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Titolo: PCR in situ

Cerco urgentemente informazioni sulla PCR in situ, chiunque ne sappia
qualcosa può aiutarmi?
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Fabio Di Benedetto- Italy- Udine
Studente Tecnico di Laboratorio Biomedico
Fab...@katamail.com
http://digilander.iol.it/fobia/FabioDiBenedetto.html
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 wrote in message
3A75AC19...@katamail.com...
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Con in situ intendo quella PCR che si fa sui vetrini dei preparati
istologici, praticamente si amplificata il DNA target all'interno del
nucleo marcando l'amplificato in contemporanea con qualcosa di visibile
al microscopio. Serve un apparecchio apposito per fare la PCR su questi
vetrini.
Ma quello che volevo fare io in realtà è una cosa diversa, e volevo
scoprire se era realmente possibile.
Dopo aver fatto correre del DNA genomico digerito su gel di agarosio,
vorrei blottarlo su qualcosa che resista alle temperature della PCR
senza sciogliersi ed amplificarlo(aplificare quello che cerco) con una
PCR calda sullo stesso filtro (per cui pensavo di usare lo stesso
apparecchio della PCR in situ.
Devo scoprire se esiste qualcosa tipo un filtro di nitrocellulosa o
altro che lega solo un estremità degli oligo- magari marcati con
qualsiasi cosa consentendo all'amplificato per PCR che si forma di non
diffondere via dal filtro, un paio di idee ce le ho, ma mi chiedevo se
qualcuno lo ha già fatto, se in commercio esistono dei filtri appositi,
o dei gel che resistono ad alte temperatute e separano grossi frammenti
di DNA...Nella PCR in situ vera è il nucleo stesso che impedisce
all'amplificato neoformato di diffondere, ma su gel o filtro in teoria
non c'è bariera.
Hai dei consigli?Esistono tecniche già sperimentate vagamente simili a
quella da me descritta?
Per quello che è il mio scopo,infatti, una banale sonda radioattiva non
è del tutto sufficiente.


 al microscopio. ..........................
Scusa, Fabio, una curiosità. Io opero con la PCR ed RT-PCR ma non ho mai
fatto PCR in situ. Come si fa a fare entrare nel nucleo delle cellule sui
vetrini la Taq? Occorre uno speciale trattamento d fissazione? Grazie. A
presto.
Stefano
gifa...@tin.it
http://web.tiscalinet.it/gifalone

Neppure io l'ho mai fatta, però in un laboratorio in cui sono stato si
stanno organizzando per farla, quindi hanno manuali e strumenti, da
quello che mi hanno detto  non servono particolari metodi di fissazione,
nel senso che la fomalina (e i fissativi aldeidici aditivi in genere)
dovrebbe essere adatta, e per come me l'hanno spiegata si dovrebbe
rendere le membrane porose. Ora credo che non sia sempre necessario, ma
di solito si fa un pretrattamento con con proteinasi K e detergenti (sto
parlando di tessuti fissati, processati e tagliati, per la citologia
forse le cose sono leggermente diverse, nel senso che i pretrattamenti
dovrebbero essere  diversi.
Poi si aggiunge il mix di reazione e le cellule dovrebbero fare da
camere di amplificazione.
Poi ci sono vari modi più o meno radioattivi per identificare
l'amplificato, molti usano delle sonde in un passaggi successivo alla
PCR.
Forse, se avrò tempo e la possibilità approfondirò l'argomento nei
prossimi mesi.
Per tornare alla membrana ho visto che esistono varie PCR in fase solida
che però non sono esattamente ciò che cerco, comunque ho trovato una
soluzione alternativa almeno per ora.
Nonostante questo l'argomento membrane di Nylon mi interessa ed ho
notato che sono un notevole ignorante in materia. 
Di solito noi blottiamo, croslinkiamo ecc.(perdonate il gergo).
Però su internet ho trovato nel sito
http:/
nunc.nalgenunc.com/resource/technical/techinfo/diapopsp.html
 la
tecnica DIAPOPS appunto che fa uso di primer con un estremità 5' formata
da un poli T. In un libretto  sulla PCR della biomedia ho letto poi di 
un certo  Revers Dot Blot che fa uso di Nyalon rivestito di sonde legate
per un estremità poli T.
Dunque credo che mi sia stato spiegata la natura del legame covalente
DNA nyalon , ma ora non me la ricordo, se qualcuno mi può rinfrescare la
memoria ,lo ringrazio.
Poi, perchè queste membrane hanno una predilezione per i poli T e qual è
la natura del loro legame.
Infine le membrane che legano questi poli T, possono anche essere usate
per i Southern Blot?
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