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Titolo: Nuove tecniche di amplificazione e sequenziamento proteine

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TECNICA DI AMPLIFICAZIONE PROTEINE
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Si tratta di un procedimento simile alla PCR che consente di replicare la
stessa proteina un gran numero di copie.
IPOTESI:
Il motivo per cui una proteina potrebbe replicarsi è dovuto al fatto che,
come per i nucleotidi, anche gli amminoacidi hanno una parte della loro
molecola, in questo caso il "gruppo (R) variabile" che può essere
complementare al "gruppo (R) variabile" di un'altro amminoacido forse se
posto in posizione antiparallela.
I motivi per cui di norma le proteine non si replicano se poste in soluzione
con i 20 amminoacidi sono questi:
1: Sono avvolte su se stesse. 2: E' possibile che alcuni amminoacidi possano
essere complementari e quindi legarsi a più di un solo tipo di amminoacido.
3: Occorre come per la PCR il "primer" un breve frammento polipeptidico che
si aggancierà, ad una determinata temperatura, con i "gruppi (R) variabili"
dei suoi amminoacidi a quelli della proteina da replicare. 4: Occorre una
determinata temperatura, concentrazione degli amminoacidi, e forse
un'appropiato enzima.
Quindi denaturando la proteina in particolari condizioni di concentrazione
amminoacidi e temperatura, e fornendo i 20 amminoacidi e forse anche
l'appropiato enzima, sarebbe possibile replicarla come avviene nella PCR.
L'unico problema è la possibilità che alcuni dei 20 amminoacidi possano
essere complementari e quindi legarsi a più di un tipo di amminoacido. Per
risolvere questo problema occorre sintetizzare degli amminoacidi più
selettivi; Esempio:
Immaginiamo che l'amminoacido (A) possa legarsi sia con l'amminoacido (B)
che non l'amminoacido (C), in tal caso occorrerà sintetizzare due
amminoacidi artificiali modificando la struttura dell'amminoacido (A) in
modo da renderlo in grado di legarsi solo l'amminoacido (B) ma non con (C),
e poi sintetizzarne un'altro in grado di legarsi solo l'amminoacido (C) ma
non con (B).
Avremo così a disposizione un gruppo di amminoacidi (tra i quali alcuni
modificati) ognuno dei quali capace di legarsi ad un solo altro amminoacido
complementare.
Diventa così possibile con un procedimento simile alla PCR ottenere, prima
una proteina (B) costituita esclusivamente da amminoacidi più selettivi,
complementare alla proteina (A) da amplificare, poi replicare la proteina
(B) ottenendone un gran numero di copie, e infine, usando una soluzione
contenente amminoacidi normali, assemblare la proteina (A) originaria,
usando la proteina (B) come stampo.
Diverrà quindi possibile sequenziare le proteine replicate; Conoscendo la
sequenza di ognuna delle diverse proteine ottenute, e conoscendo la
complementarietà tra gli amminoacidi normali, e quelli modificati per
renderli più selettivi, sarà possibile riconoscere le due proteine (B) tra
loro complementari, costituite esclusivamente da amminoacidi più selettivi,
e da queste le due proteine originarie (A), ognuna complementare a una delle
due proteine (B). Una delle due corrisponderà alla proteina originaria che è
stata amplificata.
Tale proteina potrà essere dunque purificata dal resto della soluzione.
Altro problema è che la temperatura alla quale gli amminoacidi si legheranno
al "primer" (breve frammento polipeptidico agganciato con i suoi "gruppi (R)
variabili" a quelli degli amminoacidi della proteina da replicare) potrebbe
non coincidere con la temperatura di denaturazione della proteina. Quindi
potrebbe essere necessario far coincidere tali temperature utilizzando
appropiati catalizzatori.
INFORMAZIONI CHE PROVANO LA COMPLEMENTARIETA' TRA' GLI AMMINOACIDI:
---Da enciclopedia---
La zona della molecola enzimatica in cui sono presenti questi "siti" è detta
sito attivo. Il legame tra i reagenti e l'enzima è possibile grazie alla
complementarietà che sussiste tra la struttura dell'enzima e quella dei
reagenti stessi. La corrispondenza tra le molecole è talmente precisa che il
legame tra l'enzima e i reagenti viene solitamente paragonato al legame tra
una chiave e la serratura corrispondente.
[....]
Il riconoscimento di un antigene da parte di un anticorpo avviene in modo
specifico grazie al fatto che la struttura dell'anticorpo è complementare a
quella dell'antigene: ciò permette alle due molecole di legarsi in modo
analogo alla combinazione di una chiave con la corrispondente serratura.
---Fine--------------
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NUOVO APPARECCHIO PER IL SEQUENZIAMENTO DELLE PROTEINE
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FASE DI PREPARAZIONE:
