CELEX: 31992L0095
Language: ro
Date: 1992-11-09 00:00:00
Title: Directiva 92/95/CEE a Comisiei din 9 noiembrie 1992 de modificare a anexei la a șaptea Directivă 76/372/CEE de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor

03/Volumul 11
            
            
               RO
            
            
               Jurnalul Ofícial al Uniunii Europene
            
            
               190
            
         31992L0095
   
               L 327/54
            
            
               JURNALUL OFÍCIAL AL UNIUNII EUROPENE
            
            
               
            
         
      DIRECTIVA 92/95/CEE A COMISIEI
   
   din 9 noiembrie 1992
   de modificare a anexei la a șaptea Directivă 76/372/CEE de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor
   COMISIA COMUNITĂȚILOR EUROPENE,
   având în vedere Tratatul de instituire a Comunității Economice Europene,
   având în vedere Directiva 70/373/CEE a Consiliului din 20 iulie 1970 privind introducerea modalităților de prelevare de probe și a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor (1), modificată ultima dată de Actele de aderare ale Spaniei și Portugaliei, în special articolul 2,
   întrucât a șaptea Directivă 76/372/CEE a Comisiei din 1 martie 1976 de stabilire a metodelor comunitare de analiză pentru controlul oficial al furajelor (2), modificată de Directiva 81/680/CEE (3), prevede metodele care trebuie aplicate pentru determinarea aflatoxinei B1;
   întrucât există motive pentru adaptarea acestor metode din perspectiva progreselor științifice și tehnice înregistrate; întrucât este recomandabil, în special, să se dispună de o metodă de control a limitelor foarte scăzute pentru aflatoxină stabilite de Directiva 74/63/CEE a Consiliului din 17 decembrie 1973 privind stabilirea nivelurilor maxime admise de substanțe și produse nedorite în furaje (4), modificată ultima dată de Directiva 91/132/CEE (5);
   întrucât este recomandabil, de asemenea, să se dispună de o metodă de determinare a aflatoxinei B1 în prezența substanțelor interferente, cum ar fi pulpa de citrice;
   întrucât măsurile prevăzute în prezenta directivă sunt în conformitate cu avizul Comitetului permanent pentru furaje,
   ADOPTĂ PREZENTA DIRECTIVĂ:
   Articolul 1
   Anexa la Directiva 76/372/CEE se modifică în conformitate cu anexa la prezenta directivă.
   Articolul 2
   Statele membre pun în aplicare până la 1 octombrie 1993 actele cu putere de lege și actele administrative necesare pentru a se conforma prezentei directive. Statele membre informează de îndată Comisia cu privire la aceasta.
   Atunci când statele membre adoptă aceste acte, ele cuprind o trimitere la prezenta directivă sau sunt însoțite de o asemenea trimitere la data publicării lor oficiale. Statele membre stabilesc modalitatea de efectuare a acestei trimiteri.
   Articolul 3
   Prezenta directivă se adresează statelor membre.
   
      Adoptată la Bruxelles, 9 noiembrie 1992.
      
         
            Pentru Comisie
         
         Ray MAC SHARRY
         
         
            Membru al Comisiei
         
      
   
   
      (1)  JO L 170, 3.8.1970, p. 2.
   
      (2)  JO L 102, 15.4.1976, p. 8.
   
      (3)  JO L 246, 29.8.1981, p. 32.
   
      (4)  JO L 38, 11.2.1974, p. 31.
   
      (5)  JO L 66, 13.3.1991, p. 16.
   ANEXĂ
   I.   În partea A „Metodă cromatografică monodimensională pe strat subțire”, textul punctului 1 „Obiectiv și domeniu de aplicare” se înlocuiește cu următorul text:
   
      „1.   Obiectiv și domeniu de aplicare
      Metoda permite determinarea nivelului de aflatoxină B1 din materiile prime și furajele simple. Această metodă nu se poate aplica în prezența pulpei de citrice. Limita inferioară de determinare este de 0,01 mg/kg (10 ppb).
      În prezența substanțelor interferente, este necesar să se repete analiza folosind metoda B (cromatografie lichidă de înaltă performanță).”
   
