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Titolo: saggio di inibizione enzimatica

Salve a tutti!
Devo effettuare dei saggi per valutare la capacità inibitoria di
alcune molecole nei confronti di una proteasi (anthrax lethal factor).
Questo saggio viene condotto untilizzando lo spettrofotometro per
monitorare la diminuzione dell'assorbimento a 405 nm (dovuto alla
formazione del prodotto)a seguito dell'aggiunta dell'inibitore. Nella
miscela di reazione sarà presente l'enzima, il substrato e quantità
crescenti di ininbitore. Il problema che mi si presenta è il
seguente:preparo il tutto in un eppendorf e prima di trasferirlo nella
cuvetta aggiungo l'enzima.Dopodichè inizio la lettura a 405 nm. Nei
primi secondi si verifica sempe una diminuzione dell'assorbimento,
così la curva presenta sempre un'avvallamento iniziale!Non capisco da
cosa dipenda..forse è un problema di omogeneità della soluzione di
reazione oppure di concentrazioni?
un grazie a chiunque possa darmi un'idea in più!

 un grazie a chiunque possa darmi un'idea in più!
Beh, puo' essere un problema di omogeneità. Prima di aggiungere l'enzima 
(e appea dopo) sei sicuro di invertire bene. A volte per tensione 
superficiale (sopratutto con cuvette piccole, es da 300ul, che immagino 
userai per usare meno enzima possibile) pur invertendo il liquido non 
"cade".
Altra cosa, il volume in cui e' disciolto l'enzima e' trascurabile 
rispetto al volume totale? Mi spiego, se il saggio e' in 100ul e poi 
aggiungi 10ul di enzima hai di botto una diluizione 1/10 >>> calo dell'OD.
Oppure ancora, il buffer/solvente in cui e' disciolto l'enzima 
interferisce con la lettura? (prova a aggiungere il buffer/solvente da 
solo e controllare l'andamento dell'OD).
Sono banalita', ma a volte non ci si pensa.
JM2C

 JM2C

 secondi per poi risalire
se è una diluizione, certamente interessa tutto lo spettro
dell'ammontare del 2.5%, ma questa cosa è indipendente dal fatto che
poi risalga o no. Inoltre dovrebbe esseere senza cinetica, cioè a
gradino. Sempre che non ci sia un mescolamento lento.
Quano è ampio in termini di valori reali di assorbanza il calo che
osservi? Quale è il valore iniziale? zero? o la mix ha già
un'assorbanza diversa da zero? Con cosa è fatto il bianco?
L'avvallamento iniziale potrebbe essere anche un transitorio
abbastanza lento, ma in assenza di dati certi sulla assoluta mancanza
di artefatti, è bene non esprimersi a riguardo.
In conclusione, spiega meglio l'esperimento dicendo come fai il
bianco, i solventi, etc.. Molto utili sono gli esperimenti di
controllo che ti hanno suggerito. Anche altri esperimenti che ottieni
variando la concentrazione di substrato e guardando se il salto è
proporzionale. Potrebbe ancora essere una reazione veloce dell'enzima
con una impurezza presente nella mix iniziale.


A me sembra una inibizione competitiva, tipica delle proteasi, tirerei
i valori dopo il drop iniziale.
Ciao
Zille


erratum
tirerei=considererei
zille

 - Mostra testo citato -
posso non considerare i valori che seguono?perchè io dovrei utilizzare
i primi per ottenere la V0

 i primi per ottenere la V0
Sará che puoi considerare il drop iniziale in una cinetica semi-
logaritmica di primo ordine tipica delle inibizioni? Riesci ad
ottenere una linearitá decente dall'equazione di regressione? Io
personalmente eliminerei il drop iniziale e estrapolerei lo t=0
dall'equazione calcolata sul resto della curva.
Ciao
Zille