                              
                              
                                 231 865,51
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 46,37
                              
                              
                                 463,73
                              
                              
                                 4 637,31
                              
                              
                                 46 373,10
                              
                              
                                 463 731,03
                              
                           
                                 7,5
                              
                              
                                 0,002
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 19,82
                              
                              
                                 198,18
                              
                              
                                 1 981,77
                              
                              
                                 19 817,73
                              
                              
                                 198 177,33
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 39,64
                              
                              
                                 396,35
                              
                              
                                 3 963,55
                              
                              
                                 39 635,47
                              
                              
                                 396 354,66
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 79,27
                              
                              
                                 792,71
                              
                              
                                 7 927,09
                              
                              
                                 79 270,93
                              
                              
                                 792 709,32
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 158,54
                              
                              
                                 1 585,42
                              
                              
                                 15 854,19
                              
                              
                                 158 541,86
                              
                              
                                 1 585 418,63
                              
                           
                                 8
                              
                              
                                 0,001
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 33,88
                              
                              
                                 338,77
                              
                              
                                 3 387,68
                              
                              
                                 33 876,77
                              
                              
                                 338 767,72
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,0005
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 67,75
                              
                              
                                 677,54
                              
                              
                                 6 775,35
                              
                              
                                 67 753,54
                              
                              
                                 677 535,44
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,00025
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 135,51
                              
                              
                                 1 355,07
                              
                              
                                 13 550,71
                              
                              
                                 135 507,09
                              
                              
                                 1 355 070,89
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 0,000125
                              
                              
                                  
                              
                              
                                 271,01
                              
                              
                                 2 710,14
                              
                              
                                 27 101,42
                              
                              
                                 271 014,18
                              
                              
                                 2 710 141,77
                              
                           
                                 Volum folosit pentru LOD (I)
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                              
                                  
                              
                           
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Exemplu de vas de testare cu manta din sticlă pentru experimentul cu agitare lentă, pentru determinarea POW
                        
                     
                     
                        
                  ”
            
                  3.
               
               
                  Capitolul B.2 se înlocuiește cu următorul text:
                  „B.2.   TOXICITATEA ACUTĂ PRIN INHALARE
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 403 (2009) a OCDE (1). Versiunea originală a Orientării 403 privind testarea toxicității acute prin inhalare a fost adoptată în 1981. Această metodă de testare B.2 revizuită (ca echivalent al Orientării 403 revizuite) a fost concepută pentru a fi mai flexibilă, pentru reducerea gradului de utilizare a animalelor și pentru satisfacerea cerințelor de reglementare. Metoda de testare revizuită prezintă două tipuri de studii: un protocol tradițional LC50 și un protocol concentrație × timp (C × t). Caracteristicile principale ale acestei metode de testare sunt capacitatea de a oferi o relație concentrație-răspuns de la rezultate non-letale la letale, pentru a obține concentrația letală medie (LC50), concentrația non-letală limită (de exemplu, LC01) și panta, precum și capacitatea de a identifica o posibilă susceptibilitate în funcție de sex. Protocolul C × t trebuie să fie folosit în cazul în care există o cerință specifică de reglementare sau științifică ce impune testarea pe animale pe mai multe perioade de timp, cum ar fi pentru planificarea reacției de urgență [de exemplu, determinarea nivelurilor orientative de expunere acută (AEGL), orientările privind planificarea reacției de urgență (ERPG) sau nivelurile-limită de expunere acută (AETL)] sau pentru planificarea folosirii terenurilor.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Orientări privind desfășurarea și interpretarea studiilor în legătură cu această metodă de testare se pot găsi în ghidul privind testarea toxicității acute prin inhalare (Ghidul 39) (2).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Definițiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la finele acestui capitol și în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Această metodă de testare permite caracterizarea substanței chimice testate și evaluarea cantitativă a riscurilor și permite ordonarea și clasificarea substanțelor chimice testate în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (3). Ghidul 39 (2) prezintă orientări în alegerea metodei de testare corespunzătoare pentru testarea toxicității acute. În cazul în care sunt necesare doar informații privind clasificarea și etichetarea, se recomandă în general capitolul B.52 din prezenta anexă (4) [a se vedea Ghidul 39 (2)]. Această metodă de testare B.2 nu este destinată în mod specific testării unor materiale specializate, cum ar fi compuși izometrici puțin solubili sau materiale fibroase sau nanomateriale artificiale.
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              5.
                           
                           
                              Înainte de a lua în considerare testarea în conformitate cu această metodă de testare, laboratorul care efectuează testele trebuie să țină seama de toate informațiile disponibile privind substanța chimică testată, inclusiv studiile existente [de exemplu, capitolul B.52 din prezenta anexă (4)] ale căror date ar susține neefectuarea unor testări suplimentare, pentru minimizarea utilizării animalelor. Informațiile care pot contribui la selectarea celor mai adecvate specii, sușe, sexe, moduri de expunere și concentrații de testare corespunzătoare includ identitatea, structura chimică și proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate; rezultatele oricăror teste de toxicitate in vitro sau in vivo; utilizările anticipate și potențialul de expunere umană; datele (Q)SAR disponibile și datele toxicologice privind substanțele cu structură apropiată [a se vedea Ghidul 39 (2)].
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Se evită, în măsura în care este posibil, testarea substanțelor chimice corozive și/sau iritante la concentrații despre care se anticipează că produc durere și/sau suferință gravă. Potențialul corosiv/iritant se evaluează pe baza experienței, folosind dovezi cum ar fi experiența la oameni și la animale (de exemplu, din studii cu doză repetată efectuate la concentrații necorozive/neiritante), date existente in vitro [de exemplu, din capitolele B.40, (5), B.40bis (6) din prezenta anexă sau din Orientarea 435 a OCDE (7)], valori ale pH-ului, informații privind substanțe similare sau orice date pertinente, pentru a investiga posibilitatea de a renunța la alte testări. Pentru cerințe de reglementare specifice (de exemplu, pentru planificare în situații de urgență), această metodă de testare se poate folosi pentru expunerea animalelor la aceste materiale, deoarece permite conducătorului studiului sau investigatorului principal să dețină controlul asupra alegerii concentrațiilor țintă. Cu toate acestea, concentrațiile vizate nu trebuie să inducă efecte iritante/corozive grave, dar trebuie să fie suficient de mari pentru a extinde curba concentrație-răspuns la niveluri care ating obiectivul de reglementare și științific al testului. Aceste concentrații sunt alese în mod individualizat și se prezintă justificarea pentru alegerea concentrației [a se vedea Ghidul 39 (2)].
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              7.
                           
                           
                              Această metodă de testare revizuită B.2 a fost concepută în vederea obținerii de informații suficiente privind toxicitatea acută a unei substanțe chimice testate pentru a permite clasificarea sa și pentru a furniza date privind caracterul letal (de exemplu, LC50, LC01 și panta) pentru unul sau ambele sexe, așa cum este necesar pentru evaluările cantitative ale riscului. Această metodă de testare oferă două metode. Prima metodă este un protocol tradițional în care grupuri de animale sunt expuse unei concentrații-limită (test la valori-limită) sau unei serii de concentrații în cadrul unei proceduri secvențiale, pe o durată predeterminată, de obicei de 4 ore. Alte durate de expunere se pot aplica pentru scopuri de reglementare specifice. A doua metodă este un protocol de tip (C × t), în cadrul căruia grupuri de animale sunt expuse unei concentrații (limită) sau unei serii de concentrații multiple pentru durate multiple.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferință gravă și prelungită sunt eutanasiate și sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor la fel ca animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau suferinde și indicațiile pentru recunoașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul Ghidului OCDE nr. 19 privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (8).
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase, provenind din sușe folosite în mod obișnuit în laboratoare. Specia preferată este șobolanul, iar în cazul în care se utilizează alte specii alegerea trebuie să fie justificată.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Femelele trebuie să fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua expunerii, animalele trebuie să fie adulți tineri în vârstă de 8 până la 12 săptămâni, iar greutatea lor corporală trebuie să fie în limita ± 20 % din greutatea medie pentru fiecare sex a tuturor animalelor expuse anterior, de aceeași vârstă. Animalele sunt selectate aleatoriu și marcate pentru identificare individuală. Animalele se țin în cuștile lor timp de minimum cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea lor la condițiile de laborator. De asemenea, animalele trebuie să fie aclimatizate la aparatul de testare pentru o scurtă perioadă înainte de testare, deoarece astfel se va reduce stresul produs prin introducerea în noul mediu.
                           
                        
                     Îngrijirea animalelor
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Temperatura camerei în care sunt ținute animalele utilizate în scop experimental trebuie să fie de 22 ± 3 °C. Umiditatea relativă trebuie să fie menținută, în mod ideal, în intervalul 30 până la 70 %, deși acest lucru poate să nu fie posibil în cazul utilizării apei ca vehicul. În general, înainte și după expuneri, animalele sunt închise în cuști în grupuri, în funcție de sex și de concentrație, dar numărul de animale dintr-o cușcă nu trebuie să perturbe observarea clară a fiecărui animal și trebuie să minimizeze pierderile cauzate de canibalism și lupte. În cazul în care animalele urmează să fie expuse doar în zona nasului, ar putea fi necesară aclimatizarea lor la tuburile de imobilizare. Tuburile de imobilizare nu trebuie să producă asupra animalului un stres excesiv fizic, termic sau de imobilizare. Imobilizarea poate influența efecte fiziologice cum ar fi temperatura corporală (hipertermie) și/sau debitul respirator. În cazul în care sunt disponibile date generice care demonstrează că nu se produc asemenea modificări într-o măsură considerabilă, nu este necesară adaptarea preliminară la tuburile de imobilizare. Animalele la care întregul corp este expus unui aerosol sunt ținute în cuști individuale în timpul expunerii, pentru a preveni filtrarea aerosolului testat prin blana celorlalte animale din cușcă. Se pot folosi regimuri alimentare de laborator, convenționale și certificate, cu excepția perioadei de expunere, împreună cu o cantitate nelimitată de apă potabilă din rețeaua municipală. Iluminatul este artificial, cu o succesiune de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric.
                           
                        
                     Incinte de inhalare
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              La selectarea unei incinte de inhalare se iau în considerare natura substanței chimice testate și obiectivul testului. Modul de expunere preferat este doar în zona nasului (expresie care include expunerea doar în zona capului, a nasului sau a botului). Expunerea doar în zona nasului este preferată, în general, pentru studii ale aerosolilor lichizi sau solizi și pentru vapori care pot condensa pentru a forma aerosoli. Obiectivele speciale ale studiului pot fi atinse mai bine prin utilizarea unui mod de expunere a întregului corp, dar această metodă trebuie să fie justificată în raportul de studiu. Pentru a asigura stabilitatea atmosferei la utilizarea unei incinte pentru întregul corp, volumul total al animalelor testate nu trebuie să depășească 5 % din volumul incintei. Principiile tehnicilor de expunere doar în zona nasului și expunere a întregului corp, precum și avantajele sau dezavantajele lor specifice sunt descrise în Ghidul 39 (2).
                           
                        CONDIȚII DE EXPUNERE
                  
                     Administrarea concentrațiilor
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              La șobolani, expunerile doar în zona nasului pot avea orice durată până la 6 ore. În cazul în care șoarecii sunt expuși doar în zona nasului, expunerile nu trebuie să depășească, în general, 4 ore. În cazul în care sunt necesare studii pe durată mai mare, trebuie să se prezinte o justificare [a se vedea Ghidul 39 (2)]. Animalele expuse la aerosoli în incinte destinate expunerii întregului corp sunt ținute în cuști separate, pentru a preveni ingestia substanței testate prin îngrijirea corporală a altor animale din cușcă. Hrănirea se sistează pe durata expunerii. În timpul expunerii prin intermediul întregului corp se poate asigura apa.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Animalele sunt expuse la substanța chimică testată sub formă de gaz, vapori, aerosol sau un amestec al acestora. Starea fizică testată depinde de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate, concentrația aleasă și/sau forma fizică cea mai probabilă în timpul manipulării și utilizării substanței chimice testate. Substanțele chimice higroscopice și reactive din punct de vedere chimic se testează în condiții de aer uscat. Trebuie să se acorde atenție pentru a evita generarea de concentrații explozive.
                           
                        
                     Distribuția granulometrică
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Determinarea granulometriei se efectuează pentru toți aerosolii și vaporii care pot condensa pentru a forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor regiunilor relevante ale căilor respiratorii, se recomandă aerosoli cu diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) între 1 și 4 μm, cu o abatere standard geometrică (σg) în intervalul 1,5-3,0 (2) (9) (10). Deși trebuie să se depună un efort rezonabil pentru a satisface acest standard, în cazul în care acest lucru nu este posibil trebuie să se prezinte o apreciere bazată pe experiență. De exemplu, vaporii de metale pot fi sub acest standard iar particulele cu sarcină electrică, fibrele și materialele higroscopice (a căror dimensiune crește în mediul umed din căile respiratorii) pot depăși acest standard.
                           
                        
                     Prepararea substanței chimice testate într-un vehicul
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Se poate folosi un vehicul pentru a genera valori adecvate ale concentrației substanței chimice testate în atmosferă și ale granulometriei. Ca regulă, se preferă apa. Particulele în suspensie pot fi supuse unor procese mecanice pentru a atinge granulometria necesară, dar se iau măsuri pentru a evita descompunerea sau alterarea substanței chimice testate. În cazurile în care se consideră că procesele mecanice au alterat compoziția chimică a substanței chimice testate (de exemplu, temperaturi extreme datorate frecării în timpul măcinării excesive), se verifică analitic compoziția substanței chimice testate. Trebuie să se acorde atenție pentru a evita contaminarea substanței chimice testate. Nu este necesară testarea materialelor granulare nefriabile care sunt formulate pentru a nu fi inhalabile. Se folosește un test de atriție pentru a demonstra că nu se produc particule respirabile la manipularea materialului granular. În cazul în care testul de atriție conduce la formarea de substanțe respirabile, se efectuează un test de toxicitate prin inhalare.
                           
                        
                     Animale din grupul martor
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Nu este necesar un grup martor negativ (aer) studiat în paralel. Atunci când se folosește un alt vehicul decât apa pentru generarea atmosferei de testare, se folosește un grup martor pentru vehicul doar dacă nu sunt disponibile date istorice privind toxicitatea prin inhalare. În cazul în care un studiu de toxicitate a unei substanțe chimice de testare formulate într-un vehicul nu indică nicio toxicitate, rezultă că vehiculul nu este toxic la concentrația testată; astfel încât nu este necesar un vehicul martor.
                           
                        MONITORIZAREA CONDIȚIILOR DE EXPUNERE
                  
                     Debitul de aer în incintă
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Debitul de aer prin cameră trebuie să fie controlat cu atenție, monitorizat continuu și înregistrat cel puțin o dată pe oră în timpul fiecărei expuneri. Monitorizarea concentrației (sau stabilității) atmosferei de testare este un indicator integral al tuturor parametrilor dinamici și oferă un mijloc indirect de control al parametrilor relevanți pentru generarea atmosferei dinamice. Trebuie să se acorde o atenție specială pentru evitarea reinhalării în incinte destinate expunerii doar în zona nasului, în cazurile în care debitul de aer prin sistemul de expunere este inadecvat pentru a asigura un flux dinamic al atmosferei ce conține substanța chimică testată. Există metodologii recomandate care se pot folosi pentru a demonstra că nu se produce reinhalarea în condițiile de lucru alese (2) (11). Concentrația de oxigen trebuie să fie de minimum 19 %, iar concentrația de dioxid de carbon nu trebuie să depășească 1 %. În cazul în care există motive să se considere că nu se pot atinge aceste standarde, se măsoară concentrațiile de oxigen și dioxid de carbon.
                           
                        
                     Temperatura și umiditatea relativă în incintă
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Temperatura incintei se menține la 22 ± 3 °C. Umiditatea relativă în zona în care respiră animalele, atât la expunerea în zona nasului, cât și a întregului corp, se monitorizează și se înregistrează de cel puțin trei ori pentru durate de până la 4 ore și orar, pentru durate mai scurte. În mod ideal, umiditatea relativă trebuie să fie menținută în intervalul 30-70 % dar acest lucru poate fi irealizabil (de exemplu, la testarea amestecurilor apoase) sau imposibil de măsurat din cauza interferenței substanței chimice testate cu metoda de testare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația nominală
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Când este posibil, se calculează și se înregistrează concentrația nominală în incinta de expunere. Concentrația nominală este masa substanței chimice testate generate împărțită la volumul total de aer vehiculat prin sistemul incintei. Concentrația nominală nu este folosită pentru a caracteriza expunerea animalelor, dar o comparație între concentrația nominală și concentrația efectivă oferă o indicație privind eficiența de generare a sistemului de testare și astfel se poate folosi pentru a descoperi probleme legate de generare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația efectivă
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Concentrația efectivă este concentrația substanței chimice testate în zona de respirație a animalelor într-o incintă de inhalare. Concentrațiile efective se pot obține prin metode specifice (de exemplu, prelevare directă, metode bazate pe adsorbție sau reacții chimice și caracterizare analitică ulterioară) sau prin metode nespecifice, cum ar fi analiza gravimetrică a filtrului. Utilizarea analizei gravimetrice este acceptabilă doar pentru aerosoli cu component pulverulent unic sau aerosoli cu lichide cu volatilitate redusă și trebuie să fie susținută prin caracterizările specifice ale substanței chimice testate din studii preliminare. Concentrația aerosolilor cu pulberi multicomponente se poate determina tot prin analiză gravimetrică. Dar, în acest caz, sunt necesare date analitice care demonstrează similaritatea între compoziția materialului în suspensie în aer și cea a materialului inițial. În cazul în care aceste informații nu sunt disponibile, poate fi necesară reanalizarea substanței chimice testate (în mod ideal, în starea sa în suspensie în aer) la intervale regulate, pe parcursul studiului. Pentru agenții sub formă de aerosoli care se pot evapora sau care pot sublima, trebuie să se demonstreze că toate fazele au fost colectate prin metoda aleasă. Concentrațiile-țintă nominale și efective se prezintă în raportul de studiu, dar numai concentrațiile efective se folosesc în analizele statistice pentru a calcula valorile concentrației letale.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Se folosește un lot de substanță chimică testată, dacă este posibil, iar proba testată se păstrează în condiții care îi asigură puritatea, omogenitatea și stabilitatea. Înainte de începerea studiului, trebuie să existe o caracterizare a substanței testate, inclusiv puritatea sa și, dacă este realizabil din punct de vedere tehnic, identitatea și cantitățile de contaminanți și impurități identificate. Aceasta se poate demonstra prin următoarele date, dar fără a se limita la acestea: timpul de retenție și zona de vârf relativ, masa moleculară rezultată în urma analizelor de spectroscopie de masă sau cromatografie în stare gazoasă sau alte estimări. Deși identitatea probei de testare nu constituie responsabilitatea laboratorului care efectuează testarea, o atitudine prudentă pentru acel laborator ar fi să confirme caracterizarea solicitantului, cel puțin în mod limitat (de exemplu, culoare, natura fizică etc.).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Atmosfera de expunere se menține cât mai constantă posibil și se monitorizează continuu și/sau intermitent, în funcție de metoda de analiză. Atunci când se folosește prelevarea intermitentă, probele de atmosferă din incintă se prelevează cel puțin de două ori în cadrul unui studiu de patru ore. În cazul în care acest lucru nu este realizabil din cauza debitelor limitate de aer sau a concentrațiilor reduse, se poate preleva o probă pe parcursul întregii perioade de expunere. Dacă apar fluctuații accentuate de la o probă la alta, la următoarele concentrații testate se utilizează patru probe pentru fiecare expunere. Probele individuale de concentrație din incintă nu trebuie să se abată de la concentrația medie cu mai mult de ± 10 % pentru gaze și vapori sau ± 20 % pentru aerosolii cu lichide sau solide. Se calculează și se consemnează timpul necesar pentru echilibrarea incintei (t95). Durata unei expuneri acoperă timpul în care este generată substanța chimică testată și aceasta ia în considerare perioadele necesare pentru a se atinge t95. Orientări privind estimarea t95 pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Pentru amestecuri foarte complexe, constând în gaze/vapori și aerosoli (de exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice de testare propulsate de produse/dispozitive de utilizare finală cu acționare specifică), este posibil ca fiecare fază să se comporte diferit într-o incintă de inhalare, astfel încât trebuie să se selecteze cel puțin o substanță indicatoare (analit), în mod normal substanța activă principală din amestec, pentru fiecare fază (gaz/vapori și aerosoli). În cazul în care substanța chimică testată este un amestec, se consemnează concentrația analitică pentru amestec și nu doar pentru substanța activă sau componentul activ (analit). Informații suplimentare privind concentrațiile efective pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                     Substanța chimică testată: distribuția granulometrică
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Distribuția granulometrică a aerosolilor se determină cel puțin de două ori în timpul fiecărei expuneri de 4 ore, folosind un impactor în cascadă sau un instrument alternativ, de exemplu un aparat aerodinamic de determinare a granulometriei. În cazul în care se obțin rezultate echivalente cu impactorul în cascadă și cu un instrument alternativ, se poate folosi instrumentul alternativ pentru întregul studiu. Un al doilea dispozitiv, de exemplu un filtru gravimetric sau un epurator/barbotor de gaze, se folosește în paralel cu primul instrument, pentru a confirma eficiența colectării la primul instrument. Concentrația masică obținută prin analiza granulometriei trebuie să fie în concordanță rezonabilă cu concentrația masică obținută prin analiza filtrului [a se vedea Ghidul 39 (2)]. În cazul în care se poate demonstra echivalența în faza inițială a studiului, se pot omite alte măsurători de confirmare. Pentru motive legate de bunăstarea animalelor, se iau măsuri de minimizare a datelor neconcludente, care pot duce la necesitatea de a repeta o expunere. Determinarea granulometriei se face pentru vapori dacă există vreo posibilitate ca prin condensarea vaporilor să se ajungă la formarea unui aerosol sau dacă sunt detectate particule într-o atmosferă cu vapori cu potențial de formare a unor faze mixte (a se vedea punctul 15).
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                              26.
                           
                           
                              În continuare sunt descrise două tipuri de studii: protocolul tradițional și protocolul C × t. Ambele protocoale pot include un studiu de observare, un studiu principal și/sau un test la valori-limită (protocolul tradițional) sau testarea la o concentrație-limită (C × t). Atunci când se știe că un sex este mai receptiv, conducătorul studiului poate alege să efectueze studiile folosind doar sexul receptiv. În cazul în care sunt expuse alte specii de rozătoare decât șobolanii doar în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi ajustate pentru minimizarea suferinței specifice speciei. Înainte de a începe, se iau în considerare toate datele disponibile, pentru a minimiza utilizarea animalelor. De exemplu, datele generate folosind capitolul B.52 din prezenta anexă (4) pot elimina necesitatea unui studiu de observare și, de asemenea, pot demonstra dacă un sex este mai receptiv [a se vedea Ghidul 39 (2)].
                           
                        PROTOCOLUL TRADIȚIONAL
                  
                     Considerații generale: protocolul tradițional
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              În cadrul unui studiu tradițional, grupurile de animale sunt expuse la o substanță chimică de testare pentru o perioadă fixă (în general, 4 ore) într-o incintă de expunere în zona nasului sau a întregului corp. Animalele sunt expuse la o concentrație-limită (test la valori-limită) sau la minimum trei concentrații într-o procedură secvențială (studiu principal). Studiul principal poate fi precedat de un studiu de observare, în afara cazului în care există deja unele informații privind substanța chimică testată, de exemplu un studiu B.52 anterior [a se vedea Ghidul 39 (2)].
                           
                        
                     Studiul de observare: protocolul tradițional
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Un studiu de observare se folosește pentru a estima tăria substanței chimice testate, pentru a indica diferențe de receptivitate între sexe și pentru a ajuta la selectarea nivelurilor de concentrație de expunere pentru studiul principal sau testul la valori-limită. La selectarea nivelurilor de concentrație pentru studiul de observare, se folosesc toate informațiile disponibile, inclusiv date (Q)SAR și date pentru substanțe chimice similare. Nu se vor expune mai mult de trei masculi și trei femele la fiecare concentrație (pot fi necesare 3 animale/sex, pentru a stabili o diferență între sexe). Un studiu de observare poate consta într-o singură concentrație, dar se pot testa mai multe concentrații, dacă este necesar. Un studiu de observare nu trebuie să implice la fel de multe animale și concentrații ca în cazul unui studiu principal. În schimb, se poate folosi un studiu B.52 efectuat anterior (4) în locul unui studiu de observare [a se vedea Ghidul 39 (2)].
                           
                        
                     Testul la valori-limită: protocolul tradițional
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Se folosește un test la valori-limită atunci când substanța chimică testată este cunoscută sau anticipată ca fiind practic netoxică, adică generând un răspuns toxic doar peste limita de concentrație reglementată. În cadrul unui test la valori-limită, un singur grup de trei masculi și trei femele este expus la substanța chimică testată la o concentrație-limită. Informațiile privind toxicitatea substanței chimice testate pot fi deduse din cunoștințele despre substanțe testate similare, ținând seama de identitatea și procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situațiile în care nu există sau există puține informații privind toxicitatea sau atunci când se estimează că substanța testată este toxică, se efectuează testul principal.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              De obicei, selectarea concentrațiilor-limită depinde de cerințele de reglementare. În cazul în care se folosește Regulamentul (CE) nr. 1272/2008, concentrațiile-limită pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 20 000 ppm, 20 mg/l, respectiv 5 mg/l (sau concentrația maximă realizabilă) (3). Din punct de vedere tehnic, poate fi dificilă generarea concentrațiilor-limită la unele substanțe chimice testate, în special la cele sub formă de vapori sau aerosoli. La testarea aerosolilor, obiectivul principal este atingerea unei dimensiuni respirabile a particulelor (DAMM de 1-4 μm). Acest lucru este posibil pentru majoritatea substanțelor chimice testate la o concentrație de 2 mg/l. Testarea aerosolilor la o concentrație mai mare de 2 mg/l este încercată doar în cazul în care se poate atinge o dimensiune respirabilă a particulelor [a se vedea Ghidul 39 (2)]. Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 descurajează testarea peste concentrația-limită, din motive care țin de bunăstarea animalelor (3). Concentrația-limită este luată în considerare doar atunci când există o probabilitate mare ca rezultatele unui asemenea test să aibă relevanță directă pentru protejarea sănătății umane (3) și când justificarea este prezentată în raportul de studiu. În cazul unor substanțe de testare potențial explozive, trebuie să se ia măsuri pentru a evita condițiile favorabile unei explozii. Pentru a evita o utilizare inutilă a animalelor, se efectuează un rând de teste fără animale înainte de testul la valori-limită, pentru a asigura că în incintă se pot atinge condițiile necesare pentru un test la valori-limită.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              În cazul în care se observă cazuri de deces sau agonie la concentrația-limită, rezultatele testului la valori-limită pot servi ca studiu de observare pentru testarea ulterioară la alte concentrații (a se vedea studiul principal). Atunci când proprietățile fizice sau chimice ale unei substanțe chimice testate fac imposibilă atingerea unei concentrații limită, se testează concentrația maximă realizabilă. În cazul în care se atinge o mortalitate sub 50 % la concentrația maximă realizabilă, nu este necesară testarea suplimentară. Atunci când nu se poate atinge concentrația-limită, raportul de studiu trebuie să prezinte o explicație și date doveditoare. În cazul în care concentrația maximă realizabilă a unor vapori nu conduce la toxicitate, poate fi necesar ca substanța chimică testată să fie generată ca aerosol lichid.
                           
                        
                     Studiul principal: protocolul tradițional
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              De obicei, un studiu principal este efectuat cu cinci masculi și cinci femele (sau cinci animale din sexul receptiv, dacă acesta este cunoscut) pentru fiecare nivel de concentrație, cu cel puțin trei niveluri de concentrație. Pentru a obține o analiză statistică credibilă, trebuie să se folosească suficiente niveluri de concentrație. Intervalul de timp dintre grupurile de expunere se determină în funcție de momentul declanșării, durata și severitatea semnelor de toxicitate. Expunerea animalelor la următorul nivel de concentrație se amână până când există un nivel rezonabil de încredere privind supraviețuirea animalelor testate anterior. Acest lucru permite conducătorului studiului să ajusteze concentrația-țintă pentru următorul grup de expunere. Din cauza dependenței de tehnologii complexe, această metodă poate să nu fie întotdeauna practică în studiile de inhalare, astfel încât expunerea animalelor la următorul nivel de concentrație trebuie să se bazeze pe experiența anterioară și pe judecata științifică. La testarea amestecurilor trebuie consultat Ghidul 39 (2).
                           
                        PROTOCOLUL CONCENTRAȚIE × TIMP (C × T)
                  
                     Considerații generale: protocolul C × t
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Un studiu secvențial după protocolul C × t poate fi luat în considerare ca alternativă la protocolul tradițional pentru evaluarea toxicității prin inhalare (12) (13) (14). Această abordare permite expunerea animalelor la o substanță chimică testată la mai multe niveluri de concentrație și pentru durate multiple. Întreaga testare este efectuată într-o incintă pentru expunere doar în zona nasului (incintele pentru întregul corp nu sunt practice pentru acest protocol). O diagramă din apendicele 1 ilustrează acest protocol. O analiză de simulare a arătat că atât protocolul tradițional cât și protocolul C × t pot conduce la valori LC50 de încredere, dar protocolul C × t este, în general, mai potrivit pentru obținerea unor valori de încredere pentru LC01 și LC10 (15).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              O analiză de simulare a demonstrat că folosirea a două animale pentru fiecare interval C × t (unul din fiecare sex, atunci când se folosesc ambele sexe, sau două din sexul mai receptiv) poate fi, în general, adecvată pentru testarea a 4 concentrații și 5 durate de expunere într-un studiu principal. În anumite circumstanțe, conducătorul studiului poate alege să folosească doi șobolani din fiecare sex, pentru fiecare interval C × t (15). Utilizarea a 2 animale din fiecare sex și pentru fiecare punct de concentrație/timp poate reduce dezechilibrul și variabilitatea estimărilor, poate crește rata de succes a estimării și îmbunătăți acoperirea intervalului de încredere. Cu toate acestea, în cazul unei corespondențe insuficient de strânse cu datele pentru estimare (la utilizarea unui animal din fiecare sex sau a două animale din sexul mai receptiv) poate fi suficientă a cincea concentrație de expunere. Orientări suplimentare privind numărul de animale și concentrațiile care trebuie folosite într-un studiu C × t se pot găsi în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                     Studiul de observare: protocolul C × t
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Un studiu de observare se folosește pentru a estima tăria substanței chimice testate și a ajuta la selectarea nivelurilor de concentrație de expunere pentru studiul principal. Un studiu de observare cu până la trei animale/sex/concentrație [pentru detalii, a se vedea apendicele III la Ghidul 39 (2)] poate fi necesar pentru a alege o concentrație de pornire adecvată pentru studiul principal și pentru a minimiza numărul de animale utilizate. Pentru a stabili o diferență între sexe, poate fi necesar să se folosească trei animale din fiecare sex. Aceste animale sunt expuse pe parcursul unei singure durate, în general 240 de minute. Posibilitatea de a genera atmosfere de testare corespunzătoare se evaluează în cursul testelor preliminare fără animale. În general, nu este necesar un studiu de observare dacă sunt disponibile date privind mortalitatea dintr-un studiu B.52 (4). La alegerea concentrației-țintă inițiale într-un studiu B.2, conducătorul studiului trebuie să ia în considerare modelele de mortalitate observate în orice studiu B.52 disponibil (4) pentru ambele sexe și pentru toate concentrațiile testate [a se vedea Ghidul 39 (2)].
                           
                        
                     Concentrație inițială: protocolul C × t
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Concentrația inițială (sesiunea de expunere I) (apendicele 1) va fi o concentrație-limită sau o concentrație aleasă de conducătorul studiului pe baza studiului de observare. Grupuri de 1 animal/sex sunt expuse la această concentrație pe durate multiple (de exemplu, 15, 30, 60, 120 sau 240 de minute), rezultând un număr total de 10 animale (sesiunea de expunere I) (apendicele 1).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              De obicei, selectarea concentrațiilor-limită depinde de cerințele de reglementare. În cazul în care se folosește Regulamentul (CE) nr. 1272/2008, concentrațiile-limită pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 20 000 ppm, 20 mg/l, respectiv 5 mg/l (sau concentrația maximă realizabilă) (3). Din punct de vedere tehnic, poate fi dificil să se genereze concentrații-limită la unele substanțe chimice testate, în special sub formă de vapori sau aerosoli. La testarea aerosolilor, obiectivul este atingerea unei dimensiuni respirabile a particulelor (adică DAMM de 1-4 μm) la o concentrație-limită de 2 mg/l. Acest lucru este posibil cu majoritatea substanțelor chimice testate. Testarea aerosolilor la o concentrație peste 2 mg/l trebuie încercată doar dacă se poate atinge o dimensiune respirabilă a particulelor [a se vedea Ghidul 39 (2)]. Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 descurajează testarea peste o limită de concentrație, din motive de bunăstare a animalelor (3). Testarea peste concentrația-limită este luată în considerare atunci când există o probabilitate mare ca rezultatele unui asemenea test să aibă relevanță directă pentru protejarea sănătății umane (3) și trebuie să se prezintă justificarea în raportul de studiu. În cazul unor substanțe chimice testate potențial explozive, trebuie să se ia măsuri pentru a evita condiții favorabile unei explozii. Pentru a evita o utilizare inutilă a animalelor, se efectuează un rând de teste fără animale înainte de testarea la concentrația inițială, pentru a asigura că în incintă se pot atinge condițiile necesare pentru această concentrație.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              În cazul în care se observă cazuri de deces sau agonie la concentrația inițială, rezultatele pentru această concentrație pot servi ca punct de plecare pentru testarea ulterioară la alte concentrații (a se vedea studiul principal). În cazul în care când proprietățile fizice sau chimice ale unei substanțe chimice testate fac imposibilă atingerea unei concentrații-limită, se testează concentrația maximă realizabilă. Atunci când mortalitatea obținută la concentrația maximă realizabilă este sub 50 %, nu este necesară testarea suplimentară. Dacă nu se poate atinge concentrația-limită, raportul de studiu trebuie să prezinte o explicație și date doveditoare. În cazul în care concentrația maximă realizabilă a unor vapori nu duce la toxicitate, poate fi necesar ca substanța chimică testată să fie generată ca aerosol lichid.
                           
                        
                     Studiul principal: protocolul C × t
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Concentrația inițială (sesiunea de expunere I) (apendicele 1) testată în cadrul studiului principal va fi o concentrație-limită sau o concentrație aleasă de conducătorul studiului pe baza studiului de observare. În cazul în care s-au observat cazuri de mortalitate în timpul sau după sesiunea de expunere I, expunerea minimă (C × t) care duce la mortalitate va fi luată ca indicație pentru a stabili concentrația și perioadele de expunere pentru sesiunea de expunere II. Fiecare sesiune de expunere ulterioară va depinde de sesiunea anterioară (a se vedea apendicele 1).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Pentru numeroase substanțe chimice testate, rezultatele obținute la concentrația inițială, împreună cu trei ședințe de expunere suplimentare cu o grilă de timp mai mică (adică distanțarea geometrică a perioadelor de expunere așa cum indică factorul dintre perioadele succesive, în general √2), vor fi suficiente pentru a stabili relația între C × t și mortalitate (15), dar poate fi benefică folosirea unei a cincea concentrații de expunere [a se vedea apendicele 1 și Ghidul 39 (2)]. Pentru interpretarea matematică a rezultatelor pentru protocolul C × t, a se vedea apendicele 1.
                           
                        OBSERVAȚII
                  
                              41.
                           
                           
                              Animalele sunt observate clinic frecvent în timpul perioadei de expunere. După expunere, observațiile clinice se fac cel puțin de două ori în ziua expunerii sau mai frecvent dacă răspunsul animalelor la tratament indică acest lucru și cel puțin o dată pe zi după aceea, timp de 14 zile în total. Lungimea perioadei de observație nu este fixă, ci este determinată de natura și momentul de instalare a semnelor clinice și de lungimea perioadei de recuperare. Momentele de apariție și dispariție a semnelor de toxicitate sunt importante, în special în cazurile în care semnele de toxicitate au tendința de a apărea cu întârziere. Toate observațiile se consemnează sistematic, ținându-se evidențe separate pentru fiecare animal. Animalele găsite în stare muribundă și animalele care manifestă dureri mari și semne prelungite de suferință profundă sunt eutanasiate, din considerente care țin de bunăstarea animalelor. Examinările pentru identificarea semnelor clinice de toxicitate trebuie să fie efectuate cu atenție, pentru ca un aspect inițial defavorabil și modificările respiratorii tranzitorii, rezultate în urma procedurii de expunere, să nu fie confundate cu toxicitatea substanței chimice testate, care ar impune eutanasierea prematură a animalelor. Se iau în considerare principiile și criteriile rezumate în ghidul privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (Ghidul 19) (7). În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morții se înregistrează cât mai exact posibil.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Observațiile asupra animalelor în cușcă trebuie să includă modificările pielii și blănii, ochilor și mucoaselor, activitatea sistemului respirator, sistemului circulator, sistemului nervos autonom și central, precum și activitatea somato-motorie și modelele de comportament. Acolo unde este posibil, se vor consemna orice diferențe între efectele locale și cele sistemice. Se va acorda o atenție specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului și comei. Măsurarea temperaturii rectale poate furniza dovezi de bradipnee reflexă sau hipo/hipertermie asociate cu tratamentul sau cu privarea de libertate.
                           
                        
                     Greutatea corporală
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Greutățile individuale ale animalelor sunt consemnate o dată după perioada de aclimatizare, în ziua expunerii, înainte de expunere (ziua 0) și cel puțin în zilele 1, 3 și 7 (și săptămânal după aceea), precum și la momentul morții sau eutanasierii, dacă acestea survin după ziua 1. Greutatea corporală este recunoscută ca un indicator critic al toxicității, astfel încât animalele care prezintă o reducere susținută a greutății, ≥ 20 %, comparativ cu valorile dinainte de studiu, sunt monitorizate îndeaproape. La finalul perioadei de după expunere, animalele supraviețuitoare sunt cântărite și eutanasiate.
                           
                        
                     Patologia
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Toate animalele testate, inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din rațiuni care țin de bunăstare animală, sunt supuse unei autopsii. În cazul în care autopsia nu se poate efectua imediat ce este descoperit un animal mort, animalul este refrigerat (nu congelat) la temperaturi suficient de joase pentru a minimiza autoliza. Autopsiile se fac imediat ce este posibil, în mod normal după o zi sau două. Toate modificările patologice macroscopice sunt consemnate pentru fiecare animal, cu o atenție specială pentru orice modificări ale căilor respiratorii.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Pot fi luate în considerare examinări suplimentare incluse a priori în protocol, pentru extinderea valorii interpretative a studiului, de exemplu măsurarea masei pulmonare a șobolanilor supraviețuitori și/sau prezentarea unor semne de iritație, prin examinarea microscopică a căilor respiratorii. Organele examinate pot include, de asemenea, pe cele care prezintă semne de modificări patologice majore la animalele care au supraviețuit cel puțin 24 de ore și organele despre care se știe sau se anticipează că vor fi afectate. Examinarea microscopică în întregime a căilor respiratorii poate furniza informații utile privind substanțele chimice testate care reacționează cu apa, de exemplu acizii și substanțele higroscopice.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Pentru greutățile corporale și rezultatele autopsiei la animale se furnizează date individuale. Datele privind observațiile clinice sunt rezumate în formă tabelară, prezentând, pentru fiecare grup testat, numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne specifice de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluția în timp și reversibilitatea efectelor toxice și constatările autopsiei.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Raportul de testare include următoarele informații, după caz:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animale testate și îngrijirea lor
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea condițiilor de ținere în cuști, inclusiv: numărul (sau modificarea numărului) de animale pe fiecare cușcă, materialul pentru așternut, temperatura ambiantă și umiditatea relativă, perioada de expunere la lumină și identificarea regimului alimentar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      specia/sușa utilizată și justificarea pentru utilizarea unei alte specii decât șobolanul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, vârsta și sexul animalelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele de randomizare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului alimentar, sursa de apă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea oricăror condiții dinainte de testare, inclusiv regimul alimentar, carantina și tratamentul unor boli;
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritatea și, dacă este cazul, proprietăți fizico-chimice (inclusiv izomerizarea);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare și numărul din registrul CAS, dacă este cunoscut;
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea utilizării vehiculului și justificarea alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date istorice sau concurente care demonstrează că vehiculul nu interferează cu rezultatul studiului;
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Incinta de inhalare
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea incintei de inhalare, inclusiv dimensiunile și volumul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa și descrierea echipamentului folosit pentru expunerea animalelor precum și generarea atmosferei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      echipamentul pentru măsurarea temperaturii, umidității, granulometriei și concentrației efective;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa de aer și tratarea aerului alimentat/extras și sistemul folosit pentru condiționare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele folosite pentru calibrarea echipamentului în vederea asigurării unei atmosfere de testare omogenă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diferența de presiune (pozitivă și negativă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orificiile de expunere pentru fiecare incintă (pentru expunere doar în zona nasului); amplasarea animalelor în sistem (pentru expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      omogenitatea/stabilitatea în timp a atmosferei de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      amplasarea senzorilor de temperatură și umiditate și prelevarea probelor din atmosfera de testare din incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      debitele de aer, debitul de aer/orificiu de expunere (doar în zona nasului) sau numărul de animale/incintă (pentru expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informațiile privind echipamentul folosit pentru măsurarea oxigenului și dioxidului de carbon, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare (t95)
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul modificărilor volumetrice pe oră;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dispozitive de măsurare (după caz);
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Datele privind expunerea
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii concentrației-țintă în studiul principal;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile nominale (masa totală a substanței chimice testate generate în incinta de inhalare împărțită la volumul de aer vehiculat prin incintă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile efective ale substanței chimice testate, din probe prelevate din zona de respirație a animalelor; pentru amestecuri care generează forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli); fiecare poate fi analizată separat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate concentrațiile în aer sunt consemnate în unități de masă (de exemplu, mg/l, mg/m3 etc.); pot fi consemnate în paranteze și unități de volum (de exemplu, ppm, ppb etc.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuția granulometrică, diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) și abaterea standard geometrică (σg), inclusiv metodele pentru calcularea lor. Trebuie să se consemneze analizele granulometrice individuale.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaliile privind prepararea substanței chimice testate, inclusiv detalii privind orice proceduri folosite pentru a reduce dimensiunea particulelor de materiale solide sau pentru a prepara soluții ale substanței chimice testate. În cazurile în care este posibil ca procesele mecanice să fi alterat compoziția substanței chimice testate, se includ rezultatele analizelor pentru verificarea compoziției substanței chimice testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      o descriere (preferabil incluzând o diagramă) a echipamentului folosit pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la atmosfera de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind metoda de analiză chimică folosită și validarea metodei (inclusiv eficiența recuperării substanței chimice testate din mediul de prelevare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea pentru selectarea concentrațiilor de testare;
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a temperaturii, umidității și debitului de aer în incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a datelor de concentrație nominală și efectivă în incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a datelor privind dimensiunea particulelor, inclusiv a datelor privind colectarea probelor analitice, distribuția granulometrică și calcularea DAMM și σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a datelor privind răspunsul și nivelul de concentrație la fiecare animal (adică animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea, momentul instalării și durata efectelor);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutățile individuale ale animalelor, măsurate în cadrul studiului; data și ora morții, dacă au avut loc înainte de eutanasiere, momentul instalării semnelor de toxicitate și dacă acestea au fost reversibile pentru fiecare animal;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      estimări privind mortalitatea (de exemplu, LC50, LD01), inclusiv limite de încredere de 95 % și panta (dacă sunt furnizate de metoda de evaluare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relația statistică, inclusiv estimarea exponentului n (protocolul C × t). Se indică denumirea programului informatic statistic;
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Discutarea și interpretarea rezultatelor
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se acorde o atenție specială descrierii metodelor folosite pentru a satisface criteriile acestei metode de testare, de exemplu concentrația-limită sau granulometria;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      potențialul de inhalare a particulelor este abordat în perspectiva rezultatelor generale, în special în cazul în care nu se pot respecta criteriile privind granulometria;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      în cazul în care a fost necesară eutanasierea animalelor cu dureri sau care prezentau semne de suferință gravă și prelungită, trebuie să se prezinte o explicație, pe baza criteriilor din Ghidul OCDE privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (8);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      în cazul în care testarea conform capitolului B.52 din prezenta anexă (4) a fost întreruptă în favoarea acestei metode de testare B.2, trebuie să se prezinte justificări;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      evaluarea de ansamblu a studiului trebuie să includă coerența metodelor folosite la determinarea concentrațiilor nominale și efective și relația între concentrația efectivă și concentrația nominală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sunt tratate cauza probabilă a morții și modul predominant de acțiune (sistemic sau local).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (2009), Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Disponibilă la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1).
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Capitolul B.52 din prezenta anexă, «Toxicitatea acută prin inhalare – Metoda clasei de toxicitate acută».
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Capitolul B.40 din prezenta anexă, «Coroziunea cutanată in vitro: Testul rezistenței electrice transcutanate (RET)».
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Capitolul B.40 bis din prezenta anexă, «Coroziunea cutanată in vitro: Testare pe un model de piele umană».
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Disponibilă la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              SOT (1992), Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Phalen R.F. (2009), Inhalation Studies: Foundations and Techniques (ediția a doua) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Pauluhn J. and Thiel A. (2007), A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation, Chambers. J., Appl. Toxicol. 27: 160-167.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Zwart J.H.E., Arts J.M., ten Berge W.F., Appelman L.M. (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing, Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Zwart J.H.E., Arts J.M., Klokman-Houweling E.D., Schoen E.D. (1990), Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Ten Berge W.F. and Zwart A. (1989), More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              OECD (2009), Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Finney D.J. (1977), Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York.
                           
                        DEFINIȚIE
                  Substanță chimică testată: Orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  
                     Apendicele 1
                     
                        Protocolul C × t
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Un studiu secvențial concentrație × timp (C × t) poate fi luat în considerare ca alternativă la protocolul tradițional pentru evaluarea toxicității prin inhalare (12) (13) (14). De preferință, el se aplică în cazul în care există o cerință specifică de reglementare sau științifică privind testarea animalelor pe perioade multiple, de exemplu pentru planificarea reacțiilor în situații de urgență sau pentru planificarea folosirii terenurilor. Această metodă începe de obicei prin testarea la o concentrație-limită (sesiunea de expunere I), în cadrul căreia animalele sunt expuse la o substanță chimică testată pentru cinci intervale de timp (de exemplu, 15, 30, 60, 120 și 240 de minute), astfel încât se vor obține durate multiple în cadrul unei sesiuni de expunere (a se vedea figura 1). În cazul în care se folosește Regulamentul (CE) nr. 1272/2008, concentrațiile-limită pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 20 000 ppm, 20 mg/l, respectiv 5 mg/l. Aceste niveluri pot fi depășite doar în cazul în care există o cerință specifică de reglementare sau științifică privind testarea la aceste niveluri (a se vedea punctul 37 din textul principal al B.2).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 În situațiile în care sunt puține informații sau nu există informații privind toxicitatea unei substanțe chimice testate, se efectuează un studiu de observare în care grupuri de maxim 3 animale din fiecare sex sunt expuse la concentrațiile-țintă selectate de conducătorul studiului, în general timp de 240 min.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 În cazul în care se testează o concentrație-limită în cursul sesiunii de expunere I și se constată o mortalitate sub 50 %, nu este necesară o testare suplimentară. În cazul în care există o cerință specifică de reglementare sau științifică de a stabili relația concentrație/timp/răspuns la niveluri mai mari decât concentrația-limită indicată, următoarea expunere se face la un nivel superior, de exemplu de două ori concentrația-limită (adică 2L în figura 1).
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Dacă se observă toxicitate la concentrația-limită, este necesară testarea suplimentară (studiul principal). Aceste expuneri suplimentare se fac la concentrații inferioare (în figura 1: Sesiunile de expunere II, III sau IV’) sau la concentrații superioare cu durate mai mici (în figura 1: Sesiunea de expunere IV), folosind durate care sunt adaptate și nu sunt separate de intervale atât de mari.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Testul (concentrația inițială și concentrațiile suplimentare) se efectuează folosind 1 animal/sex pentru fiecare punct de concentrație/timp sau 2 animale din sexul mai receptiv pentru fiecare punct de concentrație/timp. În anumite circumstanțe, conducătorul studiului poate alege să folosească doi șobolani din fiecare sex pentru fiecare punct de concentrație/timp (sau 4 animale din sexul mai receptiv pentru fiecare punct de concentrație/timp) (15). Utilizarea a 2 animale din fiecare sex pentru fiecare punct de concentrație/timp reduce dezechilibrul și variabilitatea estimărilor, crește rata de succes a estimării și îmbunătățește acoperirea intervalului de încredere privind protocolul descris aici. Detalii suplimentare sunt prezentate în Ghidul 39 (2).
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 În mod ideal, fiecare sesiune de expunere este realizată într-o zi. Acest lucru oferă oportunitatea de amânare a următoarei expuneri până când există un grad de încredere rezonabil privind supraviețuirea și permite conducătorului studiului să ajusteze concentrația-țintă și duratele pentru următoarea sesiune de expunere. Se recomandă să se înceapă fiecare sesiune de expunere cu grupul care va fi expus cel mai mult, de exemplu grupul de expunere de 240 de minute, urmat de grupul de expunere de 120 de minute și așa mai departe. Dacă, de exemplu, animalele din grupul de 240 de minute mor după 90 de minute sau prezintă semne de toxicitate gravă (de exemplu, modificări extreme în modelul respirator, cum ar fi respirație dificilă), nu ar avea sens să se expună un grup timp de 120 de minute, deoarece mortalitatea ar fi probabil de 100 %. Astfel, conducătorul studiului va selecta durate de expunere mai scurte pentru acea concentrație (de exemplu 90, 65, 45, 33 și 25 de minute).
                              
                           
                                 7.
                              
                              
                                 Concentrația incintei se măsoară frecvent, pentru a determina concentrația medie ponderată în timp pentru fiecare durată de expunere. De câte ori este posibil, în analiza statistică se folosește momentul morții fiecărui animal (în locul duratei de expunere).
                              
                           
                                 8.
                              
                              
                                 Se examinează rezultatele primelor patru sesiuni de expunere pentru a identifica o neconcordanță de date în curba concentrație-timp (a se vedea figura 1). În cazul unei concordanțe insuficiente, se poate efectua o expunere suplimentară (a cincea concentrație). Concentrația și duratele de expunere pentru a cincea expunere sunt alese pentru a acoperi această neconcordanță.
                              
                           
                                 9.
                              
                              
                                 Toate sesiunile de expunere (inclusiv prima sesiune de expunere) se vor folosi pentru a calcula relația concentrație-timp-răspuns pe baza analizei statistice (16). Atunci când este posibil, pentru fiecare interval C × t se folosește concentrația medie ponderată în timp și durata de expunere până la moarte (dacă moartea intervine în timpul expunerii).
                                 
                                    Figura 1
                                 
                                 
                                    Ilustrarea ipotetică a relației concentrație-timp-mortalitate la șobolani
                                 
                                 
                                    
                                 Simboluri goale = supraviețuitori, simboluri pline = animale moarte
                                 Triunghiuri = femele; cercuri = masculi
                                 Linie plină = valori LC50 (domeniu 7,5-240 min) pentru masculi cu n = 1
                                 Linie întreruptă = valori LC50 (domeniu 7,5-240 min) pentru femele cu n = 1
                                 Linii punctate = valori ipotetice LC50 pentru masculi și femele dacă n ar fi fost egal cu 2 (12).
                                 Glosar
                                 concentrație:
                                 durata de expunere:
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Mai jos se prezintă un exemplu de procedură secvențială:
                                 
                                    Sesiunea de expunere I –   Testare la concentrația-limită (a se vedea figura 1)
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 animal/sex per punct de concentrație/timp; 10 animale în total (2)
                                             
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Concentrație-țintă (3) = concentrație-limită.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Se expun cinci grupuri de animale la această concentrație-țintă pentru durate de 15, 30, 60, 120, respectiv 240 de minute.
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Sesiunea de expunere II
                                     (4)
                                    –   Studiul principal
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 animal/sex per punct de concentrație/timp; 10 animale în total.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Se expun cinci grupuri de animale la o concentrație inferioară (5) (1/2 L) cu durate de expunere puțin mai mari (eșalonat la un factor √2; a se vedea figura 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Sesiunea de expunere III –   Studiul principal
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 animal/sex per punct de concentrație/timp; 10 animale în total.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Se expun cinci grupuri de animale la o concentrație inferioară (5) (1/4 L) cu durate de expunere puțin mai mari (eșalonat la un factor √2; a se vedea figura 1).
                                          
                                       
                                    ↓
                                 
                                 
                                    Sesiunea de expunere IV’ –   Studiul principal
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 animal/sex per punct de concentrație/timp; 10 animale în total.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Se expun cinci grupuri de animale la o concentrație inferioară (5) (1/8 L) cu durate de expunere puțin mai mari (eșalonat la un factor √2; a se vedea figura 1).
                                          
                                       
                                    ↓ sau
                                 
                                 
                                    Sesiunea de expunere IV –   Studiul principal
                                 
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             1 animal/sex per punct de concentrație/timp; 10 animale în total.
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Se expun cinci grupuri de animale la o concentrație superioară (6) (2 L) cu durate de expunere puțin mai mici (eșalonat la un factor √2; a se vedea figura 1).
                                          
                                       
                           
                        Interpretarea matematică a rezultatelor pentru protocolul C × t
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 O procedură C × t cu 4 sau 5 concentrații de expunere și cinci durate va genera 20, respectiv 25 de puncte experimentale. Cu aceste puncte experimentale, relația C × t se poate calcula cu ajutorul analizei statistice (16):
                                 
                                    Ecuația 1:
                                 
                                 
                                    
                                 unde C = concentrația; t = durata expunerii sau
                                 
                                    Ecuația 2:
                                 
                                 
                                    
                                 unde 
                                 Cu ajutorul ecuației 1 se poate calcula valoarea LC50 pentru un interval de timp dat (de exemplu, 4 ore, 1 oră, 30 de minute sau orice interval de timp din domeniul intervalelor testate), folosind P = 5 (50 % răspuns). Trebuie reținut faptul că regula lui Haber se poate aplica doar în cazul în care n = 1. LC01 se poate calcula folosind P = 2,67.
                              
                           ”
            
                  4.
               
               
                  Capitolele B.7 și B.8 se înlocuiesc cu următorul text:
                  „B.7.   STUDIU DE 28 DE ZILE DE TOXICITATE ORALĂ CU DOZĂ REPETATĂ LA ROZĂTOARE
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 407 (2008) a OCDE. Versiunea originală a Orientării 407 a fost adoptată în 1981. În 1995 s-a adoptat o versiune revizuită, pentru a obține informații suplimentare de la animalele folosite în cadrul studiului, în special în ceea ce privește neurotoxicitatea și toxicitatea imunologică.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              În 1998, OCDE a inițiat o activitate prioritară de revizuire a orientărilor privind testele și de elaborare a noilor orientări pentru depistarea și testarea unor factori perturbatori potențiali ai sistemului endocrin (8). Un element al activității a fost actualizarea orientării OCDE pentru «studiul de 28 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la rozătoare» (Orientarea 407) prin parametri adecvați pentru detectarea activității endocrine a substanțelor chimice testate. Această procedură a fost supusă unui amplu program internațional de testare a relevanței și fezabilității parametrilor suplimentari, performanțele acestor parametri pentru substanțe cu activitate (anti)estrogenică, (anti)androgenică și (anti)tiroidiană, reproductibilitatea intra- și interlaboratoare și interferența noilor parametri cu cei impuși de Orientarea 407 precedentă. Cantitatea mare de date obținute astfel a fost compilată și evaluată în detaliu într-un raport OCDE cuprinzător (9). Această metodă de testare actualizată B.7 (echivalentă cu Orientarea 407) este rezultatul experienței și rezultatelor obținute în cursul programului de testare internațional. Această metodă de testare permite plasarea unor efecte endocrine mediate în context cu alte efecte toxicologice.
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE
                  
                              3.
                           
                           
                              La aprecierea și evaluarea caracteristicilor toxice ale unei substanțe, determinarea toxicității orale folosind doze repetate se poate realiza după ce au fost obținute informațiile inițiale privind toxicitatea din teste de toxicitate acută. Această metodă de testare este destinată investigării efectelor asupra unei varietăți foarte largi de ținte potențiale ale toxicității. Studiul furnizează informații despre posibilele pericole pentru sănătate ce pot fi antrenate de expunerea repetată pe o perioadă relativ limitată, inclusiv efecte asupra sistemului nervos, sistemului imunitar și celui endocrin. Referitor la aceste efecte particulare, studiul are în vedere identificarea substanțelor chimice cu potențial neurotoxic, care ar putea justifica investigarea mai aprofundată a acestui aspect și a substanțelor chimice care afectează fiziologia tiroidei. De asemenea, el poate furniza date privind substanțele care afectează organele reproductive ale masculilor și/sau femelelor la animalele adulte tinere și poate oferi o indicație privind efectele imunologice.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Rezultatele acestei metode de testare B.7 sunt folosite pentru identificarea pericolelor și evaluarea riscurilor. Rezultatele obținute din parametrii endocrini conecși sunt evaluate în contextul din «Cadrul conceptual OCDE pentru testarea și evaluarea substanțelor chimice care perturbă procesele endocrine» (11). Metoda cuprinde studiul de bază de toxicitate la doză repetată, care se poate folosi pentru substanțe chimice pentru care nu este justificat un studiu de 90 de zile (de exemplu, în cazul în care volumul producției nu depășește anumite limite) sau ca preliminar pentru un studiu pe termen lung. Durata de expunere este de 28 de zile.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Programul internațional desfășurat la validarea parametrilor corespunzători pentru posibila detectare a activității endocrine a unei substanțe chimice testate a arătat că experiența laboratorului de testare influențează mult calitatea datelor obținute prin această metodă de testare B.7. Acest lucru se referă în mod specific la determinarea histopatologică a modificărilor ciclice ale organelor reproductive ale femelelor și la determinarea greutății organelor mici dependente de hormoni, care sunt dificil de disecat. S-a elaborat un ghid privind examenul histopatologic (19). El este disponibil pe site-ul internet public al OCDE privind orientările pentru testare. Ghidul este conceput pentru a fi util medicilor patologi în examinările lor și contribuie la creșterea sensibilității testului. S-a constatat că o varietate de parametri indică toxicitatea pentru sistemul endocrin și aceștia au fost incluși în metoda de testare. Parametrii pentru care au fost disponibile date insuficiente pentru a demonstra utilitatea sau care au prezentat, în cadrul programului de validare, doar indicii slabe privind capacitatea lor de a contribui la detectarea perturbatorilor endocrini sunt propuși ca puncte finale opționale (a se vedea apendicele 2).
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Pe baza datelor generate în cadrul procesului de validare, trebuie subliniat faptul că sensibilitatea acestui test nu este suficientă pentru identificarea tuturor substanțelor cu moduri de acțiune (anti)androgenice sau (anti)estrogenice (9). Metoda de testare nu se aplică într-o etapă de viață foarte sensibilă la perturbarea endocrină. Cu toate acestea, metoda de testare a identificat, în cursul procesului de validare, substanțe care afectează în mică sau mare măsură funcția tiroidei și substanțe cu acțiune endocrină puternică și moderată, care acționează prin intermediul receptorilor estrogenici sau androgenici dar, în majoritatea cazurilor, nu a reușit să identifice substanțele cu activitate endocrină care afectează ușor receptorii estrogenici sau androgenici. Astfel, metoda nu poate fi descrisă ca un test de screening pentru activitatea endocrină.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              În consecință, lipsa efectelor legate de aceste moduri de acțiune nu se poate considera o dovadă a lipsei de efecte asupra sistemului endocrin. În ceea ce privește efectele endocrine mediate, caracterizarea substanței nu trebuie să se bazeze doar pe rezultatele acestei metode de testare, ci trebuie să fie folosite într-o abordare bazată pe forța probantă a datelor, integrând toate datele existente referitoare la o substanță chimică, pentru a caracteriza posibila activitate endocrină. Din acest motiv, luarea unei decizii de reglementare privind activitatea endocrină (caracterizarea substanței) trebuie să constituie o abordare cu bază largă, care nu se bazează doar pe rezultatele aplicării acestei metode de testare.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Se recunoaște faptul că toate procedurile bazate pe animale vor fi conforme cu standardele locale privind îngrijirea animalelor; descrierile referitoare la îngrijire și tratament prezentate mai jos reprezintă standarde de performanțe minime și vor fi înlocuite de regulamentele locale, dacă acestea sunt mai stricte. OCDE pune la dispoziție orientări suplimentare privind tratamentul uman al animalelor (14).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Definițiile utilizate sunt prezentate în apendicele 1.
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              10.
                           
                           
                              Substanța chimică testată se administrează zilnic, pe cale orală, în doze graduale, câtorva grupuri de animale de laborator, nivelul dozei fiind același pentru un grup, timp de 28 de zile. Pe perioada administrării, animalele sunt examinate cu atenție zilnic, în vederea detectării eventualelor semne de toxicitate. Animalele care au murit sau care au fost eutanasiate în cursul testului se supun unei autopsii, iar la sfârșitul testului sunt eutanasiate și autopsiate animalele care au supraviețuit. Un studiu de 28 de zile furnizează informații privind efectele expunerii. De asemenea, studiul poate furniza informații privind selectarea concentrațiilor pentru studiile pe termen mai lung. Datele obținute prin utilizarea metodei de testare permit caracterizarea toxicității substanței chimice testate, pentru indicarea relației doză-răspuns și determinarea nivelului la care nu se observă niciun efect advers (NOAEL).
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Testele se efectuează, de preferință, pe șobolani, dar pot fi utilizate și alte specii de rozătoare. În cazul în care parametrii specificați în cadrul acestei metode de testare B.7 sunt investigați pe alte specii de rozătoare, trebuie să se prezinte o justificare detaliată. Deși din punct de vedere biologic este plauzibil ca alte specii să răspundă la substanțele toxice într-o manieră similară cu șobolanul, utilizarea unor specii mai mici poate conduce la o variabilitate crescută din cauza dificultăților de disecție a unor organe mici. În cadrul programului de validare internațional pentru detectarea factorilor perturbatori ai sistemului endocrin, șobolanul a fost singura specie folosită. Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase, provenind din sușele utilizate în mod obișnuit în laboratoare. Femelele trebuie să fie nulipare și să nu fie gestante. Administrarea începe cât mai curând posibil după înțărcare și, în orice caz, înainte de vârsta de nouă săptămâni. La începutul studiului, diferențele de greutate între animalele folosite trebuie să fie minime și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie pentru fiecare sex. Atunci când se efectuează un studiu prin administrare orală repetată înaintea unui studiu mai lung, se recomandă folosirea animalelor din aceeași sușă și origine în ambele studii.
                           
                        
                     Adăpostire și hrănire
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Toate procedurile trebuie să fie în conformitate cu standardele locale privind îngrijirea animalelor de laborator. În spațiul pentru adăpostirea animalelor de laborator se asigură o temperatură de 22 °C (± 3 °C). Deși umiditatea relativă este de minimum 30 % și, de preferință, nu trebuie să depășească 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul, obiectivul este de 50-60 %. Iluminatul este artificial, alternând perioade de 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a asigura o proporție adecvată a substanței chimice testate în cazul administrării prin această metodă. Animalele sunt adăpostite în grupuri mici de același sex; animalele pot fi adăpostite individual dacă există o justificare științifică. În cazul cuștilor colective nu se va depăși numărul de cinci animale pe fiecare cușcă.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Hrana se analizează regulat în vederea identificării contaminanților. O probă din regimul alimentar se păstrează până la finalizarea raportului.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Animale adulte, tinere, sănătoase se distribuie în mod aleatoriu în grupuri martor și grupuri de tratament. Cuștile trebuie să fie aranjate astfel încât să se reducă la minimum posibilele efecte provocate de această aranjare. Animalele sunt identificate individual și ținute în cuștile lor timp de cel puțin cinci zile înainte de începerea studiului, pentru a permite aclimatizarea lor la condițiile de laborator.
                           
                        
                     Pregătirea dozelor
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Substanța chimică testată se administrează prin gavaj sau prin regimul alimentar ori apa potabilă. Metoda de administrare pe cale orală depinde de scopul studiului și de proprietățile fizico/chimice/toxico-cinetice ale substanței chimice testate.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Dacă este necesar, substanța testată se dizolvă sau se aduce în formă de suspensie într-un vehicul adecvat. Se recomandă, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluții/suspensii apoase, apoi a unei soluții/suspensii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și apoi a unei alte soluții posibile în alte vehicule. În cazul în care vehiculul utilizat nu este apa, trebuie să fie cunoscute caracteristicile de toxicitate ale acestuia. Trebuie să se determine stabilitatea substanței chimice testate în vehicul.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Numărul și sexul animalelor
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Se vor folosi minimum 10 animale (5 femele și 5 masculi) pentru fiecare doză. Dacă se prevede eutanasierea unui număr de animale pe parcursul studiului, acest număr se adaugă la total înainte de finalizarea studiului. În plus, se poate lua în considerare un grup satelit de 10 animale (5 din fiecare sex) în grupul martor și în grupul cu doza maximă, pentru observații vizând reversibilitatea, persistența sau apariția tardivă a efectelor toxice pe parcursul a minimum 14 zile după tratament.
                           
                        
                     Dozare
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Ca regulă generală, trebuie să existe cel puțin trei grupuri de testare și un grup martor, dar dacă din evaluarea altor date nu se anticipează niciun efect la administrarea repetată a unei doze de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, se poate realiza un test la valori-limită. Atunci când nu există date adecvate disponibile, se poate realiza un studiu de stabilire a intervalului (animale din aceeași sușă și sursă), pentru a contribui la determinarea dozelor de administrat. Exceptând tratamentul cu substanța chimică testată, animalele din grupul martor se tratează în mod identic cu animalele din grupul testat. Dacă pentru administrarea substanței chimice testate se folosește un vehicul, acesta se administrează grupului martor în volumul maxim utilizat.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Nivelurile de dozare sunt selecționate ținându-se cont de toate datele disponibile privind toxicitatea și aspectele (toxico-)cinetice referitoare la substanța chimică testată sau la substanțele înrudite. Doza cea mai ridicată trebuie să fie aleasă astfel încât să producă efecte toxice care să nu ducă însă la moarte sau la suferințe intense. Se va alege mai apoi o serie de doze descrescătoare, pentru a se evidenția relația dintre răspuns și doza administrată și nivelul dozei la care nu se observă niciun efect advers (NOAEL). Intervalul optim pentru determinarea nivelurilor descrescătoare ale dozelor este frecvent un factor de doi sau patru și deseori este de preferat să se adauge un al patrulea grup de tratament, în loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              În prezența toxicității generale observate (de exemplu, greutate corporală redusă, efecte asupra ficatului, plămânilor sau rinichilor etc.) sau altor schimbări care pot să nu constituie răspunsuri toxice (de exemplu, consum de hrană redus, mărirea ficatului), efectele observate asupra indicatoarelor de rezultat sensibile de tip imunitar, neurologic sau endocrin trebuie să fie interpretate cu precauție.
                           
                        
                     Testul la valori-limită
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Atunci când un test efectuat pe baza metodelor descrise în prezentul studiu, la o doză de cel puțin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi sau, în cazul administrării prin regimul alimentar sau prin apa potabilă, la o concentrație echivalentă (în funcție de greutatea corporală) nu produce efecte toxice detectabile și atunci când nu se anticipează toxicitatea pe baza informațiilor despre substanțe cu structuri asemănătoare, poate să nu fie considerată necesară efectuarea unui studiu complet cu trei niveluri de dozare. Testul la valori-limită este justificat, cu excepția cazului în care condițiile de expunere umană impun utilizarea unei doze mai ridicate.
                           
                        
                     Administrarea dozelor
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Substanța chimică testată va fi administrată animalelor timp de 7 zile pe săptămână, pe o perioadă de 28 de zile. Când substanța chimică testată se administrează prin gavaj, ea se administrează animalelor în doză unică, folosind o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de greutatea animalului. Volumul nu trebuie să depășească 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, din care se pot administra 2 ml/100 g greutate corporală. Cu excepția cazului substanțelor iritante sau corozive care produc, de obicei, efecte exacerbate la concentrații mai mari, variabilitatea volumului administrat trebuie să fie redusă la minim prin ajustarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant la toate nivelurile de dozare.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              În cazul administrării substanțelor chimice prin intermediul regimului alimentar sau al apei potabile, este important să se asigure că bilanțul nutrițional sau hidric normal nu este afectat de cantitatea de substanță chimică testată utilizată. Dacă substanța chimică testată se administrează prin intermediul regimului alimentar, există două alternative: fie sub forma unei concentrații constante în alimentație (ppm), fie sub forma unei doze constante în raport cu greutatea corporală a animalului; trebuie să se specifice alternativa folosită. Atunci când substanța chimică se administrează prin gavaj, administrarea dozei trebuie să se facă zilnic aproximativ la aceeași oră și să fie ajustată după în funcție de necesități, pentru a menține un nivel constant al dozei în raport cu greutatea corporală a animalului. Atunci când se efectuează un studiu cu doză repetată înainte de un studiu pe lungă durată, regimul alimentar trebuie să fie similar în ambele cazuri.
                           
                        
                     Observații
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Perioada de observație durează 28 de zile. Animalele dintr-un grup satelit, prevăzut pentru examinări suplimentare, sunt ținute sub observație, fără tratament, timp de cel puțin încă 14 zile, astfel încât să se poată detecta eventualele apariții întârziate ale efectelor toxice, persistența lor sau recuperarea de pe urma efectelor toxice.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Observațiile clinice generale sunt efectuate cel puțin o dată pe zi, de preferință în același moment (sau aceleași momente) ale zilei, în funcție de perioada de după încheierea administrării în care efectele sunt mai pronunțate. Se consemnează starea de sănătate a animalelor. Toate animalele sunt examinate cel puțin de două ori pe zi, pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Toate animalele sunt supuse unei observații clinice detaliate înaintea primei expuneri (astfel încât mai târziu să se poată facă comparații între diferitele stări de sănătate la același individ) și cel puțin o dată pe săptămână în perioada următoare. Aceste examinări sunt efectuate în afara cuștii în care sunt găzduite animalele, într-o incintă standard și, de preferință, de fiecare dată în același moment al zilei. Ele se consemnează cu atenție, de preferat folosind un sistem de notare definit explicit de laboratorul de testare. Variabilitatea condițiilor de laborator este redusă la minim, iar examinările se fac, de preferință, de către persoane care nu sunt informate asupra tratamentului. Examinările vor avea în vedere, între altele, modificări ale pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, secrețiilor și excrețiilor, precum și activitatea autonomă (de exemplu, lăcrimare, piloerecție, dimensiunea pupilelor, respirație neobișnuită). Sunt consemnate, de asemenea, schimbările în mers, ținută și răspuns la manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice și tonice, a stereotipiilor (de exemplu, îngrijirea corporală excesivă, mersul circular repetat) sau a comportamentelor bizare (de exemplu, automutilarea, mersul înapoi) (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              În cursul celei de-a patra săptămâni de expunere, se evaluează răspunsul la diferiți stimuli (2) (de exemplu, stimuli auditivi, vizuali și proprioceptivi) (3) (4) (5), forța de prehensiune (6) și activitatea locomotoare (7). Detalii suplimentare referitoare la procedurile utilizabile figurează în referințele bibliografice respective. Se pot folosi însă și alte proceduri decât cele din referințele bibliografice.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Observațiile funcționale din a patra săptămână de expunere pot fi omise dacă studiul este efectuat înaintea unui studiu subcronic (de 90 de zile). În acest caz, observațiile funcționale trebuie să facă parte din studiul complementar. În schimb, dacă există informații pe baza unor observații funcționale efectuate în cadrul unor studii anterioare prin administrare repetată, acest lucru poate facilita alegerea dozelor la studiul subcronic ulterior.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              În mod excepțional, observațiile funcționale pot fi, de asemenea, omise pentru grupurile care prezintă simptome de toxicitate în asemenea măsură încât ar interfera semnificativ cu desfășurarea testului funcțional.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              La autopsie se poate determina (opțional) ciclul estral al tuturor femelelor, prin prelevarea de frotiuri vaginale. Aceste observații vor furniza informații privind stadiul ciclului estral la momentul sacrificiului și vor fi utile la evaluarea histologică a țesuturilor sensibile la estrogen [a se vedea ghidul privind examenul histopatologic (19)].
                           
                        
                     Greutatea corporală și consumul de hrană și apă
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Toate animalele trebuie să fie cântărite cel puțin o dată pe săptămână. Măsurarea consumului de hrană se face cel puțin săptămânal. Atunci când substanța chimică testată se administrează în apa potabilă, se măsoară cel puțin săptămânal și consumul de apă.
                           
                        
                     Examenul hematologic
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Următoarele examinări hematologice trebuie să fie efectuate la sfârșitul perioadei de testare: hematocritul, concentrațiile de hemoglobină, numărul de eritrocite, reticulocitele, numărul total de leucocite și formula leucocitară, numărul de trombocite și timpul/potențialul de coagulare. Printre alte determinări efectuate în cazul în care substanța chimică testată sau eventualii săi metaboliți au sau se presupune că au proprietăți oxidante se numără concentrația de methemoglobină și corpii Heinz.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Probele de sânge trebuie să fie prelevate într-un punct determinat, chiar înainte de procedura de eutanasiere a animalelor sau în timpul acesteia și se conservă în condiții adecvate. Animalele nu primesc hrană în noaptea dinainte de eutanasiere (7).
                           
                        
                     Biochimia clinică
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Trebuie să se efectueze măsurări biochimice clinice în vederea cercetării principalelor efecte toxice asupra țesuturilor, în special asupra ficatului și asupra rinichilor, pe baza unor probe de sânge prelevate de la toate animalele chiar înainte sau în timpul procedurii de eutanasiere (cu excepția animalelor muribunde sau eutanasiate înainte de încheierea studiului). Determinările efectuate în plasmă sau ser vor include nivelurile de sodiu, potasiu, glucoză, colesterol total, uree, creatinină, proteine totale și albumină, nivelurile a cel puțin două enzime care indică efectele hepatocelulare (cum ar fi alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza alcalină, gama glutamil transpeptidaza și sorbitol dehidrogenaza), precum și acizii biliari. În unele cazuri, determinările altor enzime (de origine hepatică sau diferită) și a bilirubinei pot furniza informații utile.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Opțional, în cursul ultimei săptămâni a studiului se pot efectua următoarele analize de urină, cu colectarea într-un interval de timp a unui volum de urină: aspect, volum, osmolalitate sau densitate, pH, proteinurie, glucozurie, hematurie.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              În plus, trebuie avute în vedere studii pentru investigarea indicatorilor plasmatici sau serici ai leziunilor generale ale țesuturilor. Alte determinări care ar putea fi necesare în cazul în care proprietățile substanței chimice testate pot sau sunt susceptibile să modifice profilurile metabolice, includ calciul, fosfații, trigliceridele, hormonii specifici și colinesteraza. Acestea trebuie să fie identificate pentru substanțele chimice din anumite clase sau de la caz la caz.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Deși în cadrul evaluării internaționale a efectelor endocrine conexe nu s-a putut demonstra un avantaj clar pentru determinarea hormonilor tiroidieni (T3, T4) și TSH, poate fi necesar să se păstreze probe de plasmă sau ser pentru măsurarea T3, T4 și TSH (opțional) în cazul în care există o indicație a unui efect asupra axei hipofiză-tiroidă. Aceste probe pot fi congelate la –20 °C pentru păstrare. Următorii factori pot influența variabilitatea și concentrațiile absolute la determinarea hormonale:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          momentul eutanasierii, din cauza variației diurne a concentrațiilor hormonale;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metoda de eutanasiere pentru a evita stresul excesiv al animalelor, care poate afecta concentrațiile hormonale;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          seturile de testare pentru determinările hormonale, care pot diferi prin curbele standard.
                                       
                                    Identificarea definitivă a substanței cu activitate asupra tiroidei este mai credibilă pe baza analizei histopatologice decât pe baza determinării nivelurilor hormonale.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Probele de plasmă destinate în mod specific determinării hormonale trebuie să fie prelevate la momente comparabile din zi. Se recomandă să se ia în considerare determinarea valorilor T3, T4 și TSH inițiate pe baza modificărilor în histopatologia tiroidei. Valorile numerice obținute la analiza concentrațiilor hormonale diferă în funcție de diferitele seturi de testare comerciale. În consecință, se poate ca furnizarea criteriilor de performanță să nu fie posibilă pe baza unor date istorice uniforme. Ca alternativă, laboratoarele trebuie să încerce menținerea coeficienților de control al variației sub 25 pentru T3 și T4 și sub 35 pentru TSH. Toate concentrațiile se consemnează în ng/ml.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Dacă informațiile de bază colectate anterior nu sunt adecvate, trebuie luată în considerare determinarea parametrilor hematologici și biochimici înaintea începerii administrării sau, de preferință, pe un grup de animale neincluse în grupurile experimentale.
                           
                        PATOLOGIA
                  
                     Autopsia
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii complete și detaliate, care cuprinde examinarea atentă a suprafeței externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavităților craniană, toracică și abdominală, precum și a conținutului acestora. Ficatul, rinichii, glandele suprarenale, testiculele, epididimul, prostata + veziculele seminale și glandele coagulante în ansamblu, timusul, splina, creierul și inima tuturor animalelor (cu excepția celor muribunde și/sau a celor eutanasiate înaintea încheierii studiului) sunt curățate de țesuturile aderente, după caz, și cântărite în stare proaspătă după disecție, pentru a evita deshidratarea. Se procedează cu atenție la curățarea ansamblului prostatei, pentru a evita perforarea veziculelor seminale care conțin fluid. Ca alternativă, veziculele seminale și prostata pot fi curățate și cântărite după fixare.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              În plus, opțional se pot cântări alte două țesuturi, cât mai repede după disecție, pentru a evita deshidratarea: perechea de ovare (greutate în stare umedă) și uterul, inclusiv colul uterin [îndrumări privind îndepărtarea și prepararea țesuturilor uterine pentru determinarea greutății sunt puse la dispoziție în Orientarea 440 a OCDE (18)].
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              După fixare se poate determina (opțional) greutatea tiroidei. Curățarea se face foarte atent și doar după fixare, pentru a evita deteriorarea țesuturilor. Deteriorarea țesuturilor poate compromite analiza histopatologică.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Țesuturile următoare trebuie să fie conservate în mediul de fixare cel mai adecvat atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic prevăzut (a se vedea punctul 47): toate țesuturile care prezintă leziuni macroscopice, encefalul (regiuni reprezentative: creierul mare, cerebelul și puntea), măduva spinării, ochiul, stomacul, intestinul subțire, intestinul gros (inclusiv plăcile Peyer), ficatul, rinichii, glandele suprarenale, splina, inima, timusul, tiroida, traheea și plămânii (conservați prin umflare cu fixativ și imersie ulterioară), gonadele (testiculele și ovarele), organele genitale anexe (de exemplu, uterul și colul, epididimul, prostata + veziculele seminale cu glandele coagulante), vaginul, vezica urinară, ganglionii limfatici [în afară de cel mai apropiat ganglion de drenare, se prelevează încă un ganglion limfatic, conform experienței laboratorului (15)], nervul periferic (sciatic sau tibial), de preferință foarte aproape de mușchi, mușchi scheletic și os cu măduvă osoasă (secțiune sau, ca alternativă, aspirat de măduvă osoasă proaspăt fixat pe lamă). Se recomandă fixarea testiculelor prin imersie în fixator Bouin sau Davidson modificat (16) (17). Tunica albuginea trebuie perforată cu un ac, cu atenție și la adâncime mică, la ambii poli ai organului, pentru a permite penetrarea rapidă a fixatorului. Observațiile clinice și de altă natură pot să conducă la necesitatea de a examina țesuturi suplimentare. Se conservă și alte organe considerate organe-țintă probabile pentru substanța chimică testată, având în vedere proprietățile sale cunoscute.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Următoarele țesuturi pot furniza indicații valoroase privind efectele asupra sistemului endocrin: gonadele (ovarele și testiculele), organele sexuale anexe (uterul, inclusiv colul uterin, epididimul, veziculele seminale cu glandele coagulante, prostata dorso-laterală și ventrală), vaginul, hipofiza, glanda mamară masculină, tiroida și glanda suprarenală. Modificările glandelor mamare masculine nu au fost suficient documentate dar acest parametru poate fi foarte sensibil la substanțe cu acțiune estrogenică. Observarea organelor/țesuturilor neenumerate la punctul 43 este opțională (a se vedea apendicele 2).
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Ghidul privind examenul histopatologic (19) prezintă detalii suplimentare privind disecția, fixarea, secționarea și examenul histopatologic al țesuturilor endocrine.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              În programul internațional de testare s-au obținut dovezi în sensul că se pot identifica efecte endocrine subtile ale unor substanțe cu capacitate redusă de afectare a homeostaziei hormonale, prin perturbarea sincronizării ciclului estral în diferite țesuturi și mai puțin prin alterări histopatologice clare ale organelor sexuale feminine. Deși nu s-a obținut vreo dovadă concludentă privind asemenea efecte, se recomandă să se ia în considerare dovezile unor posibile desincronizări ale ciclului estral la interpretarea examenului histopatologic al ovarelor (celule foliculare, tecale și granulare), uterului, colului uterin și vaginului. În cazul în care este evaluat, stadiul ciclului determinat prin frotiuri vaginale poate fi inclus de asemenea în această comparație.
                           
                        
                     Examenul histopatologic
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Se efectuează un examen histopatologic complet al țesuturilor și organelor conservate ale tuturor animalelor aparținând grupului martor și grupului tratat cu doza cea mai mare. Aceste examene sunt extinse la animalele tratate cu alte doze, dacă se constată modificări care au legătură cu tratamentul la grupul tratat cu doza cea mai mare.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Se examinează toate leziunile macroscopice.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Atunci când se folosește un grup satelit, se efectuează un examen histopatologic al țesuturilor și organelor la care au fost identificate efecte în grupurile tratate.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Rezultatele sunt indicate pentru fiecare animal în parte. În plus, toate datele sunt rezumate în formă tabelară, arătându-se pentru fiecare grup de testare numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în timpul testului sau eutanasiate din motive umane și momentul morții sau al eutanasierii, numărul de animale prezentând simptome de toxicitate, o descriere a simptomelor de toxicitate observate, în special momentul apariției acestora, durata și severitatea tuturor efectelor toxice, numărul animalelor prezentând leziuni, tipul leziunilor și procentul animalelor care prezintă fiecare tip de leziune.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Dacă este posibil, rezultatele numerice se evaluează cu ajutorul unei metode statistice adecvate și general acceptate. Pentru comparațiile efectelor pe un interval de dozare se evită recurgerea la teste t multiple. Metodele statistice se aleg în faza de concepere a studiului.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Pentru controlul calității, se propune colectarea datelor martor anterioare și calculul coeficienților de variație pentru datele numerice, în special pentru parametrii în legătură cu detectarea unui factor perturbator al proceselor endocrine. Aceste date se pot folosi în scop comparativ la evaluarea studiilor curente.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să conțină următoarele date:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritatea și proprietățile fizico-chimice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul (dacă este cazul):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii vehiculului, dacă este altul decât apa.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animalele testate:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      specia/sușa utilizată;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, vârsta și sexul animalelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea fiecărui animal la începutului testului.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea, în cazul în care se folosesc alte specii decât șobolanul.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii nivelului dozei administrate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind formula substanței chimice testate/prepararea hranei, concentrația obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind modalitatea de administrare a substanței chimice testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      conversia concentrației substanței chimice testate (ppm) în hrană/apa potabilă la doza reală (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii cu privire la calitatea hranei și apei.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Efecte opționale investigate
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      lista efectelor opționale investigate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală/modificările în greutatea corporală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      consumul de hrană și apă, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultate privind răspunsul toxic, pe sexe și niveluri ale dozelor, inclusiv simptomele de toxicitate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura, gravitatea și durata semnelor clinice (reversibile sau nu);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      evaluările activității senzoriale, a forței de prehensiune și a activității locomotorii;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      examenele hematologice și valorile de referință corespunzătoare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      examenele de biochimie clinică și valorile de referință corespunzătoare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală în momentul eutanasierii animalului și date privind greutatea organelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concluziile autopsiei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date referitoare la absorbție, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tratamentul statistic aplicat rezultatelor, dacă este cazul.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Evaluarea rezultatelor
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Concluzii
                                          
                                       
                                    
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚII
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Androgenicitatea este capacitatea unei substanțe de a acționa ca hormon androgen natural (de exemplu, testosteron) în organismul unui mamifer.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiandrogenicitatea este capacitatea unei substanțe de a suprima acțiunea unui hormon androgen natural (de exemplu, testosteron) în organismul unui mamifer.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Antiestrogenicitatea este capacitatea unei substanțe de a suprima acțiunea unui hormon estrogen natural (de exemplu, estradiol 17ß) în organismul unui mamifer.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Activitatea antitiroidiană este capacitatea unei substanțe de a suprima acțiunea unui hormon tiroidian natural (de exemplu, estradiol T3) în organismul unui mamifer.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Dozarea este un termen general care desemnează doza administrată, frecvența și durata administrării.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Doza este cantitatea de substanță chimică testată administrată. Doza este exprimată ca greutatea substanței chimice testate pe unitatea de greutate a animalului testat (de exemplu, mg/kg greutate corporală/zi) sau ca o concentrație constantă în regimul alimentar.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Toxicitatea evidentă este un termen general care descrie simptome clare de toxicitate în urma administrării unei substanțe chimice testate. Aceste manifestări trebuie să fie suficient de pronunțate pentru a permite o evaluare a riscurilor și să se poată anticipa că o mărire a dozei administrate poate declanșa apariția unor simptome de toxicitate severe și probabil moartea.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    NOAEL este abrevierea pentru nivelul la care nu se observă niciun efect advers. Acesta este cel mai înalt nivel de dozare la care nu se observă efecte adverse în legătură cu tratamentul.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Estrogenicitatea este capacitatea unei substanțe de a acționa ca hormon estrogen natural (de exemplu, estradiol 17ß) în organismul unui mamifer.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Substanță chimică testată: orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Activitatea tiroidiană este capacitatea unei substanțe de a acționa ca hormon tiroidian natural (de exemplu, estradiol T3) în organismul unui mamifer.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Validarea este un proces științific conceput pentru caracterizarea cerințelor operaționale și limitărilor unei metode de testare și pentru demonstrarea credibilității sale și relevanței pentru un anumit scop.
                              
                           
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Indicatori de rezultat recomandați pentru detectarea perturbatorilor endocrini (EDs) în această metodă de testare B.7
                     
                     
                                 Indicatori de rezultat obligatorii
                              
                              
                                 Indicatori de rezultat opționali
                              
                           
                                 Greutate
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Testicule
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Epididim
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Glande suprarenale
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Prostată + veziculele seminale cu glandele coagulante
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Ovare
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Uter, inclusiv colul uterin
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Tiroidă
                                          
                                       
                           
                                 Examen histopatologic
                              
                           
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Gonade:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         testicule; și
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         ovare
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Organe sexuale anexe:
                                             
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         epididim;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         prostată + veziculele seminale cu glandele coagulante;
                                                      
                                                   
                                                         —
                                                      
                                                      
                                                         uter, inclusiv colul uterin
                                                      
                                                   
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Glande suprarenale
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Tiroidă
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Vagin
                                          
                                       
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Frotiuri vaginale
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Glande mamare masculine
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Hipofiză
                                          
                                       
                           
                                 Determinări hormonale
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                             —
                                          
                                          
                                             Nivelurile circulatorii ale T3, T4
                                          
                                       
                                             —
                                          
                                          
                                             Nivelurile circulatorii ale TSH
                                          
                                       
                           
                  
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (Paris, 1992), Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              IPCS (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, Environmental Health Criteria Document No. 60
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Tupper D.E., Wallace R.B. (1980), Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Gad S.C. (1982), A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991), Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979), A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991), Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (1998), Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              OECD (2006), Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              OECD (2002), Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              OECD (2012), Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2006), Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              OECD, Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Haley P., Perry R., Ennulat D., Frame S., Johnson C., Lapointe J.-M., Nyska A., Snyder P.W., Walker D., Walter G. (2005), STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Hess R.A., Moore B.J. (1993), Histological Methods for the Evaluation of the Testis. În: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin R.E. and Heindel J.J. (eds.), Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Latendresse J.R., Warbrittion A.R, Jonassen H., Creasy D.M. (2002), Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              OECD (2007), OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.
                           
                        B.8.   TOXICITATEA SUBACUTĂ PRIN INHALARE: STUDIU DE 28 DE ZILE
                  
                  REZUMAT
                  Această metodă de testare revizuită B.8 a fost concepută pentru caracterizarea completă a toxicității substanței chimice testate prin calea de inhalare în urma expunerii repetate pe o perioadă limitată (28 de zile) și pentru a furniza date pentru evaluările cantitative ale riscului prin inhalare. Grupuri de minim 5 masculi și 5 femele de rozătoare sunt expuse 6 ore pe zi timp de 28 zile la a) substanța chimică testată la trei sau mai multe niveluri de concentrație; b) aer filtrat (grup martor negativ); și/sau c) vehicul (grup martor vehicul). În general, animalele sunt expuse 5 zile pe săptămână, dar este permisă și expunerea timp de 7 zile pe săptămână. Masculii și femelele se testează întotdeauna, dar pot fi supuși unor niveluri de concentrație diferite dacă se cunoaște faptul că un sex este mai receptiv la o anumită substanță chimică testată. Această metodă permite conducătorului studiului flexibilitatea de a include grupuri satelit (de reversibilitate), lavajul bronhoalveolar (BAL), teste neurologice și evaluări suplimentare clinice patologice și histopatologice, pentru caracterizarea mai bună a toxicității unei substanțe chimice testate.
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 412 (2009) a OCDE. Versiunea originală a Orientării 412 privind inhalarea subacută a fost adoptată în 1981 (1). Această metodă de testare B.8 (ca echivalent la varianta revizuită a Orientării 412) a fost actualizată pentru a reflecta nivelul științific și pentru a satisface cerințele de reglementare curente și viitoare.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Această metodă permite caracterizarea efectelor adverse în urma expunerii repetate zilnice prin inhalarea substanței chimice testate timp de 28 de zile. Datele obținute din studiile de 28 de zile de toxicitate subacută se pot folosi pentru evaluări cantitative ale riscului [în cazul în care studiul nu este urmat de un studiu de 90 de zile de toxicitate subcronică prin inhalare (capitolul B.29 din prezenta anexă)]. De asemenea, datele pot furniza informații privind selectarea concentrațiilor pentru studiile pe termen mai lung, de exemplu un studiu de 90 de zile de toxicitate subcronică prin inhalare. Această metodă nu este destinată în mod specific testării nanomaterialelor. Definițiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la sfârșitul acestui capitol și în Ghidul 39 (2).
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              3.
                           
                           
                              Toate informațiile disponibile privind substanța chimică testată trebuie luate în considerare de laboratorul de testare înainte de efectuarea studiului, în vederea îmbunătățirii calității studiului și minimizării utilizării animalelor. Informațiile care pot contribui la selectarea celor mai adecvate concentrații de testare corespunzătoare includ: identitatea, structura chimică și proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate; rezultatele tuturor testelor de toxicitate in vitro sau in vivo; utilizări anticipate și potențialul de expunere umană; date (Q)SAR disponibile și date toxicologice privind substanțe cu structură apropiată; și date rezultate din testarea toxicității acute prin inhalare. În cazul în care în decursul studiului se anticipează sau se observă neurotoxicitatea, conducătorul studiului poate alege să includă și evaluări adecvate, de exemplu un set de observații funcționale (FOB) și măsurarea activității motorii. Deși momentele expunerii în funcție de examinările specifice pot fi critice, desfășurarea acestor activități suplimentare nu trebuie să afecteze protocolul studiului de bază.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Diluțiile substanțelor corozive sau iritante testate se pot testa la concentrații care generează gradul dorit de toxicitate [a se vedea Ghidul 39 (2)]. La expunerea animalelor la aceste materiale, concentrațiile vizate trebuie să fie suficient de reduse pentru a nu induce durere sau suferință accentuată, dar totuși suficiente pentru a extinde curba concentrație-răspuns la niveluri care ating obiectivul de reglementare și științific al testului. Aceste concentrații sunt selectate de la caz la caz, de preferință pe baza unui studiu de stabilire a dozelor conceput corespunzător, care furnizează informații privind efectul critic, pragul de iritare și momentul apariției (a se vedea punctele 11-13). Se prezintă justificarea pentru selecția concentrației.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferință gravă și prelungită trebuie să fie eutanasiate. Animalele muribunde sunt considerate în același mod ca animalele care mor în cursul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau expuse unor suferințe intense și indicațiile pentru recunoașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unui ghid separat OCDE privind efectele asupra omului (3).
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Se utilizează rozătoare adulte, tinere, sănătoase, provenite din sușele folosite în mod obișnuit în laboratoare. Specia preferată este șobolanul. Dacă se utilizează alte specii, decizia trebuie să fie motivată.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Femelele trebuie să fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua randomizării, animalele trebuie să fie adulți tineri în vârstă de 7 până la 9 săptămâni. Greutățile corporale trebuie să se încadreze în intervalul de ± 20 % față de greutatea medie pentru fiecare sex. Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individuală și ținute în cuștile lor cel puțin 5 zile înainte de începerea administrării dozelor, pentru a permite aclimatizarea lor la condițiile de laborator.
                           
                        
                     Îngrijirea animalelor
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Dacă este posibil, animalele sunt identificate individual, cu transpondere subcutanate, pentru a facilita observarea și a evita confuziile. Temperatura camerei în care sunt ținute animalele utilizate în scop experimental trebuie să fie de 22 ± 3 °C. Umiditatea relativă este menținută, în mod ideal, în intervalul de 30 până la 70 %, deși, acest lucru poate să nu fie posibil în cazul utilizării apei ca vehicul. În general, înainte și după expuneri animalele sunt închise în cuști în grupuri, în funcție de sex și concentrație, dar numărul de animale dintr-o cușcă nu trebuie să perturbe observarea clară a fiecărui animal și trebuie să minimizeze pierderile cauzate de canibalism și lupte. În cazul în care animalele sunt expuse doar în zona nasului, ar putea fi necesară aclimatizarea lor la tuburile de imobilizare. Tuburile de imobilizare nu trebuie să producă asupra animalului un stres excesiv fizic, termic sau de imobilizare. Imobilizarea poate afecta efecte fiziologice cum ar fi temperatura corporală (hipertermie) și/sau debitul respirator pe minut. În cazul în care sunt disponibile date generice care demonstrează că nu se produc asemenea modificări într-o măsură considerabilă, nu este necesară adaptarea preliminară la tuburile de imobilizare. Animalele la care întregul corp este expus corp unui aerosol sunt ținute în cuști individuale în timpul expunerii, pentru a preveni filtrarea aerosolului testat prin blana celorlalte animale din cușcă. Se pot folosi regimuri alimentare de laborator, convenționale și certificate, cu excepția perioadei de expunere, iar apa de băut din rețeaua municipală este furnizată în cantitate nelimitată. Iluminatul este artificial, cu o succesiune de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric.
                           
                        
                     Incintele de inhalare
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Natura substanței chimice testate și obiectivul testului sunt luate în considerare la selectarea unei incinte de inhalare. Modul de expunere preferat este doar în zona nasului (expresie care include expunerea doar în zona capului, a nasului sau a botului). În general, expunerea doar în zona nasului este preferată pentru studii ale aerosolilor lichizi sau solizi și pentru vapori care pot condensa pentru a forma aerosoli. Obiectivele speciale ale studiului pot fi atinse mai bine prin utilizarea unui mod de expunere prin intermediul întregului corp, dar această metodă trebuie să fie justificată în raportul de studiu. Pentru a asigura stabilitatea atmosferei la utilizarea unei incinte pentru întregul corp, «volumul» total al animalelor testate nu trebuie să depășească 5 % din volumul incintei. Principiile tehnicilor de expunere doar în zona nasului și a întregului corp, precum și avantajele sau dezavantajele lor particulare sunt descrise în Ghidul 39 (2).
                           
                        STUDII DE TOXICITATE
                  
                     Concentrații-limită
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Spre deosebire de studiile de toxicitate acută, în studiile de 28 de zile de toxicitate subacută prin inhalare nu se definesc limite de concentrație. Concentrația testată maximă trebuie să țină seama de: 1. concentrația maximă realizabilă; 2. nivelul de expunere umană în «cele mai nefavorabile condiții»; 3. necesitatea de a menține un aport adecvat de oxigen; și/sau 4. considerații privind bunăstarea animalelor. În absența unor limite bazate pe date, se pot utiliza limitele acute din Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (13) (până la o concentrație maximă de 5 mg/l pentru aerosoli, 20 mg/l pentru vapori și 20 000 ppm pentru gaze); a se vedea Ghidul 39 (2). În cazul în care este necesară depășirea acestor limite la testarea gazelor sau substanțelor de testare foarte volatile (de exemplu, agenți frigorifici), trebuie să se prezinte justificarea. Concentrația-limită trebuie să determine toxicitatea neechivocă, fără a induce un stres excesiv pentru animale și fără a le afecta longevitatea (3).
                           
                        
                     Studiul de stabilire a intervalului
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Înainte de a începe studiul principal, poate fi necesar să se efectueze un studiu de stabilire a intervalului. Un astfel de studiu este mai cuprinzător decât un studiu de observare, deoarece nu se limitează la alegerea concentrației. Cunoștințele dobândite în urma unui studiu de stabilire a intervalului pot conduce la un studiu principal reușit. Un studiu de stabilire a intervalului poate, de exemplu, să furnizeze informații tehnice privind metodele analitice, granulometria, descoperirea mecanismelor toxice, date de patologie clinică și histopatologice și estimări asupra posibilelor concentrații NOAEL și MTC în studiul principal. Conducătorul studiului poate alege să folosească studiul de stabilire a intervalului pentru identificarea pragului de iritație a căilor respiratorii (de exemplu, cu examenul histopatologic al căilor respiratorii, testarea funcției pulmonare sau lavaj bronhoalveolar), a concentrației superioare care este tolerată fără stres excesiv pentru animale și a parametrilor care vor caracteriza cel mai bine toxicitatea unei substanțe chimice testate.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Un studiu de stabilire a intervalului poate consta în unul sau mai multe niveluri de concentrație. Nu se vor expune mai mult de trei masculi și trei femele la fiecare nivel de concentrație. Un studiu de stabilire a intervalului durează minimum 5 zile și, în general, nu mai mult de 14 zile. Justificarea alegerii concentrațiilor pentru studiul principal trebuie să fie specificată în raportul de studiu. Obiectivul studiului principal este să demonstreze relația concentrație-răspuns pe baza efectului anticipat ca fiind cel mai sensibil. În mod ideal, concentrația inferioară este o concentrație fără efect advers observabil, iar concentrația superioară trebuie să determine toxicitatea neechivocă fără a induce stres excesiv pentru animale și fără a le afecta longevitatea (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              La selectarea nivelurilor de concentrație pentru studiul de stabilire a intervalului, se folosesc toate informațiile disponibile, inclusiv relațiile structură-activitate și date pentru substanțe chimice similare (a se vedea punctul 3). Un studiu de stabilire a intervalului poate confirma/infirma efectele considerate a fi cele mai sensibile din punct de vedere al mecanismului, de exemplu inhibarea colinesterazei de către fosfați organici, formarea methemoglobinei de către agenți toxici pentru eritrocite, hormonii tiroidieni (T3, T4) pentru agenții toxici față de tiroidă, proteinele, LDH sau neutrofilele în lavajul bronhoalveolar pentru particule puțin solubile nedăunătoare sau aerosoli iritanți pentru plămâni.
                           
                        
                     Studiul principal
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Studiul principal de toxicitate subacută constă, în general, în trei niveluri de concentrație și grupuri martor negative (cu aer) și/sau cu vehicul studiate în paralel, după cum este necesar (a se vedea punctul 17). Trebuie să se utilizeze toate datele disponibile, pentru a contribui la selectarea nivelurilor de expunere adecvate, inclusiv rezultatele studiilor de toxicitate sistemică, metabolism și cinetică (trebuie să se acorde o atenție specială evitării nivelurilor ridicate de concentrație care saturează procesele cinetice). Fiecare grup testat conține cel puțin 10 rozătoare (5 masculi și 5 femele) expuse la substanța chimică testată timp de 6 ore pe zi, 5 zile pe săptămână, pe o perioadă de 4 săptămâni (durata totală a studiului de 28 de zile). Animalele pot fi expuse și 7 zile pe săptămână (de exemplu, la testarea produselor farmaceutice inhalate). În cazul în care se știe că un sex este mai receptiv la o anumită substanță chimică testată, sexele pot fi expuse la niveluri diferite de concentrație, pentru optimizarea răspunsului la concentrație, așa cum se arată la punctul 15. Dacă alte specii de rozătoare sunt expuse doar în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi ajustate pentru minimizarea suferinței specifice speciei. Trebuie să se prezinte o justificare la utilizarea unei durate de expunere sub 6 ore/zi sau în cazul în care este necesar un studiu de lungă durată (de exemplu 22 de ore/zi) cu expunerea întregului corp [a se vedea Ghidul 39 (2)]. Alimentarea se sistează în perioada expunerii, în afară de cazul în care expunerea depășește 6 ore. La expunerea prin intermediul întregului corp se poate asigura apa.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Concentrațiile-țintă selectate identifică organele-țintă și demonstrează o relație clară concentrație-răspuns:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          nivelul de concentrație ridicat trebuie să inducă efecte toxice dar să nu determine simptome persistente sau mortalitate, ceea ce ar preveni o evaluare semnificativă;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nivelurile de concentrație intermediare sunt administrate eșalonat, astfel încât efectele toxice să fie graduale între concentrația redusă și cea ridicată;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nivelul de concentrație redusă trebuie să producă o toxicitate redusă sau să nu producă semne de toxicitate.
                                       
                                    
                        
                     Studiul satelit (de reversibilitate)
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Un studiu satelit (de reversibilitate) se poate folosi pentru a observa reversibilitatea, persistența sau apariția cu întârziere a toxicității pentru o perioadă post-tratament de lungime adecvată, dar nu mai mare de 14 zile. Grupurile satelit (de reversibilitate) constau în cinci masculi și cinci femele expuse în paralel cu animalele experimentale din studiul principal. Grupurile din studiile satelit (de reversibilitate) sunt expuse la substanța chimică testată la nivelul maxim de concentrație și trebuie să existe grupuri martor cu aer și/sau vehicul, după caz, studiate în paralel (a se vedea punctul 17).
                           