FASE1: Della resina viene miscelata a delle particolari molecole ognuna
delle quali costituita da due brevi frammenti polipeptidici; Gli amminoacidi
di un polipeptide hanno agganciati ai loro "gruppi (R) variabili" i gruppi
(R) variabili degli amminoacidi dell'altro frammento polipeptidico
perfettamente complementare.
Questi frammenti serviranno per fissare alla resina la proteina da
sequenziare, e forniranno il "primer", necessario ad innescare la reazione,
che si troverà già legato all'estremità iniziale della catena.
FASE2: Ad una determinata temperatura la proteina da sequenziare dovrebbe
legarsi ai brevi frammenti polipeptidici fissati e sporgenti dalla
superficie della resina.
Siccome in una proteina gli amminoacidi sono uniti tra loro con legami
peptidici, che si formano tra il gruppo amminico e il gruppo carbossilico di
due amminoacidi adiacenti, ne consegue che una proteina ha due estremità:
l'estremità amminica e l'estremità carbossilica.
Siccome le molecole fissate e sporgenti dalla superficie della resina, sono
costituite da due brevi frammenti polipeptidici complementari, agganciati
tra loro con i "gruppi (R) variabili" dei loro amminoacidi, ne consegue che
ognuna di tali molecole, avrà 4 estremità: due estremità amminiche e due
estremità carbossiliche.
C'è una molecola legata all'estremità amminica di ciascuno dei due frammenti
polipeptidici di cui sono composte le molecole fissate e sporgenti dalla
superficie della resina, che impedisce ad ulteriori amminoacidi di legarsi a
tali estremita, in modo che le proteine da sequenziare possano legarsi solo
con la loro estremità amminica all'estremità carbossilica del polipeptide
sporgente dalla resina (Questo se i due frammenti polipeptidici, di cui sono
composte le molecole nella resina, sono tra loro antiparalleli, altrimenti
si può procedere in diverso modo).
In questo caso si è scelto di unire la proteina con la sua estremità
amminica al frammento nella resina ma non sò con quale delle due estremità
la proteina debba legarsi affinchè il procedimento funzioni, quella amminica
oppure carbossilica.
FASE3: La molecola legata all'estremità amminica di ciascuno dei due
frammenti polipeptidici di cui sono composte le molecole fissate e sporgenti
dalla superficie della resina, che impedisce ad ulteriori amminoacidi di
legarsi a tali estremita, è costituita in modo tale da legarsi all'estremità
amminica con deboli legami in modo che possa essere rimossa col calore, ad
una temperatura tale da non danneggiare la catena polipeptidica.
La temperatura necessaria per staccare tale molecola può essere superiore a
quella necessaria per separare i due frammenti polipeptidici complementari,
agganciati tra loro con i "gruppi (R) variabili" dei loro amminoacidi, ma la
resina, solida a quella temperatura trattiene i due filamenti nel tratto
iniziale con cui sono ad essa fissati.
Rimangono così solo le proteine da sequenziare legate con le loro estremità
amminiche alle estremità carbossiliche delle molecole, fissate e sporgenti
dalla superficie della resina, costituite da due frammenti polipeptidici
complementari, agganciati tra loro con i "gruppi (R) variabili" dei loro
amminoacidi.
Ora è possibile con l'apparecchio sotto descritto eseguire il sequenziamento
della proteina.
FASE DI SEQUENZIAMENTO:
IPOTESI:
Come per i nucleotidi, anche gli amminoacidi hanno una parte della loro
molecola, in questo caso il "gruppo (R) variabile" che può essere
complementare al "gruppo (R) variabile" di un'altro amminoacido forse se
posto in posizione antiparallela. Quindi denaturando la proteina in
particolari condizioni di concentrazione amminoacidi e temperatura, fornendo
i 20 amminoacidi e forse anche l'appropiato enzima, sarebbe possibile
replicarla come avviene nella PCR. Occorre come per la PCR il "primer" un
breve frammento polipeptidico che si aggancierà, ad una determinata
temperatura, con i "gruppi (R) variabili" dei suoi amminoacidi a quelli
della proteina da replicare. Altro problema è che la temperatura alla quale
gli amminoacidi si legheranno al "primer" potrebbe non coincidere con la
temperatura di denaturazione della proteina. Quindi potrebbe essere
necessario far coincidere tali temperature utilizzando appropiati
catalizzatori. Vi è la possibilità che alcuni dei 20 amminoacidi possano
essere complementari e quindi legarsi a più di un tipo di amminoacido; In
tal caso occorre sintetizzare degli amminoacidi più selettivi; Esempio:
Immaginiamo che l'amminoacido (A) possa legarsi sia con l'amminoacido (B)
che non l'amminoacido (C), in tal caso occorrerà sintetizzare due
amminoacidi artificiali modificando la struttura dell'amminoacido (A) in
modo da renderlo in grado di legarsi solo l'amminoacido (B) ma non con (C),
