çısal momentumu, ona, kütlesi ile orantılı bir merkezkaç kuvvet verir. Belli bir taneciğe etki eden merkezkaç kuvvet, sıvının ona karşı uyguladığı direnç ile dengelenince tanecik sıvı içinde sabit hızda ilerler. Numunenin santrifüj içinde döndürülmesinin sonucunda, yoğun kütleli tanecikler dışarı doğru daha hızlı hareket ederler, düşük kütleli veya sıvı üzerinde daha çok sürtünme yapan taneciklere kıyasla. Taneciklerden oluşan bir süspansiyon "döndürülünce" (santrifüjlenince), kabın dibinde, "pellet" denen sıkışık bir çökelti topağı meydana gelir; sıvıda bulunan en kütleli ve en az sürüklenim gösteren tanecikler bu pellette diğer taneciklere kıyasla daha zenginleşmiş olurlar. Kabın dibinde sıkışmayan ve çoğunlukla sıvı içinde kalan taneciklere "süpernatan" (veya üst faz) denir; bu sıvı, kaptan boşaltmak yoluyla pelletten ayrılabilir. Santrifügasyon hızı numuneye uygulanan açısal ivme ile belirtilir, tipik olarak "g" 'nin katı olarak ifade edilir.

Eğer numuneler yeterince uzun süreli santrifüjlenirse, kabın içindeki çözeltinin yoğunluğu, dönme yarıçapı ile orantılı bir dağılıma ulaşır; bu sıvının içinde ilerleyen tanecikler kendileri ile aynı yoğunlukta olan noktaya kadar gidip (batıp veya yükselip) orada durular. Bu denge santrifüjlemesi ile belli yoğunlukta bir taneciğin yüksek derecede saflaşması elde edilebilir.

Sükroz gradyan santrifüjlemesinde bir santrifüj tübünün içine, konsantrasyonu lineer bir gradyan oluşturan bir sükroz çözeltisi konur, öyle ki en yüksek konsantrasyon tübün altında, en düşük konsantrasyon tüpün üstündedir. Bu gradyanın tepsine bir protein çözeltisi yerleştirilir ve bir ultrasantrifüj içinde yüksek hızda döndürülür. Bu şartlar altında, yüksek kütleli makromoleküller tübün dibine doğru daha yüksek bir hızla ilerler, hafif molekÜllere kıyasla. Çözeltide sükroz olmayınca, tanecikler dönme merkezinden uzaklaştıkça daha çok merkezkaç kuvvete tâbi olurlar, bu yüzden ilerledikçe daha hızlı hareket ederler. Doğru tasarlanmış bir sükroz gradyanında dönme merkezinden uzaklaştıkça sıvının yoğunluğu artacağı için sürtünme artar, dolayısıyla taneciklerin ilerleme hızı zaman içinde yaklaşık sabit kalır. Bu sayede tanecikleri biribirinden ayırt etmeye yarayan faydalı ayrışma aralığı daha geniş olur. Bu gradyanlar içinde yapılan ayrıştırmaya "hız bölgesel" (İngilizce"rate zonal") santrifügasyon denir. Protein veya tanecikler ayrıştıktan sonra gradyan, bölümlere (fraksiyonlara) ayrılır ve toplanır. Bu yöntemde bazen, saflaştırılacak olan proteinin büyüklüğüne bağlı olarak, sükroz yerine gliserol veya Percoll gibi silika tabanlı bir polimer de kullanılabilir (Percoll, GE Healthcare şirketinin tescilli markasıdır).

Dializ, protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır. Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir. Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.