                        
                     Animalele din grupul martor
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Animalele din grupul martor negativ (cu aer) studiat în paralel se manipulează într-o manieră identică cu cele din grupul de testare, cu excepția faptului că sunt expuse la aer filtrat în locul substanței chimice testate. În cazul în care se folosește apa sau altă substanță pentru generarea atmosferei de testare, se include în studiu un grup martor pentru vehicul, în locul grupului martor negativ (cu aer). Când este posibil, se folosește apa ca vehicul. Când se folosește apa ca vehicul, animalele din grupul martor se expun la aer cu aceeași umiditate relativă ca și grupurile expuse. Alegerea unui vehicul adecvat se bazează pe un studiu preliminar corespunzător sau pe date anterioare. În cazul în care nu se cunoaște bine toxicitatea unui vehicul, conducătorul studiului poate alege să folosească atât un grup martor negativ (cu aer) cât și un grup martor pentru vehicul, dar se recomandă categoric evitarea acestei abordări. În cazul în care datele anterioare arată că vehiculul nu este toxic, nu este necesar un grup martor negativ (cu aer) și se folosește doar un grup martor pentru vehicul. În cazul în care un studiu preliminar al unei substanțe chimice testate formulate într-un vehicul nu prezintă nicio toxicitate, rezultă că vehiculul nu este toxic la concentrația testată și se va utiliza acest grup martor pentru vehicul.
                           
                        CONDIȚII DE EXPUNERE
                  
                     Administrarea concentrațiilor
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Animalele sunt expuse la substanța chimică testată sub formă de gaz, vapori, aerosoli sau un amestec al acestora. Starea fizică testată depinde de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate, de concentrația aleasă și/sau forma fizică cu cea mai probabilitate de prezență în timpul manipulării și utilizării substanței chimice testate. Substanțele higroscopice și reactive din punct de vedere chimic sunt testate în condiții de aer uscat. Trebuie să se acorde atenție pentru a evita generarea concentrațiilor explozive. Materialele sub formă de particule pot fi supuse unor procese mecanice pentru reducerea dimensiunii particulelor. Orientări suplimentare sunt prezentate în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                     Distribuția granulometrică
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Granulometria se efectuează pentru toți aerosolii și vaporii care pot condensa pentru a forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor regiunilor relevante ale căilor respiratorii, se recomandă aerosoli cu diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) de la 1 la 3 μm, cu o abatere standard geometrică (σg) în intervalul 1,5-3,0 (4). Trebuie depus un efort rezonabil pentru a satisface acest standard, dar în cazul în care acest lucru nu este realizabil, trebuie să se prezinte o apreciere bazată pe experiență. De exemplu, particulele de vapori metalici pot fi mai mici decât acest standard iar particulele cu sarcină electrică și fibrele pot fi mai mari.
                           
                        
                     Prepararea substanței chimice testate într-un vehicul
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              În mod ideal, substanța chimică testată se testează fără vehicul. În cazul în care este necesar să se folosească un vehicul pentru a genera o concentrație și o granulometrie corespunzătoare pentru substanța chimică testată, se preferă apa. Întotdeauna când o substanță chimică testată este dizolvată într-un vehicul, trebuie să se demonstreze stabilitatea sa.
                           
                        MONITORIZAREA CONDIȚIILOR DE EXPUNERE
                  
                     Debitul de aer în incintă
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Debitul de aer vehiculat prin incinta de expunere este controlat cu atenție, monitorizat continuu și înregistrat cel puțin o dată pe oră în timpul fiecărei expuneri. Monitorizarea în timp real a concentrației (sau stabilității în timp a) atmosferei de testare este un indicator integral al tuturor parametrilor dinamici și oferă un mijloc de control indirect al parametrilor dinamici relevanți pentru inhalare. În cazul în care concentrația este monitorizată în timp real, frecvența măsurătorii debitelor de aer se poate reduce la o singură măsurătoare pe zi pentru fiecare expunere. Trebuie să se acorde o atenție specială pentru evitarea reinhalării în incinte pentru expunere doar în zona nasului. Concentrația de oxigen este de minimum 19 % iar concentrația de dioxid de carbon nu trebuie să depășească 1 %. În cazul în care există motive să se considere că nu se poate atinge acest standard, se măsoară concentrațiile de oxigen și dioxid de carbon. În cazul în care măsurătorile în prima zi de expunere arată că aceste gaze se află la niveluri corespunzătoare, nu mai sunt necesare alte măsurători.
                           
                        
                     Temperatura și umiditatea relativă în incintă
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Temperatura incintei trebuie să fie menținută la 22 ± 3 °C. Umiditatea relativă în zona de respirație a animalelor, pentru expunerea în zona nasului și a întregului corp, trebuie să fie monitorizată și înregistrată orar în timpul fiecărei expuneri, dacă este posibil. Este preferabil ca umiditatea relativă să fie menținută în intervalul de 30 până la 70 %, dar acest lucru poate fi irealizabil (de exemplu, la testarea amestecurilor apoase) sau imposibil de măsurat din cauza interferenței substanței chimice testate cu metoda de testare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația nominală
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Când este posibil, se calculează și se consemnează concentrația nominală în incinta de expunere. Concentrația nominală reprezintă masa substanței chimice testate generate împărțită la volumul total de aer vehiculat prin sistemul incintei. Concentrația nominală nu este utilizată pentru a caracteriza expunerea animalelor, dar o comparație între concentrația nominală și concentrația efectivă oferă o indicație privind eficiența de generare a sistemului de testare și astfel se poate folosi pentru a descoperi probleme legate de generare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația efectivă
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Concentrația efectivă este concentrația substanței chimice testate în zona de respirație a animalelor într-o incintă de inhalare. Concentrațiile efective se pot obține prin metode specifice (de exemplu, prelevare directă, metode bazate pe adsorbție sau reacții chimice și caracterizare analitică ulterioară) sau prin metode nespecifice, cum ar fi analiza gravimetrică a filtrului. Utilizarea analizei gravimetrice este acceptabilă doar pentru aerosoli cu component pulverulent unic sau aerosoli cu lichide cu volatilitate redusă și trebuie să fie susținută printr-un studiu preliminar privind caracterizările specifice ale substanței chimice testate. Concentrația aerosolilor cu pulberi multicomponent se poate determina tot prin analiză gravimetrică. Dar, în acest caz sunt necesare date analitice care demonstrează caracterul similar al compoziției materialului antrenat de aer și al materialului inițial. În cazul în care aceste informații nu sunt disponibile, poate fi necesară reanalizarea la intervale regulate a substanței chimice testate (în mod ideal, în starea sa de suspensie în aer). Pentru agenții sub formă de aerosoli care se pot evapora sau care pot sublima, trebuie să se demonstreze că toate fazele au fost colectate prin metoda aleasă.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Se folosește un lot de substanță chimică testată pe întreaga durată a studiului, dacă este posibil, iar proba testată trebuie să fie păstrată în condiții care îi asigură puritatea, omogenitatea și stabilitatea. Înainte de începerea studiului, trebuie să existe o caracterizare a substanței chimice testate, care să includă puritatea sa și, dacă este fezabil din punct de vedere tehnic, identitatea și cantitățile de contaminanți și impurități identificate. Aceasta se poate demonstra prin următoarele date, dar fără să se limiteze la acestea: timpul de retenție și zona de vârf relativ, masa moleculară determinată prin analize de spectroscopie de masă sau cromatografie în stare gazoasă sau alte estimări. Deși identitatea probei testate nu constituie responsabilitatea laboratorului care efectuează testarea, o atitudine prudentă pentru acel laborator ar fi să confirme caracterizarea solicitantului, cel puțin în mod limitat (de exemplu culoare, natura fizică etc.).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Atmosfera de expunere trebuie să se mențină cât mai constantă posibil. Pentru a demonstra stabilitatea condițiilor de expunere se poate utiliza un dispozitiv de monitorizare în timp real, de exemplu un fotometru pentru aerosoli sau un analizor de carbon total pentru vapori. Concentrația efectivă în incintă se măsoară ce puțin de 3 ori în timpul fiecărei zile de expunere, pentru fiecare nivel de expunere. În cazul în care acest lucru nu este realizabil din cauza debitelor limitate de aer sau a concentrațiilor reduse, se poate preleva o probă pe parcursul întregii perioade de expunere. În mod ideal, această probă se colectează apoi pe întreaga perioadă de expunere. Probele individuale de concentrație din incintă nu trebuie să se abată de la concentrația medie cu mai mult de ± 10 % pentru gaze și vapori sau ± 20 % pentru aerosoli cu lichide sau solide. Trebuie să se calculeze și să se înregistreze timpul necesar pentru echilibrarea incintei (t95). Durata unei expuneri acoperă timpul în care se generează substanța chimică testată. Aceasta ia în considerare perioadele necesare pentru atingerea echilibrului în incintă (t95) și pentru descompunere. Îndrumări pentru estimarea t95 pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Pentru amestecuri foarte complexe formate din gaze/vapori și aerosoli (de exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice testate propulsate de produse/dispozitive de utilizare finală cu acționare specifică), fiecare fază se poate comporta diferit într-o incintă de inhalare. Prin urmare, se selectează cel puțin o substanță indicatoare (analit), de obicei substanța activă principală din amestec, din fiecare fază (gaz/vapori și aerosol). În cazul în care substanța chimică testată este un amestec, trebuie să se raporteze concentrația analitică pentru amestecul total și nu doar pentru ingredientul activ sau substanța indicatoare (analit). Informații suplimentare privind concentrațiile efective pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                     Substanța chimică testată: distribuția granulometrică
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Granulometria aerosolilor se face cel puțin o dată pe săptămână pentru fiecare nivel de concentrație, folosind un impactor în cascadă sau un instrument alternativ, de exemplu un aparat aerodinamic de granulometrie (APS). În cazul în care se obține o echivalență a rezultatelor obținute cu impactorul în cascadă și cu un instrument alternativ, se poate folosi instrumentul alternativ pentru întregul studiu.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Un al doilea dispozitiv, de exemplu un filtru gravimetric sau un epurator/barbotor de gaze în paralel cu primul instrument, pentru a confirma eficiența colectării la primul instrument. Concentrația masică obținută prin analiza granulometrică trebuie să fie în concordanță rezonabilă cu concentrația masică obținută prin analiza filtrului [a se vedea Ghidul 39 (2)]. În cazul în care se poate demonstra echivalența tuturor concentrațiilor în faza inițială a studiului, se pot omite alte măsurători de confirmare. Pentru motive legate de bunăstarea animalelor, trebuie să se ia măsuri pentru a minimiza datele neconcludente care pot duce la necesitatea de repetare a unui studiu.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Se efectuează granulometria pentru vapori atunci când există vreo posibilitate ca prin condensarea vaporilor să se ajungă la formarea unui aerosol sau în cazul în care se detectează particule într-o atmosferă cu vapori cu potențial de formare a unor faze mixte.
                           
                        OBSERVAȚII
                  
                              31.
                           
                           
                              Animalele trebuie să fie observate clinic înainte, în timpul și după perioada de expunere. Poate fi indicată observarea mai frecventă, în funcție de răspunsul animalelor în timpul expunerii. În cazul în care observarea animalelor este împiedicată de utilizarea tuburilor de imobilizare, a incintelor slab iluminate pentru expunerea întregului corp sau a atmosferelor opace, animalele se observă cu atenție după expunere. Prin observarea înainte de expunerea din ziua următoare se poate evalua reversibilitatea sau exacerbarea efectelor toxice.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Toate observațiile trebuie să fie consemnate în evidențele individuale pentru fiecare animal. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morții se înregistrează cât mai exact posibil.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Observarea animalelor în cușcă urmărește modificările pielii și blănii, ochilor și mucoaselor; modificarea sistemului respirator și circulator, modificările sistemului nervos și modificări în activitatea somato-motorie și în modelele comportamentale. Se va acorda o atenție specială observării tremorului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului și comei. Măsurarea temperaturii rectale poate furniza dovezi de bradipnee reflexă sau hipo/hipertermie asociate cu tratamentul sau cu privarea de libertate. În protocolul studiului se pot include evaluări suplimentare, de exemplu cinetica, biomonitorizarea, funcționarea plămânilor, retenția unor materiale puțin solubile care se acumulează în țesutul pulmonar și modificările comportamentale.
                           
                        GREUTATEA CORPORALĂ
                  
                              34.
                           
                           
                              Greutățile individuale ale animalelor se consemnează cu puțin înaintea primei expuneri (ziua 0), apoi de două ori pe săptămână (de exemplu: vineri și luni, pentru a evidenția recuperarea după un weekend fără expunere sau la un interval de timp pentru a permite evaluarea toxicității sistemice), precum și la momentul morții sau eutanasierii. În cazul în care nu există efecte în primele 2 săptămâni, greutățile corporale se pot măsura săptămânal pe restul duratei studiului. Animalele din grupuri satelit (de reversibilitate) (în cazul în care sunt folosite) se cântăresc în continuare săptămânal pe întreaga perioadă de recuperare. La încheierea studiului, toate animalele sunt cântărite cu puțin înainte de sacrificare, pentru a permite calcularea corectă a rapoartelor între greutatea organelor și cea corporală.
                           
                        CONSUMUL DE HRANĂ ȘI APĂ
                  
                              35.
                           
                           
                              Consumul de hrană se măsoară săptămânal. Se poate măsura și consumul de apă.
                           
                        PATOLOGIA CLINICĂ
                  
                              36.
                           
                           
                              Evaluările de patologie clinică se efectuează pentru toate animalele, inclusiv pentru animalele din grupurile martor și satelit (de reversibilitate), atunci când sunt sacrificate. Trebuie să se consemneze intervalul de timp între încetarea expunerii și recoltarea de sânge, în special dacă restabilirea efectului vizat este rapidă. Se recomandă prelevarea după expunere pentru acei parametri cu timp scurt de înjumătățire plasmatică (de exemplu, COHb, CHE și MetHb).
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Tabelul 1 prezintă parametrii de patologie clinică necesari în general pentru toate studiile toxicologice. Nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când se consideră util pe baza toxicității anticipate sau observate. Conducătorul studiului poate opta pentru evaluarea unor parametri suplimentari în vederea unei mai bune caracterizări a toxicității substanței chimice testate (de exemplu, colinesteraza, lipidele, hormonii, echilibrul acido-bazic, methemoglobina sau corpii Heinz, creatinkinaza, raportul mieloid/eritroid, troponinele, gazele din sângele arterial, dehidrogenaza lactică, sorbitol dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza și gama glutamil transpeptidaza).
                              
                                 Tabelul 1
                              
                              
                                 Parametri standard de patologie clinică
                              
                              
                                          Examen hematologic
                                       
                                    
                                          Număr de eritrocite
                                          Hematocrit
                                          Concentrația de hemoglobină
                                          Hemoglobina corpusculară medie
                                          Volumul corpuscular mediu
                                          Concentrația hemoglobinei corpusculare medii
                                          Reticulocite
                                       
                                       
                                          Număr total de leucocite
                                          Formulă leucocitară
                                          Număr de plachete
                                          Potențial de coagulare (selectați unul):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timp de protrombină
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timp de coagulare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timp de tromboplastină parțial
                                                   
                                                
                                    
                                          Chimie clinică
                                       
                                    
                                          Glucoză (8)
                                          
                                          Colesterol total
                                          Trigliceride
                                          Azot ureic sangvin
                                          Bilirubină totală
                                          Creatinină
                                          Proteine totale
                                          Albumină
                                          Globulină
                                       
                                       
                                          Alanin aminotransferază
                                          Aspartat aminotransferază
                                          Fosfatază alcalină
                                          Potasiu
                                          Sodiu
                                          Calciu
                                          Fosfor
                                          Clor
                                       
                                    
                                          Analiza urinei (opțional)
                                       
                                    
                                          Aspect (culoare și turbiditate)
                                          Volum
                                          Greutate specifică sau osmolalitate
                                          pH
                                       
                                       
                                          Proteine totale
                                          Glucoză
                                          Hematurie
                                       
                                    
                        
                              38.
                           
                           
                              În cazul în care există dovezi că principalul loc de depunere și retenție este în căile respiratorii inferioare (adică în alveole), lavajul bronhoalveolar (BAL) poate fi tehnica de elecție pentru analiza cantitativă a parametrilor doză-efect ipotetici, cu accentul pe alveolită, inflamație pulmonară și fosfolipidoză. Aceasta permite studierea adecvată a modificărilor doză-răspuns și a evoluțiilor în timp ale leziunilor alveolare. Lichidul BAL poate fi analizat pentru determinarea numărului total de leucocite și a formulei leucocitare, a proteinelor totale și a lactat dehidrogenazei. Alți parametri care pot fi luați în considerare sunt cei care indică leziuni lizozomale, fosfolipidoză, fibroză și inflamație iritantă sau alergică, putând include determinarea citokinelor/chemokinelor pro-inflamatoare. În general, măsurătorile BAL completează rezultatele examinărilor histopatologice, dar nu le pot înlocui. Îndrumări pentru modul de efectuare a lavajului pulmonar pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        PATOLOGIA MACROSCOPICĂ ȘI GREUTATEA ORGANELOR
                  
                              39.
                           
                           
                              Toate animalele testate, inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din rațiuni care țin de bunăstare animalelor, sunt supuse unei evacuări complete a sângelui (dacă este posibil) și unei autopsii. Se consemnează timpul între încheierea ultimei expuneri a fiecărui animal și sacrificarea sa. În cazul în care autopsia nu se poate efectua imediat ce s-a descoperit un animal mort, animalul este refrigerat (nu congelat) la temperaturi suficient de joase pentru a minimiza autoliza. Autopsiile se efectuează imediat ce este posibil, în mod normal după o zi sau două. Toate modificările patologice majore se consemnează pentru fiecare animal, cu o atenție specială pentru orice modificări ale căilor respiratorii.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Tabelul 2 prezintă organele și țesuturile care se păstrează într-un mediu corespunzător în timpul autopsiei, în vederea unor examene histopatologice. Conservarea organelor și țesuturilor [din paranteze] și a altor organe și țesuturi rămâne la aprecierea conducătorului studiului. Organele trecute cu caractere aldine se curăță și se cântăresc în stare umedă, cât mai repede posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea. Tiroida și epididimul se cântăresc doar dacă este necesar, deoarece artefactele în urma curățării pot împiedica evaluarea histopatologică. Țesuturile și organele se fixează în soluție de formol de 10 % tamponat sau în alt fixator adecvat, imediat după autopsie și la nu mai puțin de 24-48 de ore înainte de curățare, în funcție de fixatorul folosit.
                              
                                 Tabelul 2
                              
                              
                                 Organe și țesuturi conservate în cursul autopsiei
                              
                              
                                 Glande suprarenale
                              
                              Măduvă osoasă (și/sau aspirat proaspăt)
                              
                                 Creier (inclusiv secțiuni din creierul mare, cerebel și punte)
                              [Ochi (retină, nerv optic) și pleoape]
                              
                                 Inimă
                              
                              
                                 Rinichi
                              
                              Laringe (3 niveluri, 1 nivel pentru a include baza epiglotei)
                              
                                 Ficat
                              
                              
                                 Plămân (toți lobii la un nivel, inclusiv bronhiile principale)
                              Noduli limfatici din zona hilusului pulmonar, în special în cazul substanțelor chimice testate cu particule slab solubile. Pentru examinări și studii mai aprofundate de natură imunologică, se pot lua în considerare noduli limfatici suplimentari, de exemplu cei din regiunile mediastinale, cervicale/submandibulare și/sau auriculare.
                              Țesuturi nazo-faringiene (minimum 4 niveluri; 1 nivel include ductul nazo-faringian și țesutul limfoid asociat mucoasei nazale (NALT)
                              Esofag
                              [Bulb olfactiv]
                              Ovare
                              Vezicule seminale
                              Măduva spinării (cervicală, toracică mediană și lombară)
                              
                                 Splină
                              
                              Stomac
                              
                                 Testicule
                              
                              
                                 Timus
                              
                              Tiroidă
                              Trahee (minimum 2 niveluri, inclusiv o secțiune longitudinală prin carină și o secțiune transversală)
                              [Vezica urinară]
                              Uter
                              Toate leziunile macroscopice
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Plămânii se prelevează în stare intactă, se cântăresc și se tratează cu un fixator adecvat la o presiune de 20-30 cm coloană de apă, pentru a asigura conservarea structurii pulmonare (5). Secțiunile se colectează pentru toți lobii la un nivel, inclusiv bronhiile principale, dar în cazul în care se efectuează lavajul pulmonar, lobul nelavat se secționează pe trei niveluri (fără secțiuni seriale).
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Se examinează cel puțin 4 niveluri de țesuturi nazo-faringiene, dintre care unul include ductul nazo-faringian, (5, 6, 7, 8, 9), pentru a permite examinarea adecvată a epiteliului scuamos, tranzițional (respirator neciliat), respirator (respirator ciliat) și olfactiv, precum și a țesutului limfatic de drenare (NALT; 10, 11). Se examinează trei niveluri ale laringelui, iar unul dintre aceste niveluri trebuie să includă baza epiglotei (12). Se examinează cel puțin trei niveluri ale traheei, inclusiv o secțiune longitudinală prin carina de la bifurcarea bronhiilor extrapulmonare și o secțiune transversală.
                           
                        EXAMENUL HISTOPATOLOGIC
                  
                              43.
                           
                           
                              Se efectuează o evaluare histopatologică a tuturor organelor și țesuturilor enumerate în tabelul 2 pentru grupurile martor și grupurile de concentrație ridicată și pentru toate animalele care mor sau sunt sacrificare în cursul studiului. Se acordă o atenție specială căilor respiratorii, organelor-țintă și leziunilor macroscopice. Organele și țesuturile care prezintă leziuni în grupul de concentrație ridicată se examinează la toate grupurile Conducătorul studiului poate alege să efectueze examenele histopatologice pentru grupuri suplimentare, pentru a demonstra o relație clară între concentrație și răspuns. Atunci când se folosește un grup satelit (de reversibilitate), trebuie să se efectueze un examen histopatologic al țesuturilor și organelor la s-au identificat efecte în grupurile tratate. În cazul în care intervin excesiv de multe decese premature sau alte probleme în grupul cu expunere ridicată, care compromit semnificația datelor, se examinează histopatologic următorul nivel de concentrație inferioară. Se încearcă o corelare a observațiilor macroscopice cu rezultatele microscopice.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Trebuie să se furnizeze date individuale despre animale referitoare la greutatea corporală, consumul de hrană, patologia clinică, patologia macroscopică, greutatea organelor și examenul histopatologic. Datele privind observațiile clinice sunt rezumate în formă tabelară, pentru fiecare grup testat prezentându-se numărul de animale utilizate, numărul de animale care au manifestat semne specifice de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate din rațiuni umane, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluția în timp și reversibilitatea efectelor toxice și constatările autopsiei. Toate rezultatele cantitative și incidentale se evaluează printr-o metodă statistică adecvată. Se poate folosi orice metodă statistică acceptată, iar metodele statistice și datele care urmează să fie analizate se aleg în etapa de concepție a studiului.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații, după caz:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animalele testate și îngrijirea lor
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea condițiilor de ținere în cuști, printre care: numărul (sau modificarea numărului) de animale pe fiecare cușcă, materialul pentru așternut, temperatura ambiantă și umiditatea relativă, perioada de iluminat și identificarea regimului alimentar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      specia/sușa utilizată și justificarea pentru utilizarea altor animale decât șobolanul. Se prezintă sursa și datele anterioare în cazul în care provin de la animale expuse la condiții similare de expunere, adăpost și privare de hrană;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, vârsta și sexul animalelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de randomizare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea tuturor condițiilor dinainte de testare, inclusiv regimul alimentar, carantina și tratamentul unor boli.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritatea și, dacă este cazul, proprietăți fizico-chimice (inclusiv izomerizarea);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare și numărul din registrul CAS, dacă este cunoscut.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea utilizării și alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date istorice sau concomitente care demonstrează că vehiculul nu interferează cu rezultatul studiului.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Incinta de inhalare
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea incintei de inhalare, inclusiv volumul și o diagramă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa și descrierea echipamentului folosit pentru expunerea animalelor precum și generarea atmosferei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      echipamentul pentru măsurarea temperaturii, umidității, granulometriei și concentrației efective;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa de aer și sistemul folosit pentru condiționare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele folosite pentru calibrarea echipamentului, pentru a asigura o atmosferă de testare omogenă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diferența de presiune (pozitivă și negativă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orificiile de expunere pentru fiecare incintă (pentru expunere doar în zona nasului); amplasarea animalelor în sistem (pentru expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabilitatea atmosferei de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      amplasarea senzorilor de temperatură și umiditate și prelevarea probelor din atmosfera de testare din incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tratarea aerului introdus/extras.
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      debitele de aer, debitul de aer/orificiu de expunere (doar în zona nasului) sau numărul de animale/incintă (pentru expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare (t95);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul modificărilor volumetrice pe oră;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dispozitive de măsurare (după caz).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Datele privind expunerea
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii concentrației-țintă în studiul principal;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile nominale (masa totală a substanței chimice testate generate în incinta de inhalare împărțită la volumul de aer vehiculat prin incintă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile efective ale substanței chimice testate, din probe prelevate din zona de respirație a animalelor; pentru amestecuri care generează forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli), fiecare poate fi analizată separat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate concentrațiile în aer trebuie să fie consemnate în unități de masă (de exemplu, mg/l, mg/m3 etc.), mai degrabă decât în unități de volum (de exemplu, ppm, ppb etc.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuția granulometrică, diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) și abaterea standard geometrică (σg), inclusiv metodele pentru calcularea lor. Trebuie să se consemneze analizele granulometrice individuale.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaliile preparării substanței chimice testate, inclusiv detalii privind orice proceduri folosite pentru a reduce dimensiunea particulelor de materiale solide sau pentru a prepara soluții ale substanței chimice testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea (preferabil incluzând o diagramă) a echipamentului folosit pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la atmosfera de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind echipamentul utilizat pentru monitorizarea temperaturii incintei, umidității și debitului de aer prin incintă (adică realizarea unei curbe de calibrare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind echipamentul utilizat pentru prelevarea probelor pentru determinarea concentrației în incintă și a distribuției granulometrice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind metoda de analiză chimică folosită și validarea metodei (inclusiv eficiența recuperării substanței chimice testate din mediul de prelevare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de randomizare în evaluarea animalelor din grupurile de testare și martor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului alimentar, sursa de apă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea pentru selectarea concentrațiilor de testare.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a temperaturii, umidității și debitului de aer în incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea tabelară a datelor de concentrație nominală și efectivă în incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea tabelară a datelor privind dimensiunea particulelor, inclusiv a datelor privind colectarea probelor analitice, distribuția granulometrică și calcularea DAMM și σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea tabelară a datelor privind răspunsul și nivelul de concentrație la fiecare animal (adică animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea și durata efectelor);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea tabelară a greutății animalelor individuale;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea tabelară a consumului de hrană;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea tabelară a datelor de patologie clinică;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea tabelară a celorlalți parametri măsurați.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Discutarea și interpretarea rezultatelor
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie acordată o atenție specială descrierii metodelor folosite pentru satisfacerea criteriilor acestei metode de testare, de exemplu concentrația-limită sau granulometria;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inhalabilitatea particulelor trebuie să fie abordată în perspectiva rezultatelor generale, în special în cazul în care nu se pot îndeplini criteriile privind granulometria;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      în evaluarea de ansamblu a studiului trebuie să se includă coerența metodelor folosite pentru a determina concentrațiile nominale și efective și relația între concentrația efectivă și concentrația nominală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se studieze cauza probabilă a morții și modul predominant de acțiune (sistemic sau local);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se prezintă o explicație în cazul în care a fost necesară eutanasierea animalelor cu dureri sau care prezentau semne de suferință gravă și prelungită, pe baza criteriilor din Ghidul OCDE privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (3).
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se identifice organul sau organele-țintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se determine NOAEL și LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1981), Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Whalan J.E. și Redden J.C. (1994), Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Dungworth D.L., Tyler W.S., Plopper C.E. (1985), Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Young J.T. (1981), Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Harkema J.R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A., van Slootweg P.J., Feron V.J. (1994), Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. În: Waalkes M.P. și Ward J.M. (eds.), Carcinogenesis, Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Mery S., Gross E.A., Joyner D.R., Godo M., Morgan K.T. (1994), Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice, Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992), The role of nasopharyngeal lymphoid tissue, Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003), Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue, Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Lewis D.J. (1981), Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1).
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚIE
                     Substanță chimică testată: Orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  ”
            
                  5.
               
               
                  Capitolele B.29 și B.30 se înlocuiesc cu următorul text:
                  „B.29.   TOXICITATEA SUBACUTĂ PRIN INHALARE: STUDIU DE 90 DE ZILE
                  
                  REZUMAT
                  Această metodă de testare revizuită B.29 a fost concepută pentru caracterizarea completă a toxicității substanței chimice testate prin calea de inhalare în urma expunerii repetate pe o perioadă limitată (90 de zile), precum și pentru a furniza date pentru evaluările cantitative ale riscului prin inhalare. Grupuri de minim 10 masculi și 10 femele de rozătoare sunt expuse câte 6 ore pe zi timp de 90 de zile (13 săptămâni) la: (a) substanța chimică testată la trei sau mai multe niveluri de concentrație; (b) aer filtrat (grup martor negativ); și/sau (c) vehicul (grup martor pentru vehicul). În general, animalele sunt expuse 5 zile pe săptămână, dar este permisă și expunerea timp de 7 zile pe săptămână. Masculii și femelele se testează întotdeauna, dar pot fi supuși unor niveluri de concentrație diferite dacă se cunoaște că un sex este mai receptiv la o anumită substanță chimică testată. Această metodă permite conducătorului studiului flexibilitatea de a include grupuri satelit (de reversibilitate), lavajul bronhoalveolar (BAL), teste neurologice și evaluări suplimentare clinice chimice testate.
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 413 (2009) a OCDE. Versiunea originală a Orientării 413 originale privind testarea subcronică a fost adoptată în 1981 (1). Această metodă de testare B.29 [ca echivalent al variantei revizuite a Orientării 413 (2009)] a fost actualizată pentru a reflecta nivelul științific și pentru a satisface cerințele de reglementare curente și viitoare.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Studiile de toxicitate subcronică prin inhalare se folosesc, în principal, pentru determinarea concentrațiilor de reglementare pentru evaluarea riscului pentru lucrători în cadru ocupațional. De asemenea, ele sunt utilizate pentru evaluarea riscurilor umane în domeniul rezidențial, de transport și de mediu. Această metodă permite caracterizarea efectelor adverse în urma expunerii zilnice repetate, prin inhalarea substanței chimice testate timp de 90 de zile (aproximativ 10 % din durata de viață a unui șobolan). Datele obținute din studii de toxicitate subcronică prin inhalare se pot folosi pentru evaluări cantitative ale riscului și pentru alegerea concentrațiilor pentru studii cronice. Această metodă nu este destinată în mod specific testării nanomaterialelor. Definițiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la sfârșitul acestui capitol și în Ghidul 39 (2).
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              3.
                           
                           
                              Toate informațiile disponibile privind substanța chimică testată trebuie luate în considerare de laboratorul de testare înainte de efectuarea studiului, pentru îmbunătățirea calității studiului și minimizarea utilizării animalelor. Informațiile care pot contribui la selectarea celor mai adecvate concentrații de testare corespunzătoare includ: identitatea, structura chimică și proprietățile fizico-chimie ale substanței chimice testate; rezultatele oricăror teste de toxicitate in vitro sau in vivo; utilizări anticipate și potențialul de expunere umană; date (Q)SAR disponibile și date toxicologice privind substanțe cu structură apropiată; și date rezultate din testarea toxicității acute prin inhalare. În cazul în care în cursul studiului se anticipează sau se observă neurotoxicitatea, conducătorul studiului poate alege să includă și evaluări adecvate, de exemplu un set de observații funcționale (FOB) și măsurarea activității motorii. Deși momentele expunerii în funcție de examinările specifice pot fi critice, desfășurarea acestor activități suplimentare nu trebuie să afecteze protocolul studiului de bază.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Diluțiile substanțelor corozive sau iritante testate pot fi testate la concentrații care generează gradul dorit de toxicitate. Vă rugăm să consultați Ghidul 39 (2) pentru informații suplimentare. La expunerea animalelor la aceste materiale, concentrațiile vizate trebuie să fie suficient de mici pentru a nu induce durere sau suferință accentuată, dar totuși suficiente pentru a extinde curba concentrație-răspuns la niveluri care ating obiectivul de reglementare și științific al testului. Aceste concentrații sunt selectate de la caz la caz, preferabil pe baza unui studiu de stabilire a intervalului, conceput corespunzător, care furnizează informații privind efectul critic, pragul de iritare și momentul apariției manifestărilor (a se vedea punctele 11-13). Trebuie să se prezinte justificarea pentru selectarea concentrației.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferință gravă și prelungită trebuie să fie eutanasiate. Animalele muribunde sunt considerate în același mod ca și animalele care mor în cursul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau expuse unor suferințe intense și indicațiile pentru recunoașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul unui ghid OCDE privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (3).
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              Se utilizează rozătoare adulte, tinere, sănătoase, provenind din sușele folosite în mod obișnuit în laboratoare. Specia preferată este șobolanul. Dacă se utilizează alte specii, decizia trebuie să fie motivată.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              7.
                           
                           
                              Femelele trebuie să fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua randomizării, animalele trebuie să fie adulți tineri, în vârstă de 7 până la 9 săptămâni. Greutățile corporale trebuie să fie în intervalul de ± 20 % față de greutatea medie pentru fiecare sex. Animalele sunt selectate la întâmplare, marcate pentru a permite identificarea individuală și ținute în cuștile lor cel puțin 5 zile înainte de începerea testului, pentru a permite aclimatizarea lor la condițiile de laborator.
                           
                        
                     Îngrijirea animalelor
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Animalele sunt identificate individual, preferabil cu transpondere subcutanate, pentru a facilita observarea și a evita confuziile. Temperatura camerei în care sunt ținute animalele folosite în scopuri experimentale trebuie să fie de 22 ± 3 °C. Umiditatea relativă este menținută, în mod ideal, în intervalul 30-70 %, deși, acest lucru ar putea să nu fie posibil în cazul utilizării apei ca vehicul. În general, înainte și după expuneri animalele sunt închise în cuști, în grupuri, în funcție de sex și concentrație, dar numărul de animale dintr-o cușcă nu trebuie să perturbe observarea clară a fiecărui animal și trebuie să minimizeze pierderile cauzate de canibalism și lupte. În cazul în care animalele sunt expuse doar în zona nasului, poate fi necesară aclimatizarea lor la tuburile de imobilizare. Tuburile de imobilizare nu trebuie să producă asupra animalului un stres excesiv fizic, termic sau prin imobilizare. Fixarea poate afecta puncte finale fiziologice, cum ar fi temperatura corporală (hipertermie) și/sau debitul respirator pe minut. În cazul în care sunt disponibile date generice pentru a arăta că nu se produc asemenea modificări în vreo măsură considerabilă, nu este necesară adaptarea prealabilă la tuburile de imobilizare. Animalele expuse unor aerosoli cu întregul corp sunt plasate individual în timpul expunerii, pentru a preveni filtrarea aerosolului testat prin blana celorlalte animale din cușcă. Se pot folosi regimuri alimentare clasice și certificate utilizate în laboratoare, cu excepția perioadei de expunere iar apa potabilă de la rețeaua municipală se poate furniza în mod nelimitat. Iluminatul trebuie să fie artificial, cu o succesiune de 12 ore de lumină/12 ore de întuneric.
                           
                        
                     Incintele de inhalare
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              La selectarea unei incinte de inhalare se iau în considerare natura substanței chimice testate și obiectivul testului. Modul de expunere preferat este doar în zona nasului (expresie care include expunerea doar în zona capului, a nasului sau a botului). În general, expunerea doar în zona nasului este preferată pentru studii ale aerosolilor lichizi sau solizi și pentru vapori care pot condensa pentru a forma aerosoli. Obiectivele speciale ale studiului pot fi atinse mai bine prin utilizarea unui mod de expunere prin intermediul întregului corp, dar acest lucru trebuie să fie justificat în raportul de studiu. Pentru a asigura stabilitatea atmosferei la utilizarea unei incinte pentru întregul corp, volumul total al animalelor testate nu trebuie să depășească 5 % din volumul incintei. Principiile tehnicilor de expunere doar în zona nasului și a întregului corp, precum și avantajele sau dezavantajele lor particulare sunt descrise în Ghidul 39 (2).
                           
                        STUDII DE TOXICITATE
                  
                     Concentrațiile-limită
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Spre deosebire de studiile de toxicitate acută, în studiile de toxicitate subcronică prin inhalare nu sunt definite limite de concentrație. Concentrația testată maximă trebuie să țină seama de: 1. concentrația maximă realizabilă; 2. nivelul de expunere umană în «cele mai nefavorabile condiții»; 3. necesitatea de a menține un aport adecvat de oxigen; și/sau 4. considerații care țin de bunăstarea animalelor. În absența unor limite bazate pe date, se pot utiliza limitele acute din Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (13) (până la o concentrație maximă de 5 mg/l pentru aerosoli, 20 mg/l pentru vapori și 20 000 ppm pentru gaze); a se vedea Ghidul 39 (2). În cazul în care este necesar să se depășească aceste limite la testarea gazelor sau substanțelor chimice testate foarte volatile (de exemplu, agenți frigorifici), trebuie să se prezinte justificarea. Concentrația-limită trebuie să determine toxicitatea neechivocă, fără a induce un stres excesiv pentru animale și fără a le afecta longevitatea (3).
                           
                        
                     Studiul de stabilire a intervalului
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Înainte de a începe studiul principal, poate fi necesar un studiu de stabilire a intervalului. Un studiu de stabilire a intervalului este mai cuprinzător decât un studiu de observare, deoarece nu se limitează la alegerea concentrației. Cunoștințele dobândite în urma unui studiu de stabilire a intervalului pot conduce la un studiu principal reușit. Un studiu de stabilire a intervalului poate, de exemplu, să furnizeze informații tehnice privind metodele analitice, granulometrie, descoperirea mecanismelor toxice, date de patologie clinică și histopatologice și estimări asupra posibilelor concentrații NOAEL și MTC în studiul principal. Conducătorul studiului poate alege să folosească studiul de stabilire a intervalului pentru identificarea pragului de iritare a căilor respiratorii (de exemplu, prin examenul histopatologic al căilor respiratorii, testarea funcției pulmonare sau lavaj bronhoalveolar), a concentrației superioare care este tolerată de animale fără a provoca un stres excesiv și a parametrilor care vor caracteriza cel mai bine toxicitatea unei substanțe chimice testate.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Într-un studiu de stabilire a intervalului se pot stabili unul sau mai multe niveluri de concentrație. În funcție de efectele alese, se expun trei până la șase masculi și trei până la șase femele la fiecare nivel de concentrație. Un studiu de stabilire a intervalului durează cel puțin 5 zile și, în general, nu mai mult de 28 de zile. Raportul de studiu trebuie să conțină justificarea alegerii concentrațiilor pentru studiul principal Obiectivul studiului principal este să demonstreze relația concentrație-răspuns pe baza efectului anticipat ca fiind cel mai sensibil Concentrația inferioară este, în mod ideal, o concentrație fără efect advers observabil iar concentrația superioară trebuie să determine toxicitatea neechivocă, fără a induce stres excesiv pentru animale și fără a le afecta longevitatea (3).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              La selectarea nivelurilor de concentrație pentru studiul de stabilire a intervalului, se folosesc toate informațiile disponibile, inclusiv relațiile structură-activitate și date pentru substanțe similare (a se vedea punctul 3). Un studiu de stabilire a intervalului poate confirma/infirma efectele considerate a fi cele mai sensibile din punct de vedere al mecanismului, de exemplu inhibarea colinesterazei de către fosfați organici, formarea methemoglobinei de către agenți toxici pentru eritrocite, hormonii tiroidieni (T3, T4) pentru agenții toxici față de tiroidă, proteinele, valoarea LDH sau neutrofilele în lavajul bronhoalveolar pentru particule puțin solubile nedăunătoare sau aerosoli iritanți pentru plămâni.
                           
                        
                     Studiul principal
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              În studiul principal de toxicitate subacută se folosesc, în general, trei niveluri de concentrație și grupuri martor negative (cu aer) și/sau cu vehicul studiate în paralel, după cum este necesar (a se vedea punctul 18). Toate datele disponibile sunt utilizate pentru a contribui la selectarea nivelurilor de expunere adecvate, inclusiv rezultatele studiilor de toxicitate sistemică, metabolism și cinetică (trebuie acordată o atenție specială evitării nivelurilor ridicate de concentrație care saturează procesele cinetice). Fiecare grup testat conține cel puțin 10 rozătoare masculi și 10 rozătoare femele expuse la substanța chimică testată timp de 6 ore pe zi, 5 zile pe săptămână, pe o perioadă de 13 săptămâni (durata totală a studiului trebuie să fie de cel puțin 90 de zile). Animalele pot fi expuse și 7 zile pe săptămână (de exemplu, la testarea produselor farmaceutice inhalate). În cazul în care se știe că un sex este mai receptiv la o anumită substanță chimică testată, sexele pot fi expuse la niveluri diferite de concentrație pentru optimizarea răspunsului la concentrație, așa cum se arată la punctul 15. Atunci când alte specii de rozătoare sunt expuse doar în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi ajustate pentru minimizarea suferinței specifice speciei. La utilizarea unei durate de expunere sub 6 ore/zi sau în cazul în care este necesar să se efectueze un studiu cu expunerea întregului corp pe o durată lungă (de exemplu, 22 de ore/zi), trebuie să se prezinte o justificare [a se vedea Ghidul 39 (2)]. Alimentarea se sistează în perioada expunerii, în afară de cazul în care expunerea depășește 6 ore. La expunerea la nivelul întregului corp se poate asigura apa.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Concentrațiile-țintă selectate trebuie să identifice organele-țintă și să demonstreze o relație clară concentrație-răspuns:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          nivelul de concentrație ridicat trebuie să inducă efecte toxice, dar să nu determine simptome persistente sau mortalitate, fapt ce ar preveni o evaluare semnificativă;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nivelurile de concentrație intermediare trebuie să fie administrate eșalonat, astfel încât efectele toxice să fie graduale între concentrația redusă și cea ridicată;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          nivelul de concentrație redusă trebuie să producă o toxicitate redusă sau să nu producă semne de toxicitate.
                                       
                                    
                        
                     Sacrificările pe parcursul studiului
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Dacă se prevede sacrificarea unui număr de animale pe parcursul studiului, acest număr se adaugă la total. Trebuie să se prezinte justificarea pentru recurgerea la sacrificări pe parcursul studiului, iar analizele statistice le vor lua în considerare în mod corespunzător.
                           
                        
                     Studiul satelit (de reversibilitate)
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Un studiu satelit (de reversibilitate) se poate folosi pentru a observa reversibilitatea, persistența sau apariția cu întârziere a toxicității pentru o perioadă post-tratament de lungime adecvată, dar nu mai mare de 14 zile. Grupurile satelit (de reversibilitate) constau în 10 masculi și 10 femele expuse în paralel cu animalele folosite în scopuri experimentale din studiul principal. Grupurile din studiile satelit (de reversibilitate) sunt expuse la substanța chimică testată la nivelul maxim de concentrație și trebuie să existe grupuri martor cu aer și/sau vehicul studiate în paralel, după caz (a se vedea punctul 18).
                           
                        
                     Animalele din grupul martor
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Animalele din grupul martor negativ (cu aer) studiat în paralel se manipulează într-o manieră identică cu cele din grupul de testare, cu excepția faptului că sunt expuse la aer filtrat în locul substanței chimice testate. În cazul în care se folosește apa sau altă substanță pentru generarea atmosferei de testare, trebuie să se includă în studiu un grup martor pentru vehicul, în locul grupului martor negativ (cu aer). Când este posibil, se folosește apa ca vehicul. Când se folosește apa ca vehicul, animalele din grupul martor sunt expuse la aer cu aceeași umiditate relativă ca și grupurile expuse. Alegerea unui vehicul adecvat se bazează pe un studiu preliminar corespunzător sau pe date anterioare. În cazul în care nu se cunoaște bine toxicitatea unui vehicul, conducătorul studiului poate alege să folosească atât un grup martor negativ (aer) cât și un martor pentru vehicul, dar această abordare este categoric descurajată. În cazul în care datele anterioare arată că vehiculul nu este toxic, nu este necesar un grup martor negativ (aer) și se folosește doar un grup martor pentru vehicul. În cazul în care un studiu preliminar al unei substanțe chimice testate formulate într-un vehicul nu prezintă nicio toxicitate, rezultă că vehiculul nu este toxic la concentrația testată și se va utiliza acest control pentru vehicul.
                           
                        CONDIȚII DE EXPUNERE
                  
                     Administrarea concentrațiilor
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Animalele sunt expuse la substanța chimică testată sub formă de gaz, vapori, aerosoli sau un amestec al acestora. Starea fizică testată depinde de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate, de concentrația aleasă și/sau forma fizică cu cea mai mare probabilitate de prezență în timpul manipulării și utilizării substanței chimice testate. Substanțele chimice testate higroscopice și reactive din punct de vedere chimic trebuie să fie testate în condiții de aer uscat. Trebuie avut grijă să se evite generarea unor concentrații explozive. Materialele sub formă de particule pot fi supuse unor procese mecanice pentru reducerea dimensiunii particulelor. Orientări suplimentare sunt prezentate în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                     Distribuția granulometrică
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Granulometria trebuie să fie efectuată pentru toți aerosolii și vaporii care pot condensa pentru a forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor regiunilor relevante ale căilor respiratorii, se recomandă aerosoli cu diametru aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) de la 1 la 3 μm, cu o abatere standard geometrică (σg) în intervalul 1,5-3,0 (4). Trebuie depus un efort rezonabil pentru a satisface acest standard, dar în cazul în care acest lucru nu se poate realiza trebuie să se prezinte o apreciere bazată pe experiență. De exemplu, particulele de vapori metalici vor fi mai mici decât acest standard, iar particulele cu sarcină electrică și fibrele pot fi mai mari.
                           
                        
                     Prepararea substanței chimice testate într-un vehicul
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              În mod ideal, substanța chimică se testează fără vehicul. În cazul în care este necesar să se folosească un vehicul pentru a genera o concentrație și o dimensiune a particulelor corespunzătoare pentru substanța chimică testată, se preferă apa. Întotdeauna când o substanță chimică testată este dizolvată într-un vehicul, trebuie să se demonstreze stabilitatea sa.
                           
                        MONITORIZAREA CONDIȚIILOR DE EXPUNERE
                  
                     Debitul de aer în incintă
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Debitul de aer prin incinta de expunere este controlat cu atenție, monitorizat continuu și înregistrat cel puțin o dată pe oră în timpul fiecărei expuneri. Monitorizarea în timp real a concentrației (sau stabilității în timp a) atmosferei de testare este un indicator integral al tuturor parametrilor dinamici și oferă un mijloc indirect de control al parametrilor dinamici relevanți pentru inhalare. În cazul în care concentrația este monitorizată în timp real, frecvența măsurătorii debitelor de aer se poate reduce la o singură măsurătoare pentru fiecare expunere și fiecare zi. Trebuie acordată o atenție specială pentru evitarea reinhalării în incinte pentru expunere doar în zona nasului. Concentrația de oxigen trebuie să fie de minimum 19 %, iar concentrația de dioxid de carbon nu trebuie să depășească 1 %. În cazul în care există motive să se considere că nu se poate atinge acest standard, trebuie măsurate concentrațiile de oxigen și dioxid de carbon. În cazul în care măsurătorile în prima zi de expunere arată că aceste gaze sunt la niveluri corespunzătoare, nu mai sunt necesare alte măsurători.
                           
                        
                     Temperatura și umiditatea relativă în incintă
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Temperatura incintei trebuie să se mențină la 22 ± 3 °C. Umiditatea relativă în zona de respirație a animalelor, pentru expunerea în zona nasului și a întregului corp, trebuie să fie monitorizată și înregistrată orar în timpul fiecărei expuneri, dacă este posibil. Este preferabil ca umiditatea relativă să fie menținută în intervalul 30-70 % dar acest lucru poate fi irealizabil (de exemplu, la testarea amestecurilor apoase) sau imposibil de măsurat din cauza interferenței substanței chimice testate cu metoda de testare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația nominală
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Când este posibil, trebuie să se calculeze și să se înregistreze concentrația nominală în incinta de expunere. Concentrația nominală este masa substanței chimice testate generate împărțită la volumul total de aer vehiculat prin sistemul incintei. Concentrația nominală nu este folosită pentru a caracteriza expunerea animalelor, dar o comparație între concentrația nominală și concentrația efectivă oferă o indicație privind eficiența de generare a sistemului de testare și astfel se poate folosi pentru a descoperi probleme legate de generare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația efectivă
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Concentrația efectivă este concentrația substanței chimice testate în zona de respirație a animalelor într-o incintă de inhalare. Concentrațiile efective se pot obține prin metode specifice (de exemplu, prin prelevare directă, metode bazate pe adsorbție sau reacții chimice și caracterizare analitică ulterioară) sau prin metode nespecifice, cum ar fi analiza gravimetrică a filtrului. Utilizarea analizei gravimetrice este acceptabilă doar pentru aerosoli cu component pulverulent unic sau aerosoli cu lichide cu volatilitate redusă și trebuie susținută printr-un studiu preliminar privind caracterizările specifice ale substanței chimice testate. Concentrația aerosolilor cu pulberi multicomponent se poate determina tot prin analiză gravimetrică. Dar, în acest caz sunt necesare date analitice care să demonstreze similaritatea între compoziția materialului antrenat de aer și cea a materialului inițial. În cazul în care nu sunt disponibile aceste informații, poate fi necesară reanalizarea la intervale regulate a substanței chimice testate (în mod ideal, în starea sa în suspensie în aer). Pentru agenții sub formă de aerosoli care se pot evapora sau care pot sublima, trebuie să se demonstreze că toate fazele au fost colectate prin metoda aleasă.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Trebuie să se folosească un lot de substanță chimică testată pe întreaga durată a studiului, dacă este posibil, iar proba testată să fie păstrată în condiții care îi asigură puritatea, omogenitatea și stabilitatea. Înainte de începerea studiului, trebuie să existe o caracterizare a substanței chimice testate, inclusiv puritatea sa și, dacă este realizabil din punct de vedere tehnic, identitatea și cantitățile de contaminanți și impurități identificate. Aceasta se poate demonstra prin următoarele date, dar fără limitare la acestea: timpul de retenție și zona de vârf relativ, masa moleculară determinată prin analize de spectroscopie de masă sau cromatografie în stare gazoasă sau alte estimări. Deși identitatea probei de testare nu constituie responsabilitatea laboratorului care efectuează testarea, o atitudine prudentă pentru acel laborator ar fi să confirme caracterizarea solicitantului, cel puțin în mod limitat (de exemplu, culoare, natura fizică etc.).
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Atmosfera de expunere este menținută cât mai constantă posibil. Pentru a demonstra stabilitatea condițiilor de expunere se poate utiliza un dispozitiv de monitorizare în timp real, de exemplu un fotometru pentru aerosoli sau un analizor de carbon total pentru vapori. Concentrația efectivă în incintă se măsoară de minimum 3 ori în timpul fiecărei zile de expunere pentru fiecare nivel de expunere. În cazul în care acest lucru nu este realizabil din cauza debitelor limitate de aer sau a concentrațiilor reduse, se poate preleva o probă pe parcursul întregii perioade de expunere. În mod ideal, această probă se prelevează apoi pe întreaga perioadă de expunere. Probele individuale de concentrație din incintă nu trebuie să se abată de la concentrația medie cu mai mult de ± 10 % pentru gaze și vapori sau ± 20 % pentru aerosolii cu lichide sau solide. Se calculează și se înregistrează timpul necesar pentru echilibrarea incintei (t95). Durata unei expuneri acoperă timpul în care este generată substanța chimică testată. Aceasta ia în considerare timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incintă (t95) și pentru descompunere. Îndrumări pentru estimarea t95 pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Pentru amestecurile foarte complexe constând în gaze/vapori și aerosoli (de exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice testate propulsate de produse/dispozitive de utilizare finală cu acționare specifică), fiecare fază se poate comporta diferit într-o incintă de inhalare. Prin urmare, se selectează cel puțin o substanță indicatoare (analit), de obicei substanța activă principală din amestec, din fiecare fază (gaz/vapori și aerosol). În cazul în care substanța chimică testată este un amestec, trebuie să se raporteze concentrația analitică pentru amestecul total și nu doar pentru ingredientul activ sau substanța indicatoare (analit). Informații suplimentare privind concentrațiile efective pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        
                     Substanța chimică testată: distribuția granulometrică
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Granulometria aerosolilor trebuie să fie efectuată cel puțin săptămânal pentru fiecare nivel de concentrație, folosind un impactor în cascadă sau un instrument alternativ, de exemplu un aparat aerodinamic de granulometrie (APS). În cazul în care se obține o echivalență a rezultatelor obținute cu impactorul în cascadă și un instrument alternativ, se poate folosi instrumentul alternativ pentru întregul studiu.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Un al doilea dispozitiv, de exemplu un filtru gravimetric sau un epurator/barbotor de gaze trebuie să se folosească în paralel cu primul instrument, pentru a confirma eficiența colectării la primul instrument. Concentrația masică obținută prin analiza granulometriei trebuie să fie în concordanță rezonabilă cu concentrația masică obținută prin analiza filtrului [a se vedea Ghidul 39 (2)]. În cazul în care se poate demonstra echivalența tuturor concentrațiilor în faza inițială a studiului, se pot omite alte măsurători de confirmare. Pentru motive legate de bunăstarea animalelor, se iau măsuri pentru a minimiza datele neconcludente care pot duce la necesitatea de repetare a unui studiu.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Granulometria se efectuează pentru vapori atunci există vreo posibilitate ca prin condensarea vaporilor să se ajungă la formarea unui aerosol sau dacă sunt detectate particule între atmosferă cu vapori cu potențial de formare a unor faze mixte.
                           
                        OBSERVAȚII
                  
                              32.
                           
                           
                              Observarea clinică a animalelor trebuie să se facă înainte, în timpul și ulterior perioadei de expunere. Poate fi indicată observarea mai frecventă în funcție de răspunsul animalelor în timpul expunerii. În cazul în care observarea animalelor este împiedicată de utilizarea tuburilor de imobilizare, incintelor slab iluminate pentru expunerea întregului corp sau atmosferelor opace, animalele se observă cu atenție după expunere. Prin observarea înainte de expunerea din ziua următoare se poate evalua reversibilitatea sau exacerbarea efectelor toxice.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Toate observațiile se consemnează în evidențele individuale pentru fiecare animal. În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morții se înregistrează cât mai exact posibil.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Observațiile privind animalele în cușcă trebuie să includă modificările pielii și blănii, ochilor și mucoaselor; modificarea sistemului respirator și sistemului circulator; modificările sistemului nervos; modificări în activitatea somato-motorie și modelele de comportament. Se va acorda o atenție specială observării tremorului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului și comei. Măsurarea temperaturii rectale poate furniza dovezi privind bradipneea reflexă sau hipo/hipertermia asociate cu tratamentul sau cu privarea de libertate. În protocolul studiului pot fi incluse evaluări suplimentare, de exemplu privind cinetica, biomonitorizarea, funcționarea plămânilor, retenția unor materiale slab solubile care se acumulează în țesutul pulmonar și modificările de comportament.
                           
                        GREUTATEA CORPORALĂ
                  
                              35.
                           
                           
                              Greutatea animalelor individuale se consemnează cu puțin înaintea primei expuneri (ziua 0), apoi de două ori pe săptămână (de exemplu: vineri și luni, pentru a evidenția recuperarea după un weekend fără expunere sau la un interval de timp pentru a permite evaluarea toxicității sistemice) și la momentul morții sau eutanasierii. În cazul în care nu există efecte în primele 4 săptămâni, greutățile corporale pot fi măsurate săptămânal pe restul duratei studiului. În cazul în care se folosesc animale din grupuri satelit (cu reversibilitate), acestea se cântăresc în continuare săptămânal pe întreaga perioadă de recuperare. La încheierea studiului, toate animalele sunt cântărite cu puțin înainte de sacrificare, pentru a permite calcularea corectă a rapoartelor între greutatea organelor și cea corporală.
                           
                        CONSUMUL DE HRANĂ ȘI APĂ
                  
                              36.
                           
                           
                              Consumul de hrană trebuie să fie măsurat săptămânal. De asemenea, se poate măsura și consumul de apă.
                           
                        PATOLOGIA CLINICĂ
                  
                              37.
                           
                           
                              Evaluările de patologie clinică trebuie să fie efectuate pentru toate animalele, inclusiv pentru animalele din grupul martor și grupul satelit (de reversibilitate), atunci când sunt sacrificate. Se consemnează intervalul de timp între încetarea expunerii și recoltarea de sânge, în special dacă restabilirea efectului vizat este rapidă. Se recomandă prelevarea după expunere pentru acei parametri cu timp scurt de înjumătățire plasmatică (de exemplu, COHb, CHE și MetHb).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Tabelul 1 prezintă parametrii de patologie clinică necesari, în general, pentru toate studiile toxicologice. Nu este necesară efectuarea cu regularitate a analizei de urină, ci numai atunci când se consideră util, pe baza toxicității presupuse sau observate. Conducătorul studiului poate opta pentru evaluarea unor parametri suplimentari pentru o mai bună caracterizare a toxicității substanței chimice testate (de exemplu, colinesterază, lipide, hormoni, echilibrul acido-bazic, methemoglobina sau corpii Heinz, creatinkinaza, raportul mieloid/eritroid, troponinele, gazele din sângele arterial, dehidrogenaza lactică, sorbitol dehidrogenaza, glutamat dehidrogenaza și gama glutamil transpeptidaza).
                              
                                 Tabelul 1
                              
                              
                                 Parametri standard de patologie clinică
                              
                              
                                          Examen hematologic
                                       
                                    
                                          Număr de eritrocite
                                          Hematocrit
                                          Concentrația de hemoglobină
                                          Hemoglobina corpusculară medie
                                          Volumul corpuscular mediu
                                          Concentrația hemoglobinei corpusculare medii
                                          Reticulocite
                                       
                                       
                                          Număr total de leucocite
                                          Formulă leucocitară
                                          Număr de plachete
                                          Potențial de coagulare (selectați unul):
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timp de protrombină
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timp de coagulare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timp de tromboplastină parțial
                                                   
                                                
                                    
                                          Chimie clinică
                                       
                                    
                                          Glucoză (9)
                                          
                                          Colesterol total
                                          Trigliceride
                                          Azot ureic în sânge
                                          Bilirubină totală
                                          Creatinină
                                          Proteine totale
                                          Albumină
                                          Globulină
                                       
                                       
                                          Alanin aminotransferază
                                          Aspartat aminotransferază
                                          Fosfatază alcalină
                                          Potasiu
                                          Sodiu
                                          Calciu
                                          Fosfor
                                          Clor
                                       
                                    
                                          Analiza urinei (opțional)
                                       
                                    
                                          Aspect (culoare și turbiditate)
                                          Volum
                                          Greutate specifică sau osmolalitate
                                          pH
                                       
                                       
                                          Proteine totale
                                          Glucoză
                                          Hematurie
                                       
                                    
                        
                              39.
                           
                           
                              În cazul în care există dovezi că principalul loc de depunere și retenție este în căile respiratorii inferioare (adică alveolele), lavajul bronhoalveolar (BAL) poate fi tehnica de elecție pentru analiza cantitativă a parametrilor doză-efect ipotetici, cu accentul pe alveolită, inflamație pulmonară și fosfolipidoză. Aceasta permite studierea adecvată a modificărilor doză-răspuns și a evoluțiilor în timp ale leziunilor alveolare. Lichidul BAL poate fi analizat pentru determinarea nivelului total de leucocite și a formulei leucocitare, a proteinelor totale și a lactat dehidrogenazei. Alți parametri care pot fi luați în considerare sunt cei indicatori ai leziunilor lizozomale, fosfolipidozei, fibrozei și inflamației iritante sau alergice, putând include determinarea citokinelor/chemokinelor pro-inflamatoare. În general, măsurătorile BAL completează rezultatele examinărilor histopatologice, dar nu le pot înlocui. Îndrumări pentru modul de efectuare a lavajului pulmonar pot fi găsite în Ghidul 39 (2).
                           
                        EXAMENUL OFTALMOLOGIC
                  
                              40.
                           
                           
                              Cu ajutorul unui oftalmoscop sau unui dispozitiv echivalent, la toate animalele trebuie să se efectueze examinări oftalmologice ale fundului de ochi, mediului de refracție, irisului și conjunctivei, înainte de administrarea substanței chimice testate și pentru toate grupurile cu concentrație ridicată și grupurile martor la final. În cazul în care se constată modificări oculare, se vor examina toate animalele din celelalte grupuri, inclusiv din grupul satelit (de reversibilitate).
                           
                        PATOLOGIA MACROSCOPICĂ ȘI GREUTATEA ORGANELOR
                  
                              41.
                           
                           
                              Toate animalele testate, inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eliminate din studiu din rațiuni care țin de bunăstare animală, sunt supuse unei evacuări complete a sângelui (dacă este posibil) și unei autopsii. Se consemnează timpul între încheierea ultimei expuneri a fiecărui animal și sacrificarea sa. În cazul în care autopsia nu se poate efectua imediat ce a fost descoperit un animal mort, animalul este refrigerat (nu congelat) la temperaturi suficient de joase pentru a minimiza autoliza. Autopsiile se efectuează imediat ce este posibil, în mod normal după una sau două zile. Toate modificările patologice macroscopice trebuie să fie consemnate pentru fiecare animal, cu o atenție specială pentru orice modificări ale căilor respiratorii.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Tabelul 2 prezintă organele și țesuturile care se păstrează într-un mediu corespunzător în timpul autopsiei în vederea unor examene histopatologice. Conservarea organelor și țesuturilor încadrare în paranteze pătrate [ ] și a altor organe și țesuturi este la aprecierea conducătorului studiului. Organele trecute cu caractere aldine se curăță și cântăresc în stare umedă, cât mai repede posibil după disecție, pentru a se evita deshidratarea. Tiroida și epididimul se cântăresc doar dacă este necesar, deoarece artefactele în urma curățării pot împiedica evaluarea histopatologică. Țesuturile și organele sunt fixate în formol tamponat 10 % sau alt fixator adecvat, imediat după autopsie și nu mai puțin de 24-48 de ore înainte de curățare, în funcție de fixatorul folosit.
                              
                                 Tabelul 2
                              
                              
                                 Organe și țesuturi conservate în cursul autopsiei macroscopice
                              
                              
                                 Glande suprarenale
                              
                              Aortă
                              Măduva osoasă (și/sau aspirat proaspăt)
                              
                                 Creier (inclusiv secțiuni din creierul mare, cerebel și punte)
                              Cec
                              Colon
                              Duoden
                              [Epididim]
                              [Ochi (retină, nerv optic) și pleoape]
                              Femur și articulația genunchiului
                              Vezica biliară (în cazul în care este prezentă)
                              [glande Harder]
                              
                                 Inimă
                              
                              Ileon
                              Jejun
                              
                                 Rinichi
                              
                              [glande lacrimale (extraorbitale)]
                              Laringe (3 niveluri, inclusiv baza epiglotei)
                              
                                 Ficat
                              
                              
                                 Plămân (toți lobii la un nivel, inclusiv bronhiile principale)
                              Noduli limfatici din zona hilusului pulmonar, în special în cazul substanțelor chimice testate cu particule slab solubile. Pentru examinări și studii mai aprofundate de natură imunologică, pot fi luați în considerare noduli limfatici suplimentari, de exemplu cei din regiunile mediastinale, cervicale/submandibulare și/sau auriculare.
                              Noduli limfatici (distal față de punctul de intrare)
                              Glande mamare (la femele)
                              Mușchi (coapsă)
                              Țesuturi nazo-faringiene [minim 4 niveluri; un nivel include ductul nazo-faringian și țesutul limfoid asociat mucoasei nazale (NALT)]
                              Esofag
                              [Bulb olfactiv]
                              
                                 Ovare
                              
                              Pancreas
                              Glande paratiroide
                              Nerv periferic (sciatic sau tibial, preferabil aproape de mușchi)
                              Hipofiză
                              Prostată
                              Rect
                              Glande salivare
                              Vezicule seminale
                              Piele
                              Măduva spinării (cervicală, toracică mediană și lombară)
                              
                                 Splină
                              
                              Stern
                              Stomac
                              Dinți
                              
                                 Testicule
                              
                              
                                 Timus
                              
                              
                                 Tiroida
                              
                              [Limbă]
                              Trahee (cel puțin 2 niveluri, inclusiv o secțiune longitudinală prin carină și o secțiune transversală)
                              [Ureter]
                              [Uretră]
                              Vezica urinară
                              
                                 Uter
                              
                              Organe-țintă
                              Toate leziunile și formațiunile mari
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Plămânii se prelevează intacți, se cântăresc și se tratează cu un fixator adecvat la o presiune de 20-30 cm coloană de apă, pentru a asigura conservarea structurii pulmonare (5). Secțiunile sunt colectate pentru toți lobii la un nivel, inclusiv bronhiile principale, dar în cazul în care se efectuează lavajul pulmonar, lobul nelavat trebuie să fie secționat în trei niveluri (nu secțiuni seriale).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Se examinează minimum 4 niveluri de țesuturi nazo-faringiene, dintre care unul include ductul nazo-faringian (5) (6) (7) (8) (9), pentru a permite examinarea adecvată a epiteliului scuamos, tranzițional (respirator neciliat), respirator (respirator ciliat) și olfactiv și a țesutului limfatic de drenare (NALT) (10) (11). Se examinează trei niveluri ale laringelui, iar unul dintre aceste niveluri trebuie să includă baza epiglotei (12). Se examinează minimum trei niveluri ale traheii, inclusiv o secțiune longitudinală prin carina de la bifurcația bronhiilor extrapulmonare și o secțiune transversală.
                           
                        EXAMENUL HISTOPATOLOGIC
                  
                              45.
                           
                           
                              Se efectuează o evaluare histopatologică a tuturor organelor și țesuturilor enumerate în Tabelul 2 pentru grupurile martor și de concentrație ridicată și pentru toate animalele care mor sau sunt sacrificare în cursul studiului. Se acordă o atenție specială organelor căilor respiratorii, organelor-țintă și leziunilor macroscopice. Organele și țesuturile care prezintă leziuni în grupul de concentrație ridicată se examinează la toate grupurile Conducătorul studiului poate alege să efectueze evaluările histopatologice pentru grupuri suplimentare, pentru a demonstra o relație clară concentrație-răspuns. Atunci când se folosește un grup satelit (de reversibilitate), se efectuează un examen histopatologic al țesuturilor și organelor la care au fost identificate efecte în grupurile tratate. În cazul în care intervin excesiv de multe decese premature sau alte probleme în grupul cu expunere ridicată, compromițând semnificația datelor, se examinează histopatologic următorul nivel inferior de concentrație. Se încearcă o corelare a observațiilor macroscopice cu rezultatele microscopice.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Trebuie să se furnizeze date individuale despre animale referitoare la greutatea corporală, consumul de hrană, patologia clinică, patologia macroscopică, greutatea organelor și examenul histopatologic. Datele privind observațiile clinice sunt rezumate în formă tabelară, prezentând pentru fiecare grup testat numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne specifice de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate din motive umane, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere, evoluția în timp și reversibilitatea efectelor toxice și constatările autopsiei. Toate rezultatele cantitative și incidentale se evaluează printr-o metodă statistică adecvată. Se poate folosi orice metodă statistică acceptată, iar metodele statistice și datele care urmează să fie analizate se aleg în etapa în care este conceput studiul.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Raportul de testare include următoarele informații, după caz:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animalele testate și îngrijirea lor:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea condițiilor de ținere în cuști, inclusiv: numărul (sau modificarea numărului) de animale pe fiecare cușcă, materialul pentru așternut, temperatura ambiantă și umiditatea relativă, perioada de iluminat și identificarea regimului alimentar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      specia/sușa utilizată și justificarea pentru utilizarea altor animale decât șobolanul. Se prezintă sursa și datele anterioare, în cazul în care provin de la animale expuse la condiții similare de expunere, adăpost și privare de hrană;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, vârsta și sexul animalelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de randomizare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea oricăror condiții dinainte de testare, inclusiv regimul alimentar, carantina și tratamentul unor boli.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritatea și, dacă este cazul, proprietăți fizico-chimice (inclusiv izomerizarea);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare și numărul din registrul CAS, dacă este cunoscut.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea utilizării vehiculului și alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date istorice sau concomitente, care demonstrează că vehiculul nu interferează cu rezultatul studiului.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Incinta de inhalare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea incintei de inhalare, inclusiv volumul și o diagramă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa și descrierea echipamentului folosit pentru expunerea animalelor precum și pentru generarea atmosferei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      echipamentul pentru măsurarea temperaturii, umidității, dimensiunii particulelor și concentrației efective;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa de aer și sistemul folosit pentru condiționare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele folosite pentru calibrarea echipamentului, pentru a asigura o atmosferă de testare omogenă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diferența de presiune (pozitivă și negativă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orificiile de expunere pentru fiecare incintă (pentru expunere doar în zona nasului); amplasarea animalelor în sistem (pentru expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      stabilitatea atmosferei de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      amplasarea senzorilor de temperatură și umiditate și prelevarea probelor din atmosfera de testare din incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tratarea aerului introdus/extras;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      debitele de aer, debitul de aer/orificiu de expunere (doar în zona nasului) sau numărul de animale/incintă (expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timpul necesar pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare (t95);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul de schimburi de volum pe oră;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dispozitive de măsurare (după caz).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Datele privind expunerea:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii concentrației-țintă în studiul principal;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile nominale (masa totală a substanței chimice testate generate în incinta de inhalare împărțită la volumul de aer vehiculat prin incintă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile efective ale substanței chimice testate, din probe prelevate din zona de respirație a animalelor; pentru amestecuri care generează forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli), fiecare poate fi analizată separat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate concentrațiile în aer se consemnează în unități de masă (mg/l, mg/m3 etc.), nu în unități de volum (ppm, ppb etc.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuția granulometrică, diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) și abaterea standard geometrică (σg), inclusiv metodele pentru calcularea lor. Se consemnează analizele granulometrice individuale.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detaliile preparării substanței chimice testate, inclusiv detalii privind orice proceduri folosite pentru a reduce dimensiunea particulelor materialelor solide sau pentru a prepara soluții ale substanței chimice testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      o descriere (preferabil incluzând o diagramă) a echipamentului folosit pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la atmosfera de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind echipamentul utilizat pentru monitorizarea temperaturii incintei, umidității și debitului de aer prin incintă (adică realizarea unei curbe de calibrare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind echipamentul utilizat pentru prelevarea probelor în vederea determinării concentrației în incintă și a dimensiunii particulelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind metoda de analiză chimică folosită și validarea metodei (inclusiv eficiența recuperării substanței chimice testate din mediul de prelevare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de randomizare în evaluarea animalelor din grupurile de testare și martor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa regimului alimentar, sursa de apă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea pentru selectarea concentrațiilor de testare.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea în formă tabelară a temperaturii, umidității și debitului de aer în incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea în formă tabelară a datelor de concentrație nominală și efectivă în incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea în formă tabelară a datelor privind dimensiunea particulelor, inclusiv a datelor privind colectarea probelor analitice, distribuția granulometrică și calcularea DAMM și σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea în formă tabelară a datelor privind răspunsul și nivelul de concentrație la fiecare animal (adică animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea și durata efectelor);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea în formă tabelară a greutăților animalelor individuale;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea în formă tabelară a consumului de hrană;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea în formă tabelară a datelor de patologie clinică;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concluziile autopsiei și concluziile examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Discutarea și interpretarea rezultatelor:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie acordată o atenție specială descrierii metodelor folosite pentru satisfacerea criteriilor acestei metode de testare, de exemplu concentrația-limită sau granulometria;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se abordeze inhalabilitatea particulelor din perspectiva rezultatelor generale, în special în cazul în care nu se pot realiza criteriile privind dimensiunea particulelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      în evaluarea de ansamblu a studiului trebuie să fie incluse coerența metodelor folosite pentru a determina concentrațiile nominale și efective și relația între concentrația efectivă și concentrația nominală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se analizeze cauza probabilă a morții și modul predominant de acțiune (sistemic sau local);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se prezinte o explicație în cazul în care a fost necesară eutanasierea animalelor cu dureri sau care prezintă semne de suferință gravă și prelungită, pe baza criteriilor din Ghidul OCDE privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (3);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se identifice organul sau organele-țintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trebuie să se determine NOAEL și LOAEL.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1981), Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Whalan E. și Redden J.C. (1994), Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Dungworth D.L., Tyler W.S., Plopper C.E. (1985), Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) în Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds.), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Young J.T. (1981), Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Harkema J.R. (1990), Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A., van Slootweg P.J., Feron V.J. (1994), Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. În: Waalkes M.P. and Ward J.M. (eds.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Mery S, Gross E.A., Joyner D.R., Godo M., Morgan K.T. (1994), Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992), The role of nasopharyngeal lymphoid tissue, Immunol. Today 13: 219-224.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003), Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue, Toxicol. Lett. 140-141: 281-285.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Lewis D.J. (1981), Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia, Journal of Anatomy 132(3): 419-428.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1).
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚIE
                     Substanță chimică testată: Orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  
                  B.30.   STUDII DE TOXICITATE CRONICĂ
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 452 (2009) a OCDE. Versiunea originală a Orientării 452 a fost adoptată în 1981. S-a considerat necesară elaborarea acestei metode de testare revizuite B.30 pentru a reflecta evoluțiile recente în domeniul bunăstării animalelor și cerințelor de reglementare (1) (2) (3) (4). Actualizarea acestei metode de testare B.30 s-a realizat în paralel cu revizuirea capitolului B.32 din prezenta anexă («Studii privind carcinogenitatea») și a capitolului B.33 din prezenta anexă («Studii combinate de toxicitate cronică și carcinogenitate»), cu obiectivul de a obține informații suplimentare de la animalele folosite în studiu și de a furniza detalii suplimentare privind alegerea dozelor. Această metodă testare este concepută pentru a fi utilizată la testarea unei game largi de substanțe, inclusiv pesticide și produse chimice industriale.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Majoritatea studiilor de toxicitate cronică sunt efectuate pe specii de rozătoare, prin urmare, această metodă de testare este destinată aplicării în primul rând la studiile efectuate pe aceste specii. În cazul în care sunt necesare studii pe alte specii în afara rozătoarelor, se pot aplica, de asemenea, principiile și procedurile prezentate în această metodă de testare, împreună cu cele prezentate în capitolul B.27 din prezenta anexă [«Testul de toxicitate orală subcronică. Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare» (5)], cu modificările corespunzătoare, așa cum se arată în Ghidul OCDE nr. 116 privind protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate (6).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Cele trei căi de administrare principale folosite în studiile de toxicitate cronică sunt orală, cutanată și prin inhalare. Alegerea căii de administrare depinde de caracteristicile fizice și chimice ale substanței chimice testate și de calea de expunere probabilă în cazul omului. Informații suplimentare privind alegerea căii de expunere sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (6).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Această metodă de testare se axează pe expunerea prin intermediul căii orale, calea cea mai folosită în cadrul studiilor de toxicitate cronică. În timp ce studiile de toxicitate cronică pe termen lung implicând căi de expunere cutanată sau prin inhalare ar putea fi necesare și pentru evaluarea riscului pentru sănătatea umană și/sau în cadrul anumitor regimuri de reglementare, aceste două căi de expunere implică o complexitate tehnică semnificativă. Asemenea studii vor trebui concepute de la caz la caz, deși metoda de testare prezentată aici pentru evaluarea toxicității cronice prin administrare orală ar putea forma baza unui protocol pentru studii de expunere prin inhalare și/sau cutanată, în ceea ce privește recomandările pentru perioadele de tratament, parametrii clinci și patologici etc. Sunt disponibile orientări OCDE privind administrarea substanțelor chimice testate prin inhalare (6) (7) și pe cale cutanată (6). Capitolul B.8 din prezenta anexă (8) și capitolul B.29 din prezenta anexă (9), împreună cu Ghidul OCDE privind testarea toxicității acute prin inhalare (7) trebuie să fie consultate în mod special la conceperea unor studii mai lungi ce implică expunerea prin inhalare. Capitolul B.9 din prezenta anexă (10) trebuie consultat în cazul efectuării testului prin intermediul căii cutanate.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Studiul de toxicitate cronică furnizează informații despre posibilele pericole pentru sănătate care pot fi antrenate de expunerea repetată în timpul unei părți considerabile a perioadei de viață a speciei utilizate. Studiul va furniza informații privind efectele toxice ale substanței chimice testate; va indica organele-țintă și posibilitatea de acumulare. De asemenea, studiul poate furniza o estimare a nivelului la care nu se observă efecte adverse, ce poate fi folosită la stabilirea criteriilor pentru expunerea umană. Se subliniază, de asemenea, necesitatea observării clinice atente a animalelor, astfel încât să se obțină cât mai multe informații posibil.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Obiectivele studiilor acoperite de această metodă de testare includ:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea toxicității cronice a unei substanțe chimice testate;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea organelor-țintă;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          caracterizarea relației doză-răspuns;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea nivelului la care nu se observă niciun efect advers (NOAEL) sau a punctului de pornire pentru stabilirea unei doze de referință (BMD);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          estimarea efectelor de toxicitate cronică la niveluri de expunere umană;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          furnizarea datelor pentru ipotezele de testare privind modul de acțiune (6).
                                       
                                    
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              7.
                           
                           
                              În evaluarea caracteristicilor toxicologice ale unei substanțe chimice testate, laboratorul de testare trebuie să ia în considerare toate informațiile disponibile privind substanța chimică testată, înainte de efectuarea testului, pentru un protocol mai eficient al testului privind potențialul de toxicitate cronică și pentru minimizarea utilizării animalelor. Informațiile care pot contribui la concepția studiului includ identitatea, structura chimică și proprietățile fizico-chimie ale substanței chimice testate; orice informații privind modul de acțiune; rezultatele tuturor testelor de toxicitate in vitro sau in vivo; utilizări anticipate și potențialul de expunere umană; date (Q)SAR disponibile și date toxicologice privind substanțe cu structură apropiată; date toxicocinetice disponibile (cinetica pentru doză unică și doză repetată, acolo unde sunt disponibile), precum și date rezultate din studii de expunere repetată. Determinarea toxicității cronice se efectuează doar după ce s-au obținut informațiile inițiale privind toxicitatea din testele de toxicitate la doză repetată pe o perioadă de 28 de zile și/sau 90 de zile. Trebuie să se ia în considerare o abordare de testare a toxicității cronice în etape, ca parte a evaluării generale a potențialelor efecte adverse asupra sănătății a unei anumite substanțe chimice testate (11) (12) (13) (14).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Metodele statistice cele mai adecvate pentru analiza rezultatelor, ținând cont de protocolul experimentului și de obiective, se stabilesc înainte de începerea studiului. Aspectele care trebuie luate în considerare sunt, de exemplu, necesitatea ca statisticile să includă ajustarea pentru supraviețuire și analiza în cazul încheierii anticipate pentru unul sau mai multe grupuri. În Ghidul nr. 116 (6) și în Ghidul nr. 35 privind analiza și evaluarea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate (15) sunt prezentate orientări privind analizele statistice corespunzătoare și referințe de bază privind metodele statistice acceptate la nivel internațional.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              La efectuarea unui studiu de toxicitate cronică trebuie să se respecte întotdeauna principiile și considerațiile din Ghidul OCDE nr. 19 privind recunoașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca puncte finale din considerente umane pentru animalele utilizate în scop experimental în evaluarea siguranței (16), în special punctul 62 al documentului. Acest punct stipulează că «În studiile care implică dozarea repetată, în cazul în care un animal prezintă semne clinice progresive, conducând la deteriorarea în continuare a stării, trebuie să se ia o decizie în cunoștință de cauză privind eutanasierea animalului. Decizia trebuie să includă considerații privind valoarea informațiilor care s-ar putea obține din păstrarea în continuare a animalului în studiu, în funcție de starea sa generală. În cazul în care se ia decizia de a menține animalul în cadrul testului, trebuie să crească frecvența observărilor, după cum este necesar. De asemenea, fără a afecta negativ scopul testului, se poate întrerupe temporar dozarea sau se poate reduce doza de testare, dacă astfel se reduce durerea sau suferința.»
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              În Ghidul nr. 116 (6), precum și în două publicații ale International Life Sciences Institute (17) (18) se pot găsi orientări detaliate privind principiile de selectare a dozei pentru studii de toxicitate cronică și carcinogenitate, precum și discuții pe această temă. Strategia de selectare a dozei de bază depinde de obiectivul principal sau obiectivele principale ale studiului (punctul 6). La selectarea nivelurilor de dozare adecvate trebuie să se atingă un echilibru între depistarea pericolelor, pe de-o parte, și caracterizarea răspunsurilor la doză redusă și relevanța lor, pe de altă parte. Acest lucru este relevant în special în cazul în care se efectuează un studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anexă) (punctul 11).
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Trebuie să se aibă în vedere efectuarea unui studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anexă) în locul efectuării separate a unui studiu de toxicitate cronică (această metodă de testare B.30) și a unui studiu de carcinogenitate (capitolul B.32 din prezenta anexă). Testul combinat oferă o eficiență mai mare din punct de vedere al timpului și costului, comparativ cu efectuarea a două studii separate, fără a compromite calitatea datelor din faza de toxicitate cronică sau de carcinogenitate. Cu toate acestea, trebuie să se acorde multă atenție principiilor de selectare a dozei (punctele 9 și 20-25) la efectuarea unui studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anexă) și se recunoaște, de asemenea, faptul că pot fi necesare studii separate în anumite cadre de reglementare.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Definițiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la sfârșitul acestui capitol și în Ghidul nr. 116 (6).
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              13.
                           
                           
                              Substanța chimică testată este administrată zilnic, în doze graduale, mai multor grupuri de animale utilizate în scopuri experimentale, de obicei pe o perioadă de 12 luni, deși se pot alege durate mai mari sau mai scurte, în funcție de cerințele de reglementare (a se vedea punctul 33). Această durată se alege suficient de mare pentru a permite manifestarea oricăror efecte cumulative ale toxicității, fără efectele perturbatoare date de modificările geriatrice. Abaterile de la durata de expunere de 12 luni trebuie justificate, în special în cazul unor durate mai scurte. De obicei, substanța chimică testată se administrează pe cale orală, deși poate fi adecvată testarea prin inhalare sau pe cale cutanată. Protocolul studiului include, de asemenea, una sau mai multe sacrificări pe parcurs, de exemplu la 3 și 6 luni, și se pot include grupuri suplimentare de animale, pentru a lua în considerare aceasta (a se vedea punctul 19). În perioada administrării, animalele se țin sub observație atentă, în scopul de a constata semnele de toxicitate. Animalele care mor sau care sunt sacrificate în cursul testului trebuie să fie supuse unei autopsii, iar la încheierea testului se eutanasiază și se autopsiază animalele care au supraviețuit.
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Această metodă de testare acoperă, în principal, evaluarea toxicității cronice la rozătoare (a se vedea punctul 2), deși se recunoaște faptul că pot fi necesare studii similare pe nerozătoare, în cadrul anumitor regimuri de reglementare. Alegerea speciei trebuie să fie justificată. Protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate cronică pe specii de nerozătoare, în cazul în care sunt necesare, se bazează pe principiile subliniate în această metodă de testare și pe cele din capitolul B.27 din prezenta anexă, «Testul de toxicitate orală subcronică. Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare» (5). Informații suplimentare privind alegerea speciei și sușei sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (6).
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              În această metodă de testare, specia preferată este șobolanul, deși pot fi folosite și alte specii de rozătoare, de exemplu șoarecele. Șobolanii și șoarecii au fost modelele experimentale preferate din cauza duratei lor de viață relativ scurte, utilizării lor pe scară largă în studii de farmacologie și toxicologie, receptivității lor la inducerea tumorilor și disponibilității unor sușe cu nivel suficient de caracterizare. Ca o consecință a acestor caracteristici, este disponibil un volum mare de informații privind fiziologia și patologia lor. Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase, provenind din sușele folosite în mod obișnuit în laboratoare. Studiul de toxicitate cronică trebuie efectuat pe animale din aceeași sușă și sursă cu cele folosite în studiile preliminare de toxicitate, de durată mai scurtă. Femelele trebuie să fie nulipare și să nu fie gestante.
                           
                        
                     Condiții de adăpostire și de hrănire
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Animalele pot fi adăpostite în cuști fie individual, fie în grupuri mici de același sex; se ia în considerare adăpostirea individuală a animalelor doar dacă există o justificare științifică (19) (20) (21). Cuștile trebuie aranjate astfel încât să se reducă la minimum posibilele efecte provocate de această aranjare. Temperatura camerei în care se află animalele utilizate în scop experimental trebuie să fie de 22 °C (± 3 °C). Deși se recomandă ca umiditatea relativă să fie de cel puțin 30 % și să nu depășească, de preferință, 70 %, cu excepția momentului în care se curăță camera, se tinde spre un nivel de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial, alternând 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, furnizându-se o cantitate nelimitată de apă potabilă. Regimul alimentar trebuie să satisfacă toate cerințele nutriționale ale speciei testate, iar conținutul de contaminanți alimentari care ar putea influența rezultatul testului, printre care reziduuri de pesticide, poluanți organici persistenți, fitoestrogeni, metale grele și micotoxine, dar fără limitare la acestea, trebuie să fie cât mai redus posibil. Informațiile analitice privind nutrienții și nivelurile de contaminanți din regimul alimentar trebuie să fie generate periodic, cel puțin la începutul studiului și atunci când există o modificare a grupului folosit, și trebuie să fie incluse în raportul final. În mod similar, trebuie să se furnizeze informații analitice privind apa potabilă folosită în cadrul studiului. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a asigura o proporție adecvată a substanței chimice testate și de a satisface cerințele nutriționale ale animalelor, în cazul administrării substanței chimice testate prin alimentație.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Se utilizează animale sănătoase, care au fost aclimatizate la condițiile de laborator timp de cel puțin 7 zile și nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare. În cazul rozătoarelor, administrarea trebuie să înceapă cât mai curând posibil după înțărcare și aclimatizare și, preferabil, înainte de vârsta de 8 săptămâni. Pentru animalele testate trebuie să se precizeze specia, sușa, sursa, sexul, greutatea și vârsta. La începutul studiului, variațiile de greutate între animalele utilizate pentru fiecare sex trebuie să fie minime și să nu depășească 20 % din greutatea medie a tuturor animalelor din cadrul studiului, separat pentru fiecare sex. Animalele se repartizează aleator în grupurile tratate și grupurile martor. După randomizare, nu trebuie să existe diferențe semnificative între greutățile corporale medii ale grupurilor din cadrul fiecărui sex. În cazul în care există diferențe semnificative statistic, se repetă etapa de randomizare, dacă este posibil. Fiecărui animal i se atribuie un număr unic de identificare și este marcat permanent cu acest număr prin tatuare, implantare de microcip sau altă metodă adecvată.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Numărul și sexul animalelor
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Se folosesc ambele sexe. Trebuie să se utilizeze un număr suficient de animale astfel încât la încheierea studiului să fie disponibile suficiente animale în fiecare grup pentru evaluarea biologică și statistică adecvată. Pentru rozătoare, de obicei se folosesc minimum 20 de animale din fiecare sex și grup, la fiecare nivel de dozare, iar pentru nerozătoare se recomandă minimum 4 animale din fiecare sex și grup. La studiile pe șoareci pot fi necesare animale suplimentare în fiecare grup de doză, pentru efectuarea tuturor determinărilor hematologice necesare.
                           
                        
                     Sacrificări pe parcurs, grupuri satelit și animale santinelă
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Studiul poate prevedea sacrificări pe parcurs (minimum 10 animale/sex/lot), de exemplu la 6 luni, pentru a asigura informații privind evoluția modificărilor toxicologice și informații mecaniciste, dacă există justificare științifică. În cazul în care asemenea informații sunt deja disponibile din studii anterioare de toxicitate la doză repetată pentru substanța chimică testată, este posibil ca sacrificările pe parcurs să nu fie justificate din punct de vedere științific. Pot fi incluse grupuri satelit pentru monitorizarea reversibilității modificărilor toxicologice induse de substanța chimică testată studiată; de obicei, acestea se limitează la nivelul cel mai ridicat al dozei plus grupul martor. De asemenea, în timpul studiului se poate include un grup suplimentar de animale santinelă (de obicei, 5 animale din fiecare sex), pentru monitorizarea stării de boală, dacă este necesar (22). Dacă sunt planificate sacrificări pe parcurs sau includerea de grupuri satelit sau santinelă, numărul de animale prevăzute în protocolul studiului trebuie suplimentat cu numărul de animale planificate să fie sacrificate înainte de sfârșitul testului. În mod normal, aceste animale trebuie să fie supuse acelorași observații, incluzând greutatea corporală, consumul de hrană/apă, măsurători hematologice și de biochimie clinică și investigații patologice, ca și animalele din studiul de toxicitate cronică, dar se poate prevedea (la grupurile de animale sacrificate pe parcurs) faptul că măsurătorile se limitează la indicatori de bază, specifici, cum ar fi neurotoxicitatea sau imunotoxicitatea.
                           
                        
                     Grupuri de doze și dozare
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              În Ghidul nr. 116 (6) sunt furnizate orientări privind toate aspectele legate de selectarea dozelor și intervalele dintre nivelurile de dozare. Se utilizează minimum trei niveluri de dozare și un grup martor în paralel, în afara cazului în care se efectuează un test la valori-limită (a se vedea punctul 27). De regulă, nivelul dozelor se stabilește în funcție de rezultatele studiilor cu doză repetată pe termen mai scurt sau ale studiilor preliminare și trebuie să ia în considerare orice date toxicologice și toxico-cinetice disponibile pentru substanța chimică testată sau substanțe înrudite.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Cu excepția situației în care există limite impuse de natura fizico-chimică sau de efectele biologice ale substanței chimice testate, cel mai mare nivel de dozare se alege, de regulă, pentru a identifica principalele organe-țintă și efectele toxice, evitându-se în același timp suferința, toxicitatea severă, morbiditatea sau moartea. Luând în considerare factorii prezentați la punctul 22 de mai jos, nivelul cel mai mare de dozare se alege pentru a produce dovezi de toxicitate, evidențiată, de exemplu, prin diminuarea ritmului de creștere în greutate (aproximativ 10 %).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Cu toate acestea, în funcție de obiectivele studiului (a se vedea punctul 6), se poate alege o doză maximă mai mică decât doza care furnizează dovada toxicității, de exemplu, în cazul în care o doză provoacă un efect advers îngrijorător care totuși are un efect redus asupra duratei de viață sau a greutății corporale. Doza maximă nu trebuie să depășească 1 000 mg/kg greutate corporală/zi (doza-limită, a se vedea punctul 27).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Nivelurile dozelor și intervalul între nivelurile de dozare se pot alege astfel încât să se stabilească o relație doză-răspuns și un NOAEL sau alt rezultat intenționat al studiului, de exemplu o BMD (a se vedea punctul 25) la nivelul dozei minime. Printre factorii care trebuie să fie luați în considerare la stabilirea dozelor inferioare se numără panta anticipată a curbei doză-răspuns, dozele la care se pot produce modificări importante în metabolism sau în modul de acțiune toxică a substanței, nivelul la care se anticipează un prag sau nivelul la care este anticipat punctul de pornire pentru extrapolarea la doză redusă.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Intervalele dintre nivelurile de dozare vor depinde de caracteristicile substanței chimice testate și nu pot fi prescrise în această metodă de testare, dar o performanță bună a testului se obține în mod frecvent cu un factor de 2 până la 4 la formarea seriei descrescătoare a dozelor, iar adăugarea unui al patrulea grup de probă este adesea preferabilă folosirii unor intervale cu factori foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între doze. În general trebuie să se evite utilizarea unor factori peste 10 și, în cazul în care sunt utilizați, trebuie să se prezinte justificarea.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Așa cum se arată în Ghidul nr. 116 (6), aspectele care trebuie luate în considerare la selectarea dozei includ:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          neliniarități sau puncte de inflexiune cunoscute sau prezumptive în relația doză-răspuns;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aspecte toxicocinetice și intervale ale dozelor în care intervin sau nu intervin inducția metabolică, saturația sau neliniaritatea între dozele externe și interne;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          leziuni precursoare, marcatori de efect sau indicatori ai acțiunii unor procese biologice de bază;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aspecte de bază (sau prezumptive) ale modului de acțiune, de exemplu doze la care începe să apară citotoxicitatea, la care sunt perturbate nivelurile hormonale, la care sunt excedate mecanismele homeostazice etc.;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          regiunile curbei doză-răspuns unde este necesară o estimare deosebit de precisă, de exemplu în domeniul BMD anticipate sau al unui prag anticipat;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          considerații privind nivelurile de expunere umană anticipate.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Grupul martor nu este supus tratamentului sau i se administrează exclusiv vehiculul, în cazul în care pentru administrarea substanței testate se utilizează un vehicul. Cu excepția administrării substanței chimice testate, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod identic cu acelea din grupurile testate. Dacă se utilizează un vehicul, grupului martor i se administrează cel mai mare volum de vehicul utilizat pentru grupurile de dozare. Dacă substanța chimică testată se administrează în hrană și determină diminuarea semnificativă a consumului de hrană din cauza savorii reduse, poate fi considerată necesară utilizarea unui grup martor hrănit în paralel.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Atunci când se poate anticipa, pe baza informațiilor din studiile preliminare, că un test efectuat la o doză unică, echivalentă cu cel puțin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, folosind metodele de testare descrise pentru acest studiu, este improbabil să producă efecte adverse și dacă nu este anticipată toxicitatea în baza datelor existente pentru substanțe înrudite structural, se consideră că nu este necesar un studiu integral cu trei doze de niveluri diferite. Se poate aplica o limită de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, cu excepția cazului în care condițiile de expunere umană impun utilizarea unei doze mai ridicate.
                           
                        
                     Pregătirea dozelor și administrarea substanței chimice testate
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Substanța chimică testată se administrează de obicei oral, prin alimente ori apa potabilă, sau prin gavaj. Informații suplimentare privind căile și metodele de administrare sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (6). Alegerea căii și metodei de administrare depinde de scopul studiului, de caracteristicile fizice și chimice ale substanței chimice testate, de biodisponibilitatea sa și de calea și metoda de expunere predominante în cazul omului. Trebuie să se prezinte justificarea pentru calea și metoda de administrare alese. Din rațiuni care țin de bunăstarea animalelor, gavajul oral se alege, de obicei, doar pentru acei agenți la care această cale și metodă de administrare reprezintă, în mod rezonabil, o expunere umană potențială (de exemplu, produse farmaceutice). Pentru substanțe din hrană sau mediu, inclusiv pesticide, administrarea se face, de obicei, prin intermediul regimului alimentar sau al apei potabile. Cu toate acestea, pentru unele scenarii, de exemplu expunerea ocupațională, pot fi mai adecvate alte căi de administrare.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Dacă este necesar, substanța chimică testată se dizolvă sau se aduce în formă de suspensie într-un vehicul adecvat. Trebuie luate în considerare următoarele caracteristici ale vehiculului și ale altor aditivi, după caz: efectele acestuia asupra absorbției, distribuției, metabolismului sau retenției substanței chimice testate, care i-ar putea afecta caracteristicile toxice; efectele asupra consumului de hrană sau de apă sau asupra stării de nutriție a animalului. Se recomandă, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluții/suspensii apoase, apoi a unei soluții/emulsii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și apoi a unei alte soluții posibile în alte vehicule. Pentru alte vehicule decât apa, este necesar să se cunoască proprietățile toxice ale vehiculului. Trebuie să fie disponibile informații privind stabilitatea substanței chimice testate și omogenitatea soluțiilor sau regimurilor alimentare (după caz) în condițiile administrării (de exemplu, prin hrană).
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              În cazul substanțelor administrate prin intermediul hranei sau al apei potabile, este important să se asigure că bilanțul nutrițional sau hidric normal nu este afectat de cantitatea de substanță chimică testată utilizată. În studiile de toxicitate pe termen lung folosind administrarea prin hrană, concentrația substanței testate în hrană nu trebuie să depășească, de obicei, o limită superioară de 5 % din totalul regimului alimentar, pentru a evita dezechilibrele nutriționale. Când substanța chimică testată este administrată în alimente, se poate folosi fie o concentrație constantă în hrană (mg/kg alimente sau ppm), fie o doză de nivel constant în raport cu greutatea animalului (mg/kg greutate corporală), calculată săptămânal. Trebuie să se precizeze alternativa utilizată.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              În cazul administrării orale, animalele primesc zilnic doza de substanță chimică testată (șapte zile pe săptămână), de obicei pe o perioadă de 12 luni (a se vedea și punctul 33), deși poate fi necesară o durată mai mare, în funcție de cerințele de reglementare. Orice alt regim de dozare, de exemplu cinci zile pe săptămână, trebuie să fie justificat. În cazul administrării cutanate, animalele sunt tratate de obicei cu substanța chimică testată timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe săptămână, așa cum se specifică în capitolul B.9 din prezenta anexă (10), pe o perioadă de 12 luni. Expunerea prin inhalare se face timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe săptămână, dar se poate folosi și expunerea timp de 5 zile pe săptămână, dacă este justificată. Perioada de expunere va fi, de obicei, de 12 luni. În cazul în care sunt expuse alte specii de rozătoare decât șobolanii, doar în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi ajustate pentru minimizarea suferinței specifice speciei. În cazul în care durata expunerii este sub 6 ore pe zi, trebuie să se prezinte o justificare. A se vedea și capitolul B.8 din prezenta anexă (8).
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Când substanța chimică testată este administrată prin gavaj, ea se administrează animalelor folosind o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată, la momente similare în fiecare zi. De obicei, se administrează o doză unică, o dată pe zi; în cazul în care o substanță are efect iritant local, rata dozei zilnice poate fi menținută prin administrare ca doză fracționată (de două ori pe zi). Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de greutatea animalului testat. Volumul se menține cât mai redus posibil și de obicei nu trebuie să depășească 1 ml/100 g greutate corporală pentru rozătoare (22). Variațiile volumului administrat trebuie să fie reduse la minimum prin modificarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant la toate nivelurile dozelor. Substanțele potențial corozive sau iritante constituie o excepție și trebuie diluate pentru a evita efecte locale grave. Trebuie să se evite testarea la concentrații potențial corozive pentru tractul gastrointestinal.
                           
                        
                     Durata studiului
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              În principal, această metodă de testare este concepută ca studiu de toxicitate cronică pe 12 luni, dar protocolul permite și se poate aplica unor studii cu durate mai scurte (de exemplu, 6 la 9 luni) sau mai lungi (de exemplu, 18 la 24 de luni), în funcție de cerințele regimurilor de reglementare specifice sau în scopuri mecaniciste specifice. Abaterile de la durata de expunere de 12 luni trebuie să fie justificate, în special în cazul unor durate mai scurte. Grupurile satelit incluse pentru monitorizarea reversibilității modificărilor toxicologice induse de substanța chimică testată trebuie să fie menținute fără administrare de doze pe o perioadă de minimum 4 săptămâni și nu mai mult de o treime din durata totală a studiului după încetarea expunerii. Orientări suplimentare, inclusiv considerații privind supraviețuirea în cadrul studiului, sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (6).
                           
                        OBSERVAȚII
                  
                              34.
                           
                           
                              Toate animalele trebuie să fie examinate pentru constatarea simptomelor de morbiditate și mortalitate, de regulă la începutul și la sfârșitul fiecărei zile, inclusiv în zilele de weekend și sărbători. Se recomandă ca observațiile clinice generale să fie făcute cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după dozare, în cazul administrării prin gavaj.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Se recomandă efectuarea de observații clinice detaliate asupra tuturor animalelor, cel puțin o dată înainte de prima expunere (pentru a putea face comparații în cazul aceluiași individ) și la sfârșitul primei săptămâni de studiu, apoi o dată pe lună. Protocolul pentru observații trebuie organizat astfel încât variațiile între observatorii independenți să fie minimizate și independente de grupul de testare. Aceste observații se recomandă să fie făcute în afara cuștii, de preferință într-o incintă standardizată și la aceeași oră de fiecare dată. Ele trebuie să fie consemnate cu atenție, de preferat folosind un sistem de notare definit explicit de laboratorul de testare. Trebuie acționat astfel încât să se asigure că variațiile privind condițiile de observare sunt minime. Simptomele observate includ modificări ale pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariția secrețiilor și excrețiilor, precum și activitatea autonomă (de exemplu, lăcrimare, piloerecție, dimensiunea pupilelor, respirație neobișnuită), fără limitare la acestea. Trebuie să fie consemnate, de asemenea, schimbările apărute în mers, ținută și răspunsul la manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice și tonice, a stereotipiilor (de exemplu, îngrijirea corporală excesivă, mersul circular repetat) sau a comportamentelor bizare (de exemplu, automutilarea, mersul înapoi) (24).
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Toate animalele sunt supuse unei examinări oftalmologice cu ajutorul unui oftalmoscop sau a unui echipament similar, înainte de prima administrare a substanței testate. La încheierea studiului, această examinare se face, de preferință, la toate animalele, dar trebuie făcută cel puțin la grupurile cu doză de nivel mare și grupurile martor. Dacă se constată modificări ale ochilor legate de tratament, toate animalele trebuie să fie examinate. În cazul în care analiza structurală sau alte informații sugerează toxicitate oculară, se mărește frecvența examinărilor oculare.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Pentru substanțe chimice testate la care testele anterioare de toxicitate la doză repetată de 28 și/sau 90 de zile au indicat potențialul de a produce efecte neurotoxice, se pot face opțional evaluări ale reactivității senzoriale la stimuli de diferite tipuri (24) (de exemplu, stimuli auditivi, vizuali și proprioceptivi) (25) (26) (27), evaluarea forței prehensile (28) și evaluarea activității motorii (29) înainte de începerea studiului și la perioade de 3 luni de la începerea studiului, până la 12 luni inclusiv, precum și la terminarea studiului (dacă durează mai mult de 12 luni). Detalii suplimentare referitoare la procedurile de urmat sunt prezentate în referințele bibliografice respective. Se pot folosi și metode diferite de cele menționate.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Pentru substanțe chimice testate la care testele anterioare de toxicitate la doză repetată de 28 și/sau 90 de zile au indicat potențialul de a produce efecte imunotoxice, se pot efectua opțional la finalizare investigații suplimentare privind acest efect.
                           
                        
                     Greutatea corporală, consumul de hrană și apă și eficiența hranei
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Toate animalele se cântăresc la începutul tratamentului, cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni și cel puțin o dată pe lună după aceea. Măsurătorile consumului de hrană și ale eficienței hranei se fac cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior. Consumul de apă se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior, în cazul în care substanța este administrată în apa potabilă. Măsurătorile consumului de apă se iau în considerare și la studiile în care băutul apei suferă modificări.
                           
