CELEX: 31974L0203
Language: es
Date: 1974-03-25 00:00:00
Title: Quinta Directiva 74/203/CEE de la Comisión, de 25 de marzo de 1974, por la que se determinan los métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales

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31974L0203

Quinta Directiva 74/203/CEE de la Comisión, de 25 de marzo de 1974, por la que se determinan los métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales  

Diario Oficial n° L 108 de 22/04/1974 p. 0007 - 0024 Edición especial en finés : Capítulo 3 Tomo 5 p. 0210  Edición especial griega: Capítulo 03 Tomo 10 p. 0168  Edición especial sueca: Capítulo 3 Tomo 5 p. 0210  Edición especial en español: Capítulo 03 Tomo 7 p. 0191  Edición especial en portugués: Capítulo 03 Tomo 7 p. 0191 

 QUINTA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN    de 25 de marzo de 1974    por la que se determinan los métodos de análisis   comunitarios para el control oficial de los   alimentos para animales     ( 74/203/CEE )    LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,    Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad   Económica Europea ,    Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 ,   relativa a la introducción de métodos de toma de   muestras de análisis comunitarios para el control   oficial de los alimentos para animales (1) , modificada   en último lugar por el Acta (2) adjunta al Tratado   relativo a la adhesión de nuevos Estados miembros   a la Comunidad Económica Europea y a la Comunidad   Europea de la Energía Atómica (3) firmada en   Bruselas el 22 de enero de 1972 , y , en particular ,   su artículo 2 ,    Considerando que la Directiva antes citada prevé los   controles oficiales de los alimentos para animales   dirigidos a comprobar si se respetan las condiciones   establecidas en virtud de las disposiciones legales ,   reglamentarias o administrativas sobre la calidad   y composición de dichos alimentos se efectuarán   según los métodos de toma de muestras y de   análisis comunitarios ;    Considerando que las Directivas 71/250/CEE ,   71/393/CEE , 72/199/CEE y 73/46/CEE de la Comisión ,   de 15 de junio de 1971 (4) , 18 de noviembre de 1971   (5) , 27 de abril de 1972 (6) y 5 de diciembre de 1972   (7) respectivamente , ya han establecido métodos   de análisis comunitarios ; que , habida cuenta   del grado de avance de los trabajos efectuados   desde entonces es conveniente establecer una quinta   seria de métodos ;    Considerando que las medidas previstas en la presente   Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente   de la alimentación animal ,    HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :    Artículo 1    Los Estados miembros dispondrán los análisis para los   controles oficiales de los alimentos para animales , en lo   que se refiere al contenido en almidón y en productos de   degradación de alto peso molecular de almidón de los   alimentos que contengan peladuras , pulpas , hojas o   cuellos secos de remolachas , pulpas de patatas ,   levaduras deshidratadas , productos ricos en inulina o   chicharrones se efectúen según el meétodo descrito   en el Anexo I de la presente Directiva .    Serán aplicables al método descrito en el Anexo I   de la presente Directiva las disposiciones generales que   figuren en la Parte I ( Introducción ) del Anexo de la   primera Directiva 71/250/CEE de la Comisión de   15 de junio de 1971 .    Artículo 2    Los Estados miembros dispondrán que los análisis   para los controles oficiales de los alimentos para   animales , en lo que se refiere a sus contenidos en   amprolio , etopabato , dinitolmida ( DOT ) , nicarbacina   y menadiona ( vitamina K3 ) , se efectúen según   los métodos descritos en el Anexo II de la   presente Directiva .    Serán aplicables a los métodos descritos en el   Anexo II de la presente Directiva las disposiciones   generales que figuran en la Parte I ( Introducción )   del Anexo de la Directiva 71/250/CEE de la Comisión ,   de 15 de junio de 1971 , con excepción de la parte   relativa a la preparación de la muestra para análisis .    Artículo 3    Los Estados miembros aplicarán , a más tardar el   1 de noviembre de 1974 , las disposiciones legales ,   reglamentarias o administrativas necesarias para   cumplir las disposiciones de la presente Directiva .   Informarán de ello inmediatamente a la Comisión .    Artículo 4    Los destinatarios de la presente Directiva serán   los Estados miembros .    Hecho en Bruselas , el 25 de marzo de 1974 .    Por la Comisión    El Presidente    François-Xavier ORTOLI    (1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .    (2) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 14 .    (3) DO n º L 73 de 27 . 3 . 1972 , p. 5 .    (4) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .    (5) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .    (6) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .    (7) DO n º L 83 de 30 . 3 . 1973 , p. 21 .    ANEXO I    DETERMINACIÓN DEL ALMIDÓN     - Método de la pancreatina -    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar el contenido en   almidón y en productos de degradación de   alto peso molecular en almidón de los alimentos   que contienen peladuras , pulpas , hojas o cuellos   desecados de remolacha , pulpas de patata , levaduras   deshidratadas , productos ricos en inulina   ( por ejemplo , peladura y harina de patata )   o chicharrones . La determinación sólo se   habrá de efectuar cuando el examen microscópico   muestre la presencia de cantidades no despreciables   de almidón en la muestra .    2 . Principio    Los azúcares presentes en la mezcla se eliminan   mediante extracción por etanol . El almidón   del residuo de extracción se sacarifica mediante   la pancreatina . Los azúcares se hidrolizan   mediante el ácido clorhídrico y la glucosa se   forma y se determina mediante el método de   Luff-Schoorl . La cantidad de glucosa obtenida   de esta forma multiplicado por un factor constante ,   da el contenido en almidón de la muestra .    3 . Reactivos    3.1 . Etanol al 90 % ( v/v ) , neutro a la   fenolftaleina .    3.2 . Alcohol n-amílico p.a.    3.3 . Tolueno p.a.    3.4 . Solución tampón : Disolver en el agua   9,078 g de fosfato monopotásico KH2 PO4 y 11,876 g   de fosfato disódico Na2 HPO4 · 2H2O . Completar   a 1 l mediante agua .    3.5 . Solución de cloruro de sodio 0,2 N .    3.6 . Solución de Carrez I : Disolver en el agua   21,9 g de acetato de zinc Zn (CH3COO)2 · 2H2O y 3 g   de ácido acético glacial . Completar a 100 ml   mediante agua .    3.7 . Solución de Carrez II : Disolver en el agua   10,6 g de ferrocianura de potasio    K4 [ Fe(CN6) ] · 3H2O . Completar a 100 ml   mediante agua .    3.8 . Ácido clorhídrico N .    3.9 . Ácido clorhídrico p.a. , 8 N   aproximadamente , d : 1,125 .    3.10 . Solución de hidróxido de sodio p.a. ,   10 N aproximadamente , d : 1,33 .    3.11 . Indicador : solución al 0,1 % ( p/v )   de metilorangina .    3.12 . Pancreatina , pulverulento , que responda   a las disposiciones dadas en el punto B : conservar   en frascos tapados , a resguardo de la luz y de   la humedad .    