ı tüm ödüller:






Streptavidin

Streptavidin, "Streptomyces avidinii"den elde edilen tetramerik (dört altbirimli) bir proteindir. Biotin-strepavidin kompleksinin ayrışma katsayısı (K) 10 mol/L mertebesindedir, bu bağlanma doğada bilinen en güçlü non-kovalent etkileşimlerden biridir. Streptavidin moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır, çünkü biotin'e olan olağanüstü afinitesinin yanı sıra, aşırı pH, sıcaklık, organik çözücüler, denaturanlar (guanidinium klorür gibi), deterjanlar (SDS, Triton gibi) ve proteolitik enzimler, bu proteinin biotine bağlanmasını etkilemez.

Streptavidin'in doğadaki işlevi bilinmemektedir. Bu protein hücre dışına salgılandıktan sonra ortamdaki biotin moleküllerine bağlanıp onları başka mikroorganizmalar tarafından kullanılmaz hale getireceği için, streptavidinin bir antibiyotik görevine sahip olabileceği öne sürülmüştür.

Streptavidin-biotin kompleksinin kristal yapısı Hendrickson ve arkadaşları tarafından 1989'da çözülmüştür. 159 amino asit kalıntılı protein işlemlendikten sonra N- ve C- ucundan kırpılır, kalan protein 13-139. kalıntılardan ibarettir. Streptavidin monomerinin ikincil yapısı sekiz antiparalel beta (β) yapraktan oluşur, bunlar katlanıp bir antiparalel beta fıçı üçüncül yapı oluşturur. Her bir β fıçısının bir ucunda bir biotin bağlana yeri bulunur, bunların biotin için hem yüksek spesifitesi hem de yüksek afinitesi vardır. Dört tane birbirinin aynı streptavidin monomeri (yani dört birbirinin aynı β-fıçı) bir araya gelip streptavidinin tetramerik dördüncül yapısını oluşturur. Her fıçıdaki biotin bağlanıcı yer, fıçı içindeki kalıntılar ile, komşu bir altbirime ait bir Trp120'den oluşur. Böylece, her altbirim komşu altbirimin bağlanmasına katkıda bulunur. Dolayısıyla tetramerin aslında iki tane işlevsel dimerden oluştuğu düşünülebilir.

Streptavidinin en yaygın kullanımları arasında çeşitli biyomoleküllerin saflaştırılması ve deteksiyonu vardır. Güçlü streptavidin-biotin bağı çeşitli biyomolekülleri birbirine veya katı bir yüzeye bağlamakta kullanılabilir. Proteinlerin saflaştırılması ve deteksiyonu için kullanılan Strep-tag bir diğer uygulamadır.

Başka bir yöntemde DNA önce bir restriksiyon enzimi ile sindirilir. Kesik DNA sonra E. coli DNA polimeraz I'in Klenow parçası ve biotin-11-dUTP (biotine kovalent bağlı bir deoksiribonükleotit analogu) ile inkübe edilir. Kesik DNA'nın 3' ucuna biotin-11-dUTP eklenir. Bunun nedeni DNA polimerazın DNA'nın 5'-fosfat ucuna değil sadece 3'-OH ucuna nükleotit ekleyebilmesidir.


dUTP eklemek için tek bir uç varsa, reaksiyonun ürünü bir ucu biotinleştirilmiş bir DNA ipliğidir. Biotinlenmiş DNA'nın başlıca kullanımlarından biri, DNA'yı streptavidin kaplı yüzeylere bağlamaktır. DNA sıkıca bu yüzeye bağlanınca, çeşitli DNA hibridizasyon ve immün testler yapılabilir. DNA ayrıca streptavidin kaplı agaroz mikrokürelere, polistiren ve hatta paramanyetik boncuklara de bağlanabilir. Bu kompleksler en yaygın olarak DNA'ya bağlanıcı proteinlerin saflaştırılması veya izolasyonunda kullanılır. Diğer moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak bu moleküler aracın dizisi, uzunluğu vb. kontrol edilebilir.

Streptavidin bir tetramerdir ve her altbirim biotin'e aynı affinite ile bağlanır. Bazı uygulamalarda multivalent bağlanma bir avantajdır, örneğin streptavidine bağlı moleküllerin spesifik T-hücrelerine tespit etme yeteneğini artırır. Başka durumlarda, örneğin hücre hücre içinde belli proteinlerin görüntülenmesi için streptavidin kullanılmasında, multivalentlik ilgi konusu olan proteinin işlevine bozabilir. Monovalent streptavidin, tetramerik streptavidinin genetik mühendislikle değiştirilmiş bir versiyonudur, dört bağlanma yerinden sadece biri işlevseldir.. Bu tek bağlanma yeri 10 düzeyinde bir affiniteye sahiptir ve çapraz bağlanmaya ("cross linking") neden olmaz.

Monomerik streptavidin streptavidinin rekombinant bir biçimidir, tetramerin monomerlere ayrışmasına neden olan bir mutasyon içerir. Bu mutasyon ayrıca meydan gelen monomerlerin çözünürlüğünü artırır. Monomerik streptavidinin biotine olan afinitesi 10mol/L'dir ve bu yüzden işaretleme uygulamaları için ideal değildir, ama tersinirlik arzu ediliyorsa bu afinite değeri iyi bir özelliktir..