   II.   În partea B „Metodă cromatografică bidimensională pe strat subțire”, textul se înlocuiește cu următorul text:
   
      „B.   DETERMINAREA AFLATOXINEI B1. METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ
      1.   Obiectiv și domeniu de aplicare
      Prezenta metodă permite determinarea aflatoxinei B1 din furaje, inclusiv din cele care conțin pulpă de citrice. Limita inferioară de determinare este de 0,001 mg/kg (1 ppb).
      2.   Principiu
      Eșantionul se extrage cu cloroform. Se filtrează extrasul, iar o parte alicotă se purifică pe un cartuș de Florisil, apoi pe un cartuș C18. Separarea finală și determinarea se realizează prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (CLIP), folosind o coloană C18 în fază inversă, urmată de derivatizare postcoloană cu iod în apă și detecție fluorimetrică.
      Notă:
      Micotoxinele sunt substanțe extrem de toxice. Acestea trebuie manipulate sub o hotă ventilată. Trebuie să se ia măsuri speciale de precauție atunci când toxinele sunt în stare uscată, din cauza naturii lor electrostatice și, ca urmare, a tendinței de a se dispersa în zonele de lucru.
      3.   Reactivi
      3.1.   Cloroform, stabilizat cu 0,5-1,0 % etanol, în masă. A se vedea observația de la punctul 10.2.
      3.2.   Metanol, calitate CLIP pentru prepararea 3.6.
      3.3.   Acetonă.
      3.4.   Acetonitril, calitate CLIP.
      Solvenți de eluare: se prepară cu o zi înainte de utilizare sau se elimină aerul din solvenți cu ajutorul ultrasunetelor.
      3.5.1.   Amestec de acetonă (3.3) și apă, 98 + 2 (v + v).
      3.5.2.   Amestec de apă și metanol (3.2), 80 + 20 (v + v).
      3.5.3.   Amestec de apă și acetonă (3.3), 85 + 15 (v + v).
      3.6.   Fază mobilă pentru CLIP.
      Amestec de apă, metanol (3.2) și acetonitril (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v).
      
         N.B. Compoziția solventului de fază mobilă poate fi modificată, în funcție de caracteristicile coloanei CLIP folosite.
      3.7.   Soluție de iod saturată: se adaugă 2 g de iod la 400 ml apă. Se amestecă cel puțin 90 minute și se filtrează printr-o membrană filtrantă (4.15). Se protejează soluția saturată de lumină pentru a evita fotodegradarea.
      3.8.   Celite 545 spălat cu acid, sau echivalent.
      3.9.   Cartuș de Florisil (Waters SEP-PAK), sau echivalent.
      3.10.   Cartuș C18 (Waters SEP-PAK), sau echivalent.
      3.11.   Gaz inert, de exemplu azot.
      Soluție etalon de aflatoxină B1 în cloroform, concentrație 10 μg/ml. Se verifică concentrația soluției după cum urmează: se determină spectrul de absorbție al soluției între 330 și 370 nm cu ajutorul spectrofotometrului (4.23). Se măsoară absorbanța (A) la valoarea maximă aproape de 363 nm. Se calculează concentrația de aflatoxină B1 în micrograme per mililitru de soluție conform formulei:
      
         
      3.12.1.   Soluția mamă a soluției etalon de aflatoxină B1 în cloroform.
      Se transferă cantitativ 2,5 ml de soluție etalon de aflatoxină B1 (3.12) într-un balon cotat de 50 ml și se completează până la nivel cu cloroform (3.1). Se păstrează această soluție la rece (4 °C) și la întuneric, bine sigilată și învelită în folie de aluminiu.
      Soluții de aflatoxină B1 pentru etalonare prin CLIP.
      
