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흑두 품종의 영향 콩의 종류가 발아에 비치는 영향을 검토하여 Fig. 2에 나타내었다. 흑두의 대표적 품종인 흑태, 서목태 및 서리태를 3시간 침지 후 2시간 물빼기의 조건으로 침지시켜 실온에서 발아를 행한 후 싹의 길이를 측정한 결과 12시간 경과 후 품종별 싹의 길이는 흑태, 서목태 및 서리태가 각각 \( 10 \mathrm { ~mm } , 10 \) \( \mathrm { mm } \) 및 \( 8 \mathrm { ~mm } \)이었으며 48시간째는 \( 35 \mathrm { ~mm } , 30 \mathrm { ~mm } \) 및 31 \( \mathrm { mm } \)로 싹의 길이가 거의 비슷하였다. 청국장의 제조 시 콩의 표면적이 넓으면 청국장의 발효가 효율적으로 진행될 것으로 생각되어 3종류의 흑두 중 콩의 알갱이가 적어 표면적이 넓은 서목태를 선정하여 이하의 실험을 행하였다. 발아 온도의 영향 발아 온도가 흑두의 발아율에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 3에 나타내었다. 발아 온도가 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 인 경우는 48시간 발아시켜도 \( 2 \% \) 미만의 발아율을 나타내었으나, \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서는 발아 12시간째에 \( 50 \% \), 24시간째에도 약 \( 83 \% \), 48시간째에는 약 \( 95 \% \)의 발아율을 나타내었다. 그러나 발아 온도를 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 높였을 경우는 상온에서 발아시키는 것보다 발아율이 떨어져 48시간째에 각각 \( 75 \% \)와 \( 68 \% \)의 발아율을 나타내었다. 이상의 결과로 흑두의 발아 온도는 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 저온이나 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 고온에서보다 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 상온에서 행하는 것이 적당한 것으로 생각되어졌다. 일반 성분의 변화 상온에서 발아시킨 서목태 싹의 길이가 흑두의 일반 성분 변화에 미치는 영향을 검토하여 Table 1에 나타내었다. 대조구는 발아시키지 않은 서목태를 사용하였다. 조단백과 조지방은 발아가 진행됨에 따라 그 함량이 약간씩 감소하여 싹의 길이가 \( 15 \mathrm { ~mm } \)일 때 각각 \( 23.7 \% \) 및 \( 12.9 \% \)의 함량을 나타내었다. 그러나 조회분은 \( 5.3 \sim 5.8 \% \), 조섬유는 \( 9.5 \sim 10.4 \% \)로 함량 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. Kim등은 우리나라 전통 콩의 이화학적 특성 연구에서 콩의 종류에 따라 조단백의 함량이 \( 38.7 \sim 46.3 \% \), 조지방의 함량이 \( 14.1 \sim 19.2 \% \) 및 조회분의 함량이 \( 4.2 \sim 5.0 \% \)로 보고하여 조단백 성분을 제외한 다른 성분은 본 연구의 결과와 비슷하였다. Kim 등의 장려 품종 콩의 이화학적 특성에서도 조단백의 함량이 \( 37.42 \sim 44.37 \% \), 조지방의 함량이 \( 19.49 \sim 21.17 \% \), 조회분의 함량이 \( 5.10 \sim 6.02 \% \) 및 조섬유의 함량이 \( 4.41 \sim 5.95 \% \) 로 조섬유의 함량을 제외하고 유사한 결과를 보였다.

청국장 제조 시 효율적인 발효를 위해 표면적이 넓은 흑두인 서목태를 이용한 실험을 진행하였다. 실험 결과, 흑두의 발아 온도는 10°C의 저온과 25°C의 고온보다는 18°C의 상온에서 가장 적절하다는 결론을 도출하였다. 또한, 발아 진행에 따라 조단백과 조지방 함량은 감소하였으나, 조회분과 조섬유 함량은 변화가 미미하였다. 본 연구 결과는 Kim 등의 연구 결과와 일치하여, 콩의 종류에 따라서도 이러한 변화가 나타나는 것을 확인하였다.

서 론 콩은 우리나라 전통 장류 발효식품의 주된 원료로 사용되어져 왔고 또한 식물류의 기능성 소재로서 양질의 단백질과 불포화지방산이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.그리고 최근의 연구에 의하면 콩 발효식품의 영양적 인자로 알려진 여러 종류의 물질들이 오히려 항암성, 항산화능 및 면역성 강화 등의 다양한 새로운 기능성을 가지는 것으로 보고되어 콩의 생리활성과 영양학적 중요성에 대한 많은 관심과 기대가 고조되고 있는 실정이다. 우리나라의 전통 콩 발효식품 중의 하나인 청국장은 간장,된장, 고추장과는 달리 전통장류 중 유일하게 소금을 첨가하지 않고 고온에서 속성으로 발효시킨 식품이기 때문에 전통적으로 콩을 수확한 뒤 늦가을부터 초봄 사이에 각 가정에서 손쉽게 제조하여 소금이나 마늘, 고춧가루 등을 섞어 절구통으로 찧어 단지에 다져 넣어 보관하면서 찌개의 재료로 사용하여 왔다. 그러나 그 제조방법은 정형화 된 것이 없고 경험에 의해서 전래된 방법대로 깨끗한 볏짚을 사용하여 삶은 콩을 따뜻한 아랫목에 덮어 두면 하룻밤 사이에 표면이 회백색이 되고 끈적끈적한 실이 나오면서 뜨워진다. 이와 같은 청국장은 된장보다 단백질과 지방이 많으나 소화흡수율은 오히려 높으며, 칼슘과 비타민 A, B의 중요한 공급원, 청국장균의 정장효과, 섬유질의 변비예방효과, 발암물질과 콜레스테롤의 체외 배출효과, 점질물(mucin)의 알코올 흡수에 의한 해장효과 등이 우수한 것으로 밝혀져 있다. 청국장에 대한 연구로는 발효과정 중 청국장의 성분변화, 발효미생물과 발효조건 및 원료 콩의 차이에 따른 청국장의 품질변화 , 세균학적 특성, 효소학적 특성 및 향기성분 등에 관한 보고 등은 다수 있으나 청국장을 제조할 때 콩의 생리활성 등을 보다 효율적으로 이용하기 위한 연구는 전무한 실정이기 때문에 본 연구자들은 활성화된 상태의 콩을 청국장의 재료로 이용하기 위하여 일반청국장 제조법을 약간 변형한 두아청국장의 제조방법을 시도하였다. 즉, 전통적인 청국장 제조는 콩을 냉수에 수침시켜 증자한 후 발효시키지만, 두아청국장은 수침한 콩을 균일하게 발아시킨 다음 증자한 후 적당한 온도에서 발효를 행하여 청국장을 제조하였다. 이와 같은 두아청국장 개발을 위한 기초 자료를 제공하고자 본 연구에서는 콩의 수침방법, 최적발아온도, 발아된 원료의 특성 및 isoflavone 함량 등을 검토하였다. 재료 및 방법 실험 재료 본 연구에서 사용한 콩은 2006년 가을에 수확한 흑태, 서리태 및 서목태의 3품종을 사용하였다. 이들 품종은 모두 경상대학교 자원식물환경학부 유전육종연구실에서 작물유전체 기능연구 및 바이오그린 사업연구비의 협조를 얻어 유전자 조작이 아닌 전통적인 유전·육종기술을 이용하여 육종된 콩 품종의 일부를 분양 받아 사용하였다.

콩은 우리나라 전통적인 장류 발효식품의 핵심 원료로서, 단백질과 불포화 지방산을 풍부하게 함유하고 있다. 최근의 연구에 따르면, 콩 발효식품은 항암, 항산화 및 면역 강화 등 다양한 기능성을 갖는 것으로 알려져 있다. 볏짚을 사용하여 콩을 삶고 덮어두면 뜨거워져 표면이 하얗게 변하고 끈적이는 실이 나온다. 청국장은 단백질과 지방이 많고, 소화 흡수율이 높아 비타민 A, B, 칼슘을 공급하며, 다양한 건강 효과를 가지고 있다. 본 연구에서는 콩의 수침 방법, 최적 발아 온도, 발아된 원료의 특성 및 isoflavone 함량 등을 조사하여 두아청국장 제조를 위한 기초 정보를 제공한다.

발아 조건 확립 흑두의 최적 발아조건을 확립하기 위하여 콩의 침지조건은 6시간 및 12시간 동안 냉수에 침지하여 발아 시키는 것과 3시간 침지한 다음 2시간 물빼기를 3회 반복한 후 일정온도에서 발아 시키는 조건에 대하여 검토하였다. 발아온도는 수침한 콩을 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } , 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)(실온), \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 및 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 일정시간 발아시킨 후 발아율을 조사하였다. 발아는 빛이 들지 않고 배수가 용이한 용기에 담아 행하였다. 청국장의 제조 두아청국장의 제조는 콩을 선별, 세정 및 수침한 다음 발아시켜 싹의 길이가 \( 20 \mathrm { ~mm } \)정도 균일하게 성장하였을 때 \( 121 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30분 동안 증자하여 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 항온실에서 발효를 행하였다. 대조구인 전통청국장은 냉수에 콩을 12시간 수침시킨 후 물빼기를 하고 stainless steel에 담아 두아청국장 제조과정과 동일하게 발효시켰다. 그리고 제조한 청국장의 관능검사는 훈련된 패널원 5명을 통하여 각 생청국장을 검사하는 방법과 청국장 찌개(물 \( 500 \mathrm { ml } \)에 청국장 \( 50 \mathrm { ~g } \), 두부 \( 10 \mathrm { ~g } \), 소금 \( 3 \mathrm { ~g } \), 무 \( 10 \mathrm { ~g } \) )를 만들어 검사하는 2가지 방법을 사용하였다. 평가항목은 전자의 경우 색깔, 고유의 냄새 및 점질물의 형성에 대하여, 후자의 경우는 색깔, 구수한 맛, 이취 및 전체적인 선호도에 대하여 실시하였다. 평가방법은 4점 기호도 채점법 ( + 매우 싫다, + + 약간 싫다, + + + 약간 좋다, + + + + 매우 좋다)을 이용하였다. 이화학적 분석 콩 및 청국장의 일반성분인 조단백, 조지방, 조회분 및 조섬유는 상법에 준하여 분석하였다. 총산은 각 시료 \( 10 \mathrm { ~g } \)을 \( 250 \mathrm { ml } \) 삼각플라스크에 넣고 증류수 \( 90 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 2시간 동안 교반한 다음 원심분리 \( (8,000 \times g, 10 \mathrm { ~min } ) \) 하여 상등액을 취한 후 그 상등액 \( 20 \mathrm { ml } \)에 증류수 \( 180 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 페놀프탈렌용액을 2 3방울 떨어뜨린 다음 \( 0.1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \)로 적정하여 초산함량으로 환산하여 계산하였다. \( \mathrm { pH } \)는 시료를 10배 희석하여 \( \mathrm { pH } \)meter로 측정하였다.

흑두의 최적 발아조건을 확립하기 위해 다양한 침지 시간과 온도 조건에서 실험을 수행하였으며, 두아청국장 제조에는 발아시킨 콩을 사용하였다. 발아된 콩은 증기에서 30분 동안 가열 후, 항온실에서 발효를 진행하였다. 제품의 조단백, 조지방, 조회분 및 조섬유 같은 일반성분은 표준방법에 따라 분석하였다.

효소 활성 Protease 활성측정을 위한 기질용액은 milk casein \( 1.8 \mathrm { ~g } \)을 sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 7.2) 300 \mathrm { ml } \)에 용해하여 사용하였다. 효소활성 측정은 조효소액 \( 1 \mathrm { ml } \)에 기질용액 \( 5 \mathrm { ml } \)을 넣고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10 분간 반응시킨 다음, \( 0.4 \mathrm { M } \) trichloracetic acid (TCA) \( 5 \mathrm { ml } \)을 넣어 30분간 방치하여 반응을 중지시켰다. 반응 중지액을 원심분리하여 얻은 상징액 \( 2 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.5 \mathrm { M } \) \( \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { CO } _ { 3 } 5 \mathrm { ml } \)와 1 / 3 농도로 희석한 foline phenol 시약 \( 1 \mathrm { ml } \)을 첨가하여 발색 시킨 후 \( 660 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하여 tyrosine \( ( \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } ) \)의 양으로 나타내었다. Protease 1 unit는 조효소액 \( 1 \mathrm { ml } \)가 1 분간 \( 1 \mu \mathrm { g } \)의 trosine을 생성하는 효소의 양으로 나타내었다. \( \beta \)-Glucosidase 활성은 조효소액을 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 미리 활성화시켜 사용하였다. \( 5 \mathrm { mM } p \) - nitro-phenyl - \( \beta \) - D - glucopyranoside (sigma chemical Co., USA)를 함유한 \( 50 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 6.0) \( 0.5 \mathrm { ml } \) 에 조효소액 \( 0.2 \mathrm { ml } \)를 가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 10분간 반응시킨 후 \( 1 \mathrm { ml } \) 의 sodium tetraborate 포화용액으로 반응을 중지시켜 유리되는 p-nitrophenol의 양을 \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. 효소 활성 1 unit는 1분 동안에 \( p \)-nitro-phenol 1 μmole을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. Glucoamylase 활성은 시험관에 \( 0.05 \mathrm { M } \)acetate buffer \( ( \mathrm { pH } \) 4.8)에 \( 1 \% \)가용성전분을 녹인 기질용액을 \( 5 \mathrm { ml } \)와 조효소액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 첨가 한 후 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 30분간 반응 시키고 그 반응액 \( 1 \mathrm { ml } \)을 취하여 환원당량을 DNS법으로 측정하였다. 효소 활성 1 unit는 1분 동안에 \( 1 \mu \) mole의 glucose를 생산하는 효소량으로 나타내었다.

Protease, Glucoamylase의 활성을 측정하기 위한 다양한 시약과 버퍼를 사용하여 실험하였다. 이 중 Protease의 활성 측정을 위해 우유 카세인을 이용하였고, 반응 결과를 tyrosine의 양으로 표현하였다. Glucoamylase의 활성은 가용성 전분을 이용한 반응 후 DNS법으로 환원당량을 측정하여 나타내었다. 각각의 실험은 특정 온도와 시간에서 반응을 진행하였으며, 효소의 활성은 해당 조건에서 생산되는 특정 물질의 양으로 표현되었다.

효소 활성 발아된 서목태의 싹 길이가 여러 가지 효소 활성에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 4에 나타내었다. Protease의 활성은 싹이 발아하여 성장함에 따라 그 활성은 점차 낮아져 싹의 길이가 \( 15 \mathrm { ~mm } \)일 때 0.48 unit를 나타낸 반면에 glucoamylase활성은 싹의 길이가 \( 0 \mathrm { ~mm } \)일 때는 \( 0.2 \) unit 이었으나 20 \( \mathrm { mm } \)일 때는 0.4 unit로 싹 길이가 성장함에 따라 효소활성이 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 \( \beta \)-glucosidase활성은 발 아 콩의 싹 길이에 크게 영향을 반지 않는 것으로 나타났다. Isoflavone 함량 발아 싹의 길이가 콩의 대표적 생리활성 성분인 isoflavone 함량에 미치는 영향을 검토하여 Fig. 5에 나타내었다. 대조구는 발아하지 않는 서목태를 사용하였다. 대조구에서는 \( 134.2 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)이었으나 싹의 길이가 5, 10 및 \( 15 \mathrm { ~mm } \)까지 증가함에 따라 각각139.12,148.22 및 \( 149.37 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)으로 약간씩 증가하였다. 그러나 싹의 길이가 \( 20 \mathrm { ~mm } \)일 때는 \( 259.52 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)급격하게 증가하여 대조구보다 약 2배 높은 isoflavone 함량을 나타내었다. 이상의 결과로 두아청국장을 제조할 때 발아콩의 싹 길 이는 glucoamylase 및 \( \beta \)-glucosidase활성이 약간 높고, 그리고 isoflavone 함량이 가장 높게 나타난 \( 20 \mathrm { ~mm } \)일 때가 적당한 것으로 생각되었다. 두아 청국장의 제조 두아청국장의 특성을 검토할 목적으로 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 청국장을 제조한 다음 그 특성을 검토하여 Table 2에 나타내었다. 발효시간에 따른 각 성분의 함량 변화는 거의 일어나지 않았지만 조단백, 조지방 및 조섬유 함량은 전통 청국장 Chungkukjang A보다 두아 청국장(Chungkukjang B)에서 약간 높게 나타났다. 그러나 조회분의 함량은 \( 4.56 \sim 4.81 \% \)이었으며 \( \mathrm { pH } \)는 7.21 8.55 범위로 거의 비슷하였다. 본 연구의 결과는 Joo 등이 시판 청국장의 일반성분을 조사한 결과 조단백은 \( 11.99 \sim 22.5 \%, \mathrm { pH } 6.40 \) 7.27라고 보고한 내용 등과는 유사하였으나 조지방 함량이 \( 1.28 \sim 5.55 \% \)라고 보고한 내용과는 약간 상이하였다. 그러나 Yang 등의 청국장 분 말에서 조지방이 \( 15.3 \sim 16.3 \% \)로 보고한 결과와는 유사한 함량을 보였다.

발아된 서목태의 싹 길이가 20 mm일 때 glucoamylase, \(\beta\)-glucosidase 활성이 약간 높고 대표적 생리 활성 성분인 Isoflavone 함량이 최대가 된다. 두아청국장이 발효에 따른 성분 변화는 거의 없지만 전통청국장보다 조단백 ,조지방 및 조섬유,함량이 약간 높게 나타난다.

Isoflavone 분석 Isoflavone 분석은 동결건조 하여 분쇄한 시료 \( 1 \mathrm { ~g } \)에 0.1 N HCl \(2 \mathrm { ml } \)와 acetonitril (HPLC grade, 99.9%) \( 10 \mathrm { ml } \)를 첨가한 다음 실온에서 2 시간 교반한 후 여과지(No. 4)로 여과하여 그 여과액을 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)이하에서 진공농축 시켜 \( 80 \% \) meth-anol (HPLC grade, 99.9 \%) \( 10 \mathrm { ml } \)에 용해시킨 다음 \( 0.45 \mu \mathrm { m } \) membrane filter로 다시 여과하여 HPLC의 분석시료로 사용하였다. Isoflavone isomer 분석을 위한 HPLC (LC-10AD, Liquid Chlomatograph)의 칼럼은 YMC-pack ODS-AM-303 \( (5 \mu \mathrm { m } , 25 \mathrm { ~cm } \times 4.6 \mathrm { ~mm } \) i.d \( ) \)을 사용하였고, UV/VIS Detector 유속은 solvent \( 1 \mathrm { ml } / \mathrm { min } \)로 하였다. 파장은 \( 254 \mathrm { ~nm } \)에서 3차 증류수의 \( 0.1 \% \) glacial acetic acid를 용매로 하여 \( 0.1 \% \) gla-cial acetic acid / acetonitrile linear을 이동상으로 하여 line-ar gradient법으로 분석하였다. Isoflavone의 표준품은 일본 후지코 주식회사에서 구입하여 사용하였다. 결과 및 고찰 흑두의 침지 조건 흑두를 발아시켜 청국장을 제조하는 두아청국장의 제조방법을 확립하기 위하여 먼저 흑두의 침지조건을 검토하였다. 냉수에 6시간 침지시킨 시험구의 발아율은 12시간째에 약 \( 1 \%, 24 \) 시간째에는 약 \( 5 \% \)정도를 나타내었으나 12시간 침지시킨 시험구에서는 발아 12시간째에 \( 30 \% \), 24시간째에는 \( 50 \% \)정도의 발아율을 나타내었다. 그러나 3시간 침지후 2시간 물빼기를 3회 반복한 시험구에서는 발아 12시간째에 \( 50 \% \), 발아 24 시간째에는 \( 80 \% \)정도의 높은 발아율을 나타내었다. 그리고 6시간 및 12시간 침지시킨 흑두의 싹 길이는 불균일하였지만, 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 행한 시험구 의 싹 길이는 매우 균일하였다. 이상의 결과로 두아청국장 제조를 위한 콩은 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 반복하는 것이 수분흡수량이 보다 효율적인 것으로 생각 되어졌다.

Isoflavone 분석은 동결건조 후 분쇄한 시료 1g에 0.1 N HCl 2ml와 acetonitril 10ml를 첨가해 실온에서 2시간 교반하고 여과지로 여과한 여과액을 30\(^\circ \mathrm{C}\) 이하에서 진공농축해 80% methanol 10ml에 용해시킨 후 0.45\(\mu\mathrm{m}\) membrane filter로 여과해 HPLC의 분석시료로 사용했다. 두아청국장의 제조방법을 확립하기 위해 흑두의 침지조건을 실험하니 콩을 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 반복하는 것이 수분흡수량이 효율적인 것으로 나타났다.

관능 검사 본 연구에서 개발한 두아 청국장의 기호도를 평가하기 위하여 두아 생청국장에 대한 관능검사를 실시하여 Table 3에 나타내었다. 청국장의 발효가 종료된 직후에 실시한 생청국장의 관능검사 결과 색깔 및 점질물 생성은 대조구와 두아청국장이 거의 비슷하였지만 청국장 고유의 불쾌취는 오히려 두아 청국장에서 적게 발생하는 것으로 나타났다. 그리고 결과는 나타내지 않았지만 두아 청국장으로 찌개(물 \( 500 \mathrm { ml } \)에 청국장 \( 50 \mathrm { ~g } \), 두부 \( 10 \mathrm { ~g } \), 소금 \( 3 \mathrm { ~g } \), 무 \( 10 \mathrm { ~g } \) )를 만들어 실시한 관능검사에서도 거의 유사한 결과를 나타내었다. 이상의 결과로 콩을 발아시켜 제조한 두아 청국장의 경우 관능검사에서 대조구와 거의 유사한 결과를 나타내고 원료 콩에서 기능성 물질인 isoflavone 함량 등은 오히려 높게 검출되었기 때문에 두아청국장을 개발할 가치가 있는 것으로 생각되었다.이후의 연구는 개발한 두아 청국장의 생리활성 및 기능성 등의 깊이 있는 연구가 필요할 것으로 사료된다. 요 약 콩의 기능성을 보다 효율적으로 이용할 목적으로 청국장을 제조할 때 콩을 약간 발아시켜 제조한 두아청국장의 개발조건을 검토하였다. 흑두의 침지조건은 3시간 침지 후 2시간 물빼기를 3회 반복한 시험구에서 발아 12 시간째에 \( 50 \% \), 발아 24시간째에는 \( 80 \% \)정도의 높은 발아율을 나타내었다. 흑두의 발아온도를 검토한 결과 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 저온이나 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 고온보다 \( 18 ^ {\circ } \mathrm { C } \)의 상온이 적당하였다. 발아 콩의 일반성분을 검토한 결과 조단백과 조지방은 발아가 진행됨에 따라 그 함량이 약간 감소하였으나 조회분은 \( 5.3 \sim 5.8 \% \), 조섬유는 \( 9.5 \sim 10.4 \% \)로 대조구와 거의 비슷한 함량을 나타났다. 발아 콩의 효소활성을 측정한 결과 protease의 활성은 싹이 성장함에 따라 그 활성이 약간 낮아졌으나 glucoamylase활성은 증가하였으며, \( \beta \)-glucosidase활성은 싹 길이에 크게 영향을 받지않는 것으로 나타났다. 그러나 isoflavone 함량은 싹의 길이 가 \( 20 \mathrm { ~mm } \)일 때는 약 \( 260 \mu \mathrm { g } / \mathrm { g } \)으로 급격하게 증가하여 대조구보다 약 2배 높은 함량을 나타내었다. 두아청국장의 기호도를 평가한 결과 청국장의 색깔 및 점질물 생성은 전통청국장과 거의 차이가 없었지만 청국장 고유의 불쾌취는 오히려 두아청국장에서 적게 발생하는 것으로 나타났다. 그리고 두아청국장으로 찌게를 만들어 실시한 관능검사에서도 거의 유사한 결과를 나타내었다.

본 연구에서는 두아 청국장의 기호도를 평가하기 위해 관능검사를 실시하여 색깔, 점질물 생성 등과 불쾌취 발생 정도가 대조구와 비슷하게 나타났다. 두아 청국장으로 찌개를 만들어 행한 관능검사 또한 비슷한 결과를 나타냈다. 두아 청국장의 원료 콩에서 기능성 물질인 isoflavone이 발효과정 중 합성되어 있음을 알 수 있었다.

