Newsgroup: it.scienza.biologia
Titolo: ADP ribosylation .... AIUTO!

Ciao a tutti. Sono una nuova iscritta al NG, e appena arrivata eccomi
qui a... "batter cassa".
Ho da esporre un problema a cui spero che qualcuno sappia dare un
contributo.
Sono una dottoranda di ricerca e sono coinvolta in un processo che
studia, tra le altre cose, i fenomeni di poli-ADP-ribosilazione
PARP-mediati.
La PARP (poly ADP Ribose Polimerase) è un enzima nucleare - che
utilizza il NAD come cofattore - di cui a noi interessa misurare
l'attività, in colture cellulari.
A tale scopo utlizziamo un protocollo sperimentale (Virag e coll.)di
tipo isotopico.
Le cellule vengono dapprima trattate seguendo i protocolli di
interesse, al termine della reazione (cioè quando la PARP ha già fatto
il suo dovere) il medium di trattamento dei campioni viene sostituito
con un buffer di reazione contennete il tracciante (3H)NAD e della
digitonina.
Dopo 10 minuti la reazione viene bloccata in TCA le proteine
precipitate e poi solubilizzate e quindi l'emissione isotopica contata
allo scintillatore.
IL nostro dubbio è su COME agisca la PARP a quel punto. Sintetizza
nuovo polimero? La lunghezza del polimero e quindi la quantità di
incorporazione di (3H)NAD da cosa dipende?
Cercando in letteratura dei chiarimenti abbiamo trovato un articolo
(S. Homburg et al; J. Cell Biol. 2000, Vol. 150, 293-306) in cui viene
proposto un meccanimso detto di BACK-ADP-RIBOSYLATION, secondo il
quale la quantità di polimero formato durante l'incubazione con il
tracciante radioattivo è inversamente proporzionale al polimero
neoformato dal campione durnate i trattamenti.
Dal punto di vista pratico io dovrei veder quindi delle conte (CPM)
inferiori nei campioni in cui l'attività PARP è stata maggiore.
Ho cercato ulteriori conferme a questa teoria... ma nulla! Il vuoto
più assoluto.
Dal momento che i dati sperimentali ottenuti sono contrastanti... non
posso stabilire se la cosa sia effettivamente così o meno.
C'è qualcuno che sia in grado di aiutarmi a superare questo punto???
Ho sentito dire che qualcosa del genere è stato visto per le
fosforilazioni ma nenache lì ho ottenuto conferme dalla letteratura.
In ogni caso, vi ringrazio dell'attenzione e mi scuso della
lungaggine.
Alice

 ha scritto:
Ciao! Non sono un ricercatore (magari!) ma uno studente di ctf 4° anno.
Mi intrometto perche mi piace la biologia molecolare e soprattutto perche
ho molta fantasia :-P
Se ho capito bene la parp si lega al nad marcato, viene precipitata con
lui prima che finisca di lavorare, e contata. La digitonina (che sarebbe?
conosco la digitossina e la digitossigenina) a che serve?
Si conosce il meccanismo d'azione dell'enzima, eventuali regolazioni?
Il prodotto a che serve? Io risponderei a queste domande per far luce
sulla questione. Perche non provate ad usare subito il nad marcato?
E se usate un vostro protocollo? E con il substrato marcato?
Mi dai altre info che cosi ti pianto altre domande? :-P
-- 
LINUX USER #250527

 ha scritto:
Ciao! Non sono un ricercatore (magari!) ma uno studente di ctf 4�%/1iso8859-15 anno. 
Mi intrometto perche mi piace la biologia molecolare e soprattutto perche
ho molta fantasia :-P
Se ho capito bene la parp si lega al nad marcato, viene precipitata con
lui prima che finisca di lavorare, e contata. La digitonina (che sarebbe?
conosco la digitossina e la digitossigenina) a che serve?
Si conosce il meccanismo d'azione dell'enzima, eventuali regolazioni?
Il prodotto a che serve? Io risponderei a queste domande per far luce
sulla questione. Perche non provate ad usare subito il nad marcato?
E se usate un vostro protocollo? E con il substrato marcato?
Se mi dai qlc altra info ti pianto altre domande...   :-P
-- 
LINUX USER #250527