3.13 . Reactivo según Luff-Schoorl : verter ,   agitando con prudencia , la solución de ácido   cítrico ( 3.1.3.2 ) en la solución de carbonato   de sodio ( 3.1.3.3 ) . Añadir a continuación   sulfato de cobre ( 3.1.3.1 ) y completar a 1 l   mediante agua . Dejar reposar una noche y filtrar .   Controlar la normalidad del reactivo así obtenido   ( Cu 0,1 N ; Na2 CO3 2 N ) . El pH de la solución   debe ser de 9,4 aproximadamente .    3.1.3.1 . Solución de sulfato de cobre : disolver   25 g de sulfato de cobre p.a. Cu SO4 · 5H2O en   100 ml de agua .    3.1.3.2 . Solución de ácido cítrico :   disolver 50 g de ácido cítrico p.a. C6H8O7 ·   H2O en 50 ml de agua .    3.1.3.3 . Solución de carbonato de sodio :   disolver 143,8 g de carbonato de sodio anhidro   p.a. en 300 ml aproximadamente de agua caliente .   Dejar refrigerar .    3.14 . Granulados de piedra pómez hervidas   en el ácido clorhídrico , lavados en el agua   y secados .    3.15 . Solución al 30 % ( p/v ) de yoduro de potasio   p.a.    3.16 . Ácido sulfurico , 6 N aproximadamente ,   d : 1,18 .    3.17 . Solución de tiosulfato de sodio 0,1 N .    3.18 . Solución de almidón : añadir una mezcla   de 5 g de almidón soluble en 30 ml de agua a 1 l   de agua hirviendo . Hacer hervir durante 3 minutos ,   después dejar reposar . Preparar justo antes de su   empleo .    4 . Equipo    4.1 . Extractor ( ver esquema de la página 12 ) ,   que incluirá :    4.1.1 . Un erlenmeyer de 500 ml , de cuello largo ,    4.1.2 . Un refrigerante de reflujo ajustado al   erlenmeyer por medio de un tapón ,    4.1.3 . Una varilla corrediza en el tubo central   del refrigerante , provista de un gancho en su   extremidad inferior , una pinza para fijar   la varilla ,    4.1.4 . Una cesta metálica destinada a ser   suspendida al gancho de la varilla ( 4.1.3 ) y a   llevar el crisol filtrante ( 4.1.5 ) ,    4.1.5 . Un crisol filtrante para filtración   rápida , dimensión máxima de los poros :   90 a 150 mm ( por ejemplo G1 ) , 30 ml   aproximadamente ,    4.1.6 . Papeles-filtro , de formato apropiado   al crisol filtrante ( 4.1.5 ) .    4.2 . Estufa de incubación , regulada a   38 ° C .    4.3 . Matraces aforados de 200 ml , de esmerilado   normalizado , con refrigerante de reflujo .    4.4 . Matraces aforados de 100 ml , de esmerilado   normalizado , con refrigerante de reflujo .    5 . Método operatorio    5.1 . Preparación de la muestra    Triturar la muestra de forma que pase en su   totalidad a través de un tamiz de mallas de   0,5 mm .    5.2 . Extracción    Pesar , con precisión de 1 mg , 2 g de la   muestra e introducirlos en un crisol filtrante   ( 4.1.5 ) cuyo fondo se ha recubierto previamente   con un papel de filtro ( 4.1.6 ) mojado por el   etanol ( 3.1 ) . Introducir en el erlenmeyer   ( 4.1.1 ) 55 ml de etanol ( 3.1 ) y algunos   granulados de piedra pómez ( 3.14 ) . Colocar   el crisol filtrante en la cesta metálica   ( 4.1.4 ) y colgar a éste del gancho de la   varilla ( 4.1.3 ) . Colocar el refrigerante sobre   el erlenmeyer y bajar la varilla de forma que el   fondo del crisol sobresalga en la superficie del   etanol . Fijar la varilla a esta altura con ayuda   de la pinza . Llevar el etanol a ebullición y   mantenerla durante 3 horas . Dejar refrigerar a   continuación y levantar la varilla ( 4.1.3 ) de   forma que se coloque el crisol lo más alto que   sea posible dentro del erlenmeyer . Destapar   prudentemente el erlenmeyer y dejar deslizar 45 ml   de agua a lo largo de las paredes del frasco .   Colocar de nuevo el refrigerante sobre el   erlenmeyer y mantener el crisol filtrante a   10 cm por encima del nivel del líquido . Llevar   el líquido a ebullición y mantenerla   durante 3 horas . Dejar refrigerar , destapar   el erlenmeyer y retirar el crisol de la cesta .    5.3 . Sacarificación e hidrólisis    Colocar el crisol sobre un matraz de vacío   y secar por aspiración . Llevar el residuo de   extracción a un mortero y triturar finamente .   Transvasar cuantitativamente el polvo con ayuda de   60 ml de agua aproximadamente en un matraz aforado   de 200 ml de esmerilado normalizado y añadir   algunas gotas de alcohol amílico ( 3.2 ) .   Ajustar al balón un refrigerante de reflujo .   Calentar a ebullición y mantener durante 1 hora .   Dejar después refrigerar y separar el refrigerante .    Añadir 25 ml de solución tampón ( 3.4 ) ,   250 mg de pancreatina ( 3.12 ) , 2,5 ml de solución de   cloruro de sodio ( 3.5 ) y 10 gotas de tolueno   ( 3.3 ) . Agitar durante 2 minutos , colocar el   matraz en una estufa de incubación ( 4.2 ) y   mantenerlo allí durante 21 h , agitando de vez   en cuando . Dejar refrigerar a continuación   hasta la temperatura ambiente .    Añadir 5 ml de solución de Carrez I   ( 3.6 ) y agitar durante un minuto . Añadir a   continuación 5 ml de solución de Carrez II   ( 3.7 ) y agitar de nuevo durante un minuto .   Completar al volumen mediante agua , homogeneizar   y filtrar . Tomar con la pipeta 50 ml de filtrado   y llevarlos al matraz aforado de 100 ml ( se puede   trabajar también sobre 100 ml de filtrado en un   matraz aforado de 200 ml ) . Añadir algunas   gotas de indicador ( 3.11 ) y acidificar mediante   el ácido clorhídrico 8 N ( 3.9 ) hasta el   viraje al rojo . Añadir a continuación un   exceso de 6,25 ml de ácido clorhídrico 8 N   ( 3.9 ) ( 12,50 ml si se trabaja sobre 100 ml   de filtrado ) . Añadir al matraz a ebullición   y mantenerla durante 1 h . Dejar refrigerar ,   neutralizar por la solución de hidróxido de   sodio 10 N ( 3.10 ) hasta viraje al amarillo del   indicador . Acidificar a continuación ligeramente   añadiendo un poco de ácido clorhídrico N   ( 3.8 ) , completar el volumen mediante agua y   homogeneizar . Determinar el contenido en glucosa   según el método de Luff-Schoorl como se   indica en 5.4 .    5.4 . Titulación según Luff-Schoorl    Tomar con la pipeta 25 ml del reactivo según   Luff-Schoorl ( 3.13 ) y llevarlos a un erlenmeyer   de 300 ml ; añadir 25 ml , medidos con exactitud ,   de la solución obtenida en 5.3 que contiene como   máximo 60 mg de glucosa . Añadir dos granulados   de piedra pómez ( 3.14 ) , calentar , agitando   manualmente , sobre una llama libre de altura   media y llevar el líquido a ebullición en   2 minutos aproximadamente . Colocar inmediatamente   el erlenmeyer sobre una tela metálica   provista de una pantalla de amianto con un agujero   de 6 cm aproximadamente de diámetro , bajo la   que se ha encendido previamente una llama . Ésta   se regula de forma que sólo se calienta el fondo   del erlenmeyer . Adaptar a continuación un   refrigerante de reflujo sobre el erlenmeyer . A partir   de este momento hacer hervir durante 10 minutos   exactamente . Refrigerar inmediatamente en el agua   fría y después de 5 minutos aproximadamente ,   titular como sigue .    