재료 및 방법 국화분말을 첨가한 빵의 제조 본 실험에 사용한 국화는 2009년 경남 마산에서 수확한 백국(White Chrysanthemum morifolium Ramat)을 동결건조 후 \(100\mesh\)로 분쇄하여 밀가루 \( 100 \% \) 기준으로 국화분말을 \(0\sim 7 \% \)씩 각각 다르게 첨가하였고, Table 1 과 같은 원료의 배합조건으로 식빵을 만들어 사용하였다. 또 반죽공정은 직접반죽법 (straight dough method)에 따라 쇼트닝을 제외한 모든 재료를 믹서 볼에 넣고 저속 3분간 믹싱 후 클린업단계(clean up stage)에서 쇼트닝을 혼합하고 저속 2분간 믹싱한 뒤 중속으로 8분간 더 믹싱하고 고속에서 1분간 믹싱하여 신장성이 최대인 최종단계(final stage)까지 반죽을 완료하였다. 반죽의 온도는 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \)로 맞추었고 1 차 발효 조건은 온도 \( 27^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 80 \% \) 에서 60분간 발효 후 \( 180 \mathrm{~g} \)씩 분할하고 둥글리기 하여 실온에서 15분간 중간발효를 실시하였다. 중간발효가 끝난 반죽은 밀대를 이용하여 반죽 내 가스를 뺀 다음 정형하여 산 모양으로 팬닝(panning)하였다. 또 2차 발효는 온도 \( 38^{\circ} \mathrm{C} \), 습도 \( 90 \% \) 조건에서 50분간 발효하여 윗불 \( 170^{\circ} \mathrm{C} \), 아랫불 \( 200^{\circ} \mathrm{C} \)로 예열된 오븐(Model FDO-7102, Dae Young Co., Korea)에서 35분간 구워 냉각 후 식빵용 포장지인 polyethylene (PE)필름 포장지를 이용하여 포장한 뒤 상온에 보관하며 실험에 사용하였다. 비용적 및 굽기 손실율 측정 식빵의 무게는 빵을 구운 후 실온에서 식힌 후 측정하였고 부피는 종자치환법으로 측정하였다. 각 시료는 3회 반복 측정 하였으며 빵의 비용적(specific volume)은 빵의 부피\(( \mathrm{ml} \))를 반죽의 무게 \( (\mathrm{g}) \)로 나눠 계산하였다. 굽기손실율은 다음의 식으로 계산하였다 굽기손실율 \( (\%)=(\) Dough weight \( (\mathrm{g})- \) Bread weight \( (\mathrm{g}) \)) / Dough weigh \( (\mathrm{g}) \times 100 \) 반죽의 물리·화학적 특성 측정 국화분말을 첨가한 빵의 \( \mathrm{pH} \)와 가용성 고형물함량은 빵 \(10 \mathrm{g} \)에 \( 90 \mathrm{ml} \)의 증류수를 첨가 후 Stomacher Lab Blender (400 cirulator, seward, England)로 \( 230 \mathrm{rpm} \), 30초간 균질화 시켜 \( \mathrm{pH} \) meter (Orion Research Inc., Boston, MA, USA)와 굴절계(Atago Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 각각 3회 반복 측정하였다. 빵의 경도는 Rheometer Compac-100 (Sun Scientific Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 Jung 등의 방법에 따라 측정하였다. 시료의 중심부를 \( 2 \times 2 \times 2 \mathrm{~cm} \)로 잘라서 평판에 놓고 지름 \( 3 \mathrm{~cm} \)의 구 probe로 누를 때 얻어지는 최대값의 힘을 5회 반복 측정하였다. Rheometer측정 조건은 최대하중 \( 2 \mathrm{~kg} \), table speed \( 60 \mathrm{~mm} / \mathrm{min} \)으로 하였다. 빵의 색도 또한 식빵을 \( 2 \times 2 \times 2 \)\( \mathrm{cm} \)로 잘라 색차계(Model JC801, Color Techno System Co.,Japan)를 이용하여 색도를 측정하고 L (Lightness), a (redness), b (yellowness) 값으로 나타내었다. 각각의 시료마다 5회 반복 측정하였으며, 표준 백판은 \( \mathrm{X} \)값 94.25, \( \mathrm{Y} \)값 96.06, \( \mathrm{Z} \)값 114.26 (\(\mathrm{L} \) 값 98.01, \(\mathrm{a}\)값 \( 2.27, \mathrm{b} \) 값 -1.13)이였다. 관능검사 국화분말의 첨가량을 달리한 식빵의 기호도 조사는 경남대학교 대학원생 15 명을 대상으로 실온에서 0,2,4일간 저장한 시료를 이용하여 각각 3회에 걸쳐 실시하였다. \( 0 \%, 3 \%, 5 \% \), \( 7 \% \) 국화를 첨가한 4가지 시료에 대해 식빵의 향(Flavor bal-ance), 경도(Hardness), 쓴맛 정도(Bitterness), 촉촉한 정도(Moistness), 종합적인 기호도(Overall acceptability)의 항목으로 관능검사를 Blind test로 실시하였다. 10점 척도법에 준하여 각 관능이 좋거나 강할수록 점수가 높고 나쁘거나 약할수록 낮은 점수를 주도록 하였다. 통계분석 통계분석은 Statistical Analysis System (SAS) package를 이용하여 분산분석을 실시하였고 각 시료간의 유의성 검증은 던컨의 다중 범위시험법(Duncan's multiple range test)을 사용하였다.

본 연구에서는 동결건조한 백국을 이용하여 국화분말을 식빵에 첨가하고 제조하였다. 반죽은 직접반죽법을 사용하여 쇼트닝을 제외한 재료를 믹서 볼에 넣고 세 단계로 믹싱하였다. 발효 조건은 온도 27°C, 습도 80%에서 60분 동안 1차 발효 후 분할 및 둥글기와 15분의 중간발효를 거친다. 국화분말을 첨가한 빵의 pH와 가용성 고형물함량은 Stomacher Lab Blender와 측정기를 사용하여 측정하였다. 통계 분석은 SAS 패키지를 사용하여 분산분석을 수행하였으며, Duncan의 다중 범위시험법을 사용하여 각 시료간의 유의성을 확인하였다.

결과 및 고찰 국화분말을 첨가한 빵의 반죽 및 제빵 특성 국화분말의 첨가는 빵의 반죽특성에 몇 가지 변화를 유도하였다. 국화분말을 첨가한 빵의 경우 무첨가 시료에 비해 제빵 시간이 9~23분 더 소요되는 것을 알 수 있었다. Table 2에서 보는 바와 같이 \( 5 \% \) 와 \( 7 \% \) 의 국화분말을 첨가한 시료의 1차 발효시간이 60분에서 75분으로 증가하였으며 2차 발효는 모든 첨가군에서 5분이 더 소요되었는데 이것은 국화분말의 첨가가 효모의 발효지연에 영향을 미친 것으로 판단된다. 또 굽는 과정에서도 첨가군 모두에서 5분이 더 소요되었는데 이러한 결과는 국화분말에 포함된 섬유소에 의해 수분 흡수율이 증가하였고 그로 인해 빵의 수분 보수력이 향상된 것으로 보인다. 그러나 Mixing time은 1~2분 짧아졌는데 이것은 국화분말 첨가량이 많아질수록 전체 밀가루의 함량은 적어지므로 결국 반죽에 포함된 gluten 함량의 감소에 의해 Mixing time이 짧아진 것으로 판단된다. 국화분말 첨가 빵의 부피, 무게, 비용적 및 굽기손실율 국화의 첨가량을 달리한 빵의 무게, 굽기손실율, 부피, 비용적은 Table 3과 같다. 국화분말의 첨가량이 증가할수록 빵의 무게가 증가하였는데 반죽의 무게가 일정한 것에 비해 빵의 무게는 증가함으로써 결국 굽기손실율이 감소하는 결과를 보였다. 반대로 부피의 경우 국화분말을 첨가할수록 감소하는 경향을 관찰할 수 있었는데 이는 국화분말의 첨가에 의해 나타나는 발효의 지연과 국화에 포함된 섬유소에 의해 수분 보수력이 증가하여 빵의 굽기과정 중에 나타난 수분의 손실감소가 원인인 것으로 추측된다. 따라서 비용적 또한 국화분말의 첨가량이 증가할수록 감소하는 경향을 보였다. 국화분말을 첨가한 빵의 저장 중 특성 변화 고형물함량과 경도의 변화 국화분말의 첨가에 따른 빵의 고형물함량의 변화는 거의 나타나지 않았지만 경도는 국화분말의 첨가량에 따라 증가하는 경향을 보였다. 저장기간에 따라 국화분말의 첨가유무에 관계없이 모든 시료에서 증가하는 경향을 보였고 특히 국화분말 첨가군의 경우 무첨가 시료에 비해 저장기간에 따른 경도의 증가가 더욱 컸다. 무첨가 시료의 경우에는 저장 4일째 가장 높은 경도를 보이다가 점차 감소하는 경향을 보인 반면 국화분말 첨가군의 경우 저장 6일째까지 증가하였다. 빵의 고형물함량에 차이가 없음에도 불구하고 경도의 차이가 나타나는 것은 빵의 부피가 감스할수록 경도가 높아진다는 사실과 일치하는 결과이다. \( \mathrm{pH} \)의 변화 국화분말의 첨가에 따른 빵의 \( \mathrm{pH} \) 변화는 무첨가 시료의 경우 \( \mathrm{pH} 5.63 \), 첨가군은 \( \mathrm{pH} 5.30 \)으로 국화분말의 첨가에 의해 \( \mathrm{pH} \)가 약 0.33정도 낮아지는 것을 확인하였다. 또 저장기간에 따라 \( \mathrm{pH} \)는 거의 변화없이 첨가군들의 \( \mathrm{pH} \)가 모두 낮게 유지되었다. 따라서 낮은 \( \mathrm{pH} \)는 미생물증식을 억제시키는 효과가 있으므로 빵의 저장 안전성에 도움이 될 것으로 생각된다. 또한 제빵의 특성을 고려해도 지친 반죽의 경우 \( \mathrm{pH} \)는 5.0 이하이고 어린 반죽은 6.0 이상이므로 국화분말의 첨가가 제빵에는 문제되지 않는 것으로 판단된다. 색도의 변화 국화분말의 첨가에 따른 빵의 색도변화는 Table 7과 같다. 색의 명도를 나타내는 \( \mathrm{L} \)값은 무첨가 시료가 80.78로 가장 높았고 \( 7 \% \) 첨가시료가 67.41로 가장 낮은 값을 보였다. 따라서 국화 분말의 첨가량이 많아질수록 빵의 명도는 감소하는 것으로 확인되었다. 또 적색도를 나타내는 \( \mathrm{a} \)값의 경우 무첨가시료가 -2.59, \( 7 \% \) 첨가시료가 -1.99로 점차 적색에 가까워지는 경향을 보였으며 황색도 \( \mathrm{b} \)값은 무첨가 시료보다 첨가군이 높아 국화분말의 첨가에 따라 황색에 가까워짐을 알 수 있었다. 그러나 저장기간에 따른 색도의 변화는 거의 나타나지 않았다. 국화분말을 첨가한 빵의 저장기간에 따른 관능 변화 국화분말의 첨가량을 달리한 빵의 관능검사는 Table 8에서 보는 바와 같이 식빵의 향(Flavor balance), 경도(Hardness), 쓴맛 정도(Bitterness), 촉촉한 정도(Moistness), 종합적인 기호도(Overall acceptability)에 대해 Blind test로 실시하였다. 그 결과 향과 경도, 그리고 촉촉한 정도는 모든 실험군에서 큰 차이를 보이지 않았으나 종합적인 기호도의 경우 무첨가 시료가 가장 우수한 값을 나타냈으며 국화분말의 첨가량이 많을수록 낮아지는 경향을 보였다. 또 저장기간이 경과함에 따라 모든 실험군의 종합적인 기호도는 감소하였는데 특히 국화분말의 첨가량이 적을수록 종합적인 기호도의 감소폭은 크게 나타났다. 따라서 빵에 국화분말을 첨가하는 것은 빵의 풍미를 유지하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 판단된다.

국화분말을 첨가하여 빵을 굽는 실험에서, 국화분말은 수분 흡수율을 증가시켜 빵의 수분 보수력을 향상시키고, 빵의 무게를 증가시켰다. 그 결과, 굽기 손실율은 감소하였다. 그러나 향, 경도, 촉촉함 등에는 큰 차이를 보이지 않았으며, 종합적인 기호도는 국화분말 첨가량이 많아질수록 낮아지는 경향을 보였다.

서 론 식생활의 형태가 서구화 내지는 편리한 식생활 패턴으로 변모되면서 주식대용으로 빵 소비가 크게 증가하게 되었고, 국민들의 건강에 대한 높은 관심으로 기능성이 부여된 제품에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다. 따라서 빵이 가지는 장점인 간편성과 맛뿐만 아니라 건강적인 측면까지 고려한 기능성이 첨가된 제품의 개발이 요구되고 있다. 최근에는 빵에 기능성 및 저장성을 부여하기 위해 다양한 식품소재의 사용이 시도되고 있는데 지금까지 발표된 연구결과들을 보면 당 알코올, 멍게껍질, 저항전분(resistant starch), 그리고 미강식이성섬유 등을 이용한 기능성 제품에 관한 연구가 있다. 또한 부추와 녹차가루를 이용한 연구, 신선초가루를 첨가한 식빵의 품질특성, 측백의 히노키티올 추출물의 효과, 미역과 다시마가루, 그리고 느타리버섯을 이용한 제품연구, 양파나 마늘분 등의 향신료를 첨가한 빵에 대한 연구 등이 있다. 그러나 예로부터 한방 및 민간요법에서 많이 이용되고 있으며 중국에서는 불로장생의 영약으로 귀하게 여겨줬고 현대에 와서는 국화차, 국화주 등의 제품에 원료가 되고 있는 국화를 첨가한 빵에 대한 연구는 지금까지 이루어진 바 없다. 국화는 쌍떡잎식물로 국화목 국화과에 속하며 중국이 원산으로 알려져 있으며 우리나라에는 중부 이남지역의 산간지에 널리 자생되고 있다. 또 산국과 소국으로 대별되어 전통식품의 천연향 및 천연색소 소재로써 널리 사용되어왔다. 최근 한방에서 산국의 꽃잎이 중추신경 진정작용, 혈압강화작용, 결핵 및 각종 바이러스에 대한 억제 효과 등이 있는 것으로 보고되었으며 주요 약리 성분으로 chrysnathemine, camphor 등이 밝혀져 있다. 또 국화에는 우수한 항균성분을 가지고 있다는 연구보.고가 있어 식품의 보존성을 높이는 천연보존제로써의 기능을 기대할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 빵에 국화분말을 첨가할 수 있는지에 대한 기초연구를 수행하기 위해 식빵에 \( 0 \%, 3 \%, 5 \%, 7 \% \) 의 국화분말을 첨가하여 반죽특성, 비용적 및 굽기 손실율, 고형물함량, 경도, \( \mathrm{pH} \), 색도, 관능검사 등을 실시하였다. 또 국화분말의 첨가가 빵의 품질유지에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 상온에서 8일간 저장하며 품질변화를 관찰하였다.

빵에 국화분말을 첨가할 수 있는지에 대한 기초연구를 수행하기 위해 식빵에 \( 0 \%, 3 \%, 5 \%, 7 \% \) 의 국화분말을 첨가하여 반죽특성, 비용적 및 굽기 손실율, 고형물함량, 경도, \( \mathrm{pH} \), 색도, 관능검사 등을 실시하였으며 또 국화분말의 첨가가 빵의 품질유지에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 상온에서 8일간 저장하며 품질변화를 관찰하였다.

서 론 파(Allium fistulosum)는 우리나라에서 식용으로 널리 사용되고 있는 백합목 백합과의 여러해살이풀로서, 파의 뿌리 부분은 특히 한의학에서 총백이라 불리며 맵고 따뜻한 성질을 가져 감기를 치료하는 데 사용되어져 왔다. 일반적으로 파는 칼슘과 비타민을 풍부하게 함유하고 있으며, 특히 파의 매운 향을 내는 황화아릴 성분은 소화를 돕고 장을 튼튼하게 하는 강장작용을 가진 것으로 알려져 있다. 또한 최근 연구에 따르면 파는 항산화작용을 포함하여 항혈액응고, 항콜레스테롤, 항균작용 및 혈당 강하 작용 등을 가지고 있음이 보고되었으나, 파 추출물의 염증에 관한 효과는 아직 연구가 미비한 실정이다. 염증 반응은 외부 자극에 대한 생체의 정상적인 방어 기작으로서 발생 위치에 따라 관절염, 천식, 염증성 장질환 및 동맥 경화 등과 같은 여러 가지 질병의 유발 원인이 된다. 특히 중추신경계(central never system, CNS) 내의 염증은 뇌에 존재하는 세포에 의해 일어나거나 혹은 말초로부터 면역세포가 침투함에 따라 일어나는데, CNS의 염증반응에 관여하는 대표적인 세포로서 microglia가 있다. Microglia의 활성화는 다양한 약물이나 독소에 의해 유발되어 이물질을 제거하고 신경성장 인자를 분비하여 신경세포 보호 및 CNS의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나 microglia의 활성화가 기본적으로 긍정적인 치유 과정임에도 불구하고, 활성화 상태가 너무 오래 지속되거나 과도하게 활성화될 시에는 진행성 염증반응을 일으켜 nitric oxide \((\mathrm{NO})\), prostaglandin \(\mathrm{E}_{2}\) \((\mathrm{PGE}_{2})\), tumor necrosis alpha \((\mathrm{TNF}-\alpha)\), interleukin-1\(\beta\)(IL-1\(\beta\)) 및 interleukin-6 (IL-6) 등과 같은 염증성 매개인자 및 염증성 cytokine과 reactive oxygen species (ROS) 등을 배출함으로써 신경 독성을 유발하고 뇌실질 조직을 파괴함으로서, 알츠하이머 치매, 파킨슨씨 병 및 크로이펠츠-야콥병과 같은 신경퇴행성 질환의 원인이 됨과 동시에 이러한 환자들의 병소에서 활성화된 microglia가 축적되어 있음이 보고되고 있다. 염증 산물인 \(\mathrm{NO}\)와 \(\mathrm{PGE}_{2}\)는 각각 in-ducible \(\mathrm{NO}\) synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)에 의해 만들어지므로 이들 염증성 유전자와 그 산물을 효과적으로 조절하는 것이 신경염증 조절뿐만 아니라 신경퇴행성 질환의 치료에 중요한 표적으로 인식되고 있다. 본 연구에서는 immortalized 된 mouse microglia BV2 세포에 lipopolysaccharide (LPS)를 이용하여 인위적인 활성화 및 염증반응을 일으킨 후 다양한 파 추출물이 염증 저해 활성을 보이는지 조사하였다. 그 결과 파 추출물이 iNOS, COX-2 및 염증성 cytokine의 발현과 그 최종 산물을 조절함으로써 신경 염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있을 가능성을 관찰하였기에 이를 보고하는 바이다.

파는 칼슘과 비타민을 풍부하게 함유하고 항산화작용 및 항혈액응고, 항콜레스테롤, 항균작용 및 혈당 강하 작용 등을 가지며, 파 추출물이 신경 염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있는 염증 저해 활성을 보인다.

고 찰 Microglia는 CNS에 존재하는 면역세포로서 다양한 약물이나 독소에 의해 활성화되어 이물질을 제거하고 면역기능을 나타내므로 신경세포를 보호하고 CNS의 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 그러나 microglia가 과도하게 활성화 될 경우 진행성인 염증반응을 일으켜 \(\mathrm{NO}\), \(\mathrm{PGE}_{2}\), 전구염증 cytokine 및 ROS 등을 배출하며, 이러한 인자들은 microglia 매개 신경 독성을 유발한다고 알려져 있다. 염증성 반응과 연관된 과도한 \(\mathrm{NO}\)와 \(\mathrm{PGE}_{2}\)를 생성하는 효소로서 iNOS와 COX-2가 가장 중요한 표적 유전자인데, iNOS는 세포질 안에서 여러 단계를 거쳐 \(\mathrm{NO}\)를 생성하며, COX-2는 prostanoids인 prostaglandins, prostacyclin 및 thromboxanes 등의 합성을 촉진하여 염증반응을 유도하는 핵심 인자로서 작용한다. 병리학적 측적에서 iNOS와 COX-2는 다양한 CNS의 외상과 질병 연관 조직에서 과다하게 발현되어 있으며, 특히 신경교증(gliosis) 및 파킨슨씨 병의 흑질 내 glia 세포에서 발현이 동시에 증가되어 있음이 보고되어 있다. 또한 LPS를 처리한 마우스 뇌의 microglia에서 iNOS와 COX-2가 동시에 과발현된다는 보고 등 은 다양한 in vitro 실험에서 LPS는 microglia를 활성화시켜 염증반응 및 신경독성을 유발하는 자극원으로 사용될 수 있음을 의미한다. 몇 가지 선행 연구에서 iNOS와 COX-2의 저해제가 LPS로 유도한 신경독성에 대해 보호 효과를 보인 바, microglia에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 효과적으로 저지하는 것이 염증성 cytokine의 생성 억제와 함께 신경염증과 신경퇴행성 질환의 치료와 예방을 위한 일반적인 접근 방법으로 인식되고 있다. 본 연구에서는 BV2 세포에 LPS를 처리하여 인위적으로 염증반응을 유도시킨 후 4가지 종류의 파 추출물의 염증 저해활성 효과를 비교하였다. 이를 위하여 파의 전체 및 뿌리 부분을 각각 열수 및 에탄올 추출물을 사용하였으며, 먼저 각 파 추출물 및 LPS의 단독 처리 혹은 복합 처리에 의해 세포독성을 나타내지 않는 조건을 설정하였고, 동일 조건에서 파 추출물이 LPS에 의해 유도된 염증 매개 인자인 iNOS와 COX-2의 발현 증가를 억제할 수 있는지를 조사하였다. Fig. 2 및 3에 제시된 바와 같이 본 실험에 사용된 파 추출물은 추출물의 종류에 따라 다소의 차이는 있었지만, 전반적으로 LPS에 의해 유도된 iNOS 및 COX-2의 발현을 매우 억제하였음을 확인할 수 있었다. 아울러 iNOS의 발현 증가데 대한 반응 산물인 \(\mathrm{NO}\)의 생성 억제 효과를 조사한 결과에서도, 파 추출물은 전반적으로 처리 농도 의존적으로 LPS에 의한 \(\mathrm{NO}\) 의 생성을 유의적으로 차단시켰으며, 이는 전사 및 번역 수준에서 iNOS의 발현 억제 효과와 연관성이 있었음을 알 수 있었다. 다음은 파 추출물의 염증성 cytokine의 발현 및 반응 산물의 억제 효과를 조사하기 위하여 동일 조건에서 LPS에 의해 유도된 TNF-\(\alpha\), IL-1\(\beta\) 및 IL-6의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. Fig. 5의 결과에 제시한 바와 같이, 조사된 4종류의 파 추출물 은 LPS에 의해 유도된 3가지 종류의 cytokine의 발현을 전사 수준에서 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다. 이러한 전사 수준에서의 염증성 cytokine의 발현 저하가 cytokine의 생성 억제와 연관성이 있는지의 여부를 조사한 결과, TNF-\(\alpha\)의 생성 억제에 전체 열수 추출물(WERA)이 유의적인 효과를 보였지만, 나머지 파 추출물에 대한 효과는 전사 수준에서의 발현 억제 효과에 비하여 다소 미비하게 나타났다. 이러한 파 추출물의 염증성 cytokine 발현의 전사 수준 억제 효과와 cytokine의 생성 억제 효과가 다소 다르게 나타난 가능성으로 해당 cytokine 유전자들의 전사 후 번역 과정에서의 조절 및 다른 신호 전달계들과의 상호 작용 여부 등을 생각할 수 있겠지만, 파 추출물이 iNOS와 염증성 cytokine의 증가를 억제하는 경향성은 분명하였으며, 4가지의 파 추출물 중에서는 파 전체 에탄올 추출물(EEWA)이 가장 탁월한 항염증 효과를 보였다. 본 연구에서 사용된 파 추출물의 염증 억제 작용에 관한 추가적인 연구의 수행과 활성형 분획의 선별과 후보물질의 동정 등에 관한 연구가 추가로 이루어져야겠지만, 본 연구의 결과는 파 추출물이 CNS의 면역세포인 microglia의 과도한 활성화로 인한 신경염증 작용을 차단함으로써 항염증 효과 및 신경 보호 효과를 지닐 수 있음을 보여 주는 것이다.

