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Titolo: Varie su estrazione DNA ed RNA e PCR

Volevo avere informazioni su meccanismo d'azione e scopo di alcuni reattivi
che si usano spesso in vari protocolli per  estrarre DNA ed RNA:
Beta mercaptoetanolo (riducente di che cosa?);
CTAB (come funziona?Si usa nell'astrazione da vegetali).
L'estrazione Fenolo-cloroformio: Si dice e si vede che le proteine finiscono
nell'interfase, ma perché nell'interfase e non nel fenolo?
Estrazione Fenolo-Cloroformio RNA, si usa fenolo acido che estrae anche il
DNA: mi sono inventato la seguente spiegazione: il fenolo è più apolare
dell'acqua pertanto il fenolo acido rende  il DNA indissociato a livello di
gruppi acidi e pertanto più affine alla fase fenolica, l'RNA non passa
perché ha qualche gruppo polare a livello delle basi nucleotidiche che
complessivamente lo rendono più polare (non avendo la doppia elica ed
esponendo le basi quindi). Complessivamente la spiegazione non mi
"autoconvince" pienamente perché le basi globalmente dovrebbero essere
lipofile.
PCR: Una tesi che ho senti girando in vari laboratorio e che non ho mai
verificato se è o non è vera è la seguente: la PCR come tutti sanno dopo un
certo numero di cicli giunge al plateau, pertanto aumentando tale numero di
cicli non dovrebbe aumentare l'amplificato. La tesi di alcune persone è che
anzi diminuisce ! Io questa cosa non la capivo e non l'ho mai verificata sul
campo, però dando la tesi per buona ho provato a pensare la possibile
spiegazione teorica che sarebbe la seguente: superato il plateau la PCR in
fase di elongazione non polimerizza niente per cui il DNA rimane denaturato
dalla fase precedente di denaturazione e visto i rapidi cambi di T della PCR
non fa in tempo a formare la doppia elica. Questo DNA denaturato ha poi una
resa minore in fase di elettroforesi (nel senso che cattura meno
EtidioBr).Ne sapete qualcosa?
Grazie e Ciao
Fabio Di Benedetto

 EtidioBr).
Se carichi in elettroforesi DNA denaturato dovresti vedere le due bande
relative a ciascun ssDNA...


Scusa se nell'ultima parte faccio un po' l'avvocato del diavolo, ma vorrei
accertarmi della totale infondatezza dell'ipotesi che ho riportato sulla
PCR.
Grazie, intanto dei consigli, che come sempre sono puntuali e validi.
Ciao

 attribuita ad aspecificità della Taq.
Ed è sicuramente quello il motivo. La denaturazione dei due strand la hai
solo se tieni a temperatura elevata la provettina con il tuo prodotto PCR
(oppure ci aggiungi un denaturante...). Quando la PCR è finita e prendi il
tuo campione per fare l'elettroforesi, la temperatura all'interno della
provetta avrà nel frattempo raggiunto i 20-25 °C e quindi si sarà rinaturato
tutto.
La mia risposta precedente è stata un po' inutile, lo ammetto.

"dawe"............

NOOOOOOOO!
Ho fatto una figura barbina mica da ridere! Se il mio capo mi avesse letto
mi butterebbe fuori a calci dal laboratorio! E pensare che ho fatto
estrazioni fenolo-cloroformio per una estate!
Il fatto che le proteine si raccolgono all'interfase è vero, però
l'interfase la ottieni tra fenolo-cloroformio e isopropanolo (è lui a dare
la fase polare, acquosa)!
Cioè col fenolo-cloroformio tu denaturi e non è che poi centrifughi ed
ottieni due fasi a diversa polarità! Non si separano! Questo lo ottieni
aggiungendo un egual volume di isopropanolo che solubilizza il DNA. Infatti
poi tu recuperi il surnatante composto da isopropanolo con DNA! Mio dio,
quante cazzate sono riuscito a scrivere?
Ho passato una giornata a pensarci e c'era qualcosa che non andava in quello
che ho scritto, poi questa sera tornando da un concerto ho realizzato cosa
ti avevo detto! Mio dio, non dirlo a nessuno (anche se ormai lo avranno
letto tutti sul NG!). Faccio pubblica ammenda! Questo è quello che succede
quando si danno spiegazioni già supponendo che la tesi sia vera e non
guardando i fatti!
Scusa ancora per il mio errore grossolano (1annoemezzo di tesi e dico ancora
queste cose? Non merito di laurearmi).
Scusa e scusa ancora, non volevo!
in fede
dawe

 quante cazzate sono riuscito a scrivere?
Tranquillo, almeno tu te ne sei accorto, io credo di aver fatto altrettanto
un sacco di
volte senza neanche accorgermene :P, magari anche ora.
Comunque ci sono ancora in sospeso il discorso CTAB e fenolo acido per
l'estrazione RNA, chiunque volesse dire la sua, lo faccia, Grazie :)
Fabio Di Benedetto

poi tu recuperi il surnatante composto da isopropanolo con
DNA! 
Scusate, forse ho capito male....ma l'isopropanolo non è uno dei
reagenti utilizzati per far precipitare gli acidi nucleici? Io sto,
attualmente, lavorando proprio su questo e uso l'isopropanolo per la
precipitazione del DNA.
Leila
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Inviato via 
http://usenet.iol.it
 

 reagenti utilizzati per far precipitare gli acidi nucleici? ...
Si; sai qualcosa riguardo CTAB e fenolo acido per estrarre l'RNA?
Fabio Di Benedetto

> Quindi credo che tu ti sia confuso con l'alcool isoamilico
No, devo ammetterlo, ho proprio dimenticato il passaggio in cui si aggiunge
l'alcool... :,-(

Si, è proprio lui...

Ciao,
scusa se ti rispondo solo ora.
Purtroppo so ben poco sul metodo che
usa il CTAB.Quello che so č che č utilizzato nel tampone di estrazione
degli acidi nucleici per rimuovere i contaminanti umici (se si tratta di un
campione proveniente dal suolo) che potrebbero interferire con gli enzimi
di restrizione utilizzati successivamente. Questo č uno dei motivi per il
quale il metodo con CTAB č preferito per la PCR (anche se ha una bassa resa
di estrazione).
Per quanto riguarda il metodo che usa il fenolo acido non
posso aiutarti perchč non lo conosco.


 degli acidi nucleici per rimuovere i contaminanti umici
Grazie
Ciao
Fabio Di Benedetto