Añadir 10 ml de solución de yoduro de potasio   ( 3.15 ) y , inmediatamente después y con   prudencia ( en razón del riesgo de formación   de espuma abundante ) , 25 ml de ácido sulfúrico   6 N ( 3.16 ) . Titular a continuación por la   solución de tiosulfato de sodio 0,1 N ( 3.17 )   hasta la aparición de una coloración amarilla   clara , añadir el indicador del almidón   ( 3.18 ) y acabar la titulación .    Efectuar la misma titulación sobre una mezcla   medida con exactitud de 25 ml de reactivo según   Luff-Schoorl ( 3.13 ) y 25 ml de agua , después   de haber añadido 10 ml de solución de yoduro de   potasio ( 3.15 ) y 25 ml de ácido sulfúrico   6 N ( 3.16 ) , sin llevar a ebullición .    5.5 . Prueba en blanco    Efectuar una prueba en blanco aplicando el   método operatorio descrito en 5.3 y 5.4 , a falta   de muestra .    6 . Cálculo de los resultados    Establecer con ayuda de la tabla adjunta la cantidad   de glucosa en mg correspondiente a la diferencia   entre los resultados de dos titulaciones ( expresados   en ml de tiosulfato de sodio 0,1 N ) y que se   refieren por un lado , al análisis de la muestra   y , por otro lado , al ensayo en blanco .    El contenido en almidón en porcentaje de la   muestra está dado por la fórmula :    0,72 ( a - b )    en la que    a = mg de glucosa referidos a la muestra ,    b = mg de glucosa referidos a la prueba en blanco   ( ver observación 7.2 ) .    7 . Observaciones    7.1 . La presencia simultánea en la muestra   de almidón parcial o totalmente dextrinizado   y de lactosa puede dar lugar a un resultado por   exceso del 0,5 al 3 % de almidón . En dicho   caso , el contenido real en almidón se obtiene   como sigue :    a ) determinar el contenido en azúcares reductores   del extracto etanólico obtenido en 5.2 y   expresar el resultado en porcentaje de glucosa ;    b ) determinar el contenido de la muestra en   azúcares reductores solubles en el agua , y   expresar el resultado en porcentaje de glucosa ;    c ) deducir el resultado obtenido en c ) del   obtenido en b ) y multiplicar la diferencia por 0,9 ;    d ) deducir el valor obtenido en c ) del contenido   en almidón obtenido por aplicación del método y   calculado como se indica en 6 .    7.2 . La cantidad de glucosa que se refiere a la   prueba en blanco es normalmente de 0,25 mg . No   puede ser superior a 0,50 mg .    8 . Disposiciones referidas a la pancreatina    Aspecto físico : polvo blanco-amarillento , amorfo .    Contenido en glucosa : la cantidad de glucosa   de la prueba en blanco ( ver 5.5 ) es normalmente de   0,25 mg . Un resultado superior a 0,50 mg indica   que la pancreatina ya no es utilizable .    Control del consumo de yodo : poner en suspensión   62,5 mg de pancreatina en 50 ml de agua aproximadamente   llevados a 25-30 ° C . Añadir 1 ml de solución   de yodo 0,1 N . Remover durante 2 minutos . Titular   por una solución de tiosulfato de sodio 0,1 N   en presencia de indicador de almidón . El consumo   de solución de yodo por la pancreatina no debe   exceder de 0,5 ml .    Control de la actividad amilolítica : mezclar   100 ml de solución de almidón ( 3.18 ) , 5 ml   de solución tampón ( 3.4 ) , 0,5 ml de solución   del cloruro de sodio ( 3.5 ) y 62,5 mg de   pancreatina . Llevar la mezcla a 25-30 ° C ,   remover durante 2 minutos . Añadir 1 ml de   solución de yodo 0,1 N . La coloración azul   debe haber desaparecido en los 15 minutos que   siguen a la adición de la solución de yodo .    Tabla de valores para 25 ml de reactivo según   Luff-Schoorl    ml de Na2S2O3 0,1 N , 2 minutos de calentamiento ,   10 minutos de ebullición    Na2S2O3 0,1 N * Glucosa , fructosa , azúcares   invertidos C6H12O6 * Lactosa C12H22O11 * Maltosa   C12H22O11 * Na2S2O3 0,1 N *    ml * mg * diferencia * mg * diferencia * mg *   diferencia * ml *    1 * 2,4 * * 3,6 * * 3,9 * * 1 *     * * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *    2 * 4,8 * * 7,3 * * 7,8 * * 2 *     * * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *    3 * 7,2 * * 11,0 * * 11,7 * * 3 *     * * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *    4 * 9,7 * * 14,7 * * 15,6 * * 4 *     * * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *    5 * 12,2 * * 18,4 * * 19,6 * * 5 *     * * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *    6 * 14,7 * * 22,1 * * 23,5 * * 6 *     * * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *    7 * 17,2 * * 25,8 * * 27,5 * * 7 *     * * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *    8 * 19,8 * * 29,5 * * 31,5 * * 8 *     * * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *    9 * 22,4 * * 33,2 * * 35,5 * * 9 *     * * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *    10 * 25,0 * * 37,0 * * 39,5 * * 10 *     * * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *    11 * 27,6 * * 40,8 * * 43,5 * * 11 *     * * 2,7 * * 3,8 * * 4,0 * *    12 * 30,3 * * 44,6 * * 47,5 * * 12 *     * * 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *    13 * 33,0 * * 48,4 * * 51,6 * * 13 *      * 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *    14 * 35,7 * * 52,2 * * 55,7 * * 14 *     * * 2,8 * * 3,8 * * 4,1 * *    15 * 38,5 * * 56,0 * * 59,8 * * 15 *     * * 2,8 * * 3,9 * * 4,1 * *    16 * 41,3 * * 59,9 * * 63,9 * * 16 *     * * 2,9 * * 3,9 * * 4,1 * *    17 * 44,2 * * 63,8 * * 68,0 * * 17 *     * * 2,9 * * 3,9 * * 4,2 * *    18 * 47,1 * * 67,7 * * 72,2 * * 18 *     * * 2,9 * * 4,0 * * 4,3 * *    19 * 50,0 * * 71,7 * * 76,5 * * 19 *     * * 3,0 * * 4,0 * * 4,4 * *    20 * 53,0 * * 75,7 * * 80,9 * * 20 *     * * 3,0 * * 4,1 * * 4,5 * *    21 * 56,0 * * 79,8 * * 85,4 * * 21 *     * * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *    22 * 59,1 * * 83,9 * * 90,0 * * 22 *     * * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *    23 * 62,2 * * 88,0 * * 94,6 * * 23 *    Figura : ver D.O.    ANEXO II    1 . DETERMINACIÓN DEL AMPROLIO     [ Clorhidrato de cloruro   1-(4-amino-2-propil-5-pirimidilmetil)-2-picolinio ]    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar el amprolio en los   alimentos , los concentrados y en las premezclas . El   límite inferior de la determinación es de 40 ppm .    2 . Principio    La muestra se somete a la extracción mediante metanol   diluido . El extracto se purifica sobre columna de   óxido de aluminio y se trata mediante una solución   metanólica de 2,7-dihidroxinaftaleno , ferricianuro   de potasio , cianuro de potasio e hidróxido de sodio .   Se desarrolla una coloración púrpura . El amprolio   determina por expectrofotometría a 530 nm .    3 . Reactivos    3.1 . Metano p.a .    3.2 . Metanol diluido : mezclar 2 volúmenes de   metanol ( 3.1 ) y 1 volumen de agua .    3.3 . Solución al 0,2 % ( p/v ) de ferricianuro   de potasio K3Fe-(CN)6 p.a . Dicha solución se mantiene   estable durante dos semanas .    3.4 . Solución al 1 % ( p/v ) de cianuro de   potasio p.a . Dicha solución se mantiene estable durante   dos semanas .    3.5 . Solución al 1,125 % ( p/v ) de hidróxido de   sodio p.a .    3.6 . Solución metanólica de hidróxido de sodio :   tomar 15 ml de la solución ( 3.5 ) y completar a   200 ml mediante metanol ( 3.1 ) .    3.7 . Solución al 0,0025 % ( p/v ) de   2,7-dihidroxinaftaleno : disolver 25 mg de   2,7-dihidroxinaftaleno p.a. en el metanol ( 3.1 ) y   completar a 1 000 ml mediante metano ( 3.1 ) .    