Microglia는 중추신경계의 면역세포로, 다양한 약물과 독소에 반응해 이물질을 제거하며 신경세포를 보호하고 항상성을 유지하는 핵심 역할을 한다. 병리학적 관점에서 보면, iNOS와 COX-2는 CNS의 손상 및 질환과 연관된 조직에서 과발현되는데, 이는 특히 신경교증과 파킨슨 병의 흑질 내 글리아 세포에서 동시에 증가하는 현상이다. iNOS와 COX-2를 억제하는 약물이 신경독성에 대한 보호 효과를 보였으며, 이로 인해 iNOS와 COX-2의 발현을 저지하는 것이 신경염증과 신경퇴행성 질환 치료 및 예방에 대한 일반적인 접근법으로 인식되고 있다. 이 연구에서는 파 추출물이 microglia의 과도한 활성화로 인한 신경염증을 차단하고, 따라서 항염증 및 신경 보호 효과를 지니는 가능성을 보여주었다.

결 과 파 추출물의 BV2 세포에 대한 세포독성 여부 다양한 파 추출물이 BV2 세포에 독성을 나타내지 않는 조건에서 항염증효과를 조사하기 위해 준비된 파 추출물을 각각 단독 처리한 후 MTT assay를 먼저 실시하였다. Fig. 1A에 나타난 바와 같이 파 추출물 처리 24시간 후 WEWA, EEWA 및 WERA 처리군에서는 \(250\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)까지, EERA 단독 처리군에서는 \(40\mu\mathrm{g}/\mathrm{ml}\)까지는 BV2 세포가 각각 \(90\%\) 이상의 생존율을 보였으나, 그 이상의 처리 농도에서는 처리 농도 의존적으로 세포독성을 나타내었다. 이상의 결과를 바탕으로 WEWA, EEWA 및 WERA 처리군은 \(250\mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)을, EERA 처리군은 \(40 \mathrm{\mu g}/\mathrm{ml}\)을 최고농도로 선정하여 몇 가지 농도별로 1시간 선처리한 후 LPS \((500\mathrm{ng}/\mathrm{ml})\)를 처리하여 24시간 경과 후에 생존율을 측정하였다. Fig. 1B의 결과에서 알 수 있듯이 각 추출물의 최고 농도와 LPS를 동시에 처리하여도 생존율이 \(90\%\) 이상으로서 BV2 세포에 대한 독성을 나타내지 않았기에 이를 항염증효능 실험 조건으로 선정하였다. LPS로 유도한 BV2 세포의 iNOS 및 COX-2 발현 증가에 미치는 파 추출물의 영향 이상에서 설정된 조건에서 LPS 처리에 의하여 활성화된 BV2 세포에서 파 추출물의 항염증 효과를 조사하기 위하여 LPS에 의해 유도된 대표적인 염증 매개 유전자인 iNOS와 COX-2의 발현에 미치는 파 추출물의 영향을 전사 및 번역 수준에서 조사하였다. 그 결과 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2 유전자의 mRNA 및 단백질 발현이 전체적으로 파 추출물의 처리 농도 의존적으로 감소되었는데, iNOS 발현 억제의 효과는 EEWA 처리군과 EERA 처리군에서 강하게 나타났으며, COX-2 발현의 경우 WEWA 처리군과 EERA 처리군에서 효과적으로 억제시켰음을 알 수 있었다. 아울러 EEWA 처리군은 iNOS의 발현을 현저히 억제한 반면에 COX-2의 억제능은 비교적 낮게 나타났으며, WERA 처리군은 mRNA 수준에서는 두 유전자의 발현을 억제하였으나 단백질수준에서의 억제능은 다소 약하게 나타났다. 따라서 파 추출물의 종류에 따라 정도의 차이는 있지만, 파 추출물이 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제함으로서 항염증효능이 있을 것임을 알 수 있었다. LPS로 유도된 BV2 세포의 \(\mathrm{NO}\) 생성 증가에 미치는 파 추출물의 영향 이상의 결과에서 관찰된 파 추출물의 iNOS 발현 억제 효능이 iNOS의 반응 산물인 \(\mathrm{NO}\)의 생성 억제와 연관되어 있는지의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 파 추출물을 각각 단독 처리하거나 1시간 선처리한 후 LPS를 처리하여 \(\mathrm{NO}\) 생성량을 측정하기 위하여 Griess assay를 실시하였다. 그 결과는 Fig.4 에 나타난 바와 같이 LPS 처리 후 현저히 증가했던 \(\mathrm{NO}\)의 생성량이 파 추출물 처리에 의해 처리 농도 의존적으로 감소되었는데, 특히 EEWA 처리군에서는 거의 대조군 수준까지 감소하여 가장 탁월한 효과를 보였다. 아울러 WEWA와 EERA 처리군은 비슷한 수준의 \(\mathrm{NO}\) 생성 억제 효과를 보였으며, WERA 처리군의 효과가 상대적으로 적게 나타났으며, 이러한 결과들은 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현 억제 수준과 그 경향성이 유사하였다. LPS로 유도된 BV2 세포의 염증성 cytokine 발현 증가에 미치는 파 추출물의 영향 다음은 microglia가 활성화되었을 때 분비되는 대표적인 염증성 cytokine인 TNF-\(\alpha\), IL-1\(\beta\) 및 IL-6의 발현에 미치는 파 추출물의 영향을 조사하였다. Fig. 5 의 결과에서 알 수 있듯이 LPS 처리에 의하여 조사된 3 가지 cytokine의 발현이 전사 수준에서 모두 증가되었으나, 파 추출물 처리에 의하여 전체적으로 감소되는 경향성을 보였다. 특히 IL-1가 4 가지 파 추출물 처리에 의해 3 가지 유전자의 발현을 가장 현저하게 감소시켰으며, IL-6은 파 뿌리 추출물인 WERA와 EERA에 의해서만 감소하는 경향을 보였다. 그리고 TNF-a 발현의 경우 WEWA 처리군에서 약간 감소하였으며, 다른 파 추출물에 의해서 억제되는 효과가 약하게 나타났다. 그러나 전반적으로 LPS로 유도된 전구염증 cytokine의 mRNA 수준을 억제하는 경향을 보여 파 추출물이 iNOS 및 COX-2와 함께 cytokine들의 발현 억제를 통하여 염증반응을 억제할 수 있을 가능성을 보여주었다. LPS에 의하여 증가된 BV2 세포의 TNF-\(\alpha\) 및 lL-6 생성에 미치는 파 추출물의 영향 Fig. 5 에서 관찰된 파 추출물의 염증성 cytokine의 발현 억제 효과가 cytokine의 생성 억제 효과와 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 동일 조건에서 배양된 BV2 세포에서의 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 양적 변화를 조사하였다. 먼저 TNF-\(\alpha\) 생성의 경우, Fig. 5A에 나타낸 바와 같이 LPS 처리에 의하여 증가된 TNF-\(\alpha\) 생성이 EEWA 처리에 의하여 유의적인 감소를 보였고, WEWA와 EERA 처리군에서도 TNF-\(\alpha\) 생성량을 다소 감소되었으나 통계적으로 유의할 수준은 아니었다. IL-6의 경우도 LPS 단독 처리에 의하여 매우 증가되었으며, 파 추출물의 처리에 의하여 부분적으로 감소되었으나 통계적으로 유의한 수준은 아니었다. 이들 결과는 Fig. 5 에서 보여준 TNF-\(\alpha\) 와 IL-6의 mRNA 발현 변화와는 다소 차이가 있었음을 알 수 있었는데, EERA 처리군에서 TNF-\(\alpha\)의 mRNA는 큰 변화가 없었으나 실제 TNF-\(\alpha\)의 생성은 감소하였다는 점과, WERA 처리군에서 IL-6의 mRNA 수준은 감소하였으나 실제 IL-6의 생성은 오히려 다소 증가하였다는 점 등이다. 이들은 유전자의 발현 과정에서 전사 후 번역 과정이나 번역 후 조절 과정에서 변화가 생겼을 것으로 추측되며, 이에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

파 추출물이 독성을 나타내지 않는 조건에서 준비된 파 추출물을 각각 단독으로 처리한 후 MTT assay를 항염증효과를 조사하기 위하여 우선적으로 실험을 수행하였다. 각 추출물의 최고 농도와 LPS를 동시에 처리한 결과, 생존율이 \(90\%\) 이상으로서 BV2 세포에 대한 독성을 나타내지 않았기 때문에 이를 항염증효능 실험 조건으로 선정하였는데 이를 통하여 파 추출물이 iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제하면서 항염증효능이 있을 것임을 알 수 있었다. 또한, WEWA와 EERA 처리군은 비슷한 수준의 \(\mathrm{NO}\) 생성 억제 효과를 보였으며, WERA 처리군의 효과가 상대적으로 적게 나타났으며, 이러한 결과들은 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현 억제 수준과 그 경향성이 유사하였는데, 전사 후 번역 과정과 번역 후 조절 과정에서 유전자의 발현 과정에서의 변화가 생겼을 것으로 예상되어지며, 이에 대하여 지속적으로 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료되어진다.

재료 및 방법 실험 재료 본 실험에 사용된 파(A. fistulosum) 추출물은 인제대학교 식품영양학과에서 공급받았으며, 세포 배양에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. mRNA 발현 분석을 위해 사용된 primer (Bioneer, Taejeon, Korea)는 Table 1에 표기하였으며, 단백질 발현 분석에 쓰인 모든 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 사용하였고, anti-rabbit 및 anti-mouse 2차 항체는 Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. 별도 표기하지 않은 모든 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 세포 배양 본 실험에 사용된 BV2 세포는 인제대학교 의과대학 면역학 교실로부터 제공받아, DMEM 배지에 \(10\%\mathrm{FBS}\)와 \(1\%\) penicillin-streptomycin을 첨가하여 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \( 5\% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 배양하였다. 모든 실험에서 BV2 세포는 다양한 파 추출물을 각각 1시간 선처리한 후 LPS \((500\mathrm{ng/ml})\)를 처리하여 24시간 배양하였다. MTT assay에 의한 세포독성 조사 세포 배양용 6 well plate에 BV2 세포를 \(6\times 10^{5}\mathrm{cells/well}\)로 분주하여 24시간 안정화시킨 후, 파 전체 열수 추출물(water extract from the whole A. fistulosum, WEWA), 파 전체 에탄올 추출물(ethanol extract from the whole A. fistulosum, EEWA), 파 뿌리 열수 추출물(water extract from the root of A. fistulosum, WERA) 및 파 뿌리 에탄올 추출물(ethanol extract from the root of A. fistulosum, EERA)을 각각 농도별로 1시간 선처리 후 LPS를 후처리하여 24시간 배양하였다. 그 후 배지를 모두 제거하고, tetrazolium bromide salt (MTT)를 \(0.5\mathrm{mg/ml}\) 농도로 희석하여 well 당 \(1\mathrm{ml}\) 씩 분주하였다. 2시간 배양 후 상층액을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO)로 formazin을 모두 용해시켜 96 well plate에 \(200\mathrm{\mu l}\) 씩 옮긴 다음 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 흡광도를 측정하였다. RT-PCR에 의한 mRNA의 분석 상기와 동일 조건에서 배양된 세포를 모아서 TRIzol re-agent (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)에 lysis 시켜 total RNA를 분리하고, 정량을 통해 동량의 RNA를 준비한 후 iNOS, COX-2, TNF-\(\alpha\), IL-\(1\beta\), IL-6 및 glyceraldhyde-3-phos-phate dehydrogenase (GAPDH)의 primer, EPC water, ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 각각 혼합하여 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)로 증폭시켰다. 그 후 \(1\%\) agarose gel에 ethidium bromide (EtBr)를 첨가하여 굳힌 다음, 각 sample을 동량 loading하여 \(100\mathrm{~V}\)에서 전기영동시킨 후, UV 하에서 mRNA 발현의 차이를 비교하였다. Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석 준비된 세포들을 모아서 lysis buffer [\(25 \mathrm{mM}\) Tris-Cl (\(\mathrm{pH} 7.5\), \(250\mathrm{mM}\) \(\mathrm{NaCl}\), \(5\mathrm{mM}\) EDTA, \(1\%\) NP-40, \(1\mathrm{~mM}\) pheny-methylsulfonyl fluoride (PMSF), \(5\mathrm{~mM} \) dithiothreitol (DTT)]에 1시간 가량 lysis시켰다. 그 후 Bio-rad 단백질 정량 시약과 그 사용방법을 따라 정량 후, Laemmli sample buffer (Bio-rad)를 동량으로 섞어 SDS-polyacrylamide gel에 loading한 후 \(90\mathrm{~V}\)로 전기영동으로 분리하고, electroblotting을 통해 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)에 옮긴 다음, \(5\%\) skim milk로 1시간 동안 blocking하고 \(4^{\circ} \mathrm{C}\)에서 1차 항체를 붙여 1시간 이상 반응시켰다. 그 후 PBS-T로 수차례 세척하고 상온에서 1시간 동안 2차 항체를 붙인 후 다시 PBS-T로 세척하고 암실에서 Enhanced Chemilunimoecence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp.)에 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켰다. NO의 측정 Griess assay를 통하여 \(\mathrm{NO}\) 생성량을 측정하였다. 이를 위해 세포 배양용 6 well plate에 상기한 방식으로 세포를 배양한 후, 각 well에서 상층액을 \(100\mathrm{\mu l} \)씩 회수하여 각각 Griess reagent [\(1\%\) sulfanilamide, \(0.1\%\) N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride, \(2.5 \%\) \(\mathrm{H}_{3}\mathrm{PO}_{4}\)] \(100\mathrm{\mu l}\)와 혼합하여 96 well plate에 분주하였다. ELISA reader \((540\mathrm{~nm})\)를 사용하여 흡광도를 측정한 후, sodium nitrite \((\mathrm{NaNO}_{2})\)의 standard curve를 바탕으로 \(\mathrm{NO}\) 농도를 계산하였다. Cytokine의 측정 세포 배양용 6 well plate에 상기한 방식으로 세포를 배양한 후, 각 well에서 상층액을 회수하였다. 상층액 내 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 양은 각각 R&D System Inc (Minneapolis, MN, USA)에서 구입한 Fluorokine MAP Mouse IL-6 kit와 Fluorokine MAP Mouse TNF-\(\alpha\) kit를 사용하여 제시된 방법에 따라 처리한 다음, ELISA reader로 흡광도를 측정한 후 standard curve를 바탕으로 TNF-\(\alpha\)와 IL-6의 생성량을 계산하였다. 통계 처리 모든 실험결과는 평균\(\pm\)표준편차로 표시하였고 SigmaPlot을 이용하여 Student \(t\)-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.

BV2 세포를 \(37^{\circ}\mathrm{C}\), \( 5\% \mathrm{~CO}_{2} \) 조건에서 DMEM 배지에 \(10\%\mathrm{FBS}\)와 \(1\%\) penicillin-streptomycin을 첨가하여 배양하고, LPS \((500\mathrm{ng/ml})\)를 처리하여 24시간 배양하여 mRNA 발현 분석과 단백질 발현 분석을 수행하였다. MTT assay에 의한 세포독성 조사, RT-PCR에 의한 mRNA의 분석, Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석, NO 농도 및 Cytokine를 측정하였다.

서 론 최근 우리나라는 생활의 변화로 동물성 포화지방, 고칼로리 식품의 섭취 등 지방 섭취량이 증가함에 따라 고콜레스테롤, 성인병, 동맥경화, 고혈압 등 순환기계 질환이 점차 증가되고 있는 추세다. 뿐만 아니라 순환기계 질환이 한국인 사망원인의 30% 이상을 차지하고, 주요 위험인자인 고지혈증 또한 빠른 속도로 증가하고 있으며, 심혈관계 질환에서는 혈중 콜레스테롤, 중성 지질의 증가 및 지단백 함량의 변화와 같은 비정상적인 지질대사가 문제시 되고 있다. 질환의 발병 원인은 지질대사 이상으로 나타나게 되는데, 그중에서 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 뿐만 아니라 고 탄수화물식이로 인한 당질유도성 고 중성지질혈증(hypertriglyceridemia)으로 유발된다는 보고가 있다. 혈중 콜레스테롤의 농도 조절은 콜레스테롤의 흡수, 생합성, 담즙산으로의 합성과 배설, 조직으로의 분배 등 복합적인 기전들의 상호작용에 의하여 이루어진다.식사로부터 섭취된 콜레스테롤은 간으로 운반된 후 일부는 담즙산을 형성하며 담즙산은 소장으로 분비되어 지방을 유화시켜 소화를 촉진하고 다시 간으로 흡수되는 장간순화를 하며, 또한, 지방 분해산물과 콜레스테롤의 유화 는 담즙산의 생리적 기전이며, 이 담즙산 pool은 담즙산의 장간 재순환과 콜레스테롤 전구체로부터 담즙산의 합성에 의해 만들어진다. 이는 담즙산이 콜레스테롤로부터 합성되는 물질로서 체내 콜레스테롤이 체외로 배설되는 유일한 경로이다. 콜레스테롤 대사 과정 가운데 간의 콜레스테롤을 제거하기 위한 담즙합성을 위해 포합 빌리루빈 및 UDP-glucuronyl transferase (UDP-GT) 활성이 증가되고 콜레스테롤의 이용을 증가시켜 조직과 혈중의 콜레스테롤을 저하시키는 기능으로 본다. 울금(Curcuma longa L, tumeric)은 우리나라에서 예로부터 고지혈증의 민간요법에 쓰이는 약재로, 원산지는 인도, 중국 및 일본 등으로 생강과의 다년초로서 고온다습한 남부 아시아, 아프리카 및 중남미에 자생하고 있다. 울금의 대표적인 성분인 커큐민(curcumin)은 고지혈 모델에서 담즙분비 촉진을 통하여 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키는 것으로 보고되었다. 최근 울금에 대한 여러 연구가 활발히 이루어지고 있는데 이와 관련된 보고로는 명일엽과 울금 추출물의 투여가 고콜레스테롤 식이와 P-407로 유도한 고지혈증쥐의 혈중 지질대사 효과가 우수함을 보고 하였으며, 발효울금의 투여가 마우스의 간 기능 및 혈중 지질함량에 혈중지질을 효과적으로 개선하였다는 연구 등이 보고되고 있다. 또한, 울금의 활성 성분인 커큐민은 콜레스테롤 수치를 감소시키며, 담즙분비를 촉진시키고, 콜레스테롤의 생합성에 관여하는 squalene synthase 억제작용 및 간에 축적된 콜레스테롤 수치를 저하시킨다고 알려졌으나, 울금과 관련되어 UDP-glucuronyl transferase (UDP-GT) 활성과 담즙산의 함량에 관한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 울금의 지질대사 개선효과를 입증하고자 고지방 및 고콜레스테롤 식이를 공급한 흰쥐에게 울금 분말을 공급한 후, 체내 혈청 및 분변에서의 지질 함량, 간조직의 UDP-glucuronyl tranferase 활성 및 bile acid 함량 측정을 통하여 울금의 지질대사 효과를 규명하고자 하였다.

동물성 포화지방과 고칼로리 식품 섭취 증가로 인해 우리나라의 순환기계 질환 유병률이 증가하는 가운데, 혈중 콜레스테롤 농도는 복합적인 기작을 통해 조절된다. 이 중 간에서 콜레스테롤을 제거하는 과정인 담즙합성은 포합 빌리루빈 및 UDP-GT 활성 증가와 연결되어 있다. 본 연구는 고지방 및 고콜레스테롤 식이를 섭취하는 흰쥐에게 울금 분말을 공급하여, 울금의 지질대사 효과를 조사하였다. 조사는 혈청 및 분변에서의 지질 함량, 간조직의 UDP-GT 활성 및 담즙산 함량 측정을 통해 이루어졌다.

간조직의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 측정 간조직의 지질성분을 관찰한 결과는 Table 4와 같다. 간조직의 총 지질함량을 관찰한 결과 고지방 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말 공급군 모두에서 감소하였고, 특히 TPB군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 중성지질의 함량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였고, 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말 공급군 모두에서 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 콜레스테롤 함량에서 는 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 감소하였고, 울금 분말을 공급한 모든군에서는 고지방 · 고콜레스테롤에 비해 감소하였으나 유의적인 차이는 없었다. 일반적으로 지방 또는 콜레스테를의 섭취에 의해 간 조직에서 지질대사의 이상이 초래되어 지질의 침착에 의해 간의 무게가 증가하고 간에서의 지질과 콜레스테롤 함량이 증가한다는 여러 연구에서와 같이 고지방 · 고콜레스테롤로 유도된 비만 쥐에서 울금 분말의 공급은 지질의 흡수를 지연 시키거나 억제하여 지질대사의 개선에 효과적으로 작용했을 것으로 사료되어진다. 분변의 총콜레스테롤 및 중성지방 함량 Table 5는 분변의 총콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 나타낸 결과이다. 분변의 총 콜레스테롤 함량은 고지방 · 고콜레스테롤에서에 비해 울금 분말을 공급한 군에서는 증가되 었으나 그 차이는 다소 적었다. 중성지방의 함량 또한 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 증가되었고, 울금 분말을 공급한 군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적이지는 않았지만 증가하는 경향을 보였다. 울금에 함유된 식이섬유는 소장에서 콜레스테롤과 담즙산의 재흡수를 저해하는데 식이섬유가 소화기에서 콜레스테롤 및 담즙산과 직접 결합하므로써 흡수가 억제되어 분변으로의 배설이 증가된다고 밝혀진 바 있다. 이와 같이 울금 분말을 공급함 으로서 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 변으로서의 중성지질의 배설량이 증가하는 것을 볼 때 체내의 지질지하 효능이 있을 것으로 추측된다. 혈청 중의 total bile acid 함량 체내 콜레스테롤 대사의 최종 산물인 담즙산 함량을 측정한 결과 Fig. 1과 같다. 혈청 중의 담즙산 농도가 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말을 공급한 TPA, TPB 군에서 유의적으로 증가하였으며, 이러한 효과는 울금 5% 를 공급한 TPB 군에서 현저하였다. 이는 Cha 등의 연구에서 함초에 다량 함유된 식이섬유에 의해 콜레스테롤로부터 간 내의 콜레스테롤로부터 담즙산의 합성을 증가시켜 혈중으로 분비를 증가시킨 연구와 비슷한 경향을 보였다. 울금 또한 다량의 식이섬유의 작용에 의하며 혈중으로 담즙산의 분비를 증가시킨 것으로 추측된다. 간의 UDP-glucuronyl transferase 활성 UDP-glucuronyl transferase는 UDP-glucuronic acid를 glucuronic acid로 전환 촉매하는 내인성, 외인성 화합물의 해독기전에 중요한 효소로 담즙합성에 풜요한 황색 담즙 색소인 bilirubin의 생성에 관여한다. 간의 담즙대사와 관련된 glucuronidation율을 알아보기 위헤 UDP-glucuronyl transferase (UDP-GT) 활성을 관찰한 결과는 Fig. 2 와 같다. 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 증가되었고, 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말을 공급한 TPA군과 TPB군에서 증가되었다. 특히 울금 분말 5%를 공급한 TPB 군은 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적으로 증가되어 가장 높은 활성을 나타내었다. Song 등의 연구에서는 폴리페놀의 함량이 뛰어난 고추씨 에탄올 추출물의 섭취로 인해 고지방 · 고콜레스테롤 식이로 증가된 콜레스테롤을 감소시킨 연구와 비 슷한 경향을 보였다. 이는 울금 또한 폴리페놀 함량이 뛰어나다는 Jang의 연구결과와 유사함을 알 수 있었다. 따라서 울금 파우더를 공급함으로써 간에 증가된 콜레스테롤을 제거하기 위해 담즙합성을 위한 UDP-GT의 활성이 증가되었을 것으로 판단된다.

간조직의 지질성분 관찰 결과, 울금 분말 공급군에서 총 지질함량이 고지방 고콜레스테롤 군에 비해 감소하였다. 특히 TPB군에서는 더욱 감소하였다. 이는 울금 분말이 지질 흡수를 억제하여 지질대사를 개선하며, 중성지질의 배설량 증가를 통해 지질지하 효능을 갖는 것으로 파악된다. 또한, 울금 분말 공급으로 인해 혈청 중 담즙산 농도가 증가하였으며, 이는 울금이 폴리페놀을 풍부하게 함유하고 있음을 반영한다. 즉, 울금 파우더 공급이 간의 콜레스테롤 제거와 담즙 합성을 촉진한다.

혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, \( \mathrm { HDL } \)-콜레스테롤, \( \mathrm { LDL } \) 콜레스테롤의 함량과 동맥경화지수(atherogenic index, Al) 측정 혈청 내 중성지방 함량은 표준 효소법에 의한 kit (Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 \(550\mathrm{nm}\)에서 홉광도를 측정하여 계산하였다. 총콜레스테롤 함량은 표준 효소법에 의한 kit(Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 \(500\mathrm{nm}\) 에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 HDL-콜레스테롤 함량은 \(2\%\) dextron sulfate 용액과 \(1\mathrm{M}\) 의 \( \mathrm { MgCl } _ { 2 } \) 침전액을 1:1로 혼합하여 \(12,000\mathrm{rpm}\)에서 8 분간 원심분리하여 그 상층액을 표준 효소법에 의한 kit (Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 사용하여 (500\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하여 함량을 계산하였다. 혈청 LDL-콜레스테롤 함량은 Friedewald의 계산법으로, 혈청 동맥경화지 수(AI)는 Fiordaliso의 계산법으로 각각 산출하였다. 간조직의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량 측정 간조직의 총지질의 함량은 Folch 등의 방법에 의해 추출하여 정량하였고, 간조직 지질의 정량에서는 Sale 등의 수정된 방법으로 측정하였다. 중성지방과 콜레스테롤 측정용 효소시액에 유화제로서 \(0.5\%\) Triton X-100과 \(3\mathrm{nM}\) sodium cholate를 혼합하여 발색 시 일어나는 탁도(turbidity)를 제거하여 간조직의 triglyceride와 cholesterol 농도를 \(550\mathrm{nm}\)와 \(500\mathrm{nm}\)에서 각각 흡광도를 측정하였다. 분변의 총콜레스테롤과 중성지질 함량 측정 실험 전 마지막 3일간의 변의 wet 무게를 측정한 후 동결건조기 (\(-70\mathrm{°C}\)) 에서 함량에 도달할 때까지 냉동 건조시킨 뒤 건조 중량을 측정하여 변 중의 수분함량을 계산하였다. 변의 총 지질 배설량은 Folch 등의 방법에 의해 정량하였고, 콜레스테롤은 Pearson 등의 방법에 의해 \(550\mathrm{nm}\)에서 정량하였다. 혈청 중의 total bile acid 농도 측정 혈중 total bile acid (TBA) 농도 측정은 rat total bile acid elisa kit (Cusabio, USA)를 이용하여 FLUO star OPTIMA 제품의 BMG LABTECH ELISA reader 장비로 측정하였다. 간의 UDP-glucuronyl transferase 활성 측정 간 microsome 에서 UDP-glucuronyl transferase 활성도는 Reinke 등의 방법으로 측정하였다. 시험관에 working substrate용액(\(0.05\mathrm{M}\) phosphate buffer (\(\mathrm{pH}\) 7.0) \(3\mathrm{mL}\), \(15\mathrm{mM}\) UDP-glucuronic acid \(1\mathrm{ mL}\), \(10\mathrm{ mM}\) \( \mathrm { MgCl } 2 \cdot \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 1ml, 0.2% bovin albumin \(1\mathrm{ mL}\), \(0.5\%\)(v/v) Triton X-100 \(1\mathrm{ ml}\)) \(0.8\mathrm{ mL}\)을 가하여 3분간 preincubation 시킨 후 0.15 M KCl로 현탁시킨 micosome 시료와 증류수 \(0.2\mathrm{ mL}\)를 가하여 37℃에서 20 분간 반응시킨다. 그 후 0.3 N perchloric acid \(0.5\mathrm{ mL}\)를 가하여 \(2000\mathrm{rpm}\)에서 15 분간 원심분리하여 상층액 \(0.5\mathrm{ ml}\)를 취하여 1.6 M glycine buffer (\(\mathrm{pH}\) 10.3) \(2\mathrm{ mL}\)를 가하여 \(436\mathrm{ nm}\)에서 흡광도를 측정하였다.

혈청 내 중성지방, 총콜레스테롤, \( \mathrm { HDL } \)-콜레스테롤, \( \mathrm { LDL } \) 콜레스테롤 함량과 동맥경화지수(AI)를 측정하기 위해 효소법을 사용하여 kit (Asan Co., Gyeonggi, Korea)를 이용하여 \(550\mathrm{nm}\) 과 \(500\mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하고, 간조직의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량은 Folch 등의 방법과 Sale 등의 수정된 방법으로 측정하고, 변의 총 지질 배설량은 Pearson 등의 방법으로 정량하고, 혈중 total bile acid 농도는 rat total bile acid elisa kit 를 이용하여 FLUO star OPTIMA 제품의 BMG LABTECH ELISA reader 장비로 측정하였다.

재료 및 방법 울금 추출물 분말 제조 본 연구에 사용한 울금은 진도에서 제공받아 열풍건조기를 이용하여 85~80℃로 건조하였다. 울금은 분쇄기(대성파워 믹 서/분쇄기DA-280G, Seoul, Korea)로 분쇄한 울금 당 중량대비 6 배에 해당하는 증류수(w/v)를 가하여 95℃에서 24시간 추출한 후, 위와 같은 조건으로 3회 반복하고 상등액을 모아 여과지(Whatman No. 1)로 여과하였다. 여과한 여액은 rotary vacuum evaporator (HS-2001N, Hanshin Science CO. Korea)를 사용하여 감압 농축하고, 동결건조기(Bondiro, Ilshin, Korea)로 건조하여 사용하였다(각각의 추출물에 대한 수율은 추출 전의 시료 무게에 대한 동결 건조 후 추출물의 무게를 측정하여 나타내었음). 본 연구에서 사용한 울금 분말은 추훌 한 후 동결건조시켜 조제하였다. 실험동물 사육 및 식이조성 본 실험에 사용된 동물은 체중 \( 100 \pm 10 \mathrm { ~g } \) 내외의 Sprague-Dawley 종 수컷을 (주)바이오 제노믹스사(Bio genomics, Inc., Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험 식이 시작 전 일주일간 일반배합사료(Purina Co., Seoul, Korea)로 예비사육한 후 평균체중이 유사하도록 난괴법 (randomized complete block design)에 의해 대조군과 실헙 군으로 나눈 후 Table 1 과 같이 나누어 4 주간 사육하였다. 실험기간 중 식이는 4℃ 에서 보관하였으며, 매일 일정 시간 에 공급하여 자유로이 섭취하게 하였다. 사육실의 온도는 \( 22 \pm 2℃ \), 상대습도 \( 50 \pm 10 \% \) 를 유지하였다. 식이 group은 정상군(N group)과 (1%) 고지방 · 고콜레스테롤 식이 실험군으 로 나눈 후 고지방 · 고콜레스테롤 실험군은 고지방 · 고콜 레스테롤 대조군(HF group), 고지방 · 고콜례스테롤식이 + 2.5% 울금분말 공급군(TPA group), 고지방 · 고콜레스테롤 + 5% 울금분말 공급군(TPB group)으로, 군당 10 마리로 총 4군으로 나누어 사육하였다. 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율 식이섭취량은 전 실험기간동안 매일 일정시간에 측정하였 으며, 체중은 3일에 한 번씩 일정시간에 측정하였다. 식이효율(food efficiency ratio, FER)은 전 체중증가량을 같은 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어 줌으로 계산하였다. 혈액 및 장기의 채취 사육기간 완료 후 실험동물을 12 시간 절식시키고 가벼운 ether 마취 하에서 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 그 후 즉시 간을 채취하여 생리식염수로 헹군 다음 거즈로 수분을 제거하고 무게를 측정한 후 액체질소로 급속 동결시켜 -80℃ 에 보관하였다. 분변수집 및 배설량 측정 실험기간 중 4 주째에 3 일간 대사 cage에서 분변을 수집하여 건조전의 무게를 칭량하였다. 분변은 -70℃ 급속냉동실에서 항량에 달할 때까지 건조시킨 다음 건조중량을 칭량한 후 분변 sterol 측정 시까지 -80% 냉동고에 보관하였다.

울금을 열풍건조기로 건조하고 분쇄기로 분쇄하여 증류수로 추출하고, rotary vacuum evaporator로 감압 농축하고 동결건조기로 건조하여 사용하였다. 또한 Sprague-Dawley 종 수컷을 난괴법에 의해 대조군과 실헙군으로 나누어 4주간 사육하고, 12시간 절식 후 ether 마취하에 복부대동맥으로부터 혈액과 간을 채취하여 동결시켜 -80\(^\circ \mathrm{C}\)에 보관하였다.

통계처리 모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험군 별로 평균값의 차이가 있는가를 검증하기위해 분산분석(ANOVA 검증)을 수행하였으며 분산분석결과 유의성이 발견된 경우 Tukey's HSD test에 의해 군 간의 유의도를 분석하였다. 결과 및 고찰 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율 울금 분말의 농도별 실험에서 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율을 관찰한 결과는 Table 2와 같다. 체중증가량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였으나, 울금 분말을 공급한 군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 유의적이지는 않았으나 체중이 감소하는 경향을 보였다. 식이섭취량에서는 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 증가하였고, 식이효율 또한 유사한 경향을 나타내었다. Kim 등의 보고에 의하면 울금군과 복합조성물 투여군에서 식이 섭취의 감소가 나타났는데, 이는 울금 특유의 향미 성분이 실험동물의 식욕에 영향을 주었을 가능성이 있는 것으로 보인다고 보고하였다. 따라서 본 실험 결과도 위의 보고와 비슷한 경향으로 울금의 향미성분 때문에 체중감소의 효과가 나타난 것으로 사료된다. 혈중의 중성지질 함량, 총콜레스테롤, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol 및 동맥경화지수(Al) 혈중의 총콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 총콜레스테롤 함량은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였다. 울금 분말을 공급한 모든 군에서 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 모두 감소 하였고, 특히 TPB 군에서 유의적으로 감소하는 경향을 보였다. 중성지질 또한 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군은 유의적으로 증가되었고, 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 울금 분말 공급군 모두가 유의적으로 감소하였다. 울금의 대표적인 성분인 커큐민은 고지혈 모델에서 담즙분비 촉진을 통하여 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키는 것으로 보고 되어있다. 이러한 결과를 볼 때, 울금 분말의 공급이 혈중의 콜레스테롤을 저하시키고 중성지질의 농도를 저하시키는데 병향을 미치는 것으로 사료된다. Yun 등의 연구에서는 명일엽과 울금 추출물의 섭취는 혈중지질을 바람직한 방향으로 변화시켜 심혈관 질환의 예방에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다고 보고하였다. 또한 울금 및 발효울금이 혈중지질을 효과적으로 개선하였다는 Kang 등의 보고와도 유사함을 알 수 있었다. HDL-cholesterol 수준을 분석한 결과(Table 3), HDL 콜레스테롤은 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 감소하였고, 울금 분말 공급군에서는 고지방 · 고콜레스테롤 군에 비해 증가하였지만 유의적인 차이는 보이지 않았다. 반면, LDL-cholesterol은(Table 3) 고지방 · 고콜레스테롤에서 정상군에 비해 유의적으로 증가하였으나, 울금 분말 공급군에서는 고지방 · 고콜레스테롤에 비해 유의적인 차이는 없었지만 감소하는 경향을 보였다. 또한 동맥경화지수(AI)(Table 3)에서는 정상군에 비해 고지방 · 고콜레스테롤에서 유의적으로 증가되었으며 울금 분말을 공급한 모든 군에서 유의적이지는 않았지만 감소하는 경향을 보였다. LDL-cholesterol은 헐청 중 콜레스테롤의 주된 운반형태로 동맥 내 혈관 벽에 콜레스테롤을 축적하여 동맥경화증과 심혈관계질환의 발병에 중요한 위험인자로 알려져 있다. 그러나 본 연구에서는 울금 분말을 5% 투여한 TPB 군에서는 총 콜레스테롤 감소에 비해 LDL-cholesterol 수치가 감소하는 경향을 나타내었다. Kang 등에서도 발효울금의 경우 총 콜레스테콜 및 LDL-cholesterol을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라 HDL-cholesterol을 효과직으로 증가시켜 혈중 지질 함량의 개선효과가 뛰어난 것으로 보고되었고, Sin과 Han의 연구에서는 혈청 콜레스테롤 농도가 혈소판 웅집을 억제함으로써 동맥경화증을 예방 할 수 있다고 보고하였다. 본 실험의 결과에서도 울금 분말을 공급함으로 인해 지질 함량이 감소하는 것으로 보아 고지방 · 고콜레스테롤 식이에 의한 혈중의 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관계의 질환의 발병을 낮추는데 효과가 있을 것으로 판단된다.

본 논문은 모든 실험결과를 분산분석을 통해 각 실험군 별로 평균값의 차이가 있는지 검증하였고, Tukey's HSD test를 통해 군 간의 유의도를 분석한 결과 울금 분말의 농도별 실험에서 체중증가량, 식이섭취량 및 식이효율이 고지방 및 고콜레스테롤 군에서 유의적으로 증가하였다. 또한 울금 공급에 의해 단백질의 효소분해가 억제되어 식이 섭취가 감소하는 것으로 추정되었다. 혈중의 총콜레스테롤 및 중성지질의 함량을 분석한 결과 울금 분말을 공급해 지질 함량이 감소하는 것으로 보아 고지방, 고콜레스테롤 식이에 의한 혈중의 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관계의 질환을 개선하는데 효과가 있을 것으로 보인다.

형질전환 공동배양을 위해 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척한 Agrobacterium tumefaciens 현탁액에 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \times 0.3 \mathrm { ~cm } \) 크기로 자른 잎 절편을 넣고 10 분간 공동배양 한 후 잎 절편을 멸균된 여과지에서 10 분간 건조 시겼다. 건조된 잎 절편을 공동배양배지에서 (MS, sucrose 3 \%,2 mg/L 2,4-D) 2일간 배양한 후 재분화 선발배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { NAA } , 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } ) \) 로 옮기고 8주간 배양하여 신초를 형성시켰다. 형성된 신초는 PCR로 \( \operatorname { merB } \) 유전자를 확인하고 유전자가 확인된 신초돌만 뿌리 유도배지(1/2 MS, sucrose \( 1 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { IBA } \) 에 이식하여 발근시켰다. 유전자 발현 확인 항생제가 포함된 선발배지에서 자라는 식물체에 \( \operatorname { merB } \) 유전자가 도입되어 발현되는지 확인하기 위하여 PCR과 northern blot analysis를 실시하였다. 발근된 까마중 식물체의 어린잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. PCR 조선은 I단계: \( 95 ^ {\circ } \mathrm { C } 2 \) 분, 2 단계: \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } 20 \) 초, 3단계: \( 58 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 40초, 4 단계: 7 \( 2 ^ {\circ } \mathrm { C } 80 \) 초, 5 단계: \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } 10 \) 분이며, 2, 3, 4단계가 34 번 반복되도록 하였다. PCR 반응에 사용된 merB 유전자의 primer는 merB-F: 5'-CGT CGA GGA AGT TAA GCA AGT CC-3', merB-R: 5'-AAC GCT CGA CTC AGG GTG TTG G-3'을 사용하였다. PCR 산물은 \( 1 \% \) 아가로스 겔에 로딩 (loading)하여 merB 유전자 증폭 밴드 유무를 확인하였다. 또한 RNA발현을 확인하기위하여 충 RNA를 추출하여 정량한 RNA \( 30 \mu \mathrm { g } \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde 겔에 전기영동하여 나일론 membrane (Schleicher \& Schuell, Japan)으로 전이시켰다 (Turbo blotter system, Schleicher \& Schuell). 전이된 RNA를 고정시키기 위하여 UV crosslink \( \left (1200 \times \mu / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 를 2 회 실시하고 이 membrane을 DIG easy hybridization solution (Roche, Germany)으로 6 \( 8 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 1시간 정도 pre-hybridization 한 다음 PCR Dig Labeling Mix (Roche)와 제공된 제작방법에 따라 만든 probe로 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 6 시간 이상 hybridization시켰다. Membrane을 \( 2 \times \mathrm { SSC } , 0.1 \% \) SDS-buffer로 세척한 다음 Dig detection kit(Roche)와 제공된 방법으로 NBT/BCIP에 의한 발색 정도를 관찰하였다.

까마중 식물체의 잎 절편을 건조한 후 공동배양배지에서 2일간 배양한 후 재분화 선발배지로 옮겨 8주간 배양해 신초를 형성시켰다. 형성된 신초는 \( \operatorname { merB } \) 유전자가 확인된 신초들만 뿌리 유도 배지로 이식해 발근시켰고, 발근된 까마중 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 추출해 \( \operatorname { merB } \) 유전자 증폭 밴드 유무를 확인했다. 또한 RNA 발현을 확인하기 위해 RNA를 추출해 RNA \( 30 \mu \mathrm { g } \) 을 \( 1 \% \) formaldehyde 겔에 전기영동하여 나일론 membrane으로 전이하여 NBT/BCIP에 의한 발색 정도를 관찰했다.

결과 및 고찰 형질전환체 육성 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가연구를 위한 형질전환 식물체를 선발하기위하여 유기수은을 무기수은으로 전환시켜서 독성을 저감시키는 organomercurial lyase 유전자 \( ( \operatorname { merB } ) \) 를 까마중에 도입하여 형질전환하였다. Agrobacterium 과 공동배양한 까마중 잎 절편을 2,4-D \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 가 첨가된 동시배양 배지에서 2일간 배양한 후 항생제가 첨가된 선발배지로 옮기는 것이 공동배양한 후 잎 절편을 곧바로 항생제가 첨가된 배지로 옮기는 것보다 캘러스 (callus) 생성과 재분화가 빠르게 일어났나. 이것은 \( 2,4- \mathrm { D } \) 가 식물체의 상처부위에서 체세포배 (somatic embryo)를 유다.하여 캘러스가 왕성하게 유도된 것으로 사료된다. 이러한 결과는 Choi 등 (1996)이 감자 (Solanum tuberosum)의 잎 절편을 2,4-D \( 2 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 가 첨가된 동시배양 배지에서 2일간 배양한 후 선발배지로 옮기는 것이 효과적이라는 보고와 같았다. 또한 배양한 Agrobacterium 균주를 원심 분리하여 배양액을 버리고 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척하여 잎 절편과 공동 배양한 것이 비세척 시보다 2 배정도 많은 형질전환 신초가 형성되었다. 이는 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 이 식물체 잎 조각 상처조직의 삼투압을 조절하면서 Agrobacterium의 감염성을 유지시키는 역할을 했기 때문인 것으로 보고 있으며, Choi 등 (2005)도 포플러의 잎 절편 형질전환 시 Agrobacterium 균주를 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척하는 것이 효과적이라고 보고한 바 있다. 재분화 선발배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) NAA, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } \) 로 읆긴 잎 절편은 1 주일 후 캘러스가 형성되기 시작하여 3주후부터 신초가 재분화되기 시작하였다 (Fig. 1A, B). 재분화된 신초로부터 뿌리를 형성하는데는 \( 1 / 2 \mathrm { MS } \) 와 sucrose를 \( 1 \% \) 고 낮춘 배지가 효과적이었다 (Fig. \( 1 \mathrm { C } \) ). 발근된 까-마중을 지피포트에 옮겨 순화시킨 후 온실의 큰 포트로 이식하고 약 3개월 동안 생육시킨 후 종자를 수확하였다 (Fig. ID, E).

환경정화를 위해 형질전환 식물체를 선발하기 위해 무기수은을 유기수은으로 전환시키는 organomercurial lyase 유전자 merB를 까마중에 도입하여 형질전환하였다. 2,4-D가 첨가된 동시배양 배지에서 2일간 배양한 후 항생제가 첨가된 선발배지로 옮기는 과정에서 캘러스 생성과 재분화가 빠르게 일어났고, 이는 2,4-D가 식물체의 상처부위에서 체세포배를 유도하여 캘러스가 왕성하게 유도된 것으로 사료된다.

유전자 발현 확인 대조구 식물체 잎 절편이 백화되어 고사하는 농도의 항생제가 포함된 재분화 선발배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 40 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin, \( 500 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) carbenicillin, \( 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) NAA, \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) \( \mathrm { BA } \) 에서 정상적으로 자라는 식물체는 유전자가 도입된 형질전환체라고 1 차적으로 판단을 할 수 있었다. 좀 더 명확히 유전자 도입 및 발현을 확인하기 위하여 PCR analysis를 실시하였다. 그 결과, 대조구는 증폭된 \( \operatorname { merB } \) 유전자 밴드를 찾아볼 수 없었고 5 개의 헝질전환체에서는 \( 403 \mathrm { bp } \) 의 \( \operatorname { merB } \) 유전자 단편이 증폭된 것율 확인하였다 (Fig. 2). 또한 \( \operatorname { merB } \) 유전자의 \( \mathrm { mRNA } \) 수준에서의 발현을 확인하기 위해서 northern blot 분석을 실시한 걸과, 형질전환 두 개 라인 (merBl, merB4)에서 \( \operatorname { merB } \) 유전자의 발헌을 확인 할 수 있었다 (Fig. 3). 이 결과를 바탕으로 향후 merBl, merB4 두 라인을 연구재료로. 사용 하였다. 형질전환 까마중(Solanum nigrum)의 수은 저항성 검정 \( \mathrm { PCR } \) 분석과 northern blot 분석을 통하여 유전자가 식물체에 안정적으로 삽입되고 발현되는 merBl, merB4 두 라인을 선발하였다. 이러한 분자유전학적 확인 이외에도 merB 유전자 발현에 의해서 실제로 수은에 저항성을 나타내는지 확인하기 위하여 MS 재분화 배지 (MS, sucrose \( 3 \%, 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) \( \mathrm { NAA } , 1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } \) 에 유기수은 제제인 MMC와 PMA를 \( 0.5 \), \( 1,2,5,10,20,40,60 \mu \mathrm { M } \) 농로로 처리하고 \( \operatorname { merBl } \), merB4 라인 까마중 잎 절편의 재분화를 유도하여 수은저항성 정도를 알아보았다. 그 결과 \( \operatorname { merB1 } , \operatorname { merB4 } \) 라인은 최고 \( 2 \mu \mathrm { M } \) 까지 MMC에 저항성을 보이며 잎 조직으로부터 재분화가 일어났다. 반면 대조구 잎은 \( 0.5 \mu \mathrm { M } \mathrm { MMC } \) 에서도 잎 절편이 흰색으로 백화되어 고사하였다 (Fig 4).

항생제 함유 재분화 선발배지에서 백화되지 않고 정상적으로 성장한 식물체는 유전자 도입이 성공적으로 이루어진 형질전환체로 판명되었다. 이를 바탕으로 merBl, merB4 두 라인을 연구 재료로 활용하였다. PCR과 northern blot 분석을 통해 merBl, merB4 라인에 유전자가 안정적으로 삽입되고 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 이들 라인은 최대 2μM의 MMC에 저항성을 보였으며, 대조구 잎은 0.5 μM MMC에서 백화되어 고사하는 결과를 보였다.

서 론 미나마타병의 원인물질로 잘 알려진 수은 \( ( \mathrm { Hg } ) \) 은 자연생태계에서 토양과 하천 등 수계에 낮은 농로로 널리 분포하고 있으나, 산업이 발달함에 따라 방출량이 늘어나고 이로 인해 자연생태계의 먹이사슬에 의한 생물학적 축적 (bioaccumulation)으로 결국 인간에게 강한 독성을 나타내게 된다 (Bizily et al.2000). 특히, 수은의 위해도는 생태계에 존재하는 형태에 따라 크게 좌우되는데, 유기수은 형태 \( \left ( \mathrm { CH } _ { 3 } \mathrm { Hg } ^ {\prime } \right ) \) 로 존재하는 것이 무기수은 형태로 존재하는 것보다 위해도가 크며, 독성은 약 200 배 이상 강한 것으로 알려져 있다 (Ruiz et al.2003). 독성이 강한 유기수은은 자연상태에서 organomercurial lyase \( ( \operatorname { merB } ) \) 에 의해 비교적 독성이 약한 무기수은으로 전환되며, 이러한 무기수은 \( \left ( \mathrm { Hg } ^ { 2 + } \right ) \) 은 수은이온 환원 유전자인 mercuric ion reductase gene \( ( \mathrm { mer } A) \) 에 의해 비독성인 금속 수은 \( \left ( \mathrm { Hg } ^ { 0 } \right . \) )형태로 전환된다 (Bizily et al. 1999). 최근에는 광범위한 오염지역 정화에 적용하기 힘든 토목학적, 물리·화학적 방법 대신 식물을 이용하여 중금속을 흡수- 무독화하거나 농-도를 저감시키기는 phytoremediation 기술이 시도되고 있다. Phytoremediation은 광산 및 공장지대등 중금속 오염이 심한 토양에 식물체를 식재하여 오염된 토양을 정화할 수 있는 친환경적 기술로 알려져 있다 (Eapen and D'Souza 2005; 김용호 2008). 그러나 중금속 오염 토양이 중금속 자체의 독성과 함께 척박한 토양의 물리성을 나타내는 경우가 많으므로 (Ok et al. 2004) 중금속 내성 식물의 생육이 저조하거나 오염지역 복원에 소요되는 기간이 배우 길다. 이런 단점을 보완하기 위하여 수은 정화관련 유전자를 식물에 도입하여 수은을 정화하기 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다. Bizily 등(2000)은 merB 유전자를 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에 도입하고 수은 정화가능성을 조사하였고, merA와 \( \operatorname { mer } B \) 유전자를 동시에 발현시키기도 하였다. 애기장대 외에도 벼 (Oryza sativa) (Heaton et al. 2003), 담배 (Nicotiana tabacum) (Ruiz et al. 2003), 호화미초 (Spartina alterniflora) (Czako et al. 2005; Czako et al. 2006), 클로렐가 (Chlorella sp.DT) (Huang et al. 2006), 갈대 (Phragmites communis Trinius) (Seul et al. 2003) 등에 merA 또는 \( \operatorname { merB } \) 유전자를 노입한 형질전환체 연구가 이루어겼고,성 평가 밎 심사를 받아야만 하는데, 법에서는 유전자변형 생물체를 시험·연구용, 농업용, 산업용, 보건의료용, 환경정화용, 해양.수산용으로 구분하여 관련 부처별로 관리하고 있다. 유전자변형생물체의 환경위해성 평가는 유전자변형 생물체가 환경에 미치는 잠재적 위해성을 과학적으로 검증하는 것이며, 유전자변형생물체의 분자생문학적 특성, 생리. 생태적 특성, 유전·육종적 특성, 독성 및 타생물체에 대한 영향 등을 비변형생물체와 비교하여 위해성 여부를 판단하게 된다 (Kim and Kim 2003). 환경위해성 평가의 첫 단계는 형질전환된 평가대상 유전자변형생물체의 유전자 도입 및 발현과 생물학적 특성 (분류, 생리, 유전, 생태)을 확인하고 분석하는 것이다. 그 후 실험실과 온실, 격리포장에서 이루어지는 노출평가와 부작용 정도 검증과정을 거치며 최종적으로 전반적인 위해성을 판단하게 된다 (박홍재 2008).