         N.B. Se folosește sticlărie spălată cu acid pentru prepararea acestor soluții (a se vedea punctul 4, Aparatură).
      3.13.1.   Soluție de etalonare 4 ng/ml.
      Se lasă balonul cotat cu soluția mamă (3.12.1) să revină la temperatura camerei în folia de aluminiu (timp de câteva ore). Se transferă 400 μl din soluția mamă (200 ng de aflatoxină B1) într-un balon cotat de 50 ml și se evaporă soluția până la uscare sub un curent de gaz inert (3.11).
      Se dizolvă reziduul obținut în aproximativ 20 ml de amestec de apă/acetonă (3.5.3), se completează până la nivel cu amestec de apă/acetonă și se amestecă bine.
      3.13.2.   Soluție de etalonare 3 ng/ml.
      Se transferă cantitativ 7,5 ml de soluție de etalonare (3.13.1) într-un balon cotat de 10 ml, se completează până la nivel cu amestec de apă/acetonă (3.5.3) și se amestecă bine.
      3.13.3.   Soluție de etalonare 2 ng/ml.
      Se transferă cantitativ 25 ml de soluție de etalonare (3.13.1) într-un balon cotat de 50 ml, se completează până la nivel cu amestec de apă/acetonă (3.5.3) și se amestecă bine.
      Această soluție este, de asemenea, un etalon de referință, folosit pentru injecția repetitivă în timpul CLIP (5.5).
      3.13.4.   Soluție de etalonare 1 ng/ml.
      Se transferă cantitativ 2,5 ml de soluție de etalonare (3.13.1) într-un balon cotat de 10 ml, se completează până la nivel cu amestec de apă/acetonă (3.5.3) și se amestecă bine.
      Flacon conținân un amestec de aflatoxine B1, B2, G1 și G2 în concentrații de aproximativ 1, 0,5, 1 și respectiv 0,5 μg/ml, în 1 ml de cloroform.
      3.14.1.   Soluție de test prin cromatografie.
      Se transferă conținutul flaconului (3.14) într-o eprubetă de sticlă cu dop sau într-un flacon cu dop cu șurub. Se transferă 40 μl din această soluție într-o eprubetă de sticlă cu dop (spălată cu acid) (4.22). Se evaporă cloroformul sub un curent de gaz inert (3.11) și se redizolvă în 10 ml de amestec de apă și acetonă (3.5.3).
      Reactivi pentru testul de confirmare (6).
      3.15.1.   Soluție de clorură de sodiu saturată.
      3.15.2.   Sulfat de sodiu, anhidru, granulat.
      4.   Aparatură
      
         Atenție: Utilizarea sticlăriei nespălate cu acid pentru soluțiile apoase de aflatoxină poate cauza pierderi. Trebuie să se acorde o atenție specială la folosirea sticlăriei noi și a sticlăriei de unică folosință, cum ar fi flaconul cu injecție automată și pipetele Pasteur. Prin urmare, sticlăria de laborator care intră în contact cu soluțiile apoase de aflatoxine trebuie înmuiate în acid diluat (de exemplu acid sulfuric = 2 mol/l) timp de câteva ore, apoi clătite bine cu apă distilată pentru a îndepărta orice urme de acid (de exemplu de trei ori, se verifică cu hârtie pH). În practică, acest tratament este necesar pentru balonul cu fund rotund (4.4), baloanele cotate, cilindrii gradați, flacoanele sau eprubetele folosite pentru soluțiile de etalonare și extractele finale (în special flacoanele cu injecție automată) și pipetele Pasteur, dacă acestea sunt folosite pentru transferarea soluțiilor de etalonare sau a extractelor.
      4.1.   Râșniță-mixer.
      4.2.   Sită cu ochi de 1,0 mm (ISO R 565).
      4.3.   Agitator mecanic.
      4.4.   Evaporator rotativ cu vid, prevăzut cu un balon cu fund rotund de 150-250 ml.
      4.5.   Cromatografie lichidă de înaltă performanță, injector cu buclă adecvat pentru injectarea a 250 ml. A se vedea instrucțiunile producătorului pentru umplerea parțială sau completă a buclei.
      4.6.   Coloană analitică CLIP: umplută cu particule de 3 μm sau 5 μm C18.
      4.7.   Pompă fără puls de dozare a reactivului postcoloană cu iod.
      4.8.   Racord în T fără volum mort, din oțel inoxidabil (1/16″ × 0,75 mm).
      4.9.   Spirală de reacție, din teflon sau oțel inoxidabil. Dimensiunile 3 000 × 0,5 mm până la 5 000 × 0,5 mm sunt adecvate în combinație cu coloane CLIP de 5 μm sau 3 μm.
      4.10.   Baie controlată termostatic, reglată la 60 °C, care permite o reglare a temperaturii cu o finețe de cel puțin 0,1 °C.
      4.11.   Detector fluorimetric, cu excitație la lungimi de undă de 365 nm și emisie la lungimi de undă de 435 nm. (Pentru aparatul cu filtru: lungimea de undă de emisie >400 nm). Este posibilă o detecție de cel puțin 0,05 ng de aflatoxină B1. Se recomandă o anumită contrapresiune (de exemplu prin regulator de presiune sau prin spirală din teflon sau din oțel inoxidabil conectată la ieșirea detectorului), pentru a elimina bulele de aer din celula de măsurare.
      4.12.   Înregistrator.
      4.13.   Integrator electronic (opțional).
      4.14.   Hârtie de filtru încrețită cu diametru de 24 cm, Macherey-Nagel 617 ¼ sau echivalent.
      4.15.   Membrană filtrantă cu porozitate de 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 sau echivalent.
      4.16.   Balon conic de sticlă de 500 ml cu dop.
      4.17.   Coloană de sticlă (diametru interior de aproximativ 1 cm, lungime de aproximativ 30 cm) prevăzută cu vârf Luer.
      4.18.   Robinet cu vârf Luer rezistent la cloroform (de exemplu Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 sau echivalent).
      4.19.   Seringă de 10 ml cu conector Luer, rezistentă la produse chimice.
      4.20.   Seringă de 250 ml pentru injecție CLIP (a se vedea 4.5).
      4.21.   Microseringă de 100 μl pentru prepararea soluțiilor de etalonare (se verifică prin cântărire ca marja de eroare să nu depășească 2 %).
      4.22.   Eprubete gradate din sticlă de 10 ml cu dop.
      4.23.   Spectrofotometru, pentru efectuarea de măsurători în regiunea UV a spectrului.
      Echipament pentru testul de confirmare (6).
      4.24.1.   Pâlnie de separare de 100 ml cu robinet de teflon, clătită cu acid.
      4.24.2.   Bloc de încălzire la 40-50 °C.
      5.   Procedură
      5.1.   Prepararea eșantionului.
      Se macină eșantionul astfel încât să treacă prin sită (4.2).
      5.2.   Eșantion de testare.
      Se cântărește 50 g din eșantionul preparat pentru testare într-un balon conic (4.16).
      5.3.   Extracție.
      Se adăugă 25 g de Celite (3.8), 250 ml de cloroform (3.1) și 25 ml de apă la eșantionul de testare (5.2). Se astupă balonul și se agită timp de 30 minute pe un agitator mecanic (4.3). Se filtrează printr-o hârtie de filtru încrețită (4.14). Se prelevează 50 ml din filtrat. După caz, se ia o parte alicotă din filtrat și se diluează până la 50 ml cu cloroform, astfel încât concentrația de aflatoxină B1 să nu fie mai mare de 4 ng/ml.
      5.4.   Purificare (procedura trebuie efectuată fără întreruperi semnificative).
      Atenție:
      