Genelde bir protein saflaştırma protokolünde bir veya daha çok kromatografik adım bulunur. Kromotografideki temel uygulama, proteini içeren bir çözeltinin, içinde özel bir malzeme (genelde "reçine" tabir edilir) bulunan bir kolon (cam veya metal bir boru) içinden geçirilmesidir. Çözelti kolon içinde ilerlerken farklı proteinler reçine ile farklı şekilde etkileşir ve bu nedenle kolonun içinden geçme süreleri farklı olur. Kolonun öbür ucundan çıkan proteinler zamana bağlı olarak farklı tüplerde toplanır, böylece arzu edilen protein karışımdaki diğer proteinlerin çoğundan ayrılmış olarak elde edilir. Bazı durumlarda proteinler kolon malzemesine sıkıca bağlanırlar, sonradan özel şartların uygulanması ile kolondan koparlar; kopmalarını sağlayan şartlar proteinden proteine fark eder. Proteinler kolondan çıkarken genelde 280 nm dalga boylu ışığı soğurmaları ile tespit edilirler. Çeşitli kromatografik yöntemler mevcuttur:

Boy dışlama kromatografisi proteinleri boylarına göre ayrıştırır. "Boy dışlama kromatografisi" olarak bilinen bu yöntemde kolon malzemesi poröz mikroskopik taneciklerden oluşur. Küçük moleküller poröz matriksin içine girebildikleri için, kolonun içinden geçen hareketli faza geri dönmeleri zaman alır; büyük moleküller ise matriksin içine giremediklerinden dolayı, hareketli fazın akıntısı ile hızla kolondan geçerler. Poröz matrikse giren moleküllerin matriksinin içinde geçidikleri süre büyüklükleri ile orantılıdır. Bu yüzden, belli bir büyüklük aralığındaki proteinlerin kolonun öbür tarafından çıkabilmeleri için gereken eluent (hareketli faz) hacmi, onların büyüklüğüne bağlı olur.

Protein saflaştırılmasında, kolondan çıkan eluent zamana bağlı olarak farklı deney tüplerinde toplanır. Saflaştırılacak proteinin bulunmadığı tüplerdeki malzeme atılır; kalan çözelti, arzulanan protein ve onunla aynı boydaki diğer proteinlerden oluşur.

İyon değişim kromatografisi, bileşikleri iyonik yüklerinin cinsi ve miktarına göre olarak ayrıştırır. Kullanılacak kolon malzemesi (reçine), tipi ve elektrik yüklenme gücüne göre seçilir. Anyon değişim reçinelerinin artı yüklü olur ve negatif yüklü tanecikleri tutup ayrıştırmak için kullanılır; katyon değişim reçineleri ise negatif yüklüdür ve pozitif yüklü molekülleri ayrıştırmak için kullanılır.

Ayrıştırma başlamadan önce kolonun içinden bir tampon çözelti geçirilir, reçinenin karşıt yüklü iyonlarını dengelemek için. Numunenin kolona enjeksiyonu ardından, çözeltideki iyonlar ile diğer çözünenler (proteinler) arasında, reçineye bağlanmak için bir yarışma oluşur. Her bir çözünenin reçineye ne kadar sıklıkla bağlı kaldığı, onun taşıdığı elektrik yüküye ilişkilidir. En zayıf yüklü bileşikler kolondan ilk çıkar, onun ardından çıkanlar giderek artan yüklü bileşiklerdir. Ayrışma mekanizmasının doğası gereği, ayrışmaya etki eden faktörler, pH, tampon tipi, tampon konsantrasyonu ve sıcaklıktır.

İyon ayrışma kromatografisi protein saflaştırılmasından çok etkili bir araçtır ve hem analitik hem preparatif saflaştırmalarda yaygın olarak kullanılır.

Afinite kromatografisi, moleküler biçime (konformasyona) bağlı olan bir ayrıştırma yöntemidir, genelde her protein için farklı bir kromatografi reçinesi kullanılır. Bu reçinelerin yüzeyinde ayrıştırılacak proteinlere özgül ligandlar bağlıdır. Antikor-antijen bağlanmasına benzer şekilde çalışan bu ligandlar, hedef proteine spesifik olarak bağlandığı için, kolona yüklelenen numunenin hemen tamamı ona tutunmadan akıp çıkar, kolona bağlı kalan sadece ligandın bağlandığı protein olur.