3.8 . Reactivo de coloración : introducir 90 ml   de solución de 2,7-dihidroxinaftaleno ( 3.7 ) en un   pequeño matraz cónico de 250 ml ( 4.1 ) , añadir   5 ml de solución de ferricianuro de potasio ( 3.3 ) y   homogeneizar . Añadir a continuación 5 ml de   solución de cianuro de potasio ( 3.4 ) , tapar el   matraz y homogeneizar . Dejar réposar durante 30 a   35 minutos , añadir 100 ml de solución metanólica   de hidróxido de sodio ( 3.6 ) , homogeneizar y filtrar   sobre un crisol filtrante ( 4.3 ) . Utilizar dicho   reactivo en los 75 minutos que siguen a la filtración .    3.9 . Óxido de aluminio para cromatografía   sobre columna . Antes de la utilización , agitar   durante 30 minutos 100 g de óxido de aluminio con   500 ml de agua , filtrar , lavar tres veces el   sedimento sobre el filtro con 50 ml de metanol ( 3.1 )   cada vez , secar por aspiración , dejar reposar una   noche y secar durante 2 h a 100 ° C en una estufa de   vacío . Dejar refrigerar en desecador . Controlar la   actividad sometiendo el análisis , a partir   del punto 5.2 , una cantidad determinada de solución   de patrón ( 3.11 ) . El índice de recuperación   del amprolio debe ser del 100 % mas o menos 4 % .    3.10 . Substancia de calibrado : aprolio puro que   responda a las características definidas a   continuación .    Punto de fusión ( descomposición ) : 248 ° C .    Coeficiente de extinción molecular a 265 y a 235 nm   en el agua destilada : 11,0 por 10 3 .    3.11 . Solución patrón : pesar , con precisión   de 0,1 mg , 50 mg de substancia patrón ( 3.10 ) .   Disolver por el metanol diluido ( 3.2 ) en un   matraz aforado de 500 ml , completar al volumen por el   mismo disolvente y homogeneizar . Tomar 100 ml , completar   50 ml mediante metanol diluido ( 3.2 ) en un   matraz aforado y homogeneizar , 1 ml de dicha solución   contiene 20 mg de amprolio .    4 . Equipo    4.1 . Pequeños matraces cónicos de 50 , 250   y 500 ml , de tapón esmerilado .    4.2 . Agitador .    4.3 . Crisol filtrante , porosidad G 3 , diámetro :   60 mm .    4.4 . Tubo para cromatografía , de cristal   ( díametro interior : 9 mm longitud : 400 a 500 mm ) .    4.5 . Centrifugadora , con tubos de 25 ml de tapón   esmerilado .    4.6 . Espectrofotometría , con cubetas de 10 mm de   espesor .    5 . Método operatorio    5.1 . Extracción y purificación    5.1.1 . Alimentos y premezclas    Pesar , con precisión de 1 mg , 10 g de la muestra   finamente dividida y homogeneizada . Para las   premezclas , pesar de 3 a 6 g , con precisión de 1 g .   Introducir la toma de muestra en un erlenmeyer de   250 ml ( 4.1 ) y añadir 100 ml exactamente de   metanol diluido ( 3.2 ) . Agitar durante 60 minutos   y filtrar . Diluir , si fuera necesario mediante el   metanol diluido ( 3.2 ) para obtener una solución que   contenga de 5 a 15 mg de amprolio por ml . Introducir   en un tubo para cromatografía ( 4.4 ) , previamente   provisto en su extremidad inferior de un tapón de   algodón , 5 g de óxido de aluminio ( 3.9 ) y   a continuación 25,0 ml del extracto . Dejar correr   el líquido , eliminar los 5 primeros ml y recoger   los 12 ml siguientes en una probeta graduada .    5.1.2 . Concentrados    Pesar , con precisión de 1 mg , 0,5 g de la muestra   finamente dividida y homogeneizada , introducirlos en   un pequeño matraz cónico de 500 ml ( 4.1 ) ,   añadir 250 ml de metanol diluido ( 3.2 ) , agitar   durante 60 minutos y filtrar . Tomar 5,0 ml del   filtrado y completar a 200 ml mediante el metanol   diluido ( 3.2 ) en un matraz aforado .    5.2 . Desarrollo de la coloración y medición   de la densidad óptica    Tomar 5,0 ml de la solución obtenida en 5.1.1 o   5.1.2 e introducirlos en un tubo de centrifugación   A ( 4.5 ) . Introducir 5,0 ml de metanol diluido   ( 3.2 ) en un tubo de centrifugación B ( 4.5 ) .   Añadir en cada tubo 10,0 ml del reactivo de   coloración ( 3.8 ) , tapar los tubos , homogeneizar   y dejar reposar durante 18 minutos . Centrifugar a   continuación durante 3 minutos para obtener   soluciones límpidas y decanter las soluciones A y B   en los pequeños matraces cónicos de 50 ml ( 4.1 ) .    Medir inmediatamente mediante el espectrofotómetro   a 530 nm la densidad óptica de la solución A ,   utilizando como blanco la solución B . Determinar la   cantidad de amprolio refiríendose a la curva de   muestrar ( 5.3 ) .    5.3 . Curva de muestras    Introducir en los tubos de centrifugación ( 4.5 )   volúmenes respectivos de 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 y   5,0 ml de solución patrón ( 3.11 ) . Completar el   volumen de los cuatro primeros tubos hasta 5,0 ml con   metanol diluido ( 3.2 ) . Añadir en los anco tubos   10,0 ml de reactivo de coloración ( 3.8 ) , tapar   los tubos , homogeneizar y dejar reposar durante   18 minutos . Centrifugar a continuación durante   3 minutos y decantar las soluciones en matraces   cónicos de 50 ml ( 4.1 ) .    Medir inmediatamente mediante el espectrofotómetro   a 530 nm la densidad óptica de las soluciones ,   utilizando como blanco una mezcla de 5 ml de metanol   diluido ( 3.2 ) y 10 ml del reactivo de coloración   ( 3.8 ) . Trazar la curva de muestras llevando a la   ordenada los valores de la densidad óptica y a   la abscisa las cantidades correspondientes de amprolio   en mg .    6 . Cálculo y premezclas    6.1 . Alimentos y premezclas    El contenido en mg de amprolio por kg de muestra   está dado por la fórmula    A/P · F · 20 000    en la que :    A = cantidad en mg de amprolio determinada mediante la   medición fotométrica ,    P = peso en g de la toma de muestras ,    F = coeficiente de dilución ( efectuado si se   diera el caso en 5.1.1 ) .    6.2 . Concentrados    El contenido en amprolio en porcentaje de muestra   está dado por la fórmula    A/P · 200    en la que :    A = cantidad en mg de amprolio determinada por la   medición fotométrica ,    P = peso en g de la toma de muestras .    7 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder de 10 ppm , en valor absoluto , para los   contenidos en amprolio inferiores a 100 ppm ; del 10 % ,   en valor relativo , para los contenidos comprendidos   entre 100 y 5 000 ppm ; de 500 ppm , en valor   absoluto , para los contenidos comprendidos entre   5 000 y 10 000 ppm ; del 5 % , en valor relativo ,   para los contenidos superiores a 10 000 ppm .    2 . DETERMINACIÓN DEL ETOPABATO     ( metil-4-acetamida-2-etoxibenzoato )    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar el etopabato en los   alimentos , los concentrados y las premezclas . El   límite inferior de la determinación es de 2 ppm .    2 . Principio    La muestra está sometida a la extracción por   metanol diluido . La solución se acidificará y se   extraerá por el cloroformo . El extracto clorofórmico   se lava primero con una solución alcalina y después   con agua . El extracto purificado se concentra , el   etopabato se hidroliza mediante el ácido clorhídrico   diluido . El derivado aminado así formado se diazotea   y se acopla con la N-(1-nafti) etilenodiamina . El   complejo coloreado se extrae mediante el butanol y   la densidad óptica de la solución se mide a 555 nm .    