CELEX: 31990R2676
Language: fi
Date: 1990-09-17 00:00:00
Title: Komission asetus (ETY) N:o 2676/90, annettu 17 päivänä syyskuuta 1990, yhteisön viinianalyysimenetelmistä

Avis juridique important

|

31990R2676

Komission asetus (ETY) N:o 2676/90, annettu 17 päivänä syyskuuta 1990, yhteisön viinianalyysimenetelmistä  

Virallinen lehti nro L 272 , 03/10/1990 s. 0001 - 0192 Suomenk. erityispainos Alue 3 Nide 34 s. 0005  Ruotsink. erityispainos Alue 3 Nide 34 s. 0005 

KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2676/90,annettu 17 päivänä syyskuuta 1990,yhteisön viinianalyysimenetelmistä EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, jokaottaa huomioon Euroopan talousyhteisön perustamis- sopimuksen,ottaa huomioon viinikaupan yhteisestä järjestämisestä 16 päivänä maaliskuuta 1987 annetun neuvoston asetuksen (ETY) N:o 822/87(1), sellaisena kuin se on muutettuna asetuksella (ETY) N:o 1325/90(2), ja erityisesti sen 74 artiklan,sekä katsoo, ettäasetuksen (ETY) N:o 822/87 74 artiklan 1 kohdassa säädetään sellaisten määritysmenetelmien antamisesta, joiden avulla voidaan määrittää mainitun asetuksen 1 artiklassa tarkoitettujen tuotteiden koostumus, ja säännöistä, joiden avulla voidaan tarkastaa, onko näitä tuotteita käsitelty sallittujen enologisten käytäntöjen vastaisesti,jos yhteisö ei ole vielä antanut tiettyjen enologisten käytäntöjen käyttöä luonnehtivien aineiden raja-arvoja ja taulukoita, joiden avulla voidaan verrata määritystuloksia, jäsenvaltiot voivat määrittää nämä rajat,asetuksen (ETY) N:o 822/87 13 artiklan 1 kohdassa säädetään analyyttisesta tutkimuksesta, jolla määritetään vähintään kyseisten tma-laatuviinien mainitun asetuksen liitteessä lueteltujen luonteenomaisten aineiden arvot,kyseisiä tuotteita koskevissa asiakirjoissa olevien tietojen valvonta tekee tarpeelliseksi sellaisten yhdenmukaisten määritysmenetelmien laatimisen, joita käyttämällä varmistetaan tarkkojen ja verrattavissa olevien tulosten saaminen; tämän vuoksi näiden menetelmien on oltava pakollisia kaikissa liiketoimissa ja kaikessa valvonnassa; kaupan rajoitettujen mahdollisuuksien perusteella olisi hyväksyttävä rajoitettu määrä tavanomaisia menetelmiä, joilla voidaan tehdä nopea ja tarpeeksi varma tutkittavien aineiden määritys,mahdollisuuksien mukaan on hyödyllistä omaksua menetelmiä, jotka on hyväksytty yleisesti, kuten vuoden 1954 määritysmenetelmien yhtenäistämistä ja viinien arvioimista koskevan kansainvälisen sopimuksen perusteella kehitetyt menetelmät, jotka kansainvälinen viinivirasto julkaisee teoksessa Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins (kokoelma kansainvälisiä viinien määritysmenetelmiä),komission asetuksella (ETY) N:o 1108/82(3) on annettu viinialalla sovellettavia yhteisön määritysmenetelmiä; tieteen kehityksen vuoksi on osoittautunut tarpeelliseksi korvata tiettyjä menetelmiä sopivammilla menetelmillä, muuttaa menetelmiä ja esittää muita menetelmiä, erityisesti sellaisia, jotka kansainvälinen viinivirasto on jo hyväksynyt; näiden mukautusten suuren lukumäärän ja monimutkaisuuden vuoksi kaikki määritysmenetelmät olisi yhdistettävä uuteen asetukseen ja asetus (ETY) N:o 1108/82 olisi kumottava,asetuksen (ETY) N:o 822/87 74 artiklassa tarkoitettuja määritysmenetelmiä käyttämällä saatujen tulosten vertailukelpoisuuden varmistamiseksi olisi viitattava toistettavuuden ja näiden tulosten uusittavuuden osalta kansainvälisen viiniviraston laatimiin määritelmiin,tieteen kehityksen ja virallisten laboratorioiden teknisen välineistön huomioon ottamiseksi ja näiden laboratorioiden työn tehokkuuden ja kannattavuuden parantamiseksi olisi sallittava automatisoitujen määritysmenetelmien käyttö tietyin edellytyksin; on tärkeää täsmentää, että erimielisyyksien esiintyessä automatisoidut menetelmät eivät voi korvata vertailumenetelmiä ja tavanomaisia menetelmiä,taajuusvärähtelyn mittaamiseen perustuvalla automatisoidulla menetelmällä tiheysmittauksessa saatujen tulosten tarkkuus, toistettavuus ja uusittavuus on vähintään sama kuin tämän asetuksen liitteessä olevassa 1 kohdassa esitetyillä menetelmillä saadut tulokset tiheyden ja suhteellisen tiheyden mittauksen osalta; tämän vuoksi on suositeltavaa asetuksen (ETY) N:o 822/87 74 artiklan 3 kohdan mukaisesti pitää tätä automatisoitua menetelmää vastaavana kuin tämän asetuksen liitteessä esitettyjä edellä mainittuja menetelmiä,tämän asetuksen liitteen 25 luvun 2.2.3.3.2 kohdassa kuvailtu menettely viinien ja rypälemehujen rikkidioksidin kokonaispitoisuuden määrittämiseksi, kun oletettu kokonaispitoisuus on vähemmän kuin 50 mg/l, johtaa tämän aineen parempaan saantiin kuin asetuksen (ETY) N:o 1108/82 liitteen 13 luvun 13.4 kohdassa kuvailtu menetelmä; tuloksena on määritettyjen tuotteiden korkeampi rik- kidioksidin kokonaispitoisuus, joka voi olla erityisesti tiettyjen rypälemehujen osalta suurempi kuin säädetty enimmäisraja; jo valmiin rypälemehun myyntivaikeuksien välttämiseksi tämän asetuksen voimaan tullessa ja kunnes valmistuksessa siirrytään täydellisempään rikinpoistoon rypälemehusta, jonka käyminen on estetty tai keskeytetty alkoholia lisäämällä, on siirtymäkautena syytä sallia mainitussa asetuksessa kuvaillun menettelyn käyttö edelleen, jatässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat viinin hallintokomitean lausunnon mukaiset,ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN:1 artikla 1 Tämän asetuksen liitteessä esitetään viinialalla sovellettavat yhteisön määritysmenetelmät, joilla liiketoimissa ja kaikessa valvonnassa- voidaan määrittää asetuksen (ETY) N:o 822/87 1 artiklassa tarkoitettujen tuotteiden koostumus,- voidaan määrittää, onko näitä tuotteita käsitelty sallittujen enologisten käytäntöjen vastaisesti.2 Vertailumenetelmällä saadut tulokset ovat ensisijaisia sellaisten aineiden osalta, joille vahvistetaan vertailumenetelmät ja tavanomaiset menetelmät.2 artikla Tätä asetusta sovellettaessa:a) toistettavuus edustaa arvoa, jonka alapuolella on tietyllä todennäköisyydellä kahden yksittäisen, käytetyillä menetelmillä samoissa koeolosuhteissa (sama suorittaja, sama laite, sama laboratorio ja lyhyt aikaväli) saadun tuloksen välisen erotuksen itseisarvo,b) uusittavuus edustaa arvoa, jonka alapuolella on tietyllä todennäköisyydellä kahden yksittäisen eri koeolosuhteissa (eri suorittaja, eri välineistö ja/tai eri laboratorio ja/tai eri aika) saadun tuloksen välisen erotuksen itseisarvo.`Yksittäisellä tuloksella` tarkoitetaan arvoa, joka saadaan käyttämällä yhteen näytteeseen yhden kerran ja täydellisesti standardisoitua koemenetelmää.Jos muuta ei todeta, todennäköisyys on 95 prosenttia.3 artikla 1 Automatisoidut määritysmenetelmät hyväksytään käytettäväksi laboratorion johtajan vastuulla sillä edellytyksellä, että tulosten tarkkuus, toistettavuus ja uusittavuus vastaavat vähintään liitteessä kuvatuilla määritysmenetelmillä saatuja tuloksia.Jos erimielisyyksiä esiintyy, liitteessä kuvattuja menetelmiä ei voi korvata automatisoiduilla menetelmillä.2 Taajuusvärähtelyyn perustuvaa automatisoitua menetelmää tiheysmittauksessa pidetään tämän asetuksen liitteessä olevassa 1 kohdassa kuvailtuja menetelmiä vastaavana.4 artikla Liuoksiin, laimentamiseen tai pesuun tarkoitetulla vedellä tarkoitetaan tislattua tai vähintään vastaavan puhtausasteen omaavaa demineralisoitua vettä. Kaikkien kemikaalien on oltava puhtausasteeltaan analyysilaatua, jollei toisin määrätä.5 artikla Kumotaan asetus (ETY) N:o 1108/82.Mainitun asetuksen 1 artiklan 4 kohtaa sovelletaan kuitenkin 31 päivään joulukuuta 1990.6 artikla Tämä asetus tulee voimaan päivänä, jona se julkaistaan Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä.Sitä sovelletaan 1 päivästä lokakuuta 1990.Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.Tehty Brysselissä 17 päivänä syyskuuta 1990.Komission puolestaRay MAC SHARRYKomission jäsen(1) EYVL N:o L 84, 27.3.1987, s. 1(2) EYVL N:o L 132, 23.5.1990, s. 19(3) EYVL N:o L 133, 14.5.1982, s. 1LIITE 1 TIHEYS JA SUHTEELLINEN TIHEYS 20 °C:SSA 1 MÄÄRITELMÄT Tiheys on viinin tai rypälemehun tietyn tilavuusyksikön massa 20 °C:ssa. Se ilmoitetaan grammoina millilitrassa ja sen tunnus on ñ20 °C.Suhteellinen tiheys 20 °C:ssa tai tiheys 20 °C/20 °C on desimaalilukuna ilmoitettu tietyn viini- tai rypälemehutilavuuden massan suhde 20 °C:ssa saman vesitilavuuden massaan samassa lämpötilassa. Sen tunnus on d20 °C20 °C.2 PERIAATETiheys ja suhteellinen tiheys 20 °C:ssa mitataan määritettävästä näytteestä:- joko pyknometrillä: vertailumenetelmä,- tai areometrillä tai densimetrillä käyttäen hydrostaattista vaakaa: tavanomaiset menetelmät.HuomautusHyvin tarkoissa määrityksissä rikkidioksidin vaikutus tiheyteen on korjattava.ñ20 °C = ñ'20 °C - 0,0006 × Sjossa>TAULUKON PAIKKA>3 NÄYTTEEN VALMISTAMINENJos viini tai rypälemehu sisältää huomattavia määriä hiilidioksidia, suurin osa siitä voidaan poistaa ravistelemalla 250 ml viiniä 1 000 ml mittapullossa, tai suodattamalla alipaineessa läpi putken, jossa on 2 g vanua.4 VERTAILUMENETELMÄ4.1 VälineistöTavalliset laboratoriovälineet, ja erityisesti4.1.1 Vetoisuudeltaan noin 100 ml:n pyrex-lasinen pyknometri(1), jossa on irrallinen hioksellinen lämpömittari, jonka 1/10 asteen välein oleva asteikko on välillä 10 30 °C. Tämän lämpömittarin on oltava hyväksytty (kuvio 1).>VIITTAUS KAAVIOON>Pyknometrissä on 25 mm:n pituinen, sisähalkaisijaltaan enintään 1 mm oleva sivuputki, joka päättyy hiokseen. Tähän sivuputkeen voidaan liittää "keräyspullo", joka koostuu putkesta, jonka toisessa päässä on kartiohios ja toisessa päässä kapea poistoputki. Tätä käytetään paisuntasäiliönä.Laitteen molempien hiosten on oltava hyvin huolellisesti tehtyjä.4.1.2 Ulkotilavuudeltaan pyknometrin kokoinen taara (vähintään 1 ml:n tarkkuudella), jonka massa on sama kuin nesteellä, jonka tiheys on 1,01 (2,0 % natriumkloridiliuos (m/v)), täytetyn pyknometrin massa.Lämpöeristetty säiliö, joka mukautuu täydellisesti pyknometrin muotoon.4.1.3 Tasavarsivaaka, jonka vähimmäiskuormitus on 300 g ja tarkkuus 1/10 mgtaiyksikuppivaaka, jonka vähimmäiskuormitus on 200 g ja tarkkuus 1/10 mg.4.2 Pyknometrin kalibrointiPyknometrin kalibrointi käsittää seuraavien ominaisuuksien määrittämisen:- tyhjän pyknometrin taara,- pyknometrin tilavuus 20 °C:ssa,- vedellä täytetyn pyknometrin massa 20 °C:ssa.4.2.1 Menetelmä tasavarsivaakaa käytettäessäTaara asetetaan tasavarsivaa'an vasempaan vaakakuppiin ja puhdas kuiva pyknometri, joka on varustettu paisuntasäiliöllä, oikeaan vaakakuppiin. Lisätään punnuksia siihen vaakakuppiin, jossa pyknometri on, ja otetaan paino, kun tasapaino on saavutettu: se on p grammaa.Pyknometri täytetään huolellisesti huoneenlämpöisellä tislatulla vedellä ja lämpömittari asetetaan paikoilleen: pyknometri kuivataan huolellisesti ja se asetetaan lämpöeristettyyn säiliöön. Sekoitetaan kääntelemällä säiliötä, kunnes lämpömittarin osoittama lämpötila ei muutu. Säädetään taso tarkalleen sivuputken reunaan. Kuivataan sivuputki ja asetetaan paisuntasäiliö paikoilleen: luetaan lämpötila t °C:ssa huolellisesti ja korjataan mahdollinen lämpöasteikon epätarkkuus. Punnitaan vedellä täytetty pyknometri ja luetaan paino p' grammoina, kun tasapaino saavutetaan.Laskentakaavat(2):Tyhjän pyknometrin taaraus:tyhjän pyknometrin taara = p + m,jossa>TAULUKON PAIKKA>Tilavuus 20 °C:ssa:V20 °C = (p + m - p') × F1,jossa F1 = taulukossa 1 olevasta lämpötila t °C sarakkeesta otettu kerroin.V20 °C on tunnettava ± 0,001 ml:n tarkkuudella.Veden massa 20 °C:ssa:M20 °C = V20 °C × 0,998203,jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:ssa.4.2.2 Menetelmä yksikuppivaakaa käytettäessäMääritetään:- puhtaan ja kuivan pyknometrin massa: P.- vedellä täytetyn pyknometrin massa P1 lämpötilassa t °C 4.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla.- taaran massa: T0.Laskentakaavat(3)Tyhjän pyknometrin taaraus:tyhjän pyknometrin taara: P   m, jossa>TAULUKON PAIKKA>Tilavuus 20 °C:ssa:V20 °C = [P1   (P   m)] × F1,jossa F1 = taulukossa 1 olevasta lämpötila t °C sarakkeesta otettu kerroin.Tilavuus 20 °C:ssa on tunnettava ± 0,001 ml:n tarkkuudella.Veden massa 20 °C:ssa:M20 °C = V20 °C. 0,998203,jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:ssa.4.3 Mittausmenetelmä(4)4.3.1 Menetelmä tasavarsivaakaa käytettäessäTäytetään pyknometri määritystä varten valmistetulla näytteellä (3) ja menetellään 4.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla.p" on se paino grammoina, joka vaaditaan tasapainon saavuttamiseksi lämpötilassa t °C.Pyknometrin sisältämän nesteen massa = p + m   p".Näennäinen tiheys t °C:ssa:ñt °C = >NUM>p + m   p"/>DEN>V20 °CTiheys 20 °C:ssa lasketaan jäljempänä olevan korjaustaulukon avulla tutkitun nesteen tyyppi huomioon ottaen: kuiva viini (taulukko II), luonnollinen tai tiivistetty rypälemehu (taulukko III), makea viini (taulukko IV).Viinin tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203.4.3.2 Menetelmä yksikuppivaakaa käytettäessä(5)Taara punnitaan. Sen massa on T.Lasketaan dT = T1   T0.Tyhjän pyknometrin massa mittaushetkellä = P   m + dT.Täytetään pyknometri määritystä varten valmistetulla näytteellä (3) ja menetellään 4.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla. P2 on sen massa t °C:ssa.Pyknometrin sisältämän nesteen massa t °C:ssa = P2   (P   m + dT).Näennäinen tiheys t °C:ssa:ñt °C = >NUM>P2   (P   m + dT)/>DEN>V20 °CLasketaan tutkitun nesteen tiheys 20 °C:ssa (kuiva viini, luonnollinen tai tiivistetty rypälemehu, makea viini) 4.3.1 kohdassa esitetyllä tavalla.Tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203.4.3.3 Tiheysmittausten toistettavuuskuivat ja puolimakeat viinit: r = 0,00010makeat viinit: r = 0,00018.4.3.4 Tiheysmittausten uusittavuuskuivat ja puolimakeat viinit: R = 0,00037makeat viinit: R = 0,00045.5 TAVANOMAISET MENETELMÄT5.1 Areometria5.1.1 Välineistö5.1.1.1 AreometriAreometrien mittojen ja asteikoinnin on oltava ISO:n vaatimusten mukaisia.Niissä on oltava sylinterimäinen paksunnos, poikkileikkaukseltaan pyöreä halkaisijaltaan vähintään 3 mm oleva varsi. Kuivien viinien osalta niiden asteikon on oltava jaettu mittausalueella 0,983 1,003 0,0010 ja 0,0002 millimetrin välein. Jokaista tuhannesosaa osoittavan ja sitä seuraavan vastaavan merkkiviivan välin on oltava vähintään 5 mm. Viinien, joista alkoholi on poistettu, makeiden viinien ja rypälemehun tiheyden mittauksessa käytetään viittä areometria, joiden asteikko on jaettu 1,000 1,030; 1,030 1060; 1,060 1,090; 1,090 1,120; 1,120 1,150. Tiheyden mittaamisessa 20 °C:ssa näiden laitteiden asteikot on jaettava vähintään 0,0010 ja 0,0005 välein siten, että jokaisen tuhannesosaa osoittavan ja sitä seuraavan vastaavan merkkiviivan väli on vähintään 3 mm.Nämä areometrit on asteikoitava siten, että niitä luetaan "meniskin korkeimmasta kohdasta". Asteikossa tai runkoon suljetussa paperiliuskassa on oltava maininta tiheyden 20 °C:ssa tai suhteellisen tiheyden 20 °C:ssa asteikoinnista tai lukemisesta meniskin korkeimmasta kohdasta.Näiden laitteiden on oltava viranomaisten tarkastamia.5.1.1.2 Tarkastettu lämpömittari, jonka asteikko on jaettu vähintään 0,5 °C:n välein.5.1.1.3 Sisähalkaisijaltaan 36 mm ja korkeudeltaan 320 mm oleva mittalasi, joka tuetaan pystyasentoon statiivilla.5.1.2 Suoritus5.1.2.1 MittausmenetelmäMitataan 5.1.1.3 kohdassa tarkoitettuun mittalasiin 250 ml määritystä varten valmistettua näytettä (3) ja sijoitetaan areometri ja lämpömittari nesteeseen. Sekoitetaan lämpötilan tasaamiseksi ja luetaan lämpötila minuutti sekoittamisen jälkeen. Poistetaan lämpömittari ja luetaan areometristä näennäinen tiheys t °C:ssa areometristä minuuttia myöhemmin.Korjataan lämpötilan vaikutus näennäiseen tiheyteen t °C:ssa käyttäen taulukoita, joita on laadittu kuiville viineille (taulukko V), rypälemehuille (taulukko VI) ja sokeria sisältäville viineille (taulukko VII).Tiheys 20 °C/20 °C lasketaan jakamalla tiheys 20 °C:ssa luvulla 0,998203.5.2 Densimetria hydrostaattista vaakaa käyttäen5.2.1 VälineistöHydrostaattinen vaaka.Hydrostaattinen vaaka, jonka enimmäiskuormitus on vähintään 100 g ja tarkkuus 0,1 mg.Molempien vaakakuppien alapuolelle ripustetaan Pyrex-lasiset uppokappaleet, joiden tilavuus on vähintään 20 ml. Nämä uppokappaleet ripustetaan paksuudeltaan enintään 0,1 mm olevalla langalla.Oikeanpuoleisen vaakakupin alle ripustettu uppokappale on voitava sijoittaa mittalasiin, jossa on tason osoittava merkki. Tämän mittalasin sisähalkaisijan on oltava vähintään 6 mm suurempi kuin uppokappaleen halkaisijan. Uppokappaleen on mahduttava kokonaan mittalasissa olevan merkin alapuolelle ja mitattavan nesteen pinnan saa rikkoa ainoastaan ripustuslanka. Mittalasissa olevan nesteen lämpötila mitataan lämpömittarilla, jonka asteikko on jaettu 0,2 °C:n välein.Voidaan käyttää myös yksikuppista hydrostaattista vakaa.5.2.2 Suoritus5.2.2.1 Hydrostaattisen vaa'ankalibrointiKun molemmat uppokappaleet ovat ilmassa, vaaka tasapainotetaan sijoittamalla oikeaan vaakakuppiin punnuksia joiden massa on p.Mittalasi täytetään merkkiin asti puhtaalla vedellä, sekoitetaan, annetaan seistä 2 3 minuuttia ja luetaan lämpötila t °C.Tasapainotetaan vaaka uudelleen oikeaan vaakakuppiin sijoitettujen massojen avulla. Tämä merkitään p:llä.Uppokappaleen tilavuus 20 °C:ssa:V20 °C = (ñ'   ñ)(F + 0,0012)jossa F = taulukossa 1 olevasta lämpötila t °C sarakkeesta otettu kerroin.p ja V20 °C ovat uppokappaleen ominaisuuksia.5.2.2.2 M i t t a u s m e n e t e l m äUpotetaan oikea uppokappale mittalasiin joka on täytetty merkkiin viinillä (tai rypälemehulla). Luetaan viinin (tai rypälemehun) lämpötila t °C:p" uudelleen tasapainotetaessa tarvittava massapt °C näennäinen tiheys:ñt °C = >NUM>(p"   p)/>DEN>V + 0,0012Tämä tiheys korjataan 20 °C:seen käyttäen taulukoita II, III tai IV.6 ESIMERKKI TIHEYDEN 20 °C JA TIHEYDEN 20 °C/20 °C LASKEMISEKSI (VERTAILUMENETELMÄ)6.1 Pyknometria tasavarsivaakaa käytettäessä6.1.1 Pyknometrin parametrit1 Puhtaan ja kuivan pyknometrin punnitseminen:>TAULUKON PAIKKA>2 Täynnä vettä olevan pyknometrin punnitseminen t °C:ssa:>TAULUKON PAIKKA>3 Pyknometrin sisältämän ilman massan laskeminen:>TAULUKON PAIKKA>4 Huomioon otettavat parametrit:Tyhjän pyknometrin taara p + m:p + m = 104,9454 + 0,1244p + m = 105,0698 gTilavuus 20 °C:ssa = (p + m   p') × Ft °CF20,50 °C = 1,001900V20 °C = (105,0698   1,2396) × 1,001900V20 °C = 104,0275 mlVeden massa 20 °C:ssa = V20 °C × 0,998203M20 °C = 103,8405 g6.1.2 Kuivan viinin tiheyden 20 °C ja tiheyden 20 °C/20 °C laskeminenñ" = 1,2622 17,80 °C:ssañ17,80° C = >NUM>105,0698  />DEN>1,2622;104,0275ñ17,80 °C = 0,99788 g/mlTaulukon II avulla voidaan laskea ñ20 °C ñt °C:sta käyttäen suhdetta:ñ20 °C = ñt °C ± >NUM>c/>DEN>1 000Kun t = 17,80 °C ja alkoholipitoisuus 11 til-%, c = 0,54.ñ20 °C = 0,99788   >NUM>0,54/>DEN>1 000ñ20 °C = 0,99734 g/mld20 °C20 °C = >NUM>0,99734/>DEN>0,998203 = 0,999136.2 Pyknometria yksikuppivaakaa käytettäessä6.2.1 Pyknometrin parametrit1 Puhtaan ja kuivan pyknometrin punnitseminen:P = 67,7913 g2 Vedellä täytetyn pyknometrin punnitseminen t °C:ssa:P1 = 169,2715 g 21,65 °C:ssa3 Pyknometrin sisältämän ilman massan laskeminen:m = 0,0012 (P1   P)m = 0,0012 × 101,4802m = 0,1218 g4 Huomioon otettavat parametrit:Tyhjän pyknometrin taara P   m:P   m = 67,7913 - 0,1218P   m = 67,6695 gTilavuus 20 °C:ssa = [P1   (P   m)] Ft °CF21,65 °C = 1,002140V20 °C = (169,2715   67,6695) × 1,002140V20 °C = 101,8194 mlVeden massa 20 °C:ssa = V20 °C × 0,998203M20 °C = 101,6364 gTaaran massa: T0T0 = 171,9160 g6.2.2 Kuivan viinin tiheyden 20 °C ja tiheyden 20 °C/20 °C laskeminenT1 = 171,9178 gdT = 171,9178   171,9160 = 0,0018 gP   m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 gP2 = 169,2799 18 °C:ssañ18 °C = >NUM>169,2799  />DEN>67,6713;101,8194ñ18 °C = 0,99793 g/mlTaulukon II avulla voidaan laskea ñ20 °C ñt °C:sta käyttäen suhdetta:ñ20 °C = ñt °C ± >NUM>c/>DEN>1 000Kun t = 18 °C ja alkoholipitoisuus 11 til-%, c = 0,49.ñ20 °C = 0,99793   >NUM>0,49/>DEN>1 000ñ20 °C = 0,99744 g/mld20 °C20 °C = >NUM>0,99744/>DEN>0,998203 = 0,99923TAULUKKO I F kertoimet, joilla pyrex-lasisen pykonometrin t°C:ssa sisältämän veden massa 9 on kerrottava, pyknometrin tilavuuden laskemiseksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON>>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>TAULUKKO II Lämpötilan korjaukset c kuivien viinien ja kuivien viinien, joista alkoholi on poistettu, pyrex-laisella pyknometrillä t°C:ssa mitatum tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON>>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>TAULUKKO III Lämpötilan korjaukset c lunnollisen ja tiivistetyn rypälemehun pyrex-lasisella pyknometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON>>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>TAULUKKO IV Lämpötilan korjaukset c vähintään 13 till-% jäännössokeria sisältävien viinien pyrex-lasisella pyknometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON>>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>TAULUKKO V Lämpötilan korjaukset c luonnollisen ja tiivistetyn rypälemehun tavallisesta lasista valmistetulla pyknometrillä tai areometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON>>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>TAULUKKO VI Lämpötilan korjaukset c luonnollisen ja tiivistetyn rypälemehun tavallisesta lasista valmistetulla pyknometrillä tai areometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON>>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>TAULUKKO VII Lämpötilan korjaukset c vähintään 13 till-% jäännössokeria sisältävien viinien tavallisesta lasista valmistetula pyknometrillä tai areometrillä t°C:ssa mitatun tiheyden muuntamiseksi tiheydeksi 20 °C:ssa >VIITTAUS KAAVIOON>>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>2 RYPÄLEMEHUN, TIIVISTETYN RYPÄLEMEHUN JA PUHDISTETUN TIIVISTETYN RYPÄLEMEHUN SOKERIPITOISUUDEN ARVIOINTI REFRAKTOMETRILLÄ 1 PERIAATETaitekerroin 20 °C:ssa, esitettynä lukuarvona tai sakkaroosin massaprosentteina, annetaan vastaavissa taulukoissa, joista saadaan rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus g/l ja g/kg.2 VÄLINEISTÖ2.1 Abbe-refraktometriKäytetyssä refraktometrissä on oltava asteikko, josta näkyy:- joko sakkaroosin massaprosentti 0,1 %:n tarkkuudella,- tai taitekertoimet neljällä desimaalilla.Refraktometrissä on oltava lämpömittari, jonka asteikko ulottuu mittausalueelle + 15   25 °C, ja kiertovesijärjestelmä, joka mahdollistaa mittausten tekemisen 20 °C ± 5 °C lämpötilassa.Tämän laitteen käyttöohjeita on noudatettava tarkasti, erityisesti kalibroinnin ja valonlähteen osalta.3 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN3.1 Rypälemehut ja tiivistetyt rypälemehutRypälemehu suodatetaan tarvittaessa kuivan, neljään osaan taitetun harson läpi, ensimmäiset suodostipat hylätään ja määritys tehdään suodatetusta tuotteesta.3.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehutKonsentraation mukaan käytetään joko puhdistettua tiivistettyä rypälemehua tai liuosta, joka saadaan laimentamalla 200 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua 500 g:ksi vedellä; punnitseminen on tehtävä tarkasti.4 SUORITUSSaatetaan näytteen lämpötila lähelle 20 °C:ta. Asetetaan pieni näyte refraktometrin alemmalle prismalle ja tarkastetaan, että prismojen ollessa tiukasti toisiaan vasten näyte peittää lasipinnan kokonaan. Mittaus tehdään käytetyn laitteen käyttöohjeiden mukaisesti.Luetaan sakkaroosin massaprosentti 0,1 %:n tarkkuudella tai taitekerroin neljällä desimaalilla.Samasta valmistetusta näytteestä tehdään vähintään 2 määritystä. Kirjataan lämpötila t °C.5 LASKEMINEN5.1 Lämpötilan korjaus5.1.1 Laitteet, joissa asteikko on sakkaroosin massaprosentteja: lämpötilan korjaamisessa käytetään taulukkoa I.5.1.2 Laitteet, joissa asteikko on taitekerroin: etsitään t °C:ssa mitattu taitekerroin taulukosta II, josta saadaan (sarake 1) sakkaroosin massaprosentti t °C:ssa. Tämä arvo korjataan lämpötilan suhteen ja ilmoitetaan 20 °C:ssa taulukon I avulla.5.2 Rypälemehun ja tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuusEtsitään taulukosta II sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa, josta saadaan sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina yhdellä desimaalilla.5.3 Puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuusEtsitään taulukosta II sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa, josta saadaan sokeripitoisuus grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa. Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina yhdellä desimaalilla.Jos mittaus tehdään laimennetusta puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta, tulos kerrotaan laimennuskertoimella.5.4 Rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun taitekerroinEtsitään taulukosta II sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa, josta saadaan taitekerroin 20 °C:ssa. Tämä taitekerroin esitetään neljällä desimaalilla.>TAULUKON PAIKKA>Lämpötila ei saa poiketa 20 °C:sta yli ± 5 °C:ta.TAULUKKO II Taulukossa esistetään rypälemehun ja tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus (6)grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa, joka on määritetty refraktometrillä, jossa asteikko on joko sakkaroosin massaprossentti 20 °C:ssa tai taitekerroin 20 °C:ssa. Myös tiheys 20 °C:ssa on esitetty. >VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>TAULUKKO III Taulukossa esitetään puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sokeripitoisuus (7) grammoina litrassa ja grammoina kilogrammassa, joka on määritetty refraktometrillä, jossa asteikko on joko sakkaroosin massaprosentti 20 °C:ssa tai taitekerroin 20 °C:ssa. Myös tiheys 20 °C:ssa on esitetty. >VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>3 ALKOHOLIPITOISUUS TILAVUUSPROSENTTEINA 1 MÄÄRITELMÄ Alkoholipitoisuus tilavuusprosentteina on samansuuruinen kuin etanolin määrä litroina 100 litrassa viiniä, kun molemmat mitataan 20 °C:ssa. Sen tunnus on "til-%".Huomautus:Etanolin homologit sekä estereihin sitoutunut etanoli ja etanolin homologit kuuluvat tisleen alkoholipitoisuuteen.2 PERIAATE2.1 Kalsiumhydroksidiliuoksella emäksiseksi tehdyn viinin tislaus. Alkoholipitoisuuden määrittäminen tisleestä.2.2 Vertailumenetelmä: tisleen tiheyden määrittäminen pyknometrillä.2.3 Tavanomaiset menetelmät2.3.1 Tisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen areometrisesti2.3.2 Tisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen densimetrisesti hydrostaattisella vaa'alla2.3.3 Tisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen refraktometrisestiHuomautus:Alkoholipitoisuus saadaan tisleen tiheydestä käyttäen tämän luvun liitteessä II olevia taulukoita I, II ja III. Ne on laskettu Lakisääteisen mittaustoiminnan kansainvälisen järjestön vuonna 1972 julkaisemassa suosituksessa N:o 22 esitetyn kansainvälisen alkoholipitoisuustaulukon perusteella ja OIV (Yleiskokous 1974) on hyväksynyt taulukon.Taulukossa I esitetään yleinen vesi-etanoliseosten tilavuusprosentteina annetun alkoholipitoisuuden ja tiheyden yhteys eri lämpötiloissa.3 TISLEEN VALMISTAMINEN3.1 Välineistö3.1.1 Tislauslaitteisto, johon kuuluu:- pyöreäpohjainen, hioksellinen tislauskolvi, jonka vetoisuus on 1 litra,- noin 20 cm korkea tislauskolonni tai muu laite roiskumisen estämiseksi,- lämmönlähde: pyrolyysi on estettävä sopivalla laitteella,- jäähdytin, joka päättyy ulosmenoputkeen, joka ohjaa tisleen muutaman millilitran vettä sisältävään mittapulloon.3.1.2 Vesihöyrytislauslaitteisto, johon kuuluu:1 vesihöyrykehitin,2 tislauskolvi, jossa on putki vesihöyryn johtamiseksi,3 tislauskolonni,4 jäähdytin.Voidaan käyttää mitä tahansa tislaus- tai vesihöyrytislauslaitteistoa sillä edellytyksellä, että se läpäisee seuraavan kokeen: tislataan 5 kertaa peräkkäin alkoholipitoisuudeltaan 10 til-% oleva vesi-etanoliseos.Viidennen tislauskerran jälkeen tisleen alkoholipitoisuuden on oltava vähintään 9,9 til-%, toisin sanoen tislauksen aikana alkoholipitoisuus ei saa laskea yli 0,02 til-%:lla.3.2 Reagenssit3.2.1 2 M kalsiumhydroksidisuspensioKaadetaan varovasti 1 l kuumaa vettä (60  70 °C) 120 g:n sammuttamattoman kalkin (CaO) päälle.3.3 Näytteen valmistaminenNuorista viineistä ja kuohuviineistä poistetaan aluksi suurin osa niiden sisältämästä hiilidioksidista ravistelemalla 250  300 ml viiniä 500 ml mittapullossa.3.4 SuoritusMittapulloon mitataan 200 ml viiniä. Viinin lämpötila kirjataan.Näyte kaadetaan tislaus- tai vesihöyrytislauslaitteiston kolviin. Mittapullo huuhdellaan neljä kertaa 5 ml vettä ja tämä vesi lisätään tislauskolviin. Lisätään 10 ml kalsiumhydroksidia (3.2.1) ja muutama palanen inerttiä huokoista ainetta (hohkakiveä).Tisle kerätään 200 ml:n mittapulloon, jota käytettiin viinin mittaamiseen.Tavallisessa tislauksessa tislettä otetaan noin 3/4 alkuperäisestä tilavuudesta ja vesihöyrytislauksessa 198 199 ml. Täytetään 200 ml:ksi tislatulla vedellä lämpötilassa, joka ei poikkea alkuperäisestä lämpötilasta yli ± 2 °C.Sekoitetaan varovasti pyöreällä liikkeellä.Huomautus:Jos viini sisältää erityisen paljon ammoniumioneja, tisle on mahdollisesti tislattava uudelleen edellä kuvatuissa koeolosuhteissa siten, että kalsiumhydroksidisuspensio korvataan 1 ml:lla 10 %:n (v/v) rikkihappoa.4 VERTAILUMENETELMÄTisleen alkoholipitoisuuden määrittäminen pyknometrillä.4.1 Välineistö4.1.1 Käytetään "Tiheys"-luvussa kuvattua kalibroitua pyknometriä.4.2 SuoritusMääritetään tisleen (3.4) näennäinen tiheys t °C:ssa 1 luvussa "Tiheys" olevan 4.3.1 ja 4.3.2 kohdan mukaisesti. Tämä tiheys on ñt.4.3 Tulosten ilmoittaminen4.3.1 LaskentamenetelmäAlkoholipitoisuus 20 °C:ssa löytyy taulukosta I. Taulukon vaakasuoralta riviltä, joka vastaa lämpötilaa T (ilmoitettu kokonaislukuna) välittömästi t °C:n alapuolella, etsitään pienin mahdollinen ñt:n ylittävä tiheys. Tämän tiheyden alapuolella taulukossa annettua erotusta käytetään tiheyden ñ laskemisessa lämpötilassa T.Lämpötila T riviltä etsitään pienin mahdollinen ñ:n ylittävä tiheys ñ' ja lasketaan näiden kahden tiheyden ñ ja ñ' erotus. Tämä erotus jaetaan tiheyden ñ' oikealla puolella ilmoitetulla erotuksella. Osamäärästä saadaan alkoholipitoisuuden desimaaliosa ja tämän pitoisuuden kokonaislukuosa annetaan sen sarakkeen yläosassa, jossa tiheys ñ' on.Alkoholipitoisuuden laskemisesta annetaan esimerkki tämän luvun liitteessä I.Huomautus:Tämä lämpötilakorjaus on sisällytetty tietokoneohjelmaan ja se voidaan mahdollisesti tehdä automaattisesti.4.3.2 Toistettavuus (r)r = 0,10 til-%4.3.3 Uusittavuus (R)R = 0,19 til-%5 TAVANOMAISET MENETELMÄT5.1 Areometria5.1.1 Välineistö5.1.1.1 A l k o h o l o m e t r iAlkoholometrin on täytettävä OIML:n kansainvälisessä suosituksessa N:o 44 "Alkoholometrit ja areometrit" määriteltyihin luokkiin I tai II kuuluvien laitteiden erityisvaatimukset.5.1.1.2 Lämpömittari, jonka asteikko on asteen ja 0,1 °C:n välein alueella 0 40 °C ja jonka mittaustarkkuus on tarkastusten mukaan 1/20 astetta.5.1.1.3 Sisähalkaisijaltaan 36 mm ja korkeudeltaan 320 mm oleva mittalasi, joka on tuettu pystyasentoon statiivilla.5.1.2 SuoritusKaadetaan tisle (3.4) mittalasiin. Varmistetaan, että mittalasi on pystysuorassa asennossa. Ravistellaan mittalasia lämpömittarin, alkoholometrin ja tisleen lämpötilan tasaamiseksi, ja luetaan lämpötila minuutti tämän jälkeen. Poistetaan lämpömittari ja annetaan seistä 1 minuutin ajan. Tämän jälkeen luetaan näennäinen alkoholipitoisuus. Lukema otetaan vähintään kolme kertaa käyttäen apuna suurennuslasia. Lämpötilan vaikutus t °C:ssa mitattuun näennäiseen alkoholipitoisuuteen korjataan taulukon II avulla.Nesteen lämpötila saa poiketa vain hieman ympäristön lämpötilasta (korkeintaan 5 °C).5.2 Densimetria hydrostaattista vaakaa käyttäen5.2.1 VälineistöKäytetään hydrostaattista vaakaa "Tiheys"-luvussa kuvatulla tavalla.5.2.2 SuoritusMääritetään tisleen näennäinen tiheys t °C:ssa I luvussa "Tiheys" olevan 5.2.2 kohdan mukaisesti.5.2.3 Tulosten ilmoittaminenAlkoholipitoisuus 20 °C:ssa saadaan 4.3.1 kohdassa kuvatulla tavalla taulukkoa I käyttäen, jos uppokappale on pyrex-lasinen, tai taulukkoa III käyttäen, jos uppokappale on tavallisesta lasista.5.3 Refraktometria5.3.1 Välineistö5.3.1.1 Refraktometri, jolla voidaan mitata alueella 1,330-1,346 olevat taitekertoimet.Laitetyypin mukaan mittaus voidaan tehdä:- joko 20 °C:ssa sopivalla välineellä,- tai ympäristön lämpötilassa t °C, välineellä, jossa on lämpömittari, jolla lämpötila voidaan määrittää vähintään 0,05 °C:n tarkkuudella. Lämpötilan korjaustaulukko toimitetaan laitteen mukana.5.3.2 SuoritusTaitekertoimen mittaus tehdään viinitisleestä (3.4) seuraten käytettyä laitetyyppiä koskevia ohjeita.5.3.3 Tulosten ilmoittaminenTaulukosta IV saadaan taitekerrointa vastaava alkoholipitoisuus 20 °C:ssa.Huomautus:Taulukossa IV annetaan puhtaiden vesi-etanoliseosten ja viinitisleen taitekerrointen välinen vastaavuus. Taulukossa otetaan huomioon viinitisleen epäpuhtaudet (pääasiassa korkeammat alkoholit). Metanoli vähentää taitekerrointa ja tämän vuoksi myös alkoholipitoisuutta.6 ESIMERKKI VIININ ALKOHOLIPITOISUUDEN LASKEMISESTA6.1 Pyknometria tasavarsivaakaa käytettäessä6.1.1 Pyknometrin parametrit on määritetty ja laskettu I luvussa "Tiheys ja suhteellinen tiheys" (6.1.1 kohta) kuvatulla tavalla.6.1.2 Tisleellä täytetyn pyknometrin punnitseminen>TAULUKON PAIKKA>p + m   p" = tisleen massa t °C:ssa105,0698   2,8074 = 102,2624 gNäennäistiheys t °C:ssa:>TAULUKON PAIKKA>6.1.3 Alkoholipitoisuuden laskeminen>TAULUKON PAIKKA>6.2 Pyknometria yksikuppista vaakaa käytettäessä6.2.1 Pyknometrin parametrit on määritetty ja laskettu I luvun "Tiheys ja suhteellinen tiheys" 6.2.1 kohdassa.6.2.2 Tisleellä täytetyn pyknometrin punnitseminen>TAULUKON PAIKKA>6.2.3 Alkoholipitoisuuden laskeminen>TAULUKON PAIKKA>YHTÄLÖ ALKOHOLIPITOISUUSTAULUKOIDEN LASKEMISEKSI ETYYLIALKOHOLI-VESISEOKSILLEEtyylialkoholi-vesiseoksen tiheys "ñ" kilogrammoina kuutiometrissä (kg/m3) lämpötilassa t °C saadaan lasketuksi seuraavasta yhtälöstä, joka on- massaprosenttina annetun alkoholipitoisuuden ñ suhteellisen osuuden funktio, jolloin ñ on desimaaliluku(8),- Celsiusasteina (IPTS -68) ilmoitetun lämpötilan t funktio,- ja jonka numeeriset kertoimet ilmoitetaan jäljempänä.Yhtälö pätee lämpötila-alueella   20 - + 40 °C.