Newsgroup: it.scienza.biologia
Titolo: ma serve il controllo negativo?

Sembra una domanda sciocca ma durante le mie giornate in laboratorio
me lo sono chiesto davvero. Facciamo un esempio:
Io faccio una PCR partendo da un estratto totale di DNA da una
comunità batterica e nella mia PCR  (diciamo 72 campioni) ci metto il
mio bel C-. Però:
1- Se il C- viene positivo non è detto che lo sia anche all'interno
delle altre 72 reazioni (anche se per precauzione è meglio rifare)
2- Se il C- è negativo chi mi assicura che non sia "positivo"
all'interno delle altre 72 reazioni?
Ok, mi rendo conto che se parliamo dell'amplificazione di una banda
specifica da un DNA puro proveniente da una singola fonte posso, a
fronte di un eventuale C+, essere sicuro della validità della mia PCR,
ma nel mio caso, in cui amplifico decine di bande (diverse da campione
a campione) a cosa mi serve un controllo negativo?
Spero di essere stato chiaro. 
Ciao a tutti

Capita a volte di amplificare aspecificamente una o più bande a seconda
delle condizioni in cui lavori, quindi se le vedi nel tuo C- vuol dire
che qualcosa comunque non va. Andrebbero sempre fatti i C- e i C+: Il C+
ti dice se la/le tue bande possono amplificarsi in quelle condizioni (ma
sempre a patto che la preparazione e la natura del DNA sia la stessa,
hai presente quanto è facile ottenere un controllo positivo che viene da
miniprep batteriche mentre quando vuoi amplificare lo stesso gene su DNA
estratto da cellule di mammifero non ti viene niente manco a crepare?),
mentre con il C- se non vedi nulla ti dice che almeno le bande
amplificate sui campioni non sono un artefatto. Per la mia esperienza su
cellule superiori mi è capitato di amplificare proprio una banda simile
a quella che cercavo.... sul controllo negativo! quindi ho dovuto
provare un bel pò di altre condizioni prima di dire che le bande erano
quelle giuste.
Ciao, GP.
P.S.
complimenti per le 72 PCR, se le fai tutte insieme senza una buona
macchina per colony-PCR è una bella ammazzata, specie se qualcosa va
storto (a mio consiglio fai prima poche prove con C-, C+ e qualche
campione, se va storta non ne ripeti 72 e se ti dice culo becchi pure i
campioni giusti).

 a campione) a cosa mi serve un controllo negativo?
Un controllo negativo è tale quendo non presenta nessuna banda e quindi nel
tuo caso è ancora più utile perchè così sei sicuro di non lavorare con
un'aspecifico della PCR.
Non su casa lavori ma ti assicuro che può essere frustante dopo due mesi di
lavoro rendersi conto di aver lavorato su uno aspecifico.


 E' frustrante anche quando dopo due mesi ti rendi conto che forse
l'estrazione del DNA totale non andava fatta come invece è stata
fatta!

 >
Resta il consiglio di prima, e soprattutto tieni conto che più campioni fai
per volta peggio ti viene la PCR (ad esempio da quando metti la Taq nel
primo campione a quando la metti al 72esimo già è passato troppo tempo, e
questo può pregiudicare la riuscita delle prime reazioni, figurati con 96
campioni. Dividi assolutamente il lavoro, che quel di più che ci metti te lo
risparmi dopo).
Per quanto riguarda lo sgobbo del tesista non ho mai sentito di un lab dove
non ti spremano al massimo, purtroppo.
Buona fortuna, GP.