Çoğu membran proteini glikoproteindir ve lektin afinite kromatografisi ile saflaştırılabilir. Deterjanla çözündürülmüş proteinlerin, üzerinde lektin molekülleri bağlı olan bir reçine ile temas etmesi sağlanır. Lektine bağlanmayan proteinler kolon yıkanınca akıp giderler. Spesifik olarak bağlanmış glikoproteinlerin reçineden ayrışması için, proteindeki lektin bağlanma bölgesindeki lektinlerle yarışabilen bir şeker eklenir. Bazı lektinler glikoproteinlere o kadar sıkı bağlanır ki onlar şeker eklenerek ayrışamaz, bu tür glikoproteinlerin reçineden salınması için onların denatüre edilmesi gerekir.

Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, 6 ila 8 histidinden oluşan bir peptidin, proteinin N- veya C-ucuna takılmasıdır. Polihistidin, nikel veya kobalt gibi, iki değerlikli (divalent) metal iyonlarına sıkı şekilde bağlanır. Numune, sabitlenmiş nikel iyonları bulunduran bir kolonun içinden geçirilir. Nikel, polihistidin etikete bağlanır. Etiketsiz proteinler kolona bağlanmadan geçerler. Etiketli proteinin kolondan çıkmasını sağlamak için imidazol kullanır (çünkü imidazol kolona bağlanmak için polihistidin ile yarışır) veya pH yaklaşık 4,5'e düşürür (çünkü düşük pH, etiketin metal iyonlarına olan afinitesini azaltır). Bu yöntem genelde genetik mühendislik yoluyla bir afinite etiketi (6xHis etiketi veya Clontech tarafından pazarlanan HAT etiketi) taşıyan rekombinant proteinleri saflaştırılmak için kullanılsa da, iki değerlikli katyonlara kendiliğinden afinitesi olan doğal proteinler için de kullanılabilir.

İmmünoaffinite kromatografisi bir antikorun bir hedef proteine spesifik olarak bağlanmasından yararlanarak o proteinin saflaştırılmasıdır. Bu yöntemde antikor bir kolon malzemesi üzerinde sabitlenir, böylece kolon spesifik olarak bu proteine bağlanır, geri kalan her şey ise kolon içinden akıp geçer. Proteinin kolondan çıkması için pH veya çözeltinin tuzluluğu değiştirilir. Bir etiketin genetik mühendislik yoluyla proteinin yapısı ile bütünleştirilmesi gerekmediği için, bu yöntem doğal kökenli proteinlerin saflaştırılmasında kullanılabilir.

Bir proteine RuBPS gibi bir etiket takılması sayesinde normalde olmayan bir bağlanma afinitesine sahip olabilir. Genelde, karışım içindeki proteinler arasında bu afiniteye sahip olan tek rekombinant protein bu olduğundan, etiketin varlığı saflaştırmayı büyük oranda kolaylaştırır. En yaygın kullanılan etiket, Histidin etiketidir (His-tag), bunun nikel ve kobalt iyonlarına afinitesi vardır. Dolayısıyla, nikel veya kobalt iyonlar bir reçine üzerinde sabitlenerek, histidin etiketli proteinleri spesifik olarak bağlayan bir afinite yüzeyi elde edilmiş olur. Saflaştırılacak protein histidin etiketli tek protein olduğu için, karışımda bulunan diğer tüm proteinler kolona bağlanmadan içinden geçerler, ve geriye sadece reçineye bağlanmış olan histidin etiketli protein kalır. Bu proteinin daha sonra yıkama (elüsyon) denen bir işlemle kolondan çıkması sağlanır. Histidin etiketi kullanılması durumunda, elüsyon için imidazol kullanılır, çünkü bu bileşiğin halka yapısı histid