3 . Reactivos    3.1 . Metanol p.a .    3.2 . Metanol al 50 % ( v/v ) : mezclar los volúmenes   iguales de metanol ( 3.1 ) y de agua .    3.3 . Ácido clorhídrico p.a. , d : 1,19 .    3.4 . Ácido clorhídrico diluido a 1/10 : tomar   10,0 ml de ácido clorhídrico ( 3.3 ) , completar a   100 ml con agua .    3.5 . Ácido clorhídrico 0,3 N aproximadamente :   tomar 25,0 ml de ácido clorhídrico ( 3.3 ) ,   completar a 1 000 ml con agua .    3.6 . Cloroformo p.a .    3.7 . Solución al 4 % ( p/v ) de carbonato de   sodio : disolver 40,0 g de carbonato de sodio   anhídro p.a. en el agua y completar a 1 000 ml con   agua .    3.8 . Solución al 0,2 % ( p/v ) de nitrito de sodio :   disolver en el agua 100 mg de nitrito de sodio p.a. y   completar a 50 ml con agua en un matraz aforado .   Preparar inmediatamente antes del empleo .    3.9 . Solución al 1,0 % ( p/v ) de sulfanato de   amonio : disolver en el agua 500 mg de sulfanato de   amonio p.a. y completar a 50 ml con agua en un matraz   aforado . Preparar inmediatamente antes de su empleo .    3.10 . Solución al 0,2 % ( p/v ) de N-(1-nafti)   etilenodiamina : disolver en el agua 100 mg de   N-(1-nafti) etilenodiamina p.a. y completar a 50 ml   mediante agua en un matraz aforado . Preparar   inmediatamente antes del empleo .    3.11 . Cloruro de sodio anhidro , p.a .    3.12 . Butanol-n , p.a .    3.13 . Substancia patrón : etopabato puro .    3.14 . Soluciones de calibrado :    3.14.1 . Solución a 0,040 mg de etopabato por ml :   pesar , con precisión de 0,1 mg , 40 g de substancia   patrón ( 3.13 ) . Disolver mediante metanol diluido   ( 3.2 ) en un matraz aforado de 100 ml , completar   al volumen mediante el mismo disolvente y homogeneizar .   Tomar 10,0 ml , completar a 100 ml mediante el metanol   ( 3.2 ) en un matraz aforado y homogeneizar . Dicha   solución se mantiene estable durante un mes .    3.14.2 . Solución a 0,016 mg de etopabato por 20 ml :   tomar 5,0 ml de la solución ( 3.14.1 ) ,   completar a 250 ml por el metanol diluido ( 3.2 )   en un matraz aforado y homogeneizar . Preparar antes   de su empleo .    4 . Equipo    4.1 . Matraces cónicos de 250 ml , de tapón   esmerilado .    4.2 . Ampollas de decantar de 100 ml , de tapón   esmerilado .    4.3 . Agitador .    4.4 . Aparato rotativo de evaporación en vacío ,   con matraces de 250 ml .    4.5 . Baño de agua .    4.6 . Centrifugadora , con tubos de 15 y 50 ml , de   esmerilado normalizado .    4.7 . Refrigerante de aire , de esmerilado normalizado .    4.8 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm   de espesor .    5 . Método operatorio    5.1 . Extracción    Pesar , con precisión de 1 mg , una cantidad de   muestra finamente divida y homogeneizada que   contenga 80 mg aproximadamente de etopabato . Introducir   la toma de muestras en un matraz cónico de 250 ml   ( 4.1 ) y añadir 100,0 ml de metanol diluido ( 3.2 ) .   Mezclar , tapar el matraz y agitar durante 1 hora con   la ayuda de un agitador ( 4.3 ) . Dejar decantar ,   filtrar y eliminar los primeros ml del filtrado .    5.2 . Purificación   NB : Todas las operaciones descritas en este punto   deben efectuarse rápidamente .    Introducir 20,0 ml del extracto límpido en una ampolla   de decantación de 100 ml ( 4.2 ) , añadir 5,0 ml   de ácido clorhídrico diluido a 1/10 ( 3.4 ) y   20,0 ml de cloroformo ( 3.6 ) . Agitar primero con   prudencia y después vigorosamente durante 3 minutos .   Dejar reposar hasta la separación de las fases y   recoger la fase clorofórmica en una segunda ampolla   de decantación de 100 ml ( 4.2 ) .    Extraer la fase ácida dos veces sucesivas mediante   20,0 ml de cloroformo ( 3.6 ) cada vez . Reunir los   extractos clorofórmicos en la segunda ampolla   de decantar y eliminar la fase ácida . Añadir a   la solución clorofórmica 10 ml de solución de   carbonato de sodio ( 3.7 ) , agitar durante 3 minutos   y dejar reposar hasta la separación de las fases .   Recoger la fase clorofórmica en una tercera ampolla   de decantación de 100 ml ( 4.2 ) y eliminar la fase   acuosa . Añadir a la solución clorofórmica 10 ml   de solución de carbonato de sodio ( 3.7 ) , agitar   durante 3 minutos y dejar reposar hasta la separación   de las fases .    Recoger la fase clorofórmica en una cuarta ampolla   de decantación de 100 ml ( 4.2 ) , lavar dos   veces sucesivamente con 25 ml de agua cada vez ,   separar las fases acuosas y recoger cuantitativamente   el extracto clorofórmico en un matraz de 250 ml   ( 4.4 ) . Reunir las fases acuosas , lavar las ampollas   de decantación vaciadas mediante algunos ml de   cloroformo ( 3.6 ) , lavar a continuación la   fase acuosa mediante dicho cloroformo . Separar la   fase clorofórmica y añadirla al extracto recogido   en un matraz .    5.3 . Hidrólisis    Evaporar el extracto clorofórmico hasta 2 ml   aproximadamente sobre un baño de agua a 50 ° C con la   ayuda del aparato rotativo de evaporación en vacio   ( 4.4 ) . Disolver el residuo mediante 2 a 3 ml de metanol   ( 3.1 ) transvasar cuantitativamente la solución   a un tubo de centrifugación de 50 ml ( 4.6 ) con   ayuda de dos porciones de 10 ml y una porción de 5 ml   de ácido clorhídrico 0,3 N aproximadamente ( 3.5 ) .   Añadir algunos fragmentos de piedra porosa ,   homogeneizar y armar al tubo de un refrigerante de aire   ( 4.7 ) . Sumergir el tubo en un baño de agua   hirviendo y mantenerlo durante 45 minutos . Dejar   refrigerar a continuación bajo una corriente de agua   fría .    5.4 . Desarrollo de la coloración y medición de la   densidad óptica    Añadir 1,0 ml de solución de nitrito de sodio   ( 3.8 ) , agitar y dejar reposar 2 minutos .   Añadir 1,0 ml de solución de sulfanato de amonio   ( 3.9 ) , agitar y dejar reposar 2 minutos . Añadir   1,0 ml de solución de N-(1-naftil) etilenodiamina   ( 3.10 ) , agitar y dejar reposar 10 minutos .   Añadir 5,0 g de cloruro de sodio ( 3.11 ) y 10,0 ml   de butanol-n ( 3.12 ) agitar vigorosamente hasta la   disolución completa del cloruro de sodio .    Prepara la solución butanólica sobrecadente con   ayuda de una pipeta , introducirla en un tubo de   centrifugación de 15 ml ( 4.6 ) y centrifugar .   Medir a continuación la densidad óptica E A con el   espectrómetro a 555 nm por comparación con el   butanol-n ( 3.12 ) .    5.5 . Prueba en blanco    Efectuar una prueba en blanco aplicando el   método operatorio , a partir del punto 5.2 ,   a 20,0 ml de metanol diluido ( 3.2 ) . Medir la densidad   óptica E B a 555 nm por comparación con el   butanol-n ( 3.12 ) .    5.6 . Prueba patrón    Efectuar una prueba aplicando el mismo método   operatorio , a partir del punto 5.2 , a 20,0 ml de   solución patrón ( 3.14.2 ) . Medir la densidad   óptica E C a 555 nm por comparación con el   butanol-n ( 3.12 ) .    