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Titolo: dna che non entra nel gel

Sto aiutando un mio amico dottorando a valutare la qualità del DNA
genomico estratto da Boletus aedulis con il metodo del
fenolo/cloroformio e c siamo trovati d fronte ad un bel problema. Il DNA
non entra x niente nel gel (nemmeno con un gel 0.6%). Rimane tutto nei
pozzetti. Il rapporto A260/A280 è maggiore d 1.8 quindi non dovremmo
essere d fronte ad una schifezza. Voi che dite? E' da tagliare x forza
con qualche enzima d restrizione? grazie a tutti.
Stefano
xxxgi...@tin.it
(rimuovere xxx per un reply)
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!!sito completamente rinnovato!!

 con qualche enzima d restrizione? grazie a tutti.
Si`.
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):
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Non entra per niente? Il genomico umano, che suppongo allora molto più
piccolo entra tranquillamente, il problema è separare gli alti pesi -->
pulse field, 300V, camera fredda sono utili per farlo;).
Perchè usate fenolo cloroformio e non salting out ? Motivi razionali o
per abitudine?
Ciao
-- 
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Fabio Di Benedetto- Italy- Udine
Studente Tecnico di Laboratorio Biomedico
Fab...@katamail.com
http://digilander.iol.it/fobia/FabioDiBenedetto.html
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 Ciao

 
Questa è la metodica dal sangue, da questa con semplici ragionamenti
abbiamo fatto quella per l'estrazione da Hela e da amniociti, però
esistono varie varianti in letteratura (Miller et all 1998 ecc).
Il solting out, fa precipitare le proteine cambiando la forza ionica con
sale da cucina, quindi costa meno (be queso forse non è vero, non lo
sò), è ugualmente efficace, rovina meno il DNA (NB è particolarmente
indicato per chi vuole ottenere un DNA genomico intatto, però quando non
si forma la medusa l'estrazione riesce, ma la qualità è inferiore),
salvaguarda la salute dell'operatore che non deve usare solventi.
Ecco la metodica da sangue:
ESTRAZIONE DNA DAI LEUCOCITI DEL SANGUE COL METODOTO NaCl
Il procedimento richiede 2 giorni.
Bisogna controllare il giorno prima la presenza dei reagenti e del
materiale (sono sottolineati).
Ricordarsi sempre che lo scopo e estrarre il DNA spezzettandolo il meno
possibile, quindi limitare le forze frizionali.
PRIMO GIORNO
1.Prelevare i campioni in frigo e scongelarli in bagnetto a 37°C.
2.Versa 15-20 mL di EDTA/ sangue (EDTA complessa i cofattori delle
DNAsai) in falcon da 50 mL.
3.Porta al volume di 40 mL2 con Lysis Buffer3.
4.30' in ghiaccio.
5.Cfg. 30' a 4000 rpm (3040g)a 4°C4.
6.Scartare il supernatante per rovesciamento (attenzione al pellet5).
7.Lavare il pellet (rompere il pellet) portando al volume di 40 mL con
Lysis buffer.
8.Mettere in ghiaccio 15'.
9.Cfg.15' 4000 rpm.(3040g)
10.Scartare il supernatante.
11.Risospendere il pellet con 6mL di Kern Buffer6.
12.Aggiungere 300uL SDS7 al 10%.
13.Aggiungere 300 uL Proteinasi K 10mg/mL8.
14.Lasciare 2 h in bagno caldo a 55°C e o.n. a 37°C.
N.B. Il lisis bufer rompe i globuli rossi e non i bianchi (o forse non i
nuclei dei bianchi, ma questa sembra una ipotesi sbagliata visto che in
modo simile si ottiene DNA mitocondriale). E' importante eliminare
l'emoglobina ed in particolare il ferro che interferisce come cofattore
con vari enzimi (se non erro).
Il Kern buffer rompe i globuli bianchi.
SECONDO GIORNO
1.Aggiungere 2 mL di NaCl saturo (6M)9 (salting out delle proteine: le
proteine precipitano)
2.Shake-mix 15''.
3.Trasferire attentamente Tutto in tubi da centrifuga.
4.Cfg.30' 8000 g (anche di più).
5.Trasferire il supernatante (non torbido, altrimenti ricentrifugare)
con attenzione 10in falcon da 50 mL.
6.Aggiungere 2 volumi di etanolo assoluto. Si dovrebbe formare la medusa
(ssi cerca un genomico particolarmente integro può essere il caso di
prelevarla con una pasteur di vetro piegata ad uncino).
7.Cfg. a 4000 rpm per 10' se si forma la medusa, a 13000 rpm (17761g)per
20' se non si forma.
8.Scartare il supernatante con attenzione.
9.Aggiungere per un lavaggio EtOH 75%11.
10.Cfg come prima a 4000 o a 13000 rpm a seconda del caso.
11.Buttare il supernatante con attenzione, raccogliere e lasciare
asciugare  l'eccesso di etanolo.
12.Dissolvere il DNA in 7-800 uL di Tris HCl 20 mM (o TE, o acqua MQ)
13.Incubare O.N. a 37°C o 30' a 50°C per idurre la dissoluzione (
spipettare il meno possibile con puntali tagliati, sterili ). 
14.Procedere con elettroforesi e quantizzazione.
15.Conservare a 4°C.
Lysis Buffer (X 1L)
10.95%P/V Saccarosio: 109.5g
10mM Tris-HCl,pH8.2 1M:10 mL
5mM MgCl2 1M: 5mL
1%V/VTriton-X100: 10mL
H2O al volume di 1L
KERN BUFFER (X 1L)
10 mM Tris-HCl,pH8.2 1M: 10mL
400 mM NaCl:
2mM Na2EDTA:
pH 8,2


 Il solting out, fa precipitare le proteine cambiando la forza ionica
con......................