                        
                     Hematologia și biochimia clinică
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              La studiile pe rozătoare, examinările hematologice se fac pe minimum 10 masculi și 10 femele din fiecare grup, la 3, 6 și 12 luni, precum și la încheierea studiului (dacă durează mai mult de 12 luni), folosind întotdeauna aceleași animale. La studiile pe șoareci pot fi necesare animale satelit pentru efectuarea tuturor determinărilor hematologice necesare (a se vedea punctul 18). La studiile pe nerozătoare, probele se vor preleva de la mai puține animale (de exemplu, 4 animale din fiecare sex și grup, la studiile pe câini), la momente intermediare de prelevare și la încheiere, așa cum s-a arătat pentru rozătoare. Măsurătorile la 3 luni, atât pentru rozătoare cât și pentru nerozătoare, nu trebuie efectuate dacă nu s-a observat niciun efect asupra parametrilor hematologici la studiul anterior de 90 de zile, efectuat la doze de niveluri comparabile. Probele de sânge sunt prelevate dintr-un punct determinat, de exemplu prin puncție cardiacă sau din sinusul retro-orbital, sub anestezie.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Se investighează următoarea listă de parametri (30): numărul total de leucocite și formula leucocitară, numărul de eritrocite, numărul de plachete, concentrația hemoglobinei, hematocritul, volumul corpuscular mediu (MCV), concentrația medie de hemoglobină corpusculară (MCHC), timpul de protrombină și timpul de protrombină parțial activat. Alți parametri hematologici, de exemplu corpii Heinz sau morfologia atipică a eritrocitelor sau methemoglobina, se pot măsura, după caz, în funcție de toxicitatea substanței chimice testate. În ansamblu, se adoptă o abordare flexibilă, în funcție de efectul observat și/sau anticipat al unei anumite substanțe chimice testate. În cazul în care substanța chimică testată are vreun efect asupra sistemului hematopoietic, se mai pot indica numărul de reticulocite și citologia măduvei osoase, dar aceste examinări nu trebuie să fie efectuate în mod obișnuit.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Determinările de biochimie clinică în scopul determinării efectelor toxice majore în țesuturi și, în special, a efectelor asupra rinichiului și ficatului sunt practicate pe probe de sânge obținute de la cel puțin 10 masculi și 10 femele din fiecare grup, la aceleași intervale cu cele specificate pentru investigațiile hematologice, folosind întotdeauna aceleași animale. La studiile pe șoareci pot fi necesare animale satelit pentru efectuarea tuturor determinărilor de biochimie clinică necesare. La studiile pe nerozătoare, probele se vor preleva de la mai puține animale (de exemplu, 4 animale din fiecare sex și grup, la studiile pe câini), la momente intermediare de prelevare și la încheiere, așa cum s-a arătat pentru rozătoare. Măsurătorile la 3 luni, atât pentru rozătoare cât și pentru nerozătoare, nu trebuie efectuate dacă nu s-a observat niciun efect asupra parametrilor de biochimie clinică la studiul anterior de 90 de zile efectuat la doze de niveluri comparabile. Se recomandă privarea de hrană a animalelor pe timpul nopții (cu excepția șoarecilor) înainte de prelevarea probelor de sânge. Se investighează parametrii din lista următoare (30): glucoză, uree (azot ureic), creatinină, proteină totală, albumină, calciu, sodiu, potasiu, colesterol total, cel puțin două teste adecvate pentru evaluarea hepatocelulară (alanin aminotransferază, aspartat alanin aminotransferază, glutamat dehidrogenază, acizi biliari totali) (31) și cel puțin două teste adecvate pentru evaluarea hepatobiliară (fosfatază alcalină, gama-glutamil transferază, 5’-nucleotidază, bilirubină totală, acizi biliari totali) (31). Alți parametri biochimici, de exemplu trigliceridele à jeun, hormonii specifici și colinesteraza se pot măsura, după caz, în funcție de toxicitatea substanței testate. În general, este nevoie de o abordare flexibilă, în funcție de efectele constatate și scontate ale substanței testate în cauză.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Determinările de analize urinare se efectuează pe cel puțin 10 masculi și 10 femele din fiecare grup, pe probe recoltate la aceleași intervale ca pentru analizele hematologice și biochimice. Măsurătorile la 3 luni nu trebuie să fie efectuate dacă nu s-a observat niciun efect asupra analizei de urină la studiul anterior de 90 de zile efectuat la doze de niveluri comparabile. Următoarea listă de parametri a fost inclusă într-o recomandare a experților privind studiile de patologie clinică (30): aspect, volum, osmolalitate sau densitate, pH, proteină totală și glucoză. Alte determinări includ corpi cetonici, urobilinogen, bilirubină și hemoragii oculte. Se pot folosi și alți parametri, dacă este necesar să se extindă investigarea efectului (efectelor) observat(e).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              De regulă, se consideră că, pentru studiile pe câini, variabilele de referință ale parametrilor hematologici și biochimici sunt necesare înainte de tratament, dar acestea nu trebuie determinate în cazul studiilor pe rozătoare (30). Cu toate acestea, dacă datele de referință istorice (a se vedea punctul 50) sunt necorespunzătoare, trebuie să se aibă în vedere generarea unor asemenea date.
                           
                        
                     Patologia
                  
                  
                     Autopsia
                  
                  
                              45.
                           
                           
                              În mod normal, toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii complete și detaliate, care cuprinde examinarea atentă a suprafeței externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavităților craniană, toracică și abdominală, precum și a conținutului acestora. Cu toate acestea, se poate prevedea (la grupurile de sacrificare pe parcurs sau satelit) ca măsurătorile să se limiteze la indicatori de bază specifici, de exemplu neurotoxicitatea sau imunotoxicitatea (a se vedea punctul 19). Aceste animale nu trebuie supuse autopsiei și procedurilor ulterioare descrise la punctele următoare. Animalele santinelă pot necesita autopsierea, de la caz la caz, decizia fiind la aprecierea conducătorului studiului.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Se măsoară greutatea organelor pentru toate animalele, în afară de cele excluse conform ultimei părți a punctului 45. Glandele suprarenale, creierul, epididimul, inima, rinichii, ficatul, ovarele, splina, testiculele, glanda tiroidă (cântărită după fixare, cu glandele paratiroide) și uterul fiecărui animal (cu excepția celor găsite muribunde și/sau a celor sacrificate pe parcurs) sunt curățate de țesuturile aderente, după caz, și cântărite în stare proaspătă, cât mai repede după disecție, pentru a evita deshidratarea. La studiile pe șoareci, cântărirea glandelor suprarenale este opțională.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Următoarele țesuturi se conservă în mediul de fixare cel mai adecvat pentru țesut și pentru examinarea histopatologică ulterioară intenționată (32) (țesuturile trecute între paranteze pătrate sunt opționale):
                              
                                          toate leziunile macroscopice
                                       
                                       
                                          inimă
                                       
                                       
                                          pancreas
                                       
                                       
                                          stomac (stomacul anterior, stomacul glandular)
                                       
                                    
                                          glande suprarenale
                                       
                                       
                                          ileon
                                       
                                       
                                          glande paratiroide
                                       
                                       
                                          [dinți]
                                       
                                    
                                          aortă
                                       
                                       
                                          jejun
                                       
                                       
                                          nervi periferici
                                       
                                       
                                          testicule
                                       
                                    
                                          creier (inclusiv secțiuni din creierul mare, cerebel și bulb rahidian/punte)
                                       
                                       
                                          rinichi
                                       
                                       
                                          hipofiză
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cec
                                       
                                       
                                          glande lacrimale (extraorbitale)
                                       
                                       
                                          prostată
                                       
                                       
                                          tiroidă
                                       
                                    
                                          col uterin
                                       
                                       
                                          ficat
                                       
                                       
                                          rect
                                       
                                       
                                          [limbă]
                                       
                                    
                                          glande coagulante
                                       
                                       
                                          plămân
                                       
                                       
                                          glande salivare
                                       
                                       
                                          trahee
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          noduli limfatici (superficiali și de profunzime)
                                       
                                       
                                          veziculă seminală
                                       
                                       
                                          vezică urinară
                                       
                                    
                                          duoden
                                       
                                       
                                          glande mamare (obligatoriu pentru femele și, dacă se pot diseca vizibil, de la masculi)
                                       
                                       
                                          mușchi scheletici
                                       
                                       
                                          uter (inclusiv colul uterin)
                                       
                                    
                                          epididim
                                       
                                       
                                          [căi respiratorii superioare, inclusiv nasul, cornetele nazale și sinusurile paranazale]
                                       
                                       
                                          piele
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          ochi (inclusiv retina)
                                       
                                       
                                          esofag
                                       
                                       
                                          măduva spinării (la trei niveluri: cervical, toracic și lombar)
                                       
                                       
                                          [uretră]
                                       
                                    
                                          [femur cu articulație]
                                       
                                       
                                          [bulb olfactiv]
                                       
                                       
                                          splină
                                       
                                       
                                          vagin
                                       
                                    
                                          vezica biliară (pentru alte specii în afară de șobolan)
                                       
                                       
                                          ovar
                                       
                                       
                                          [stern],
                                       
                                       
                                          secțiune de măduvă osoasă și/sau aspirat proaspăt de măduvă
                                       
                                    
                                          glandă lacrimală
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    În cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, se conservă ambele organe. Observațiile clinice și de altă natură pot să conducă la necesitatea de a examina țesuturi suplimentare. Se conservă și alte organe considerate probabile organe-țintă pentru substanța chimică testată, având în vedere proprietățile sale cunoscute. În studiile care implică administrarea pe cale cutanată, se păstrează lista organelor specificată pentru calea orală și este esențială prelevarea specifică și conservarea pielii de la locul de aplicare. În studiile de inhalare, lista de țesuturi conservate și examinate din căile respiratorii urmează recomandările capitolului B.8 din prezenta anexă (8) și ale capitolului B.29 din prezenta anexă (9). Pentru alte organe/țesuturi (și suplimentar față de țesuturile conservate specific din căile respiratorii) se examinează lista organelor specificate pentru calea de administrare orală.
                           
                        
                     Examenul histopatologic
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              Sunt disponibile orientări privind cele mai bune practici în desfășurarea studiilor de patologie toxicologică (32). Examinările histopatologice minime sunt:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile din grupurile tratate cu doza maximă și din grupurile martor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile de la animalele care au murit sau au fost sacrificate în cursul studiului;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile prezentând anomalii macroscopice;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          țesuturile-țintă sau țesuturile care au prezentat modificări legate de tratamentul din grupul tratat cu doză maximă, de la toate animalele din toate grupurile pentru celelalte doze;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, trebuie să se examineze ambele organe.
                                       
                                    
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Se furnizează date individuale despre animale pentru toți parametrii evaluați. În plus, toate datele trebuie rezumate în formă tabelară, pentru fiecare grup testat indicându-se numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în timpul testului sau sacrificate din motive umane și momentul morții sau al sacrificării, numărul de animale prezentând simptome de toxicitate, o descriere a simptomelor de toxicitate, în special momentul apariției acestora, durata și severitatea tuturor efectelor toxice, numărul animalelor ce prezintă leziuni, tipul leziunilor și procentul animalelor prezentând fiecare tip de leziune. Tabelele cu date sumare prezintă mediile și deviațiile standard (pentru date de testare continue) la animalele care prezintă efecte toxice sau leziuni, plus clasificarea leziunilor.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Datele istorice de control pot fi utile pentru interpretarea rezultatelor studiului, de exemplu în cazul în care există indicații că datele provenite de la grupurile martor studiate în paralel nu sunt în concordanță, într-o măsură substanțială, cu datele recente de la animale din grupul martor din aceeași unitate/colonie de testare. În cazul în care sunt evaluate, datele istorice de control se transmit de la același laborator și se referă la animale de aceeași vârstă și din aceeași sușă cu cele generate în cursul unei perioade de cinci ani înainte de studiul în cauză.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Dacă este cazul, datele numerice se evaluează printr-o metodă statistică adecvată și general acceptată. Metodele statistice și datele care urmează să fie analizate trebuie să fie selecționate în etapa de concepție a studiului (punctul 8). Selecția ia în considerare ajustări în funcție de supraviețuire, dacă este necesar.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să conțină următoarele date:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritatea și proprietățile fizico-chimice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa substanței;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul lotului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certificatul de analiză chimică.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul (dacă este cazul):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animalele testate:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      specia/sușa folosite și justificarea alegerii făcute;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, vârsta și sexul animalelor la începutul testului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea fiecărui animal la începutului testului.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea căii de administrare și a dozelor alese;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dacă este cazul, metodele statistice folosite pentru analiza datelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind formularea/includerea în hrană a substanței testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date analitice privind concentrația atinsă, stabilitatea și omogenitatea preparatului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      calea de administrare și detalii privind administrarea substanței testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pentru studiile de inhalare, dacă expunerea a fost în zona nasului sau a întregului corp;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozele reale (mg/kg greutate corporală/zi) și factorul de conversie a substanței testate din concentrație în hrană sau apa potabilă (mg/kg sau ppm) la doza reală, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii cu privire la calitatea hranei și apei.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate (se prezintă date tabelare rezumate și date individuale privind animalele):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date privind supraviețuirea;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală/modificările în greutatea corporală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      consumul de hrană, calcule privind eficiența hranei, dacă s-au efectuat, precum și consumul de apă, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultate privind răspunsul toxic, pe sexe și niveluri ale dozelor, inclusiv simptome de toxicitate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura, incidența (și, dacă s-a evaluat, gravitatea) și durata semnelor clinice (dacă sunt reversibile sau permanente);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele examenului oftalmologic;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teste hematologice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      teste de biochimie clinică;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analize de urină;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele tuturor investigațiilor de neurotoxicitate sau imunotoxicitate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală finală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutățile organelor (și rapoartele lor, dacă este cazul);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concluziile autopsiei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      o descriere detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice în legătură cu tratamentul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date referitoare la absorbție, dacă este cazul.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Interpretarea statistică a rezultatelor, după caz.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Discutarea rezultatelor, care include următoarele aspecte:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relații doză-răspuns;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      considerarea tuturor informațiilor privind modul de acțiune;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea tuturor abordărilor privind modelarea;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      determinarea valorilor BMD, NOAEL sau LOAEL;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date istorice de control;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relevanța pentru om.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Concluzii.
                                          
                                       
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1995), Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Combes R.D., Gaunt I., Balls M. (2004), A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System, ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W. et al. (2002), Hazard identification by methods of animal-based toxicology, Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003), Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Capitolul B.27 din prezenta anexă, «Testul de toxicitate orală subcronică. Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare».
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              OECD (2012), Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Capitolul B.8 din prezenta anexă, «Toxicitate subacută prin inhalare: studiu de 28 zile».
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Capitolul B.29 din prezenta anexă, «Toxicitate subcronică prin inhalare: studiu de 90 de zile».
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Capitolul B.9 din prezenta anexă, «Toxicitate la doză repetată (28 de zile) (administrare cutanată)».
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R. et al. (2006), Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements, Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T. et al. (2006), The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A. et al. (2006), A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M. et al. (2006), A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              OECD (2002), Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007), Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997), Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran J.A. (ed.). ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice, JO L 276, 20.10.2010, p. 33.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23, Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988), Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006), Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001), A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes, Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              IPCS (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Tupper D.E., Wallace R.B. (1980), Utility of the Neurologic Examination in Rats, Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Gad S.C. (1982), A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology, J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991), Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz, Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979), A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice, Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991), Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments, Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996), Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies, Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              EMEA (draft) document «Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity» (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Crissman J.W., Goodman D.G., Hildebrandt P.K. et al. (2004), Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology, Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚIE
                     Substanță chimică testată: Orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  ”
            
                  6.
               
               
                  Capitolele B.32 și B.33 se înlocuiesc cu următorul text:
                  „B.32.   STUDII DE CARCINOGENITATE
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 451 (2009) a OCDE. Orientarea originală 451 privind carcinogenitatea a fost adoptată în 1981. S-a considerat necesară elaborarea acestei metode de testare revizuite B.32 pentru a reflecta evoluțiile recente în domeniul bunăstării animalelor și cerințelor de reglementare (2) (3) (4) (5) (6). Actualizarea acestei metode de testare B.32 s-a realizat în paralel cu revizuirea capitolului B.30 din prezenta anexă, «Studii de toxicitate cronică», și capitolului B.33 din prezenta anexă, «Studii combinate de toxicitate cronică și carcinogenitate», cu obiectivul de a obține informații suplimentare de la animalele folosite în studiu și furnizând detalii suplimentare privind alegerea dozelor. Această metodă testare B.32 este concepută pentru a fi utilizată la testarea unei game largi de substanțe, inclusiv pesticide și produse chimice industriale. Trebuie reținut însă faptul că unele detalii și cerințe pot fi diferite pentru produsele farmaceutice [a se vedea documentul «International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals»].
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Majoritatea studiilor de carcinogenitate sunt efectuate pe specii de rozătoare, prin urmare, această metodă de testare este destinată în primul rând studiilor efectuate pe aceste specii. În cazul în care sunt necesare studii pe specii de nerozătoare, se aplică principiile subliniate în această metodă de testare și cele din capitolul B.27 din prezenta anexă, «Testul de toxicitate orală subcronică. Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare» (6), cu modificările corespunzătoare. Orientări suplimentare sunt disponibile în Ghidul OCDE nr. 116 privind protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Cele trei căi de administrare principale folosite în studiile de carcinogenitate sunt orală, cutanată și prin inhalare. Alegerea căii de administrare depinde de caracteristicile fizice și chimice ale substanței testate și de calea de expunere probabilă în cazul omului. Informații suplimentare privind alegerea căii de expunere sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Această metodă de testare se axează pe expunerea prin intermediul căii orale, calea cea mai folosită în cadrul studiilor de carcinogenitate. Pentru evaluarea riscului pentru sănătatea umană pot fi necesare și studii de carcinogenitate implicând căi de expunere cutanată sau prin inhalare și/sau acestea pot fi necesare în cadrul anumitor regimuri de reglementare, dar aceste două căi de expunere implică o complexitate tehnică considerabilă. Asemenea studii trebuie concepute de la caz la caz, deși metoda de testare prezentată aici pentru evaluarea carcinogenității la administrare orală poate constitui baza unui protocol pentru studiile de inhalare și/sau cutanate, în legătură cu recomandările pentru perioadele de tratament, parametrii clinici și patologici etc. Sunt disponibile orientări OCDE privind administrarea substanțelor chimice testate prin inhalare (7) și pe cale cutanată (7) (8). Capitolul B.8 din prezenta anexă (9) și capitolul B.29 din prezenta anexă (10), împreună cu Ghidul OCDE privind testarea toxicității acute prin inhalare (8) trebuie consultate în mod special la conceperea unor studii mai lungi implicând expunerea prin inhalare. Capitolul B.9 din prezenta anexă (11) trebuie consultat în cazul testării expunerii prin intermediul căii cutanate.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Studiul de carcinogenitate furnizează informații despre posibilele pericole pentru sănătate care pot fi antrenate de expunerea repetată pe o parte considerabilă a perioadei de viață a speciei utilizate. Studiul va furniza informații privind efectele toxice ale substanței testate, inclusiv potențiala carcinogenitate și poate indica organele-țintă și posibilitatea de acumulare. El poate furniza, de asemenea, o estimare a nivelului efectelor toxice la care nu se observă efecte adverse, iar în cazul agenților carcinogeni fără efect genotoxic, a nivelului răspunsurilor tumorale, informație care poate fi folosită la stabilirea criteriilor pentru expunere umană. Se subliniază, de asemenea, necesitatea observării clinice atente a animalelor, astfel încât să se obțină cât mai multe informații posibil.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Obiectivele studiilor de carcinogenitate acoperite de această metodă de testare includ:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea proprietăților carcinogene ale unei substanțe chimice testate, conducând la o incidență crescută a neoplasmelor, o proporție crescută a neoplasmelor maligne sau a reducerii timpului de apariție a neoplasmelor comparativ cu grupurile martor studiate în paralel;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea organului (organelor) țintă pentru carcinogenitate;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea timpului până la apariția neoplasmelor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          caracterizarea relației doză-răspuns a tumorii;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea unui nivel la care nu se observă niciun efect advers (NOAEL) sau a punctului de pornire pentru stabilirea unei doze de referință (BMD);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          extrapolarea efectelor cancerigene la niveluri de expunere umană cu doză redusă;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          furnizarea de date pentru ipotezele de testare privind modul de acțiune (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              7.
                           
                           
                              În evaluarea carcinogenității potențiale a unei substanțe chimice testate, laboratorul de testare trebuie să ia în considerare toate informațiile disponibile privind substanța chimică testată, înainte de efectuarea testului, pentru un protocol mai eficient al testului privind potențialul cancerigen și pentru minimizarea utilizării animalelor. Informațiile și considerațiile privind modul de acțiune al unui prezumtiv agent carcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) sunt deosebit de importante, deoarece protocolul optim poate diferi în funcție de tipul substanței chimice testate, respectiv agent carcinogen genotoxic cunoscut sau prezumtiv. Orientări suplimentare asupra considerațiilor privind modul de acțiune se pot găsi în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informațiile care pot contribui la protocolul studiului includ identitatea, structura chimică și proprietățile fizico-chimie ale substanței chimice testate; rezultatele oricăror teste de toxicitate in vitro sau in vivo, inclusiv teste de genotoxicitate; utilizare (utilizări) anticipată (anticipate) și potențialul de expunere umană; date (Q)SAR disponibile, date de mutagenicitate/genotoxicitate, carcinogenitate și alte date toxicologice privind substanțe cu structură apropiată; date toxicocinetice disponibile (cinetica pentru doză unică și doză repetată, acolo unde sunt disponibile) și date rezultate din studii de expunere repetată. Evaluarea carcinogenității se efectuează doar după ce s-au obținut informațiile inițiale privind toxicitatea din testele de toxicitate la doză repetată de 28 de zile și/sau 90 de zile. Testele de inițiere-promovare a cancerului pe termen scurt pot furniza, de asemenea, informații utile. Se ia în considerare o abordare de testare pe etape a carcinogenității, ca parte a evaluării generale a potențialelor efecte adverse asupra sănătății a unei anumite substanțe chimice testate (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Metodele statistice cele mai adecvate pentru analiza rezultatelor, protocolul experimentului și obiective se stabilesc înainte de începerea studiului. Aspectele care trebuie luate în considerare sunt, de exemplu, necesitatea ca statisticile să includă ajustarea pentru supraviețuire, analiza riscurilor cumulate privind tumorile relativ la durata de supraviețuire, stabilitatea timpului până la apariția tumorii și analiza în cazul încheierii anticipate pentru unul sau mai multe grupuri. În Ghidul nr. 116 (7) și în Ghidul nr. 35 privind analiza și evaluarea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate (20) sunt prezentate orientări privind analizele statistice corespunzătoare și referințe de bază la metode statistice acceptate la nivel internațional.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              La efectuarea unui studiu de carcinogenitate trebuie să se respecte întotdeauna principiile și considerațiile din Ghidul OCDE nr. 19 privind recunoașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca puncte finale din considerente umane pentru animalele utilizate în scop experimental în evaluarea siguranței (21), în special punctul 62 al documentului. Acest punct stipulează că «În studiile care implică dozarea repetată, în cazul în care un animal prezintă semne clinice progresive, rezultând în deteriorarea în continuare a stării, se ia o decizie în cunoștință de cauză privind eutanasierea animalului. Decizia include considerații privind valoarea informațiilor care s-ar putea obține din păstrarea în continuare a animalului în studiu, în funcție de starea sa generală. În cazul în care se ia decizia de a menține animalul în cadrul testului, se crește frecvența observărilor, după cum este necesar. Poate fi de asemenea posibil, fără a afecta negativ scopul testului, să se întrerupă temporar dozarea sau să se reducă doza de testare, dacă astfel se reduce durerea sau suferința.»
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              În Ghidul nr. 116 (7), precum și în două publicații ale International Life Sciences Institute (22) (23) se pot găsi orientări detaliate privind principiile de selectare a dozei pentru studii de toxicitate cronică și carcinogenitate și discuții pe această temă. Strategia de selectare a dozei de bază depinde de obiectivul principal sau obiectivele studiului (punctul 6). La selectarea nivelurilor de dozare adecvate trebuie să se atingă un echilibru între depistarea pericolelor, pe de-o parte, și caracterizarea răspunsurilor la doză redusă și relevanța lor, pe de altă parte. Acest lucru este relevant în special în cazul în care se efectuează un studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anexă) (punctul 12).
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Trebuie să se aibă în vedere efectuarea unui studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anexă) în locul efectuării separate a unui studiu de toxicitate cronică (capitolul B.30 din această metodă de testare) și a unui studiu de carcinogenitate (această metodă de testare, B.32). Testul combinat oferă o eficiență mai mare din punct de vedere al timpului și costului, comparativ cu efectuarea a două studii separate, fără a compromite calitatea datelor din faza de toxicitate cronică sau de carcinogenitate. Cu toate acestea, trebuie acordată multă atenție principiilor selectării dozei (punctele 11 și 22-25) la efectuarea unui studiu combinat de toxicitate și carcinogenitate (capitolul B.33 din prezenta anexă) și se recunoaște, de asemenea, că pot fi necesare studii separate în anumite cadre de reglementare.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Definițiile folosite în contextul acestei metode de testare sunt prezentate la sfârșitul acestui capitol și în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              14.
                           
                           
                              Substanța chimică testată se administrează zilnic, de obicei pe cale orală, în doze graduale, câtorva grupuri de animale testate, pe cea mai mare parte din durata lor de viață. Poate fi adecvată și testarea pentru căile de expunere prin inhalare sau cutanată. Animalele sunt examinate atent în legătură cu prezența semnelor de toxicitate și cu apariția leziunilor neoplazice. Animalele care mor sau care sunt sacrificate în cursul testului trebuie să fie supuse unei autopsii, iar la încheierea testului se eutanasiază și se autopsiază animalele care au supraviețuit.
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Această metodă de testare acoperă, în principal, evaluarea carcinogenității la rozătoare (punctul 2). Utilizarea unor specii de nerozătoare poate fi luată în considerare în cazul în care datele disponibile sugerează că acestea sunt mai relevante pentru estimarea efectelor asupra sănătății la om. Alegerea speciei trebuie să fie justificată. Specia de rozătoare preferată este șobolanul, deși pot fi folosite și alte specii de rozătoare, de exemplu șoarecele. Deși utilizarea șoarecilor în testele de carcinogenitate poate avea o utilitate limitată (24) (25) (26), în cadrul unor programe de reglementare curente se impune testarea carcinogenității pe șoareci, în afară de cazul în care se determină faptul că asemenea studiu nu este necesar din punct de vedere științific. Șobolanii și șoarecii au fost modelele experimentale preferate din cauza duratei lor de viață relativ scurte, utilizării lor pe scară largă în studii de farmacologie în toxicologie, receptivității lor privind inducerea tumorilor și disponibilității unor sușe cu un nivel suficient de caracterizare. Ca o consecință a acestor caracteristici, este disponibil un volum mare de informații privind fiziologia și patologia lor. Informații suplimentare privind alegerea speciei și sușei sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Se utilizează animale adulte, tinere, sănătoase, provenind din sușele folosite în mod obișnuit în laboratoare. Studiul carcinogenității se efectuează, de preferință, pe animale din aceeași sușă și sursă cu cele folosite în studiul (studiile) de toxicitate preliminare de durată mai scrută dar, în cazul în care se știe că animalele din această sușă și sursă prezintă probleme în atingerea criteriilor de supraviețuire acceptate în mod normal pentru studiile pe termen lung [a se vedea Ghidul nr. 116 (7)], se ia în considerare utilizarea unei sușe de animale care au o rată de supraviețuire acceptabilă pentru studiul pe termen lung. Femelele trebuie să fie nulipare și să nu fie gestante.
                           
                        
                     Adăpostire și hrănire
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Animalele pot fi adăpostite în cuști fie individual, fie în grupuri mici de același sex; se ia în considerare adăpostirea individuală a animalelor doar dacă există o justificare științifică (27) (28) (29). Cuștile sunt aranjate astfel încât să se reducă la minimum posibilele efecte provocate de această aranjare. Temperatura camerei în care se află animalele utilizate în scop experimental este de 22 °C (± 3 °C). Deși se recomandă ca umiditatea relativă să fie de cel puțin 30 % și să nu depășească, de preferință, 70 %, cu excepția momentului în care se curăță camera, se tinde spre un nivel de 50-60 %. Iluminatul este artificial, alternând 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Regimul alimentar trebuie să satisfacă toate cerințele nutriționale ale speciei testate iar conținutul de contaminanți alimentari care ar putea influența rezultatul testului, incluzând reziduuri de pesticide, poluanți organici persistenți, fitoestrogeni, metale grele și micotoxine, dar fără limitare la acestea, trebuie să fie cât mai redus posibil. Informațiile analitice privind nutrienții și nivelurile de contaminanți din regimul alimentar se generează periodic, cel puțin la începutul studiului și atunci când există o modificare a grupului folosit și se includ în raportul final. În mod similar, se furnizează informații analitice privind apa potabilă folosită în cadrul studiului. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a asigura o proporție adecvată a substanței testate și de a satisface cerințele nutriționale ale animalelor, în cazul administrării substanței testate prin alimentație.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Se utilizează animale sănătoase, care au fost aclimatizate la condițiile de laborator timp de cel puțin 7 zile și nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare. În cazul rozătoarelor, administrarea începe cât mai curând posibil după înțărcare și aclimatizare și, preferabil, înainte de vârsta de 8 săptămâni. Pentru animalele testate se precizează specia, sușa, sursa, sexul, greutatea și vârsta. La începutul studiului, variațiile în greutate între animalele utilizate pentru fiecare sex trebuie să fie minime și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a tuturor animalelor în cadrul studiului, separat pentru fiecare sex. Animalele se repartizează aleator în grupurile tratate și grupurile martor. După randomizare, nu trebuie să existe diferențe semnificative între greutățile corporale medii ale grupurilor din cadrul fiecărui sex. În cazul în care există diferențe semnificative din punct de vedere statistic, se repetă etapa de randomizare, dacă este posibil. Fiecărui animal i se atribuie un număr unic de identificare și este marcat permanent cu acest număr prin tatuare, implantare de microcip sau altă metodă adecvată.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Numărul și sexul animalelor
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Se folosesc ambele sexe. Se folosește un număr suficient de animale, astfel încât să fie posibilă o evaluare biologică și statistică temeinică. Prin urmare, fiecare grup de dozare și grup martor paralel trebuie să conțină minimum 50 de animale de același sex. În funcție de scopul studiului, poate fi posibil să se crească puterea statistică a estimărilor de bază, prin alocarea diferențiată a animalelor în mod inegal la diferitele grupuri de doze, cu mai mult de 50 de animale în grupurile cu doze mici; de exemplu, pentru a estima potențialul cancerigen la doze mici. Cu toate acestea, trebuie recunoscut faptul că o creștere moderată a dimensiunii grupului va produce o creștere redusă a puterii statistice a studiului. Informații suplimentare privind protocolul statistic al studiului și alegerea nivelului de dozare pentru maximizarea puterii statistice sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7).
                           
                        
                     Sacrificări pe parcurs și grupuri satelit (santinelă)
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Studiul poate prevedea sacrificări pe parcurs, de exemplu la 12 luni, pentru a asigura informații privind evoluția modificărilor neoplazice și informații mecaniciste, dacă există justificare științifică. În cazul în care asemenea informații sunt deja disponibile din studii anterioare de toxicitate la doză repetată asupra substanței testate, este posibil ca sacrificările pe parcurs să nu fie justificate din punct de vedere științific. În cazul în care sacrificările pe parcurs sunt incluse în protocolul studiului, numărul de animale din fiecare grup de dozare programat pentru sacrificare pe parcurs va fi, de obicei, de 10 animale din fiecare sex, iar numărul total de animale incluse în concepția studiului trebuie să se suplimenteze cu numărul de animale programate să fie sacrificate înainte de încheierea studiului. Se poate include, de asemenea, un grup suplimentar de animale santinelă (de obicei 5 animale din fiecare sex) pentru monitorizarea stării de boală în timpul studiului, dacă este necesar (30). Orientări suplimentare sunt prezentate în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                     Grupuri de doze și dozare
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              În Ghidul nr. 116 (7) sunt furnizate orientări privind toate aspectele în legătură cu selectarea dozelor și intervalele dintre nivelurile de dozare. Se utilizează cel puțin trei doze diferite și un grup martor paralel. Nivelul dozelor este stabilit în general în funcție de rezultatele studiilor pe termen mai scurt cu doză repetată sau ale studiilor de stabilire a intervalului și iau în considerare orice date toxicologice și toxico-cinetice disponibile pentru substanța chimică testată sau substanțe înrudite.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Cu excepția cazului în care există limite impuse de natura fizico-chimică sau de efectele biologice ale substanței chimice testate, nivelul cu doza cea mai mare se alege astfel încât să se identifice principalele organe țintă și efectele toxice, fără să se inducă suferințe, toxicitate severă, morbiditate sau moartea. Luând în considerare factorii prezentați la punctul 23 de mai jos, se alege nivelul de cea mai mare doză pentru a produce dovezi de toxicitate, evidențiată, de exemplu, prin diminuarea ritmului de creștere în greutate (aproximativ 10 %). Cu toate acestea, în funcție de obiectivele studiului (a se vedea punctul 6), se poate alege o doză maximă mai mică decât doza care furnizează dovada toxicității, de exemplu, în cazul în care o doză provoacă un efect advers îngrijorător care are totuși un efect redus asupra duratei de viață sau a greutății corporale.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Nivelurile dozelor și intervalul dintre nivelurile de dozare se pot alege astfel încât să se stabilească o reacție doză-răspuns și, în funcție de substanța chimică testată, un NOAEL sau un rezultat intenționat al studiului, de exemplu o BMD (a se vedea punctul 25) la nivelul dozei minime. Printre factorii care trebuie luați în considerare la stabilirea dozelor inferioare se includ panta anticipată a curbei doză-răspuns, dozele la care se pot produce modificări importante în metabolism sau în modul de acțiune toxică, nivelul la care se anticipează un prag sau nivelul la care este anticipat punctul de pornire pentru extrapolarea la doză redusă.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Intervalele dintre nivelurile de dozare vor depinde de caracteristicile substanței chimice testate și nu pot fi prescrise în această metodă de testare, dar o performanță bună a testului se obține în mod frecvent cu un factor de 2 până la 4 la formarea seriei descrescătoare a dozelor, iar adăugarea unui al patrulea grup de probă este adesea preferabilă folosirii unor intervale cu factori foarte mari (de exemplu, mai mari de 6-10) între doze. În general se evită utilizarea unor factori peste 10 și, în cazul în care sunt utilizați, trebuie să se prezinte justificarea.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Așa cum se arată în Ghidul nr. 116 (7), aspectele care sunt luate în considerare la selectarea dozei includ:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          neliniarități sau puncte de inflexiune cunoscute sau prezumptive în relația doză-răspuns;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aspecte toxicocinetice și intervale ale dozelor în care intervin sau nu intervin inducția metabolică, saturația sau neliniaritatea între dozele externe și interne;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          leziuni precursoare, markere de efect sau indicatori ai acțiunii unor procese biologice de bază;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aspecte de bază (sau prezumtive) ale modului de acțiune, de exemplu doze la care începe să apară citotoxicitatea, la care sunt perturbate nivelurile hormonale, sunt excedate mecanismele homeostazice etc.;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          regiunile curbei doză-răspuns unde este necesară o estimare deosebit de precisă, de exemplu în domeniul BMD anticipate sau al unui prag anticipat;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          considerații privind nivelurile de expunere umană anticipate.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              Grupul martor nu este supus tratamentului sau i se administrează exclusiv vehiculul, în cazul în care pentru administrarea substanței testate se utilizează un vehicul. Cu excepția administrării substanței chimice testate, animalele din grupul martor sunt tratate în mod identic cu acelea din grupurile testate. Dacă se utilizează un vehicul, grupului martor i se administrează cel mai mare volum de vehicul utilizat pentru grupurile de dozare. Dacă substanța chimică testată se administrează în hrană și determină diminuarea semnificativă a consumului de hrană din savorii reduse, poate fi considerată necesară utilizarea unui grup martor hrănit în paralel.
                           
                        
                     Pregătirea dozelor și administrarea substanței chimice testate
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Substanța chimică testată se administrează de obicei oral, prin alimente ori prin apa potabilă, sau prin gavaj. Informații suplimentare privind căile și metodele de administrare sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7). Calea și metoda de administrare depind de scopul studiului, de caracteristicile fizice și chimice ale substanței testate, de biodisponibilitatea sa și de calea și metoda de expunere predominante în cazul omului. Trebuie să se prezinte justificarea pentru calea și metoda de administrare alese. Din rațiuni care țin de bunăstarea animalelor, gavajul oral se alege, de obicei, doar pentru acei agenți la care această cale și metodă de administrare reprezintă în mod rezonabil expunerea umană (de exemplu, produse farmaceutice). Pentru substanțe din hrană sau mediu, inclusiv pesticide, administrarea se face de obicei prin intermediul regimului alimentar sau al apei potabile. Cu toate acestea, pentru unele scenarii, de exemplu expunerea ocupațională, pot fi mai adecvate alte căi de expunere.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Dacă este necesar, substanța chimică testată se dizolvă sau se aduce în formă de suspensie într-un vehicul adecvat. Trebuie luate în considerare următoarele caracteristici ale vehiculului și ale altor aditivi, după caz: efectele acestuia asupra absorbției, distribuției, metabolismului sau retenției substanței testate, care i-ar putea afecta caracteristicile toxice; efectele asupra consumului de hrană sau de apă sau asupra stării de nutriție a animalului. Se recomandă, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluții/suspensii apoase, apoi a unei soluții/emulsii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și apoi a unei alte soluții posibile în alte vehicule. Pentru alte vehicule decât apa, este necesar să se cunoască proprietățile toxice ale vehiculului. Trebuie să fie disponibile informații privind stabilitatea substanței testate și omogenitatea soluțiilor sau regimurilor alimentare (după caz) în condițiile administrării (de exemplu, prin hrană).
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              În cazul substanțelor administrate prin intermediul hranei sau al apei potabile, este important să se asigure că bilanțul nutrițional sau hidric normal nu este afectat de cantitatea de substanță chimică testată utilizată. În studiile de toxicitate pe termen lung folosind administrarea prin hrană, concentrația substanței testate în hrană nu trebuie să depășească, de regulă, o limită superioară de 5 % din totalul regimului alimentar, pentru a evita dezechilibrele nutriționale. Când substanța chimică testată este administrată în hrană, se poate folosi fie o concentrație constantă în hrană (mg/kg alimente sau ppm), fie o doză de nivel constant în raport cu greutatea animalului (mg/kg greutate corporală), calculată săptămânal. Trebuie să se precizeze alternativa utilizată.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              În cazul administrării orale, animalele primesc zilnic doza de substanță chimică testată (șapte zile pe săptămână), de obicei pe o perioadă de 24 de luni pentru rozătoare (a se vedea și punctul 32). Orice alt regim de dozare, de exemplu cinci zile pe săptămână, trebuie justificat. În cazul administrării cutanate, animalele sunt tratate de obicei cu substanța chimică testată timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe săptămână, așa cum se specifică în capitolul B.9 din prezenta anexă (11), pe o perioadă de 24 de luni. Expunerea prin inhalare se face timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe săptămână, dar se poate folosi și expunerea timp de 5 zile pe săptămână, dacă este justificată. Expunerea va fi de obicei pe o perioadă de 24 de luni. În cazul în care sunt expuse alte specii de rozătoare decât șobolanii doar în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi ajustate pentru minimizarea suferinței specifice speciei. În cazul în care durata expunerii este sub 6 ore pe zi, se prezintă o justificare. A se vedea și capitolul B.8 din prezenta anexă (9).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Când substanța chimică testată se administrează prin gavaj, ea se administrează animalelor folosind o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată, la momente apropiate în fiecare zi. De obicei se administrează o doză unică, o dată pe zi; în cazul în care, de exemplu, o substanță are efect iritant local, rata dozei zilnice poate fi menținută prin administrare ca doză fracționată (de două ori pe zi). Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o singură dată depinde de greutatea animalului testat. Volumul se menține cât mai redus posibil și de obicei nu trebuie să depășească 1 ml/100 g greutate corporală pentru rozătoare (31). Variațiile volumului administrat trebuie reduse la minimum prin modificarea concentrației, astfel încât să se asigure un volum constant la toate nivelurile dozelor. Substanțele potențial corozive sau iritante constituie o excepție și trebuie diluate pentru a evita efecte locale grave. Se evită testarea la concentrații la care este probabil să fie corozive pentru tractul gastrointestinal.
                           
                        
                     Durata studiului
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              De regulă, durata studiului este de 24 de luni pentru rozătoare, reprezentând cea mai mare parte a duratei de viață a animalelor utilizate. Se pot folosi durate mai scurte sau mai lungi, în funcție de durata de viață a sușei și speciei de animale utilizate în studiu, dar acestea trebuie să fie justificate. Pentru sușe specifice de șoareci, de exemplu AKR/J, C3H/J sau C57BL/6J, poate fi mai adecvată o durată de 18 luni. În continuare, se prezintă orientări privind durata studiului, încetarea sa și supraviețuirea; orientări suplimentare, inclusiv considerații privind posibilitatea de acceptare a unei carcinogenități negative în raport cu rata de supraviețuire, sunt prezentate în Ghidul nr. 116 privind protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate (7).
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          încheierea studiului trebuie să fie luată în considerare când numărul de supraviețuitori din grupurile cu niveluri reduse de dozare sau din grupurile martor scade sub 25 %;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în cazul în care doar grupul cu nivel ridicat de dozare moare prematur din cauza toxicității, acest lucru nu determină încheierea studiului;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          supraviețuirea la fiecare sex este luată în considerare separat;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          studiul nu se va extinde dincolo de punctul unde datele disponibile din studiu nu mai sunt suficiente pentru a permite efectuarea unei evaluări valabile din punct de vedere statistic.
                                       
                                    
                        OBSERVAȚII
                  
                              33.
                           
                           
                              Toate animalele sunt examinate pentru a constata simptome de morbiditate și mortalitate, de regulă la începutul și la sfârșitul fiecărei zile, inclusiv în zilele de weekend și sărbători. Animalele se examinează în plus o dată pe zi, de preferat la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, pentru simptome specifice cu relevanță toxicologică, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare, în cazul administrării prin gavaj. O atenție deosebită trebuie acordată evoluției tumorilor; se înregistrează momentul apariției, localizarea, dimensiunile, aspectul și dezvoltarea atât a tumorilor vizibile macroscopic, cât și a celor palpabile.
                           
                        
                     Greutatea corporală, consumul de hrană și apă și eficiența hranei
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Toate animalele se cântăresc la începutul tratamentului, cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior. Măsurătorile consumului de hrană și ale eficienței hranei se fac cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior. Consumul de apă se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni și cel puțin o dată pe lună ulterior, în cazul în care substanța chimică testată este administrată în apa potabilă. Măsurătorile consumului de apă se iau în considerare și la studiile în care băutul suferă modificări.
                           
                        
                     Determinările hematologice, biochimice și de alt tip
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Pentru maximizarea informațiilor obținute din studiu, în special pentru considerațiile privind modul de acțiune, se recoltează probe de sânge pentru analize hematologice și biochimice, la aprecierea conducătorului studiului. Poate fi indicată și analiza urinei. Orientări suplimentare privind utilitatea recoltării unor asemenea probe ca parte a studiului de carcinogenitate sunt prezentate în Ghidul OCDE nr. 116 (7). Dacă se consideră adecvat, recoltarea de probe de sânge pentru determinările hematologice și analiza urinei se pot efectua ca parte a unei sacrificări pe parcurs (punctul 20) și la încheierea studiului, pe minimum 10 animale din fiecare sex și grup. Probele de sânge sunt prelevate dintr-un punct determinat, de exemplu prin puncție cardiacă sau din sinusul retro-orbital, sub anestezie, și sunt păstrate, dacă este cazul, în condiții adecvate. Se pot prepara și frotiuri sangvine pentru examinare, în special dacă măduva osoasă pare a fi organul-țintă, deși s-a pus la îndoială valoarea acestei examinări pentru evaluarea potențialului carcinogen/oncogen (32).
                           
                        PATOLOGIA
                  
                     Autopsia
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Toate animalele care participă la studiu, cu excepția animalelor santinelă (a se vedea punctul 20) și altor animale satelit, sunt supuse unei autopsii complete, care să includă o examinare aprofundată a suprafeței externe a corpului, a tuturor orificiilor, a cavității craniene, toracice și abdominale și a conținutului acestora. Animalele santinelă și alte animale satelit pot necesita autopsierea de la caz la caz, la aprecierea conducătorului studiului. În mod obișnuit, greutatea organelor nu face parte dintr-un studiu de carcinogeneză, deoarece modificările geriatrice și, în stadii mai târzii, formarea tumorilor, afectează utilitatea datelor privind greutatea organelor. Ele pot fi însă critice pentru o evaluare bazată pe forța probantă a datelor și, în special, pentru considerații privind modul de acțiune. În cazul în care sunt parte a unui studiu satelit, ele sunt colectate nu mai târziu de un an de la inițierea studiului.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Următoarele țesuturi se conservă în mediul de fixare cel mai adecvat pentru țesut și pentru examinarea histopatologică ulterioară intenționată (33) (țesuturile trecute între paranteze pătrate sunt opționale):
                              
                                          toate leziunile macroscopice
                                       
                                       
                                          inimă
                                       
                                       
                                          pancreas
                                       
                                       
                                          stomac (stomacul anterior, stomacul glandular)
                                       
                                    
                                          glande suprarenale
                                       
                                       
                                          ileon
                                       
                                       
                                          glande paratiroide
                                       
                                       
                                          [dinți]
                                       
                                    
                                          aortă
                                       
                                       
                                          jejun
                                       
                                       
                                          nervi periferici
                                       
                                       
                                          testicule
                                       
                                    
                                          creier (inclusiv secțiuni din creierul mare, cerebel și bulb rahidian/punte)
                                       
                                       
                                          rinichi
                                       
                                       
                                          hipofiză
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cec
                                       
                                       
                                          glandele lacrimale (extraorbitale)
                                       
                                       
                                          prostată
                                       
                                       
                                          tiroidă
                                       
                                    
                                          col uterin
                                       
                                       
                                          ficat
                                       
                                       
                                          rect
                                       
                                       
                                          [limbă]
                                       
                                    
                                          glande coagulante
                                       
                                       
                                          plămân
                                       
                                       
                                          glande salivare
                                       
                                       
                                          trahee
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          noduli limfatici (superficiali și de profunzime)
                                       
                                       
                                          veziculă seminală
                                       
                                       
                                          vezică urinară
                                       
                                    
                                          duoden
                                       
                                       
                                          glande mamare (obligatoriu pentru femele și, dacă se pot diseca vizibil, de la masculi)
                                       
                                       
                                          mușchi scheletici
                                       
                                       
                                          uter (inclusiv colul uterin)
                                       
                                    
                                          epididim
                                       
                                       
                                          [căi respiratorii superioare, inclusiv nasul, cornetele nazale și sinusurile paranazale]
                                       
                                       
                                          piele
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          ochi (inclusiv retina)
                                       
                                       
                                          esofag
                                       
                                       
                                          măduva spinării (la trei niveluri: cervical, toracic și lombar)
                                       
                                       
                                          [uretră]
                                       
                                    
                                          [femur cu articulație]
                                       
                                       
                                          [bulb olfactiv]
                                       
                                       
                                          splină
                                       
                                       
                                          vagin
                                       
                                    
                                          vezica biliară (pentru alte specii în afară de șobolan)
                                       
                                       
                                          ovar
                                       
                                       
                                          [stern],
                                       
                                       
                                          secțiune de măduvă osoasă și/sau aspirat proaspăt de măduvă
                                       
                                    
                                          glandă lacrimală
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    În cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, se conservă ambele organe. Observațiile clinice și de altă natură pot să conducă la necesitatea de a examina țesuturi suplimentare. Se conservă și alte organe considerate probabile organe-țintă, având în vedere proprietățile cunoscute ale substanței testate. În studiile care implică administrarea pe cale cutanată, se păstrează lista organelor specificată pentru calea orală și este esențială prelevarea specifică și conservarea pielii de la locul de aplicare. În studiile de inhalare, lista de țesuturi conservate și examinate din căile respiratorii urmează recomandările capitolelor B.8 și B.29 din prezenta anexă. Pentru alte organe/țesuturi (și suplimentar față de țesuturile conservate specific din căile respiratorii) se examinează lista organelor specificate pentru calea de administrare orală.
                           
                        
                     Examenul histopatologic
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Sunt disponibile orientări privind cele mai bune practici în desfășurarea studiilor de patologie toxicologică (33). Țesuturile supuse examinărilor histopatologice includ, cel puțin următoarele:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile din grupurile tratate cu doza maximă și din grupurile martor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile de la animalele care au murit sau au fost sacrificate în cursul studiului;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile prezentând anomalii macroscopice, inclusiv tumori;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în cazul în care se observă modificări histopatologice în legătură cu tratamentul în grupul tratat cu doză maximă, acele țesuturi se vor examina la toate animalele din toate celelalte grupuri de dozare;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în cazul organelor perechi, de exemplu rinichi, glande suprarenale, se examinează ambele organe.
                                       
                                    
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Se furnizează date individuale despre animale pentru toți parametrii evaluați. În plus, toate datele trebuie rezumate în formă tabelară, arătându-se pentru fiecare grup testat, numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în timpul testului sau sacrificate din motive umane și momentul morții sau al sacrificării, numărul de animale prezentând simptome de toxicitate, o descriere a simptomelor de toxicitate, în special momentul apariției acestora, durata și severitatea tuturor efectelor toxice, numărul animalelor prezentând leziuni, tipul leziunilor și procentul animalelor prezentând fiecare tip de leziune. Tabele cu date sumare prezintă mediile și deviațiile standard (pentru date de testare continue) la animalele care prezintă efecte toxice sau leziuni, plus clasificarea leziunilor.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Datele istorice de control pot fi utile pentru interpretarea rezultatelor studiului, de exemplu în cazul în care există indicații că datele furnizate de animale din grupul martor paralel nu sunt în concordanță, într-o măsură substanțială, cu datele recente de la animale din grupul martor din aceeași unitate/colonie de testare. În cazul în care sunt evaluate, datele martor anterioare se transmit de la același laborator și se referă la animale de aceeași vârstă și din aceeași sușă cu cele generate în ultimii cinci ani înaintea studiului în cauză.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Dacă este cazul, datele numerice se evaluează printr-o metodă statistică adecvată și general acceptată. Metodele statistice și datele care urmează să fie analizate trebuie să fie selecționate în etapa de concepție a studiului (punctul 9). Selecția ia în considerare ajustări pentru supraviețuire, dacă este necesar.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Raportul de testare conține următoarele date:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritatea și proprietățile fizico-chimice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa substanței;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul lotului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certificatul de analiză chimică.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul (dacă este cazul):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animalele testate:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      specia/sușa folosite și justificarea alegerii făcute;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, vârsta și sexul animalelor la începutul testării;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea fiecărui animal la începutul testului.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea căii de administrare și a dozelor alese;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      după caz, metodele statistice folosite pentru analiza datelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind formularea/includerea în hrană a substanței testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date analitice privind concentrația atinsă, stabilitatea și omogenitatea preparatului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      calea de administrare și detalii privind administrarea substanței testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pentru studiile de inhalare, dacă expunerea a fost în zona nasului sau a întregului corp;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozele reale (mg/kg greutate corporală/zi) și factorul de conversie a substanței testate din concentrație în hrană sau apa potabilă (mg/kg sau ppm) la doza reală, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii cu privire la calitatea hranei și apei.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate (se prezintă date tabelare rezumate și date individuale privind animalele)
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Generalități:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date privind supraviețuirea;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală/modificările în greutatea corporală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      consumul de hrană, calcule privind eficiența hranei, dacă s-au efectuat, și consumul de apă, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date toxicocinetice (dacă sunt disponibile);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      oftalmoscopie (dacă este disponibilă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      examen hematologic (dacă este disponibil);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analize de biochimie (dacă sunt disponibile).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Concluziile clinice:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      semne de toxicitate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incidența (și, dacă a fost evaluată, gravitatea) anomaliilor morfologice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura, gravitatea și durata semnelor clinice (dacă sunt tranzitorii sau permanente).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Datele privind autopsia:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală finală;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea organelor și rapoartele lor, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele autopsiei; incidența și gravitatea anomaliilor.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Examenul histopatologic:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele histopatologice non-neoplazice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele histopatologice neoplazice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      corelația între rezultatele macroscopice și cele microscopice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      o descriere detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice în legătură cu tratamentul, inclusiv clasificarea gravității;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      raportarea examinării lamelor de către alte echipe.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Interpretarea statistică a rezultatelor, dacă este cazul.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Discutarea rezultatelor, care include următoarele aspecte:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea tuturor abordărilor privind modelarea;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relațiile doză-răspuns;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date istorice de control;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      considerarea tuturor informațiilor privind modul de acțiune;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      determinarea valorilor BMD, NOAEL sau LOAEL;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relevanța pentru om.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Concluzii.
                                          
                                       
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1995), Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              EPA (2005), Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Combes R.D., Gaunt I., Balls M. (2004), A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System, ATLA 32: 163-208.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W. et al. (2002), Hazard identification by methods of animal-based toxicology, Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003), Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview, Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Capitolul B.27 din prezenta anexă, «Testul de toxicitate orală subcronică. Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare».
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2012), Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, disponibil pe site-ul internet public al OCDE referitor la orientările privind testele, la adresa www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Capitolul B.8 din prezenta anexă, «Toxicitate subacută prin inhalare: studiu de 28 de zile».
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Capitolul B.29 din prezenta anexă, «Toxicitate subcronică prin inhalare: studiu de 90 de zile».
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Capitolul B.9 din prezenta anexă, «Toxicitate la doză repetată (28 de zile) (administrare cutanată)».
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Boobis A.R., Cohen S.M., Dellarco V., McGregor D., Meek M.E., Vickers C., Willcocks D., Farland W. (2006), IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans, Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Cohen S.M., Meek M.E., Klaunig J.E., Patton D.E., and Fenner-Crisp P.A. (2003), The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview, Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Holsapple M.P., Pitot H.C., Cohen S.N., Boobis A.R., Klaunig J.E., Pastoor T., Dellarco V.L., Dragan Y.P. (2006), Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk, Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Meek E.M., Bucher J.R., Cohen S.M., Dellarco V., Hill RN., Lehman-McKemmon L.D., Longfellow D.G., Pastoor T., Seed J., Patton D.E. (2003), A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action, Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R. et al. (2006), Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements, Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T. et al. (2006), The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A. et al. (2006), A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M. et al. (2006), A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              OECD (2002), Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007), Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection, Crit Rev. Toxicol., 37 (9): 729 – 837.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997), Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran J.A. (ed.), ILSI Press, Washington, DC.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Griffiths S.A., Parkinson C., McAuslane J.A.N. and Lumley C.E. (1994), The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals, The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Usui T., Griffiths S.A. și Lumley C.E. (1996), The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. În D’Arcy P.O.F. & Harron D.W.G. (eds), Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation, Queen’s University Press, Belfast, pp. 279-284.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Carmichael N.G., Enzmann H., Pate I., Waechter F. (1997), The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33).
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              National Research Council (1985), Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23, Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988), Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments, ISBN 3-906255-04-2.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006), Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001), A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes, Journal of Applied Toxicology 21:15-23.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Weingand K. et al. (1996), Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies, Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Crissman J., Goodman D., Hildebrandt P. et al. (2004), Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology, Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚIE
                     Substanța chimică testată: Orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  
                  B. 33.   STUDII COMBINATE DE TOXICITATE CRONICĂ ȘI DE CARCINOGENITATE
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 453 (2009) a OCDE. Prima orientare 453 a fost adoptată în 1981. Elaborarea acestei metode de testare B.33 actualizată a fost considerată necesară pentru a reflecta evoluțiile recente din domeniul bunăstării animalelor și ale cerințelor de reglementare (1) (2) (3) (4) (5). Actualizarea acestei metode de testare B.33 s-a realizat simultan cu revizuirea capitolelor B.32 «Studii de carcinogenitate» și B.30 «Studii de toxicitate cronică» din prezenta anexă, în vederea obținerii de informații adiționale de la animalele utilizate în studii și furnizării unor detalii suplimentare privind selectarea dozei. Această metodă de testare este destinată utilizării în testarea unei game largi de substanțe chimice, inclusiv pesticide și substanțe chimice industriale. Cu toate acestea, ar trebui avut în vedere faptul că unele detalii și cerințe pot fi diferite de cele privind produsele farmaceutice [a se vedea International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals].
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Majoritatea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate se desfășoară pe specii de rozătoare, această metodă de testare fiind destinată în primul rând studiilor efectuate pe aceste specii. În cazul în care va fi necesară realizarea acestor studii la specii de nerozătoare pot fi aplicate, de asemenea, principiile și procedurile descrise, cu modificările corespunzătoare, împreună cu cele descrise în capitolul B.27 «Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare» (6) din prezenta anexă, astfel cum este descris în Ghidul OCDE nr. 116 privind protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate (Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies) (7).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Cele trei căi de administrare principale utilizate în studiile de toxicitate cronică/carcinogenitate sunt cea orală, cutanată și prin inhalare. Alegerea căii de administrare depinde de caracteristicile fizice și chimice ale substanței chimice testate și de calea de expunere predominantă la om. Informații suplimentare privind alegerea căii de expunere sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Această metodă de testare vizează expunerea pe cale orală, calea cea mai frecvent utilizată în cadrul studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate. Deși studiile pe termen lung care utilizează expunerea pe cale cutanată sau prin inhalare pot fi, de asemenea, necesare pentru evaluarea riscurilor la adresa sănătății umane și/sau în conformitate cu anumite regimuri de reglementare, ambele căi de expunere presupun o complexitate tehnică deosebită. Aceste studii vor trebui să fie proiectate de la caz la caz și, chiar dacă metoda de testare, astfel cum este prezentată aici, pentru evaluarea toxicității cronice și carcinogenității prin administrare orală ar putea forma baza unui protocol pentru studii privind administrarea pe cale cutanată/prin inhalare în ceea ce privește recomandările privind perioadele de tratament, parametrii clinici și patologici etc., sunt disponibile orientări OCDE privind administrarea substanțelor chimice testate prin inhalare (7) (8) și pe cale cutanată (7). La proiectarea studiilor pe termen lung privind expunerea prin inhalare ar trebui consultate, în mod special, capitolul B.8 (9) și capitolul B.29 (10) din prezenta anexă, împreună cu Ghidul OCDE privind testarea acută prin inhalare (8). Capitolul B.9 din prezenta anexă (11) ar trebui să fie consultat în cazul testelor efectuate pe cale cutanată.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Studiul combinat de toxicitate cronică/carcinogenitate oferă informații privind posibilele pericole la adresa sănătății care pot apărea ca urmare a expunerii repetate pe o perioadă cel mult egală cu întreaga durată de viață a speciei utilizate. Studiul furnizează informații privind efectele toxice ale substanței chimice testate, inclusiv eventualul potențial cancerigen, indicând organele țintă și posibilitatea de acumulare. Acesta poate oferi și o estimare a nivelului la care nu se observă efecte adverse în ceea ce privește efectele toxice și, în cazul substanțelor cancerigene non-genotoxice, în ceea ce privește răspunsul tumoral, care poate fi utilă la stabilirea criteriilor de securitate în cazul expunerii umană. De asemenea, se pune accentul pe necesitatea observării clinice atente a animalelor, astfel încât să se obțină cât mai multe informații cu putință.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Obiectivele studiilor de toxicitate cronică/carcinogenitate incluse în această metodă de testare includ:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea proprietăților cancerigene ale unei substanțe chimice testate care conduc la o incidență crescută a neoplasmelor, creșterea numărului de neoplasme maligne sau reducerea perioadei de apariție a neoplasmelor comparativ cu grupurile martor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea perioadei de apariție a neoplasmelor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea toxicității cronice a substanței chimice testate;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea organului (organelor) țintă ale toxicității cronice și carcinogenității;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          caracterizarea relației doză-răspuns;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea nivelului dozei fără efect advers vizibil (NOAEL) sau a punctului de plecare pentru stabilirea unei doze de referință (BMD);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          extrapolarea efectelor cancerigene la niveluri ale expunerii umane corespunzătoare unor doze reduse;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          predicția efectelor toxicității cronice la niveluri ale expunerii umane;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          furnizarea de date pentru ipotezele de testare privind modul de acțiune (2) (7) (12) (13) (14) (15).
                                       
                                    
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              7.
                           
                           
                              Atunci când apreciază și evaluează carcinogenitatea și toxicitatea cronică potențiale ale unei substanțe chimice testate, laboratorul de testare ar trebui să țină cont de toate informațiile disponibile privind substanța chimică testată anterior efectuării studiului, în vederea adaptării acestuia pentru o testare mai eficientă a proprietăților toxicologice ale substanței și pentru a reduce la minimum utilizarea animalelor. Informațiile și analizarea modului de acțiune al unei substanțe suspectate a fi cancerigenă (2) (7) (12) (13) (14) (15) sunt deosebit de importante, deoarece proiectul optim al studiului poate diferi în funcție de caracterul cancerigen genotoxic cunoscut sau suspectat al substanței chimice testate. Orientări suplimentare privind modul de acțiune sunt disponibile în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Informațiile care vor ajuta la proiectarea studiului includ identitatea, structura chimică și proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate, orice date referitoare la modul de acțiune, rezultatele oricăror teste de toxicitate in vitro sau in vivo, inclusiv teste de genotoxicitate, utilizarea (utilizările) anticipată (anticipate) și potențialul de expunere umană, datele Q(SAR) disponibile, caracterul mutagen/genotoxic, carcinogenitatea și alte date toxicologice referitoare la substanțele chimice înrudite din punct de vedere structural, datele toxicocinetice disponibile (cinetica dozei unice și, de asemenea, a dozei multiple, atunci când este disponibilă) și datele obținute din alte studii de expunere repetată. Determinarea toxicității cronice/carcinogenității ar trebui efectuată numai după obținerea de informații inițiale asupra toxicității din teste de toxicitate cu doză repetată de 28 de zile și/sau de 90 de zile. Informații utile pot fi oferite, de asemenea, de testele de scurtă durată de inițiere-promovare a cancerului. Ar trebui avută în vedere o procedură de testare etapizată a carcinogenității ca parte din evaluarea generală a posibilelor efecte adverse ale unei anumite substanțe chimice testate asupra sănătății (16) (17) (18) (19).
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Înainte de începerea studiului ar trebui stabilite cele mai adecvate metode statistice pentru analiza rezultatelor, în funcție de proiectul experimental și obiectivele date. Între aspectele care ar trebui avute în vedere se află necesitatea ca statisticile să includă ajustarea în funcție de supraviețuire, analiza riscurilor de tumori cumulative în raport cu durata de supraviețuire, analiza perioadei până la apariția tumorii și analiza în cazul sfârșitului prematur al unuia sau mai multor grupuri. Ghidul nr. 116 (7) și Ghidul nr. 35 privind analiza și evaluarea studiilor de toxicitate cronică și carcinogenitate (20) conțin recomandări privind analizele statistice adecvate, precum și referințe cheie la metode statistice acceptate la nivel internațional.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              În cursul realizării unui studiu de carcinogenitate ar trebui să se respecte întotdeauna principiile și considerațiile fundamentale conținute în Ghidul OCDE privind recunoașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca puncte finale din considerente umane pentru animalele utilizate în scop experimental în evaluarea siguranței (21), în special punctul 62. Acest punct prevede: «În studiile care implică dozarea repetată, în cazul în care un animal prezintă semne clinice progresive, conducând la deteriorarea în continuare a stării, trebuie să se ia o decizie în cunoștință de cauză privind eutanasierea animalului. Decizia trebuie să includă considerații privind valoarea informațiilor care s-ar putea obține din păstrarea în continuare a animalului în studiu, în funcție de starea sa generală. În cazul în care se ia decizia de a menține animalul în cadrul testului, trebuie să crească frecvența observărilor, după cum este necesar. De asemenea, fără a afecta negativ scopul testului, se poate întrerupe temporar dozarea sau se poate reduce doza de testare, dacă astfel se reduce durerea sau suferința».
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Orientări detaliate și o discuție asupra principiilor de selectare a dozelor pentru studiile de toxicitate cronică și carcinogenitate sunt disponibile în Ghidul nr. 116 (7) și în două publicații ale International Life Sciences Institute (22) (23). Strategia de selecție a dozei principale depinde de obiectivul sau obiectivele primare ale studiului (punctul 6). La selectarea nivelurilor dozelor adecvate ar trebui să asigure un echilibru între screening-ul pericolelor, pe de o parte, și caracterizarea reacțiilor la doze reduse și relevanța acestora, pe de altă parte. Acest lucru este necesar în special în cazul studiului combinat de toxicitate cronică și carcinogenitate de față.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Ar trebui avută în vedere efectuarea acestui studiu combinat de toxicitate cronică și carcinogenitate în locul realizării separate a studiului de toxicitate cronică (capitolul B.30 din prezenta anexă) și a studiului de carcinogenitate (capitolul B.32 din prezenta anexă). Testul combinat asigură o eficiență mai mare din punct de vedere financiar și al duratei și o reducere a numărului de animale comparativ cu realizarea studiilor separate, fără a compromite calitatea datelor obținute în etapa de studiu a cronicității sau a carcinogenității. Cu toate acestea, când se realizează studiul combinat de toxicitate cronică și carcinogenitate ar trebui să se acorde atenție deosebită principiilor de selecție a dozei (punctele 11 și 22-26), recunoscându-se în același timp că anumite cadre de reglementare pot impune efectuarea separată a unor astfel de studii. Orientări suplimentare pentru obținerea unei eficiențe maxime a studiului combinat de toxicitate cronică și carcinogenitate în ceea ce privește posibilitățile de reducere a numărului de animale utilizate și simplificarea diferitelor proceduri experimentale sunt disponibile în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Definițiile utilizate în contextul acestei metode de testare sunt disponibile la sfârșitul prezentului capitol și în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              14.
                           
                           
                              Proiectul studiului prevede două etape paralele: o etapă privind cronicitatea și o etapă privind carcinogenitatea (pentru duratele acestora, a se vedea punctele 34, respectiv 35). Substanța chimică testată se administrează de obicei oral, dar și administrarea prin inhalare sau pe cale cutanată poate fi adecvată. În etapa privind cronicitatea, substanța chimică testată se administrează zilnic, în doze crescătoare, la mai multe grupuri de animale de test, un nivel al dozei pe grup, fiind administrată în mod normal timp de 12 luni, deși perioadele de administrare pot varia în funcție de cerințele de reglementare (a se vedea punctul 34). Această perioadă ar trebui să fie suficient de lungă pentru a evidenția efectele toxicității cumulative, dar și suficient de scurtă pentru a preveni efectele de confuzie cauzate de modificările legate de îmbătrânire. Proiectul studiului poate include, de asemenea, una sau mai multe sacrificări pe parcurs, de exemplu la 3 și la 6 luni, și pot fi incluse grupuri suplimentare de animale pentru a le înlocui pe cele sacrificate (a se vedea punctul 20). În etapa privind carcinogenitatea, substanța chimică testată este administrată zilnic mai multor grupuri de animale de test, pe o perioadă îndelungată din viața acestora. Animalele sunt observate cu atenție în ambele etape pentru identificarea semnelor de toxicitate și dezvoltarea de leziuni neoplazice. Animalele care au murit sau care au fost sacrificate în cursul testului sunt supuse unei autopsii, iar cele care supraviețuiesc până la sfârșitul testului sunt sacrificate și autopsiate.
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Această metodă de testare se referă în principal la aprecierea și evaluarea toxicității cronice și carcinogenității la rozătoare (punctul 2). Poate fi avută în vedere utilizarea speciilor de nerozătoare atunci când datele disponibile sugerează că acestea oferă date mai relevante pentru anticiparea efectelor asupra sănătății umane. Alegerea speciei ar trebui justificată. Specia de rozătoare preferată este șobolanul, deși pot fi folosite și alte specii de rozătoare, de exemplu, șoarecele. Deși folosirea șoarecilor în testele de carcinogenitate poate avea o utilitate limitată (24) (25) (26), unele programe de reglementare actuale continuă să impună efectuarea testelor de carcinogenitate pe șoareci, cu excepția cazurilor în care este stabilit faptul că un astfel de studiu nu este necesar din punct de vedere științific. Șobolanii și șoarecii au fost preferați ca modele experimentale datorită duratei de viață relativ scurte, utilizării extinse în studii farmacologice și toxicologice, susceptibilității la declanșarea tumorilor și disponibilității de sușe cu un nivel suficient de caracterizare. Ca urmare a acestor caracteristici, există un volum mare de informații disponibile privind fiziologia și patologia acestora. Protocolul și efectuarea studiilor de toxicitate cronică și de carcinogenitate pe specii de nerozătoare ar trebui să se întemeieze, dacă este necesar, pe principiile evidențiate în această metodă de testare și în capitolul B.27 din prezenta anexă, «Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare» (6). Informații suplimentare privind alegerea speciei și sușei sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Trebuie să se utilizeze animale adulte, tinere, sănătoase provenind din sușe utilizate în mod obișnuit în laboratoare. Studiul combinat de toxicitate cronică și carcinogenitate trebuie să se desfășoare pe animale provenite din aceeași sușă și sursă ca animalele utilizate în cadrul studiilor preliminare de toxicitate de scurtă durată; cu toate acestea, în cazul în care animalele din această sușă și sursă sunt recunoscute ca având dificultăți de satisfacere a criteriilor acceptate de supraviețuire necesare pentru studiile de lungă durată [a se vedea Ghidul nr. 116 (7)], ar trebui avută în vedere utilizarea unei sușe de animale cu o rată de supraviețuire acceptabilă pentru studiile pe termen lung. Femelele ar trebui să fie nulipare și să nu fie gestante.
                           
                        
                     Condiții de adăpostire și de hrănire
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Animalele pot fi adăpostite în cuști fie individual, fie în grupuri mici de același sex; adăpostirea individuală ar trebui avută în vedere numai atunci când se justifică din punct de vedere științific (27) (28) (29). Cuștile ar trebui să fie dispuse astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minim. Temperatura incintei în care se află animalele utilizate în scopuri experimentale ar trebui să fie de 22 °C (± 3 °C). Deși se recomandă ca umiditatea relativă să fie de cel puțin 30 % și să nu depășească, de preferință, 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul, nivelul urmărit ar trebui să fie de 50-60 %. Iluminatul ar trebui să fie artificial, alternând 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu asigurarea unei cantități nelimitate de apă de băut. Alimentația ar trebui să satisfacă toate cerințele nutriționale ale speciei supuse testului, iar conținutul contaminanților din alimentație, inclusiv dar fără a se limita la reziduuri de pesticide, poluanți organici persistenți, fitoestrogeni, metale grele și micotoxine, care pot influența rezultatul testului, ar trebui menținut la un nivel cât mai redus. Informațiile analitice privind nivelul nutrienților și al substanțelor contaminante din alimentație ar trebui generate periodic, cel puțin la începutul studiului și în caz de modificare a grupului utilizat, și ar trebui incluse în raportul final. În mod similar, ar trebui furnizate informații analitice privind apa de băut utilizată în cursul studiului. Alegerea regimului alimentar poate fi influențată de necesitatea de a se asigura o proporție adecvată a substanței chimice testate și de a satisface cerințele nutriționale ale animalelor în cazul în care substanța chimică testată se administrează prin alimentație.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Ar trebui utilizate animale sănătoase, care au fost aclimatizate la condițiile de laborator timp de cel puțin 7 zile și care nu au fost supuse anterior altor proceduri experimentale. În cazul rozătoarelor, administrarea ar trebui să înceapă cât mai curând posibil după înțărcare și aclimatizare, preferabil, înainte de a împlini vârsta de 8 săptămâni. Pentru animalele utilizate în scopuri experimentale ar trebui precizată specia, sușa, sursa, sexul, greutatea și vârsta. La începutul studiului, diferențele de greutate între animalele utilizate în scopuri experimentale de ambele sexe ar trebui să fie minime și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a tuturor animalelor din cadrul studiului, separat pentru fiecare sex. Animalele ar trebui să fie repartizate aleator în grupuri tratate și grupuri martor. După această repartizare aleatorie, greutatea medie a grupurilor de același sex nu mai ar trebui să prezinte diferențe semnificative. Dacă există diferențe importante din punct de vedere statistic, etapa de repartizare aleatorie ar trebui repetată, dacă este posibil. Fiecărui animal ar trebui să i se atribuie un număr unic de identificare, și care să îi fie marcat permanent prin tatuare, implantarea unui microcip sau prin altă metodă adecvată.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Numărul și sexul animalelor
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Ar trebui utilizate animale de ambele sexe. Ar trebui utilizat un număr suficient de animale pentru a permite o evaluare biologică și statistică amănunțită. Astfel, fiecare grup de rozătoare de doză (conform punctului 22) și grupul martor aferent din etapa de studiu al carcinogenității ar trebui să conțină cel puțin 50 de animale de fiecare sex. În funcție de scopul studiului, puterea statistică a estimărilor principale poate fi majorată prin alocarea diferențiată și neproporțională a animalelor în diferitele grupuri de doză, cu mai mult de 50 de animale repartizate în grupurile cu tratate cu doză redusă, de exemplu, pentru a estima potențialul cancerigen la doze reduse. Cu toate acestea, ar trebui recunoscut faptul că o creștere moderată a dimensiunii grupului va oferi o creștere relativ redusă a puterii statistice a studiului. Atunci când sunt utilizate rozătoare, fiecare grup de doză (conform punctului 22) și grupul martor aferent din etapa de studiu al carcinogenității ar trebui să conțină cel puțin 10 animale de fiecare sex. Ar trebui observat că acest număr este mai mic decât cel utilizat în studiul privind toxicitatea cronică (capitolul B.30 din prezenta anexă). Totuși, interpretarea datelor provenite de la un număr mai mic de animale pe grup care au fost obținute în etapa de toxicitate cronică a acestui studiu combinat va fi confirmată de datele provenite de la numărul mai mare de animale, obținute în etapa de carcinogenitate a studiului. În studiile care utilizează șoareci, efectuarea tuturor analizelor hematologice poate necesita un număr suplimentar de animale în fiecare grup de doză în etapa de toxicitate cronică. Informații suplimentare privind proiectul statistic al studiului și selectarea nivelurilor dozelor în vederea maximizării puterii statistice sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                     Sacrificări pe parcurs, grupuri satelit și animale santinelă
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Studiul poate conține prevederi referitoare la sacrificări pe parcurs, de exemplu la 6 luni în etapa de studiu a toxicității cronice, care să ofere informații privind progresul modificărilor non-neoplazice și informații mecaniciste, dacă acestea sunt justificate din punct de vedere științific. Sacrificările pe parcurs pot să nu fie justificate din punct de vedere științific atunci când studiile de toxicitate cu dozare repetată asupra substanței chimice testate conțin deja astfel de informații. Animalele utilizate în etapa de toxicitate cronică a acestuia, de obicei pentru o perioadă de 12 luni (punctul 34), oferă date utile privind sacrificările pe parcurs pentru etapa de carcinogenitate a studiului, permițând astfel reducerea numărului total de animale utilizate. În etapa de toxicitate cronică a studiului pot fi incluse, de asemenea, grupuri satelit pentru monitorizarea reversibilității oricăror modificări toxicologice induse de substanța chimică testată. Acestea pot fi limitate la nivelul cel mai mare al dozei și la grupul martor. Dacă este necesar, în studiu poate fi inclus un grup suplimentar de animale santinelă (de obicei, câte 5 animale de fiecare sex), în scopul monitorizării stadiului bolii (30). Orientări suplimentare privind introducerea în proiectul studiului a sacrificărilor pe parcurs, a animalelor satelit și santinelă, precum și pentru diminuarea numărului de animale utilizate sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7).
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Dacă în proiectul studiului sunt incluse animale satelit și/sau sacrificări pe parcurs, numărul animalelor din fiecare grup de doză inclus în acest scop va fi, în mod normal, de câte 10 exemplare pentru fiecare sex, iar numărul total de animale incluse în proiectul studiului ar trebui să fie suplimentat cu numărul de animale planificate să fie sacrificate înainte de finalizarea studiului. Animalele sacrificate pe parcurs și animalele satelit ar trebui supuse, în mod normal, acelorași observații și investigații patologice ca și animalele utilizate în etapa privind toxicitatea cronică a studiului principal, inclusiv măsurători ale greutății corporale, consum de hrană/apă, hematologice și de biochimie clinică, deși pot fi prevăzute și dispoziții (în cazul grupurilor care urmează a fi sacrificate în cursul studiului) pentru limitarea măsurătorilor la criterii cheie specifice, precum neurotoxicitatea sau imunotoxicitatea.
                           
                        
                     Grupuri de doză și dozare
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Orientări privind toate aspectele legate de selectarea și intervalul între doze sunt disponibile în Ghidul nr. 116 (7). Ar trebui utilizate cel puțin trei doze diferite și un grup martor paralel, atât în etapa de toxicitate cronică, cât și în cea de carcinogenitate. Nivelurile dozelor se vor stabili, în general, în funcție de rezultatele studiilor pe termen scurt cu doză repetată sau ale studiilor de stabilire a dozei și ar trebui să ia în considerare orice date toxicologice și toxicocinetice disponibile pentru substanța chimică testată sau substanțele chimice înrudite.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Este posibil ca un studiu integral cu trei doze de niveluri diferite să nu fie considerat necesar în etapa de toxicitate cronică a studiului dacă se poate anticipa că un test cu o doză având un singur nivel, echivalentă cu cel puțin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, nu va produce efecte adverse. Această decizie ar trebui să se întemeieze pe informații obținute din studii preliminare și, ținând cont de datele de la substanțele chimice înrudite structural, pe absența probabilă a toxicității. Limita recomandată este de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, cu excepția cazurilor în care expunerea umană indică necesitatea utilizării unui nivel mai mare al dozei.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Cu excepția cazului în care există limite impuse de caracterul fizico-chimic sau de efectele biologice ale substanței chimice testate, nivelul cel mai mare al dozei ar trebui ales astfel încât să permită identificarea principalelor organe-țintă și a efectelor toxice, evitând în același timp suferința, toxicitatea severă, morbiditatea sau moartea. În mod normal, nivelul cel mai mare al dozei ar trebui selectat astfel încât să provoace toxicitate, evidențiată, de exemplu, prin diminuarea ritmului de creștere în greutate (aproximativ 10 %). Cu toate acestea, în funcție de obiectivele studiului (a se vedea punctul 6), o doză maximă mai mică decât doza care provoacă toxicitate poate fi selectată dacă, de exemplu, o doză provoacă un efect advers îngrijorător, dar care are un impact redus asupra duratei de viață sau a greutății corporale.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Nivelurile dozelor și intervalele între doze pot fi selectate astfel încât să se determine o relație doză-răspuns și, în funcție de modul de acțiune al substanței chimice testate, un NOAEL sau un alt rezultat avut în vedere pentru studiu, de exemplu BMD (doză de referință) (a se vedea punctul 27). Factorii care ar trebui luați în considerare la stabilirea dozelor reduse includ panta preconizată a curbei doză-răspuns, dozele la care pot avea loc modificări importante ale metabolismului sau modului de acțiune toxică și dacă se anticipează un prag sau un punct de pornire pentru extrapolarea dozei reduse. Principalul obiectiv al unui studiu combinat de carcinogenitate/toxicitate cronică va consta în obținerea de informații utilizabile în scopuri de evaluare a riscului de carcinogenitate, iar informațiile privind toxicitatea cronică vor fi, în mod normal, un obiectiv secundar. Acest aspect ar trebui avut în vedere atunci când se stabilesc nivelurile dozelor și intervalele între doze pentru studiu.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Intervalul selectat între doze va depinde de obiectivele studiului și de caracteristicile substanței chimice testate și nu poate fi stabilit în detaliu în această metodă de testare, dar intervale ce corespund unui factor de 2 până la 4 oferă în mod frecvent performanțe de testare bune în determinarea nivelurilor descrescătoare ale dozelor și este deseori de preferat să fie adăugat un al patrulea grup de testare în loc să fie utilizate intervale foarte mari între doze (de exemplu, mai mari decât un factor cuprins între 6-10). În general, un factor mai mare de 10 ar trebui evitat, iar acesta ar trebui justificat în cazul în care este utilizat.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Astfel cum este evidențiat în Ghidul nr. 116 (7), elementele de care ar trebui să se țină cont la selectarea dozei includ:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          non-linearități sau puncte de inflexiune cunoscute sau suspectate în relația doză-răspuns;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toxicocinetică și intervale între doze la care apare sau nu apare fenomenul de inducție metabolică, saturație sau nelinearitate între dozele externe și interne;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          leziuni precursor, markeri de efect sau indicatori ai desfășurării unor procese biologice subiacente cheie;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          aspecte cheie (sau suspectate) ale modului de acțiune, precum doze la care începe să se manifeste citotoxicitate, nivelurile hormonilor sunt perturbate, mecanismele homeostatice devin ineficiente etc.;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          regiuni ale curbei doză-răspuns în care sunt necesare estimări deosebit de robuste, de exemplu, în intervalul dozei de referință anticipate sau un prag suspectat;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          considerarea nivelurilor anticipate de expunere umană, în special la selectarea dozelor medii și reduse.
                                       
                                    
                        
                              28.
                           
                           
                              Grupul martor va fi un grup netratat sau un grup martor pentru vehicul în cazul în care pentru administrarea substanței chimice testate este utilizat un vehicul. Exceptând administrarea substanței chimice testate, animalele din grupul martor ar trebui tratate în mod identic cu cele din grupurile testate. Dacă se utilizează un vehicul, grupului martor i se administrează cel mai mare volum utilizat de vehicul dintre grupurile de doză. Dacă o substanță chimică testată se administrează în alimente și provoacă reducerea semnificativă a apetitului ca urmare a modificării caracteristicilor organoleptice ale alimentelor, poate fi considerată necesară utilizarea, ca punct de referință mai adecvat, a unui grup martor hrănit în paralel.
                           
                        
                     Prepararea dozelor și administrarea substanței chimice testate
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Substanța chimică testată se administrează de obicei pe cale orală, prin alimente sau apa de băut sau prin gavaj. Informații suplimentare privind căile și metodele de administrare sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7). Calea și metoda de administrare depind de scopul studiului, de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate, de biodisponibilitatea acesteia și de calea și metoda de expunere predominante la om. Alegerea căii și metodei de administrare ar trebui să fie justificată. În interesul bunăstării animalelor, gavajul oral ar trebui folosit, în mod normal, numai în cazul agenților pentru care această cale și această metodă de administrare corespunde unei căi de expunere potențiale rezonabile la om (de exemplu, produse farmaceutice). Pentru substanțele chimice alimentare și ambientale, inclusiv a pesticidelor, administrarea are loc de obicei prin hrană sau apa de băut. Totuși, în anumite situații, cum ar fi riscul de expunere profesională, administrarea pe alte căi poate fi mai potrivită.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Dacă este necesar, substanța chimică testată se dizolvă într-un vehicul adecvat. Ar trebui luate în considerare următoarele caracteristici ale vehiculului și ale altor aditivi, după caz: efectele asupra absorbției, distribuției, metabolismului sau retenției substanței chimice testate, efectele asupra proprietăților chimice ale substanței chimice testate care i-ar putea afecta caracteristicile toxice, precum și efectele asupra consumului de alimente sau de apă sau asupra stării de nutriție a animalelor. Se recomandă, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluții/suspensii apoase, apoi a unei soluții/emulsii în ulei (de exemplu, ulei de porumb) și ulterior a unei soluții posibile în alte vehicule. Dacă vehiculul este altul decât apa, ar trebui să fie cunoscute proprietățile toxice ale vehiculului. Ar trebui să fie disponibile informații privind stabilitatea substanței chimice testate și a omogenității soluțiilor de dozare sau a alimentației (după caz) în condițiile de administrare (de exemplu, alimentație).
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              Pentru substanțele chimice administrate în alimente sau în apa de băut, este important să se ia măsuri astfel încât cantitățile de substanță chimică testată implicate să nu interfereze cu nutriția normală sau cu echilibrul hidric. În studiile de toxicitate pe termen lung care utilizează administrarea prin alimentație, concentrația substanței chimice testate din hrană nu ar trebui să depășească, în mod normal, o limită superioară de 5 % din alimentația totală, pentru a fi evitate dezechilibrele nutriționale. Când substanța chimică testată se administrează în hrană, se poate folosi fie o concentrație alimentară constantă (mg/kg hrană sau ppm), fie o doză constantă în raport cu greutatea corporală a animalelor (mg/kg greutate corporală), care se calculează săptămânal. Alternativa utilizată ar trebui precizată.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              În cazul administrării orale, animalele sunt expuse la o doză zilnică din substanța chimică testată (șapte zile pe săptămână) timp de 12 luni (etapa de toxicitate cronică) sau 24 de luni (etapa de carcinogenitate), a se vedea, de asemenea, punctele 33 și 34. Orice alt regim de dozare, cum ar fi cel de cinci zile/săptămână, ar trebui să fie justificat. În cazul administrării cutanate, animalele sunt, în mod normal, tratate cu substanța chimică testată timp de cel puțin 6 ore pe zi, 7 zile pe săptămână, astfel cum se indică în capitolul B.9 din prezenta anexă (11), timp de 12 luni (etapa de toxicitate cronică) sau 24 de luni (etapa de carcinogenitate). Expunerea prin inhalare se desfășoară timp de 6 ore pe zi, 7 zile pe săptămână, dar dacă se justifică poate fi utilizată și o perioadă de expunere de 5 zile pe săptămână. Perioada de expunere variază de obicei între 12 luni (etapa de toxicitate cronică) și 24 de luni (etapa de carcinogenitate). Dacă speciile de rozătoare, altele decât șobolanii, sunt expuse numai în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi modificate pentru a reduce la minimum nivelurile de suferință specifice speciei. Orice durată de expunere mai mică de 6 ore pe zi ar trebui să fie justificată. A se vedea, de asemenea, capitolul B.8 din prezenta anexă (9).
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Când substanța chimică testată se administrează animalelor prin gavaj, ar trebui să se folosească o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată, la aceleași ore în fiecare zi. În mod normal, o doză unică se administrează o dată pe zi, iar în cazurile în care, de exemplu, substanța chimică testată are efect iritant local, aceeași cantitate de doză zilnică poate fi administrată fracționat (de două ori pe zi). Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dată depinde de greutatea animalului utilizat în scopuri experimentale. Volumul ar trebui menținut la un nivel cât mai redus posibil și nu ar trebui să depășească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală la rozătoare (31). Se recomandă ca variațiile volumului administrat să fie reduse la minimum prin modificarea concentrațiilor, astfel încât să se asigure un volum constant la toate nivelurile dozelor. Substanțele chimice potențial corozive sau iritante sunt exceptate de la această regulă și ar trebui să fie diluate pentru a evita efecte locale severe. Testele la concentrații care pot fi corozive sau iritante pentru tractul gastrointestinal ar trebui evitate.
                           
                        
                     Durata studiului
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Perioada de administrare și durata etapei de toxicitate cronică tipice ale acestui studiu sunt de 12 luni, dar proiectul studiului permite și poate fi aplicat pentru studii cu durata mai scurtă (de exemplu, 6 sau 9 luni) sau mai lungă (de exemplu, 18 sau 24 de luni), în funcție de cerințele de reglementare sau în scopuri specifice de ordin mecanicist. Abaterile de la o perioadă de expunere de 12 luni ar trebui să fie justificate, în special atunci când aceasta este mai scurtă. Toate grupurile de doze alocate acestei etape vor fi oprite la momentul stabilit pentru evaluarea toxicității cronice și a patologiei non-neoplazice. Grupurile satelit utilizate pentru monitorizarea reversibilității oricăror modificări toxicologice induse de substanța chimică testată ar trebui menținute fără administrarea niciunei doze timp de cel puțin 4 săptămâni și cel mult o treime din durata totală a studiului după încetarea expunerii.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Durata tipică a etapei de evaluare a carcinogenității din acest studiu va fi de 24 de luni pentru rozătoare, reprezentând durata de viață normală pentru majoritatea animalelor utilizate. Pot fi utilizate durate mai scurte sau mai lungi ale studiului în funcție de durata de viață a sușei speciei de animale utilizate în cadrul studiului, dar acestea ar trebui să fie justificat. În cazul anumitor sușe de șoareci, de exemplu, AKR/J, C3H/J sau C57BL/6J, perioada de 18 luni poate fi mai adecvată. În cele ce urmează sunt prezentate câteva orientări privind durata, încetarea studiului și supraviețuirea; orientări suplimentare, inclusiv considerarea acceptabilității unui studiu de carcinogenitate negativ în legătură cu supraviețuirea în cadrul studiului, sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          încheierea studiului ar trebui avută în vedere atunci când numărul de animale supraviețuitoare din grupurile cu doză redusă sau din grupul martor scade sub 25 %;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în cazul în care numai animalele din grupul tratat cu doza maximă mor prematur datorită toxicității, aceasta nu ar trebui să determine încheierea studiului;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          animalele supraviețuitoare ar trebui considerate separat, în funcție de sex;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          studiul nu ar trebui să fie extins dincolo de limita la care datele obținute nu mai sunt suficiente pentru a permite efectuarea unei evaluări valabile din punct de vedere statistic.
                                       
                                    
                        OBSERVAȚII (ETAPA DE TOXICITATE CRONICĂ)
                  
                              36.
                           
                           
                              Toate animalele ar trebui examinate pentru observarea semnelor de morbiditate și mortalitate de două ori pe zi, de regulă la începutul și la sfârșitul fiecărei zile, inclusiv la sfârșit de săptămână și în zilele nelucrătoare. În cazul administrării prin gavaj, se recomandă ca examinările clinice generale să fie făcute cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare.
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Toate animalele ar trebui să fie supuse unor observații clinice detaliate cel puțin o dată înainte de prima expunere (pentru a permite realizarea de comparații la același individ), la sfârșitul primei săptămâni de studiu și apoi lunar. Protocolul de observație ar trebui să fie proiectat astfel încât variațiile între observatorii individuali să fie reduse la minimum și independente de grupul testat. Aceste observații se recomandă să fie făcute în afara cuștii în care sunt ținute animalele, de preferință într-o incintă standardizată și la aceeași oră de fiecare dată. Ele ar trebui înregistrate cu atenție, de preferat folosind un sistem de notare definit explicit de laboratorul de testare. Ar trebui acționat pentru a se asigura că variațiile condițiilor de observare sunt minime. Observațiile ar trebui să includă, dar nu sunt limitate la modificări la nivelul pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, secrețiilor și excrețiilor și reacțiile neurovegetative (de exemplu, lăcrimare, piloerecție, dimensiunea pupilei, respirație neobișnuită). Se vor consemna, de asemenea, toate modificările de comportament, modificările posturii sau ale reacțiilor la manipulare, precum și apariția unor mișcări clonice sau tonice, a unor comportamente stereotipe (de exemplu, curățare excesivă, mișcări circulare repetate), precum și orice alt comportament bizar (automutilare, mers cu spatele) (32).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Toate animalele ar trebui supuse unui examen oftalmologic, cu un oftalmoscop sau un alt aparat adecvat, înainte de prima administrare a substanței chimice testate. La încheierea studiului, acest examen ar trebui să fie efectuat la toate animalele, însă cel puțin la animalele din grupul cu doza cea mai mare și din grupul martor. Dacă se constată modificări ale ochilor asociate tratamentului, ar trebui examinate toate animalele. În cazul în care analiza structurală sau alte informații sugerează toxicitate oculară, frecvența examenelor oculare ar trebui mărită.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              În cazul substanțelor chimice ale căror teste anterioare de toxicitate cu doză repetată la 28 și/sau 90 de zile au indicat un potențial de inducere a efectelor neurotoxice și reacții la diferiți stimuli senzoriali (32) (auditivi, vizuali și proprioceptivi) (33) (34) (35), forța de prehensiune (36) și activitatea motorie (37) pot fi evaluate opțional înainte de începerea studiului și la perioade de 3 luni după aceasta, timp de cel mult 12 luni, precum și la încheierea studiului (dacă acesta durează mai mult de 12 luni). Detalii suplimentare referitoare la metodele utilizabile figurează în referințele bibliografice respective. Totuși, ar putea fi folosite și metode diferite de cele menționate.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              În cazul substanțelor chimice ale căror teste anterioare de toxicitate cu doză repetată la 28 și/sau 90 de zile au indicat un potențial de inducere a efectelor imunotoxice, investigații suplimentare ale acestui efect pot fi realizate opțional la încheierea studiului.
                           
                        
                     Greutatea corporală, consumul de hrană/apă și eficiența hranei
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Toate animalele ar trebui să fie cântărite la începutul tratamentului și cel puțin o dată pe săptămână pe parcursul primelor 13 săptămâni, iar apoi cel puțin o dată pe lună. Consumul de hrană și eficiența alimentelor ar trebui măsurate cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni, apoi cel puțin o dată pe lună. Atunci când substanța chimică testată se administrează în apa de băut, consumul de apă ar trebui măsurat cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni, iar apoi cel puțin o dată pe lună. Măsurarea consumului de apă ar trebui avută în vedere, de asemenea, în cadrul studiilor în care băutul apei suferă modificări.
                           
                        
                     Hematologie și biochimie clinică
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              În studiile la rozătoare, examinările hematologice ar trebui să fie realizate la toate animalele de studiu (10 masculi și 10 femele din fiecare grup), la intervale de 3, 6 și 12 luni, precum și la încheierea studiului (dacă acesta durează mai mult de 12 luni). În studiile la șoareci, efectuarea tuturor analizelor hematologice impuse poate necesita utilizarea de animale satelit (a se vedea punctul 19). În studiile la specii de nerozătoare, se vor recolta probe de la un număr mai mic de animale (de exemplu, 4 animale din fiecare sex și din același grup în cazul studiilor la câini), la intervale de prelevare intermediare și la încheierea studiului, în aceleași condiții descrise pentru rozătoare. Măsurătorile la intervale de trei luni la rozătoare sau la nerozătoare nu ar trebui efectuate dacă într-un studiu anterior de 90 de zile, desfășurat la doze comparative, nu au fost constatate efecte asupra parametrilor hematologici. Probele de sânge ar trebui recoltate sub anestezie, din anumite locuri (de exemplu, prin puncție cardiacă sau din sinusul retro-orbital).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Ar trebui investigați următorii parametri (38): numărul total de leucocite și formula leucocitară, numărul de hematii, numărul de trombocite, concentrația hemoglobinei, hematocritul (volumul celular sangvin după centrifugare), media volumului globulelor (MCV), media globulară a hemoglobinei (MCH), concentrația medie a hemoglobinei (MCHC), timpul de protrombină și timpul de tromboplastină parțial activată. Alți parametri hematologici, cum sunt corpurile Heinz, morfologia atipică a hematiilor sau methemoglobina, pot fi măsurați, după caz, în funcție de toxicitatea substanței chimice testate. În general, ar trebui adoptată o abordare flexibilă, în funcție de efectul observat și/sau scontat al substanței chimice testate în cauză. Dacă substanța chimică testată are un efect asupra sistemului hematopoietic, pot fi indicate, de asemenea, numărul de reticulocite și citologia măduvei osoase, chiar dacă aceste valori nu ar trebui măsurate în mod obișnuit.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Ar trebui efectuate analize de biochimie clinică în vederea investigării principalelor efecte toxice asupra țesuturilor și, în special, asupra ficatului și a rinichilor, pe probe de sânge prelevate de la toate animalele de studiu (10 masculi și 10 femele din fiecare grup), la aceleași intervale de timp specificate pentru investigațiile hematologice. În studiile la șoareci, efectuarea tuturor analizelor de biochimie clinică impuse poate necesita utilizarea de animale satelit. În studiile la specii de nerozătoare, se vor recolta probe de la un număr mai mic de animale (de exemplu, 4 animale din fiecare sex și din același grup în cazul studiilor pe câini), la intervale de prelevare intermediare și la încheierea studiului, în aceleași condiții descrise pentru rozătoare. Măsurătorile la intervale de trei luni la rozătoare și la nerozătoare nu ar trebui efectuate dacă într-un studiu anterior de 90 de zile, desfășurat la doze comparative, nu au fost constatate efecte asupra parametrilor de biochimie clinică. Se recomandă ca animalele să nu fie hrănite cu o noapte înainte de prelevarea probelor de sânge (cu excepția șoarecilor) (10). Ar trebui investigați următorii parametri (38): glucoză, uree (azot ureic), creatinină, proteine totale, albumină, calciu, sodiu, potasiu, colesterol total, cel puțin două teste adecvate pentru evaluare hepatocelulară (alanin-aminotransferază, aspartat-aminotransferază, glutamat-dehidrogenază, acizi biliari totali) (39) și cel puțin două teste adecvate de evaluare hepatobiliară (fosfatază alcalină, gama-glutamil transferază, 5’-nucleotidază, bilirubină totală, acizi biliari totali) (39). După caz, pot fi măsurați alți parametri de chimie clinică cum sunt trigliceridele à jeun, hormonii specifici și colinesteraza, în funcție de toxicitatea substanței chimice testate. În general, este nevoie de o abordare flexibilă, adaptată efectului observat și/sau scontat al substanței chimice testate în cauză.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Ar trebui efectuate analize de urină la toate animalele de studiu (10 masculi și 10 femele din fiecare grup), pe probe recoltate la aceleași intervale ca pentru analizele de hematologie și chimie clinică. Măsurătorile la intervale de trei luni nu ar trebui efectuate dacă într-un studiu anterior de 90 de zile, desfășurat la doze comparative, nu au fost constatate efecte în urma analizelor de urină. Următoarea listă de parametri a fost inclusă într-o recomandare a experților privind studiile de patologie clinică (38): aspectul, volumul, osmolalitatea sau greutatea specifică, pH-ul, proteinuria totală și glicozuria. Alte analize vizează corpii cetonici, urobilinogenul, bilirubina și hemoragiile oculte. Dacă este necesar, pot fi utilizați și alți parametri pentru extinderea investigării efectului (efectelor) observat(e).
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              În general, se consideră că variabilele de referință hematologice și de biochimie clinică ar trebui să fie stabilite înainte de tratament în cazul studiilor la câini, dar nu și în cazul studiilor la rozătoare (38). Totuși, dacă datele de referință istorice (a se vedea punctul 58) nu sunt adecvate, poate fi luată în considerare generarea unor astfel de date.
                           
                        PATOLOGIE
                  
                     Autopsia
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              În mod normal, toate animalele cuprinse în studiu sunt supuse unei autopsii complete și detaliate, care include examinarea atentă a suprafeței externe a corpului, a tuturor orificiilor și a cavităților craniană, toracică și abdominală și a conținutului acestora. Cu toate acestea, pot fi stabilite prevederi care pot limita măsurătorile (în cazul grupurilor care urmează a fi sacrificate pe parcurs sau al grupurilor satelit) la măsurători cheie specifice, cum sunt neurotoxicitatea sau imunotoxicitatea (a se vedea punctul 21). Aceste animale nu ar trebui să fie supuse unei autopsii și procedurilor ulterioare descrise în punctele următoare. Animalele santinelă pot fi autopsiate de la caz la caz, la alegerea conducătorului studiului.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Se înregistrează greutatea organelor de la toate animalele, cu excepția celor prevăzute în ultima parte a punctului 47. Glandele suprarenale, creierul, epididimurile, inima, rinichii, ficatul, ovarele, splina, testiculele, glanda tiroidă (cântărită după fixare, împreună cu glandele paratiroide) și uterul de la toate animalele (cu excepția celor găsite muribunde și/sau a celor sacrificate pe parcurs) sunt curățate de țesuturile aderente, după caz, și cântărite proaspete cât mai repede după disecție, pentru a evita deshidratarea.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Țesuturile următoare ar trebui să fie conservate în mediul de fixare cel mai adecvat atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic ulterior (40) (țesuturile între paranteze pătrate sunt opționale):
                              
                                          toate leziunile macroscopice
                                       
                                       
                                          inimă
                                       
                                       
                                          pancreas
                                       
                                       
                                          stomac (stomacul anterior, stomacul glandular)
                                       
                                    
                                          glanda suprarenală
                                       
                                       
                                          ileon
                                       
                                       
                                          glanda paratiroidă
                                       
                                       
                                          [dinți]
                                       
                                    
                                          aortă
                                       
                                       
                                          jejun
                                       
                                       
                                          nervi periferici
                                       
                                       
                                          testicule
                                       
                                    
                                          creier (inclusiv secțiuni din creierul mare, cerebel și bulb rahidian/punte)
                                       
                                       
                                          rinichi
                                       
                                       
                                          glanda pituitară
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cecum
                                       
                                       
                                          glanda lacrimală (extraorbitală)
                                       
                                       
                                          prostată
                                       
                                       
                                          glanda tiroidă
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          ficat
                                       
                                       
                                          rect
                                       
                                       
                                          [limbă]
                                       
                                    
                                          glanda coagulantă
                                       
                                       
                                          plămân
                                       
                                       
                                          glanda salivară
                                       
                                       
                                          trahee
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          ganglioni limfatici (superficiali și profunzi)
                                       
                                       
                                          vezicula seminală
                                       
                                       
                                          vezica urinară
                                       
                                    
                                          duoden
                                       
                                       
                                          glanda mamară (obligatoriu pentru femele, iar dacă poate fi disecată, și la masculi)
                                       
                                       
                                          mușchi scheletici
                                       
                                       
                                          uter (inclusiv cervix)
                                       
                                    
                                          epididim
                                       
                                       
                                          [căile respiratorii superioare, inclusiv nas, fose nazale și sinusurile paranazale]
                                       
                                       
                                          piele
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          ochi (inclusiv retina)
                                       
                                       
                                          esofag
                                       
                                       
                                          măduva spinării (din trei segmente: cervical, medio-toracic și lombar)
                                       
                                       
                                          [uretra]
                                       
                                    
                                          [femur, inclusiv articulația]
                                       
                                       
                                          [bulbul olfactiv]
                                       
                                       
                                          splina
                                       
                                       
                                          vaginul
                                       
                                    
                                          vezica biliară (la specii altele decât șobolanul)
                                       
                                       
                                          ovar
                                       
                                       
                                          [stern]
                                       
                                       
                                          probă de măduvă osoasă și/sau o puncție aspirativă de măduvă osoasă
                                       
                                    
                                          glanda Harder
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    În cazul organelor pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), ar trebui conservate ambele organe. Observațiile clinice și cele de altă natură pot sugera necesitatea examinării unor țesuturi suplimentare. Ar trebui conservate și alte organe considerate posibile organe-țintă pentru substanța chimică testată, având în vedere proprietățile cunoscute ale acesteia. În studiile care implică administrarea pe cale cutanată, ar trebui examinată lista de organe stabilită pentru calea orală și este necesară prelevarea și conservarea specifică a pielii de la locul aplicării. În studiile cu administrare prin inhalare, lista țesuturilor conservate și examinate din căile respiratorii ar trebui să urmeze recomandările conținute în capitolele B.8 (9) și B.29 (10) din prezenta anexă. În cazul altor organe/țesuturi (și suplimentar față de țesuturile conservate specifice prelevate din tractul respirator), ar trebui examinată lista de organe stabilită pentru calea de administrare orală.
                           