6 . Cálculo de los resultados    El contenido en mg de etopabato por kg de la muestra   está dado por la fórmula     ( E A - E B ) / ( E C - E B ) · 80/P    en la que    E A = densidad óptica de la solución procedente   de la muestra ,    E B = densidad óptica de la solución resultante   de la prueba en blanco ,    E C = densidad óptica de la solución   resultante de la prueba patrón ,    P = peso en gramos de la toma de muestras .    5 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos determinaciones   paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe   exceder :    del 20 % , en valor relativo , para los contenidos   en etopabato inferior a 7,5 ppm ,    de 1,5 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 7,5 y 10 ppm ,    del 15 % , en valor relativo , para los contenidos   superiores a 10 ppm .    3 . DETERMINACIÓN DE LA DINITOLMIDA ( DOT )     ( 3,5-dinitro-o-toluamida )    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar la dinitolmida   ( DOT ) en los alimentos , los concentrados y las   premezclas . Los derivados del nitroturano interfieren .   El límite inferior de la determinación es de 40 ppm .    2 . Principio    La muestra está sometida a la extracción por   acetonitrilo . El extracto se purifica sobre   óxido de aluminio y se filtra . Una parte alícuota   del filtrado se evapora en seco . El residuo se recoge   mediante la dimetilformamida y se trata mediante   la etilenodiamina . Se desarrolla una coloración   púrpura . La dinitolmida se determina por   espectrofometría a 560 nm .    3 . Reactivos    3.1 . Acetonitrilo al 85 % ( v/v ) : mezclar   850 ml de acetonitrilo puro y 150 ml de agua ;   destilar la mezcla antes de su empleo ; recoger   la fracción destilando entre 75 y 77 ° C .    3.2 . Óxido de aluminio para cromatografía   sobre columna . Calcinar durante 2 h al menos a   750 ° C , refrigerar en desecador y conservar   en frasco de cristal marrón , de tapón esmerilado .   Antes de su utilización , humedecer tal como se   indica : introducir en un frasco de cristal marrón   10 g de óxido de aluminio y 0,7 ml de agua ,   tapar herméticamente , volver a calentar durante   5 minutos en un baño de agua hirviendo agitando   durante todo el tiempo con energía . Dejar refrigerar   agitándolo . Controlar la actividad sometiendo   al análisis , a partir del punto 5.1 , una   cantidad determinada de solución de muestra ( 3.6 ) .   El índice determinado de recuperación de la   dinitolmida debe ser del 100 % más o menos 2 % .    3.3 . N,N-dimetilformamida al 95 % ( v/v ) :   mezclar 95,0 ml de N,N-dimetilformamida p.a. y 5,0 ml   de agua .    3.4 . Etilenodiamina p.a. , contenido máximo   en agua : 2,0 % .    3.5 . Substancia patrón : 3,5 dinitro-o-toluamida   pura que responda a las siguientes características :    Punto de fusión : 177 ° C .    Coeficiente de extinción molecular a 248 nm en el   acetonitrilo . 13,1 por 10 3 .    Coeficiente de extinción molecular a 266 um   en la N,N-dimetilformamida : 10,1 por 10 3 .    3.6 . Solución patrón : pesar , precisión   de 0,1 mg , 40 mg de substancia patrón ( 3.5 ) .   Disolver por acetonitrilo ( 3.1 ) en un matraz aforado   de 200 ml , completar el volumen por el mismo disolvente   y homogeneizar . Tomar 20,0 ml , completar a 100 ml   por el acetonitrilo ( 3.1 ) en un matraz aforado   y homogeneizar . 1 ml de dicha solución contiene   40 mg de dinitolmida .    4 . Equipo    4.1 . Matraz cónico de 250 ml , de esmerilado   normalizado .    4.2 . Refrigerante de reflujo , de esmerilado   normalizado .    4.3 . Crisol filtrante , porosidad G 3 , diámetro   60 mm .    4.4 . Aparato de filtración sobre vacío ( por   ejemplo aparato de Witt ) .    4.5 . Baño de agua , regulado a 50 ° C .    4.6 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm de   espesor .    5 . Método operativo    5.1 . Extracción y purificación    Pesar , con precisión de 1 mg , 10 g de la   muestra finamente dividida y homogeneizada . Para   los concentrados y las premezclas , pesar con precisión   de 1 mg , 1 g . Introducir la toma de muestras   en un matraz cónico de 250 ml ( 4.1 ) y añadir   65 ml de acetonitrilo ( 3.1 ) . Mezclar , dotar   el matraz cónico de un refrigerante de reflujo   ( 4.2 ) y calentar sobre el baño de agua ( 4.5 )   durante 30 minutos agitándolo continuamente .   Dejar refrigerar bajo una corriente de agua fría .   Añadir 20 g de óxido de aluminio ( 3.2 ) , agitar   durante 3 minutos y dejar decantar .    Situar un matraz aforado de 100 ml en el aparato   de filtrar ( 4.4 ) , ajustar el crisol filtrante   ( 4.3 ) y filtrar el líquido aspirando . Transvasar   a continuación el sedimento al crisol con la ayuda   de algunos ml de acetonitrilo ( 3.1 ) y aspirar .   Cortar el vacío , volver a poner el sedimento en   suspensión en algunos ml de acetonitrilo ( 3.1 ) y   aspirar de nuevo . Repetir estas últimas operaciones   hasta que el volumen del filtrado alcance 95 ml   aproximadamente . Completar el volumen a 100 ml   mediante el acetonitrilo ( 3.1 ) y homogeneizar .    Si fuera necesario , tomar una parte alícuota y diluir   mediante acetonitrilo ( 3.1 ) para obtener una solución   que contenga de 5 a 15 mg de dinitolmida por ml .    5.2 . Desarrollo de la coloración y medición   de la densidad óptica    Introducir respectivamente en tres vasos de   50 ml A , B y C , 4,0 ml de la solución obtenida   en 5.1 . Añadir , además , en el vaso C solamente ,   1,0 ml de solución patrón ( 3.6 ) . Llevar los   tres vasos sobre el baño de agua ( 4.5 ) situado   bajo una campana de gases bien ventilada y   evaporar en seco , bajo corriente de aire . Dejar   refrigerar hasta la temperatura ambiente .    Añadir 10,0 ml de N,N-dimentilformamida ( 3.3 )   en el vaso A y 2,0 ml respectivamente en los vasos   B y C . Dejar en contacto durante algunos minutos   agitando ligeramente hasta la completa disolución   del residuo . Añadir a continuación 8,0 ml   de etilenodiamina ( 3.4 ) en los vasos B y C y   homogeneizar . Medir , cinco minutos exactamente   después de la adición de etilenodiamina , la   densidad óptica de las tres soluciones mediante   el espectrofotómetro ( 4.6 ) a 560 nm ,   empleando como blanco la N,N-dimentilformamida ( 3.3 ) .    6 . Cálculo de los resultados    El contenido en mg de dinitolmida por kg de   muestra está dado por la fórmula     ( E B - E A ) / ( E C - E B ) · F/P · 1 000    en la que :    E A = densidad óptica de la solución A ( testigo ) ,    E B = densidad óptica de la solución B ( muestra ) ,    E C = densidad óptica de la solución C ( patrón   interno ) ,    P = peso en g de la toma de muestras ,    F = coeficiente de dilución ( efectuado si se   diera el caso 5.1 ) .    7 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de las   determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma   muestra no debe exceder :    de 10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   en dinitolmida inferiores a 100 ppm ,    del 10 % , en valor relativo , para los   contenidos comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ,    de 500 ppm , en valor absoluto , para los   contenidos comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ,    del 5 % , en valor relativo , para los contenidos   superiores a 10 000 ppm .    