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Titolo: Domande sulle terapie geniche

Salve, vorrei chiarirmi qualche dubbio.
Scusate se magari dico delle ingenuit�, ma non sono biologo, n� medico, n� 
di questo ng (di nessuno, per la verit�), anche se ogni tanto ci do una 
sbirciatina per curiosit�.
Dunque, pare che l'area pi� evoluta della medicina cellulare sia quella 
delle terapie geniche, con diversi trattamenti gi� in fase clinica, o sul 
punto di arrivarci.
Il concetto � quello di transfettare le cellule di un tessuto malato a causa 
di uno o pi� geni malfunzionanti con i geni corretti, che, anche se a fianco 
di quelli difettosi, prevarrebbero, esprimendo le proteine necessarie al 
ripristino del tessuto.
Il primo dubbio, anche se minore, � gi� qui: che fanno i geni difettosi? Non 
lavorano pi�? E se s�, come interferisce la loro attivit� con quella dei 
loro "colleghi" sani?
La tecnica di transfezione pi� consolidata utilizza dei virus, che 
normalmente penetrano nelle cellule, e l� rilasciano il proprio patrimonio 
genetico.
A questo viene tolto il DNA patogeno, e aggiunto quello terapeutico, umano, 
che cos� viene veicolato dove � necessario mediante una semplice iniezione 
di qualche sostanza contenente i virus cos� modificati.
Il secondo dubbio � questo: � ininfluente che una cellula venga infettata 
pi� volte? E se non lo �, come si pu� fare in modo (a meno che non avvenga 
gi� spontaneamente) che "tutte" le cellule malate ricevano solo le copie 
necessarie dei geni terapeutici, e non di pi�?
Capisco come ci� sia possibile statisticamente: dosando in modo adeguato le 
iniezioni, ma mi sfugge, se il controllo � necessario anche al livello delle 
singole cellule.
Grazie e ciao a tutti.
Fernando

 più volte?
La domanda è interessante e dato che non lo so, sono andato a cercare
quante copie di un genoma virale vengono di norma inserite nel genoma
ospite, ma non ho trovato una risposta precisa. Credo di capire però
che si tratta di molte copie, perchè ogni singolo virus che infetta
una certa cellula ha una possibilità di inserivisi. Invece non ho
trovato del tutto se un singolo genoma virale può essere trascritto
più volte per generare più di uno spezzone di DNA.
In ogni caso rimane il fatto che il numero di copie è abbastanza
irrilevante, perchè qui entra in gioco l'autoregolazione dell cellula.
Normalmente ogni copia di un gene qualsiasi può essere bloccata, nel
qual caso non produce niente. Se non è bloccata produce una quantità
costante ma piuttosto bassa della sua proteina (livello basale). La
maggior parte della produzione avviene invece sotto l'influsso di un
sistema di regolazione che può aumentare enormemente la produzione se
c'è fabbisogno o invece ridurla giù giù fino al livello basale se non
c'è fabbisogno.
Nel nostro caso, se il sistema di regolazione del gene difettoso non è
anche lui difettoso, nel momento in cui si riesca a inserire un numero
qualsiasi die copie del gene funzionante, la sua produzione verrà
regolata ai livelli giusti per quella cellula, più o meno
indipendentemente dal numero di copie. In generale non dovrebbe però
essere troppo difficile dosare in modo tale che più o meno tutte le
cellule bersaglio ricevano fra diciamo zero e dieci inserzioni.
Presupponendo, che gli altri problemi siano stati risolti.
(Sì, quel che segue non l'hai chiesto, ma tant'è. Il tema mi interessa
perchè qualche anno fa conoscevo una biologa che ha fatto il suo
dottorato esattamente sull'infettare dei topi con un herpes contenente
un gene estraneo per vedere se questo gene si installava
correttamente.)
I problemi connessi col metodo della transfezione, per cui dopo tanti
anni non si hanno ancora risultati veramente utilizzabili, sono:
1) evitare che il virus ammazzi l'ospite.
2) evitare che l'ospite ammazzi il virus.
Ed è veramente un problema, perchè naturalmente le due pretese si
contraddicono: Se devi riprodurre un virus in quantità tali da usarlo
in laboratorio e poi in terapia, deve essere abbastanza vitale da
poterlo coltivare e poi da non essere immediatamente distrutto dalle
difese del paziente in cui lo inietti. Se poi è abbastanza vitale,
basta un niente perchè si riproduca più del voluto e danneggi
l'ospite.
Infatti la dottoranda di cui parlavo ne era appunto allo stadio di
cercare di indebolire il virus al punto giusto. Purtroppo non era
ancora al punto giusto e tutti i sui topi morirono nel giro di nove
giorni di una morte orribile, spelati, coperti di pustole e
contorcendosi per il dolore. Ma non fa niente, anche i risultati
negativi sono necessari per far avanzare la scienza.
Tu dici "viene tolto il DNA patogeno", ma la cosa non è così semplice,
dato che a ben vedere la capacità stessa di inserirsi nel genoma
dell'ospite fa parte delle caratteristiche patogene.
Essendo il punto di inserzione scelto più o meno casualmente, non si
può escludere che il nuovo gene vada a finire in mezzo a un altro,
disattivandolo, o nel mezzo della sua sequenza enhancer,
sconvolgendone la regolazione (alcune forme di cancro vengono
incominciano in questo modo.). Anzi, sarebbe del tutto sicuro che ciò
accada, se non fosse che la maggior parte del nostro genoma consiste
di sequenze cosidette "mute", fra cui gli introni, in cui una
mutazione in linea di principio non ha conseguenze. A mio parere
questo effetto, di offrire un largo bersaglio in cui una inserzione
virale non ha conseguenze negative dirette, deve essere una delle
pricipali ragioni d'essere die queste regioni mute.
L'altra caratteristica patogena che che si dovrebbe eliminare è
naturalmente la capacità di riprodursi. Ma nel momento in cui un virus
non si può più riprodurre non serve più a niente, dato che non lo puoi
produrre in quantità utilizzabili.
In conclusione, dato che togliere il DNA patogeno in senso letterale è
un pio desiderio, si è ridotti a un gioco di equilibrismo fra un virus
che non riesce a invadere l'organismo che deve invadere, e uno che ci
riesce anche troppo bene.
Ciao
Marco