                        
                     Examenul histopatologic
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Sunt disponibile orientări privind bunele practici de realizare a studiilor de patologie toxicologică (40). Ar trebui să fie examinate cel puțin următoarele țesuturi:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile animalelor din grupurile expuse la doza maximă și din grupurile martor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile animalelor care au murit sau au fost sacrificate pe parcurs;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile care prezintă anomalii macroscopice, inclusiv tumorile;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          atunci când la grupul expus la doza maximă sunt observate țesuturi-țintă sau țesuturi care prezintă modificări histopatologice în legătură cu tratamentul, se vor examina aceleași țesuturi la toate animalele din toate celelalte grupuri de doză;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în cazul organelor-pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), ar trebui examinate ambele organe.
                                       
                                    
                        OBSERVAȚII (ETAPA DE CARCINOGENITATE)
                  
                              51.
                           
                           
                              Toate animalele ar trebui examinate pentru observarea semnelor de morbiditate și mortalitate de două ori pe zi, de regulă la începutul și la sfârșitul fiecărei zile, inclusiv la sfârșit de săptămână și în zilele nelucrătoare. În plus, animalele ar trebui examinate o dată pe zi pentru semne specifice cu relevanță toxicologică. În cazul studiilor cu administrare prin gavaj, animalele ar trebui să fie examinate în perioada imediat următoare administrării dozei. Ar trebui acordată o atenție specială dezvoltării tumorale și ar trebui înregistrate momentul apariției, localizarea, dimensiunile, aspectul și dezvoltarea tumorilor atât a celor vizibile macroscopic, cât și a celor palpabile.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Toate animalele ar trebui să fie cântărite la începutul tratamentului și cel puțin o dată pe săptămână pe parcursul primelor 13 săptămâni, iar apoi cel puțin o dată pe lună. Consumul de hrană și eficiența alimentelor ar trebui măsurate cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni, apoi cel puțin o dată pe lună. Atunci când substanța chimică testată se administrează în apa de băut, consumul de apă ar trebui măsurat cel puțin o dată pe săptămână în primele 13 săptămâni, iar apoi cel puțin o dată pe lună. Consumul de apă poate fi măsurat și în cadrul studiilor în care băutul apei suferă modificări.
                           
                        
                     Hematologie, biochimie chimică și alte măsurători
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Pentru a crește volumul de informații obținut din studiu, în special în ceea ce privește modul de acțiune, pot fi prelevate probe de sânge pentru examene hematologice și de biochimie clinică, însă decizia privind aceste prelevări aparține conducătorului studiului. De asemenea, pot fi adecvate analize ale urinei. Datele privind animalele utilizate în etapa de toxicitate cronică a studiului, a cărei durată tipică este de 12 luni (punctul 34), vor oferi informații referitoare la acești parametri. Orientări suplimentare privind utilitatea prelevării acestor probe în cadrul studiului de carcinogenitate sunt furnizate în Ghidul nr. 116 (7). Dacă se prelevează probe de sânge, acestea ar trebui colectate la încheierea perioadei de testare, imediat înainte de sacrificarea animalelor sau ca parte a acestei proceduri. Probele de sânge ar trebui recoltate sub anestezie, dintr-un loc stabilit (de exemplu, prin puncție cardiacă sau din sinusul retro-orbital). De asemenea, pot fi preparate frotiuri sangvine pentru a fi examinate, în special atunci când organul țintă pare a fi măduva osoasă, deși valoarea examinării frotiurilor sangvine în etapa de carcinogenitate a studiului pentru evaluarea potențialului cancerigen/oncogen a fost pusă sub semnul întrebării (38).
                           
                        PATOLOGIE
                  
                     Autopsia
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Toate animalele care participă la studiu, cu excepția animalelor santinelă și a altor animale satelit (a se vedea punctul 20), sunt supuse unei autopsii macroscopice complete și detaliate, care include examinarea atentă a suprafeței externe a corpului, a tuturor orificiilor și a cavităților craniană, toracică și abdominală și a conținutului acestora. Animalele santinelă și animalele satelit pot fi autopsiate de la caz la caz, la alegerea conducătorului studiului. Cântărirea organelor nu este inclusă de obicei în studiul de carcinogenitate, deoarece modificările asociate îmbătrânirii și, ulterior, dezvoltarea tumorilor reduc utilitatea datelor privind greutatea organelor. Totuși, acestea pot fi importante în evaluările în funcție de greutatea probelor și, în special, ale modului de acțiune. Dacă fac parte dintr-un studiu satelit, aceste date ar trebui colectate în termen de cel mult un an de la începerea studiului.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Țesuturile următoare ar trebui conservate în mediul de fixare cel mai adecvat atât pentru tipul de țesut, cât și pentru examenul histopatologic ulterior (40) (țesuturile între paranteze pătrate sunt opționale):
                              
                                          toate leziunile macroscopice
                                       
                                       
                                          inimă
                                       
                                       
                                          pancreas
                                       
                                       
                                          stomac (stomacul anterior, stomacul glandular)
                                       
                                    
                                          glanda suprarenală
                                       
                                       
                                          ileon
                                       
                                       
                                          glanda paratiroidă
                                       
                                       
                                          [dinți]
                                       
                                    
                                          aortă
                                       
                                       
                                          jejun
                                       
                                       
                                          nervi periferici
                                       
                                       
                                          testicule
                                       
                                    
                                          creier (inclusiv secțiuni din creierul mare, cerebelul și bulb rahidian/punte)
                                       
                                       
                                          rinichi
                                       
                                       
                                          glanda pituitară
                                       
                                       
                                          timus
                                       
                                    
                                          cec
                                       
                                       
                                          glanda lacrimală (extraorbitală)
                                       
                                       
                                          prostată
                                       
                                       
                                          glanda tiroidă
                                       
                                    
                                          cervix
                                       
                                       
                                          ficat
                                       
                                       
                                          rect
                                       
                                       
                                          [limbă]
                                       
                                    
                                          glanda coagulantă
                                       
                                       
                                          plămân
                                       
                                       
                                          glanda salivară
                                       
                                       
                                          trahee
                                       
                                    
                                          colon
                                       
                                       
                                          ganglioni limfatici (superficiali și profunzi)
                                       
                                       
                                          vezicula seminală
                                       
                                       
                                          vezica urinară
                                       
                                    
                                          duoden
                                       
                                       
                                          glanda mamară (obligatoriu pentru femele, iar dacă poate fi disecată, și la masculi)
                                       
                                       
                                          mușchi scheletici
                                       
                                       
                                          uter (inclusiv cervix)
                                       
                                    
                                          epididim
                                       
                                       
                                          [căile respiratorii superioare, inclusiv nas, fose nazale și sinusurile paranazale]
                                       
                                       
                                          piele
                                       
                                       
                                          [ureter]
                                       
                                    
                                          ochi (inclusiv retina)
                                       
                                       
                                          esofag
                                       
                                       
                                          măduva spinării (din trei segmente: cervical, medio-toracic și lombar)
                                       
                                       
                                          [uretra]
                                       
                                    
                                          [femur, inclusiv articulația]
                                       
                                       
                                          [bulb olfactiv]
                                       
                                       
                                          splina
                                       
                                       
                                          vaginul
                                       
                                    
                                          vezica biliară (la specii altele decât șobolanul)
                                       
                                       
                                          ovar
                                       
                                       
                                          [stern]
                                       
                                       
                                          probă de măduvă osoasă și/sau o puncție aspirativă de măduvă osoasă
                                       
                                    
                                          glanda Harder
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                       
                                           
                                       
                                    În cazul organelor pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), ar trebui conservate ambele organe. Observațiile clinice și cele de altă natură pot sugera necesitatea examinării unor țesuturi suplimentare. Ar trebui conservate și alte organe considerate posibile organe-țintă pentru substanța chimică testată, având în vedere proprietățile cunoscute ale acesteia. În studiile care implică administrarea pe cale cutanată, ar trebui examinată lista de organe stabilită pentru calea de administrare orală ar trebui examinată și în cazul studiilor cu administrare cutanată și este necesară prelevarea și conservarea specifică a pielii de la locul aplicării. În studiile cu administrare prin inhalare, lista țesuturilor din căile respiratorii care au fost conservate și examinate ar trebui să urmeze recomandările conținute în capitolele B.8 (8) și B.29 din prezenta anexă (9). În cazul altor organe/țesuturi (și suplimentar față de țesuturile conservate specifice prelevate din căile respiratorii), ar trebui examinată lista de organe stabilită pentru calea de administrare orală.
                           
                        
                     Examenul histopatologic
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Sunt disponibile orientări privind bunele practici de realizare a studiilor de patologie toxicologică (40). Ar trebui să fie examinate cel puțin următoarele țesuturi:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile animalelor din grupurile expuse la doza maximă și din grupurile martor;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile animalelor care au murit sau au fost sacrificate pe durata studiului;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          toate țesuturile care prezintă anomalii macroscopice, inclusiv tumorile;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          atunci când la grupul expus la doza maximă sunt observate modificări histopatologice apărute ca urmare a tratamentului, se vor examina aceleași țesuturi la toate animalele din toate celelalte grupuri de doză;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în cazul organelor-pereche (de exemplu, rinichi sau glande suprarenale), ar trebui examinate ambele organe.
                                       
                                    
                        DATE ȘI RAPORT (CARCINOGENITATE ȘI TOXICITATE CRONICĂ)
                  
                     Date
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Ar trebui furnizate date obținute de la fiecare animal, pentru toți parametrii evaluați. În plus, toate datele ar trebui rezumate în formă tabelară, pentru fiecare grup utilizat în scopuri experimentale indicându-se numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte în timpul testului sau eutanasiate din motive umane și momentul morții sau al eutanasierii acestora, numărul de animale care au prezentat semne de toxicitate, o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul apariției acestora, durata și severitatea oricăror efecte toxice, numărul animalelor care au prezentat leziuni, tipul leziunilor și procentul animalelor care au prezentat fiecare tip de leziune. Ar trebui ca mediile și deviațiile standard (pentru datele de test colectate continuu) ale animalelor care prezintă efecte toxice sau leziuni, suplimentar față de clasificarea leziunilor, să fie indicate în tabele rezumative.
                           
                        
                              58.
                           
                           
                              Datele istorice de control pot fi utile în interpretarea rezultatelor studiului, de exemplu, în cazul în care există indicii potrivit cărora datele furnizate de grupurile martor paralele diferă substanțial față de datele recente provenite de la animale martor din același laborator de test/colonie. Dacă sunt evaluate, datele istorice de control ar trebui să fie transmise de la același laborator, să se refere la animale de aceeași vârstă și din aceeași sușă și să fi fost obținute într-o perioadă de cel mult cinci ani înainte de studiul în cauză.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Dacă este posibil, rezultatele numerice ar trebui evaluate cu ajutorul unei metode statistice adecvate și general acceptate. Metodele statistice și datele care urmează să fie analizate ar trebui să fie selecționate în timpul proiectării studiului (punctul 9). Dacă este necesar, procesul de selecție ar trebui să prevadă ajustări privind animalele supraviețuitoare.
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Raportul de testare ar trebui să conțină următoarele informații:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritatea și proprietățile fizico-chimice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa substanței chimice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul lotului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      certificatul de analiză chimică.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul (dacă este cazul):
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii vehiculului (dacă acesta este altul decât apa).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animalele utilizate în scopuri experimentale:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      speciile/sușa utilizată și justificarea opțiunii;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, sexul și vârsta animalelor la începutul testului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar etc.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea fiecărui animal la începutului testului.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea căii de administrare și a dozei alese;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele statistice utilizate pentru analiza datelor, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind formula substanței chimice testate/prepararea hranei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date analitice privind concentrația obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      calea de administrare și detalii privind administrarea substanței chimice testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      în cazul studiilor prin inhalare se specifică dacă este expus întregul corp sau numai nasul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dozele efective (mg/kg greutate corporală/zi) și factorul de conversie a concentrației substanței chimice testate din hrană sau apa de băut (mg/kg sau ppm) în doza efectivă, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii cu privire la calitatea hranei și a apei.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate (se prezintă date tabelare rezumate și date individuale privind animalele):
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Date generale:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date privind supraviețuirea;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală/modificările greutății corporale;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      consumul de hrană, calculul eficiența hranei (dacă a fost efectuat) și consumul de apă, după caz;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date toxicocinetice, dacă sunt disponibile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date ale examenului oftalmoscopic (dacă sunt disponibile);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date hematologice (dacă sunt disponibile);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de chimie clinică (dacă sunt disponibile).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Concluziile clinice:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      semne de toxicitate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      incidența (și severitatea, dacă a fost evaluată) oricărei anomalii;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura, severitatea și durata observațiilor clinice (temporare sau permanente).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Datele privind autopsia:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală la finalul studiului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea organelor și raportul dintre acestea și greutatea corporală, după caz;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele autopsiei; incidența și gravitatea anomaliilor.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Examenul histopatologic:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultate histopatologice non-neoplazice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultate histopatologic neoplazice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      corelația între observațiile macroscopice și microscopice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea detaliată a tuturor rezultatelor histopatologice care au legătură cu tratamentul, inclusiv clasificarea severității;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orice raport de evaluare științifică a lamelelor.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Interpretarea statistică a rezultatelor, dacă este cazul.
                                          
                                       
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Discutarea rezultatelor, care include următoarele aspecte:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea metodelor de modelare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relațiile doză-răspuns;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datele istorice de control;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      analiza oricăror informații privind modul de acțiune;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      determinarea BMD, NOAEL sau LOAEL;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      relevanța pentru om.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Concluzii.
                                          
                                       
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (1995), Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              EPA (2005), Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Combes R.D., Gaunt I., Balls M. (2004), A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System, ATLA 32: 163-208
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Barlow S.M., Greig J.B., Bridges J.W. et al. (2002), Hazard identification by methods of animal-based toxicology, Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Chhabra R.S., Bucher J.R., Wolfe M., Portier C. (2003), Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview, Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Capitolul B.27 din prezenta anexă, «Test de toxicitate orală subcronică. Studiu de 90 de zile de toxicitate orală cu doză repetată la nerozătoare».
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2012), Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, disponibil pe site-ul internet public al OCDE referitor la orientările privind testele, la adresa www.oecd.org/env/testguidelines.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Capitolul B.8 din prezenta anexă, «Toxicitate subacută prin inhalare: studiu de 28 de zile».
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Capitolul B.29 din prezenta anexă, «Toxicitate subcronică prin inhalare: studiu de 90 de zile».
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Capitolul B.9 din prezenta anexă, «Toxicitate la doză repetată (28 de zile) (administrare cutanată)».
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Boobis A.R., Cohen S.M., Dellarco V., McGregor D., Meek M.E., Vickers C., Willcocks D., Farland W. (2006), IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans, Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Cohen S.M., Meek M.E., Klaunig J.E., Patton D.E., Fenner-Crisp P.A. (2003), The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview, Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Holsapple M.P., Pitot H.C., Cohen S.N., Boobis A.R., Klaunig J.E., Pastoor T., Dellarco V.L., Dragan Y.P. (2006), Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk, Toxicol. Sci. 89:51-56.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Meek E.M., Bucher J.R., Cohen S.M., Dellarco V., Hill R.N., Lehman-McKemmon L.D., Longfellow D.G., Pastoor T., Seed J., Patton D.E. (2003), A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action, Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Carmichael N.G., Barton H.A., Boobis A.R. et al. (2006), Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements, Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Barton H.A., Pastoor T.P., Baetcke T. et al. (2006), The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Doe J.E., Boobis A.R., Blacker A. et al. (2006), A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Cooper R.L., Lamb J.S., Barlow S.M. et al. (2006), A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              OECD (2002), Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West W., Olin S. (2007), Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection, Crit. Rev. Toxicol. 37 (9): 729-837.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              ILSI (International Life Sciences Institute) (1997), Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (ed.), ILSI Press, Washington, D.C.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Griffiths S.A., Parkinson C., McAuslane J.A.N. and Lumley C.E. (1994), The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals, The Toxicologist 14(1):214.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              Usui T., Griffiths S.A. and Lumley C.E. (1996), The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. În D’Arcy P.O.F. & Harron D.W.G. (eds.), Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp. 279-284.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Carmichael N.G., Enzmann H., Pate I., Waechter F. (1997), The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry, Environ Health Perspect 105:1196-1203.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33).
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              National Research Council (1985), Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23, Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989), Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments, ISBN 3-906255-06-9.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006), Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., Vidal J.-M., van de Vorstenbosch C. (2001), A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes, Journal of Applied Toxicology, 21:15-23.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              IPCS (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, Environmental Health Criteria Document No. 60.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Tupper D.E., Wallace R.B. (1980), Utility of the Neurologic Examination in Rats, Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003.
                           
                        
                              (34)
                           
                           
                              Gad S.C. (1982), A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology, J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704.
                           
                        
                              (35)
                           
                           
                              Moser V.C., McDaniel K.M., Phillips P.M. (1991), Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz, Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283.
                           
                        
                              (36)
                           
                           
                              Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979), A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice, Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236.
                           
                        
                              (37)
                           
                           
                              Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991), Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments, Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609.
                           
                        
                              (38)
                           
                           
                              Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996), Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies, Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201.
                           
                        
                              (39)
                           
                           
                              EMEA (draft) document «Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity» (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).
                           
                        
                              (40)
                           
                           
                              Crissman J.W., Goodman D.G., Hildebrandt P.K. et al. (2004), Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚIE
                     Substanța chimică testată: Orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  ”
            
                  7.
               
               
                  Capitolul B.36 se înlocuiește cu următorul text:
                  „B.36.   TOXICOCINETICĂ
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 417 (2010) a OCDE. Studiile care evaluează toxicocinetica unei substanțe au ca scop să obțină informații adecvate privind absorbția, distribuția, biotransformarea (adică metabolismul) și excreția acesteia, să ajute la stabilirea unei relații între concentrație sau doză și toxicitatea observată și să ajute la înțelegerea mecanismului toxicității. Toxicocinetica poate contribui la înțelegerea studiilor toxicologice prin demonstrarea faptului că animalele utilizate în scopuri experimentale sunt expuse în mod sistematic la substanța chimică testată și prin identificarea fracțiilor circulante (substanță chimică de origine/metaboliți). Parametrii toxicocinetici de bază determinați în urma acestor studii vor furniza, de asemenea, informații privind potențialul de acumulare a substanței chimice testate în țesuturi și/sau organe și potențialul de declanșare a biotransformării ca urmare a expunerii la aceasta.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Datele toxicocinetice pot contribui la evaluarea adecvării și relevanței datelor de toxicitate animală în scopul extrapolării pericolelor pentru om și/sau a evaluării riscurilor. În plus, studiile toxicocinetice pot oferi informații utile privind stabilirea nivelurilor dozelor pentru studiile de toxicitate (cinetică liniară și neliniară), efectele asociate căilor de administrare, biodisponibilitatea și aspecte legate de proiectul studiului. Anumite tipuri de date toxicocinetice pot fi utilizate pentru elaborarea de modele toxicocinetice fiziologice.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Datele privind metabolismul/toxicocinetica au utilizări importante, cum ar fi sugerarea posibilelor toxicități și a modurilor de acțiune și a relațiilor dintre acestea și nivelul dozei și calea de expunere. În plus, datele privind metabolismul pot oferi informații utile pentru evaluarea importanței toxicologice a expunerilor la metaboliți exogeni ai substanței chimice testate.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Datele toxicocinetice adecvate vor fi utile în susținerea suplimentară a acceptabilității și a aplicabilității relațiilor cantitative structură-activitate, a metodelor de extrapolare sau a grupării în evaluarea siguranței substanțelor chimice. Datele cinetice mai pot fi utilizate pentru evaluarea relevanței toxicologice a altor studii (de exemplu, studii in vivo/in vitro).
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Dacă nu sunt menționate alte căi de administrare (a se vedea în special punctele 74-78), această metodă de testare se aplică administrării orale a substanței chimice testate.
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              6.
                           
                           
                              Sistemele de reglementare conțin cerințe și necesități diferite în ceea ce privește măsurarea efectelor și a parametrilor toxicocinetici ai diferitelor clase de substanțe chimice (de exemplu, pesticide, biocide, substanțe chimice industriale). Spre deosebire de majoritatea metodelor de testare, aceasta metodă descrie testarea toxicocinetică, care presupune măsurători și efecte multiple. În viitor pot fi dezvoltate metode de testare și/sau documente de orientare noi pentru a descrie fiecare efect în parte și în detaliu. În cazul acestei metode de testare, testele sau evaluările efectuate sunt specificate de către fiecare dintre cerințele și/sau sistemele de reglementare.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Există numeroase studii ce pot fi realizate pentru a evalua comportamentul toxicocinetic al unei substanțe chimice testate în scopuri de reglementare. Totuși, în funcție de necesități și de situațiile de reglementare specifice, este posibil să nu fie necesare toate aceste studii pentru evaluarea unei substanțe chimice testate. În proiectarea studiilor toxicocinetice este nevoie de flexibilitate, pentru a se ține cont de caracteristicile substanței chimice testate care face obiectul investigațiilor. În unele cazuri, este necesară numai studierea unui anumit de set de elemente pentru abordarea motivelor de îngrijorare privind pericolele și riscurile asociate substanței chimice testate. În unele situații, datele toxicocinetice pot fi colectate ca parte a evaluării din alte studii toxicologice. În alte situații pot fi necesare studii toxicocinetice suplimentare și/sau mai complexe, în funcție de necesitățile de reglementare și/sau dacă apar noi elemente în cursul evaluării substanței chimice testate.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Laboratorul de testare ar trebui să țină cont de toate informațiile disponibile referitoare la substanța chimică testată, la metaboliții și la analogii relevanți înainte de efectuarea studiului, în vederea creșterii calității acestuia și pentru a evita utilizarea inutilă a animalelor. Aceste informații ar putea include date obținute prin alte metode de testare relevante (studii in vivo/in vitro și/sau evaluări in silico). Proprietățile fizico-chimice, cum sunt coeficientul de partiție octanol/apă (exprimat ca log POW), pKa, solubilitatea în apă, presiunea de vapori și greutatea moleculară a unei substanțe chimice, pot fi utile în planificarea studiului și interpretarea rezultatelor. Acestea pot fi determinate prin metode adecvate, astfel cum sunt descrise în metodele de testare relevante.
                           
                        LIMITĂRI
                  
                              9.
                           
                           
                              Această metodă de testare nu poate fi aplicată în situații speciale, cum ar fi la animale gestante sau care alăptează și la pui de animale sau pentru evaluarea eventualelor reziduuri din animalele destinate producției de alimente care au fost expuse. Totuși, datele obținute în urma unui studiu conform capitolului B.36 pot oferi informații de referință, utile în proiectarea unor studii specifice pentru aceste investigații. Această metodă nu este destinată testării nanomaterialelor. Un raport privind revizuirea preliminară a aplicabilității orientărilor OCDE la nanomateriale indică faptul că Orientarea 417 (echivalentă metodei de testare B. 36) nu se aplică acestora (1).
                           
                        DEFINIȚII
                  
                              10.
                           
                           
                              Definițiile utilizate în scopurile acestei metode de testare sunt furnizate în apendice.
                           
                        CONSIDERAȚII REFERITOARE LA BUNĂSTAREA ANIMALELOR
                  
                              11.
                           
                           
                              Orientări privind tratamentul uman al animalelor sunt disponibile în Ghidul OCDE nr. 19 (2). Se recomandă consultarea Ghidului OCDE nr. 19 pentru toate studiile in vivo și in vitro descrise în această metodă de testare.
                           
                        DESCRIEREA METODELOR
                  
                     Studii pilot
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Utilizarea studiilor pilot este recomandată și încurajată pentru selectarea parametrilor experimentali ai studiilor de toxicocinetică (de exemplu, metabolism, bilanț masic, proceduri analitice, determinarea dozei, expirația CO2 etc.). Caracterizarea unora dintre acești parametri poate să nu necesite utilizarea de substanțe chimice marcate radioactiv.
                           
                        
                     Selectarea animalelor
                  
                  
                     Specia
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              Specia (și sușa) animalelor utilizate pentru testele toxicocinetice ar trebui, de preferință, să fie identice cu cele utilizate în alte studii toxicologice efectuate pe substanța chimică studiată. Animalul recomandat este șobolanul, acesta fiind cel mai frecvent utilizat în studiile toxicologice. Utilizarea altor specii sau a unor specii suplimentare poate fi justificată atunci când studiile toxicologice critice identifică urme importante de toxicitate la astfel de specii sau dacă se constată că toxicitatea/toxicocinetica acestora prezintă o relevanță mai mare pentru om. Selectarea speciei de animale și a sușei acesteia ar trebui justificată.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Dacă nu se specifică altfel, specia utilizată pentru această metodă de testare este șobolanul. Este posibil ca anumite aspecte ale acestei metode de testare să trebuiască a fi modificate pentru folosirea altor specii utilizate în scopuri experimentale.
                           
                        
                     Vârsta și sușa
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Ar trebui utilizate animale adulte sănătoase, tinere (de obicei având 6-12 săptămâni la momentul administrării dozei) (a se vedea, de asemenea, punctele 13 și 14). Utilizarea altor animale în afara celor adulte tinere ar trebui să fie justificată. Toate animalele ar trebui să aibă aceeași vârstă la începutul studiului. Diferența de greutate între animale nu ar trebui să depășească ± 20 % din greutatea medie a grupului de test. În mod ideal, sușa utilizată ar trebui să fie identică cu cea utilizată pentru obținerea bazei de date toxicologice privind substanța chimică testată.
                           
                        
                     Numărul și sexul animalelor
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Pentru fiecare doză testată ar trebui să se utilizeze cel puțin patru animale de același sex. Ar trebui prezentată o justificare pentru sexul animalelor utilizate. Ar trebui avută în vedere utilizarea animalelor de ambele sexe (patru masculi și patru femele) atunci când există indicii privind diferențe semnificative de toxicitate în legătură cu sexul.
                           
                        
                     Condiții de adăpostire și de hrănire
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              În general, animalele ar trebui adăpostite în incinte individuale pe durata perioadei de testare. Adăpostirea în grupuri poate fi justificată doar în cazuri speciale. Iluminatul ar trebui să fie artificial, alternând 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. Temperatura și umiditatea relativă a sălii în care se află animalele utilizate în scopuri experimentale ar trebui să fie de 22 °C (± 3 °C), iar umiditatea relativă de 30-70 %. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu asigurarea unei cantități nelimitate de apă de băut.
                           
                        
                     Substanța chimică testată
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Pentru toate aspectele studiului care se referă la bilanțul masic și la identificarea metaboliților ar trebui utilizată o substanță chimică marcată radioactiv cu 14C; totuși, dacă se poate demonstra că:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          bilanțul masic și identificarea metaboliților pot fi evaluate în mod adecvat utilizând o substanță chimică testată nemarcată;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          specificitatea și sensibilitatea analitică a metodei utilizate cu substanța chimică testată nemarcată radioactiv sunt egale sau mai mari decât cele care ar putea fi obținute prin marcarea radioactivă a acesteia,
                                       
                                    atunci nu este necesară utilizarea unei substanțe chimice testate marcate radioactiv. În plus, pot fi utilizați alți izotopi radioactivi și stabili, în special dacă elementul determină toxicitatea sau dacă face parte din porțiunea toxică a substanței chimice testate. Dacă este posibil, marcajul radioactiv ar trebui localizat în porțiunea centrală a moleculei stabile din punct de vedere metabolic (nu poate fi înlocuită, nu este eliminată prin metabolism sub formă de CO2 și nu este inclusă ansamblul radicalilor un atom de carbon din organism). Este posibil să fie necesară marcarea mai multor porțiuni sau zone specifice ale moleculei pentru a urmări soarta metabolică a substanței chimice testate.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Substanțele testate marcate și nemarcate radioactiv ar trebui să fie analizate folosind metode adecvate de stabilire a purității și identității. Puritatea radiochimică a substanței chimice testate marcate radioactiv ar trebui să fie cea mai înaltă posibilă pentru o anumită substanță chimică testată (în mod ideal, peste 95 %) și ar trebui depuse eforturi rezonabile pentru a identifica impuritățile prezente în procent mai mare sau egal cu 2 %. Puritatea, împreună cu identitatea și proporția impurităților identificate ar trebui să fie raportate. Anumite programe de reglementare pot alege să ofere orientări suplimentare pentru a ajuta la definirea și la specificarea substanțelor testate formate din amestecuri și a metodelor de determinare a purității.
                           
                        
                     Alegerea dozei
                  
                  
                     Studiul pilot
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              De obicei, pentru studiul pilot este suficientă o doză orală unică. Doza nu ar trebui să fie toxică, însă ar trebui să fie suficient de mare pentru a permite identificarea metaboliților în excremente (și, după caz, în plasmă) și pentru a atinge obiectivul declarat al studiului pilot, astfel cum se menționează la punctul 12 al acestei metode de testare.
                           
                        
                     Studiile principale
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Numărul preferat de doze pentru studiile principale este de cel puțin două, deoarece informațiile colectate de la cel puțin două grupuri de doză pot fi utile la stabilirea dozelor în alte studii de toxicitate și pentru evaluarea relației doză-răspuns din testele de toxicitate existente.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Atunci când se administrează două niveluri de doze, ambele ar trebui să fie suficient de mari pentru a permite identificarea metaboliților în excreții (și, după caz, în plasmă). Stabilirea dozei ar trebui să țină cont de informațiile obținute din datele de toxicitate disponibile. Dacă nu sunt disponibile informații (obținute, de exemplu, din studiile de toxicitate orală acută care înregistrează semnele clinice de toxicitate sau din studiile de toxicitate cu doză repetată), poate fi avută în vedere o valoare pentru doza mai mare situată sub valoarea estimată pentru DL50 (căile orală și cutanată) sau pentru CL50 (calea de administrare prin inhalare) sau sub valoarea cea mică estimată pentru intervalul de toxicitate acută. Doza mai mică ar trebui să fie o fracțiune din doza mai mare.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Dacă este investigat un singur nivel de doză, aceasta ar trebui să fie, în condiții ideale, suficient de mare pentru a permite identificarea metaboliților în excreții (și, după caz, în plasmă), fără a produce toxicitate vizibilă. Motivul neintroducerii unei a doua doze ar trebui să fie justificat.
                           
                        
                              24.
                           
                           
                              Dacă este necesară stabilirea efectului dozei asupra proceselor cinetice, este posibil ca două doze să nu fie suficiente și ar trebui ca cel puțin o doză să fie suficient de mare pentru a satura aceste procese. În cazul în care zona de sub curba concentrație plasmatică în funcție de timp (ASC) nu este liniară între cele două niveluri de doză utilizate în studiul principal, acesta este un indiciu clar că între cele două niveluri de doză are loc saturarea a unuia sau mai multor procese cinetice.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Doza maximă care ar trebui utilizată pentru substanțele chimice testate cu toxicitate redusă este de 1 000 mg/kg greutate corporală (căile orală și cutanată) – dacă administrarea se face prin inhalare, pentru orientare consultați capitolul B.2 din prezenta anexă; în mod normal, această doză nu ar trebui să depășească 2 mg/l. Anumite considerații de specifice substanței chimice pot impune utilizarea unei doze mai mari, în funcție de necesitățile de reglementare. Alegerea dozei ar trebui să fie întotdeauna justificată.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Datele toxicocinetice și de distribuție tisulară pentru doza unică pot fi suficiente pentru a determina potențialul de acumulare și/sau de persistență. Totuși, în anumite cazuri, poate fi necesară administrarea de doze repetate: (i) pentru o mai bună identificare a potențialului de acumulare și/sau de persistență sau a modificărilor toxicocinetice (de exemplu, inducția și inhibarea enzimelor); sau (ii) întrucât este impus de sistemul de reglementare în vigoare. În studiile cu doze repetate, deși administrarea dozei mici este, de obicei, suficientă, în anumite circumstanțe poate fi necesară administrarea repetată a unei doze mari (a se vedea, de asemenea, punctul 57).
                           
                        
                     Administrarea substanței chimice testate
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Substanța chimică testată ar trebui să fie dizolvată sau trecută în suspensie omogenă în același vehicul utilizat pentru celelalte studii de toxicitate cu administrare prin gavaj oral, dacă informațiile privind acest vehicul sunt cunoscute. Alegerea vehiculului ar trebui să fie justificată. Alegerea vehiculului și volumul de dozare ar trebui avute în vedere în proiectul studiului. Metoda cea mai obișnuită de administrare este prin gavaj; cu toate acestea, în anumite situații poate fi utilă administrarea prin capsule din gelatină sau prin amestecarea în hrană (în ambele cazuri, soluția folosită ar trebui justificată). Ar trebui verificată doza efectivă administrată fiecărui animal.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Volumul maxim de lichid care poate fi administrat o dată prin gavaj oral depinde de dimensiunea animalelor utilizate în scopuri experimentale, tipul vehiculului în care este introdusă doza și dacă animalul este hrănit sau nu înainte de administrarea substanței chimice testate. Motivele pentru hrănire sau limitarea acesteia înainte de administrarea dozei ar trebui să fie explicate. În mod normal, volumul ar trebui menținut la un nivel cât mai redus posibil atât pentru vehiculele apoase, cât și pentru cele neapoase. De regulă, volumul dozelor nu ar trebui să depășească 10 ml/kg greutate corporală la rozătoare. Volumele vehiculelor utilizate pentru substanțele chimice testate mai lipofile pot începe de la 4 ml/kg greutate corporală. Atunci când dozele sunt repetate, caz în care privarea zilnică de hrană ar fi contraindicată, ar trebui avute în vedere volume mai mici (de exemplu, 2-4 ml/kg greutate corporală). Dacă este posibil, va fi avută în vedere utilizarea unui volum al dozei în concordanță cu cele utilizate pentru substanța chimică testată în alte studii cu administrare prin gavaj oral.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Biodisponibilitatea sau absorbția orală relativă pot fi stabilite cu ajutorul administrării intravenoase (IV) a substanței chimice testate și a măsurării nivelului substanței chimice testate în sânge și/sau în excreții. Pentru studiul IV, se administrează o doză unică (de obicei echivalentă, însă fără a depăși doza orală mai mică – a se vedea selecția dozei) de substanță chimică testată, într-un vehicul adecvat. Acest material ar trebui să fie administrat într-un volum adecvat (de exemplu, 1 ml/kg greutate corporală), la locul selectat pentru administrare, la cel puțin patru animale de sex corespunzător (dacă se justifică, pot fi utilizate ambele sexe, a se vedea punctul 16). Pentru administrarea IV a substanței chimice testate este necesară prepararea unei doze complet dizolvate sau în suspensie. Vehiculul pentru administrarea IV nu ar trebui să interfereze cu integritatea sângelui sau fluxul sangvin. Dacă substanța chimică testată este administrată prin perfuzie, viteza perfuziei ar trebui să fie raportată și standardizată pentru toate animale, cu condiția utilizării unei pompe de perfuzie. Animalul ar trebui anesteziat atunci când se canulează vena jugulară (pentru administrarea substanței chimice testate și/sau prelevarea de sânge) sau când este utilizată artera femurală pentru administrare. Ar trebui să se acorde atenție tipului de anestezie folosit, deoarece poate avea efecte asupra toxicocineticii. Animalele ar trebui lăsate să își revină la starea normală înainte de administrarea substanței chimice testate și a vehiculului.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Pentru anumite substanțe chimice testate pot fi utilizate alte căi de administrare, cum sunt cea cutanată și cea prin inhalare (a se vedea punctele 74-78), în funcție de proprietățile fizico-chimice ale acestora și de utilizarea sau expunerea umană preconizată.
                           
                        
                     Măsurări
                  
                  
                     Bilanțul masic
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Bilanțul masic se calculează prin însumarea procentului dozei (radioactive) administrate care a fost excretat în urină, fecale și aerul expirat, cu procentul corespunzător prezent în țesuturi, în carcasa rămasă și în reziduurile colectate la spălarea cuștii (a se vedea punctul 46). În general, se consideră adecvată orice recuperare a substanței chimice testate (radioactivitate) administrate în procent de peste 90 %.
                           
                        
                     Absorbția
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              O primă estimare a absorbției poate fi obținută prin scăderea din valoarea bilanțului masic a procentului dozei prezente în tractul gastrointestinal (GI) și/sau în fecale. Pentru calculul procentului de absorbție, a se vedea punctul 33. Pentru investigarea excrețiilor, a se vedea punctele 44-49. Dacă gradul de absorbție după administrarea dozei orale nu poate fi calculat cu precizie pe baza studiilor de bilanț masic (de exemplu, atunci când în fecale este prezentă peste 20 % din doza administrată), pot fi necesare investigații suplimentare. Aceste studii ar putea include: 1. administrarea orală a substanței chimice testate și măsurarea substanței chimice testate în bilă; sau 2. administrarea orală și IV a substanței chimice testate și măsurarea substanței chimice testate nete prezente în urină, aerul expirat și carcasă pentru fiecare din cele două căi de administrare. În oricare dintre proiectele studiilor, radioactivitatea se măsoară ca metodă alternativă pentru analiza chimică specifică a substanței chimice testate și a metaboliților.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              În cazul în care se efectuează un studiu al excreției biliare, calea de administrare cel mai frecvent utilizată este cea orală. În acest studiu, substanța chimică testată se administrează într-o doză unică, prin canularea căilor biliare la cel puțin patru animale de sex corespunzător (sau de ambele sexe, dacă se justifică). După administrarea substanței chimice testate, excreția radioactivității/substanței chimice testate în bilă ar trebui urmărită atât timp cât este necesar pentru a estima procentul din doza administrată care a fost excretat pe această cale, care poate fi utilizat apoi pentru a calcula în mod direct gradul de absorbție orală, după cum urmează:
                              
                                 .
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              La unele clase de substanțe chimice testate, secreția directă a dozei absorbite poate avea loc prin membranele intestinale. În astfel de cazuri, măsurarea procentului dozei în fecale după administrarea unei doze orale la șobolanul cu căile biliare canulate nu este considerată reprezentativă pentru doza neabsorbită. În cazul în care se presupune că are loc o secreție intestinală, se recomandă ca procentul dozei absorbite să se bazeze pe absorbția calculată prin compararea excreției după administrare pe cale orală și cea pe cale IV (la șobolanul cu și fără căile biliare canulate) (a se vedea punctul 35). Dacă se consideră necesară cuantificarea secreției intestinale, se recomandă, de asemenea, măsurarea excreției după administrarea dozei IV la șobolanul cu căile biliare canulate.
                           
                        
                     Biodisponibilitatea
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Biodisponibilitatea poate fi calculată pe baza cineticii plasmatice/sangvine la grupurile cu administrare orală și IV descrise la punctele 50-52, prin analiza chimică specifică a substanței chimice testate și/sau a metabolitului (metaboliților) relevant (relevanți), prin urmare nefiind necesară marcarea radioactivă a substanței chimice testate. Biodisponibilitatea (F) substanței chimice testate sau a metabolitului (metaboliților) relevant (relevanți) poate fi calculată după cum urmează:
                              
                                 
                           
                        unde ASC este zona de sub curba concentrației plasmatice în funcție de timp, iar exp este calea de administrare experimentală (orală, cutanată sau prin inhalare).
                  
                              36.
                           
                           
                              Pentru evaluarea riscurilor efectelor sistemice, biodisponibilitatea componentei toxice este în general preferată procentului de absorbție atunci când concentrațiile sistemice ale studiilor la animale sunt comparate cu datele analoge de biomonitorizare ale studiilor privind expunerea muncitorilor. Situația poate deveni mai complicată atunci când dozele se află în intervalul neliniar, astfel încât este important ca procedura de screening toxicocinetic să determine dozele din intervalul liniar.
                           
                        
                     Distribuția tisulară
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Cunoașterea distribuției tisulare a unei substanțe chimice testate și/sau a metaboliților acesteia este importantă atât pentru identificarea țesuturilor țintă și înțelegerea mecanismelor de toxicitate subiacente, cât și pentru obținerea de informații privind potențialul de acumulare și de persistență al substanței chimice testate și al metaboliților. Procentul dozei totale (radioactive) din țesuturi și din carcasa reziduală ar trebui să fie măsurat cel puțin la încheierea experimentului de excreție (de obicei, într-un interval de cel mult 7 zile după administrarea dozei, în funcție de comportamentul specific al substanței chimice testate). Dacă la încheierea studiului nu este detectată nicio urmă a substanței chimice testate în țesuturi (de exemplu, deoarece substanța chimică testată a fost eliminată înainte de încheierea studiului ca urmare a unui timp scurt de înjumătățire), ar trebui să se acorde atenție evitării erorilor de interpretare a datelor. Într-o astfel de situație, distribuția tisulară ar trebui investigată la momentul concentrației plasmatice/sangvine maxime (Tmax) a substanței chimice testate (și/sau a metaboliților) sau la rata maximă a excreției urinare, după caz (a se vedea punctul 38). În plus, prelevarea de țesuturi poate fi necesară și la alte momente, pentru a se determina distribuția tisulară a substanței chimice testate și/sau a metaboliților săi, pentru a evalua dependența de timp (dacă este necesar), pentru a ajuta la calculul bilanțului masic și/sau la solicitarea unei autorități competente. Țesuturile care ar trebui prelevate includ țesuturi hepatice, adipoase, de la nivelul tractului GI, renale sau splenice, sânge integral, țesuturi din carcasa reziduală, din organele țintă și orice alte țesuturi [de exemplu, din glanda tiroidă, eritrocite, din organele reproductive, piele, din ochi (în special la animalele pigmentate)] care pot prezenta interes în evaluarea toxicologică a substanței chimice testate. Ar trebui avută în vedere analiza țesuturilor suplimentare la aceleași momente, în scopul unei utilizări mai eficiente a animalelor și în cazul în care se observă toxicitate la organul țintă în cursul studiilor de toxicitate cronică sau subcronică. De asemenea, ar trebui raportate concentrația reziduurilor (radioactive) și rapoartele țesut-plasmă (sangvină).
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              De asemenea, ar putea fi necesară sau solicitată de o autoritate competentă, evaluarea distribuției tisulare la momente precum cel al concentrației plasmatice/sangvine maxime (Tmax) sau al ratei maxime de excreție urinară, obținute în urma studiilor de cinetică plasmatică/sangvină sau de excreție respective. Aceste informații pot fi utile pentru înțelegerea toxicității și a potențialului de acumulare și de persistență al substanței chimice testate și al metaboliților. Selecția probelor ar trebui justificată; în general, probele pentru analiză ar trebui să îndeplinească aceleași condiții ca mai sus (a se vedea punctul 37).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Cuantificarea radioactivității pentru studiile privind distribuția tisulară poate fi efectuată prin disecarea, omogenizarea, combustia și/sau solubilizarea organelor, urmată de numărarea în scintilație lichidă (LSC) a reziduurilor capturate. Anumite tehnici, aflate în prezent în diferite stadii de evoluție, cum sunt autoradiografierea cantitativă a întregului organism și autoradiografierea microscopică a receptorilor, se pot dovedi utile pentru determinarea distribuției unei substanțe chimice testate în organe și/sau țesuturi (3) (4).
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Pentru alte căi de expunere decât cea orală, ar trebui prelevate și analizate țesuturi specifice, precum cele pulmonare, în cazul studiilor de toxicitate prin inhalare, sau piele, în cazul studiilor de toxicitate cutanată. A se vedea punctele 74-78.
                           
                        
                     Metabolismul
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Excrețiile (și, după caz, plasma) ar trebui să fie colectate pentru identificarea și cuantificarea substanței chimice testate și a metaboliților nemodificați, în conformitate cu descrierea de la punctele 44-49. Se acceptă gruparea excrețiilor pentru a facilita identificarea metaboliților unui anumit grup tratat. Se recomandă stabilirea profilurilor metaboliților pentru fiecare perioadă. Totuși, dacă lipsa de probe și/sau marcare radioactivă împiedică aceasta, se acceptă gruparea urinei și fecalelor de la mai multe momente, dar nu se acceptă gruparea celor provenite de la sexe sau doze diferite. Urina, fecalele, radioactivitatea din expirația animalelor tratate și bila, după caz, ar trebui evaluate prin metode calitate și cantitative adecvate.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Ar trebui depuse eforturi rezonabile pentru a se identifica toți metaboliții prezenți în procent de minimum 5 % din doza administrată și pentru a se alcătui o schemă metabolică pentru substanța chimică testată. Substanțele testate care au fost caracterizate în excreții ca reprezentând cel puțin 5 % din doza administrată ar trebui identificate. Această identificare constă în determinarea structurii exacte a componentelor. De obicei, identificarea este efectuată fie prin co-cromatografia metabolitului împreună cu etaloane cunoscute, folosind două sisteme diferite, sau prin tehnici de identificare structurală pozitivă, cum sunt spectrometria de masă, rezonanța magnetică nucleară (RMN) etc. În cazul co-cromatografiei, tehnicile cromatografice care utilizează aceeași fază staționară cu două sisteme de solvenți diferite nu sunt considerate ca fiind o metodă adecvată de dublă verificare a identității metabolitului, deoarece metodele nu sunt independente. Identificarea prin co-cromatografie ar trebui să fie obținută prin folosirea a două sisteme diferite și independente din punct de vedere analitic, precum cromatografia în strat subțire (CSS), cu fază inversă și cu fază normală, și cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC). Dacă separarea cromatografică este de calitate adecvată, confirmarea suplimentară prin mijloace spectroscopice nu este necesară. Alternativ, identificarea clară mai poate fi obținută utilizând metode care furnizează informații structurale cum sunt: cromatografia de lichide/spectrometria de masă (LC-MS), cromatografia de lichide/spectrometria de masă în tandem (LC-MS/MS), cromatografia de gaze/spectrometria de masă (GC-MS) și spectrometria RMN.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Dacă identificarea metaboliților în procent de minimum 5 % din doza administrată nu este posibilă, această situație ar trebui justificată/explicată în raportul final. Identificarea metaboliților care reprezintă sub 5 % din doza administrată poate fi utilă pentru o mai bună înțelegere a căii metabolice, pentru evaluarea pericolelor și/sau a riscurilor asociate substanței chimice testate. Ar trebui să se furnizeze o confirmare structurală ori de câte ori acest lucru este posibil. Aceasta poate include stabilirea profilului în plasmă, sânge sau alte țesuturi.
                           
                        
                     Excreția
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Rata și gradul de excreție a dozei administrate ar trebui să fie determinate prin măsurarea procentului dozei (radioactive) recuperate din urină, fecale și aerul expirat. Aceste date vor ajuta și la calcularea bilanțului masic. Cantitățile de substanță chimică testată (radioactivitate) care au fost eliminate prin urină, fecale și aerul expirat ar trebui să fie determinate la intervale adecvate de timp (a se vedea punctele 47-49). Experimentele cu doză repetată ar trebui să fie proiectate în mod corespunzător, astfel încât să permită colectarea datelor de excreție pentru atingerea obiectivelor descrise la punctul 26. Aceasta va permite realizarea unei comparații cu studiile în care se administrează o doză unică.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Dacă un studiu pilot a demonstrat că în aerul expirat nu a fost excretată nicio cantitate semnificativă din substanța chimică testată (radioactivitate) (conform punctului 49), aerul expirat nu ar trebui să fie colectat în studiul definitiv.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Fiecare animal ar trebui să fie plasat într-o unitate metabolică separată pentru colectarea excrețiilor (urină, fecale și aer expirat). La sfârșitul fiecărei perioade de prelevare (a se vedea punctele 47-49), unitățile metabolice se curăță cu un solvent adecvat (procedură denumită «spălarea cuștii»), care permite recuperarea cu maximă eficiență a substanței chimice testate (radioactivitate). Prelevarea excrețiilor ar trebui să înceteze după 7 zile sau, în caz contrar, după recuperarea a cel puțin 90 % din doza administrată.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Cantitățile totale de substanță chimică testată (radioactivitate) din urină ar trebui să se determine de cel puțin două ori în prima zi de prelevare, una dintre acestea ar trebui să aibă loc la 24 de ore după administrarea dozei, iar apoi zilnic, până la încheierea studiului. Se recomandă prelevarea de probe la mai mult de două momente în prima zi (de exemplu, la 6, 12 și 24 de ore). Rezultatele studiilor pilot ar trebui analizate pentru obținerea de informații privind momente alternative sau suplimentare de prelevare. Graficele de prelevare utilizate ar trebui justificate.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Cantitățile totale de substanță chimică testată (radioactivitate) din fecale ar trebui să se determine zilnic, începând cu 24 de ore de la prima administrare a dozei și până la încheierea studiului, cu excepția cazului în care studiile pilot sugerează momente alternative sau suplimentare de prelevare. Graficele alternative de prelevare utilizate ar trebui justificate.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Prelevarea CO2 expirat și a altor materiale volatile poate fi întreruptă în cursul unui studiu experimental în cazul în care în aerul expirat se determină mai puțin de 1 % din doza administrată într-un interval de prelevare de 24 de ore.
                           
                        
                     Studii privind evoluția în timp
                  
                  
                     Cinetica plasmatică/sangvină
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Scopul acestor studii este de a obține estimări ale parametrilor toxicocinetici de bază [de exemplu, Cmax, Tmax, timp de înjumătățire (t1/2), ASC] ai substanței chimice testate. Aceste studii pot fi efectuate la o doză unică sau, mai probabil, la cel puțin două doze. Nivelul dozei ar trebui să fie stabilit în funcție de natura experimentului și/sau problema studiată. Datele cinetice pot fi necesare pentru identificarea unor aspecte precum biodisponibilitatea substanței chimice testate și/sau pentru a clarifica efectul dozei asupra eliminării (de exemplu, pentru a clarifica dacă saturarea eliminării depinde de doză).
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Pentru aceste studii ar trebui utilizate cel puțin patru animale de același sex în fiecare grup de doză. Ar trebui prezentată o justificare pentru sexul animalelor utilizate. Ar trebui avută în vedere utilizarea animalelor de ambele sexe (patru masculi și patru femele) atunci când există indicii privind diferențe semnificative de toxicitate în legătură cu sexul.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              După ce substanța chimică testată (marcată radioactiv) a fost administrată, ar trebui prelevate probe de sânge de la fiecare animal, la intervale adecvate, folosind metodologia corespunzătoare de prelevare. Volumul și numărul probelor de sânge care pot fi prelevate de la fiecare animal pot fi limitate de eventualele efecte ale prelevării repetate asupra sănătății/fiziologiei animalelor și/sau asupra sensibilității metodei analitice. Se analizează toate probele de la fiecare animal. În unele cazuri (de exemplu, caracterizarea metaboliților), poate fi necesară gruparea probelor de la mai multe animale. Probele grupate ar trebui să fie identificate în mod clar și să fie însoțite de o justificare a grupării. Dacă se utilizează o substanță marcată radioactiv, poate fi necesară analizarea radioactivității prezente totale. În acest caz, radioactivitatea totală ar trebui analizată fie în sângele integral și în plasmă, fie în plasmă și în globulele roșii pentru a permite calcularea raportului sânge/plasmă. În alte cazuri, pot fi necesare investigații mai specifice care necesită identificarea compusului de origine și/sau a metaboliților sau evaluarea legării de proteine.
                           
                        
                     Cinetica altor țesuturi
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Scopul acestor studii este de a obține informații privind evoluția în timp, pentru analizarea unor aspecte precum modul de acțiune toxică, bioacumularea și biopersistența prin determinarea nivelurilor substanței chimice testate în diverse țesuturi. Selecția țesuturilor și a numărului de momente evaluate va depinde de aspectul vizat și de baza de date toxicologică referitoare la substanța chimică testată. Proiectarea acestor studii suplimentare de cinetică a țesuturilor ar trebui să țină seamă de informațiile obținute în conformitate descrierea de la punctele 37-40. Aceste studii pot implica administrarea unei doze unice sau a unor doze repetate. Fiecare abordare ar trebui justificată în detaliu.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Motivele pentru efectuarea unor studii privind cinetica altor țesuturi pot include:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          identificarea unui timp de înjumătățire în sânge extins, care sugerează o posibilă acumulare a substanței chimice în diferite țesuturi; sau
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          interesul de a vedea dacă s-a atins o stare staționară în anumite țesuturi (de exemplu, în cadrul studiilor cu doză repetată, chiar dacă a fost obținut un nivel aparent staționar al substanței chimice testate în sânge, poate fi de interes să se stabilească dacă a fost obținut un nivel staționar și în țesuturile țintă).
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              Pentru aceste tipuri de studii privind evoluția în timp se administrează o doză orală corespunzătoare din substanța chimică testată la cel puțin patru animale, la fiecare interval de administrare, și se urmărește evoluția în timp a distribuției în țesuturile relevante. Pot fi utilizate numai animale de același sex, cu excepția cazurilor în care se observă o toxicitate specifică unui anumit sex. Analiza radioactivității totale sau a substanței chimice de origine și/sau a metaboliților va depinde, de asemenea, de problema studiată. Evaluarea distribuției tisulare ar trebui realizată folosind tehnici adecvate.
                           
                        
                     Inducția/inhibarea enzimatică
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Studiile care abordează posibilele efecte ale inducției/inhibării enzimatice sau biotransformării substanței studiate pot fi necesare în unul sau mai multe din cazurile următoare:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          dovezile disponibile indică o legătură între biotransformarea substanței chimice testate și creșterea toxicității;
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          datele de toxicitate disponibile indică o legătură neliniară între doză și metabolism;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          rezultatele studiilor de identificare a metaboliților demonstrează existența unui metabolit cu potențial toxic care ar fi putut să fie produs pe o cale enzimatică indusă de substanța chimică testată;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          pentru explicarea efectelor posibil legate de fenomenele de inducție a enzimelor;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          dacă în cursul experimentelor in vitro sau in vivo cu specii sau în condiții diferite se observă modificări toxicologice semnificative ale profilului metabolic al substanței chimice testate, poate fi necesară caracterizarea enzimei (enzimelor) implicate (de exemplu, enzimele de fază I, cum sunt izoenzimele sistemului mono-oxigenază dependent de citocromul P450, enzimele de fază II, cum sunt izoenzimele sulfotransferazei sau uridin-difosfat-glucuronil transferazei sau orice alte enzime relevante). Aceste informații pot fi utilizate pentru a evalua pertinența extrapolărilor interspecii.
                                       
                                    
                        
                              57.
                           
                           
                              Ar trebui utilizate protocoale de studiu adecvate pentru evaluarea modificărilor în toxicocinetica substanței chimice testate, validate și justificate corespunzător. Astfel de proiecte de studiu pot consta în administrarea de doze repetate cu substanță chimică testată nemarcată, urmate de administrarea unei doze unice marcate radioactiv în ziua a 14-a sau a unei doze repetate cu substanța chimică testată marcată radioactiv și de prelevarea de probe în zilele 1, 7 și 14, pentru determinarea profilurilor metaboliților. Administrarea de doze repetate cu substanța chimică testată marcată radioactiv poate oferi, de asemenea, informații privind bioacumularea (a se vedea punctul 26).
                           
                        ALTE ABORDĂRI
                  
                              58.
                           
                           
                              Pe lângă experimentele in vivo descrise în această metodă de testare, alte abordări pot oferi informații utile privind absorbția, distribuția, metabolizarea sau eliminarea unei substanțe chimice testate la anumite specii.
                           
                        
                     Utilizarea informațiilor obținute din experimentele in vitro
                     
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Studiile in vitro care folosesc sisteme de testare adecvate pot răspunde la mai multe întrebări privind metabolizarea substanței chimice testate. Posibilii metaboliți pot fi studiați cu ajutorul hepatocitelor recent izolate sau cultivate și a fracțiilor subcelulare hepatice (de exemplu, microzomi și citozol sau fracția S9). Metabolizarea locală în organul țintă (de exemplu, plămân) poate prezenta interes pentru evaluarea riscurilor. În aceste scopuri pot fi utile fracțiile microzomiale ale organelor țintă. Studiile cu microzomi pot fi utile în abordarea posibilelor diferențe între sexe și stadii de viață și în caracterizarea parametrilor enzimatici (Km și Vmax), care pot ajuta la evaluarea dependenței de doză a metabolismului în raport cu nivelurile de expunere. În plus, microzomii pot fi utili pentru identificarea enzimelor microzomiale specifice implicate în metabolizarea substanței chimice testate, care se pot dovedi utile pentru extrapolarea între specii (a se vedea, de asemenea, punctul 56). Potențialul de inducție al biotransformării mai poate fi examinat folosind fracțiile subcelulare hepatice (de exemplu, microzomi și citozol) ale animalelor pretratate cu substanța chimică testată de interes, prin intermediul studiilor in vitro de inducție a hepatocitelor sau pe baza unor linii de celule specifice care produc enzimele relevante. În anumite circumstanțe și în condiții adecvate, poate fi avută în vedere utilizarea fracțiilor subcelulare provenite din țesuturi umane pentru determinarea posibilelor diferențe de biotransformare dintre specii. Rezultatele investigațiilor in vitro pot fi utilizate, de asemenea, în dezvoltarea modelelor PBTK (5).
                           
                        
                              60.
                           
                           
                              Studiile de absorbție cutanată in vitro pot oferi informații suplimentare pentru caracterizarea absorbției (6).
                           
                        
                              61.
                           
                           
                              Culturile primare de celule pe bază de celule hepatice și secțiuni de țesuturi recente pot fi utilizate în abordarea unor probleme similare celor din cazul microzomilor hepatici. În anumite cazuri, este posibil să se răspundă la anumite întrebări prin utilizarea liniilor celulare care exprimă clar enzima relevantă sau a liniilor celulare modificate genetic. În anumite cazuri, se poate dovedi utilă studierea inhibării și a inducției izoenzimelor specifice citocromului P450 (de exemplu, CYP1A1, 2E1, 1A2 și altele) și/sau a enzimelor de fază II de către compusul de origine, folosind studii in vitro. Informațiile obținute pot fi relevante pentru compuși cu structuri similare.
                           
                        
                     Utilizarea datelor toxicocinetice din studiile de toxicitate ca informații complementare
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Analiza probelor de sânge, țesuturi și/sau excreții obținute în cursul studiilor de toxicitate pot oferi date privind biodisponibilitatea, modificările concentrației plasmatice în timp (ASC, Cmax), potențialul de bioacumulare, ratele de eliminare și modificările de metabolizare și cinetică în funcție de sex și vârstă.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              Proiectul studiului poate fi utilizat pentru a răspunde la întrebări privind: saturația absorbției, căile de biotransformare sau de excreție la niveluri mai mari ale dozei; funcționarea noilor căi de metabolizare la doze mai mari și limitarea metaboliților toxici la doze mai mari.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Alte considerații privind evaluarea pericolelor ar putea include aspecte precum:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          sensibilitatea în funcție de vârstă datorită diferențelor privind starea barierei hematoencefalice, a rinichilor și/sau a capacităților de detoxifiere;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          sensibilitatea sub-populației ca urmare a diferențelor între capacitățile de biotransformare sau a altor diferențe toxicocinetice;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          gradul de expunere al fetusului prin transferul transplacental al substanțelor chimice sau al puilor nou-născuți prin alăptare.
                                       
                                    
                        
                     Utilizarea modelării toxicocinetice
                  
                  
                              65.
                           
                           
                              Modelele toxicocinetice se pot dovedi utile în diferite aspecte ale evaluării pericolelor și riscurilor, cum ar fi, de exemplu, predicția expunerii sistemice și a dozei transferate țesuturilor interne. În plus, pot fi elucidate probleme specifice privind modul de acțiune, iar modelele pot oferi o bază de extrapolare între specii, căi de expunere, modele de dozare și pentru evaluarea riscurilor la om. Indiferent de specie, datele utile pentru dezvoltarea modelelor PBTK ale unei substanțe chimice testate includ: 1. coeficienți de partiție; 2. constante biochimice și parametri fiziologici; 3. parametri de absorbție specifici căilor; și 4. date cinetice in vivo pentru evaluarea modelelor [de exemplu, parametrii de eliminare pentru căile de excreție relevante (> 10 %), Km și Vmax pentru metabolism]. Datele experimentale utilizate pentru dezvoltarea modelelor ar trebui să fie generate prin metode științifice valabile, iar rezultatele modelului ar trebui să fie validate. Parametrii specifici substanței chimice testate și speciilor, precum ratele de absorbție, coeficientul de partiție sânge-țesut și constantele ratei de metabolizare sunt adeseori determinate pentru a facilita dezvoltarea de modele necompartimentate sau fiziologice (7).
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                              66.
                           
                           
                              Se recomandă ca raportul studiului să conțină un cuprins.
                           
                        
                     Conținutul raportului
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Conținutul raportului ar trebui să includă informații tratate de această metodă de testare, organizate în secțiuni și puncte, după cum urmează:
                           
                        
                     Rezumat
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Această secțiune a raportului studiului ar trebui să conțină un rezumat al proiectului studiului și o descriere a metodelor utilizate. De asemenea, acesta ar trebui să evidențieze rezultatele cheie privind bilanțul masic, natura și magnitudinea metaboliților, reziduurile din țesuturi, rata de eliminare, potențialul de bioacumulare, diferențele între sexe etc. Rezumatul ar trebui să fie suficient de detaliat pentru a permite evaluarea rezultatelor.
                           
                        
                     Introducere
                  
                  
                              69.
                           
                           
                              Această secțiune a raportului ar trebui să includă obiectivele, justificarea și proiectul studiului, precum și referințele bibliografice corespunzătoare și eventualul context al acestuia.
                           
                        
                     Materiale și metode
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Această secțiune a raportului ar trebui să includă o descriere detaliată a tuturor informațiilor pertinente, inclusiv:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          substanța chimică testată
                                          Această subsecțiune ar trebui să includă identificarea substanței chimice testate: denumirea chimică, structura moleculară, determinarea calitativă și cantitativă a compoziției chimice, puritatea chimică și, atunci când este posibil, tipul și cantitățile impurităților. De asemenea, aceasta ar trebui să includă informații referitoare la proprietățile fizico-chimice, inclusiv starea fizică, culoarea, solubilitatea brută și/sau coeficientul de partiție, stabilitatea și, după caz, corozivitatea. Dacă este necesar, ar trebui furnizate informații privind izomerii. În cazul în care substanța chimică testată este marcată radioactiv, în această subsecțiune ar trebui introduse informații referitoare la: tipul de radionuclid, poziția marcajului, activitatea specifică și puritatea radiochimică.
                                          Ar trebui indicate tipul sau descrierea oricăror vehicule, diluanți, agenți de suspensie și emulgatori, precum și orice alte materiale utilizate pentru administrarea substanței chimice testate;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          animalele utilizate în scopuri experimentale
                                          Această subsecțiune ar trebui să conțină informații privind animalele utilizate în scopuri experimentale, inclusiv selectarea și justificarea speciei, sușei și a vârstei la începerea studiului, sexul, greutatea corporală, starea de sănătate și condițiile de creștere a animalului;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          metodele
                                          Această subsecțiune ar trebui să includă detalii privind proiectul studiului și metodologia utilizată. Aceasta ar trebui să conțină o descriere referitoare la:
                                          
                                                      1.
                                                   
                                                   
                                                      justificarea oricărei modificări a căii și a condițiilor de expunere, după caz;
                                                   
                                                
                                                      2.
                                                   
                                                   
                                                      justificarea selectării nivelurilor dozei;
                                                   
                                                
                                                      3.
                                                   
                                                   
                                                      descrierea studiilor pilot utilizate în proiectarea experimentală a studiilor de urmărire, după caz. Ar trebui prezentate datele de susținere din studiul pilot;
                                                   
                                                
                                                      4.
                                                   
                                                   
                                                      modul de preparare a soluției de dozare și tipul eventualului solvent sau vehicul utilizat;
                                                   
                                                
                                                      5.
                                                   
                                                   
                                                      numărul grupurilor de tratament și numărul animalelor din fiecare grup;
                                                   
                                                
                                                      6.
                                                   
                                                   
                                                      nivelul și volumul dozelor (și, în cazul utilizării radioactivității, activitatea specifică a dozei);
                                                   
                                                
                                                      7.
                                                   
                                                   
                                                      calea (căile) și metodele de administrare;
                                                   
                                                
                                                      8.
                                                   
                                                   
                                                      frecvența de administrare a dozelor;
                                                   
                                                
                                                      9.
                                                   
                                                   
                                                      perioadele de privare de hrană (dacă se utilizează);
                                                   
                                                
                                                      10.
                                                   
                                                   
                                                      radioactivitatea totală a fiecărui animal;
                                                   
                                                
                                                      11.
                                                   
                                                   
                                                      manipularea animalelor;
                                                   
                                                
                                                      12.
                                                   
                                                   
                                                      prelevarea și manipularea probelor;
                                                   
                                                
                                                      13.
                                                   
                                                   
                                                      metodele analitice utilizate pentru separarea, cuantificarea și identificarea metaboliților;
                                                   
                                                
                                                      14.
                                                   
                                                   
                                                      limita de detecție pentru metodele utilizate;
                                                   
                                                
                                                      15.
                                                   
                                                   
                                                      alte măsurători și proceduri experimentale utilizate (inclusiv validarea metodelor de analiză a metaboliților);
                                                   
                                                
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          analiza statistică
                                          Dacă rezultatele studiului sunt examinate folosind analiza statistică, ar trebui să fie incluse informații suficiente privind metoda de analiză și programul informatic utilizate, astfel încât un auditor/statistician independent să poată reevalua și reface analiza.
                                          În cazul studiilor de modelare a sistemelor, precum PBTK, modelul ar trebui să fie prezentat suficient de detaliat pentru a permite reconstrucția și validarea independentă a modelului (a se vedea punctul 65 și apendicele «Definiții»).
                                       
                                    
                        
                     Rezultate
                  
                  
                              71.
                           
                           
                              Toate datele ar trebui să fie prezentate sub formă de rezumat și tabelar, însoțite de evaluarea statistică adecvată și descrise în textul acestei secțiuni. Datele de contorizare a radioactivității ar trebui să fie rezumate și prezentate în forma corespunzătoare pentru studiu, de obicei în echivalenți microgram sau miligram pe masa de probă, dar pot fi utilizate și alte unități. Această secțiune ar trebui să includă ilustrări grafice ale rezultatelor, reproducerea datelor cromatografice și spectrometrice reprezentative, identificarea/cuantificarea metaboliților și căile metabolice propuse, inclusiv structura moleculară a metaboliților. În plus, în această secțiune vor fi introduse, după caz, următoarele informații:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          cantitatea și procentul recuperare a radioactivității din urină, fecale, aerul expirat și din reziduurile de urină și fecale colectate la spălarea cuștii:
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pentru studiile cutanate vor mai fi incluse, de asemenea, date privind substanța chimică testată recuperată din pielea tratată, spălările pielii, radioactivitatea reziduală din dispozitivul care acoperiră pielea și din unitatea metabolică, precum și rezultatele studiului de spălare a substanței de pe piele. Pentru discuții suplimentare, a se vedea punctele 74-77;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pentru studiile prin inhalare vor mai fi incluse, de asemenea, date privind recuperarea substanței chimice testate din plămâni și țesuturile nazale (8). Pentru discuții suplimentare, a se vedea punctul 78;
                                                   
                                                
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          distribuția tisulară, raportată ca procent din doza și din concentrația administrată (echivalent micrograme pe gram de țesut) și rapoartele țesut-sânge sau țesut-plasmă;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          bilanțul de materiale rezultat din fiecare studiu presupunând analizarea țesuturilor corporale și a excrețiilor;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          concentrațiile plasmatice și parametrii toxicocinetici (biodisponibilitate, ASC, Cmax, Tmax, eliminare, timp de înjumătățire) după administrarea pe calea (căile) relevantă (relevante) de expunere;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          rata și nivelul de absorbție a substanței chimice testate după administrarea pe calea (căile) relevantă (relevante) de expunere;
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          cantitățile de substanță chimică testată și de metaboliți (raportate ca procent din doza administrată) prelevate din excreții;
                                       
                                    
                                          7.
                                       
                                       
                                          o trimitere la datele anexate care conțin date pentru fiecare animal pentru toate efectele măsurate (de exemplu, administrarea dozei, procentul de substanță recuperată, concentrațiile, parametrii toxicocinetici etc.);
                                       
                                    
                                          8.
                                       
                                       
                                          o figură conținând căile metabolice propuse și structurile moleculare ale metaboliților.
                                       
                                    
                        
                     Discuție și concluzii
                  
                  
                              72.
                           
                           
                              În această secțiune, autorul (autorii) ar trebui:
                              
                                          1.
                                       
                                       
                                          să propună o cale metabolică pe baza rezultatelor metabolizării și a eliminării substanței chimice testate;
                                       
                                    
                                          2.
                                       
                                       
                                          să discute orice posibilă diferență între specii și sexe privind eliminarea și/sau biotransformarea substanței chimice testate;
                                       
                                    
                                          3.
                                       
                                       
                                          să prezinte în formă tabelară și să discute identificarea și amploarea metaboliților, ratele de eliminare, potențialul de bioacumulare și nivelul reziduurilor în țesuturi al substanței de origine și/sau a metaboliților, precum și posibilele modificări ale parametrilor toxicocinetici în funcție de variația dozei, după caz;
                                       
                                    
                                          4.
                                       
                                       
                                          să introducă în această secțiune orice date toxicocinetice relevante obținute în cursul studiilor de toxicitate;
                                       
                                    
                                          5.
                                       
                                       
                                          să prezinte o concluzie concisă care poate fi susținută de rezultatele studiului;
                                       
                                    
                                          6.
                                       
                                       
                                          să adauge secțiuni (după caz sau dacă este necesar).
                                       
                                    
                        
                              73.
                           
                           
                              Ar trebui utilizate secțiuni suplimentare care să conțină informații bibliografice, tabele, figuri, apendice etc.
                           
                        CĂI ALTERNATIVE DE EXPUNERE
                  
                     Calea cutanată
                  
                  
                     Tratament cutanat
                  
                  
                              74.
                           
                           
                              Această secțiune oferă informații specifice privind investigarea toxicocineticii substanței chimice testate administrate pe cale cutanată. Pentru absorbția cutanată, ar trebui consultat capitolul B.44 din prezenta anexă [Absorbția cutanată: metoda de testare in vivo (9)]. Prezenta metodă de testare B.36 poate fi utilizată și pentru alte puncte finale, cum sunt distribuția și metabolismul. În tratamentul cutanat ar trebui folosite unul sau mai multe niveluri ale dozei de substanță chimică testată. Substanța chimică testată (de exemplu materialul pur, diluat sau amestec care conține substanța chimică testată aplicată pe piele) ar trebui să fie același (sau un înlocuitor adecvat) cu preparatul la care pot fi expuși omul sau alte specii țintă posibile. Nivelul (nivelurile) dozei ar trebui selectate în conformitate cu punctele 20-26 din această metodă de testare. Factorii care pot fi luați în considerare în stabilirea dozei cutanate sunt expunerea preconizată la om și/sau dozele la care au fost observate efecte toxice în alte studii de toxicitate cutanată. Dacă este necesar, doza (dozele) cutanată (cutanate) ar trebui să fie dizolvate într-un vehicul adecvat și aplicate într-un volum suficient pentru administrare. Cu puțin timp înainte de testare, blana din regiunea dorsală a animalelor ar trebui tunsă. Blana poate fi și rasă, dar o astfel de operațiune ar trebui efectuată cu aproximativ 24 de ore înainte de test. Când se tunde sau se rade blana ar trebui acordată atenție pentru a nu se leza pielea, acest lucru putându-i afecta permeabilitatea. Zona care se degajează în vederea aplicării substanței chimice testate ar trebui să fie de aproximativ 10 % din suprafața corporală. În cazul substanțelor foarte toxice, suprafața tratată poate fi mai mică de 10 %, însă substanța ar trebui să fie aplicată într-un strat cât mai subțire și mai uniform posibil pe o parte cât mai mare posibil din această suprafață. Aceeași suprafață de tratare ar trebui să fie utilizată la toate grupurile de testare cutanată. Zonele tratate ar trebui să fie protejate prin acoperire permanentă cu un material adecvat, fixat pe suprafață. Animalele ar trebui să fie adăpostite în incinte individuale.
                           
                        
                              75.
                           
                           
                              Ar trebui efectuat un studiu de spălare cutanată, pentru a evalua cantitatea de doză de substanță chimică testată aplicată care poate fi îndepărtată prin spălare cu un săpun neutru și apă a zonei de piele tratate. Acest studiu poate, de asemenea, să ajute la stabilirea bilanțului masic atunci când substanța chimică testată se administrează pe cale cutanată. Pentru acest studiu de spălare cutanată ar trebui aplicată o doză unică de substanță chimică testată pe două animale. Nivelul dozei este stabilit în conformitate cu punctul 23 al acestei metode de testare (a se vedea, de asemenea, discuția privind perioada de contact cu pielea de la punctul 76). Pentru a evalua eficiența îndepărtării substanței chimice testate prin procedura de spălare ar trebui să se determine cantitatea de substanță chimică testată care a fost recuperată din reziduurile de spălare.
                           
                        
                              76.
                           
                           
                              Cu excepția cazurilor în care apare corozivitate, substanța chimică testată ar trebui aplicată și păstrată pe piele timp de cel puțin 6 ore. După înlăturarea materialului protector, zona tratată ar trebui spălată conform procedurii prevăzute de studiul de spălare cutanată (a se vedea punctul 75). Atât materialul protector cât și reziduurile de spălare ar trebui analizate pentru identificarea reziduurilor substanței chimice testate. La încheierea studiilor, fiecare animal ar trebui eutanasiat în conformitate cu punctul 2, iar pielea tratată ar trebui eliminată. O porțiune adecvată din pielea tratată ar trebui analizată pentru identificarea reziduurilor de substanță chimică testată (radioactivitate).
                           
                        
                              77.
                           
                           
                              Pentru evaluarea toxicocinetică a produselor farmaceutice pot fi necesare proceduri diferite, în conformitate cu prevederile sistemului de reglementare relevant.
                           
                        
                     Inhalare
                  
                  
                              78.
                           
                           
                              Ar trebui utilizată o singură concentrație (sau mai multe, dacă este necesar) a substanței chimice testate. Concentrația (concentrațiile) ar trebui selectate în conformitate cu punctele 20-26 din această metodă de testare. Tratamentele prin inhalare urmează a se efectua cu ajutorul dispozitivelor de inhalare nazală sau care se fixează pe cap, pentru a preveni absorbția prin alte căi de expunere (8). Dacă se utilizează alte condiții de expunere, justificarea pentru modificarea acestora ar trebui documentată. Durata de expunere prin inhalare ar trebui să fie stabilită anterior; de obicei, aceasta durează 4-6 ore.
                           
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              OECD (2009), Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Solon E.G., Kraus L. (2002), Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J. Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Stumpf W.E. (2005), Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography, J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Loizou G., Spendiff M., Barton H.A., Bessems J., Bois F.Y., d’Yvoire M.B., Buist H., Clewell H.J. 3rd, Meek B., Gundert-Remy U., Goerlitz G., Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400-411.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Capitolul B.45 din prezenta anexă, «Absorbția cutanată: Metoda de testare in vitro».
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              IPCS (2010), Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment, IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Capitolul B.44 din prezenta anexă, «Absorbția cutanată: Metoda de testare in vivo».
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Barton H.A. et al. (2006), The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Gibaldi M. and Perrier D. (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York.
                           
                        
                     Apendice
                     DEFINIȚII
                     
                        Absorbție: Procesul (procesele) de asimilare a substanțelor chimice în interiorul țesuturilor sau între acestea. Absorbția se referă la compusul de origine și la toți metaboliții săi. A nu se confunda cu «biodisponibilitatea».
                     
                        Acumulare (Bioacumulare): Creșterea în timp a cantității unei substanțe chimice testate în țesuturi (de obicei, în țesuturile adipoase, după expunere repetată); dacă substanța chimică testată intră în corp mai repede decât este eliminată, organismul o acumulează, ceea ce poate conduce la creșterea concentrațiilor toxice.
                     
                        ADME: Acronim pentru «Absorbție, distribuție, metabolism și excreție».
                     
                        ASC: Zona de sub curba concentrație plasmatică în funcție de timp (Area under the plasma concentration-time curve): zona aflată sub curba unui grafic care reprezintă concentrația substanței chimice testate în plasmă în funcție de timp. Aceasta reprezintă cantitatea totală de substanță chimică testată absorbită de organism într-o anumită perioadă de timp. În condiții liniare, ASC (de la momentul zero la infinit) este proporțională cu cantitatea totală a substanței chimice testate care a fost absorbită de către organism, indiferent de rata de absorbție.
                     
                        Autoradiografie: (autoradiografia întregului corp): Utilizată pentru determinarea, din punct de vedere cantitativ și/sau calitativ, a localizării unei substanțe chimice testate radioactive în țesuturi, această tehnică utilizează razele X sau, mai recent, fosforimagistica digitală pentru a vizualiza moleculele sau fragmentele de molecule marcate radioactiv prin înregistrarea radiațiilor emise în interiorul obiectului studiat. Comparativ cu disecția organelor, autoradiografia cantitativă a întregului corp poate prezenta anumite avantaje în evaluarea distribuției substanței chimice testate și în aprecierea recuperării și resorbției generale a materialului radioactiv în țesuturi. De exemplu, unul din cele mai importante avantaje constă în faptul că poate fi utilizată într-un model pentru animale pigmentate pentru a evalua posibila asociere a substanței chimice testate cu melanina, aceasta din urmă având capacitatea de a se lega de anumite molecule. Totuși, deși poate oferi imagini de ansamblu ale locurilor cu capacitate ridicată/afinitate redusă de legare din întregul corp, această tehnică poate fi limitată în recunoașterea locurilor țintă specifice, cum sunt locurile de legare la receptori, care necesită o rezoluție și o sensibilitate înalte pentru a fi detectate. Atunci când se utilizează tehnica autoradiografierii, experimentele care au ca scop determinarea bilanțului masic al compusului administrat ar trebui efectuate pe un grup separat sau în cadrul unui studiu separat de experimentul de distribuție tisulară, prin care toate excrețiile (care pot include și aerul expirat) și carcasele integrale sunt omogenizate și analizate prin numărare în scintilație lichidă.
                     
                        Excreție biliară: Excreție prin căile biliare.
                     
                        Bioacumulare: A se vedea «acumulare».
                     
                        Biodisponibilitate: Fracție a unei doze administrate care intră în circulația sistemică sau care devine disponibilă la locul activității fiziologice. De obicei, biodisponibilitatea unei substanțe chimice testate se referă la compusul de origine, dar ar putea să se refere și la metabolitul acestuia. Biodisponibilitatea ia în considerare o singură formă chimică. Nota bene: biodisponibilitatea și absorbția sunt noțiuni diferite. Diferența între, de exemplu, absorbția orală (prezența în peretele intestinal și în circulația portală) și biodisponibilitate (prezența în sângele sistemic și în țesuturi) poate apare ca urmare a degradării chimice provocate de factori precum metabolizarea în peretele intestinal, transportul efluxului înapoi în lumenul intestinal sau metabolizarea presistemică hepatică (10). Biodisponibilitatea componentei toxice (compus de origine sau un metabolit) reprezintă un parametru critic al evaluării riscului la om (extrapolarea dozei în sens descendent, extrapolarea de la o cale la alta), utilizat pentru derivarea unei valori interne pe baza NOAEL sau BMD externe (doza aplicată). Absorbția orală este un parametru suficient de evaluare a efectelor hepatice la administrare orală. Totuși, pentru evaluarea oricărui alt efect în afara locului de intrare, biodisponibilitatea este, în general, un parametru mai fiabil decât absorbția pentru evaluarea riscurilor.
                     
                        Biopersistență: A se vedea «persistență».
                     
                        Biotransformare: Conversia chimică (de obicei enzimatică) a unei substanțe chimice testate de interes într-o substanță chimică diferită în interiorul corpului. Sinonim cu «metabolism».
                     
                        Cmax
                        : Concentrația maximă (de vârf) în sânge (plasmă/ser) după administrare sau excreția maximă (de vârf) (în urină sau fecale) după administrare.
                     
                        Rată de eliminare: Măsura cantitativă a ratei cu care substanța chimică testată este îndepărtată din sânge, plasmă sau anumite țesuturi în unitatea de timp.
                     
                        Compartiment: Porțiune (sau unitate) structurală sau biochimică individuală a unui corp, țesut sau celulă, separată de rest.
                     
                        Căi de detoxifiere: Serie de etape de eliminare a substanțelor chimice toxice din organism, prin modificare metabolică sau prin excreție.
                     
                        Distribuție: Dispersia unei substanțe chimice testate și a derivaților săi în tot organismul.
                     
                        Enzime/Izoenzime: Proteine care catalizează reacții chimice. Izoenzimele sunt enzime care catalizează reacții chimice similare, dar care prezintă secvențe diferite ale aminoacizilor.
                     
                        Parametri enzimatici: Km: constanta Michaelis și Vmax: viteza maximă.
                     
                        Excreție: Proces(e) prin care substanța chimică testată administrată și/sau metaboliții săi sunt îndepărtați din organism.
                     
                        Exogen: Introdus din sau produs în afara organismului sau sistemului.
                     
                        Extrapolare: Deducerea (derivarea) uneia sau mai multor valori necunoscute pe baza informațiilor deja cunoscute sau observate.
                     
                        Timp de înjumătățire (t1/2): Perioada necesară pentru scăderea cu 50 % a concentrației substanței chimice testate dintr-un compartiment. De obicei, se referă la concentrația plasmatică sau la cantitatea substanței chimice testate din întregul corp.
                     
                        Inducție/Inducție enzimatică: Sinteza enzimatică declanșată de un stimul de mediu sau de o moleculă inductoare.
                     
                        Liniaritate/cinetică liniară: Un proces este liniar din punct de vedere cinetic atunci când toate vitezele de transfer între compartimente sunt proporționale cu cantitățile sau concentrațiile prezente, adică de ordinul întâi. Prin urmare, volumele de eliminare și de distribuție și timpii de înjumătățire sunt constanți. Concentrațiile obținute sunt proporționale cu rata dozării (expunerea), iar acumularea poate fi mai ușor de anticipat. Liniaritatea/neliniaritatea poate fi evaluată prin compararea parametrilor relevanți, de exemplu ASC, după administrarea de doze diferite sau după expuneri unice și repetate. Lipsa dependenței de doză poate indica saturația enzimelor implicate în metabolizarea compusului, creșterea ASC după expunere repetată în raport cu expunerea unică poate fi un simptom de inhibare a metabolismului, în timp ce o scădere a ASC poate indica inducerea metabolismului (a se vedea, de asemenea, punctul 11).
                     
                        Bilanț masic: Cuantificarea cantităților de substanță chimică testată care intră și ies din organism.
                     
                        Bilanț de materiale: A se vedea «bilanț masic».
                     
                        Mecanism (mod) de toxicitate/Mecanism (mod) de acțiune: Mecanismul de acțiune se referă la interacțiuni biochimice specifice prin care o substanță chimică testată își produce efectul. Modul de acțiune se referă la căile generale care conduc la toxicitatea unei substanțe chimice testate.
                     
                        Metabolism: Sinonim cu «biotransformare».
                     
                        Metaboliți: Produși ai metabolismului sau ai proceselor metabolice.
                     
                        Absorbție orală: Procentul dozei de substanță chimică testată absorbită de la locul de administrare (de exemplu, tractul GI). Acest parametru critic poate fi utilizat pentru identificarea fracției din substanța chimică testată administrată care intră în vena portă, apoi în ficat.
                     
                        Coeficient de partiție: Cunoscut și sub denumirea de coeficient de distribuție, acesta reprezintă o măsură a diferențelor de solubilitate ale unei substanțe chimice în doi solvenți.
                     
                        Niveluri maxime în sânge (ser/plasmă): Concentrația maximă (de vârf) în sânge (plasmă/ser) după administrare (a se vedea, de asemenea, «Cmax»).
                     
                        Persistență (biopersistență): Prezența pe termen lung a unei substanțe chimice (într-un sistem biologic) ca urmare a rezistenței la degradare/eliminare.
                     
                        Extrapolare: Informațiile privind efectul produs de una sau mai multe substanțe chimice sunt utilizate pentru a anticipa efectul produs de substanța chimică țintă.
                     
                        Autoradiografie microscopică a receptorilor (sau microautoradiografia receptorilor): Această tehnică poate fi utilizată pentru identificarea interacțiunii xenobiotice cu siturile tisulare sau cu populații celulare specifice, de exemplu în cadrul studiilor privind legarea la receptori sau a celor privind modul specific de acțiune, care pot necesita o rezoluție și o sensibilitate înaltă ce nu sunt disponibile prin alte tehnici, cum este autoradiografierea întregului corp.
                     
                        Cale de administrare (orală, intravenoasă, cutanată, inhalare etc.): Se referă la mijloacele de introducere a substanțelor chimice în corp (de exemplu, prin gavaj oral sau prin alimentație, pe cale cutanată, prin inhalare, intravenos etc.).
                     
                        Saturație: Stare în care unul sau mai multe din procesele cinetice (de exemplu, absorbție, metabolism sau eliminare) se află la valori maxime (sunt «saturate»).
                     
                        Sensibilitate: Capacitatea unei metode sau a unui instrument de a face diferența între rezultate măsurătorilor reprezentând niveluri diferite ale unei variabile de interes.
                     
                        Stare staționară a concentrației sangvine (plasmatice): Stare care nu a atins echilibrul unui sistem deschis, prin care toate forțele care acționează asupra sistemului sunt contrabalansate de forțe opuse similare, astfel încât toate componentele sistemului au o concentrație staționară în ciuda faptului că prin acesta continuă să circule materie.
                     
                        Modelarea sistemelor (toxicocinetică pe bază fiziologică, pe bază farmacocinetică, farmacocinetică pe bază fiziologică, pe bază biologică etc.): Model abstract care utilizează limbajul matematic pentru a descrie comportamentul unui sistem.
                     
                        Țesut-țintă: țesut în care se manifestă unul din principalele efecte adverse al unei substanțe toxice.
                     
                        Substanță chimică testată: Orice substanță sau amestec chimic care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                     
                        Distribuție tisulară: Deplasare reversibilă a unei substanțe chimice testate în diferite locuri din corp. Distribuția tisulară poate fi studiată prin disecția, omogenizarea sau combustia organelor, numărare în scintilație lichidă sau prin autoradiografiere calitativă și/sau cantitativă a întregului corp. Prima metodă este utilă pentru calcularea concentrației și a procentului de recuperare din țesuturile și carcasele reziduale ale acelorași animale, dar rezoluția sa poate să nu fie suficientă pentru toate țesuturile și poate să prezinte o capacitate de recuperare generală inferioară celei optime (< 90 %). Definiția ultimei metode este disponibilă mai sus.
                     
                        Tmax
                        : Perioada necesară pentru atingerea Cmax.
                     
                        Toxicocinetică (farmacocinetică): Studiul absorbției, distribuției, metabolismului și excreției substanțelor chimice în timp.
                     
                        Validarea modelelor: Procesul de evaluare a capacității unui model de a descrie datele toxicocinetice disponibile într-o manieră consecventă. Modelele pot fi evaluate prin comparare statistică și vizuală a valorilor anticipate de acestea cu valorile experimentale, în funcție de o variabilă independentă comună (de exemplu, perioada). Sfera evaluării ar trebui justificată în funcție de utilizarea preconizată pentru model.
                  ”
            
                  8.
               
               
                  Se adaugă capitolul B.52:
                  „B.52.   TOXICITATE ACUTĂ PRIN INHALARE – METODA CLASEI DE TOXICITATE ACUTĂ
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 436 (2009) a OCDE. Prima orientare 403 pentru testarea toxicității acute prin inhalare a fost adoptată în 1981, fiind ulterior modificată [a se vedea capitolul B.2 din prezenta anexă (1)]. Dezvoltarea unei metode pentru clasa de toxicitate acută prin inhalare (ATC) (2) (3) (4) a fost considerată necesară în urma revizuirii metodei ATC pe cale orală (capitolul B.1 tris din prezenta anexă) (5). O evaluare retrospectivă a performanței metodei de testare ATC pentru toxicitatea acută prin inhalare a arătat că această metodă poate fi utilizată în scopuri de clasificare și etichetare (6). Metoda de testare ATC prin inhalare va permite utilizarea unei serii succesive de concentrații țintă fixate pentru clasificarea nivelurilor de toxicitate ale unei substanțe chimice testate. Indicatorul cheie de rezultat folosit este letalitatea, totuși animalele care prezintă semne de durere sau suferință profundă sau sunt muribunde ar trebui eutanasiate pentru a li se reduce suferința. Orientări privind efectele etice acceptate sunt disponibile în Ghidul OCDE nr. 19 (7).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Orientări privind desfășurarea și interpretarea acestei metode de testare sunt disponibile în Ghidul nr. 39 privind testarea la toxicitate acută prin inhalare (8).
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Definițiile utilizate în contextul acestei metode de testare sunt disponibile în apendicele 1 și în Ghidul 39 (8).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Metoda de testare furnizează informații privind proprietățile periculoase și permite clasificarea substanței chimice testate în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 de clasificare a substanțelor chimice care cauzează toxicitate acută (9). În cazul în care sunt necesare estimări punctuale ale valorilor CL50 sau analize ale relației concentrație-răspuns, metoda de testare adecvată este cea prezentată în capitolul B.2 din prezenta anexă (1). Orientări suplimentare privind selecția metodei de testare sunt disponibile în Ghidul 39 (8). Această metodă de testare nu este destinată exclusiv materialelor speciale, cum sunt materialele izometrice sau fibroase puțin solubile sau nanomaterialele fabricate.
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                              5.
                           
                           
                              Înainte de a aplica această metodă, laboratorul de testare ar trebui să ia în considerare toate informațiile disponibile cu privire la substanța chimică testată, inclusiv rezultatele studiilor existente ale căror date ar susține neefectuarea unor teste suplimentare pentru a reduce la minimum testele pe animale. Informațiile utile în selecția speciei, sușei, sexului, modului de expunere și al concentrațiilor de testare adecvate includ identitatea, structura chimică și proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate, rezultatele oricăror teste de toxicitate in vitro sau in vivo, utilizarea (utilizările) preconizată (preconizate) și potențialul de expunere la om, datele (Q)SAR și datele toxicologice disponibile referitoare la substanțele chimice înrudite cu aceasta din punct de vedere structural. Concentrațiile despre care se știe că provoacă dureri și suferințe profunde din cauza acțiunilor corozive (11) sau puternic iritante nu ar trebui testate prin această metodă [a se vedea Ghidul 39 (8)].
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              6.
                           
                           
                              Conform principiului acestui test, clasificarea substanței chimice testate este posibilă atunci când au fost obținute informații suficiente privind toxicitatea acută prin inhalare a acesteia pe parcursul unei perioade de expunere de 4 ore. Perioadele de expunere pot varia în funcție de obiectivele de reglementare. Pentru fiecare nivel de concentrație se testează câte trei animale din fiecare sex. În funcție de mortalitatea și/sau starea muribundă a animalelor, pot fi suficiente două etape pentru a determina toxicitatea acută a substanței chimice testate. Dacă există indicii că animalele de un anumit sex sunt mai susceptibile decât celălalt sex, testul poate continua numai pe animalele susceptibile. Rezultatele obținute în etapa anterioară vor determina etapa următoare și anume:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          nu mai sunt necesare teste suplimentare;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          se testează câte trei animale din fiecare sex; sau
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          se testează numai 6 animale având sexul care s-a dovedit a fi cel mai susceptibil, adică estimările limitei inferioare ale clasei de toxicitate ar trebui să se bazeze pe șase animale din fiecare grup de testare a concentrației, indiferent de sex.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Animalele muribunde sau cele care manifestă dureri evidente sau prezintă semne de suferință gravă și prelungită ar trebui eutanasiate și sunt luate în considerare la interpretarea rezultatelor în aceeași măsură cu animalele care au murit în timpul testului. Criteriile pentru luarea deciziei de eutanasiere a animalelor muribunde sau care suferă profund și indicațiile pentru recunoașterea decesului previzibil sau iminent fac obiectul Guidance Document No. 19 on Humane Endpoints (7).
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Selectarea speciilor de animale
                  
                  
                              8.
                           
                           
                              Ar trebui utilizate animale adulte, tinere, sănătoase provenind din sușele utilizate în mod obișnuit în laboratoare. Specia preferată este șobolanul, iar orice utilizare a unei specii diferite ar trebui justificată.
                           
                        
                     Pregătirea animalelor
                  
                  
                              9.
                           
                           
                              Femelele ar trebui să fie nulipare și să nu fie gestante. În ziua expunerii, animalele ar trebui să fie adulte, cu vârsta cuprinsă între 8 și 12 săptămâni, iar greutatea corporală ar trebui să se situeze în limita a ± 20 % din greutatea medie a animalelor de ambele sex expuse anterior la aceeași vârstă. Animalele se selectează aleatoriu și se marchează pentru a putea fi identificate individual. Animalele sunt ținute în cuști timp de minimum cinci zile înainte de începerea testului, pentru a permite aclimatizarea la condițiile de laborator. De asemenea, animalele ar trebui obișnuite cu dispozitivele de testare cu puțin timp înainte de testare, deoarece aceasta va atenua stresul provocat de introducerea în noul mediu.
                           
                        
                     Creșterea animalelor
                  
                  
                              10.
                           
                           
                              Temperatura spațiului în care sunt ținute animalele utilizate în scopuri experimentale ar trebui să fie de 22 °C ± 3 °C. Umiditatea relativă ar trebui menținută în intervalul optim de 30-70 %, deși acest lucru ar putea să nu fie posibil atunci când vehiculul utilizat este apa. În general, înainte și după expuneri, animalele ar trebui să fie închise în cuști, în grupuri de același sex și cu aceeași concentrație, însă numărul de animale din cușcă ar trebui selectat astfel să permită observarea ușoară a fiecărui exemplar și să reducă la minim pierderile provocate de canibalism și luptele dintre animale. Atunci când animalele urmează a fi expuse numai în zona nasului, poate fi necesară aclimatizarea lor prealabilă cu tuburile de imobilizare. Tuburile de imobilizare nu ar trebui să provoace stres fizic, termic sau de imobilizare asupra animalelor. Dispozitivele de imobilizare pot afecta date fiziologice finale, cum sunt temperatura corporală (hipertermie) și/sau volumul respirator pe minut. Dacă sunt disponibile date generice care demonstrează că nu apar modificări semnificative de acest tip, pre-aclimatizarea cu tuburile de imobilizare nu este necesară. Animalele expuse cu întregul corp la un aerosol ar trebui să fie adăpostite individual pe durata expunerii, pentru a preveni filtrarea aerosolilor testați prin blana celorlalte animale din cușcă. Se poate utiliza hrană convențională și certificată de laborator, cu excepția perioadelor de expunere, însoțită de asigurarea unei cantități nelimitate de apă de băut de la rețeaua publică. Iluminatul ar trebui să fie artificial, alternând 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric.
                           
                        
                     Incintele de inhalare
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Incintele de inhalare ar trebui să fie selectate în funcție de natura substanței chimice testate și obiectivul testului. Modul preferat de expunere este numai în zona nasului (termen care include expunerea numai în zona «a capului», «a nasului» sau «a botului»). Expunerea numai în zona nasului este în general preferată în studiile cu expunere la aerosoli lichizi sau solizi sau la vapori care se pot condensa și forma aerosoli. Unele obiective speciale ale studiului pot fi atinse mai eficient prin expunerea întregului corp, dar această metodă ar trebui să fie justificată în raportul studiului. Pentru a asigura stabilitatea atmosferei din incinta pentru expunere a întregului corp, volumul total al animalelor utilizate în scopuri experimentale nu ar trebui să depășească 5 % din volumul incintei. Principiile tehnicilor de expunere exclusiv în zona nasului și a întregului corp și avantajele și dezavantajele specifice ale acestora sunt descrise în Ghidul 39 (8).
                           
                        CONDIȚII DE EXPUNERE
                  
                     Administrarea concentrațiilor
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              Perioada recomandată de expunere este de patru ore, fără a include perioada de echilibrare. Pentru satisfacerea anumitor cerințe poate fi necesară utilizarea unor perioade diferite, totuși acestea ar trebui să fie justificate în raportul studiului [a se vedea Ghidul 39 (8)]. Animalele expuse în incintele pentru expunerea întregului corp ar trebui adăpostite individual, pentru a preveni ingestia substanței chimice testate în urma toaletării celorlalte animale din aceeași cușcă. Animalele nu ar trebui să fie hrănite pe perioada de expunere a întregului corp. Apa poate fi furnizată pe tot parcursul expunerii întregului corp.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Animalele sunt expuse la substanța chimică testată sub formă de gaz, vapori, aerosoli sau un amestec al acestora. Starea fizică a care urmează a fi testată depinde de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate, de concentrația selectată și/sau de forma fizică cea mai probabilă din timpul manipulării și utilizării acesteia. Substanțele chimice testate higroscopice și reactive din punct de vedere chimic ar trebui testate în condiții de aer uscat. Ar trebui să se evite generarea unor concentrații cu risc de explozie.
                           
                        
                     Distribuția granulometrică
                  
                  
                              14.
                           
                           
                              Ar trebui măsurată dimensiunea particulelor pentru toți aerosolii și vaporii care pot condensa și forma aerosoli. Pentru a permite expunerea tuturor zonelor relevante ale tractului respirator, sunt recomandați aerosoli cu diametre aerodinamice mediane masice ale particulelor (DAMM) cuprins între 1 și 4 μm și cu o abatere geometrică standard (σg) situată intervalul 1,5-3 (8) (13) (14). Deși ar trebui depuse eforturi rezonabile pentru satisfacerea acestui standard, în cazul în care acesta nu poate fi obținut ar trebui prezentată o apreciere bazată pe experiență. De exemplu, particulele vaporilor de metale pot avea dimensiuni sub acest standard, în timp ce particulele încărcate, fibrele și materialele higroscopice (a căror dimensiune crește în mediul umed din tractul respirator) pot depăși dimensiunile acestui standard.
                           
                        
                     Prepararea substanței chimice testate într-un vehicul
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Este posibilă utilizarea unei vehicul pentru a genera o concentrație și dimensiune a adecvată a particulelor substanței chimice testate în atmosferă. De regulă, vehiculul preferat este apa. Particulele pot fi supuse la procese mecanice pentru a ajunge la distribuția granulometrică necesară, dar ar trebui avut grijă să se evite descompunerea sau modificarea substanței chimice testate. În cazurile în care se consideră că procesele mecanice au modificat compoziția substanței chimice testate (de exemplu, temperaturi extreme ca urmare a măcinării excesive prin fricțiune), compoziția substanței chimice testate ar trebui verificată analitic. Ar trebui să se acorde atenție deosebită pentru a se evita contaminarea substanței chimice testate. Nu este necesară testarea materialelor granulare nefriabile a căror formulare nu permite inhalarea. Ar trebui realizat un test de măcinare pentru a demonstra că în timpul manipulării materialelor granulare nu se produc particule respirabile. Dacă un test de măcinare produce particule respirabile, ar trebui efectuat un test de toxicitate prin inhalare.
                           
                        
                     Animale martor
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Nu este necesar un grup paralel de martori negativi (aer). Atunci când pentru generarea atmosferei testului se utilizează un alt vehicul decât apa, ar trebui folosit un grup martor pentru vehicul numai în cazul în care nu sunt disponibile date istorice privind toxicitatea prin inhalare. Dacă un studiu privind toxicitatea unei substanțe chimice testate care a fost introdusă într-un vehicul nu identifică urme de toxicitate, se deduce că vehiculul nu este toxic la concentrația testată; prin urmare, nu este necesar un grup martor pentru vehicul.
                           
                        MONITORIZAREA CONDIȚIILOR DE EXPUNERE
                  
                     Alimentarea cu aer a incintei
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Debitul de aer în incintă ar trebui să fie controlat cu atenție, monitorizat în mod continuu și înregistrat cel puțin o dată pe oră în timpul fiecărei expuneri. Monitorizarea concentrației (sau stabilității) atmosferei de testare reprezintă o măsură integrală a tuturor parametrilor dinamici și oferă un mijloc indirect de a controla toți parametrii dinamici relevanți de generare a atmosferei. Ar trebui acordată o deosebită atenție evitării re-inhalării în incintele de inhalare numai în zona nasului, în cazurile în care debitul de aer asigurat de sistemul de expunere este insuficient pentru a asigura un flux dinamic al atmosferei conținând substanța chimică testată. Există metodologii care pot fi utilizate pentru a demonstra lipsa re-inhalării în condițiile de operare selectate (8) (15). Concentrația de oxigen ar trebui să fie de cel puțin 19 %, iar concentrația de dioxid de carbon nu ar trebui să depășească 1 %. Dacă există motive să se considere că aceste standarde nu pot fi satisfăcute, concentrațiile de oxigen și dioxid de carbon ar trebui să fie măsurate.
                           
                        
                     Temperatura și umiditatea relativă a incintei
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Temperatura incintei se menține la 22 °C ± 3 °C. Umiditatea relativă în zona de respirație a animalelor cu expunere numai în zona nasului sau a întregului corp se monitorizează și se înregistrează de cel puțin trei ori, pentru perioadele de expunere de până la patru ore, și o dată pe oră, în cazul perioadelor mai scurte. Umiditatea relativă ar trebui menținută în intervalul optim de 30-70 %, dar un asemenea nivel fi dificil de atins (de exemplu, atunci când se testează amestecuri conținând apă) sau de măsurat, ca urmare a interferențelor dintre substanța chimică testată și metoda de testare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația nominală
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Dacă este posibil, concentrația nominală de expunere în incintă ar trebui calculată și înregistrată. Concentrația nominală constă în masa substanței chimice testate generate, împărțită la volumul total de aer care a circulat prin sistemul incintei. Deși concentrația nominală nu este utilizată pentru a caracteriza expunerea animalelor, însă o comparare a acesteia cu concentrația efectivă oferă indicații privind eficiența de generare a sistemului de testare și, astfel, poate fi utilizată pentru a identifica eventualele probleme de generare.
                           