4 . DETERMINACIÓN DE LA NICARBACINA     ( mezcla equimolecular de 4,4-dinitrocarbanilida y   2-hidroxi-4,6-dimetilpirimidina )    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar la nicarbacina en   los alimentos , los concentrados y las premezclas   que no contienen más del 5 % de harinas de hierbas .   Los derivados del nitrofurano , el acetilenheptino y el   carbodox interferente . El límite inferior de la   determinación es de 20 ppm .    2 . Principio    La mezcla está sometida a la extracción por   la N,N-dimetilformamida . El extracto se purifica   por cromatografía sobre columna de óxido   de aluminio ; la nicarbacina es eluida por el   etanol . El eluido se trata por una solución etanólica   de hidróxido de sodio ; se desarrolla una coloración   amarilla . La nicarbacina se determina mediante la   espectrofotometría a 430 mm .    3 . Reactivos    3.1 . N,N-dimetilformamida p.a.    3.2 . Óxido de aluminio para cromatografía   sobre columna .    Calcinar durante 2 h al menos a 750 ° C ,   refrigerar en el desecador y conservar en frasco   de cristal marrón de tapón esmerilado . Antes   de su empleo , controlar la actividad sometiendo   al análisis , a partir del punto 5.2 , una cantidad   determinada de solución patrón ( 3.8.3 ) .    El índice de recuperación de la nicarbacina   debe ser del 100 % más o menos 2 % .    3.3 . Etanol al 95 % ( v/v ) .    3.4 . Etanol al 80 % ( v/v ) .    3.5 . Solución al 50 % ( p/v ) de hidróxido   de sodio p.a.    3.6 . Solución etanólica al 1 % ( p/v )   de hidróxido de sodio :    Llevar 1 ml de solución de hidróxido de   sodio ( 3.5 ) a un matraz aforado de 50 ml ,   completar al volumen por el etanol al 80 % ( 3.4 ) .   Preparar en el momento de su empleo .    3.7 . Substancia de patrón : nicarbacina pura ,   coeficiente de extinción molecular a 362 nm en la   N,N-dimetilformamida : 37,8 por 10 3 .    3.8 . Soluciones patrón :    3.8.1 . Solución a 1,25 mg de nicarbacina por   ml : pesar , con precisión de 0,1 mg , 125 mg de   substancia patrón ( 3.7 ) . Disolver mediante   75 ml de N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) en un   matraz aforado de 100 ml , calentando ligeramente .   Dejar refrigerar , completar al volumen mediante   el mismo disolvente y homogeneizar . Conservar a   resguardo de la luz .    3.8.2 . Solución a 0,125 mg de nicarbacina   por ml : tomar 10,0 ml de la solución ( 3.8.1 ) ,   completar a 100 ml por la N,N-dimetilformamida   ( 3.1 ) en un matraz aforado y homogeneizar .    3.8.3 . Solución a 0,025 mg de nicarbacina   por ml : tomar 20,0 ml de la solución ( 3.8.2 ) ,   completar a 100 ml por la N,N-dimetilformamida ( 3.1 )   en un matraz aforado y homogeneizar .    4 . Equipo    4.1 . Matraz cónico de 250 ml , de esmerilado   normalizado .    4.2 . Refrigerante de reflujo , de esmerilado   normalizado .    4.3 . Baño de agua hirviendo .    4.4 . Centrifugadora , con tubos de 120 ml .    4.5 . Tubo para cromatografía de cristal   ( diámetro interior ; 25 mm , longitud : 30 mm ) .    4.6 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm   de espesor .    4.7 . Bureta graduada a 1/10 ml .    5 . Método operativo    5.1 . Extracción    Pesar , con precisión de 1 mg , 10 g de la   muestra finamente dividida y homogeneizada . Para los   concentrados y las premezclas , pesar con precisión   de 1 mg , 1 g . Introducir la toma de muestras   en un matraz cónico de 250 ml ( 4.1 ) y añadir   100 ml exactamente de N,N-dimetil-formamida ( 3.1 ) .   Mezclar , dotar al matraz de un refrigerante de   reflujo ( 4.2 ) y calentar sobre baño de agua ( 4.3 )   durante 15 minutos agitando de vez en cuando . Dejar   refrigerar bajo una corriente de agua fría .    Transvasar a continuación el líquido sobrenadante a   un tubo de centrifugación ( 4.4 ) y centrifugar durante   aproximadamente 3 minutos .    Si fuera necesario , tomar 25,0 ml del líquido   sobrenadante y diluir mediante la N,N-dimetilformamida   ( 3.1 ) para obtener una solución que contenga   de 2,0 a 10,0 mg de nicarbacina por ml .    5.2 . Cromatografía    Introducir en un tubo para cromatografía   ( 4.5 ) 30 g de aluminio ( 3.2 ) en suspensión   en la N,N-dimetilformamida ( 3.1 ) . Dejar descender   el líquido hasta 1 cm por encima de la columna de   óxido de aluminio e introducir a continuación   en la columna 25,0 ml del extracto obtenido en   5.1 . Dejar fluir el líquido evitando dejar la   columna seca y lavar tres veces la columna   mediante 10 ml de N,N-dimetilformamida ( 3.1 )   cada vez . Eluir a continuación mediante 70 ml etanol   al 95 % ( 3.3 ) . Eliminar los 10 primeros ml del eluido   y recoger el resto dividiendo de la siguiente forma :    una fracción a ) de 5 ml ,    una fracción b ) de 50 ml en un matraz aforado ,    una fracción c ) de 5 ml .    Controlar que las fracciones a ) y c ) no den una   coloración amarilla por adición de solución   etanólica de hidróxido de sodio ( 3.6 ) . Continuar   las operaciones sobre la fracción b ) tal como se indica   en 5.3 .    5.3 . Desarrollo de la coloración y medición   de la densidad óptica    Introducir respectivamente 20,0 ml de la   fracción b ) del eluido en dos matraces aforados   A y B de 25 ml . Añadir en el matraz A 5,0 ml   de solución etanólica de hidróxido de sodio   ( 3.6 ) y 5,0 ml de etanol al 95 % ( 3.3 ) en el matraz   B . Homogeneizar .    Medir , en los cinco minutos siguientes , la   densidad óptica de las dos soluciones a 430 nm ,   utilizando como blanco una mezcla de 20,0 ml de   etanol al 95 % ( 3.3 ) y 5,0 ml de solución etanólica   de hidróxido de sodio ( 3.6 ) .    Restar el valor de la densidad óptica de la   solución B del de la solución A . Determinar ,   a partir de dicho valor , la cantidad de nicarbacina   que se refiera a la curva de calibrado ( 5.4 ) .    5.4 . Curva de calibrado    Someter 25,0 ml de la solución de patrón   ( 3.8.3 ) a la cromatografía tal como se indica en   5.2 . Transvasar mediante la bureta graduada ( 4.7 )   la fracción b ) del eluido y hacer fluir a matraces   aforados de 25 ml unos volúmenes respectivos de   2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 y 10,0 ml ( correspondientes   respectivamente a 0,025 , 0,050 , 0,075 , 0,100 y 0,125 mg   de nicarbacina ) . Añadir a cada matraz 5,0 ml   de solución etanólica de hidróxido de   sodio ( 3.6 ) , completar el volumen mediante el etanol   al 95 % ( 3.3 ) y homogeneizar .    Medir en los 5 minutos que siguen la densidad   óptica de las soluciones a 430 nm , empleando   como blanco una mezcla de 20 ml de etanol al 95 %   ( 3.3 ) y 5,0 ml de solución etanólica de   hidróxido de sodio ( 3.6 ) .    Trazar la curva de calibrado llevando a las ordenadas   los valores de la densidad óptica y a las abscisas   las cantidades correspondientes de nicarbacina en mg .    6 . Cálculo de los resultados    El contenido en mg de nicarbacina por kg de muestra   está dado por la fórmula    A/P · F · 10 000    en la que :    A = cantidad en mg de nicarbacina determinada   por la medición fotométrica ,    P = peso en g de la toma de muestras ,    F = coeficiente de dilución ( efectuada si se   diera el caso en 5.1 ) .    