e poi sintetizzarne un'altro in grado di legarsi solo l'amminoacido (C) ma
non con (B). Avremo così a disposizione un gruppo di amminoacidi (tra cui
alcuni modificati) ognuno dei quali capace di legarsi ad un solo altro
amminoacido complementare. Diventa così possibile con un procedimento simile
alla PCR ottenere, una copia di proteina artificiale complementare alla
proteina da amplificare.
DESCRIZIONE APPARECCHIO:
L'apparecchio è costituito da un piccolo recipiente a cui sono collegati 20
tubi ognuno dei quali serve a far scorrere nel recipiente una soluzione
contenente un solo tipo di amminoacido, piu un'ulteriore tubo per
allontanare le soluzioni dal recipiente.
In tal recipiente sono contenute le proteine da sequenziare i cui
amminoacidi iniziali sono legati a particelle di resina trattenute da un
filtro o fuse su una superficie tubolare esposta alla soluzione e nella
quale questa scorre. Su è descritto il procedimento per ottenere le proteine
legati con la loro estremità amminica all'estremità carbossilica delle
molecole, fissate e sporgenti dalla superficie della resina, costituite da
due frammenti polipeptidici complementari, agganciati tra loro con i "gruppi
(R) variabili" dei loro amminoacidi, quindi i primers non sono necessari.
In tale recipiente vengono riprodotte le condizioni necessarie affinchè le
proteine ancorate alla resina si replichino: Denaturazione proteina, ideale
concentrazione di amminoacidi, temperatura, e gli appropiati catalizzatori,
solo che non vengono immessi tutti e 20 gli amminoacidi ma solo uno alla
volta.
Con ritmo regolare vengono fatti fluire nel recipiente dai 20 tubi, una sola
alla volta, le venti soluzioni contenenti ognuna un solo tipo di
amminoacido.
La temperatura deve essere tale da permettere ad un amminoacido di legarsi
con il suo "gruppo (R) variabile" al "gruppo (R) variabile" dell'amminoacido
della proteina ancorata alla resina, solo se tal amminoacido può legarsi
anche con la sua estremità carbossilica all'estremità amminica del
polipeptide complementare (e si ipotizza in posizione antiparallela) alla
proteina da sequenziare.
Quando gli amminoacidi di un solo tipo si legano alla proteina da
sequenziare, i sensori nel piccolo recipiente registrano i fotoni emessi
dalla reazione o variazioni di temperatura.
In base a quali tubi erano aperti, e quindi quale dei 20 amminoacidi era in
soluzione, nel momento che i sensori rilevano che è avvenuta una reazione, è
possibile stabilire quale dei 20 amminoacidi si è legato alla proteina.
Un computer memorizza in un file i segnali elettrici provenienti dai sensori
e dallo stato delle valvole dei tubi (aperte o chiuse).
Se si attaccano due o più amminoacidi dello stesso tipo in successione nella
catena, vi dovrebbe essere una differenza (una doppia o tripla quantità di
fotoni) che i sensori sono in grado di rilevare e tradurre (come segnale
elettrico) in due o piu amminoacidi dello stesso tipo invece di uno.
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PROCEDIMENTO PER OTTENERE L'IMMORTALITA' (Nuova versione, riassuntiva)
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Tecnica che permette di ringiovanire e raddoppiare la durata della vita di
un soggetto anche se in eta avanzata, usando le sue stesse cellule; Tal
procedimento può essere ripetuto illimitatamente. Una cellula del tessuto
del testicolo inietta alcuni filamenti di acido nucleico nello spermatocito
tra cui uno che azzera il "valore dell'età dell'organismo" memorizzato in
quella cellula. Con gli attuali mezzi a disposizione è possibile isolare tal
filamento (di DNA oppure di RNA) e, anche se in piccolissime quantità
replicarlo con la PCR per ottenerlo in enormi quantità per poi iniettarlo
nelle cellule del midollo o in altre cellule dell'organismo.
UN POSSIBILE PROCEDIMENTO: Con gli attuali mezzi a disposizione è possibile
isolare e replicare con la PCR i seguenti filamenti di acido nucleico, per
esporvi in soluzione le cellule staminali prelevate con leucaferesi dal
paziente, le quali verranno infine reiniettate nel paziente:
Il filamento di acido nucleico, iniettato da una cellula all'altra del
tessuto del midollo osseo, avente lo scopo di trasformare la cellula del
midollo in una cellula staminale (A) indifferenziata.
Il filamento di acido nucleico, iniettato da una cellula del tessuto del
testicolo nello spermatocito avente lo scopo di azzerare il "valore dell'età
dell'organismo" memorizzato in quella cellula.
Il filamento di acido nucleico, iniettato da una cellula all'altra del
tessuto del midollo osseo, avente lo scopo di trasformare la cellula
staminale (A) indifferenziata del midollo, in una cellula staminale che
liberata in circolo attecchirà ad altri tessuti trasformandosi nel tessuto a
cui ha attecchito.