미나마타병의 원인물질인 수은은 자연에 널리 분포하고 있지만 산업이 발달함에 따라 방출량이 늘어나고 자연생태계의 먹이사슬에 의한 생물학적 축적으로 결국 인간에게 강한 독성을 나타내게 된다. 특히 수은의 유기수은 형태가 무기수은 형태보다 위해도가 크며, 독성은 약 200배 이상 강한 것으로 알려져 있다. 최근에는 토목학적, 물리·화학적 방법 대신에 식물을 이용한 중금속을 흡수- 무독화하거나 농-도를 저감시키기는 phytoremediation 기술이 시도된다.

형질전환 까마중의 수은 저항성 검정 유전자 밭현이 확인된 형질전환 까마중의 수은저항성을 확인하기 위하여 잎을 약 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \times 0.3 \mathrm { ~cm } \) 로 잘라서 유기수은 제제인 methylmercury (II) chloride (MMC; \( \mathrm { CH } _ { 3 } \mathrm { HgCl } \), Aldrich, Germany)와 phenylmercuric acetate (PMA; \( \mathrm { C } _ { 6 } \mathrm { H } _ { 5 } \mathrm { HgOCOCH } _ { 3 } \), Sigma, Germany)가 \( 0.5,1,2,5,10,20,40,60 \mu \mathrm { M } \) 농도별 처리된 \( \mathrm { MS } \) 재분화 배지 ( \( \mathrm { MS } \), sucrose \( 3 \%, 0.1 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { NAA } , 1 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { L } \mathrm { BA } \) )에 치상하였다. 20 일후 잎 전편의 재분화 정도를 조사함하여 수은저항성을 알아보았다. 또한 수은저항성이 확인된 까마중은 온실에서 3 개월 간 재배한 후 종자를 수학하였다. 수확한 종자는 \( 70 \% \) ethanol과 \( 2 \% \) sodium hypochlorite 용액으로 소독하여 MMC와 PMA가 각각 \( 2 \mu \mathrm { M } \) 농도로 첨가된 발아배지에 치상하였으며, 치상 후 10 일째 생육상태를 조사하였다. 형질전환 까마중의 형질전환 1 세대 \( \left (T_ { 1 } \right ) \) 종자형성과 유전자 분리비 조사 유전자 발현과 수은저항성이 확인된 까마중을 배양실에서 순화시킨 후 온실의 포트로 이식하고 약 3 개월 동안 재배하였다. 3 개월 후 화서당 열매수, 열매의 개당 종자수를 대조구와 비교하였고, 수확 후 자연 건조시킨 형질전환 1세대 \( \left ( \mathrm { T } _ { 1 } \right ) \) 종자 100 립의 건조 중량도 측정하였다. \( \mathrm { merB } \) 유전자가 후대로 안정되게 유전되는지를 확인하기 위하여 건조된 \( \mathrm { T } _ {\mathrm { i } } \) 종자를 \( 70 \% \) ethanol에 30 초, \( 2 \% \) sodium hypochlorite 용액에 20 분간 표면살균하고 멸균수로 세척한 후 물기를 제거한 다음 항생제 hygromycin (Sigma)이 첨가 발아배지 (1/2MS, 50 \( \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) hygromycin)에 치상하였다. 10 일 동안 배양 \( \left (25 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \right . \), \( 16 \mathrm { hr } \) day \( / 8 \mathrm { hr } \) dark) 한 후 발아되어 생장하는 항생제 저항성 종자와 발아하지 못하는 감수성인 종자 수를 조사하였다.

형질전환 까마중의 수은저항성을 확인하기 위해 여러 농도의 유기수은 제제를 사용한 실험을 진행하였으며, 해당 저항성이 확인된 까마중은 배양실에서 순화시킨 후 온실로 이식하여 3개월 동안 재배하였다. 이후 화서당 열매수, 열매의 개당 종자수 등을 대조군과 비교하고, 자연 건조시킨 형질전환 1세대 까마중 종자의 건조 중량을 측정하였다.

현재까지 국내에서 상업화들 위하여 승인된 유전자변형 생물체는 국내 수입 콩, 옥수수, 면화, 유채, 감자, 알팔파 등 농업용 작물이 대부분이다. 국내에서도 다양한 유전자변형 생물체 연구가 수행되고 있으나 아직 실용화 단계에는 이르지 못하고 있으며 (Woo et al. 2006), 격리포장 단계에서 환경위해성율 평가 중인 유전자변형생물체도 벼, 고추, 배추, 들깨 등 농업용이다 (김동헌 2008). 환경정화용 유전자변형 생물체는 식물수목류를 대상으로 개발단계이고, 아직 환경 위해성 평가가 이루지고 있지는 않지만 환경정화용이 환경 정화 효과 검정을 위하여 환경에 방출될 가능성에 대비하여 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가기술 개발 연구가 필요할 것으로 여겨진다. 본 연구에서는 환경정회용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가연구를 위한 형질전환 식물체를 확보하기 위하여 생태 환경변화에 따른 유전자 변화 연구 모델식물로 이용되는 까마중에 수은 무독화 관련 유전자인 Organomercurial lyase 유전자 \( ( \operatorname { merB } ) \) 를 도입하여 형진전환체를 선발하고 그 특성을 조사하기 위한 것이다. 재료 및 방법 식물체 재료 한국생명공학연구원 식물유전체연구센터로부터 분양받은 까마중 종자를 중성세제에 5-10분 세척하고, Tween \( 20 \mathrm { TM } \)이 2-3방율 첨가된 2% sodium hypochlorite에 7 분간 침지한 후 멸균수로 세척하였다. 멸균 처리한 종자를 MS 기본 고체배지 (Murashige and Skoog 1962)에 치상하여 발아 \( (25 \pm 1 \mathrm { C } , 16 \mathrm { hr } \) day/8hr dark) 시켰다. 발아 후 l주일된 잎 절편을 Agrobacterium과 공동 배양 하였다. 균주 본 실험에 사용된 A. tumefaciens 균주는 환경정화용 관련 수은무독화 유전자인 \( \operatorname { merB } \) 유전자를 함유하고 있으며 (Choi 2007), 국립산립과학원 형질전환연구실로부터 공여 받았다. Agrobacterium tumefaciens 균주는 kanamycin \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \), rifampicin \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { ml } \) 가 함유된 \( 50 \mathrm { ~mL } \) LB배지에서 균 농도가 \( \mathrm { OD } _ { 600 } = \) \( 0.7 \) 인 대수기까지 배양하여 한빈 원심분리한 후 \( 20 \mathrm { ~mL } \) 의 \( 0.85 \% \mathrm { NaCl } \) 로 세척하고, 잎 절편과 공동 배양하였다.

국내에서 승인된 유전자 변형 생물체는 농업용 작물이 대부분으로 환경정화용 유전자 변형 생물체는 식물수목류를 대상으로 개발단계이다. 환경위해성 평가가 이루어지고 있지 않으므로 환경정화용 유전자 변형 생물체의 환경위해성 평가기술 개발 연구가 필요하며, 그중 Organomercurial lyase 유전자를 도입하여 형질전환 식물체를 선발하고 그 특성을 조사하기 위한 연구를 수행하고 있다.

형질전환 1 세대 끼미중 종자의 수은 저항성 \( \operatorname { merB1 } , \operatorname { merB4 } \) 두 라인의 형질전환 1 세대 종자의 수은저항성을 확인하기 위하여 유기수은 제제인 MMC와 PMA가 \( 2 \mu \mathrm { M } \) 천가된 종가 밥아배지에 치상한 결과, 형질전환체는 발아후 뿌리를 내리며 성장하였으나 대조구근 발아 후 뿌리를 내지지 못하고 결국 갈변되어 고사하였다 (Fig. 6). 이상의 결과, \( \operatorname { merB } \) 유전자가 형질전환 1 세대로 안정되게 유전되어 수은 저항성을 나타내는 두 개의 형질전환 라인(merBl, merB4)을 선발하였다. 향후 이들 두 라인은 후대번식을 봉하여 \( \operatorname { merB } \) 유전자 형질이 고정된 계통을 확보하고 유전자 전이 평가. 독성 대사산물 생산가능성 분석, 주변 생물체와의 상호작용 조사 등 다양한 환경영향평가 실혐을 수행하는데 활용할 것이다. 적요 수은은 산업화될수록 방출량이 많아지고 자연생태계의 먹이사슬에 의한 생물학적 축적에 의하여 결국 인간에게 강한 독성을 나타내게 된다. 최근 중금속 무독화관련 유전자를 도입한 유전자변형식물체를 이용하여 중금속의 독성을 제거하거나 저감하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그러나 유전자변형생물체는 자연생태계에 미치는 환경위해성을 평가하여 안전성을 검증한 후 환경에 방출해야만 한다. 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가기술개발 연구에 이용하기 위한 형질전환 식물체 생산을 위하여 까마중에 유기수은 (organic mercury)을 무기수은 (ionic mercury) 으로 전환시켜서 독성을 저감시키는 organomercurial lyase \( ( \operatorname { merB } ) \) 유전자를 도입하여 형질전환 시켰다. 유전자 도입 및 발현이 확인된 2 개의 형질전환 라인 \( ( \operatorname { merBl,~ } \operatorname { merB4 } ) \) 은 유기수은제제인 MMC \( 0.5 \mu \mathrm { M } \), PMA \( 1 \mu \mathrm { M } \) 에서 저항성을 나타내었다. 또한 형질전환 1 세대 종자도 \( 2 \mu \mathrm { M } \mathrm { MMC } \) 와 PMA에 저항성을 나타내는 것을 확인하였다. 향후 이들 형질전환체를 이용하여 환경정화용 유전자변형생물체의 환경위해성 평가방법 개발 연구를 수행 할 것이다.

두 개의 라인 merBl과 merB4은 유기수은 제제인 MMC와 PMA로 테스트한 후 수은 저항성을 위해 선택되었다. merB 유전자는 1세대 유전자가 안정적으로 유전돼 향후 유전자 전이 번식 및 평가는 물론 환경영향평가 실험 등에 활용될 예정이다. 유전자변형식물체는 환경 내 중금속의 독성을 제거하거나 줄이기 위해 만들어졌지만, 출시 전에 안전성을 확인해야 한다. 이들 형질전환체를 이용한 환경정화를 위한 유전자변형생물의 환경위험도 평가방법 개발 연구가 진행될 예정이다.

초록 본 연구에서는 혈전용해능이 우수한 Bacillus sp. sm26을 선별하고 신품종 기능성 콩인 노란 아가콩(YA)와 검정 아가콩(BA)을 발효시킨 발효콩(FYA, FBA)의 혈전용해 활성과 \( 70 \% \) ethanol 추출(FYAE, FBAE)에 대한 항산화 효능을 조사하였다. FYA와 FBA의 혈전용해 활성은 각각 \( 6.38 \pm 0.5 \)와 \( 6.83 \pm 0.5 \mathrm { U } / \mathrm { ml } \)로 대두 발효물(FSB)보다 각각 1.3배와 1.4배 높은 것으로 나타났다. 총 페놀 함량은 FYAE와 FBAE가 각각 \( 3.40 \pm 0.44 \mathrm { mg } / \mathrm { g } , 2.45 \pm 0.20 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)으로 나타나, 대두 발효 추출물(FSBE)에 비하여 약 2 배 이상의 높은 페놀 함량을 나타내었다. FYAE의 총 단백질과 총 당 함량은 각각 \( 0.56 \pm 0.11 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)과 \( 2.41 \pm 0.48 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 이었으며 FYBA는 각각 \( 0.39 \pm 0.12 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)과 \( 2.72 \pm 0.63 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { g } \)으로 나타나, FYAE가 FSBE보다 각각 4.7배와 1.7배 높은 총 단백질과 총 당 함량을 지닌 것으로 나타났다. DPPH radical 소거능은 FBAE가 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)에서 \( 79 \% \)로 가장 높게 나타났으며 2 배 높은 활성을 나타내었다. 환원력은 FBAE가 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)의 농도에서 가장 높은 환원력을 나타내었으며 FSBE에 비해 2배 높은 활성을 보였다. 지질 과산화능은 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \)일 때 FBAE는 \( 93 \% \)로 FSBE의 약 3배 높은 활성을 나타내었고 FYAE 또한 \( 80 \% \)로 2.5배 높은 활성을 보였다. 과산화 수소에 대한 소거능은 \( 1 \mathrm { mg } / \mathrm { ml } \) 농도에서는 FBAE가 \( 82 \% \)로 FSBE에 비해 4배 높은 효과를 나타내고 FYAE의 경우 2.5배 높은 효과를 나타낸다. 이상의 연구 결과에서, 기능성 콩인 아가콩 발효물의 혈전용해 활성과 항산화 효능은 일반 콩에 높게 나타났으며 이는 앞으로 새로운 천연 기능성 식품으로서의 이용 가능성을 시사하고 있다.

혈전용해능이 우수한 Bacillus sp. sm26을 이용해 발효한 노란 아가콩(FYA)과 검정 아가콩(FBA)의 혈전용해 활성은 각각 1.3배와 1.4배 높게 나타나, 페놀 함량은 각각 약 2 배 이상 높았다. 또한, DPPH radical 소거능에서는 FBAE가 2 배 높은 활성을 보였다. 이러한 결과로 볼 때, 아가콩 발효물의 혈전용해 활성과 항산화 효능은 일반 콩보다 높으며, 이는 신 천연 기능성 식품으로서의 활용 가능성을 시사한다.

재료 및 방법 재료 일반 대두(SB)는 시중에서 판매되는 것을 구입하여 사용하였으며 육종 품종인 아가콩 3호(노란 아가콩, YA와 아가콩 4호(검정 아가콩, BA)는 경북대학교에서 제공받아 사용하였다. 발표 균주의 선별 각각의 콩을 \( 20^{\circ} \mathrm{C} \)의 물에 24시간 동안 침지하여 건져낸 후 30분간 물을 뺀 다음 \( 50 \mathrm{g} \)씩 담아 autoclave에서 30분간 가압증자하였다. 증자대두를 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \) 이하로 냉각시킨 후 혈전 용해능을 지닌 10가지의 Bacillus sp. 균주 배양액을 증자대두의 \(3\%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \)가 되도록 접종하고 \( 45^{\circ} \mathrm{C} \)에서 72시간 발효하였다. 발효된 콩의 혈전용해능을 Fibrin plate method로 측정하고 혈전용해능이 가장 우수한 균주를 발효 균주로 사용하였다. 발효콩 추출물의 제조 Bacillus sp. sm26 균주를 이용하여 발효시킨 콩 발효물을 \( 70 \% \) ethanol로 추출한 후 여과(whatman paper No.2)하여 얻어진 ethanol 추출액을 감압 농축하여 발효 대두 추출물 (FSBE), 발효 아가콩 3호 추출물(FYAE), 발효 아가콩 4호 추출물(FBAE)를 각각 얻었으며 이를 본 연구의 시료로 사용하였다. 총 페놀 함량 분석 총 페놀 함량은 Singleton and Rossi method을 이용하여 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하였다. FSBE, FYAE, FBAE \(~40 \mathrm{mg} \) 씩을 각각 증류수 \( 1 \mathrm{ml} \)에 녹인 후 96-microwell plate (Nunc, Roskilde, Denmark)에 \( 20 \mu \mathrm{l} \) 씩 분주하고 sodium carbonate \( (0.7 \mathrm{~M}) ~80 \mu \mathrm{l} \)를 혼합한 후 Folin-Ciocalteu regent (Folin-Ciocalteu : Water \( =1: 10 \mathrm{~v} / \mathrm{v}) 100 \mu \mathrm{l} \) 첨가하여 15분간 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 반응 후 microplate reader (Versa Max, USA)를 이용하여 \( 765 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 페놀 함량을 계산하였다. 총 단백질 및 당 함량 분석 단백질 함량 측정은 Bio-rad사의 protein assay kit를 사용하여 정량 하였다. 각 추출물의 농도가 \( 0.1 \sim 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 증류수로 희석하고, 이 시료 \( 0.1 \mu \mathrm{l} \)와 4배 희석한 protein assay reagent \( 0.5 \mu \mathrm{l} \) 혼합하여 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 방치한 후 595\( \mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 BSA (bovine serum albumin) standard curve를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 단백질 함량을 구하였다. 총 당 함량은 시료 \( 2 \mathrm{ml} \)를 test tube에 넣고 \(5\%(\mathrm{w} / \mathrm{w}) \) phenol 수용액 \( 100 \mu \mathrm{l} \)를 넣은 후 \( 95 \% \) 황산 \( 500\mu \mathrm{l} \)를 첨가하고 30분 동안 실온에서 반응시킨 후 470\( \mathrm{nm}\)에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡은 glucose standard curve를 이용하여 작성한 표준곡선으로 총 당 함량을 구하였다.

본 연구의 재료는 아가콩 3호(노란 아가콩, YA와 아가콩 4호(검정 아가콩, BA)이며 72시간 발효된 콩중 혈전용해능이 가장 우수한 균주를 발효균주로 사용하였다. ethanol 추출액을 감압 농축하여 발효 대두 추출물 (FSBE), 발효 아가콩 3호 추출물(FYAE), 발효 아가콩 4호 추출물(FBAE)을 연구의 시료로 사용하였다. 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색되는 원리를 이용하여 분석하고, 단백질 함량은 protein assay kit를 사용하여 정량하여 측정한다.

Free radical scavenging activity Free radical scavenging activity의 측정은 Brand-Williams method을 이용하여 측정 하였다. \( 6 \times 10^{-5}\) M DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) MeOH용액 \( 195\mu \mathrm{l} \)와 증류수로 희석한 추출물 \( 5 \mu \mathrm{l} \)를 96-microwell plate에 혼합하였다 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. 실온에서 30 분간 방치한 후 \( 515 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였고 기존의 항산화제로 알려진 BHA (butylated hydroxy anisole), BHT (butylated hydroxytoluene), ascobic acid를 대조구로 사용하였다. 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다. Redcing power activity Reducing power activity의 측정은 Oyaizu method을 이용하여 측정하였다. 시료 \( 50 \mu \mathrm{l} \)에 Phosphate buffer ( \( 200 \mathrm{mM}, \mathrm{pH} \) \( 6.6\ \)) \( 50\mu \mathrm{l} \)와 \( 1 \% \) potassium ferricyanide \( 50 \mu \mathrm{l} \)를 넣고 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 20분간 반응시켰다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. 반응 종료 후 반응액에 \( 10 \% \) trichloroacetic acid 용액 \( 50\mu \mathrm{l} \)를 가하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 후 상등액을 \( 100 \mu \mathrm{l} \) 취하여 증류수 \(100 \mu \mathrm{l} \)와 \( 1 \% \) ferric chloride \( 20 \mu \mathrm{l} \)을 혼합한 후 10분간 반응시킨 뒤 \( 700 \mathrm{~nm} \) 에서 흡광도를 측정하였다. \( \beta \)-carotene-linoleic acid activity \( \beta \)-carotene-linoleic acid activity는 Miller method을 이용하여 측정하였다. \( 0.1 \mathrm{mg} \)의 \( \beta \)-carotene을 chloroform \( 500 \mu \mathrm{l} \)에 용해시킨 후 \( 20 \mathrm{mg} \)의 linoleic acid 및 \( 100 \mathrm{mg} \)의 Tween 40을 첨가하여 \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 chloroform을 감압 농축하여 제거하고 얻어진 잔류물에 증류수 \( 50 \mathrm{ml} \)를 가하여 정용한 것을 기질액으로 사용하였다. 기질액 \( 10 \mu \mathrm{l} \)와 시료 \(200\mu \mathrm{l} \)를 96-microwell plate 가하여 혼합하였다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였다. \( 50^{\circ} \mathrm{C} \)에서 2시간 반응시킨 후 \( 470 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다. Hydrogen peroxide scavenging activity Hydrogen peroxide scavenging activity의 측정은 Miller method을 이용하여 2,2-azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonicacid (ABTS)-peroxidase system에서 측정하였다. 96-microwell plate에 시료 \( 80 \mu \mathrm{l}, ~10 \mathrm{~mM} \mathrm{~H}_{2} \mathrm{O}_{2} ~20 \mu \mathrm{l} \), phosphate buffer (\( \mathrm{pH} \) \( 5.0 \), \( 0.1 \mathrm{M}) 100\mu \mathrm{l} \)를 넣고 혼합하였다. 이때, 혼합용액 중의 추출물 최종 농도는 \( 1.0 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)가 되도록 하였고 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 5분간 반응하였다. 반응액에 \( 1.25 \mathrm{mM} \) ABTS \(30\mu \mathrm{l} \)와 \(1 \mathrm{U} / \mathrm{ml} \) peroxidase \( 30 \mu \mathrm{l} \)를 가하고 혼합한 후 \( 37^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분간 반응하여 \( 405 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였으며 시료의 항산화 효능은 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구의 흡광도비로 산출하였다.

본 연구에서는 Free radical scavenging activity, Reducing power activity, Hydrogen peroxide scavenging activity의 측정을 각각 Brand-Williams method, Oyaizu method, Miller method를 활용하여 수행하였다. 각각의 방법을 통해 추출물의 항산화 효능을 산출하였으며, 반응 액에 필요한 특정 물질을 첨가하고 특정 온도에서 반응 시킨 후 흡광도를 측정하였다.