ñ = A1 + Ók = 212 Ak pk - 1 + Ók = 16 Bk(t - 20 °C)k + Ói = 1n Ók = 1m Ci,k pk(t - 20 °C)in = 5m1 = 11m2 = 10m3 = 9m4 = 4m5 = 2>TAULUKON PAIKKA>TAULUKKO I >KAAVION ALKU>KANSAINVÄLINEN ALKOHOLIPITOISUUS 20 °C:SSATaulukko vesi-alkoholiseoksen näennäisille tiheyksille - pyrex-lasinen pyknometriTiheys t °C:ssa, ilman noste korjattu>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>TAULUKKO II >KAAVION ALKU>KANSAINVÄLINEN ALKOHOLIPITOISUUS 20 °C:SSATaulukko lämpötilan vaikutuksen näennäiseen alkoholipitoisuuteen korjaamiseksiNäennäiseen alkoholipitoisuuteen t °C:ssa (tavallisesta lasista valmistettu alkoholometri) lisätään tai siitä vähennetään annettu korjausluku>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>TAULUKKO III >KAAVION ALKU>KANSAINVÄLINEN ALKOHOLIPITOISUUS 20 °C:SSATaulukko vesi-alkoholiseosten näennäisille tiheyksile - tavallisesta lasista valmistetut laitteetTiheys t °C:ssa, ilman noste korjattu>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>TAULUKKO IV >KAAVION ALKU>Taulukko puhtaiden vesi-alkoholiseosten ja tisleiden taitekerrointoimille 20 °C:ssa ja vastaaville alkoholipitoisuuksille 20 °C:ssa>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON> 4. KOKONAISUUTOS Kokonaiskuiva-aine 1 MÄÄRITELMÄKokonaisuutos tai kokonaiskuiva-aine sisältää kaikki aineet, jotka eivät haihdu määritellyissä fysikaalisissa olosuhteissa. Näiden fysikaalisten olosuhteiden on oltava sellaiset, että uutoksen muodostavat aineet muuttuvat mahdollisimman vähän.Sokeriton uutos on kokonaisuutoksen ja kokonaissokeripitoisuuden välinen erotus.Vähennetty uutos on kokonaisuutoksen ja 1 g/l ylittävän kokonaissokeripitoisuuden, 1 g/l ylittävän kaliumsulfaattipitoisuuden, mahdollisen mannitolin sekä muiden viiniin mahdollisesti lisättyjen kemikaalien välinen erotus.Jäännösuutos on sokeriton uutos, josta on vähennetty kiinteät hapot, ilmoitettuna viinihappona.Uutos ilmoitetaan grammoina litrassa ja se on määritettävä 0,5 g:n tarkkuudella.2 PERIAATEAinoa menetelmä: densimetrillä mittaaminen.Kokonaisuutos lasketaan epäsuorasti rypälemehun tiheydestä ja alkoholittoman viinin tiheydestä.Uutos ilmoitetaan sakkaroosin määränä, joka veteen liuotettuna ja yhdeksi litraksi täytettynä antaa saman tiheyden kuin rypälemehu tai alkoholiton viini. Tämä määrä saadaan taulukosta I.3 SUORITUS"Alkoholittoman viinin" suhteellinen tiheys d2020 (dr) saadaan yhtälöstä:>TAULUKON PAIKKA>dr voidaan myös laskea viinin tiheydestä ñv ja vesi-etanoliseoksen tiheydestä ña 20 °C:ssa yhtälöllä:dr = 1,0018(ñv   ña) + 1,000,jossa kerroin 1,0018 lähenee käytännössä 1:tä, kun ñv on alle 1,05, mikä on yleisin tapaus.4 TULOSTEN ILMOITTAMINENKäytetään taulukossa I olevia alkoholittoman viinin tiheyttä dr2020 ja rypälemehun tiheyttä d2020 kokonaisuutoksen laskemiseksi grammoina litrassa.Kokonaisuutos ilmoitetaan grammoina litrassa yhdellä desimaalilla.TAULUKKO I >KAAVION ALKU>Kokonaisuutoksen laskemiseksi (grammoina litrassa)>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>5 PELKISTÄVÄT SOKERIT 1 MÄÄRITELMÄPelkistävillä sokereilla tarkoitetaan kaikkia sokereita, jotka osoittavat ketonista tai aldehydistä toimintaa ja joiden määritys perustuu niiden kykyyn pelkistää kuparisuolaa emäksisessä liuoksessa.2 PERIAATE2.1 Kirkastaminen2.1.1 Vertailumenetelmä: neutraloitu ja alkoholiton viini valutetaan asetaattimuodossa anioninvaihtokolonnin läpi, jossa anionit vaihtuvat asetaatti-ioneihin, ja tämän jälkeen se kirkastetaan neutraalilla lyijyasetaatilla.2.1.2 Tavanomainen menetelmä: viini käsitellään toisella seuraavista reagensseista:2.1.2.1 Neutraali lyijyasetaatti2.1.2.2 Sinkki(II)heksasyanoferraatti2.2 Määritys2.2.1 Ainoa menetelmä: tietyn määrän emäksistä kuparisuolaliuosta annetaan reagoida kirkastetun viinin tai rypälemehun kanssa ja määritetään kupari-ionien ylijäämä jodometrisesti.3 KIRKASTAMINENMääritettävän sokeripitoisuuden liuoksessa on oltava välillä 0,5 5 g/l.Kuivaa viiniä ei saa laimentaa kirkastamisen aikana; makea viini on laimennettava kirkastamisen aikana sokeripitoisuuden saattamiseksi mainittujen raja-arvojen välille seuraavan taulukon mukaisesti.>TAULUKON PAIKKA>3.1 Vertailumenetelmä3.1.1 Reagenssit3.1.1.1 Kloorivetyhappoliuos (HCl), 1 M3.1.1.2 Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 1 M3.1.1.3 Etikkahappoliuos (CH3COOH), 4 M3.1.1.4 Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 2 M3.1.1.5 Anioninvaihtohartsi [Dowex 3 (20 50 mesh) tai vastaava hartsi].Anioninvaihtokolonnin valmistaminen. Asetetaan byretin pohjalle pieni lasivillatuppo ja 15 ml anioninvaihtohartsia (3.1.1.5).Ennen käyttöönottoa hartsi on regeneroitava täydellisesti käsittelemällä se kaksi kertaa peräkkäin 1 M kloorivetyhappo- (3.1.1.1) ja natriumhydroksidiliuoksilla (3.1.1.2). Kun hartsi on huuhdottu 50 ml:lla tislattua vettä, se siirretään dekantterilasiin, lisätään 50 ml 1 M etikkahappoliuosta (3.1.1.3) ja sekoitetaan 5 minuutin ajan. Täytetään byretti uudelleen ja valutetaan 100 ml 4 M etikkahappoliuosta (3.1.1.3) kolonnin läpi. (On suositeltavaa pitää varastossa hartsia 4 M etikkahappoliuoksella täytetyssä pullossa.) Pestään kolonnia tislatulla vedellä, kunnes eluaatti on muuttunut neutraaliksi.Hartsin regenerointi. Valutetaan 150 ml 2 M natriumhydroksidiliuosta hartsin läpi happojen ja useimpien hartsiin tarttuneiden väriaineiden poistamiseksi. Huuhdotaan 100 ml:lla vettä, kaadetaan 100 ml 4 M etikkahappoliuosta hartsin läpi. Pestään kolonnia, kunnes eluaatti on neutraali.3.1.1.6 Neutraali lyijyasetaattiliuos (lähes kyllästetty):Neutraali lyijyasetaatti Pb (CH3COO)2 3 H2O 250 gTäytetään 500 ml:ksi hyvin kuumalla vedelläRavistellaan, kunnes lyijyasetaatti liukenee.3.1.1.7 Kalsiumkarbonaatti CaCO33.1.2 Suoritus3.1.2.1 K u i v a t v i i n i tKaadetaan 50 ml viiniä dekantterilasiin, jonka halkaisija on noin 10 12 cm, ja lisätään 1/2 (n   0,5) ml 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.1.2) (n = 0,1 M natriumhydroksidiliuostilavuus, joka kuluu, kun kokonaishapot määritetään 10 lista viiniä.) Haihdutetaan kiehuvassa vesihauteessa kuumassa ilmavirrassa, kunnes nestettä on jäljellä noin 20 ml.Valutetaan 3 ml tätä nestettä asetaattimuodossa olevan anioninvaihtokolonnin (3.1.1.5) läpi joka toinen minuutti. Kerätään eluaatti 100 ml:n mittapulloon. Pestään dekantterilasi ja kolonni kuusi kertaa 10 ml:lla tislattua vettä, lisätään sekoittaen 2,5 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta (3.1.1.6) ja 0,5 g kalsiumkarbonaattia (3.1.1.7), ravistetaan useita kertoja ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan.1 ml tätä suodosta vastaa 0,5 ml:aa viiniä.3.1.2.2 R y p ä l e m e h u t, m i s t e l l e t, m a k e a t j a p u o l i m a k e a t v i i n i tSeuraavat laimennokset ovat ohjeellisia.1) Rypälemehut ja mistelletValmistetaan 10-prosenttinen liuos ja otetaan siitä 10 ml:n näyte.2) Makeat tislausta varten väkevöidyt tai väkevöimättömät viinit, joiden tiheys on välillä 1,005 1,038. Otetaan 20 ml:n näyte 20-prosenttisesta liuoksesta.3) Puolimakeat viinit, joiden tiheys on 0,997 1,005. Otetaan 20 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä.Valutetaan edellä mainittu määrä viiniä tai rypälemehua 3 ml:n erissä asetaattimuodossa olevan anioninvaihtokolonnin läpi joka toinen minuutti. Kerätään eluaatti 100 ml:n mittapulloon, huuhdellaan kolonnia vedellä, kunnes saadaan noin 90 ml eluaattia. Lisätään 0,5 g kalsiumkarbonaattia ja 1 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta. Sekoitetaan ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia aina välillä sekoittaen. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan.Tapauksen mukaan:1) 1 ml suodosta vastaa 0,01 ml:aa rypälemehua tai mistelleä,2) 1 ml suodosta vastaa 0,04 ml:aa makeaa viiniä,3) 1 ml suodosta vastaa 0,20 ml:aa puolimakeaa viiniä.3.2 Tavanomaiset menetelmät3.2.1 Kirkastaminen neutraalilla lyijyasetaatilla3.2.1.1 R e a g e n s s i tNeutraali lyijyasetaattiliuos (lähes kyllästetty) (katso 3.1.1.6).Kalsiumkarbonaatti3.2.1.2 S u o r i t u s3.2.1.2.1 Kuivat viinitKaadetaan 50 ml viiniä 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 1/2 (n-0,5) ml 1 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.1.2); n on 0,1 M natriumhydroksidiliuostilavuus, joka kuluu, kun kokonaishapot määritetään 10 ml:sta viiniä. Lisätään sekoittaen 2,5 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta (3.1.1.6) ja 0,5 g kalsiumkarbonaattia (3.1.1.7), ravistellaan useita kertoja ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan.1 ml suodosta vastaa 0,5 ml:aa viiniä.3.2.1.2.2 Rypälemehut, mistellet ja puolimakeat viinitKaadetaan 100 ml:n mittapulloon määrätty määrä viiniä (tai rypälemehua tai mistelleä) seuraavien ohjeellisten laimennosten mukaisesti:1) Rypälemehut ja mistelletValmistetaan 10-prosenttinen liuos ja otetaan siitä 10 ml:n näyte.2) Makeat väkevöidyt tai väkevöimättömät viinit, joiden tiheys on 1,005 1,038. Otetaan 20 ml:n näyte 20-prosenttisesta liuoksesta.3) Puolimakeat viinit, joiden tiheys on 0,997-1,005. Otetaan 20 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä.Lisätään 0,5 g kalsiumkarbonaattia, noin 60 ml vettä ja 0,5 tai 1 tai 2 ml kyllästettyä lyijyasetaattiliuosta. Sekoitetaan ja annetaan seistä vähintään 15 minuuttia aina välillä sekoittaen. Täytetään merkkiin vedellä. Suodatetaan.Tapauksen mukaan:1) 1 ml suodosta vastaa 0,01 ml:aa rypälemehua tai mistelleä,2) 1 ml suodosta vastaa 0,04 ml:aa makeaa viiniä,3) 1 ml suodosta vastaa 0,20 ml:aa puolimakeaa viiniä.3.2.2 Kirkastaminen sinkki(II)heksasyanoferraatillaTätä kirkastamismenetelmää saa käyttää ainoastaan valkoviiniin, heikosti värillisiin makeisiin viineihin ja rypälemehuihin.3.2.2.1 R e a g e n s s i t3.2.2.1.1 Liuos I: Kalium(II)heksasyanoferraattiliuos>TAULUKON PAIKKA>3.2.2.1.2 Liuos II: Sinkkisulfaattiliuos>TAULUKON PAIKKA>3.2.2.2 S u o r i t u sKaadetaan 100 ml:n mittapulloon määrätty määrä viiniä (tai rypälemehua tai mistelleä) seuraavien ohjeellisten laimennosten mukaisesti:1) Rypälemehut ja mistelletValmistetaan 10-prosenttinen liuos ja otetaan siitä 10 ml:n näyte.2) Makeat tislausta varten väkevöidyt tai väkevöimättömät viinit, joiden tiheys on 1,005 1,038. Otetaan 20 ml:n näyte 20-prosenttisesta liuoksesta.3) Puolimakeat viinit, joiden tiheys on 0,997 1,005. Otetaan 20 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä.4) Kuivat viinitOtetaan 50 ml:n näyte laimentamattomasta viinistä.Lisätään 5 ml kalium(II)heksasyanoferraattiliuosta I (3.2.2.1.1) ja 5 ml sinkkisulfaattiliuosta II (3.2.2.1.2). Sekoitetaan. Täytetään merkkiin vedellä. Odotetaan 10 minuuttia. Suodatetaan.Tapauksen mukaan:1) 1 ml suodosta vastaa 0,01 ml:aa rypälemehua tai mistellea,2) 1 ml suodosta vastaa 0,04 ml:aa makeaa viiniä,3) 1 ml suodosta vastaa 0,20 ml:aa puolimakeaa viiniä.4) 1 ml suodosta vastaa 0,50 ml:aa kuivaa viiniä.4 MÄÄRITYS4.1 Reagenssit4.1.1 Emäksinen kuparisuolaliuos>TAULUKON PAIKKA>Liuotetaan kuparisulfaatti 100 ml:aan vettä, sitruunahappo 300 ml:aan vettä ja natriumkarbonaatti 300 400 ml:aan lämmintä vettä. Sekoitetaan sitruunahappo- ja natriumkarbonaattiliuokset. Lisätään kuparisulfaattiliuos ja täytetään yhdeksi litraksi.4.1.2 30 % kaliumjodidiliuos>TAULUKON PAIKKA>Säilytetään värillisessä lasipullossa.4.1.3 25 % rikkihappo>TAULUKON PAIKKA>Happo kaadetaan varovasti veteen, annetaan jäähtyä ja täytetään 100 ml:ksi.4.1.4 5 g/l tärkkelysliuosSekoitetaan 5 g tärkkelystä noin 500 ml:aan vettä. Kuumennetaan kiehuvaksi koko ajan sekoittaen ja annetaan kiehua noin 10 minuuttia. Lisätään 200 g natriumkloridia (NaCl). Täytetään yhdeksi litraksi jäähtymisen jälkeen.- Natriumtiosulfaattiliuos, 0,1 M- Inverttisokeriliuos, 5 g/l:käytetään määritysmenetelmän tarkastamiseen.Mitataan 200 ml:n mittapulloon seuraavat aineet>TAULUKON PAIKKA>Pidetään mittapulloa 60 °C:ssa vesihauteessa, kunnes liuoksen lämpötila on 50 °C ja pidetään tämä lämpötila 15 minuutin ajan. Annetaan pullon jäähtyä 30 minuuttia itsekseen ja tämän jälkeen jäähdytetään kylmässä vesihauteessa. Siirretään liuos 1 l:n mittapulloon. Täytetään litraksi. Tämä liuos säilyy käyttökelpoisena yhden kuukauden ajan. Käyttöön otettaessa neutraloidaan määritettävä näyte (tämä liuos on noin 0,06 M happo) natriumhydroksidiliuoksella.4.2 SuoritusMitataan 300 ml:n mittapulloon 25 ml emäksistä kuparisuolaliuosta, 15 ml vettä ja 10 ml kirkastettua liuosta, joka saa sisältää enintään 60 mg inverttisokeria.Lisätään muutamia hohkakivirakeita. Yhdistetään pystyjäähdyttimeen ja kuumennetaan kiehumispisteeseen 2 minuutin kuluessa. Annetaan kiehua tarkalleen 10 minuuttia.Jäähdytetään välittömästi kylmässä juoksevassa vedessä. Kun liuos on jäähtynyt täysin, lisätään 10 ml 30-prosenttista kaliumjodidiliuosta (4.1.2), 25 ml 25-prosenttista rikkihappoa (4.1.3) ja 2 ml tärkkelysliuosta (4.1.4).Titrataan 0,1 M natriumtiosulfaattiliuoksella (4.1.5). n = käytetty millilitramäärä.Tehdään myös sokeakoe, jossa 10 ml sokeriliuosta korvataan 10 ml:lla tislattua vettä. n' = titraukseen käytetty tiosulfaatin määrä.4.3 Tulosten ilmoittaminen4.3.1 LaskutoimituksetMääritettävän näytteen sisältämä sokerimäärä, inverttisokerina ilmoitettuna, annetaan jäljempänä olevassa taulukossa käytetyn tiosulfaatin n'   n millilitramäärän funktiona.Viinin sokeripitoisuus inverttisokeria grammoina litrassa on ilmoitettava yhdellä desimaalilla ottaen huomioon kirkastamisen aikana suoritetut laimennukset ja määritettävän näytteen tilavuus.4.3.2 Toistettavuus>TAULUKON PAIKKA>4.3.3 Uusittavuus>TAULUKON PAIKKA>>TAULUKON PAIKKA>6 SAKKAROOSI 1 PERIAATEI Kvalitatiivinen koemenetelmä ohutlevykromatografialla. Sakkaroosi erotetaan muista sokereista selluloosalla päällystetyllä levyllä ja täplä kehitetään urea-kloorivetyhapporeagenssilla 105 °C:ssa lämpökaapissa.II Koe- ja määritysmenetelmä suuren erotuskyvyn nestekromatografialla. Sakkaroosi erotetaan sidostetulla alkyyliamiinisilikakolonnilla, ja määritetään refraktometrillä. Tulos suhteutetaan samoissa koeolosuhteissa määritettyyn ulkoisena standardina käytettyyn aineeseen.Huomautukset:Rypälemehun tai viinin aitous voidaan tarkistaa deuterium NMR-menetelmällä, joka on kuvattu rypälemehujen, puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen ja viinien väkevöinnin osoittamiseksi.Sakkaroosin toteamiseksi ja määrittämiseksi voidaan käyttää myös 42 luvun f kohdassa kuvattua kaasukromatografiaa.2 KVALITATIIVINEN MENETELMÄ OHUTLEVYKROMATOGRAFIALLA2.1 Laitteet2.1.1 Selluloosalla päällystettyjä kromatografialevyjä2.1.2 Kromatografiakammio2.1.3 Mikroruisku tai mikropipetti2.1.4 Lämpökaappi, joka voidaan säätää 105 °C ± 2 °C:seen2.2 Reagenssit2.2.1 Aktiivihiili värin poistoon2.2.2 Liikkuva faasi: dikloorimetaani - jääetikka (ñ20 = 1,05 g/ml) - etanoli - metanoli - vesi (50:25:9:6:10).2.2.3 Kehitin>TAULUKON PAIKKA>2.2.4 Vertailuliuos>TAULUKON PAIKKA>2.3 Suoritus2.3.1 Näytteen valmistaminenJos rypälemehun tai viinin väri on voimakas, väri poistetaan aktiivihiilikäsittelyllä.Kun kyseessä on puhdistettu tiivistetty rypälemehu käytetään liuosta, jonka sokeripitoisuus on 25 % (m/m) (25°Brix) ja joka on valmistettu luvussa "pH:n määrittäminen" olevassa 4.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla, ja laimennetaan mittapullossa 25 ml liuosta vedellä 100 ml:ksi.2.3.2 KromatografointiAnnostellaan 2,5 cm:n etäisyydelle levyn alareunasta:- 10 ìl näytettä,- 10 ìl vertailuliuosta.Asetetaan levy liikkuvan faasin höyryllä kyllästettyyn kromatografiakammioon ja annetaan nesteen nousta 1 cm:n etäisyydelle yläreunasta. Nostetaan levy pois ja kuivataan se lämpimässä ilmavirrassa. Toistetaan ajo kaksi kertaa ja kuivataan levy molemmilla kerroilla. Sumutetaan levylle tasaisesti 15 ml kehitintä ja pidetään sitä 105 °C:ssa lämpökaapissa 5 minuuttia.2.4 TuloksetSakkaroosi ja fruktoosi näkyvät tummansinisinä täplinä valkoisella taustalla; glukoosin täplä on heikosti vihertävä.3 KOE- JA MÄÄRITYSMENETELMÄ SUUREN EROTUSKYVYN NESTEKROMATOGRA-FIALLAKromatografiset olosuhteet ovat ohjeellisia.3.1 Laitteet3.1.1 Suuren erotuskyvyn nestekromatografi, jossa on:1) 10 ìl injektointiluuppi,2) detektori, differentiaalinen refraktometri tai interferometri-refraktometri,3) sidostettu alkyyliamiinisilikakolonni (pituus 25 mm ja sisähalkaisija 4 mm),4) samalla faasilla täytetty esikolonni,5) valmius esikolonnin ja kolonnin eristämiseksi ja lämpötilan pysyttämiseksi (30 °C),6) piirturi ja mahdollisesti integraattori,7) liikkuvan faasin virtausnopeus: 1 ml/min.3.1.2 Kalvosuodatuslaitteisto (0,45 ìm)3.2 Reagenssit3.2.1 Kahdesti tislattu vesi3.2.2 Asetonitriili (CH3CN), HPLC-laatu3.2.3 Liikkuva faasi: asetonitriili vesi, suodatettu kalvon (0,45 ìm) läpi, (80 20 v/v).Liikkuvasta faasista on poistettava kaasu ennen sen käyttöä.3.2.4 Vertailuliuos: sakkaroosin vesiliuos 1,2 g/l. Suodatetaan kalvon (0,45 ìm) läpi.3.3 Suoritus3.3.1 Näytteen valmistaminen- Viinit ja rypälemehut.Suodatetaan kalvon (0,45 ìm) läpi.- Puhdistetut tiivistetyt rypälemehut.Käytetään liuosta, joka on valmistettu laimentamalla puhdistettu tiivistetty rypälemehu 40 %:ksi (m/v) luvussa "Kokonaishappopitoisuus" olevassa 5.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla ja suodatettu kalvon (0,45 ìm) läpi.3.3.2 Kromatografinen määrittäminenInjektoidaan kromatografiin vuorotellen 10 ìl vertailuliuosta ja 10 ìl 3.3.1 kohdassa kuvatulla tavalla valmistettua näytettä. Toistetaan injektoinnit samassa järjestyksessä.Tulostetaan kromatogrammi.Sakkaroosin retentioaika on noin 10 minuuttia.3.4 LaskutoimituksetLaskutoimituksissa käytetään vertailuliuoksen ja näytteen kahden määrityksen tulosten keskiarvoa.3.4.1 Viinit ja rypälemehutLasketaan pitoisuus grammoina litrassa.3.4.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehutC g/l on 40 % (m/v) puhdistetun tiivistetyn rypälemehuliuoksen sakkaroosipitoisuus.Puhdistetun tiivistetyn rypälemehun sakkaroosipitoisuus grammoina kilogrammassa: 2,5 × C.3.5 Tulosten ilmoittaminenViinien, rypälemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen sakkaroosipitoisuus ilmoitetaan grammoina litrassa (viinit ja rypälemehut) ja grammoina kilogrammassa (puhdistetut tiivistetyt rypälemehut) yhdellä desimaalilla.7 GLUKOOSI JA FRUKTOOSI 1 MÄÄRITELMÄGlukoosi ja fruktoosi voidaan määrittää erikseen entsymaattisella menetelmällä, jonka ainoa tavoite on glukoosi/fruktoosi -suhteen laskeminen.2 PERIAATEGlukoosi tuottaa adenosiinitrifosforihapon kanssa (ATP) heksokinaasilla (HK) katalysoidussa entsymaattisessa reaktiossa glukoosi-6-fosfaattia (G6P) ja fruktoosi fruktoosi-6-fosfaattia (F6P).glukoosi + ATP>KAAVION ALKU>HK>KAAVION LOOPU>G6P + ADPfruktoosi + ATP>KAAVION ALKU>HK>KAAVION LOOPU>F6P + ADPAluksi glukoosi-6-fosfaatti hapetetaan nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatilla (NADP) glukonaatti-6-fosfaatiksi glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi-entsyymin (G6PDH) läsnäollessa. Pelkistyneen nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatin (NADPH) määrä vastaa glukoosi-6-fosfaatin määrää eli glukoosin määrää.G6P + NADP+>KAAVION ALKU>G6PDH>KAAVION LOOPU>Glukonaatti-6-fosfaatti + NADPH + H+Pelkistynyt nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatti määritetään mittaamalla absorptio 340 nm:ssä.Reaktion päättyessä fruktoosi-6-fosfaatti muutetaan fosfoglukoosi-isomeraasilla (PGI) glukoosi-6-fosfaatiksi.F6P>KAAVION ALKU>PGI>KAAVION LOOPU>G6Plukoosi-6-fosfaatti reagoi jälleen nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatin kanssa ja tuottaa glukonaatti-6-fosfaattia ja pelkistynyttä nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaattia: jälkimmäinen määritetään.3 LAITTEET- Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittaus 340 nm:ssä, jossa NADPH:n absorptio on suurin. Jos kyseessä ovat absoluuttiset mittaukset (ei käytetä kalibrointisarjoja, vaan NADPH:n ekstinktiokerrointa), laitteen aallonpituus- ja absorbanssiarvot on tarkistettava.Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään spektrofotometriä, josta saadaan epäjatkuva spektri ja jolla voidaan tehdä mittauksia 334 tai 365 nm:ssä.- Lasikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm tai kertakäyttöisiä kyvettejä.- Entsymaattisissa kokeissa käytettäviä pipettejä, 0,02 - 0,05 - 0,1 - 0,2 ml.4 REAGENSSIT4.1 Liuos 1: puskuriliuos (trietanoliamiini 0,3 M: pH = 7,6; 4 × 10-3M, Mg2+). 150 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 11,2 g trietanoliamiinihydrokloridia ((C2H5)3N × HCl) ja 0,2 g MgSO4 × 7 H2O, lisätään noin 4 ml 5 M natriumhydroksidiliuosta (NaOH) pH:n säätämiseksi arvoon 7,6 ja täytetään 200 ml:ksi.Tätä standardiliuosta voi säilyttää 4 viikkoa + 4 °C:ssa.4.2 Liuos 2: nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaatti-liuos (noin 11,5 × 10-3M): 5 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 50 mg dinatrium nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi-fosfaattia.Liuos säilyy 4 viikkoa + 4 °C:ssa.4.3 Liuos 3: adenosiini-5'-trifosfaatti -liuos (noin 81 × 10-3M): 5 ml:aan kahdesti tislattua vettä liuotetaan 250 mg dinatrium adenosiini-5'-trifosfaattia ja 250 mg natriumvetykarbonaattia NaHCO3.Liuos säilyy 4 viikkoa + 4 °C:ssa.4.4 Liuos 4: Heksokinaasi/glukoosi-6-fosfaatti-dehydraasi: sekoitetaan 0,5 ml heksokinaasia (2 mg proteiinia/ml tai 280 U/ml) ja 0,5 ml glukoosi-6-fosfaatti-dehydraasia (1 mg proteiinia/ml).Liuos säilyy yhden vuoden + 4 °C:ssa.4.5 Liuos 5: Fosfoglukoosi-isomeraasi (2 mg proteiinia/ml tai 700 U/ml). Liuosta käytetään laimentamattomana.Liuos säilyy vuoden + 4 °C:ssa.Huomautus:Kaikkia määrityksessä tarvittavia reagensseja on kaupallisesti saatavilla.5 SUORITUS5.1 Näytteen valmistaminenArvioidun glukoosi + fruktoosimäärän/l mukaan tehdään seuraavat laimennukset:>TAULUKON PAIKKA>5.2 MääritysTehdään mittaukset 340 nm:n aallonpituudelle säädetyllä spektrofotometrillä vertailuna ilma (ei kyvetti) tai vesi.Lämpötila 20-25 °C.Annostellaan kahteen 1 cm:n kyvettiin:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan ja luetaan liuosten absorbanssi (A1) noin 3 minuutin kuluttua. Käynnistetään reaktio lisäämällä:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan; odotetaan 15 minuuttia; luetaan absorbanssi ja tarkistetaan, että reaktio on tapahtunut loppuun 2 minuutin kuluttua (A2).Lisätään välittömästi:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan; luetaan absorbanssi 10 minuutin kuluttua; tarkistetaan, että reaktio on tapahtunut loppuun 2 minuutin kuluttua (A3).Lasketaan absorbanssin erotukset vertailu- ja määritysliuoksille:A2   A1 vastaa glukoosia,A3   A2 vastaa fruktoosia,Lasketaan absorbanssien erotukset vertailu-(ÄAV) ja määritysliuoksille (ÄAM), jolloin saadaan>TAULUKON PAIKKA>Huomautus:Entsyymiaktiivisuuden loppuunsaattamiseen tarvittava aika voi vaihdella erästä toiseen. Edellä annettu arvo on vain ohjeellinen. On suositeltavaa määrittää aika erikseen jokaiselle erälle.5.3 Tulosten ilmoittaminen5.3.1 LaskeminenKonsentraatioiden yleinen laskentakaava on:C = >NUM>V × MP/>DEN>å × d × v × 1000 Ä A(g/l)jossa>TAULUKON PAIKKA>Saadaan:>TAULUKON PAIKKA>Jos näyte on laimennettu valmistamisen yhteydessä, tulos kerrotaan laimennuskertoimella F.Huomautus:Jos mittaukset on tehty aallonpituuksilla 334 tai 365 nm, saadaan:- mittaus 334 nm:ssä: Ó = 6,2 (mmol-1 × 1 × cm-1)>TAULUKON PAIKKA>- mittaus 365 nm:ssä: Ó = 3,4 (mmol-1 × 1× cm-1)>TAULUKON PAIKKA>5.3.2 Toistettavuus (r)r = 0,056x15.3.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>8 RYPÄLEMEHUJEN, TIIVISTETTYJEN RYPÄLEMEHUJEN, PUHDISTETTUJEN TIIVISTETTYJEN RYPÄLEMEHUJEN JA VIININ VÄKEVÖINNIN HAVAITSEMINEN DEUTERIUMIN YDINMAGNEETTISTA RESONANSSIA SOVELTAMALLA 1 MÄÄRITELMÄKäymisen jälkeen rypälemehussa ollut veden ja sokerien sisältämä deuterium jakautuu uudelleen viinissä molekyyleihin I, II, III ja IV:>TAULUKON PAIKKA>Väkevöinti sokeria lisäämällä (chaptalisation) ennen rypälemehun käymistä vaikuttaa deuteriumin jakautumiseen.Verrattaessa saman alueen luonnollisen vertailuviinin parametrien arvoihin, väkevöinti sokerilla johtaa seuraaviin muutoksiin:>TAULUKON PAIKKA>(D/H)I: isotooppisuhde, joka liittyy molekyyliin I(D/H)II: isotooppisuhde, joka liittyy molekyyliin II(D/H)QW: veden isotooppisuhde viinissä.R = 2(D/H)II/(D/H)I ilmaisee deuteriumin suhteellisen jakautumisen molekyyleissä I ja II: R mitataan suoraan signaalien h-voimakkuudesta ja tällöin R = 3hII/hI.(D/H)I on tunnusomainen erityisesti sokerin yhteyttäneelle kasvilajille ja vähemmässä määrin satopaikan maantieteelliselle sijainnille (fotosynteesin aikana käytetyn veden laatu).(D/H)II kuvaa viinirypäleiden tuotantopaikan ilmasto-oloja (sadeveden luonne ja sääolosuhteet) ja vähemmässä määrin alkuperäisen rypälemehun sokerikonsentraatiota.(D/H)QW kuvaa tuotantopaikan ilmasto-oloja ja alkuperäisen rypälemehun sokeripitoisuutta.2 PERIAATEEdellä määritellyt parametrit [R, (D/H)I, (D/H)II] määritetään deuteriumin ydinmagneettisella resonanssilla viinistä, tai rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun annetuissa olosuhteissa saaduista käymistuotteista erotetusta etanolista. Määritystä voidaan mahdollisesti täydentää määrittämällä viinistä erotetun veden isotooppisuhde, (D/H)QW ja määrittämällä 13C/12C isotooppisuhde etanolista.Kunnes perustetaan yhteisön tietopankki:- viineistä tuotantovyöhykkeillä otettujen tarkastusnäytteiden mukana on oltava samaa alkuperää olevat (maantieteellinen paikka ja vuosikerta) luonnolliset vertailunäytteet (vähintään kolme); näitä näytteitä otetaan kolme sarjaa.- rypälemehujen, tiivistettyjen rypälemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen vertailunäytteet (vähintään kolme) kerätään samaa alkuperää olevista (maantieteellinen paikka ja vuosikerta) luonnollisista rypälemehuista.Yhteisön tietopankin perustamiseen saakka jäsenvaltiot voivat käyttää väliaikaisesti kansallista tietopankkia omalla alueellaan valmistettujen tuotteiden tarkastuksessa.3 NÄYTTEEN VALMISTAMINEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN3.1 Etanolin ja veden erottaminen viinistäHuomautus: Etanolin erottamiseen voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää sillä edellytyksellä, että 98 98,5 % viinin sisältämästä kokonaisalkoholista saadaan yhteen tisleeseen, jonka alkoholipitoisuus on 92 93 massa-% (95 til-%).3.1.1 Laitteet ja reagenssit- Laitteisto etanolin erottamiseksi (kuva 1), jossa on- tehonsäätimellä varustettu sähköhaude,- 1 litran vetoinen hioksellinen keittopullo,- Cadiot-kolonni, jossa on pyörivä läpivienti (liikkuva osa teflonia),- hioksellisia 125 ml:n erlenmeyerkolveja,- muovitulpallisia 125 ja 60 ml:n pulloja.- Reagensseja veden määrittämiseen Karl Fischerin menetelmällä (esimerkiksi Merck 9241 ja 9243).3.1.2 Suoritus3.1.2.1 Määritetään viinin alkoholipitoisuus (tv) vähintään 0,05 til-%:n tarkkuudella.3.1.2.2 E t a n o l i n e r o t t a m i n e nMitataan 500 ml:n homogeeninen näyte alkoholipitoisuudeltaan tv olevaa viiniä noin 0,9 vakiopalautussuhteen omaavan tislauslaitteen tislauskolviin. Asetetaan aiemmin taarattu tisleen keräykseen tarkoitettu 125 ml:n hioksellinen erlenmeyerpullo paikoilleen. Kerätään 78,0 78,2 °C:ssa kiehuva neste, eli noin 40 60 ml. Jos lämpötila on yli 78,5 °C, keskeytetään keräys viideksi minuutiksi.Kun lämpötila on palautunut 78 °C:seen, jatketaan tisleen keräystä 78,5 °C:seen saakka ja suoritus toistetaan, kunnes lämpötila keräyksen keskeyttämisen jälkeen suljetussa järjestelmässä ei enää muutu. Täydellinen tislaus kestää noin 5 tuntia. Tällä periaatteella voidaan kerätä 98 98,5 % viinin kokonaisalkoholista tisleeseen, jonka alkoholipitoisuus on 92 93 massa-% (95 til-%). Jäljempänä 4 kohdassa kuvatut NMR-olosuhteet on vahvistettu tälle pitoisuudelle.Kerätty etanoli punnitaan.Tislausjäännöksen 60 ml:n suuruinen homogeeninen näyte säilytetään 60 ml:n mittapullossa ja se edustaa viinissä olevaa vettä. Sen isotooppisuhde määritetään tarvittaessa.Huomautus:Jos käytettävissä on spektrometri, joka on varustettu 10 mm:n näyteputkella (katso kuva 4), 300 ml:n suuruinen homogeeninen viininäyte on riittävä.3.1.2.3 U u t e t u n a l k o h o l i n a l k o h o l i p i t o i s u u d e n m ä ä r i t t ä m i n e nNoin 0,5 ml:n alkoholinäytteen, jonka massa p on tarkalleen tunnettu, vesipitoisuus, p'g, määritetään Karl Fischerin menetelmällä.>VIITTAUS KAAVIOON>Etanolin alkoholipitoisuus painoprosentteina saadaan kaavastatDm = >NUM>p - p'/>DEN>p × 1003.2 Rypälemehujen, tiivistettyjen rypälemehujen ja puhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen fermentointi3.2.1 Laitteet ja reagenssit- viinihappo,- Bacto Yeast Nitrogen, Base without amino acids DIFCO,- aktiivisia kuivahiivoja (Saccharomyces cerevisiae).Jos veden isotooppisuhde rypälemehussa on tunnettu, hiivat voidaan aktivoida etukäteen uudelleen pienessä määrässä tislaamatonta haaleaa vettä (1 g/50 ml), jotta isotooppisuhde pysyisi lähellä viinin sisältämän veden isotooppisuhdetta.Jos veden isotooppisuhde viinissä ei ole tunnettu, on suositeltavaa siirrostaa suoraan.Käytettävien kuivahiivojen määrä on noin 1 g eli noin 1010 solua/1 l rypälemehua.Vetoisuudeltaan 1,5 l oleva käymisastia, joka on varustettu astian ilmatiiviinä pitävällä osalla ja jolla alkoholihöyryt voidaan tiivistää, sillä etanolia ei saa hävitä käymisen aikana. Sokeri on fermentoitava etanoliksi vähintään 98 %:n saannolla.3.2.2 Suoritus3.2.2.1 R y p ä l e m e h u t- Tuoreet rypälemehutMitataan käymisastiaan 1 l rypälemehua, jonka käymiskykyisten sokerien konsentraatio on ennalta määritetty. Lisätään 1 g etukäteen aktivoitua kuivahiivaa. Asetetaan ilmatiiviyden pitävä osa paikoilleen. Annetaan käydä noin 20 °C:n lämpötilassa, kunnes sokerit ovat käyneet loppuun. Kun käymistuotteen alkoholipitoisuus on määritetty ja sokerien käymisaste alkoholiksi laskettu, käymisliuos sentrifugoidaan ja tislataan etanolin erottamiseksi.