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Titolo: PCR con un primer

Dunque, innanzitutto ciao a tutti.
Io vorrei sapere se 2° voi è normale che un primer di 21 bp con una
percentuale di GC del 38% e con una tripletta al 5' complementare alla
coda 3' (non ho scelto io il primer!...io la mia capa ci abbiamo solo
fatto la PCR) e con una Tm di 61.4°C si sia attaccato pochissimo avendo
noi impostato sul thermal cycler 40 cicli con una T d annealing di 65°C
x 45 secondi.
Da quanto ne so io è stata fatta coi piedi sia la progettazione a
tavolino del primer, sia la programmazione del termocycler (la T di
annealing non doveva essere al max di 61°C?). Che ne pensate voi?
Inoltre, qualcuno d voi ha mai provato a fare una PCR con 4 primers
messi come riportato sotto?
--->        <---        --->        <---
Mettendo una uguale concentrazione dei quattro primers (x essere precisi
0.22 uM), 2° voi dovrebbero venire 2 amplificati o dovrebbe uscire anche
il terzo (quello lungo amplificato dai due primers estremi), magari con
una resa bassissima?
Grazie a tutti.
Alla prox.
Stefano
xxxgi...@tin.it
(rimuovere xxx per un reply)
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!!sito completamente rinnovato!!

 una resa bassissima?
Teoricamente dovrebbero amplificarsi tutti e tre i frammenti, compreso
quello lungo. In ogni caso i primer esterni sono quelli che finiscono prima,
perchè vengono incorporati di più di quelli interni (nel tuo schema), quindi
alla fine credo che tu ottenga i due frammenti piccoli in maggiore quantità
e quello lungo in minore, come hai già detto tu.
--
Emanuele Passerini
ema.pa...@libero.it
 (messaggi brevi)
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http://go.to/manupippo
ICQ# 34957310

 e quello lungo in minore, come hai già detto tu.
Non sono  molto daccordo su questo punto.  Prima di tutto dubito che i
primer "finiscano".  La quantita` canonica  di primer usati nelle  PCR
(10 picomoli, o per un primer di 18-21  bp intorno a  100 ng) e` molto
in eccesso, anche  per   tre prodotti.   Inoltre c'e`  da  considerare
quello che  si   chiama effetto  CoT. In   pratica in  condizioni  non
limitanti dei vari  reagenti    (e quelle canoniche ripeto    non sono
affatto limitanti per una PCR di 40-60  cicli) quello che determina la
quantita` di amplificato  e` l'accessibilita` dei primer sullo  stampo
(quello che si  chiama in  gergo  il templato).   L'accessibilita`  e`
legata alla stabilita` di legame dei  primer e all'effetto competitivo
tra il prodotto di amplificazione e i primer stessi.
Mettiamola cosi`, diciamo che al primo ciclo c'e` una sola molecola di
templato e qualche  chilo di primer, e`  ovvio che durante l'annealing
si  leghino i due primer e   si formino 4 molecole   di DNA che a loro
volta saranno  il templato per il   ciclo successivo.  Ora  pero` alla
successiva fase  di annealing le 4   molecole di DNA  competono con il
chilo di primer per riformare la  doppia elica, ma siccome questi sono
ancora largamente in eccesso si producono 8  molecole di DNA.  Andando
avanti si arrivera` ad una situazione nella  quale avremo qualche etto
di DNA che riesce a competere con il chilo  di primer nell'annealing e
quindi l'efficenza di amplificazione a quel punto inizia a diminuire e
ad ogni ciclo diventa sempre meno efficiente.
Il risultato e` che si raggiunge un plateau e la  quantita` di DNA non
aumenta piu` con  il procedere dei   cicli (tutto questo spiega  anche
perche`   il templato   deve   essere *sempre*  messo  in piccolissime
quantita`, altrimenti la PCR non funziona bene).
Cosa succede  quando abbiamo 3  possibili prodotti? Teoricamente anche
se l'efficienza  di amplificazione dei 3  prodotti non e` la stessa se
si fanno abbastanza cicli da permettere il raggiungimento del platau a
tutti e tre, si avra` una uguale  quantita` di prodotto per ognuno dei
tre.  Per esempio se  il prodotto A e` il  piu` efficiente arrivera` a
platau al 20 esimo ciclo, mentre il B ci arriva al  25 esimo e il C al
30  esimo, basta fare  30  cicli e otteniamo   tre prodotti in  uguale
quantita`.
Inoltre nel caso presentato
-------------------------------------------
--->        <----     ---->         <----
otteniamo i tre prodotti: A, B e C .
      (A)                     (B)  
-----------------     -------------------          
                  (C)        
-----------------------------------------
Ora malaguratamente  A e B sono degli  ottimi primer per C che secondo
me per  questo motivo dovrebbe avere piu`  probabilita` di arrivare al
platau persino prima degli altri due.
Per  quanto riguarda il  problema  di Stefi~,  avere degli Hairpin sui
primer  (cioe`  quelle  strutture  che   si   formano per  i    legami
intracatena),  non aiuta  di   certo,  ma  usare una  temperatura   di
annealing maggiore  di  quella di mealting  aiuta  ancora  di meno  ad
ottenere una   quantita`  apprezzabile di  prodotto (sebbene  aiuti ad
avere un'alta specificita`).
Io ripeterei la PCR con TM a 60 e se  non funziona, farei una serie di
reazioni a concentrazioni diverse di Magnesio (che  so 1 mM, 5 mM, 10,
mM,  15 mM, 20 mM  e 25 mM)  sempre a 60 C.   Non scenderei sotto i 60
altrimenti favorisci la formazione  degli  hairpin, e se non  funziona
ordinatevi degli altri primer :-) .
-- 
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cf   |  - italia.*   gruppi creati e gestiti dalle reti civiche locali
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 platau persino prima degli altri due.
Ripensandoci,  l'effetto CoT blocca anche i  frammenti A  e B e quindi
credo che  quello che si ottiene alla  fine e`  una larga predominanza
del frammento C.


