olması veya bu dizilerin birbiriyle çok yakın ilişkili olması hâlinde, motifte temsil edilen harf dağılımını normalize etmek için sahte sayımlar eklenir.

Bilgisayar biliminde yaygın kullanılan çeşitli optimizasyon algoritmaları çoklu dizi hizalama problemine uygulanmıştır. Gizli Markov modelleri belli bir sorgu kümesi için olasıl çoklu dizi hizalamaları için olasılık skorları üretmek için kullanılır. Bu yaklaşımla çalışan ilk uygulamalar hayal kırıcı olduysa da, daha sonrakilerin uzaktan ilişkili dizilerin tespitinde özellikle etkili olduğu bulunmuştur, çünkü bu yöntemler korunmuş veya yarı korunmuş substitusyonların yarattığı gürültüden kolay etkilenmemektedirler. Genetik algoritmalar ve benzetilmiş tavlama da çoklu dizi hizalama skorlarını optimize etmekte kullanılmıştır. Bu konuda daha çok ayrıntı çoklu dizi hizalaması hakkındaki maddede bulunabilir.

Yapısal hizalamalar genelde protein ve bazen RNA dizileri için yapılır, dizileri hizalamak için protein ve RNA molekülünün ikincil ve üçüncül yapısı hakkındaki bilgiyi kullanılır. Bu yöntemler iki ve daha çok dizi için uygulanabilir ve tipik olarak lokal hizalamalar üretir. Ancak, yapısal bilgiye bağımlı oldukları için, sadece yapısı bilinen dizilerde işe yararlar. Gerek protein gerek RNA'da yapı, evrimsel olarak diziden daha çok korunur, Evrimsel olarak çok uzaktan ilişkili olan, dizi kıyaslaması yoluyla benzerlikleri belirlenemeyecek derecede ıraksamış dizilerde yapısal hizalamalar daha güvenilir sonuç verir.

Homoloji-temelli protein yapı tahmini için yapılan hizalamaları değerlendirmede yapısal hizalamalar "altın standart" sayılır Bunun nedeni, sadece dizi bilgisine dayanmak yerine yapısal benzerlik gösteren bölgeleri kasten hizalamalarıdır. Ancak, tamamen yapısal hizalamalar tabii ki yapı tahmininde kullanılamaz çünkü sorgu kümesindeki en az bir dizi, modellenmesi amaçlanan hedef dizidir ve onun yapısı bilinmemektedir. Bir hedef ve bir kalıp dizinin yapısal hizalamasında, hedef proteinin yüksek doğruluklu modellerinin bu tür yöntemlerle elde edilebileceği gösterilmiştir.

DALI yöntemi (İngilizce "distance matrix alignment" teriminden kısaltılmıştır), sorgu dizisindeki ardışık heksapeptitlerin temas benzerliklerine dayanarak elde edilen yapısal bir hizalama yöntemidir. Bu yöntemle ikili veya çoklu hizalamalar üretebilir ve sorgu dizisinin Protein Data Bank'taki yapısal komşularını tespit edebilir. FSSP yapısal hizalama veri tabanını oluşturmakta kullanılmıştır. DALI Web sunucusuna EBI DALI'den ulaşılabilir, FSSP ise The Dali Database'de bulunmaktadır.

SSAP ("sequential structure alignment program", sıralı yapı hizalama programı), dinamik programlama ile çalışan bir yapısal hizalama yöntemidir, yapı uzayında atomdan atoma vektörleri kıyaslama noktaları olarak değerlendirir. İlk tarif edilişinden beri bu yöntem geliştirilerek hem ikili hem de çoklu hizalamaları kapsamaktadır.. SSAP kullanılarak CATH ("Class, Architecture, Topology, Homology", sınıf mimarî, topoloji homoloji) adlı, protein katlamalarının hiyerarşik bir veritabanı kurulmuştur. CATH veritabanına CATH Protein Structure Classification sitesinden erişilebilir.