- Rypälemehut, joissa käyminen on estetty rikkidioksidia lisäämälläPoistetaan rikki hieman yli 1 l:n (1,2 l) rypälemehumäärästä kuplittamalla typpeä rypälemehun läpi kuumassa vesihauteessa 70-80 °C:ssa palautusjäähdyttimen alla, kunnes kokonaisrikkidioksidipitoisuus on alle 200 mg/l. Veden haihtumisesta aiheutuva rypälemehun väkevöityminen on estettävä käyttämällä tehokasta jäähdytintä.Mitataan käymisastiaan 1 l rypälemehua, josta rikki on poistettu, ja jatketaan suoritusta samalla tavoin kuin tuoreella rypälemehulla.Huomautus:Jos rypälemehun rikittämiseen käytetään natriummetabisulfiittia, rypälemehuun on lisättävä ennen rikin poistamista 0,25 ml väkevää rikkihappoa (ñ20 = 1,84 g/ml) rypälemehulitraan käytettyä metabisulfiittigrammaa kohti.3.2.2.2 T i i v i s t e t y t r y p ä l e m e h u tMitataan käymisastiaan V ml tiivistettyä rypälemehua, joka sisältää tunnetun määrän sokeria, noin 170 g. Täytetään tilavuus 1 l:ksi (1 000 - V) ml:lla vettä, jonka isotooppisuhde on sama kuin luonnollisen vertailurypälemehun sisältämän veden isotooppisuhde. Siirrostetaan 3.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla. Lisätään 3 g Bacto Yeast Nitrogen Base without amino acids DIFCO. Homogenoidaan ja jatketaan suoritusta edellä kuvatulla tavalla.3.2.2.3 P u h d i s t e t u t t i i v i s t e t y t r y p ä l e m e h u tEdetään 3.2.2.2 kohdassa kuvatulla tavalla täyttämällä tilavuus 1 l:ksi (1 000 - V) ml:lla vettä, jonka isotooppisuhde on sama kuin luonnollisen vertailurypälemehun, johon on liuotettu 3 g viinihappoa, sisältämän veden isotooppisuhde.Huomautus:Säästetään 50 ml:n näyte rypälemehusta tai rypälemehusta, josta rikki on poistettu, tai tiivistetystä rypälemehusta tai puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta, jotta voidaan tarvittaessa erottaa vesi ja määrittää sen isotooppisuhde (D/H)QW.Rypälemehujen sisältämä vesi voidaan erottaa aseotrooppisella tislauksella käyttäen tolueenia.3.3 Alkoholinäytteen valmistaminen NMR-mittausta varten3.3.1 ReagenssitN,N-tetrametyyliurea (TMU): käytetään TMU-vertailunäytettä, jonka isotooppisuhde D/H on tunnettu ja tarkistettu. Tämän näytteen voi toimittaa:Directorate-General for Science, Research and DevelopmentCommunity Bureau of References200 rue de la Loi,B-1049 BrusselsBelgia3.3.2 Suoritus- Halkaisijaltaan 15 mm oleva NMR-näyteputki:Mitataan taarattuun pulloon 7 ml:aa 3.1.2 kohdan mukaisesti saatua alkoholia ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella, mA; tämän jälkeen otetaan 3 ml:aa sisäistä standardia (TMU) ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella, mst. Homogenoidaan seos ravistelemalla.- Halkaisijaltaan 10 mm oleva NMR-näyteputki:Riittävä määrä on 3,2 ml alkoholia ja 1,3 ml TMU:ta.Spektrometrin ja käytetyn näyteyksikön mukaan (ks. 4 kohta) lisätään riittävä määrä heksafluorobentseeniä kenttätaajuuden stabilointiaineeksi (lock).>TAULUKON PAIKKA>3.4 Vesinäytteen valmistaminen NMR-mittausta varten isotooppisuhteen määrittämiseksi3.4.1 ReagenssitN,N-tetrametyyliurea (TMU): ks. 3.3.1.3.4.2 SuoritusMitataan taarattuun pulloon 3 ml 3.1.2 tai 3.2 (huomautus) kohdan mukaista vettä; punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella, m'E; tämän jälkeen lisätään 4 ml sisäistä standardia (TMU) ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella. Homogenoidaan ravistelemalla.Huomautus:Jos laboratoriossa on massaspektrometri isotooppisuhteen määrittämiseen, tämä määritys voidaan tehdä tällä laitteella NMR-spektrometrin kuormituksen vähentämiseksi. On tarpeen kalibroida TIV-suhde (5.2) jokaiselle tutkitulle viinisarjalle.4 ALKOHOLIN JA VEDEN (2) H NMR-SPEKTRIEN TULOSTAMINENIsotooppisten parametrien määrittäminen.4.1 Laitteet- NMR-spektrometri, joka on varustettu erityisellä "deuterium" näyteyksiköllä, joka on viritetty B°-kentälle (esimerkiksi kun B° = 7,05 T niin V° = 46,05 MHz ja kun B° = 9,4 T niin V° = 61,4 MHz) tyypilliselle taajuudelle V°, ja jossa on protonin irtautuskanava B2 ja kenttä-frekvenssisuhteen stabilointikanava (lock) fluorin frekvenssillä. Spektristä mitattu resoluutio muunnetaan ilman eksponenttikerrointa (toisin sanoen LB = 0) (kuva 2 b) ja ilmoitetaan etanolin metyyli- ja metyleenisignaalien ja TMU:n metyylisignaalin puolileveytenä, ja sen on oltava alle 0,5 Hz.Herkkyyden, joka mitataan eksponenttikertoimella LB = 2 (kuva 2 a), on oltava vähintään 150 95 til-%:ssa (93,5 massa-%) alkoholissa olevan etanolin metyylisignaalille. Näissä koeolosuhteissa signaalin korkeusmittauksen luotettavuusväli, joka on laskettu 97,5 %:n todennäköisyydelle (yksipuolinen koe) ja 10 spektrin toistolle, on 0,35 %.- Automaattinen näytteenvaihtaja (mahdollisesti).- Tietokoneohjelma tulosten käsittelyyn.- Spektrometrin ominaisuuksien mukaan 15 mm:n ja 10 mm:n näyteputkia.4.2 Spektrometrin kalibrointi ja tarkistus4.2.1 AsetuksetTehdään valmistajan antamien ohjeiden mukaiset tavalliset homogeenisuuden ja herkkyyden asetukset.4.2.2 Kalibroinnin tarkastaminenKäytetään vertailuetanoleja, jotka merkitään kirjaimilla C (ruokosokerietanoli), V (viinietanoli) ja B (juurikasetanoli) ja joiden isotooppipitoisuus on erilainen, mutta tarkalleen mitattu. Näillä tarkoitetaan C: ruoko- tai maissisokerialkoholi; V: viinialkoholi ja B: juurikasalkoholi. Yhteisön vertailumittaustoimisto toimittaa nämä näytteet.Määritetään näiden alkoholien isotooppiarvot 4.3 kohdassa kuvatun menettelyn mukaisesti ja merkitään ne Cmeas, Vmeas, Bmeas (ks. 5.3).Verrataan näitä vastaaviin vertailuarvoihin ja merkitään alaindekseillä Cst, Bst, Vst (ks. 5.3).>VIITTAUS KAAVIOON>Kuva 2aViinin sisältämän etanolin ja sisäisen standardin(TMU: N,N-tetrametyyliurea) 2H NMR-spektri>VIITTAUS KAAVIOON>Kuva 2bVastaavissa olosuhteissa kuin kuva 2 a, mutta ilmaneksponenttikerrointa (LB = 0) ajettu etanolin 2H spektri.Jokaisen spektrin keskimäärin 10 toistosta saadun toistettavuuden keskihajonnan on oltava alle 0,01 suhteelle R ja alle 0,3 ppm (D/H)I:lle ja (D/H)II:lle.Eri isotooppiparametrien [R, (D/H)I, (D/H)II] keskiarvojen on oltava vastaavan, yhteisön vertailumittaustoimiston kolmen vertailualkoholin parametreille ilmoittaman toistettavuuden keskihajonnan rajoissa. Jos näin ei ole, on kalibrointi tehtävä uudelleen.4.3 NMR-spektrien määritysolosuhteetKaadetaan 3.3 kohdan mukaisesti valmistettu alkoholinäyte (tai 3.4 kohdan mukaisesti valmistettu vesinäyte) 15 tai 10 mm:n putkeen ja asetetaan näyteyksikköön.NMR-spektrien määritysolosuhteet ovat seuraavat:- Näyteputken lämpötilan (esimerkiksi 302 K) on säilyttävä vakiona.- Vähintään 6,8 sekunnin keräämisaika 1 200 Hz:n spektrin leveydellä (16 K muisti), eli noin 20 ppm 61,4 MHz:ssä tai 27 ppm 46,1 MHz:ssä.- Pulssi: 90°.- Keräämisajan asetus: arvon on oltava samaa luokkaa kuin näytepisteiden poimintaväli (dwell time).- neliöllinen ilmaiseminen: säädetään "offset" 01 etanolille signaalien OD ja CHD välillä ja vedelle signaalien HOD ja TMU välillä.- Määritetään irtautus-offset 02 protonispektristä, joka on mitattu saman putken irtautuskäämillä. Hyvä irtautus saavutetaan, kun 02 on CH3- ja CH2- -ryhmien frekvenssi-intervallin keskellä. Käytetään laajakaistaista irtautusmenetelmää.Jokaista spektriä kohti tehdään sellainen määrä NS-summauksia, että saadaan 4.1. kohdassa annettu signaali-kohinasuhde ja tämä NS-summaussarja toistetaan NE = 10 kertaa. NS-arvot riippuvat käytetystä spektrometristä ja näyteyksiköstä (ks. 4 kohta). Voidaan valita esimerkiksi:>TAULUKON PAIKKA>5 TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 EtanoliMääritetään kaikille 10 spektrille (ks. etanolin NMR-spektri, kuva 2a):- R = 3 >NUM>hII/>DEN>hI = 3 × >NUM>signaalin II korkeus (CH3CHD OH)/>DEN>signaalin I korkeus (CH2D CH2OH)- (D/H)I = 1,5866 × TI × >NUM>mst/>DEN>mA × >NUM>(D/H)st/>DEN>tmD- (D/H)II = 2,3799 × TII × >NUM>mst/>DEN>mA × >NUM>(D/H)st/>DEN>tmDjoissa- TI = >NUM>signaalin I korkeus (CH2D CH2OH)/>DEN>sisäisen standardin (TMU) signaalin korkeus- TII = >NUM>signaalin II korkeus (CH3T CHD OH)/>DEN>sisäisen standardin (TMU) signaalin korkeus- CH3CHDOH mst ja mA, ks. 3.3.2.- tmD se 3.1.2.3.- (D/H)st = sisäisen standardin (TMU) isotooppisuhde, joka on merkitty yhteisön vertailumittaustoimiston toimittamaan pulloon.Käytettäessä piikkien korkeuksia niiden pinta-alojen asemasta, mikä on epätarkempaa, piikin puolileveyden on oltava sama kuin pinta-alan. Tämä antaa kohtuullisen hyvän arvion (kuva 2b).5.2 VesiMääritettäessä veden isotooppisuhdetta vesi-TMU-seoksesta NMR-menetelmällä käytetään seuraavaa suhdetta:- (D/H)WQ = 0,9306 × TIV × >NUM>m'st/>DEN>m'E × (D/H)stjossa- TIV = >NUM>Viinistä erotetun veden (HOD) signaalin pinta-ala/>DEN>Sisäisen standardin (TMU) signaalin pinta-ala- m'st ja m'E ks. 3.4.2.- (D/H)st = sisäisen standardin (TMU) isotooppisuhde, joka on merkitty yhteisön vertailumittaustoimiston toimittamaan pulloon.5.3 Jokaiselle isotooppiparametrille lasketaan 10 määrityksen keskiarvo ja luotettavuusväli.Spektrometrin tietokone täydennettynä sopivalla lisäohjelmistolla (esimerkiksi SNIF-NMR) antaa mahdollisuuden suorittaa nämä laskutoimitukset suoraan.Huomautus:Jos spektrometrin asetusten säätämisen jälkeen vertailualkoholien tyypillisille isotoopeille saatujen keskiarvojen (4.2.2) ja yhteisön vertailumittaustoimiston antamien arvojen välillä on järjestelmällinen ero keskihajonnan rajoissa, oikean arvon saamiseksi mille tahansa näytteelle X voidaan tehdä seuraavat korjaukset.Interpolaatio tehdään ottamalla näytteen X arvon ympärillä olevat vertailunäytearvot.(D/H)XmesI on mitattu arvo ja (D/H)XcorrI on korjattu arvo. Tästä saadaan:(D/H)XcorrI = (D/H)Bst + á [(D/H)XmesI - (D/H)BmesI]jossa á = >NUM>(D/H)VstI × (D/H)BstI/>DEN>(D/H)VmesI × (D/H)BmesIEsimerkki:Yhteisön vertailumittaustoimiston toimittamat ja määrittämät vertailunäytteet:(D/H)VstI = 102,0 ppm (D/H)BstI = 91,95 ppmLaboratorion mittaamat vertailunäytteet:(D/H)VmesI = 102,8 ppm (D/H)BmesI = 93,0 ppmEpävarma korjaamaton näyte:(D/H)XmesI = 100,2 ppmLasketaan á = 1,0255 ja (D/H)XcorrI = 99,3 ppm6 TULOSTEN TULKITSEMINENVerrataan epävarman näytteen suhteelle R saatua arvoa RX vertailuviineille saatuihin suhteisiin. Jos RX eroaa vertailuviineille saadusta keskiarvosta RT enemmän kuin kaksi kertaa keskihajonta, voidaan epäillä väärentämistä.6.1 Juurikassokerilla, ruokosokerilla tai maissiglukoosilla väkevöinti6.1.1 ViinitRX on suurempi kuin RT: oletetaan, että on lisätty juurikassokeria.RX on pienempi kuin RT: oletetaan, että on lisätty ruokosokeria tai maissisokeria.On huomattava, että (D/H)XIIja (D/H)QXWkasvavat.Tutkitaan (D/H)XI. Oletetaan, että- on lisätty juurikassokeria:epävarman näytteen (D/H)XI on enemmän kuin keskihajonnan verran pienempi kuin (D/H)TI vertailunäytteille saatu keskiarvo.- on lisätty ruokosokeria tai maissisokeria:(D/H)XI on enemmän kuin keskihajonnan verran suurempi kuin (D/H)TI.- Väkevöinnin E laskeminen, ilmaistuna etanolin til-%:na.- Juurikassokerin lisääminen:E til - % = tv >NUM>(D/H)TI - (D/H)XI/>DEN>(D/H)TI - (D/H)BI(D/H)BI - isotooppisuhde sijaintipaikan I juurikassokerista valmistetussa alkoholissa:(D/H)BI = 92,5(9).tv = määritetyn viinin (X) alkoholipitoisuus- Ruoko- tai maissisokerin lisääminen:E til - % = tv >NUM>(D/H)XI - (D/H)TI/>DEN>(D/H)CI - (D/H)TI(D/H)CI - isotooppisuhde sijaintipaikan I ruokosokerista tai juurikassokerista valmistetussa alkoholissa: (D/H)CI = 110,5(10).tv = määritetyn viinin (X) alkoholipitoisuus.6.1.2 Rypälemehut, tiivistetyt rypälemehut ja puhdistetut tiivistetyt rypälemehutTutkitaan rypälemehun, tiivistetyn rypälemehun ja puhdistetun tiivistetyn rypälemehun käymistuotteesta (3.2) 3.1 kohdan mukaisesti erotetun alkoholin isotooppiparametrien arvot noudattaen kohdan 6 "Tulosten tulkitseminen" 6.1.1 alakohdassa annettuja ohjeita ja verrataan niitä luonnollisten vertailurypälemehujen käymistuotteista erotettuun alkoholiin.Väkevyys, E til-%, ilmaisee käyneeseen tuotteeseen lisätyn alkoholin tilavuuden. Kun tunnetaan ennen käymistä mahdollisesti tehty laimentaminen (tiivistetyt rypälemehut ja puhdistetut tiivistetyt rypälemehut) ja oletetaan, että 16,83 g sokeria tuottaa 1 til-% alkoholia, voidaan laskea yhteen litraan rypälemehua, tiivistettyä rypälemehua tai puhdistettua tiivistettyä rypälemehua lisätyn sokerin massamäärä.6.2 Juurikassokeri-, ruokosokeri- ja maissiglukoosiseoksella väkevöintiIsotooppisuhteet (D/H)I ja R muuttuvat vähemmän kuin tehtäessä väkevöinti yhdellä sokerilla.(D/H)II kasvaa, kuten myös (D/H)OWW.Nämä lisäykset voidaan varmentaa määrittämällä etanolin 13C/12C suhde massaspektrometrillä: tässä tapauksessa suhde on korkeampi.9 TUHKAPITOISUUS 1 MÄÄRITELMÄTuhkalla tarkoitetaan kaikkia viinin haihdutusjäännöksen hehkuttamisen jälkeen jäljelle jääneitä tuotteita. Hehkuttaminen on tehtävä siten, että kaikki kationit (lukuun ottamatta ammoniumia) muuttuvat karbonaateiksi tai muiksi vedettömiksi mineraalisuoloiksi.2 PERIAATEHehkutetaan viiniuutetta 500 550 °C:een lämpötilassa, kunnes orgaaninen aines on palanut täydellisesti.3 VÄLINEISTÖ3.1 Vesihaude, 100 °C.3.2 Tarkkuudeltaan 0,1 mg oleva vaaka.3.3 Sähkölevy tai infrapunahaihdutin.3.4 Sähköuuni, jonka lämpötilaa voidaan säätää.3.5 Eksikkaattori.3.6 Laakeapohjainen platinamalja, jonka halkaisija on 70 mm ja korkeus 25 mm.4 SUORITUSPipetoidaan 20 ml viiniä taarattuun platinamaljaan (P0g). Haihdutetaan 100 °C:ssa vesihauteessa, kuumennetaan jäännöstä 200 °C:n sähkölevyllä tai infrapunahaihduttimen alla hiiltymiseen asti. Kun höyryä ei enää synny, sijoitetaan malja sähköuuniin, jota pidetään 525 °C ± 25 °C:ssa. 15 minuutin kuluttua hiiltymisestä otetaan malja uunista, lisätään 5 ml tislattua vettä. Haihdutetaan tämän jälkeen vesihauteessa tai infrapunahaihduttimessa ja kuumennetaan uudelleen noin 10 minuutin ajan 525 °C:ssa.Jos hiiltyneiden hiukkasten palaminen ei ole täydellinen, toistetaan hiiltyneiden hiukkasten pesu, veden haihduttaminen ja hehkuttaminen.Kun kyseessä ovat hyvin sokeripitoiset viinit, on tarkoituksenmukaista lisätä uutteeseen muutama tippa puhdasta kasvisöljyä ennen ensimmäistä hehkuttamista sisällön liiallisen kuohumisen estämiseksi.Eksikkaattorissa jäähdyttämisen jälkeen malja punnitaan, P1 g.Näytettä (20 ml) vastaavan tuhkan paino on p = (P1 - P0) g.5 TULOSTEN ILMOITTAMINENLaskentamenetelmäTuhkan paino ilmoitettuna grammoina litrassa kahdella desimaalilla on: P = 50 × p10 TUHKAN EMÄKSISYYS 1 MÄÄRITELMÄTuhkan emäksisyydellä tarkoitetaan ammoniumia lukuun ottamatta sellaisten kationien summaa, jotka ovat liittyneet viinin orgaanisiin happoihin.2 PERIAATETuhka liuotetaan tunnettuun määrään kuumaa happoliuosta; ylijäämä määritetään titraamalla käyttäen metyylioranssia indikaattorina.3 REAGENSSIT JA LAITTEET3.1 0,05 M rikkihappoliuos (H2SO4)3.2 0,1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH)3.3 Metyylioranssiliuos, 0,1 g metyylioranssia/100 ml tislattua vettä3.4 Vesihaude, 100 °C.4 SUORITUSLisätään platinamaljaan, joka sisältää 20 ml:sta viiniä saadun tuhkan, 10 ml 0,05 M rikkihappoliuosta (3.1); asetetaan 100 °C:seen vesihauteeseen noin 15 minuutiksi murskaten jäännös lasipuikolla liukenemisen edistämiseksi. Tämän jälkeen lisätään kaksi tippaa metyylioranssiliuosta ja titrataan rikkihappoylijäämää 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2), kunnes indikaattorin väri muuttuu keltaiseksi.5 TULOSTEN ILMOITTAMINENLaskentamenetelmäTuhkan emäksisyys ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa yhdellä desimaalilla on:A = 5 (10 - n)n = titrauksessa kuluneen 0,1 M natriumhydroksidin määrä millilitroina.11 KLORIDIT 1 PERIAATEKloridit määritetään suoraan viinistä potentiometrisesti käyttäen Ag/AgCl-elektrodia.2 VÄLINEISTÖ2.1 Millivolttiasteikolla varustettu pH-mittari, jonka asteikko on jaettu vähintään 2 mV:n välein.2.2 Magneettisekoittaja.2.3 Ag/AgCl-elektrodi, jossa elektrolyyttinä on kyllästetty kaliumnitraattiliuos.2.4 Mikrobyretti, jonka asteikko on jaettu 1/100 ml:n välein.2.5 Sekuntikello.3 REAGENSSIT3.1 Kloridistandardiliuos: liuotetaan tislattuun veteen 2,1027 g kaliumkloridia, KCl (max. 0,005 % Br), jota on kuivattu ennen käyttöä eksikkaattorissa usean päivän ajan; täytetään yhdeksi litraksi; 1 ml tätä liuosta sisältää 1 mg Cl-:a.3.2 Hopeanitraattititrausliuos: 4,7912 g analyysilaatua olevaa hopeanitraattia, AgNO3, liuotetaan 10 % (v/v) alkoholiliuokseen ja täytetään yhdeksi litraksi; 1 ml tätä liuosta vastaa 1 mg Cl-:a.3.3 Typpihappo, puhtaus vähintään 65 % (ñ20 = 1,40 g/ml).4 SUORITUS4.1 Mitataan 5,0 ml kloridistandardiliuosta 150 ml:n vetoiseen magneettisekoittajaan asetettuun lieriönmuotoiseen astiaan, laimennetaan noin 100 ml:ksi tislatulla vedellä ja hapotetaan 1,0 ml:lla vähintään 65 % typpihappoa. Kun elektrodi on upotettu liuokseen, titrataan lisäämällä mikrobyretillä hopeanitraattititrausliuosta sekoittaen kohtuullisesti. Aloitetaan lisäämällä 1,00 ml neljää ensimmäistä ml:aa kohti ja luetaan vastaavat millivolttiarvot. Tämän jälkeen lisätään 2 ml 0,20 ml:n erissä. Jatketaan lisäämistä 1 ml:n erissä, kunnes on lisätty yhteensä 10 ml. Jokaisen lisäyksen jälkeen odotetaan noin 30 sekuntia ennen vastaavien millivolttien lukemista. Siirretään saadut arvot millimetripaperille siten, että ne vastaavat titrausliuoksen millilitroja ja määritetään ekvivalenttipisteen potentiaali saadun käyrän yksittäisen pisteen perusteella.4.2 150 ml:n lieriömäiseen astiaan mitataan 5 ml kloridistandardiliuosta sekä 95 ml tislattua vettä ja 1 ml vähintään 65 % typpihappoa. Upotetaan elektrodi liuokseen ja titrataan sekoittaen, kunnes saavutetaan ekvivalenttipisteen potentiaali. Tämä määritys toistetaan, kunnes saavutetaan tulosten hyvä yhdenmukaisuus. Tämä tarkistus on tehtävä ennen kloridien mittaussarjan tekemistä näytteestä.4.3 Mitataan 50 ml määritettävää viiniä 150 ml:n lieriömäiseen astiaan. Lisätään 50 ml tislattua vettä ja 1 ml vähintään 65 % typpihappoa ja titrataan 4.2 kohdan mukaisesti.5 TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskutoimituksetJos n edustaa hopeanitraattititrausliuoksen millilitramäärää, tutkitun liuoksen kloriittipitoisuus on:>TAULUKON PAIKKA>5.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>5.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>6 Huomautus: Erittäin tarkat määrityksetKäytetään hopeanitraattiliuoksella koeliuoksen määrityksessä saatua titrauskäyrää.a) Mitataan 50 ml määritettävää viiniä 150 ml:n lieriömäiseen astiaan. Lisätään 50 ml tislattua vettä ja 1 ml vähintään 65 % typpihappoa. Titrataan hopeanitraattiliuoksella 0,5 ml:n lisäyksin ja luetaan vastaavat millivolttipotentiaalit. Johdetaan tästä ensimmäisestä titrauksesta tarvittavan hopeanitraattiliuoksen likimääräinen tilavuus.b) Toistetaan määritys samoissa koeolosuhteissa. Aluksi lisätään titrausliuosta 0,5 ml kerrallaan, kunnes lisätty tilavuus on 1,5 2 ml pienempi kuin a alakohdassa määritetty tilavuus. Tämän jälkeen lisätään 0,2 ml kerrallaan; jatketaan likimääräisesti määritetyn ekvivalenttipisteen jälkeen liuoksen lisäämistä symmetrisesti, aluksi 0,2 ml:n ja sitten 0,5 ml:n erissä.Määrityksen päätepiste ja käytetyn hopeanitraattiliuoksen tarkka tilavuus saadaan:- joko piirtämällä käyrä ja määrittämällä ekvivalenttipiste,- tai seuraavalla yhtälöllä:V = V' + Ä Vi >NUM>ÄÄ E1/>DEN>ÄÄ E1 + ÄÄ E2jossa>TAULUKON PAIKKA>Esimerkki:>TAULUKON PAIKKA>Tässä esimerkissä titrauksen päätepiste on 1,6 ja 1,8 ml:n välillä: tällä välillä esiintyy potentiaalin suurin muutos (ÄE = 44 mV). Käytetyn hopeanitraattititrausliuoksen tilavuus kloridin määrittämiseksi näytteestä on:V = 1,6 + 0,2 >NUM>22/>DEN>22 + 10 = 1,74 ml.12 SULFAATIT 1 PERIAATE1.1 VertailumenetelmäSaostetaan bariumsulfaattina ja punnitaan. Samoissa koeolosuhteissa saostunut bariumfosfaatti poistetaan pesemällä sakka kloorivetyhapolla.Jos rypälemehu tai viini sisältää runsaasti rikkidioksidia, on suositeltavaa poistaa rikki ilmatiiviissä astiassa keittämällä.1.2 Nopea koemenetelmäViinit luokitellaan moniin laatuluokkiin käyttäen ns. rajamenetelmää, joka perustuu bariumsulfaatin saostamiseen bariumionititrausliuoksella.2 VERTAILUMENETELMÄ2.1 Reagenssit2.1.1 2 M kloorivetyhappoliuos.2.1.2 Bariumkloridiliuos, BaCl2, 2 H2O, 200 g/l.2.2 Suoritus2.2.1 Yleinen suoritusMitataan 50 ml:n sentrifugiputkeen 40 ml määritettävää näytettä; lisätään 2 ml 2 M kloorivetyhappoa ja 2 ml 200 g/l bariumkloridiliuosta; sekoitetaan lasipuikolla; huuhdotaan lasipuikko pienellä määrällä tislattua vettä ja annetaan seistä viisi minuuttia. Sentrifugoidaan 5 minuutin ajan ja dekantoidaan supernatantti varovasti.Tämän jälkeen pestään bariumsulfaattisakka seuraavasti: lisätään 10 ml 2 M kloorivetyhappoa, suspendoidaan sakka ja sentrifugoidaan 5 minuutin ajan. Erotetaan supernatantti varovasti. Toistetaan sakan pesu kaksi kertaa samoissa koeolosuhteissa aina 15 ml:lla tislattua vettä.Siirretään sakka kvantitatiivisesti tislatulla vedellä huuhtoen taarattuun platinamaljaan ja haihdutetaan kuivaksi 100 °C:ssa vesihauteessa. Kuivattu sakka hehkutetaan nopeasti liekillä useita kertoja, kunnes saadaan valkea jäännös. Annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja punnitaan.Saadun bariumsulfaatin massa milligrammoina on m.2.2.2 Erityinen suoritus: rikitetyt rypälemehut ja viinit, joiden rikkidioksidipitoisuus on korkeaAluksi poistetaan rikkidioksidi.Mitataan 500 ml:n erlenmeyerkolviin, joka on varustettu tiputussuppilolla ja päästöputkella, 25 ml vettä ja 1 ml puhdasta kloorivetyhappoa (ñ20 = 1,15 1,18 g/ml). Kiehautetaan tämä liuos ilman poistamiseksi ja lisätään 100 ml viiniä tiputussuppilon kautta koko ajan kiehuttaen. Annetaan kiehua, kunnes kolvin sisältämä nestetilavuus on vähentynyt 75 ml:aan ja siirretään kvantitatiivisesti jäähdyttämisen jälkeen 100 ml:n mittapulloon. Täytetään merkkiin vedellä. Määritetään sulfaattipitoisuus 40 ml:n näytteestä 2.2.1 kohdan mukaisesti.2.3 Tulosten ilmoittaminen2.3.1 LaskutoimituksetSulfaattipitoisuus, ilmoitettuna milligrammoina kaliumsulfaattia, K2SO4, litrassa, on:18,67 × mRypälemehun tai viinin sulfaattipitoisuus ilmoitetaan kokonaislukuna milligrammoina kaliumsulfaattia litrassa.2.3.2 Toistettavuus>TAULUKON PAIKKA>2.3.3 Uusittavuus>TAULUKON PAIKKA>3 NOPEA KOEMENETELMÄ3.1 Reagenssit3.1.1 BariumkloridititrausliuosLiuotetaan 2,804 g bariumkloridia, BaCl2, 2H2O, ja 10 ml kloorivetyhappoa (ñ20 = 1,15 1,18 g/ml) sellaiseen vesimäärään, että saadaan 1 l liuosta. 1 ml tätä liuosta saostaa 2 mg kaliumsulfaattia vastaavan määrän sulfaatti-ioneja.3.1.2 Rikkihappo (ñ20 = 1,84 g/ml) suhteessa 1/10 (m/v) laimennettu liuos.3.2 SuoritusMitataan kolmeen koeputkeen 10 ml rypälemehua tai viiniä; lisätään koeputkeen n:o 1 3,5 ml, koeputkeen n:o 2 5 ml ja koeputkeen n:o 3 10 ml bariumkloridiliuosta. Ravistellaan ja kuumennetaan kiehumispisteeseen; annetaan seisoa 1 2 tuntia. Jokaisen koeputken sisältämä neste dekantoidaan, suodatetaan ja jaetaan kahteen osaan. Toiseen osaan lisätään muutama tippa laimennettua rikkihappoliuosta ja toiseen lisätään muutama tippa bariumkloridiliuosta. Tutkitaan kaikki koeputket ja pannaan merkille, onko liuos kirkasta vai sameaa. Tämän tulkitseminen esitetään seuraavassa taulukossa.>TAULUKON PAIKKA>13. KOKONAISHAPPOPITOISUUS 1 MÄÄRITELMÄKokonaishappopitoisuudella tarkoitetaan titrattavien happojen yhteismäärää, kun pH säädetään arvoon 7 emäksisellä titrausliuoksella.Hiilidioksidi ei kuulu kokonaishappopitoisuuteen.2 PERIAATEPotentiometrinen titraus tai titraus indikaattori bromtymolisininen ja vertaaminen päätepisteen värimalliin.3 REAGENSSIT3.1 Standardiliuos pH 7,0:Monokaliumfosfaatti KH2PO4: 107,3 g1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH): 500 mlTäytetään vedellä 1 000 ml:ksi.Voidaan käyttää myös kaupallisesti saatavissa olevia vertailupuskuriliuoksia.3.2 0,1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH).3.3 4 g/ml bromtymolisininen indikaattoriliuos.>TAULUKON PAIKKA>Liuotetaan ja lisätään:>TAULUKON PAIKKA>4 VÄLINEISTÖ4.1 Vesivakuumipumppu.4.2 500 ml:n vakuumipullo.4.3 Potentiometri, jonka asteikko on jaettu pH-yksiköihin ja elektrodeja. Lasielektrodia on säilytettävä tislatussa vedessä. Kalomeli/kyllästetty kaliumkloridi-elektrodia on säilytettävä kyllästetyssä kaliumkloridiliuoksessa. Useimmiten käytetään yhdistettyä elektrodia, jota säilytetään tislatussa vedessä.4.4 Vetoisuudeltaan 50 ml olevia mittalaseja (viinit) ja vetoisuudeltaan 100 ml olevia mittalaseja (puhdistetut tiivistetyt rypälemehut).5 SUORITUS5.1 Näytteen valmistaminen5.1.1 ViinitPoistetaan hiilidioksidi. Mitataan noin 50 ml viiniä vakuumipulloon, ravistellaan ja samanaikaisesti poistetaan ilma käyttäen vesivakuumipumppua. Ravistelun on kestettävä 1 2 minuuttia.5.1.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehutMitataan tarkalleen 200 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua 500 ml:n mittapulloon. Täytetään merkkiin vedellä. Homogenoidaan.5.2 Potentiometrinen titraus5.2.1 pH-mittarin kalibrointiValmistajan ohjeita noudattaen kalibroidaan pH-mittari 20 °C:ssa puskuriliuoksella, jonka pH-arvo 20 °C:ssa on 7.5.2.2 MittausmenetelmäMitataan mittalasiin (4.4) 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä 10 ml, kun kyseessä on viini, ja 50 ml, kun kyseessä on puhdistettu tiivistetty rypälemehu. Lisätään noin 10 ml tislattua vettä ja byretillä 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2), kunnes pH-arvo 20 °C:ssa on 7. Emäksisen nesteen lisääminen on tehtävä hitaasti ja liuosta on sekoitettava koko ajan. Lisätyn 0,1 M NaOH:n millilitramäärä on n.5.3 Indikaattorititraus (bromtymolisininen)5.3.1 Esikoe: värimallin määrittäminenMitataan mittalasiin (4.4) 25 ml keitettyä tislattua vettä, 1 ml bromtymolisinisen liuosta (3.3) ja 10 ml viiniä tai 50 ml puhdistettua tiivistettyä rypälemehua, joka on valmistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2), kunnes väri muuttuu sinivihreäksi. Lisätään 5 ml puskuriliuosta (3.1), jonka pH-arvo on 7.5.3.2 MääritysMitataan mittalasiin (4.4) 30 ml keitettyä tislattua vettä, 1 ml bromtymolisinisen liuosta (3.3) ja 10 ml viiniä tai 50 ml puhdistettua tiivistettyä rypälemehua, joka on valmistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2), kunnes värinmuutos on samanlainen kuin esikokeessa (5.3.1) saatu väri. Lisätyn 0,1 M natriumhydroksidin millilitramäärä on n.6 TULOSTEN ILMOITTAMINEN6.1 Laskentamenetelmä6.1.1 ViinitKokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa on:A = 10nTulos annetaan yhdellä desimaalilla.Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna grammoina viinihappoa litrassa on:A' = 0,075 × ATulos annetaan yhdellä desimaalilla.6.1.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehut- Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina kilogrammassa puhdistettua tiivistettyä rypälemehua: a = 5 × n- Kokonaishappopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina kilogrammassa kokonaissokereita:A = >NUM>500 ×/>DEN>n;PP = kokonaissokerien pitoisuus %:eina (m/m).Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.6.2 Titrauksen toistettavuus (r) indikaattorilla>TAULUKON PAIKKA>valko-, rosee- ja punaviineille.6.3 Titrauksen (5.3) uusittavuus (R) indikaattorillaValko- ja roseeviineille:>TAULUKON PAIKKA>Punaviineille:>TAULUKON PAIKKA>14 HAIHTUVAT HAPOT 1 MÄÄRITELMÄHaihtuvat hapot muodostuvat etikkahappoihin kuuluvista hapoista, joita on viinissä sekä vapaina happoina että suoloina.2 MENETELMÄErotetaan haihtuvat hapot viinistä vesihöyrytislauksella ja titrataan tisleestä.Viinistä poistetaan aluksi hiilidioksidi.Näissä koeolosuhteissa tislattava vapaa rikkidioksidi ja sitoutunut rikkidioksidi on vähennettävä tisleen happopitoisuudesta.Mahdollisesti viiniin lisätyn sorbiinihapon pitoisuus on myös vähennettävä.Huomautus:Joissain maissa viinit stabiloidaan ennen määritystä salisyylihapolla, jota löytyy tisleestä. Se on määritettävä ja vähennettävä happopitoisuudesta. Määritysmenetelmä selostetaan tämän luvun 7 kohdassa.3 REAGENSSIT3.1 Kiteinen viinihappo (C4H6O6).3.2 0,1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH).3.3 1 % fenoliftaleiiniliuos 96 til-% neutraalissa alkoholissa.3.4 Kloorivetyhappo (ñ20 = 1,18 1,19 g/ml) laimennettu suhteessa 1/4 (v/v).3.5 0,005 M jodiliuos (I2).3.6 Kiteinen kaliumjodidi (KI).3.7 5 g/l tärkkelysliuos:Sekoitetaan 5 g tärkkelystä noin 500 ml:aan vettä. Kuumennetaan kiehuvaksi koko ajan sekoittaen ja annetaan kiehua noin 10 minuuttia; lisätään 200 g natriumkloridia. Täytetään 1 litraksi jäähtymisen jälkeen.3.8 Kyllästetty natriumboraattiliuos (Na2B4O7, 10H2O), eli noin 55 g/l 20 °C:ssa.4 VÄLINEISTÖ4.1 Vesihöyrytislauslaitteisto, johon kuuluu:1) vesihöyrykehitin: vesihöyryn on oltava hiilidioksidivapaata,2) tislauskolvi, jossa on putki vesihöyryn johtamiseksi,3) tislauskolonni,4) jäähdytin.Tämän laitteen on läpäistävä seuraavat kolme koetta:a) Mitataan tislauskolviin 20 ml keitettyä vettä; kerätään 250 ml tislettä ja lisätään 0,1 ml 0,1 M natriumhydroksidiliuosta (3.2) ja 2 tippaa fenoliftaleiiniliuosta (3.3); vaaleanpunaisen värin on pysyttävä muuttumattomana vähintään 10 sekunnin ajan (hiilidioksidista vapaa vesihöyry).b) Mitataan tislauskolviin 20 ml 0,1 M etikkahappoliuosta. Kerätään 250 ml tislettä. Titrataan 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2). Käytetyn tilavuuden on oltava vähintään 19,9 ml. (Tislattu etikkahappo &ge; 99,5 %).c) Mitataan tislauskolviin 20 ml 1 M maitohappoliuosta. Kerätään 250 ml tislettä ja titrataan happo 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2).Kulutettu tilavuus saa olla enintään 1,0 ml (tislattu maitohappo &le; 0,5 %).Mikä tahansa laite tai menetelmä, joka läpäisee nämä kokeet, katsotaan viralliseksi kansainväliseksi laitteeksi tai menetelmäksi.4.2 Vesivakuumipumppu.4.3 Vakuumipullo.5 SUORITUS5.1 Näytteen valmistaminen hiilidioksidin poistaminen.Mitataan noin 50 ml viiniä vakuumipulloon; koko ajan ravistellen imetään ilma pullosta vesivakuumipumpulla. Ravistelun on kestettävä 1 2 minuuttia.5.2 VesihöyrytislausMitataan tislauskolviin 20 ml viiniä, josta hiilidioksidi on poistettu 5.1 kohdan mukaisesti. Lisätään noin 0,5 g viinihappoa (3.1). Kerätään vähintään 250 ml tislettä.5.3 TitrausTitrataan 0,1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.2) käyttäen indikaattorina kahta tippaa fenoliftaleiiniliuosta (3.3), käytetty tilavuus on n ml.Lisätään 4 tippaa suhteessa 1/4 laimennettua kloorivetyhappoa (3.4), 2 ml tärkkelysliuosta (3.7) ja muutamia kaliumjodikiteitä (3.6). Titrataan vapaa rikkidioksidi 0,005 M jodiliuoksella (3.5). Käytetty tilavuus on n' ml.Lisätään kyllästettyä natriumboraattiliuosta (3.8), kunnes vaaleanpunainen väri ilmestyy uudelleen. Titrataan sitoutunut rikkidioksidi 0,005 M jodiliuoksella (3.5). Käytetty tilavuus on n" ml.6 TULOSTEN ILMOITTAMINEN6.1 LaskentamenetelmäHaihtuvat hapot ilmoitettuna milliekvivalentteina litrassa yhdellä desimaalilla ovat:A = 5 (n   0,1 n'   0,05 n")Haihtuvat hapot ilmoitettuna grammoina etikkahappoa litrassa kahdella desimaalilla ovat:0,300 (n   0,1 n'   0,05 n")6.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>6.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>6.4 Viini, johon on lisätty sorbiinihappoaKoska 250 ml:n tisleeseen saadaan vesihöyrytislauksella 96 % sorbiinihaposta, se on vähennettävä haihtuvista hapoista. Tiedetään, että 100 mg sorbiinihappoa vastaa 0,89 milliekvivalenttia, tai 0,053 g etikkahappoa, ja tunnetaan sorbiinihappopitoisuus, joka on määritetty muilla menetelmillä.7 SALISYYLIHAPON MÄÄRITTÄMINEN HAIHTUVIA HAPPOJA SISÄLTÄVÄSTÄ TISLEESTÄ7.1 PeriaateHaihtuvien happojen määrittämisen ja rikkidioksidin suhteen tehdyn korjauksen jälkeen, salisyylihappo osoitetaan happamaksi tehdystä liuoksesta rauta(III)suolalla, joka antaa violetin värin.Haihtuvia happoja sisältävään tisleeseen tislautuva salisyylihappo määritetään toisesta tisleestä, jonka tilavuus on sama kuin tisleen, josta haihtuvat hapot on määritetty. Salisyylihappo määritetään tästä tisleestä kolorimetrisellä vertailumenetelmällä. Se on vähennettävä haihtuvat hapot sisältävän tisleen happopitoisuudesta.7.2 Reagenssit7.2.1 Kloorivetyhappo (HCl) (ñ20 = 1,18-1,19 g/ml).7.2.2 0,1 M natriumtiosulfaatti (Na2S2O3, 5H2O).7.2.3 10 % (m/v) rauta(III)ammoniumsulfaattiliuos [Fe2(SO4)3.