                        
                     Substanța chimică testată: concentrația reală
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Concentrația efectivă este reprezentată de concentrația substanței chimice testate în zona de respirație a animalului din incinta de inhalare. Concentrațiile efective pot fi obținute prin metode specifice (de exemplu, prelevare directă, adsorbție sau reacții chimice și caracterizare analitică ulterioară) sau nespecifice, cum este analiza filtrului gravimetric. Utilizarea analizei gravimetrice este acceptată numai pentru aerosolii sub formă de pulbere cu o singură componentă sau pentru aerosolii lichidelor cu volatilitate redusă și ar trebui să fie susținută de caracterizări prealabile adecvate specifice pentru substanțele testate. Concentrația aerosolilor sub formă de pulbere cu componente multiple poate fi determinată, de asemenea, prin analiză gravimetrică. Totuși, o astfel de analiză necesită date analitice care să demonstreze că materialul aflat în suspensie aer are aceeași compoziție ca materialul inițial. Dacă aceste informații nu sunt disponibile, poate fi necesară o nouă analiză a substanței chimice testate (în mod ideal, în starea sa în suspensie în aer) la intervale regulate pe durata studiului. În cazul agenților transformați în aerosoli care se pot evapora sau pot sublima, ar trebui demonstrat că toate fazele au fost prelevate prin metoda selectată. Concentrațiile țintă, nominale și efective ar trebui indicate în raportul studiului, dar numai concentrațiile efective sunt utilizate pentru a calcula valorile concentrației letale din analizele statistice.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Dacă este posibil, se va utiliza un singur lot de substanță chimică testată, iar proba testată ar trebui păstrată în condiții care să îi asigure puritatea, omogenitatea și stabilitatea. Înainte de începerea studiului, substanța chimică testată ar trebui să fie caracterizată atât în ceea ce privește puritatea, cât și, în limita posibilităților tehnice, identitatea, cantitățile de contaminați identificați și de impurități. Aceasta poate fi demonstrată de, dar nu se limitează la următoarele date: timpul de retenție și suprafața relativă a vârfului, greutatea moleculară obținută prin analize de spectroscopie de masă sau de cromatografie în fază gazoasă sau prin alte estimări. Chiar dacă laboratorul de testare nu are obligația de a stabili identitatea probei testate, acesta ar trebui să confirme cel puțin parțial caracterizarea oferită de sponsor (de exemplu, culoare, caracteristici fizice etc.).
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Atmosfera de expunere este menținută la un nivel cât mai constant posibil și monitorizată permanent și/sau intermitent, în funcție de metoda de analiză. Atunci când prelevarea probelor se desfășoară în mod intermitent, ar trebui prelevate probe din atmosfera incintei cel puțin de două ori pe durata unui studiu de patru ore. Dacă acest lucru nu este posibil din cauza debitului limitat de aer sau a nivelului redus al concentrațiilor, se poate preleva o singură probă pentru întreaga perioadă de expunere. În cazul în care apar fluctuații semnificative între probe, următoarele concentrații testate ar trebui să utilizeze patru probe pentru fiecare expunere. Nicio probă a concentrației din incintă nu ar trebui să se abată de la concentrația medie a incintei cu mai mult de ± 10 % în cazul gazelor și vaporilor și cu mai mult de ± 20 % în cazul aerosolilor lichizi sau solizi. Perioada până la atingerea echilibrului în incintă (t95) ar trebui calculată și înregistrată. Durata de expunere cuprinde perioada de generare a substanței chimice testate, inclusiv perioada necesară pentru atingerea t95. Orientări privind estimarea t95 sunt disponibile în Ghidul 39 (8).
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Fiecare fază a amestecurilor foarte complexe formate din vapori/gaze și aerosoli (de exemplu, atmosfere de combustie și substanțe chimice testate evacuate din produse/dispozitive specializate finale) poate avea un comportament diferit într-o incintă de inhalare, astfel încât ar trebui selectată cel puțin o substanță-indicator (analit) a fiecărei faze (vapori/gaz și aerosol), de obicei substanța activă principală a amestecului. Atunci când substanța chimică testată constă într-un amestec, concentrația analitică ar trebui raportată pentru amestecul total, nu doar pentru ingredientul activ al componentei (analit). Informații suplimentare privind concentrațiile efective sunt disponibile în Ghidul 39 (8).
                           
                        
                     Substanța chimică testată: distribuția granulometrică
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Distribuția granulometrică a aerosolilor ar trebui să fie determinată de cel puțin două ori în timpul fiecărei durate de expunere de patru ore, cu ajutorul unui impactor în cascadă sau a unui instrument alternativ, cum ar fi un separator de particule aerodinamice. Dacă echivalența rezultatelor obținute cu ajutorul impactorului în cascadă sau a instrumentului alternativ poate fi demonstrată, instrumentul alternativ poate fi utilizat pe durata întregului studiu. Eficiența de colectare a instrumentului principal poate fi confirmată prin utilizarea în paralel cu un al doilea dispozitiv, precum un filtru gravimetric sau un impactor/barbotor de gaze. Concentrația masică obținută prin analiza dimensiunii particulelor ar trebui să difere într-o marjă rezonabilă de limitele concentrațiilor masice obținute prin analiza filtrului [a se vedea Ghidul 39 (8)]. Dacă echivalența poate fi demonstrată încă din primele etape ale studiului, măsurările de confirmare suplimentare pot fi omise. Din motive de protecție a bunăstării animalelor, se vor lua măsuri pentru a reduce la minimum cantitatea de date neconcludente care poate obliga la repetarea expunerii. Determinarea dimensiunii particulelor ar trebui realizată pentru vapori atunci când condensarea acestora poate conduce la formarea unui aerosol sau dacă sunt detectate particule într-o atmosferă de vapori cu potențial de amestec al fazelor (a se vedea punctul 14).
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Testul principal
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              În fiecare etapă se utilizează trei animale de fiecare sex sau șase animale având sexul care s-a dovedit cel mai susceptibil. Dacă speciile de rozătoare, altele decât șobolanii, sunt expuse numai în zona nasului, duratele maxime de expunere pot fi modificate pentru a reduce la minimum nivelurile de suferință specifice speciei. Nivelul concentrației primei doze se selectează din cele patru niveluri fixate și ar trebui să fie cel mai susceptibil să producă toxicitate la unele din animalele expuse. Schemele de testare pentru gaze, vapori și aerosoli (incluse în apendicele 2-4) reprezintă testele cu valorile limită pentru categoriile CLP 1-4 (9) pentru gaze (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (apendicele 2), pentru vapori (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (apendicele 3) și pentru aerosoli (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (apendicele 4). Categoria 5, care nu este prevăzută în Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (9), se referă la concentrații care depășesc respectivele concentrații limită. Pentru fiecare concentrație inițială se aplică schema corespunzătoare. În funcție de numărul de animale moarte sau eutanasiate, se urmează procedura de testare indicată prin săgeți până la stabilirea unei categorii.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Intervalul de timp dintre administrarea dozelor la grupurile expuse se determină în funcție de momentul declanșării, durata și severitatea semnelor de toxicitate. Expunerea animalelor la următorul nivel de concentrație se amână până când există o certitudine rezonabilă că animalele testate anterior vor supraviețui. Se recomandă un interval de 3 sau 4 zile între expunerile la fiecare nivel de concentrație, pentru a permite observarea toxicității întârziate. Intervalul de timp poate fi adaptat după caz, de exemplu în cazul unor rezultate neconcludente.
                           
                        
                     Testul la valori-limită
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Testul la valori-limită se utilizează atunci când substanța chimică testată este cunoscută sau considerată ca fiind practic netoxică, adică atunci când are efecte toxice numai la o concentrație peste limita reglementată. Informațiile privind toxicitatea substanței chimice testate pot fi obținute pe baza datelor cunoscute despre substanțe și amestecuri similare testate, ținând seama de identitatea și procentajul componentelor cunoscute ca fiind semnificative din punct de vedere toxicologic. În situațiile în care nu există sau există puține informații privind toxicitatea materialului sau în care se estimează că substanța chimică testată este toxică, se efectuează testul principal [orientări suplimentare sunt disponibile în Ghidul 39 (8)].
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Când se utilizează procedura normală, trei animale pentru fiecare sex sau șase animale de sexul dovedit cel mai susceptibil sunt expuse la concentrații de 20 000 ppm pentru gaze, 20 mg/l pentru vapori și 5 mg/l pentru pulberi/aburi (dacă este posibil), care reprezintă valorile limită ale acestei metode de testare. În cazul testării aerosolilor, principalul obiectiv ar trebui să fie obținerea unor particule de dimensiuni respirabile (de exemplu, DAMM de 1-4 μm). Acest lucru este posibil pentru majoritatea substanțelor testate la o concentrație de 2 mg/l. Testarea aerosolilor la o valoare peste 2 mg/l ar trebui efectuată numai atunci când pot fi obținute particule de dimensiuni respirabile [a se vedea Ghidul 39 (8)]. Conform GHS (16), din motive de asigurare a bunăstării animalelor, testarea peste valoarea concentrației-limită nu este recomandată. Testarea în categoria GHS 5 (16), care nu este prevăzută în Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (9), ar trebui să fie luată în considerare doar atunci când este foarte probabil ca rezultatele acestor teste să fie de interes direct pentru protecția sănătății oamenilor și animalelor și ar trebui să fie justificată în raportul studiului. În cazul substanțelor de test cu risc de explozie, vor fi luate toate măsurile pentru a se evita întrunirea condițiilor favorabile unei explozii. Pentru a evita utilizarea inutilă a animalelor, se va efectua un test prealabil fără animale, anterior testului la valorile limită, pentru a se verifica satisfacerea condițiilor din incintă.
                           
                        OBSERVAȚII
                  
                              29.
                           
                           
                              Animalele ar trebui observate frecvent din punct de vedere clinic în perioada de expunere. După expunere, observațiile clinice ar trebui efectuate de cel puțin două ori în ziua expunerii sau mai frecvent, în funcție de reacția animalelor la tratament, apoi de cel puțin o dată pe zi, pentru o perioadă totală de 14 zile. Perioada de observație nu este fixă, însă ar trebui determinată în funcție de tipul și momentul apariției semnelor clinice și de durata perioadei de recuperare. Momentele la care semnele de toxicitate apar și dispar sunt importante, în special în cazurile în care acestea au tendința de a apărea cu întârziere. Toate observațiile se consemnează sistematic în înregistrările individuale pentru fiecare animal. Din motive de protecție a bunăstării acestora, animalele găsite în stare muribundă și care manifestă dureri mari și/sau semne prelungite de suferință profundă ar trebui eutanasiate. Atunci când se efectuează examinări privind semnele clinice de toxicitate, starea defavorabilă inițială și modificările respiratorii temporare în urma expunerii nu ar trebui să fie confundate cu efectele tratamentului. Se iau în considerare principiile și criteriile rezumate în ghidul privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (7). În cazul în care animalele sunt eutanasiate sau sunt găsite moarte, momentul morții se înregistrează cât mai exact posibil.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Observațiile asupra animalelor din cuști vizează modificările blănii și pielii, ochilor și mucoaselor, membranelor și, de asemenea, ale sistemelor respirator, circulator, vegetativ și nervos central, precum și ale activității somato-motorii și a comportamentului. Dacă este posibil, se înregistrează fiecare diferență între efectele locale și sistemice. Se va acorda o atenție specială observării tremuratului, convulsiilor, salivării, diareii, letargiei, somnului și comei. Măsurarea temperaturii rectale poate oferi indicii de susținere privind bradipneea reflexă sau hipo/hipertermia asociate condițiilor de tratament sau de captivitate.
                           
                        
                     Greutatea corporală
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Greutatea corporală a fiecărui animal ar trebui să fie înregistrată o dată pe zi pe durata perioadei de aclimatizare, imediat înainte de expunere (ziua 0) și cel puțin în zilele 1, 3 și 7 (apoi săptămânal), precum și în momentul morții sau al eutanasierii, dacă acestea au loc după prima zi. Greutatea corporală este recunoscută ca indicator critic al toxicității, iar animalele care prezintă o scădere susținută de ≥ 20 % comparativ cu valorile anterioare studiului ar trebui să fie atent monitorizate. Animalele care au supraviețuit sunt cântărite și eutanasiate la sfârșitul perioadei de post-expunere.
                           
                        
                     Patologia
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Toate animalele participante la test, inclusiv cele care mor în cursul testului sau sunt eutanasiate și eliminate din studiu din motive de protecție a bunăstării animalelor, ar trebui să fie supuse unei autopsii. Dacă autopsia nu poate fi efectuată imediat după descoperirea animalului mort, acesta ar trebui să fie refrigerat (nu congelat) la temperaturi suficient de joase pentru a minimiza autoliza. Autopsiile ar trebui efectuate cât mai repede posibil, de obicei în termen de 1-2 zile. Ar trebui înregistrate toate modificările patologice macroscopice intervenite la fiecare animal, fiind acordată o atenție specială modificărilor tractului respirator.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Pot fi efectuate examinări suplimentare, incluse a priori în proiect, dacă acestea sunt considerate necesare pentru a spori valoarea interpretativă a studiului, cum sunt cântărirea plămânilor șobolanilor supraviețuitori și/sau identificarea iritațiilor prin examinare microscopică a tractului respirator. Organele examinate le pot include pe cele care prezintă semne de modificări patologice macroscopice, provenite de la animalele care au supraviețuit cel puțin 24 de ore, precum și organele despre care se știe sau se consideră că au fost afectate. Examinarea microscopică a întregului tract respirator poate furniza informații utile privind substanțele chimice care produc reacții la contactul cu apa, cum sunt acizii și substanțele higroscopice.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Date
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Ar trebui furnizate date privind greutatea corporală și rezultatele autopsiei fiecărui animal. Observațiile clinice se rezumă în format tabelar, indicând pentru fiecare grup testat numărul de animale utilizate, numărul de animale care au prezentat semne specifice de toxicitate, numărul de animale găsite moarte în cursul testului sau eutanasiate, ora decesului pentru fiecare animal, o descriere și evoluția în timp și reversibilitatea efectelor toxice și rezultatele autopsiei.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Raportul de testare ar trebui să includă următoarele informații, după caz:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Animalele testate și îngrijirea lor
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea condițiilor de captivitate, inclusiv: numărul (sau modificarea numărului) animalelor din fiecare cușcă, materialul pentru așternut, temperatura ambiantă și umiditatea relativă, perioada de expunere la lumină și alimentația;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      specia/sușa utilizată și justificarea utilizării altor specii decât șobolanul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul, vârsta și sexul animalelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de repartizare aleatorie;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv tipul/sursa de alimentație, sursa de apă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea tuturor condițiilor anterioare testului, inclusiv alimentație, carantină și tratarea unor boli.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică, puritate și, dacă este cazul, proprietăți fizico-chimice (inclusiv izomerizare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datele de identificare și numărul din registrul Chemical Abstract Service (CAS), dacă este cunoscut.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Vehiculul
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea utilizării unui vehicul și a vehiculului ales (dacă este altul decât apa);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date istorice și de confirmare care demonstrează că vehiculul nu afectează rezultatul studiului.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Incinta de inhalare
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea incintei de inhalare, inclusiv dimensiunile și volumul acesteia;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa și descrierea echipamentului utilizat pentru expunerea animalelor, precum și pentru generarea atmosferei;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      echipamentele de măsurare a temperaturii, umidității, dimensiunii particulelor și concentrației efective;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa de aer, modul de tratare a aerului introdus/extras și sistemul de condiționare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele utilizate pentru calibrarea echipamentelor pentru asigurarea unei atmosfere omogene de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      diferențele de presiune (pozitive sau negative);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orificiile de expunere ale incintei (pentru expunere la nivelul nasului); locul animalelor în sistem (pentru expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      omogenitatea temporală/stabilitatea atmosferei de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      amplasarea senzorilor de temperatură și umiditate și prelevarea probelor din atmosfera de testare din incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      debitele de aer, debitul de aer/orificiul de expunere (pentru expunere la nivelul nasului) sau greutatea animalului/incintă (pentru expunerea întregului corp);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații privind aparatele de măsurare a nivelului de oxigen și dioxid de carbon, după caz;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      perioada necesară pentru atingerea echilibrului în incinta de inhalare (t95);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul modificărilor de volum pe oră;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dispozitivele de contorizare (după caz).
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Date privind expunerea
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea concentrației țintă selectată pentru studiul principal;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile nominale (masa totală a substanței chimice testate generate în incinta de inhalare împărțită la volumul total de aer care a circulat prin incintă);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile efective ale substanței chimice testate care au fost prelevate din zona de respirație a animalelor; în cazul amestecurilor testate care produc forme fizice eterogene (gaze, vapori, aerosoli), acestea pot fi analizate separat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate concentrațiile în aer ar trebui raportate separat, în unități de masă (de exemplu, mg/l, mg/m3 etc.), iar unitățile de volum (de exemplu, ppm, ppb) pot fi indicate și între paranteze;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      distribuția granulometrică, diametrul aerodinamic median masic al particulelor (DAMM) și abaterea geometrică standard (σg), inclusiv metodele de calcul ale acestora. analizele granulometrice individuale ar trebui să fie raportate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind preparatul substanței chimice testate, inclusiv detalii referitoare la orice procedură utilizată pentru reducerea dimensiunii particulelor substanțelor solide sau prepararea soluțiilor substanței chimice testate. În cazurile în care se consideră că procesele mecanice au modificat compoziția substanței chimice testate, se includ rezultatele analizelor de verificare a acesteia;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      o descriere (preferabil însoțită de o diagramă) a echipamentului utilizat pentru generarea atmosferei de testare și expunerea animalelor la aceasta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind metoda de chimie analitică utilizată și validarea metodei (inclusiv eficiența recuperării substanței chimice testate din mediul de prelevare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea selectării concentrațiilor testate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultate
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a temperaturii, umidității și debitului de aer din incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a concentrației nominale și efective din incintă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a dimensiunii particulelor, inclusiv date analitice privind prelevarea probelor, distribuția granulometrică și calculele DAMM și σg;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prezentarea sub formă tabelară a datelor privind răspunsul și nivelul concentrației la fiecare animal (animale care prezintă semne de toxicitate, inclusiv mortalitatea, natura, gravitatea și durata efectelor);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea corporală a fiecărui animal în perioada studiului, data și ora morții, dacă aceasta are loc anterior eutanasierii; apariția și evoluția semnelor de toxicitate și reversibilitatea acestora pentru fiecare animal;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele autopsiei și ale examenului histopatologic pentru fiecare animal, dacă sunt disponibile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      categoria CLP și valoarea limită CL50.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Discutarea și interpretarea rezultatelor
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ar trebui să se pună un accent deosebit asupra descrierii metodelor utilizate pentru satisfacerea criteriilor acestei metode de testare, de exemplu concentrația limită sau dimensiunea particulelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ar trebui tratată respirabilitatea particulelor în contextul rezultatelor generale, în special atunci când criteriile privind dimensiunile particulelor nu au putut fi satisfăcute;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      consecvența metodelor utilizate pentru determinarea concentrațiilor nominale și efective și relația dintre concentrația efectivă și concentrația nominală ar trebui incluse în evaluarea generală a studiului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      ar trebui tratată cauza probabilă a morții și modul predominant de acțiune (sistemic sau local);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      eutanasierea animalelor care prezentau semne de durere și suferință gravă și îndelungată ar trebui justificată în conformitate cu criteriile prevăzute de Ghidul OCDE privind punctele finale din considerente umane în experimentele cu animale (7).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Capitolul B.2 din prezenta anexă, «Toxicitate acută (administrare prin inhalare)».
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Holzhütter H.-G., Genschow E., Diener W., and Schlede E. (2003), Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System, Arch. Toxicol. 77: 243-254.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Diener W., Kayser D. and Schlede E. (1997), The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations, Arch. Toxicol. 71: 537-549.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Diener W. and Schlede E. (1999), Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests, ALTEX 1: 129-134.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Capitolul B.1 tris din prezenta anexă, «Toxicitate orală acută – Metoda clasei de toxicitate acută».
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              OECD (2009), Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              OECD (2009), Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 al Parlamentului European și al Consiliului din 16 decembrie 2008 privind clasificarea, etichetarea și ambalarea substanțelor și a amestecurilor, de modificare și de abrogare a Directivelor 67/548/CEE și 1999/45/CE, precum și de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1907/2006 (JO L 353, 31.12.2008, p. 1).
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Capitolul B.40 din prezenta anexă, «Coroziunea cutanată in vitro: Testul rezistenței electrice transcutanate (RET)».
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Capitolul B.40 din prezenta anexă, «Coroziunea cutanată in vitro: Testare pe un model de piele umană».
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Disponibil la adresa: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Phalen R.F. (2009), Inhalation Studies: Foundations and Techniques (2nd Edition) Informa Healthcare, New York.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              SOT (1992), Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT), Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests, Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Pauluhn J. and Thiel A. (2007), A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers, J. Appl. Toxicol. 27: 160-167.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Disponibil la adresa: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html].
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚIE
                     Substanța chimică testată: Orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Procedura urmată pentru fiecare din concentrațiile inițiale pentru gaze (ppm/4h)
                     
                     Observații generale (12)
                     
                     Pentru fiecare concentrație inițială, ar trebui urmate diferitele scheme de testare, astfel cum sunt conținute în prezentul apendice.
                     Apendicele 2a: concentrația inițială este 100 ppm.
                     Apendicele 2b: concentrația inițială este 500 ppm.
                     Apendicele 2c: concentrația inițială este 2 500 ppm.
                     Apendicele 2d: concentrația inițială este 20 000 ppm.
                     În funcție de numărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de urmat este indicată prin săgeți.
                  
                  
                     Apendicele 2a
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 100 ppm/4 h pentru gaze
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 2b
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 500 ppm/4h pentru gaze
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 2c
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 2 500 ppm/4h pentru gaze
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 2d
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 20 000 ppm/4h pentru gaze
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 3
                     
                        Procedura urmată pentru fiecare din concentrațiile inițiale pentru vapori (mg/L/4h)
                     
                     Observații generale (13)
                     
                     Pentru fiecare concentrație inițială, ar trebui urmate diferitele scheme de testare conținute în prezentul apendice.
                     Apendicele 3a: concentrația inițială este 0,5 mg/l.
                     Apendicele 3b: concentrația inițială este 2 mg/l.
                     Apendicele 3c: concentrația inițială este 10 mg/l.
                     Apendicele 3d: concentrația inițială este 20 mg/l.
                     În funcție de numărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de urmat este indicată prin săgeți.
                  
                  
                     Apendicele 3a
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 0,5 mg/l/4h pentru vapori
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 3b
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 2 mg/l/4h pentru vapori
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 3c
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 10 mg/l/4h pentru vapori
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 3d
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 20 mg/l/4h pentru vapori
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 4
                     
                        Procedura urmată pentru fiecare din concentrațiile inițiale pentru aerosoli (mg/L/4h)
                     
                     Observații generale (14)
                     
                     Pentru fiecare concentrație inițială, ar trebui urmate diferitele scheme de testare conținute în prezentul apendice.
                     Apendicele 4a: concentrația inițială este 0,05 mg/l.
                     Apendicele 4b: concentrația inițială este 0,5 mg/l.
                     Apendicele 4c: concentrația inițială este 1 mg/l.
                     Apendicele 4d: concentrația inițială este 5 mg/l.
                     În funcție de numărul de animale moarte sau eutanasiate, procedura de testare de urmat este indicată prin săgeți.
                  
                  
                     Apendicele 4a
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 0,05 mg/l/4h pentru vapori
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 4b
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 0,5 mg/l/4h pentru aerosoli
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 4c
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 1 mg 1/4h pentru aerosoil
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 4d
                     
                        Toxicitate acută prin inhalare
                     
                     
                        Procedură de testare cu o concentrație inițială de 5 mg/l/4h pentru aerosoli
                     
                     
                        
                  ”
            
                  9.
               
               
                  Capitolul C.10 se înlocuiește cu următorul text:
                  „C.10.   TEST DE SIMULARE – TRATAREA AEROBĂ A APELOR UZATE: C.10-A: UNITĂȚI CU NĂMOL ACTIV – C.10-B: BIOPELICULE
                  
                  
                     C.10-A:   Unități cu nămol activ
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 303 (2001) a OCDE. În anii 1950 s-a ajuns la concluzia că agenții tensioactivi nou introduși produceau spumare excesivă în stațiile de epurare a apei și în râuri. Aceștia nu au fost eliminați complet prin tratarea aerobă și în unele cazuri au limitat eliminarea altor materii organice. Această situație a determinat mai multe analize privind modul în care agenții tensioactivi ar putea fi eliminați din apele uzate și pentru a vedea dacă noile substanțe chimice produse de industrie se pretează pentru tratarea apelor uzate. În acest scop, s-au utilizat unități model care reprezintă cele două tipuri principale de tratare biologică aerobă a apelor uzate (nămol activ și filtrare cu stropire sau percolare). Ar fi fost nepractic și foarte costisitor să se distribuie fiecare substanță chimică nouă și să se monitorizeze instalațiile de epurare de mari dimensiuni, chiar și pe plan local.
                           
                        CONSIDERAȚII INIȚIALE
                  
                     Unități cu nămol activ
                  
                  
                              2.
                           
                           
                              Modelele de unități cu nămol activ au fost descrise ca având dimensiuni de la 300 ml până la circa 2 000 ml. Unele modele au reprodus îndeaproape instalații industriale, cu rezervoare de decantare a nămolului, nămolul decantat fiind pompat înapoi în vasul de aerare, în timp ce altele nu aveau instalații de decantare, de exemplu Swisher (1). Dimensiunea aparatului este un compromis; pe de o parte, trebuie să fie suficient de mare pentru o funcționare mecanică reușită și pentru a furniza un volum suficient de probe fără să afecteze funcționarea, iar pe de altă parte nu trebuie să fie atât de mare încât să necesite spațiu și materiale excesive.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Două tipuri de aparate care au fost utilizate pe scară largă și cu rezultate satisfăcătoare sunt unitățile Husmann (2) și unitățile de tip «vas poros» (3) (4), utilizate mai întâi în studiul agenților tensioactivi; acestea sunt descrise în această metodă de testare. Au mai fost utilizate și alte tipuri de unități cu rezultate satisfăcătoare, de exemplu unitățile Eckenfelder (5). Din cauza costului relativ ridicat și a efortului de aplicare a acestui test de simulare, s-au investigat în paralel teste de screening mai simple și mai ieftine, care acum sunt integrate în capitolul C.4 A-F din prezenta anexă (6). Experiența cu mulți agenți tensioactivi și alte substanțe chimice a arătat că cele care treceau testele de screening (ușor biodegradabile) se degradau și în testul de simulare. Unele din cele care nu au trecut testele de screening au trecut testele de biodegradabilitate intrinsecă [capitolul C.12 (7) și capitolul C.19 (8) din prezenta anexă], dar numai unele din acest al doilea grup au fost degradate în testul de simulare, în timp ce acele substanțe chimice care nu au trecut testele de biodegradabilitate intrinsecă nu s-au degradat în testele de simulare (9) (10) (11).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              În unele scopuri sunt suficiente testele de simulare efectuate în cadrul unui singur set de condiții de funcționare; rezultatele sunt exprimate ca eliminare procentuală a substanței chimice testate sau a carbonului organic dizolvat (COD). Această metodă de testare oferă o descriere a unui astfel de test. Totuși, spre deosebire de versiunea anterioară a prezentului capitol, care descria un singur tip de aparat de tratare a apelor uzate sintetice în regimul cu instalații cuplate, care utiliza o metodă relativ brută a surplusului de nămol, acest text prezintă o serie de variații. Sunt descrise alternative la tipul de aparat, modul de funcționare, eliminarea surplusului de ape uzate și nămol. Prezentul text respectă îndeaproape textul din ISO 11733 (12), care a fost verificat cu minuțiozitate în timpul pregătirii sale, cu toate că metoda nu a fost supusă unui test de comparare interlaboratoare.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              În alte scopuri, concentrația în efluent a substanței chimice testate trebuie să fie cunoscută cu mai multă precizie, de aceea este nevoie de o metodă mai extinsă. De exemplu, rata de pierdere a surplusului de nămol trebuie să fie controlată mai precis pe parcursul fiecărei zile și pe întreaga perioadă de testare, iar unitățile trebuie să funcționeze la mai multe rate de pierdere. Pentru o metodă cu adevărat completă, testele ar trebui să fie efectuate, de asemenea, la două sau trei temperaturi diferite: o astfel de metodă este descrisă de Birch (13) (14) și sintetizată în apendicele 6. Totuși, cunoștințele actuale sunt insuficiente pentru a decide care dintre modelele cinetice pot fi aplicate la biodegradarea substanțelor chimice în tratarea apelor uzate și în general în mediul acvatic. Aplicarea cineticii Monod, indicată ca exemplu în apendicele 6, se limitează la substanțele chimice prezente într-o concentrație de cel puțin 1 mg/l, dar în opinia unor specialiști chiar și acest lucru rămâne de demonstrat. Testele la concentrații care reflectă mai îndeaproape pe cele din apele uzate sunt indicate în apendicele 7, dar astfel de teste, ca și cele din apendicele 6, sunt incluse în apendice, fără să fie prezentate ca metode de testare separate.
                           
                        
                     Filtre
                  
                  
                              6.
                           
                           
                              S-a acordat mult mai puțină atenție filtrelor de percolare utilizate ca model, probabil pentru că ocupă mai mult spațiu și sunt mai puțin compacte decât modelele de instalații cu nămol activ. Gerike et al. au dezvoltat unități de filtrare cu percolare și le-au exploatat în regim cu instalații cuplate (15). Aceste filtre erau destul de mari (înălțime 2 m; volum 60 l) și pentru fiecare era nevoie de un debit de ape uzate de 2 l/h. Baumann et al. (16) au simulat filtrele de percolare prin inserarea de fâșii de material din poliester tip «fleece» în tuburi de 1 m lungime (diametru interior 14 mm), după scufundarea fâșiilor timp de 30 de minute în nămol activ concentrat. Alimentarea cu substanța chimică testată, ca unică sursă de C într-o soluție de săruri minerale, se făcea printr-un tub vertical, iar biodegradarea era evaluată pe baza măsurării COD în efluent și a CO2 în gazul evacuat.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Biofiltrele au fost simulate în alt mod (15); suprafețele interioare ale tuburilor rotative, înclinate la un unghi mic față de orizontală, au fost alimentate cu ape uzate (circa 250 ml/h), cu și fără substanța chimică testată specifică, iar efluenții colectați au fost analizați pentru COD și/sau substanța chimică specifică testată.
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              8.
                           
                           
                              Această metodă este concepută pentru a determina eliminarea și biodegradarea primară și/sau finală a substanțelor chimice organice solubile în apă de către microorganisme aerobe, într-un sistem de testare cu funcționare continuă, care simulează procesul cu nămol activ. Un mediu organic ușor biodegradabil și substanța chimică organică testată reprezintă sursele de carbon și energie pentru microorganisme.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Două unități de testare cu funcționare continuă (instalații cu nămol activ sau vase poroase) funcționează în paralel, în condiții identice, care sunt alese pentru a corespunde scopului testului. În mod normal, timpul mediu de retenție hidraulică este de 6 h iar vârsta medie a nămolului (timpul de retenție a nămolului) este de 6 până la 10 zile. Nămolul este înlăturat prin una din cele două metode, substanța chimică testată se adaugă, în mod normal, la o concentrație între 10 mg/l de carbon organic dizolvat (COD) și 20 mg/l COD, la influentul (mediul organic) numai uneia dintre unități. A doua unitate este utilizată ca unitate de control pentru determinarea biodegradării mediului organic.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              În probele prelevate frecvent din efluenți se determină COD, de preferință, sau consumul chimic de oxigen (CCO), împreună cu concentrația substanței chimice testate (dacă este nevoie) prin analiză specifică, în efluentul de la unitatea care primește substanța chimică testată. Se consideră că diferența dintre concentrațiile din efluenți ale COD sau CCO în unitățile de testare și de control este datorată substanței chimice testate sau metaboliților săi organici. Această diferență este comparată cu concentrația de COD sau CCO în influent datorată substanței chimice testate adăugate, pentru a determina eliminarea substanței chimice testate.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              În mod normal, biodegradarea poate fi deosebită de bioadsorbție prin examinarea atentă a curbei eliminare-timp și în general poate fi confirmată prin aplicarea unui test pentru biodegradare rapidă, utilizând un inocul aclimatizat din unitatea care primește substanța chimică testată.
                           
                        INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA CHIMICĂ TESTATĂ
                  
                              12.
                           
                           
                              Pentru o interpretare corectă a rezultatelor trebuie să se cunoască puritatea, solubilitatea în apă, volatilitatea și caracteristicile de adsorbție ale substanței chimice testate. În mod normal, substanțele chimice volatile și insolubile nu pot fi testate fără a se lua măsuri speciale de precauție (a se vedea apendicele 5). Trebuie să se cunoască și structura chimică sau cel puțin formula empirică pentru a calcula valorile teoretice și/sau pentru a verifica valorile măsurate ale parametrilor, de exemplu consumul teoretic de oxigen (CTO), carbonul organic dizolvat (COD) și consumul chimic de oxigen (CCO).
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              Informațiile legate de toxicitatea substanței chimice testate asupra microorganismelor (a se vedea apendicele 4) pot fi utile pentru alegerea concentrațiilor de testare adecvate și se pot dovedi esențiale pentru interpretarea corectă a valorilor scăzute de biodegradare.
                           
                        NIVELURI DE TRECERE
                  
                              14.
                           
                           
                              În aplicarea originală a acestui test de simulare (de confirmare) la biodegradarea primară a agenților tensioactivi este necesară înlăturarea a mai mult de 80 % din substanța chimică specifică înainte ca agentul tensioactiv să poată fi comercializat. În cazul în care nu se atinge valoarea de 80 %, testul de simulare (de confirmare) poate fi aplicat, iar agentul tensioactiv se poate comercializa numai dacă se înlătură mai mult de 90 % din substanța chimică specifică. În general, la substanțele chimice nu se pune problema de a trece sau a nu trece testul, iar valoarea eliminării procentuale obținute poate fi utilizată în calcule aproximative ale concentrației probabile în mediu, care urmează să fie utilizate în evaluarea riscurilor implicate de substanțele chimice. Rezultatele tind să urmeze un tipar de tipul «totul sau nimic». Într-o serie de studii privind substanțe chimice pure s-a constatat că procentul de eliminare a COD era > 90 % în mai mult de trei sferturi și > 80 % în peste 90 % din substanțele chimice, ceea ce a indicat un grad semnificativ de biodegradabilitate.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Relativ puține substanțe chimice (de exemplu, agenți tensioactivi) sunt prezente în apele uzate în concentrațiile (circa 10 mg C/l) utilizate în acest test. La aceste concentrații, unele substanțe chimice pot fi inhibitoare, în timp ce cinetica eliminării altor substanțe poate fi diferită la concentrații scăzute. O evaluare mai precisă a degradării s-ar putea face cu ajutorul unor metode modificate, utilizând concentrații de substanță chimică testată realist scăzute, iar datele culese ar putea fi utilizate pentru calculul constantelor cinetice. Totuși, tehnicile experimentale necesare nu au fost încă pe deplin validate și nici nu s-au stabilit modelele cinetice care descriu reacțiile de biodegradare (a se vedea apendicele 7).
                           
                        SUBSTANȚE CHIMICE DE REFERINȚĂ
                  
                              16.
                           
                           
                              Pentru a asigura executarea corectă a procedurii experimentale, ocazional este util ca analiza substanțelor chimice testate să se facă simultan cu testarea unor substanțe chimice cu comportament cunoscut. Printre aceste substanțe se numără acidul adipic, 2-fenil-fenolul, 1-naftolul, acidul difenic, acidul 1-naftoic etc. (9) (10) (11).
                           
                        REPRODUCTIBILITATEA REZULTATELOR TESTĂRII
                  
                              17.
                           
                           
                              Există mult mai puține rapoarte privind studii despre teste de simulare decât despre teste pentru biodegradabilitate rapidă. Reproductibilitatea între duplicate (simultane) este bună (în limita a 10-15 %) pentru substanțe chimice testate degradate în procent de cel puțin 80 %, dar pentru substanțe chimice mai puțin degradate gradul de variație este mai mare. De asemenea, la unele substanțe chimice de limită s-au înregistrat rezultate foarte variate (de exemplu, 10 %, 90 %) în diferite ocazii în perioada celor 9 săptămâni în care s-a desfășurat testul.
                           
                        
                              18.
                           
                           
                              S-au înregistrat diferențe mici între rezultatele obținute cu cele două tipuri de aparate, dar unele substanțe chimice s-au degradat mai mult și în mod constant în prezența apelor uzate de origine menajeră decât în cazul apelor uzate sintetice din testele OCDE.
                           
                        DESCRIEREA METODEI DE TESTARE
                  
                     Aparatură
                  
                  
                     Sistem de testare
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Sistemul de testare pentru o substanță chimică testată este format dintr-o unitate de testare și o unitate de control; dar atunci când se fac doar analize specifice (biodegradare primară), este nevoie doar de o unitate de testare. O unitate de control se poate utiliza pentru mai multe unități de testare care primesc fie aceeași substanță chimică testată, fie substanțe chimice testate diferite. În cazul cuplării unităților (apendicele 3), fiecare unitate de testare trebuie să aibă propria unitate de control. Sistemul de testare poate fi un model de instalație cu nămol activ, o unitate Husmann (apendicele 1, figura 1) sau un vas poros (apendicele 1, figura 2). În ambele cazuri sunt necesare vase de alimentare de mărime suficientă pentru influenți și efluenți, precum și pompe pentru dozarea influentului, fie amestecat cu soluția de substanță chimică testată, fie separat.
                           
                        
                              20.
                           
                           
                              Fiecare instalație cu nămol activ este formată dintr-un vas de aerare cu o capacitate cunoscută de circa 3 litri de nămol activ și un separator (decantor secundar) cu o capacitate de circa 1,5 litri; volumele pot fi modificate, într-o oarecare măsură, prin ajustarea înălțimii separatorului. Sunt permise vase de dimensiuni diferite, cu condiția să fie utilizate la sarcini hidraulice comparabile. În cazul în care temperatura din camera de testare nu poate fi menținută în intervalul dorit, se recomandă utilizarea vaselor cu manta cu apă, cu temperatură controlată. Se utilizează o pompă de evacuare cu aer comprimat sau o pompă de dozare pentru reciclarea nămolului activ din separator spre vasul de aerare, fie în mod continuu, fie intermitent, la intervale regulate.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Sistemul cu vas poros constă într-un cilindru poros interior, cu fund conic, amplasat într-un vas ceva mai mare de aceeași formă, dar fabricat dintr-un material plastic impermeabil. Un material adecvat pentru vasul poros este polietilena poroasă, cu o dimensiune maximă a porilor de 90 μm și grosime de 2 mm. Separarea nămolului de mediul organic tratat se face prin trecerea diferențială prin peretele poros. Efluenții se colectează în spațiul inelar, de unde se revarsă în vasul de colectare. Nu se produce decantare, deci nu apare retur de nămol. Întregul sistem poate fi montat într-o baie de apă cu control termostatic. În fazele inițiale, vasele poroase se blochează și se pot revărsa. Într-o astfel de situație se înlocuiește căptușeala poroasă cu una curată, mai întâi prin sifonarea nămolului din vas într-o găleată curată și înlăturarea căptușelii blocate. După ștergerea temeinică a cilindrului exterior impermeabil se inserează o căptușeală curată și apoi se toarnă nămolul la loc în vas. De asemenea, se curăță bine și se înlătură orice rest de nămol care aderă la pereții căptușelii blocate. Vasele blocate se curăță mai întâi cu ajutorul unui jet fin de apă pentru a elimina resturile de nămol, apoi prin înmuiere în soluție diluată de hipoclorit de sodiu, apoi în apă, după care se clătesc bine cu apă.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Pentru aerarea nămolului în vasele de aerare din ambele sisteme este nevoie de tehnici adecvate, de exemplu cuburi din material sinterizat (pietre de difuzare) și aer comprimat. Aerul trebuie să fie curățat, dacă este necesar, prin trecerea printr-un filtru adecvat și apoi trebuie să fie spălat. Prin sistem trebuie să treacă suficient aer pentru a menține condiții aerobe și pentru a păstra precipitatele floconoase de nămol în suspensie pe toată durata testului.
                           
                        
                     Aparat de filtrare sau centrifugă
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Dispozitiv de filtrare a probelor cu filtre cu membrană de porozitate corespunzătoare (diametrul deschiderii nominale de 0,45 μm), care adsorb substanțele chimice organice și eliberează carbon organic la un nivel minim. Atunci când se utilizează filtre care eliberează carbon organic, ele trebuie să fie spălate cu grijă cu apă caldă, pentru a înlătura carbonul organic lixiviabil. Ca alternativă, se poate utiliza și o centrifugă care poate produce o accelerație de 40 000 m/s2.
                           
                        
                     Echipamente pentru analiză
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Aparat necesar pentru a determina:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          COD (carbon organic dizolvat) și COT (carbon organic total) sau CCO (consum chimic de oxigen);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          substanțele chimice specifice, dacă este necesar;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          materiile solide în suspensie, pH, concentrația de oxigen în apă;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura, aciditatea și alcalinitatea;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          conținutul de amoniu, nitriți și nitrați, în cazul în care testul se face în condiții nitrificatoare.
                                       
                                    
                        
                     Apă
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Apă de la robinet, cu conținut de COD mai mic de 3 mg/l. Trebuie să se determine alcalinitatea, atunci când nu este deja cunoscută.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Apă deionizată, cu conținut de COD mai mic de 2 mg/l.
                           
                        
                     Mediu organic
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Ca mediu organic se poate utiliza apă uzată sintetică, apă uzată menajeră sau un amestec din cele două. S-a demonstrat (11) (14) că numai prin utilizarea apei uzate menajere se ajunge deseori la un procent crescut de eliminare a COD și chiar se permit eliminarea și biodegradarea unor substanțe chimice care nu sunt biodegradate atunci când se utilizează apa uzată sintetică din testele OCDE. De asemenea, adăugarea constantă sau intermitentă de apă uzată menajeră conduce adesea la stabilizarea nămolului activ, inclusiv la capacitatea esențială de decantare satisfăcătoare. Astfel, se recomandă utilizarea apei uzate menajere. Trebuie să se măsoare concentrația de COD sau CCO în fiecare lot nou de mediu organic. Trebuie să se cunoască aciditatea sau alcalinitatea mediului organic. În cazul în care mediul organic are o aciditate sau alcalinitate scăzută, ar putea fi necesar să se adauge o soluție tampon corespunzătoare (bicarbonat de sodiu sau fosfat diacid de potasiu), pentru a menține un pH de circa 7,5 ± 0,5 în vasul de aerare în timpul testului. Cantitatea de soluție tampon care se adaugă, precum și momentul adăugării, sunt decise pentru fiecare caz în parte. Atunci când se utilizează amestecuri, fie în mod continuu, fie intermitent, COD (sau CCO) al amestecului trebuie să fie menținut la o valoare aproximativ constantă, de exemplu prin diluare cu apă.
                           
                        
                     Apă uzată sintetică
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              În fiecare litru de apă de la robinet se dizolvă: peptonă, 160 mg; extract de carne, 110 mg; uree, 30 mg; fosfat acid de di-potasiu anhidru (K2HPO4), 28 mg; clorură de sodiu (NaCl), 7 mg; clorură de calciu dihidrat (CaCl2.2H2O), 4 mg; sulfat de magneziu heptahidrat (Mg2SO4.7H20), 2 mg. Această apă uzată sintetică din testele OCDE este un exemplu și indică o concentrație medie a COD în influent de circa 100 mg/l. Ca metodă alternativă, se pot utiliza alte amestecuri, cu aproximativ aceeași concentrație de COD, care sunt apropiate de apele uzate reale. În cazul în care este nevoie de un influent mai puțin concentrat, apa uzată sintetică se diluează, de exemplu în proporție de 1:1, cu apă de la robinet, pentru a obține o concentrație de circa 50 mg/l. Un astfel de influent mai slab va oferi condiții mai bune de creștere a organismelor nitrificatoare și această modificare trebuie să fie utilizată în cazul în care se analizează simularea instalațiilor de tratare a apelor uzate prin nitrificare. Apa uzată sintetică poate fi obținută din apă distilată într-o formă concentrată și poate fi depozitată la circa 1 °C până la o săptămână. Atunci când este nevoie să fie utilizată, se diluează cu apă de la robinet. (Acest mediu nu este satisfăcător, de exemplu concentrația de azot este foarte mare, conținutul de carbon este relativ scăzut, dar nu s-a propus nicio altă metodă mai bună, cu excepția adăugării unei cantități mai mari de fosfat ca soluție tampon și a creșterii procentului de peptonă).
                           
                        
                     Apă uzată menajeră
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              Se utilizează apă uzată proaspătă decantată, colectată zilnic dintr-o instalație de tratare care primește în special apă uzată menajeră. Apa trebuie să fie colectată, înainte de sedimentarea primară, din canalul deversor al rezervorului de sedimentare primară sau din alimentarea instalației de nămol activ și trebuie să fie, în mare măsură, lipsită de particule grosiere. Apa uzată poate fi utilizată după ce a fost depozitată timp de mai multe zile (dar, în general, nu trebuie să se depășească șapte zile) la circa 4 °C, dacă s-a dovedit că COD (sau CCO) nu a scăzut în mod semnificativ (adică cu mai puțin de 20 %) în timpul perioadei de depozitare. Pentru a limita perturbațiile aduse sistemului, COD (sau CCO) din fiecare lot nou trebuie să fie ajustat înainte de utilizare la o valoare constantă adecvată, de exemplu prin diluarea cu apă de la robinet.
                           
                        
                     Nămol activ
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Nămolul activ pentru inoculare se colectează din bazinul de aerare al unei instalații de epurare a apelor uzate care funcționează corespunzător sau dintr-o unitate de laborator cu nămol activ, care tratează în principal ape uzate menajere.
                           
                        
                     Soluții stoc de substanță chimică testată
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Pentru substanțe chimice cu solubilitate adecvată, se prepară soluții stoc de concentrații corespunzătoare (de exemplu, de la 1 până la 5 g/l) în apă deionizată sau în partea minerală a apei uzate sintetice (pentru substanțe chimice insolubile și volatile, a se vedea apendicele 5). Se determină COD și carbonul organic total (COT) ale soluției stoc și se repetă măsurătorile pentru fiecare lot nou. În cazul în care diferența dintre COD și COT este mai mare de 20 %, se verifică solubilitatea în apă a substanței chimice testate. Se compară COD sau concentrația substanței chimice testate măsurate prin analiza specifică a soluției stoc cu valoarea nominală, pentru a verifica dacă recuperarea este suficient de bună (în mod normal se poate aștepta o valoare > 90 %). Se verifică, în special pentru dispersii, dacă COD poate fi utilizat sau nu ca parametru analitic sau dacă pentru substanța chimică testată se poate utiliza doar o tehnică de analiză specifică. Pentru dispersii este necesară centrifugarea probelor. Pentru fiecare lot nou se măsoară COD, CCO sau substanța chimică testată, printr-o analiză specifică.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Se determină pH-ul soluției stoc. Valorile extreme indică faptul că adăugarea substanței chimice poate avea o influență asupra pH-ului nămolului activ în sistemul de testare. În acest caz, soluția stoc se neutralizează, pentru a obține un pH de 7 ± 0,5, cu mici cantități de acid sau bază anorganică, dar se evită precipitarea substanței chimice testate.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                              33.
                           
                           
                              Procedura este descrisă pentru instalațiile cu nămol activ; ea trebuie să fie ușor adaptată pentru sistemul cu vas poros.
                           
                        
                     Prepararea inoculului
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Sistemul de testare se inoculează la începutul testului, fie cu nămol activ, fie cu un inocul cu concentrație scăzută de microorganisme. Până la utilizare, inoculul se păstrează aerat la temperatura camerei și se utilizează în termen de 24 de ore. În primul caz, se prelevează o probă de nămol activ din bazinul de aerare al unei instalații de epurare biologică a apelor uzate care funcționează eficient sau al unei instalații de tratare de laborator, care primește în principal apă uzată menajeră. În cazul în care se simulează condiții de nitrificare, nămolul se ia dintr-o instalație de epurare a apelor uzate prin nitrificare. Se determină concentrația de materii solide în suspensie și, dacă este necesar, se concentrează nămolul prin decantare, astfel încât volumul adăugat la sistemul de testare să fie minim. Se asigură o concentrație inițială de substanță uscată de circa 2,5 g/l.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              În al doilea caz, se utilizează ca inocul de la 2 ml/l până la 10 ml/l dintr-un efluent de la o instalație de epurare biologică a apelor uzate menajere. Pentru a obține cât mai multe specii diferite de bacterii, poate fi utilă adăugarea de inocul din diverse alte surse, de exemplu din ape de suprafață. În acest caz, nămolul activ se va dezvolta și va crește în sistemul de testare.
                           
                        
                     Dozarea mediului organic
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Se asigură curățarea temeinică a recipientelor pentru influent și efluent și a tuburilor de la vasele pentru influent și către vasele pentru efluent, pentru a înlătura creșterea microbiană inițială și pe parcursul testului. Sistemele de testare se asamblează într-o încăpere cu temperatură controlată (în mod normal, între 20 și 25 °C) sau se utilizează unități de testare cu manta cu apă. Se prepară un volum suficient din mediul organic necesar (punctele 27-29). Inițial, vasul de aerare și separatorul se umplu cu mediul organic și se adaugă inoculul (punctele 34, 35). Se începe aerarea astfel încât nămolul să fie menținut în suspensie și într-o stare aerobă și se începe dozarea influentului și reciclarea nămolului decantat. Se dozează mediul organic din vasele de alimentare în vasele de aerare (punctele 20, 21) ale unităților de testare și de control și se colectează efluenții respectivi în vase de alimentare similare. Pentru a obține un timp de retenție hidraulică normal de 6 h, mediul organic este pompat cu un debit de 0,5 l/h. Pentru confirmarea acestui debit, se măsoară cantitatea zilnică de mediu organic dozat, notând reducerea volumelor mediului în vasele de alimentare. Alte moduri de dozare sunt necesare pentru determinarea efectelor degajării intermitente și a încărcării substanțelor chimice în doze «șoc».
                           
                        
                              37.
                           
                           
                              Atunci când mediul organic este preparat pentru a fi utilizat pe o perioadă mai mare de o zi, este necesar să fie răcit la circa 4 °C sau să se folosească alte metode de conservare pentru prevenirea creșterii microbiene și a biodegradării în exteriorul unităților de testare (punctul 29). Atunci când se utilizează apă uzată sintetică, se poate prepara și depozita la circa 4 °C o soluție stoc concentrată (de exemplu, de 10 ori concentrația normală, punctul 28). Înainte de utilizare, această soluție stoc poate fi amestecată bine cu un volum corespunzător de apă de la robinet; sau poate fi pompată direct, în timp ce se pompează separat volumul corespunzător de apă de la robinet.
                           
                        
                     Dozarea substanței chimice testate
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Se adaugă un volum corespunzător de soluție stoc din substanța chimică testată (punctul 31) la vasul de alimentare pentru influent sau se dozează direct în vasul de aerare, cu o pompă separată. Concentrația de testare medie normală în influent trebuie să fie între 10 mg/l și 20 mg/l COD, cu o concentrație maximă de cel mult 50 mg/l. În cazul în care solubilitatea în apă a substanței chimice testate este scăzută sau dacă pot apărea efecte toxice, se reduce concentrația la 5 mg/l COD sau chiar mai puțin, dar numai atunci când este disponibilă și se utilizează o metodă analitică specifică corespunzătoare (se pot adăuga substanțe chimice testate dispersate și greu solubile în apă, cu ajutorul unor tehnici de dozare speciale, a se vedea apendicele 5).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Se începe adăugarea substanței chimice testate după o perioadă în care sistemul s-a stabilizat și se elimină eficient COD din mediul organic (circa 80 %). Este important să se verifice dacă toate unitățile funcționează la fel de eficient înainte de adăugarea substanței chimice testate; în caz contrar, de obicei este util să se amestece nămolurile individuale și să se redistribuie volume egale la unitățile individuale. Atunci când se folosește un inocul de nămol activ de (circa) 2,5 g/l (greutate uscată), substanța chimică testată se poate adăuga de la începutul testului, deoarece adăugarea directă, de la început, a unor cantități din ce în ce mai mari are avantajul că nămolul activ se poate adapta mai bine la substanța chimică testată. Indiferent de metoda de adăugare a substanței chimice testate, se recomandă măsurarea la intervale regulate a debitului relevant și/sau a volumelor din vasul (vasele) de alimentare.
                           
                        
                     Manipularea nămolului activ
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              În mod normal, concentrația de materii solide în nămolul activ se stabilizează între anumite limite în timpul testului, independent de inoculul folosit, între 1 și 3 g/l (greutate uscată), în funcție de calitatea și concentrația mediului organic, de condițiile de funcționare, de natura microorganismelor prezente și de influența substanței chimice testate.
                           
                        
                              41.
                           
                           
                              Fie se determină materiile solide în suspensie în vasele de aerare cel puțin o dată pe săptămână și se elimină nămolul în exces pentru a se menține concentrația la o valoare între 1 g/l și 3 g/l (greutate uscată), fie se controlează vârsta medie a nămolului la o valoare constantă, de obicei între 6 și 10 zile. De exemplu, dacă se alege un timp de retenție a nămolului de 8 zile, se scoate zilnic 1/8 din volumul nămolului activ din vasul de aerare și se elimină. Se face acest lucru zilnic sau, de preferință, printr-o pompă automată cu funcționare intermitentă. Prin menținerea unei concentrații de materii solide în suspensie la o valoare constantă sau între niște limite înguste nu se menține un timp constant de retenție a nămolului (TRN), care este variabila de funcționare ce determină valoarea concentrației substanței chimice testate în efluent.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Pe toată durata testului se înlătură, cel puțin o dată pe zi, orice nămol care aderă la pereții vasului de aerare și ai separatorului, astfel încât să se refacă suspensia. Se verifică și se curăță regulat toate tuburile și țevile, pentru a preveni dezvoltarea biopeliculei. Nămolul decantat din separator spre vasul de aerare se reciclează, de preferință prin pompare intermitentă. În sistemul cu vas poros nu are loc reciclare, dar trebuie să se asigure inserarea de vase interioare curate înainte ca volumul din vase să crească semnificativ (punctul 21).
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              În unitățile Husmann, decantarea poate fi necorespunzătoare și pot apărea pierderi de nămol. Pentru a remedia acest neajuns, se poate recurge la una sau mai multe din acțiunile enumerate mai jos, în paralel în unitățile de testare și de control:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          se poate adăuga nămol proaspăt sau floculant (de exemplu, 2 ml/vas cu soluție de FeCl3 în concentrație de 50 g/l) la intervale regulate, de exemplu zilnic, dar trebuie să se verifice că nu apare o reacție sau o precipitare a substanței chimice testate la contactul cu FeCl3;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pompa de evacuare cu aer comprimat poate fi înlocuită cu o pompă peristaltică, permițând astfel un debit de recirculare a nămolului aproape egal cu debitul influentului utilizat și permițând dezvoltarea unei zone aerobe în nămolul decantat (geometria pompei de evacuare cu aer comprimat limitează debitul minim al nămolului returnat la circa de 12 ori cel al influentului);
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      nămolul poate fi pompat intermitent din separator spre vasul de aerare (de exemplu, timp de 5 minute la fiecare 2,5 h, pentru a recicla între 1 l/h și 1,5 l/h);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      un agent antispumare netoxic, la concentrație minimă, se poate folosi pentru a preveni pierderea prin spumare (de exemplu, ulei siliconic);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aerul poate fi trecut prin nămolul din separator în impulsuri scurte, de șoc (de exemplu, câte 10 secunde la fiecare oră);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mediul organic poate fi dozat la intervale în vasul de aerare (de exemplu, 3 până la 10 minute la fiecare oră).
                                                   
                                                
                                    
                        
                     Prelevare de probe și analiză
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              La intervale regulate se măsoară concentrația de oxigen dizolvat, temperatura și valoarea pH-ului nămolului activ din vasele de aerare. Se asigură că există întotdeauna suficient oxigen (> 2 mg/l) și că temperatura este menținută în intervalul necesar (în mod normal, între 20 și 25 °C). pH-ul se menține la 7,5 ± 0,5 prin dozarea unor cantități mici de bază sau acid anorganic în vasul de aerare sau prin creșterea capacității de tamponare a mediului organic (a se vedea punctul 27). Atunci când apare nitrificarea se produce acid, oxidarea unui miligram de azot producând echivalentul a 7 mg CO3
                                 –. Frecvența de măsurare depinde de parametrul de măsurat și de stabilitatea sistemului și poate varia între măsurători zilnice și săptămânale.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Se măsoară COD sau CCO în influenții către vasele de control și de testare. Concentrația de substanță chimică testată în influentul de testare se măsoară prin analiză specifică sau se estimează din concentrația în soluția stoc (punctul 31), volumul utilizat și cantitatea de apă uzată dozată în unitatea de testare. Se recomandă să se calculeze concentrația substanței chimice testate, pentru a reduce variabilitatea datelor privind concentrația.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Se prelevează probe corespunzătoare din efluentul colectat (de exemplu, compozit pe 24 h) și se filtrează printr-o membrană cu pori de 0,45 μm sau se centrifughează la circa 40 000 m/s2 timp de aproximativ 15 minute. Centrifugarea trebuie să fie folosită atunci când filtrarea este dificilă. Se determină COD sau CCO cel puțin de două ori pentru a măsura biodegradarea finală și, dacă este necesar, biodegradarea primară printr-o analiză specifică pentru substanța chimică testată.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Folosirea CCO poate duce la probleme de analiză la concentrații scăzute, prin urmare este recomandată doar atunci când se utilizează o concentrație de testare suficient de ridicată (circa 30 mg/l). De asemenea, pentru substanțe chimice cu putere mare de adsorbție, se recomandă măsurarea cantității de substanță chimică adsorbită din nămol cu ajutorul unei tehnici de analiză specifică pentru substanța chimică testată.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Frecvența de prelevare a probelor depinde de durata estimată a testului. Frecvența recomandată este de trei ori pe săptămână. După ce unitățile funcționează eficient, se lasă o perioadă de adaptare de una până la șase săptămâni de la introducerea substanței chimice testate, pentru a ajunge la o stare stabilă. Este preferabil să se obțină cel puțin 15 valori valabile în faza de platou (punctul 59), care în mod normal durează trei săptămâni, pentru evaluarea rezultatelor testului. Testul poate fi încheiat atunci când s-a atins un grad suficient de eliminare (de exemplu, > 90 %) și când sunt disponibile aceste 15 valori, care reprezintă analizele efectuate în fiecare zi a săptămânii, timp de 3 săptămâni. În mod normal, durata testului nu trebuie să depășească 12 săptămâni de la introducerea substanței chimice testate.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Dacă nămolul nitrifică și se studiază efectele substanței chimice testate asupra nitrificării, se analizează probe din efluentul din unitățile de testare și control cel puțin o dată pe săptămână, pentru depistarea amoniului și/sau nitritului plus nitratului.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Toate analizele trebuie să fie efectuate cât mai devreme posibil, în special determinările azotului. În cazul în care trebuie să se amâne analizele, probele se depozitează la 4 °C, la întuneric, în sticle închise etanș. Atunci când trebuie să se depoziteze probele mai mult de 48 de ore, se conservă prin congelare, acidifiere (de exemplu, 10 mg/l dintr-o soluție de acid sulfuric în concentrație de 400 g/l) sau prin adăugarea unei substanțe toxice adecvate [de exemplu, 20 ml/l dintr-o soluție de clorură de mercur (II) în concentrație de 10 g/l]. Se asigură că tehnica de conservare nu influențează rezultatul analizei.
                           
                        
                     Cuplarea unităților de testare
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Atunci când se folosește cuplarea (apendicele 3), se schimbă zilnic aceeași cantitate de nămol activ (între 150 ml și 1 500 ml pentru vase de aerare care conțin 3 litri de soluție apoasă) între vasele de aerare ale unității de testare și cele ale unității de control. În cazul în care substanța chimică testată adsoarbe puternic pe nămol, se schimbă doar supernatantul separatoarelor. În ambele cazuri se folosește un factor de corecție pentru calculul rezultatelor testului (punctul 55).
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Interpretarea rezultatelor
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Se calculează procentul de eliminare a COD sau CCO din substanța chimică testată, pentru fiecare evaluare într-un interval de timp, cu ecuația:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminare COD sau CCO la momentul t
                                       
                                    
                                          Cs
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          COD sau CCO în influent, datorită substanței chimice testate, de preferință estimată din soluția stoc (mg/l)
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          valoarea COD sau CCO măsurată în efluentul de testare la momentul t (mg/l)
                                       
                                    
                                          Eo
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          valoarea COD sau CCO măsurată în efluentul de control la momentul t (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              53.
                           
                           
                              Gradul de eliminare a COD sau CCO din mediul organic în unitatea de testare este o informație utilă pentru evaluarea activității de biodegradare a nămolului activ în timpul testului. Se calculează procentul de eliminare cu ecuația:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          DB
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminare COD sau CCO în mediul organic în unitatea de control la momentul t
                                       
                                    
                                          CM
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          COD sau CCO în mediul organic în influentul de control (mg/l)
                                       
                                    Opțional, se calculează procentul de eliminare a COD sau CCO datorat mediului organic plus substanței chimice testate în unitatea de testare cu ecuația:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          DT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminare COD sau CCO în totalul influentului de testare
                                       
                                    
                                          CT
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          COD sau CCO în totalul influentului de testare sau calculat din soluțiile stoc (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              54.
                           
                           
                              Se calculează eliminarea substanței chimice testate dacă este măsurată cu o metodă analitică specifică la fiecare evaluare temporală, cu ecuația:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          DST
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          % eliminare primară a substanței chimice testate la momentul t
                                       
                                    
                                          Si
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentrația de substanță chimică, măsurată sau estimată în influentul de testare (mg/l)
                                       
                                    
                                          Se
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentrația de substanță chimică testată, măsurată sau estimată în efluentul de testare la momentul t (mg/l)
                                       
                                    
                        
                              55.
                           
                           
                              În cazul în care s-a folosit modul de cuplare, diluția substanței chimice testate în vasul de aerare la schimbul de nămol se compensează cu ajutorul unui factor de corecție (a se vedea apendicele 3). Dacă s-au utilizat un timp de retenție hidraulică mediu de 6 ore și un schimb de jumătate din volumul de nămol activ în vasul de aerare, valorile de eliminare zilnică determinate (Dt, punctul 52) trebuie să fie corectate pentru a obține gradul de eliminare real, Dtc al substanței chimice testate, cu ecuația:
                              
                                 
                           
                        
                     Exprimarea rezultatelor testului
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Se face graficul eliminării procentuale Dt (sau Dtc) și Dst, dacă este disponibil, în funcție de timp (a se vedea apendicele 2). Din forma curbei de eliminare a substanței chimice testate (în sine sau ca COD) se pot trage unele concluzii despre procesul de eliminare.
                           
                        
                     Adsorbție
                  
                  
                              57.
                           
                           
                              Dacă de la începutul testului se observă un nivel ridicat de eliminare a COD din substanța chimică testată, probabil că substanța chimică testată este eliminată prin adsorbție pe materiile solide din nămolul activ. Acest lucru se poate dovedi prin determinarea substanței chimice testate adsorbite, prin analize specifice. Nu este uzual ca nivelul de eliminare a COD din substanțele chimice adsorbabile să rămână ridicat pe toată durata testului; în mod normal, eliminarea este mai pronunțată la început, iar apoi scade treptat până la o valoare de echilibru. Totuși, dacă substanța chimică testată adsorbabilă a putut duce la aclimatizarea populației microbiene într-un fel sau altul, gradul de eliminare a COD din substanța chimică testată ar urma să crească ulterior, ajungând la o valoare de platou ridicată.
                           
                        
                     Fază de latență
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              La fel ca în cazul testelor statice de screening, pentru multe substanțe chimice testate este nevoie de o fază de latență înainte de apariția biodegradării totale. În faza de latență, aclimatizarea sau adaptarea bacteriilor de degradare are loc aproape fără nicio eliminare din substanța chimică testată; apoi apare creșterea inițială a acestor bacterii. Această fază se încheie, iar faza de degradare se consideră că începe atunci când este înlăturată circa 10 % din cantitatea totală de substanță chimică testată (după ce se lasă timp pentru adsorbție, dacă apare). Faza de latență este adesea foarte variabilă și slab reproductibilă.
                           
                        
                     Fază de platou
                  
                  
                              59.
                           
                           
                              Faza de platou a unei curbe de eliminare dintr-un test continuu este definită ca fiind faza în care are loc degradarea maximă. Faza de platou trebuie să fie de cel puțin 3 săptămâni și să conțină circa 15 valori măsurate valabile.
                           
                        
                     Grad mediu de eliminare a substanței chimice testate
                  
                  
                              60.
                           
                           
                              Se calculează valoarea medie din valorile de eliminare (Dt) ale substanței chimice testate în faza de platou. Rotunjit la cel mai apropiat număr întreg (1 %), reprezintă gradul de eliminare a substanței chimice testate. De asemenea, se recomandă calcularea intervalului de încredere de 95 % pentru valoarea medie.
                           
                        
                     Eliminare din mediul organic
                  
                  
                              61.
                           
                           
                              Se face graficul eliminării de COD sau CCO din mediul organic în unitatea de control (DB) funcție de timp. Se indică gradul minim de eliminare în același mod ca și pentru substanța chimică testată (punctul 60).
                           
                        
                     Indicarea biodegradării
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Dacă substanța chimică testată nu adsoarbe în mod semnificativ pe nămolul activ și curba de eliminare are forma tipică a unei curbe de biodegradare cu faze de latență, degradare și platou (punctele 58, 59), eliminarea măsurată poate fi atribuită fără ezitare biodegradării. Dacă are loc o înlăturare inițială ridicată, testul de simulare nu poate face diferența între procesele de eliminare biologică și abiotică. În asemenea cazuri, precum și în alte cazuri în care există dubii privind biodegradarea (de exemplu, dacă are loc procesul de stripare), se analizează substanțele chimice testate adsorbite sau se efectuează teste de biodegradare statică suplimentare, pe baza parametrilor care indică în mod clar procese biologice. Astfel de teste sunt metodele de absorbție a oxigenului [capitolul C.4 D, E și F din prezenta anexă (6)] sau un test cu măsurarea producției de dioxid de carbon [capitolul C.4 C din prezenta anexă (6)] sau metoda ISO Headspace (18), folosind un inocul preexpus, din testul de simulare. Dacă s-au măsurat atât eliminarea COD, cât și eliminarea substanței chimice specifice, diferențele semnificative (prima fiind mai scăzută decât a doua) dintre procentele eliminate indică prezența de produse organice intermediare în efluenți, care pot fi mai dificil de degradat decât substanța chimică inițială.
                           
                        
                     Validarea rezultatelor testelor
                  
                  
                              63.
                           
                           
                              Informații despre comportamentul normal de biodegradare a inoculului se obțin dacă se determină gradul de eliminare din mediul organic (punctul 53) în unitatea de control. Testul este considerat valabil dacă gradul de eliminare a COD sau CCO în unitatea (unitățile) de control este > 80 % după două săptămâni și nu s-au înregistrat observații neobișnuite.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Dacă s-a utilizat o substanță chimică (de referință) ușor biodegradabilă, gradul de biodegradare (Dt, punctul 52) trebuie să fie > 90 %.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Atunci când testul este efectuat în condiții de nitrificare, concentrația medie în efluenți trebuie să fie < 1 mg/l de azot amoniacal și < 2 mg/l de azot nitric.
                           
                        
                              66.
                           
                           
                              Dacă aceste criterii (punctele 63-65) nu sunt îndeplinite, se repetă testul folosind un inocul dintr-o sursă diferită, se testează o substanță chimică de referință și se revizuiesc toate procedurile experimentale.
                           
                        
                     Raport de testare
                  
                  
                              67.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică și, dacă este cazul, proprietățile fizice și chimice.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tipul sistemului de testare; orice modificări pentru testarea substanțelor chimice insolubile și volatile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tipul mediului organic;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      proporția și natura apelor reziduale industriale prezente în apele uzate, dacă se cunosc;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      inoculul, natura și locul (locurile) de prelevare a probelor, concentrația și orice tratare preliminară;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      soluția stoc de substanță chimică testată: conținutul de COD și COT; modul de preparare, dacă este în suspensie; concentrația de testare utilizată; motivele, dacă COD nu se încadrează în limitele 10-20 mg/l; metoda de adăugare; data primei adăugări; orice schimbări;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vârsta medie a nămolului și timpul mediu de retenție hidraulică; metoda de înlăturare a surplusului de nămol; metode de prevenire a aglomerării, pierderii de nămol etc.;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tehnici de analiză utilizate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      calitățile aglomeratelor de nămol, indexul de volum al nămolului (IVN), materiile solide în suspensie în soluția apoasă mixtă (MSSSAM);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orice deviație de la procedurile standard și orice circumstanțe care ar fi putut afecta rezultatele.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatele testului:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate datele măsurate (COD, CCO, analize specifice, pH, temperatură, concentrație de oxigen, materii solide în suspensie, substanțe azotoase, dacă sunt relevante);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate valorile calculate ale Dt (sau Dtc), DB, DSt obținute în formă tabelară și curbele de eliminare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații privind fazele de latență și platou, durata de testare, gradul de eliminare a substanței chimice testate și a mediului organic în unitatea de control, împreună cu informații statistice și specificații privind biodegradabilitatea și valabilitatea testului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea rezultatelor.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Swisher R.D. (1987), «Surfactant Biodegradation», 2nd Edn. Marcel Dekker Inc., New York, 1085 pp.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              German Government (1962), Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents, Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Painter H.A. and King E.F. (1978a), WRc porous-pot method for assessing biodegradability, Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, UK.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Painter H.A. and King E.F. (1978b), The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants, Wat. Res. 12: 909-915.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Eckenfelder, W.W. (19) US EPA.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Capitolul C.4 din prezenta anexă, «Determinarea biodegradabilității «rapide» ».
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Capitolul C.12 din prezenta anexă, «Biodegradare – Testul SCAS modificat».
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Capitolul C.19 din prezenta anexă, «Estimarea coeficientului de adsorbție (KCO) pe sol și nămol de epurare cu ajutorul cromatografiei lichide de înaltă performanță (HPLC)».
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Gerike P. și Fischer W.K. (1979), A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Gerike P. și Fischer W.K. (1981), as (9), II Additional results and conclusions, Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Painter H.A. and Bealing D. (1989), Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp. 113-138. În: Laboratory tests for simulation of water treatment processes, CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              ISO 11733 (1995; revizuit 2004), Calitatea apei. Determinarea eliminării și a biodegradabilității compușilor organici în mediu apos. Test de simulare cu nămol activ.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Birch R.R. (1982), The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Birch R.R. (1984), Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Gerike P., Fischer W.K. and Holtmann W. (1980), Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test, Wat.Res. 14: 753-758.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Baumann U., Kuhn G. și Benz M. (1998), Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem, Ökotox. 10: 214-220.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982), Assessment of biodegradability, Methods for the examination of waters and associated materials, pp. 91-98 ISBN 011 751661 9.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998), Calitatea apei. Evaluarea în mediu apos a biodegradabilității aerobe ultime a compușilor organici. Metoda prin analiza carbonului anorganic în vase închise ermetic (încercare cu CO2 în spațiul superior).
                           
                        
                     Apendicele 1
                     
                        Figura 1
                     
                     
                        Echipament utilizat pentru evaluarea biodegradabilității
                     
                     Unitate Husmann
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Vas de alimentare
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Pompă de dozare
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Vas de aerare (capacitate 3 l)
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Vas de decantare
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Pompă de evacuare cu aer comprimat
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Vas de colectare
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Aerator
                              
                           
                                 H.
                              
                              
                                 Contor debit de aer
                              
                           
                        Figura 2
                     
                     
                        Echipament utilizat pentru evaluarea biodegradabilității
                     
                     Vas poros
                     
                        
                     
                                 A.
                              
                              
                                 Vas de alimentare
                              
                           
                                 B.
                              
                              
                                 Pompă dozatoare
                              
                           
                                 C.
                              
                              
                                 Vas poros de aerare
                              
                           
                                 D.
                              
                              
                                 Vas exterior impermeabil
                              
                           
                                 E.
                              
                              
                                 Vas de colectare
                              
                           
                                 F.
                              
                              
                                 Difuzor
                              
                           
                                 G.
                              
                              
                                 Contor debit de aer
                              
                           
                        Figura 3
                     
                     
                        Detalii ale vasului poros de aerare de 3 litri
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Exemplu de curbă de eliminare
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 3
                     [INFORMATIV]
                     CUPLAREA UNITĂȚILOR DE TESTARE
                     Pentru a încerca egalizarea populațiilor microbiene în nămolurile din unitatea de testare, care primește ape uzate plus o substanță chimică testată, și din unitatea de control, care primește doar ape uzate, s-a introdus schimbul reciproc de nămol (1). Procedura s-a numit cuplare, iar metoda este cunoscută sub numele de regim cu instalații cuplate. Inițial, cuplarea s-a realizat cu ajutorul unităților Husmann cu nămol activ, dar ea s-a făcut și cu unități de tip vas poros (2) (3). Nu s-au constatat diferențe semnificative între rezultatele obținute cu unități necuplate și cu unități cuplate, fie de tip Husmann, fie de tip vas poros, deci nu este avantajos să se dedice mai mult timp și energie pentru cuplarea unităților.
                     Schimburile de nămol pot apărea ca o înlăturare destul de considerabilă, întrucât unele din substanțele chimice testate sunt transferate, iar concentrațiile de substanță chimică testată din efluenții de testare și de control se apropie mai mult de egalitate. Astfel, trebuie să se folosească factori de corecție, care depind de fracțiunea schimbată și de timpul mediu de retenție hidraulică. S-au publicat mai multe detalii privind acest calcul (1).
                     Se calculează gradul de eliminare a COD sau CCO corectat, cu ajutorul formulei generale:
                     
                        
                     unde:
                     
                                 Dtc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % corectat de eliminare a COD sau CCO
                              
                           
                                 Dt
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 % determinat de eliminare a COD sau CCO
                              
                           
                                 a
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 fracțiunea de schimb a volumului unităților de nămol activ
                              
                           
                                 r
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 timpul mediu de retenție hidraulică (h)
                              
                           Dacă, de exemplu, jumătate din volumul din vasul de aerare este schimbat (a = 0,5), iar timpul mediu de retenție hidraulică este de 6 h, formula de corecție este:
                     
                        
                     
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Fischer W., Gerike P., Holtmann W. (1975), Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Painter H.A., Bealing D.J. (1989), Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. În: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Painter H.A., King E.F. (1978), Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability, Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK.
                              
                           
                  
                     Apendicele 4
                     EVALUAREA INHIBIȚIEI NĂMOLULUI ACTIV
                     
                        Proces în funcție de substanțele chimice testate
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 O substanță chimică (sau o apă uzată) poate să nu fie degradată sau înlăturată în testul de simulare și poate avea chiar un efect inhibitor asupra microorganismelor din nămol. Alte substanțe chimice sunt biodegradate la concentrații scăzute, dar sunt inhibitoare la concentrație mai mare (hormeză). Este posibil ca efectele inhibitoare să fi fost relevate într-un stadiu mai incipient sau ele pot fi determinate prin aplicarea unui test de toxicitate, cu ajutorul unui inocul similar sau identic cu cel folosit în testul de simulare (1). Astfel de metode sunt inhibarea absorbției de oxigen [capitolul C.11 din prezenta anexă (2) și ISO 8192 (3)] sau inhibarea creșterii organismelor din nămol [ISO 15522 (4)].
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 În testul de simulare, orice inhibiție se va manifesta prin faptul că diferența de carbon organic dizolvat (COD) sau consum chimic de oxigen CCO între efluentul din vasul de testare și cel din vasul de control este mai mare decât COD adăugat ca substanță chimică testată. Exprimat în alt mod, înlăturarea procentuală a COD (și consumul biochimic de oxigen CBO, consumul chimic de oxigen CCO și/sau NH+
                                    4) din mediul organic tratat va scădea în prezența substanței chimice testate. Dacă se întâmplă acest lucru, testul trebuie să fie repetat, reducând concentrația substanței chimice testate până ce se atinge un nivel la care nu apare inhibiția și eventual se reduce concentrația în continuare până ce substanța chimică testată este biodegradată. Totuși, dacă substanța chimică testată (sau apa uzată) are efecte adverse asupra procesului la toate concentrațiile testate, sunt indicii că este dificil, dacă nu chiar imposibil, ca substanța chimică să fie tratată biologic, dar poate ar merita să se repete testul cu nămol activ dintr-o altă sursă și/sau nămolul să fie supus unei aclimatizări mai treptate.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Dimpotrivă, atunci când substanța chimică testată este bioeliminată la prima încercare în testul de simulare, concentrația sa trebuie să fie crescută în cazul în care trebuie să se cunoască dacă substanța chimică ar putea fi inhibitoare.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 La determinarea gradelor de inhibiție, trebuie să se rețină faptul că populația din nămolul activ se poate schimba, astfel încât în timp microorganismele pot dezvolta o toleranță față de substanța chimică inhibitoare.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Calculul gradului de inhibiție:
                                 Procentele generale de înlăturare Ro a CBO, COD, CCO etc. pentru unitățile de testare și de control se pot calcula cu formula:
                                 
                                    
                                 unde:
                                 
                                             I
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația în influent a CBO, COD, CCO etc. pentru vasele de testare sau de control (mg/l)
                                          
                                       
                                             E
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrațiile respective în efluent (mg/l)
                                          
                                       I și E trebuie să fie corectate ținând seama de COD datorate substanței chimice testate din unitățile de testare, altfel calculele inhibiției procentuale vor fi incorecte.
                                 Gradul de inhibiție produs de prezența substanței chimice testate se poate calcula cu formula:
                                 
                                    
                                 unde:
                                 
                                             Rc
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             înlăturare procentuală în vasele de control
                                          
                                       
                                             Rt
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             înlăturare procentuală în vasele de testare
                                          
                                       
                           
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Reynolds L. et al. (1987), Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability, Chemosphere 16: 2259.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Capitolul C.11 din prezenta anexă, «Biodegradare – Nămolul activ: Test de inhibiție a respirației».
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ISO 8192 (2007) Calitatea apei – Test de inhibiție a consumului de oxigen al nămolului activ la oxidarea carbonului și amoniului.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO 15522 (1999) Water Quality – Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
                              
                           
                  
                     Apendicele 5
                     
                        Substanțe chimice testate puțin solubile în apă – substanțe chimice volatile
                     
                     
                        Substanțe chimice puțin solubile în apă
                     
                     Se pare să s-au publicat puține rapoarte privind substanțele chimice puțin solubile și insolubile în apă supuse la teste care simulează tratarea apelor uzate (1) (2) (3).
                     Nu există o metodă unică de dispersie a substanței chimice testate care să poată fi aplicată la toate substanțele chimice insolubile. Două din cele patru tipuri de metode descrise în ISO 10634 (4) par potrivite pentru încercarea de a dispersa substanțele chimice testate pentru testul de simulare; este vorba despre utilizarea agenților de emulsifiere și/sau a energiei ultrasonice. Trebuie să se determine stabilitatea dispersiei rezultate, pe perioade de cel puțin 24 de ore. Apoi, dispersiile stabilizate corespunzător, conținute într-un rezervor cu amestecare continuă (punctul 38), trebuie să fie adăugate într-un vas de aerare, separat de apele uzate menajere (sau sintetice).
                     Dacă dispersiile sunt stabile, se analizează modul în care substanța chimică testată se poate determina în formă dispersată. Este puțin probabil ca COD să fie adecvat, astfel încât trebuie să se stabilească o metodă analitică specifică, ce poate fi aplicată efluenților, substanțelor solide din efluenți și nămolului activ. Evoluția substanței chimice testate în simularea procesului cu nămol activ se determină apoi în fazele lichidă și solidă. Astfel, se stabilește un «bilanț masic» pentru a decide dacă substanța chimică testată a fost biodegradată. Totuși, aceasta ar indica doar biodegradarea primară. Demonstrarea biodegradării finale trebuie să fie încercată prin aplicarea unui test respirometric pentru biodegradabilitate rapidă [capitolul C.4 din prezenta anexă (5) C, F sau D], utilizând ca inocul nămol expus substanței chimice testate în testul de simulare.
                     
                        Substanțe chimice volatile
                     
                     Aplicarea simulărilor privind tratarea apelor uzate la substanțe chimice volatile este în egală măsură discutabilă și problematică. La fel ca în cazul substanțelor chimice testate puțin solubile în apă, s-au publicat foarte puține rapoarte care descriu testele de simulare cu substanțe chimice volatile. Un tip convențional de aparat de amestecare completă este adaptat prin etanșarea vaselor de aerare și decantare, măsurarea și controlul fluxului de aer cu ajutorul unor debitmetre și trecerea gazului evacuat prin separatoare, pentru a colecta materiile organice volatile. În unele cazuri se folosește o pompă de vid pentru extragerea gazului evacuat printr-un separator «rece» sau un separator de purjare care conține Tenax și silicagel pentru analize de cromatografie în fază gazoasă. Substanța chimică testată prezentă în separator poate fi determinată prin metodă analitică.
                     Testul se efectuează în două etape. Mai întâi, unitățile funcționează fără nămol, dar cu apă uzată sintetică plus substanța chimică testată care este pompată în vasul de aerare. Se prelevează probe din influent, efluent și gazul evacuat, care sunt analizate timp de câteva zile pentru determinarea substanței chimice testate. Din datele colectate, se poate calcula procentul (Rvs) din substanța chimică testată eliminată din sistem.
                     Apoi se efectuează testul biologic (cu nămol), în condiții de funcționare identice cu cele din studiul privind striparea. Măsurătorile privind COD sau CCO se fac și pentru a verifica dacă unitățile funcționează eficient. Ocazional, se fac analize pentru a determina substanța chimică testată din influent, efluent și gazul evacuat în prima parte a testului; după aclimatizare se fac analize mai frecvente. Din nou, din datele în starea stabilă, se poate calcula procentul de înlăturare a substanței chimice testate din faza lichidă pentru toate procesele (RT) (fizic și biologic), precum și proporția (RV) eliminată din sistem.
                     Calcul:
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 în testul nebiologic, procentul (RVP) de material de testare eliminat din sistem se poate calcula cu formula:
                                 unde:
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             înlăturarea substanței chimice testate prin volatilizare (%)
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             substanța chimică testată colectată în separator, exprimată ca și concentrație echivalentă în faza lichidă (mg/l)
                                          
                                       
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația de substanță chimică testată în influent (mg/l);
                                          
                                       
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 în testul biologic, procentul (RV) de material de testare eliminat din sistem se poate calcula cu formula:
                                 unde:
                                 
                                             RV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             înlăturarea substanței chimice testate prin volatilizare în testul biologic (%)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             substanța chimică testată colectată în separator în testul biologic, exprimată ca și concentrație echivalentă în influentul lichid (mg/l)
                                          
                                       
                                             SI
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația de substanță chimică testată în influent (mg/l);
                                          
                                       
                           
                                 (c)
                              
                              
                                 în testul biologic, procentul (RT) din substanța chimică testată înlăturată prin toate procesele este calculat cu formula:
                                 unde:
                                 SE= concentrația de substanță chimică testată în efluent (lichid) (mg/l);
                              
                           
                                 (d)
                              
                              
                                 astfel, procentul (RBA) înlăturat prin biodegradare plus adsorbție se poate calcula astfel:
                                 Trebuie să se facă teste separate, pentru a determina dacă substanța chimică testată este adsorbită; dacă da, atunci se poate face o corecție ulterioară;
                              
                           
                                 (e)
                              
                              
                                 o comparație între proporția de substanță chimică testată înlăturată din sistemele de testare biologică (Rv) și nebiologică (Rvp) indică efectul general al tratării biologice asupra emisiei de substanță chimică testată în atmosferă.
                                 
                                             
                                                Exemplu:
                                             
                                          
                                          
                                             Benzen
                                          
                                       Timp de retenție a nămolului = 4 zile
                                 Apă uzată sintetică; timp de retenție = 8 ore
                                 
                                             SIP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             SI = 150 mg/l
                                          
                                       
                                             SVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             150 mg/l (SEP = 0)
                                          
                                       
                                             SV
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             22,5 mg/l
                                          
                                       
                                             SE
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             50 μg/l
                                          
                                       Astfel,
                                 
                                             RVP
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 %, RV = 15 %
                                          
                                       
                                             RT
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             100 % și RBA = 85 %.
                                          
                                       S-a presupus că benzenul nu este adsorbit în nămol.
                              
                           
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Horn J.A., Moyer J.E., Hale J.H. (1970), Biological degradation of tertiary butyl alcohol, Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939854.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Pitter P., Chudoba J. (1990), Biodegradability of organic substances in the aquatic environment, CRC Press. Boston, USA.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Stover E.L., Kincannon D.F. (1983), Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters, J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 ISO 10634 (1995) Calitatea apei. Ghid pentru pregătirea și tratarea compușilor organici greu solubili în apă în vederea evaluării biodegradabilității lor în mediu apos.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Capitolul C.4 din prezenta anexă, «Determinarea biodegradabilității „rapide”».
                              
                           
                  
                     Apendicele 6
                     
                        Efectele timpului de retenție a nămolului (TRN) asupra tratabilității substanțelor chimice
                     
                     INTRODUCERE
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Metoda descrisă în textul principal a fost concepută pentru a verifica dacă substanțele chimice testate (de obicei cele cunoscute ca fiind inerent, dar nu ușor, biodegradabile) pot fi biodegradate în limitele impuse în cadrul stațiilor de epurare a apelor uzate. Rezultatele sunt exprimate ca procent de înlăturare și procent de biodegradare. Condițiile de exploatare a unităților cu nămol activ și alegerea influentului permit variații destul de mari ale concentrației substanței chimice testate în efluent. Testele sunt efectuate doar la o singură concentrație nominală de substanțe solide în nămol sau la un timp nominal de retenție a nămolului (TRN), iar regimurile de înlăturare a surplusului de nămol descrise pot face ca valoarea TRN să varieze considerabil în timpul testului, atât de la o zi la alta, cât și pe durata unei zile.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 În această variantă (1) (2), TRN este controlat în limite mult mai restrânse pe fiecare perioadă de 24 de ore (la fel cum se întâmplă și pe scară largă), ceea ce conduce la o concentrație mai puțin variabilă în efluenți. Se recomandă apa uzată menajeră, întrucât conduce la procente de înlăturare mai mari și mai consecvente. De asemenea, sunt analizate efectele unei serii de valori ale TRN, iar în cadrul unui studiu mai detaliat se pot determina efectele unui interval de temperaturi asupra concentrației efluentului.
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Încă nu s-a ajuns la un consens general privind modelele cinetice care trebuie să fie utilizate în cazul degradării substanțelor chimice în condițiile tratării apelor uzate. S-a utilizat modelul Monod de creștere bacteriană și utilizare a substratului (1) (2), pentru a fi aplicat la datele colectate, întrucât metoda a fost concepută pentru a fi aplicată doar la substanțele chimice produse în cantități mari, ducând la concentrații de peste 1 mg/l în apele uzate. Valabilitatea modelului simplificat și ipotezele adoptate au fost stabilite cu ajutorul unei serii de alcooli etoxilați cu diverse grade de biodegradabilitate primară (2) (3).
                                 
                                             
                                                Notă:
                                             
                                          
                                          
                                             Această variantă de metodă respectă în mare măsură textul metodei de testare din C.10-A, prin urmare în continuare se indică mai jos doar detaliile care diferă.
                                          
                                       
                           PRINCIPIUL TESTULUI
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Unitățile de tip vas poros cu nămol activ, concepute pentru a facilita înlăturarea (aproape) continuă de soluții apoase mixte care permit un control foarte precis al timpului de retenție a nămolului (TRN sau θs), sunt exploatate în regim de instalații necuplate, într-un interval de TRN și – opțional – într-un interval de temperaturi. De obicei, timpul de retenție este cuprins între 2 și 10 zile, iar temperatura între 5 și 20 °C. Apa uzată, de preferință menajeră, și o soluție din substanța chimică testată sunt dozate separat în unități, în ritmul necesar pentru a obține timpul necesar de retenție în apele uzate (3 până la 6 ore) și concentrația necesară a substanței chimice testate în influent. Unitățile de control care nu primesc substanța chimică testată sunt exploatate în paralel, în scop comparativ.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Se pot utiliza și alte tipuri de aparate, dar trebuie să se acorde mare atenție pentru asigurarea unui control corespunzător asupra TRN. De exemplu, atunci când se utilizează instalații cu decantor integrat ar putea fi necesar să se ia în considerare pierderea de substanțe solide prin efluentul instalației. În plus, trebuie să se ia măsuri speciale de precauție pentru a evita erorile datorate variației cantității de nămol în decantor.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Unitățile sunt exploatate la fiecare set de condiții selectat și, după ce s-a atins un echilibru, sunt obținute concentrațiile medii în stare stabilă în efluentul substanței chimice testate și, opțional, COD, pe o perioadă de circa trei săptămâni. În afară de evaluarea procentului de înlăturare a substanței chimice testate și, opțional, a COD, relația dintre condițiile de funcționare în instalație și concentrația în efluent este exprimată în formă grafică. De aici se pot calcula constantele cinetice experimentale și se pot prevedea condițiile în care poate fi tratată substanța chimică testată.
                              
                           INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA CHIMICĂ TESTATĂ
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 12 și 13.
                              
                           NIVELURI DE TRECERE
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 14 și 15.
                              
                           SUBSTANȚA CHIMICĂ DE REFERINȚĂ
                     
                                 9.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctul 16.
                              
                           REPRODUCTIBILITATEA REZULTATELOR TESTĂRII
                     
                                 10.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 17 și 18.
                              
                           DESCRIEREA METODEI
                     
                        Aparatură
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 O unitate adecvată este sistemul cu vas poros modificat (apendicele 6.1). El constă într-un vas interior (sau căptușeală) construit din polipropilenă poroasă de 3,2 mm grosime și cu pori de circa 90 μm diametru, ansamblul fiind sudat în partea inferioară. (Prin această metodă se obține o unitate mai robustă decât cea descrisă la punctul 21 din prezentul capitol C.10 A). Căptușeala este montată într-un vas exterior impermeabil, din polietilenă, format din două părți: o bază circulară în care sunt făcute găuri pentru a permite montarea a două furtunuri de aer și a unui furtun de înlăturare a surplusului de nămol și un cilindru superior care se înșurubează de baza circulară și care are un orificiu de evacuare plasat astfel încât în vasul poros să se obțină un volum cunoscut (3 l). Unul din furtunurile de aer este echipat cu o piatră de difuzare, iar celălalt este deschis la capăt și montat în unghi drept la piatra din vas. Acest sistem produce turbulența necesară pentru a asigura amestecarea completă a conținutului vasului, precum și pentru a obține concentrații de oxigen dizolvat mai mari de 2 mg/l.
                              
                           
                                 12.
                              
                              
                                 Numărul corespunzător de unități este menținut la temperaturi controlate în intervalul de la 5 până la 20 °C (± 1 °C), fie în bazine cu apă, fie în încăperi cu temperatură constantă. Este nevoie de pompe pentru a doza alimentarea vaselor de aerare cu soluția de substanță chimică testată și cu apă uzată decantată la debitele cerute (0-1,0 ml/min, respectiv 0-25 ml/min) și de o a treia pompă pentru a înlătura nămolul rezidual din vasele de aerare. Debitul de curgere foarte scăzut necesar pentru nămolul rezidual este obținut prin utilizarea unei pompe reglate la un debit mai mare și care funcționează intermitent, cu ajutorul unui temporizator, de exemplu timp de 10 secunde pe minut, un debit de pompare de 3 ml/min conducând la o rată de pierdere a surplusului de nămol de 0,5 ml/min.
                              
                           
                        Aparat de filtrare sau centrifugă
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctul 23.
                              
                           
                        Echipamente pentru analiză
                     
                     
                                 14.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctul 24.
                              
                           
                        Apă
                     
                     
                                 15.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 25 și 26.
                              
                           
                        Mediu organic
                     
                     
                                 16.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctul 27.
                              
                           
                        Apă uzată sintetică
                     
                     
                                 17.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctul 28.
                              
                           
                        Apă uzată menajeră
                     
                     
                                 18.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctul 29.
                              
                           
                        Nămol activ
                     
                     
                                 19.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctul 30.
                              
                           
                        Soluții stoc de substanță chimică testată
                     
                     
                                 20.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 31 și 32.
                              
                           PROCEDURĂ
                     
                        Prepararea inoculului
                     
                     
                                 21.
                              
                              
                                 Sunt valabile doar informațiile din capitolul C.10-A, punctul 34 – se folosește nămol activ (circa 2,5 g/l).
                              
                           
                        Număr de unități de testare
                     
                     
                                 22.
                              
                              
                                 Pentru un test simplu, adică de măsurare a procentului de înlăturare, este nevoie de un singur TRN, dar pentru obținerea datelor necesare pentru calculul constantelor cinetice experimentale sunt necesare 4 sau 5 valori. De obicei, se aleg valori cuprinse între 2 și 10 zile. Practic, este convenabil să se facă un test la 4 sau 5 TRN simultan, la o singură temperatură; în studiile extinse, aceleași valori ale TRN sau poate o gamă de valori diferite se utilizează la alte temperaturi în intervalul 5-20 °C. Pentru biodegradarea primară (utilizarea principală), în mod normal este nevoie doar de o singură unitate pentru fiecare set de condiții. Totuși, pentru biodegradabilitatea finală este nevoie, pentru fiecare set de condiții, de o unitate de control care primește apă uzată, dar nu substanță chimică testată. Atunci când se crede că substanța chimică testată este prezentă în apa uzată utilizată, trebuie să se folosească unități de control la evaluarea biodegradării primare și să se facă toate corecțiile necesare în calcule.
                              
                           
                        Dozarea mediului organic și a substanței chimice testate
                     
                     
                                 23.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 36-39, dar trebuie notat faptul că soluția de substanță chimică testată este dozată separat și că se folosesc diverse rate de pierdere a surplusului de nămol. De asemenea, se monitorizează și, dacă este necesar, se ajustează frecvent, de exemplu de două ori pe zi, la circa ± 10 %, debitele de curgere a influenților, efluenților și surplusului de nămol. În cazul în care apar dificultăți în metodele analitice la utilizarea apei uzate menajere, testul se efectuează cu apă uzată sintetică, dar trebuie să se asigure că mediile diferite duc la obținerea unor date cinetice comparabile.
                              
                           
                        Manipularea unităților cu nămol activ
                     
                     
                                 24.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 40 și 43, dar TRN se controlează doar pentru pierderea «constantă» a nămolului.
                              
                           
                        Prelevare de probe și analiză
                     
                     
                                 25.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 44 și 50, cu excepția faptului că este opțională determinarea concentrației de substanță chimică testată și COD; nu trebuie să se utilizeze CCO.
                              
                           DATE ȘI RAPORT
                     
                        Interpretarea rezultatelor
                     
                     
                                 26.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 52-54.
                              
                           
                        Exprimarea rezultatelor testului
                     
                     
                                 27.
                              
                              
                                 Sunt valabile informațiile din capitolul C.10-A, punctele 56-62.
                              
                           
                        Calculul constantelor cinetice
                     
                     
                                 28.
                              
                              
                                 Este mai realist să se menționeze concentrația medie în stare stabilă a substanței chimice testate în efluent și să se descrie modul în care aceasta variază în funcție de condițiile de funcționare în instalație, decât să se menționeze biodegradarea primară procentuală. Aceasta se poate face prin considerarea ecuației 6 din apendicele 6.2, cu care se pot obține valori pentru KS, μm și θSC, timpul critic de retenție a nămolului.
                                 [Ca alternativă, se pot obține valori aproximative de KS și μm cu ajutorul unui program de calculator simplu, pentru a potrivi curba teoretică rezultată din ecuația 2 (apendicele 6.2) cu valorile experimentale obținute. Cu toate că nicio substanță nu este unică, se poate obține o aproximare rezonabilă a KS și μm.]
                              
                           
                        Variabilitatea rezultatelor
                     
                     
                                 29.
                              
                              
                                 S-a observat experimental că pentru substanțe chimice individuale se obțin valori variabile ale parametrilor cinetici. Se consideră că valorile rezultate sunt influențate în mare măsură de condițiile de creștere a nămolului, precum și de condițiile preponderente în testul utilizat (ca la punctul 5 și în alte teste). Un aspect al acestei variabilități a fost discutat de Grady et al. (4), care au sugerat că termenii «extant» și «intrinsec» ar trebui să fie aplicați la două condiții extreme care reprezintă limitele stării fiziologice pe care o poate atinge o cultură în timpul unui experiment cinetic. Atunci când nu este permisă schimbarea stării în timpul testului, valorile parametrului cinetic reflectă condițiile din mediul din care au fost extrase microorganismele; aceste valori sunt numite «extant» sau valori existente în mod curent. La cealaltă extremă, atunci când condițiile de testare permit dezvoltarea completă a sistemului de sintetizare a proteinelor, care să permită o rată de creștere maximă, parametrii cinetici obținuți sunt numiți «intrinseci» și depind doar de natura substratului și de tipurile de bacterii din cultură. Orientativ, valorile extant vor fi obținute prin menținerea la o valoare scăzută a ratei de concentrare a substratului în microorganisme competente (So/Xo), de exemplu la 0,025, iar valorile intrinseci apare atunci când rata este ridicată, de exemplu de cel puțin 20. În ambele cazuri, So trebuie să fie egală sau mai mare decât valoarea relevantă a Ks, constanta de semi-saturare.
                              
                           
                                 30.
                              
                              
                                 Variabilitatea și alte aspecte legate de cinetica biodegradării au fost discutate în cadrul unui grup de lucru recent al SETAC. Din astfel de studii, raportate și proiectate, ar trebui să se contureze o perspectivă mai clară asupra cineticii care funcționează în instalațiile de tratare a apelor uzate, pentru a permite o interpretare mai bună a datelor existente, precum și pentru a sugera conceperea unor metode de testare mai relevante în viitor.
                              
                           
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Birch R.R. (1982), The biodegradability of alcohol ethoxylates, XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33-48.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Birch R.R. (1984), Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340-343.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 Birch R.R. (1991), Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment, J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Grady C.P.L., Smets B.F. and Barbeau D.S. (1996), Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology, Wat. Res., 30 (3): 742-748.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997), Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales S.G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W., 4-6th Sept. 1996. SETAC – Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     Apendicele 6.1
                     
                        Vas poros cu control al TRN
                     
                     
                        
                  
                  
                     Apendicele 6.2
                     
                        Calculul constantelor cinetice
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Pornind de la ipoteza aplicării cineticii Monod și considerând un bilanț masic de substanțe solide active și substrat în sistemul cu nămol activ (1), se pot obține următoarele expresii pentru starea stabilă:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [1]
                                          
                                       sau
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [2]
                                          
                                       unde:
                                 
                                             S1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația de substrat în efluent, (mg/l)
                                          
                                       
                                             KS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             constanta de semi-saturare, concentrația la care μ = μm/2 (mg/l)
                                          
                                       
                                             μ
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             rata specifică de creștere (d–1)
                                          
                                       
                                             μm
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             valoarea maximă a μm(d–1)
                                          
                                       
                                             Kd
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             rata specifică de descompunere a substanțelor solide active (d–1)
                                          
                                       
                                             θS
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             timpul mediu de retenție a nămolului, TRN (d)
                                          
                                       Examinarea acestei ecuații conduce la următoarele concluzii:
                                 
                                             (i)
                                          
                                          
                                             concentrația în efluent nu depinde de cea în influent (S0); prin urmare, procentul de biodegradare variază în funcție de concentrația în influent, S0;
                                          
                                       
                                             (ii)
                                          
                                          
                                             singurul parametru de control al instalației care afectează S1 este timpul mediu de retenție a nămolului, θS;
                                          
                                       
                                             (iii)
                                          
                                          
                                             unei anumite concentrații în influent, S0, îi va corespunde un timp critic de retenție a nămolului, astfel încât:
                                             
                                                         
                                                            
                                                      
                                                      
                                                         [3]
                                                      
                                                   unde:
                                             θSC= timpul critic de retenție a nămolului, sub care microorganismele competente vor fi îndepărtate din instalație de apa care curge;
                                          
                                       
                                             (iv)
                                          
                                          
                                             întrucât ceilalți parametri din ecuația 2 sunt asociați cu cinetica creșterii, temperatura poate afecta nivelul de substrat în efluent, iar vârsta critică a nămolului, adică timpul de retenție a nămolului necesar pentru obținerea unui anumit grad de tratare, ar crește odată cu scăderea temperaturii.
                                          
                                       
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Din bilanțul masic al substanțelor solide în sistemul cu vas poros și în ipoteza că X2, concentrația de substanțe solide în efluent, este scăzută comparativ cu cea din vasul de aerare, X1, timpul de retenție a nămolului.
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [4]
                                          
                                       și
                                 
                                    
                                 unde:
                                 
                                             V
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             volumul vasului de aerare (l)
                                          
                                       
                                             X1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația de substanțe solide în vasul de aerare (mg/l)
                                          
                                       
                                             X2
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația de substanțe solide în efluent (mg/l)
                                          
                                       
                                             Q0
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             debitul influentului (l/zi)
                                          
                                       
                                             Q1
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             debitul de nămol rezidual (l/zi)
                                          
                                       Astfel, se poate controla timpul de retenție a nămolului la orice valoare prestabilită, prin controlul debitului de nămol rezidual, Q1.
                                 Concluzii
                              
                           
                                 3.
                              
                              
                                 Prin urmare, scopul principal al testului este să permită prognozarea concentrației în efluent și astfel a nivelurilor de substanță chimică testată în apele care primesc substanța.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Prin trasarea graficului S1 în funcție de θS, timpul critic de retenție a nămolului, θSC, poate fi evaluat rapid, de exemplu curba 3 din figura 1. Atunci când acest lucru nu este posibil, θSC poate fi calculat, împreună cu valorile aproximative ale μm și KS, prin trasarea graficului S1 în funcție de S1•θS.
                                 Prin rearanjarea ecuației 1 se obține:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [5]
                                          
                                       Atunci când Kd are o valoare mică, 1 + θs · Kd ~1 și [5] devine:
                                 
                                             
                                                
                                          
                                          
                                             [6]
                                          
                                       Astfel, graficul ar trebui să fie o linie dreaptă (a se vedea figura 2) cu panta 1/μm și ordonata la origine KS/μm; de asemenea, θS ~1/μm.
                                 
                                    Figura 1
                                 
                                 
                                    Trei temperaturi; cinci TRN
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Figura 2
                                 
                                 
                                    Linie de regresie TRN · S1 în funcție de S1 la T = 5 °C
                                 
                                 
                                    
                                 
                                    Glosar:
                                 
                                 Concentrație în efluent
                                 Curbă
                              
                           
                  
                     Apendicele 7
                     TESTARE LA CONCENTRAȚII SCĂZUTE (μg/l)
                     
                                 1.
                              
                              
                                 În mod normal, în mediul acvatic sunt prezente multe substanțe chimice, chiar și în apele uzate, la concentrații foarte scăzute (μg/l). La astfel de concentrații probabil ele nu au rol de substraturi primare care conduc la creștere, dar sunt mai multe șanse să se degradeze sub formă de substraturi secundare, care nu determină creșterea, la concurență cu diverse substanțe chimice pe bază de carbon, care apar în mod natural. În consecință, degradările unor astfel de substanțe chimice nu se vor încadra în modelul descris în apendicele 6. Există multe modele care pot fi aplicate și, în condițiile predominante din sistemele de epurare a apelor uzate, pot funcționa simultan mai multe dintre ele. Pentru elucidarea acestei probleme vor fi necesare mult mai multe activități de cercetare.
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Între timp, se poate urma procedura indicată în textul principal (capitolul C.10-A), dar numai pentru biodegradabilitatea primară, folosind concentrații scăzute corespunzătoare (< 100 μg/l) și o procedură analitică validată. Procentul de biodegradare poate fi calculat (a se vedea punctul 54 din metoda de testare), cu condiția să se ia în considerare procesele abiotice (adsorbție, volatilitate etc.). Un exemplu este studiul făcut de Nyholm și asociații săi (1) (2), utilizând un ciclu de 4 ore într-un sistem de încărcare-descărcare. Ei au raportat constante cinetice de pseudo-prim ordin pentru 5 substanțe chimice adăugate într-o apă uzată sintetică, la o concentrație între 5 și 100 μg/l. [Pentru biodegradabilitatea finală se pot utiliza substanțe chimice testate marcate cu C14. O descriere a acestei metode depășește domeniul de aplicare al acestei metode de testare, întrucât nu există încă proceduri agreate, cu toate că o metodă propusă pentru ISO 14592 (3) conține orientări privind utilizarea substanțelor chimice marcate cu C14.]
                              