                  —
               
               
                  se protejează în mod adecvat laboratorul în care se efectuează analizele de lumina zilei. Acest lucru se poate realiza în mod eficient utilizând:
                  
                              (i)
                           
                           
                              Folie care absoarbe UV la ferestre în combinație cu lumină atenuată (fără lumină solară directă);
                           
                        
                              (ii)
                           
                           
                              Draperii sau jaluzele în combinație cu lumină artificială (se pot accepta tuburi fluorescente);
                           
                        
            
                  —
               
               
                  soluțiile care conțin aflatoxine trebuie protejate de lumină cât de mult posibil (prin păstrare la întuneric, prin utilizarea foliilor de aluminiu).
               
            5.4.1.   Purificare cu SEP-PAK Florisil
      5.4.1.1.   Prepararea ansamblului coloană-cartuș
      Se montează un robinet (4.18) la tija mai scurtă a cartușului de Florisil (3.9) (vezi figura 1). Se spală cartușul și se îndepărtează aerul luând 10 ml de cloroform (3.1) și lăsând să treacă 8 ml prin robinet în mod rapid în cartuș utilizând o seringă (4.19). Se conectează tija mai lungă a cartușului la o coloană de sticlă (4.17) și se introduce restul de 2 ml de cloroform prin cartuș în coloană. Se închide robinetul. Se îndepărtează seringa.
      5.4.1.2.   Purificare
      Se adăugă filtratul colectat la 5.3 în ansamblul coloană-cartuș și se evacuează prin gravitație. Se clătește cu 5 ml de cloroform (3.1), iar apoi cu 20 ml de metanol (3.2). Se îndepărtează eluații. În timpul acestor operațiuni, se iau măsuri pentru a preveni uscarea ansamblului coloană-cartuș.
      Se eluează aflatoxină B1 cu 40 ml de amestec acetonă-apă (3.5.1) și se colectează întregul eluat în balonul cu fund rotund al evaporatorului rotativ (4.4). Se concentrează eluatul cu ajutorul evaporatorului rotativ la 40-50 °C până când se încheie distilarea acetonei. (N.B. în acest stadiu, o cantitate de aproximativ 0,5 ml de lichid rămâne în balon. Experimentele au arătat că evaporarea ulterioară nu este dăunătoare și că, atunci când rămân 0,5 ml de lichid, nu mai există o cantitate semnificativă de acetonă. Reziduurile de acetonă pot duce la pierderi de aflatoxină B1 pe cartușul C18). Se adaugă 1 ml de metanol (3.2), se agită balonul pentru a dizolva aflatoxină B1 pe pereții balonului, se adaugă 4 ml apă și se amestecă. Se deconectează și se îndepărtează cartușul. Se clătește coloana de sticlă cu apă și se păstrează pentru etapa de purificare cu C18.
      5.4.2.   Purificare cu SEP-PAK C18
      