(NH4)2SO4 × 24H2O]7.2.4 0,01 M natriumsalisylaattiliuos. Liuos sisältää 1,60 g/l natriumsalisylaattia (NaC7 H5O3).7.3 Suoritus7.3.1 Salisyylihapon tunnistaminen haihtuvia happoja sisältävästä tisleestäVälittömästi haihtuvien happojen määrittämisen ja vapaan ja sitoutuneen rikkidioksidin suhteen tehdyn korjauksen jälkeen lisätään pulloon 0,5 ml kloorivetyhappoa (7.2.1), 3 ml 0,1 M natriumtiosulfaattiliuosta (7.2.2) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (7.2.3).Jos salisyylihappoa esiintyy, ilmaantuu violetti väri.7.3.2 Salisyylihapon määrittäminenTehdään mainittuun keräyspulloon merkki tisleen tilavuuden kohdalle. Tyhjennetään ja huuhdotaan pullo.Otetaan viinistä uusi 20 ml:n näyte, joka tislataan vesihöyrytislauksella ja kerätään tislettä keräyspullossa olevaan merkkiin asti. Lisätään 0,3 ml puhdasta kloorivetyhappoa (7.2.1) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (7.2.3). Pullon sisältö värjäytyy violetiksi, jos salisyylihappoa esiintyy.Kaadetaan samanlaiseen pulloon tislattua vettä edellisessä pullossa olevan tisleen tasolle. Lisätään 0,3 ml puhdasta kloorivetyhappoa (7.2.1) ja 1 ml rauta(III)ammoniumsulfaattiliuosta (7.2.3). Lisätään byretillä 0,01 M natriumsalisylaattiliuosta (7.2.4), kunnes saadaan saman intensiteetin omaava violetti väri kuin viinitisleen sisältämässä pullossa.Käytetty millilitramäärä on n'".7.4 Haihtuvien happojen pitoisuuden korjaaminenVähennetään tilavuus 0,1 × n'" 0,1 M natriumhydroksidiliuoksen n ml tilavuudesta, joka kului, kun haihtuvat hapot titrattiin tisleestä.15. KIINTEÄT HAPOT 1 PERIAATEKiinteät hapot määritetään kokonaishappojen pitoisuuden ja haihtuvien happojen pitoisuuden erotuksesta.2 TULOSTEN ILMOITTAMINENKiinteät hapot ilmoitetaan:- milliekvivalentteina litrassa,- grammoina viinihappoa litrassa.16. VIINIHAPPO 1 PERIAATE1.1 VertailumenetelmäViinihappo saostetaan kalsiumtartraattina ja määritetään gravimetrisesti. Tätä määritystä voidaan täydentää volumetrisellä vertailumenetelmällä. Saostamisolosuhteet: pH, käytetty kokonaistilavuus, saostamisioneiden konsentraatio ovat sellaisia, että raseemisen kalsiumtartraatin saostuminen on täydellinen, kun taas kalsiumD( )tartraatti pysyy liuoksessa.Kun viiniin on lisätty mesoviinihappoa, joka aiheuttaa kalsiumtartraatin epätäydellisen saostumisen, se on hydrolysoitava ennen määritystä.1.2 Tavanomainen menetelmäAnioninvaihtokolonnissa erotettu viinihappo määritetään eluaatista kolorimetrisesti mittaamalla vanadiinihapolla saatu punainen väri. Tämä eluaatti sisältää myös maito- ja omenahappoja, jotka eivät häiritse määritystä.2 VERTAILUMENETELMÄ2.1 Gravimetrinen menetelmä2.1.1 Reagenssit2.1.1.1 Kalsiumasetaattiliuos, joka sisältää kalsiumia 10 g/l:>TAULUKON PAIKKA>2.1.1.2 Kiteytetty kalsiumtartraatti: CaC4O6H4.4H2O:itataan 400 ml:n dekantterilasiin 20 ml L(+)viinihappoliuosta (5 g/l), 20 ml ammoniumD( )tartraattiliuosta (6,126 g/l) ja 6 ml kalsiumasetaattiliuosta, joka sisältää kalsiumia 10 g/l (2.1.1.1).Annetaan saostua kahden tunnin ajan. Kootaan sakka huokoisuudeltaan 4 olevaan lasisintteriin ja pestään se kolmeen kertaan noin 30 ml:lla tislattua vettä. Kuivataan lämpökaapissa 70 °C:n lämpötilassa, kunnes paino pysyy vakiona. Käyttäen mainittuja reagenssimääriä saadaan noin 340 mg kiteistä raseemista kalsiumtartraattia.Säilytetään tulpalla suljetussa pullossa.2.1.1.3 Saostusliuos (pH 4,75):>TAULUKON PAIKKA>Liuotetaan D( )viinihappo ja lisätään ammoniumhydroksidi; säädetään tilavuus noin 900 ml:ksi; lisätään 8,8 ml kalsiumasetaattiliuosta (2.1.1.1) ja sekoittamisen jälkeen säädetään pH etikkahapolla arvoon 4,75. Täytetään yhdeksi litraksi.Koska raseemista kalsiumtartraattia liukenee niukasti tähän liuokseen, siihen on lisättävä 5 mg raseemista kalsiumtartraattia litrassa, ravistellaan 12 tunnin ajan ja suodatetaan.2.1.2 Suoritus2.1.2.1 Viinit, joihin ei ole lisätty mesoviinihappoaMitataan 600 ml:n dekantterilasiin 500 ml saostusliuosta ja 10 ml viiniä. Sekoitetaan ja aloitetaan saostaminen hieromalla lasin pintaa lasipuikolla. Annetaan saostua 12 tunnin ajan (yön yli).Suodatetaan liuos ja sakka puhtaan vakuumipullon päälle asetetun taaratun huokoisuudeltaan 4 olevan lasisintterin läpi. Huuhdotaan saostusastia suodoksella sen varmistamiseksi, että koko sakka on saatu kerätyksi.Kuivataan lämpökaapissa 70 °C:n lämpötilassa, kunnes paino pysyy vakiona. Punnitaan: p on kiteytyneen, neljä vesimolekyyliä sisältävän kalsiumtartraatin CaC4O6H4 paino.2.1.2.2 Viinit, joihin on lisätty mesoviinihappoaMääritettäessä viinejä, joihin on lisätty mesoviinihappoa tai joihin epäillään lisätyn mesoviinihappoa, tämä happo hydrolysoidaan seuraavissa olosuhteissa.Mitataan 50 ml:n keittopulloon 10 ml viiniä ja 0,4 ml puhdasta etikkahappoa (CH3COOH, ñ20 = 1,05 g/ml). Yhdistetään pystyjäähdytin pulloon ja kuumennetaan kiehuvaksi 30 minuutissa. Jäähtymisen jälkeen siirretään neste 600 ml:n dekantterilasiin; huuhdotaan pullo 2 kertaa 5 ml:lla vettä ja jatketaan suoritusta edellä kuvatulla tavalla.Mesoviinihappo lasketaan viinihapoksi.2.1.3 Tulosten ilmoittaminenYksi raseeminen kalsiumtartraattimolekyyli vastaa puolta L(+)viinihapon molekyyliä.Viinihapon määrä litrassa viiniä, ilmoitettuna milliekvivalentteina, on 384,5 p.Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.Viinihapon määrä litrassa viiniä, ilmoitettuna grammoina viinihappoa, on 28,84 p.Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.Viinihapon määrä litrassa viiniä, ilmoitettuna grammoina kaliumvetytartraattia, on 36,15 p.Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.2.2 Volumetrinen vertailumenetelmä2.2.1 Reagenssit2.2.1.1 Kloorivetyhappo (HCl) (ñ20 = 1,18 1,19 g/ml) laimennetaan suhteessa 1/5 (v/v).2.2.1.2 0,05 M EDTA-liuos:EDTA (etyleenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuola)>TAULUKON PAIKKA>2.2.1.3 40 % (m/v) natriumhydroksidiliuos:>TAULUKON PAIKKA>2.2.1.4 Kalkoni-karbonihappo kompleksometrinen indikaattori: 1 % (m/m)Kalkoni-karbonihappo tai 2-hydroksi-1-(2-hydroksi-4-sulfo-1-naftyyliatso)->TAULUKON PAIKKA>2.2.2 SuoritusPunnitsemisen jälkeen raseeminen kalsiumtartraattisakan sisältävä lasisintteri pannan imupullon päälle ja liuotetaan sakka 10 ml:lla laimennettua kloorivetyhappoa (2.2.1.1). Pestään lasisintteri 50 ml:lla tislattua vettä.Lisätään 5 ml 40 % natriumhydroksidiliuosta (2.2.1.3) ja noin 30 mg indikaattoria (2.2.1.4). Titrataan 0,05 M EDTA-liuoksella (2.2.1.2). Käytetty millilitramäärä on n.2.2.3 Tulosten ilmoittaminenViinihapon määrä litrassa viiniä, milliekvivalentteina ilmoitettuna, on 5 n.Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.Viinihapon määrä litrassa viiniä, ilmoitettuna grammoina viinihappoa, on 0,375n.Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.Viinihapon määrä litrassa viiniä, ilmoitettuna grammoina kaliumvetytartraattia, on 0,470n.Se ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.3 TAVANOMAINEN MENETELMÄ3.1 Reagenssit3.1.1 Viinin esikäsittelyssä3.1.1.1 Etikkahappo CH3COOH (ñ20 = 1,05 g/ml) laimennettu 30 %:ksi (v/v).3.1.1.2 Vahvasti emäksinen anioninvaihtohartsi (esimerkiksi Merck III 20 50 meshiä) asetaattimuodossa. Asetetaan anioninvaihtohartsia (noin 100 g) 200 ml:aan 30 %:ksi laimennettua etikkahappoa (3.1.1.1). Annetaan seistä vähintään 24 tuntia ennen käyttöä.Ioninvaihtohartsia säilytetään myöhempää käyttöä varten 30 %:ssa etikkahapossa.3.1.1.3 Etikkahappo CH3COOH (ñ20 = 1,05 g/ml) laimennettu 0,5 %:ksi (v/v).3.1.1.4 Natriumsulfaattiliuos, 7,1 g/100 ml (0,5 M).Liuotetaan 71 g vedetöntä natriumsulfaattia (Na2SO4) tislattuun veteen ja täytetään 1 000 ml:ksi tislatulla vedellä.3.1.2 Viinihapon määrittämisessä3.1.2.1 Natriumasetaattiliuos (NaCH3COO) 27 % (m/v).Liuotetaan 270 g vedetöntä natriumasetaattia, NaCH3COO, tislattuun veteen ja täytetään 1 000 ml:ksi.3.1.2.2 VanadiinireagenssiLiuotetaan 10 g ammoniummetavanadaattia (NH4VO3) 150 ml:aan 1 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.2.10). Siirretään tämä liuos 500 ml:n mittapulloon, lisätään 200 ml 27 % natriumasetaattiliuosta (3.1.2.1). Täytetään 500 ml:ksi tislatulla vedellä.3.1.2.3 1 M H2SO4-liuos.3.1.2.4 0,5 M H2SO4-liuos.3.1.2.5 0,05 M H2SO4-liuos.3.1.2.6 0,05 M perjodihappoliuos.Mitataan 1 000 ml:n mittapulloon 10,696 g natriumperjodaattia, NaIO4, 50 ml 0,5 M rikkihappoa (3.1.2.4) ja täytetään 1 000 ml:ksi tislatulla vedellä.3.1.2.7 Glyseroliliuos, 10 % (m/v).Mitataan 100 ml:n mittapulloon 10 g glyserolia C3H8O3; täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä.3.1.2.8 Natriumsulfaattiliuos, 7,1 g/100 ml (ks. 3.1.1.4).3.1.2.9 Viinihappoliuos, 1 g/l.Mitataan 500 ml:n mittapulloon 0,5 g viinihappoa, 6,66 ml 1 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.2.10) ja täytetään 500 ml:ksi 7,1 %:lla natriumsulfaattiliuoksella (3.1.1.4).3.1.2.10 1 M natriumhydroksidiliuos, NaOH.3.2 Välineistö3.2.1 Lasikolonni, jonka pituus on noin 300 mm ja sisähalkaisija 10 11 mm ja joka on varustettu hanalla.3.2.2 Spektrometri, jolla voidaan tehdä absorbanssimittaukset 490 nm:n aallonpituudella, ja kyvettejä, joiden optinen pituus on 10 mm.3.3 Suoritus3.3.1 Ioninvaihtokolonnin valmistaminenPannaan lasivillatuppo lasikolonniin hanan yläpuolelle (3.2.1). Kostutetaan tuppo tislatulla vedellä. Kaadetaan kolonniin 10 ml asetaattimuodossa olevan ioninvaihtohartsin suspensiota (3.1.1.2). Annetaan laskeutua. Asetetaan lasivillatuppo hartsipatsaan päälle (siten, että vältetään hartsipatsaan hajoaminen myöhempien pesujen aikana).Ioninvaihtohartsia saa käyttää ainoastaan yhteen määritykseen.3.3.2 Orgaanisten happojen erottaminenAvataan hana ja annetaan etikkahapon valua siten, että pinta on noin 2 3 mm hartsin päällä olevan lasivillatupon yläpuolella.Lisätään 10 ml 0,5 % etikkahappoliuosta (3.1.1.3), ja valutetaan neste samalle tasolle kuin edellä. Toistetaan tämä pesu vielä 4 kertaa.Viimeisen pesun jälkeen suljetaan hana, kaadetaan vaihtimeen 10 ml viiniä tai rypälemehua. Annetaan viinin valua tipoittain (keskimääräinen virtausnopeus 1 tippa sekunnissa) ja pysäytetään valuminen täsmälleen ioninvaihtohartsin yläpuolelle. Lisätään kolonniin uudelleen 10 ml 0,5 % etikkahappoliuosta (3.1.1.3), annetaan valua samalla nopeudella kuin edellä ja toistetaan pesu 7 kertaa aina 10 ml:lla vettä. Viimeisen pesun aikana suljetaan hana heti, kun nesteen taso on hieman lasivillatupon yläpuolella.Eluoidaan kiinteät hapot ioninvaihtohartsista 7,1 % natriumsulfaattiliuoksella (3.1.1.4); otetaan eluaattia 100 ml:n mittapullon merkkiin asti.3.3.3 Viinihapon määrittäminen3.3.3.1 Viinit, joihin ei ole lisätty mesoviinihappoaMitataan kahteen erlenmeyerpulloon, a ja b, 20 ml eluaattia.Pullo a käytetään määrittämiseen ja pulloa b, josta viinihappo hävitetään perjodihapolla, käytetään vertailuun.Pulloon a mitataan:- 2 ml 1 M H2SO4 (3.1.2.3).- 5 ml 0,05 M H2SO4 (3.1.2.5).- 1 ml 10 % glyserolia (3.1.2.7).Pulloon b mitataan:- 2 ml 1 M H2SO4 (3.1.2.3).- 5 ml 0,05 M perjodihappoliuos (3.1.2.6).Odotetaan 15 minuuttia ja lisätään:1 ml 10 % glyserolia (3.1.2.7) perjodihappoylijäämän hävittämiseksi.Odotetaan 2 minuuttia.Samalla kun sekoitetaan, pipetoidaan pulloon b ja välittömästi tämän jälkeen pulloon a 5 ml vanadiinireagenssia (3.1.2.2). Käynnistetään sekuntikello viipymättä ja kaadetaan pullojen a ja b sisältö spektrofotometrin kyvetteihin. 90 sekunnin kuluttua mitataan pullossa a olevan nesteen absorbanssi 490 nm:ssä (määritys) käyttäen vertailuun nestettä b (sokea).Jos eluaatin viinihappopitoisuus on niin korkea, että sen antama absorbanssi ylittää korkeimman vertailun, on eluaatti laimennettava 7,1 % natriumsulfaattiliuoksella; mittaus tehdään laimennetusta liuoksesta.3.3.3.2 Viinit, joihin on lisätty mesoviinihappoaMääritettäessä viinejä, joihin on lisätty mesoviinihappoa tai joihin epäillään lisätyn mesoviinihappoa, tämä happo hydrolysoidaan vertailumenetelmän mukaisesti.Jäähtymisen jälkeen erlenmeyerpullon sisältö samoin kuin huuhtomisvesi (5 ml kahdesti) kaadetaan ioninvaihtokolonnin yläosaan. Määritystä jatketaan edellä esitetyllä tavalla.Mesoviinihappo lasketaan määritystuloksessa viinihapoksi.3.3.4 Kalibrointikäyrän esittäminen graafisestiMitataan 100 ml:n mittapulloihin viinihappoliuosta (1 g/l) (3.1.2.9) 10, 20, 30, 40 ja 50 ml ja täytetään 100 ml:ksi 7,1 % natriumsulfaattiliuoksella (3.1.1.4). Näiden liuosten konsentraatiot vastaavat viineistä saatuja ja eluaatteja, joissa on viinihappoa 1, 2, 3, 4 ja 5 g litrassa.Mitataan kahteen erlenmeyerpulloon, a ja b, 20 ml kutakin liuosta ja jatketaan määritystä edellä kuvatulla tavalla.Näiden liuosten absorbanssien graafinen kuvaaja viinihappopitoisuuden funktiona on suora, joka kaartuu hieman nollakohtaa kohti. Tämä osa käyrästä voidaan tarvittaessa piirtää tarkemmin käyttäen määrityksiin liuoksia, joissa konsentraatiot ovat alle 1,0 g/l ja tarkalleen tunnettuja.3.3.5 Tulosten ilmoittaminenEtsitään kalibrointikäyrältä eluaatille mitattu absorbanssi ja tätä vastaava viinin viinihappopitoisuus grammoina litrassa.Tämä pitoisuus ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.17. SITRUUNAHAPPO 1 PERIAATESitruunahappo muutetaan sitraattilyaasilla (CL) katalysoidussa reaktiossa oksaaliasetaatiksi ja asetaatiksi:sitraatti>KAAVION ALKU>CL>KAAVION LOOPU>oksaaliasetaatti + asetaattiMalaattidehydrogenaasin (MDH) ja laktaattidehydrogenaasin läsnäollessa oksaaliasetaatti ja sen dekarboksylaatiojohdannainen, pyruvaatti, pelkistyvät nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidilla (NADH) L-malaatiksi ja L-laktaatiksi:Oksaaliasetaatti + NADH + H+>KAAVION ALKU>MDH>KAAVION LOOPU>L-malaatti + NAD+Pyruvaatti + NADH + H+>KAAVION ALKU>LDH>KAAVION LOOPU>L-laktaatti + NAD+Näissä reaktioissa NAD+:ksi hapettuneen NADH on verrannollinen sitraattimäärään. NADH:n hapettuminen mitataan sen absorbanssin pienenemisestä 340 nm:n aallonpituudella.2 REAGENSSIT2.1 Standardiliuos pH 7,8(0,51 M glysyyliglysiini; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 × 10-3M):Liuotetaan 7,13 g glysyyliglysiiniä noin 70 ml:aan kahdesti tislattua vettä.Säädetään pH arvoon 7,8 noin 13 ml:lla 5 M natriumhydroksidiliuosta; lisätään 10 ml sinkkikloridiliuosta ZnCL2 (80 mg/100 ml) ja täytetään kahdesti tislatulla vedellä 100 ml:ksi.Liuos säilyy vähintään 4 viikon ajan + 4 °C:ssa.2.2 Pelkistynyt nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NADH) -liuos, noin 6 x 10-3 M, liuotetaan 30 mg NADH:ta ja 60 mg NaHCO3 6 ml:aan kahdesti tislattua vettä.2.3 Malaattidehydrogenaasi/laktaattidehydrogenaasi -liuos, (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml): sekoitetaan 0,1 ml MDH:ta (5 mg MDH/ml), 0,4 ml ammoniumsulfaattiliuosta (3,2 M) ja 0,5 ml LDH:ta (5 mg/ml). Tämä liuos säilyy vähintään yhden vuoden + 4 °C:ssa.2.4 Sitraattilyaasi CL (5 mg proteiinia/ml). Liuotetaan 168 mg lyofiilisaattia 1 ml:aan jäävettä. Liuos säilyy vähintään yhden viikon ajan + 4 °C:ssa ja vähintään neljän viikon ajan jäädytettynä.On suositeltavaa varmistaa entsyymin aktiivisuus ennen määritystä.2.5 Polyvinyylipolypyrrolidoni (PVPP)Huomautus: Kaikki tähän määritykseen tarvittavat reagenssit ovat kaupallisesti saatavilla.3 VÄLINEISTÖ3.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittauksia 340 nm:ssä, jossa NADH:n absorptio on korkeimmillaan.Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään epäjatkuvan spektrin omaavaa fotometriä, jolla voidaan mitata 334 tai 365 nm:ssä. Jos kyseessä ovat absoluuttiset absorbanssimittaukset (ei käytetä kalibrointisarjoja, vaan NADH:n ekstinktiokerrointa), laitteen aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen on oltava tarkistettuja.3.2 Lasikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm, tai kertakäyttöisiä kyvettejä.3.3 Mikropipettejä, joilla voidaan pipetoida 0,02 - 2 ml:n suuruisia tilavuuksia.4 NÄYTTEEN VALMISTAMINENSitraatti määritetään tavallisesti suoraan viinistä ilman, että väriaineet poistetaan ennen määritystä tai viini laimennetaan, jos sitruunahappopitoisuus on alle 400 mg/l. Jos näin ei ole laimennetaan viini siten, että sen sitraattikonsentraatio on välillä 20 400 mg/l (näytteen sitraattimäärä välillä 5-80 ìg.Kun kyseessä on runsaasti fenolisia yhdisteitä sisältävä punaviini, on suositeltavaa käsitellä viini ennen määritystä PVPP:llä:Suspendoidaan veteen noin 0,2 g PVPP:tä, annetaan seistä 15 minuutin ajan. Suodatetaan laskostetun suodattimen läpi.50 ml:n erlenmeyerpulloon mitataan 10 ml viiniä, lisätään lastalla suodattimesta otettua kosteaa PVPP:tä. Ravistellaan 2-3 minuuttia. Suodatetaan.5 SUORITUSTehdään 340 nm:n aallonpituudelle kalibroidulla spektrofotometrillä absorptiomittaukset 1 cm:n kyvettejä käyttäen; absorbanssiasteikko nollataan ilmaa (ei kyvettiä) vastaan. Mitataan 1 cm:n kyvetteihin:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan; noin 5 minuutin kuluttua luetaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssit (A1).Lisätään:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan; odotetaan reaktion päättymistä (noin 5 minuuttia) ja luetaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssit (A2).Lasketaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssien erotus (A1 - A2).Lasketaan vertailuliuoksen absorbanssien erotuksen ja määritysliuoksen absorbanssien erotuksen erotus:ÄA = ÄAD - ÄATHuomautus: Entsyymien aktiivisuuden loppuunsaattamiseksi tarvittava aika voi vaihdella eri erien kohdalla. Edellä annettu arvo on vain ohjeellinen. On suositeltavaa määrittää se erikseen jokaisesta erästä.6 TULOSTEN ILMOITTAMINENSitruunahappopitoisuus ilmoitetaan kokonaislukuna milligrammoina litrassa (mg/l).6.1 LaskentamenetelmäKonsentraatio milligrammoina litrassa saadaan yleisestä yhtälöstä:C = >NUM>V × MP/>DEN>å × d × v × Ä A>TAULUKON PAIKKA>Saadaan:C = 479 × ÄAJos näytettä valmistettaessa on tehty laimennus, kerrotaan tulos laimennuskertoimella.Huomautus:>TAULUKON PAIKKA>6.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>6.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>18. MAITOHAPPO 1 PERIAATE1.1 VertailumenetelmäMaitohapot (L-laktaatti ja D-laktaatti) hapetetaan nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidilla (NAD) pyruvaatiksi L-laktaattidehydrogenaasin (L-LDH) ja D-laktaattidehydrogenaasin (D-LDH) katalysoimassa reaktiossa.Reaktion tasapaino on laktaatin puolella. Pyruvaatin poistaminen reaktioseoksesta siirtää reaktion tasapainon pyruvaatin muodostumisen suuntaan.L-glutamaatti muuttaa pyruvaatin L-alaniiniksi glutamaatti-pyruvaatti-transaminaasin (GPT) katalysoimassa reaktiossa:1) L-laktaatti + NAD+>KAAVION ALKU>L-LDH>KAAVION LOOPU>pyruvaatti + NADH + H+2) D-laktaatti + NAD+>KAAVION ALKU>D-LDH>KAAVION LOOPU>pyruvaatti + NADH + H+3) Pyruvaatti + L-glutamaatti>KAAVION ALKU>GPT>KAAVION LOOPU>L-alaniini + á-ketoglutaraattiNADH:n muodostuminen, joka mitataan absorbanssin kasvuna aallonpituudella 340 nm, on verrannollinen laktaattimäärään.Huomautus:L-maitohappo voidaan määrittää erikseen reaktioilla 1 ja 3.D-maitohappo voidaan määrittää erikseen reaktioilla 2 ja 3.1.2 Tavanomainen menetelmäAnioninvaihtokolonnilla erotettu maitohappo hapetetaan asetaldehydiksi ja määritetään kolorimetrisesti antamalla aldehydin ensin reagoida natriumnitroprussidin ja piperidiinin kanssa.2. VERTAILUMENETELMÄ2.1 Reagenssit2.1.1 Standardiliuos pH 10 (glysyyliglysiini 0,6 mol/l; L-glutamaatti 0,1 mol/l).Liuotetaan 4,75 g glysyyliglysiiniä ja 0,88 g L-glutaamihappoa noin 50 ml:aan kahdesti tislattua vettä; säädetään pH arvoon 10 muutamalla millilitralla 10 M natriumhydroksidiliuosta ja täytetään 60 ml:ksi kahdesti tislatulla vedellä.Liuos säilyy vähintään 12 viikkoa + 4 °C:ssa.2.1.2 Nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NAD) -liuos, noin 40 × 10-3 M; liuotetaan 900 mg NAD:tä 30 ml:aan kahdesti tislattua vettä. Liuos säilyy vähintään 4 viikkoa + 4 °C:ssa.2.1.3 Glutamaatti-pyruvaatti-transaminaasi (GPT) -liuos, 20 mg/ml. Liuos säilyy vähintään yhden vuoden + 4 °C:ssa.2.1.4 L-laktaattidehydrogenaasi (L-LDH) -liuos, 5 mg/ml. Liuos säilyy vähintään yhden vuoden + 4 °C:ssa.2.1.5 D-laktaattidehydrogenaasi (D-LDH) -liuos, 5 mg/l. Liuos säilyy vähintään yhden vuoden + 4 °C:ssa.On suositeltavaa varmistaa entsyymin aktiivisuus ennen määritystä.Huomautus: Kaikki määritykseen tarvittavat reagenssit ovat kaupallisesti saatavilla.2.2 Välineistö2.2.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittauksia 340 nm:ssä, jossa NADH:n absorptio on korkeimmillaan.Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään epäjatkuvan spektrin omaavaa fotometriä, jolla voidaan tehdä mittauksia 334 tai 365 nm:ssä.Jos kyseessä ovat absoluuttiset absorbanssimittaukset (ei käytetä kalibrointisarjoja, vaan NADH:n ekstinktiokerrointa), laitteen aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen on oltava tarkistettuja.2.2.2 Lasikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm, tai kertakäyttöisiä kyvettejä.2.2.3 Mikropipettejä, joilla voidaan pipetoida 0,02-2 ml:n suuruisia näytteitä.2.3 Näytteen valmistaminenReaktioseosten kanssa kosketuksiin joutuvia lasitavaroiden osia ei saa koskea sormin, sillä kosketuksesta voi siirtyä reaktioseokseen tuloksen vääristävää L-maitohappoa.Laktaatin määrittäminen tehdään yleensä suoraan viinistä ilman, että väriaineet poistetaan ennen määrittämistä tai viini laimennetaan, jos maitohappopitoisuus on alle 100 mg/l. Jos viinin maitohappokonsentraatio on välillä:100 mg/l-1 g/l laimennetaan suhteessa 1/10 kahdesti tislatulla vedellä,1-2,5 g/l laimennetaan suhteessa 1/25 kahdesti tislatulla vedellä,2,5-5 g/l laimennetaan suhteessa 1/50 kahdesti tislatulla vedellä.2.4 Suoritus2.4.1 Kokonaismaitohappopitoisuuden määrittäminenStandardiliuoksen lämpötilan on oltava 20-25 °C ennen määrityksen aloittamista.Tehdään aallonpituudelle 340 nm kalibroidulla spektrofotometrillä absorptiomittaukset 1 cm:n kyvettejä käyttäen, absorbanssiasteikko nollataan ilmaa (ei kyvettiä) tai vettä vastaan.Mitataan kyvetteihin, joiden optinen pituus on 1 cm:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan lasisekoittajalla tai synteettisestä materiaalista valmistetulla litteäpäisellä puikolla; noin 5 minuutin kuluttua luetaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssit (A1).Lisätään 0,02 ml 2.1.4 -liuosta ja 0,05 ml 2.1.5 -liuosta, homogenoidaan, odotetaan reaktion päättymistä (noin 30 minuuttia) ja mitataan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssit (A2).Lasketaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssien erotus (A2-A1).Lasketaan vertailuliuoksen absorbanssien erotuksen ja määritysliuoksen absorbanssien erotuksen erotus:ÄA = ÄAM - ÄAV2.4.2 L-maitohapon ja D-maitohapon määrittäminenL-maitohappo ja D-maitohappo voidaan määrittää erikseen noudattaen kokonaismaitohapon määritysmenetelmää, mutta A1:n määrittämisen jälkeen jatketaan määritystä seuraavasti:Lisätään 0,02 ml 2.1.4 -liuosta, homogenoidaan, odotetaan reaktion loppuun kulumista (noin 20 minuuttia) ja mitataan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssit (A2).Lisätään 0,05 ml 2.1.5 -liuosta, homogenoidaan, odotetaan reaktion loppuun kulumista (noin 30 minuuttia) ja mitataan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssit (A3).Lasketaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssien erotus L-maitohapon (A2-A1) ja D-maitohapon (A3-A2) osalta.Lasketaan vertailuliuoksen absorbanssien erotuksen ja määritysliuoksen absorbanssien erotuksen erotus:ÄA = ÄAM - ÄAVHuomautus:Entsyymiaktiivisuuden loppuun saattamiseksi tarvittava aika voi vaihdella eri erien kohdalla. Edellä annettu arvo on vain ohjeellinen. On suositeltavaa määrittää se erikseen jokaiselle erälle. Määritettäessä ainoastaan L-maitohappoa L-laktaattidehydrogenaasin lisäämisen jälkeen inkubointiaika voidaan vähentää 10 minuuttiin.2.5 Tulosten ilmoittaminenMaitohappopitoisuus ilmoitetaan grammoina litrassa (g/l) yhdellä desimaalilla.2.5.1 LaskentamenetelmäKonsentraatio grammoina litrassa lasketaan yleisellä yhtälöllä:C = >NUM>V × MP/>DEN>å × d × v × 1 000 × Ä A>TAULUKON PAIKKA>2.5.1.1 Kokonaismaitohappo ja D-maitohappoC = 0,164 × ÄAJos näytettä valmistettaessa on tehty laimennus, kerrotaan tulos laimennuskertoimella.Huomautus:>TAULUKON PAIKKA>2.5.1.2 L-maitohappoC = 0,160 × ÄAJos näytettä valmistettaessa on tehty laimennus, kerrotaan tulos laimennuskertoimella.Huomautus:>TAULUKON PAIKKA>2.5.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>2.5.3 Uusittavuus (R)R = 0,05 + 0,125x1 g/l.xi är mjölksyrakoncentrationen i provet i g/l.3. TAVANOMAINEN MENETELMÄ3.1.1 Viinin esikäsittelyKs. luku « Viinihappo », tavanomainen menetelmä, 3.1.1 kohta.3.1.2 Maitohapon måärittäminen3.1.2.1 0,1 M cerium(IV)sulfaattiliuos 0,35 M rikkihapossa.Pidetään linos viileänä ja liuotetaan 40,431 g cerium(IV)sulfaattia, Ce(SO4)2, 4H2O, 350 ml:aan tarkalleen mitattua 1 M rikkihappoliuosta (3.1.2.4). Täytetään 1 000 ml:ksi tislatulla vedellä.3.1.2.2 2,5 M natriumhydroksidiliuos (NaOH).3.1.2.3 Natriumasetaattiliuos, 270 g/l (valmistetaan kuivasta natriumasetaatista, NaCH3COO).3.1.2.4 1 M rikkihappoliuos (H2SO4).3.1.2.5 (m/v) natriumnitrosinihappoliuos [Na2(Fe(CN)5NO × 2H2O]Säilytetään valolta suojattuna hyvin suljetussa pullossa.Liuoksen säilytysaika on 8 päivää.3.1.2.6 1 (v/v) piperidiiniliuos (C5H11N).3.1.2.7 1 M maitohappoliuos.Liuotetaan 100 ml maitohappoa (C3H6O3) 400 ml:aan vettä. Liuos kaadetaan haihdutusmaljaan ja sitälämmitetään kiehuvassa vesihauteessa 4 tunnin ajan täyttämällä tilavuus ajoittain tislatulla vedellä. Jäähtymisen jälkeen täytetään yhdeksi litraksi. Titrataan maitohappo 10 ml:sta tätä liuosta 1 M natriumhydroksidiliuoksella (3.1.2.8). Säädetään linos 1 M maitohapoksi (90 g).3.1.2.8 1 M natriumhydroksidiliuos (NaOH).3.2 Välineistö3.2.1 Lasikolonni, jonka pituus on noin 300 mm ja sisähalkaisija 10-11 mm, ja joka on varustettu hanalla virtauksen säätämiseksi.3.2.2 Vesihaude, joka on säädetty 65 °C:seen.3.2.3 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä absorbanssimittaukset aallonpituudella 570 nm, ja kyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm.3.3 Suoritus3.3.1 loninvaihtokolonnin valmistaminenKs. luku « Viinihappo », tavanomainen menetelmä, 3.3.1 kohta.3.3.2 Orgaanisten happojen erottaminenKs. luku « Viinihappo », tavanomainen menetelmä, 3.3.2 kohta.3.3.3 Maitohapon määrittäminenMitataan 50 ml:n hiostulpalliseen lasiseen koeputkeen 10 ml eluaattia, lisätään 10 ml ceriumsulfaattiliuosta (3.1.2.1). Sekoitetaan; asetetaan koeputki 65 °C:seen säädettyyn vesihauteeseen tarkalleen 10 minuutiksi. Upotusvaiheessa irrotetaan tulppa muutaman sekunnin ajaksi siten, että lämmittämisestä aiheutuva paine tasoittuu ja tämän jälkeen suljetaan koeputki tiiviisti, jotta vältetään muodostuvan asetaldehydin hä- viäminen. Otetaan koeputki hauteesta, jäähdytetään virtaavan veden alla noin 20 °C:ksi, lisätään 5 ml 2,5 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.2.2), sekoitetaan ja suodatetaan.Otetaan 15 ml suodosta 50 ml:n hiokselliseen mittapulloon, joka sisältää homogeenisena seoksena 5 ml 27 %:sta natriumasetaattia (3.1.2.3) ja 2 ml 1 M rikkihappoa (3.1.2.4). Lisätään 5 ml natrium- nitroprussidiliuosta (3.1.2.5), sekoitetaan ja tämän jälkeen lisätään 5 ml piperidiiniliuosta (3.1.2.6), sekoitetaan nopeasti ja kaadetaan viipymättä tämä linos spektrofotometrin kyvettiin. Vihreästä violettiin vaihteleva väri mitataan 570 nm:ssä ilmaa (ei kyvettiä) vastaan: värin voimakkuus kasvaa ja sitten heikkenee nopeasti.Vastaavan absorbanssin kehitystä seurataan ja valitaan lopulliseksi arvoksi sen suurin arvo.Jos eluaatti sisältää runsaasti maitohappoa ja absorbanssi on liian korkea, laimennetaan eluaatti 7,1 % natriumsulfaattiliuoksella (3.1.1) ja tehdään mittaus laimennetusta liuoksesta.3.3.4 Kalibrointikäyrän esittäminen gruafisestiMitataan 1 000 ml: n mittapulloon 10 ml maitohappoliuosta (3.1.2.7) ja 10 ml titrattua 1 M natriumhydroksidiliuosta (3.1.2.8) ja täytetään merkkiin 7,1 % natriumsulfaattiliuoksella. Otetaan tätä liuosta 100 ml:n mittapulloihin 5, 10, 15, 20 ja 25 ml. Täytetään merkkiin 7,1 % natriumsulfaattiliuoksella (3.1.1). Otetaan jokaista liuosta 10 ml ja määritetään näille absorbanssiarvo 3.3.3 kohdan mukaisesti.Nämä liuokset vastaavat eluaatteja, jotka saadaan 0,45; 0,9; 1,35; 1,80 ja 2,25 g/l maitohappoa sisältävistä viineistä.Näiden liuosten absorbanssien graafinen kuvaaja maitohappopitoisuuden funktiona on suora.3.4 Tulosten ilmoittaminenEtsitään kalibrointikäyrältä eluaatille mitattu absorbanssi ja tätä vastaava viinin maitohappopitoisuus grammoina litrassa.Tämä pitoisuus ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.Huomautus: Yli 250 mg/l rikkidioksidia sisältävissä viineissä voi olla hydroksietaanisulfonihappoa, jokalasketaan mukaan maitohappopitoisuuteen. Tässä tapauksessa määritystulos on kojattava tuloksella, jokasaadaan seuraavalla lisämäärityksellä: 15 ml eluaattia sekoitetaan hiostulpalla sulje tussa koeputkessa 5 ml: aan 27 % natriumasetaattia (3.1.2.3)ja 2 ml: aan 0,775 M H2SO4:a (77,5 ml 1 M H2SO4 täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä). Tämän jälkeen lisätään, kuten maitohappoa määritettäessä, 5 ml 2 % natriumnitroprussidia (3.1.2.5) ja 5 ml 10 % piperidiinia (3.1.2.6). Sekoittamisen jälkeen mitataan absorbanssi maitohapon määrittämisessä kuvatuissa koeolosuhteissa. Tämä absorbanssi sijoitetaan kalibrointikäyrälle,jotta saataisiin hydroksietaanisulfonihaposta johtuva näennäinen arvo B maitohappoa grammoina litrassa. Jos L on viinin sisältämän maitohapon näennäinen pitoisuus grammoina litrassa, todellinen maitohappopitoisuus L saadaan:L = L'   B × 0,4 (g/l)19. L-OMENAHAPPO 1 PERIAATENikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NAD) hapettaa L-omenahapon (L-malaatti) oksaaliasetaatiksi L- malaattidehydrogenaasin (L-MDH) katalysoimassa reaktiossa.Reaktion tasapaino on malaatin puolella. Oksaaliasetaatin poistaminen reaktioseoksesta siirtää reaktion tasapainoa oksaaliasetaatin muodostumisen suuntaan. L-glutamaatinläsnäollessa oksaaliasetaatti muutetaan L-aspartaatiksi glutamaatti-oksaaliasetaatti-transaminaasin (GOT) katalysoimassa reaktiossa:1) L-malaatti + NAD+>KAAVION ALKU>L-MDH>KAAVION LOOPU>oksaaliasetaatti + NADH + H+2) Oksaaliasetaatti + L-glutamaatti>KAAVION ALKU>GOT>KAAVION LOOPU>L-aspartaatti + á-ketoglutaraattiMuodostunut NADH mitataan absorbanssin kasvuna aallonpituudella 340 nm ja se on verrannollinen L-maltaatin määrään.2 REAGENSSIT2.1 Puskuriliuos pH 10(Glysyyliglysiini 0,6 mol/l, L-glutamaatti 0,1 mol/l).Liuotetaan 4,75 g glysyyliglysiiniä ja 0,88 g L-glutaamihappoa noin 50 ml: aan kahdesti tislattua vettä; säädetään pH arvoon 10 noin 4,6 ml:lla 10 M natriumhydroksidiliuosta ja täytetään 60 ml:ksi kahdesti tislatulla vedellä.Liuos säilyy vähintään 12 viikkoa + 4 °C:ssa.2.2 Nikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NAD) -liuos, noin 40 × 10-3 M; liuotetaan 420 mg NAD:tä 12 ml:aan kahdesti tislattua vettä. Liuos säilyy vähintään 4 viikkoa + 4 °C:ssa.2.3 Glutamaatti-oksaaliasetaatti-transaminaasi (GOT) -liuos, 2 mg/ml. Liuos säilyy vähintään yhden vuoden + 4 °C:ssa.2.4 L-malaattidehydrogenaasi (L-MDH) -liuos, 5 mg/ml. Liuos säilyy vähintään yhden vuoden + 4 °C: ssa.Huomautus: Kaikki määritykseen tarvittavat reagenssit ovat kaupallisesti saatavilla.3 VÄLINEISTÖ3.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä absorbanssimittaukset aallonpituudella 340 nm, jossa NADH: n absorptio on korkeimmillaan.Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään epäjatkuvan spektrin omaavaa fotometriä, jolla voidaan tehdä mittauksia 334 tai 365 nm:ssä.Jos kyseessä ovat absoluuttiset absorbanssimittaukset (ei käytetä kalibrointisarjoja, vaan NADH:n ekstink- tiokerrointa), laitteen aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen on oltava tarkistettuja.3.2 Lasikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm, tai kertakäyttöisiä kyvettejä.3.3 Mikropipettejä, joilla voidaan pipetoida 0,01   2 ml:n suuruisia tilavuuksia.4 NÄYTTEEN VALMISTAMINENL-malaatin määrittäminen tehdään tavallisesti suoraan viinistä ilman, että väriaineet poistetaan ennen määrittämistä tai viini laimennetaan, jos L-omenahappopitoisuus on alle 350 mg/l (mitattu 365 nm:ssä). Jos näin ei ole, laimennetaan viini kahdesti tislatulla vedellä siten, että sen L-malaattikonsentraatio on välillä 30 350 mg/l (näytteen L-malaattimäärä välillä 3 35 ìg).Jos viinin malaattikonsentraatio on alle 30 mg/l, näytteen tilavuus voidaan nostaa 1 ml: aan. Tässä tapauksessa lisättävän veden tilavuutta vähennetään siten, että molemmissa kyveteissä kokonaistilavuus on sama.5. SUORITUSTehdään aallonpituudelle 340 nm kalibroidulla spektrofotometrillä absorptiomittaukset 1 cm:n kyvettejä käyttäen; absorbanssiasteikko nollataan ilmaa (ei kyvettiä) tai vettä vastaan.Mitataan kyvetteihin, joiden optinen pituus on 1 cm:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan; noin 3 minuutin kuluttua mitataan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssi (A1).Lisätään:>TAULUKON PAIKKA>Sekoitetaan; odotetaan reaktion päättymistä (noin 5-10 minuuttia) ja mitataan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssi (A2).Lasketaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssien erotus (A2   A1).Lasketaan vertailuliuoksen absorbanssien erotuksen ja määritysliuoksen absorbanssien erotuksen erotus:ÄA = ÄAD   ÄATHuomautus: Entsyymiaktiivisuuden loppuun saattamiseksi tarvittava aika voi vaihdella eri erien kohdalla. Edellä annettu arvo on vain ohjeellinen. On suositeltavaa määrittää se erikseen jokaisesta erästä.6. TULOSTEN ILMOITTAMINENL-omenahappokonsentraatio ilmoitetaan grammoina litrassa (g/l) yhdellä desimaalilla.6.1 LaskentamenetelmäKonsentraatio grammoina litrassa lasketaan yleisellä yhtälöllä:C = >NUM>V × MP/>DEN>å × d × v × 1 000 × Ä A>TAULUKON PAIKKA>L-malaatille saadaan:C = 0,473 × Ä A g/lJos näytettä valmistettaessa on tehty laimennus, kerrotaan tulos laimennuskertoimella.Huomautus:>TAULUKON PAIKKA>6.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>6.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>20. D-OMENAHAPPO (entsyymimenetelmä) KOEYHDISTELMÄ NOIN 30 MÄÄRITYKSEEN1. PERIAATENikotiiniamidi-adeniini-dinukleotidi (NAD) hapettaa D-omenahapon (D-malaatti) oksaaliasetaatiksi D- malaattidehydrogenaasi-dekarboksyylin (D-MDH) läsnäollessa. Muodostunut oksaaliasetaatti hajoaa pyruvaatiksi ja hiilidioksidiksi.D-malaatti + NAD>KAAVION ALKU>D-MDH>KAAVION LOOPU>pyruvaatti + CO2 + NADH + H+Muodostunut NADH mitataan absorbanssin kasvuna aallonpituudella 334, 340 ja 365 nm ja se on verrannollinen D-malaatin määrään.2. KOEYHDISTELMÄN SISÄLTÖa) Pullo 1, joka sisältää noin 30 ml Hepes 4(2-hydroksietyyli-l-pipentseinetaani-sulfonihappo) -pusku-riliuosta, pH = 9,0 ja stabilointiaineita,b) Pullo 2, joka sisältää noin 210 mg NAD-lyofilisaattia,c) 3 pulloa 3, jotka sisältävät D-MDH-lyofilisaattia, jokainen noin 8 U.2.1 Liuosten valmistaminen2.1.1 2 a kohdan pullon sisältö käytetään laimentamattomana. Ennen käyttöä saatetaan liuos 20   25 °C:ksi.2.1.2 Liuotetaan 2 b kohdan pullon sisältö 4 ml:aan kahdesti tislattua vettä.2.1.3 Liuotetaan 2 c kohdan pullojen sisältö 0,6 ml:aan kahdesti tislattua vettä. Ennen käyttöä saatetaan liuos 20-25 °C:ksi.2.2 Liuosten säilyvyys2.1.1 kohdan pullon sisältö säilyy vähintään yhden vuoden ajan + 4 °C:ssa. Liuos 2.1.2 säilyy noin 3 viikkoa + 4 °C:ssa ja 2 kuukautta   20 °C:ssa.Liuos 2.1.3 säilyy 5 päivää + 4 °C:ssa.3. VÄLINEISTÖ3.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittaukset aallonpituudella 340 mn, jossa y NADH:n ja NADPH:n absorptio on korkeimmillaan.Jos tällaista spektrofotometriä ei ole saatavissa, käytetään epäjatkuvan spektrin omaavaa fotometriä, jolla voidaan tehdä mittauksia 334 tai 365 nm:ssä.3.2 Lasikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm, tai kertakäyttöisiä kyvettejä.3.3 Mikropipettejä, joilla voidaan pipetoida 0,01   2 ml:n suuruisia tilavuuksia.4. NÄYTTEEN VALMISTAMINENKyvetin sisältämän D-malaattimäärän on oltava välillä 2-50 ìg. Tämän vuoksi näyteliuos on laimennettava siten, että malaattikonsentraatio on välillä 0,02-0,5 g/l ja vastaavasti 0,02-0,3 g/l.Jos absorptioero ÄA on TAULUKON PAIKKA>Lasketaan vertailu- ja määritysliuosten absorbanssien erotus (A2 A1). Lasketaan vertailuliuoksen absorbanssien erotuksen ja määritysliuoksen absorbanssien erotuksen erotus:ÄA = ÄAM   ÄAV6. TULOSTEN ILMOITTAMINEND-omenahapon pitoisuus ilmoitetaan grammoina litrassa (g/l) yhdellä desimaalilla.6.1 LaskentamenetelmäKonsentraatio lasketaan seuraavalla yleisellä yhtälöllä:C = >NUM>V × MP/>DEN>å × d × v × 1 000 × Ä A (g/l)>TAULUKON PAIKKA>>TAULUKON PAIKKA>Tästä D-malaatille saadaan:C = >NUM>2,95 × 134,9/>DEN>å × 1 × 0,1 × 1 000 × Ä A = >NUM>3,956/>DEN>å × Ä A (D-malaattig/näyteliuos)Jos näytettä valmistettaessa on tehty laimennus, kerrotaan tulos laimennuskertoimella F.6.2 Toistettavuus (r)r = 0,05 xi6.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>21. KOKONAISOMENAHAPPO TAVANOMAINEN MENETELMA1 PERIAATEAnioninvaihtokolonnilla erotettu omenahappo määritetään kolorimetrisesti eluaatista mittaamalla keltainen väri, joka saadaan 96 % rikkihapon kromotropahapon avulla. Eluaatin sisältämät aineet häiritsevät reaktiossa. Nämä aineet reagoivat vielä, toisin kuin omenahappo, 86 % rikkihapossa kromotropahapon kanssa. Häiriön poistamiseksi vähennetään kromotropahapolla 96 % rikkihapossa saadusta absorbanssista kromatokropahapolla 86 % rikkihapossa saatu absorbanssi.2 VÄLINEISTÖ2.1 Lasikolonni, jonka pituus on noin 250 mm ja sisähalkaisija 35 mm ja joka on varustettu hanalla.2.2 Lasikolonni, jonka pituus on noin 300 mm ja sisähalkaisija 10 11 mm ja joka on varustettu hanalla.2.3 Vesihaude, 100 °C.2.4 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä absorbanssimittaukset aallonpituudella 420 nm, ja kyvettejä, joiden optinen pituus on 10 mm.3 REAGENSSIT3.1 Vahvasti emäksinen anioninvaihtohartsi (esimerkiksi Merck III).3.2 5 % (m/v) natriumhydroksidi.3.3 30 % (m/v) etikkahappo.3.4 0,5 % (m/v) etikkahappo.3.5 10 % (m/v) natriumsulfaattiliuos (Na2SO4).3.6 95 97 % (m/m) väkevä rikkihappo.3.7 86 % (m/m) rikkihappo.3.8 5 % (m/v) kromotropahappoliuos.Tuore liuos valmistetaan ennen jokaista määritystä liuottamalla 500 mg kromotropahapon natriumsuolaa (C10H6Na2O8S2, 2H2O) 10 ml:aan tislattua vettä.3.9 DL-omenahappoliuos, 0,5 g/l.Liuotetaan 250 mg/l omenahappoa (C4H6O5) riittävään määrään 10 % natriumsulfaattiliuosta (3.5) ja täytetään 500 ml:ksi.4 SUORITUS4.1 Ioninvaihtohartsin esikäsittelyAsetetaan tislatulla vedellä kostutettu vanutuppo kolonnin (35 × 250 mm) pohjalle hanan yläpuolelle. Kaadetaan anioninvaihtohartsi lasikolonniin. Nesteen olisi ulotuttava 50 mm hartsin yläpuolelle. Huuhdotaan 1 000 ml: lla tislattua vettä. Pestään kolonni natriumhydroksidiliuoksella (5 %), annetaan valua 2 3 mm hartsin yläpuolelle, toistetaan 5 % natriumhydroksidiliuoksella pesu kaksi kertaa ja annetaan seistä tunnin ajan. Pestään kolonni 1 000 ml:lla tislattua vettä. Täytetään kolonni uudelleen 30 % etikkahapolla, annetaan valua 2-3 mm etäisyydelle hartsin yläpinnasta ja toistetaan 30 % etikkahapolla pesu kaksi kertaa. Annetaan seistä vähintään 24 tuntia ennen käyttöä. Myöhempiä määrityksiä varten ioninvaihtohartsia säilytetään etikkahapossa (30 %).4.2 Ioninvaihtokolonnin valmistaminenAsetetaan vanutuppo kolonnin (11 × 300 mm) pohjalle hanan yläpuolelle. Kaadetaan 4.1 kohdassa kuvatulla tavalla valmistettua ioninvaihtohartsia lasikolonniin 10 cm:n korkeudelle. Avataan hana ja annetaan etikkahappoliuoksen (30 %) valua 2 3 mm hartsin yläpuolelle. Pestään 50 ml: lla etikkahappoa (0,5 %).4.3 DL-omenahapon erottaminenKaadetaan 4.2 kohdan mukaisesti valmistettuun kolonniin 10 ml viiniä tai rypälemehua. Annetaan virrata tipoittain (keskimääräinen virtausnopeus 1 tippa sekunnissa) ja pysäytetään virtaus 2 3 mm hartsin yläpuolelle. Pestään kolonni 50 ml: lla etikkahappoa (0,5 %) ja tämän jälkeen 50 ml:lla tislattua vettä, annetaan virrata samalla nopeudella kuin edellä ja pysäytetään virtaus 2 3 mm etäisyydelle hartsin yläosasta.Eluoidaan hartsiin absorboituneet hapot 10 % natriumsulfaattiliuoksella (3.5). Kerätään eluaatti 100 ml:n mittapulloon.Kolonni voidaan regeneroida käyttäen 4.1 kohdassa kuvattua menetelmää.4.4 Omenahapon määrittäminenOtetaan kaksi laajakaulaista lasihiostulpallista 30 ml: n putkea ja nimetään ne putkiksi A ja B. Lisätään molempiin putkiin 1,0 ml eluaattia (4.3) ja 1 ml kromotropahappoa (5 %). Lisätään putkeen A 10 ml 86 % rikkihappoa (vertailu) ja putkeen B 10 ml 96 % rikkihappoa (nayte). Suljetaan ja homogenoidaan ravistelemalla lasitulpan kastumista varoen. Upotetaan putket kiehuvaan vesihauteeseen tarkalleen 10 minuutiksi. Jäähdytetään putkia valolta suojattuna 20 °C:ssa tarkalleen 90 minuuttia. Mitataan absorbanssi viipymättä vertailunäytettä vastaan 420 nm:ssä 10 mm:n kyvetissä.4.5 Kalibrointikäyrän esittäminen graafisestiPipetoidaan neljään 50 ml:n mittapulloon 5,0; 10,0; 15,0 ja 20 ml näytettä. Täytetään merkkiin natriumsulfaattiliuoksella (10 %).Nämä liuokset vastaavat eluaatteja, jotka saadaan 0,5; 1,0; 1,5 ja 2,0 g/l omenahappoa sisältävistä viineista.Jatketaan 4.4 kohdassa kuvatulla tavalla.Näiden liuosten absorbanssien graafinen kuvaaja maitohappopitoisuuden funktiona on origon kautta kulkeva suora.Syntyvän värin intensiteetti riippuu suuressa määrin käytetyn rikkihapon vakevyydesta. On tarpeen tarkistaa kalibrointi jokaisen suorasarjan suhteen ainakin yhdellä pisteellä sen tarkastamiseksi, onko rikkihapon väkevyys muuttunut.5. TULOSTEN ILMOITTAMINENArvioimalla mitatusta absorbanssista kalibrointikäyrän avulla eluaatin konsentraatio saadaan vastaava omenahappokonsentraatio g/l. Tulos ilmoitetaan yhdellä desimaalilla.Toistettavuus:>TAULUKON PAIKKA>Uusittavuus:R = 0,3 g/l.22. SORBIINIHAPPO 1. PERIAATE1.1 Määrittäminen ultraviolettiabsorptiospektrofotometrisestiSorbiinihappo (trans. 2,4-heksadieenihappo), joka on erotettu vesihöyrytislauslaitteistolla, määritetään viinitisleestä ultraviolettiabsorptiospektrofotometrisesti. Ultravioletin absorptiomittauksessa häiriöitä aiheuttavat aineet poistetaan haihduttamalla hieman emaksiseksi tehty tislenäyte kuivaksi kalsiumhydroksidiiiuokselia. Alle 20 mg/l olevat pitoisuudet on varmistettava ohutlevykromatografialla (herkkyys: 1 mg/l).1.2 Määrittäminen kaasukromatografiallaEtyylieetterissä erotettu sorbiinihappo määritetään kaasukromatografialla sisäisen standardin kanssa.1.3 Jälkien tunnistaminen ohutlevykromatografiallaEtyylieetterissä erotettu sorbiinihappo erotetaan ohutlevykromatografialla ja sen konsentraatio arvioidaan semi-kvantitatiivisesti.2. MÄÄRITTÄMINEN ULTRAVIOLETTIABSORPTIOSPEKTROFOTOMETRISESTI2.1 Reagenssit2.1.1 Kiteinen viinihappo (C4H6O6).2.1.2 Noin 0,02 M kalsiumhydroksidiliuos, Ca (OH)2.2.1.3 Sorbiinihappovertailuliuos, 20 mg/l.Liuotetaan 20 mg sorbiinihappoa, C4H8O6, noin 2 ml:aan 0,1 M natriumhydroksidiliuosta. Kaadetaan 1 000 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin vedellä. Voidaan myös liuottaa 26,8 mg kaliumsorbaattia, C6H7KO2, veteen ja täyttää 1 000 ml:ksi vedellä.2.2 Välineistö2.2.1 Vesihöyrytislauslaite (ks. "Haihtuvat hapot").2.2.2 Vesihaude, 100 °C.2.2.3 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittaukset aallonpituudella 256 nm, ja kvartsikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm.2.3 Suoritus2.3.1 TislausMitataan 10 ml viiniä vesihöyrytislauslaitteen tislauskolviin, lisätään 1-2 g viinihappoa (2.2.1). Kerätään 250 ml tislettä.2.3.2 KalibrointikäyräValmistetaan vertailuliuoksesta (2.3.1) veteen 4 laimennettua vertailuliuosta, joiden pitoisuudet ovat 0,5; 1; 2,5 ja 5 mg viinihappoa litrassa; mitataan spektrofotometrillä niiden absorbanssit tislattua vettä vastaan 256 nm: ssä. Piirretaan absorbanssin kuvaaja, joka esittää muutoksen konsentraatioiden funktiona. Kuvaaja on lineaarinen.2.3.3 MääritysMitataan 55 mm halkaisijaltaan olevaan haihdutusmaljaan 5 ml tislettä, lisätään 1 ml kalsiumhydroksidfiiuosta (2.1.2). Haihdutetaan kuivaksi kiehuvassa vesihauteessa.Liuotetaan jäännös muutamaan millilitraan tislattua vettä, siirretään kvantitatiivisesti 20 ml:n mittapulloonja täytetään merkkiin huuhteluvedellä. Mitataan absorbanssi spektrofotometrillä 256 nm:ssä vertailuliuostavastaan, joka on saatu laimentamalla 1 ml kalsiumhydroksidil iuo sta (2.1.2) 20 ml:lla vettä.Merkitään mitattu absorbanssiarvo kalibrointikäyrälle ja johdetaan siitä liuoksen sorbiinihappokonsentraatio C.Huomautus: Käytännössä kuivaksi haihduttaminen voidaan ohittaa. Mitataan absorbanssi tislattua vettävastaan suoraan tisleestä, joka on laimennettu suhteessa 1/4.2.4 Tulosten ilmoittaminen2.4.1 LaskentamenetelmäViinin sorbiinihappokonsentraatio ilmoitettuna milligrammoina litrassa on:100 × CC = spektrofotometrisesti määritetyn liuoksen sorbiinihappokonsentraatio, ilmoitettuna milligrammoina litrassa.3 MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFIALLA3.1 Reagenssit3.1.1 Etyylieetteri, (C2H5)2O, tislataan juuri ennen käyttöä.3.1.2 Sisäinen standardiliuos: undekaanihappoliuos, C11H22O2, 95 til-% etanolissa ja pitoisuus 1 g/l.3.1.3 Vedellä laimennettu nkkihappo, H2SO4 (ñ= 1,84 g/ml), laimennettu suhteessa 1/3 (v/v).3.2 Välineistö3.2.1 Kaasukromatografi, jossa on liekki-ionisaatiodetektori ja ruostumattomasta teräksestä valmistettu kolonni(4 m × 1/8 tuuma), joka on käsitelty dimetyylikloorisilaanilla ja pakattu stationaarifaasilla, Gaschrom Q80 - 100 mesh, johon sidottu dietyleeniglykolisukkinaatin (5 %) ja fosforihapon (1 %) seos (DEGS - H3PO4) tai dietyleeniglykoliadipaatin (7 %) ja fosforihapon (1 %) seos (DEGA - H3PO4).Dimetyylikloorisilaani (DMDCS) -käsittelyssä johdetaan kolonnin läpi liuosta, jovka sisältää 2 3 gDMDCS:ia tolueenissa. Pestään kolonni välittömästi metanolilla; johdetaan kolonnllll typpivirta ja tämän jälkeen hekseenivirta ja uudelleen typpivirta. Tämän jälkeen se täytetään.Suoritusolosuhteet:Uunin lämpötila: 175 °C.Injektorin ja detektorin lämpötila: 230 °C.Kantokaasu: typpi (virtausnopeus 20 ml/min).3.2.2 Vetoisuudeltaan 10 mikrolitraa oleva mikroruisku, jonka asteikko on jaettu 0,1 mikrolitran välein.Huomautus: Myös muilla kolonneilla voidaan saada aikaan hyvä erottuminen, erityisesti kapillaarikolonnilla (esimerkiksi FFAP).Jäljempänä kuvattu suoritus annetaan esimerkkinä.3.3 Suoritus3.3.1 Näytteen valmistaminen määritystä vartenKaadetaan noin 40 ml: n hiostulpalliseen lasiseen koeputkeen 20 ml viiniä, lisätään 2 ml sisäistä standardiliuosta (3.1.2) ja 1 ml laimennettua rikkihappoliuosta (3.1.3).Sekoitetaan liuos kääntelemällä koeputkea ylösalaisin, lisätään putkeen 10 ml etyylieetteriä (3.1.1). Uutetaan sorbiinihappo orgaaniseen faasiin ravistelemalla putkea 5 minuutin ajan. Annetaan erottua.3.3.2 Vertailuliuoksen valmistaminenValitaan viini, jonka eetteriuutteen kromatogrammissa ei esiinny yhtään sorbiinihapon eluoitumista vastaavaa piikkiä; lisätään tähän viiniin sorbiinihappoa 100 mg litrassa. Käsitellään 20 ml näin valmistettua näytettä 3.3.1 kohdassa kuvatulla tavalla.3.3.3 KromatografiaInjektoidaan kromatografiin mikroruiskulla vuorotellen 2 ìl 3.3.2 kohdassa kuvatulla tavalla saatua eetterifaasia ja 2 ìl 3.3.1 kohdassa kuvatulla tavalla saatua eetterifaasia.Tulostetaan vastaavat kromatogrammit: tarkistetaan sorbiinihapon ja sisäisen standardin retentioaikojen identtisyys. Mitataan molempien piikkien korkeus tai pinta-ala.3.4 Tulosten ilmoittaminen3.4.1 LaskentamenetelmäMääritetyn viinin sorbiinihappokonsentraatio, ilmoitettuna milligrammoina litrassa, on:100 × >NUM>h/>DEN>H × >NUM>1/>DEN>i>TAULUKON PAIKKA>Huomautus: Sorbiinihappokonsentraatio voidaan määrittää samalla tavoin vastaavien piikkien pinta-alojen mittauksista.4 SORBIINIHAPPOJÄLKIEN TUNNISTAMINEN OHUTLEVYKROMATOGRAFIALLA4.1 Reagenssit4.1.1 Etyylieetteri, (C2H5)2O.4.1.2 Vedellä laimennettu rikkihappo, H2SO4 (ñ = 1,84 glml), laimennettu suhteessa 1/3 (v/v).4.1.3 Sorbiinihappovertailuliuos, noin 10 til-% etanoli-vesiseoksessa, 20 mg/l.4.14 Liikkuva faasi: heksaani   pentaani   etikkahappo (20:20:3)(C6H14 - C5H12 - CH3COOH, ñ = 1,05 g/ml).4.2 Välineistö4.2.1 Käyttövalmiita ohutlevykromatografialevyjä, 20 × 20 cm jotka on päällystetty polyamidigeelillä (paksuus:0,15 mm), johon on lisätty fluorenssi-indikaattoria.4.2.2 Ohutlevykromatografiakammio4.2.3 Tarkkuudeltaan ± 0,1 mikrolitraa oleva mikropipetti tai mikroruisku, jolla voidaan siirtää 5 mikrolitransuuruisia tilavuuksia.4.2.4 Ultraviolettilamppu (254 nm).4.3 Suoritus4.3.1 Näytteen valmistaminen määritystä vartenKaadetaan noin 25 ml: n hiostulpalliseen lasiseen koeputkeen 10 ml viiniä, lisätään 1 ml laimennettuarikkihappoliuosta (4.1.2) ja 5 ml etyylieetteriä (4.1.1). Sekoitetaan kääntelemällä koeputkea ylösalaisin. Annetaan erottua.4.3.2 Laimennettujen vertailuliuosten valmistaminenValmistetaan 4.1.3 kohdan liuoksesta 5 laimennettua vertailuliuosta, joissa pitoisuudet ovat 2, 4, 6, 8 ja 10 mg sorbiinihappoa litrassa.4.3.3 KromatografiaAnnostellaan mikroruiskulla tai mikropipetillä 2 cm etäisyydelle levyn alareunasta ja 2 cm etäisyydelletoisistaan 5 ìl eetterifaasia, joka on saatu 4.3.1 kohdassa kuvatulla tavalla ja 5 ìl kaikkia laimennettujavertailuliuoksia (4.3.2).Pannaan liikkuvaa faasia (4.1.4) kromatografiakammioon noin 0,5 cm korkeuteen ja annetaan kammionilman kyllästyä liuotinhöyrystä. Asetetaan levy kammion. Annetaan levyn kehittyä 12 15 cm: iin(kehittymisaika noin 30 minuuttia). Kuivataan levy kylmässä ilmavirrassa. Tutkitaan kromatogrammiultraviolettilampun alla 254 nm:ssä.Sorbiinihappotäplät ilmenevät tumman violetteina levyn fluorenssikeltaista taustaa vasten.4.4 Tulosten ilmoittaminenMääritettävän näytteen ja vertailuliuosten täpliä vertailemalla voidaan arvioida semi-kvantitatiivisestisorbiinihappokonsentraatio välillä 2 10 mg litrassa. Suuruudeltaan 1 mg litrassa oleva konsentraatio voidaan määrittää 10 ìl:n suuruisesta näyte-erästä.10 mg litrassa suuremmat konsentraatiot voidaan määrittää alle 5 ìl:n suuruisesta näyteliuoserästä (mitattumikroruiskulla).23. L-ASKORBIINIHAPPO 1. MENETELMIEN PERIAATEEhdotetuilla menetelmillä on mahdollista määrittää viineissä ja rypälemehuissa oleva L-askorbiinihappo ja dehydroaskorbiinihappo.1.1 Vertailumenetelmä (fluorometria)L-askorbiinihappo hapetetaan aktiivihiilellä dehydroaskorbiinihapoksi. Tämä muodostaa fluoresoivan yhdisteen reagoimalla ortofenyleenidiamiinin (OPDA) kanssa. Vertailukokeella boorihapon kanssa voidaan määrittää häiriöfluorenssi (boorihappo - dehydroaskorbiinihppo -kompleksin muodostumisella) ja johtaa siitä fluorometrinen määritys.1.2 Tavanomainen menetelmä (kolorimetria)L-askorbiinihappo hapetetaan jodilla dehydroaskorbiinihapoksi. Tämä saostuu 2,4-dinitrofenyylihydrat siinilla ja tuottaa bis(2,4-dinitrofenyylihydratsoni):n. Ohutlevykromatografialla erottamisen ja etikkahappoiseen liuokseen liuottamisen jälkeen y tämä väriltään punainen yhdiste määritetään spektrofo tometrillä 500 nm:ssä.2. VERTAILUMENETELMÄ (FLUOROMETRINEN MENETELMÄ)2.1 Reagenssit2.1.1 Ortofenyleenidiamiini- dihydrokloridi -liuos (C6H10Cl2N2), 0,02 g/100 ml, valmistetaan juuri ennen käyttöä.2.1.2 Natriumasetaatti trihydraatti (CH3COONa-3H2O), 500 g/l.2.1.3 Boorihapon ja natriumasetaatin liuos.Liuotetaan 3 g boorihappoa (H3BO3) 100 ml: aan natriumasetaattiliuosta (2.1.2). Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.2.1.4 Jääetikkaliuos CH3COOH, (ñ = 1,05 g/ml) laimennettu 56 %: ksi (v/v), pH noin 1,2.2.1.5 L-askorbiinihappo-vertailuliuos, 1 g/l:Liuotetaan juuri ennen käyttöä 50 mg L-askorbiinihappoliuosta (C6H8O6), joka on aiemmin kuivattu eksikkaattorissa valolta suojattuna, 50 ml:aan etikkahappoliuosta (2.1.4).2.1.6 Erittäin puhdas analyysilaatua oleva aktiivihiili(11)Mitataan 2 l:n erlenmeyerpulloon 100 g aktiivihiiltä, lisätään 500 ml 10 % (v/v) kloorivetyhappoliuosta (Hcl), (ñ20 = 1,19 g/ml). Kuumennetaan kiehuvaksi, suodatetaan huokoisuudeltaan 3 olevaa lasisintteriä käyttäen. Kerätään tällä tavoin käsitelty hiili 2 l: n pulloon, lisätään 1 l vettä, ravistellaan ja suodatetaan huokoisuudeltaan 3 olevaa lasisintteriä käyttäen. Toistetaan tämä suoritus kaksi kertaa. Asetetaan jäännös 115 ± 5 °C:n uuniin 12 tunnin ajaksi (esimerkiksi yhdeksi yöksi).2.2 Välineistö2.2.1 Fluorometri. Käytetään spektrofluorometriä, jossa lamppu antaa jatkuvan spektrin, kun sitä käytetään sen pienimmällä teholla. Kokeen optimaaliset heräte- ja emissioaallonpituudet määritetään ennen suoritusta ja ne riippuvat käytetystä laitteesta. Ohjeellinen heräteaallonpituus on noin 350 nm ja ohjeellinen emissioaallonpituus noin 430 nm.Kyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm.2.2.2 Huokoisuudeltaan 3 oleva lasisintteri.2.2.3 Koeputkia (halkaisija noin 10 mm).2.2.4 Sekoitin koeputkille.2.3 Suoritus2.3.1 Viini- ja rypälemehunäytteen valmistaminenOtetaan tilavuus viiniä tai rypälemehua ja laimennetaan se mittapullossa 100 ml: ksi 56 % etikkahappoliuoksella (2.1.4) siten, että saadaan liuos, jonka L-askorbiinihappokonsentraatio on välillä 0 60 mg/litra. Homogenoidaan mittapullon sisältö ravistelemalla. Lisätään 2 g aktiivihiiltä (2.1.6) ja annetaan seistä 15 minuutin ajan ajoittain ravistellen. Suodatetaan tavallisen suodatinpaperin läpi hyläten suodoksen ensimmäiset millilitrat.Mitataan kahteen 100 ml:n mittapulloon 5 ml suodosta ja ensimmäiseen mittapulloon 5 ml boorihapon ja natriumasetaatin liuosta (2.1.3) (vertailu) ja toiseen mittapulloon 5 ml natriumasetaattiliuosta (2.1.2) (näyte). Annetaan seistä 15 minuuttia ajoittain ravistellen, täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä.Otetaan 2 ml kummankin mittapullon sisällöstä, lisätään 5 ml ortofenyleenidiamiiniliuosta (2.1.1), ravistellaan; annetaan reagoida 30 minuuttia kunnes liuos tummenee, tämän jälkeen tehdään mittaus spektrofluorometrillä.2.3.2 KalibrointikäyräMitataan kolmeen 100 ml:n mittapulloon 2, 4 ja 6 ml L-askorbiinihappo-vertailuliuosta (2.1.5), täytetään 100 ml:ksi etikkahappoliuoksella (2.1.4), homogenoidaan ravistelemalla. Valmistetut vertailuliuokset sisältävät 2 4 6 mg/100 ml.Lisätään 2 g aktiivihiiltä (2.1.6) jokaiseen mittapulloon ja annetaan seistä 15 minuuttia ajoittain ravistellen. Suodatetaan tavallisen suodatinpaperin läpi hyläten suodoksen ensimmäiset millilitrat. Mitataan jokaista kerättyä suodosta 5 ml kolmeen 100 ml:n mittapulloon (ensimmäinen sarja), toistetaan suoritus toisen kolmen mittapuilosaijan saamiseksi. Lisätään jokaiseen ensimmäisen sarjan mittapulloon (vastaavat vertailunäytettä) 5 ml boorihapon ja natriumasetaatin liuosta (2.1.3) ja jokaiseen toisen sarjan mittapulloon 5 ml natriumasetaattiliuosta (2.1.2).Annetaan seistä 15 minuuttia ajoittain ravistellen, täytetään 100 ml: ksi tislatulla vedellä. Otetaan 2 ml jokaisesta mittapullosta, lisätään 5 ml ortofenyleenidiamiiniliuosta (2.1.1), ravistellaan, annetaan reagoida 30 minuuttia kunnes liuos tummenee, tämän jälkeen tehdään mittaus spektrofluorometrillä.2.3.3 Fluorometrinen måäritysSäädetään jokaiselle kalibrointiliuokselle ja määritysliuokselle nollakohta mittausasteikolla käyttäen vastaavia vertailukoenäytteitä. Tämän jälkeen mitataan fluorenssin intensiteetti jokaiselle kalibrointisarjan liuokselle ja määritysliuokselle.Piirretään kalibrointikäyrä: sen on oltava lineaarinen ja kuljettava origon kautta. Etsitään tältä kuvaajalta määritystä vastaava arvoj ajohdetaan määritettävän liuoksen L-askorbiinihapon + dehydroaskorbiinihapon pitoisuus C.2.3.4 Tulosten ilmoittaminenViinin L-askorbiinihappo + dehydroaskorbiinihappo -konsentraatio, ilmoitettuna milligrammoina litrassa, on:C × FF = laimennuskerroin3. TAVANOMAINEN MENETELMÄ (KOLORIMETRINEN MENETELMÄ)3.1 Reagenssit3.1.1 30 % (m/v) metafosforihappoliuos.Otetaan 30 g aiemmin huhmareessa jauhettua metafosforihappoa (HPO3)n. Pestään nopeasti upottamalla tislattuun veteen ja ravistelemalla. Liuotetaan pesty happo tislattuun veteen 100 ml:n mittapullossa ravistellen, täytetään merkkiin. Saadun liuoksen metafosforihappopitoisuus noin 30 % (m/v).3.1.2 3 % (m/v) metafosforihappoliuos, valmistettu juuri ennen käyttöä laimentamalla liuos 3.1.1 tislatulla vedellä suhteessa 1/10.3.1.3 1 % (m/v) metafosforihappoliuos, valmistettu juuri ennen käyttöä laimentamalla liuos 3.1.1 tislatulla vedellä suhteessa 1/30.3.1.4 Polyamidisuspensio.Suspendoidaan 10 g kromatografiaan tarkoitettua polyamidijauhetta ja 60 ml tislattua vettä, annetaan seistä 2 tuntia. Valmistettu määrä riittää 4 määritykseen.3.1.5 Tiourea (H2NCSNH2).3.1.6 0,05 M jodiliuos (I2).3.1.7 6 % (m/v) 2,4-dinitrofenyylihydratsiiniliuos. Suspendoidaan 6 g 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia (C6H6N4O4) 50 ml:aan jääetikkaa(ñ20 = 1,05 g/ml); lisätään 50 ml rikkihappoa (ñ20 = 1,84 g/ml); liuotetaan 2,4- dinitrofenyylihydratsiini ravistelemalla.3.1.8 Etyyliasetaatti (C4H802), johon on lisätty 2 % (v/v) jääetikkaa (3.1.12).3.1.9 Kloroformi (CHCl3).3.1.10 0,5 % (m/v) tärkkelyksen vesiliuos.3.1.11 Liikkuva faasi:>TAULUKON PAIKKA>Annetaan liuotinseoksen seistä 12 tuntia ennen käyttöä.3.1.12 Jääetikka CH3COOH (ñ20 = 1,05 g/ml).3.1.13 L-askorbiinihappoliuos, 0,1 g/100 ml 1 % metafosforihappoliuos (3.1.3).3.2 Välineistö3.2.1 Laboratoriosentrifugi ja 50 ml: n hiostulpallisia sentrifugiputkia.3.2.2 Kylmä vesihaude, joka on säädetty välille 5 10 °C.3.2.3 Vesihaude, joka on säädetty 20 °C:seen.3.2.4 Käyttövalmiita ohutlevykromatografialevyjä, 20 × 20 cm, jotka on päällystetty silikageelillä G (paksuus: 0,25 tai 0,3 mm).3.2.5 Kromatografiakammio.3.2.6 Mikropipetti, jolla voidaan mitata 0,2 ml:n suuruisia tilavuuksia.3.2.7 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä absorbanssimittauksia 500 nm:ssä, ja kyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm.3.3 Suoritus3.3.1 L-askorbiinihapon hapettaminen dehydroaskorbiinihapoksiMitataan 50 ml viiniä 100 ml:n mittapulloon, lisätään 15 ml polyamidisuspensiota (3.1.4) ja täytetään merkkiin 3 % metafosforihappoliuoksella (3.1.2). Annetaan seistä tunnin ajan ravistellen säännöllisin välein. Suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi. Kerätään 20 ml suodosta sentrifugiputkeen, lisätään 1 ml 0,05 M jodiliuosta (3.1.6). Homogenoidaan tulpalla suljetun sentrifugiputken sisältö ravistelemalla ja minuutin kuluttua poistetaan ylimääräinen jodi lisäämällä noin 25 mg tioureaa.3.3.2 Diketogulonihapon bis (2,4-dinitrofenyylihydratsoni) -johdannaisen muodostuminen ja uuttaminenAsetetaan putki 5 10 °C:seen jäähdytettyyn vesihauteeseen, lisätään 4 ml 2,4-dinitro fenyylihydratsiiniliuosta (3.1.7). Homogenoidaan putken sisältö varoen tulpan kastumista. Avataan putki huolellisestija asetetaan se 20 °C:n vesihauteeseen noin 16 tunnin ajaksi (esimerkiksi yhdeksi yöksi).Lisätään sentrifugiputkeen 15 ml etyyliasetaattia (3.1. 8), suljetaan putkiuudelleen, ravistellaan 30 sekuntiaja sentrifugoidaan 5 minuutin ajan käyttäen 350 400 g:n keskipakoisvoimaa. Pipetoidaan 10 ml etyyliasetaattiuutetta hiostulpalliseen pulloon. Lisätään sentrifugiputken sisältöön 5 ml etyyliasetaattia (3.1.8). Suljetaan putki. Ravistellaan 30 sekuntia ja sentrifugoidaan 5 minuuttia samalla nopeudella. Otetaan 5 ml etyyliasetaattiuutetta ja lisätään tämä tilavuus pullon sisältämään ensimmäiseen uuteliuokseen. Homogenoidaan seos sekoittamalla.3.3.3. Bis (2,4-dinitrofenyylihydratsonin) erottaminen kromatografialla: tehdään uuttamista seuraavien 2 tunninaikana (3.3.2)Levitetään vaakasuorana vyöhykkeenä 2 cm:n etäisyydelle levyn ala- ja sivureunoista 0,2 ml etyyliasetaattiuutetta. Pannaan liikkuvaa faasia (3.1.11) kammioon noin 1 cm korkeuteen ja annetaan kammion ilman kyllästyä liuotinhöyryistä. Asetetaan levy kammioon, annetaan liuottimen nousta levyn yläreunaan saakka, kuivataan levyä vetokaapissa tunnin ajan. Irrotetaan lastalla kohtisuorasti nousuvyöhykettä vastaan punaiseksi värjäytynyt vyöhyke (ominaista 2,4-dinitro fenyylihydratsonille). Kerätään aine kiiltopaperille ja siirretään se kvantitatiivisesti hiostulpalliseen mittapulloon, lisätään 4 ml etikkahappoa (3.1.12). Annetaan seistä 30 minuutin ajan ravistellen säännöllisesti. Suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi suoraan spektrofotometrin kyvettiin (3.2.7). Suodoksen on oltava kirkasta. Säädetään etikkahapolla (3.1.12) absorbanssiasteikon nollakohta 500 nm:ssä, mitataan nesteen absorbanssi.3.3.4 KalibrointikäyräMitataan kolmeen 100 ml:n mittapulloon 5, 10 ja 15 ml L-askorbiinihappoliuosta (3.1.13), täytetään merkkiin 1 % metafosforihappoliuoksella (3.1.3). Valmistetut liuokset sisältävät 50, 100 ja 150 mg/litrassa askorbiinihappoa.Otetaan kutakin liuosta 50 ml ja menetellään 3.3.1; 3.3.2 ja 3.3.3 kohdassa kuvatulla tavalla. Piirretään kalibrointikäyrä, jonka on oltava lineaarinen ja kuljettava origon kautta.3.3.5 Tulosten ilmaiseminenViinin L-askorbiinihappo + dehydroaskorbiinihappo -konsentraatio ilmoitetaan milligrammoina litrassa.3.3.5.1 LaskeminenEtsitaan kalibrointikäyrältä 3.3.3 kohdassa mitattu absorbanssiarvo ja johdetaan siitä maaritetyn liuoksen L-askorbiinihappo + dehydroaskorbiinihappo -konsentraatio.Huomautus: Jos L-askorbiinihappo + dehydroaskorbiinihappo -konsentraatio on yli 150 mg/l, pienennetään viininäytteen tilavuutta 25, 20 tai 10 ml:aan ja kerrotaan saatu tulos laimennuskertoimella F.24. pH 1 PERIAATEMitataan potentiaaliero kahden tutkittavaan nesteeseen upotetun elektrodin välillä. Toisen elektrodin potentiaali on nesteen pH:n funktio, toisen potentiaali on kiinteä ja tunnettuja se muodostaa vertailuelektrodin.2 LAITTEET2.1 pH-mittari, jonka asteikko on kalibroitu pH-yksiköiksi ja jolla voidaan tehdä mittaukset vähintään 0,05 pH-yksikön tarkkuudella.2.2 Elektrodit:2.2.1 Lasielektrodi, säilytetään tislatussa vedessä.2.2.2. Kalomeli/kyllästetty natriumklo ridi -vertailuelektrodi, säilytetään kyllästetyssä kaliumkloridiliuoksessa.2.2.3 Tai yhdistetty elektrodi, säilytetään tislatussa vedessä.3 REAGENSSIT3.1 Puskuriliuokset:3.1.1 Kaliumvetytartraatilla kyllästetty liuos. Liuos sisältää vähintään 5,7 g/l kaliumvetytartraattia (C4H5KO6) 20 °C:ssa. Tätä liuosta voidaan säilyttää 2 kuukautta lisäämällä siihen 0,1 g tymolia 200 ml:aa kohti.>TAULUKON PAIKKA>3.1.2 0,05 M kaliumvetyftalaattiliuos. Liuos sisältää 10,211 g/l kaliumvetyftalaattia (C8H5KO4) 20 °C:ssa. (Pisin säilytysaika: 2 kuukautta).