Yapısal hizalama için kombinatoryal uzatma yöntemi, karşılaştırılan iki proteinin kısa parçaları için lokal geometriye dayalı ikili yapısal hizalamalar yapar, sonra bu parçaları birleştirerek daha büyük bir hizalama yapar. Katı-gövde ("rigid body") karekök ortalama uzaklık, kalıntı uzaklıkları, lokal ikincil yapı ve çevresel özellikler (kalıntı komşu hidrofobisitesi gibi) kullanılarak "hizalanmış parça ikilileri" denen lokal hizalamalar üretilir. Bunlar kullanılarak, belli tanımlanmış eşik kıstasları dahilinde tüm olasıl yapısal hizalamaları temsil eden bir benzerlik matrisi inşa edilir. Büyüyen birer dizi parçası eklenerek hizalama büyütülür. Bu işlem sırasında, matris aracılığıyla, bir protein yapı hâlinden diğerine giden bir yol çizilir; optimal yol, kombinatoryal uzatma hizalamasını tanımlar. Bu yöntemi uygulayan bir Web sunucusu ve Protein Data Bank'taki yapılar için ikili hizalamalar veritabanı Combinatorial Extension sitesinde bulunmaktadır.

Filogenetik ve dizi hizalaması birbiriyle yakından ilişkili sahalardır çünkü ikisi de dizi yakınlığı belirlemesi yapar. Filogenetik sahası, filogenetik ağaçların inşası ve yorumlamasında dizi hizalamasından yararlanır. Filogenetik ağaçlar, evrimsel olarak ıraksamış türlerin genomlarında bulunan homolog genlerdeki evrimsel ilişkiyi sınıflandırmakta kullanılır. Bir sorgu kümesindeki dizilerin birbirlerinden farklılığı, bu dizilerin birbirlerine olan evrimsel uzaklığı ile nitel olarak ilişkilidir. Basit şekilde ifade edilecek olursa, yüksek derecede dizi aynılığı, söz konusu dizilerin nispeten yakın zamanda bir en yakın ortak atası olabileceğini ima eder, buna karşın düşük derecede aynılık, evrimsel ıraksamanın daha eskilere dayandığı olasılığına karşılık gelir. Bu ilkenin dayalı olduğu "moleküler saat" hipotezine göre dizilerden meydana gelen soylarda mutasyon ve seleksiyon etkisinin değişmediği varsayılır. Yaklaşık sabit bir evrimsel değişim hızına dayanarak yapılacak bir ekstrapolasyon sayesinde, iki genin ilk defa birbirinden ne zaman farklılaştığının hesaplanabilir. Dolayısıyla, organizmalar veya türler arasında DNA tamiri yeteneği bakımından farklılık olabileceğini, veya dizilerde belli bölgelerin işlevsel nedenlerle korunabileceğini hesaba katmaz. Ayrıca, moleküler saat hipotezinin en basit versiyonunda, protein kodlayıcı bölgelerde proteinin amino asit dizisini değiştiren ve değiştirmeyen DNA mutasyonlarının korunma olasılıkları arasında bir fark olabileceği de hesaba katılmaz. Daha hassas istatistik yöntemler bir filogenetik ağacın her dalı için evrimleşme hızının farklı olmasına izin verir, bu sayede gen soylarının birleştiği zamanın daha doğru kestirilmesine olanak verir.

İlerleyici çoklu hizalama teknikleri zorunlu olarak bir filogenetik ağaç üretir, çünkü büyüyün hizalamaya ekledikleri dizilerin sırası, evrimsel yakınlık derecesine bağlıdır. Çoklu dizi hizalamalarını ve filogenetik ağaçları oluşturan diğer yöntemler önce tüm olasıl ağaçlara bir skor verir, sonra en yüksek skora sahip ağaçtan bir çoklu dizi hizalaması hesaplar. Filogenetik ağaç inşasında yaygın olarak kullanılan yöntemler başlıca höristiktir çünkü optimal ağacın seçilmesi, optimal çoklu dizi hizalamasının seçilmesi gibi, NP-zordur.

Dizi hizalaması biyoenformatikte dizi benzerliğini tespit etmeye, filogenetik ağaç üretmeye ve protein yapıları için homoloji modelleri geliştirmeye yarar. Ancak, dizi hizalamalarının biyolojik anlamı her zaman açık değildir. Hizalamaların, ortak atadan inmiş diziler arasındaki evrimsel farklılığı yansıttığı varsayılır. Fakat, evrimsel olarak ilişkisiz olup benzer işlev gösteren ve bu yüzden benzer yapıya sahip proteinlerin yakınsak evrim sonucu dizi benzerliği göstermeleri mümkündür.