                           
                        Testul SCAS
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Ulterior s-a propus un test mai simplu, în două etape (4) (5) (6); metoda semicontinuă cu nămol activ (SCAS) este urmată de teste cinetice pe termen scurt pe probe prelevate din unitățile SCAS. Sistemul SCAS funcționează cu rate cunoscute de pierdere a surplusului de nămol (spre deosebire de metoda de testare originală C.12) și este alimentat cu o apă sintetică modificată față de formula indicată de OCDE sau cu apă uzată menajeră. Apa uzată sintetică a fost modificată (din cauza schimbării valorii pH-ului și a capacității scăzute de decantare a nămolului) prin adăugarea de fosfat ca soluție tampon, extract de drojdie, clorură ferică și săruri din microelemente, iar CCO-ul său a fost crescut la circa 750 mg/l, prin creșterea concentrației de peptonă și extract de carne. Instalațiile au funcționat într-un ciclu de 24 de ore: aerare timp de 23 de ore, înlăturarea surplusului de nămol, decantare, extragerea supernatantului (efluent), urmată de adăugarea de apă uzată sintetică plus substanța chimică testată, până la 100 μg/l (adică la aproximativ aceeași concentrație ca cea utilizată în testul de scurtă durată). O dată pe săptămână, 10 % din cantitatea totală de nămol a fost înlocuită cu nămol proaspăt, pentru a menține o populație microbiană echilibrată.
                              
                           
                                 4.
                              
                              
                                 Se măsoară concentrațiile de substanță chimică testată de la început și de la sfârșitul operației de aerare și se continuă testul până ce se ajunge la înlăturarea unei cantități constante de substanță chimică testată; acest proces poate dura de la o săptămână până la câteva luni.
                              
                           
                        Test de scurtă durată
                     
                     
                                 5.
                              
                              
                                 Un test scurt (de exemplu, de 8 ore) se aplică pentru a determina constanta cinetică de (pseudo) prim ordin pentru descompunerea substanței chimice testate în nămolul activ de origini și cu istorice cunoscute, dar diferite. În particular, se prelevează probe de nămol din reactoarele SCAS – la sfârșitul unei perioade aerobe în care concentrația de substrat organic este scăzută – în timpul unui experiment de aclimatizare (punctele 3, 4). De asemenea, nămolul se poate preleva dintr-o instalație paralelă SCAS care nu este expusă substanței chimice testate, pentru comparație. Amestecurile de nămol și substanță chimică testată adăugate la două sau mai multe concentrații în intervalul 1-50 μg/l sunt aerate, fără să se adauge apă uzată sintetică sau un alt substrat organic. Substanța chimică testată care rămâne în soluție se determină la intervale regulate, de exemplu la fiecare oră, în funcție de capacitatea de degradare a substanței chimice, pe o perioadă care să nu depășească 24 de ore. Probele sunt centrifugate înainte de a face analiza corespunzătoare.
                              
                           
                        Calcule
                     
                     
                                 6.
                              
                              
                                 Datele provenite de la instalațiile SCAS sunt utilizate pentru calculul procentului de înlăturare a substanței chimice testate (punctul 54). De asemenea, se poate calcula o constantă de rată medie, K1, (normalizată pentru concentrația de materii solide în suspensie), cu formula:
                                 
                                    
                                 unde:
                                 
                                             t
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             timpul de aerare (23 h)
                                          
                                       
                                             Ce
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația la sfârșitul perioadei de aerare (μg/l)
                                          
                                       
                                             Ci
                                             
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația la începutul perioadei de aerare (μg/l)
                                          
                                       
                                             SS
                                          
                                          
                                             =
                                          
                                          
                                             concentrația de substanțe solide în nămolul activ (g/l)
                                          
                                       
                           
                                 7.
                              
                              
                                 La testul de scurtă durată se trasează curba logaritmică a concentrației (%) în funcție de timp, iar panta părții inițiale (degradare de 10-50 %) a curbei este echivalentă cu K1, constanta cinetică de (pseudo) prim ordin. Constanta este normalizată în funcție de concentrația de substanțe solide în nămol, prin divizarea pantei la concentrația de substanțe solide în nămol. Rezultatul raportat trebuie să includă și detalii privind concentrațiile inițiale ale substanței chimice testate și ale materiilor solide în suspensie, timpul de retenție a nămolului, încărcarea și sursa nămolului, precum și detalii privind expunerea anterioară la substanța chimică testată (dacă este cazul).
                              
                           
                        Variabilitatea rezultatelor
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 Variabilitatea și alte aspecte legate de cinetica biodegradării au fost discutate în cadrul unui grup de lucru recent al SETAC (7). Din astfel de studii, raportate și proiectate, ar trebui să se contureze o perspectivă mai clară asupra cineticii care funcționează în instalațiile de tratare a apelor uzate, pentru a permite o interpretare mai bună a datelor existente, precum și pentru a sugera conceperea unor metode de testare mai relevante în viitor.
                              
                           
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     
                                 (1)
                              
                              
                                 Nyholm N., Jacobsen B.N., Pedersen B.M., Poulsen O., Dambourg A. și Schultz B. (1992), Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors, Biodegradability Wat. Res. 26: 339-353.
                              
                           
                                 (2)
                              
                              
                                 Jacobsen B.N., Nyholm N., Pedersen B.M., Poulsen O. și Ostfeldt P. (1993), Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption, Wat. Res. 27: 1505-1510.
                              
                           
                                 (3)
                              
                              
                                 ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998), Water Quality – Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.
                              
                           
                                 (4)
                              
                              
                                 Nyholm N., Ingerslev F., Berg U.T., Pedersen J.P. și Frimer-Larsen H. (1996), Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864.
                              
                           
                                 (5)
                              
                              
                                 Berg U.T. și Nyholm N. (1996), Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations, Chemosphere 33 (4): 711-735.
                              
                           
                                 (6)
                              
                              
                                 Danish Environmental Protection Agency (1996), Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm N., Berg U.T., Ingerslev F., Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
                              
                           
                                 (7)
                              
                              
                                 Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales S.G., Feitjel T., King H., Fox K., și Verstraete W., 4-6th Sept. 1996. SETAC – Europe, Brussels.
                              
                           
                  
                     C.10-B:   Biopelicule
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              În mod normal, testele de simulare se aplică la substanțele chimice care nu au trecut testul de screening pentru biodegradabilitate rapidă [capitolul C.4 A-F din prezenta anexă (9)], dar au trecut testul pentru biodegradabilitate intrinsecă. În mod excepțional, se aplică teste de simulare și la orice substanțe chimice despre care sunt necesare mai multe informații, în special cele de mare tonaj, și în mod normal se aplică testul cu nămol activ (C.10-A). În unele situații, totuși, este nevoie de informații specifice referitoare la comportamentul unei substanțe chimice față de metodele de epurare a apelor uzate care presupun utilizarea de biopelicule, mai precis filtre de percolare, contactori biologici rotativi, straturi fluidizate. Pentru îndeplinirea acestei cerințe au fost dezvoltate diverse dispozitive.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Gerike et al. (1) au folosit filtre de percolare mari, la scară pilot, pe care le-au utilizat în regim cu instalații cuplate. Aceste filtre ocupau mult spațiu și aveau nevoie de volume relativ mari de apă uzată sau apă uzată sintetică. Truesdale et al. (2) au descris filtre mai mici (diametru 6 picioare și 6 țoli), care au fost alimentate cu apă uzată naturală fără agenți tensioactivi, dar încă mai era nevoie de volume relativ mari. A fost nevoie de nu mai puțin de 14 săptămâni pentru dezvoltarea unei biopelicule «mature» și încă 4-8 săptămâni după prima introducere de agent tensioactiv de testare, înainte să aibă loc aclimatizarea.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Baumann et al. (3) au dezvoltat un filtru mult mai mic, care folosea material din poliester tip «fleece», scufundat în prealabil în nămol activ, ca mediu inert de suport al biopeliculei. Substanța chimică testată a fost utilizată ca sursă unică de carbon, iar biodegradabilitatea a fost evaluată din măsurătorile carbonului organic dizolvat (COD) în influent și în efluent, precum și din cantitatea de CO2 din gazul evacuat.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              O abordare destul de diferită a fost cea adoptată de Gloyna et al. (4), care au inventat reactorul tubular rotativ. Pe fața internă a tubului rotativ a crescut o biopeliculă pe suprafața cunoscută, prin trecerea unui influent introdus prin partea superioară a tubului, înclinat la un unghi mic față de orizontală. Reactorul a fost utilizat pentru a studia biodegradabilitatea agenților tensioactivi (5), precum și pentru a analiza grosimea optimă a biopeliculei și difuzarea prin peliculă (6). Acești din urmă autori au dezvoltat în continuare reactorul, inclusiv prin modificarea sa pentru a putea determina nivelul de CO2 în gazul evacuat.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Reactorul tubular rotativ a fost adoptat de Comitetul permanent al analiștilor (Regatul Unit), ca metodă standard de evaluare atât a biodegradabilității substanțelor chimice (7), cât și a tratabilității și toxicității apelor uzate (8). Metoda descrisă aici prezintă avantajul de a fi simplă, compactă, reproductibilă și de a avea nevoie de volume de mediu organic relativ mici.
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              6.
                           
                           
                              Apa uzată sintetică și menajeră și substanța chimică testată, în amestec sau separat, sunt aplicate pe suprafața internă a unui tub înclinat cu rotație lentă. Pe suprafața internă se dezvoltă un strat de microorganisme, similar cu cel prezent pe mediile de biofiltrare. Condițiile de funcționare a reactorului sunt alese pentru a asigura o eliminare corespunzătoare a materiei organice și, dacă este necesar, oxidarea amoniului.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Se colectează efluentul din tub și se decantează și/sau se filtrează înainte de analiza pentru determinarea carbonului organic dizolvat (COD) și/sau a substanței chimice testate, printr-o metodă specifică. Unitățile de control care nu primesc substanța chimică testată sunt exploatate în paralel, în aceleași condiții, în scop comparativ. Se consideră că diferența dintre concentrațiile de COD din influent în unitățile de testare și de control este datorată substanței chimice testate și metaboliților săi organici. Diferența este comparată cu concentrația substanței chimice testate adăugate (exprimată ca COD), pentru a determina eliminarea substanței chimice testate.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              În mod normal, se poate face distincția între biodegradare și bioadsorbție, prin examinarea atentă a curbei eliminare-timp. De obicei, confirmarea se poate obține prin aplicarea unui test de biodegradare rapidă (absorbție de oxigen sau producție de dioxid de carbon), folosind un inocul aclimatizat, prelevat la sfârșitul testului din reactoarele care primesc substanța chimică testată.
                           
                        INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA CHIMICĂ TESTATĂ
                  
                              9.
                           
                           
                              Pentru o interpretare corectă a rezultatelor, trebuie să se cunoască puritatea, solubilitatea în apă, volatilitatea și caracteristicile de adsorbție ale substanței chimice testate.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              În mod normal, substanțele chimice volatile și puțin solubile nu pot fi testate dacă nu se iau măsuri speciale de precauție (a se vedea apendicele 5 din capitolul C.10-A). Trebuie să se cunoască structura chimică sau cel puțin formula empirică, pentru a calcula valorile teoretice și/sau pentru a verifica valorile măsurate ale parametrilor, de exemplu consumul teoretic de oxigen (CTO), COD.
                           
                        
                              11.
                           
                           
                              Informațiile legate de toxicitatea substanței chimice testate asupra microorganismelor (a se vedea apendicele 4 din capitolul C.10-A) pot fi utile pentru alegerea concentrațiilor de testare adecvate și se pot dovedi esențiale pentru interpretarea corectă a valorilor de biodegradare scăzute.
                           
                        NIVELURI DE TRECERE
                  
                              12.
                           
                           
                              Inițial, a fost necesar ca biodegradarea primară a agenților tensioactivi să ajungă la cel puțin 80 % înainte ca substanța chimică să poată fi comercializată. În cazul în care nu se atinge valoarea de 80 %, testul de simulare (de confirmare) poate fi aplicat, iar agentul tensioactiv se poate comercializa numai dacă s-a înlăturat mai mult de 90 % din substanța chimică specifică. În general, la substanțele chimice nu se pune problema de a trece sau a nu trece testul, iar valoarea înlăturării procentuale obținute poate fi utilizată în calcule aproximative ale concentrației probabile în mediu ce urmează să fie folosită în evaluarea riscurilor implicate de substanțe chimice. Într-o serie de studii privind substanțe chimice pure, s-a constatat că procentul de înlăturare a COD era > 90 % în mai mult de trei sferturi și > 80 % în peste 90 % din substanțele chimice, ceea ce a indicat un grad semnificativ de biodegradabilitate.
                           
                        SUBSTANȚE CHIMICE DE REFERINȚĂ
                  
                              13.
                           
                           
                              Pentru a asigura executarea corectă a procedurii experimentale, ocazional este util să se testeze substanțe chimice de referință, cu comportament cunoscut. Printre aceste substanțe se numără acidul adipic, 2-fenil-fenolul, 1-naftolul, acidul difenic și acidul 1-naftoic.
                           
                        REPRODUCTIBILITATEA REZULTATELOR TESTĂRII
                  
                              14.
                           
                           
                              Un laborator din Regatul Unit a constatat că deviația standard relativă în cadrul testelor este de 3,5 %, iar între teste este de 5 % (7).
                           
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Aparatură
                  
                  
                     Reactoare tubulare rotative
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Aparatul (a se vedea figurile 1 și 2 din apendicele 8) este format dintr-o baterie de tuburi acrilice, fiecare cu lungime de 30,5 cm și cu diametru interior de 5 cm, care se sprijină pe roți cauciucate, montate într-un cadru de susținere metalic. Fiecare tub are o muchie exterioară, cu o adâncime de circa 0,5 cm, pentru a fi fixat pe roți, suprafața externă este înăsprită cu burete din sârmă, iar la capătul superior (de alimentare) este prevăzut cu o margine internă adâncă, cu rol de reținere a lichidului. Tuburile sunt înclinate la un unghi de aproximativ un grad față de orizontală, pentru a obține timpul de contact necesar atunci când mediul de testare este aplicat la un tub curat. Roțile cauciucate sunt rotite cu ajutorul unui motor cu viteză variabilă, lentă. Temperatura tuburilor este controlată prin instalarea într-o încăpere cu temperatura constantă.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Prin includerea fiecărui reactor tubular într-un tub ceva mai mare, acoperit, și asigurând etanșeitatea conexiunilor împotriva scurgerilor de gaze, gazul CO2 evacuat poate fi colectat într-o soluție alcalină, pentru a fi măsurat ulterior (6).
                           
                        
                              17.
                           
                           
                              Într-un vas de alimentare de 20 l se pune volumul de mediu organic necesar pentru 24 h, pentru fiecare tub, la care se adaugă substanța chimică testată, dacă este cazul. Dacă este necesar, soluția de substanță chimică testată poate fi dozată separat. Aproape de baza fiecărui vas de alimentare se află un orificiu de evacuare, conectat, prin tuburi adecvate (de exemplu, din cauciuc siliconic) și printr-o pompă peristaltică (B) la un tub de alimentare care pătrunde 2-4 cm în capătul superior (de alimentare) al tubului inclinat (C). Efluentul se lasă să se scurgă din partea inferioară a tubului înclinat, pentru a fi colectat într-un alt vas de alimentare (D). Înainte de analiză, efluentul se decantează sau se filtrează.
                           
                        
                     Aparat de filtrare – centrifugă
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Dispozitiv de filtrare a probelor, cu filtre cu membrană de porozitate corespunzătoare (diametrul deschiderii nominale de 0,45 μm), care adsorb substanțele chimice organice solubile sau eliberează carbon organic la un nivel minim. Atunci când se utilizează filtre care eliberează carbon organic, ele trebuie să fie spălate cu grijă cu apă caldă, pentru a înlătura carbonul organic lixiviabil. Se poate utiliza și o centrifugă care poate asigura o accelerație de 40 000 m/s2.
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Echipamente de analiză pentru a determina:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          COD/carbonul organic total (COT) sau consumul chimic de oxigen (CCO);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          substanțe chimice specifice (HPLC, GC etc.) dacă este necesar;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pH-ul, temperatura, aciditatea și alcalinitatea;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          conținutul de amoniu, nitriți și nitrați, în cazul în care testele se fac în condiții de nitrificare.
                                       
                                    
                        
                     Apă
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Apă de la robinet, cu conținut de COD mai mic de 3 mg/l.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Apă distilată sau deionizată, cu conținut de COD mai mic de 2 mg/l.
                           
                        
                     Mediu organic
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Ca mediu organic se poate utiliza apă uzată sintetică, apă uzată menajeră sau un amestec din cele două. S-a demonstrat că numai prin utilizarea apei uzate menajere se ajunge la un procent crescut de eliminare a COD (în instalațiile cu nămol activ) și chiar se permite biodegradarea unor substanțe chimice care nu sunt biodegradate atunci când se utilizează apa uzată sintetică indicată de OCDE. Astfel, se recomandă utilizarea apei uzate menajere. Trebuie să se măsoare concentrația de COD (sau CCO) în fiecare lot nou de mediu organic. Trebuie să se cunoască aciditatea sau alcalinitatea mediului organic. În cazul în care mediul organic are o aciditate sau alcalinitate scăzută, ar putea fi necesar să se adauge o soluție tampon corespunzătoare (bicarbonat de sodiu sau fosfat monoacid de potasiu), pentru a menține un pH de circa 7,5 ± 0,5 în reactor în timpul testului. Cantitatea de soluție tampon, precum și momentul adăugării sale se decid pentru fiecare caz în parte.
                           
                        
                     Apă uzată sintetică
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              În fiecare litru de apă de la robinet se dizolvă: peptonă, 160 mg; extract de carne, 110 mg; uree, 30 mg; fosfat acid de di-potasiu anhidru (K2HPO4), 28 mg; clorură de sodiu (NaCl), 7 mg; clorură de calciu dihidrat (CaCl2.2H2O), 4 mg; sulfat de magneziu heptahidrat, (MgSO4.7H20), 2 mg. Această apă uzată sintetică din testele OCDE este un exemplu și indică o concentrație medie a COD în influent, de circa 100 mg/l. Ca metodă alternativă, se pot utiliza alte compoziții, cu aproximativ aceleași concentrații de COD, care sunt mai apropiate de apele uzate reale. Această apă uzată sintetică poate fi produsă din apă distilată într-o formă concentrată și poate fi depozitată la circa 1 °C până la o săptămână. Atunci când este nevoie să fie utilizată, se diluează cu apă de la robinet. (Acest mediu nu este satisfăcător, de exemplu concentrația de azot este foarte mare, conținutul de carbon este relativ scăzut, dar nu s-a sugerat o altă metodă mai bună, cu excepția adăugării unei cantități mai mari de fosfat, ca soluție tampon, și creșterii procentului de peptonă.)
                           
                        
                     Apă uzată menajeră
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Se utilizează apă uzată proaspătă decantată, colectată zilnic dintr-o instalație de tratare care primește în special apă uzată menajeră. Apa trebuie să fie colectată din canalul deversor al rezervorului de sedimentare primară sau din alimentarea instalației de nămol activ și trebuie să fie, în mare măsură, lipsită de particule grosiere. Apa uzată poate fi utilizată după ce a fost depozitată timp de mai multe zile la circa 4 °C, dacă s-a dovedit că COD (sau CCO) nu a scăzut în mod semnificativ (adică la mai puțin de 20 %) în timpul perioadei de depozitare. Pentru a limita perturbațiile aduse sistemului, COD (sau CCO) din fiecare lot nou trebuie să fie ajustat înainte de utilizare la o valoare constantă adecvată, de exemplu prin diluarea cu apă de la robinet.
                           
                        
                     Lubrifiant
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Pentru lubrifierea rolelor de ghidare de la pompa peristaltică se poate utiliza glicerină sau ulei de măsline; ambele fiind adecvate pentru tuburile din cauciuc siliconic.
                           
                        
                     Soluții stoc de substanță chimică testată
                  
                  
                              26.
                           
                           
                              Pentru substanțe chimice cu solubilitate adecvată, se prepară soluții stoc de concentrații corespunzătoare (de exemplu, de la 1 până la 5 g/l) în apă deionizată sau în partea minerală a apei uzate sintetice. Pentru substanțele chimice insolubile, a se vedea apendicele 5 din capitolul C.10-A. Această metodă nu este potrivită pentru substanțe chimice volatile dacă nu se fac modificări la reactoarele tubulare (punctul 16). Se determină COD și COT din soluția stoc și se repetă măsurătorile pentru fiecare lot nou. În cazul în care diferența dintre COD și COT este mai mare de 20 %, se verifică solubilitatea în apă a substanței chimice testate. Se compară COD sau concentrația substanței chimice testate măsurate prin analiza specifică a soluției stoc cu valoarea nominală, pentru a verifica dacă recuperarea este suficient de bună (în mod normal se poate aștepta o valoare > 90 %). Se verifică, în special pentru dispersii, dacă COD poate fi utilizat sau nu ca parametru analitic sau dacă se poate utiliza doar o tehnică de analiză specifică pentru substanța chimică testată. Pentru dispersii este necesară centrifugarea probelor. Pentru fiecare lot nou se măsoară COD, CCO ale substanței chimice testate printr-o analiză specifică.
                           
                        
                              27.
                           
                           
                              Se determină pH-ul soluției stoc. Valorile extreme indică faptul că adăugarea substanței chimice poate avea o influență asupra pH-ului nămolului activ în sistemul de testare. În acest caz, soluția stoc se neutralizează, pentru a obține un pH de 7 ± 0,5, cu mici cantități de acid sau bază anorganică, dar se evită precipitarea substanței chimice testate.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Prepararea mediului organic pentru dozare
                  
                  
                              28.
                           
                           
                              Se asigură curățarea temeinică a tuturor recipientelor pentru influent și efluent și a tuburilor de la vasele pentru influent și către vasele pentru efluent, pentru a înlătura creșterea microbiană inițială și pe parcursul testului.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Apa uzată sintetică (punctul 23) se prepară proaspăt în fiecare zi, fie din substanțe solide, fie din soluția stoc concentrată, prin diluare corespunzătoare cu apă de la robinet. Cantitatea necesară se măsoară într-un cilindru și se adaugă într-un vas curat pentru influent. De asemenea, atunci când este nevoie, la apa uzată sintetică se adaugă, înainte de diluare, cantitatea necesară de soluție stoc din substanța chimică testată sau substanța chimică de referință. Dacă este mai convenabil sau dacă este necesar pentru evitarea pierderilor de substanță chimică testată, într-un rezervor separat se prepară o soluție diluată separată din substanța chimică testată, care este distribuită în tuburile înclinate printr-o altă pompă de dozare.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Ca soluție alternativă (și preferabilă), se poate utiliza apă uzată menajeră decantată (punctul 24), proaspăt colectată în fiecare zi, dacă este posibil.
                           
                        
                     Funcționarea reactoarelor tubulare rotative
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Pentru evaluarea unei substanțe chimice testate este nevoie de două reactoare tubulare identice; ele sunt asamblate într-o încăpere cu temperatură constantă, în mod normal la 22 ± 2 °C.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Pompele peristaltice se reglează pentru a debita 250 ± 25 ml/h de mediu organic (fără substanță chimică testată) în tuburile înclinate, care sunt rotite la o viteză de 18 ± 2 rpm. Lubrifiantul (punctul 25) se aplică la tuburile pompei la început și periodic, pe întreaga durată a testului, pentru a asigura funcționarea corespunzătoare și pentru a prelungi viața tuburilor.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Se reglează unghiul de înclinare a tuburilor la orizontală, în vederea obținerii unui timp de rezidență de 125 ± 12,5 secunde, pentru alimentarea într-un tub curat. Se estimează timpul de retenție prin adăugarea unui marker nebiologic (de exemplu, NaCl, vopsea inertă) la alimentare: timpul necesar pentru a atinge concentrația maximă în efluent este considerat ca fiind timpul mediu de retenție (atunci când pelicula este la grosime maximă, timpul de retenție poate crește până la circa 30 de minute).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              S-a constatat că aceste debite, viteze și timpi conduc la procente adecvate de înlăturare a COD (sau CCO) (> 80 %) și determină obținerea de efluenți nitrificați. Debitul de curgere trebuie să fie modificat în cazul în care înlăturarea este insuficientă sau dacă trebuie să fie simulată performanța unei anumite instalații de tratare. În acest din urmă caz se ajustează debitul de dozare a mediului organic până ce performanța reactorului este egală cu cea a instalației de tratare.
                           
                        
                     Inoculare
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Inocularea pe calea aerului poate fi suficientă pentru a începe creșterea microorganismelor, atunci când se utilizează apa uzată sintetică; în alte situații, se adaugă 1 ml/l de apă uzată decantată, timp de 3 zile.
                           
                        
                     Măsurători
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              La intervale regulate se verifică dacă debitele de dozare și vitezele de rotație se încadrează în limitele necesare. De asemenea, se măsoară pH-ul efluentului, în special atunci când este de așteptat să apară nitrificarea.
                           
                        
                     Prelevare de probe și analiză
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Metoda, tiparul și frecvența de prelevare a probelor sunt alese pentru a corespunde scopului testului. De exemplu, se prelevează probe instantanee din influent și din efluent sau se colectează probe pe o perioadă mai lungă, de exemplu 36 de ore. În prima perioadă, fără substanța chimică testată, se prelevează probe de două ori pe săptămână. Probele se filtrează prin membrane sau se centrifughează la circa 40 000 m/sec2, timp de aproximativ 15 minute (punctul 18). Poate fi necesară decantarea probelor și/sau trecerea lor printr-un filtru cu pietriș înainte de filtrarea prin membrană. Se determină COD (sau CCO) cel puțin de două ori și, dacă este necesar, CBO, conținutul de amoniu și nitrit/nitrat.
                           
                        
                              38.
                           
                           
                              Toate analizele trebuie să fie efectuate imediat ce este posibil, după colectarea și pregătirea probelor. În cazul în care trebuie să se amâne analizele, probele se depozitează la 4 °C, la întuneric, în sticle pline, închise etanș. Atunci când probele trebuie să fie depozitate mai mult de 48 de ore, ele se conservă prin congelare, acidifiere sau prin adăugarea unei substanțe toxice adecvate [de exemplu, 20 ml/l dintr-o soluție de clorură de mercur (II) în concentrație de 10 g/l]. Se asigură că tehnica de conservare nu influențează rezultatul analizei.
                           
                        
                     Perioada de pornire
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              În această perioadă, biopelicula de suprafață crește până ajunge la o grosime optimă, perioadă care durează de obicei 2 săptămâni și nu trebuie să depășească 6 săptămâni. Gradul de înlăturare (punctul 44) a COD (sau CCO) crește și atinge o valoare de platou. Atunci când nivelul de platou a ajuns la o valoare similară în ambele tuburi, unul dintre ele este selectat ca martor în restul testului, timp în care funcționarea sa trebuie să se mențină în aceiași parametri.
                           
                        
                     Introducerea substanței chimice testate
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              În această etapă se adaugă substanța chimică testată la celălalt reactor, în concentrația necesară, de obicei 1 020 mg C/l. Tubul martor continuă să primească doar mediul organic.
                           
                        
                     Perioada de aclimatizare
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Analizele pentru COD (sau CCO) continuă de două ori pe săptămână și, în cazul în care trebuie să se evalueze biodegradabilitatea primară, se măsoară concentrația substanței chimice testate prin analiză specifică. Pentru apariția aclimatizării este nevoie să treacă o perioadă de una până la șase săptămâni (sau mai mult, în condiții specifice) după prima introducere a substanței chimice testate. Atunci când procentul de înlăturare (punctele 43-45) atinge o valoare maximă, trebuie să se obțină 12-15 valori valabile în faza de platou, timp de circa 3 săptămâni, pentru evaluarea procentului mediu de înlăturare. Testul se consideră complet atunci când s-a atins un grad de eliminare suficient de mare. În mod normal, durata testului nu trebuie să depășească 12 săptămâni de la prima introducere a substanței chimice testate.
                           
                        
                     Desprinderea peliculei
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Înlăturarea bruscă a unor cantități mari de peliculă în exces din tuburi, numită desprindere, are loc la intervale relativ regulate. Pentru a asigura că nu este afectat caracterul comparabil al rezultatelor, testele trebuie să acopere cel puțin două cicluri complete de creștere și desprindere.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Interpretarea rezultatelor
                  
                  
                              43.
                           
                           
                              Se calculează procentul de eliminare a COD (sau CCO) din substanța chimică testată, pentru fiecare evaluare într-un interval de timp, cu ecuația:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          Dt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          procent de eliminare a COD (sau CCO) la momentul t
                                       
                                    
                                          Cs
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentrația de COD (sau CCO) în influent, datorită substanței chimice testate, de preferință estimată din concentrația în soluția stoc și volumul adăugat (mg/l)
                                       
                                    
                                          E
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          valoarea COD (sau CCO) măsurată în efluentul de testare la momentul t (mg/l)
                                       
                                    
                                          Eo
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          valoarea COD (sau CCO) măsurată în efluentul de control la momentul t (mg/l)
                                       
                                    Calculul se repetă pentru substanța chimică de referință, dacă este testată.
                           
                        
                     Funcționarea reactorului martor
                  
                  
                              44.
                           
                           
                              Gradul de eliminare a COD (sau CCO) (DB) din mediul organic în reactoarele martor este o informație utilă pentru evaluarea activității de biodegradare a biopeliculei în timpul testului. Se calculează procentul de eliminare cu ecuația:
                              
                                 
                              unde:
                              Cm= valoarea COD (sau CCO) a mediului organic în influentul de control (mg/l)
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Se calculează înlăturarea (DST) substanței chimice testate, dacă este măsurată, cu o metodă analitică specifică la fiecare evaluare temporală, cu ecuația:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          Si
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentrația măsurată sau, de preferință, estimată a substanței chimice testate în influentul de testare (mg/l)
                                       
                                    
                                          Se
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentrația de substanță chimică testată măsurată în efluentul de testare la momentul t (mg/l)
                                       
                                    În cazul în care metoda analitică indică o valoare pozitivă în apa uzată nemodificată echivalentă cu S
                                    c
                                  mg/l, se calculează procentul de eliminare (DSC), cu formula:
                              
                                 
                           
                        
                     Exprimarea rezultatelor testului
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Se trasează graficul eliminării procentuale D
                                    t
                                  și DST (sau DSC, dacă este disponibilă), în funcție de timp (a se vedea apendicele 2 din capitolul C.10-A). Se calculează media (rotunjită la cel mai apropiat număr întreg) și deviația standard ale celor 12-15 valori pentru DT (și pentru DST, dacă este disponibilă) obținute în faza de platou, ca procent de eliminare a substanței chimice testate. Din forma curbei de eliminare se pot trage unele concluzii privind procesele de eliminare.
                           
                        
                     Adsorbție
                  
                  
                              47.
                           
                           
                              Dacă la începutul testului se observă un nivel ridicat de eliminare a COD din substanța chimică testată, probabil că substanța chimică testată este eliminată prin adsorbție pe biopeliculă. Acest lucru poate fi dovedit prin determinarea substanței chimice testate adsorbite pe solidele desprinse de pe peliculă. Nu este uzual ca nivelul de eliminare a COD din substanțele chimice adsorbabile să rămână ridicat pe toată durata testului; în mod normal, eliminarea este mai pronunțată la început, iar apoi scade treptat până la o valoare de echilibru. Totuși, dacă substanța chimică testată adsorbabilă a putut conduce la aclimatizarea populației microbiene, gradul de eliminare a COD din substanța chimică testată ar urma să crească ulterior, ajungând la o valoare de platou ridicată.
                           
                        
                     Fază de latență
                  
                  
                              48.
                           
                           
                              La fel ca în cazul testelor statice de screening, pentru multe substanțe chimice testate este nevoie de o fază de latență înainte de apariția biodegradării totale. În faza de latență, aclimatizarea (sau adaptarea) bacteriilor competente are loc aproape fără nicio eliminare din substanța chimică testată; apoi apare creșterea inițială a acestor bacterii. Această fază se încheie, iar faza de degradare se consideră că începe, în mod arbitrar, atunci când este înlăturată circa 10 % din cantitatea totală de substanță chimică testată (după ce se lasă timp pentru adsorbție, dacă apare). Faza de latență este adesea foarte variabilă și slab reproductibilă.
                           
                        
                     Fază de platou
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Faza de platou a unei curbe de eliminare dintr-un test continuu este definită ca fiind faza în care are loc degradarea maximă. Faza de platou trebuie să dureze cel puțin 3 săptămâni și să conțină circa 12-15 valori măsurate valabile.
                           
                        
                     Grad mediu de eliminare a substanței chimice testate
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Se calculează valoarea medie din valorile de eliminare Dt (și Dst, dacă este disponibilă) ale substanței chimice testate în faza de platou. Rotunjit la cel mai apropiat număr întreg (1 %), reprezintă gradul de eliminare a substanței chimice testate. De asemenea, se recomandă calcularea intervalului de încredere de 95 % pentru valoarea medie. În mod similar, se calculează gradul mediu (DB) de eliminare a mediului organic în vasul de control.
                           
                        
                     Indicarea biodegradării
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Dacă substanța chimică testată nu se adsoarbe în mod semnificativ pe biopeliculă și curba de eliminare are forma tipică a unei curbe de biodegradare cu faze de latență, degradare și platou (punctele 48, 49), eliminarea măsurată poate fi atribuită fără ezitare biodegradării. Dacă are loc o înlăturare inițială, testul de simulare nu poate face diferența între procesele de eliminare biologică și abiotică. În asemenea cazuri, precum și în alte cazuri în care există dubii privind biodegradarea (de exemplu, dacă are loc procesul de stripare), se analizează substanțele chimice testate adsorbite sau se efectuează teste statice (de screening) suplimentare pentru biodegradare, pe baza parametrilor care indică în mod clar procese biologice. Astfel de teste sunt metodele de absorbție de oxigen (capitolul C.4 D, E și F din prezenta anexă) (9) sau un test prin care se măsoară producția de CO2 (capitolul C.4 C din prezenta anexă sau metoda Headspace) (10); ca inocul, se folosește biopeliculă preexpusă de la reactorul corespunzător.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Dacă s-au măsurat atât eliminarea COD, cât și eliminarea substanței chimice specifice, diferențele semnificative (prima fiind mai scăzută decât a doua) dintre procentele eliminate indică prezența de produse organice intermediare în efluenți, care pot fi mai dificil de degradat; acestea trebuie să fie analizate.
                           
                        
                     Validarea rezultatelor testelor
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Testul este considerat valabil dacă gradul de eliminare a COD (sau CCO) (DB) în unitățile de control este > 80 % după două săptămâni și nu s-au înregistrat observații neobișnuite.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              În cazul în care s-a testat o substanță chimică ușor biodegradabilă (de referință), gradul de biodegradare trebuie să fie > 90 %, iar diferența dintre valorile pentru probe duplicat să nu fie mai mare de 5 %. Atunci când nu se respectă aceste două criterii, se revizuiesc procedurile experimentale și/sau se obține apă uzată menajeră din altă sursă.
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Similar, diferențele dintre valorile de biodegradare de la unitățile duplicat (dacă se utilizează) care tratează o substanță chimică testată nu trebuie să difere cu mai mult de 5 %. Dacă nu se îndeplinește acest criteriu, dar procentele de eliminare sunt mari, se continuă analiza timp de trei săptămâni. În cazul în care gradul de eliminare este scăzut, se analizează efectele inhibitoare ale substanței chimice testate, dacă nu sunt cunoscute, și se repetă testul la o concentrație mai scăzută de substanță chimică testată, dacă acest lucru este posibil.
                           
                        
                     Raport de testare
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      date de identificare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică și, dacă sunt relevante, proprietățile fizico-chimice.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orice modificări ale sistemului de testare, în special atunci când se testează substanțe insolubile sau volatile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tipul mediului organic;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      proporția și natura apelor reziduale industriale prezente în apele uzate, dacă sunt utilizate și dacă se cunosc;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de inoculare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      conținutul de COD (carbon organic dizolvat) și COT (carbon organic total) în soluția stoc de substanță chimică testată; modul de preparare, dacă este în suspensie; concentrația (concentrațiile) de testare, motivul, dacă COD este în afara domeniului 10-20 mg/l; metoda de adăugare; data primei adăugări; orice modificări ale concentrației;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      timpul mediu de retenție hidraulică (fără creștere); viteza de rotație a tubului; unghiul de înclinare aproximativ, dacă este posibil;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind desprinderea; durata și intensitatea;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura și domeniul de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tehnicile de analiză utilizate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatele testului:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate datele măsurate pentru COD, CCO, analize specifice, pH, temperatură, substanțe azotoase, dacă sunt relevante;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      toate datele calculate privind Dt (sau Dtc), DB, Ds obținute în formă de tabel și curbe de eliminare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații privind fazele de latență și platou, durata de testare, gradul de eliminare a substanței chimice testate, a substanței chimice de referință (dacă este testată) și a mediului organic (în unitatea de control), împreună cu informații statistice și specificații privind biodegradabilitatea și valabilitatea testului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea rezultatelor.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Gerike P., Fischer W., Holtmann W. (1980), Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test, Wat. Res. 14: 753758.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Truesdale G.A., Jones K., Vandyke K.G. (1959), Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material, Wat. Waste Tr. J. 7: 441444.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Baumann U., Kuhn G. and Benz M. (1998), Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Gloyna E.F., Comstock R.F., Renn C.E. (1952), Rotary tubes as experimental trickling filters, Sewage ind. Waste 24: 13551357.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Kumke G.W., Renn C.E. (1966), LAS removal across an institutional trickling filter, JAOCS 43: 9294.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Tomlinson T.G., Snaddon D.H.M. (1966), Biological oxidation of sewage by films of microorganisms, Int. J. Air Wat. Pollut. 10: 865881.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1982), Methods for the examination of waters and associated materials, Assessment of biodegradability, 1981, London.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Her Majesty’s Stationery Office (1984), Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Capitolul C.4 din prezenta anexă, «Determinarea biodegradabilității „rapide”», A-F.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              ISO 14593 (1998), Calitatea apei. Evaluarea în mediu apos a biodegradabilității aerobe ultime a compușilor organici. Metoda prin analiza carbonului anorganic în vase închise ermetic (Încercare cu CO2 în spațiul superior).
                           
                        
                     Apendicele 8
                     
                        Figura 1
                     
                     
                        Tuburi rotative
                     
                     
                        
                     
                        Glosar:
                     
                     Vedere în plan
                     Vedere A/B
                     Roți conduse
                     Roți intermediare
                     Motor de antrenare
                     Reductor
                     Flanșă internă
                     Mecanism de basculare
                     Angrenaj conic de antrenare
                     
                        Figura 2
                     
                     
                        Diagramă flux
                     
                     
                        
                     A: Rezervor de alimentare
                     B: Pompă peristaltică
                     C: Tub rotativ
                     D: Vas colector al efluentului
                     
                        DEFINIȚII
                     
                     Substanță chimică testată: orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                     Substanțe chimice: «Trebuie să se noteze faptul că termenul „substanță chimică” este utilizat pe scară largă în acordurile UNCED și documentele ulterioare, pentru a include substanțe, produse, amestecuri, preparate sau orice alți termeni care pot fi utilizați în sistemele existente pentru a indica acoperirea».
                  ”
            
                  10.
               
               
                  Se adaugă capitolele C.27, C.28, C.29 și C.30:
                  „C.27   TEST DE TOXICITATE ASUPRA CHIRONOMIDELOR ÎNTR-UN SISTEM APĂ-SEDIMENT CU SEDIMENT ÎMBOGĂȚIT
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 218 (2004) a OCDE. Această metodă de testare este concepută pentru evaluarea efectelor expunerii prelungite a substanțelor chimice la larvele de diptere de apă dulce din specia Chironomus, care trăiesc în sedimente. Se bazează pe protocoalele de testare a toxicității existente pentru Chironomus riparius și Chironomus tentans, care au fost dezvoltate în Europa (1) (2) (3) și America de Nord (4) (5) (6) (7) (8) și testate prin comparare interlaboratoare (1) (6) (9). Se pot utiliza și alte specii de chironomide, despre care există documentație adecvată, de exemplu Chironomus yoshimatsui (10) (11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Scenariul de expunere utilizat în această metodă de testare este îmbogățirea sedimentului cu substanța testată. Selectarea scenariului de expunere adecvat depinde de intenția de aplicare a testului. Scenariul de îmbogățire a sedimentului are rolul de a simula niveluri acumulate de substanțe chimice care persistă în sediment. Acest sistem de expunere implică îmbogățirea sedimentului dintr-un sistem de testare tip apă-sediment.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De obicei, substanțele care trebuie să fie testate din punct de vedere al efectului asupra organismelor care trăiesc în sedimente persistă în acest compartiment pe perioade lungi de timp. Organismele care trăiesc în sedimente pot fi expuse printr-o serie de căi. Importanța relativă a fiecărei căi de expunere, precum și timpul necesar pentru ca fiecare să contribuie la efectele toxice generale, depind de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice respective. Pentru substanțele puternic adsorbante (de exemplu, cu log Kow > 5) sau pentru substanțe cu legături covalente cu sedimentul, ingestia de hrană contaminată poate fi o cale de expunere semnificativă. Pentru a nu subestima toxicitatea substanțelor puternic lipofile, se poate lua în considerare adăugarea de hrană la sediment înainte de aplicarea substanței chimice testate. Pentru a lua în considerare toate căile de expunere potențiale, această metodă de testare se concentrează pe expunerea pe termen lung. Durata de testare este în intervalul 20-29 de zile pentru C. riparius și C. yoshimatsui și de 28-65 de zile pentru C. tentans. În cazul în care este nevoie de date pe termen scurt pentru un anumit scop, de exemplu pentru analiza efectelor unei substanțe chimice instabile, după o perioadă de zece zile se pot înlătura probele duplicat suplimentare.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Punctele finale măsurate sunt numărul total de adulți ieșiți din larve și durata până la emergență. Se recomandă ca măsurătorile ratei de supraviețuire și creștere a larvelor să se facă doar după o perioadă de zece zile, în cazul în care sunt necesare date suplimentare pe termen scurt, folosind probe duplicat suplimentare, după caz.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Se recomandă utilizarea de sediment preparat. Sedimentul preparat are o serie de avantaje față de sedimentele naturale:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          variabilitatea experimentală este redusă, pentru că formează o «matrice standardizată» cu caracter reproductibil și se elimină necesitatea de a găsi surse de sediment necontaminate și curate;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testele pot fi inițiate în orice moment, fără să apară fenomenul de variație sezonieră în sedimentul de testare și nu este nevoie ca sedimentul să fie pretratat pentru înlăturarea faunei indigene; de asemenea, utilizarea sedimentului preparat reduce costul asociat cu colectarea pe teren a unor cantități suficiente de sediment, pentru testele de rutină;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          utilizarea sedimentelor preparate permite compararea toxicității și clasificarea substanțelor în consecință.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Definițiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              7.
                           
                           
                              Chironomide în primul stadiu larvar sunt expuse unui interval de concentrații de substanță chimică testată în sistemele apă-sediment. Substanța de testare este îmbogățită în sediment și apoi larvele în primul stadiu sunt introduse în pahare Berzelius în care s-au stabilizat concentrațiile de sediment și apă. La sfârșitul testului se măsoară rata de emergență și dezvoltare a chironomidelor. De asemenea, dacă este necesar se pot măsura și rata de supraviețuire și greutatea larvelor (cu ajutorul unor probe duplicat suplimentare, după caz). Aceste date sunt analizate fie printr-un model de regresie, pentru a estima concentrația care ar produce o reducere cu × % a ratei de emergență sau supraviețuire sau creștere a larvelor (de exemplu, EC15, EC50 etc.), fie prin testarea ipotezei statistice, pentru a determina CFEO/CMEO. Pentru această ultimă metodă este nevoie de compararea valorilor de efect cu valorile de control, cu ajutorul testelor statistice.
                           
                        INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA TESTATĂ
                  
                              8.
                           
                           
                              Trebuie să se cunoască solubilitatea substanței testate în apă, presiunea de vapori, măsurată sau calculată, partiția în sediment și stabilitatea în apă și în sediment. Este oportun să fie disponibilă o metodă analitică fiabilă de cuantificare a substanței testate în apa acoperitoare, în apa interstițială și în sediment, a cărei precizie și ale cărei limite de detecție sunt cunoscute. Informații utile includ formula structurală și puritatea substanței testate. Evoluția chimică a substanței testate (de exemplu, disipare, degradare abiotică și biotică etc.) este o altă informație utilă. Îndrumări suplimentare privind substanțele testate cu proprietăți fizico-chimice care le fac dificil de testat sunt prezentate în referința (12).
                           
                        SUBSTANȚE CHIMICE DE REFERINȚĂ
                  
                              9.
                           
                           
                              Substanțele chimice de referință pot fi testate periodic, ca mijloc de asigurare a fiabilității protocolului de testare și a condițiilor de testare. Exemple de substanțe toxice utilizate cu succes în testele de comparare interlaboratoare și în studiile de validare: lindan, trifuralin, pentaclorfenol, clorură de cadmiu și clorură de potasiu (1) (2) (5) (6) (13).
                           
                        VALIDITATEA TESTULUI
                  
                              10.
                           
                           
                              Pentru ca testul să fie valid, trebuie să îndeplinească următoarele condiții:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          la sfârșitul testului, emergența în vasele de control trebuie să fie de cel puțin 70 % (1) (6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          apariția de C. riparius și C. yoshimatsui la adulți din vasele de control trebuie să aibă loc între 12 și 23 de zile după inserarea în vase; pentru C. tentans este nevoie de o perioadă de la 20 până la 65 de zile;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          la sfârșitul testului, în fiecare vas trebuie să se măsoare pH-ul și concentrația de oxigen dizolvat. Concentrația de oxigen trebuie să fie de cel puțin 60 % din valoarea de saturație în aer (VSA) la temperatura utilizată, iar pH-ul apei acoperitoare trebuie să fie în intervalul 6-9, în toate vasele de testare;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura apei nu trebuie să difere cu mai mult de ± 1,0 °C. Temperatura apei poate fi controlată printr-o cameră izotermică, iar în acest caz temperatura camerei trebuie să fie confirmată într-un interval de timp corespunzător.
                                       
                                    
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Vase de testare
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Studiul este efectuat în pahare Berzelius din sticlă de 600 ml, cu diametru de 8 cm. Se pot folosi și alte recipiente, dar ele trebuie să asigure o adâncime corespunzătoare pentru sediment și apa acoperitoare. Suprafața sedimentului trebuie să fie suficient de mare pentru a permite un spațiu de 2 până la 3 cm2 pentru fiecare larvă. Raportul dintre adâncimea stratului de sediment și adâncimea apei acoperitoare trebuie să fie 1:4. Se recomandă ca recipientele de testare și alte aparate care vor intra în contact cu sistemul de testare să fie complet din sticlă sau dintr-un alt material inert din punct de vedere chimic (de exemplu, teflon).
                           
                        
                     Alegerea speciei
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              De preferință, specia care se utilizează în test este Chironomus riparius. Este potrivită și specia Chironomus tentans, dar este mai greu de manipulat și necesită o durată mai mare de testare. Se poate utiliza și Chironomus yoshimatsui. Detalii privind metodele de cultură sunt prezentate în apendicele 2, pentru Chironomus riparius. Sunt disponibile și informații despre condițiile de cultură pentru alte specii, adică Chironomus tentans (4) și Chironomus yoshimatsui (11). Identificarea speciei trebuie să se facă înainte de testare, dar nu este necesară înainte de fiecare test în parte atunci când organismele provin dintr-o cultură internă.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              De preferință, trebuie să se utilizeze sediment preparat (numit și sediment reconstituit, artificial sau sintetic). Totuși, în cazul în care se folosește sediment natural, caracteristicile acestuia trebuie să fie cunoscute (cel puțin pH-ul, conținutul de carbon organic, dar se recomandă și determinarea altor parametri ca raportul C/N și granulometria) și trebuie să nu existe niciun fel de contaminare și alte organisme care ar putea concura cu chironomidele sau care le-ar putea consuma. De asemenea, se recomandă ca, înainte de utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, sedimentul natural să fie condiționat timp de șapte zile în aceleași condiții care predomină în testul ulterior. Pentru acest test se recomandă următorul sediment preparat, care are la bază solul artificial utilizat în metoda de testare C.8 (14) (1) (15) (16):
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          4-5 % (greutate uscată) turbă: cu un pH cât mai aproape de 5,5-6,0; este important să se folosească turbă sub formă de pulbere, fin măcinată (dimensiunea particulei de ≤ 1 mm) și doar uscată cu aer;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          20 % (greutate uscată) caolin (de preferință, cu conținut de caolinit de peste 30 %);
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          75-76 % (greutate uscată) nisip cuarțos (trebuie să predomine nisipul fin, cu peste 50 % particule între 50 și 200 μm);
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          se adaugă apă deionizată pentru a obține un conținut de umiditate al amestecului final în intervalul 30-50 %;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          se adaugă carbonat de calciu cu calitate chimică pură (CaCO3), pentru a ajusta pH-ul amestecului final al sedimentului la 7,0 ± 0,5. Conținutul de carbon organic din amestecul final trebuie să fie 2 % (± 0,5 %) și se ajustează prin utilizarea unor cantități corespunzătoare de turbă și nisip, conform (a) și (c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Trebuie să se cunoască sursa de turbă, caolin și nisip. Componentele sedimentului trebuie să fie verificate, pentru a dovedi absența contaminării chimice (de exemplu, metale grele, compuși organici clorurați, compuși organici fosforici etc.). În apendicele 3 este descris un exemplu de preparare a sedimentului. Se acceptă și amestecul de constituenți uscați, dacă se demonstrează că după adăugarea apei acoperitoare nu apare o separare a constituenților sedimentului (de exemplu, plutirea unor particule de turbă) și că turba sau sedimentul este suficient condiționat.
                           
                        
                     Apă
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Orice tip de apă care corespunde caracteristicilor chimice ale unei ape de diluare de nivel acceptabil, așa cum este prezentat în apendicele 2 și 4, este potrivit ca apă pentru testare. Orice apă potrivită, apă naturală (apă de suprafață sau apă subterană), apă reconstituită (a se vedea apendicele 2) sau apa de la robinet declorurată sunt acceptabile ca apă de cultură și apă de testare, dacă chironomidele vor supraviețui în ea pe durata culturii și testării fără să prezinte semne de stres. La începutul testului, pH-ul apei de testare trebuie să fie între 6 și 9, iar duritatea totală să nu fie mai mare de 400 mg/l CaCO3. Totuși, în cazul în care se bănuiește că există o interacțiune între ionii care determină duritatea apei și substanța testată, trebuie să se utilizeze o apă cu duritate mai scăzută (astfel, în această situație nu trebuie să se folosească mediu Elendt M4). Același tip de apă trebuie să se utilizeze pe toată durata studiului. Parametrii de calitate a apei prezentați în apendicele 4 trebuie să fie măsurați cel puțin de două ori pe an sau ori de câte ori se presupune că este posibil ca aceste caracteristici să se fi schimbat semnificativ.
                           
                        
                     Soluții stoc – Sedimente îmbogățite
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              De obicei, sedimentele îmbogățite, cu o anumită concentrație, sunt preparate prin adăugarea unei soluții de substanță testată direct în sediment. O soluție stoc a substanței testate dizolvate în apa deionizată este amestecată cu sedimentul preparat cu ajutorul unei mori cu valțuri, al unui malaxor sau prin amestecare manuală. Dacă este puțin solubilă în apă, substanța testată se poate dizolva într-un volum cât se poate de mic de solvent organic adecvat (de exemplu, hexan, acetonă sau cloroform). Această soluție este apoi amestecată cu 10 g de nisip cuarțos fin pentru fiecare vas de testare. Se lasă să se evapore solventul, care trebuie să fie complet eliminat din nisip; apoi nisipul este amestecat cu o cantitate adecvată de sediment pentru fiecare pahar Berzelius. Pentru solubilizarea, dispersia sau emulsionarea substanței testate se pot folosi numai agenți cu volatilizare rapidă. E necesar să se țină cont de faptul că nisipul provenit din amestecul de substanță testată și nisip trebuie să fie luat în considerare atunci când se prepară sedimentul (adică sedimentul trebuie să fie preparat cu mai puțin nisip). Trebuie să se verifice distribuirea completă și uniformă în sediment a substanței testate care se adăugă la sediment. La nevoie, se pot analiza subprobe pentru determinarea gradului de omogenitate.
                           
                        PROTOCOLUL TESTULUI
                  
                              17.
                           
                           
                              Protocolul testului se referă la alegerea numărului și a intervalelor de concentrații testate, la numărul de vase pentru fiecare nivel de concentrație și la numărul de larve pentru fiecare vas. Sunt descrise modelele pentru estimarea punctuală a CE, pentru estimarea CFEO și pentru efectuarea unui test la valori-limită.
                           
                        
                     Modelul pentru analiza de regresie
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Concentrațiile cu efect (de exemplu CE15, CE50) și intervalul de concentrații în care efectul substanței testate prezintă interes trebuie să fie cuprinse în domeniul concentrațiilor incluse în test. În general, precizia și în special validitatea cu care se pot face estimările concentrațiilor de efect (CEx) sunt mai bune atunci când concentrația de efect se încadrează în limitele concentrațiilor testate. Trebuie să se evite extrapolarea mult sub nivelul celei mai mici concentrații pozitive sau peste nivelul celei mai mari concentrații. Este util să se facă un test preliminar de stabilire a intervalului, pentru a selecta gama de concentrații care vor fi utilizate (a se vedea punctul 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Atunci când se estimează CEx, trebuie să se testeze cel puțin cinci concentrații și trei probe duplicat pentru fiecare concentrație. În orice caz, este recomandat să se utilizeze concentrații de testare suficiente, pentru a permite o bună estimare a modelului. Factorul dintre concentrații nu trebuie să fie mai mare de doi (cu o posibilă excepție în cazurile în care curba de răspuns a dozei are o înclinare mică). Numărul de probe duplicat la fiecare tratare poate fi redus în cazul în care se crește numărul de concentrații de testare cu răspunsuri diferite. La creșterea numărului de duplicate sau la reducerea mărimii intervalelor concentrațiilor de testare, intervalele de încredere pentru test au tendința de a se îngusta. Atunci când trebuie să se estimeze rata de supraviețuire și de creștere a larvelor într-un interval de 10 zile, este nevoie de duplicate suplimentare.
                           
                        
                     Modelul pentru estimarea CFEO/CMEO
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Atunci când urmează să se estimeze CMEO sau CFEO, trebuie să se utilizeze cinci concentrații de testare cu cel puțin patru duplicate, iar factorul dintre concentrații nu trebuie să fie mai mare de doi. Numărul de probe duplicat trebuie să fie suficient pentru a asigura o putere statistică adecvată pentru detectarea unei diferențe de 20 % față de martor, la un nivel de semnificație statistică de 5 % (p = 0,05). Pentru rata de dezvoltare, de obicei se recomandă analiza varianței (ANOVA), cum ar fi testul lui Dunnett sau testul lui Williams (17) (18) (19) (20). Pentru rata de emergență, se pot utiliza testul Cochran-Armitage, testul exact al lui Fisher (cu corecția Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel.
                           
                        
                     Test la valori-limită
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Se poate efectua un test la valori-limită (o concentrație de testare și martor) atunci când nu s-au observat efecte în testul preliminar de stabilire a intervalului. Scopul testului la valori-limită este de a efectua un test la o concentrație suficient de mare pentru a permite factorilor de decizie să excludă efectele posibil toxice ale substanței testate, iar limita este stabilită la o concentrație care nu este așteptată să apară în nicio situație. Se recomandă 1 000 mg/kg (greutate uscată). De obicei, sunt necesare cel puțin șase probe duplicat atât pentru loturile tratate, cât și pentru cele martor. Trebuie să se demonstreze o putere statistică adecvată pentru detectarea unei diferențe de 20 % față de lotul martor, la un nivel de semnificație statistică de 5 % (p = 0,05). Cu răspuns metric (rată de dezvoltare și greutate), testul t este o metodă statistică adecvată atunci când datele îndeplinesc cerințele acestui test (normalitate, varianțe omogene). În cazul în care nu sunt îndeplinite aceste cerințe, se pot utiliza testul t pentru varianțe inegale sau un test nonparametric, cum ar fi testul Wilcoxon-Mann-Whithey. Pentru rata de emergență este adecvat testul exact al lui Fisher.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Condiții de expunere
                  
                  
                     Prepararea sistemului apă-sediment îmbogățit
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Procedura de îmbogățire descrisă în metoda de testare C.8: Toxicitatea la râme este recomandată pentru aplicarea substanței testate (14). Sedimentele îmbogățite sunt puse în vase și se adaugă apă acoperitoare, pentru a ajunge la un raport de volum sediment-apă de 1:4 (a se vedea punctele 11 și 15). Adâncimea stratului de sediment trebuie să fie între 1,5 și 3 cm. Pentru a evita separarea ingredientelor sedimentului și repunerea în suspensie a materiei fine în timpul adăugării apei de testare în coloana de apă, sedimentul poate fi acoperit cu un disc din plastic în timp ce se toarnă apa, apoi discul este înlăturat imediat. Se pot utiliza și alte dispozitive.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Vasele de testare trebuie să fie acoperite (de exemplu, cu plăci din sticlă). La nevoie, în timpul studiului se completează apa până la volumul inițial, pentru a compensa evaporarea. Această operațiune trebuie să fie făcută cu apă distilată sau apă deionizată, pentru a preveni acumularea de săruri.
                           
                        
                     Stabilizare
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              După adăugarea de apă acoperitoare la sedimentul îmbogățit, este de preferat să se lase timp pentru separarea substanței testate din faza apoasă și trecerea ei în sediment (3) (4) (6) (13). De preferință, această operațiune trebuie să se facă în aceleași condiții de temperatură și aerare ca și cele utilizate în test. Perioada de timp corespunzătoare pentru echilibrare depinde de sediment și de substanța chimică și poate fi de ordinul orelor sau de ordinul zilelor, iar în cazuri rare poate ajunge la câteva săptămâni (4-5 săptămâni). Întrucât în această perioadă se poate produce degradarea multor substanțe chimice, nu se așteaptă atingerea echilibrului, dar se recomandă să se lase o perioadă de echilibrare de 48 de ore. La sfârșitul acestei perioade de echilibrare ulterioară, concentrația substanței testate trebuie să fie măsurată în apa acoperitoare, în apa interstițială și în sediment, cel puțin la concentrația cea mai mare și la una mai scăzută (a se vedea punctul 38). Aceste determinări analitice ale substanței testate permit calculul bilanțului masic și exprimarea rezultatelor pe baza concentrațiilor măsurate.
                           
                        
                     Adăugarea de organisme de testare
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Cu patru până la cinci zile înainte de adăugarea organismelor de testare în vasele de testare, pontele trebuie să fie prelevate din culturi și plasate în vase mici, în mediu de cultură. Se poate utiliza un mediu de cultură vechi, provenit din cultura-mamă, sau un mediu proaspăt preparat. În cazul în care se recurge la a doua metodă, la mediul de cultură trebuie să se adauge o cantitate mică de hrană, de exemplu alge verzi și/sau câteva picături de filtrat de la o suspensie de hrană pentru pești fin măcinată (a se vedea apendicele 2). Trebuie să se utilizeze doar ponte proaspăt depuse. În mod normal, larvele încep să eclozeze la câteva zile după ce sunt depuse ouăle (2 până la 3 zile pentru Chironomus riparius la 20 °C și 1 până la 4 zile pentru Chironomus tentans la 23 °C și Chironomus yoshimatsui la 25 °C), iar creșterea larvară are loc în patru stadii, fiecare cu o durată de 4-8 zile. În studiu trebuie să se utilizeze larve din primul stadiu (2-3 sau 1-4 zile după eclozare). Stadiul musculițelor poate fi verificat prin măsurarea lățimii capsulei cefalice (6).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              Câte douăzeci de larve în primul stadiu sunt repartizate arbitrar la fiecare vas de testare care conține sediment îmbogățit și apă, cu ajutorul unei pipete cu vârf teșit. În timpul adăugării larvelor în vasele de testare trebuie să se oprească aerarea apei și ea trebuie să rămână oprită pentru încă 24 de ore după adăugarea larvelor (a se vedea punctele 25 și 32). Conform protocolului de testare utilizat (a se vedea punctele 19 și 20), numărul de larve utilizate în funcție de concentrație este 60 pentru estimarea punctuală a CE și 80 pentru determinarea CFEO.
                           
                        
                     Concentrațiile de testare
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Poate fi util un test de stabilire a intervalului, pentru a determina gama de concentrații pentru testul definitiv. În acest scop, se utilizează o serie de concentrații de substanță testată, distribuite la intervale largi. Pentru a obține aceeași densitate de suprafață pentru chironomide, care va fi utilizată pentru testul definitiv, chironomidele sunt expuse la fiecare concentrație a substanței testate pentru o perioadă care permite estimarea unor concentrații de testare adecvate și nu este nevoie de duplicate.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Concentrațiile de testare pentru testul definitiv sunt decise pe baza rezultatului obținut în testul de stabilire a intervalului. Trebuie să se utilizeze cel puțin cinci concentrații, care să fie alese după metoda descrisă la punctele 18-20.
                           
                        
                     Martori
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              În test trebuie să se includă vase cu probe-martor, care să nu conțină nicio substanță testată, dar în care să se afle sediment, cu un număr corespunzător de duplicate (a se vedea punctele 19-20). În cazul în care pentru aplicarea substanței testate s-a utilizat un solvent (a se vedea punctul 16), trebuie să se adauge un martor de solvent pentru sediment.
                           
                        
                     Sistem de testare
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Sunt utilizate sisteme statice. Sistemele semistatice sau dinamice, cu reînnoire continuă sau intermitentă a apei acoperitoare pot fi folosite în cazuri excepționale, de exemplu în cazul în care specificațiile privind calitatea apei devin inadecvate pentru organismul testat sau afectează echilibrul chimic (de exemplu, nivelurile de oxigen dizolvat scad prea mult, concentrația de produse excretoare crește prea mult sau mineralele se dizolvă din sediment și afectează pH-ul și/sau duritatea apei). Totuși, în mod normal, alte metode de ameliorare a calității apei acoperitoare, cum ar fi aerarea, vor fi suficiente și de preferat.
                           
                        
                     Hrană
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Larvele trebuie să fie hrănite, de preferință zilnic sau cel puțin de trei ori pe săptămână. Hrana pentru pești (o suspensie în apă sau hrană măcinată fin, de exemplu TetraMin sau TetraPhyll; a se vedea detalii în apendicele 2), o cantitate de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg pentru C. yoshimatsui) pentru fiecare larvă, zilnic, pare a fi potrivită pentru larvele tinere în primele 10 zile. Pentru larvele mai mature poate fi necesară o cantitate de hrană ceva mai mare: o cantitate de 0,5-1 mg pentru fiecare larvă, zilnic, ar trebui să fie suficientă pentru restul testului. Rația de hrană trebuie să fie redusă în toate loturile tratate și în loturile martor, în cazul în care se observă creștere fungică sau atunci când se constată mortalitate în loturile martor. Atunci când nu se poate opri proliferarea fungică, testul trebuie să fie repetat. La testarea unor substanțe cu capacitate mare de adsorbție (de exemplu, cu log Kow > 5) sau a unor substanțe cu legătură covalentă cu sedimentul, cantitatea de hrană necesară pentru asigurarea supraviețuirii și creșterii naturale a organismelor poate fi adăugată la sedimentul preparat înainte de perioada de stabilizare. Pentru aceasta, trebuie să se utilizeze material vegetal în loc de hrană pentru pești, de exemplu se poate adăuga o cantitate de 0,5 % (greutate uscată) frunze măcinate mărunt de urzică (Urtica dioica), de dud (Morus alba), de trifoi alb (Trifolium repens), de spanac (Spinacia oleracea) sau de alt material vegetal (Cerophyl sau celuloză alfa).
                           
                        
                     Condiții de incubare
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Aerarea ușoară a apei acoperitoare în vasele de testare se face, de preferință, cu 24 de ore înainte de adăugarea larvelor și este urmărită pe tot parcursul testului (trebuie să se acorde atenție concentrației de oxigen dizolvat, care nu trebuie să scadă sub nivelul de 60 % din VSA). Aerarea se face printr-o pipetă Pasteur din sticlă, fixată la 2-3 cm deasupra stratului de sediment (una sau câteva bule de aer pe secundă). La testarea substanțelor chimice volatile, e bine să se aibă grijă să nu se aereze sistemul apă-sediment.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Testul se face la o temperatură constantă de 20 °C (± 2 °C). Pentru C. tentans și C. yoshimatsui, temperaturile recomandate sunt 23 °C și respectiv 25 °C (± 2 °C). Se utilizează o perioadă de expunere la lumină de 16 ore, iar nivelul de iluminare trebuie să fie de 500-1 000 de lucși.
                           
                        
                     Durata de expunere
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Expunerea începe cu adăugarea de larve la vasele cu probe îmbogățite și la cele cu probe-martor. Durata maximă de expunere este de 28 de zile pentru C. riparius și C. yoshimatsui și de 65 de zile pentru C. tentans. În cazul în care musculițele ies mai devreme, testul poate fi încheiat după cel puțin cinci zile de la emergența ultimului adult din lotul-martor.
                           
                        
                     Observații
                  
                  
                     Emergență
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Se determină perioada de dezvoltare și numărul total de musculițe masculi și femele deplin ieșite din stadiul de larvă. Masculii sunt ușor de identificat după antenele plumoase.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Vasele de testare trebuie să fie controlate cel puțin de trei ori pe săptămână, pentru a evalua vizual orice comportament anormal (de exemplu, părăsirea sedimentului, un mod neobișnuit de a înota), prin comparație cu lotul martor. În perioada de emergență probabilă este nevoie să se numere zilnic musculițele ieșite din stadiul de larvă. Zilnic se înregistrează sexul și numărul musculițelor ieșite complet din stadiul de larvă. După identificare, musculițele sunt scoase din vase. Orice ponte depuse înainte de terminarea testului trebuie să fie înregistrate și apoi înlăturate, pentru a preveni reintroducerea larvelor în sediment. De asemenea, se înregistrează numărul de pupe vizibile la care nu s-a produs emergența. În apendicele 5 se dau orientări privind măsurarea emergenței.
                           
                        
                     Creștere și supraviețuire
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              În cazul în care este nevoie de datele pe 10 zile privind supraviețuirea și creșterea larvelor, trebuie să se prevadă de la început vase de testare suplimentare, pentru a putea fi utilizate ulterior. Sedimentul din aceste vase suplimentare este cernut printr-o sită de 250 μm, pentru reținerea larvelor. Simptomele care indică moartea larvelor sunt imobilitatea sau lipsa de reacție la stimuli mecanici. Larvele care nu sunt recuperate trebuie să fie numărate tot ca larve moarte (există posibilitatea ca larvele care au murit la începutul testului să fi fost degradate de microbi). Se determină greutatea uscată (fără resturi de la larvele moarte) a larvelor supraviețuitoare din fiecare vas de testare, apoi se calculează greutatea uscată medie individuală pentru fiecare vas. Este util să se determine în ce stadiu de dezvoltare se află larvele supraviețuitoare; pentru aceasta, se poate măsura lățimea capsulei cefalice a fiecărui individ.
                           
                        
                     Măsurători analitice
                  
                  
                     Concentrația substanței testate
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Înainte de începerea testului (adică adăugarea de larve), probe de sediment compact sunt înlăturate din cel puțin un vas pentru fiecare lot tratat, în vederea determinării analitice a concentrației substanței testate în sediment. Se recomandă, ca cerința minimă, ca probe din apa acoperitoare, din apa interstițială și din sediment să fie analizate la începutul testului (a se vedea punctul 24) și la sfârșitul testului, la concentrația cea mai mare și la o concentrație mai scăzută. Aceste determinări ale concentrației substanței testate furnizează informații despre comportamentul/separarea substanței testate în sistemul apă-sediment.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Atunci când se fac măsurători intermediare (de exemplu, în ziua a șaptea) și când pentru analiză este nevoie de probe mari, care nu pot fi prelevate din vasele de testare fără a influența sistemul de testare, trebuie să se efectueze determinări analitice pe probe din vase de testare suplimentare, tratate în același mod (inclusiv prezența organismelor de testare), dar neutilizate pentru observații biologice.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Procedura recomandată pentru izolarea apei interstițiale este centrifugarea, de exemplu la 10 000 g și 4 °C, timp de 30 de minute. Totuși, în cazul în care se demonstrează că substanța testată nu adsoarbe pe filtre, se poate accepta și filtrarea. În unele cazuri, nu se pot analiza concentrațiile în apa interstițială, pentru că dimensiunea eșantionului este prea mică.
                           
                        
                     Parametri fizico-chimici
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Trebuie să se măsoare în mod corespunzător pH-ul și temperatura din vasele de testare (a se vedea punctul 10). Duritatea și conținutul de amoniac trebuie să fie măsurate în loturile martor și într-un vas de testare, la cea mai mare concentrație, la începutul și la sfârșitul testului.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Interpretarea rezultatelor
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Scopul acestui test este să se determine efectul unei substanțe testate asupra ratei de dezvoltare și asupra numărului total de musculițe masculi și femele ieșite complet din stadiul de larvă sau, în cazul testului de 10 zile, efectele asupra supraviețuirii și greutății larvelor. În cazul în care nu există indicii de sensibilități diferite, din punct de vedere statistic, rezultatele obținute de la masculi și de la femele pot fi grupate, în scop statistic. Diferențele de sensibilitate între sexe pot fi interpretate statistic, de exemplu cu ajutorul unui test tabelar χ2-r × 2. După zece zile trebuie să se determine rata de supraviețuire a larvelor și greutatea uscată medie individuală pentru fiecare vas, unde este cazul.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Concentrațiile de efect, exprimate și bazate pe greutatea uscată, sunt calculate, de preferință, pe baza concentrațiilor în sediment măsurate la începutul testului (a se vedea punctul 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Pentru a calcula o estimare punctuală pentru CE50 sau orice altă CEx, se pot utiliza statisticile pentru fiecare vas, ca duplicate adevărate. La calcularea intervalului de încredere pentru orice CEx, trebuie să se țină seama de variabilitatea între vase sau trebuie să se demonstreze că această variabilitate este atât de redusă încât poate fi ignorată. Atunci când modelul este ajustat cu metoda celor mai mici pătrate, trebuie să se aplice o transformare la statistica pentru fiecare vas, în vederea îmbunătățirii omogenității varianței. Totuși, valorile CEx trebuie să fie calculate după ce răspunsul revine la valoarea originală.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Atunci când analiza statistică are ca scop determinarea CFEO/CMEO prin testarea ipotezei statistice, variabilitatea între vase trebuie să fie luată în considerare, de exemplu printr-o analiză a varianței cu mai multe criterii de clasificare. Alternativ, mai multe teste robuste (21) pot fi adecvate în situații în care există violări ale ipotezelor ANOVA obișnuite.
                           
                        
                     Rată de emergență
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Ratele de emergență sunt date cantitative și pot fi analizate cu ajutorul testului Cochran-Armitage aplicat în mod descrescător atunci când se așteaptă o relație doză-răspuns de tip monoton și când aceste date corespund așteptărilor. În caz contrar, se pot utiliza testul exact al lui Fisher sau testul Mantel-Haenszel, cu valori p ajustate Bonferroni-Holm. Dacă există dovezi că variabilitatea între probe duplicat este mai mare, la aceeași concentrație, decât cea indicată de o distribuție binomială (adesea numită variație «extra-binomială»), atunci trebuie să se utilizeze un test robust Cochran-Armitage sau testul exact al lui Fisher, așa cum se propune în (21).
                              Se determină suma musculițelor ieșite în fiecare vas, ne, care se împarte la numărul de larve introduse, na:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          rata de emergență
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          numărul de musculițe ieșite în fiecare vas
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          numărul de larve introduse în fiecare vas
                                       
                                    
                        
                              47.
                           
                           
                              O alternativă mai potrivită pentru eșantioane de dimensiuni mari, atunci când există varianță extra-binomială, este tratarea ratei de emergență ca o reacție continuă și utilizarea unor proceduri, cum ar fi testul lui William, atunci când se așteaptă o relație doză-răspuns de tip monoton, care corespunde cu aceste date ER. Testul lui Dunnett este potrivit în cazurile în care nu există monotonie. O dimensiune mare a eșantionului este definită, în acest caz, ca fiind un număr mai mare de cinci musculițe ieșite și cinci musculițe neieșite, pentru fiecare probă duplicat (vas).
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Pentru aplicarea metodelor ANOVA, valorile ER trebuie să fie mai întâi transformate prin transformarea trigonometrică sau prin transformarea Freeman-Tukey, pentru a obține o distribuție aproximativ normală și pentru a egaliza varianțele. Testul Cochran-Armitage, testul exact al lui Fisher (Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel pot fi aplicate atunci când se utilizează frecvențe absolute. Transformarea trigonometrică este aplicată prin preluarea arcsinusului (sin–1) rădăcinii pătrate a ER.
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Pentru rate de emergență, valorile CEx sunt calculate cu ajutorul analizei de regresie [sau, de exemplu, probit (22), logit, Weibull, un program informatic comercial corespunzător etc.]. În cazul în care analiza de regresie nu are succes (de exemplu, atunci când există mai puțin de două reacții parțiale), se utilizează alte metode nonparametrice, cum ar fi media mobilă sau interpolarea simplă.
                           
                        
                     Rată de dezvoltare
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Durata medie de dezvoltare reprezintă intervalul de timp mediu dintre introducerea larvelor (ziua 0 a testului) și emergența cohortei experimentale de musculițe. (Pentru calculul duratei reale de dezvoltare, trebuie să se ia în considerare vârsta larvelor la momentul introducerii). Rata de dezvoltare este inversul duratei de dezvoltare (unitate: 1/zi) și reprezintă acea parte din dezvoltarea larvară care are loc în cursul unei zile. Rata de dezvoltare este preferată pentru evaluarea acestor studii de toxicitate a sedimentelor, pentru că varianța sa este mai mică și este mai omogenă și mai apropiată de distribuția normală, comparativ cu durata de dezvoltare. Prin urmare, procedurile de testare parametrică puternice se pot utiliza mai curând pentru rata de dezvoltare, decât pentru durata de dezvoltare. Pentru rata de dezvoltare ca reacție continuă, valorile CEx pot fi estimate prin utilizarea analizei de regresie [de exemplu, (23), (24)].
                           
                        
                              51.
                           
                           Pentru testele statistice următoare, se presupune că numărul de musculițe observate la inspecția din ziua × au ieșit la jumătatea intervalului de timp dintre ziua × și ziua x – l (l = lungimea intervalului de inspecție, de obicei o zi). Rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas (
                                 ) este calculată cu formula:
                                 
                              unde:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          indicele intervalului de inspecție
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          numărul maxim de intervale de inspecție
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          numărul de musculițe ieșite în intervalul de inspecție i
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          numărul total de musculițe ieșite la sfârșitul experimentului (= )
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          rata de dezvoltare a musculițelor ieșite în intervalul i
                                       
                                    
                                 
                              unde:
                              
                                          ziuai
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          ziua inspecției (zile de la aplicare)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          lungimea intervalului de inspecție i (zile, de obicei 1 zi)
                                       
                                    
                        
                     Raport de testare
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să includă cel puțin următoarele informații:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța de testat:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică și, dacă sunt relevante, proprietățile fizico-chimice [solubilitatea în apă, presiunea de vapori, coeficientul de partiție în sol (sau în sediment, dacă este disponibil), stabilitatea în apă etc.];
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datele de identificare chimică (denumirea comună, denumirea chimică, formula structurală, numărul CAS etc.), inclusiv puritatea și metoda analitică de cuantificare a substanței testate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Speciile folosite pentru testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      animalele de testare utilizate: specie, denumire științifică, sursa organismelor și condițiile de reproducere;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații privind manipularea pontelor și a larvelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vârsta animalelor testate la inserarea în vasele de testare.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sedimentul folosit, adică sediment natural sau preparat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pentru sedimentul natural, localizarea și descrierea locului de prelevare a probelor, inclusiv, dacă este posibil, istoricul contaminării; caracteristici: pH, conținut de carbon organic, raport C/N și granulometrie (dacă este cazul);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prepararea sedimentului: ingrediente și caracteristici (conținut de carbon organic, pH, umiditate etc. la începutul testului);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pregătirea apei de testare (dacă se folosește apă reconstituită) și caracteristici (concentrație de oxigen, pH, conductivitate, duritate etc. la începutul testului);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      adâncimea sedimentului și a apei acoperitoare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumul apei acoperitoare și al apei interstițiale; greutatea sedimentului ud cu și fără apă interstițială;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vasele de testare (material și dimensiune);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de îmbogățire a sedimentului: concentrații de testare utilizate, număr de probe duplicat și utilizarea solventului, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      faza de stabilizare de echilibru a sistemului apă-sediment îmbogățit: durată și condiții;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      condițiile de incubare: temperatură, ciclu de lumină și nivel de iluminare, aerare (frecvență și intensitate);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații detaliate privind hrănirea, inclusiv tipul de hrană, prepararea, cantitatea și regimul de hrănire.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatele:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      valorile nominale ale concentrațiilor de testare, valorile măsurate ale concentrațiilor de testare și rezultatul tuturor analizelor pentru determinarea concentrației substanței testate în vasul de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      calitatea apei în vasele de testare, adică pH-ul, temperatura, oxigenul dizolvat, duritatea și conținutul de amoniac;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      înlocuirea apei de testare evaporate, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul de musculițe masculi și femele ieșite în fiecare vas și în fiecare zi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul de larve care nu s-au transformat în musculițe, în fiecare vas;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea medie individuală a larvelor în fiecare vas și pentru fiecare stadiu larvar, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procentul de emergență pe fiecare probă duplicat și concentrația de testare (musculițe masculi și femele, împreună);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rata medie de dezvoltare a musculițelor complet ieșite din stadiul de larvă pe fiecare probă duplicat și rata de tratare (musculițe masculi și femele împreună);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      estimări ale efectelor toxice, de exemplu CEx (și intervalele de încredere asociate), CFEO și/sau CMEO și metode statistice utilizate pentru determinarea lor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea rezultatelor, inclusiv orice influență asupra rezultatului testului rezultată din abaterile de la această metodă de testare.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Fleming R. et al. (1994), Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances, Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738, August 1994, WRc, UK.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              SETAC (1993), Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002), Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp. 1125-1241. În ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997), Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius), Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              US-EPA (2000), Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064, March 2000, Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Milani D., Day K.E., McLeay D.J. și Kirby R.S. (1996), Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Sugaya Y. (1997), Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui, Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera), Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995), Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Metoda de testare C.8 din prezenta anexă, «Toxicitatea la râme».
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Suedel B.C. and J.H. Rodgers (1994), Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing, Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Naylor C. and C. Rodrigues (1995), Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment, Chemosphere 31: 3291-3303.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Dunnett C.W. (1964), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, 20: 482-491.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Williams D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics, 27: 103-117.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Williams D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics, 28: 510-531.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48: 577-585.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Christensen E.R. (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model, Water Research 18: 213-221.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Slob W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints, Toxicol. Sci. 66: 298-312.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚII
                     În cadrul acestei metode de testare se folosesc următoarele definiții și prescurtări:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sedimentul preparat sau sedimentul reconstituit, artificial sau sintetic: un amestec de materiale utilizat pentru a simula componentele fizice ale sedimentului natural.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Apa acoperitoare: apa plasată peste sediment în vasul de testare.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Apa interstițială: apa care ocupă spațiul dintre sediment și particulele de sol.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sedimentul îmbogățit: sedimentul la care se adaugă substanța testată.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Substanța chimică testată: orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                              
                           
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Recomandări pentru cultura de Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larvele de Chironomus pot fi crescute în vase de cristalizare sau în recipiente mai mari. Pe fundul unui recipient se împrăștie nisip cuarțos într-un strat subțire, de circa 5-10 mm grosime. Un substrat adecvat s-a dovedit a fi și kieselgur (de exemplu Merck, articolul 8117). Este suficient un strat mai subțire, de maximum câțiva mm. Apoi se adaugă apa corespunzătoare, la o adâncime de câțiva cm. Nivelurile de apă trebuie să fie completate la nevoie, pentru a compensa pierderea prin evaporare și pentru a preveni uscarea. Apa poate fi înlocuită, dacă este necesar. Trebuie să se asigure o aerare ușoară. Vasele în care sunt crescute larvele trebuie să fie păstrate într-o cutie adecvată, pentru a nu permite ca adulții emergenți să scape. Cutia trebuie să fie suficient de mare pentru a permite mișcarea în voie a adulților emergenți, altfel este posibil să nu apară copulația (dimensiunea minimă este de circa 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Cutiile trebuie să fie păstrate la temperatura camerei sau într-o încăpere cu mediu constant, la 20 ± 2 °C, cu o perioadă de expunere la lumină de 16 ore (la un nivel de iluminare de circa 1 000 de lucși), cu 8 ore de întuneric. S-a raportat că o umiditate a aerului mai mică de 60 % umiditate relativă poate împiedica reproducerea.
                              
                           
                        Apa de diluție
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Se poate utiliza orice apă naturală sau sintetică adecvată. În mod obișnuit, se folosește apă de fântână, apă de la robinet declorurată și medii artificiale (de exemplu, mediu Elendt «M4» sau «M7», a se vedea mai jos). Apa trebuie să fie aerată înainte de utilizare. Dacă este nevoie, apa de cultură poate fi reînnoită prin turnarea sau sifonarea cu atenție a apei uzate din vasele de cultură, fără să se distrugă tuburile de larve.
                              
                           
                        Hrănirea larvelor
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Larvele de Chironomus trebuie să fie hrănite cu hrană pentru pești sub formă de fulgi (TetraMin®, TetraPhyll® sau altă marcă patentată similară de hrană pentru pești) la aproximativ 250 mg pe zi pentru fiecare vas. Hrana poate fi administrată sub formă de pulbere măcinată uscată sau ca suspensie în apă: o cantitate de 1,0 g de hrană sub formă de fulgi se adaugă la 20 ml de apă de diluție și se amestecă pentru a obține un amestec omogen. Acest preparat poate fi administrat la o rată de circa 5 ml pentru fiecare vas și fiecare zi (a se agita înainte de utilizare). Larvele cu vârstă mai mare pot primi mai mult.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Hrănirea este ajustată în funcție de calitatea apei. Dacă mediul de cultură devine «neclar», trebuie să se micșoreze cantitatea de hrană. Adăugarea de hrană trebuie să fie atent monitorizată. Prea puțină hrană va conduce la emigrarea larvelor spre coloana de apă, iar o cantitate prea mare de hrană va avea ca rezultat creșterea activității microbiene și concentrații reduse de oxigen. Ambele condiții pot conduce la scăderea ratelor de creștere.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Se pot adăuga și câteva celule de alge verzi (de exemplu, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris), atunci când se pregătesc noile vase de cultură.
                              
                           
                        Hrănirea adulților ieșiți din larve
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Unele experimente au sugerat că se poate folosi ca hrană pentru adulții ieșiți din larve un tampon de vată îmbibat într-o soluție saturată de zaharoză.
                              
                           
                        Emergență
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 La 20 ± 2 °C, adulții vor începe să iasă din vasele de creștere a larvelor după aproximativ 13-15 zile. Masculii sunt ușor de identificat după antenele plumoase.
                              
                           
                        Ponte
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 După ce adulții sunt prezenți în cutia de creștere, toate vasele de creștere a larvelor trebuie să fie verificate de trei ori pe săptămână, pentru a observa depunerea de ponte gelatinoase. Dacă aceasta apare, pontele trebuie să fie înlăturate cu atenție. Ele trebuie să fie transferate într-un vas mic, care conține o probă din apa în care au crescut. Pontele sunt utilizate pentru a începe un nou vas de cultură (de exemplu, 2-4 ponte/vas) sau sunt folosite pentru teste de toxicitate.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larvele în primul stadiu ar trebui să eclozeze după 2-3 zile.
                              
                           
                        Pregătirea de noi vase de cultură
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 După constituirea culturilor, se poate pregăti un nou vas de cultură larvară o dată pe săptămână sau mai puțin frecvent, în funcție de cerințele de testare, prin înlăturarea vaselor mai vechi după ce musculițele adulte au ieșit din larve. Cu ajutorul acestui sistem, se va asigura o cantitate regulată de adulți, cu minimum de manipulare.
                              
                           
                        Prepararea soluțiilor de testare «M4» și «M7»
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) a descris mediul «M4». Mediul «M7» este preparat la fel ca mediul «M4», cu excepția substanțelor indicate în tabelul 1, pentru care concentrațiile sunt de patru ori mai scăzute în «M7» față de «M4». Este în pregătire o publicație privind mediul «M7» (Elendt, comunicare personală). Soluția de testare nu trebuie să fie preparată conform indicațiilor lui Elendt și Bias (1990) deoarece concentrațiile de NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 și K2HPO4 indicate pentru prepararea soluțiilor stoc nu sunt adecvate.
                              
                           
                        Prepararea mediului «M7»
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Fiecare soluție stoc (I) este preparată individual, iar din aceste soluții stoc (I) se prepară o soluție stoc combinată (II) (a se vedea tabelul 1). 50 de ml din soluția stoc combinată (II) și cantitățile din fiecare soluție stoc de macronutrienți care sunt indicate în tabelul 2 sunt adăugate la un litru de apă deionizată, pentru a prepara mediul «M7». Se prepară o soluție stoc de vitamine, prin adăugarea a trei vitamine la apa deionizată, așa cum se indică în tabelul 3, iar 0,1 ml din soluția stoc de vitamine combinată se adaugă la mediul final «M7» cu puțin timp înainte de utilizare. (Soluția stoc combinată de vitamine se păstrează în stare înghețată, în mici alicote). Mediul este aerat și stabilizat.
                              
                           
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, edited by M. Streloke and H.Köpp, Berlin 1995.
                     
                        Tabelul 1
                     
                     
                        Soluții stoc de microelemente pentru mediile M4 și M7
                     
                     
                                 Soluții stoc (I)
                              
                              
                                 Cantitate (mg) adăugată la un litru de apă deionizată
                              
                              
                                 Pentru a prepara soluția stoc combinată (II): se amestecă următoarele cantități (ml) de soluții stoc (I) și se adaugă la un litru de apă deionizată
                              
                              
                                 Concentrații finale în soluțiile de testare (mg/l)
                              
                           
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                              
                                 M4
                              
                              
                                 M7
                              
                           
                                 H3BO3
                                     (15)
                                 
                              
                              
                                 57 190
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 2,86
                              
                              
                                 0,715
                              
                           
                                 MnCl2 · 4 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 7 210
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,361
                              
                              
                                 0,090
                              
                           
                                 LiCl (15)
                                 
                              
                              
                                 6 120
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,306
                              
                              
                                 0,077
                              
                           
                                 RbCl (15)
                                 
                              
                              
                                 1 420
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,071
                              
                              
                                 0,018
                              
                           
                                 SrCl2 · 6 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 3 040
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,152
                              
                              
                                 0,038
                              
                           
                                 NaBr (15)
                                 
                              
                              
                                 320
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,016
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 Na2MoO4 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 1 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,063
                              
                              
                                 0,016
                              
                           
                                 CuCl2 · 2 H2O (15)
                                 
                              
                              
                                 335
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,25
                              
                              
                                 0,017
                              
                              
                                 0,004
                              
                           
                                 ZnCl2
                                 
                              
                              
                                 260
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,013
                              
                              
                                 0,013
                              
                           
                                 CaCl2 · 6 H2O
                              
                              
                                 200
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,010
                              
                              
                                 0,010
                              
                           
                                 KI
                              
                              
                                 65
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0033
                              
                              
                                 0,0033
                              
                           
                                 Na2SeO3
                                 
                              
                              
                                 43,8
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,0022
                              
                              
                                 0,0022
                              
                           
                                 NH4VO3
                                 
                              
                              
                                 11,5
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,00058
                              
                              
                                 0,00058
                              
                           
                                 Na2EDTA · 2 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 5 000
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 2,5
                              
                              
                                 0,625
                              
                           
                                 FeSO4 · 7 H2O (15)
                                     (16)
                                 
                              
                              
                                 1 991
                              
                              
                                 20,0
                              
                              
                                 5,0
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 0,249
                              
                           
                        
                     
                        Tabelul 2
                     
                     
                        Soluții stoc de macronutrienți pentru mediile M4 și M7
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Cantitate adăugată la un litru de apă deionizată
                                 (mg)
                              
                              
                                 Cantitate de soluții stoc de macronutrienți adăugate pentru prepararea mediilor M4 și M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Concentrații finale în soluțiile de testare M4 și M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 CaCl2 · 2 H2O
                              
                              
                                 293 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 293,8
                              
                           
                                 MgSO4 · 7 H2O
                              
                              
                                 246 600
                              
                              
                                 0,5
                              
                              
                                 123,3
                              
                           
                                 KCl
                              
                              
                                 58 000
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 5,8
                              
                           
                                 NaHCO3
                                 
                              
                              
                                 64 800
                              
                              
                                 1,0
                              
                              
                                 64,8
                              
                           
                                 NaSiO3 · 9 H2O
                              
                              
                                 50 000
                              
                              
                                 0,2
                              
                              
                                 10,0
                              
                           
                                 NaNO3
                                 
                              
                              
                                 2 740
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,274
                              
                           
                                 KH2PO4
                                 
                              
                              
                                 1 430
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,143
                              
                           
                                 K2HPO4
                                 
                              
                              
                                 1 840
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,184
                              
                           
                        
                     
                        Tabelul 3
                     
                     
                        Soluție stoc de vitamine pentru mediile M4 și M7. Toate cele trei soluții de vitamine sunt combinate pentru a obține o singură soluție stoc de vitamine
                     
                     
                                  
                              
                              
                                 Cantitate adăugată la un litru de apă deionizată
                                 (mg)
                              
                              
                                 Cantitate de soluție stoc de vitamine adăugată pentru prepararea mediilor M4 și M7
                                 (ml/l)
                              
                              
                                 Concentrații finale în soluțiile de testare M4 și M7
                                 (mg/l)
                              
                           
                                 Clorhidrat de tiamină
                              
                              
                                 750
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,075
                              
                           
                                 Ciancobalamină (B12)
                              
                              
                                 10
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,0010
                              
                           
                                 Biotină
                              
                              
                                 7,5
                              
                              
                                 0,1
                              
                              
                                 0,00075
                              
                           
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
                     Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990), Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
                  
                  
                     Apendicele 3
                     PREPARAREA SEDIMENTULUI
                     
                        Compoziția sedimentului
                     
                     Compoziția sedimentului preparat trebuie să fie următoarea:
                     
                                 Constituent
                              
                              
                                 Caracteristici
                              
                              
                                 % de sediment
                                 greutate uscată
                              
                           
                                 Turbă
                              
                              
                                 Mușchi de turbă (Sphagnum), cu pH cât mai apropiat posibil de valoarea 5,5-6,0, fără resturi vizibile de plante, fin măcinat (dimensiunea particulelor ≤ 1 mm) și uscat cu aer
                              
                              
                                 4-5
                              
                           
                                 Nisip cuarțos
                              
                              
                                 Granulație: > 50 % din particule trebuie să fie în intervalul 50-200 μm
                              
                              
                                 75-76
                              
                           
                                 Argilă caolinitică
                              
                              
                                 Conținut de caolinit ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Carbon organic
                              
                              
                                 Ajustat prin adăugarea de turbă și nisip
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Carbonat de calciu
                              
                              
                                 CaCO3, pulverizat, pur din punct de vedere chimic
                              
                              
                                 0,05-0,1
                              
                           
                                 Apă
                              
                              
                                 Conductivitate ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30-50
                              
                           
                        Preparare
                     
                     Turba este uscată cu aer și măcinată într-o pulbere fină. Se prepară o suspensie din cantitatea necesară de pulbere de turbă în apă deionizată, cu ajutorul unui dispozitiv de omogenizare de înaltă performanță. pH-ul acestei suspensii este ajustat la 5,5 ± 0,5 cu CaCO3. Suspensia este condiționată timp de cel puțin două zile, agitându-se ușor la 20 ± 2 °C, pentru stabilizarea pH-ului și stabilirea unei componente microbiene stabile. Se măsoară din nou pH-ul, care trebuie să fie între 6,0 ± 0,5. Apoi, suspensia de turbă este amestecată cu alți constituenți (nisip și argilă caolin) și cu apă deionizată, pentru a obține un sediment omogen cu un conținut de apă în gama de 30-50 % din greutatea uscată a sedimentului. Se măsoară încă o dată pH-ul amestecului final și se ajustează la 6,5 până la 7,5 cu CaCO3, dacă este necesar. Se prelevează probe din sediment, pentru a determina greutatea uscată și conținutul de carbon organic. Apoi, înainte de utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, se recomandă ca sedimentul natural să fie condiționat timp de șapte zile în aceleași condiții care predomină în testul ulterior.
                     
                        Depozitare
                     
                     Constituenții uscați pentru prepararea sedimentului artificial pot fi depozitați într-un loc uscat și răcoros, la temperatura camerei. Sedimentul preparat (umed) nu trebuie să fie depozitat înainte de utilizarea sa în cadrul testului. El trebuie să fie folosit imediat după perioada de condiționare de 7 zile, cu care se încheie prepararea.
                     
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     Capitolul C.8 din prezenta anexă, «Toxicitatea la râme».
                     Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media, Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
                  
                  
                     Apendicele 4
                     
                        Caracteristici chimice acceptabile ale apei de diluție
                     
                     
                                 Substanță
                              
                              
                                 Concentrații
                              
                           
                                 Particule în suspensie
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Carbon organic total
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Amoniac neionizat
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Duritate ca CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (17)
                                 
                              
                           
                                 Clor rezidual
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Total pesticide organofosforice
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Total pesticide organofosforice plus bifenil policlorurat
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Total clor organic
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Apendicele 5
                     
                        Orientări pentru monitorizarea emergenței larvelor de chironomide
                     
                     Pe paharele Berzelius de testare sunt plasate capcane de emergență. Aceste capcane sunt necesare începând din a douăzecea zi până la sfârșitul testului. În figura de mai jos se prezintă un exemplu de capcană utilizată:
                     
                        
                     A: sită de nailon
                     B: cupe de plastic răsturnate
                     C: pahar Berzelius fără muchie, pentru expunere
                     D: orificii cu sită, pentru schimbul de apă
                     E: apă
                     F: sediment
                  
                  C. 28.   TESTUL DE TOXICITATE ASUPRA CHIRONOMIDELOR ÎNTR-UN SISTEM APĂ-SEDIMENT CU APĂ ÎMBOGĂȚITĂ
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea 219 (2004) a OCDE. Această metodă de testare este concepută pentru evaluarea efectelor expunerii prelungite a substanțelor chimice la larvele de diptere de apă dulce din specia Chironomus, care trăiesc în sedimente. Ea se bazează în principal pe orientările BBA, folosind un sistem de testare apă-sediment cu sol artificial și un scenariu de expunere cu coloană de apă (1). De asemenea, ține cont de protocoalele de testare a toxicității existente pentru Chironomus riparius și Chironomus tentans, care au fost dezvoltate în Europa și America de Nord (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) și testate prin comparare interlaboratoare (1) (6) (9). Se pot utiliza și alte specii de chironomide, despre care există documentație adecvată, de exemplu Chironomus yoshimatsui (10) (11).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Scenariul de expunere utilizat în această metodă de testare este îmbogățirea apei. Selectarea scenariului de expunere adecvat depinde de aplicarea intenționată a testului. Scenariul de expunere pentru apă, care implică îmbogățirea coloanei de apă, este menit să simuleze o pulverizare cu pesticide și acoperă valoarea maximă inițială a concentrațiilor în apa interstițială. De asemenea, este util pentru alte tipuri de expunere (inclusiv scurgerile chimice), cu excepția proceselor de acumulare care durează mai mult decât perioada de testare.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              De obicei, substanțele care trebuie să fie testate din punct de vedere al efectului asupra organismelor care trăiesc în sedimente persistă în acest compartiment pe perioade lungi de timp. Organismele care trăiesc în sedimente pot fi expuse printr-o serie de căi. Importanța relativă a fiecărei căi de expunere, precum și timpul necesar pentru ca fiecare să contribuie la efectele toxice generale, depind de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice respective. Pentru substanțele puternic adsorbante (de exemplu, cu log Kow > 5) sau pentru substanțe cu legături covalente cu sedimentul, ingestia de hrană contaminată poate fi o cale de expunere semnificativă. Pentru a nu subestima toxicitatea substanțelor puternic lipofile, se poate lua în considerare adăugarea de hrană la sediment înainte de aplicarea substanței chimice testate. Pentru a lua în considerare toate căile de expunere potențiale, această metodă de testare se concentrează pe expunerea pe termen lung. Durata de testare este în intervalul de 20-28 de zile pentru C. riparius și C. yoshimatsui și de 28-65 de zile pentru C. tentans. În cazul în care este nevoie de date pe termen scurt pentru un anumit scop, de exemplu pentru analiza efectelor unei substanțe chimice instabile, după o perioadă de zece zile se pot înlătura probele duplicat suplimentare.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Punctele finale măsurate sunt numărul total de adulți ieșiți și durata până la emergență. Se recomandă ca măsurătorile ratei de supraviețuire și creștere a larvelor să se facă doar după o perioadă de zece zile, în cazul în care sunt necesare date suplimentare pe termen scurt, folosind probe duplicat suplimentare, după caz.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Se recomandă utilizarea de sediment preparat. Sedimentul preparat are o serie de avantaje față de sedimentele naturale:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          variabilitatea experimentală este redusă, pentru că formează o «matrice standardizată» cu caracter reproductibil și se elimină necesitatea de a găsi surse de sediment necontaminate și curate;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          testele pot fi inițiate în orice moment, fără să apară fenomenul de variație sezonieră în sedimentul de testare și nu este nevoie ca sedimentul să fie pretratat pentru înlăturarea faunei indigene; de asemenea, utilizarea sedimentului preparat reduce costul asociat cu colectarea pe teren a unor cantități suficiente de sediment, pentru testele de rutină;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          utilizarea de sediment preparat permite comparații de toxicitate și clasificarea substanțelor în consecință: datele de toxicitate din teste cu sedimente naturale și artificiale au fost comparabile pentru mai multe substanțe chimice (2).
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Definițiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              7.
                           
                           
                              Chironomidele în primul stadiu larvar sunt expuse la o gamă de concentrații de substanță chimică testată în sistemele apă-sediment. Testul începe prin plasarea larvelor în primul stadiu în paharele Berzelius de testare care conțin sistemul apă-sediment, urmată de îmbogățirea substanței testate în apă. La sfârșitul testului se măsoară rata de emergență și dezvoltare a chironomidelor. Dacă este necesar se pot măsura, după 10 zile, și rata de supraviețuire și greutatea larvelor (cu ajutorul unor probe duplicat suplimentare, după caz). Aceste date sunt analizate fie printr-un model de regresie, pentru a estima concentrația care ar produce o reducere cu × % a ratei de emergență, supraviețuire sau creștere a larvelor (de exemplu, EC15, EC50 etc.), fie prin testarea ipotezei statistice, pentru a determina CFEO/CMEO. Pentru această ultimă metodă este nevoie de compararea valorilor de efect cu valorile de control, cu ajutorul testelor statistice.
                           
                        INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA TESTATĂ
                  
                              8.
                           
                           
                              Trebuie să se cunoască solubilitatea substanței testate în apă, presiunea de vapori, măsurată sau calculată, partiția în sediment și stabilitatea în apă și în sediment. Este oportun să fie disponibilă o metodă analitică fiabilă de cuantificare a substanței testate în apa acoperitoare, în apa interstițială și în sediment, a cărei precizie și ale cărei limite de detecție sunt cunoscute. Informații utile includ formula structurală și puritatea substanței testate. Evoluția chimică a substanței testate (de exemplu, disipare, degradare abiotică și biotică etc.) este o altă informație utilă. Îndrumări suplimentare privind substanțele de testare cu proprietăți fizico-chimice care le fac dificil de testat sunt prezentate în referința (12).
                           
                        SUBSTANȚE CHIMICE DE REFERINȚĂ
                  
                              9.
                           
                           
                              Substanțele chimice de referință pot fi testate periodic, ca mijloc de asigurare a fiabilității protocolului de testare și a condițiilor de testare. Exemple de substanțe toxice utilizate cu succes în testele de comparare interlaboratoare și în studiile de validare sunt: lindan, trifuralin, pentaclorfenol, clorura de cadmiu și clorura de potasiu. (1) (2) (5) (6) (13).
                           
                        VALIDITATEA TESTULUI
                  
                              10.
                           
                           
                              Pentru ca testul să fie valid, trebuie să îndeplinească următoarele condiții:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          la sfârșitul testului, emergența în vasele cu loturi martor trebuie să fie de cel puțin 70 % (1) (6);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          emergența C. riparius și C. yoshimatsui din larve în adulți din vasele cu loturi martor trebuie să aibă loc între 12 și 23 de zile după inserarea în vase; pentru C. tentans este nevoie de o perioadă de la 20 până la 65 de zile;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          la sfârșitul testului, în fiecare vas trebuie să se măsoare pH-ul și concentrația de oxigen dizolvat. Concentrația de oxigen trebuie să fie de cel puțin 60 % din valoarea de saturație în aer (VSA) la temperatura utilizată, iar pH-ul apei acoperitoare trebuie să fie în intervalul 6-9, în toate vasele de testare;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          temperatura apei nu trebuie să difere cu mai mult de ± 1,0 °C. Temperatura apei poate fi controlată printr-o cameră izotermică, iar în acest caz temperatura camerei trebuie să fie confirmată într-un interval de timp corespunzător.
                                       
                                    
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Vase de testare
                  
                  
                              11.
                           
                           
                              Studiul este efectuat în pahare Berzelius din sticlă de 600 ml, cu diametru de 8 cm. Se pot folosi și alte recipiente, dar ele trebuie să asigure o adâncime corespunzătoare pentru sediment și apa acoperitoare. Suprafața sedimentului trebuie să fie suficient de mare pentru a permite un spațiu de 2 până la 3 cm2 pentru fiecare larvă. Raportul dintre adâncimea stratului de sediment și adâncimea apei acoperitoare trebuie să fie 1:4. Se recomandă ca recipientele de testare și alte aparate care vor intra în contact cu sistemul de testare să fie complet din sticlă sau dintr-un alt material inert din punct de vedere chimic (de exemplu, teflon).
                           
                        
                     Alegerea speciei
                  
                  
                              12.
                           
                           
                              De preferință, specia care se utilizează în test este Chironomus riparius. Este potrivită și specia Chironomus tentans, dar este mai greu de manipulat și necesită o durată mai mare de testare. Se poate utiliza și Chironomus yoshimatsui. Detalii privind metodele de cultură sunt date în apendicele 2, pentru Chironomus riparius. Sunt disponibile și informații despre condițiile de cultură pentru alte specii, adică Chironomus tentans (4) și Chironomus yoshimatsui (11). Identificarea speciei trebuie să se facă înainte de testare, dar nu este necesară înainte de fiecare test în parte atunci când organismele provin dintr-o cultură internă.
                           
