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Titolo: elettroforesi nativa d proteine

Ciao a tutti. Ho un problema. Devo distinguere mediante Western blotting 2
proteine. Il probl è che gli anticorpi non sono molto specifici e c'è un po'
d cross-reazione. Ora, potrei risolvere il probl se le mie prot migrassero
diversamente ma, disgraziatamente, con l'SDS-PAGE si fermano esattamente
allo stesso punto. Secondo voi, se facessi un blotting dopo PAGE nativa,
riuscirei a discriminare tra le 2 forme? Le 2 prot hanno quasi identico pm
ma punto isolettrico leggermente diverso. Datemi un consiglio, plz!!
Grazieeeeeee!!!!!!!
Stefano
gifa...@tin.it
http://web.tiscalinet.it/gifalone
ICQ 110419911

 
gifa...@tin.it
Ma scusa fai una elettroforesi bidimensionale no?
 
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   ,','"_:./\/\,'_ `.`.       Sandro Altamura        ,','"_:./\/\,'_ `.`. 
  /_:--:_ ( oo ) _:--:_\    
alta...@atlink.it
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 Stefano
Non è il mio campo, ma giusto per dare un contributo alla discussione  forse
si potrebbe valutare oltre alla elettroforesi bidimensionale una
cromatografia per affinità con gli Ab legati alla colonna (partendo dal
presupposto che la proteina che cross reagisce abbia un affinità minore),
certo che se non conosci qualcuno che abbia una buona esperienza nel settore
mi sa che è difficile...se poi magari queste proteine avessero delle
caratteristiche funzionale sfruttabili per separarle.
Poi volevo sapere come hai risolto quel problema degli inquinamenti in
RT-PCR?! (Se lo hai risolto).
Fabio Di Benedetto

 RT-PCR?! (Se lo hai risolto).
Ciao Fabio. Sono felice d avere anche la tua opinione in merito.
Dunque, vogliamo risolvere il probl della comigrazione sempre con una
metodica elettroforetica x un motivo molto semplice: preferiamo una tecnica
che c permetta d realizzare uno screening dei ns campioni con poco materiale
xché ne abbiamo poco. L'affinità col GSH, seguita da un cromatofocusing o da
un HPLC in fase inversa richiedono + materiale d partenza e noi non
l'abbiamo. Con un IEF od una nativa ce la caviamo con poche proteine (una
decina d ug x canale) e quindi è preferibile. Ripeto, il ns scopo non è una
preparativa ma solo un'analitica.
Il probl della contaminazione da DNA in RT-PCR (se è quello a cui t
riferisci) è stato risolto ottimizzando la concentrazione d DNasi I ed il
tempo x la digestione. Se, invece, t riferisci ad aspecifici tra gli
ampliconi, il guaio è stato affrontato x via "post-sperimentale"...cioè con
Photoshop!! :-))
Cmq, a parte gli scherzi, le bande d DNA amplificate nelle ns RT-PCR sono a
volte accompagnate da bande corrispondenti ad ampliconi derivati da
appaiamenti aspecifici ma, anche qui, avevamo bisogno d un metodo d
screening x verificare l'assenza o la presenza d un trascritto in un
campione.
Mercoledì prox ho la seduta d laurea...
FATEMI UN IN BOCCA AL LUPO!!!!!


Stefano
Oh!!! Finalmente, non se ne poteva piů!!!    :)
IN BOCCA AL LUPO!
Facci sapere come č andata.
Ciao
Fabio Di Benedetto

 Ciao
come ho già detto in un posto sopra...benone! 110 e lode. E' andata bene e
adesso voglio solo rilassarmi per tutto agosto. Fabio, c si continua a
vedere sul ng! :) CIAOOO!!!!!!!!!