>TAULUKON PAIKKA>3.1.3 Liuos, joka sisältåä:>TAULUKON PAIKKA>(Pisin säilytysaika: 2 kuukautta)>TAULUKON PAIKKA>Huomautus: Voidaan käyttää myös kaupallisia vertailupuskuriliuoksia.4 SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminen määritystä varten4.1.1 Rypälemehu ja viiniKäytetään rypälemehua tai viiniä sellaisenaan.4.1.2 Puhdistettu tiivistetty rypalemehuLaimennetaan puhdistettu tiivistetty rypälemehu vedellä, jotta saataisiin suuruudeltaan 25 + 0,5 % (m/m) oleva kokonaissokerikonsentraatio (25°Brix).Jos P on puhdistetun tiivistetyn rypälemehun kokonaissokerin pitoisuus prosentteina (m/m), punnitaan massa, joka vastaa>NUM>2 500/>DEN>Pja täytetään 100 g:ksi vedellä. Käytetyn veden johtokyvyn on oltava alle 2 mikrosiemensiä senttimetriä kohti.4.2 Laitteen säätäminen nollaanLaitteen säätäminen nollaan tehdään ennen mittausta käytetyn laitteen käyttöohjeiden mukaisesti.4.3 pH-mittarin kalibrointiKalibrointi tehdään 20 °C:ssa puskuriliuoksilla, joiden pH-arvot 20 °C:ssa ovat 6,88 ja 3,57, käytetyn laitteen käyttöohjeiden mukaisesti.Asteikon kalibrointi tarkistetaan puskuriliuoksella, jonka pH-arvo 20 °C:ssa on 4,00.4.4 MittausUpotetaan elektrodi määritettävään näytteeseen, jonka lämpötilan on oltava välillä 20 25 °C ja mahdollisimman lähellä 20 °C. Luetaan pH-arvo suoraan asteikolta.Samasta näytteestä tehdään vähintään kaksi määritystä.Tulokseksi otetaan kahden määrityksen aritmeettinen keskiarvo.5 TULOSTEN ILMOITTAMINENRypälemehun, viinin tai 25 % (m/m) (25 °Brix) puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta valmistetun liuoksen pH-arvo ilmoitetaan kahdella desimaalilla.25. RIKKIDIOKSIDI 1 MÄÄRITELMÄTRikkidioksidilla tarkoitetaan rypälemehussa ja viinissä seuraavissa muodoissa olevaa rikkidioksidia: H2SO3, HSO3-. Näiden muotojen tasapaino on pH:n ja lämpötilan funktio:H2SO3>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>H+ + HSO3-H2SO3 edustaa molekulaarista rikkidioksidia.Kokonaisrikkidioksidilla tarkoitetaan viinissä vapaana olevien tai sen ainesosiin sitoutuneiden rikkidioksidimuotojen yhteenlaskettua määrää.2 VAPAA RIKKIDIOKSIDI JA KOKONAISRIKKIDIOKSIDI2.1 Menetelmien periaate2.1.1 Vertailumenetelmä2.1.1.1 Viinit ja rypälemehutRikkidioksidi erotetaan ilma- tai typpivirralla: se sidotaan ja hapetetaan kuplittamalla kaasuvirta laimenne- tun neutraalin vetyperoksidiliuoksen läpi. Muodostunut rikkihappo määritetään titraamalla natriumhydroksidiliuoksella. Vapaa rikkidioksidi erotetaan viinistä tislaamalla matalassa lämpötilassa (10 °C).Kokonaisrikkidioksidi erotetaan viinistä tislaamalla korkeassa lämpötilassa (noin 10 °C).2.1.1.2 Puhdistetut tiivistetyt rypälemehutKokonaisrikkidioksidi erotetaan kuumassa (noin 100 °C) aiemmin laimennetusta puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta.2.1.2 Nopea koemenetelmä (viinit ja rypälemehut)Vapaa rikkidioksidi määritetään suoralla jodometrisellä titrauksella.Tämän jälkeen määritetään sitoutunut rikkidioksidi emäs-hydrolyysin jälkeen jodometrisellä titrauksella. Kun se lisätään vapaaseen rikkidioksidiin, saadaan kokonaisrikkidioksidi.2.2 Vertailumenetelmä2.2.1 Välineistö2.2.1.1 Käytettävän laitteen, erityisesti jäähdyttimen, on oltava alla olevan kaavion mukainen.>VIITTAUS KAAVIOON>Kuva 1Mitat on annettu millimetreinä. Jäähdyttimen muodostaa neljä samankeskeistä putkea, joiden sisähalkaisijat ovat 45, 34, 27 ja 10 mm.Kaasun syöttöputki kuplimisastiassa B päättyy halkaisijaltaan 1 cm olevaan palloon, jonka laajimmalla vaakasuoralla kehällä on 20 halkaisijaltaan 0,2 mm olevaa reikää. Tämä putki voi myös päättyä huokoiseen lasilaattaan, jolla saadaan aikaan paljon pieniä kuplia ja tällä tavoin varmistetaan hyvä kosketus kaasu- ja nestefaasien välillä.Laitteen läpi kulkevan kaasuvirran nopeuden on oltava noin 40 l/h. Laitteen oikealla puolella olevan pullon tarkoituksena on rajoittaa vesipumpulla aikaan saatu paineen aleneminen 20 30 cm:iin vettä. Vakuumin säätämiseksi oikeaan arvoonsa olisi kuplimisastian ja pullon väliin sijoitettava puolikapillaariputkella varustettu virtausmittari.2.2.1.2 Mikrobyretti.2.2.2 Reagenssit2.2.2.1 85 % fosforihappo (H3PO4) (ñ20 = 1,71 g/ml).2.2.2.2 Vetyperoksidiliuos, 9,1 g H2O2/l (3 tilavuutta).2.2.2.3 Indikaattorireagenssi:>TAULUKON PAIKKA>2.2.2.4 Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 0,01 M2.2.3 Suoritus2.2.3.1 Vapaan rikkidioksidin määrittäminenViini on säilytettävä suljetussa täysinäisessä pullossa 20 °C:ssa 2 vuorokauden ajan ennen määritystä.- Kuplituslaitteeseen B mitataan 2 3 ml vetyperoksidiliuosta (2.2.2.2), 2 tippaa indikaattori-reagenssia ja neutraloidaan vetypéroksidiliuos 0,01 M natriumhydroksidiliuoksella (2.2.2.4). Liitetään kuplituslaite laitteeseen.- Tislauslaitteen 250 ml:n pulloon A mitataan 50 ml näytettä ja 15 ml fosforihappoa (2.2.2.1). Liitetään pullo laitteeseen.Tämän jälkeen kuplitetaan ilmaa (tai typpeä) 15 minuuttia. Ylikulkeutuva vapaa rikkidioksidi hapettuu rikkihapoksi. Irrotetaan kuplituslaite ja titrataan muodostunut happo 0,01 M natriumhydroksidiliuoksella (2.2.2.4). Käytetty millilitramäärä on n.2.2.3.2 Tulosten ilmoittaminenVapaa rikkidioksidi ilmoitetaan kokonaislukuna milligrammoina litrassa (mg/l).2.2.3.2.1 LaskeminenVapaa rikkidioksidi milligrammoina litrassa: 6,4 n.2.2.3.3 Kokonaisrikkidioksidin määrittäminen2.2.3.3.1 Määritettäessä puhdistettuja tiivistettyjä rypälemehuja käytetään liuosta, joka on saatu laimentamalla määritettävä näyte 40 %: ksi (m/v) luvussa « Kokonaishappopitoisuus » olevassa 5.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla. Tislauslaitteen 250 ml:n pulloon A mitataan 50 ml tätä liuosta ja 5 ml fosforihappoa (2.2.2.1). Liitetään pullo laitteeseen.2.2.3.3.2 Viinit ja rypälemehutNäytteen arvioitu pitoisuus &le; 50 mg/ kokonais-SO2|reset|} litrassa. Tislauslaitteen 250 ml:n pulloon A mitataan 50 ml näytettä ja 15 ml fosforihappoa (2.2.2.1). Liitetään pullo laitteeseen.Kuitenkin rypäletäysmehun rikkidioksidipitoisuuden määrittämisessä käytetään 31 päivään joulukuuta 1992 saakka 5 ml fosforihappoa (2.2.2.1), joka on laimennettu 25 %:ksi (m/v).2.2.3.3.3 Näytteen arvioitu pitoisuus &ge; 50 mg/kokonais-SO2 litrassa. Tislauslaitteen 250 ml:n pulloon A mitataan 20 ml näytettä ja 5 ml fosforihappoa (2.2.2.1). Liitetään pullo laitteeseen.Mitataan kuplitusastiaan B 2 3 ml vetyperoksidiliuosta (2.2.2.2), neutraloidaan se edellä kuvatulla tavalla, kuumennetaan pullon A sisältämä viini kiehumispisteeseen pienellä noin 4 5 cm korkealla liekillä, joka koskettaa suoraan pullon pohjaa. Pullon alle ei saa asettaa metalliverkkoa, mutta sen voi asettaa levylle, jossa on 30 mm halkaisijaltaan oleva reikä. Tällä tavoin vältetään viinistä erottuvien pullon seinämiin tarttuneiden aineiden ylikuumentuminen.Pidetään kiehuvana ja johdetaan samalla ilmavirtaa (tai typpivirtaa). 15 minuutissa kokonaisrikkidioksidi on kulkeutunut yli ja hapettunut. Määritetään muodostunut rikkihappo titraamalla 0,01 M natriumhydroksidilla (2.2.2.4).Käytetty millilitramäärä on n.2.2.3.4 Tulosten ilmoittaminenKokonaisrikkidioksidi ilmoitetaan kokonaislukuna milligrammoina litrassa (mg/l) tai vastaavasti milligrammoina kilogrammassa (mg/kg) kokonaissokeria.2.2.3.4.1 Laskeminen- Viinit ja rypälemehutKokonaisrikkidioksidipitoisuus milligrammoina litrassa.- näytteet, joiden rikkidioksidipitoisuus on matala (näyte 50 ml):6,4 × n- muut näytteet (näyte 20 ml):16 × n.- Puhdistetut tiivistetyt rypälemehutRikkidioksidi milligrammoina kilogrammassa kokonaissokeria (näyte 50 ml valmistetusta näytteestä) (2.2.3.3.1):>NUM>1600 ×/>DEN>n;PP = kokonaissokerin pitoisuus prosentteina (m/m)2.2.3.4.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>2.2.3.4.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>2.3 Nopea koemenetelmä2.3.1 Reagenssit2.3.1.1 EDTA (Complexone III): etyleenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuola (C10H14N2O8, 2H2O).2.3.1.2 4 M natriumhydroksidiliuos NaOH (160 g/l).2.3.1.3 Rikkihappo H2SO4(ñ20 = 1,84 g/ml, laimennettu suhteessa 1/10 (v/v)).2.3.1.4 Tärkkelysliuos, 5 g/l.Sekoitetaan 5 g tärkkelystä noin 500 ml:aan vetta. Kuumennetaan kiehuvaksi sekoittaenja annetaan kiehua 10 minuutin ajan; lisätään 200 g natriumkloridia (NaCI). Täytetään litraksi jäähtymisen jälkeen.2.3.1.5 0,025 M jodiliuos (I2).2.3.2 Välineet2.3.2.1 500 ml:n erlenmeyerpulloja.2.3.2.2 Byretti.2.3.2.3 1, 2, 5 ja 50 ml:n pipettejä.2.3.3 Suoritus2.3.3.1 Vapaa rikkidioksidiMitataan 500 ml:n erlenmeyerpulloon:- 50 ml viiniä,- 5 ml tärkkelysliuosta (2.3.1.4),- 30 mg EDTA (2.3.1.1),- 3 ml H2SO4, 1/10 (v/v) (2.3.1.3).Titrataan viipymättä 0,025 M jodilla (2.3.1.5), kunnes sininen väri säilyy selvänä 10 5 sekuntia. Käytetty joditilavuus on n.2.3.3.2 Sitoutunut rikkidioksidiLisätään 8 ml 4 M natriumhydroksidiliuosta (2.3.1.2), ravistetaan kerran ja annetaan seistä 5 minuutin ajan. Kaadetaan yhdellä kertaa voimakkaasti sekoittaen pieneen dekantterilasiin mitattu 10 ml 1/10 rikkihappoa (2.3.1.3). Titrataan viipymättä 0,025 M jodilla (2.3.1.5). Käytetty joditilavuus on n'.Lisätään 20 ml 4 M natriumhydroksidiliuosta (2.3.1.2), ravistetaan yhden kerran ja annetaan seistä 5 minuutin ajan. Laimennetaan 200 ml:lla jääkylmää vettä.Kaadetaan yhdellä kertaa voimakkaasti ravistellen koeputkeen mitattu 30 ml 1/10 rikkihappoa (2.3.1.3). Titrataan vapautunut rikkidioksidi 0,025 M jodilla (2.3.1.5). Käytetty joditilavuus on n''.2.3.4 Tulosten ilmoittaminen2.3.4.1 LaskeminenVapaa rikkidioksidi milligrammoina litrassa: 32n.Kokonaisrikkidioksidi milligrammoina litrassa: 32 (n + n' + n'').Huomautukset:1 Sellaisten punaviinien määrityksessä, joiden SO2-pitoisuus on matala, on hyödyllistä käyttää laimeampaa kuin 0,025 M jodia, esimerkiksi 0,01 M. Korvataan edellä esitettyjen yhtälöiden kerroin 32 kertoimella 12,8.2 Punaviinejä määritettäessä on hyödyllistä valaista viini alhaalta päin keltaisella valolla, joka saadaan antamalla tavallisen hehkulampun valaista kaliumkromaattiliuoksen läpi tai natriumlampulla. Määritys on tehtävä pimeässä huoneessa ja viinin läpikuultavuutta on tarkkailtava. Viini muuttuu sameaksi kun tärkkelyksen väri vaihtuu.3 Jos rikkidioksidin määrä on lähellä hyväksyttyä rajaa tai ylittää sen, kokonaisrikkidioksidipitoisuus on määritettävä vertailumenetelmällä.4 Jos vaaditaan erityisesti vapaan rikkidioksidin määrittämistä, se tehdään yleensä näytteestä, jota on pidetty ennen määritystä 2 päivän ajan anaerobisissa olosuhteissa 20 °C:n lämpötilassa; myös määritys tehdään tässä lämpötilassa.5 Koska jodi hapettaa tiettyjä aineita happamassa liuoksessa, tarkemmissa määrityksissä on tarpeen arvioida tähän käytetty jodimäärä. Tässä tarkoituksessa on sidottava vapaa rikkidioksidi ylimääräisellä asetaldehydillä tai propionaldehydillä ennen jodititrauksen tekemistä. Mitataan 300 ml:n mittapulloon 50 ml viiniä, lisätään 5 ml asetaldehydiliuosta (C2H4O, 7 g/l) tai 5 ml propionaldehydiliuosta (C3H6O, 10 g/l).Suljetaan pullo ja annetaan seistä vähintään 30 minuutin ajan. Lisätään 3 ml 1/10 rikkihappoa (2.3.1.3) ja tärkkelyksen värimuutokseen tarvittava määrä 0,025 M jodia (2.3.1.5). Käytetty joditilavuus on n'''. Se on vähennettävä n:stä (vapaa rikkidioksidi) ja n + n' + n'':stä (kokonaisrikkidioksidi).n''' on yleensä pieni: 0,2 0,3 ml 0,025 M jodia. Jos viiniin on lisätty sorbiinihappoa, n''' on paljon suurempi ja tämän aineen määrä voidaan mitata, ainakin likimain, n''' arvosta, sillä 1 ml 0,025 M jodia hapettaa 4,4 mg askorbiinihappoa. Määrittämällä n''' on mahdollista löytää helposti hapettumaton askorbiinihappojäännös viineistä, joihin on lisätty yli 20 mg/l askorbiinihappoa.3 MOLEKULAARINEN RIKKIDIOKSIDI3.1 Menetelmän periaateMolekulaarisen rikkodioksidin, H2SO3, prosentuaalinen osuus vapaassa rikkihapokkeessa arvioidaan pH:n, alkoholipitoisuuden ja lämpötilan funktiona.Kun lämpötila ja alkoholipitoisuus ovat annettuja:H2SO3>KAAVION ALKU>>KAAVION LOOPU>H+ + HSO3-[H2SO3] = >NUM>L/>DEN>10(pH × pkM) + 1(1)jossa pKM = pKT - >NUM>AI/>DEN>1 + BIL = [H2SO3] + [HSO3]I = ionivahvuusA ja B = kertoimet, jotka vaihtelevat lämpötilan ja alkoholipitoisuuden mukaanKT = termodynaaminen dissosiaatiovakioKM = yhdistetty dissosiaatiovakioKun ionivahvuuden I:n keskiarvoksi otetaan 0,038, saadaan taulukosta 2 ñÊM arvot lämpötilan ja alkoholipitoisuuden funktiona.Yhtälöä 1 käyttäen laskettu molekulaarinen rikkidioksidi saadaan taulukosta 3 pH:n, lämpötilan ja alkoholipitoisuuden funktiona.3.2 LaskeminenKun tunnetaan viinin pH-arvo ja sen alkoholipitoisuus, saadaan molekulaarisen rikkidioksidin prosentuaalinen osuus taulukosta 3 lämpötilassa t °C: tämä on X %.Molekulaarisen rikkidioksidin pitoisuus mg/l:X × CC = vapaan rikkidioksidin pitoisuus mg/l.TAULUKKO 1 >KAAVION ALKU>Termodynaamisen vakion pKT arvot>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>TAULUKKO 2 >KAAVION ALKU>Yhdistetyn vakion pKM arvot (I = 0,038)>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>TAULUKKO 3 >KAAVION ALKU>Molekulaarisen rikkidioksidin prosentuaalinen ossus vapaasta rikkidioksidista (I = 0,038)>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>TAULUKKO 3 (jatkoa) >KAAVION ALKU>Molekulaarisen rikkidioksidin prosentuaalinen osuus vapaasta rikkidioksidista (I = 0,038)>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>26. NATRIUM 1 MENETELMIEN PERIAATE1.1 Vertailumenetelmä: atomiabsorptiospektrofotometriaNatrium määritetään suoraan viinistä atorniabsorptiospektrofotometrisesti sen jälkeen, kun siihen on lisätty ionisaatiota vaimentavaksi aineeksi cesiumkloridia.1.2 Tavanomainen menetelmä: liekkifotometriaNatrium määritetään suoraan vähintään suhteessa 1/10 laimennetusta viinistä liekkifotometnsesti.2 VERTAILUMENETELMÄ2.1 Reagenssit2.1.1 Natriumliuos, 1 g/lKäytetään kaupallisesti saatavissa olevaa standardiliuosta, joka sisältää natriumia 1 g/l. Tarma liuos voidaan valmistaa liuottamalla 2,542 g kuivaa natriumkloridia, NaCl, tislattuun veteen ja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi.Tätä liuosta säilytetään polyetyleenipullossa.2.1.2 Matriisiliuos>TAULUKON PAIKKA>2.1.3 Cesiumkloridiliuos, joka sisältää 5 % cesiumiaLiuotetaan 6,330 g cesiumkloridia, CsCI, 100 ml:aan tislattua vettä.2.2 Laitteet2.2.1 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on ilma-asetyleenipoltin.2.2.2 Natriumonttokatodilamppu.2.3 Suoritus2.3.1 Näytteen valmistaminenMitataan 2,5 ml viiniä 50 ml:n mittapulloon, lisätään 1 ml cesiumklondiliuosta (2.1.3) ja täytetään merkkiin tislatulla vedellä.2.3.2 KalibrointiMitataan 100 ml:n mittapulloista koostuvan sarjan jokaiseen mittapulloon 5,0 ml matriisiliuosta, lisätään suhteessa 1/100 laimennettua 1 g/l natriumliuosta (2.1.1) 0; 2,5; 5; 7,5 ja 10 ml, lisätään kaikkiin pulloihin 2 ml cesiumkloridiliuosta (2.1.3) ja täytetään tilavuus 100 ml: ksi tislatulla vedellä.Valmistettujen vertailuliuosten pitoisuudet ovat 0; 0,25; 0,50; 0,75 ja 1,00 mg natriumia litrassa ja nesisältävät 1 g cesiumia litrassa. Näitä liuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa.2.3.3 MääritysValitaan aallonpituus 589,0 nm. Säädetään 1 g cesiumia litrassa sisältävällä matriisiliuoksella (2.3.2) absorbanssiasteikon nollakohta. Imetään laimennettu viini suoraan spektrofotometrin polttimoon ja tämänjälkeen vertailuliuokset (2.3.2) vuorotellen. Luetaan absorbanssit. Toistetaan määritykset.2.4 Tulosten ilmoittaminen2.4.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssi vertailuliuosten natriumkonsentraation funktiona.Etsitään käyrältä näytteelle saatujen absorbanssien keskiarvo ja luetaan vastaava natriumkonsentraatio Cmilligrammoina litrassa.Natriumkonsentraatio ilmoitettuna kokonaislukuná milligrammoina litrassa viiniä on: 20 × C2.4.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>2.4.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>3. Tavanomainen menetelmä3.1 Reagenssit3.1.1 Vertailuliuos, joka sisältää natriumia 20 mg/l>TAULUKON PAIKKA>3.1.2 Laimennusijuos>TAULUKON PAIKKA>Liuoksia 3.1.1 ja 3.1.2 valmistettaessa liuotetaan kaliumvetytartraatti noin 500 ml:aan hyvin kuumaatislattua vettä, sekoitetaan liuos muihin kemikaaleihin, jotka on tätä ennen liuotettu 400 ml:aan tislattuavettä, ja täytetään yhdeksi litraksi.Näitä liuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa lisäämällä niihin 2 tippaa allyyli-isotiosyanaattia.3.2 Laite3.2.1 Ilma butaani -seos liekkifotometri.3.3 Suoritus3.3.1 KalibrointiMitataan viiteen 100 ml:n mittapulloon 5; 10; 15; 20 ja 25 ml 20 mg/l natriumliuosta (3.1.1) ja täytetään100 ml:ksi laimennusliuoksella (3.1.2). Tällä tavoin saadaan liuokset, jotka sisältävät 1; 2; 3; 4 ja 5 mgnatriumia litrassa.3.3.2 MääritysTehdään mittaukset 589,0 nm:ssä. Säädetään 100-prosenttinen transmissio tislatulla vedellä. Imetään vertailuliuokset (3.3.1) vuorotellen suoraan fotometrin polttimoon ja tämän jälkeen tislatulla vedellä suhteessa 1/10 laimennettu viini ja kirjataan transmissioprosentit. Tarpeen vaatiessa laimennetaan jo suhteessa 1/10 laimennettu viini laimennusliuoksella (3.1.2).3.4 Tulosten ilmoittaminen3.4.1 LaskentamenetelmäPiirretään transmissioprosentit vertailuliuosten natriumkonsentraation funktiona. Etsitään tältä käyrältä viininäytteelle saatu transmissio ja määritetään natriumkonsentraatio C. Natriumkonsentraatio ilmoitettuna kokonaislukuna milligrammoina litrassa on:C × FF = laimennuskerroin.3.4.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>3.4.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>27. KALIUM 1. MENETELMIEN PERIAATE1.1 VertailumenetelmäKalium määritetään suoraan laimennetusta viinistä atomiabsorptiospektrofotometrisesti sen jälkeen, kun siihen on lisätty ionisaatiota vaimentavaksi aineeksi cesiumkloridia.1.2 Tavanomainen menetelmäKalium määritetään suoraan laimennetusta viinistä liekkifotometrisesti.2. VERTAILUMENETELMÄ2.1 Reagenssit2.1.1 Kaliumliuos, 1 g/lKäytetään kaupallisesti saatavissa olevaa standardiliuosta, joka sisältää kaliumia 1 g/l. Tämä liuos voidaanvalmistaa liuottamalla 4,813 g kaliumvetytartraattia (C4H5KO6) tislattuun veteen ja täyttämällä tilavuusyhdeksi litraksi.2.1.2 Matriisiliuos>TAULUKON PAIKKA>2.1.3 Cesiumkloridiliuos, joka sisältää 5 % cesiumiaLiuotetaan 6,330 g cesiumkloridia (CsCl) 100 ml:aan tislattua vettä.2.2 Laitteet2.2.1 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on ilma-asetyleenipoltin.2.2.2 Kaliumonttokatodilamppu.2.3 Suoritus2.3.1 Näytteen valmistaminenMitataan 2,5 ml viiniä (laimennettu suhteessa 1/10) 50 ml:n mittapulloon, lisätään 1 ml cesiumkloridiliuosta (2.1.3) ja täytetään merkkiin tislatulla vedellä.2.3.2 KalibrointiMitataan 100 ml:n mittapulloista koostuvan sarjan jokaiseen pulloon 5 ml matriisiliuosta (2.1.2), lisätäänkaliumliuosta (1 g/l) (2.1.1) (laimennettu suhteessa 1/10) 0; 2,0; 4,0; 6,0 ja 8,0 ml, lisätään kaikkiinpulloihin 2 ml cesiumkloridiliuosta (2.1.3), täytetään tilavuus 100 ml:ksi tislatulla vedellä. Valmistettujen vertailuliuosten pitoisuudet ovat 0; 2; 4; 6 ja 8 mg kaliumia litrassa ja ne sisältävät 1 g cesiumia litrassa. Näitä liuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa.2.3.3 MääritysValitaan aallonpituus 769,9 mn. Säädetään 1 g cesiumia litrassa sisältävällä matriisiliuoksella (2.3.2) absorbanssiasteikon nollakohta. Imetään laimennettu viini (2.3.1) suoraan spektrofotometrin po lttimoon ja tämän jälkeen vertailuliuokset (2.3.2) vuorotellen; luetaan absorbanssit. Toistetaan määritykset.2.4 Tulosten ilmoittaminen2.4.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit vertailuliuosten kaliumkonsentraation funktiona.Etsitään tältä käyrältä laimennetulle viininäytteelle saatujen absorbanssien keskiarvo ja luetaan vastaava kaliumkonsentraatio C milligrammoina litrassa.Kaliumkonsentraatio ilmoitettuna kokonaislukuna milligrammoina litrassa viiniä on: F × CF = laimennuskerroin (tässä 200).2.4.2 Toistettavuus (r)r = 35 mg/l.2.4.3 Uusittavuus (R)R = 66 mg/l.2.4.4 Muut tulosten ilmaisutavat- milliekvivalentteina litrassa: 0,0256 × F × C- milligrammoina kaliumvetytartraattia litrassa4,813 × F × C3. TAVANOMAINEN MENETELMÄ: LIEKKIFOTOMETRIA3.1 Reagenssit3.1.1 Vertailuliuos, joka sisältää kaliumia 100 mg/l>TAULUKON PAIKKA>Liuotetaan kaliumvetytartraatti noin 500 ml:aan hyvin kuumaa tislattua vettä, sekoitetaan seos muihin kemikaaleihin, jotka on tätä ennen liuotettu 400 ml:aan tislattua vettä ja täytetään yhdeksi litraksi.3.1.2 Laimennusliuos>TAULUKON PAIKKA>Näitä liuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa lisäämällä niihin 2 tippaa allyyli-isotiosyanaattia.3.2 Laitteet3.2.1 Ilma butaani -seoksella toimiva liekkifotometri.3.3 Suoritus3.3.1 KalibrointiMitataan neljään 100 ml:n mittapulloon 25; 50; 75 ja 100 ml vertailuliuosta (3.1.1) ja täytetään 100 ml:ksi laimennusliuoksella (3.1.2). Tällä tavoin saadaan liuokset, jotka sisältävät 25; 50; 75 ja 100 mg kaliumia litrassa.3.3.2 MääritysTehdään mittaukset 766 nm:ssä. Säädetään transmissio 100 %:iin tislatulla vedellä. Imetään vuorotellen suoraan fotometrin polttimoon vertailuliuokset (3.3.1) ja tämän jälkeen tislatulla vedellä suhteessa 1/10 laimennettu viini ja kirjataan transmissioprosentit. Tarpeen vaatiessa laimennetaan jo suhteessa 1/10 laimennettu viini laimennusliuoksella (3.1.2).3.4 Tulosten ilmoittaminen3.4.1 LaskentamenetelmäPiirretään transmissioprosentit vertailuliuosten kaliumkonsentraation funktiona vertailuliuoksissa. Etsitään tältä käyrältä laimennetulle viininäytteelle saatu transmissio ja luetaan vastaava kaliumkonsentraatio C.Kaliumkonsentraatio ilmoitettuna kokonaislukuna milligrammoina litrassa on:C × FF = laimennuskerroin.3.4.2 Toistettavuus (r)r = 17 mg/l3.4.3 Uusittavuus (R)R = 66 mg/l3.4.4 Muut tulosten ilmaisutavat- milliekvivalentteina litrassa: 0,0256 × F × C- milligrammoina kaliumvetytartraattia litrassa 4,813 × F × C.28. MAGNESIUM 1. PERIAATEMagnesium määritetään suoraan sopivasti laimennetusta viinistä atomiabsorptiospektro-fotometrisesti.2. REAGENSSIT2.1 Väkevä vertailuliuos, jonka magnesiumpitoisuus on 1 g/lKäytetään kaupallisesti saatavissa olevaa magnesiumstandardiliuosta, jonka pitoisuus on 1 g/l. Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 8,3646 g magnesiumkloridia (MgCl2, 6H2O) tislattuun veteen ja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi.2.2 Laimennettu standardiliuos, jonka magnesiumpitoisuus on 5 mg/lHuomautus:Näitä magnesiumstandardiliuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa.3. LAITTEISTO3.1 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on ilma-asetyleenipoltin.3.2 Magnesiumonttokatodilamppu.4. SUORITUS4.1 Naytteen valmistaminenLaimennetaan viini tislatulla vedellä suhteessa 1/100.4.2 KalibrointiMitataan 100 ml:n mittapulloista koostuvaan sarjaan 5; 10; 15 ja 20 ml liuosta 2.2 ja täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä. Valmistettujen vertailuliuosten pitoisuudet ovat 0,25; 0,50; 0,75 ja 1 mg magnesiumia litrassa. Näitä liuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa.4.3 MääritysValitaan aallonpituus 285 nm. Säädetään tislatulla vedellä absorbanssiasteikon nollakohta. Imetään laimennettu viini suoraan spektrofotometrin polttimoon ja tämän jälkeen vuorotellen 4.2 kohdan mukaisesti valmistetut vertailuliuokset.Luetaan absorbanssit; toistetaan määritykset.5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit vertailuliuosten magnesiumkonsentraation funktiona.Etsitään tältä käyrältä laimennetulle viininäytteelle saatujen absorbanssien keskiarvo ja luetaan vastaava magnesiumkonsentraatio C.Magnesiumkonsentraatio ilmoitettuna kokonaislukuna milligrammoina litrassa viiniä on:100 × C.5.2 Toistettavuus (r)r = 3 mg/l.5.3 Uusittavuus (R)R = 8 mg/l.29. KALSIUM 1. PERIAATEKalsium määritetään suoraan sopivasti laimennetusta viinistä atomiabsorptiospektrofotometrisesti sen jälkeen, kun siihen on lisätty ionisaation vaimentavaa ainetta.2. REAGENSSIT2.1 Vertailuliuos, jonka kalsiumpitoisuus on 1 g/lKaytetaan kaupallisesti saatavissa olevaa kalsiumstandardiliuosta, jonka pitoisuus on 1 g/l. Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 2,5 g kalsiumkarbonaattia (CaCO3) sen liuottamiseksi tarvittavaan määrään suhteessa 1/10 (v/v) laimennettua HCl:a ja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi tislatulla vedellä.2.2 Laimennettu standardiliuos, jonka kalsiumpitoisuus on 50 mg/lHuomautus: Näitä kalsiumstandardiliuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa.2.3 Lantaanikloridiliuos, jonka lantaanipitoisuus on 50 g/lLiuotetaan 13,369 g lantaanikloridia (LaCi3,7H2O) tislattuun veteen; lisätään 1 ml suhteessa 1/10 (v/v) laimennettua HCl:a ja täytetään tilavuus 100 ml:ksi.3. LAITTEISTO3.1 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on ilma-asetyleenipoltin.3.2 Kalsiumonttokatodilamppu.4. SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminenMitataan 20 ml:n mittapulloon 1 ml viiniä, 2 ml 2.3 liuosta ja täytetään merkkiin tislatulla vedellä. Suhteessa 1/20 laimennetun viinin lantaanipitoisuus on 5 g/l.Huomautus: Makeiden viinien määrityksessä riittää 5 g/l:n suuruinen lantaanikonsentraatio sillä edellytyksellä, että laimennuksen jälkeen sokeripitoisuus on vähintään 2,5 g/l. Jos viinin sokerikonsentraa- tio on korkeampi, on tarpeen säätää lantaanipitoisuus 10 g/l:aan.4.2 KalibrointiMitataan viiteen 100 ml:n mittapullon sarjaan 0; 5; 10; 15 ja 20 ml 2.2 liuosta, lisätään kaikkiin pulloihin 10 ml 2.3. liuosta ja taytetaan 100 ml:ksi tislatulla vedellä. Valmistettujen vertailuliuosten pitoisuudet ovat 0; 2,5; 5; 7,5 ja 10 mg kalsiumia litrassa ja ne sisältävät lantaania 5 g/l. Näitä liuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa.4.3 MääritysValitaan aallonpituus 422,7 nm. Saadetaan lantaania 5 g/l sisältävällä liuoksella (4.2) absorbanssiasteikon nollakohta. Imetään laimennettu viini suoraan spektrofotometrin polttimoon ja tämän jälkeen vuorotellen 4.2 kohdan mukaisesti valmistetut vertailuliuokset. Luetaan absorbanssit. Toistetaan maaritykset.5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskentamenetelmäPiirretaan absorbanssit vertailuliuosten kalsiumkonsentraation funktiona.Etsitään tältä käyrältä laimennetulle viininäytteelle saatujen absorbanssien keskiarvo ja luetaan vastaava kalsiumkonsentraatio C. Kalsiumkonsentraatio ilmoitettuna kokonaislukuna milligrammoina litrassa viiniä on:20 × C5.2 Toistettavuus (r)>TAULUKON PAIKKA>5.3 Uusittavuus (R)>TAULUKON PAIKKA>30. RAUTA 1. MENETELMIEN PERIAATE1.1 VertailumenetelmäRauta määritetään suoraan atomiabsorptiospektrofotometrisesti sen jälkeen, kun viini on laimennettu sopivassa suhteessa ja alkoholi on poistettu.Tavanomainen menetelmäViini digestoidaan 30 % vetyperoksidin kanssa, jolloin kaikki rauta hapettuu rauta(III):ksi. Rauta(III) pelkistetään rauta(II)-muotoon ja määritetään ortofenantroliinilla, joka antaa rauta(II):n kanssa punaisen värin.2. VERTAILUMENETELMÄ2.1 Reagenssit2.1.1 Väkevä vertailuliuos, jonka rauta(III)pitoisuus on 1 g/l.Käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa standardiliuosta, jonka rauta(III)pitoisuus on 1 g/l. Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 8,6341 g rauta(III)sulfaattia ja ammoniumsulfaattia (FeNH4(SO4)2, 12H2O) tislattuun 1 M kloorivetyhapolla happamaksi tehtyyn veteen ja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi.2.1.2 Laimennettu vertailuliuos, jonka rautapitoisuus on 100 mg/l.2.2 Laitteisto2.2.1 Pyöröhaihdutin ja säädettävä vesihaude.2.2.2 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on ilma-asetyleenipoltin.2.2.3 Rautaonttokatodilamppu.2.3 Suoritus2.3.1 Näytteen valmistaminenPoistetaan viinistä alkoholi haihduttamalla näytteen tilavuus puoleen alkuperäisestä pyöröhaih duttimessa (50-60 °C). Täytetään alkuperäiseen tilavuuteensa tislatulla vedellä.Tarpeen vaatiessa tehdään laimennus ennen määritystä.2.3.2 KalibrointiMitataan viiteen 100 ml:n mittapullon sarjaan 1, 2, 3, 4 ja 5 ml 100 mg/l rautaliuosta (2.1.2), täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä. Valmistettujen liuosten pitoisuudet ovat 1, 2, 3, 4 ja 5 mg rautaa litrassa.Näitä liuoksia säilytetään polyetyleenipulloissa.2.3.3 MääritysValitaan aallonpituus 248,3 nm. Säädetään tislatulla vedellä absorbanssiasteikon nollakohta. Imetään laimennettu näyte suoraan spektrofotometrin polttimoon ja tämän jälkeen vuorotellen 2.3.2 kohdan mukaisesti valmistetut vertailuliuokset. Luetaan absorbanssit. Toistetaan määritykset.2.4 Tulosten ilmoittaminen2.4.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit vertailuliuosten rautakonsentraation funktiona. Etsitään tältä käyrältä laimennetulleviininäytteelle saadun absorbanssin keskiarvo ja luetaan vastaava rautakonsentraatio C.Rautakonsentraatio ilmoitettuna milligrammoina litrassa viiniä yhdellä desimaalilla on:C × FF = laimennuskerroin.3. TAVANOMAINEN MENETELMÄ3.1 Reagenssit3.1.1 Vetyperoksidiliuos (H2O2), 30 % (m/v), rautavapaa.3.1.2 1 M kloorivetyhappoliuos, rautavapaa.3.1.3 Ammoniumhydroksidi, NH4OH (ñ20 = 0,92 g/ml).3.1.4 Hohkakiviä, jotka on käsitelty suhteessa 1/2 laimennetulla kiehuvalla kloorivetyhapolla ja pesty tislatulla vedellä.3.1.5 2,5 % hydrokinoniliuos (C6H6O2), hapotettu 1 ml:lla väkevää rikkihappoa(ñ20 = 1,84 g/ml) 100 ml:aa liuosta kohti. Tätä liuosta säilytetään kylmäkaapissa keltaisessa pullossa ja se on hylättävä heti, kun vähäisintäkään tummenemista esiintyy.3.1.6 20 % natriumsulfiittiliuos (Na2SO3), joka on valmistettu neutraalista vedettömästä sulfiitista.3.1.7 0,5 % ortofenantroliiniliuos (C12H8N2, H2O) 96 til-% alkoholissa.3.1.8 20 % (m/v) ammoniumasetaattiliuos (CH3COONH4).3.1.9 Rauta(III)liuos, joka sisältää rautaa 1 g/l. Käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa standardiliuosta. Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 8,6341 g rautasulfaattia ja ammoniumsulfaattia (NH4Fe(SO4)2, 12H2O) 100 ml:aan 1 M kloorivetyhappoliuosta (3.1.2) ja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi 1 M kloorivetyhappoliuoksella (3.1.2).3.1.10 Laimennettu vertailuliuos, joka sisältää rautaa 100 mg/l.3.2 Laitteisto3.2.1 100 ml:n vetoinen Kjeldahl-kolvi.3.2.2 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittauksia 508 mn:n aallonpituudella.3.3 Suoritus3.3.1 Digestointi3.3.1.1 Viinit, joiden sokeripitoisuus on alle 50 g/lMitataan Kjeldahl-kolviin 25 ml viiniä ja 10 ml vetyperoksidiliuosta (3.1.1) sekä lisätään muutamiahohkakivijyväsiä (3.1.4). Tiivistetään neste 2-3 ml:n tilavuuteen.Jäähtymisen jälkeen lisätään jäännökseen, kolvin seinämien kastumista varoen, tarvittava määrä ammoniumhydroksidia (3.1.3), jotta liuos tulee emäksiseksi ja hydroksidit saostuvat.Jäähtymisen jälkeen lisätään emäksiseen liuokseen tarvittava määrä 1 M kloorivetyhappoliuosta (3.1.2) hydroksidisakan liuottamiseksi ja siirretään liuos 100 ml:n mittapulloon. Huuhdellaan Kjeldahl-kolvi 1 M kloorivetyhappoliuoksella (3.1.2) ja täytetään mittapullon tilavuus 100 ml:ksi tällä liuoksella.3.3.1.2 Rypälemehut ja viinit, joiden sokeripitoisuus on yli 50 g/l3.3.1.2.1 Sokeripitoisuus välillä 50   200 g/l:25 ml:n suuruinen rypälemehu- tai viininäyte käsitellään 20 ml:lla vetyperoksidiliuosta (3.1.1). Jatketaan suoritusta 3.3.1.1 kohdassa kuvatulla tavalla.3.3.1.2.2 Sokeripitoisuus yli 200 g/l:Rypälemehu- ja viininäytteet on laimennettava suhteessa 1/2 tai jopa suhteessa 1/4 ja käsiteltävä 3.3.1.2.1 kohdassa kuvatulla tavalla.3.3.2 SokeakoeTehdään sokeakoe tislatulla vedellä käyttäen digestoinnissa yhtä paljon vetyperoksidiliuosta (3.1.1) ja seuraten 3.3.1.1 kohdassa kuvattua suoritustapaa.3.3.3 MääritysMitataan 20 ml kloorivetyhapoista digestoimalla saatua näytettä (3.3.1.1) ja 20 ml "sokeakokeen" kloorivetyhappoliuosta (3.3.2) kahteen 50 ml:n mittapulloon. Lisätään molempiin pulloihin 2 ml hydrokinoniliuosta (3.1.5), 2 ml sulfiittiliuosta (3.1.6) ja 1 ml ortofenantroliiniliuosta (3.1.7). Annetaan seistä 15 minuutin ajan, jotta rauta(III) pelkistyisi rauta(II)muotoon. Lisätään 10 ml am- moniumasetaattiliuosta (3.1.8), täytetään tilavuus 50 ml:ksi tislatulla vedellä ja ravistellaan molempia mittapulloja. Mitataan määritettävän liuoksen absorbanssi 508 nm:ssä säätäen absorbanssiasteikon nollakohta sokeakokeesta peräisin olevalla liuoksella.3.3.4 KalibrointiMitataan neljään 50 ml:n mittapulloon 0,5; 1; 1,5 ja 2 ml 100 mg/l rautaliuosta (3.1.10) ja 20 ml tislattua vettä; jatketaan 3.3.3 kohdassa kuvatulla tavalla. Nämä liuokset sisältävät 50, 100, 150 ja 200 mikrogrammaa rautaa.3.4 Tulosten ilmoittaminen3.4.