                        
                     Sediment
                  
                  
                              13.
                           
                           
                              De preferință, trebuie să se utilizeze sediment preparat (numit și sediment reconstituit, artificial sau sintetic). Totuși, în cazul în care se folosește sediment natural, caracteristicile acestuia trebuie să fie cunoscute (cel puțin pH-ul, conținutul de carbon organic, dar se recomandă și determinarea altor parametri ca raportul C/N și granulometria) și trebuie să nu existe niciun fel de contaminare și alte organisme care ar putea concura cu chironomidele sau care le-ar putea consuma. De asemenea, se recomandă ca, înainte de utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, sedimentul natural să fie condiționat timp de șapte zile în aceleași condiții care predomină în testul ulterior. Pentru acest test se recomandă următorul sediment preparat, care are la bază solul artificial utilizat în metoda de testare C.8 (14) (1) (15) (16):
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          4-5 % (greutate uscată) turbă: cu un pH cât mai aproape de 5,5-6,0 %; este important să se folosească turbă sub formă de pulbere, fin măcinată (dimensiunea particulei de ≤ 1 mm) și doar uscată cu aer;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          20 % (greutate uscată) caolin (de preferință, cu conținut de caolinit de peste 30 %);
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          75-76 % (greutate uscată) nisip cuarțos (trebuie să predomine nisipul fin, cu peste 50 % particule între 50 și 200 μm);
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          se adaugă apă deionizată pentru a obține un conținut de umiditate al amestecului final în intervalul 30-50 %;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          se adaugă carbonat de calciu cu calitate chimică pură (CaCO3), pentru a ajusta pH-ul amestecului final al sedimentului la 7,0 ± 0,5;
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          conținutul de carbon organic din amestecul final trebuie să fie 2 % (± 0,5 %) și se ajustează prin utilizarea unor cantități corespunzătoare de turbă și nisip, conform (a) și (c).
                                       
                                    
                        
                              14.
                           
                           
                              Trebuie să se cunoască sursa de turbă, argilă caolin și nisip. Componentele sedimentului trebuie să fie verificate, pentru a dovedi absența contaminării chimice (de exemplu, metale grele, compuși organici clorurați, compuși organici fosforici etc.). În apendicele 3 este descris un exemplu de preparare a sedimentului. Se acceptă și amestecul de constituenți uscați, dacă se demonstrează că după adăugarea apei acoperitoare nu apare o separare a constituenților sedimentului (de exemplu, plutirea unor particule de turbă) și că turba sau sedimentul este suficient condiționat.
                           
                        
                     Apă
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Orice tip de apă care corespunde caracteristicilor chimice ale unei ape de diluare de nivel acceptabil, așa cum este prezentat în apendicele 2 și 4, este potrivit ca apă pentru testare. Orice apă potrivită, apă naturală (apă de suprafață sau apă subterană), apă reconstituită (a se vedea apendicele 2) sau apa de la robinet declorurată sunt acceptabile ca apă de cultură și apă de testare, dacă chironomidele vor supraviețui în ea pe durata culturii și testării fără să prezinte semne de stres. La începutul testului, pH-ul apei de testare trebuie să fie între 6 și 9, iar duritatea totală să nu fie mai mare de 400 mg/l CaCO3. Totuși, în cazul în care se bănuiește că există o interacțiune între ionii care determină duritatea apei și substanța testată, trebuie să se utilizeze o apă cu duritate mai scăzută (astfel, în această situație nu trebuie să se folosească mediu Elendt M4). Același tip de apă trebuie să se utilizeze pe toată durata studiului. Parametrii de calitate a apei prezentați în apendicele 4 trebuie să fie măsurați cel puțin de două ori pe an sau ori de câte ori se presupune că este posibil ca aceste caracteristici să se fi schimbat semnificativ.
                           
                        
                     Soluții stoc – Apă îmbogățită
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Concentrațiile de testare se calculează pe baza concentrațiilor din coloana de apă, adică apa care acoperă sedimentul. Soluțiile testate, în concentrațiile alese, se prepară de obicei prin diluarea unei soluții stoc. Soluțiile stoc se prepară de preferință prin dizolvarea substanței testate în mediul experimental. În unele cazuri, poate fi necesară folosirea solvenților sau a agenților de dispersie pentru a realiza o soluție stoc corespunzătoare, cu concentrație corespunzătoare. Exemple de solvenți potriviți sunt acetona, etanolul, metanolul, eterul monometilic de etilen glicol, eterul dimetilic de etilen glicol, dimetilformamida și trietilen glicolul. Agenții de dispersie care pot fi utilizați sunt Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloză 0,01 % și HCO-40. Concentrația de agent de solubilizare în mediul de testare final trebuie să fie minimă (adică ≤ 0,1 ml/l) și să fie aceeași în toate loturile tratate. Când se folosește agent de solubilizare, acesta trebuie să nu provoace efecte semnificative asupra supraviețuirii sau efecte adverse vizibile asupra larvelor de chironomide, în testul pe un lot martor tratat numai cu solvent. Totuși, se va face tot posibilul să se evite folosirea unor astfel de materiale.
                           
                        PROTOCOLUL TESTULUI
                  
                              17.
                           
                           
                              Protocolul testului se referă la alegerea numărului și a intervalelor de concentrații testate, la numărul de vase pentru fiecare nivel de concentrație și la numărul de larve pe fiecare vas. Sunt descrise modelele pentru estimarea punctuală a CE, pentru estimarea CFEO și pentru efectuarea unui test la valori-limită. Analiza de regresie este preferabilă față de testarea ipotezei statistice.
                           
                        
                     Modelul pentru analiza de regresie
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Concentrațiile cu efect (de exemplu CE15, CE50) și intervalul de concentrații în care efectul substanței testate prezintă interes trebuie să fie cuprinse în domeniul concentrațiilor incluse în test. În general, precizia și în special validitatea cu care se pot face estimările concentrațiilor de efect (CEx) sunt mai bune atunci când concentrația de efect se încadrează în limitele concentrațiilor testate. Trebuie să se evite extrapolarea mult sub nivelul celei mai mici concentrații pozitive sau peste nivelul celei mai mari concentrații. Este util să se facă un test preliminar de stabilire a intervalului, pentru a selecta intervalul de concentrații care vor fi utilizate (a se vedea punctul 27).
                           
                        
                              19.
                           
                           
                              Atunci când se estimează CEx, trebuie să se testeze cel puțin cinci concentrații și trei probe duplicat pentru fiecare concentrație. În orice caz, este recomandat să se utilizeze concentrații de testare suficiente, pentru a permite o bună estimare a modelului. Factorul dintre concentrații nu trebuie să fie mai mare de doi (cu o posibilă excepție în cazurile în care curba de răspuns a dozei are o înclinare mică). Numărul de duplicate la fiecare tratare poate fi redus în cazul în care se crește numărul de concentrații de testare cu răspunsuri diferite. La creșterea numărului de duplicate sau la reducerea mărimii intervalelor concentrațiilor de testare, intervalele de încredere pentru test au tendința de a se îngusta. Atunci când trebuie să se estimeze rata de supraviețuire și de creștere a larvelor într-un interval de 10 zile, este nevoie de duplicate suplimentare.
                           
                        
                     Modelul pentru estimarea CFEO/CMEO
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Atunci când urmează să se estimeze CMEO sau CFEO, trebuie să se utilizeze cinci concentrații de testare cu cel puțin patru probe duplicat, iar factorul dintre concentrații nu trebuie să fie mai mare de doi. Numărul de probe duplicat trebuie să fie suficient pentru a asigura o putere statistică adecvată pentru detectarea unei diferențe de 20 % față de martor, la un nivel de semnificație statistică de 5 % (p = 0,05). Pentru rata de dezvoltare, de obicei se recomandă analiza varianței (ANOVA), cum ar fi testul lui Dunnett sau testul lui Williams (17) (18) (19) (20). Pentru rata de emergență, se pot utiliza testul Cochran-Armitage, testul exact al lui Fisher (cu corecția Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel.
                           
                        
                     Test la valori-limită
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Se poate efectua un test la valori-limită (o concentrație de testare și martor) atunci când nu s-au observat efecte în testul preliminar de stabilire a intervalului. Scopul testului la valori-limită este să indice faptul că valoarea de toxicitate a substanței testate este mai mare decât limita de concentrație testată. În această metodă de testare nu se poate face nicio sugestie de concentrație recomandată; se lasă acest lucru la latitudinea organismelor de reglementare. De obicei, sunt necesare cel puțin șase probe duplicat atât pentru loturile tratate, cât și pentru cele martor. Trebuie să se demonstreze o putere statistică adecvată pentru detectarea unei diferențe de 20 % față de lotul martor, la un nivel de semnificație statistică de 5 % (p = 0,05). Cu răspuns metric (rată de dezvoltare și greutate), testul t este o metodă statistică adecvată atunci când datele îndeplinesc cerințele acestui test (normalitate, varianțe omogene). În cazul în care nu sunt îndeplinite aceste cerințe, se pot utiliza testul t pentru varianțe inegale sau un test nonparametric, cum ar fi testul Wilcoxon-Mann-Whithey. Pentru rata de emergență este adecvat testul exact al lui Fisher.
                           
                        PROCEDURĂ
                  
                     Condiții de expunere
                  
                  
                     Prepararea sistemului apă-sediment îmbogățit
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              În vasele de testare se adaugă cantități corespunzătoare de sediment preparat (a se vedea punctele 13-14 și apendicele 3), pentru a forma un strat de cel puțin 1,5 cm. Se adaugă apă până la adâncimea de 6 cm (a se vedea punctul 15). Raportul între adâncimea stratului de sediment și adâncimea apei nu trebuie să fie mai mare de 1:4, iar stratul de sediment nu trebuie să fie mai adânc de 3 cm. Sistemul apă-sediment trebuie să fie lăsat timp de șapte zile în condiții de aerare ușoară, înainte de adăugarea organismelor testate (a se vedea punctul 14 și apendicele 3). Pentru a evita separarea ingredientelor sedimentului și repunerea în suspensie a materiei fine în timpul adăugării apei de testare în coloana de apă, sedimentul poate fi acoperit cu un disc din plastic în timp ce se toarnă apa, apoi discul este înlăturat imediat. Se pot utiliza și alte dispozitive.
                           
                        
                              23.
                           
                           
                              Vasele de testare trebuie să fie acoperite (de exemplu, cu plăci din sticlă). La nevoie, în timpul studiului se completează apa până la volumul inițial, pentru a compensa evaporarea. Această operațiune trebuie să se facă cu apă distilată sau apă deionizată, pentru a preveni acumularea de săruri.
                           
                        
                     Adăugarea de organisme de testare
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Cu patru până la cinci zile înainte de adăugarea organismelor de testare în vasele de testare, pontele trebuie să fie prelevate din culturi și plasate în vase mici, în mediu de cultură. Se poate utiliza un mediu de cultură vechi, provenit din cultura-mamă, sau un mediu proaspăt preparat. În cazul în care se recurge la a doua metodă, la mediul de cultură trebuie să se adauge o cantitate mică de hrană, de exemplu alge verzi și/sau câteva picături de filtrat de la o suspensie de hrană pentru pești fin măcinată (a se vedea apendicele 2). Trebuie să se utilizeze doar ponte proaspăt depuse. În mod normal, larvele încep să eclozeze la câteva zile după ce sunt depuse ouăle (2 până la 3 zile pentru Chironomus riparius la 20 °C și 1 până la 4 zile pentru Chironomus tentans la 23 °C și Chironomus yoshimatsui la 25 °C), iar creșterea larvară are loc în patru stadii, fiecare cu o durată de 4-8 zile. În studiu trebuie să se utilizeze larve din primul stadiu (2-3 sau 1-4 zile după eclozare). Stadiul musculițelor poate fi verificat prin măsurarea lățimii capsulei cefalice (6).
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Câte douăzeci de larve în primul stadiu sunt repartizate arbitrar la fiecare vas de testare care conține sediment îmbogățit și apă, cu ajutorul unei pipete cu vârf teșit. În timpul adăugării larvelor în vasele de testare trebuie să se oprească aerarea apei și ea trebuie să rămână oprită pentru încă 24 de ore după adăugarea larvelor (a se vedea punctele 24 și 32). Conform protocolului de testare utilizat (a se vedea punctele 19 și 20), numărul de larve utilizate în funcție de concentrație este 60 pentru estimarea punctuală a CE și 80 pentru determinarea CFEO.
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              La douăzeci și patru de ore după adăugarea larvelor, substanța testată este îmbogățită în coloana de apă acoperitoare și se asigură din nou o aerare ușoară. Cu ajutorul unei pipete, se aplică mici volume de soluții de substanță testată sub suprafața apei. Apoi, apa acoperitoare trebuie să fie amestecată cu grijă, pentru a nu perturba sedimentul.
                           
                        
                     Concentrațiile substanței testate
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Poate fi util un test de stabilire a intervalului, pentru a determina gama de concentrații pentru testul definitiv. În acest scop, se utilizează o serie de concentrații de substanță testată, distribuite la intervale largi. Pentru a obține aceeași densitate de suprafață pentru chironomide, care va fi utilizată pentru testul definitiv, chironomidele sunt expuse la fiecare concentrație a substanței testate pentru o perioadă care permite estimarea unor concentrații de testare adecvate și nu este nevoie de duplicate.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Concentrațiile de testare pentru testul definitiv sunt decise pe baza rezultatului obținut în testul de stabilire a intervalului. Trebuie să se utilizeze cel puțin cinci concentrații, care să fie alese după metoda descrisă la punctele 18-20.
                           
                        
                     Martori
                  
                  
                              29.
                           
                           
                              În test trebuie să se includă vase cu probe-martor, care să nu conțină nicio substanță testată, dar în care să se afle sediment, cu un număr corespunzător de duplicate (a se vedea punctele 19-20). În cazul în care pentru aplicarea substanței testate s-a utilizat un solvent (a se vedea punctul 16), trebuie să se adauge un martor de solvent pentru sediment.
                           
                        
                     Sistem de testare
                  
                  
                              30.
                           
                           
                              Sunt utilizate sisteme statice. Sisteme semistatice sau dinamice, cu reînnoire continuă sau intermitentă a apei acoperitoare pot fi folosite în cazuri excepționale, de exemplu în cazul în care specificațiile privind calitatea apei devin inadecvate pentru organismul testat sau afectează echilibrul chimic (de exemplu, nivelurile de oxigen dizolvat scad prea mult, concentrația de produse excretoare crește prea mult sau minerale se dizolvă din sediment și afectează pH-ul și/sau duritatea apei. Totuși, în mod normal, alte metode de ameliorare a calității apei acoperitoare, cum ar fi aerarea, vor fi suficiente și de preferat.
                           
                        
                     Hrană
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Larvele trebuie să fie hrănite, de preferință zilnic sau cel puțin de trei ori pe săptămână. Hrana pentru pești (o suspensie în apă sau hrană măcinată fin, de exemplu TetraMin sau TetraPhyll; a se vedea detalii în apendicele 2), o cantitate de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg pentru C. yoshimatsui) pentru fiecare larvă, zilnic, pare adecvată pentru larvele tinere în primele 10 zile. Pentru larvele mai mature poate fi necesară o cantitate de hrană ceva mai mare: o cantitate zilnică de 0,5-1 mg pentru fiecare larvă ar trebui să fie suficientă pentru restul testului. Rația de hrană trebuie să fie redusă în toate loturile tratate și în loturile martor, în cazul în care se observă creștere fungică sau atunci când se constată mortalitate în loturile martor. Atunci când nu se poate opri proliferarea fungică, testul trebuie să fie repetat. La testarea unor substanțe cu capacitate mare de adsorbție (de exemplu, cu log Kow > 5) sau a unor substanțe cu legătură covalentă cu sedimentul, cantitatea de hrană necesară pentru asigurarea supraviețuirii și creșterii naturale a organismelor poate fi adăugată la sedimentul preparat înainte de perioada de stabilizare. Pentru aceasta, trebuie să se utilizeze material vegetal în loc de hrană pentru pești, de exemplu se poate adăuga o cantitate de 0,5 % (greutate uscată) frunze măcinate mărunt de urzică (Urtica dioica), de dud (Morus alba), de trifoi alb (Trifolium repens), de spanac (Spinacia oleracea) sau de alt material vegetal (Cerophyl sau celuloză alfa).
                           
                        
                     Condiții de incubare
                  
                  
                              32.
                           
                           
                              Aerarea ușoară a apei acoperitoare în vasele de testare se face, de preferință, cu 24 de ore după adăugarea larvelor și este urmărită pe tot parcursul testului (trebuie să se acorde atenție concentrației de oxigen dizolvat, care nu trebuie să scadă sub nivelul de 60 % din VSA). Aerarea se face printr-o pipetă Pasteur din sticlă, fixată la 2-3 cm deasupra stratului de sediment (adică una sau câteva bule de aer pe secundă). La testarea substanțelor chimice volatile, e bine să se aibă grijă să nu se aereze sistemul apă-sediment.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Testul se face la o temperatură constantă de 20 °C (± 2 °C). Pentru C. tentans și C. yoshimatsui, temperaturile recomandate sunt 23 °C și respectiv 25 °C (± 2 °C). Se utilizează o perioadă de expunere la lumină de 16 ore, iar nivelul de iluminare trebuie să fie de 500-1 000 de lucși.
                           
                        
                     Durata de expunere
                  
                  
                              34.
                           
                           
                              Expunerea începe cu adăugarea de larve la vasele cu probe îmbogățite și la cele cu probe-martor. Durata maximă de expunere este de 28 de zile pentru C. riparius și C. yoshimatsui și de 65 de zile pentru C. tentans. În cazul în care musculițele ies mai devreme, testul poate fi încheiat după cel puțin cinci zile de la emergența ultimului adult din lotul-martor.
                           
                        OBSERVAȚII
                  
                     Emergență
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Se determină perioada de dezvoltare și numărul total de musculițe masculi și femele deplin ieșite din stadiul de larvă. Masculii sunt ușor de identificat după antenele plumoase.
                           
                        
                              36.
                           
                           
                              Vasele de testare trebuie să fie controlate cel puțin de trei ori pe săptămână, pentru a evalua vizual orice comportament anormal (de exemplu, părăsirea sedimentului, un mod neobișnuit de a înota), prin comparație cu lotul martor. În perioada de emergență probabilă este nevoie să se numere zilnic musculițele ieșite din stadiul de larvă. Zilnic se înregistrează sexul și numărul musculițelor ieșite complet din stadiul de larvă. După identificare, musculițele sunt scoase din vase. Orice ponte depuse înainte de terminarea testului trebuie să fie înregistrate și apoi înlăturate, pentru a preveni reintroducerea larvelor în sediment. De asemenea, se înregistrează numărul de pupe vizibile la care nu s-a produs emergența. În apendicele 5 se oferă orientări privind măsurarea emergenței.
                           
                        
                     Creștere și supraviețuire
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              În cazul în care este nevoie de datele pe 10 zile privind supraviețuirea și creșterea larvelor, trebuie să se prevadă de la început vase de testare suplimentare, pentru a putea fi utilizate ulterior. Sedimentul din aceste vase suplimentare este cernut printr-o sită de 250 μm, pentru reținerea larvelor. Simptomele care indică moartea larvelor sunt imobilitatea sau lipsa de reacție la stimuli mecanici. Larvele care nu sunt recuperate trebuie să fie numărate tot ca larve moarte (există posibilitatea ca larvele care au murit la începutul testului să fi fost degradate de microbi). Se determină greutatea uscată (fără resturi de la larvele moarte) a larvelor supraviețuitoare din fiecare vas de testare, apoi se calculează greutatea uscată medie individuală pentru fiecare vas. Este util să se determine în ce stadiu de dezvoltare se află larvele supraviețuitoare; pentru aceasta, se poate măsura lățimea capsulei cefalice a fiecărui individ.
                           
                        
                     Măsurători analitice
                  
                  
                     Concentrația substanței testate
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Cerința minimă este ca probe din apa acoperitoare, din apa interstițială și din sediment să fie analizate la începutul testului (de preferință, la o oră după aplicarea substanței testate) și la sfârșitul testului, la concentrația cea mai mare și la o concentrație mai scăzută. Aceste determinări ale concentrației substanței testate furnizează informații despre comportamentul/partiția substanței testate în sistemul apă-sediment. Prelevarea de probe din sediment la începutul testului poate influența sistemul de testare (de exemplu, prin înlăturarea larvelor), astfel încât trebuie să se utilizeze vase de testare suplimentare pentru efectuarea determinărilor analitice la începutul și în timpul testului, după caz (a se vedea punctul 39). S-ar putea ca măsurătorile în sediment să nu fie necesare, în cazul în care partiționarea substanței testate între apă și sediment a fost clar determinată în cadrul unui studiu apă/sediment, în condiții comparabile (de exemplu, raportul sediment/apă, tipul de aplicare, conținutul de carbon organic al sedimentului).
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Atunci când se fac măsurători intermediare (de exemplu, în ziua a șaptea) și când pentru analiză este nevoie de probe mari, care nu pot fi prelevate din vasele de testare fără a influența sistemul de testare, trebuie să se efectueze determinări analitice pe probe din vase de testare suplimentare, tratate în același mod (inclusiv prezența organismelor de testare), dar neutilizate pentru observații biologice.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Procedura recomandată pentru izolarea apei interstițiale este centrifugarea, de exemplu la 10 000 g și 4 °C, timp de 30 de minute. Totuși, în cazul în care se demonstrează că substanța testată nu adsoarbe pe filtre, se poate accepta și filtrarea. În unele cazuri, nu se pot analiza concentrațiile în apa interstițială, pentru că dimensiunea eșantionului este prea mică.
                           
                        
                     Parametri fizico-chimici
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              PH-ul, oxigenul dizolvat în apa de testare și temperatura din vasele de testare trebuie să fie măsurate în mod corespunzător (a se vedea punctul 10). Duritatea și conținutul de amoniac trebuie să fie măsurate în loturile martor și într-un vas de testare, la cea mai mare concentrație, la începutul și la sfârșitul testului.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Interpretarea rezultatelor
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Scopul acestui test este să se determine efectul unei substanțe testate asupra ratei de dezvoltare și asupra numărului total de musculițe masculi și femele ieșite complet din stadiul de larvă sau, în cazul testului de 10 zile, efectele asupra supraviețuirii și greutății larvelor. În cazul în care nu există indicații privind sensibilități diferite, din punct de vedere statistic, rezultatele obținute de la masculi și de la femele pot fi grupate, în scop statistic. Diferențele de sensibilitate între sexe pot fi interpretate statistic, de exemplu cu ajutorul unui test tabelar χ2-r × 2. După zece zile trebuie să se determine rata de supraviețuire a larvelor și greutatea uscată medie individuală pentru fiecare vas, unde este cazul.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Concentrațiile de efect exprimate ca și concentrații în apa acoperitoare sunt calculate, de preferință, pe baza concentrațiilor măsurate la începutul testului (a se vedea punctul 38).
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Pentru a calcula o estimare punctuală pentru CE50 sau orice altă CEx, se pot utiliza statisticile pentru fiecare vas, ca duplicate adevărate. La calcularea intervalului de încredere pentru orice CEx, trebuie să se țină seama de variabilitatea între vase sau trebuie să se demonstreze că această variabilitate este atât de redusă încât poate fi ignorată. Atunci când modelul este ajustat cu metoda celor mai mici pătrate, trebuie să se aplice o transformare la statistica pentru fiecare vas, în vederea îmbunătățirii omogenității varianței. Totuși, valorile CEx trebuie să fie calculate după ce reacția revine la valoarea originală.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Atunci când analiza statistică are ca scop determinarea CFEO/CMEO prin testarea ipotezei statistice, variabilitatea între vase trebuie să fie luată în considerare, de exemplu printr-o analiză a varianței cu mai multe criterii de clasificare. Alternativ, mai multe teste robuste (21) pot fi potrivite în situații în care există violări ale ipotezelor ANOVA obișnuite.
                           
                        
                     Rată de emergență
                  
                  
                              46.
                           
                           
                              Ratele de emergență sunt date cantitative și pot fi analizate cu ajutorul testului Cochran-Armitage aplicat în mod descrescător atunci când se așteaptă o relație doză-reacție de tip monoton li când aceste date corespund așteptărilor. În caz contrar, se pot utiliza testul exact al lui Fisher sau testul Mantel-Haenszel, cu valori p ajustate Bonferroni-Holm. În cazul în care există dovezi că variabilitatea între probe duplicat este mai mare, la aceeași concentrație, decât cea indicată de o distribuție binomială (adesea numită variație «extra-binomială»), atunci trebuie să se utilizeze un test robust Cochran-Armitage sau testul exact al lui Fisher, așa cum se propune în (21).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Se determină suma musculițelor ieșite în fiecare vas, ne, care se împarte la numărul de larve introduse, na:
                              
                                 
                              unde:
                              
                                          ER
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          rata de emergență
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          numărul de musculițe ieșite în fiecare vas
                                       
                                    
                                          na
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          numărul de larve introduse în fiecare vas
                                       
                                    
                        
                              48.
                           
                           
                              O alternativă mai potrivită pentru probele de dimensiuni mari, atunci când există varianță extra-binomială, este tratarea ratei de emergență ca o reacție continuă și utilizarea unor proceduri, cum ar fi testul lui William, atunci când se așteaptă o relație doză-răspuns de tip monoton, care corespunde cu aceste date ER. Testul lui Dunnett este potrivit în cazurile în care nu există monotonie. O dimensiune mare a eșantionului este definită, în acest caz, ca fiind un număr mai mare de cinci musculițe ieșite și cinci musculițe neieșite, pentru fiecare probă identică (vas).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Pentru aplicarea metodelor ANOVA, valorile ER trebuie să fie mai întâi transformate prin transformarea trigonometrică sau prin transformarea Freeman-Tukey, pentru a obține o distribuție aproximativ normală și pentru a egaliza varianțele. Testul Cochran-Armitage, testul exact al lui Fisher (Bonferroni) sau testul Mantel-Haenszel pot fi aplicate atunci când se utilizează frecvențe absolute. Transformarea trigonometrică este aplicată prin preluarea arcsinusului (sin–1) rădăcinii pătrate a ER.
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Pentru rate de emergență, valorile CEx sunt calculate cu ajutorul analizei de regresie [sau, de exemplu, probit (22), logit, Weibull, un program informatic comercial corespunzător etc.]. În cazul în care analiza de regresie nu are succes (de exemplu, atunci când există mai puțin de două reacții parțiale), se utilizează alte metode nonparametrice, cum ar fi media mobilă sau interpolarea simplă.
                           
                        
                     Rată de dezvoltare
                  
                  
                              51.
                           
                           
                              Durata medie de dezvoltare reprezintă intervalul de timp mediu dintre introducerea larvelor (ziua 0 a testului) și emergența cohortei experimentale de musculițe. (Pentru calculul duratei reale de dezvoltare, trebuie să se ia în considerare vârsta larvelor la momentul introducerii). Rata de dezvoltare este inversul duratei de dezvoltare (unitate: 1/zi) și reprezintă acea parte din dezvoltarea larvară care are loc în cursul unei zile. Rata de dezvoltare este preferată pentru evaluarea acestor studii de toxicitate a sedimentelor, pentru că varianța sa este mai mică și este mai omogenă și mai apropiată de distribuția normală, comparativ cu durata de dezvoltare. Prin urmare, procedurile de testare parametrică puternice se pot utiliza mai curând pentru rata de dezvoltare, decât pentru durata de dezvoltare. Pentru rata de dezvoltare ca reacție continuă, valorile CEx pot fi estimate prin utilizarea analizei de regresie [de exemplu (23), (24)].
                           
                        
                              52.
                           
                           Pentru testele statistice următoare, se presupune că numărul de musculițe observate la inspecția din ziua × au ieșit la jumătatea intervalului de timp dintre ziua × și ziua x - l (l = lungimea intervalului de inspecție, de obicei o zi). Rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas (
                                 ) este calculată cu formula:
                                 
                              unde:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          rata medie de dezvoltare pentru fiecare vas
                                       
                                    
                                          i
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          indicele intervalului de inspecție
                                       
                                    
                                          m
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          numărul maxim de intervale de inspecție
                                       
                                    
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          numărul de musculițe ieșite în intervalul de inspecție i
                                       
                                    
                                          ne
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          numărul total de musculițe ieșite la sfârșitul experimentului (= )
                                       
                                    
                                          xi
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          rata de dezvoltare a musculițelor ieșite în intervalul i
                                       
                                    
                                 
                              unde:
                              
                                          ziuai
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          ziua inspecției (zile de la aplicare)
                                       
                                    
                                          li
                                          
                                       
                                       
                                          :
                                       
                                       
                                          lungimea intervalului de inspecție i (zile, de obicei 1 zi)
                                       
                                    
                        
                     Raport de testare
                  
                  
                              53.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să includă cel puțin următoarele informații:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      natura fizică și, dacă sunt relevante, proprietățile fizico-chimice [solubilitatea în apă, presiunea de vapori, coeficientul de partiție în sol (sau în sediment, dacă este disponibil), stabilitatea în apă etc.];
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datele de identificare chimică (denumirea comună, denumirea chimică, formula structurală, numărul CAS etc.), inclusiv puritatea și metoda analitică de cuantificare a substanței testate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Speciile folosite pentru testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      animalele de testare utilizate: specie, denumire științifică, sursa organismelor și condițiile de reproducere;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații privind manipularea pontelor și a larvelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vârsta animalelor testate la inserarea în vasele de testare.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sedimentul folosit, adică sediment natural sau preparat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pentru sedimentul natural, localizarea și descrierea locului de prelevare a probelor, inclusiv, dacă este posibil, istoricul contaminării; caracteristici: pH, conținut de carbon organic, raport C/N și granulometrie (dacă este cazul);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      prepararea sedimentului: ingrediente și caracteristici (conținut de carbon organic, pH, umiditate etc. la începutul testului);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      pregătirea apei de testare (dacă se folosește apă reconstituită) și caracteristici (concentrație de oxigen, pH, conductivitate, duritate etc. la începutul testului);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      adâncimea sedimentului și a apei acoperitoare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      volumul apei acoperitoare și al apei interstițiale; greutatea sedimentului ud cu și fără apă interstițială;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      vasele de testare (material și dimensiune);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de preparare a soluțiilor stoc și concentrațiile de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      aplicarea substanței testate; concentrația de testare utilizată, numărul de duplicate și utilizarea unui solvent, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      condițiile de incubare: temperatură, ciclu de lumină și nivel de iluminare, aerare (frecvență și intensitate);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații detaliate privind hrănirea, inclusiv tipul de hrană, prepararea, cantitatea și regimul de hrănire.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatele:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      valorile nominale ale concentrațiilor de testare, valorile măsurate ale concentrațiilor de testare și rezultatul tuturor analizelor pentru determinarea concentrației substanței testate în vasul de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      calitatea apei în vasele de testare, adică pH-ul, temperatura, oxigenul dizolvat, duritatea și conținutul de amoniac;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      înlocuirea apei de testare evaporate, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul de musculițe masculi și femele ieșite în fiecare vas și în fiecare zi;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul de larve care nu s-au transformat în musculițe, în fiecare vas;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutatea medie individuală a larvelor în fiecare vas și pentru fiecare stadiu larvar, dacă este cazul;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procentul de emergență pe fiecare probă identică și concentrația de testare (musculițe masculi și femele, împreună);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rata medie de dezvoltare a musculițelor complet ieșite din stadiul de larvă pe fiecare probă identică și rata de tratare (musculițe masculi și femele împreună);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      estimări ale efectelor toxice, de exemplu CEx (și intervalele de încredere asociate), CFEO și/sau CMEO și metode statistice utilizate pentru determinarea lor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea rezultatelor, inclusiv orice influență asupra rezultatului testului rezultată din abaterile de la prezenta metodă de testare.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Fleming R. et al. (1994), Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              SETAC (1993), Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              ASTM International/E1706-00 (2002), Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp. 1125-1241. În ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Environment Canada (1997), Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius), Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              US-EPA (2000), Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, second edition, EPA 600/R-99/064, March 2000, Revision to the first edition dated June 1994.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), Chironomid Sediment toxicity Test.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Milani D., Day K.E., McLeay D.J., Kirby R.S. (1996), Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius), Technical Report. Environment Canada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Canada.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Sugaya Y. (1997), Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui, Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Kawai K. (1986), Fundamental studies on Chironomid allergy, I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera), Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Environment Canada (1995), Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant, Report EPS 1/RM/30, September 1995.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Capitolul C.8 din prezenta anexă, «Toxicitatea la râme»,
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Suedel B.C. and Rodgers J.H. (1994), Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing, Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Naylor C. and Rodrigues C. (1995), Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment, Chemosphere 31: 3291-3303.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Dunnett C.W. (1964), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20: 482-491.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Williams D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27: 103-117.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Williams D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28: 510-531.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48:577-585.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Christensen E.R. (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model, Water Research 18: 213-221.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Bruce and Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Slob W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints, Toxicol. Sci. 66: 298-312.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚII
                     În cadrul prezentei metode de testare se folosesc următoarele definiții și prescurtări:
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Sedimentul preparat sau sedimentul reconstituit, artificial sau sintetic: un amestec de materiale utilizat pentru a simula componentele fizice ale sedimentului natural.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Apa acoperitoare: apa plasată peste sediment în vasul de testare.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Apa interstițială: apa care ocupă spațiul dintre sediment și particulele de sol.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Apa îmbogățită: apa la care s-a adăugat substanța testată.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Substanța chimică testată: orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                              
                           
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Recomandări pentru cultura de Chironomus riparius
                        
                     
                     
                                 1.
                              
                              
                                 Larvele de Chironomus pot fi crescute în vase de cristalizare sau în recipiente mai mari. Pe fundul unui recipient se împrăștie nisip cuarțos într-un strat subțire, de circa 5-10 mm grosime. Un substrat adecvat s-a dovedit a fi și kieselgur (de exemplu Merck, articolul 8117). Este suficient un strat mai subțire, de maximum câțiva mm. Apoi se adaugă apa corespunzătoare, la o adâncime de câțiva cm. Nivelurile de apă trebuie să fie completate la nevoie, pentru a compensa pierderea prin evaporare și pentru a preveni uscarea. Apa poate fi înlocuită, dacă este necesar. Trebuie să se asigure o aerare ușoară. Vasele în care sunt crescute larvele trebuie să fie păstrate într-o cutie adecvată, pentru a nu permite ca adulții emergenți să scape. Cutia trebuie să fie suficient de mare pentru a permite mișcarea în voie a adulților emergenți, altfel este posibil să nu apară copulația (dimensiunea minimă este de circa 30 × 30 × 30 cm).
                              
                           
                                 2.
                              
                              
                                 Cutiile trebuie să fie păstrate la temperatura camerei sau într-o încăpere cu mediu constant, la 20 ± 2 °C, cu o perioadă de expunere la lumină de 16 ore (la un nivel de iluminare de circa 1 000 de lucși), cu 8 ore de întuneric. S-a raportat că o umiditate a aerului mai mică de 60 % umiditate relativă poate împiedica reproducerea.
                              
                           
                        Apa de diluție
                     
                     
                                 3.
                              
                              
                                 Se poate utiliza orice apă naturală sau sintetică adecvată. În mod obișnuit, se folosește apă de fântână, apă de la robinet declorurată și medii artificiale (de exemplu, mediu Elendt «M4» sau «M7», a se vedea mai jos). Apa trebuie să fie aerată înainte de utilizare. Dacă este nevoie, apa de cultură poate fi reînnoită prin turnarea sau sifonarea cu atenție a apei uzate din vasele de cultură, fără să se distrugă tuburile de larve.
                              
                           
                        Hrănirea larvelor
                     
                     
                                 4.
                              
                              
                                 Larvele de Chironomus trebuie să fie hrănite cu hrană pentru pești sub formă de fulgi (TetraMin®, TetraPhyll® sau altă marcă patentată similară de hrană pentru pești) la aproximativ 250 mg pe zi pentru fiecare vas. Hrana poate fi administrată sub formă de pulbere măcinată uscată sau ca suspensie în apă: o cantitate de 1,0 g de hrană sub formă de fulgi se adaugă la 20 ml de apă de diluție și se amestecă pentru a obține un amestec omogen. Acest preparat poate fi administrat la o rată de circa 5 ml pentru fiecare vas și fiecare zi (a se agita înainte de utilizare). Larvele cu vârstă mai mare pot primi mai mult.
                              
                           
                                 5.
                              
                              
                                 Hrănirea este ajustată în funcție de calitatea apei. Dacă mediul de cultură devine «neclar», trebuie să se micșoreze cantitatea de hrană. Adăugarea de hrană trebuie să fie atent monitorizată. Prea puțină mâncare va conduce la emigrarea larvelor spre coloana de apă, iar o cantitate prea mare de hrană va avea ca rezultat creșterea activității microbiene și concentrații reduse de oxigen. Ambele condiții pot conduce la scăderea ratelor de creștere.
                              
                           
                                 6.
                              
                              
                                 Se pot adăuga și câteva celule de alge verzi (de exemplu Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris), atunci când se pregătesc noile vase de cultură.
                              
                           
                        Hrănirea adulților ieșiți din larve
                     
                     
                                 7.
                              
                              
                                 Unele experimente au sugerat că se poate folosi ca hrană pentru adulții ieșiți din larve un tampon de vată îmbibat într-o soluție saturată de zaharoză.
                              
                           
                        Emergență
                     
                     
                                 8.
                              
                              
                                 La 20 ± 2 °C, adulții vor începe să iasă din vasele de creștere a larvelor, după aproximativ 13-15 zile. Masculii sunt ușor de identificat după antenele plumoase.
                              
                           
                        Ponte
                     
                     
                                 9.
                              
                              
                                 După ce adulții sunt prezenți în cutia de creștere, toate vasele de creștere a larvelor trebuie să fie verificate de trei ori pe săptămână, pentru a observa depunerea de ponte gelatinoase. Dacă aceasta apare, pontele trebuie să fie înlăturate cu atenție. Ele trebuie să fie transferate într-un vas mic, care conține o probă din apa în care au crescut. Pontele sunt utilizate pentru a începe un nou vas de cultură (de exemplu, 2-4 ponte/vas) sau sunt folosite pentru teste de toxicitate.
                              
                           
                                 10.
                              
                              
                                 Larvele în primul stadiu trebuie să eclozeze după 2-3 zile.
                              
                           
                        Pregătirea de noi vase de cultură
                     
                     
                                 11.
                              
                              
                                 După constituirea culturilor, se poate pregăti un nou vas de cultură larvară o dată pe săptămână sau mai puțin frecvent, în funcție de cerințele de testare, prin înlăturarea vaselor mai vechi după ce musculițele adulte au ieșit din larve. Cu ajutorul acestui sistem, se va asigura o cantitate regulată de adulți, cu minimum de manipulare.
                              
                           
                        Pregătirea soluțiilor de testare «M4» și «M7»
                     
                     
                                 12.
                              
                              
                                 Elendt (1990) a descris mediul «M4». Mediul «M7» este preparat la fel ca mediul «M4», cu excepția substanțelor indicate în tabelul 1, pentru care concentrațiile sunt de patru ori mai scăzute în «M7» față de «M4». Este în pregătire o publicație privind mediul «M7» (Elendt, comunicare personală). Soluția de testare nu trebuie să fie preparată conform indicațiilor lui Elendt și Bias (1990) deoarece concentrațiile de NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 și K2HPO4 indicate pentru prepararea soluțiilor stoc nu sunt adecvate.
                              
                           
                        Prepararea mediului «M7»
                     
                     
                                 13.
                              
                              
                                 Fiecare soluție stoc (I) este preparată individual, iar din aceste soluții stoc (I) se prepară o soluție stoc combinată (II) (a se vedea tabelul 1). Cincizeci de ml din soluția stoc combinată (II) și cantitățile din fiecare soluție stoc de macronutrienți care sunt indicate în tabelul 2 se adăugă la un litru de apă deionizată, pentru a prepara mediul «M7». Se prepară o soluție stoc de vitamine, prin adăugarea a trei vitamine la apa deionizată, așa cum se indică în tabelul 3, iar 0,1 ml din soluția stoc de vitamine combinată se adaugă la mediul final «M7» cu puțin timp înainte de utilizare. (Soluția stoc combinată de vitamine se păstrează în stare înghețată, în mici alicote). Mediul este aerat și stabilizat.
                                 
                                    Tabelul 1
                                 
                                 
                                    Soluții stoc de microelemente pentru mediile M4 și M7
                                 
                                 
                                             Soluții stoc (I)
                                          
                                          
                                             Cantitate (mg) adăugată la un litru de apă deionizată
                                          
                                          
                                             Pentru a prepara soluția stoc combinată (II): se amestecă următoarele cantități (ml) de soluții stoc (I) și se adaugă la un litru de apă deionizată
                                          
                                          
                                             Concentrații finale în soluțiile de testare (mg/l)
                                          
                                       
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                          
                                             M4
                                          
                                          
                                             M7
                                          
                                       
                                             H3BO3
                                                 (18)
                                             
                                          
                                          
                                             57 190
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             2,86
                                          
                                          
                                             0,715
                                          
                                       
                                             MnCl2 · 4 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             7 210
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,361
                                          
                                          
                                             0,090
                                          
                                       
                                             LiCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             6 120
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,306
                                          
                                          
                                             0,077
                                          
                                       
                                             RbCl (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 420
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,071
                                          
                                          
                                             0,018
                                          
                                       
                                             SrCl2 · 6 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             3 040
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,152
                                          
                                          
                                             0,038
                                          
                                       
                                             NaBr (18)
                                             
                                          
                                          
                                             320
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             Na2MoO4 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             1 260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,063
                                          
                                          
                                             0,016
                                          
                                       
                                             CuCl2 · 2 H2O (18)
                                             
                                          
                                          
                                             335
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,25
                                          
                                          
                                             0,017
                                          
                                          
                                             0,004
                                          
                                       
                                             ZnCl2
                                             
                                          
                                          
                                             260
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                          
                                             0,013
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 6 H2O
                                          
                                          
                                             200
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                          
                                             0,010
                                          
                                       
                                             KI
                                          
                                          
                                             65
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                          
                                             0,0033
                                          
                                       
                                             Na2SeO3
                                             
                                          
                                          
                                             43,8
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                          
                                             0,0022
                                          
                                       
                                             NH4VO3
                                             
                                          
                                          
                                             11,5
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                          
                                             0,00058
                                          
                                       
                                             Na2EDTA · 2 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             5 000
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             2,5
                                          
                                          
                                             0,625
                                          
                                       
                                             FeSO4 · 7 H2O (18)
                                                 (19)
                                             
                                          
                                          
                                             1 991
                                          
                                          
                                             20,0
                                          
                                          
                                             5,0
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             0,249
                                          
                                       
                                    Tabelul 2
                                 
                                 
                                    Soluții stoc de macronutrienți pentru mediile M4 și M7
                                 
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Cantitate adăugată la un litru de apă deionizată
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Cantitate de soluții stoc de macronutrienți adăugate pentru prepararea mediilor M4 și M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Concentrații finale în soluțiile de testare M4 și M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             CaCl2 · 2 H2O
                                          
                                          
                                             293 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             293,8
                                          
                                       
                                             MgSO4 · 7 H2O
                                          
                                          
                                             246 600
                                          
                                          
                                             0,5
                                          
                                          
                                             123,3
                                          
                                       
                                             KCl
                                          
                                          
                                             58 000
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             5,8
                                          
                                       
                                             NaHCO3
                                             
                                          
                                          
                                             64 800
                                          
                                          
                                             1,0
                                          
                                          
                                             64,8
                                          
                                       
                                             NaSiO3 · 9 H2O
                                          
                                          
                                             50 000
                                          
                                          
                                             0,2
                                          
                                          
                                             10,0
                                          
                                       
                                             NaNO3
                                             
                                          
                                          
                                             2 740
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,274
                                          
                                       
                                             KH2PO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 430
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,143
                                          
                                       
                                             K2HPO4
                                             
                                          
                                          
                                             1 840
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,184
                                          
                                       
                                    Tabelul 3
                                 
                                 
                                    Soluție stoc de vitamine pentru mediile M4 și M7
                                 
                                 Toate cele trei soluții de vitamine sunt combinate pentru a se obține o singură soluție stoc de vitamine.
                                 
                                    
                                 
                                              
                                          
                                          
                                             Cantitate adăugată la un litru de apă deionizată
                                             (mg)
                                          
                                          
                                             Cantitate de soluție stoc de vitamine adăugată pentru prepararea mediilor M4 și M7
                                             (ml/l)
                                          
                                          
                                             Concentrații finale în soluțiile de testare M4 și M7
                                             (mg/l)
                                          
                                       
                                             Clorhidrat de tiamină
                                          
                                          
                                             750
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,075
                                          
                                       
                                             Ciancobalamină (B12)
                                          
                                          
                                             10
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,0010
                                          
                                       
                                             Biotină
                                          
                                          
                                             7,5
                                          
                                          
                                             0,1
                                          
                                          
                                             0,00075
                                          
                                       
                           
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp, Berlin 1995.
                     Elendt B.P. (1990), Selenium Deficiency in Crustacean, Protoplasma 154: 25-33.
                     Elendt B.P. and Bias W.-R. (1990), Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna, Water Research 24 (9): 1157-1167.
                  
                  
                     Apendicele 3
                     PREPARAREA SEDIMENTULUI
                     
                        Compoziția sedimentului
                     
                     Compoziția sedimentului preparat trebuie să fie următoarea:
                     
                                 Constituent
                              
                              
                                 Caracteristici
                              
                              
                                 % de sediment
                                 greutate uscată
                              
                           
                                 Turbă
                              
                              
                                 Mușchi de turbă (Sphagnum), cu pH cât mai apropiat posibil de valoarea 5,5-6,0, fără resturi vizibile de plante, fin măcinat (dimensiunea particulelor ≤ 1 mm) și uscat cu aer
                              
                              
                                 4-5
                              
                           
                                 Nisip cuarțos
                              
                              
                                 Granulație: > 50 % din particule trebuie să fie în intervalul 50-200 μm
                              
                              
                                 75-76
                              
                           
                                 Argilă caolinitică
                              
                              
                                 Conținut de caolinit ≥ 30 %
                              
                              
                                 20
                              
                           
                                 Carbon organic
                              
                              
                                 Ajustat prin adăugarea de turbă și nisip
                              
                              
                                 2 (± 0,5)
                              
                           
                                 Carbonat de calciu
                              
                              
                                 CaCO3, pulverizat, pur din punct de vedere chimic
                              
                              
                                 0,05-0,1
                              
                           
                                 Apă
                              
                              
                                 Conductivitate ≤ 10 μS/cm
                              
                              
                                 30-50
                              
                           
                        Preparare
                     
                     Turba este uscată cu aer și măcinată într-o pulbere fină. Se prepară o suspensie din cantitatea necesară de pulbere de turbă în apă deionizată, cu ajutorul unui dispozitiv de omogenizare de înaltă performanță. pH-ul acestei suspensii este ajustat la 5,5 ± 0,5 cu CaCO3. Suspensia este condiționată timp de cel puțin două zile, agitându-se ușor la 20 ± 2 °C, pentru stabilizarea pH-ului și stabilirea unei componente microbiene stabile. Se măsoară din nou pH-ul, care trebuie să fie între 6,0 ± 0,5. Apoi, suspensia de turbă este amestecată cu alți constituenți (nisip și argilă caolin) și cu apă deionizată, pentru a obține un sediment omogen cu un conținut de apă în gama de 30-50 % din greutatea uscată a sedimentului. Se măsoară încă o dată pH-ul amestecului final și se ajustează la 6,5 până la 7,5 cu CaCO3, dacă este necesar. Se prelevează probe din sediment, pentru a determina greutatea uscată și conținutul de carbon organic. Apoi, înainte de utilizarea într-un test de toxicitate asupra chironomidelor, se recomandă ca sedimentul natural să fie condiționat timp de șapte zile în aceleași condiții care predomină în testul ulterior.
                     
                        Depozitare
                     
                     Constituenții uscați pentru prepararea sedimentului artificial pot fi depozitați într-un loc uscat și răcoros, la temperatura camerei. Sedimentul preparat (umed) nu trebuie să fie depozitat înainte de utilizarea sa în cadrul testului. El trebuie să fie folosit imediat după perioada de condiționare de 7 zile, cu care se încheie prepararea.
                     
                        BIBLIOGRAFIE:
                     
                     Capitolul C.8 din prezenta anexă, „Toxicitatea la râme”.
                     Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998), Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media, Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
                  
                  
                     Apendicele 4
                     
                        Caracteristici chimice acceptabile ale apei de diluție
                     
                     
                                 Substanță
                              
                              
                                 Concentrații
                              
                           
                                 Particule în suspensie
                              
                              
                                 < 20 mg/l
                              
                           
                                 Carbon organic total
                              
                              
                                 < 2 mg/l
                              
                           
                                 Amoniac neionizat
                              
                              
                                 < 1 μg/l
                              
                           
                                 Duritate ca CaCO3
                                 
                              
                              
                                 < 400 mg/l (20)
                                 
                              
                           
                                 Clor rezidual
                              
                              
                                 < 10 μg/l
                              
                           
                                 Total pesticide organofosforice
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Total pesticide organofosforice plus bifenil policlorurat
                              
                              
                                 < 50 ng/l
                              
                           
                                 Total clor organic
                              
                              
                                 < 25 ng/l
                              
                           
                  
                     Apendicele 5
                     
                        Orientări pentru monitorizarea emergenței larvelor de chironomide
                     
                     Pe paharele Berzelius de testare sunt plasate capcane de emergență. Aceste capcane sunt necesare începând din a douăzecea zi până la sfârșitul testului. În figura de mai jos se prezintă un exemplu de capcană utilizată:
                     
                        
                     
                                 A
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 sită de nailon
                              
                           
                                 B
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 cupe de plastic răsturnate
                              
                           
                                 C
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 pahar Berzelius fără muchie, pentru expunere
                              
                           
                                 D
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 orificii cu sită, pentru schimbul de apă
                              
                           
                                 E
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 apă
                              
                           
                                 F
                              
                              
                                 :
                              
                              
                                 sediment
                              
                           
                  C.29.   BIODEGRADABILITATEA RAPIDĂ – CO2 ÎN VASE ÎNCHISE ERMETIC (TESTARE ÎN SPAȚIUL LIBER)
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) 310 (2006). Această metodă de testare este o metodă de screening pentru evaluarea biodegradabilității rapide a substanțelor chimice și furnizează informații similare celor obținute din cele șase metode de testare descrise la capitolul C.4 din prezenta anexă, A-F. Prin urmare, o substanță chimică care prezintă rezultate pozitive în cadrul acestei metode de testare poate fi considerată ca fiind ușor biodegradabilă și, în consecință, cu degradare rapidă în mediu.
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Metoda bine stabilită (1) privind dioxidul de carbon (CO2), bazată pe testul Sturm original (2) pentru evaluarea biodegradabilității substanțelor chimice organice prin măsurarea dioxidului de carbon produs prin activitatea microbiană, a reprezentat, de obicei, prima alegere pentru testarea substanțelor chimice greu solubile și a celor care se adsorb puternic. Aceasta este selectată, de asemenea, pentru substanțele chimice solubile (nu însă și volatile), întrucât mulți consideră că degajarea dioxidului de carbon reprezintă singura dovadă fără echivoc a activității microbiene. Eliminarea carbonului organic dizolvat se poate realiza prin procese fizico-chimice – adsorbție, volatilizare, precipitare, hidroliză –, precum și prin activitate microbiană și prin numeroase reacții nebiologice care consumă oxigen; CO2 rezultă rareori din substanțe chimice pe cale abiotică. În testul Sturm original și în cel modificat (1) (2), CO2 este eliminat din faza lichidă în vase de absorbție prin barbotare (adică prin trecerea forțată a aerului tratat sub formă de bule prin mediul lichid pentru a elimina CO2), în timp ce în varianta Larson (3) (4), CO2 este transferat din vasul de reacție în vasele de absorbție prin trecerea aerului fără CO2 prin spațiul liber și, în plus, prin agitarea continuă a vasului de testare. Agitarea vasului de reacție se realizează numai în modificarea Larson; amestecarea este menționată numai pentru substanțele insolubile în ISO 9439 (5) și în varianta americană originală (6), ambele menționând barbotarea în locul înlocuirii spațiului liber. În altă metodă oficială a US EPA (Agenția americană pentru protecția mediului) (7), bazată pe metoda Gledhill (8), vasul de reacție agitat este izolat de atmosferă, iar CO2 produs este colectat într-un separator alcalin interior direct din faza gazoasă, precum în cazul respirometrelor clasice Warburg/Barcroft.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Totuși, s-a demonstrat că, în timpul utilizării testului Sturm standard modificat, pentru o serie de substanțe chimice, carbonul anorganic (CA) se acumulează în mediu (9). Degradarea a 20 mg C/l de anilină a produs o concentrație de CA de 8 mg/l. Astfel, colectarea de CO2 în separatoarele alcaline nu a reflectat fidel cantitatea de CO2 produsă pe cale microbiologică în etapele intermediare din timpul degradării. Drept urmare, specificația referitoare la faptul că > 60 % din producția maximă teoretică de CO2 (CO2T) trebuie colectată într-o «fereastră de 10 zile» (cele 10 zile care urmează imediat după atingerea nivelului de 10 % biodegradare) pentru ca o substanță chimică testată să fie clasificată ca ușor biodegradabilă, nu va fi îndeplinită de unele substanțe chimice care ar fi clasificate astfel folosind eliminarea carbonului organic dizolvat (COD).
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Atunci când procentul de degradare are o valoare mai scăzută decât cea preconizată, este posibil ca în soluția experimentală să se acumuleze CA. În acest caz, degradabilitatea poate fi evaluată folosind celelalte teste de biodegradabilitate rapidă.
                           
                        
                              5.
                           
                           
                              Alte inconveniente ale metodei Sturm (greoaie, necesită mult timp, mai expusă la erori experimentale și nu este aplicabilă substanțelor chimice volatile) au determinat deja căutarea unei tehnici în vase închise ermetic, diferite de tehnica Gledhill, în locul circulației continue a gazului (10) (11). Boatman et al. (12) au analizat metodele anterioare și au adoptat un sistem cu spațiu liber închis în care CO2 a fost eliberat în spațiul liber, la sfârșitul incubării, prin acidificarea mediului. CO2 a fost măsurat prin cromatografie în faza gazoasă (CG)/analiza CA în probe prelevate automat din spațiul liber, însă nu s-a ținut cont de carbonul anorganic dizolvat (CAD) în faza lichidă. De asemenea, vasele folosite au fost foarte mici (20 ml) conținând numai 10 ml din mediu, ceea ce a determinat probleme, de exemplu atunci când se adaugă în mod obligatoriu cantități foarte mici de substanțe chimice de testat insolubile și/sau este posibil ca în mediul inoculat să nu existe sau să fie prezent un număr insuficient de microorganisme responsabile pentru degradarea substanțelor chimice testate.
                           
                        
                              6.
                           
                           
                              Aceste dificultăți au fost depășite de studiile independente derulate de Struijs și Stoltenkamp (13) și de Birch și Fletcher (14), cel din urmă fiind inspirat de experiența acestora cu aparatura utilizată în testul de biodegradare anaerobă (15). În prima metodă menționată (13), CO2 se măsoară în spațiul liber după acidificare și echilibrare, în timp ce în a doua metodă (14) CAD a fost măsurat în ambele faze, gazoasă și lichidă, fără interpretarea rezultatelor; mai mult de 90 % din CA format a fost prezent în faza lichidă. Ambele metode au prezentat avantaje față de testul Sturm prin faptul că sistemul de testare a fost mult mai compact și maniabil, pot fi testate substanțe chimice volatile și se previne posibilitatea de întârziere în măsurarea CO2 produs.
                           
                        
                              7.
                           
                           
                              Cele două abordări au fost combinate în standardul ISO privind CO2 în spațiul liber (16), care a supus unui test de comparare interlaboratoare (17) și reprezintă standardul care stă la baza prezentei metode de testare. Cele două abordări au fost utilizate, în mod similar, în metoda US EPA (18). Au fost recomandate două metode de măsurare a CO2, respectiv CO2 în spațiul liber după acidificare (13) și CA în faza lichidă după adăugarea de substanță alcalină în exces. Ultima metodă a fost introdusă de Peterson în timpul testului de comparare interlaboratoare CONCAWE (19) al acestei metode a spațiului liber, modificată pentru măsurarea biodegradabilității intrinseci. Modificările aduse în 1992 (20) la revizuirea metodelor de la capitolul C.4 din prezenta anexă cu privire la biodegradabilitatea rapidă au fost încorporate în această metodă de testare, astfel încât condițiile (mediu, durată etc.) sunt asemănătoare cu cele din testul Sturm revizuit (20). Birch și Fletcher (14) au demonstrat că în această testare în spațiul liber s-au obținut rezultate foarte apropiate de cele obținute cu aceleași substanțe chimice în cadrul testului de comparare interlaboratoare realizat de OCDE (21) al metodelor de testare revizuite.
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              8.
                           
                           
                              Substanța chimică testată, de obicei la o concentrație de 20 mg C/l, ca sursă unică de carbon și energie, este incubată într-un mediu de soluție tampon cu săruri minerale care a fost inoculat cu o populație mixtă de microorganisme. Testul se realizează în vase închise ermetic cu un spațiu liber plin cu aer, care asigură o rezervă de oxigen pentru biodegradarea aerobă. Degajarea CO2 rezultat în urma biodegradării aerobe finale a substanței chimice testate se determină prin măsurarea excesului de CA produs în vasele de testare față de cel produs în vasele cu probă martor care conțin numai mediul inoculat. Gradul de biodegradare se exprimă ca procent din producția maximă teoretică de CA (CATh), pe baza cantității de substanță chimică testată (exprimată în carbon organic) adăugată inițial.
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              De asemenea, poate fi măsurată eliminarea COD și/sau gradul de biodegradare primară al substanței chimice testate (20).
                           
                        INFORMAȚII PRIVIND SUBSTANȚA CHIMICĂ TESTATĂ
                  
                              10.
                           
                           
                              Conținutul de carbon organic (% masice) al substanței chimice care urmează a fi testată trebuie să fie cunoscut, fie pe baza structurii sale chimice, fie prin măsurare, astfel încât să poată fi calculat procentul de degradare. Pentru substanțele chimice volatile testate, este utilă măsurarea sau calcularea constantei legii lui Henry, pentru determinarea un raport volumetric spațiu liber-lichid adecvat. Informațiile privind toxicitatea substanței chimice testate asupra microorganismelor este utilă în selectarea unei concentrații adecvate a substanței testate și în interpretarea rezultatelor care indică o biodegradabilitate redusă: se recomandă includerea verificării efectului inhibitor, exceptând cazul în care se cunoaște faptul că substanța chimică testată nu inhibă activitățile microbiene (a se vedea punctul 24).
                           
                        APLICABILITATEA METODEI
                  
                              11.
                           
                           
                              Testul este aplicabil substanțelor chimice testate solubile și insolubile în apă, trebuind totuși să se asigure o bună dispersie a substanței chimice testate. Utilizând raportul volumetric spațiu liber-lichid recomandat de 1:2, pot fi testate substanțe chimice volatile având o constantă a legii lui Henry de până la 50 Pa.m3.mol–1 întrucât proporția substanței chimice testate în spațiul liber nu va depăși 1 % (13). Se poate utiliza un volum mai mic al spațiului liber atunci când se testează substanțe chimice mai volatile, însă biodisponibilitatea acestora poate fi limitativă, mai ales dacă acestea prezintă o solubilitate redusă în apă. Totuși, utilizatorii trebuie să se asigure că raportul volumetric spațiu liber-lichid și concentrația substanței chimice testate sunt de așa natură încât este disponibil suficient oxigen pentru a se produce biodegradarea aerobă completă (de exemplu, evitarea utilizării unei concentrații mari a substratului și a unui volum mic al spațiului liber). Referințele (13) și (23) conțin informații privind această chestiune.
                           
                        SUBSTANȚE CHIMICE DE REFERINȚĂ
                  
                              12.
                           
                           
                              Pentru a verifica procedura de testare, ar trebui testată în paralel o substanță chimică de referință a cărei biodegradabilitate este cunoscută. În acest scop, poate fi utilizată anilină, benzoat de sodiu sau etilenglicol, atunci când se testează substanțe chimice testate solubile în apă, și 1-octanol, pentru substanțe chimice testate cu solubilitate redusă (13). Biodegradarea acestor substanțe chimice trebuie să atingă > 60 % CATh în decurs de 14 zile.
                           
                        REPRODUCTIBILITATE
                  
                              13.
                           
                           
                              În testul de comparare interlaboratoare a metodei realizat de ISO (17), s-au obținut următoarele rezultate la utilizarea condițiilor recomandate, incluzând 20 mg C substanță chimică testată/l.
                              
                                          Substanță chimică testată:
                                       
                                       
                                          Procent mediu de biodegradare
                                          (28 de zile)
                                       
                                       
                                          Coeficient de variație
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Număr de laboratoare
                                       
                                    
                                          Anilină
                                       
                                       
                                          90
                                       
                                       
                                          16
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                    
                                          1-Octanol
                                       
                                       
                                          85
                                       
                                       
                                          12
                                       
                                       
                                          14
                                       
                                    Variabilitatea în interiorul testului (reproductibilitatea), folosind anilină, a fost redusă, cu coeficienți de variabilitate care nu au depășit 5 % în aproape toate testele. În două cazuri în care reproductibilitatea a fost ceva mai redusă, este posibil ca variabilitatea mai mare să se fi datorat producției mari de CA în probele martor. Reproductibilitatea a fost ceva mai redusă cu 1-octanol, însă aceasta s-a situat totuși sub 10 % pentru 79 % din teste. Această variabilitate în interiorul testului este posibil să se datoreze erorilor de dozare, întrucât a trebuit injectat un volum mic de 1-octanol (3-4 μl) în vasele de testare închise ermetic. Coeficienți de variație mai mari ar trebui să rezulte când sunt utilizate concentrații mai scăzute de substanță chimică testată, în special la concentrații sub 10 mg C/l. Această problemă ar putea fi depășită parțial prin reducerea concentrației carbonului anorganic total (CAT) din proba de inocul.
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Într-un test de comparare interlaboratoare realizat în UE (24) pentru cinci agenți tensioactivi adăugați cu concentrația de 10 mg C/l, s-au obținut următoarele rezultate:
                              
                                          Substanță chimică testată:
                                       
                                       
                                          Procent mediu de biodegradare
                                          (28 de zile)
                                       
                                       
                                          Coeficient de variație
                                          (%)
                                       
                                       
                                          Număr de laboratoare
                                       
                                    
                                          Tetra-propilen
                                          benzen sulfonat
                                       
                                       
                                          17
                                       
                                       
                                          45
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Di-izo-octilsulfo-succinat
                                          (anionic)
                                       
                                       
                                          72
                                       
                                       
                                          22
                                       
                                       
                                          9
                                       
                                    
                                          Clorura de hexadecil-
                                          trimetil amoniu (21)
                                          
                                          (cationic)
                                       
                                       
                                          75
                                       
                                       
                                          13
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Izo-nonilfenol -(etoxilat)9
                                          
                                          (neionic)
                                       
                                       
                                          41
                                       
                                       
                                          32
                                       
                                       
                                          10
                                       
                                    
                                          Coco-amido-propil
                                          dimetilhidroxi
                                          sulfobetaină
                                          (amfoter)
                                       
                                       
                                          60
                                       
                                       
                                          23
                                       
                                       
                                          11
                                       
                                    Rezultatele indică faptul că, în general, variabilitatea a fost mai mare pentru agenții tensioactivi mai puțin degradați. Variabilitatea în interiorul testului a fost sub 15 % pentru aproximativ 90 % din cazuri, cea mai mare atingând 30-40 %.
                              
                                          
                                             Notă:
                                          
                                       
                                       
                                          Majoritatea agenților tensioactivi nu sunt specii moleculare unice, ci sunt amestecuri de izomeri, omologi etc. care se degradează după perioade de latență caracteristice diferite și cu cinetici diferite având ca rezultat curbe «neclare», atenuate astfel încât este posibil ca valoarea pragului de 60 % să nu poată fi atinsă în «fereastra de 10 zile», chiar dacă fiecare specie moleculară, considerată individual, ar atinge > 60 % în intervalul de 10 zile dacă ar fi testată individual. Acest fenomen poate fi observat și în cazul altor amestecuri complexe.
                                       
                                    
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Aparatură
                  
                  
                              15.
                           
                           
                              Aparatură obișnuită de laborator și:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          flacoane serologice din sticlă, închise ermetic cu dopuri de cauciuc butilic și capsule din aluminiu sertizate. Mărimea recomandată este de «125 ml», care are un volum total de aproximativ 160 ml (în acest caz, volumul fiecărui flacon ar trebui să fie cunoscut ca având 160 ± 1 ml). Poate fi utilizat un flacon de dimensiuni mai mici atunci când rezultatele se conformează condițiilor descrise la punctele 66 și 67;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          analizor de carbon sau un alt instrument (de exemplu, cromatograf în fază gazoasă) pentru măsurarea carbonului anorganic;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          seringi de precizie înaltă pentru probe gazoase sau lichide;
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          agitator orbital într-un mediu cu temperatură controlată;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          o sursă de aer fără CO2 – acesta poate fi preparat prin trecerea aerului prin granule de oxid de calciu sodat sau prin utilizarea unui amestec de gaz 80 % N2/20 % O2 (opțional) (a se vedea punctul 28);
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          dispozitiv de filtrare cu membrană cu porozitatea de 0,20-0,45 μm (opțional);
                                       
                                    
                                          (g)
                                       
                                       
                                          analizor de carbon organic (opțional).
                                       
                                    
                        
                     Reactivi chimici
                  
                  
                              16.
                           
                           
                              Se utilizează întotdeauna reactivi chimici cu puritate analitică.
                           
                        
                     Apă
                  
                  
                              17.
                           
                           
                              Ar trebui să se utilizeze apă distilată sau deionizată care conține ≤ 1 mg/l carbon organic total. Acesta reprezintă ≤ 5 % din conținutul de carbon organic inițial introdus prin doza recomandată a substanței chimice testate.
                           
                        
                     Soluții stoc pentru mediul cu săruri minerale
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Soluțiile stoc și mediul cu săruri minerale sunt similare celor din ISO 14593 (16) și C.4 teste de «biodegradabilitate rapidă» (20). Utilizarea unei concentrații mai mari de clorură de amoniu (2,0 g/l în loc de 0,5 g/l) ar trebui să fie necesară numai în cazuri excepționale, de exemplu, când concentrația substanței chimice testate este > 40 mg C/l. Soluțiile stoc ar trebui păstrate la rece și eliminate după șase luni sau mai devreme dacă există dovezi de precipitare sau de proliferare microbiană. Se prepară următoarele șase soluții stoc:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          Fosfat diacid de potasiu (KH2PO4) 8,50 g
                                          Fosfat acid de potasiu (K2HPO4) 21,75 g
                                          Fosfat acid de sodiu dihidrat (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
                                          Clorură de amoniu (NH4Cl) 0,50 g
                                          Se dizolvă în apă și se completează până la 1 litru. pH-ul acestei soluții este 7,4 (± 0,2). În caz contrar, se prepară o nouă soluție.
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          Clorură de calciu dihidrat (CaCl2.2H2O) 36,40 g
                                          Se dizolvă în apă și se completează până la 1 litru.
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          Sulfat de magneziu heptahidrat (MgSO4.7H2O) 22,50 g
                                          Se dizolvă în apă și se completează până la 1 litru.
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          Clorură de fier (III) hexahidrat (FeCl3.6H20) 0,25 g
                                          Se dizolvă în apă și se completează până la 1 litru și se adaugă o picătură de HCl concentrat.
                                       
                                    
                        
                     Prepararea mediului mineral
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Se amestecă 10 ml de soluție (a) cu aproximativ 800 ml apă (punctul 17), apoi se adaugă câte 1 ml din soluțiile (b), (c) și (d) și se completează până la 1 litru cu apă (punctul 17).
                           
                        
                     Alți reactivi chimici
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Acid fosforic concentrat (H3PO4) (> 85 % masă pe volum).
                           
                        
                     Soluție de hidroxid de sodiu 7M
                  
                  
                              21.
                           
                           
                              Se dizolvă 280 g hidroxid de sodiu (NaOH) într-un litru de apă (punctul 17). Se determină concentrația CAD a acestei soluții și se consideră această valoare când se calculează rezultatul testului (a se vedea punctele 55 și 61), ținând cont mai ales de criteriul de validitate de la punctul 66 litera (b). În cazul în care concentrația CAD este prea mare, se prepară o soluție proaspătă.
                           
                        
                     Substanța chimică testată
                  
                  
                              22.
                           
                           
                              Se prepară o soluție stoc cu o substanță chimică testată suficient de hidrosolubilă, în apă (punctul 17) sau în mediul de testare (punctul 19), la o concentrație de preferat de 100 de ori mai mare decât a concentrației finale care urmează a fi utilizată în test; poate fi necesară ajustarea pH-ului soluției stoc. Soluția stoc se adaugă mediului mineral pentru a atinge o concentrație finală a carbonului organic cuprinsă între 2 și 40 mg C/l, de preferat 20 mg C/l. Dacă sunt utilizate concentrații mai scăzute decât acestea, poate fi afectată precizia. Substanțele chimice lichide solubile și insolubile pot fi adăugate în vase direct utilizând seringi de înaltă precizie. Este posibil ca substanțele chimice testate cu solubilitate redusă sau cele insolubile să necesite un tratament special (25). Posibilitățile sunt:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          adăugarea directă a unor cantități cântărite cunoscute;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          dispersia ultrasonică înainte de adăugare;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          poate fi necesară dispersia cu ajutorul agenților de emulsionare, înainte de adăugare, pentru a stabili dacă aceștia au efecte de inhibare sau de stimulare asupra activității microbiene;
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          adsorbția substanțelor chimice testate lichide sau a unei soluții într-un solvent volatil adecvat pe un mediu sau pe un suport inert (de exemplu, filtru din fibre de sticlă), urmată de evaporarea solventului, dacă se utilizează, și adăugarea directă a unor cantități cunoscute;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          adăugarea unui volum cunoscut de soluție a substanței chimice testate într-un solvent ușor volatil într-un vas de testare gol, urmată de evaporarea solventului.
                                       
                                    Agenții sau solvenții utilizați la (c), (d) și (e) trebuie testați pentru orice efect de stimulare sau inhibare a activității microbiene [a se vedea punctul 42 litera (b)].
                           
                        
                     Substanța chimică de referință
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Se prepară o soluție stoc din substanța chimică de referință (solubilă), în apă (punctul 17), la o concentrație de preferat de 100 de ori mai mare decât concentrația finală (20 mg C/l) care urmează a fi utilizată în test.
                           
                        
                     Verificarea efectului inhibitor
                  
                  
                              24.
                           
                           
                              Deseori, substanțele chimice testate nu prezintă o degradare semnificativă în condițiile utilizate pentru evaluările biodegradării rapide. Una dintre cauzele posibile este că substanța chimică testată manifestă un efect inhibitor pentru inocul la concentrația la care este aplicată în test. O verificare a efectului inhibitor poate fi inclusă în elaborarea testului pentru a ușura identificarea (retrospectivă) acestuia ca una dintre cauzele posibile sau ca factor care contribuie la aceasta. Ca alternativă, verificarea efectului inhibitor poate elimina aceste interferențe și poate demonstra că degradarea redusă sau egală cu zero este atribuibilă numai incapacității atacului microbian în condițiile de testare. Pentru a obține informații cu privire la toxicitatea substanței chimice testate asupra microorganismelor (aerobe), se prepară o soluție care conține substanța chimică testată și produsul de referință în mediul de testare (punctul 19), fiecare având aceeași concentrație ca cea pe care a avut-o la adăugarea în mediul de testare în timpul testului (a se vedea punctele 22 și 23).
                           
                        
                     Inocul
                  
                  
                              25.
                           
                           
                              Inoculul poate proveni din diferite surse: nămol activ; efluenți de ape uzate (neclorurați), ape de suprafață și soluri sau dintr-un amestec al acestora (20). Activitatea de biodegradare a sursei ar trebui verificată folosind o substanță chimică de referință. Indiferent de sursă, microorganismele expuse anterior la substanța chimică testată nu ar trebui folosite dacă procedura urmează a se utiliza ca test pentru biodegradabilitatea rapidă.
                              
                                          Avertizare:
                                       
                                       
                                          Nămolul activ, apa uzată și efluentul de apă uzată conțin organisme patogene și trebuie manipulate cu precauție.
                                       
                                    
                        
                              26.
                           
                           
                              S-a constatat empiric că volumul optim pentru inocul este cel care:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          este suficient pentru a oferi activitate de biodegradare adecvată;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          degradează substanța chimică de referință cu procentul prevăzut (a se vedea punctul 66);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          furnizează 102-105 unități formatoare colonii pe mililitru în amestecul final;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          în mod normal, furnizează o concentrație de 4 mg/l materii solide în suspensie în amestecul final atunci când se utilizează nămol activ, pot fi utilizate concentrații de până la 30 mg/l însă pot crește semnificativ generarea de CO2 a probelor martor (26);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          contribuie cu mai puțin de 10 % la concentrația inițială a carbonului organic introdus de substanța chimică testată;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          reprezintă, în general, 1-10 ml de inocul la 1 litru de soluție experimentală.
                                       
                                    
                        
                     Nămol activ
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Se prelevează o probă de nămol activ proaspăt din vasul de aerare al unei instalații de tratare a apelor uzate sau dintr-o instalație de laborator care tratează în special ape uzate menajere. Dacă este necesar, particulele grosiere ar trebui îndepărtate prin cernere (de exemplu, utilizând o sită cu ochiuri de 1 mm2), iar nămolul ar trebui ținut în condiții aerobe până la utilizare.
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Alternativ, după îndepărtarea oricăror particule grosiere, se lasă la decantat sau se centrifughează (de exemplu, 1 100 × g timp de 10 minute). Se îndepărtează lichidul supernatant. Nămolul poate fi spălat în soluție minerală. Se prepară o suspensie de nămol concentrat în mediu mineral pentru a obține o concentrație de 3-5 g solide în suspensie/l. După aceea se aerează până în momentul folosirii.
                           
                        
                              29.
                           
                           
                              Nămolul ar trebui prelevat dintr-o instalație de tratare clasică, care funcționează corect. Dacă nămolul trebuie prelevat dintr-o instalație de tratare cu debit mare sau se presupune că ar conține inhibitori, acesta ar trebui spălat. După amestecarea puternică, nămolul din noua suspensie se lasă la decantat sau se centrifughează, apoi se îndepărtează lichidul supernatant; nămolul spălat se trece din nou în suspensie într-un alt volum de mediu mineral. Se repetă această procedură până când se consideră că nămolul nu mai conține substrat sau inhibitor în exces.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Imediat înainte de folosire, se prelevează o probă după ce nămolul este suspensionat complet sau, după caz, din nămol netratat, pentru a determina greutatea uscată a solidelor în suspensie.
                           
                        
                              31.
                           
                           
                              O altă alternativă constă în omogenizarea nămolului activ (3-5 g solide în suspensie/l). Se tratează nămolul într-un amestecător Waring timp de 2 minute la viteză medie. Se lasă apoi timp de 30 de minute, sau mai mult dacă este nevoie, la decantat și se prelevează lichidul pentru a fi folosit ca inocul într-un raport de aproximativ 10 ml/l de mediu mineral.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Se poate obține o reducere suplimentară a degajării de CO2 prin aerarea nămolului peste noapte cu aer fără CO2. În acest test, pentru concentrația inoculului se utilizează 4 mg/l materii solide în nămolul activ (13).
                           
                        
                     Efluenți secundari de ape uzate
                  
                  
                              33.
                           
                           
                              Alternativ, inoculul se poate obține din efluentul secundar al unei instalații de tratare sau al unei instalații de laborator care se alimentează în special cu apă uzată menajeră. Proba se menține în condiții aerobe și se folosește în ziua în care este colectată sau precondiționată, dacă este necesar. Efluentul ar trebui filtrat printr-un filtru grosier pentru a îndepărta particulele mari și se măsoară valoarea pH-ului.
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Pentru a reduce conținutul de CA, filtratul se barbotează cu aer fără CO2 [punctul 15 litera (e)] timp de 1 h, în timp ce pH-ul se menține la 6,5 folosind acid fosforic (punctul 20). Se aduce valoarea pH-ului la valoarea inițială cu hidroxid de sodiu (punctul 21) și, după decantarea timp de aproximativ 1 h, se prelevează un volum adecvat de supernatant pentru inoculare. Procedura de barbotare reduce conținutul de CA al inoculului. De exemplu, când s-a utilizat ca inocul volumul maxim recomandat de efluent barbotat și filtrat (100 ml) pe litru, cantitatea de CA prezentă în vasele cu probă martor s-a situat în intervalul 0,4-1,3 mg/l (14), ceea ce reprezintă 2-6,5 % din C substanței chimice testate la 20 mg C/l și 4-13 % la 10 mg C/l.
                           
                        
                     Ape de suprafață
                  
                  
                              35.
                           
                           
                              Se prelevează o probă dintr-o apă de suprafață adecvată. Aceasta ar trebui ținută în condiții aerobe și utilizată în ziua în care este colectată. Dacă este necesar, proba ar trebui concentrată prin filtrare sau centrifugare. Volumul de inocul care urmează a fi utilizat în fiecare vas de testare ar trebui să îndeplinească criteriile de la punctul 26.
                           
                        
                     Soluri
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Se prelevează o probă de sol adecvat, colectată de la o adâncime de până la 20 cm sub suprafața solului. Din proba de sol ar trebui îndepărtate pietrele, resturile de plante și nevertebratele înainte ca aceasta să fie cernută printr-o sită cu ochiuri de 2 mm (dacă proba este prea umedă pentru a fi cernută imediat, se usucă parțial cu aer pentru a ușura cernerea). Proba ar trebui ținută în condiții aerobe și utilizată în ziua colectării (dacă proba este transportată într-o pungă neagră de polietilenă care nu se închide ermetic, poate fi păstrată în pungă, la 2-4 °C, timp de o lună).
                           
                        
                     Precondiționarea inoculului
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Inoculul poate fi precondiționat și adus în condițiile de testare, dar nu și preadaptat la substanța chimică testată. Precondiționarea poate reduce degajarea de CO2 a probei martor. Precondiționarea constă în aerarea nămolului activ după diluarea în mediul de testare la 30 mg/l, cu aer umed fără CO2, timp de până la 5-7 zile, la temperatura de testare.
                           
                        PROCEDURA DE TESTARE
                  
                     Număr de sticle
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Numărul de flacoane [punctul 15 litera (a)] necesar pentru un test va depinde de frecvența analizei și de durata testului.
                           
                        
                              39.
                           
                           
                              Se recomandă analizarea a trei seturi de flacoane, după un număr suficient de intervale de timp astfel încât să poată fi identificată fereastra de 10 zile. De asemenea, la finalul testului se analizează cel puțin cinci flacoane de testare [punctul 15 litera (a)] din seturile (a), (b) și (c) (a se vedea punctul 42), pentru a putea calcula intervalele de încredere 95 % pentru valoarea procentuală medie a biodegradării.
                           
                        
                     Mediu inoculat
                  
                  
                              40.
                           
                           
                              Inoculul se utilizează la o concentrație de 4 mg/l solide uscate în nămolul activat. Imediat înainte de utilizare se prepară suficient mediu inoculat prin adăugarea, de exemplu, a 2 ml de nămol activ, tratat în mod adecvat (punctele 27-32), la o concentrație de 2 000 mg/l la 1 litru de mediu cu săruri minerale (punctul 19). Când urmează a se utiliza efluenți secundari de ape uzate, se adaugă până la 100 ml de efluent (punctul 33) la 900 ml mediu cu săruri minerale (punctul 19) și se diluează până la 1 litru cu mediu.
                           
                        
                     Pregătirea flacoanelor
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              Se dozează alicote din mediu în flacoane duplicat pentru a se obține un raport spațiu liber-lichid de 1:2 (de exemplu, se adaugă 107 ml în flacoane cu capacitatea de 160 ml). Pot fi utilizate alte rapoarte, dar se ține cont de avertismentul de la punctul 11. Când se utilizează oricare dintre tipurile de inocul, trebuie avut grijă să se asigure că mediul inoculat este amestecat corespunzător pentru a se asigura distribuția uniformă în vasele de testare.
                           
                        
                              42.
                           
                           
                              Seturile de flacoane [punctul 15 litera (a)] sunt preparate pentru a conține următoarele:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          vase de testare (notate FT) care conțin substanța chimică testată;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          vase martor (notate FB) care conțin numai mediul de testare și inoculul; trebuie adăugate, de asemenea, orice substanțe chimice, solvenți, agenți sau filtre din fibră de sticlă utilizate pentru a introduce substanța chimică testată în vasele de testare;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          vase pentru procedura de verificare (notate FC), care conțin substanța chimică de referință;
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          dacă este necesar, vase pentru verificarea posibilului efect inhibitor al substanței chimice testate (notate FI), care conțin atât substanța chimică testată, cât și substanța chimică de referință, la aceleași concentrații (punctul 24) cu cele din vasele FT și FC;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          vase pentru verificarea unei posibile degradări abiotice (notate FS), care sunt vasele de la litera (a) în care se adaugă 50 mg/l HgCl2 sau sunt sterilizate prin alte metode (de exemplu, prin autoclavare).
                                       
                                    
                        
                              43.
                           
                           
                              Substanțele chimice testate solubile în apă și substanțele chimice de referință se adaugă la soluțiile stoc apoase (punctele 22, 23 și 24) pentru a obține o concentrație de 10-20 mg C/l.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Substanțele chimice testate insolubile și substanțele chimice de referință insolubile se adaugă în flacoane prin diferite metode [a se vedea punctul 22 literele (a)-(e)], în funcție de natura substanței chimice testate, fie înainte, fie după adăugarea mediului inoculat, în funcție de metoda de tratare a substanței chimice testate. Dacă se utilizează una dintre procedurile prezentate la punctul 22 literele (a)-(e), atunci flacoanele cu probă martor FB [punctul 42 litera (b)] ar trebui tratate într-un mod similar, excluzându-se însă substanța chimică testată sau substanța chimică de referință.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Substanțele chimice testate volatile ar trebui injectate în flacoane închise ermetic (punctul 47) folosind o microseringă. Doza se calculează în funcție de volumul injectat și de densitatea substanței chimice testate.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              În vase ar trebui adăugată apă, dacă este necesar, pentru a obține același volum de lichid în fiecare vas. Trebuie să se asigure că raportul spațiu liber-lichid (de obicei 1:2) și concentrațiile substanței chimice testate sunt astfel încât în spațiul liber se află suficient oxigen pentru a permite biodegradarea completă.
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              Apoi toate flacoanele se închid ermetic, de exemplu, cu membrană de cauciuc butilic și capace de aluminiu. În acest stadiu ar trebui adăugate substanțele chimice testate volatile (punctul 45). Dacă urmează a fi monitorizată scăderea concentrației COD a soluției experimentale și dacă urmează a se efectua analize ale concentrației inițiale de CA la momentul zero [etaloane sterile, punctul 42 litera (e)] sau ale alor parametri, se prelevează o probă adecvată din vasul de testare. Vasul de testare și conținutul acestuia sunt apoi eliminate.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Flacoanele închise ermetic se pun într-un agitator rotativ [punctul 15 litera (d)], cu o viteză de agitare suficientă pentru a menține conținutul flaconului bine amestecat și în suspensie (de exemplu, 150-200 rpm) și se incubează la întuneric, la 20 °C, pentru a se menține o variație de ± 1 °C.
                           
                        
                     Prelevarea de probe
                  
                  
                              49.
                           
                           
                              Tipul de prelevare va depinde de perioada de latență și de cinetica biodegradării substanței chimice testate. Flacoanele se scot definitiv pentru analiză în ziua prelevării probei, ceea ce ar trebui să se producă săptămânal sau mai des (de exemplu, de două ori pe săptămână) dacă se cere o curbă de degradare completă. Din agitator se scoate numărul cerut de flacoane duplicat, acestea fiind FT, FB și FC și, dacă au fost folosite, FI și FS (a se vedea punctul 42). Testul durează de obicei 28 de zile. În cazul în care curba de biodegradare indică faptul că a fost atins un platou înainte de 28 de zile, testul poate fi încheiat înainte de 28 de zile. Se prelevează probe din cele cinci flacoane rezervate analizei în ziua 28 a testului, iar rezultatele se utilizează pentru calcularea limitelor de încredere sau a coeficientului de variație a procentului de biodegradare. Din flacoanele destinate verificărilor inhibării și degradării abiotice nu trebuie prelevate probe atât de des ca în cazul celorlalte vase; ar fi suficiente prelevări în ziua 1 și în ziua 28.
                           
                        
                     Analiza carbonului anorganic (CA)
                  
                  
                              50.
                           
                           
                              Generarea de CO2 în flacoane se determină prin măsurarea creșterii concentrației de carbon anorganic (CA) în timpul incubării. Sunt disponibile două metode recomandate pentru măsurarea cantității de CA generat în cadrul testului, iar acestea sunt descrise mai jos. Deoarece metodele pot genera rezultate ușor diferite, se recomandă utilizarea unei singure metode în timpul unui test.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Metoda (a) este recomandată dacă este probabil ca mediul să conțină, de exemplu, resturi de hârtie de la filtrul de sticlă și/sau de substanță chimică testată insolubilă. Această analiză poate fi realizată folosind un cromatograf în fază gazoasă, dacă nu este disponibil un analizor de carbon. Este important ca, atunci când se analizează gazul din spațiul liber, flacoanele să fie la temperatura de testare sau la o temperatură apropiată de aceasta. Metoda (b) se poate dovedi mai ușor de folosit în laboratoarele care măsoară CA folosind analizoare de carbon. Este important ca soluția de hidroxid de sodiu (punctul 21) folosită pentru a transforma CO2 în carbonat să fie preparată proaspăt sau conținutul de CA al acesteia să fie cunoscut, astfel încât acesta să poată fi avut în vedere la calcularea rezultatelor testului [a se vedea punctul 66 litera (b)].
                           
                        
                     Metoda (a):   acidificarea la pH < 3
                  
                  
                              52.
                           
                           
                              Înaintea fiecărei serii de analize, analizorul de CA se calibrează folosind un standard pentru CA adecvat (de exemplu, 1 % g/g CO2 în N2). Acidul fosforic (punctul 20) se injectează prin dopul fiecărui flacon din care se prelevează probe pentru a reduce pH-ul mediului la < 3 (de exemplu, se adaugă 1 ml la 107 ml mediu de testare). Flacoanele sunt puse înapoi în agitator. După agitarea timp de o oră la temperatura de testare, flacoanele sunt scoase din agitator, sunt extrase alicote de gaz (de exemplu, 1 ml) din spațiul liber al fiecărui flacon și sunt injectate în analizorul de CA. Concentrațiile de CA măsurate sunt înregistrate în mg C/l.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Această metodă are la bază principiul conform căruia, după acidificarea la pH < 3 și echilibrarea la 20 °C, constanta de echilibru pentru distribuția CO2 între fazele lichidă și gazoasă din flacoanele de testare este 1,0 când se măsoară sub forma concentrației (13). Această relație ar trebui demonstrată pentru sistemul de testare cel puțin o dată după cum urmează:
                              Se pregătesc flacoane care conțin 5 și 10 mg/l de CA folosind o soluție de carbonat de sodiu anhidru (Na2CO3) în apă fără CO2 preparată prin acidificarea apei la pH 6,5 cu acid fosforic concentrat (punctul 20), barbotarea peste noapte cu apă fără CO2 și aducerea pH-ului la valoarea neutră cu o substanță alcalină. Se asigură că raportul dintre volumul spațiului liber și volumul lichidului este același cu cel din cadrul testelor (de exemplu, 1:2). Se acidifică și se echilibrează conform descrierii de la punctul 52 și se măsoară concentrațiile de CA atât în faza din spațiul liber, cât și în faza lichidă. Se verifică faptul că cele două concentrații sunt identice, în intervalul de eroare experimentală. Dacă nu este așa, operatorul ar trebui să reexamineze procedurile. Această verificare a distribuției CA între fazele lichidă și gazoasă nu trebuie realizată ori de câte ori se efectuează un test; aceasta ar putea fi realizată în timpul efectuării calibrării.
                           
                        
                              54.
                           
                           
                              Dacă urmează a se măsura eliminarea COD (numai pentru substanțe chimice testate solubile în apă), ar trebui să se ia probe din faza lichidă din flacoane separate (neacidificate), filtrate prin membrană și injectate în analizorul de COD. Aceste flacoane pot fi folosite pentru alte analize, dacă este necesar, pentru a măsura biodegradarea primară.
                           
                        
                     Metoda (b):   transformarea CO2 în carbonat
                  
                  
                              55.
                           
                           
                              Înainte de analizarea fiecărei serii, analizorul de CA se calibrează folosind un standard adecvat – de exemplu, o soluție de bicarbonat de sodiu (NaHCO3) în apă fără CO2 (a se vedea punctul 53) în intervalul 0-20 mg/l CA. Soluția de hidroxid de sodiu (7M, punctul 21) (de exemplu, 1 ml la 107 ml de mediu) se injectează prin dopul fiecărui flacon folosit pentru prelevare, iar flacoanele sunt agitate timp de 1 h la temperatura de testare. Se folosește aceeași soluție de NaOH în toate flacoanele scoase definitiv într-o anumită zi, însă nu este necesar pentru toate prelevările de probe realizate pe parcursul unui test. Dacă se cer valorile CA absolute ale probei martor la fiecare prelevare de probe, va fi necesară determinarea CA din soluția de NaOH de fiecare dată când aceasta este folosită. Flacoanele sunt scoase din agitator și sunt lăsate să decanteze. Sunt prelevate volume adecvate (de exemplu, 50-1 000 μl) din faza lichidă din fiecare vas cu ajutorul unei seringi. Probele sunt injectate în analizorul de CA și sunt înregistrate concentrațiile de CA. Ar trebui să se asigure faptul că analizorul utilizat este dotat corespunzător pentru a trata probele alcaline produse prin această metodă.
                           
                        
                              56.
                           
                           
                              Această metodă are la bază principiul conform căruia, după adăugarea de produs alcalin și agitare, concentrația de CA în spațiul liber este neglijabilă. Această relație ar trebui verificată pentru sistemul testat cel puțin o dată folosind standarde pentru CA, adăugând produse alcaline și echilibrând și măsurând concentrația de CA atât în faza din spațiul liber, cât și în faza lichidă (a se vedea punctul 53). Concentrația în spațiul liber ar trebui să fie apropiată de zero. Această verificare a absorbției practic complete a CO2 nu trebuie realizată de fiecare dată când se efectuează testul.
                           
                        
                              57.
                           
                           
                              Dacă urmează a se măsura eliminarea COD (numai pentru substanțe chimice testate solubile în apă), ar trebui prelevate probe din faza lichidă din flacoane separate (care nu conțin produs alcalin), filtrate prin membrană și injectate în analizorul de COD. Aceste flacoane pot fi folosite pentru alte analize, dacă este necesar, pentru a măsura biodegradabilitatea primară.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Calcularea rezultatelor
                  
                  
                              58.
                           
                           
                              Presupunând că substanța chimică testată este mineralizată 100 % la CO2, CATh care o depășește pe cea generată în flaconul cu probă martor este egală cu COT adăugată în fiecare flacon de testare la începutul testului, adică:
                              
                                 
                              Masa totală (mg) de carbon anorganic (CAT) din fiecare flacon este:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          Ecuația [1]
                                       
                                    unde:
                              
                                          VL
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          volumul de lichid din vas (litri);
                                       
                                    
                                          CL
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentrația de CA în lichid (carbon în mg/l);
                                       
                                    
                                          VH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          volumul spațiului liber (litri);
                                       
                                    
                                          CH
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          concentrația de CA în spațiul liber (carbon în mg/l).
                                       
                                    Calculele CAT prin cele două metode analitice folosite pentru măsurarea CA în acest test sunt descrise mai jos la punctele 60 și 61. Procentul de biodegradare (% D) din fiecare caz este dat de:
                              
                                          
                                             
                                       
                                       
                                          Ecuația [2]
                                       
                                    unde:
                              
                                          CATt
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg CAT din flaconul de testare la momentul t
                                       
                                    
                                          CATb
                                          
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg CAT din flacoanele cu probă martor la momentul t
                                       
                                    
                                          COT
                                       
                                       
                                          =
                                       
                                       
                                          mg COT adăugate inițial în flaconul de testare
                                       
                                    Procentul de biodegradare % D se calculează pentru flacoanele de testare (FT), de referință (FC) și, dacă este inclus, de verificare a monitorizării efectului inhibitor (FI) în funcție de cantitățile respective de CAT generate până la momentul fiecărei prelevări de probe.
                           
                        
                              59.
                           
                           
                              Dacă s-a produs o creștere semnificativă a conținutului de CAT în etalonul steril (FS) în timpul testului, atunci se poate concluziona că a avut loc degradarea abiotică a substanței chimice testate și trebuie să se țină cont de aceasta la calcularea D din ecuația [2].
                           
                        
                     Acidificare la pH < 3
                  
                  
                              60.
                           
                           Deoarece acidificarea la pH < 3 și echilibrarea au ca rezultat egalizarea concentrației de CAT în fazele lichidă și gazoasă, trebuie măsurată numai concentrația de CA din faza gazoasă. Astfel, din Ecuația [1] 
                                 , unde VB = volumul flaconului serologic.
                        
                     Transformarea CO2 în carbonat
                  
                  
                              61.
                           
                           În această metodă calculele se efectuează la fel ca în ecuația [1], însă cantitatea neglijabilă de CA din faza gazoasă este ignorată, adică 
                                  și 
                                 .
                        
                     Exprimarea rezultatelor
                  
                  
                              62.
                           
                           
                              Prin unirea procentelor de biodegradare se obține o curbă de biodegradare, D, în funcție de timpul de incubare, iar aceasta va indica, dacă este posibil, faza de latență, faza de biodegradare, fereastra de 10 zile și faza de platou, care este faza în care s-a atins degradarea maximă și curba de biodegradare este nivelată. Dacă au fost obținute rezultate comparabile pentru vasele de testare paralele FT (diferență < 20 %), se trasează o curbă medie (a se vedea apendicele 2, figura 1); în caz contrar, se trasează curbe pentru fiecare vas. Se determină valoarea medie a procentului de biodegradare în faza de platou sau se evaluează valoarea cea mai mare a acesteia (de exemplu, când curba descrește în faza de platou), este important însă să se estimeze că, în acest din urmă caz, valoarea nu este divergentă. Acest nivel maxim al biodegradării este indicat în raportul testului ca «grad de biodegradare al substanței chimice testate». Dacă numărul de vase de testare a fost insuficient pentru indicarea fazei de platou, datele măsurate din ultima zi a testului sunt folosite pentru calcularea unei valori medii. Această valoare finală, media a cinci teste duplicat, servește la indicarea preciziei cu care a fost determinat procentul de biodegradare. Se raportează, de asemenea, valoarea obținută la finalul ferestrei de 10 zile.
                           
                        
                              63.
                           
                           
                              În același mod, se trasează o curbă pentru substanța chimică de referință FC și, dacă acestea sunt incluse, pentru verificarea degradării abiotice FS și pentru verificarea efectului inhibitor FI.
                           
                        
                              64.
                           
                           
                              Cantitățile de CAT prezente în probele martor (FB) sunt înregistrate la fel cum sunt înregistrate și cele din flacoanele FS (verificare abiotică), dacă aceste vase au fost incluse în test.
                           
                        
                              65.
                           
                           
                              Se calculează D pentru vasele FI, pe baza unui randament teoretic preconizat pentru CA numai din componentul de referință al amestecului. Dacă, în ziua 28, [(DFC
                                  (22) – DFI
                                  (23)/DFC] × 100 > 25 %, se poate presupune că substanța chimică testată a inhibat activitatea inoculului, iar acest fapt poate fi responsabil pentru valorile mici obținute pentru DFT în condițiile de testare. În acest caz, testul poate fi repetat folosind o concentrație mai mică a substanței testate și, de preferat, cu reducerea CID din inocul și a CAT format în probele martor, întrucât concentrația mai scăzută va reduce precizia metodei. Ca alternativă, poate fi utilizat un alt inocul. Dacă în flaconul FS (abiotic) se observă o creștere semnificativă (> 10 %) a cantității de CAT, este posibil ca procesele de degradare abiotică să fi avut loc.
                           
                        
                     Validarea rezultatelor
                  
                  
                              66.
                           
                           
                              Un test se consideră a fi valid dacă:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          procentul mediu de degradare din vasele FC care conțin substanța chimică de referință este > 60 % în ziua 14 a incubării; și
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          cantitatea medie de CAT prezentă în probele martor FB la finalul testului este > 3 mg C/l.
                                       
                                    Dacă aceste limite nu sunt satisfăcute, testul ar trebui să se repete cu un inocul din altă sursă și/sau procedurile folosite ar trebui revizuite. De exemplu, dacă generarea mare de CA din probele martor reprezintă o problemă, ar trebui urmărite procedurile prezentate la punctele 27-32.
                           
                        
                              67.
                           
                           
                              Dacă substanța chimică testată nu atinge 60 % CATh și s-a dovedit că nu are efect inhibitor (punctul 65), testul ar putea fi repetat cu o concentrație mai mare de inocul (până la 30 mg/l nămol activ și 100 ml efluent/l) sau cu inocul din alte surse, în special dacă degradarea s-a situat în intervalul 20-60 %.
                           
                        
                     Interpretarea rezultatelor
                  
                  
                              68.
                           
                           
                              Biodegradarea CATh > 60 % în intervalul ferestrei de 10 zile din acest test demonstrează că substanța chimică testată este ușor biodegradabilă în condiții aerobe.
                           
                        
                              69.
                           
                           
                              Dacă valoarea de prag de 60 % a CATh nu a fost atinsă, se determină valoarea pH-ului mediului din flacoanele care nu au fost acidificate sau alcalinizate; o valoare mai mică de 6,5 ar putea indica faptul că s-a produs nitrificarea. În acest caz, se repetă testul cu o soluție tampon cu o concentrație mai mare.
                           
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              70.
                           
                           
                              Se întocmește un tabel cu % D pentru fiecare flacon de testare (FT), de referință (FC) și, dacă este inclus, pentru flaconul de verificare a efectului inhibitor (FI), pentru fiecare dintre zilele în care s-au prelevat probe. Dacă s-au obținut rezultate comparabile pentru flacoane duplicat, se trasează o curbă a % D medie în funcție de timp. Se înregistrează cantitatea de CAT în probele martor (FB) și în etaloanele sterile (FS), COD și/sau alți parametri, precum și procentajul de eliminare al acestora.
                           
                        
                              71.
                           
                           
                              Se determină valoarea medie a % D din faza de platou sau se folosește valoarea cea mai mare în cazul în care curba de biodegradare descrește în faza de platou, iar această valoare se raportează ca «grad de biodegradare al substanței chimice testate». În acest din urmă caz, este important să se asigure că valoarea nu este divergentă.
                           
                        
                              72.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să includă următoarele informații:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      denumire comună, denumire chimică, număr CAS, formulă structurală și proprietăți fizico-chimice relevante;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      puritatea (impuritățile) substanței chimice testate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      trimiterea la prezenta metodă de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      descrierea sistemului de testare utilizat (de exemplu, volumul vasului, raportul spațiu liber/lichid, metoda de amestecare etc.);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      adăugarea substanței chimice testate în sistemul de testare: concentrația substanței testate și cantitatea de carbon dozată în fiecare flacon de testare și orice utilizare a solvenților;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      detalii privind inoculul utilizat, orice pretratare și precondiționare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      temperatura de incubare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      validarea principiului analizei CA;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      principalele caracteristici ale analizorului de CA utilizat (și ale oricăror ale metode analitice utilizate);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      numărul de flacoane duplicat.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatele:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datele primare și valorile calculate ale biodegradabilității în formă tabelară;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      graficul degradării procentuale în funcție de timp pentru substanța chimică testată și pentru substanța chimică de referință, faza de latență, faza de degradare, fereastra de 10 zile și panta;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procentul de eliminare la platou, la finalul testului și după fereastra de 10 zile;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      motivele de respingere a rezultatelor testului;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orice alte fapte relevante pentru procedura urmată;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      discutarea rezultatelor.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Capitolul C.4 din prezenta anexă, «Determinarea biodegradabilității «rapide» – Test de degajare a CO2 (Metoda C.4-C)».
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              Sturm R.N. (1973), Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation, J.A., Oil Chem Soc. 50: 159-167.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              Larson R.J. (1979), Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Larson R.J., Hansmann M.A. și Bookland E.A. (1996), Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              ISO 9439 (1990; revizuit în 1999), Calitatea apei – Evaluarea în mediu apos a biodegradabilității aerobe ultime a compușilor organici. Testul degajării dioxidului de carbon (Sturm).
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              US EPA (1996), Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              US EPA (1996), Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Gledhill W.E. (1975), Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate, Appl Microbiol. 30: 922-929.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Weytjens D., Van Ginneken I. and Painter H.A. (1994), The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability, Chemosphere 28: 801-812.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Ennis D.M. and Kramer A. (1975), A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides, J. Food Sci. 40: 181-185.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Ennis D.M., Kramer A., Jameson C.W., Mazzoccki P.H. and Bailey P.H. (1978), Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Boatman R.J., Cunningham S.L. and Ziegler D.A. (1986), A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Struijs J. and Stoltenkamp J. (1990), Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test, Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Birch R.R. and Fletcher R.J. (1991), The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability, Chemosphere 23: 507-524.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Birch R.R., Biver C., Campagna R., Gledhill W.E., Pagga U., Steber J., Reust H., and Bontinck W.J. (1989), Screening of chemicals for anaerobic biodegradation, Chemosphere 19: 1527-1550.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              ISO 14593 (1999), Calitatea apei – Evaluarea în mediu apos a biodegradabilității aerobe ultime a compușilor organici. Metoda prin analiza carbonului anorganic în vase închise ermetic (Încercare cu CO2 în spațiul superior).
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              Battersby N.S. (1997), The ISO headspace CO2 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              US EPA (1996), Fate, Transport and Transportation. 835,3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Battersby N.S., Ciccognani D., Evans M.R., King D., Painter H.A., Peterson D.R. and Starkey M. (1999), An «inherent» biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test, Chemosphere 38: 3219-3235.
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Capitolul C.4 din prezenta anexă, «Determinarea biodegradabilității „rapide” ».
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OCDE (1988), OCDE Metode de testare comparate interlaboratoare pentru determinarea biodegradabilității rapide: Raportul președintelui (M. Hashimoto; MITI) și raportul final (M. Kitano și M. Takatsuki; CITI). Paris.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Capitolul C.11 din prezenta anexă, «Nămolul activ: test de inhibiție a respirației».
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Struijs J., Stoltenkamp-Wouterse M.J. and Dekkers A.L.M. (1995), A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests, Biodegradation 6: 319-327.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              UE (1999), Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              ISO 10634 (1996), Calitatea apei. Ghid pentru pregătirea și tratarea compușilor organici greu solubili în apă în vederea evaluării biodegradabilității lor în mediu apos.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     ABREVIERI ȘI DEFINIȚII
                     CA: carbon anorganic.
                     CO2T: cantitatea teoretică de dioxid de carbon (mg) este cantitatea de dioxid de carbon calculată din conținutul de carbon cunoscut sau măsurat al substanței chimice testate când aceasta este complet mineralizată; se exprimă și ca mg dioxid de carbon degajat pe mg substanță chimică testată.
                     COD: carbonul organic dizolvat este carbonul organic prezent în soluție sau acela care trece printr-un filtru de 0,45 microni sau rămâne în supernatant după centrifugare la aproximativ 4 000 g (aproximativ 40 000 m s-2) timp de 15 min.
                     CAD: carbon anorganic dizolvat.
                     CATh: carbon anorganic teoretic.
                     CAT: carbon anorganic total.
                     Ușor biodegradabil: o clasificare arbitrară a substanțelor chimice care au trecut anumite teste de screening specificate pentru biodegradabilitatea finală; aceste teste sunt atât de riguroase încât se admite că asemenea substanțe chimice se vor degrada biologic rapid și complet în medii acvatice în condiții aerobe.
                     Fereastră de 10 zile: cele 10 zile care urmează imediat după atingerea nivelului de 10 % biodegradare.
                     Biodegradabilitate intrinsecă: o clasificare a substanțelor chimice pentru care există probe neechivoce de biodegradare (primară sau finală) în orice test de biodegradabilitate.
                     Biodegradare aerobă finală: nivelul de degradare realizat când substanța chimică testată este complet folosită de microorganisme având ca rezultat producerea de dioxid de carbon, apă, săruri minerale și noi constituenți celulari microbieni (biomasă).
                     Mineralizare: mineralizarea reprezintă degradarea completă a unei substanțe chimice organice în CO2 și H2O în condiții aerobe și în CH4, CO2 și H2O în condiții anaerobe.
                     Fază de latență: perioada cuprinsă între începutul unui test și momentul în care se realizează aclimatizarea și/sau adaptarea microorganismelor care produc degradarea, iar gradul de biodegradare al unei substanțe chimice testate sau al materiilor organice a crescut la un nivel detectabil (de exemplu, 10 % din biodegradarea teoretică maximă sau mai puțin, în funcție de precizia metodei de măsurare).
                     Faza de degradare: timpul de la sfârșitul perioadei de latență până în momentul în care se atinge 90 % din nivelul maxim de degradare.
                     Faza de platou: faza de platou este faza în care s-a atins degradarea maximă, iar curba de biodegradare s-a aplatizat.
                     Substanță chimică testată: orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                  
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Exemplu de curbă de biodegradare
                     
                     
                        Figura 1
                     
                     
                        Biodegradarea 1-octanolului în testul CO2 în spațiul liber
                     
                     
                        
                     
                        Glosar
                     
                     Biodegradare
                     Faza de degradare
                     Nivelul maxim de biodegradare
                     Faza de platou
                     Fereastra de 10 zile
                     Timp de testare (zile)
                  
                  C. 30.   BIOACUMULAREA ÎN OLIGOCHETELE TERESTRE
                  
                  INTRODUCERE
                  
                              1.
                           