Poveri noi, ci sarebbe da scrivere per dei giorni.
Errata:
MucOviscidosi e non MucIviscidosi.
"l'accumulo di un'altra _molecola_"
Ma un altro punto interessante è che per la maggior parte i virus
hanno una spiccata preferenza per certi tessuti ed evitano tutti gli
altri. Allora c'è anche il problema che non serve a niente avere un
virus colla virulenza giusta, con inserito il gene giusto, dosato
nella quantità giusta, se poi quel virus si rifiuta testardamente di
infettare il tuo bersaglio.
Basta, buona notte.
Marco

Marco
Grazie, sei stato molto esauriente, ma come giustamente dici, ci sarebbe da 
scrivere per dei giorni, infatti hai sollevato pi� interrogativi delle 
risposte che hai dato. E' sempre cos� con la scienza, ma non preoccuparti: 
non ho intenzione di abusare della tua disponibilit�.
Sembri pessimista, e in effetti qualche anno fa interruppero le 
sperimentazioni dopo un caso di cancro, ma ora alcuni trials hanno dato 
risultati molto buoni, e c'� dell'entusiasmo nuovo.
In oftalmologia, per esempio, la terapia dell'amaurosi congenita di Leber 
continua a produrre miglioramenti a distanza di un anno, tu pensi che non 
sia ancora il caso di cantare vittoria?
Naturalmente ho riguardato un po' l'argomento, per comprendere meglio la tua 
risposta, e cos� mi sono domandato se esistono dei software di simulazione 
in giro: faciliterebbero moltissimo lo screening.
Per esempio, tu parli di sistemi di regolazione, e infatti tutte quelle 
compartimentazioni cellulari con ingressi, uscite e controlli, mi fanno 
pensare proprio ai sistemi "automatici" che si studiano in ingegneria. Qui, 
si usano dei modelli analitici che funzionano bene, e magari si possono 
applicare anche in questo campo, bench� la complessit� di una cellula sia, 
credo, assai superiore anche a quella di una sonda interplanetaria, ti 
risulta niente al riguardo?
Grazie di nuovo, comunque.
Ciao
Fernando 