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit vertailuliuosten rautakonsentraation funktiona. Etsitään määritettävälle liuokselle saatu absorbanssi ja luetaan vastaava rautakonsentraatio C 20 ml:ssa digestoimalla saatua kloorivetyhappoista liuosta, toisin sanoen 5 ml:ssa määritettävää näytettä.Rautakonsentraatio ilmoitettuna milligrammoina litrassa viiniä yhdellä desimaalilla on:200 × C.Jos viiniä (tai rypälemehua) on laimennettu, rautakonsentraatio ilmoitettuna milligrammoina litrassa viiniä yhden desimaalin tarkkuudella on:200 × C × F.F = laimennuskerroin.31. KUPARI 1. MENETELMÄN PERIAATEKäytetään atomiabsorptiospektrofotometriaa.2. LAITTEET2.1 Platinamalja.2.2 Atomiabsorptiospektrofotometri.2.3 Kuparionttokatodilamppu.2.4 Polttokaasu: ilma-asetyleeni tai typpioksiduuli-asetyleeni.3. REAGENSSIT3.1 Kuparimetalli.3.2 Väkevä 65 % typpihappo (HNO3, ñ20 = 1,38 g/ml).3.3 Suhteessa 1/2 (v/v) laimennettu typpihappo.3.4 Kupariliuos, 1 g/lKäytetään kaupallisesti saatavissa olevaa kuparistandardiliuosta, jonka pitoisuus on 1 g/l. Tämä liuos voidaan valmistaa punnitsemalla 1,000 g kuparimetallia ja siirtämällä se kvantitatiivisesti 1 000 ml:n mittapulloon. Lisätään metallin liuottamiseen tarvittava määrä suhteessa 1/2 laimennettua typpihappoa (3.3), lisätään 10 ml väkevää typpihappoa (3.2), täytetään merkkiin kahdesti tislatulla vedellä.3.5 Kupariliuos, 100 mg/lMitataan 10 ml 3.4 liuosta 100 ml:n mittapulloon ja täytetään tilavuus kahdesti tislatulla vedellä.4. SUORITUS4.1 Näytteen vaimistaminen ja kuparin määrittäminenTarvittaessa valmistetaan sopiva laimennos kahdesti tislatulla vedellä.4.2 KalibrointiMitataan 100 ml:n mittapulloihin 0,5; 1 ja 2 ml liuosta 3.5 ja täytetään tilavuus kahdesti tislatulla vedellä; saadut liuokset sisältävät kuparia 0,5; 1 ja 2 mg.4.3 MääritysValitaan aallonpituus 324,8 nm. Säädetään kahdesti tislatulla vedellä absorbanssiasteikon nollakohta. Imetään laimennettu näyte suoraan spektrofotometrin polttimoon ja tämän jälkeen vuorotellen 4.2 kohdan mukaisesti valmistetut vertailuliuokset. Luetaan absorbanssit. Toistetaan määritykset.5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit vertailuliuosten kuparikonsentraation funktiona.Etsitään kalibrointikäyrältä laimennetulle viininäytteelle saatu absorbanssi ja luetaan vastaava konsentraatio C mg/l.Jos F on laimennuskerroin, viinin kuparipitoisuus milligrammoina litrassa on: F × C. Se annetaan kahdella desimaalilla.Huomautukset:a) Kalibrointikäyrän laadinnassa käytetyt liuokset ja näytelaimennokset on aina valittava käytetyn laitteenherkkyyden ja näytteen kuparikonsentraation mukaan.b) Jos näytteen kuparikonsentraatio on hyvin pieni, edetään seuraavasti: mitataan 100 ml näytettä platinamaljaan, haihdutetaan 100 °C:ssa vesihauteessa, kunnes näyte muuttuu siirappimaiseksi, lisätään tipoittain 2,5 ml väkevää typpihappoa (3.2) siten, että astian pohja peittyy kokonaan. Poltetaan jäännös varovasti tuhkaksi sähkölevyllä tai pienellä liekillä; tämän jälkeen siirretään astia 500 °C ± 25 °C:een säädettyyn muhveliuuniin noin yhden tunnin ajaksi. Jäähtynyt tuhka kostutetaan noin 1 ml:lla väkevää typpihappoa (3.2) murskaten se pienellä lasipuikolla, haihdutetaan ja poltetaan uudelleen tuhkaksi edellä kuvatulla tavalla. Siirretään astia uudelleen uuniin 15 minuutin ajaksi; toistetaan käsittely väkevällä typpihapolla vähintään kolme kertaa. Liuotetaan tuhka lisäämällä astiaan1 ml väkevää typpihappoa (3.2) ja 2 ml kahdesti tislattua vettä; siirretään 10 ml:n mittapulloon. Pestään astia kolme kertaa aina 2 ml:lla kahdesti tislattua vettä, täytetään merkkiin kahdesti tislatulla vedellä.32. KADMIUM 1. MENETELMÄN PERIAATEKadmium määritetään suoraan viinistä liekittömällä atomiabsorptiospektrofotometrialla.2. VÄLINEISTÖKaikki lasitavarat on pestävä ennen käyttöä kuumalla (70 80 °C) väkevällä typpihapolla ja huuhdottava kahdesti tislatulla vedellä.2.1 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on grafiittiuuni, taustankorjain ja monikanavapiirturi.2.2 Kadmiumonttokatodilamppu.2.3 Vetoisuudeltaan 5 ìl olevia mikropipettejä, joissa on atomiabsorptionmittauksiin tarkoitetut erikoispäät.3. REAGENSSITKäytettävän veden on oltava borosilikaattilasista valmistetussa laitteessa kahdesti tislattua vettä tai vastaavan puhtausasteen omaavaa vettä. Kaikkien reagenssien on oltava puhtaudeltaan yleisesti hyväksyttyä analyyttista laatua ja erityisesti kadmiumvapaita.3.1 85 % fosforihappo (ñ20 = 1,71 g/ml).3.2 Fosforihappoliuos, joka saadaan laimentamalla 8 ml fosforihappoa 100 ml:ksi vedellä.3.3 0,02 M etyleenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuola -liuos (EDTA).3.4 pH-arvoltaan 9 oleva puskunliuos, joka saadaan liuottamalla 100 ml:n mittapullossa 5,4 g ammoniumklo- ridia muutamaan millilitraan vettä, lisäämällä 35 ml 25 %:ksi (v/v) laimennettua ammoniumhy- droksidiliuosta(ñ20 = 0,92 g/ml) ja täyttämällä merkkiin vedellä.3.5 Eriokromimusta T: 1 % (w/w) kiinteä liuos natriumkloridissa.3.6 Kadmiumsulfaatti (3CdSO4, 8H2O)Kadmiumsulfaattipitoisuus on tarkastettava seuraavasti:Punnitaan tarkalleen 102,6 mg suuruinen kadmiumsulfaattinäyte, siirretään veden kanssa kvantitatiivisesti mittalasiin, ravistellaan, kunnes se on liuennut; lisätään 5 ml pH-arvoltaan 9 olevaa puskuriliuosta ja noin 20 mg eriokromimustaa T. Titrataan EDTA-liuoksella, kunnes indikaattori muuttuu siniseksi.Käytetyn EDTA-liuoksen tilavuuden on oltava 20 ml. Jos tilavuus on eri, on vertailuliuoksen valmistukseen käytetyn punnitun kadmiumsulfaattin määrä korjattava.3.7 Vertailuliuos, jonka kadmiumpitoisuus on 1 g/lKäytetään kaupallisesti saatavissa olevaa standardiliuosta. Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 2,2820 g kadmiumsulfaattia veteen ja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi. Liuosta säilytetään hiostulpallisessa borosilikaattilasista valmistetussa pullossa.4. SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminenLaimennetaan viini suhteessa 1/2 (v/v) fosforihappoliuoksella.4.2 Kalibrointisarjan liuosten valmistaminenValmistetaan kadmiumvertailuliuoksesta peräkkäisillä laimennuksilla liuokset, jotka sisältävät kadmiumia 2,5, 5, 10 ja   15 mikrogrammaa litrassa.4.3 Määritys4.3.1 Uunin säätäminen (vain ohjeellinen)Kuivaaminen 100 °C:ssa 30 sekuntia.Mineralisaatio 900 °C:ssa 20 sekuntia.Atomisaatio 2 250 °C:ssa 2 3 sekuntia.Typen virtausnopeus (huuhtelukaasu): 6 litraa minuutissa.Huomautus: Suorituksen lopussa lämpötila nostetaan 2 700 °C:seen uunin puhdistamiseksi.4.3.2 AtomiabsorptiomittauksetValitaan aallonpituus 228,8 nm. Säädetään kahdesti tislatulla vedellä absorbanssiasteikon nollakohta. Ruiskutetaan mikropipetillä uuniin kolme kertaa 5 ìl kaikkia kalibrointisarjan liuoksia ja määritettävää näyteliuosta. Luetaan mitatut absorbanssit. Lasketaan absorbanssin keskiarvo kolmen ruiskutuksen tuloksista.5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit kalibrointiliuosten kadmiumkonsentraatioiden funktiona. Kuvaaja on lineaarinen. Etsitään kalibrointisuoralta näyteliuoksen absorbanssin keskiarvo ja johdetaan siitä kadmiumkonsentraatio C. Kadmiumkonsentraatio ilmoitettuna mikrogrammoina litrassa viiniä on:2 C.33. HOPEA 1. MENETELMÄN PERIAATEKäytetään atomiabsorptiospektrofotometriaa, jota edeltää näytteen polttaminen.2. VÄLINEISTÖ2.1 Platinamalja.2.2 100 °C:seen sââdetty vesihaude.2.3 500-525 °C:seen säädetty uuni.2.4 Atomiabsorptiospektrofotometri.2.5 Hopeaonttokatodilamppu.2.6 Polttokaasu: ilma-asetyleeni.3. REAGENSSIT3.1 Hopeanitraatti (AgNO3).3.2 Väkevä 65 % typpihappo (HNO3p20 = 1,38 g/ml).3.3 Suhteessa 1/10 (v/v) laimennettu typpihappo.3.4 Hopealiuos, 1 g/lKäytetään kaupallisesti saatavaa hopeastandardiliuosta.Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 1,575 g hopeanitraattia laimennettuun typpihappoon ja täyttämällä tilavuus 1 000 ml:ksi laimennetulla typpihapolla.3.5 Hopealiuos, 10 mg/lLaimennetaan 10 ml 3.4 liuosta 1 000 ml:ksi laimennetulla typpihapolla.4. SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminenMitataan 20 ml näytettä platinamaljaan, haihdutetaan kuiviin 100 °C:ssa kiehuvassa vesihauteessa. Poltetaan 500-525 °C:ssa uunissa valkeaksi tuhkaksi. Kostutetaan tuhka 1 ml:lla väkeväâ typpihappoa (3.2), haihdutetaan 100 °C:ssa vesihauteessa, lisätään uudelleen 1 ml typpihappoa (3.2) ja haihdutetaan. Lisätään 5 ml laimennettua typpihappoa (3.3) ja lämmitetään varovasti, kunnes jäännös on liuennut.4.2 KalibrointiMitataan 100 ml:n mittapulloista koostuvaan sarjaan 2; 4; 6; 8; 10 ja 20 ml 10 g/l hopeaa sisältävää 3.5 liuosta ja täytetään merkkiin laimennetulla typpihapolla (3.3). Nämä liuokset sisältävät hopeaa 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1,0 ja 2,0 mg/l.4.3 MääritysValitaan aallonpituus 328,1 nm. Säädetään laimennetulla typpihapolla (3.3) absorbanssiasteikon nollakohta. Imetään 4.1 kohdan mukaisesti saatu neste suoraan spektrofotometrin polttimoon ja tämän jälkeen vuorotellen vertailuliuokset. Luetaan absorbanssit. Toistetaan määritykset.5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit vertailuliuosten hopeakonsentraation funktiona.Etsitään kalibrointikäyrältä 4.1 kohdan mukaisesti saadun nesteen absorbanssi ja johdetaan konsentraatio C mg/l.Viinin hopeapitoisuus ilmoitettuna mikrogrammoina litrassa on:0,25 C. Se annetaan kahdella desimaalilla.Huomautus: Kalibrointikäyrän laadinnassa käytettyjä vertailuliuoksia, näytemäärää ja lopullista nestetilavuutta voidaan muuttaa käytetyn laitteen herkkyyden mukaan.34. SINKKI 1 PERIAATESinkki määritetään suoraan viinistä atomiabsorptiospektrofotometrisesti alkoholin poistamisen jälkeen.2 REAGENSSITKäytettävän veden on oltava borosilikaattilasista valmistetussa laitteessa kahdesti tislattua vettä tai vastaavan puhtausasteen omaavaa vettä.2.1 Vertailuliuos, jonka sinkkipitoisuus on 1 g/l.Käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa sinkkistandardiliuosta. Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 4,3975 g sinkkisulfaattia (ZnSO4, 7H2O) veteen ja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi.2.2 Laimennettu vertailuliuos, jonka sinkkipitoisuus on 100 mg/l.3. LAITTEISTO3.1 Pyöröhaihdutin ja säädettävä vesihaude.3.2 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on ilma-asetyleenipoltin.3.3 Sinkkionttokatodilamppu.4. SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminenPoistetaan viinin sisaltama alkoholi tiivistamalla viinin tilavuus puoleen pyöröhaihduttimessa (lämpötila: 50 60 °C), täytetään alkuperäiseen 100 ml:n tilavuuteen kahdesti tislatulla vedellä.4.2 KalibrointiMitataan neljään 100 ml:n mittapulloon 0,5; 1;   1,5 ja 2 ml 100 mg/l sinklriliuosta (2.2) ja täytetään merkkiin kahdesti tislatulla vedellä. Liuosten sinkkipitoisuudet ovat 0,5; 1; 1,5 ja 2 mg/l.4.3 MääritysValitaan aallonpituus 213,9 nm. Säädetään kahdesti tislatulla vedellä absorbanssiasteikon nollakohta. Ime- tään viini suoraan spektrofotometrin polttimoon ja tämän jälkeen vuorotellen vertailuliuokset. Luetaan absorbanssit. Toistetaan määritykset.5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskentamenetelmäPiirretään absorbanssit vertailuliuosten sinkkikonsentraation funktiona. Etsitään viinille saatujen absorbans- sien keskiarvo ja luetaan vastaava sinkkikonsentraatio C milligrammoina litrassa viiniä yhdellä desimaalilla.35. LYIJY 1. MENETELMÄN PERIAATELyijy määritetään suoraan viinistä liekittömällä atomiabsorptiospektrofotometrialla.2. VÄLINEISTÖKaikki lasitavarat on pestävä ennen käyttöä kuumalla (70 80 °C) väkevällä typpihapollaja huuh dottava kahdesti tislatulla vedellä.2.1 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on grafiittiuuni, epaspesifinen absorptionkorjain ja monikanavapiir- turi.2.2 Lyijyonttokatodilamppu.2.3 Vetoisuudeltaan 5 ìl olevia mikropipettejä, joissa on atomiabsorptionmittauksiin tarkoitetut erikoispäät.3. REAGENSSITKaikkien reagenssien on oltava puhtaudeltaan yleisesti hyväksyttyä analyyttista laatua ja erityisesti Iyijyvapaita. Käytettävän veden on oltava borosilikaattilasista valmistetussa laitteessa kahdesti tislattua vettä tai vastaavan puhtausasteen omaavaa vettä.3.1 85 % fosforihappo(ñ20 = 1,71 g/ml).3.2 Fosforihappoliuos, joka saadaan laimentamalla 8 ml fosforihappoa 100 ml:ksi vedellä.3.3 Typpihappo (ñ20 = 1,38 g/ml).3.4 Lyijyliuos 1 g/l.Käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa standardiliuosta. Tämä lions voidaan valmistaa liuottamatta 1,600 g Iyijy(II)nitraattia, Pb(NO3)2, 1 %:ksi (v/v) laimennettuun typpihappoonja täyttämällä tilavuus yhdeksi litraksi. Liuosta säilytetään hiostulpallisessa borosilikaattilasista valmistetussa pullossa.4. SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminenLaimennetaan viini suhteessa 1/2 tai 1/3 fosforihappoliuoksella (3.2) oletetun Iyijykonsentraation mukaan.4.2 Kalibrointisarjan liuosten valmistaminenValmistetaan Iyijyvertailuliuoksesta kahdesti tislatulla vedellä peräkkäin laimentaen liuokset, jotka sisältävät Iyijyä 25, 50, 100 ja 150 mikrogrammaa litrassa.4.3 Määritys4.3.1 Uunin säätäminen (vain ohjeellinen)Kuivaaminen 100 °C:ssa 30 sekuntia.Mineralisaatio 900 °C:ssa 20 sekuntia.Atomisaatio 2 250 °C:ssa 2 3 sekuntia.Typen virtausnopeus (huuhtelukaasu): 6 litraa minuutissa.Huomautus: Suorituksen jälkeen lämpötila nostetaan 2 700 °C:seen uunin puhdistamiseksi.4.3.2 MittauksetValitaan aallonpituus 217 nm. Säädetään kahdesti tislatulla vedellä absorbanssiasteikon nollakohta. Ruisku- tetaan mikropipetillä uuniin kolme kertaa 5 ìl kaikkia kalibrointisarjan liuoksia ja määritettävää näyteliuosta. Luetaan mitatut absorbanssit. Lasketaan absorbanssin keskiarvo kolmen ruiskutuksen tuloksista.5. TULOSTEN ILMOITTAMINEN5.1 LaskeminenPiirretään absorbanssit kalibrointiliuosten Iyijykonsentraatioiden funktiona. Kuvaaja on lineaarinen. Etsitään kalibrointisuoralta näyteliuoksen absorbanssin keskiarvo ja johdetaan siitä Iyijykonsentraatio C. Lyijykonsentraatio ilmoitettuna mikrogrammoina litrassa viiniä on:C × FF = laimennuskerroin.36. FLUORIDIT 1. PERIAATEFluoridipitoisuus määritetäänpuskuriliuokseenlisätystäviinistäkiinteäkalvoelektrodilla. Mitattu potentiaali on verrannollinen fluoridi-ionien aktiviteetin logaritmiin määritettävässä liuoksessa seuraavan yhtälön mukaisesti:E = Eo ± S log aF>TAULUKON PAIKKA>2. VÄLINEISTÖ2.1 Fluondi-ioniselektiiv inen kidekalvoelektrodi.2.2 Vertailuelektrodi (Kalomeli tai Ag/AgCI).2.3 Millivolttimittari (pH-mittari, jossa on laajennettu millivolttiasteikko), tarkkuus 0,1 mV.2.4 Magneettisekoittaja, jossa on eristelaatta määritettävän liuoksen suojaamiseksi moottorin lämmöltä (polyetyleeni tai vastaava matenaali).2.5 Vetoisuudeltaan 30 tai 50 ml olevia muovisia mittalaseja tai muovisia mittapulloja (polyetyleeni tai vastaava materiaali).2.6 Tarkkuuspipettejä (pipettejä, joiden asteikko on jaettu mikrolitroihin tai muita vastaavia pipettejä).3. REAGENSSIT3.1 Fluoridikantaliuos, 1 g/l.Käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa 1 g/l standardiliuosta. Tämä liuos voidaan valmistaa liuottamalla 2,210 g natriumfluoridia (kuivattu 3 4 tuntia 105 °C:ssa) tislattuun veteen. Täytetään 1 000 ml:ksi tislatulla vedellä. Liuosta säilytetään muovipullossa.3.2 Konsentraatioltaan sopivat fluoridivertailuliuokset valmistetaan laimentamalla kantaliuosta tislatulla vedellä ja niitä säilytetään muovipulloissa. Fluoridipitoisuudeltaan 1 mg/l olevat vertailuliuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.3.3 Puskunliuos, pH 5,5.Lisätään 10 g 1,2-sykloheksaanidiamiinitetraetikkahappoa (CDTA) veteen (noin 50 ml); lisätään 700 ml:aan tislattua vettä, johon on liuotettu 58 g natriumkloridia ja 29,4 g trinatriumsitraattia. CDTA liukenee lisättäessä 32 % (m/v) natriumhydroksidiliuosta (noin 6 ml).Lopuksi lisätään 57 ml etikkahappoa(p 20 = 1,05 g/ml) ja säädetään pH arvoon 5,5 32 % natriumhydrok- sidiliuoksella (noin 45 ml). Annetaan jäähtyä ja täytetään yhdeksi litraksi tislatulla vedellä.4. SUORITUSAlkuhuomautus:On huolehdittava siitä, että kaikkia liuoksia pidetään mittauksen aikana lämpötilassa 25 ± 1 °C. (Yli ± 1 °C:n poikkeama aiheuttaa noin ± 0,2 mV:n muutoksen.)4.1 Suora menetelmäMitataan muoviseen dekantterilasiin määrätty määrä viiniä ja sama tilavuus puskuriliuosta.Sekoitetaan liuosta tasaisesti ja maltillisesti. Kun lukema on vakaa (vakaa tila saavutetaan kun potentiaali vaihtelee korkeintaan 0,2 0,3 mV/3 minuuttia), luetaan potentiaalin arvo mV.4.2 Tunnettujen lisäysten menetelmäKoko ajan sekoittaen lisätään tutkittavaan aineeseen tarkkuuspipetillä tunnettu tilavuus fluoridivertailuliuosta. Kun lukema on vakaa, luetaan potentiaalin arvo mV.Valitaan lisättävän vertailuliuoksen konsentraatio seuraavasti:a) kerrotaan tutkittavan aineen fluoridikonsentraatio kahdella tai kolmella,b) määritettävän aineen tilavuuden on pysyttävä käytännössä vakiona (tilavuuden lisäys &le; 1 %).Ehto b yksinkertaistaa laskemista (ks. 5).Tutkittavan aineen likimääräinen konsentraatio luetaan kalibrointisuoralta, joka piirretään puolilogantmias- teikolle fluoripitoisuudeltaan 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 ja 2,0 mg/l olevien vertailuliuosten kanssa.Huomautus: Jos tutkittavan aineen likimääräinen konsentraatio on konsentraatioalueen ulkopuolella, laimennetaan näyte.Esimerkki:Tutkittavan aineen (tilavuus 20 ml) likimääräinen pitoisuus on 0,25 mg/l F-; konsentraatiota on lisättävä 0,25 mg/l. Tämä tehdään esimerkiksi lisäämällä liuokseen sopivalla tarkkuuspipetillä 0,20 ml (=1 %) vertailuliuosta, joka sisältää 25 mg/l F- tai 0,050 ml vertailuliuosta, joka sisältää 100 mg/l F-.5. LASKEMINENTutkittavan aineen fluoridipitoisuus, ilmoitettuna milligrammoina litrassa, saadaan seuraavalla yhtälöllä:CF = >NUM>Va × Ca/>DEN>V° × >NUM>1/>DEN>(antilog ÄE/S) - 1>TAULUKON PAIKKA>Jos Va on kovin lähellä V°:ta, käytetään seuraavaa yksinkertaistettua yhtälöä:CF = Ca × >NUM>1/>DEN>(antilog ÄE/S) - 1Saatu arvo on kerrottava laimennuskertoimella, joka saadaan puskuriliuoslisäyksestä.37. HIILIDIOKSIDI 1. MENETELMIEN PERIAATE1.1 Vertailumenetelmä1.1.1 Hiilihapottomat viinit (CO2-ylipaine &le; 0,5 × 105 Pa)(12)Tietyn tilavuinen viininäyte jäähdytetään lähelle 0 °C ja sekoitetaan sellaiseen määrään natriumhydroksidiliuosta, että pH-arvoksi tulee 10 11. Titrataan happoliuoksella karboanhydraasin läsnäollessa. Hiili- dioksidipitoisuus lasketaan pH:n muuttamiseksi arvosta 8,6 (bikarbonaattimuoto) arvoon 4,0 (hiilihappo) tarvittavasta happotilavuudesta. Sokeatitraus tehdään samoissa koeolosuhteissa viinistä, josta hiilihappo on poistettu, jotta voitaisiin ottaa huomioon viinin happojen kuluttama natriumhydroksidiliuoksen tilavuus.1.1.2 Helmeilevät viinit ja kuohuviinitJäähdytetään määritettävästä viinistä otettu näyte lähelle jäätymispistettä. Otetaan tietty tilavuus viiniä, jota käytetään hiilihapon poistamisen jälkeen sokeanäytteenä. Tehdään pulloon jäänyt viini emäksiseksi kaiken CO2:n sitomiseksi Na2CO3 ksi. Titrataan happoliuoksen kanssa karboanhydraasin läsnäollessa. Hiilidioksidipitoisuus lasketaan pH:n muuttamiseksi arvosta 8,6 (bikarbonaattimuoto) arvoon 4,0 (hiilihappo) tarvittavasta happotilavuudesta. Sokeatitraus tehdään samoissa koeolosuhteissa viinistä, josta hiilihappo on poistettu, jotta voitaisiin ottaa huomioon viinin happojen kuluttama natriumhydroksidiliuoksen tilavuus.1.2 Tavanomainen menetelmä:helmeilevät viinit ja kuohuviinitManometrinen menetelmä: mitataan hiilidioksidiylipaine suoraan pullosta afrometrillä.2. VERTAILUMENETELMÄ2.1 Hiilihapottomat viinit (CO2-ylipaine &le; 0,5 × 105 Pa).2.1.1 Välineistö2.1.1.1 Magneettisekoittaja.2.1.1.2 pH-mittari.2.1.2 Reagenssit2.1.2.1 Natriumhydroksidiliuos (NaOH), 0,1 M.2.1.2.2 Rikkihappoliuos (H2SO4), 0,05 M.2.1.2.3 Karboanhydraasiliuos, 1 g/l.2.1.3 SuoritusJäähdytetään viininäyte sekä näytteenottoon käytettävä 10 ml:n pipetti noin 0 °C:seen.Mitataan 100 ml:n dekantterilasiin 25 ml natriumhydroksidiliuosta (2.1.2.1); lisätään 2 tippaa vesi-karboanhydraasiliuosta (2.1.2.3). Lisätään 10 ml viiniä 0 °C:seen jäähdytetyllä pipetillä.Asetetaan dekantterilasi magneettisekoittajalle, sijoitetaan elektrodi ja magneettitanko liuokseen ja sekoitetaan maltillisesti.Kun neste on saavuttanut ympäristön lämpötilan, titrataan hitaasti rikkihappoliuoksella (2.1.2.2), kunnes pH-arvo on 8,6.Jatketaan rikkihappotitrausta (2.1.2.2), kunnes pH-arvo on 4,0. pH:n 8,6 ja pH:n 4,0 välillä käytetty tilavuus on n.Poistetaan CO2 noin 50 ml:sta viininäytettä ravistelemalla sitä vakuumissa 3 minuutin ajan, lämmittäen pulloa noin 25 °C:ssa vesihauteessa.Toistetaan edellä kuvattu suoritus 10 ml:lle viiniä, josta on poistettu hiilihappo; käytetty tilavuus on n'.2.1.4 Tulosten ilmoittaminen1 ml 0,1 M natriumhydroksidititrausliuosta vastaa 4,4 mg CO2:a.CO2-määrä grammoina litrassa viiniä saadaan yhtälöstä:0,44 (n n')Se ilmoitetaan kahdella desimaalilla.Huomautus: Jos viinin CO2-pitoisuus on matala (CO2 NUM>V - v + 20/>DEN>V - vSe ilmoitetaan kahdella desimaalilla.2.3 Ylipaineen laskeminenYlipaine 20 °C:ssa, Paph20, ilmoitettuna pascaleina, saadaan yhtälöstä:Paph20 = >NUM>Q/>DEN>1,951 × 10-5(0,86 - 0,01 A)(1 - 0,00144 S) - Patmjossa>TAULUKON PAIKKA>3. TAVANOMAINEN MENETELMÄ (HELMEILEVÄT VIINIT JA KUOHUVIINIT)3.1 Välineistö3.1.1 AfrometriLaitetta, jolla voidaan suorittaa ylipaineen mittaus helmeilevää viiniä tai kuohuviiniä sisältävistä pulloista, kutsutaan afrometriksi. Se on eri muotoinen sen mukaan, miten pullo on suljettu (metallinen kapseli, kruunukorkki, korkkiaineesta tai muovista valmistettu korkki, ks. kuviot 1 ja 2).Afrometrien asteikot on jaettu pascaleihin (lyhenne Pa)(13). On käytännöllisempää käyttää yksikkönä 105 pascalia tai kilopascalia (kPa).Afrometrit kuuluvat eri luokkiin. Manometrin luokka on lukeman tarkkuus suhteessa koko asteikkoonilmoitettuna prosentteina (esimerkiksi 1 000 kPa manometri luokka I tarkoittaa, että suurimmassamahdollisessa käyttöpaineessa 1 000 kPa lukema ± 10 kPa). Luokkaa I suositellaan tarkkoihin mittauksiin.Afrometrit on tarkistettava säännöllisesti (vähintään kerran vuodessa).3.2 SuoritusMittaus on suoritettava pulloista, joiden lämpötilan on annettu tasaantua vähintään 24 tunnin ajan.Kun korkki on lävistetty, pulloa ravistellaan voimakkaasti, kunnes paine on asettunut mittauk sen suorittamiseksi.>VIITTAUS KAAVIOON>3.3 Tulosten ilmoittaminenYlipaine 20 °C:ssa (Paph20) ilmoitetaan pascaleina (Pa) tai kilopascaleina (kPa).Se on ilmoitettava yhtäpitävästi manometrin tarkkuuden kanssa (esimerkiksi: 6,3. 105 Pa tai 630 kPa, ei 6,33.105 Pa tai 633 kPa luokan I manometrille, jossa on 1 000 kPa:n lukema-asteikko).Jos mittauslämpötila ei ole 20 °C, on tehtävä korjaus kertomalla mitattu paine kertoimella>NUM>Paph20/>DEN>Paph1joka annetaan taulukossa 1. Tällä tavoin suhteutetaan tulos 20 °C:seen.4. PAINEEN JA KUOHUVIININ SISÄLTÄMÄN HIILIDIOKSIDIN VÄLINEN SUHDE(14) Absoluuttinen paine 20 °C:ssa (Pabs20) lasketaan paineesta 20 °C:ssa (Paph20) seuraavalla yhtälöllä:Pabs20 = Patm + Paph20jossa Patm on ilman paine ilmoitettuna pascaleina.Viinin sisältämä hiilidioksidimäärä annetaan seuraavina suhteina:- litroina CO2:a litrassa viiniä:0,987 × 10-5 Pabs20(0,86 - 0,01A)(1 - 0,00144S),- grammoina CO2:a litrassa viiniä:1,951 × 10-5 Pabs20(0,86 - 0,01A)(1 - 0,00144S),jossa:A on viinin alkoholipitoisuus 20 °C:ssa.S on viinin sokeripitoisuus, ilmoitettuna grammoina litrassa.>TAULUKON PAIKKA>38. SYANIDIJOHDANNAISET 1. MENETELMIEN PERIAATE1.1 Nopea koemenetelma: kaliumheksasyanoferraatti (II):lla käsiteltyjen viinien tarkastus.Tarkastetaan, ettei sakkaan ole suspendoitunut rauta (III) heksasyanoferraatti (II):a.Tarkastetaan lisäämällä rauta (III) suolaa hapotettuun viiniin, ettei rauta (III) heksasyanoferraattia ole läsnä.Tarkastetaan viinissä oleva rauta, jota on saostettu lisäämällä alkaliheksasyanoferraatti (II)-heksasy anoferraatti (III) seosta hapotettuun viiniin.1.2 Tavanomainen menetelmäHappohydrolyysissa vapautuneen ja tislauksella erotetun kokonaissyaanivetyhapon määrittäminen argentometrisesti.2. NOPEA KOEMENETELMÄKaliumheksasyanoferraatti (II):lla käsiteltyjen viinien tarkastus.2.1 LaitteetKäytettävissä on oltava toinen seuraavista laitteista:2.1.1 Sentrifugi, jolla saadaan aikaan 1 200 1 500 g:n keskipakoisvoima.2.1.2 Kalvosuodatuslaite (huokosten halkaisija 0,45 ìm).2.2 Reagenssit2.2.1 Suhteessa 1/2 (v/v) laimennettu kloorivetyhappo, joka on saatu laimentamalla rautavapaata kloorivetyhappoa (HCI),(ñ20 = 1,18-1,19 g/ml).2.2.2 Rauta (III) ammoniumsuIfaattiliuos, Fe2(S04)3,(NH4)2S04,24H20, 15 % (m/v).2.2.3 Kaliumheksasyanoferraatti (II) liuos, K4[Fe(CN)6],3H2O, 10 % (m/v).2.2.4 Kaliumheksasyanoferraatti (III) liuos, K3[Fe(CN)6], 10 % (m/v). Valmistetaan juuri ennen käyttöä.2.3 Suoritus2.3.1 Rauta (III) heksasyanoferraatti (II) jälkien havaitseminenKun näytettä on ravisteltu, mitataan 30 ml:n sentrifugiputkeen 20 ml viiniä; lisätään 1 ml kloorivetyhappoa (2.2.1). Sentrifugoidaan 15 minuutin ajan tai suodatetaan kalvosuodattimen läpi (huokosten halkaisija 0,45 ìm). Sentritugointisaostumassa tai suodoksessa ei saa esiintyä sinisiä hiukkasia.2.3.2 Heksasyanoferraatti (II) ionienjälkien havaitseminenLisätään 2.3.1 kohdan mukaisesti saatuun supernatanttiin tai suodokseen 1 tippa rauta (III) ammoniumsulfaattiliuosta (2.2.2). Ravistellaan ja annetaan tämän jälkeen seistä vähintään 24 tuntia.Sentrifugoidaan 15 minuutin ajan tai suodatetaan kalvosuodattimen läpi (huokosten halkaisija 0,45 ìm). Sentrifugointisaostumassa tai suodattimella ei saa esiintyä rauta (III) heksasyanoferraatti (II):n sinisiä hiukkasia.2.3.3 Rautaionien tarkastaminen viinistäMitataan koeputkeen 20 ml viiniä, 1 ml kloorivetyhappoa (2.2.1), 1 tippa kaliumheksasyanoferraatti(II) liuosta (2.2.3) ja 1 tippa kaliumheksasyanoferraatti (III) liuosta (2.2.4). Sinisen värin tai sinisen sakan on ilmestyttava alle 30 minuutissa. Sentrifugoidaan tai suodatetaan kalvosuodattimen läpi (huokosten halkaisija 0,45 ìm) ja huuhdellaan suodatin 2 kertaa 5 ml:lla vettä. Sentrifugiputkessa tai kalvosuodattimella olisi esiinnyttävä sininen jäännös.3 TAVANOMAINEN MENETELMÄ3.1 Laitteet3.1.1 Tislauslaite, jossa on 500 ml:n pyöreäpohjainen tislauskolvi, joka liitetään hioksellisella putkella pystyasennossa olevan ja vähintään 350 mm pitkän jäähdyttimen yläpäähän.Jäähdyttimen alapäässä on ulosmenoputkeen päättyvä jatko-osa, joka ohjaa tisleen 50 ml:n pulloon, joka on upotettu kokonaan jääveteen.3.1.2 100- °C F:i:nen vesihaude, lämmitetään sähköllä.3.2 Reagenssit3.2.1 Suhteessa 1/5 (v/v) laimennettu rikkihappo.Sekoitetaan varovasti 200 ml rikkihappoa, H2SO4(ñ20 = 1,84 g/ml), sellaiseen määrään vettä, että saadaan 1 litra liuosta.3.2.2 Kiteinen kupari (II) kloridi, CuCl2, 2 H2O.3.2.3 Fenolipunaliuos.Liuotetaan 0,05 g fenolipunaista 1,4 ml:aan 0,1 M natriumhydroksidiliuosta; täytetään liuos 1 000 ml:ksi.3.2.4 Kaliumjodidiliuos.Liuotetaan 250 g kaliumjodidia, KI, sellaiseen määrään vettä, että saadaan 1 litra liuosta.3.2.5 0,001 hopeanitraattiliuos.Lisätään 0,5 ml väkevää typpihappoa (HNO3, ñ20 = 1,40 g/ml) 10 ml:aan 0,1 M hopeanitraattiliuosta (AgNO3) ja laimennetaan 1 000 ml:ksi.3.2.6 1 M natnumhydroksidiliuos, rautavapaa.3.3 SuoritusMitataan 100 ml suodatettua viiniä (tai suodattamatonta, jos halutaan määrittää myös mahdollisen sinisen sameuden sisältämä syaanivetyhappo), lisätään noin 5 g kupari(II)kloridia (3.2.2) ja 10 ml laimennettua rikkihappoa (3.2.1). Mitataan keräyspulloon 5 ml natriumhydroksidiliuosta (3.2.6). Tislataan kunnes 50 ml:n pallo on täynnä.Tisle siirretään 400 ml:n dekantterilasiin, joka on asetettu 100 °C:n vesihauteeseen ja haihtumisen nopeuttamiseksi johdetaan melko voimakas puhaltimella aikaansaatu kylmä ilmavirta emäksisen nesteen pinnalle. Tilavuuden on vähennyttävä 5 7 ml:aan noin 30 minuutissa (tilavuus ei saa koskaan pienentyä alle 5 ml:n).Tarvittaessa jäähtynyt liuos suodatetaan keräämällä suodos lieriömäiseen putkeen, jonka halkaisija on 20 mm ja pituus 180 mm, tai liuos siirretään suoraan tähän putkeen. Pestään mittalasi ja mahdollisesti suodatin muutamalla millilitralla vettä ja lisätään tämä vesi putkeen.Pannaan lasiputki mustalle alustalle ja valaistaan se sivusuunnasta valkoisella valonsäteellä. Nesteen on oltava täysin kirkasta(15).Lisätään 2 tippaa fenolipunaliuosta (3.2.3) liuoksen pääpisteen havaitsemisen helpottamiseksi(16) ja 1 tippa kaliumjodidiliuosta (3.2.4). Titrataan 0,001 M hopeanitraattiliuoksella (3.2.5), kunnes liuos samenee hieman, mutta pysyvästi. Tähän tarvittu liuostilavuus on n.Valmistetaan toinen samalainen putki, joka sisältää 5 ml natriumhydroksidiliuosta (3.2.6), 2 tippaa fenolipunaliuosta (3.2.3)(17), 1 tipan kaliumjodidiliuosta (3.2.4) ja sellaisen määrän vettä, että tilavuus on sama kuin edellä kuvatussa kokeessa. Lisätään 0,001 M hopeanitraattiliuosta (3.2.5) sellainen määrä, että saavutetaan sama sameus kuin edellä. Käytetty tilavuus on n'(18)3.4 Tulosten ilmoittarninen1 ml 0,001 M hopeanitraattiliuosta vastaa 54 ìg syaanivetyhappoa (HCN).1 viinilitran sisältämä kokonaissyaanivetyhappomäärä, ilmoitettuna milligrammoina, on: 0,54 (n   n'). Se ilmoitetaan kahdella desimaalilla.Merkitseviä ovat ainoastaan viinin sisältämät syaanivety-yhdisteet ja kokeet, joissa n n' on yli 0,5 ml.Jos n n' on yli 10 ml, aloitetaan määritys alusta käyttäen 0,01 M hopeanitraattiliuosta.39. ALLYYLI-ISOTIOSYANAATTI 1 MENETELMÄN PERIAATEViinin mahdollisesti sisältämä allyyli-isotiosyanaatti kerätään tislaamalla ja tunnistetaan kaasukromatografisesti.2 REAGENSSIT2.1 Absoluuttinen etanoli.2.2 Vertailuliuos: absoluuttisessa alkoholissa oleva allyyli-isotiosyanaattiliuos, joka sisältää 15 mg allyyli- isotiosyanaattia litrassa.2.3 Jäähdytysseos, joka koostuu etanolin ja hiilihappojään seoksesta (lämpötila-60 °C).3. LAITTEET3.1 Kuvion mukainen laitteisto typpivirrassa tislaamista varten.3.2 Säädettävä lämpöhaude.3.3 Virtausmittari.3.4 Kaasukromatografi, liekkifotometridetektorilla, jossa on rikkiyhdisteille selektiivinen suodatin (aallonpituus = 394 nm) tai muu tähän laiteeseen soveltuva detektori.3.5 Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kromatografiakolonni, sisähalkaisija 3 mm, pituus 3 m; täytetty 10 % Carbowax 20 M 80 100 meshin Chromosorb WHP:llä.3.6 Mikroruisku, 10 ìl.4 SUORITUSMitataan 2 litraa viiniä tislauskolviin. Lisätään muutama millilitra etanolia (2.1) kahteen keräysputkeen siten, että kaasudispersioputken huokoiset osat peittyvät kokonaan. Jäähdytetään putket ulkopuolelta jäähdytysseoksella. Liitetään kolvi keräysputkiin ja annetaan typen virrata laitteeseen noin 3 I/tunnissa. Lämmitetään viini 80- C:ise ksi säätämällä lämpöhaude sopivalla tavalla ja kerätään yhteensä 45 50 ml tislettä.Stabiloidaan kromatografi. Seuraavat suoritusolosuhteet ovat suositeltavia:- injektorin lämpötila: 200 °C,- kolonnin lämpötila: 130 °C,- helium-kantokaasun virtausnopeus: 20 ml/minuutti.Ruiskutetaan mikroruiskulla sellainen määrä vertailuliuosta, että allyyli-isotiosyanaattia vastaava piikki voidaan tunnistaa kromatogrammilta helposti.Lisäksi ruiskutetaan tisleestä otettu näyte ja tarkistetaan, että saadun piikin retentioaika vastaa allyyli- isotiosyanaatin piikkiä.Edellä kuvatuissa koeolosuhteissa mikään viinin luontainen aine ei aiheuta häiritsevää piikkiä tutkittavan näytteen kromatogrammissa.>VIITTAUS KAAVIOON>40. VÄRIOMINAISUUDET 1 VIINIT JA RYPÄLEMEHUT1.1 MääritelmätViinin väriominaisuuksilla tarkoitetaan sen luminositeettia ja sen kromaattisuutta.Luminositeetti vastaa transmittanssia. Se muuttuu käänteisesti viinin värin voimakkuuden kanssa.Kromaattisuus vastaa hallitsevaa aallonpituutta (joka luonnehtii värisävyä) ja puhtautta.Perinteisesti ja mukavuussyistä, puna- ja roseeviinien väriominaisuudet esitetään värin intensiteettinä ja sävynä noudattaen tavanomaiseksi menetelmäksi omaksuttua menettelytapaa.1.2 Menetelmien periaate1.2.1 VertailumenetelmäSpektrofotometrinen menetelmä, jolla voidaan määrittää tristimulusarvot ja kolme värikoordinaattia, joitatarvitaan värin laatuvaatimuksille kansainvälisen valaistustoimikunnan (CIE) mukaisesti.1.2.2 Tavanomainen menetelmä (sovellettavissa puna- ja roseeviineihin)Spektrofotometrinen menetelmä, jolla väriominaisuudet ilmoitetaan perinteisesti seuraavalla tavalla:Väri-intensiteetti annetaan aallonpituuksilla 420, 520 ja 620 nm mitattujen niiden absorbanssien summana,jotka saadaan 1 cm:n optisella pituudella.Värisävy ilmoitetaan absorbanssien suhteena 420 ja 520 nm:ssä.1.3 Vertailumenetelmä1.3.1 Välineistö1.3.1.