 posto in posizione antiparallela.
Ma te le sogni di notte? sta ipotesi non sta ne' in cielo ne' in terra.
Non ci sono residui aminoacidici (xke' sono residui, non amminoacidi 
come dici tu) complementari quindi tutto sto castello di carte (come 
tutti gli altri che fai) crolla in partenza.




 Con cosa si lega, secondo te, un'enzima ad un'altra proteina?
Non certo con un singolo aminoacido!
I moduli di interazione proteina proteina sono domini. Non 1 residuo.
Il domino SH2 (src homology 2) riconosce Tyr fosforilate.
Ma se bastasse solo questo diremmo addio alla specificità di trasduzione del
segnale.
In particolare mi sembra di ricordare che la specificità sia data dagli aa
al C-ter rispetto
alla fosfo tirosina. Anche il dominio PTB lega fosfo tirosine. E la
specificità dovrebbe
essere data dai residui in N-terminale.
Ma MAI un residuo lega un solo altro residuo!
Certo. Si può formare un ponte salino che stabilizza. Ma da questo punto di
vista sono di
gran lunga più importanti le interazioni idrofobiche.
E ti sfido a trovare una univocità in tali interazioni.
Detto ciò... vedi di evitare di prendere come fonti basilare le
enciclopedie.
Prova a cercare su pubmed.
-- 
Do. Or do not.
There is no try.


"xke' sono residui, non amminoacidi".......???
Ma il fatto che il "gruppo (R) variabile" di un'amminoacido è detto "residuo
di amminoacido" non dimostra in alcun modo l'erroneità di questa ipotesi:
Anche gli amminoacidi hanno una parte della loro molecola, in questo caso il
"gruppo (R) variabile" che può essere complementare al "gruppo (R)
variabile" di un'altro amminoacido forse se posto in posizione
antiparallela.
Nè il fatto che il "gruppo (R) variabile" di un'amminoacido è detto "residuo
di amminoacido" dimostra che "Non ci sono residui aminoacidici
complementari".
Prova a leggere con più attenzione il messaggio.

 variabile" di un'altro amminoacido
No.