                           
                              Această metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) 317 (2010). Printre metodele de testare în legătură cu evoluția în mediu, «Bioconcentrarea: experiența cu reînnoire continuă asupra peștilor» [capitolul C.13 din prezenta anexă (49)] și «Bioacumularea în oligochetele bentice care trăiesc în sedimente» (53) au fost publicate în anii 1996 și respectiv 2008. Este dificil, dacă nu imposibil, ca datele privind bioacumularea acvatică să fie extrapolate la organismele terestre, cum sunt râmele. În prezent, sunt utilizate modele de calcul bazate pe un test al caracterului lipofil al unei substanțe chimice, de exemplu, (14) (37), pentru evaluarea bioacumulării de substanțe chimice în sol, cum este de exemplu, Ghidul tehnic al UE (19). Necesitatea unei metode de testare care să includă compartimente specifice a fost deja prezentată, de exemplu în (55). O astfel e metodă este importantă, mai ales pentru evaluarea otrăvirii secundare în lanțurile alimentare terestre (4). Mai multe metode de testare naționale abordează problema bioacumulării în alte organisme în afară de pești, de exemplu (2) și (72). O metodă de măsurare a bioacumulării din solurile contaminate în râme (Eisenia fetida, Savigny) și în enchitreide a fost dezvoltată de American Society for Testing and Materials (Societatea Americană pentru Testări și Materiale) (3). O metodă acceptată pe plan internațional pentru determinarea bioacumulării în solul îmbogățit va îmbunătăți evaluarea riscurilor substanțelor chimice asupra ecosistemelor terestre, de exemplu (25) (29).
                           
                        
                              2.
                           
                           
                              Nevertebratele geofage sunt expuse la substanțele chimice prezente în sol. Printre aceste animale, oligochetele terestre joacă un rol important în structura și funcția solurilor (15) (20). Oligochetele terestre trăiesc în sol și, parțial, la suprafața acestuia (în special în litieră); acestea reprezintă în mod frecvent specia cea mai abundentă din punct de vedere al biomasei (54). Prin rolul lor în bioturbația solului și ca pradă, aceste animale pot avea o influență puternică asupra biodisponibilității substanțelor chimice pentru organisme prădătoare, precum nevertebratele [de exemplu, acarieni prădători și coleoptere; de exemplu (64)] sau vertebratele (de exemplu, vulpi și pescăruși) (18) (62). Unele specii de oligochete terestre folosite în prezent în cadrul testelor ecotoxicologice sunt descrise în apendicele 5.
                           
                        
                              3.
                           
                           
                              Ghidul ASTM privind efectuarea testelor de laborator pentru toxicitatea solului sau bioacumulare cu râme Eisenia fetida și enchitreide Enchytraeus albidus (3) furnizează multe detalii esențiale și utile pentru realizarea metodei de testare curente privind bioacumularea în sol. Documentația suplimentară la care se face trimitere în prezenta metodă de testare sunt disponibile în capitolul C.13 din prezenta anexă, Bioconcentrarea: experiența cu reînnoire continuă asupra peștilor (49) și în orientarea nr. 315 a OCDE: Bioacumularea în oligochetele bentice care trăiesc în sedimente (53). Experiența practică obținută din studiile privind bioacumularea în sol și din diversele publicații ale literaturii de specialitate, de exemplu, (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79) reprezintă, de asemenea, surse importante de informații pentru această metodă de testare.
                           
                        
                              4.
                           
                           
                              Prezenta metodă de testare se aplică în general substanțelor chimice organice, neutre, stabile care tind să se adsoarbă în soluri. Prezenta metodă de testare poate permite testarea bioacumulării compușilor organo-metalici stabili prezenți în sol. De asemenea, aceasta este aplicabilă metalelor și altor microelemente.
                           
                        PREMISE
                  
                              5.
                           
                           
                              Testele pentru măsurarea bioacumulării unei substanțe chimice în oligochetele terestre au fost efectuate cu metale grele [a se vedea, de exemplu, (63)] și cu substanțe chimice organice persistente care aveau valorile log Kow cuprinse între 3,0 și 6,0, de exemplu (40). Aceste teste se aplică, de asemenea, la:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          substanțe chimice care prezintă un log Kow mai mare de 6,0 (substanțe chimice super-hidrofobe);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          substanțe chimice care aparțin clasei de substanțe chimice organice cunoscute a avea potențial de bioacumulare în organisme vii, de exemplu substanțe chimice tensioactive sau foarte adsorbante;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          substanțe chimice al căror potențial de bioacumulare este indicat de caracteristicile structurale, de exemplu analogi ai substanțelor chimice cu potențial de bioacumulare cunoscut; și
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          metale.
                                       
                                    
                        
                              6.
                           
                           
                              Înainte de inițierea studiului ar trebui obținute informații privind substanțele chimice testate, cum sunt denumirea comună, denumirea chimică (de preferat denumirea IUPAC), formula structurală, numărul de înregistrare CAS, puritatea, măsurile de securitate, condițiile adecvate de păstrare și metodele analitice. În plus, trebuie cunoscute următoarele informații:
                              
                                          (a)
                                       
                                       
                                          solubilitatea în apă;
                                       
                                    
                                          (b)
                                       
                                       
                                          coeficientul de partiție octanol-apă, Kow;
                                       
                                    
                                          (c)
                                       
                                       
                                          coeficientul de partiție sol-apă, exprimat prin Koc;
                                       
                                    
                                          (d)
                                       
                                       
                                          presiunea de vapori;
                                       
                                    
                                          (e)
                                       
                                       
                                          degradabilitatea (de exemplu, în sol, apă);
                                       
                                    
                                          (f)
                                       
                                       
                                          metaboliții cunoscuți.
                                       
                                    
                        
                              7.
                           
                           
                              Pot fi utilizate substanțe chimice de testare marcate radioactiv sau nemarcate radioactiv. Totuși, pentru a ușura analiza, se recomandă utilizarea unei substanțe chimice testate marcată radioactiv. Decizia se va lua în funcție de limitele de detectare sau de necesitatea de măsurare a substanței chimice testate de origine și a metaboliților. Dacă se utilizează o substanță chimică de testat marcată radioactiv și dacă sunt măsurate reziduurile radioactive totale, este important ca reziduurile marcate radioactiv, atât din sol, cât și din organismele testate, să fie definite în procente de substanță chimică testată de origine și de substanță chimică marcată ca nefiind de origine, de exemplu în probe prelevate la starea de echilibru sau la finalul fazei de absorbție, pentru a permite calcularea unui factor de bioacumulare (BAF) pentru substanța chimică testată de origine și pentru metaboliții din sol care prezintă interes (a se vedea punctul 50). S-ar putea dovedi necesară modificarea metodei descrise aici, de exemplu pentru a furniza suficientă biomasă pentru măsurarea substanțelor chimice testate organice sau a metalelor nemarcate radioactiv. Când sunt măsurate reziduurile radioactive totale (prin numărătoarea în scintilație lichidă după extracția, arderea sau solubilizarea țesutului), factorul de bioacumulare se bazează pe substanța chimică testate de origine și pe metaboliți. Calcularea BAF ar trebui să se bazeze, de preferat, pe concentrația substanței chimice testate de origine din organism și pe reziduurile radioactive totale. Ulterior, factorul de acumulare biotă-sol (BSAF), ajustat cu conținutul de lipide al viermelui și cu conținutul de carbon organic (CO) al solului, ar trebui calculat din BAF din motive de asigurare a comparabilității între rezultatele obținute din diferite teste de bioacumulare.
                           
                        
                              8.
                           
                           
                              Toxicitatea substanței chimice testate față de speciile utilizate în test ar trebui să fie cunoscută, de exemplu, o concentrație de efect (CEx) sau concentrația letală (CLx) pentru durata fazei de absorbție [de exemplu (19)]. Concentrația selectată a substanței chimice testate ar trebui să fie, de preferat, de aproximativ 1 % din CL50 acută asimptotică și de cel puțin zece ori mai mare decât limita sa de detecție în sol prin metoda de analiză utilizată. Dacă sunt disponibile, ar trebui utilizate în mod preferențial valorile de toxicitate determinate din studiile de lungă durată privind efectele subletale (51) (52). Dacă aceste date nu sunt disponibile, un test privind toxicitatea acută va furniza informații utile [a se vedea, de exemplu, (23)].
                           
                        
                              9.
                           
                           
                              Ar trebui să fie disponibilă o metodă analitică potrivită pentru care se cunosc exactitatea, fidelitatea și sensibilitatea în vederea cuantificării substanței chimice din soluțiile experimentale, din sol și din materialul biologic, împreună cu detalii privind prepararea și păstrarea probelor, precum și cu fișe tehnice de securitate. De asemenea, trebuie cunoscută limita de detecție analitică a substanței testate din sol și din țesutul viermelui. Dacă se utilizează o substanța chimică testată marcată cu C14, trebuie să fie cunoscute radioactivitatea specifică (de exemplu Bq mol–1) și procentul radioactivității asociate impurităților. Radioactivitatea specifică a substanței chimice testate trebuie să fie suficient de mare pentru a facilita analiza, iar concentrațiile substanței testate nu trebuie să producă efecte toxice.
                           
                        
                              10.
                           
                           
                              Testul poate fi realizat cu un sol artificial sau cu soluri naturale. Înainte de inițierea testului ar trebui cunoscute informațiile privind caracteristicile solului natural utilizat, de exemplu originea solului sau constituenții acestuia, pH-ul, conținutul de carbon organic, granulometria (procent de nisip, aluviuni și argilă) și capacitatea de reținere a apei (CRA), (3) (48).
                           
                        PRINCIPIUL TESTULUI
                  
                              11.
                           
                           
                              Parametrii care caracterizează bioacumularea unei substanțe chimice testate includ factorul de bioacumulare (BAF), constanta vitezei de absorbție (ks) și constanta vitezei de eliminare (ke). Definițiile sunt prevăzute în apendicele 1.
                           
                        
                              12.
                           
                           
                              Testul constă în două faze: faza de absorbție (expunere) și faza de eliminare (post-expunere). În timpul fazei de absorbție, grupuri replicate de viermi sunt expuse la solul care a fost îmbogățit cu substanța chimică testată. Pe lângă animalele testate, grupuri martor de viermi sunt ținute în condiții identice fără substanța chimică testată. Se măsoară greutatea uscată și conținutul de lipide ale organismelor testate. Aceasta se poate realiza folosind viermii din grupul martor. Valorile analitice de bază (martor) pot fi obținute prin analizarea probelor martor de viermi și de sol. Pentru faza de eliminare, viermii sunt transferați într-un sol fără substanța chimică testată. O fază de eliminare este necesară întotdeauna, exceptând cazul în care absorbția substanței chimice testate în timpul fazei de expunere a fost nesemnificativă. O fază de eliminare furnizează informații privind viteza cu care substanța chimică testată este excretată de organismele testate [de exemplu (27)]. Dacă în timpul fazei de absorbție nu se atinge o stare de echilibru, este de preferat ca determinarea parametrilor cinetici – factorul de bioacumulare cinetic BAFK, constanta (constantele) vitezei de absorbție și de eliminare – să se bazeze pe ajustarea simultană a rezultatelor fazelor de absorbție și de eliminare. Concentrația substanței chimice testate din/de pe viermi se monitorizează pe parcursul ambelor faze ale testului.
                           
                        
                              13.
                           
                           
                              În timpul fazei de absorbție, măsurătorile se realizează la intervale de prelevare de până la 14 zile (la enchitreide) sau de 21 de zile (la râme) până când se atinge starea de echilibru (11) (12) (67). Starea de echilibru apare atunci când un grafic al concentrației din viermi în funcție de timp este paralel cu axa timpului, iar analizele a trei concentrații succesive realizate pe probe prelevate la intervale de cel puțin două zile nu variază cu mai mult de ± 20 % una față de cealaltă, pe baza comparațiilor statistice (de exemplu, analiza varianței, analiza regresiei).
                           
                        
                              14.
                           
                           
                              Faza de eliminare constă în transferul organismelor testate în vase care conțin același substrat fără substanța chimică testată. În timpul fazei de eliminare, măsurătorile se realizează la intervale de prelevare de până la 14 zile (la enchitreide) sau de 21 de zile (la râme), exceptând cazul în care o determinarea analitică anterioară a indicat o reducere cu 90 % a reziduurilor substanței chimice testate în viermi. Concentrația substanței chimice testate din viermi la finalul fazei de eliminare se raportează ca reziduuri neeliminate. Factorul de bioacumulare al stării de echilibru (BAFss) se calculează, de preferință, atât ca raport între concentrația din viermi (Ca) și cea din sol (Cs) la starea de echilibru aparentă, cât și ca factor de bioacumulare cinetic, BAFK, ca raport între constanta vitezei de absorbție din sol (ks) și constanta vitezei de eliminare (ke) (a se vedea apendicele 1 pentru definiții) presupunând o cinetică de ordinul întâi (a se vedea apendicele 2 pentru calcule). În cazul în care cinetica de ordinul întâi este clar inaplicabilă, trebuie utilizate alte modele.
                           
                        
                              15.
                           
                           
                              Constanta vitezei de absorbție, constanta vitezei de eliminare (sau constantele, în cazul în care sunt implicate alte modele), factorul de bioacumulare cinetic (BAFK) și, dacă este posibil, limitele de încredere pentru fiecare dintre acești parametri, se calculează plecând de la ecuații de modelare informatice (a se vedea apendicele 2 pentru orientare). Calitatea ajustării oricărui model poate fi determinată, de exemplu, din coeficientul de corelare sau coeficientul de determinare (coeficienții apropiați de unu indică o bună calitate a ajustării) sau testul chi-pătrat. De asemenea, mărimea erorii standard sau limita de încredere în jurul parametrilor estimați poate fi un indicator al calității ajustării modelului.
                           
                        
                              16.
                           
                           
                              Pentru a reduce variabilitatea rezultatelor testului pentru substanțe chimice testate cu caracter foarte lipofil, factorii de bioacumulare trebuie exprimați în raport cu conținutul lipidic și conținutul de carbon organic (kg carbon organic sol (CO) kg-1 conținut lipidic vierme). Aceasta abordare se bazează pe faptul că, pentru unele clase de substanțe chimice, există o relație clară între potențialul de bioacumulare și caracterul lipofil; această relație a fost bine stabilită pentru pești (47). Există o relație între conținutul de lipide al peștilor și bioacumularea unor astfel de substanțe chimice. Pentru organismele bentice au fost identificate corelări similare, de exemplu (30) (44). În mod similar, această corelare a fost demonstrată pentru oligochetele terestre, de exemplu (5) (6) (7) (14). Dacă este disponibil suficient țesut de vierme, conținutul de lipide al animalelor testate poate fi determinat pe același material biologic ca cel utilizat pentru determinarea concentrației de substanță chimică testată. Ca alternativă, pot fi utilizate animale martor pentru măsurarea conținutului de lipide.
                           
                        VALIDITATEA TESTULUI
                  
                              17.
                           
                           
                              Pentru ca un test să fie valid, următoarele criterii trebuie îndeplinite atât de grupurile martor cât și de cele de tratate:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          la finalul testului, mortalitatea totală în cursul fazei de absorbție și a celei de eliminare nu trebuie să depășească 10 % (la râme) sau 20 % (la enchitreide) din numărul total al viermilor introduși;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          pentru Eisenia fetida și Eisenia andrei, pierderea masică medie măsurată la finalul fazei de absorbție și la finalul fazei de eliminare nu trebuie să depășească 20 % comparativ cu masa proaspătă inițială (m.p.) la începutul fiecărei faze.
                                       
                                    
                        DESCRIEREA METODEI
                  
                     Speciile folosite pentru testare:
                  
                  
                              18.
                           
                           
                              Pentru testarea bioacumulării sunt recomandate mai multe specii de oligochete terestre. Speciile cel mai frecvent folosite [Eisenia fetida sau Eisenia andrei (Lumbricidae) sau Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus sau Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae)] sunt descrise în apendicele 5.
                           
                        
                     Aparatură
                  
                  
                              19.
                           
                           
                              Se vor evita materialele care pot adsorbi, dizolva substanța chimică testată sau care pot lesiva alte substanțe chimice și care pot avea un efect indezirabil asupra animalelor testate, aceasta fiind valabilă pentru toate componentele echipamentelor folosite. Pot fi folosite vase standard rectangulare sau cilindrice, realizate din material inert chimic și cu o capacitate adecvată, în concordanță cu rata de încărcare, adică cu numărul de viermi testați. Pentru orice echipamente care intră în contact cu mediul de testare poate fi folosit oțel inoxidabil, plastic sau sticlă. Vasele de testare trebuie acoperite în mod corespunzător pentru a preveni răspândirea viermilor, permițând totodată pătrunderea unei cantități suficiente de aer. Pentru substanțele chimice cu coeficienți mari de adsorbție, cum ar fi piretrinele de sinteză, poate fi necesară sticla silanizată. În aceste cazuri, echipamentul se va elimina după utilizare (49). Trebuie prevenită degajarea substanțelor testate marcate radioactiv și a substanțelor chimice volatile. Trebuie utilizate separatoare (de exemplu, flacoane din sticlă pentru spălare cu gaz) care să conțină substanțe absorbante adecvate pentru a reține orice reziduuri care se evaporă din vasele de testare.
                           
                        
                     Sol
                  
                  
                              20.
                           
                           
                              Calitatea solului testat trebuie să permită supraviețuirea și, de preferat, reproducerea organismelor testate în perioada de aclimatizare și în cursul experimentului, fără apariția vreunui comportament anormal. Viermii trebuie introduși în sol.
                           
                        
                              21.
                           
                           
                              Solul artificial descris la capitolul C.8 din prezenta anexă (48) este recomandat spre a fi utilizat ca substrat în teste. Prepararea solului artificial pentru a fi utilizat în testele de bioacumulare și recomandările privind păstrarea solului artificial sunt prezentate în apendicele 4. Solul artificial uscat cu aer poate fi păstrat la temperatura camerei până la utilizare.
                           
                        
                              22.
                           
                           
                              Totuși, solurile naturale care provin din amplasamente nepoluate pot servi drept sol pentru testare/cultură. Solurile naturale trebuie să fie caracterizate cel puțin prin origine (locul de colectare), pH, conținut de carbon organic, granulometrie (procent de nisip, aluviuni și argilă), capacitatea maximă de reținere a apei (CRAmax) și conținutul procentual de apă (3). Analiza solului sau a constituenților acestuia, anterior utilizării, din punct de vedere al micropoluanților ar trebui să furnizeze informații utile. În cazul în care se utilizează sol prelevat de pe terenuri agricole, acesta nu trebuie să fi fost tratat cu produse pentru protecția recoltei sau cu bălegar de la animale tratate ca fertilizatori, timp de cel puțin un an, și nici cu fertilizatori organici, timp de cel puțin șase luni înainte de prelevarea probelor (50). Procedurile de manipulare pentru solurile naturale anterior utilizării în teste ecotoxicologice de laborator cu oligochete sunt descrise în (3). Pentru solurile naturale, perioada de păstrare în laborator trebuie să fie cât mai scurtă cu putință.
                           
                        
                     Aplicarea substanței chimice testate
                  
                  
                              23.
                           
                           
                              Substanța chimică testată se încorporează în sol. Trebuie să se țină cont de proprietățile fizico-chimice ale substanței chimice testate. O substanță chimică testată solubilă în apă trebuie să fie complet dizolvată în apă înainte de a fi amestecată cu solul. Procedura de îmbogățire recomandată pentru substanțele chimice testate cu solubilitate redusă în apă implică acoperirea unuia sau a mai multor constituenți ai solului (artificial) cu substanța chimică testată. De exemplu, nisip de cuarț sau o parte din acesta poate fi îmbibată cu o soluție de substanță chimică testată într-un solvent organic corespunzător, care este apoi evaporat lent până la uscare. Fracțiunea acoperită poate fi apoi amestecată cu solul umed. Avantajul major al acestei proceduri este acela că în sol nu se introduce solvent. Când se utilizează un sol natural, substanța chimică testată poate fi adăugată prin îmbogățirea unei părți de sol uscate cu aer, astfel cum este descris mai sus pentru solul artificial, sau prin amestecarea substanței chimice testate într-un sol umed, însoțită de un pas ulterior de evaporare dacă se utilizează un agent de solubilizare. În general, trebuie evitat, în măsura în care este posibil, contactul solului umed cu solvenți. Se au în vedere cele menționate în continuare (3):
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          dacă se utilizează un alt solvent în afară de apă, acesta trebuie să fie unul miscibil în apă și/sau care poate fi eliminat (de exemplu, evaporat), lăsând în sol numai substanța chimică testată;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          dacă se utilizează un martor tratat cu solvent, nu sunt necesari martori negativi. Martorul tratat cu solvent trebuie să conțină cea mai mare concentrație de solvent adăugat în sol și ar trebui să utilizeze un solvent din același lot cu cel folosit pentru a prepara soluția stoc. Toxicitatea și volatilitatea solventului și solubilitatea substanței chimice testate în solventul ales ar trebui să reprezinte principalele criterii folosite pentru selecția unui agent de solubilizare adecvat.
                                       
                                    
                        
                              24.
                           
                           
                              Pentru substanțele chimice cu solubilitate redusă în apă și în solvenți organici, pot fi amestecate 2,0-2,5 g de nisip de cuarț fin măcinat pe vas de testare cu cantitatea de substanța chimică testată, de exemplu folosind un mojar și un pistil, pentru a obține concentrația dorită a substanței testate. Acest amestec de nisip de cuarț și substanță chimică testată se adaugă la solul preumezit și se amestecă bine cu o cantitate corespunzătoare de apă deionizată pentru a se obține conținutul de umiditate dorit. Amestecul final se distribuie în vasele de testare. Procedura se repetă pentru fiecare concentrație a substanței testate, pregătindu-se, de asemenea, o probă martor adecvată cu 2,0-2,5 g de nisip de cuarț fin măcinat pe vas de testare.
                           
                        
                              25.
                           
                           
                              Se determină concentrația substanței chimice testate în sol după îmbogățire. Înainte de introducerea organismelor testate trebuie verificată distribuirea omogenă a substanței chimice testate în sol. Metoda utilizată pentru îmbogățire și motivele pentru alegerea unei proceduri de îmbogățire specifice trebuie raportate (24).
                           
                        
                              26.
                           
                           
                              În mod ideal, ar trebui realizat un echilibru între sol și apa interstițială înainte de adăugarea organismelor; se recomandă o perioadă de timp de patru zile la 20 °C. Pentru multe substanțe chimice organice cu solubilitate scăzută în apă timpul necesar pentru a se atinge un echilibru real între fracțiile adsorbită și dizolvată poate fi de ordinul zilelor sau al lunilor. În funcție de scopul studiului, de exemplu atunci când urmează a fi simulate condițiile de mediu, îmbogățirea solului poate fi «învechită» pentru o perioadă mai îndelungată, de exemplu, pentru metale, trei săptămâni la 20 °C (22).
                           
                        
                     Creșterea organismelor testate
                  
                  
                              27.
                           
                           
                              Viermii ar trebui, de preferat, ținuți în cultură de laborator permanentă. Ghidul privind metodele culturilor de laborator pentru speciile Eisenia fetida și Eisenia andrei și Enchytraeid, este prezentat în apendicele 5 [a se vedea și (48) (51) (52)].
                           
                        
                              28.
                           
                           
                              Viermii folosiți în teste ar trebui să nu prezinte boli, anormalități sau paraziți vizibili.
                           
                        DESFĂȘURAREA TESTULUI
                  
                              29.
                           
                           
                              Organismele testate sunt expuse la substanța chimică testată în timpul fazei de absorbție. Faza de absorbție ar trebui să dureze 14 zile (la enchitreide) sau 21 de zile (la râme), cu excepția cazului în care se demonstrează că s-a atins starea de echilibru.
                           
                        
                              30.
                           
                           
                              Pentru faza de eliminare, viermii sunt transferați într-un sol fără substanță chimică testată. Prima probă ar trebui să fie prelevată la 4-24 h după inițierea fazei de eliminare. Exemple de grafice de prelevare pentru ziua 21 a unei faze de absorbție și ziua 21 a unei faze de eliminare sunt prezentate în apendicele 3.
                           
                        
                     Organismele testate
                  
                  
                              31.
                           
                           
                              Pentru multe specii de enchitreide terestre greutatea individuală este foarte mică (de exemplu, 5-10 mg greutate umedă pe individ pentru Enchytraeus albidus și mai mică pentru Enchytraeus crypticus sau Enchytraeus luxuriosus); pentru a efectua măsurători ale greutății și analiza chimică este posibil să fie necesar ca viermii din vasele de testare duplicat să fie puși laolaltă (adică vor fi utilizați toți viermii dintr-un vas duplicat pentru a obține un răspuns pentru țesutul analizat). În fiecare vas duplicat se adaugă 20 de enchitreide și ar trebui utilizate cel puțin trei vase duplicat. Dacă limita de detecție analitică a substanței chimice testate este mare vor fi necesari mai mulți viermi. Pentru speciile testate cu greutate individuală mai mare (Eisenia fetida și Eisenia andrei), pot fi utilizate vase duplicat care conțin un individ.
                           
                        
                              32.
                           
                           
                              Râmele folosite într-un test ar trebui să aibă greutăți asemănătoare (de exemplu, Eisenia fetida și Eisenia andrei ar trebui să aibă o greutate individuală de 250-600 mg). Enchitreidele (de exemplu Enchytraeus albidus) ar trebui să aibă lungimea de aproximativ 1 cm. Toți viermii folosiți într-un anumit test ar trebui să provină din aceeași sursă și ar trebui să fie animale adulte cu clitelum (a se vedea apendicele 5). Deoarece greutatea și vârsta unui animal pot afecta valorile BAF (de exemplu, datorită conținutului diferit de lipide și/sau al prezenței ouălor), acești parametri ar trebui înregistrați cu acuratețe și avuți în vedere la interpretarea rezultatelor. În plus, în timpul perioadei de expunere pot fi depuși coconi, care vor avea de asemenea un impact asupra valorilor BAF. Este indicat ca o subprobă din viermii testați să fie cântărită înainte de experiment, pentru estimarea greutăților medii umede și uscate.
                           
                        
                              33.
                           
                           
                              Ar trebui utilizat un raport sol-vierme mare pentru a se micșora creșterea concentrației substanței chimice testate în sol în timpul fazei de absorbție. Pentru Eisenia fetida și Eisenia andrei se recomandă o cantitate minimă de 50 g greutate uscată (g.u.) de sol pe vierme, iar pentru enchitreide un minim de 10-20 g.u. de sol pe vas de testare. Vasele ar trebui să conțină un strat de sol de 2-3 cm (pentru enchitreide) sau de 4-5 cm (pentru râme).
                           
                        
                              34.
                           
                           
                              Viermii folosiți într-un test sunt scoși din cultură (de exemplu, enchitreidele prin utilizarea pensetelor de bijutier). Animalele adulte sunt transferate într-un sol de test netratat, pentru aclimatizare, și hrănite (a se vedea punctul 36). În cazul în care condițiile de testare diferă de condițiile de creștere, o fază de aclimatizare de 24-72 h ar trebui să fie suficientă pentru adaptarea viermilor la condițiile de testare. După aclimatizare, râmele sunt clătite prin transferarea în recipiente de sticlă (de exemplu, cutii Petri) care conțin apă curată, iar ulterior, înainte de a fi adăugate în solul de testare, sunt cântărite. Înaintea cântăririi, trebuie îndepărtat excesul de apă din viermi apăsându-i ușor de marginea recipientului sau tamponându-i cu atenție până se usucă, cu un prosop de hârtie puțin umezit.
                           
                        
                              35.
                           
                           
                              Comportamentul organismelor la intrarea în sol ar trebui urmărit și înregistrat. În mod obișnuit, în testele cu râme, animalele (loturile de control și cele tratate) intră în sol în decurs de câteva ore; acest lucru ar trebui verificat după cel mult 24 h de la adăugarea viermilor în vasele de testare. În cazul în care râmele nu reușesc să intre în sol (de exemplu, mai mult de 10 % nu intră în sol într-un timp care depășește jumate din faza de absorbție), aceasta indică faptul că fie condițiile de testare nu sunt adecvate, fie organismele testate nu sunt sănătoase. În acest caz, testul ar trebui oprit și repetat. Enchitreidele trăiesc în principal în porii interstițiali ai solului și deseori tegumentul acestora poate intra doar parțial în contact cu substratul înconjurător; expunerea enchitreidelor care au intrat în sol și a celor care nu au intrat se presupune a fi echivalentă, iar neintrarea în sol a enchitreidelor nu impune în mod necesar repetarea testului.
                           
                        
                     Hrănirea
                  
                  
                              36.
                           
                           
                              Hrănirea ar trebui să fie avută în vedere când este utilizat un sol cu conținut de carbon organic total scăzut. Atunci când se utilizează un sol artificial, se recomandă o rație alimentară săptămânală (adică viermii trebuie hrăniți o dată pe săptămână) de 7 mg de bălegar uscat pe g de sol greutate uscată pentru râme, iar pentru enchitreide se recomandă o rație săptămânală de 2-2,5 mg de bază de fulgi de ovăz măcinați pe g de sol greutate uscată (11). Prima rație alimentară ar trebui amestecată cu solul imediat înainte de adăugarea organismelor de testare. Ar trebui utilizat de preferat același tip de hrană cu cel din culturi (a se vedea apendicele 5).
                           
                        
                     Lumina și temperatura
                  
                  
                              37.
                           
                           
                              Testele ar trebui să se desfășoare la un ciclu controlat lumină/întuneric de 16/8 ore, de preferat la un nivel de iluminare în zona vaselor de testare de 400-800 lx (3). Temperatura de testare ar trebui să fie 20 ± 2 °C pe tot parcursul testului.
                           
                        
                     Concentrațiile substanței testate
                  
                  
                              38.
                           
                           
                              Se folosește o singură concentrație a substanței testate. Cazurile în care este (sunt) necesară (necesare) o concentrație (concentrații) suplimentară (suplimentare) a(le) substanței testate ar trebui să fie justificate. Dacă toxicitatea (CEx) a substanței chimice testate este apropiată de limita de detecție analitică, se recomandă utilizarea unei substanțe chimice de testat marcată radioactiv, cu o radioactivitate specifică ridicată. Pentru metale, concentrația substanței testate ar trebui să depășească nivelul de bază din țesut și din sol.
                           
                        
                     Vase duplicat
                  
                  
                              39.
                           
                           
                              Pentru măsurătorile cinetice (faza de absorbție și faza de eliminare), numărul minim de vase duplicat tratate ar trebui să fie de trei pentru fiecare punct de prelevare a probelor. Numărul total de vase duplicat pregătite ar trebui să fie suficient pentru a acoperi toate intervalele de prelevare a probelor din timpul fazei de absorbție și al fazei de eliminare.
                           
                        
                              40.
                           
                           
                              Pentru observațiile și măsurătorile biologice (de exemplu, raport greutate uscată- greutate umedă, conținut de lipide) și pentru analiza concentrațiilor de bază ale substanței testate din viermi și din sol, ar trebui prevăzute cel puțin 12 vase duplicat ale unui martor negativ (patru probe prelevate la inițiere, patru la finalizarea absorbției și patru la finalizarea eliminării) dacă nu este utilizat un alt solvent în afară de apă. Dacă pentru aplicarea substanței chimice testate se utilizează orice agent de solubilizare, pe lângă vasele duplicat tratate, ar trebui realizat un martor tratat cu solvent (ar trebui prelevate probe din patru vase duplicat la inițiere, din patru la finalul fazei de absorbție și din patru la finalul fazei de eliminare) care să conțină toți constituenții, mai puțin substanța testată. În acest caz, este posibil să fie prevăzute patru vase duplicat suplimentare cu martor negativ (fără solvent) pentru prelevarea opțională de probe la finalul fazei de absorbție. Aceste vase duplicat pot fi comparate din punct de vedere biologic cu martorul tratat cu solvent pentru a se obține informații privind posibila influență a solventului asupra organismelor testate. Se recomandă realizarea unui număr suficient de vase duplicat de rezervă suplimentare (de exemplu, opt) pentru tratament și martor(i).
                           
                        
                     Frecvența de măsurare a calității solului
                  
                  
                              41.
                           
                           
                              pH-ul solului, conținutul de umiditate al solului și temperatura (permanentă) din camera de testare trebuie măsurate la începutul și la finalul fazelor de absorbție și de eliminare. O dată pe săptămână ar trebui controlat conținutul de umiditate al solului prin cântărirea vaselor de testare și compararea greutăților curente cu greutățile inițiale de la începutul testului. Pierderile de apă ar trebui compensate prin adăugarea de apă deionizată.
                           
                        
                     Prelevarea probelor și analiza viermilor și a solului
                  
                  
                              42.
                           
                           
                              Un exemplu de grafic pentru fazele de absorbție și de eliminare în testele de bioacumulare la râme și enchitreide este prezentat în apendicele 3.
                           
                        
                              43.
                           
                           
                              Probele de sol se prelevează din vasele de testare pentru determinarea concentrației substanței chimice testate înainte de introducerea viermilor și în timpul fazelor de absorbție și de eliminare. În timpul testului, concentrațiile substanței chimice testate se determină în viermi și în sol. În general, se măsoară concentrațiile totale din sol. Opțional, pot fi măsurate concentrațiile din apa interstițială; în acest caz, ar trebui asigurate metode justificate și adecvate, anterior inițierii unui studiu, și incluse în raport.
                           
                        
                              44.
                           
                           
                              Probele din viermi și sol se prelevează de cel puțin șase ori în timpul fazelor de absorbție și de eliminare. Dacă stabilitatea unei substanțe chimice testate este demonstrată, numărul de analize ale solului poate fi redus. Se recomandă analizarea a cel puțin trei vase duplicat la începutul și la sfârșitul fazei de absorbție. În cazul în care concentrația substanței testate din sol măsurată la sfârșitul fazei de absorbție diferă față de concentrația inițială cu mai mult de 30 %, ar trebui ca probele de sol prelevate la alte date să fie, de asemenea, analizate.
                           
                        
                              45.
                           
                           
                              Se scot viermii din solul dintr-un vas duplicat dat de fiecare dată când se prelevează probe (de exemplu, după ce solul dintr-un vas duplicat a fost întins pe o tavă puțin adâncă și au fost scoși viermii folosind pensete moi de bijutier), se spală rapid cu apă într-un pahar puțin adânc sau pe o tavă de oțel. Se îndepărtează apa în exces (a se vedea punctul 34). Se transferă viermii cu grijă într-un vas precântărit, se cântăresc imediat, inclusiv conținutul intestinelor.
                           
                        
                              46.
                           
                           
                              Râmelor (Eisenia sp.) ar trebui apoi să li se permită să purjeze conținutul intestinelor în timpul nopții, de exemplu pe un filtru de hârtie umed într-o cutie Petri acoperită (a se vedea punctul 34). După purjare, ar trebui determinată greutatea viermilor pentru a se putea evalua posibila scădere a biomasei în timpul testului (a se vedea criteriile de validare de la punctul 17). Cântărirea și analiza țesutului enchitreidelor se realizează fără purjare, deoarece este dificil de realizat din punct de vedere tehnic datorită dimensiunii mici a acestor viermi. După determinarea greutății finale, viermii ar trebui omorâți imediat, folosind metoda cea mai adecvată (de exemplu, folosind azot lichid sau înghețarea la temperaturi sub – 18 °C).
                           
                        
                              47.
                           
                           
                              În timpul fazei de eliminare, viermii înlocuiesc conținutul contaminat al intestinelor cu sol curat. Aceasta înseamnă că măsurătorile viermilor nepurjați (în acest context enchitreide) din care s-au prelevat probe imediat după faza de eliminare includ sol contaminat în intestine. Pentru oligochetele acvatice se presupune că după primele 4-24 h ale fazei de eliminare cea mai mare parte a conținutului contaminat din intestine a fost înlocuit cu sediment curat, de exemplu (46). Constatări similare au fost raportate pentru râme în studiile privind acumularea de cadmiu și zinc marcate radioactiv (78). În enchitreidele nepurjate, concentrația acestei prime probe din faza de eliminare poate fi considerată drept concentrația din țesut după purjarea intestinelor. Pentru a ține cont de diluția concentrației substanței testate în funcție de solul necontaminat în timpul fazei de eliminare, greutatea conținutului intestinelor poate fi estimată din raportul greutate umedă vierme/greutate cenușă vierme.
                           
                        
                              48.
                           
                           
                              Probele de sol și de vierme ar trebui analizate, de preferință, imediat după ce au fost prelevate (adică în decurs de 1-2 zile) pentru a se preveni degradarea sau alte pierderi și se recomandă calcularea vitezelor de absorbție și de eliminare aproximative pe măsură ce testul avansează. În cazul în care analiza este întârziată, probele ar trebui păstrate folosind o metodă corespunzătoare, de exemplu prin congelare (≤ – 18 °C).
                           
                        
                              49.
                           
                           
                              Ar trebui verificat faptul că precizia și reproductibilitatea analizei chimice, precum și recuperarea substanței chimice testate din probele de sol și de viermi sunt satisfăcătoare pentru metoda dată; ar trebui raportate randamentului extracției, limita de detecție și limita de cuantificare. În mod similar, ar trebui verificat faptul că substanța chimică testată nu este detectabilă în vasele cu martor la concentrații mai mari decât cea de bază. Atunci când concentrația unei substanțe chimice testate în organismul testat Ca este > 0 în viermii din probele martor, aceasta ar trebui inclusă în calculul parametrilor cinetici (a se vedea apendicele 2). Toate probele trebuie manipulate în timpul testului astfel încât să se reducă contaminarea și pierderea (care ar putea rezulta, de exemplu, din adsorbția substanței chimice testate pe dispozitivul de prelevare a probelor).
                           
                        
                              50.
                           
                           
                              Când se lucrează cu substanțe chimice testate marcate radioactiv este posibil să se analizeze substanța de origine și metaboliții. Cuantificarea substanței chimice testate de origine și a metaboliților la starea de echilibru sau la sfârșitul fazei de absorbție furnizează informații importante. Probele ar trebui să fie apoi «curățate» astfel încât substanța chimică testată de origine să poată fi cuantificată separat. Dacă metaboliții simpli depășesc 10 % din radioactivitatea totală în proba (probele) analizate, se recomandă identificarea acestor metaboliți.
                           
                        
                              51.
                           
                           
                              Recuperarea globală și recuperarea substanței chimice testate din viermi, din sol și, dacă sunt utilizate, din separatoarele care conțin substanțe absorbante pentru a reține substanța chimică testată evaporată, ar trebui înregistrate și raportate.
                           
                        
                              52.
                           
                           
                              Gruparea probelor provenite de la indivizii dintr-un vas de testare dat este acceptabilă pentru viermii enchitreide care sunt mai mici decât râmele. Dacă gruparea implică reducerea numărului de vase duplicat, aceasta limitează procedurile statistice care pot fi aplicate datelor. Dacă se cere o procedură statistică specifică și o anumită putere, atunci ar trebui inclus în test un număr adecvat de vase de testare duplicat pentru a se adapta grupării, procedurii și puterii cerute.
                           
                        
                              53.
                           
                           
                              Se recomandă ca BAF să fie exprimat atât în funcție de greutatea uscată totală, cât și, dacă este necesar (adică pentru substanțele chimice foarte hidrofobe), în funcție de conținutul de lipide. Ar trebui utilizate metode adecvate pentru determinarea conținutului de lipide [unele metode existente – de exemplu (31) sau (58) – ar trebui adaptate în acest scop]. Aceste metode utilizează o tehnică de extracție cloroform/metanol. Totuși, pentru a evita utilizarea solvenților clorurați, ar trebui utilizată o modificare a metodei Bligh și Dyer (9) astfel cum este descrisă în (17). Întrucât metodele diferite nu oferă rezultate identice, este important să se precizeze detaliile metodei utilizate. Când este posibil, adică atunci când este disponibil suficient țesut de vierme, ar fi ideal ca analiza lipidelor să se facă pe aceleași probe sau extracte utilizate și pentru analiza substanței chimice testate, întrucât, deseori lipidele trebuie îndepărtate din extras înainte ca acesta să poată fi analizat prin cromatografie (49). Ca alternativă, animalele martor pot fi folosite pentru a măsura conținutul de lipide, care poate fi utilizat apoi pentru ajustarea valorilor BAF. Această din urmă abordare reduce contaminarea echipamentelor cu substanța chimică testată.
                           
                        DATE ȘI RAPORT
                  
                     Interpretarea rezultatelor
                  
                  
                              54.
                           
                           
                              Curba de absorbție a substanței chimice testate va rezulta prin trasarea concentrației sale din/de pe viermi în funcție de timp, în perioada fazei de absorbție, folosind o scară aritmetică. Când curba a atins un platou sau starea de echilibru (a se vedea definiția din apendicele 1), factorul de bioacumulare al stării de echilibru (BAFss) se calculează din:
                              
                                 
                              Ca este concentrația substanței chimice testate în organismul testat
                              Cs este concentrația substanței chimice testate în sol
                           
                        
                              55.
                           
                           
                              Când nu se atinge starea de echilibru, BAFK, ar trebui determinat în schimb BAFss, pe baza constantelor vitezei, astfel cum este descris mai jos:
                              
                                          —
                                       
                                       
                                          se determină factorul de acumulare (BAFK) ca raport între ks/ke;
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          este de preferat ca vitezele de absorbție și de eliminare să fie calculate simultan (a se vedea ecuația 11 din apendicele 2);
                                       
                                    
                                          —
                                       
                                       
                                          constanta vitezei de eliminare (ke) se determină de obicei din curba de eliminare (adică un grafic al concentrației substanței testate din viermi în timpul fazei de eliminare). Constanta vitezei de absorbție ks se calculează apoi în funcție de ke și de o valoare Ca care se determină din curba de absorbție – a se vedea apendicele 2 pentru descrierea acestor metode. Metoda cea mai bună pentru obținerea BAFK și a constantelor de viteză ks și ke, este aceea care recurge la metode informatice neliniare de estimare a parametrilor. Dacă este clar că eliminarea nu este de ordinul întâi, atunci ar trebui utilizate modele mult mai complexe.
                                       
                                    
                        
                     Raportul de testare
                  
                  
                              56.
                           
                           
                              Raportul de testare trebuie să conțină următoarele date:
                              
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Substanța chimică testată:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      orice informație disponibilă cu privire la toxicitatea acută sau pe termen lung (de exemplu, CEx, CLx, CFEO) a substanței chimice testate față de oligochetele bentice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      puritatea, natura fizică și proprietățile fizico-chimice, de exemplu log Kow, solubilitatea în apă;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      datele de identificare a substanței chimice; sursa substanței testate, identitatea și concentrația oricărui solvent utilizat;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dacă se utilizează o substanță chimică de testat marcată radioactiv, poziția exactă a atomilor marcați, radioactivitatea specifică și puritatea radiochimică.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Speciile folosite pentru testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      denumire științifică, sușă, sursă, orice tratament prealabil eventual, aclimatizare, vârstă, gama de dimensiuni etc.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Condițiile de testare:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      procedura de încercare utilizată;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      tipul și caracteristicile iluminării utilizate și perioada (perioadele) de expunere la lumină;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      protocolul testului (de exemplu, numărul și dimensiunea vaselor de testare, masa solului și înălțimea stratului de sol, numărul de duplicate, numărul de viermi, numărul de concentrații testate, durata fazelor de absorbție și de eliminare, frecvența prelevării);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      justificarea alegerii materialului vasului de testare;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metoda de preparare și aplicare a substanței testate, precum și motivele alegerii acestei metode specifice;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concentrațiile experimentale nominale, mediile valorilor măsurate și abaterile standard ale acestora în vasele de testare, precum și metoda prin care aceste valori au fost obținute;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      sursa constituenților solului artificial sau – dacă sunt utilizate medii naturale – originea solului, descrierea oricărui pretratament, rezultatele verificărilor (supraviețuire, dezvoltarea de biomasă, reproducere), caracteristicile solului [pH, conținut de carbon organic total, granulometrie (procent de nisip, aluviuni și argilă), CRAmax, conținut procentual de apă la începutul și la sfârșitul testului și orice alte măsurători realizate];
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      informații detaliate privind tratamentul probelor de sol și de vierme, inclusiv detalii privind prepararea, păstrarea, procedurile de îmbogățire, extracție și procedurile analitice (și precizia) pentru substanța testată din viermi și din sol și conținutul de lipide (dacă a fost măsurat) și recuperările substanței testate.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Rezultatele:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      mortalitatea viermilor martor și a viermilor din fiecare vas de testare și orice comportament anormal observat (de exemplu, evitarea solului, lipsa reproducerii într-un test de bioacumulare cu enchitreide);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      raportul greutate uscată/greutate umedă al solului și al organismelor testate (util pentru normalizare);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      greutățile umede ale viermilor la fiecare prelevare de probe; pentru râme, greutățile umede la începutul și la sfârșitul testului și la fiecare prelevare de probe înainte și după purjarea intestinelor;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      conținutul de lipide al organismelor testate (dacă a fost determinat);
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      curbe care indică cinetica de absorbție și de eliminare ale substanței chimice testate în viermi și timpul până la starea de echilibru;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      Ca și Cs (împreună cu abaterea standard și intervalul, dacă este cazul) pentru toate momentele de prelevare a probelor (Ca exprimată în g kg–1 greutate umedă și uscată a întregului organism, Cs exprimată în g kg–1 greutate umedă și uscată a solului). Dacă se cere un factor de acumulare biotă-sol (BSAF) (de exemplu, pentru compararea rezultatelor obținute din două sau mai multe teste efectuate cu animale cu conținut diferit de lipide), Ca poate fi exprimată suplimentar ca g kg–1 conținut de lipide din organism, iar Cs poate fi exprimată ca g kg–1 carbon organic (CO) din sol;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      BAF (exprimat în kg sol·kg–1 vierme), constanta vitezei de absorbție ks (exprimată în g sol kg–1 de vierme zi–1) și constanta vitezei de eliminare ke (exprimată în zile–1); BSAF (exprimat în kg sol CO kg–1 conținut de lipide vierme) pot fi raportate suplimentar;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      dacă se măsoară: procentajele substanței chimice testate de origine, ale metaboliților și reziduurilor legate (adică procentul de substanță chimică testată care nu poate fi extras prin metode de extracție obișnuite) detectate în sol și în animalele testate;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      metodele utilizate pentru analizele statistice ale datelor.
                                                   
                                                
                                    
                                           
                                       
                                       
                                          
                                             Evaluarea rezultatelor:
                                          
                                          
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      concordanța rezultatelor cu criteriile de validitate, astfel cum sunt enumerate la punctul 17;
                                                   
                                                
                                                      —
                                                   
                                                   
                                                      rezultatele neprevăzute sau neobișnuite, de exemplu, eliminarea incompletă a substanței chimice testate din animalele testate.
                                                   
                                                
                                    
                        
                     BIBLIOGRAFIE:
                  
                  
                              (1)
                           
                           
                              Amorim M (2000), Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.
                           
                        
                              (2)
                           
                           
                              ASTM (2000), Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, American Society for Testing and Materials, E 1688-00a.
                           
                        
                              (3)
                           
                           
                              ASTM International (2004), Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus, ASTM International, E1676-04: 26 pp.
                           
                        
                              (4)
                           
                           
                              Beek B., Boehling S., Bruckmann U., Franke C., Joehncke U., Studinger G. (2000), The assessment of bioaccumulation. În Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation – New Aspects and Developments, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg: 235-276.
                           
                        
                              (5)
                           
                           
                              Belfroid A., Sikkenk M., Seinen W., Van Gestel C., Hermens J. (1994), The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil, Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.
                           
                        
                              (6)
                           
                           
                              Belfroid A., Van Wezel A., Sikkenk M., Van Gestel C., Seinen W. și Hermens J. (1993), The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water, Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165.
                           
                        
                              (7)
                           
                           
                              Belfroid A., Meiling J., Drenth H., Hermens J., Seinen W., Van Gestel C. (1995), Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei), Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.
                           
                        
                              (8)
                           
                           
                              Bell A.W. (1958), The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus, Ann. WHX Novitat., 1902: 1-13.
                           
                        
                              (9)
                           
                           
                              Bligh E.G. și Dyer W.J. (1959), A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.
                           
                        
                              (10)
                           
                           
                              Bouche M. (1972), Lombriciens de France. Ecologie et Systematique, INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.
                           
                        
                              (11)
                           
                           
                              Bruns E., Egeler Ph., Moser T., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. (2001a), Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Raport către Agenția federală germană de mediu (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.
                           
                        
                              (12)
                           
                           
                              Bruns E., Egeler Ph., Römbke J., Scheffczyk A., Spörlein P. (2001b), Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida), Hydrobiologia 463: 185-196.
                           
                        
                              (13)
                           
                           
                              Conder J.M. și Lanno R.P. (2003), Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida, J. Soils Sediments 3: 13-20.
                           
                        
                              (14)
                           
                           
                              Connell D.W. and Markwell R.D. (1990), Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System, Chemosphere 20: 91-100.
                           
                        
                              (15)
                           
                           
                              Didden W.A.M. (1993), Ecology of Terrestrial Enchytraeidae, Pedobiologia 37: 2-29.
                           
                        
                              (16)
                           
                           
                              Didden W. (2003), Oligochaeta, în: Bioindicators and biomonitors. Markert B.A., Breure A.M. și Zechmeister H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., Țările de Jos, pp. 555-576.
                           
                        
                              (17)
                           
                           
                              De Boer J., Smedes F., Wells D., Allan A. (1999), Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
                           
                        
                              (18)
                           
                           
                              Dietrich D.R., Schmid P., Zweifel U., Schlatter C., Jenni-Eiermann S., Bachmann H., Bühler U., Zbinden N. (1995), Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.
                           
                        
                              (19)
                           
                           
                              Regulamentul (CE) nr. 1907/2006 al Parlamentului European și al Consiliului din 18 decembrie 2006 privind înregistrarea, evaluarea, autorizarea și restricționarea substanțelor chimice (REACH), de înființare a Agenției Europene pentru Produse Chimice, de modificare a Directivei 1999/45/CE și de abrogare a Regulamentului (CEE) nr. 793/93 al Consiliului și a Regulamentului (CE) nr. 1488/94 al Comisiei, precum și a Directivei 76/769/CEE a Consiliului și a Directivelor 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE și 2000/21/CE ale Comisiei (JO L 396, 30.12.2006, p. 1).
                           
                        
                              (20)
                           
                           
                              Edwards C.A. and Bohlen P.J. (1996), Biology and ecology of earthworms, third edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.
                           
                        
                              (21)
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              (22)
                           
                           
                              Egeler Ph., Gilberg D., Scheffczyk A., Moser Th. and Römbke J. (2009), Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Poate fi descărcat de la: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
                           
                        
                              (23)
                           
                           
                              Elmegaard N. și Jagers op Akkerhuis G.A.J.M. (2000), Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations, National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp.
                           
                        
                              (24)
                           
                           
                              Environment Canada (1995), Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant, Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
                           
                        
                              (25)
                           
                           
                              EPPO (2003), Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
                           
                        
                              (26)
                           
                           
                              Franke C. (1996), How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment?, Chemosphere 32: 1897-1905.
                           
                        
                              (27)
                           
                           
                              Franke C., Studinger G., Berger G., Böhling S., Bruckmann U., Cohors-Fresenborg D., Jöhncke U. (1994), The assessment of bioaccumulation, Chemosphere 29: 1501-1514.
                           
                        
                              (28)
                           
                           
                              Füll C. (1996), Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp.
                           
                        
                              (29)
                           
                           
                              Füll C., Schulte C., Kula C. (2003), Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78-84.
                           
                        
                              (30)
                           
                           
                              Gabric A.J., Connell D.W., Bell P.R.F. (1990), A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes, Wat. Res. 24: 1225-1231.
                           
                        
                              (31)
                           
                           
                              Gardner W.S., Frez W.A., Cichocki E.A., Parrish C.C. (1985), Micromethods for lipids in aquatic invertebrates, Limnology and Oceanography 30: 1099-1105.
                           
                        
                              (32)
                           
                           
                              Hawker D.W. and Connell D.W. (1988), Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish, Wat. Res. 22: 701-707.
                           
                        
                              (33)
                           
                           
                              Hund-Rinke K. and Wiechering H. (2000), Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests, J. Soils Sediments 1: 15-20.
                           
                        
                              (34)
                           
                           
                              Hund-Rinke K., Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. În: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.
                           
                        
                              (35)
                           
                           
                              ISO 11268-2 (1998) Calitatea solului – Efectele poluanților asupra râmelor (Eisenia fetida). Partea 2: Determinarea efectelor asupra reproducerii.
                           
                        
                              (36)
                           
                           
                              Jaenike J. (1982), «Eisenia foetida» is two biological species, Megadrilogica 4: 6-8.
                           
                        
                              (37)
                           
                           
                              Jager T (1998), Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta), Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
                           
                        
                              (38)
                           
                           
                              Jager T., Sanchez P.A., Muijs B., van der Welde E., Posthuma L. (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil, Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.
                           
                        
                              (39)
                           
                           
                              Jager T., Baerselman R., Dijkman E., De Groot A.C., Hogendoorn E.A., DeJong A., Kruitbosch J.A.W., Peijnenburg W.J.G.M. (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775.
                           
                        
                              (40)
                           
                           
                              Jager T., Fleuren R.L.J., Hoogendoorn E., de Korte G. (2003b), Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta), Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.
                           
                        
                              (41)
                           
                           
                              Janssen M.P.M., Bruins A., De Vries T.H., Van Straalen N.M. (1991), Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
                           
                        
                              (42)
                           
                           
                              Kasprzak K. (1982), Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems, Pedobiologia 23: 217-232.
                           
                        
                              (43)
                           
                           
                              Khalil A.M. (1990), Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Disertație, Universitatea München, 137 pp.
                           
                        
                              (44)
                           
                           
                              Landrum P.F. (1989), Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.
                           
                        
                              (45)
                           
                           
                              Marinussen M.P.J.C., Van der Zee S.E.A.T.M., De Haan F.A. (1997), Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions, Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.
                           
                        
                              (46)
                           
                           
                              Mount D.R., Dawson T.D., Burkhard L.P. (1999), Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates, Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.
                           
                        
                              (47)
                           
                           
                              Nendza M. (1991), QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, în: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
                           
                        
                              (48)
                           
                           
                              Capitolul C.8 din prezenta anexă, «Toxicitatea la râme».
                           
                        
                              (49)
                           
                           
                              Capitolul C.13 din prezenta anexă, «Bioconcentrarea: Experiența cu reînnoire continuă asupra peștilor».
                           
                        
                              (50)
                           
                           
                              Capitolul C.21 din prezenta anexă, «Microorganismele din sol: Testul de transformare a azotului».
                           
                        
                              (51)
                           
                           
                              OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              (52)
                           
                           
                              OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              (53)
                           
                           
                              OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
                           
                        
                              (54)
                           
                           
                              Petersen H. and Luxton M. (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes, Oikos 39: 287-388.
                           
                        
                              (55)
                           
                           
                              Phillips D.J.H. (1993), Bioaccumulation. În: Handbook of Ecotoxicology, vol. 1, Calow P. (ed.), Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396.
                           
                        
                              (56)
                           
                           
                              Pflugmacher J. (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem, Ökotox. 4: 77-81.
                           
                        
                              (57)
                           
                           
                              Posthuma L., Weltje L., Anton-Sanchez F.A. (1996), Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida, RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
                           
                        
                              (58)
                           
                           
                              Randall R.C., Lee II H, Ozretich R.J., Lake J.L., Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.
                           
                        
                              (59)
                           
                           
                              Römbke J., Egele P, Füll C. (1998), Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium, UBA-Texte 28/98, 84 S.
                           
                        
                              (60)
                           
                           
                              Römbke J. and Moser Th. (1999), Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test, UBA-Texte 4/99: 373 pp.
                           
                        
                              (61)
                           
                           
                              Römbke J., Riepert F., Achazi R. (2000), Enchytraeen als Testorganismen, în: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden S., Erb, R., Dott W. & Eisentraeger A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
                           
                        
                              (62)
                           
                           
                              Romijn C.A.F.M., Luttik R., Van De Meent D., Slooff W., Canton J.H., (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
                           
                        
                              (63)
                           
                           
                              Sample B.E., Suter D.W., Beauchamp J.J., Efroymson R.A. (1999), Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation, Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
                           
                        
                              (64)
                           
                           
                              Schlosser H.-J. and Riepert F. (1992), Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung, Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
                           
                        
                              (65)
                           
                           
                              Schmelz R. and Collado R. (1999), Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida), Carolinea 57: 93-100.
                           
                        
                              (66)
                           
                           
                              Sims R.W. and Gerard B.M. (1985), Earthworms, în: Kermack, D.M. & Barnes, R.S.K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.
                           
                        
                              (67)
                           
                           
                              Sousa J.P., Loureiro S., Pieper S., Frost M., Kratz W., Nogueira A.J.A., Soares A.M.V.M. (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod, Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
                           
                        
                              (68)
                           
                           
                              Spacie A. and Hamelink J.L. (1982), Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish, Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.
                           
                        
                              (69)
                           
                           
                              Stephenson G.L., Kaushik A., Kaushik N.K., Solomon K.R., Steele T., Scroggins R.P. (1998), Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. În: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81.
                           
                        
                              (70)
                           
                           
                              Sterenborg I., Vork N.A., Verkade S.K., Van Gestel C.A.M., Van Straalen N.M. (2003), Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta, Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
                           
                        
                              (71)
                           
                           
                              UBA (Umweltbundesamt) (1991), Bioakkumulation – Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug, UBA-Texte 42/91, Berlin.
                           
                        
                              (72)
                           
                           
                              US EPA (2000), Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates, second edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, martie 2000.
                           
                        
                              (73)
                           
                           
                              Van Brummelen T.C. and Van Straalen N.M. (1996), Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285.
                           
                        
                              (74)
                           
                           
                              Van Gestel C.A.M. (1992), The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, in: Ecotoxicology of Earthworms (ed. Becker H., Edwards P.J., Greig-Smith P.W. și Heimbach F.), Intercept Press, Andover (GB).
                           
                        
                              (75)
                           
                           
                              Van Gestel C.A. și Ma W.-C. (1990), An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies, Chemosphere 21: 1023-1033.
                           
                        
                              (76)
                           
                           
                              Van Straalen N.M., Donker M.H., Vijver M.G., van Gestel C.A.M. (2005), Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates, Environmental Pollution 136: 409-417.
                           
                        
                              (77)
                           
                           
                              Venter J.M. and Reinecke A.J. (1988), The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta), South African J. Zool. 23: 161-165.
                           
                        
                              (78)
                           
                           
                              Vijver M.G., Vink J.P.M., Jager T., Wolterbeek H.T., van Straalen N.M., van Gestel C.A.M. (2005), Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil, Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
                           
                        
                              (79)
                           
                           
                              Widianarko B. and Van Straalen N.M. (1996), Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
                           
                        
                     Apendicele 1
                     DEFINIȚII
                     
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioacumulare: creșterea concentrației substanței chimice testate într-un sau pe un organism în raport cu concentrația acestei substanțe chimice în mediul ambiant. Bioacumularea rezultă atât din procesul de bioconcentrare, cât și din cel de bioamplificare (a se vedea mai jos).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioconcentrare: creșterea concentrației substanței chimice testate într-un sau pe un organism, care rezultă din absorbția substanței chimice exclusiv din mediul înconjurător (adică prin intermediul suprafeței corpului și al solului ingerat), în raport cu concentrația substanței chimice testate în mediul înconjurător.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Bioamplificare: creșterea concentrației substanței chimice testate într-un sau pe un organism, care rezultă în principal din acumularea alimentelor sau prăzii contaminate, în raport cu concentrația substanței chimice testate în hrană sau în pradă. Bioamplificarea poate duce la un transfer sau la o acumulare a substanței testate în rețelele trofice.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Eliminarea unei substanțe chimice testate: pierderea acestei substanțe din țesutul organismului testat, prin procese active sau pasive, care se produc independent de prezența substanței testate în mediul înconjurător.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Factorul de bioacumulare (BAF): la orice moment în timpul fazei de absorbție a acestui test, factorul de bioacumulare reprezintă concentrația substanței chimice testate în/pe organismul testat (Ca în g·kg-1 greutate uscată vierme) împărțită la concentrația substanței chimice în mediul înconjurător (Cs exprimată în g·kg-1 greutate uscată sol); unitatea de măsură pentru BAF este kg sol·kg-1 vierme.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Factorul de bioacumulare al stării de echilibru (BAFss): BAF la starea de echilibru și nu se modifică în mod semnificativ în cursul unui interval lung de timp, concentrația substanței chimice testate în mediul înconjurător (Cs exprimată în g·kg-1 greutate uscată sol) fiind constantă în acest interval de timp.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Factorii de bioacumulare calculați direct din raportul dintre constanta vitezei de absorbție și constanta vitezei de eliminare (ks și ke, a se vedea mai jos) poartă denumirea de factor de bioacumulare cinetic (BAFK).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Factorul de acumulare biotă-sol (BSAF): concentrația normalizată de lipide a substanței chimice testate în/pe organismul testat împărțită la concentrația normalizată de carbon organic a substanței chimice testate în sol la starea de echilibru. Astfel, Ca se exprimă în g·kg-1 conținut de lipide al organismului, iar Cs în g·kg-1 conținut organic al solului; unitatea de măsură pentru BSAF este kg CO·kg-1 lipide.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Platou sau stare de echilibru: echilibrul între procesele de absorbție și de eliminare care apar simultan în timpul fazei de expunere. Starea de echilibru este atinsă în graficul BAF în funcție de timp atunci când curba devine paralelă la axa timpului, iar trei analize succesive ale BAF – realizate asupra unor probe prelevate la intervale de cel puțin două zile – se mențin într-o plajă de 20 % una față de alta și nu există diferențe semnificative între cele trei perioade de prelevare a probelor. Pentru substanțele chimice testate care se absorb lent, intervalele cele mai adecvate ar fi de șapte zile (49).
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Coeficientul de partiție carbon organic-apă (Koc): raportul dintre o substanță chimică în/pe fracția de carbon organic a unui sol și concentrația substanței chimice în apă la echilibru.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Coeficientul de partiție octanol-apă (Kow): raportul dintre solubilitatea unei substanțe chimice în n-octanol și în apă la echilibru, exprimată uneori și ca Pow. Logaritmul lui Kow (log Kow) este utilizat ca indicator al potențialului de bioacumulare al unei substanțe chimice în organismele acvatice.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faza de absorbție sau de expunere: timpul în care organismele testate sunt expuse la substanța chimică testată.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Constanta vitezei de absorbție a solului (ks): reprezintă valoarea numerică care definește viteza de creștere a concentrației substanței testate în/pe organismul testat care rezultă din absorbția fazei solului. ks se exprimă în g sol kg-1 vierme z-1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Faza de eliminare: timpul, după transferul organismelor dintr-un mediu contaminat într-un mediu în care nu se află substanța testată, în care se studiază eliminarea (sau pierderea netă) a substanței chimice din organismele testate.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Constanta vitezei de eliminare (ke): valoarea numerică care definește viteza de scădere a concentrației substanței testate în/pe organismul testat, după transferul organismelor testate dintr-un mediu care conține substanța testată într-un mediu fără substanță chimică; ke se exprimă în z-1.
                              
                           
                                  
                              
                              
                                 
                                    Substanța chimică testată: orice substanță sau amestec care se testează utilizându-se această metodă de testare.
                              
                           
                  
                     Apendicele 2
                     
                        Calculul parametrilor de absorbție și de eliminare
                     
                     Principalul indicator al unui test de bioacumulare este factorul de bioacumulare, BAF. BAF măsurat poate fi calculat prin împărțirea concentrației din organismul testat (Ca) la concentrația din sol (Cs) în starea de echilibru. Dacă starea de echilibru nu este atinsă în timpul fazei de absorbție, BAFK se calculează din constantele de viteză în loc de BAFss. Totuși, ar trebui să se indice dacă BAF se bazează pe concentrațiile la starea de echilibru sau nu.
                     Modalitatea obișnuită pentru obținerea factorului de bioacumulare cinetic (BAFK), a constantei vitezei de absorbție a solului (ks) și a constantei vitezei de eliminare (ke) este utilizarea metodelor informatice neliniare de estimare a parametrilor, de exemplu, pe baza modelelor descrise în (68). Fiind dat un set de date secvențiale concentrație timp și ecuațiile de modelare:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [ecuația 1]
                              
                           sau
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [ecuația 2]
                              
                           unde:
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentrația substanței chimice în viermi [g kg-1 greutate umedă sau uscată]
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 constanta vitezei de absorbție în țesut [g sol kg-1 vierme z-1]
                              
                           
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentrația substanței chimice în sol [g kg-1 greutate umedă sau uscată]
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 constanta vitezei de eliminare [z-1]
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 timpul la finalul fazei de absorbție,
                              
                           aceste programe informatice calculează valorile pentru BAFK, ks și ke.
                     Când concentrația de bază în viermii neexpuși, de exemplu în ziua 0, diferă în mod semnificativ de zero (acesta poate fi, de exemplu, cazul metalelor), această concentrație de bază (Ca,0) ar trebui inclusă în aceste ecuații, care devin:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [ecuația 5]
                              
                           și
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [ecuația 4]
                              
                           În cazurile în care se observă o scădere semnificativă în timp a concentrației substanței chimice testate în sol, în cursul fazei de absorbție, pot fi utilizate următoarele modele, de exemplu (67) (79):
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [ecuația 5]
                              
                           unde:
                     
                                 Cs
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentrația substanței chimice în sol [g kg-1 greutate umedă sau uscată]
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 constanta vitezei de degradare în sol [z-1]
                              
                           
                                 C0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentrația inițială a substanței chimice în sol [g kg-1 greutate umedă sau uscată]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [ecuația 6]
                              
                           
                                 
                                    
                              
                              
                                 t > tc
                                 
                              
                              
                                 [ecuația 7]
                              
                           unde:
                     
                                 Ca
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 concentrația substanței chimice în viermi [g kg-1 greutate umedă sau uscată]
                              
                           
                                 ks
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 constanta vitezei de absorbție în țesut [g sol kg-1 vierme z-1]
                              
                           
                                 k0
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 constanta vitezei de degradare în sol [z-1]
                              
                           
                                 ke
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 constanta vitezei de eliminare [z-1]
                              
                           
                                 tc
                                 
                              
                              
                                 =
                              
                              
                                 timpul la finalul fazei de absorbție.
                              
                           Când se atinge starea de echilibru în timpul fazei de absorbție (adică t = ∞), ecuația 1
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 0 < t < tc
                                 
                              
                              
                                 [ecuația 1]
                              
                           poate fi redusă la:
                     
                        
                     sau
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [ecuația 8]
                              
                           Atunci, ks/ke × Cs reprezintă o aproximare a concentrației substanței testate în țesutul viermelui la starea de echilibru (Ca,se).
                     Factorul de acumulare biotă-sol (BSAF) poate fi calculat astfel:
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [ecuația 9]
                              
                           unde foc este fracția de carbon organic din sol, iar flip este fracția de lipide din vierme, ambele fiind determinate, de preferință, din probele prelevate din test, și bazate fie pe greutatea uscată, fie pe greutatea umedă.
                     Cinetica eliminării poate fi modelată folosind datele obținute din faza de eliminare și aplicând următoarea ecuație de modelare și o metodă informatică neliniară de estimare a parametrilor. Dacă punctele aferente datelor reprezentate grafic în funcție de timp indică o scădere exponențială constantă a concentrației substanței testate în animale, poate fi utilizat un model cu un compartiment (ecuația 9) pentru a descrie evoluția temporală a eliminării.
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [ecuația 10]
                              
                           Uneori, procesele de eliminare par a se derula în două etape, indicând o scădere rapidă a Ca în timpul etapelor de început, care se modifică la o pierdere ușoară a substanțelor testate în etapele finale ale eliminării, de exemplu (27) (68). Cele două etape pot fi interpretate plecând de la ipoteza că în organism există două compartimente diferite din care substanța testată se elimină cu viteze diferite. În aceste cazuri, ar trebui studiată literatura de specialitate relevantă, de exemplu (38) (39) (40) (78).
                     Folosind ecuațiile de modelare de mai sus, parametrii cinetici (ks și ke) pot fi calculați și într-o singură etapă, aplicând modelul cineticii de ordinul întâi, simultan, tuturor datelor obținute din faza de absorbție și din cea de eliminare. Pentru o descriere a unei metode care ar putea permite un astfel de calcul combinat al constantelor vitezei de absorbție și de eliminare, pot fi consultate referințele bibliografice (41), (73) și (70).
                     
                                 
                                    
                              
                              
                                 [ecuația 11]
                              
                           
                                 
                                    Notă:
                                 
                              
                              
                                 Când parametrii de absorbție și de eliminare sunt estimați simultan din datele combinate de absorbție și de eliminare, «m» prezentat în ecuația 11 este un descriptor care permite programului informatic să atribuie subtermenii ecuației setului de date al fazei respective și să realizeze o evaluare corectă (m = 1 pentru faza de absorbție; m = 2 pentru faza de eliminare).
                              
                           Cu toate acestea, aceste ecuații de modelare ar trebui utilizate cu prudență, mai ales atunci când în timpul testului apar modificări ale biodisponibilității substanței chimice testate sau ale (bio)degradării [a se vedea, de exemplu, (79)].
                  
                  
                     Apendicele 3
                     EXEMPLE DE GRAFICE PENTRU TESTE DE BIOACUMULARE ÎN SOL
                     
                        Test pe râme
                     
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 Faza de absorbție, cu 8 date de prelevare a probelor utilizate pentru calculul parametrilor cinetici
                                 
                                             Ziua
                                          
                                          
                                             Activitate
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Condiționarea solului preparat timp de 48 h
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Îmbogățirea fracțiunii de sol cu soluția de substanță chimică testată; evaporarea oricărui solvent; amestecarea constituenților solului; repartizarea solului în vasele de testare; echilibrarea condițiilor de testare timp de 4 zile (3 săptămâni pentru solul îmbogățit cu metale)
                                          
                                       
                                             – 3 până la – 1
                                          
                                          
                                             Separarea organismelor testate din cultură pentru aclimatizare; prepararea și umezirea constituenților solului
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Măsurarea temperaturii și a pH-ului solului; prelevarea de probe din vasele tratate și a martorilor tratați cu solvent pentru determinarea concentrației substanței chimice testate; adăugarea rației alimentare; cântărirea și distribuirea aleatorie a viermilor în vasele de testare; păstrarea unui număr suficient de subprobe de viermi pentru determinarea valorilor analitice de bază, a greutății umede și uscate și a conținutului de lipide; cântărirea tuturor vaselor de testare pentru verificarea umidității solului; verificarea alimentării cu aer în cazul în care se utilizează un sistem închis
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Verificarea alimentării cu aer, înregistrarea comportamentului viermilor și a temperaturii; prelevarea de probe de sol și viermi pentru determinarea concentrației substanței testate
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Verificarea alimentării cu aer, a comportamentului viermilor și a temperaturii
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             5-6
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; adăugarea rației alimentare; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare și compensarea apei evaporate
                                          
                                       
                                             8-9
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             11-13
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; adăugarea rației alimentare; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare și compensarea apei evaporate
                                          
                                       
                                             15-16
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             18-20
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; măsurarea temperaturii și a pH-ului solului; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare; finalizarea fazei de absorbție; transferul viermilor din vasele duplicat expuse rămase în vasele care conțin sol curat pentru faza de eliminare (fără purjarea intestinelor); prelevarea de probe de sol și viermi din martorii tratați cu solvent
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Activitățile de preexpunere (faza de echilibrare) ar trebui programate ținând cont de proprietățile substanței chimice testate.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Activitățile descrise pentru ziua 3 ar trebuie realizate zilnic (cel puțin în zilele lucrătoare).
                                          
                                       
                           
                                 (b)
                              
                              
                                 Faza de eliminare
                                 
                                             Ziua
                                          
                                          
                                             Activitate
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Prepararea și umezirea constituenților solului; condiționarea solului preparat timp de 48 h
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Amestecarea constituenților solului; repartizarea solului în vasele de testare; incubarea în condiții experimentale timp de 4 zile
                                          
                                       
                                             0 (finalizarea fazei de absorbție)
                                          
                                          
                                             Măsurarea temperaturii și a pH-ului solului; cântărirea și distribuirea aleatorie a viermilor în vasele de testare; adăugarea rației alimentare; transferul viermilor din vasele duplicat expuse rămase în vasele care conțin sol curat; prelevarea de probe de sol și viermi după 4-6 h pentru determinarea concentrației substanței chimice testate
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Verificarea alimentării cu aer, înregistrarea comportamentului viermilor și a temperaturii; prelevarea de probe de sol și viermi pentru determinarea concentrației substanței chimice testate
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Verificarea alimentării cu aer, a comportamentului viermilor și a temperaturii
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             5-6
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; adăugarea rației alimentare; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare și compensarea apei evaporate
                                          
                                       
                                             8-9
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             11-13
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; adăugarea rației alimentare; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare și compensarea apei evaporate
                                          
                                       
                                             15-16
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             17
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             18-20
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             21
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; măsurarea temperaturii și a pH-ului solului; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare; prelevarea de probe de sol și viermi din martorii tratați cu solvent
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Prepararea solului înainte de începerea fazei de eliminare ar trebui realizată în același mod ca înainte de faza de absorbție.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Activitățile descrise pentru ziua 3 ar trebuie realizate zilnic (cel puțin în zilele lucrătoare).
                                          
                                       
                           
                        Test pe enchitreide
                     
                     
                                 (a)
                              
                              
                                 Faza de absorbție, cu 8 date de prelevare a probelor utilizate pentru calculul parametrilor cinetici
                                 
                                             Ziua
                                          
                                          
                                             Activitate
                                          
                                       
                                             – 6
                                          
                                          
                                             Condiționarea solului preparat timp de 48 h
                                          
                                       
                                             – 4
                                          
                                          
                                             Îmbogățirea fracțiunii de sol cu soluția de substanță chimică testată; evaporarea oricărui solvent; amestecarea constituenților solului; repartizarea solului în vasele de testare; echilibrarea condițiilor de testare timp de 4 zile (3 săptămâni pentru solul îmbogățit cu metale)
                                          
                                       
                                             – 3 până la –1
                                          
                                          
                                             Separarea organismelor testate din cultură pentru aclimatizare; prepararea și umezirea constituenților solului
                                          
                                       
                                             0
                                          
                                          
                                             Măsurarea temperaturii și a pH-ului solului; prelevarea de probe din vasele tratate și a martorilor tratați cu solvent pentru determinarea concentrației substanței chimice testate; adăugarea rației alimentare în sol; cântărirea și distribuirea aleatorie a viermilor în vasele de testare; păstrarea unui număr suficient de subprobe de viermi pentru determinarea valorilor analitice de bază, a greutății umede și uscate și a conținutului de lipide; cântărirea tuturor vaselor de testare pentru verificarea umidității solului; verificarea alimentării cu aer în cazul în care se utilizează un sistem închis
                                          
                                       
                                             1
                                          
                                          
                                             Verificarea alimentării cu aer, înregistrarea comportamentului viermilor și a temperaturii; prelevarea de probe de sol și viermi pentru determinarea concentrației substanței testate
                                          
                                       
                                             2
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             3
                                          
                                          
                                             Verificarea alimentării cu aer, a comportamentului viermilor și a temperaturii
                                          
                                       
                                             4
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             5-6
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             7
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; adăugarea rației alimentare în sol; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare și compensarea apei evaporate
                                          
                                       
                                             9
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             10
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             11
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1
                                          
                                       
                                             12-13
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 3
                                          
                                       
                                             14
                                          
                                          
                                             La fel ca în ziua 1; adăugarea rației alimentare în sol; măsurarea temperaturii și a pH-ului solului; verificarea umidității solului prin recântărirea vaselor de testare; finalizarea fazei de absorbție; transferul viermilor din vasele duplicat expuse rămase în vasele care conțin sol curat pentru faza de eliminare (fără purjarea intestinelor); prelevarea de probe de sol și viermi din martorii tratați cu solvent
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Activitățile de preexpunere (faza de echilibrare) ar trebui programate ținând cont de proprietățile substanței chimice testate.
                                          
                                       
                                              
                                          
                                          
                                             Activitățile descrise pentru ziua 3 ar trebuie realizate zilnic (cel puțin în zilele lucrătoare).
                                          
                                       
                           
                  
                     Apendicele 4
                     
                        Solul artificial – recomandări pentru preparare și păstrare
                     
                     Deoarece este posibil ca solurile naturale care provin dintr-o sursă specifică să nu fie disponibile tot timpul anului, iar organismele indigene, precum și prezența micropoluanților pot influența testul, se recomandă utilizarea în cadrul acestui test a unui substrat artificial, solul artificial conform capitolului C.8 din prezenta anexă, «Toxicitatea la râme» (48). Mai multe specii testate pot supraviețui, crește și se pot reproduce în acest sol și sunt furnizate standardizarea maximă, precum și comparabilitatea intra- și interlaboratoare a condițiilor de testare și a cultivare.
                     Constituenții solului
                     
                                 Turbă:
                              
                              
                                 10 %
                              
                              
                                 Mușchi de turbă, în conformitate cu Orientarea 207 a OCDE (48)
                              
                           
                                 Nisip de cuarț:
                              
                              
                                 70 %
                              
                              
                                 Nisip de cuarț industrial (uscat cu aer); dimensiune granule: mai mult de 50 % dintre particule ar trebui să se afle în intervalul 50-200 μm, însă toate particulele ar trebui să fie ≤ 2 mm
                              
                           
                                 Argilă caolinică:
                              
                              
                                 20 %
                              
                              
                                 Conținut de caolinit ≥ 30 %
                              
                           
                                 Carbonat de calciu:
                              
                              
                                 ≤ 1 %
                              
                              
                                 CaCO3, pulbere, chimic pur
                              
                           Ca alternativă, conținutul de carbon organic din solul artificial poate fi redus, de exemplu prin scăderea conținutului de turbă la 4-5 % din solul uscat și creșterea corespunzătoare a conținutului de nisip. Prin această reducere a conținutului de carbon organic, este posibil să scadă posibilitățile de absorbție ale substanței chimice testate în sol (carbon organic) și să crească disponibilitatea substanței chimice testate pentru viermi (74). S-a demonstrat că Enchytraeus albidus și Eisenia fetida pot satisface criteriile privind reproducerea când sunt testate pe soluri naturale cu conținut scăzut de carbon organic, de exemplu 2,7 % (33) (61), și s-a constatat experimental că aceasta se poate obține și în soluri artificiale cu 5 % turbă.
                     
                        Preparare
                     
                     Se amestecă bine constituenții uscați ai solului (de exemplu, într-un amestecător de laborator mare). Această operațiune trebuie realizată cu o săptămână înainte de inițierea testului. Constituenții solului uscați amestecați ar trebui umeziți cu apă deionizată timp de cel puțin 48 h înainte de aplicarea substanței testate pentru a se echilibra/stabiliza aciditatea. Pentru determinarea pH-ului, se utilizează un amestec de sol și soluție 1 M KCl într-un raport de 1:5. Dacă valoarea pH-ului nu este în intervalul cerut (6,0 ± 0,5), solului i se adaugă o cantitate suficientă de CaCO3 sau se prepară un nou lot de sol.
                     Capacitatea maximă de reținere a apei (CRA) a solului artificial se determină în conformitate cu ISO 11268-2 (35). Cu cel puțin două zile înainte de inițierea testului, solul artificial uscat este umezit adăugându-se suficientă apă deionizată sau apă reconstituită pentru a se obține aproximativ jumătate din conținutul final de apă. Conținutul final de apă ar trebui să fie de 40 % până la 60 % din CRA. La inițierea testului, solul preumezit este împărțit într-un număr de loturi egal cu numărul concentrațiilor substanței chimice testate și al martorilor utilizați pentru test, iar conținutul de umiditate se ajustează la 40-60 % din CRAmax utilizând soluția de substanță testată și/sau adăugând apă deionizată sau reconstituită. Conținutul de umiditate se determină la începutul și la sfârșitul testului (la 105 °C). Acesta ar trebui să fie optim pentru satisfacerea cerințelor speciilor (conținutul de umiditate poate fi verificat, de asemenea, după cum urmează: atunci când solul este strâns ușor în mână, ar trebui să apară picături mici de apă între degete).
                     
                        Păstrare
                     
                     Constituenții uscați ai solului artificial pot fi păstrați la temperatura camerei până la utilizare. Solul preparat și preumezit poate fi păstrat într-un loc răcoros timp de până la trei zile anterior îmbogățirii; trebuie redus riscul de evaporare a apei. Solul îmbogățit cu substanța testată ar trebui utilizat imediat, exceptând cazul în care există informații care indică faptul că acel sol poate fi păstrat fără a fi afectate toxicitatea și biodisponibilitatea substanței testate. Probele de sol îmbogățit pot fi păstrate până la analiză în condițiile recomandate pentru tipul respectiv de substanță testată.
                  
                  
                     Apendicele 5
                     
                        Specii de oligochete terestre recomandate pentru testarea bioacumulării din sol
                     
                     
                        Râme
                     
                     Specia recomandată pentru test este Eisenia fetida (Savigny, 1826), care aparține familiei Lumbricidae. Din 1972 aceasta este împărțită în două subspecii [Eisenia fetida și Eisenia andrei (10)]. Conform Jaenike (36), acestea sunt specii autentice și separate. Eisenia fetida este ușor de recunoscut prin dungile sale galbene de culoare deschisă poziționate intersegmentar, în timp ce Eisenia andrei are o culoare uniformă, roșu închis. Fiind probabil originare din regiunea Mării Negre, în prezent acestea sunt prezente în întreaga lume, mai ales în habitatele modificate de activitatea antropică, cum sunt grămezile de compost. Ambele pot fi utilizate pentru teste ecotoxicologice, precum și pentru teste de bioacumulare.
                     
                        Eisenia fetida și Eisenia andrei sunt disponibile în comerț, de exemplu ca momeală pentru pești. Comparativ cu celelalte râme lumbricide, acestea au un ciclu de viață scurt, ajungând la maturitate în aproximativ 2-3 luni (la temperatura camerei). Temperatura optimă pentru acestea este de aproximativ 20-24 °C. Ele preferă substraturi relativ umede, cu un pH aproape neutru și un conținut ridicat de material organic. Întrucât, în ultimii 25 de ani, aceste specii au fost utilizate pe scară largă în teste ecotoxicologice standardizate, creșterea lor este bine stabilită (48) (77).
                     Ambele specii pot fi înmulțite într-o gamă largă de deșeuri animale. Mediul de înmulțire recomandat de ISO (35) este un amestec de bălegar de cal sau bovine și turbă în raport de 50:50. Mediul ar trebui să aibă o valoare a pH-ului de 6-7 (ajustată cu carbonat de calciu), o conductivitate ionică scăzută (mai puțin de 6 mS/cm sau o concentrație de sare mai mică de 0,5 %) și ar trebui să nu fie contaminat excesiv cu amoniac sau urină de origine animală. De asemenea, poate fi utilizat un sol de grădină disponibil în comerț, fără aditivi, sau un sol artificial în conformitate cu OCDE (48) sau un amestec 50:50 din ambele. Substratul trebuie să fie umed, dar nu prea ud. Sunt adecvate cutii de înmulțire cu un volum de 10 litri până la 50 de litri.
                     Pentru a se obține viermi cu o vârstă și greutate standard, cel mai bine este să se înceapă cu creșterea de coconi. Astfel, sunt adăugați viermi adulți în cutia de înmulțire, care conține un substrat proaspăt, pentru a produce coconi. Experiența practică a demonstrat că o densitate a populației de aproximativ 100 de viermi adulți pe kg de substrat (greutate umedă) conduce la rate de producție bune. După 28 de zile, viermii adulți sunt scoși. Râmele care au ieșit din coconi sunt folosite pentru testare când ajung la maturitate, după cel puțin 2 luni, dar fără să depășească 12 luni.
                     Viermii din speciile descrise mai sus pot fi considerați sănătoși dacă se mișcă prin substrat, nu încearcă să părăsească substratul și se reproduc continuu. O extremitate posterioară care se mișcă foarte lent sau este galbenă (în cazul Eisenia fetida) indică epuizarea substratului. În acest caz, se recomandă substrat proaspăt și/sau un număr mai mic de animale pe cutie.
                     
                        Referințe bibliografice selecționate suplimentare
                     
                     Gerard B.M. (1964), Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae, Linnean Soc., London, 6: 1-58.
                     Graff O. (1953), Die Regenwürmer Deutschlands, Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
                     Römbke J., Egeler P., Füll C. (1997), Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
                     Rundgren S. (1977), Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden, Oikos 28: 49-55.
                     Satchell J.E. (1955), Some aspects of earthworm ecology, Soil Zoology (Kevan): 180-201.
                     Sims R.W. and Gerard B.M. (1985), A synopsis of the earthworms, Linnean Soc., London, 31: 1-171.
                     Tomlin A.D. (1984), The earthworm bait market in North America. În: Earthworm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell J.E. (ed.), Chapman și Hall, London, pp. 331-338.
                     
                        Enchitreide
                     
                     Specia recomandată pentru test este Enchytraeus albidus, Henle 1837 (viermele alb). Enchytraeus albidus este una dintre cele mai mari specii (până la 15 mm) din familia oligochetelor anelide Enchytraeidae și este prezentă în întreaga lume, de exemplu (8). Enchytraeus albidus se găsește în habitate marine, limnice și tericole, în special în materie organică aflată în descompunere (iarbă de mare, compost) și rareori în fânețe (42). Această toleranță ecologică mare și unele variații morfologice indică faptul că ar putea exista rase diferite ale acestei specii.
                     
                        Enchytraeus albidus este disponibil în comerț, fiind vândut ca hrană pentru pești. Ar trebui verificat dacă cultura este contaminată cu alte specii, în general mai mici (60). În cazul în care apare contaminarea, toți viermii ar trebui spălați cu apă într-o cutie Petri. Specimenele adulte mari de Enchytraeus albidus sunt apoi selecționate (utilizând un stereomicroscop) pentru a iniția o nouă cultură. Toți ceilalți viermi sunt eliminați. Ciclul de viață al acestui vierme este scurt întrucât maturitatea este atinsă între 33 de zile (la 18 °C) și 74 de zile (la 12 °C). Numai culturile care au fost ținute în laborator timp de cel puțin 5 săptămâni (o generație) fără probleme ar trebui folosite pentru teste.
                     Sunt adecvate și alte genuri din specia Enchytraeus, mai ales Enchytraeus luxuriosus. Această specie este un adevărat locuitor al solului, care a fost descrisă de curând în (65). Dacă sunt folosite alte specii de Enchytraeus, acestea ar trebui să fie clar identificate și ar trebui raportată justificarea pentru selectarea speciei.
                     
                        Enchytraeus crypticus (Westheide și Graefe, 1992) este o specie care aparține aceluiași grup ca și Enchytraeus luxuriosus. Nu s-a determinat cu certitudine existența acesteia în natură, specia fiind descrisă numai în culturile de râme și în grămezile de compost (Römbke 2003). Prin urmare, cerințele ecologice inițiale ale acesteia nu sunt cunoscute. Totuși, studii de laborator recente cu diferite soluri naturale au confirmat că această specie prezintă o toleranță ridicată la proprietățile solului, cum este pH-ul și textura (Jänsch et al. 2005). În ultimii ani, această specie a fost deseori folosită în studii ecotoxicologice datorită ușurinței înmulțirii și testării, de exemplu Kuperman et al. 2003. Totuși, această specie este mică [3-12 mm; în medie 7 mm (Westheide și Müller, 1996)], iar acest fapt face ca manipularea sa să fie mult mai dificilă comparativ cu Enchytraeus albidus. Când se folosește această specie în locul Enchytraeus albidus, dimensiunea vasului de testare poate fi mai mică, dar aceasta nu este o necesitate. În plus, ar trebui avut în vedere faptul că această specie se reproduce foarte rapid, timpul său de generare fiind mai mic de 20 de zile la 20 ± 2 °C (Achazi et al., 1999) și chiar mai rapid la temperaturi mai ridicate.
                     Enchitreidele din specia Enchytraeus albidus (precum și alte specii de Enchytraeus) pot fi înmulțite în cutii mari de plastic (de exemplu, 30 × 60 × 10 cm sau 20 × 12 × 8 cm, care este adecvată pentru creșterea viermilor de dimensiuni mici) umplute cu un amestec de sol artificial și de sol de grădină necontaminat, fără aditivi, disponibil în comerț. Trebuie evitată utilizarea compostului deoarece acesta poate conține substanțe chimice toxice, cum ar fi metale grele. Înainte de utilizare ar trebui eliminată fauna din solul pentru înmulțire prin trei congelări. De asemenea, poate fi utilizat și sol artificial, însă rata de reproducere ar putea fi mai lentă comparativ cu cea obținută în substraturile mixte. Substratul ar trebui să aibă un pH de 6,0 ± 0,5. Cultura se ține într-un incubator la temperatura de 15 ± 2 °C fără lumină. În orice caz, ar trebui evitată o temperatură mai mare de 23 °C. Solul artificial/natural ar trebui să fie umed, însă nu ud. Când solul este apăsat ușor cu mâna, ar trebui să apară numai mici picături de apă. În orice caz, ar trebui evitate condițiile anoxice (de exemplu, dacă se utilizează un capac, numărul de găuri din capac ar trebui să fie suficient de mare pentru a asigura într-o măsură suficientă schimbul de aer). Solul pentru înmulțire ar trebui să fie aerat, prin amestecare atentă, o dată pe săptămână.
                     Viermii ar trebui să fie hrăniți cel puțin o dată pe săptămână ad libitum cu fulgi de ovăz care sunt puși într-o cavitate în suprafața solului și acoperiți cu sol. Dacă în recipient rămâne hrană de la ultima dată de alimentare, cantitatea de hrană administrată ar trebui ajustată corespunzător. Dacă pe hrana rămasă se dezvoltă ciuperci, aceasta ar trebui înlocuită cu o nouă cantitate de fulgi de ovăz. Pentru a stimula reproducerea, fulgii de ovăz pot fi suplimentați, o dată la două săptămâni, cu pudră proteică disponibilă în comerț, îmbogățită cu vitamine. După trei luni, animalele sunt transferate într-un substrat de înmulțire sau de cultură proaspăt preparat. Fulgii de ovăz, care au fost ținuți în vase închise ermetic, ar trebui autoclavați sau încălziți înainte de utilizare pentru a preveni infecțiile cu acarieni de făină (de exemplu, Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) sau cu acarieni prădatori [e.g. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina]. După dezinfectare, hrana se macină astfel încât să poată fi presărată cu ușurință pe suprafața solului. O altă sursă de hrană posibilă este drojdia pentru panificație sau hrana pentru pești TetraMin®.
                     În general, condițiile de creștere sunt suficiente dacă viermii nu încearcă să părăsească substratul, se mișcă rapid prin sol, prezintă o suprafață exterioară lucioasă, fără particule de sol agățate de ea, sunt colorați mai mult sau mai puțin albicios și dacă viermii cu vârste diferite sunt vizibili. În fapt, se poate considera că viermii sunt sănătoși dacă se reproduc continuu.
                     
                        Referințe bibliografice selecționate suplimentare
                     
                     Achazi R.K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999), The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
                     Jänsch S., Amorim M.J.B., Römbke J. (2005), Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species, Environ. Reviews 13: 51-83.
                     Kuperman R.G., Checkai R.T., Simini M., Phillips C.T., Kolakowski J.E., Kurnas C.W., Sunahara G.I. (2003), Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX, Pedobiologia 47: 651-656.
                     Römbke J. (2003), Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review, Pedobiologia 47: 607-616.
                     Westheide W. and Graefe U. (1992), Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida), J. Nat. Hist. 26: 479 – 488.
                     Westheide W. and Müller M.C. (1996), Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology, Hydrobiologia 334: 263-267.
                  ”
            
         (1)  Această informație este prezentată doar pentru beneficiul utilizărilor. Se pot folosi alte programe informatice dacă se poate demonstra că generează aceleași rezultate.
      
         (2)  Dacă nu sunt disponibile informații privind receptivitatea în funcție de sex, se vor folosi șobolani de ambele sexe, adică 1 animal/sex per concentrație. Pe baza informațiilor existente sau dacă în cursul acestei sesiuni de expunere reiese că un sex este mai receptiv, se vor folosi 10 animale din sexul receptiv (2 animale per punct de concentrație/timp) la fiecare nivel de concentrație în timpul testării ulterioare.
      
         (3)  În cazul în care se folosește Regulamentul (CE) nr. 1272/2008, concentrațiile-limită pentru gaze, vapori și aerosoli sunt de 20 000 ppm, 20 mg/l, respectiv 5 mg/l. În cazul toxicității anticipate sau pe baza rezultatelor studiului de observare, se aleg concentrații inițiale mai mici. În cazul necesităților de reglementare sau științifice, se pot folosi concentrații mai mari.
      
         (4)  În mod ideal, expunerea animalelor la următorul nivel de concentrație se amână până când există un nivel rezonabil de încredere că animalele testate anterior vor supraviețui. Aceasta permite conducătorului studiului să ajusteze concentrația țintă pentru următoarea sesiune de expunere.
      
         (5)  Doza minimă (concentrație × timp) care a condus la mortalitate în timpul testării la concentrația inițială (prima sesiune de expunere) va fi considerată o indicație pentru a stabili următoarea combinație între concentrație și duratele de expunere. De obicei, concentrația va fi redusă la jumătate (1/2 L) iar animalele vor fi expuse pentru un nou interval de timp cu o grilă mai mică, folosind o diviziune geometrică a perioadelor de expunere cu un factor 1,4 (√2; a se vedea referința bibliografică 11) în jurul timpului în conformitate cu nivelul dozei letale minime (timp × concentrație) observat la prima expunere. În această figură (figura 1), mortalitatea la sesiunea de expunere I a fost observată inițial la 15 min.; prin urmare, duratele în timpul sesiunii II sunt centrate în jurul valorii de 30 min. și sunt 15, 21, 30, 42 și 60 min. După primele două expuneri, se recomandă să se reprezinte grafic datele într-o figură similară cu cea prezentată mai sus și să se verifice dacă relația între concentrație și timp are un unghi de 45 grade (n = 1) sau dacă relația concentrație-timp-răspuns este mai puțin abruptă (de exemplu n = 2) sau mai abruptă (de exemplu, n = 0,8). În al doilea caz, se recomandă să se adapteze corespunzător concentrațiile și duratele următoare.
      
         (6)  În anumite cazuri poate fi necesar să se crească concentrația (2 L) pentru un nou domeniu de timp cu o grilă și mai mică, folosind o diviziune geometrică a perioadelor de expunere cu un factor de 1,4 (√2) în jurul timpului, în conformitate cu nivelul dozei letale minime observat la prima expunere. Ar fi de preferat ca durata de expunere minimă să depășească 5 minute; iar durata maximă de expunere nu trebuie să depășească 8 ore.
      
         (7)  Pentru o serie de măsurători în ser și plasmă, în special pentru glucoză, se recomandă absența hranei peste noapte. Motivul principal pentru această preferință este că variabilitatea crescută care ar rezulta inevitabil în cazul administrării hranei peste noapte ar putea masca efecte mai subtile și ar face interpretarea mai dificilă. În schimb, privarea de hrană în timpul nopții poate afecta metabolismul general al animalelor și, în special în studiile privind hrănirea, poate să perturbe expunerea zilnică la substanța chimică testată. În cazul în care probele sunt prelevate după o perioadă de privare de hrană, determinările biochimice trebuie să fie efectuate după examinările funcționale din săptămâna a patra a studiului.
      
         (8)  Deoarece o perioadă îndelungată de privare de hrană poate introduce dezechilibre în măsurătorile de glucoză la animalele tratate, comparativ cu animalele din grupul martor, conducătorul studiului stabilește dacă este cazul ca animalele să fie private de hrană. În cazul în care se aplică o perioadă de privare de hrană, aceasta va fi corespunzătoare speciei folosite; pentru șobolani, perioada poate fi de 16 ore (privare de hrană pe timpul nopții). Determinarea glucozei à jeun se poate face după privarea de hrană pe timpul nopții în ultima săptămână de expunere sau după privarea de hrană pe timpul nopții înainte de autopsiere (în cazul din urmă, împreună cu toți ceilalți parametri de patologie clinică).
      
         (9)  Deoarece o perioadă îndelungată de privare de hrană poate introduce dezechilibre în măsurătorile de glucoză la animalele tratate comparativ cu animalele din grupul martor, conducătorul studiului determină dacă este cazul ca animalele să fie private de hrană. În cazul în care se aplică o perioadă de privare de hrană, aceasta va fi corespunzătoare speciei folosite; pentru șobolani, aceasta poate fi de 16 ore (privare de hrană pe timpul nopții). Determinarea glucozei à jeun se poate face după privarea de hrană pe timpul nopții în ultima săptămână de expunere sau după privarea de hrană pe timpul nopții înainte de autopsie (în cazul din urmă, împreună cu toți ceilalți parametri de patologie clinică).
      
         (10)  Pentru mai multe analize de ser și plasmă, în special pentru glucoză, este de preferat absența hranei în timpul nopții. Motivul principal este că variația crescută care ar rezulta inevitabil în urma consumului de hrană ar putea să mascheze efectele mai subtile și ar face dificilă interpretarea. Totuși, ar trebui reținut faptul că lipsa hranei pe durata nopții poate să interfereze cu metabolismul general al animalelor și riscă, în special în studiile în care substanța testată este administrată în alimente, să perturbe expunerea zilnică la această substanță. Toate animalele ar trebui să se afle în aceeași stare fiziologică în momentul evaluării și, prin urmare, se recomandă ca evaluările detaliate sau cele neurologice să aibă loc în alte zile decât cele în care au loc prelevările de probe pentru biochimie clinică.
      
         (11)  Caracterul coroziv poate fi stabilit de experți pe baza următoarelor: semne observate la oameni și animale, date (in vitro) existente – de exemplu, capitolele B.40 (10), B.40 bis (11) din prezenta anexă sau orientarea nr. 435 a OCDE (12), valorile pH-ului, informații privind substanțe chimice similare sau orice alte date relevante.
      
         (12)  În următoarele tabele se face referire la GHS (Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS). Echivalentul UE este Regulamentul (CE) nr. 1272/2008. În cazul Toxicității acute prin inhalare, Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (9) nu pune în aplicare Categoria 5.
      
         (13)  În următoarele tabele se face referire la GHS (Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS). Echivalentul UE este Regulamentul (CE) nr. 1272/2008. În cazul Toxicității acute prin inhalare, Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (9) nu pune în aplicare Categoria 5.
      
         (14)  În următoarele tabele se face referire la GHS (Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice (GHS). Echivalentul UE este Regulamentul (CE) nr. 1272/2008. În cazul toxicității acute prin inhalare, Regulamentul (CE) nr. 1272/2008 (9) nu pune în aplicare Categoria 5.
      
         (15)  Aceste substanțe diferă în M4 și M7, așa cum s-a indicat mai sus.
      
         (16)  Aceste soluții sunt preparate individual, apoi sunt turnate împreună și autoclavizate imediat.
      
         (17)  Totuși, trebuie notat faptul că în cazul în care se bănuiește că există o interacțiune între ionii care determină duritatea apei și substanța testată, trebuie să se utilizeze o apă cu duritate mai scăzută (astfel, în această situație nu trebuie să se folosească mediu Elendt M4).
      
         (18)  Aceste substanțe diferă în M4 și M7, așa cum s-a indicat mai sus.
      
         (19)  Aceste soluții sunt preparate individual, apoi sunt turnate împreună și autoclavizate imediat.
      
         (20)  Totuși, trebuie notat faptul că în cazul în care se bănuiește că există o interacțiune între ionii care determină duritatea apei și substanța testată, trebuie să se utilizeze o apă cu duritate mai scăzută (astfel, în această situație nu trebuie să se folosească mediu Elendt M4).
      
         (21)  Pentru neutralizarea toxicității a fost adăugat SiO2.
      
         (22)  Procentul de degradare din vasele FC care conțin substanța de referință.
      
         (23)  Procentul de degradare din vasele FI.