결과 및 고찰 혈전용해효소 생산 균주의 선별 및 혈전용해 활성 콩 발효물의 혈전용해효소 활성을 알아보기 위하여 동아대학교 연구실에서 보관 중인 10가지 균주(Bacillus. sp LC-1, LC-3, LC-5, CKJ, #15, #18, #20, #38, BB-1, sm26 를 이용하여 대두콩(SB) 발효를 수행하였다. 그 결과, Fig. 1에 나타낸 것과 같이 Bacillus sp. sm26로 발효한 발효물의 혈전용해효소가 \( 4.80 \pm 0.3 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)로 가장 높은 혈전용해 활성을 나타내었고 이 결과를 토대로 Bacillus sp. sm 26을 이용하여 YA 및 BA를 발효시키고 발효물의 혈전용해 활성을 조사하였다. 그 결과, FYA에서는 \( 6.38 \pm 0.5 \mathrm{unit} / \mathrm{ml}, \) FBA에서는 \( 6.82 \pm 0.5 \mathrm{unit} / \mathrm{ml} \)의 혈전용해 활성을 나타내었으며 이는 발효 대두인 FSB에 비하여 각각 1.3배와 1.4배 높은 혈 전용해 활성을 나타내었다. 한편, FSB, FYA, FBA의 형태학적인 측면에서는 큰 차이점을 나타내지 않았으며 특히 시판의 콩 발효물인 낫토와도 차이점은 발견되지 않아 아가콩이 혈전용해 효소의 생산적인 측면과 형태학적인 측면에서도 적합한 재료인 것으로 사료된다. 총 페놀, 단백질 및 당 함량 분석 페놀화합물은 구조식에 hydroxyl group을 소유하며, 공명 안정화된 구조로써 전자를 수용하는 기작으로 항산화능에 직접적으로 기여한다. 발효 추출물들의 총 단백질, 당, 페놀 함량의 정량 분석 결과는 Table 2와 같다. 항산화 효능에 깊은 관여를 하고 있는 총 페놀 함량은 FYAE에서 \( 135.9 \pm 17.8○ \) \( \mathrm{g} / \mathrm{ml}\)로 나타났으며 이는 FSBE보다 2 배 높은 함량을 지니고 있는 것으로 나타났다. 총 단백질의 함량은 FYAE가 22.5±4.6\( \mathrm{g} / \mathrm{ml} \)로, FSBE 보다 5배 많은 단백질 함량을 보였다. 또한, 총 당 함량은 FBAE가 \( 108.9 \pm 25.3 \mathrm{~g} / \mathrm{ml} \)로 FSBE보다 2배 많은 함량을 나타내었다. Free radical scavenging activity 추출물의 항산화 효능을 DPPH에 대한 전자 공여능(electron donation ability, \%)으로 측정하였다. 전자공여작용은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 식품들의 지방 산화작용을 억제하는 하고, 생체에서는 활성 라디칼에 의한 세포 손상과 노화를 억제한다. 추출물의 DPPH radical scavenging 활성의 결과는 Fig. 3와 같다. 추출물의 DPPH radical scavenging 활성은 농도의존적으로 농도의 증가에 따라 활성도 증가하였고 FBAE의 농도가 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)일 때 \( 79 \% \)로 가장 높게 나타났으며 FYAE도 \( 57 \% \)로 나타나 FSB에 비해 최대 2배 가량 높게 나타났다. 대조구로 사용된 gallic acid, BHA, BHT의 경우, 추출물과 동일하게 \( 1.0 \sim 0.1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도로 측정하였을 때, gallic acid와 BHA는 모든 농도에서 \( 83 \% \) 이상의 높은 활성을 나타내었고, BHT는 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \( 83 \% \)의 활성을 보였으나 농도가 낮아질수록 그 활성이 다른 대조구에 비해 급격히 낮아졌다. Reducing power activity 활성 산소종 및 유리기에 전자를 공여하는 능력인 환원력은 항산화능과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있는데 이는 항산화 활성에 주요한 인자로 작용한다. 일반적으로 환원력이 큰 것일수록 전자공여능이 높다고 알려져 있고 전자공여능은 phenol성 물질에 대한 항산화 효능의 지표라고 할 수 있다. 발효 콩 추출물의 환원력을 Fig. 4에 나타내었다. 추출물의 농도가 높아질수록 환원력은 증가하였으며, \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 FBAE가 \( 0.85 \pm 0.23 \)로 가장 높은 환원력을 나타내었으며 이는 대조구와 비슷한 환원력을 보였다. 또한, FYAE도 \( 0.55 \pm 0.42 \)로 FSB의 \( 0.45 \pm 0.11 \) 보다 높게 나타났다. 그러나 추출물의 농도가 줄어들수록 대조구에 비해 농도 의존력이 떨어지며 환원력은 감소하는 것으로 나타났다. \( \beta \)-Carotene-linoleic acid activity 추출물의 지질과산화 억제능을 \( \beta \)-carotene이 함유된 linoleic acid emulsion계에서 측정하였다(Fig. 5). 모든 추출물들 이 농도에 의존적인 지질과산화 억제능을 지니고 있었고 특히 FBAE의 경우에는 대조구인 galic acid, BHA와 비교하여 지질 과산화 억제능이 대등하게 나타났으며 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \)의 농도에서 \(93\% \)로 galic acid와 BHT보다 높게 나타났다. 또한 FSBE와 비교하면 FBAE가 FSBE보다 3배 정도 높은 활성을 나타냈고 FYAE는 2.5배 높은 활성을 나타내었다. 생체 내에서 \( \mathrm{Fe} \)과 같은 금속류는 과산화수소와 빠르게 반응하여 hydroxyl radical 을 형성함으로써 2차 산화가 진행되는데, 세포막의 지질과산화 반응이 radical에 의해 진행되고 생체 내 DNA의 손상까지 초래한다는 것을 볼 때, hydroxyl radical 소거 및 지질과산화 억제능이 우수한 FBAE와 FYAE는 2차 산화물의 생성억제제로 유효할 것으로 사료된다. Hydrogen peroxide activiy 과산화수소에 대한 추출물의 소거능 효과를 Fig. 6에 나타내었다. Hydrogen peroxide \( \left(\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}_{2}\right) \)는 세포에 대하여 독성물질로 작용하며 전이 금속이온과 함께 활성산소 종들을 생산하며, 체내의 항산화 방어효소들의 작용으로 물로 전환되어 분해된다. 추출물의 \( 1 \mathrm{mg} / \mathrm{ml} \) 농도에서는 FBAE가 \( 82 \% \)로 이는 FSBE와 비교해 4배 높은 효과를 나타내었으며 FYAE의 경우에도 FSBE보다 2.5배 높은 효과를 나타내어 FSBE에 비해 과산화수소 소거능이 뛰어 났으며 농도 의존적으로 활성의 증가를 나타내었다. 또한, galic acid, BHA, BHT와 과산화수소 제거 효과를 비교하였을 때 FBAE의 경우 그 효과가 높은 농도에서 대조구와 비슷한 효과를 나타내었다. 이상의 결과에서 기능성 콩 발효물인 FYA와 FBA는 FSB에 비하여 높은 혈전용해 활성을 나타내었으며 발효 콩 추출물인 FYAE와 FBAE도 FSBE에 비하여 높은 항산화 효능을 지니고 있었다. 특히, FBAE는 FYAE에 비하여 항산화 효능에 깊은 영향을 미치는 총 페놀성 화합물의 함량이 적었음에도 월등한 항산화 효능을 나타내고 있음을 알 수 있었다. 이는 FBAE에 존재하는 안토시아닌이 항산화 효능에 영향을 미치고 있는 것으로 사료되며 앞으로 아가콩을 이용한 발효물이 좋은 천연 항혈전과 항산화 식품으로서 높은 이용 가능성을 시사하였다.

동아대학교 연구실에서 보관 중인 10가지 균주를 이용해 대두콩 발효를 수행하여 콩 발효물의 혈정용해효소 활성을 알아보기 실험을 진행했다. 그 결과 FYA와 FBA에서 FSB에 비해 높은 혈전용해 활성을 나타내었다. 반면 이 셋은 형태학적 측면에서는 큰 차이가 발견되지 않았다. 또, 항산화능에 직접적으로 기여하는 총 페놀과 단백질 및 당 함량면에서는 FYAE가 FSBE 보다 높은 수치를 나타내었다. 그리고 추출물의 지질과산화 억제능을 측정한 결과 FBAE와 FYAE는 2차 산화물의 생성억제제로 유효하다는 결론을 얻었다. 따라서 아가콩을 이용한 발효물이 항혈전, 항산화 식품으로 높은 이용 가능성이 있음을 알수 있다.

서 론 현대과학의 발달로 인해 건강 장수생활의 혜택이 커지면서 식품이 단지 영양공급과 기호성을 충족시키는 기본적인 목적을 넘어서 꾸준한 일상섭취를 통하여 잠재적인 질병예방 및 치유의 능력까지 갖춘 기능성에 대한 연구가 중점적으로 이루어지고 있다. 특히 노화, 암, 뇌혈관과 심혈관계 질환 등은 free radical의 생성과 관련이 있다는 사실이 밝혀짐에 따라 항산화 효과를 가지는 식품의 섭취를 통해 노화를 지연시키고 이러한 질병을 예방, 치료하고자 하는 노력이 증가하고 있는 실정이다. Free radical은 생체내의 산화적 스트레스에 의해 생성되는데 세포 구성성분과 강하게 반응하여 세포와 조직에 손상을 가하고 지속적인 DNA 손상을 주어 각종 질병을 유발하게 된다. 생체는 이러한 free radical로부터 생체를 방어할 수 있는 superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPX), catalase (CAT), glutathione reductase, glutathione-S-transferase 등의 항산화 효소를 가지고 있으나, 과도한 스트레스에 노출되어 있는 현대인에게는 더욱 효과적이고 안전한 식이성 항산화제가 필요하다. 근래에 과일과 채소 등에 포함되어 되어있는 비타민 C, 비타민 E, 폴리페놀 등과 같은 천연 항산화물질들은 순환계 질병과 암 발생율을 감소시킨다고 보고된 바 있어, 자연에 널리 분포되어 있는 천연 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 근래에 단백질과 지방질을 보충하는데 우수한 대두(Glycine max L.)는 대표적인 식물성 단백질원으로써 saponin, phyticacid, isoflavones, hemaglutinins 등의 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있어 그 기능성에 대한 관심이 높아졌다. 과거 대두를 이용한 전통발효식품들은 육류의 섭취량이 부족한 동양에서는 중요한 단백질과 지방질의 공급원으로 고초균이 생산하는 효소에 의해 단백질과 당질이 분해되어 끈끈한 점질물이 형성되면서 특유의 맛과 냄새를 가지게 된다. 점질물은 주로 glutamic acid로 이루어져 칼슘 흡수를 돕고 탁솔이라는 항암 물질을 효율적으로 운반한다. 또한 노화 방지의 항산화 효과와 인슐린 분비를 원활히 하고 유산균 증식을 돕고 콜레스테롤 수치를 떨어뜨린다. 발효과정 중 분비되는 nattokinase는 fibrin을 강력하게 분해하는 효소로 밝혀지면서 혈전용해제로서 이용되며, 체중감소 및 혈압강하 효과 등을 나타내고 있다. 특히, 대두에 다량 함유된 isoflavone은 높은 항산화 효과 등 다양한 기능성을 지니고 있어 새로운 건강식품으로써 관심이 모아지고 있다. 한편, 황영현 등에 의해 새로이 육종 되어진 아가콩은 높은 질병 저항성과 isoflavone 함량을 지니고 있는 신품종 콩으로써 높은 항산화 활성 등을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 연구에서는 isoflavone의 함량이 일반 대두에 비해 높게 육종된 아가콩 3호(노란 아가콩) 및 4호(검정 아가콩)의 기능성을 조사하고자 혈전용해능이 우수한 Bacillus sp.의 선별과 이를 활용하여 대두, 아가콩 3호 및 4호를 발효시켜 생산된 점질물의 항산화 효과를 알아보았다.

현대 과학의 발전으로 인해 건강과 장수에 대한 이점이 커지면서 식품의 기능성 연구가 중요해지고 있다. 이제 식품은 영양 공급과 맛을 넘어서 잠재적인 질병 예방과 치유 능력을 갖추는 기능성을 강조하고 있다. 특히 노화, 암, 뇌혈관과 심혈관 질환과 같은 질병은 활성 산소 물질인 자유 라디칼과 관련이 있다는 사실이 알려져, 항산화 작용을 갖는 식품 섭취의 중요성이 증가하고 있다. 대두는 단백질 보충과 지방질 보충에 우수한 원료로 알려져 있으며, saponin, phyticacid, isoflavones, hemaglutinins 등 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있어 그 기능성에 관심이 높아졌다. 발효 과정 중 생성되는 나토키나아제는 혈전을 분해하는 강력한 효소로 알려져 있으며, 체중 감소와 혈압 강하 효과 등을 나타냅니다. 이에 따라 이 연구에서는 isoflavone 함량이 높게 육종된 아가콩을 활용하여 혈전용해능이 뛰어난 Bacillus sp.를 선별하고, 대두와 아가콩을 발효시켜 생산된 점질물의 항산화 효과를 조사하였다.

마늘은 \( 2-4 \% \) 첨가 고콜레스테롤 식이로 사육한 흰쥐의 간의 콜레스테롤 함량을 \( 30 \% \) 지하시켰다고 보고하고 있으나 콜레스테롤 급여 시 마늘을 \( 1 \%(17) \) 및 \( 3 \%(18) \) 첨가한 경우 간의 총콜레스테롤과 중성지방의 함량에는 차이가 없었다고 보고하였다. 토끼의 경우 마늘첨가로 간 조직중의 콜레스테롤 감소가 일어난다 하더라도 간의 콜레스테롤 합성 저하보다는 neutral 또는 acidic sterol로의 전환과 관련이 있으며 이는 간의 콜레스테롤 함량을 반영하지 않는다고 하였다. 또 흰쥐 를 대상으로 마늘가루가 지방생합성에 미치는 영향을 알아보 기 위해 \( { } ^ { 14 } \mathrm { C } \) 가 label된 acetate를 사용하여 radioactivity를 측정한 결과 간 지질로부터 incorporation된 \( { } ^ { 14 } \mathrm { C } \) 가 대조군보다 마늘 첨가군에서 유의적으로 낮았으며 이 결과는 마늘이 hepatic lipogenesis를 억제하는 효과가 있음을 암시한다고 추정 하였다. 이와 같이 마늘급여에 의한 간의 지질 감소효과에 대하여 여러 선행연구에서 비슷한 결과를 보이고 있다. 이상의 결과를 종합해 보면 흑마늘 추출물 급이에 의해서 간의 지질농도의 변화는 혈액의 지질 농도의 변화만큼 큰 차이가 나타나지 않음을 알 수 있었다. 직접적인 원인은 알려겨 있지 않으나 소장의 지방소화와 홉수경로에서 흑마늘의 유기 유황화합물이 지방의 분해효소의 활성을 억제하거나, 지방의 배설을 촉진할 수 있다는 가능성에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. 결론적으로 본 실험에서 흰쥐를 6주 동안 고지방식 이와 함께 흑마늘을 첨가하여 공급하였을 때 혈액의 지질의 농도가 크게 개선되었음을 확인할 수 있었다. 그리고 실험조건에서 흑마늘 급이량을 비례적으로 차이를 두어 급여했음에도 불구하고 각 농도에 따른 급이군들 간에 차이는 없었다. 따라서 흑마늘에 의한 고지혈증 개선작용은 간 조직의 지방합성을 억제함으로써 혈중 지질농도를 저하시킨다고 판단되며, 흑마늘을 액상형태로 지질대사에 어떠한 영향을 미치는 것에 대한 연구는 앞으로 흑마늘의 가능성 식품의 개발을 위한 새로운 시도라고 판단된다. 초록 : 흑마늘 추출물에 의한 고콜레스테롤혈증 유발 흰쥐의 지질대사의 개선효과 본 연구는 흑마늘 숙성기간 중의 흑마늘의 지표물질이라 할 수 있는 S-allylcysteine (SAC)의 함량을 측정한 다음 흑마늘 추출물이 고지방식이로 유발된 흰쥐에 미치는 영향을 조사하였다. 흑마늘을 10일, 15일 및 20일 숙성 중 S-allylcysteine의 함량은 15일 일 때가 가장 높았으며, 관능검사 결과도 숙성 15일째가 좋았다. 고지방 식이만 공급된 동물군을 정상군, 위약군 그리고 고지방식이에 흑마늘 추출물의 첨가 농도에 따라 저농도군, 중농도군 및 고농도군으로 5그룹으로 나누어 6주간 사육하였다. 정상군, 실험군 모두 체중은 지속적으로 증가하였으나 그룹 간의 유의적 차이는 없었고 흑마늘 추출물 첨가 급이군이 정상군에 비하여 체중 및 식이 효율에 유의적 차이는 없었다. 혈중 총지질은 흑마늘 추출물의 첨가 농도에 관계없이 감소하였으며, 총 콜레스테롤 및 중성지방도 흑마늘 추출물의 첨가 농도가 높을수록 유의적으로 감소하였다. 흑마늘 추출물 급이에서도 정상군에 비하여 HDL-콜레스테롤이 유의적으로 증가하였고 LDL-콜레스테롤은 감소하였다. 간의 총지방, 총 콜레스테롤 및 중성 지방의 함량은 정상군에 비하여 흑마늘 추출물을 급이한 저농도, 중능도, 고농도 군에서 모두 감소되는 경향을 나타내었다. 이상의 실험결과를 보면, 6주 동안 고지방식이로 유도된 고 콜레스테롤혈증은 동물 실험에서 흑마늘 추출물 첨가가 저농도, 중농도 및 고농도에서 혈액과 간의 중성 지방과 총콜레스테롤을 감소하는 효과가 있었으므로 체내지질 개선효과를 갖는 식품 소재로서의 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

흑마늘 추출물의 양에 따른 간의 지질농도 변화는 혈액의 지질 농도 변화보다 크지 않음을 확인하였다. 6주간 고지방식과 함께 흑마늘을 투여하면 혈중 지질 농도가 크게 개선되는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아, 흑마늘은 간 조직의 지방 합성을 억제하며, 혈중 지질 농도를 감소시키는 효과가 있을 것으로 추정된다. 이로부터 액상 형태의 흑마늘이 지질 대사에 미치는 영향에 대한 연구는 식품 개발에 새로운 방향을 제시할 것으로 보인다.

사육 및 식이 실험동물은 대한 바이오 코리아에 구입하여 동일한 환경에서 고형배합사료(Rat chow, 삼양사)로써 사육한 체중증가가 비슷한 Sprague-Dawley종 수컷 횐줘로, 동물사육실은 온도 \( 22 \pm 1 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 습도 \( 45 \% \) 내외로 유지시켰으며, lighting cycle은 12시간 주기로 개인별 cage로 자유롭계 물과 표준식이를 먹도록하였다. 실험식이 공급 전날 체중에 따른 난괴법으로 7 마리씩 마우스를 5 group으로 나누어 AIN-76 기본식이에 고지방식이를 공급하였고, 고지방식이의 동물실험군은 정상군(normal) 고지방식이와 유사 흑마늘 농축액 \( (2 \% \) 카라멜 색소용액)만 급이한 위약군(placebo), 그리고 고지방식이와 흑마늘 추출물의 양에 따라 저농도군(low dose), 중농도군(medium dose), 고농도군(high dose)으로 나누었다(Table 1). 흑마늘 추출물은 자연스럽고 자발적으로 섭취를 유도하기 위해서 동물이 매일 먹는 물을 통해서 공급하였다. 먼저 정확한 공급량 계산을 위해서, 실험동물의 1 주일간의 평균 물 섭취량을 측정 \( ( \mathrm { ml } / \mathrm { day } ) \) 한 후, 이 물을 매개체로 혹마늘 엑스분의 공급랑을 계산하였다. 투여랑은 사람-동물 체표면적[bodysurface area (BSA), \( \mathrm { ~m } ^ { 2 } \)] 비로 계산하였다. 즉, 성인 \( (70 \mathrm { ~kg } \)몸무게와 키 \( 173 \mathrm { ~cm } \) 를 기준)의 평균 BSA 은 약 \( 1.844 \mathrm { ~m } ^ { 2 } \) 이고, \( 300 \mathrm { ~g } \) 흰쥐의 BSA 가 약 \( 0.040 \mathrm { ~m } ^ { 2 } \) 인 것을 기준하여 계산된 사람과 흰쥐의 BSA 비가 약 46 이었다. 사람의 경우 매일 음료는 흑마늘 추출액 2 포 \( (150 \mathrm { ml } ) \) 를 섭취한다고 가정하여, 46 비율에 해당되는 \(3.26 \mathrm { ~ml } \)가 동물 섭취 당량(animal intake equivalent)이 된다. 이 실험에서는 흑마늘 추출물을 사람이 음료 형식으로 마실 수 있는 양을 기호에 따라 3 그룹으로 나누었다. 사람의 \( 75 \mathrm { ml } \) 에 해당하는 앙 \( (1.63 \mathrm { ml } / \mathrm { rat } ), 150 \mathrm { ml } \) 에 해당하는 양(3.26 ml/rat), 그리고 \( 300 \mathrm { ml } \) 에 해당하는 양( \( (6.52 \mathrm { ml } / \mathrm { rat } ) \) 을 각각 저농도군(low dose), 중농도군(medium dose), 고농도군(high dose)로 구분하여 해당 동물에 6 주간 매일 신선하게 공급하였다. 1 주일간 실험동물의 하루 평균 물 섭취랑이 약 25 \( \mathrm { ml } \) 이었고 매일 섭주하는 물 \( 25 \mathrm { ml } \) 당 상기된 해당 흑마늘 추출 물을 희석하여 공급하였다.

체중 증가가 비슷한 Sprague-Dawley종 수컷 횐쥐를 실험동물로 하여 고지방 식이와 흑마늘 추출물을 섭취하는의 양에 따라 정상군, 위약군, 저농도군, 중농도군, 고농도군의 5그룹으로 나눈 후 마시는 물을 통해 흑마늘 추출물을 희석하여 정확한 양을 공급하는 방식으로 사육 및 식이 실험을 진행하였다.

생마늘과 흑마늘의 S-allylcysteine (SAC)의 함량 비교 생마늘을 고은으로 숙성시킬 때 높은 온도에 의하여 휘발성유황화합물은 거의 대부분 소실되고 비휘발성 성분만 남게 된다. 흑마늘의 비휘발성 성분에는 페놀성 화합물, 멜라노이딘 색소, 사포닌, 무기염류 등이 있으나 흑마늘의 기능적 특성을 가지는 대표적인 지표성분이 SAC 이라고 할 수 있다. 흑마늘의 주요 성분으로 알려져 있고, 기능성도 잘 알려진 SAC 를 지표물질로 지정하고 제품의 표준화를 위하여 흑마늘 숙성기간에 따른 SAC 의 함량변화를 비교하였다. Fig. 1은 생마늘 및 흑마늘에 들어 있는 SAC의 chromatograms을 나타낸 것으로 생마늘의 SAC peak 보다 흑마늘에서의 SAC peak가 높은 것으로 나타났다. 생마늘과 흑마늘 숙성기간인 10일, 15일 및 20일 동안 숙성시 각종 흑마늘의 성분 중, 유기 유황화합물의 지표물질로 알려진 SAC의 함량을 Fig. 2 에 나타내었다. SAC의 함량을 보면 생마늘일 때 \( 30 \mathrm { ppm } \) 이었으나, 숙성 10 일, 15 일, 20 일째는 각각 \( 952 \mathrm { ppm } , 1140 \mathrm { ppm } , 746 \mathrm { ppm } \) 으로 나타났다. 생마늘에서는 SAC가 미량이었으나 숙성 과정을 거치면서 숙성 10일, 15일째까지 급격히 증가하다가 숙성 20 일째는 감소하였다. 이와 같이 숙성기간 중 SAC 의 함량 변화가 있는 것은 숙성기간에 따른 마늘의 유기유황성분 중 회발성 성분은 소실되고 수용성 성분인 SAC가 증가하다가 숙성 기간이 길어지면 그 성분도 장기간 고온에서 불안정하여 소실되는 것으로 사료된다. 따라서 흑마늘을 가공할 때 15일 동안 숙성하는 것이 관능검사 결과가 가장 좋았고, SAC 함량도 가장 높았으므로 15 일째 숙성 흑마늘을 동물실험에 사용하였다. 마늘의 주 성분인 allicin은 마늘을 다지거나 조리가공할 때 allinase에의하여 매우 불안정하고 휘발성이 강한 allicin이 생성된다. Allicin은 수용성 성분인 SAC, S-allylmercaptocystein (SAMC) 등이 생성되고, 휘발성 성분인 diallylsulfide, diallyldisulfide, diallyltrisulfide 등은 거의 소실되고 흔적 정도로 남게 된다. 흑마늘에 많이 들어있는 수용성 성분인 SAC는 항산화 항암, 인지기능향상등에 효능이 뛰어난 것으로 보고 하였다. 그리고 SAC는 열, \( \mathrm { pH } \), 빛에 안정하며 인체실험에서도 혈중 농도가 24시간 이상 지속될 정도로 지속성 유기 유황화합물 로 알려져 흑마늘의 기능성을 높이는데 큰 역할을 할 것으로 생각된다.

본 연구에서는 흑마늘의 주 성분인 SAC의 함량 변화를 관찰하였고, 이를 통해 흑마늘 제품의 표준화에 대한 연구를 수행하였다. 숙성 기간에 따른 SAC 함량의 변화를 분석한 결과, 15일 동안 숙성한 흑마늘에서 가장 높은 SAC 함량 및 최적의 관능적 특성을 보여, 이를 동물 실험에 사용하였다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 SAC가 갖는 항산화, 항암, 인지기능 향상 등의 효능에 대해 논의하였다.