      5.4.2.1.   Prepararea ansamblului coloană-cartuș.
      Se montează un robinet (4.18) la tija mai scurtă a cartușului C18 (3.10) (a se vedea figura 1). Se amorsează cartușul și se îndepărtează aerul lăsând să treacă 10 ml de metanol (3.2) prin robinet în mod rapid în cartuș utilizând o seringă (4.19) (Bulele de aer din cartuș sunt vizibile ca puncte luminoase pe un fond gri). Se iau 10 ml de apă și se lasă să treacă 8 ml prin cartuș (se evită introducerea de aer în cartuș la trecerea de la metanol la apă). Se conectează tija mai lungă a cartușului la o coloană de sticlă (4.17) și se introduce restul de 2 ml de apă prin cartuș în coloană. Se închide robinetul. Se îndepărtează seringa.
      5.4.2.2.   Purificare
      Se transferă cantitativ în coloana de sticlă (4.17) extrasul colectat la 5.4.1.2, clătind balonul de două ori cu 5 ml de amestec apă/metanol (3.5.2) și se evacuează prin gravitație. În timpul acestor operațiuni, se iau măsuri pentru a preveni uscarea ansamblului coloană-cartuș. (Când se formează bule de aer în partea îngustă de lângă cartuș, se oprește fluxul și se lovește ușor partea superioară a coloanei de sticlă pentru a îndepărta bulele de aer. Apoi se continuă). Se eluează cu 25 ml de amestec apă/metanol. Se elimină eluatul. Se eluează aflatoxina B1 cu 50 ml de amestec apă/acetonă (3.5.3) și se colectează întregul eluat într-un balon cotat de 50 ml. Se completează până la nivel cu apă și se amestecă: soluția de testare astfel obținută este folosită pentru cromatografie (5.5).
      