 pensare proprio ai sistemi "automatici" che si studiano in ingegneria.
Per quel che ne so, i sistemi di regolazione delle cellule si possono
effettivamente vedere in termini ingegneristici.
Ci sono quelli a temporizzatore che per modo di dire accendono il
riscaldamento alle 7 di sera e quelli a retroazione che comandano il
bruciatore secondo la temperatura esterna, o secondo la temperatura
della camera, o magari cercando di far durare più a lungo il gasolio o
che vanno a comprare lo zucchero quando la zuccheriera è quasi vuota.
Se i meccanismi sono noti, o se almeno fra causa ed effetto si riesce
a riconoscere una qualche legge, si possono modellizzare.
Sui meccanismi concreti si sa poco. Le mie conoscenze sono piuttosto
antiquate, ma ancora non molto tempo fa non si sapeva granchè anche
solo su come un comando passi dal recettore sulla membrana agli
attuatori sul DNA.
In termini di meccanismi concernenti il DNA e rilevanti proprio per i
retrovirus, il DNA è regolato da un lato direttamente, in quanto c'è
una sequenza (promotore) all'inizio della zona da trascrivere e
necessaria all'ancoraggio del sistema di trascrizione, che può essere
bloccata o no. Se non è bloccata, il gene viene già trascritto, anche
se a livello basso.
C'è però un'altra sequenza (enhancer), che se attivata può potenziare
moltissimo la trascrizione. Interessante è che questa sequenza si
trova di solito a distanze piuttosto grandi dall'inizio del gene,
anche varie migliaia di coppie di basi. Si sa nel frattempo che su
questa sequenza si ancorano dei complessi equilibristici di una
quantità di proteine differenti e che il DNA fra enhancer e promotore
è obbligato a piegarsi in uno o più cappi per permettere alle molecole
sull'enhancer di arrivare in vicinanza di quelle sul promotore. Ancora
non molto tempo fa non si sapeva perchè la cosa debba essere così
complicata, se i cappi hanno una funzione o se solo stanno fra i
piedi, se la distanza esatta fra enhancer e promotore ha importanza,
se la sequenza delle varie migliaia di basi fra enhancer e promotore
abbia importanza oppure no, e che cosa esattamente facciano le
molecole sull'enhancer a quelle sul promotore per aumentare la
trascrizione.
Se ora si usa un retrovirus per impiantare un gene, si sa che questo
in generale andrà a finire in un punto qualsiasi del genoma ospite,
perciò o lo si equipaggia del suo proprio enhancer (se si sa dove
andarlo a prendere), allungandolo così anche di dieci o quindicimila
basi, o ci si aspetta che funzioni nel modo desiderato anche senza
enhancer e che non faccia troppi danni se per caso finisce nel raggio
d'azione dell'enhancer di un altro gene, a sua volta regolato secondo
criteri del tutto diversi.
In fondo il problema da risolvere è un'altro: un gene ha un errore di
sequenza. Di inserire un gene colla corretta sequenza da qualche parte
facendolo trasportare da un virus è una delle possibili soluzioni. In
teoria correggere direttamente la sequenza sbagliata dovrebbe anche
essere possibile, sia inserendo una o più basi mancanti, sia
eliminando delle basi di troppo, sia sostituendo una base sbagliata
con quella giusta. Ci sono di fatto dei meccanismi di correttura degli
errori che sono comunemente attivi nel nucleo e che fanno proprio
questo. Molti di questi meccanismi riconoscono gli errori perchè sono
chimicamente appariscenti oppure deformano il DNA, mentre quelle che
noi chiamiamo mutazioni evidentemente hanno un aspetto assolutamente
normale, ma credo di aver letto di certi meccanismi che ciecamente
sostituiscono una certa sequenza specifica (che lì dove si trova è da
considerare sbagliata) con un'altra altrettanto specifica. Si tratta
allora "solamente" di mettergli il naso sulla sequenza voluta,
convincerlo che è sbagliata e spiegargli quale sequenza noi
considereremmo giusta.
Ciao
Marco