BLAST gibi veritabanı aramalarında, istatistik yöntemler kullanılarak, diziler arasında belli bir hizalamanın şans eseri olma olasılığı, veritabanının büyüklüğü ve bileşimine dayanarak hesaplanabilir. Arama uzayına bağlı olarak olasılık değerleri önemli derecede fark edebilir. Eğer veritabanındaki diziler sadece sorgu dizisin organizmasına ait dizilerden oluşuyorsa, belli bir hizalamanın şans eseri olma olasılığı özellikle artar. Veritabanında veya sorgu dizisinde tekrarlı dizilerin varlığı hem arama sonuçlarını hem de istatistik anlamlılık tayinini çarpıtabilir. BLAST otomatik olarak sorgu dizisindeki tekrarlı dizileri filtreler, böylece istatistik artifakt sonucu olan bulguları elimine eder.

Boşluklu dizi hizalamalarının istatistik anlamlılığını kestiren istatistik yöntemler literatürde mevcuttur.

İstatistik anlamlılık, belli kaliteye sahip bir hizalamanın şans eseri elde edilme olasılığını gösterir ama sorgu dizisinin belli bir hizalamasının diğer hizalamalardan ne derece daha iyi olduğunu belirtmez. Hizalanma inanılırlığının ölçütleri, belli bir dizi ikilisi için en yüksek skorlu hizalamalarının ne derece birbirine eşdeğer olduğunu gösterir. Boşluklu dizi hizalamaları için istatistik inanılırlık değerlendirme yöntemleri literatürde mevcuttur.

Bilinen diziler hakkında biyolojik veya istatistik gözlemleri yansıtan bir skor fonksiyonunun seçimi, iyi hizalamalar elde edilmesinde çok önemlidir. Protein dizileri genelde substitusyon matrisleri kullanılarak yapılır, bu matrisler belli karakter substitusyonlarının olma olasılıklarını yansıtır. PAM matrisi ("Point accepted mutation", noktasal olarak kabul edilmiş mutasyon) olarak adlandırılan bir grup matris, belli amino asit mutasyonlarının olma hızları ve olasılıklarını içerir (bu matrisler Margaret Dayhoff tarafından tanımlanmış olduğu için bazen "Dayhoff matrisleri" olarak da adlandrılır). Sık kullanılan başka bir grup matris ise BLOSUM ("Blocks Substitution Matrix" blok substitusyon matrisi) olarak adlandırılır, bunlar empirik olarak gözlemlenmiş substitusyon olasılıklarını kodlar. Her iki tip matrislerin varyantları, farklı düzeylerde ıraksama göstermiş dizilerin tayininde kullanılır. Böylece, BLAST veya FASTA kullanıcıları aramalarını sadece yakın ilişkili uyuşmalara kendilerini sınırlayabilir, veya arzu ederlerse daha uzak ilişkili dizileri de bulabilmeleri mümkün olur. Boşluk cezaları hizalamaya bir boşluk katılmasına etki eder. Bu boşluk ceza skoru, evrimsel anlamda bir insersiyon veya delesyon mutasyonunun olma hızı ile orantılı olmalıdır. Elde edilen hizalamaların kalitesi skor fonksiyonunun kalitesine bağlıdır.

Aynı hizalamayı farklı skor matrisleri ve/veya boşluk cezaları ile tekrarlayıp sonuçları karşılaştırmak çok yararlı olabilir. Hizalama parametrelerindeki varyasyonlara dayanıklılık gösteren hizalama bölgeleri tespit edilerek, sonucun zayıf olduğu veya tek olmadığı bölgeler belirlenebilir.

Dizilenmiş RNA, örneğin "ifade edilmiş dizi etiketleri ("expressed sequence tags") ve tam-uzunluklu mRNAlar, dizilenmiş bir genom ile hizalanarak nerede genlerin bulunduğu ve alternatif uçbirleştirme yerleri hakkında bilgi edinilebilir. and RNA editing