         Atenție: Filtrarea extractului final înainte de CLIP nu este necesară în general. Dacă se consideră că este necesară, nu se utilizează filtre de celuloză, întrucât pot duce la pierderi de aflatoxină B1. Se pot accepta filtrele de teflon.
      5.5.   Cromatografie lichidă de înaltă performanță
      (A se vedea figura 2 pentru montarea echipamentului). Se acordă un timp suficient pentru condiționarea și stabilizarea instrumentelor.
      Nota 1:
      Debitele indicate pentru faza mobilă și pentru reactivul postcoloană sunt doar orientative. Ele pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei CLIP.
      Nota 2:
      Răspunsul detectorului la aflatoxină B1 depinde de temperatură, prin urmare abaterile trebuie compensate (a se vedea figura 3). Prin injectarea unei cantități fixe de etalon de referință aflatoxină B1 (3.13.3) la intervale regulate (adică la fiecare a treia injectare), valorile maxime ale aflatoxinei B1 obținute între aceste etaloane de referință pot fi corectate folosind răspunsul mediu, cu condiția ca diferența dintre răspunsurile etaloanelor de referință consecutive să fie foarte mică (< 10 %). Prin urmare, injectările trebuie să fie efectuate fără întrerupere. Dacă este necesară o întrerupere, ultima injectare înainte de întrerupere și prima injectare după întrerupere trebuie să reprezinte etalonul de referință (3.13.3). Întrucât curba de calibrare este liniară și trece prin origine, cantitățile de aflatoxină B1 din extractele de eșantion sunt determinate direct prin raportare la etaloanele apropiate.
      5.5.1.   Reglarea pompei CLIP
      Se reglează pompa CLIP (4.5) pentru a genera un flux de 0,5 sau 0,3 ml/min pentru o coloană CLIP de 5 μm sau respectiv de 3 μm (4.6) folosind faza mobilă (3.6).
      5.5.2.   Reglarea pompei postcoloană
      Se reglează pompa (4.7) pentru a genera un flux de 0,2-0,4 ml/min de soluție apoasă saturată în iod (3.7). Cu titlu orientativ: fluxurile de aproximativ 0,4 sau 0,2 ml/min sunt recomandate în combinație cu fluxuri de 0,5 și respectiv 0,3 ml/min ale fazei mobile (3.6).
      5.5.3.   Detectorul fluorimetric
      Se reglează detectorul fluorimetric (4.11) la o lungime de undă de excitație = 365 nm și la o lungime de undă de emisie = 435 nm (pentru aparat cu filtru: >400 nm). Se ajustează atenuarea detectorului pentru a obține aproximativ 80 % din deviația la scară completă a acului de înregistrare pentru 1 ng de aflatoxină B1.
      5.5.4.   Injectorul
      Pentru toate soluțiile, se injectează cantități de 250 μl urmând instrucțiunile producătorului injectorului.
      5.5.5.   Verificarea separării cromatografice
      Se injectează soluția de test prin cromatografie (3.14.1). Înălțimea punctului de inflexiune trebuie să fie mai mică de 5 % din suma înălțimilor maximelor alăturate.
      5.5.6.   Verificarea stabilității sistemului
      Înaintea fiecărei serii de analize, se injectează de mai multe ori etalonul de referință (3.13.3) până se obțin suprafețe stabile ale maximelor (N.B. Răspunsurile maxime pentru aflatoxină B1 între injectările consecutive nu trebuie să varieze cu mai mult de 6 %). Se efectuează fără întârziere verificarea liniarității (5.5.7).
      5.5.7.   Verificarea liniarității
      Se injectează soluțiile de etalonare de aflatoxină B1 (3.13.1-3.13.4). La fiecare a treia injectare, se folosește etalonul de referință (3.13.3), pentru corectarea abaterii în răspuns (N.B. Răspunsurile maxime pentru acest etalon de referință nu trebuie să difere cu mai mult de 10 % în 90 de minute). Se corectează abaterea conform formulei descrise la punctul 7. Graficul de calibrare trebuie să fie liniar și să treacă prin origine, în cadrul unui interval de două ori mai mare decât eroarea standard a Y estimat. Valorile obținute nu trebuie să difere cu mai mult de 3 % de valorile nominale. Dacă sunt îndeplinite aceste cerințe, se continuă fără întârziere. Dacă nu, se identifică și se corectează cauzele problemei înainte de a continua.
      5.5.8.   Injectarea extractelor de eșantion
      Se injectează extractele purificate de eșantion (5.4.2.2). După fiecare două extracte de eșantion, se repetă injectarea etalonului de referință (3.13.3) conform următoarei secvențe: etalon de referință, extract, extract, etalon de referință, extract, extract, etalon de referință etc.
      6.   Test de confirmare
      6.1.   Tratarea ulterioară a extractului (5.4.2.2)
      Se adăugă 5 ml de soluție de clorură de sodiu (3.15.1) la extractul final obținut la 5.4.2.2. Se extrage de trei ori cu câte 2 ml de cloroform (3.1) timp de un minut, în pâlnia de separare (4.24.1). Se toarnă extractele combinate de cloroform peste aproximativ 1 g de sulfat de sodiu (3.15.2) într-o eprubetă de 10 ml. O pâlnie mică (diametru de 4 cm) poate fi folosită cu o bucată de vată în orificiu, acoperită de aproximativ 1 g de sulfat de sodiu.
      Se spală stratul de sulfat de sodiu cu câțiva ml de cloroform și se colectează soluția de spălare în aceeași eprubetă. Se evaporă extrasul de cloroform până la uscare în aceeași eprubetă folosind blocul de încălzire (4.24.2) și se redizolvă în 1 ml de cloroform.
      6.2.   Prepararea derivaților și cromatografia pe strat subțire
      A se vedea metoda A punctul 5.6.2 din anexa la Directiva 76/372/CEE a Consiliului.
      7.   Calcularea rezultatelor
      Se calculează conținutul de aflatoxină B1 (μg/kg) prezentă în eșantion utilizând formula:
      
         
      unde:
      
                  m
               
               
                  =
               
               
                  cantitatea de aflatoxină B1, în ng, reprezentată de maximul B1 al eșantionului, calculată după cum urmează:
                  
