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Titolo: PCR: come spiegate?

Ciao a tutti. Mi trovo d fronte ad un apparente nonsense tecnico.
Allora, in breve, io devo amplificare mediante RT-PCR un messaggero d un
gene x una forma embrionale d proteina(e ho dei primers che il computer mi
da x specifici e un messaggero x una forma adulta della stessa proteina
(grado d omologia nella sequenza nucleotica: circa 60%) x cui ho altri 2
primers che il computer mi vede ugualmente specifici.
Ora, il problema è che facendo una RT-PCR con i primers x l'adulta mi viene
fuori una banda giusta e una banda "aspecifica". Stessa cosa con i primers x
l'embrionale.
Diminuendo la quantità d RNA stampo la banda specifica diminuisce d
conseguenza, MA la banda aspecifica mi rimane assolutamente costante (almeno
a giudicare dall'intensità che mi da' con la colorazione con EtBr).
Chi mi sa dire come interpretare qs risultato?
Grazie a tutti!!
Stefano
gifa...@tin.it
http://web.tiscalinet.it/gifalone
ICQ 110419911

Alle volte i PC sbagliano...self anniling?
Puoi spiegare meglio il discorso degli mRNA, perchè non ho capito bene che cosa
hai di sicuro: i primers per l'mRNA embrionale sono sicuramente specifici, o
sono quelli che usate per la forma adulta, l'mRNA della forma adulta perchè lo
menzioni? Non si tratta mica di una PCR quantitativa?
Chiariti questi due punti potrei dirti le mie opinioni, per que che valgono:)
Ciao
Stefi~ wrote:
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Fabio Di Benedetto- Italy- Udine
 Tecnico di Laboratorio Biomedico
Fab...@katamail.com
http://digilander.iol.it/fobia/FabioDiBenedetto.html
Http://tecnicodilaboratorio.supereva.it/
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 wrote in message
3AC100B2...@katamail.com...


Ci devo pensare con calma, ma se fosse self anniling allora la banda aspecifica
aumenterebbe diminuendo il templato, potrebbero essere airpin di teplato o
primers, ed allora potresti scoprirli avendo la sequenza e ridurli aumentando la
T di anniling.
Il controllo negativo (Tris-HCl o quello che usate al posto del DNA) non forma
bande strane giusto?
Ancora una cosa la banda aspecifica con primers f.adulta da Fegato e da embrione
è sempre la stessa (e c'è indipendentemente dalla assenza della banda della
forma adulta anche nell'embrione), così come  per prim. f. embrionale da fegato
e da embrione?
Potrebbe (e forse è questo il caso) essere una questione di hnRNA, RNA primario,
RNA maturo, splicing alternativo che magari è comune alle due proteine, che
magari si formano a causa di uno splicing alternativo.
Potrebbe essere  che con i primers per la forma adulta amplifichi  il primo
trascritto o hnRNA e con quelli della forma embrionale il messaggero primario.
Se è un mRNA a monte del matura la banda sarà più grande.
Supponiamo che oltre alla forma embrionale ed a quella adulta lo stesso mRNA
formi un terzo tipo di messaggero espresso o meno...
Avresti una banda più o meno espressa a seconda di quanto quel messaggero viene
espresso.
Potresti anche cercare siti di ramificazione all'interno del tuo messaggero.
Come prova potresti marcare la banda aspecifica ed usarla come sonda sul
messaggero adulto, embrionale o meglio primo trascritto o sequenziare, ma se non
fosse così forse chi paga avrebbe qualcosa da ridire:).
Dimmi cosa ne pensi (visto che ci avrai già pensato credo).
Ciao
Stefi~ wrote:
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Fabio Di Benedetto- Italy- Udine
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http://members.tripod.it/tecnicodilaboratorio
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 Ciao
Sinceramente io credo che il sequenziamento sia una strada da percorrere.
Un'altra prova potrebbe essere quella di scegliere un enzima d restrizione
che riconosca un sito interno al frammento amplificato con i primers
dell'adulto e che non riconosca il frammento dato dai primers x
l'embrionale. In qs modo dovremmo essere in grado di distinguere senza
possibilità d errore la presenza o meno dei trascritti. Infatti, dopo
l'RT-PCR, si incuberebbe un'aliquota dell'amplificato con l'enzima d
restrizione e si vedrebbe sul gel la scomparsa della banda dell'adulto. In
quel modo si otterrebbe la prova che la banda che vediamo è davvero il gene
della proteina adulta. Ogni banda supplementare non tagliata sarebbe da
interpretarsi come appaiamento aspecifico. X l'embrionale il discorso
potrebbe anche essere messo da parte visto che lo scopo principale del mio
lavoro è vedere a che stadio d sviluppo e/o metamorfosi comincia a comparire
il messaggero per la forma adulta della proteina.
Cmq, t ringrazio per i suggerimenti che sottoporrò senz'altro all'attenzione
dei miei svariati capi! :-)
Alla prox!!!