따라서 흑마늘 중에 높은 함량이 들어있는 SAC은 흑마늘의 주요 기능성을 갖는 대표적인 성분으로 숙성 흑마늘 제품의 건강 기능성 지표물질로 이용이 가능하다. 체중 및 장기의 중량변화 고지방 식이로 고지혈증을 유도시킨 흰쥐에 15 일 숙성한 흑마늘 첨가식이를 6주 급이 하는 동안 체중 변화를 Table3 에 나타내었다. 정상군, 위약군 몇 실험군 등 모든 실험 동물군에서 6주 동안 실험 종료시점까지 지속적으로 체중이 증가하였다. 실험 시작한 날부터 6주째 동안 최종 몸무게를 보면 정상군은 \( 3.85 \pm 0.32 \mathrm { ~g } / \) day 이였으나, 정산군에 비하여 위약군은 \( 4.13 \pm 0.45 \mathrm { ~g } / \) day 증가하였으며, 흑마늘 추출물 저 농도군에서는 \( 4.12 \pm 0.48 \mathrm { ~g } / \) day, 중농도군이 \( 4.13 \pm 0.47 \) \( \mathrm { g } / \) day, 고농도군이 \( 4.17 \pm 0.38 \mathrm { ~g } / \) day으로 각가 증가하였다. 그러나 흑마늘의 저농도군, 중농도군, 고농도군 간에는 차이 는 없었다. 연구보고에 의하면 생마늘과 익힌 마늘은 각각 \( 3 \% \) 수준으로 첨가한 식이 실험에서 체중과 마늘 섭취량에 있어 대조군과의 유의적 차이가 없었다고 하였고 또한 흰쥐의 식이에 있어 생마늘과 가열마늘 급여군 간에도 유의적 차이가 없었다고 한 보고와 유사한 경향을 나타내었다. 본 연구에서는 실험 기간 동안 모든 실험 동물군에서 체중 이 지속적으로 증가하였고 실험군 간의 비교에서는 대조군 에 비해 실험군의 평균체중이 약간 증가하는 경향이었으나 유의적 차이는 찾아 볼 수 없었다. 고지혈증을 유도한 흰쥐 에 흑마늘을 첨가하여 급여한 흰쥐의 간, 심장, 신장의 중랑 을 측정한 결과를 Table 3에 나타내었다. 간장의 경우 정상 군에 비하여 위약군에서 증가하였으며 저농도, 중농도, 고농도로 급이한 흰쥐의 간장에서는 유의적 차이가 없었으며 심장 및 신장의 무게도 대조군에 비하여 약간씩 증가하였으나, 큰 차이는 없었다. 정상군이나 위약군에 비하여 흑마늘 추출물의 급이군의 장기 무게의 변화는 거의 없었다. 혈청 중의 지질의 함량변화 흑마늘 추출물을 저농도군, 중농도군, 고농도군 등 첨가량을 달리하여 6 주간 급여 한 후 흰쥐의 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, HLD-cholesterol, LDL cholesterol 함량을 측정한 결과는 Table 4 와 같다. 중성지방의 함량은 위약군이 \( 74.62 \pm \) \( 21.56 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 정상군의 \( 34.05 \pm 22.75 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 에 비하여 높았고 흑마늘 추출물의 급여시 저농도군 \( 45.21 \pm 4.37 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 중농도군 \( 45.38 \pm 18.35 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 고농도군 \( 43.49 \pm 17.68 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 위약군에 비하여 상당히 낮았으나 첨가농도에 따른 함량 변화는 거의 없었다.

고지방 식이로 고지혈증을 유도시킨 흰쥐에 15 일 숙성한 흑마늘 첨가식이를 6주 급이 하는 동안 체중 변화를 Table3 에 나타내었는데, 실험 기간 동안 모든 실험 동물군에서 체중 이 지속적으로 증가하였고 유의적 차이는 찾아 볼 수 없었다. 흑마늘 추출물을 저농도군, 중농도군, 고농도군 등 첨가량을 달리하여 6 주간 급여 한 후 흰쥐의 혈청의 중성지방, 총콜레스테롤, HLD-cholesterol, LDL cholesterol 함량을 측정한 결과 첨가농도에 따른 함량 변화는 거의 없었다.

식이섭취량 및 식이효율 실험기간 동안 식이섭취량은 매일 일정시각에 측정하였고 체중은 1 주일에 1 회 일정 시각에 측정하였다. 체중 증가량 \( ( \mathrm { g } ) \)은 같은 기간 동안의 총 식이섭취량 \( ( \mathrm { g } ) \)으로 나누어 식이효율을 구하였다. 혈장, 간 및 변의 지질 농도 혈장의 총 지방 농도는 Frings법으로 측정하였으며, 혈장의 중성지방 농도는 glycerol-3-phosphate oxidase(GPO)-PAP법을 이용한 분석 kit (영동제약)로 \( 546 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정(Genesys 10, spetronic, USA)하였다. 혈장 의 콜레스테롤 농도는 효소법을 이용한 분석 kit (영동 제약)를 이용하여 spectrophotometer (Genesys 10, spetronic, USA)로 \( 500 \mathrm { ~nm } \) 에서 비색정량 하였고 HDL-콜레스테롤 농도 는 LDL (Low-Density Lipoprotein) 및 VLDL (Very Low Density Lipoprotein)을 침전시킨 후 효소법로 측정하 는 분석 kit (아산제약)를 이용하여 \( 500 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정 (Genesys 10, spetronic, USA)하였다. 간의 총 지방 농도는 Bligh와 Dyer법으로 측정하였으며, 간의 중성지방과 콜레스테롤 농도는 위에서 추 출한 총 지방을 methanol로 녹여 혈장에서와 같은 방법으로 kit를 이용하여 측정하였다. 통계처리 자료의 통계처리는 SPSS (Statistical Package for the Social Science)를 이용하여 각 실험군의 평균값 \( \pm \) 표준편차로 나타냈으며 one-way ANOVA로 처리한 후 Duncan's new multiple test에 의해 실험군 간의 차이를 검증하고, \( p \) 값이 \( 0.05 \) 이하일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 결과 및 고찰 흑마늘의 제조 생마늘을 흑마늘로 숙성시킬 때 자동 숙성룸의 온도 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 상대습도 \( 90 \% \) 로 조절하여 숙성하였다. 숙성하는 동안 마늘 중의 휘발성성분은 소실되고, 마늘에 함유된 당분과 아미노산의 반응으로 갈변화가 일어나 시간 경과에 따라 흑갈색으로 변하였다. 본 실험에서는 숙성기간에 따른 풍미를 조사하여 제품의 규격기준의 표준화를 위하여 생마늘을 10 일 15 일 및 20 일 숙성 기간을 달리하여 흑마늘을 제조하였을 때 관능검사를 실시하였다. 마늘 숙성 시 숙성기간을 달리한 숙성 흑마늘의 색(color), 풍미(flavor), 외관(appearance) 및 종합적 기호도(overall acceptability)를 흑마늘 숙성을 10일, 15일 및 20일 숙성기간에 따른 관능평가를 실시한 결과 생마늘과 흑마늘 사이의 색, 외관은 유의적 차이가 있었으나 숙성기간에 따른 변화는 거의 비슷한 경향을 나타내었다(Table 2). 풍미에서는 숙성 10일, 15일 및 20일 등 숙성기간이 길어질수록 더 좋았으 며, 종합적 기호도에서도 숙성기간이 길어질수록 관능평가가 좋았다. 그러나 실제적으로 숙성 15일과 숙성 20일 시켰을 때 기호도는 비슷하였으나 실제 생산 공장에서는 경제적 생산을 위하여 숙성 15일째 흑마늘이 가장 적당하다고 생각된다.

실험기간 동안 식이섭취량은 매일 일정시각에 측정하였고 체중은 1 주일에 1 회 일정 시각에 측정하였고, 혈장의 총 지방 농도, 혈장의 중성지방 농도, 혈장의 콜레스테롤 농도, HDL-콜레스테롤 농도, 간의 총 지방 농도, 간의 중성지방과 콜레스테롤 농도의 흡광도를 측정하였다. 숙성 흑마늘의 제품 규격기준의 표준화를 위하여 본 실험에서는 생마늘의 숙성기간을 다르게 하여 흑마늘을 제조하였을 때 관능검사를 실시하였다.

본 연구는 흑마늘 숙성기간에 따른 S-allylcysteine의 함량을 조사함과 동시에 흰쥐에 고지방 콜레스테롤 식이를 급여하여 고지혈증을 유발시켜 흑마늘을 저농도, 중농도, 고농도로 구분하여 급이한 후 혈중 지질 개선효과를 조사하였다. 재료 및 방법 재료 본 연구에 사용한 마늘은 2010년 6월에 경남 남해에서 난지형 마늘을 구매하여 실힘에 사용하였다. 흑마늘의 제조 통마늘을 흐르는 물에 한 번 씻은 다음 스텐레스 제 밀폐용기에 담은 후 온도 \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 90 \% \) 상태로 조걸된 항온항습 숙성실(Asung Co. Seoul, Korea)에 옮겨 10일, 15일,20 일 동안 숙성시켰다. 훅마늘 \( 150 \mathrm { ~g } \) 에 물 \( 375 \mathrm { ml } \) 를 넣은 후 환류 냉각기가 부착된 추출기에서 \( 100 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 15 시간 추출한 후 여과한 다음 추출액 농도를 12 Brix로 조절한 후 실험에 사용하였다. HPLC에 의한 S-allylcysteine (SAC)의 분석 흑마늘 추출액의 전처리 흑마늘에 동량의 증류수를 넣어 분쇄하고 착즙한 후 착즙액을 \( 17,600 \times g \) 에서 \( 10,000 \mathrm { rpm } \) 으로 30 분간 원심분리 (HMR-2001V, Hanil Industrial Co., Inchon, Korea)하여 상층액만을 취하여 최종농도가 \( 70 \% \) 가 되도록 에탄올을 가하여 침전을 시킨 후 상층액을 농축하여 에탄올를 제거하였다. 그후 methylene chloride를 넣은 다음 약 20 분간 교반한 후 \(10,000 \mathrm { rpm } \)에서 15분간 원심분리(HMR-2001V, Hanil Industrial Co., Inchon, Korea)하여 물층과 methylene chloride층을 분리하였으며 물층을 rotary vacuum evaporator (N-H Series, Eyela, Japan)로 농축하여 methylene chloride층을 완전히 제거하였다. 분석 시 \( 0.2 \) \( \mu \mathrm { l } \) nylon membrane filter로 여과하여 사용하였다. 분석조건은 HPLC 분석방법[2]으로 이동상은 A용매[ \(20 \mathrm { mM } \) sodium phosphate monobasic dihydrate \( + 10 \mathrm { mM } \) so-dium 1-heptane-sulfonic acid, \( \mathrm { pH } 2.1 \) (adjusted with ortho-phosphoric acid \(85 \% \) ]와 B용매[A + acetonitrile \((50:50, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \)] 로 하여 컬럼오븐의 온도는 \( 38 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 이동상의 유속은 분당 \( 0.4 \mathrm { ml } \)이고 UV 흡광도 \( 208 \mathrm { ~nm } \) 에서 alliin, deoxyalliin, alliicin, dipeptide와 같은 마늘 성분의 표준물질을 분석하였다.

이 연구는 흑마늘 숙성기간과 S-allylcysteine의 함량, 그리고 고지방 콜레스테롤 식이로 인한 고지혈증 유발 및 흑마늘 급여에 따른 혈중 지질 개선효과를 살펴본다. 통마늘은 스테인리스 밀폐용기에 담겨 70℃, 상대습도 90%의 조건에서 10일, 15일, 20일 동안 숙성되며, HPLC 분석방법[2]을 통해 alliin, deoxyalliin, alliicin, dipeptide 등 마늘 성분의 표준물질이 분석된다.

서 론 현대 사회는 의약의 발달로 인간의 평균수명이 늘어나고 있으나 주요 사망원인이 되는 질병은 변하고 있다. 우리나라는 수년간 눈부신 경제성장으로 생활양식이 편리해지고 식생활이 서구화 되면서 각종 만성병이 증가하고 있으며 고혈압, 동맥경화 등 혈액순환기계 질환이 주요 사망 원인이 된다. 혈액순환기계 질환의 원인은 고혈압, 당뇨병, 비만과 함께 고지혈증을 들 수 있으며 그 중에서도 콜레스테롤의 농도가 주요한 위험인자로 알려져 있다. 실제로 콜레스테롤의 수치와 건강과의 관계를 연구한 보고를 보면 혈액 중 콜레스테롤의 수치가 \( 1 \mathrm { mmol } / 1 \) 증가 할 때 마다 허혈성 뇌졸중으로 인한 사망률은 \( 20 \% \), 심근경색으로 인한 사망률은 \( 48 \% \) 증가한다고 보고 하였다. 혈청 콜레스테롤과 중성지방 농도는 시대적 변화에 따라 나라별, 연령별, 성별, 지역별로 다르게 나타나지만 특히 경제 성장이 빠른 우리나라의 경우 혈청 콜레스테롤과 중성지방 농도의 폭은 매우 넓으며, 그 평균치가 해마다 높아지고 있다. 통계에 의하면 우리나라 남자의 경우 중성지방과다가 이상 소견 순위에서 1 위를 나타내어 혈청 콜례스테 롤과 중성지방이 많이 늘어난 것을 암시하고 있다. 따라서 고지혈증과 관련하여 식품 섭취를 통한 고콜레스테롤을 조절하거나 혈청 콜레스테롤을 저하시키는 식품성분중의 기능성이 있는 식품의 섭취가 바람직하다. 마늘은 특유의 냄새와 독특한 맛으로 인하여 예로부터 향신료와 민간약으로 널리 사용되어 왔으며 최근 들어 높은 사망률을 나타내는 여러 종류의 암이나 고혈압, 동맥경화, 혈중지질 및 콜레스테롤 저하효과, 항혈전의 예방과 치료에 효능이 있다고 알려지면서 많은 연구가 진행되고 있다. 마늘의 유효성분인 allicin은 마늘 특유의 휘발성 향기 성분으로 마늘조직이 파괴될 때 allinase에 의하여 생성되며 allicin이 분해되면 diallyl sulfide, diallyl disulfide, dithiin, ajoene 등의 휘발성 성분과 S-allylcysteine (SAC), S-allylmercaptocysteine 등의 수용성 유황화합물로 분해되어 효능을 나타낸다. 마늘은 기능성은 좋으나 특유의 거북스런 냄새 때문에 즐겨먹지 못하였으나 요즘 마늘의 화학적 성분의 특성을 살린 흑마늘이 인기리에 팔리고 있다. 흑마늘은 생마늘을 높은 온도와 습도에서 장시간 동안 숙성시키면 생마늘 특유의 거북한 냄새는 사라지고 신맛, 단맛, 쓴맛, 매운 맛이 어우려져 먹기 좋은 새콤 달콤 매콤한 맛이 난다. 흑마늘은 겉은 통마늘과 같은 모양 그대로 유지하고 있으나 속이 검다고 하여 붙여진 이름이다. 흑마늘은 오랜 숙성기간을 거치면서 마늘의 당 성분과 아미노산이 비효소적 갈변반응을 일으켜 melanoidins이 생성되고 휘발성 물질은 거의 소실되며 총 phenol, 플라보노이드가 증가하고 수용성 성분인 S-allylcysteine (SAC), S-allyl melcaptocystein (SAMC) 등이 생성되어 다른 기능성을 갖는다. 흑마늘의 대표적인 수용성 유황화합물인 SAC는 항산화, 암세포 증식억제, 인지기능향상, 간보호 등의 기능성이 보고되었다.

현대 사회의 만성병인 혈액순환기계 질환의 주요 위험인자는 콜레스테롤의 농도로 알려져있고, 예로부터 향신료와 민간약으로 사용되어온 마늘은 암, 고혈압, 동맥경화, 혈중지질 및 콜레스테롤 저하효과, 항혈전의 예방과 치료에 효능이 있다고 알려지면서 많은 연구가 진행되고 있다. 생마늘을 높은 온도와 습도에서 장시간 숙성시켜 먹기 좋은 맛이 나는 흑마늘은 숙성을 통해 melanoidins, 총 phenol, 플라보노이드, SAC, SAMC 등이 생성되어 항산화, 암세포 증식억제, 인지기능향상, 간보호 등의 기능성이 있다고 보고되었다.

이와 유사한 연구에서 돈지로 고콜레스테롤을 유도한 흰쥐 에서 혈중 콜레스테롤 함량은 \( 121.3 \pm 15.3 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 및 \( 103.4 \) \( \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 유의적 감소를 나타내었다고 하였고 또한 처리 조건을 달리한 마늘의 첨가 급이에도 혈첨 콜레스테롤의 저하 에 유의적 효과가 있었다고 보고하였다. 또한 고지혈증을 유도한 흰지에 고온에서 가열처리한 마늘과 생마늘을 급여한 경우를 비교한 실험에서 가열처리한 마늘을 급여한 경우 혈중 콜레스테롤의 함랑이 낮다고 보고한 바와 같이 본 실헙결 과에서도 마늘을 장기간 가뎔, 숙성하여 만든 흑마늘도 헐중 콜레스테롤의 저하를 확인한 바 숙성기간 따른 상관성이 있는 것으로 판단된다. LDL 콜레스테롤 농도는 대조군에 비하여 흑마늘 추출물 급이군에서 감소되기는 하였으나, 흑마늘 추출물의 첨가량에 따른 유의적 차이는 없었다. 여러 연구자들의 마늘을 이용한 다양한 실험에서 마늘이 고지혈증 개선작용이 있다고 보고하였다. 본 연구의 흑마늘의 중성지방이나 콜레스테롤 감소 현상은 다른 연구자들의 실험결과와 유사한 경향을 나타낸다 고 판단된다. 본 실험에서는 흑마늘 추출물을 급이한 실험군 에서는 정상군과 비슷한 경향으로 증가한 것으로 나타나 마늘의 숙성 중 마늘성분의 화학적 변화를 일으켜 다른 새로운 성분이 많이 생성된 것으로 생각된다. 고지혈증 관련 양파를 이용한 실험에서 양파의 주요 생리할성성분인 S-methylcysteine-sulfoxide를 체중 \( \mathrm { kg } \) 당 \( 200 \mathrm { mg } \) 을 \( 10 \% \) 고콜레스테롤 식이를 급이한 결과 고지혈증이 개선되었다고 하였으며, 특히 이러한 개선효과는 지방조직의 lipoprotein lipase의 활성을 억제하거나, free fatty acid의 감소에 구실을 할 것으로 보고하 였다. 또 대표적인 지방합성 효소인 glucose 6-phosphate dehydrogenase, \( \mathrm { HMG } \) CoA reductase의 훨성을 억제하는 것 으로 보고하였다. 마늘에도 S-methylcysteine sulfoxide등 수 많은 유기 유황화합물이 많이 들어있어 마늘의 고지혈중 개선효과가 있는 것으로 판단된다. 간의 지질변화 흑마늘 추출물을 저농도, 중농도 및 고농도로 6 주간 급여하여 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 간 조직 중의 총지질, 총콜레스테롤, 중성지방에 미치는 영향을 Table 5 와 같다. 간 조직의 총지방의 함량은 대조군에서 \( 32.34 \pm 9.59 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 위약군에서는 \( 140.43 \pm 23.27 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 약 6.3배 정도 높은 함량을 나타내었으나, 흑마늘 급여군인 저농도, 중농도 및 고농도에서는 가각 \( 116.51 \pm 28.03 \mathrm { mg } / \mathrm { g } , 108.56 \pm 30.41 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \), \( 106.27 \pm 29.46 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 위약군에 비하여 상당히 감소하였 다. 총 콜레스테롤은 정상군은 \( 3.92 \pm 0.24 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 이었으나 위 약군을 \( 12.65 \pm 0.63 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 으로 약3.2배 정도 증가 하다가 흑 마늘 추출물의 첨가식이 농도인 저농도, 중농도 및 고농도 에서는 각각 \( 9.43 \pm 0.43 \mathrm { mg } / \mathrm { g } 9.40 \pm 0.28 \mathrm { mg } / \mathrm { g } \) 범위로 유의적 감소를 나타내었으나 흑마늘 첨가식이 농도간의 차이는 없었다. 이와 같은 결과는 흑마늘 급여로 인한 체내 지질 축적 억제와 더불어 식이성 고콜레스테롤의 홉수는 방해하는 2 가지 효과가 있는 것으로 추정된다. 마늘과 고 콜레스테롤의 식이에 관한 연구에서도 마늘 첨가군이 대조군에 비해서 간조직 중의 중성지방과 총 콜레스테롤은 낮았으나 유의적 차이가 없었다고 보고하였다.

흑마늘 추출물의 첨가량과 숙성기간 따라 LDL 콜레스테롤 농도가 감소하는 것이 확인되었다. 돈지로 고콜레스테롤을 유도한 흰쥐 에서 혈중 콜레스테롤 함량은 감소되었고 처리 조건을 달리한 마늘의 첨가 급이에도 혈첨 콜레스테롤의 저하에 효과가 있었다. 또한 고지혈증을 유도한 흰지에 가열처리한 마늘을 급여한 경우 혈중 콜레스테롤의 함랑이 낮다고 보고한 바와 같이 본 실헙결과에서도 마늘을 장기간 가뎔, 숙성하여 만든 흑마늘도 헐중 콜레스테롤의 저하를 확인한 바 숙성기간 따른 상관성이 있는 것으로 판단된다. 마늘에도 S-methylcysteine sulfoxide등 수 많은 유기 유황화합물이 많이 들어있어 마늘의 고지혈중 개선효과가 있는 것으로 판단된다.

중성지질의 농도는 마늘을 첨가한 고클레스테롤 식이에 혈중 중성지질의 함량이 유의적으로 지하하였다는 연구와 고지혈증 환자에게 건조마늘을 급여하였을 때 대조군에 비하여 중성지질 농도를 저하시킨다는 보고와 본 연구는 비슷한 경향을 나타내었다. 고콜레스테롤 혈증을 유발하는 흰쥐에 마늘즙을 \( 1 \% \) 및 \( 2 \% \) 급이한 경우 유의적 감소를 나타내었다고 하였다. 그러나 마늘 첨가량과 마늘의 열처리에 의하여 혈중 지질함량은 감소할 뿐 유의성은 없다는 보고도 있다.본 실험에서는 고지방식이로 급여한 흰쥐의 중성지질이 증가하였으나 흑마늘 추출물을 저농도, 중농도 및 고농도의 모든 급여군에서 중성지질의 감소하는 경향으로 나타났으므로 흑마늘 추출물이 혈중 지질함량을 저하시키는 것으로 사료된다. 총 콜레스테롤의 농도.는 정상군이 \( 103.41 \pm 28.67 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \), 위약군은 \( 182.51 \pm 27.48 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 대조군에 비하여 약 \( 1.4 \) 배 증가하였으나 흑마늘 추출물을 지눙도, 중농도, 고농도의 단계별 급이군에서는 각각 \( 143.47 \pm 28.15 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } , 136.54 \pm 26.06 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \)및 \( 130.05 \pm 28.47 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 이었다. 이러한 결과는 총 콜레스테롤의 농도가 위약군의 경우 고지방 급이에 의하여 증가되었으나, 고지방식이와 함께 급이된 흑마늘 추출물의 첨가가 농도에 따라 감소되었음을 알 수 있었다. 혈청중의 HDL-콜레스테롤의 농도는 대조군에 비하여 흑마늘의 저농도군, 중농도군 및 고농도군에서 유의성 있게 증가하였다. 특히 위약군에서 \( 22.53 \pm 4.69 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 정상군의 \( 31.28 \pm 4.41 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 약 \( 1.4 \) 베 감소하였으나 흑마늘 추출물의 모든 첨가군에서 상당히 높은 함량을 나타내어 흑마늘 추출물이나변 콜레스테롤인 LDL의 혈관 막힘을 막아주는 역할을 하는 것으로 관단된다. 그리고 본 실험에서 LDL-콜레스테롤의 농도는 정상군의 \( 65.43 \pm 24.76 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 에 비하여 위약군의 \( 149.51 \pm 8.02 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 증가하였으나, 흑마늘 추출물을 저농도군, 중농도군 및 고농도군에서는 각각 \( 127.21 \pm 28.65 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } , 124.31 \pm 25.76 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 및 \( 124.65 \pm 27.53 \mathrm { mg } / \mathrm { dl } \) 로 위약군에 비하여 상당한 수준으로 감소하여 흑마늘 추출물의 첨가식이에 따라 LDL이 낮아지는 것을 알 수 있었다.

마늘 첨가가 혈중 중성지질 함량을 유의적으로 낮추는 연구 결과와, 건조마늘을 고지혈증 환자에게 급여했을 때 중성지질 농도를 줄임을 확인한 보고와 본 연구의 결과는 유사했다. 총 콜레스테롤의 농도는 위약군에서 고지방 급여로 인해 증가되었으나, 고지방식과 함께 흑마늘 추출물을 급여하면 농도가 감소되었다. 흑마늘의 저농도군, 중농도군, 고 농도군에서 혈청 중의 HDL-콜레스테롤의 농도는 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다.