                     
               
            
                  P (eșantion)
               
               
                  =
               
               
                  suprafața valorilor maxime ale aflatoxinei B1 pentru eșantion
               
            
                  P (st1)
               
               
                  =
               
               
                  suprafața valorilor maxime ale aflatoxinei B1 rezultată din injectarea anterioară a etalonului de referință (3.13.3)
               
            
                  P (st2)
               
               
                  =
               
               
                  suprafața valorilor maxime ale aflatoxinei B1 rezultată din următoarea injectare a etalonului de referință (3.13.3)
               
            
                  r (st)
               
               
                  =
               
               
                  cantitatea injectată de aflatoxină B1 în etalonul de referință (3.13.3), în ng
               
            
                  Vm
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de extract de eșantion injectat, în ml
               
            
                  Vext
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul final de extract de eșantion, în ml, ținând seama de orice diluție efectuată (5.3)
               
            
                  M
               
               
                  =
               
               
                  masa eșantionului, în g
               
            
                  Vf
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de filtrat transferat în cartușul de Florisil (5.4.1.2), în ml
               
            
                  Vc
                  
               
               
                  =
               
               
                  volumul de cloroform folosit pentru extracția eșantionului, în ml
               
            Dacă procedura este urmată conform prezentului protocol, formula se reduce la:
      
                   
               
               
                  conținut de aflatoxină B1 în μg/kg = 20 × m.
               
            7.1.   Calcularea rezultatelor se poate realiza, de asemenea, prin măsurarea înălțimii maximelor.
      8.   Repetabilitate:
      A se vedea punctul 10.1.
      9.   Reproductibilitate:
      A se vedea punctul 10.1.
      10.   Observații
      10.1.   Precizie
      Un studiu colaborativ (1), efectuat la nivel internațional pe furajele compuse, a dus la rezultatele privind repetabilitatea și reproductibilitatea prezentate în tabelul 1. Termenul de repetabilitate (r) utilizat în acest caz se definește ca raportul cel mai mare care nu este semnificativ la nivelul de probabilitate de 95 %, pentru compararea a două rezultate ale analizei aceluiași eșantion în același laborator în condiții similare. Termenul de reproductibilitate (R) se definește, în mod similar, pentru compararea rezultatelor obținute de două laboratoare diferite. În conformitate cu ISO 3534-1977, 2.35 (2) și cu Decizia 89/610/CEE a Comisiei (3), parametrii r și R sunt indicați în tabelul 1 și în coeficienți de variație.
      Tabelul 1
      Repetabilitatea (r) și reproductibilitatea (R) exprimate în raporturi și în coeficienți de variație
      
         (15 laboratoare)
      
      
                  Nivel
               
               
                  r
               
               
                  R
               
               
                  CVr
                      (4)
                  
               
               
                  CVR
                  
               
            
                  (μg/kg)
               
               
                   
               
               
                   
               
               
                  (%)
               
               
                  (%)
               
            
                  8 & 14
               
               
                  1,4
               
               
                  1,7
               
               
                  11
               
               
                  18
               
            10.2.   Stabilizarea cloroformului (3.1)
      Caracteristicile de absorbție ale cartușului de Florisil pot fi modificate dacă sunt folosiți alți stabilizatori decât etanolul. Acest lucru trebuie verificat în conformitate cu punctul 10.3 atunci când cloroformul descris nu este disponibil.
      10.3.   Precizie
      Aplicările corecte ale metodei trebuie verificate prin efectuarea de măsurări duble asupra materialelor de referință certificate. Dacă aceste măsurări nu sunt disponibile, aplicarea metodei trebuie verificată prin experimente de recuperare efectuate asupra eșantioanelor fără aflatoxină B1 contaminate artificial. Abaterea mediei de la valoarea reală, exprimată ca procent din valoarea reală, nu trebuie să se situeze în afara limitelor de - 20 % și + 10 %.
      
         
      
         
      
         
   
   
      (1)  Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. și Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.
   
      (2)  ISO 3534-1977.
   
      (3)  JO L 351, 2.12.1989, p. 39.”
   
      (4)  
   CV= coeficient de variație