7 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra   no debe rebasar :    10 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   en nicarbacina inferiores a 100 ppm ,    el 10 % , en valor relativo , para los contenidos   comprendidos entre 100 y 5 000 ppm ,    500 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 5 000 y 10 000 ppm ,    el 5 % , en valor relativo , para los contenidos   superiores a 10 000 ppm .    5 . DETERMINACIÓN DE LA MENADIONA ( VITAMINA K3 )    1 . Objetivo y campo de aplicación    El método permite determinar la menadiona   ( vitamina K3 ) en los alimentos , los concentrados y las   premezclas . El límite inferior de la determinación   es de 1 ppm .    2 . Principio    La muestra se somete a la extracción mediante   el metano diluido . La mezcla se defeca con ayuda de una   solución de tanino y se centrifuga . El   extracto se trata mediante una solución de   carbonato de sodio , la menadiona se libera y   extrae mediante el 1,2-dicloretano . El extracto   dicloretánico se trata según su contenido   en menadiona , ya sea directamente , ya sea previa   evaporación , por la 2,4-dinotrofenilhidracina   en solución en el etanol acidificado por el ácido   clorhídrico . El hidrazono obtenido , añadiéndole   un exceso de amoníaco , da lugar a un complejo   de color azul verdoso cuya densidad óptica se mide   a 635 nm .    3 . Reactivos    3.1 . Etanol al 96 % ( v/v ) .    3.2 . Etanol ( 3.1 ) diluido al 40 % mediante agua .    3.3 . Solución al 10 % ( v/v ) de tanino ,   a partir de tanino puro , en polvo .    3.4 . 1,2-dicloretano p.a.    3.5 . Solución al 10 % ( p/v ) de carbonato   de sodio anhidro p.a.    3.6 . Ácido clorhídrico al 37 % ( p/v ) , d : 1,19 .    3.7 . Etanol absoluto p.a.    3.8 . Reactivo por la 2,5-dinitrofenilhidracina :   disolver 40 mg de 2,4-dinitrofenilhidracina p.a.   en 40 ml aproximadamente de etanol absoluto ( 3.7 )   hirviendo , dejar refrigerar y transvasar a un matraz   aforado de 50 ml . Añadir 1 ml de ácido clorhídrico   ( 3.6 ) y completar al volumen mediante el etanol   absoluto ( 3.7 ) . Preparar inmediatamente antes de   su empleo .    3.9 . Amoníaco al 25 % ( p/p ) , d = 0,91 .    3.10 . Solución amoniacal de etanol : mezclar   un volumen de etanol ( 3.7 ) y un volumen de amoníaco   ( 3.9 ) .    3.11 . Soluciones de patrón de menadiona   ( vitamina K3 ) en el 1,2-dicloretano ( 3.4 )   y completar a 200 ml . Diluir unas partes alícuotas   de dicha solución mediante el 1,2-dicloretano   ( 3.4 ) para obtener una serie de soluciones   cuyas contracciones en menadiona estén comprendidas   entre 2 y 10 mg por ml . Debe estar recién   preparado antes de su empleo .    4 . Equipo    4.1 . Agitador mecánico .    4.2 . Centrifugadora ( de 3 000 a 5 000 t/minuto ) .    4.3 . Ampollas de decantación de 100 y 250 ml ,   de tapón esmerilado .    4.4 . Aparato rotativo de evaporación en   vacio , con matraces de 250 ml .    4.5 . Baño de agua .    4.6 . Espectrofotómetro , con cubetas de 10 mm de   espesor .    5 . Método operatorio    N. B. Todas las manipulaciones deben hacerse   al resguardo de la luz directa , en su caso en un   equipo de vidrio marrón .    5.1 . Toma de muestras    Realizar una toma de muestras de la muestra   finamente dividida , proporcional al contenido   supuesto en menadiona , o sea :    de 0,1 a 5,0 g para los concentrados y premezclas ,    de 20 a 30 g para los alimentos .    Introducir inmediatamente la toma de muestras   en el frasco de 250 ml de tapón esmerilado .    5.2 . Extracción    Añadir 96 ml exactamente de etanol diluido   ( 3.2 ) y agitar mecánicamente durante 15 minutos a la   temperatura ambiente .    Añadir a continuación 4,0 ml de solución de   tanino ( 3.3 ) , mezclar , transvasar el extracto a un   tubo de centrifugar , centrifugar ( 3 000 a 5 000 t/minuto )   y decantar .    Introducir 20 a 40 ml medidos con exactitud del extracto   en una ampolla de decantación de 250 ml , añadir   mediante la pipeta 50 ml de 1,2-dicloretano ( 3.4 ) ,   mezclar y añadir mediante la pipeta 20 ml de solución   de carbonato de sodio ( 3.5 ) . Agitar enérgicamente   durante 30 segundos y recoger a continuación la fase   dicloretánica en una ampolla de decantación   de 100 ml . Añadir 20 ml de agua , agitar de nuevo   durante 15 segundos , recoger la fase dicloretánica   y eliminar los restos de agua con la ayuda de bandas   de papel de filtro .    Para los concentrados y premezclas , tomar   una parte alícuota del extracto y diluir mediante   1,2-dicloretano ( 3.4 ) para obtener una concentración   en menadiona de 2 a 10 mg por ml . Para los   alimentos , evaporar en seco una parte alícuota del   extracto , bajo presión reducida y en atmósfera   de nitrógeno , en el baño de agua a 40 ° C .   Recoger rápidamente el residuo mediante   1,2-dicloretano ( 3.4 ) para obtener una solución   que contenga de 2 a 10 mg de mendiona por ml .    5.3 . Formación de la hidrazona    Llevar 2,0 ml del extracto dicloretánico   obtenido en 5.2 al matraz aforado de 10 ml y   añadir 3,0 ml del reactivo por el   2,4-dinitrofenilhidroziona ( 3.8 ) , tapar el matraz   con la ayuda de un tapón de corcho o de teflón   de forma que se evite cualquier evaporación y calentar   durante 2 horas a 70 ° C sobre baño de agua .   Dejar refrigerar , añadir 3,0 ml de solución   amoniacal de etanol ( 3.10 ) , mezclar , completar   al volumen mediante etanol absoluto ( 3.7 ) y mezclar   de nuevo .    5.4 . Medición de la densidad óptica    Medir la densidad óptica del complejo coloreado   en azulverdoso mediante el espectrofotómetro   a 635 nm por comparación con un blanco de reactivos   obtenidos tratando 2,0 ml de 1,2-dicloretano ( 3.4 ) como   se indica en 5.3 . Determinar la cantidad de   menadiona refiriéndose a una curva de   muestras establecida para cada serie de análisis .    5.5 . Curva de muestras    Tratar 2,0 ml de las soluciones de calibrado   de menadiona ( 3.11 ) tal como se indica 5.3 . Medir   la densidad óptica como se indica en 5.4 .   Trazar la curva de muestras llevando a las ordenadas los   valores de la densidad óptica y a las abscisas las   cantidades correspondientes de menadiona en mg .    6 . Cálculo de resultados    Calcular el contenido en menadiona de la muestra   teniendo en cuenta el peso de la toma de   muestras y de las diluciones efectuadas a lo largo   del análisis . Expresar el resultado en mg de menadiona   por kg .    7 . Repetibilidad    La diferencia entre los resultados de dos   determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma   muestra no debe exceder :     - del 20 % , en valor relativo , para los   contenidos en menadiona inferiores a 10 ppm ,     - de 2 ppm , en valor absoluto , para los contenidos   comprendidos entre 10 y 14 ppm ,     - del 15 % , en valor relativo , para los contenidos   comprendidos entre 14 y 100 ppm ,     - de 15 ppm , en valor absoluto , para los   contenidos comprendidos entre 100 y 150 ppm ,     - del 10 % , en valor relativo , para los   contenidos superiores a 150 ppm .