 e quello lungo in minore, come hai già detto tu.
6 stato molto gentile e anche molto chiaro. A buon rendere.


 del frammento C.
Ciao Carlo.
Ho apprezzato molto la tua spiegazione cmq, tanto x chiacchierare, il
prodotto C non č venuto. Probabilmente l'ingombro dei primer interni sul
duplex ha impedito alla Taq d procedere all'allungamento del frammento +
lungo.
Cmq, c accontenteremo d avere C da una provetta con i due primers ext e
A da un'altra provetta con un primer ext e uno interno. Forse, a tempo
perso, faremo una PCR rivedendo la T d annealing e la conc. di Mg2+ x
avere un'idea d quello che non ha funzionato.
Tante grazie e alla prox!




 del frammento C.
Secondo me no.
L'efficienza di annealing di un primer di 20 basi è nettamente maggiore
rispetto a quella di un frammento di 250 bp, soprattutto in tempi rapidi
come sono quelli dei cicli di una PCR.
--
_________________________
Emanuele Passerini
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ICQ# 34957310

 quantita`.
Ok, mi hai convinto.
Se però i cicli di amplificazione prevedono una fase di estensione molto
breve (30 secondi al massimo), non credo che la produzione del frammento
lungo C sia uguale a quella degli altri due frammenti, anzi credo che si
formi meno prodtto C. Magari su gel di agarosio sembra di aver prodotto un
uguale quantità di A, B e C, ma ricordiamoci che l'intensità delle bande
colorate con etidio bromuro è maggiore per frammenti più lunghi, a
prescindere dalla quantità di molecole.


 
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Fabio Di Benedetto- Italy- Udine
Studente Tecnico di Laboratorio Biomedico
Fab...@katamail.com
http://digilander.iol.it/fobia/FabioDiBenedetto.html
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> 
Per la cronaca aggiungo ancora una cosa: proprio oggi mi è capitato di
assistere alla messa a punto di una PCR calda che è molto + specifica ad
una T aniling maggiore della Tm dichiarata (che poi non si sa se è
sperimentale o calcolata empiricamente!), può essere che chi ha messo a
punto la tua metodica abbia avuto un problema di questo tipo (che forse
condiziona la formazione della terza banda).


 condiziona la formazione della terza banda).
t ringrazio x avermi dato la tua opinione ma, come ho già detto, la T di
annealing era effettivamente + alta di qualche grado della Tm minore di
uno dei primers (non chiedermi xché...) e, cmq, è venuta la banda
corrispondente al tratto amplificato a sx xché un primer interno non si
è attaccato! ciaooo!