효소활성에 대한 온도의 영향 효소의 최적반응 온도를 결정하기 위해 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } \) 8.0)로 녹인 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \)를 각 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위의 배양기에 넣고 4 시간 후 plate의 용해면적을 축정하여 효소의 활성을 비교하였다. 온도의 안정성은 효소액을 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 각각 30 분간 열처리 한 후 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 동안 방치한 후 잔존 활성을 측정하였다. 효소활성에 미치는 금속 2 가 이온의 영향 정제한 효소의 활성에 대한 금속 이온의 영향을 알아보기 위하여 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CuSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { ZnSO } 4, \) EDTA를 최종 농도가 각각 \( 1 \mathrm { mM } \) 이 되도록 혈 전용해 효소를 녹인 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer (pH7.5)에 첨가한 뒤, 효소와 금속 2가 이온이 포함 혹은 효소만 포함된 용액을 \( 100 \mu l \) 씩 paper disc에 흡입시켜 fibrin plate에 점적하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 8 시간 반응 후 효소만 포함된 용해된 면적을 \( 100 \% \) 으로하여 각각의 금속이온이 포함된 효소용액의 용해된 면적을 상대적 측정값으로 나타내었다. 결과 및 고찰 균주의 분리 및 동정 경남 김해시 일대에서 채취한 마른 볏짚으로부터 균주를 분리한 다음 이들 중 혈전용해 효소를 생산하는 균주를 선정하였다. 선정된 균주는 Gram 양성의 균주로 그 크기는 약 \( 0.49 \times 1.59 \mu \) 이었으며, 운동성이 있고 호기성이며 내생포자를 형성하였다. 최적 배양온도는 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 였고, \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 생육가능하였다. 생육 가능한 \( \mathrm { pH } \) 의 범위는 \( 5.0 \sim 9.0 \) 이였고, 생육 최적 \( \mathrm { pH } \) 는 7.0이었다. 생화학적, 생리학적 특성은 Table 1에 나타내었다. 결론적으로 이 균주의 형태학적,생화학적, 생뢰학적 녹성을 분석해본 결과 Bacillus subtilis인것으로 확인되었다.

효소의 최적 반응 온도를 확인하기 위해, 효소를 Tris-HCl buffer에서 녹인 뒤 fibrin plate에 점적하고 각기 다른 온도에서 4시간 동안 반응시켜 효소 활성을 비교하였다. 또한, 금속 이온의 영향을 알아보기 위해 다양한 금속 이온을 첨가한 후 효소의 활성을 비교하였다. 결과적으로 최적 배양온도는 \( 35 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 생육 가능한 온도 범위는 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \( 45 ^ {\circ } \mathrm { C } \)이며, 생육 가능한 \( \mathrm { pH } \) 범위는 \( 5. 0 \sim 9 . 0 \)이고, 생육 최적 \( \mathrm { pH } \)는 7.0이었다.

분자량 측정 BK는 부탄올 농축, 투석, 에탄올 침전, DEAE Sephadex A-50 chromatography, 그리고 Sephadex \( G-75 \) gel filtration을 이용하여 정제하였다. 이 정제된 효소를 SDS-PAGE 전기영동 결과 단일 band롤 화인 할 수 있었으며, 그 분자량은 약 \( 31 \mathrm { kDa } \) 이었다(Fig. 2). Bacillus subtilis BK-17 균주가 생산하는 fibrinolytic enzyme(BK)의 분자량은 지금까지 알려진Bacillus subtilis k-54(29 kDa)와 Bacillus sp. CK11 \( 4(28 \) \( \mathrm { kDa } \) 이 생산하는 fibrinolytic enzyme과 유사하였으나, \( \mathrm { Ba } \) cillus subtilis \( \mathrm { KCK } -7(45 \mathrm { kDa } ) \), Bacillus amyloiquefaciens \( \mathrm { K } 42 \) \( (45 \mathrm { kDa } ) \) 가 분비하는 혈전분해 효소의 분자량보다 작았다. 효소활성과 안정성에 대한 pH의 영향 BK의 활성 및 안정성에 미치는 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 조사하기위해 \( \mathrm { pH } 4.0 \) 10.0까지 조정한 반응액을 이용하여 활성 및 안정성을 검토한 결과, BK의 활성은 \( \mathrm { pH } 7 과 8 \) 에서 최대였다. \( \mathrm { pH } 7 및 8 \) 에서의 활성을 \( 100 \% \) 로 하였을 때, \( \mathrm { pH } 4,5,6 \) 에서 각각 \( 50 \%, 75 \%, 95 \% \) 의 활성을 유지했으며 \( \mathrm { pH } 9 \) 와 10 에서는 각각 \( 85 \% \) 와 \( 80 \% \) 의 활성을 나타내었다. 따라서 BK는 산성에서보다 알칼리에서 더 좋은 활성을 유지하였다. 이 결과는 양등이 보고한 멸치액젓 유래의 MK와 백등이 보고한 Bacillus subtilis KCK-7 가 분비하는 fibrinolytic en-zyme과 비슷한 양상을 보였다. BK 의 \( \mathrm { pH } \) 에 대한 안정성은 활성이 보인 양상과 비슷하였다. 결론적으로 BK의 최적 활성 및 안정성을 보여주는 \( \mathrm { pH } 7과 8 \)로 나타났다. 효소의 활성 및 안정에 대한 온도의 영향 BK의 활성 및 안정성에 미치는 온도의 영향을 검토하기위해 반응온도를 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 \( 10 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 간격으로 30 분 동안 반응시켜 BK의 상대활성 및 안정성을 표시한 결과, BK는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 반응최적 온도를 보였다. \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 BK의 활성은 점진적으로 증가되었으며, 그 이상의 온도에서는 급격히 감소하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( \mathrm { BK } \) 의 활성을 \( 100 \% \) 로 보았을 때, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 40 \%, 80 \) 에서 \( 20 \% \) 의 활성을 보였다. 이 결과는 윤등이 보고한 Bacillus amyloliquefaciens K42가 생산하는 fibrinolytic enzyme과 백등이 보고한Bacillus subtilis KCK-7이 분비하는 fibrinolytic enzyme과 비슷한 양상을 보였다. BK의 열에 대한 안정성은 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서 아주 놓았으며, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서는 급격히 감소되었다. 이 결과 역시 윤등, 백등이 보고한 결과와 유사하였다. BK의 최적 활성 및 안정성의 온도는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이었다.

BK는 부탄올 농축, 투석, 에탄올 침전, DEAE Sephadex A-50 chromatography, 그리고 Sephadex \( G-75 \) gel filtration을 이용하여 정제하였으며 BK의 활성 및 안정성에 미치는 \( \mathrm { pH } \)의 영향을 조사하기위해 \( \mathrm { pH } 4.0 \) 10.0까지 조정한 반응액을 이용하여 활성 및 안정성을 검토한 결과, BK의 활성은 \( \mathrm { pH } 7 과 8 \)에서 최대였다.

효소활성에 대한 금속 이온의 영향 금속이온이 첨가되지 않았을 때의 활성을 \( 100 \% \) 로 하여 그 상대적인 활성을 측정하였을 때, \( 1 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 와 \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \) 에 \( 100 \% \) 활성을 유지 하였으며, \( \mathrm { Zn } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Co } ^ { 2 + } \) 에 대해서는 각각 \( 65 \%, 77 \%, 77 \%, 82 \%, 95 \% \) 의 활성을 나타내었다. 반면 동일농도의 EDTA에 의해서 \( 45 \% \) 의 활성저해를 보였다. 이러한 사실은 기존의 대두발효식품인 natto와 청국장, 된장에서 분리한 fibrinolytic enzyme이 대부분 ser-ine enzyme인 것인데 반해 본 연구의 B. subtilis BK-17이 생산하는 fibrinolytic enzyme은 metallo enzyme인 것으로 생각된다. 기질에 대한 특이성 혈전용해효소는 fibrin을 분해하는 양상에 따라 2가지로 나눌 수 있다. 그 중 하나는 혈액 중 plasminogen을 active type 인 plasmin으로 변화시켜 plasmin으로 하여금 혈전(fibrin)을 분해하도록 하는 plasminogen activator type과 이와 상관없이 효소자체가 직접 혈전을 분해시키는 direct active type이 있다. 이를 확인하기 위하여 plasminogen-rich fibrin plate와 plasminogen-free fibrin plate를 사용하였다.그 결과 본 정제효소는 plasminogen-rich fibrin plate에서 뿐만 아니라 plasminogen이 제거된 plasminogen-free fibrin plate에서도 비슷한 fibrin 분해 활성을 보였다. 그러므로 본 효소는 plasminogen을 plasmin으로 activation하여 plasmin에 의하여 혈전(fibrin)을 분해하도록 하는 plasmi-nogen activator type이라기 보다는 fibrin에 직접 활성을 가지는 것으로 생각된다. Fig. 5에 나타난 것처럼, plasminogen rich plate에서 약 \( 10 \% \) 의 활성이 더 높은 것으로 보아 다소의 plasminogen activator 역할도 할 것으로 사료된다. 첨가적으로 다양한 종류의 기질을 포함한 fibrin plate, red blood agar plate, gelatin plate, skim milk plate, casein plate등을 이용한 효소활성을 검토한 결과, Fig. 6 에 나타난 것과 같이 본 정제 효소는 fibrin plate에서만 clear zone이 형성되었지만, 나머지 plate에서는 전혀 활성을 보이지 않았다. 따라서 BK는 Fig. 6에 나타난 것처럼 fibrin을 특이적으로 분해함이 밝혀졌다.

금속 이온 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Mn } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Zn } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Cu } ^ { 2 + } \), \( \mathrm { Co } ^ { 2 + } \)의 첨가로 효소 활성이 100%, 100%, 65%, 77%, 77%, 82%, 95%로 증가하였고, EDTA의 첨가로 45%의 활성 저해가 나타났다. 이는 natto, 청국장, 된장에서 분리한 fibrinolytic enzyme의 활성에 대해 금속 이온의 영향을 알 수 있게 한다. 또한, 혈전용해요소는 크게 2가지로 나눌 수 있는데, Plasmin이 혈전을 분해하는 타입과 효소가 직접 혈전을 분해시키는 타입이 있다.

효소활성에 대한 온도의 영향 효소의 최적반응 온도를 결정하기 위해 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))로 녹인 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \)를 각 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위의 배양기에 넣고 4 시간 후 plate의 용해면적을 축정하여 효소의 활성을 비교하였다. 온도의 안정성은 효소액을 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 각각 30 분간 열처리 한 후 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \) 를 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 4 시간 동안 방치한 후 잔존 활성을 측정하였다. 효소활성에 미치는 금속 2 가 이온의 영향 정제한 효소의 활성에 대한 금속 이온의 영향을 알아보기 위하여 \( \mathrm { CaCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CoCl } _ { 2 } \), \( \mathrm { CuSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { FeSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { MgSO } _ { 4 } \), \( \mathrm { ZnSO } 4 \) EDTA를 최종 농도가 각각 \( 1 \mathrm { mM } \) 이 되도록 혈 전용해 효소를 녹인 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer \( ( \mathrm { pH } 7.5) \)에 첨가한 뒤, 효소와 금속 2가 이온이 포함 혹은 효소만 포함된 용액을 \( 100 \mu l \) 씩 paper disc에 흡입시켜 fibrin plate에 점적하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 8 시간 반응 후 효소만 포함된 용해된 면적을 \( 100 \% \) 으로하여 각각의 금속이온이 포함된 효소용액의 용해된 면적을 상대적 측정값으로 나타내었다.

효소의 최적반응 온도를 결정하기 위해 \( 20 \mathrm { mM } \) Tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } 8.0 \))로 녹인 효소를 점적한 fibrin plate \( ( \mathrm { pH } 7.8) \)를 각 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위의 배양기에 넣고 4 시간 후 plate의 용해면적을 축정하여 효소의 활성을 바교하고 금속 2가 이온이 포함된 효소용액이나 효소만 포함된 용액을 paper disc에 흡입시켜 fibrin plate에 점적하고 37\(^\circ \mathrm{C}\)에서 8시간 반응 후 용해된 면적을 100%로하여 금속이온이 포함된 효소용액의 용해된 면적을 상대적 측정값으로 나타냈다.

최근 급속한 시대적 변화에 대응하여 간편하고 편리한 식문화 형성으로 인하여 혈액순환 장애에 따른 심혈관계의 질환 발병률이 증가하고 있으며, 이로 인한 사망률 역시 급속히 증가되고 있다. 상처 혹은 혈전 형성 자극이 유발되면 혈관내피 세포의 변화로 지혈에 관여하는 세포내 단백질들의 분비 및 혈소판 세포 표면의 특성이 변하여 혈전형성 환경이 조성된다. 혈소판 부착 및 활성, 동시에 혈장응고 활성이 트롬빈 형성을 촉진하여 피브린이 축적된다. 일반적으로 혈관내의 피브린 축적으로 인한 혈전의 형성 및 증가로 혈액의 흐름을 방해하거나 혈관을 따라 이동하면서 뇌경색, 심근경색과 같은 질병을 유발한다. 그러므로 혈전은 혈액 순환계 질환의 대표적인 원인중의 하나이다. 혈전은 상처회복 후 프라즈민(plasmin)과 같은 혈전분해 효소(fibrinolytic en-zyme)에 의해서 분해된다. 만약 생성된 혈전이 과도하게 축적되거나 혈전용해 기작이 원활하게 작동하지 않을 경우 혈전증(thrombosis)을 유발하여 인체에 치명적인 손상을 줄 수도 있다. 따라서 혈전분해 시스템은 혈관기능 유지 및 혈관외벽의 피브린 축적의 분해에 있어서 필수적이다. 또한 병리학적 상태에서 다수의 다른 단백질 분해 효소들과 협력하여 세포외 기질들의 분해에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 프라즈민은 혈전분해 시스템에서 피브린 분해의 핵심 단백질 분해제이다. Bacillus속의 균주들은 혈전분해 효소를 포함하여 다양한 종류의 단백질 분해효소들을 분비하는 특성이 있다. 최근 한국과 일본을 중심으로 전통발효 식품에서 혈전분해능을 가진 많은 Bacillus 속의 균주들이 분리되고 있으며, 이들이 분비하는 혈전효소에 대한 연구가 진행되어오고 있다. 특히 일본의 전통대두 발효식품인 natto (nattoki-nase)와 절임 식품인 Shiokara (katsuwokinase) 에서 혈전용해 효소 생산균주를 분리하고 효소를 정제하였으며, 이의경구 투여 시 생체내의 혈전용해능을 높일 수 있다고 보고하였다. 현재 사용되고 있는 혈전분해제로는 ur-okinase (UK), streptokinase(SK), tissue type plasmninogen activator (tPA) 등이 있다. 하지만 이와 같은 제품은 반감기가 짧고, 가격이 매우 비싼 단점을 지니고있다. 또한 urokinase를 제외하고는 경구투여가 불가능한 실정이다. 따라서 이러한 단점들을 해결하고자 본 연구진은 이전 연구에서 한국인이 오랫동안 먹어오고 있는 식품인 김치 및 멸치 젓갈로부터 혈전용해 효소를 분리하고 그 활성에 대해 보고하였다. 본 연구에서는 볏짚으로부터 혈전 용해력을 가진 균주를 분리 - 동정 하고, 이 균주가 생산하는 혈전용해 효소의 특성에 대해 연구하였다. 재료 및 방법 혈전용해효소 생산균주의 분리 경남 김해 일대에서 채취한 마른 볏짚을 \( 2-3 \mathrm { ~cm } \) 의 크기로 자른 다음 분리용 배지( \( 2.0 \% \) glucose, \( 1.0 \% \) bacto peptone, \( 0.1 \% \mathrm { ~K } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } , 0.5 \% \mathrm { NaCl } , \mathrm { pH } 7.0 \))가 들어있는 \( 18 \mathrm { ~mm } \) 시험관에 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간동안 진탕배양한 후 멸균수로 \( 10 ^ { -5 } \)까지 희석한 시료 \( 100 \mathrm { ml } \) 를 분리용 고체 배지에 도말봉으로 접종하여, \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 1-2 \) 일간 배양시켰다. 생성된 동일한 col-ony들을 각 2장의 LB 평판배지(1.0 \% tryptone, \( 0.5 \% \) yeast extract, \( 0.5 \% \mathrm { NaCl } , 1.5 \% \) agar)에 나누어 toothpick 하여 3 \( 7 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 배양 후 그중 한 장의 평판배지에 \( 0.6 \% \) fibri-nogen solution과 20 unit thrombin으로 조성된 배지를 중층하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24 시간 배양시켰다. 이들 중 fibrin을 분해시켜 clear zone을 형성하는 균주를 확인하고 보관중인 다른 1 장의 평판배지에서 동일한 colony를 선택하여 분리용 액체 배지에 배양하여 그 상등액에서 혈전용해 활성을 검토한 후 최종적으로 균을 선별하였다.

최근 혈액 순환 장애로 인해 발생하는 질병의 발병률과 사망률이 급속하게 증가하고 있다. 이는 간편하고 편리한 식문화 형성에 따른 결과로, 상처 혹은 혈전 형성 자극에 의해 혈관내피 세포의 변화로 혈전이 축적되어 혈액 순환계 질환을 유발하고 있다. Bacillus속의 균주들은 혈전분해 효소를 포함하여 다양한 종류의 단백질 분해효소들을 분비하는 특성이 있으며, 김치 및 멸치 젓갈로부터 혈전용해 효소를 분리하고 그 활성을 연구하고 있다.

요 약 마른 볏짚으로부터 fibrinolytic enzyme (BK)을 분비하는 균주를 분리하여 동정한 결과, Bacillus subtilis속으로 분류되었다. 분리된 균주(Bacillus subtilis BK-17)를 배양하여 그 배양액으로부터 에탄올 침전, ion exchange, gel filtration 등의 과정을 거쳐 fibrinolytic enzyme (BK)를 분리 및 정제하였다. 이 정제된 효소를 SDS-PAGE gel 전기영동한 결과 분자량은 약 \( 31 \mathrm { kDa } \) 이었다. BK의 활성 및 안정성에 대한 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 조사해본 결과, \( \mathrm { pH } \) 6~8범위에서 매우 높았고, 최적 \( \mathrm { pH } \) 는 7과 8이었다. 본 효소의 활성 및 안정성에 대한 최적 온도는 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 이었으며, \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서는 안정성이 그대로 유지되었지만 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \sim 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 범위에서는 현저히 감소하여 5 \( 0 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에 비해 \( 20 \% \sim 40 \% \) 의 활성을 보였다. BK에 대한 활성 역시 안정성과 비슷한 양상을 보였고, 다만 \( 20 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 약 \( 62 \% \) 의 활성을 보였고, 그 이후 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 지속적으로 증가하여 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 최대의 활성을 보였다. 실험한 금속이온들 중 \( 1 \mathrm { mM } \) 의 \( \mathrm { Zn } ^ { 2 + } \) 와 \( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \) 에서 각각 \( 35 \% \) 와 \( 23 \% \) 의 저해활성을 보였지만 나머지 이온들에서는 의미 있는 영향이 없었다. 동일농도의 \( \mathrm { EDTA } \) 에 대해서는 \( 45 \% \) 의 저해활성을 보였기 때문에 \( \mathrm { BK } \) 는 metallo enzyme으로 생각된다. Fibrinogen-rich fibrin plate 와 plasminogen-free fibrin plate에서의 분해활성을 검토해 본 결과, 두 plate에서 비슷한 분해활성을 보였다. 따라서 본 효소는 plasminogen activator type 보다는 fibrin에 직접 활성을 가지는 것으로 생각된다.

마른 볏짚에서 분리된 균주 Bacillus subtilis BK-17로부터 fibrinolytic enzyme (BK)를 분비하였다. BK는 에탄올 침전, 이온 교환, 겔 여과 등의 과정을 통해 분리 및 정제되었으며, 이는 plasminogen activator type보다는 fibrin에 직접 활성을 가지는 것으로 분석되었다. BK는 \(45\%\)의 EDTA에 대한 저해활성을 보였으므로 metallo enzyme로 판명되었다. 또한, BK의 활성은 \(20^{\circ}\mathrm{C}\)에서 약 \(62\%\)를 보여주며, \(50^{\circ}\mathrm{C}\)까지 지속적으로 증가하여 이 때 최대 활성을 나타냈다.

혈전용해 활성의 측정(fibrin plate assay) Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 \( 2 \% \) gelatin 용액에 녹인 \( 0.2 \% \) fibrinogen 용액 \( 10 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.2 \mathrm { M } \) borate 완충 용-액 \( ( \mathrm { pH } 7.8 \) )에 녹인 thrombin 20 unit를 적하하여 잘 섞은 후 이를 petri-dish에 부어 fibrin막을 만들었다. 효소용액을 \( 100 \mu 1 \) 씩 paper disc 에 훕입시켜 plate에 놓고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18시간 방치 하였다. 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. Fibrin plate는 plasminogen이 제거된 fibrinogen과 plasminogen이 포함된 fibrinogen을 이용하여 두 가지 방법으로 준비하였다. 분자량 측정 분리된 단백질의 분자량은 전기영동을 실시하여 결정 하였으며 전기영동은 \( 4 \% \) stacking gel 과 \( 12.5 \% \) separating gel로 이루어진 SDS-PAGE를 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 동안 전기영동한 후 gel을 coomassie로 염색하였다. 분자량 측정을 위해 low molecular weight standard (Bio-rad)를 사용하였다. 효소활성에 대한 pH의 영향 효소의 활성에 미치는 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium citrate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.0,4.0,5.0) \), \( 20 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 6.0,7.0), 20 \mathrm { mM } \)Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } 8.0 \) ), \( 20 \mathrm { mM } \) sodium carbonate buffer \( ( \mathrm { pH } 9.0,10.0) \) 로 희석하여 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정한 다음, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였고, 최적 반응 \( \mathrm { pH } \) 는 각 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정된 효소액을 사용하여 효소활성의 \( \mathrm { pH } \) 의존성을 검토하였다.

Haverkata-Trass의 fibrin plate법을 이용하여 fibrin막을 제작하였다. 분리된 단백질의 분자량은 4%의 stacking gel과 12.5%의 separating gel로 구성된 SDS-PAGE를 통한 전기영동으로 결정하였다. 효소의 활성에 영향을 미치는 pH를 조사하기 위해 다양한 pH 조건에서 효소를 희석한 후 잔존활성을 측정하고, 효소활성의 pH 의존성을 검토하여 최적 반응 pH를 결정하였다.

혈전용해 활성의 측정(fibrin plate assay) Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 \( 2 \% \) gelatin 용액에 녹인 \( 0.2 \% \) fibrinogen 용액 \( 10 \mathrm { ml } \) 에 \( 0.2 \mathrm { M } \) borate 완충 용-액 \( ( \mathrm { pH } 7.8 \) )에 녹인 thrombin 20 unit를 적하하여 잘 섞은 후 이를 petri-dish에 부어 fibrin막을 만들었다. 효소용액을 \( 100 \mu 1 \) 씩 paper disc 에 훕입시켜 plate에 놓고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 18시간 방치 하였다. 효소에 의해 fibrin막이 용해되면 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. Fibrin plate는 plasminogen이 제거된 fibrinogen과 plasminogen이 포함된 fibrinogen을 이용하여 두 가지 방법으로 준비하였다. 분자량 측정 분리된 단백질의 분자량은 전기영동을 실시하여 결정 하였으며 전기영동은 \( 4 \% \) stacking gel 과 \( 12.5 \% \) separating gel로 이루어진 SDS-PAGE를 사용하여 \( 100 \mathrm { ~V } \) 에서 2시간 동안 전기영동한 후 gel을 coomassie로 염색하였다. 분자량 측정을 위해 low molecular weight standard (Bio-rad)를 사용하였다. 효소활성에 대한 pH의 영향 효소의 활성에 미치는 \( \mathrm { pH } \) 의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 \( 20 \mathrm { mM } \) sodium citrate buffer \( ( \mathrm { pH } 3.0,4.0,5.0) \), \( 20 \mathrm { mM } \) potassium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } 6.0,7.0), 20 \mathrm { mM } \)Tris- \( \mathrm { HCl } \) buffer ( \( \mathrm { pH } 8.0 \) ), \( 20 \mathrm { mM } \) sodium carbonate buffer \( ( \mathrm { pH } 9.0,10.0) \) 로 희석하여 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정한 다음, \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였고, 최적 반응 \( \mathrm { pH } \) 는 각 \( \mathrm { pH } \) 별로 조정된 효소액을 사용하여 효소활성의 \( \mathrm { pH } \) 의존성을 검토하였다.

Haverkata-Trass의 fibrin plate법에 따라 gelatin, fibrinogen, borate 완충 용액과 thrombin이 포함된 petri-dish에 paper disc에 훕입시킨 효소용액을 놓고 \(\mathrm{37^{\circ} C}\)에서 18시간 방치하여 fibrin막의 용해면적을 측정하여 상대적인 활성을 측정하였다. 분리된 단백질의 분자량은 전기영동하여 결정하고, 효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해 농축한 효소를 다양한 pH로 조정하여 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였다.