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittaukset 300 700 nm:n välillä.1.3.1.2 Pareittain saatavissa olevia lasikyvettejä, joiden optinen pituus b on 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2 ja 4 cm.1.3.2 Suoritus1.3.2.1 Näytteen valmistaminenSamea viini on kirkastettava sentnfugoimalla.Mahdollisimman suuri määrä uusien viinien ja kuohuviinien sisältämästä hiilidioksidista on poistettava ravistelemalla vakuumissa.1.3.2.2 MittauksetKäytettävien kyvettien optinen pituus, b, on valittava siten, että mitattu absorbanssi on välillä 0,3 0,7.Ohjeellisesti on suositeltavaa käyttää valkoviinejä määritettäessä kyvettejä, joiden optinen pituus on 2 cm (tai 4 cm), roseeviinejä määritettäessä kyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm, ja punaviinejä määritettäessä kyvettejä, joiden optinen pituus on 0,1 cm (tai 0,2 cm).Spektrofotometriset mittaukset tehdään käyttäen vertailuliuoksena tislattua vettä, saman optisen pituuden, b, omaavassa kyvetissä, absorbanssiasteikon nollakohdan säätämiseksi aallonpituuksilla 445, 495, 550 ja 625 nm.Viinille mitataan optisella pituudella b neljä absorbanssia, A445, A495, A530 ja A625 (kolmella desimaalilla).1.3.3 LaskeminenKäyttäen taulukossa 1 esitettyjä b cm optisen pituuden absorbanssiarvoja etsitään vastaavat trans mittanssit (T %): T445, T495, T550 ja T625.- Lasketaan tristimulusarvot X, Y ja Z, ilmoitettuna kymmenmurtolukuina:>TAULUKON PAIKKA>- Lasketaan värikoordinaatit x ja y:x = >NUM>X/>DEN>X + Y + Z y = >NUM>Y/>DEN>X + Y + Z1.3.4 Tulosten ilmoittaminen1.3.4.1 Suhteellinen luminositeetti annetaan Y:n arvona prosentteina. (Musta Y % = 0, väritön: Y % = 100).1.3.4.2 Kromaattisuus ilmoitetaan hallitsevalla aallonpituudella ja puhtaudella.Näiden määrittämiseen käytetään spektripaikoilla yhdistettyä kromaattisuusdiagrammia, joka määritelläänkuviossa 1. O-piste vastaa käytettyä valkoista valonlähdettä ja edustaa standardilähteen C koordinaatteja x° = 0,3101 ja y° = 0,3163, joka edustaa keskimääräisen kirkkauden omaavaa päivänvaloa.- Hallitseva aallonpituusSijoitetaan kromaattisuusdiagrammiin x ja y koordinaatein piste C. Jos piste C sijaitsee kolmion AOB ulkopuolella, piirretään suora, joka yhdistää pisteen O pisteeseen C, ja jatketaan sitä, kunnes se leikkaa spektripaikan pisteessä S, joka vastaa hallitsevaa aallonpituutta.Jos piste C sijaitsee kolmion AOB sisäpuolella, piirretään suora C:stä O:hon; se leikkaa spektripaikan pisteessä, joka vastaa viinin komplementtivärin aallonpituutta. Tämä aallonpituus ilmoitetaan arvona, jota seuraa kirjain C.- Puhtaus:Jos piste C sijaitsee kolmion AOB ulkopuolella, puhtaus ilmoitetaan prosentteina suhteella:100 × >NUM>etä/>DEN>isyys C:stä O:hon;etäisyys O:sta S:äänJos piste C sijaitsee kolmion AOB sisäpuolella, puhtaus ilmoitetaan prosentteina suhteella:100 × >NUM>etäisyys C:stä O:hon(19)/>DEN>etäisyys O:stä P:henPiste P on piste, jossa suora OC leikkaa purppuralinjan.Puhtaus annetaan myös suoraan kromaattisuusdiagrammissa tunnetuista arvoista x ja y (kuviot 2, 3, 4, 5 ja 6).1.3.4.3 TuloksetLuminositeetti, kromaattisuus (ilmoitettuna hallitsevalla aallonpituudella) ja puhtaus määrittävät täydellisesti viininvann.Ne on ilmoitettava määritysselosteessa, samoin kuin optinen pituus, jolla mittaukset tehtiin.4. TAVANOMAINEN MENETELMÄ1.4.1 Välineistö1.4.1.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittauksia 300 700 mn:n välillä.1.4.1.2 Pareittain saatavissa olevia lasikyvettejä, joiden optinen pituus b on 0,1; 0,2; 0,5 ja 1 cm.1.4.2 Näytteen valmistaminenSamea viini on kirkastettava sentnfugoimalla.Mahdollisimman suuri määrä uusien viinien ja kuohuviinien sisältämästä hiilidioksidista on poistettavaravistelemalla vakuumissa.1.4.3 SuoritusMittauskyvettien optinen pituus, b, on valittava siten, että absorbanssi A on välillä 0,3 0,7.Spektrofotometriset mittaukset tehdään käyttäen vertailuliuoksena tislattua vettä, saman optisen pituuden,b, omaavassa kyvetissä, absorbanssiasteikon nollakohdan säätämiseksi aallonpituuksilla 420, 520 ja 620 nm.1.4.4 Tulosten ilmoittaminen1.4.4.1 LaskeminenLasketaan absorbanssit kolmella aallonpituudella 1 cm:n optisella pituudella jakamalla mitatut absorbanssit b:llä, ilmoitettuna cm:inä: A420, A520 ja A620.Intensiteetti saadaan perinteisesti:I = A420 + A520 + A620Se ilmoitetaan kolmella desimaalilla.Värisävy saadaan perinteisesti:N = >NUM>A420/>DEN>A520Se annetaan kolmella desimaalilla.TAULUKKO 1 >KAAVION ALKU>Absorbanssien muuttaminen transmittansseiksi (T %)Käyttöohje:Luetaan absorbanssiarvon ensimmäinen desimaali pystysuorasta sarakkeesta 1 ja toinen desimaalivaakasuorasta sarakkeesta 2.Luetaan niiden leikkauskohdassa sijaitseva luku. Transmittanssin saamiseksi tämä luku on jaettava 10:lläjos absorbanssin arvo on alle 1, 100:lla jos se on välillä 1 2, 1 000:lla jos se on välillä 2 3.Huomautus:Jokaisen lokeron oikeassa yläkulmassa olevan luvun avulla voidaan ottaa interpoloimalla huomioon absorbanssiarvon kolmas desimaali.>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>Exempel:>TAULUKON PAIKKA>Transmittanssit T % on ilmoitettava 0,1 %:n tarkkuudella>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>>VIITTAUS KAAVIOON>2 PUHDISTETUT TIIVISTETYT RYPÄLEMEHUT2.1 PeriaateMitataan absorbanssi 452 nm:ssä 1 cm:n paksuudessa sen jälkeen, kun puhdistetun tiivistetyn rypälemehunsokerikonsentraatio on saatettu 25 %:ksi (m/m) (25 °Brix).2.2 Laitteet2.2.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittauksia välillä 300 700 nm.2.2.2 Lasikyvettejä, joiden optinen pituus on 1 cm.2.2.3 Kalvosuodatin, jonka huokoisuus on 0,45 ìm.2.3 Suoritus2.3.1 Näytteen valmistaminenKäytetään liuosta, jonka sokeripitoisuus on 25 % (m/m) (25 °Brix) ja joka on valmistettu luvun "pH" 4.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla. Suodatetaan kalvosuodattimen läpi, jonka huokoisuus on 0,45 ìm.2.3.2 Absorbanssin määrittäminenSäädetään absorbanssin nollakohta aallonpituudella 425 nm käyttäen tislattua vettä sisältävää kyvettiä, jonka optinen pituus on 1 cm.Mitataan 25 % (25 °Brix) sokeria sisältävän nesteen, joka on valmistettu 2.3.1 kohdassa kuvatullatavalla, 1 cm:n optisen pituuden omaavassa kyvetissä, absorbanssi A samalla aallonpituudella.2.4 Tulosten ilmoittaminen25 % (m/m) sokeria sisältävän (25 °Brix) puhdistetun tiivistetyn rypalemehun absorbanssi 425 nm:ssäilmoitetaan kahdella desimaalilla.41. FOLIN-CIOCALTEU-LUKU 1 MÄÄRITELMÄFolin-Ciocalteu-luku on jäljempänä kuvatulla menetelmällä saatu tulos.2 PERIAATEKaikki viinin sisältämät fenoliset yhdisteet hapetetaan Folin-Ciocalteu-jreagenssilla. Reagenssi koostuu fosfovolframihapon (H3PWl2O40) ja fosfomolybdeenihapon (H3PMo12O40) seoksesta, joka pelkistyy fenolien hapettuessa sinisiksi volframi- (W8O23) ja molybdeenioksideiksi (Mo8O23).Sinisen värin absorptio on korkeimmillaan noin 750 nm:ssä. Se on verrannollinen fenolisten yhdisteiden kokonaismäärään.3 REAGENSSITReagenssien on oltava analyysilaatua. Käytetyn veden on oltava tislattua vettä tai vastaavan puhtausasteeno maavaa vettä.3.1 Folin-Ciocalteu-reagenssiTätä reagenssia on kaupallisesti saatavissa suoraan käytettävässä muodossa. Se voidaan valmistaaseuraavasti: liuotetaan 100 g natriumvolframaattia (Na2WO4, 2 H2O) ja 25 g natriummolybdaattia (Na2MoO4 2 H2O) 700 ml:aan tislattua vetta; lisätään 50 ml 85 % fosforihappoa (p20 = 1,71 g/ml) ja 100 ml väkevää kloorivetyhappoa (p20 = 1,19 g/ml). Kuumennetaan kiehuvaksi ja keitetään 10 tuntiapystyjäähdyttimellä varustetussa kolvissa, tämän jälkeen lisätään 150 g litiumsulfaattia (Li2SO4 H2O), muutama bromitippa ja keitetään uudelleen 15 minuutin ajan. Jäähdytetään ja täytetään yhdeksi litraksi tislatulla vedellä.3.2 Vedetön natriumkarbonaatti (Na2CO3), 20 % (m/v) -liuos.4 VÄLINEISTÖTavalliset laboratoriovälineet ja erityisesti:4.1 100 ml:n mittapulloja.4.2 Spektrofotometri, jota voidaan käyttää 750 nm:ssä.5. SUORITUS5.1 PunaviinitMitataan 100 ml:n (4.1) mittapulloon seuraavassa järjestyksessä:1 ml suhteessa 1/5 laimennettua viiniä,50 ml tislattua vettä,5 ml Folin-Ciocalteu-reagenssia (3.1),20 ml natriumkarbonaattiliuosta (3.2).Täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä.Homogenoidaan ravistelemalla. Odotetaan 30 minuuttia reaktion tasoittumista. Määritetään absorbanssi 750 nm:ssä 1 cm:n optisella pituudella suhteessa vertailunäytteeseen, jossa on käytetty viinin sijasta tislattua vettä.Jos absorbanssi ei ole lähellä 0,3:a, on viinin laimennusta muutettava.5.2 ValkoviinitTehdään määritys samalla tavalla 1 ml:sta laimentamatonta viiniä.5.3 Puhdistetut tuvistetyt rypälemehut5.3.1 Näytteen valmistaminenKäytetään liuosta, jonka sokeripitoisuus on 25 % (m/m) (25 °Brix) ja joka on valmistettu luvun "pH " 4.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla.5.3.2 MittausTehdään mittaus samalla tavoin kuin punaviineille (5.1) 5 ml:sta 5.3.1 kohdan mukaisesti valmistettuanäytettä ja mitataan absorbanssi suhteessa vertailunäytteeseen, joka on valmistettu 5 ml:sta 25 % (m/m)inverttisokeriliuosta.6. TULOSTEN ILMOITTAMINEN6.1 LaskentatapaTulos ilmoitetaan lukuna, joka saadaan kertomalla absorbanssi 100:lla, jos kyseessä ovat suhteessa 1/5 laimennetut punaviinit (tai käytettyä laimennusta vastaavalla kertoimella), ja 20:llä, jos kyseessä ova tvalkoviinit. Kun kyseessä ovat puhdistetut tiivistetyt rypälemehut, absorbanssi kerrotaan 16:lla.6.2 ToistettavuusSaman henkilön kahden samanaikaisesti tai nopeasti peräkkäin tekemän määrityksen välinen ero ei saa olla yli 1.Tulosten hyvä toistettavuus saavutetaan käyttämällä erittäin puhtaita välineitä (mittapullot ja spektrofotometrin kyvetit).42. PUHDISTETTUJEN TIIVISTETTYJEN RYPÄLEMEHUJEN ERITYISET MÄÄRITYSEENETELMÄT a) KATIONIEN KOKONAISMÄÄRÄ1 PERIAATEKäsitellään näyte vahvasti happamalla kationinvaihtajalla. Kationit vaihdetaan H+:ksi. Ne ilmoitetaan eluaatin kokonaishappopitoisuuden ja näytteen kokonaishappopitoisuuden erotuksena.2 VÄLINEISTÖ2.1 Pituudeltaan noin 300 mm ja sisähalkaisijaltaan 10 11 mm oleva lasikolonni, jossa on hana.2.2 pH-mittari, jonka asteikko on jaettu vähintään 0,1 pH-yksiköihin.2.3 Elektrodit:- lasielektrodi, säilytetään tislatussa vedessä.- kalomeli/kyllästetty kaliumkloridi-vertailuelektrodi, säilytetäänkyllästetyssä kaliumkloridi-liuoksessa,- tai yhdistetty elektrodi, säilytetään tislatussa vedessä.3 REAGENSSIT3.1 Vahvasti hapan kationinvaihtaja H+-muodossa. Ennen käyttöä hartsia on turvotettava vedessä yli yön.3.2 0,1 M natnumhydroksidiliuos.3.3 pH-indikaattoripaperi.4 SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminenKäytetään liuosta, joka on saatu laimentamalla puhdistettu tiivistetty rypälemehu 40 %:ksi (m/v) luvun "Kokonaishappopitoisuus" 5.1.2 kohdassa kuvatulla tavalla.4.2 Ioninvaihtokolonnin valmistaminenAsetetaan kolonniin noin 10 ml H+ -muodossa olevaa paisutettua ioninvaihtohartsia; huuhdellaan kolonnia tislatulla vedellä, kunnes happo on peseytynyt pois; tämä todetaan indikaattoripaperilla.4.3 IoninvaihtoValutetaan kolonnin läpi 100 ml puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta 4.1 kohdan mukaisesti valmistettua liuosta 1 tippa sekunnissa. Kerätään eluaatti mittalasiin. Huuhdotaan kolonni 50 ml:lla tislattua vettä. Titrataan eluaatin happopitoisuus (mukaan lukien huuhteluvesi) 0,1 M natriumhydroksidili uoksella pH-arvoon 7 20 °C:ssa. Emäksistä liuosta on lisättävä hitaasti ja liuosta on ravisteltava koko ajan. Käytetyn 0,1 M natriumhydroksidiliuoksen tilavuus on n ml.5 TULOSTEN ILMOITTAMINENKationien kokonaismäärä ilmoitetaan milliekvivalentteina kilogrammassa kokonaissokeria yhdellä desimaalilla.5.1 Laskeminen- Eluaatin happopitoisuus ilmoitettuna milliekvivalentteina kilogrammassa puhdistettua tiivistettyä rypälemehua:E = 2,5 × n.- Puhdistetun tiivistetyn rypälemehun kokonaishappopitoisuus milliekvivalentteina kilogrammassa (ks. "Kokonaishappopitoisuus" 6.1.2 kohta): a- Kationien kokonaismäärä milliekvivalentteina kilogrammassa kokonaissokeria:>NUM>2,5 n - a/>DEN>P × 100P = kokonaissokerien pitoisuus prosentteina (m/m).b) JOHTOKYKY1 PERIAATENestepatsaan sähkönjohtavuus määritetään kahdella samansuuntaisella platinaelektrodilla, jotka muodostavat yhden haaran Wheatstonen sillan kytkennässä.Johtokyky vaihtelee lämpötilan mukaan. Se ilmoitetaan 20 °C:ssa.2. LAITE2.1 Johtokykymittari, jolla voidaan tehdä johtokykymittauksia alueella 1-1 000 mikrosiemensiä/cm.2.2 Vesihaude, jolla voidaan saattaa määritettävien näytteiden lämpötila noin 20 °C:seen (20 ± 2 °C).3 REAGENSSIT3.1 Demineralisoitu vesi, jonka ominaisjohtokyky on alle 2 mikrosiemensiä/cm 20 °C:ssa.3.2 Kaliumkloridivertailuliuos.Liuotetaan 0,581 g aiemmin 105 °C:ssa vakiopainoon kuivattua kaliumkloridia, KCI, demineralisoituun veteen (3.1). Täytetään yhdeksi litraksi demineralisoidulla vedellä (3.1). Tämä liuoksen johtokyky on 1 000 mikrosiemensiä/cm 20 °C:ssa. Se säilyy 3 kuukautta.4 SUORITUS4.1 Näytteen valmistaminen määritystä vartenKäytetään liuosta, jonka kokonaissokenpitoisuus on 25 % (m/m) (25 °Brix), kuten kuvataan luvun "pH:n määrittäminen" 4.1.2 kohdassa.4.2 Johtokyvyn määrittäminenSaatetaan määritettävä näyte 20 °C:seen vesihauteessa. Pidetään lämpötila vakiona 0,1 °C:n tarkkuudella.Huuhdotaan johtokykymittarin mittauskenno kaksi kertaa tutkittavalla liuoksella.Mitataan johtokyky ilmoitettuna mikrosiemenseinä senttimetriä kohti.5. TULOSTEN ILMOITTAMINENPuhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta valmistetun 25 % (m/m) (25 °Brix) liuoksen johtokyky ilmoitetaan kokonaislukuna mikrosiemenseinä senttimetriä kohti (Scm-1) 20 °C:ssa.5.1 LaskeminenJos laitteessa ei ole lämpötilankompensoijaa, mitattu johtokyky korjataan taulukon 1 avulla. Jos lämpötila on alle 20 °C, lisätään korjaus; jos lämpötila on yli 20 °C, vähennetään korjaus.TAULUKKO 1 >KAAVION ALKU>Johtokykyyn tehtävät korjaukset, kun lämpötila eroaa 20 °C:sta, mikrosiemenseinä cm-1>KAAVION LOOPU>>VIITTAUS KAAVIOON>c) HYDROKSHIMETYYLIFURFURAALI1 MENETELMIEN PERIAATE1.1 Kolorimetrinen menetelmäFuraanista johdetut aldehydit, joista tärkein on hydroksimetyylifurfuraali, reagoivat barbituurihapon ja paratoluidiinin kanssa ja reaktiossa syntyy punainen yhdiste, joka määritetään kolorimetrisesti 550 nm:ssä.1.2 Suuren erotuskyvyn nestekromatografiaErottaminen kolonnissa käänteisfaasilla ja määrittäminen 280 nm:ssä.2. KOLORIMETRINEN MENETELMÄ2.1 Laitteet2.1.1 Spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittauksia välillä 300-700 nm.2.1.2 Lasikyvettejä, optinen pituus 1 cm.2.2 Reagenssit2.2.1 Barbituurihappo, 0,5 % liuos (m/v)Liuotetaan 500 mg barbituurihappoa, C4O3N2H4, tislattuun veteen lämmittäen hieman 100 °C:ssa vesihauteessa; täytetään 100 ml:ksi tislatulla vedellä. Liuos säilyy noin yhden viikon.2.2.2 Paratoluidiini, 10 % liuos (m/v)Mitataan 10 g paratoluidiinia, C6H4(CH3)NH2, 100 ml:n mittapulloon; lisätään 50 ml isopropanolia, CH3CH(OH)CH3, ja 10 ml jääetikkaa, CH3COOH(ñ20 = 1,05 g/ml); täytetään 100 ml:ksi isopropanolilla. Tämä liuos on uusittava päivittäin.2.2.3 Asetaldehydi (CH3CHO), 1 % vesiliuos (m/v)Valmistetaan juuri ennen käyttöä.2.2.4 Hydroksimetyylifurfuraali, C6O3H6, 1 g/l vesiliuosValmistetaan perättäisillä laimennuksilla liuokset, joiden pitoisuudet ovat 5; 10; 20; 30 ja 40 mg/l. Pitoisuudeltaan 1 g/l oleva liuos ja sen laimennokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.2.3 Suoritus2.3.1 Näytteen valmistaminenKäytetään liuosta, joka on saatu laimentamalla puhdistettu tiivistetty rypälemehu 40 %:ksi (m/v) luvun "Kokonaishappopitoisuus" 5.1.2 kohdan mukaisesti. Tehdään määritys 2 ml:sta tätä liuosta.2.3.2 Kolorimetrinen måäritysMitataan kahteen 25 ml:n hiostulpalliseen pulloon a ja b 2 ml näytettä, joka on valmistettu 2.3.1 kohdan mukaisesti. Mitataan molempiin pulloihin 5 ml paratoluidiiniliuosta (2.2.2); sekoitetaan. Lisätään pulloon b (vertailu) 1 ml tislattua vettä, ja pulloon a (mittaus) 1 ml barbituurihappoliuosta (2.2.1). Homogenoidaan ravistelemalla. Siirretään pullojen sisältö spektrofotometrin 1 cm:n kyvetteihin. Säädetään absor- banssiasteikon nollakohta aallonpituudelle 550 nm käyttäen pullon b sisältöä, seurataan pullon a sisällön absorbanssin muutosta; mitataan sen suurin arvo A, joka saavutetaan 2 5 minuutissa.Näytteet, joiden hydroksimetyylifurfuraalipitoisuus on yli 30 mg/l, on laimennettava ennen määritystä.2.3.3 Kalibrointikäyrän laatiminenMitataan kahteen 25 ml:n pulloon a ja b 2 ml hydroksimetyylifurfuraaliliuoksia, joiden pitoisuudet ovat 5; 10; 20; 30 ja 40 mg/l (2.2.4) ja käsitellään ne 2.3.2 kohdassa kuvatulla tavalla.Graafinen kuvaaja, joka esittää absorbanssin muutoksen vertailuliuosten hydroksimetyylifurfuraalipitoisuuksien milligrammoina litrassa funktiona on origon kautta kulkeva suora.2.4 Tulosten ilmoittaminenPuhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen hydroksimetyylifurfuraalipitoisuus ilmoitetaan milligrammoina kilogrammassa kokonaissokeria.2.4.1 LaskentatapaMääritettävän näytteen hydroksimetyylifurfuraalipitoisuus C mg/l on kalibrointikäyrältä saatava pitoisuus, joka vastaa tästä näytteestä mitattua absorbanssia A.Hydroksimetyylifurfuraalipitoisuus milligrammoina kilogrammassa kokonaissokeria:250 × >NUM>C/>DEN>PP = puhdistetun tiivistetyn rypälemehun kokonaissokerien pitoisuus prosentteina (m/m).3. SUUREN EROTUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFIA3.1 Laitteet3.1.1 Suuren erotuskyvyn nestekromatografi, jossa on:- 5-10 ìl injektointiluuppi,- detektori, spektrofotometri, jolla voidaan tehdä mittauksia 280 nm:ssä,- kolonni, silikaan sidottu oktadesyyli (esimerkiksi: Bondapak C18 - Corasil, Water Ass.),- piirturi ja mahdollisesti integraattori.Liikkuvan faasin virtausnopeus: 1,5 ml/min.3.1.2 Kalvosuodatuslaitteisto (0,45 ìm)3.2 Reagenssit3.2.1 Kahdesti tislattu vesi.3.2.2 Metanoli, CH3OH, tislattu tai HPLC-laatua.3.2.3 Etikkahappo, CH3COOH(ñ20 = 1,05 g/ml).3.2.4 Liikkuva faasi: vesi-metanoli (3.2.2)   etikkahappo (3.2.3) suodatettu kalvosuodattimen (0,45 ìm) läpi, (40 - 9 - 1 v/v).Tämä liikkuva faasi on valmistettava päivittäin ja kaasut on poistettava ennen käyttöä.3.2.5 Hydroksimetyylifurfuraalivertailuliuos, 25 mg/l (m/v).Mitataan 100 ml:n mittapulloon tarkalleen 25 mg hydroksimetyylifurfuraalia, C6H3O6, ja täytetään tilavuus merkkiin metanolilla (3.2.2). Tämä liuos laimennetaan metanolilla (3.2.2) suhteessa 1/10 ja suodatetaan kalvosuodattimen (0,45 ìm) läpi.Ruskeassa ilmatiiviisti suljetussa pullossa jääkaapissa säilytettynä tämä liuos säilyy 2 3 kuukautta.3.3 Suoritus3.3.1 Näytteen valmistaminenKäytetään liuosta, joka on saatu laimentamalla puhdistettu tiivistetty rypälemehu 40 %:ksi (m/v) luvun "Kokonaishappopitoisuus" 5.1.2 kohdan mukaisesti ja suodattamalla liuos kalvosuodattimen (0,45 ìm) läpi.3.3.2 Kromatografinen määritysInjektoidaan kromatografiin 5 (tai 10) ìl 3.3.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä ja 5 (tai 10) ìl hydroksimetyylifurfuraalivertailuliuosta (3.2.5). Tulostetaan kromatogrammi.Hydroksimetyylifurfuraalin retentioaika on noin 6 7 minuuttia.3.4 Tulosten ilmoittaminenPuhdistettujen tiivistettyjen rypälemehujen hydroksimetyylifuriuraalipitoisuus ilmoitetaan milligrammoina kilogrammassa kokonaissokeria.3.4.1 LaskentatapaPuhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta saadun 40 % (m/v) liuoksen hydroksimetyylifurfuraalipitoisuus on C mg/l.Hydroksimetyylifurfuraalipitoisuus milligrammoina kilogrammassa kokonaissokeria:>NUM>250 ×/>DEN>C;PP = puhdistetun tiivistetyn rypälemehun kokonaissokerien pitoisuus prosentteina (m/m).d) RASKASMETALLIT1. PERIAATTEETI. Raskasmetallien nopea arviointimenetelmäRaskasmetallit osoitetaan sopivasti laimennetusta puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta värillä, jonka sulfidien muodostuminen tuottaa. Ne arvioidaan vertaamalla Iyijyvertailuliuokseen, joka vastaa korkeinta hyväksyttyä pitoisuutta.II. Lyijypitoisuuden määrittäminen atomiabsorptiospektrofotometrisestiKelaatti, jonka lyijy muodostaa ammoniumpyrrolidiiniditiokarbamaatin kanssa, uutetaan metyyli- isobutyyliketonilla ja absorbanssi mitataan 283,3 nm: ssä. Lyijypitoisuus määritetään lisäysmenetelmällä.2. RASKASMETALLIEN NOPEA ARVIOINTIMENETELMÄ2.1 Reagenssit2.1.1 Laimennettu kloorivetyhappo, 70 % (m/v)Mitataan 70 g kloorivetyhappoa (Hcl),(ñ20 = 1,16-1,19 g/ml), ja täytetään vedellä 100 ml:ksi.2.1.2 Laimennettu kloorivetyhappo, 20 % (m/v)Mitataan 20 g kloorivetyhappoa (Hcl), (ñ20 = 1,16-1,19 g/ml), ja täytetään vedellä 100 ml:ksi.2.1.3 Laimennettu ammoniakkiMitataan 14 g ammoniakkia (NH3),(ñ20 = 0,931-0,934 g/ml), ja täytetään vedellä 100 ml:ksi.2.1.4 Puskuriliuos, pH 3,5Liuotetaan 25 g ammoniumasetaattia (CH3COONH4) 25 ml:aan vettä ja lisätään 38 ml laimennettua kloorivetyhappoa (2.1.1). Tarpeen vaatiessa säädetään pH laimennetulla rikkihapolla (2.1.2) tai laimennetulla ammoniakilla (2.1.3) ja täytetään vedellä 100 ml:ksi.2.1.5 Tioasetamidiliuos, (C2H5NS), 4 % (m/v)2.1.6 Glyseroliliuos (C3H8O3), 85 % (m/v)(n20 °CD = 1,449-1,455).2.1.7 TioasetamidireagenssiLisätään 0,2 ml:aan tioasetamidiliuosta (2.1.5) 1 ml seosta, jossa on 5 ml vettä, 15 ml 1 M natrium- hydroksidiliuosta ja 20 ml glyserolia (2.1.6). Lämmitetään 100 °C:ssa vesihauteessa 20 sekuntia. Valmistetaan juuri ennen käyttöä.2.1.8 Lyijyliuos, 0,002 g/lValmistetaan 1 g/l lyijyä sisältävä liuos liuottamalla veteen 0,400 g Iyijynitraattia, Pb(NO3)2, ja täytetään vedellä 250 ml:ksi. Laimennetaan tämä liuos vedellä juuri ennen käyttöä 2°/oo:ksi, jotta saadaan lyijyä 0,002 g/l sisältävä liuos.2.2 SuoritusLiuotetaan puhdistetusta tiivistetystä rypälemehusta otettu 10 g:n suuruinen näyte 10 ml:aan vettä. Lisätään 2 ml puskuriliuosta, jonka pH-arvo on 3,5 (2.1.4); sekoitetaan. Lisätään 1,2 ml tioasetamidi-reagenssia (2.1.7). Sekoitetaan viipymättä. Valmistetaan vertailunäyte samoissa koeolosuhteissa käyttäen10 ml lyijyä 0,002 g/l sisältävää liuosta (2.1.8).Puhdistettuun tiivistettyyn rypälemehuun mahdollisesti muodostunut ruskea väri ei saa olla kahden minuutin kuluttua tummempi kuin vertailuliuoksen väri.2.3 LaskeininenKäytetyissä koeolosuhteissa vertailukoe vastaa korkeinta hyväksyttyä raskasmetallipitoisuutta ilmoitettunalyijynä 2 mg/kg:ssa puhdistettua tiivistettyä rypälemehua.3 LYLTYPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN ATOMIABSORPTIOSPEKTROFOTO-METRILLÄ3.1 Laitteet3.1.1 Atomiabsorptiospektrofotometri, jossa on ilma-asetyleenipoltin.3.1.2 Lyijyonttokatodilamppu.3.2 Reagenssit3.2.1 Laimennettu etikkahappo.Mitataan 12 g jääetikkaa(ñ20 = 1,05 g/ml) ja täytetään vedellä 100 ml:ksi.3.2.2 Ammoniumpyrrolidiiniditiokarbamaattiliuos C5H12N2S2, 1 % (m/v).3.2.3 Metyyli-isobutyyliketoni, (CH3)2CHCH2COCH3).3.2.4 Lyijyliuos, joka sisältää lyijyä 0,010 g/l.Laimennetaan 1 g/l lyijyä sisältävä lyijyliuos (2.1.8) 1 %:ksi (v/v).3.3 Suoritus3.3.1 Tutkittava liuosLiuotetaan 10 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua seokseen, joka sisältää yhtä suuret tilavuudet laimennettua etikkahappoa (3.2.1) ja vettä, ja täytetään tällä seoksella 100 ml:ksi.Lisätään 2 ml ammoniumpyrrolidiiniditiokarbamaattiliuosta (3.2.2) ja 10 ml metyyli-isobutyyliketoni (3.2.3). Ravistellaan 30 sekuntia valolta suojattuna. Annetaan kerrosten erottua. Käytetään metyyli- isobutyyliketonikerros.3.3.2 VertailuliuoksetValmistetaan 3 vertailuliuosta, jotka sisältävät 10 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua, 1, 2 ja 3 ml 0,010 g/l lyijyliuosta (3.2.4). Käsitellään liuokset samalla tavoin kuin määritettävä liuos.3.3.3 SokeakoeValmistetaan sokeakoeliuos 3.3.1 kohdan koeolosuhteissa, mutta ei lisätä liuokseen puhdistettua tiivistettyä rypälemehua.3.3.4 MääritysValitaan aallonpituus 283,3 nm.Atomisoidaan sokeakokeesta peräisin oleva metyyli-isobutyyliketoni liekissä ja säädetään absorbanssin nollakohta.Käyttäen vastaavia liuosuutteita määritetään tutkittavan liuoksen ja vertailuliuosten absorbanssit.3.4 Tulosten ilmoittaminenLyijypitoisuus ilmoitetaan milligrammoina kilogrammassa puhdistettua tiivistettyä rypälemehua.3.4.1 LaskeminenPiirretään käyrä, joka edustaa absorbanssien muuttumista vertailuliuoksiin lisätyn Iyijyn konsentraation funktiona, kun nollakonsentraatio vastaa tutkittavaa liuosta.Ekstrapoloidaan pisteet yhdistävä suora, kunnes se leikkaa konsentraatioakselin negatiivisella osalla. Tämän pisteen etäisyys origosta antaa tutkittavan liuoksen Iyijykonsentraation.e) ETANOLIN KEMIALLINEN MÄÄRITYSTätä määritysmenetelmää käytetään määritettäessä alkoholipitoisuus vähän alkoholia sisältävistä nesteistä, kuten rypälemehut, tiivistetyt rypälemehut ja puhdistetut tiivistetyt rypälemehut.1 PERIAATENesteen yksinkertainen tislaus. Tisleen sisältämän etanolin hapettaminen kaliumdikromaatilla. Dikromaattiylijäämän titraus rauta (II) liuoksella.2. LAITE2.1 Käytetään luvun "Alkoholipitoisuus" 3.2 kohdassa kuvattua tislauslaitetta.3. REAGENSSIT3.1 KaliumdikromaattiliuosLiuotetaan 33,600 g kaliumdikromaattia (K2Cr2O7) sellaiseen määrään vettä, että liuosta on 20 °C:ssa yksi litra.Yksi millilitra tätä liuosta hapettaa 7,8924 mg alkoholia.3.2 Rauta (II) ammoniumsulfaattiliuosLiuotetaan 135 g rauta(II)ammoniumsulfaattia, FeSO4.(NH4)2SO4 6H2O sellaiseen määrään vettä, että siitä tulee 1 litra livosta ja lisätään 20 ml väkevää rikkihappoa (H2SO4), (ñ20 = 1,84 g/ml). Juuri valmistettuna tämä liuos vastaa noin puolen tilavuutensa kokoista dikromaattiliuosta. Tämän jälkeen se hapettuu hitaasti.3.3 KaliumpermanganaattiliuosLiuotetaan 1,088 g kaliumpermanganaattia, KMnO4, sellaiseen määrään vettä, että saadaan liuosta 1 litra.3.4 Suhteessa 1/2 (v/v) laimennettu rikkihappoLisätään ravistellen ja hieman kerrallaan 500 ml:aan vettä 500 ml rikkihappoa (H2SO4) (ñ20 = 1,84 g/ml).3.5 Rauta-ortofenantroliini -reagenssiLiuotetaan 0,695 g rautasulfaattia, FeSO4. 7H2O 100 ml:aan vettä, lisätään 1,485 g ortofenantroliini- monohydraattia, C12H8N2, H2O. Lämmitetään liukenemisen helpottamiseksi. Tämä kirkkaan punainen liuos säilyy erittäin hyvin.4 SUORITUS4.1 TislausMitataan tislauskolviin 100 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua ja 100 ml vettä. Kerätään tisle 100 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin vedellä.4.2 HapettaminenMitataan 300 ml:n hiostulpalliseen pulloon, joka voidaan huuhdella ilman hävikkiä laajennetun kaula- osansa ansiota, 20 ml kaliumdikromaattiliuosta (3.1), 20 ml suhteessa 1/2 (v/v) laimennettua rikkihappoa (3.4) ja ravistellaan. Lisätään 20 ml tislettä. Suljetaan pullo, ravistellaan ja odotetaan vähintään 30 minuuttia ravistellen pulloa ajoittain ("määritys" -pullo).Tehdään rauta (II) ammoniumsulfaattiliuoksella titraus (3.2) kaliumdikromaattiliuoksen suhteen mittaamalla samanlaiseen pulloon sama määrä reagensseja, mutta korvaamalla 20 ml tislettä 20 ml:lla tislattua vettä ("vertailu" -pullo).4.3 TitrausLisätään 4 tippaa ortofenantroliinireagenssia (3.5) "määritys" -pulloon. Titrataandikromaattiylijäämä lisää- mällä pulloon rauta (II) ammoniumsulfaattiliuosta (3.2). Keskeytetään rautaliuoksen lisääminen, kun seos muuttuu sinivihreästä ruskeaksi.Loppukohdan tarkentamiseksi muutetaan ruskea liuos sinivihreäksi kaliumpermanganaattiliuoksella (3.3). Vähennetään kymmenesosa tämän liuoksen tilavuuden rauta (II) sulfaattiliuoksen tilavuudesta. Tämä erotus on n.Toistetaan suoritus samalla tavoin "vertailu" -pullolle. Erotus on n'.5. TULOSTEN ILMOITTAMINENEtanoli ilmoitetaan grammoina kilogrammassa kokonaissokeria yhdellä desimaalilla.5.1 Laskentatapan' ml rautaliuosta pelkistää 20 ml dikromaattiliuosta, joka hapettaa 157,85 mg puhdasta etanolia.Yhdellä millilitralla rauta (II) liuosta on sama pelkistävä vaikutus kuin:>NUM>157,85/>DEN>n' mg etanoln'   n ml:lla rauta (II) liuosta on sama pelkistävä vaikutus kuin:157,85 × >NUM>n' - n/>DEN>n' mg etanolEtanolia g/kg puhdistettua tiivistettyä rypälemehua:7,892 × >NUM>n'- n/>DEN>n'Etanolia g/kg kokonaissokeria:789,2 × >NUM>n' - n/>DEN>n' × Pjossa P = kokonaissokerien pitoisuus prosentteina (m/m).f) MESOINOSITOLI, SKYLLOINOSITOLI JA SAKKAROOSI1 PERIAATESilanoitujen johdannaisten kaasukromatografia.2 REAGENSSIT2.1 Sisäinen standardi: xylitoli (10 g/l vesiliuos, johon on lisätty lastankärjellinen natriumatsidia).2.2 Bistrimetyylisilyylitrifluoroasetamidi - BSTFA - (C8H18F3NOSi2).2.3 Trimetyylikloorisilaani (C3H9ClSi).2.4 Pyridiini, analyysilaatua (C5H5N).2.5 Mesoinositoli (C6H12O6).3. VÄLINEISTÖ3.1 Kaasukromatografi, jossa on:3.2 Kapillaarikolonni (esimerkiksi sulatettu silikakapillaarikolonni, OV 1, kalvon paksuus 0,15 ìm, pituus 25 m ja sisähalkaisija 0,3 mm).Suoritusolosuhteet:- kantokaasu: vety tai helium,- kaasun virtausnopeus: noin 2 ml/minuutissa,- injektorin ja detektorin lämpötila: 300 °C,- lämpötilan ohjelmointi: 1 minuutti 160 °C, 4 °C/minuutti, kunnes saavutetaan 260 °C, isotermisesti 260 °C:ssa 15 minuuttia,- jakosuhde: noin 1 1-20.3.3 Integraanori.3.4 Mikroruisku, 10 ìl.3.5 Mikropipettejä, 50, 100 ja 200 ìl.3.6 2 ml:n mittapulloja, joissa on teflonkorkki.3.7 Uuni.4. SUORITUSMitataan 50 ml:n mittapulloon tarkalleen 5 g puhdistettua tiivistettyä rypälemehua, 1 ml xylitolistandardiliuosta (2.1) ja täytetään merkkiin vedellä. Näytteen homogenoinnin jälkeen otetaan 100 ìl liuosta mittapulloon ja kuivataan kevyessä ilmavirrassa (3.6). Haihtumisen helpottamiseksi on mahdollista lisätä 100 ìl absoluuttista etanolia.Liuotetaan jäännös huolellisesti 100 ìl:aan pyridiiniä (2.4), lisätään 100 ìl bistrimetyylisilyylitrifluoroasetamidia (2.2) ja 10 ìl trimetyylikloorisilaania (2.3), suljetaan pullo teflonkorkilla ja asetetaan 60 °C:n uuniin tunnin ajaksi.Otetaan 0,5 ìl kirkasta nestettä ja injektoidaan se käyttäen onttoa lämmitettyä neulaa edellä mainitun jaka ja suhteen mukaisesti.5 TULOSTEN LASKEMINEN5.1 Valmistetaan liuos, joka sisältää:60 g/l glukoosia, 60 g/l fruktoosia, 1 g/l mesoinositolia ja 1 g/l sakkaroosia.Punnitaan 5 g tätä liuosta ja edetään 4 kohdassa kuvatulla tavalla. Lasketaan mesoinositolin ja sakkaroosinkertoimet xylitolin suhteen saadusta kromatogrammista.Skylloinositolille, jota ei ole kaupallisesti saatavissa ja jonka retentioaika on glukoosin anomeriamuotojen viimeisen piikin ja mesoinositolin viimeisen piikin välillä (ks. liitekuva), käytetään mesoinositolin kerrointa.6 TULOSTEN ILMOITTAMINEN6.1 Mesoinositoli ja skylloinositoli ilmoitetaan milligrammoina kilogrammassa kokonaissokeria. Sakkaroosi ilmoitetaan grammoina kilogrammassa rypälemehua.>VIITTAUS KAAVIOON>(1) Voidaan käyttää kaikkia ominaisuuksiltaan vastaavia pyknometrejä.(2) Tämän luvun 6 kohdasa annetaan laskentaesimerkki.(3) Tämän luvun 6 kohdassa annetaan laskentaesimerkki.(4) Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina.(5) Sokeripitoisuus ilmoitetaan inverttisokerina.(6) Esimerkki: alkoholipitoisuudelle 12 massa-%, ñ = 0,12.(7) Nämä arvot annetaan yhteisön tietopankin perustamista odotettaessa.(8) Yksi kauppanimike on "norite".(9) 105 pascalia (Pa) = 1 bar.(10) 1 pascal (Pa) = 1 n/m2 = 10-5 bar.(11) Muita kaasuja (O2, N2jne.), joiden määrä on niin alhainen, etteivät ne vaikuta paineeseen, ei oteta huomioon.(12) Tiettyjen viinien, kuten väkevän viinin, tisle ei ole kirkas huolimatta suodatuksesta: tämä tisle on pantava 200 ml:n tislauskolviin, täytettävä 30 ml:ksi vedellâ ja tislattava edelleen emäksisenâ hylkäämällâ noin 15 ml:n suuruinen alkutisletilavuus. Jäähdytetään kolvin sisältö, tehdään happamaksi noin 5 ml:lla laimennettua rikkihappoa ja toistetaan tislaus kerâämällä tisle 5 ml:aan 1 M natriumhydroksidiliuosta. Tislataan noin 5 ml nesteestä. Tämän jälkeen se on kirkas.(13) Tämä lisäys on valinnainen, toiset henkilöt huomaavat helpommin vaaleanpunaisen liuoksen kuin värittömän liuoksen samenemisen.(14) n' on 0,05 tai 0,1 ml, jos käytetyn veden tilavuus on alle 10 ml. Jotta muutos olisi havaittava, tämän tilavuuden on oltava mahdollisimman pieni. Tämän takia laimentamista olisi vältettävä pääsuorituksen aikana.(15) Tämä etäisyys on annettava suunnassa O:sta C:hen.