Detto cio?
Ripeti a memoria cio che hai imparato è non ti accorgi che concorda con le
ipotesi descritte nei miei messaggi.
Comunque grazie per la risposta :)


 No.
A no?
Devi spiegare perchè no.
Perche no?
Posso fornirni numerosissime argomentazioni del perche invece si, alcune te
ne ho già fornite.

 ipotesi descritte nei miei messaggi.
1 - ROTFL!!!
2 - ''e'': congiunzione, ''è'': voce del verbo essere
3 - Facciamo un caso semplice...
        Un tripepeptide...
        Trp-Val-Leu
Quali sarebbero i complementari?
Dimmi...
Sono in impaziente attesa...

 Perche no?
Perchè non c'è complementarietà univoca.
Non esiste un aa complementare ad un'altro.
Ci sono aa che possono interagire.
Un'arginina, carica positivamente, con che residui
dovrebbe interagire?
Dimmi...


Il residuo dell'arginina dovrebbe interagire e quindi essere complementare
al residuo di un'altro dei 20 amminoacidi, ma non sò quale.
L'autore di questo articolo pensava inizialmente di cercare prima
informazioni sulla complementarietà dei residui degli amminoacidi e poi
inviare l'articolo, ma siccome non voleva perder tempo e siccome non era
necessario conoscere tali informazioni per sostenere le ipotesi descritte
nell'articolo, ha deciso
di non cercare tali informazioni.


Deve per forza essere complementare, altrimenti gli enzimi non potrebbero
legarsi alle proteine.
Ogni amminoacido di cui è costituito il sito attivo dell'enzima, che espone
il suo gruppo (R) variabile" verso l'esterno dell'enzima, si legherà, con il
suo gruppo (R) variabile" al "gruppo (R) variabile" complementare, di uno
degli amminoacidi di cui è costituito il substrato (in questo caso un'altra
proteina) che espone il suo "gruppo (R) variabile" verso l'esterno di
questa.

Deve esserci un tripeptide perfettamente complementare, ma non sò quali sono
i tre amminoacidi che devono comporlo.
L'autore di questo articolo pensava inizialmente di cercare prima
informazioni sulla complementarietà dei residui degli amminoacidi e poi
inviare l'articolo, ma siccome non voleva perder tempo e siccome non era
necessario conoscere tali informazioni per sostenere le ipotesi
dell'articolo, ha deciso di non cercare tali informazioni.

 di non cercare tali informazioni.
Le ipotesi sono sbagliate.
Non c'è un residuo complementare ad un altro.
La specificità (complementarietà) è data dalla struttura
globale del sito attivo dell'enzima, dalla sua forma,
dal potenziale elettrostatico della sua superficie...
Non dalla semplice somma di interazioni singole.
In modo più semplice non saprei dirlo.


 
non so come fai a cercare di ragionare seriamente con uno che copia le cose
dall'enciclopedia senza sapere che dice, ed in generale trolleggia...
bha, ognuno si diverte a modo suo. 
buon divertimento
ladybat
-- 
frinire di grilli:
penetra nel muro
la mia ombra


Si ma la struttura globale del sito attivo dell'enzima, la sua forma, e
tutte le sue caratteristiche sono date dai residui di amminoacidi che lo
compongono.
Se non si stabiliscono dei legami, ognuno dei quali trà un'atomo del sito
attivo dell'enzima e un'atomo del substrato, l'enzima non potrà mai legarsi
al substrato; Questi atomi che si legano tra loro non possono che trovarsi
uno nel residuo dell'amminoacido di cui è costituito il sito attivo
dell'enzima, e l'altro atomo si trova nel residuo dell'amminoacido di cui è
costituito il substrato (in questo caso un'altra proteina); Quei due residui
di amminoacidi sono quindi complementari, se no non si legano; Altra
considerazione è che se tutti i residui di amminoacidi si legassero tra loro
indiscriminatamente allora verrebbe meno la specificità dell'azione
enzimatica.
Già queste due considerazioni permettono di comprendere che i residui di
amminoacidi sono tra loro complementari e che diventa quindi possibile
replicare le proteine con un'opportuno procedimento.