Streptavidin, biotine yüksek afinite ile bağlanan tek protein değildir. Biotine bağlanıcı proteinler arasında en kayda değer olanı avidindir. Bu protein evrimsel olarak streptavidinle ilişkili olmasa da çok benzer özelliklere sahiptir. Yumurta beyazından elde edilmiş olan avidinin streptavidin ile %30 dizi benzerliği vardır ama ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıları neredeyse aynıdır. Biotine olan afinitesi daha yüksektir (Kd ~ 10M) ama streptavidinden farklı olarak glikoziledir, pozitif yüklüdür, psödo-katalitik aktivitesi vardır (biotin ile bir nitrofenil grubu arasındaki bir ester bağının alkalin hidrolizini hızlandırabilir) ve öbekleşme (agregasyon) eğilimi daha yüksektir.
Streptavidinin izoelektrik noktası (pI) ~5 ile hafif asidiktir ama yaklaşık nötür pI'ye sahip bir rekombinant biçimi ticari olarak elde edilebilir. Streptavidinde bir karbonhidrat modifikasyonu olmaması ve neredeyse nötür bir pI'ye sahip olması nedeniyle avidine kıyasla çok daha düşük nonspesifik bağlanma gösterir. Deglikosile edilmiş avidin, büyüklüğü, pI ve nonspesifik özellikleri ile streptavidine benzer.






Colin Pitchfork

Colin Pitchfork (doğum 1961, Newbold Verdon, İngiltere) DNA parmakizleme deliliyle cinayetten hüküm giyen ve toplu DNA taraması ile yakalanan ilk katil olmuştur. Pitchfork iki kızın ırzına geçip onları öldürmüştür. Bu olayların birincisi Narborough'da 21 Kasım 1983'de, ikincisini Enderby'de 1986'da gerçekleşmiştir. 19 Eylül 1987'de yakalanmış ve iki cinayeti kabullenmesinin ardından 22 Ocak 1988'de ömür boyu hapse mahkûm edilmiştir.

1961'de doğan Colin Pitchfork, 3 çocuklu bir ailenin ikinci çocuğuydu. Babası maden işçisi, annesi ev kadınıydı. Anne babası onu diğer çocuklarına tercih etmiş, ona yeterince şevkat göstermemişti. Okulda akranlarından daha hızlı geliştiği için arkadaşlarınca alaya alınmıştı. Liseden sonra bir pastanede çalışmaya başladı.

Pitchfork, 18 yaşındayken küçük kızlara teşhircilikten tutuklandı. 1981'de, 20 yaşında Carole ile evlendi, aynı yıl psikiyatrik danışmanlığa gitti. 1983'te bir oğlu doğdu, aynı yıl ilk kurbanını öldürdü. 1985'te genç kızlara teşhircilikten dolayı tekrar tutuklandı. Ocak 1986'da ikinci oğlu doğdu. Temmuz 1986'da ikinci kurbanını öldürdü. Eylül 1987'de DNA testi ile katil olduğu tespit edildi ve cinayetten hüküm giydi. Ocak 1988'de iki kere ömür boyu hapis cezasına çarptırıldı.

21 Kasım 1983'de, 15 yaşındaki Lynda Mann bir arkadaşını ziyaret etmek için evinde çıktıktan sonra geri gelmedi. Ertesi sabah, ırzına geçilmiş ve boğularak öldürülmüş olarak Black Pad adlı bir yürüyüş yolunda bulundu. Adli tıp yöntemleri ile vücudundan bir meni numunesi elde edildi. Bu numunenin A kan grubundan bir kişiye ait olduğu ve bu kişinin sahip olduğu enzim profilinin erkek popülasyonun %10'una uyduğu bulundu. Başka bir delil ve ipucu yoktu, vaka dosyası açık bırakıldı.
31 Temmuz 1986'da başka bir 15 yaşında kız, Dawn Ashworth, eve gitmek için normal yolu almak yerine bir kestirme yol aldı. İki gün sonra cesedi ormanlık bir bölgede, Ten Pound Lane adlı bir patika yakınında bulundu. Dövülmüş, şiddetle ırzına geçilmiş ve boğularak öldürülmüştü. Cinayet yöntemi ilk saldırıya uyuyordu ve meni numuneleri aynı kan grubuna işaret ediyordu.

Polis, önce o bölgede yaşayan 17 yaşında Richard Buckland'dan şüphelendi. Zeka geriliği olan Buckland, Ashworrth'un cesedi hakında bilgi sahibiydi ve sorgulanınca suçu kabullendi ama ilk cinayeti inkar etti.

Leicester Üniversitesinden Alec Jeffreys, İngiliz Adli Bilim Servisi'nden (Forensic Science Service, FSA) Peter Gill ve Dave Werrett ile birlikte, bir süre önce DNA profillemesini geliştirmiş ve bu tekniği 1985'de bir makalede rapor etmişti. Bu çalışmada Gill, DNA ekstraksiyonu için tüm teknikleri ve eski lekelerden DNA profilleri elde etmenin mümkün olduğunu göstemekten sorumluydu. En büyük katkısı, vajinal hücrelerden sperm hücrelerini ayrıştırmak için tercihli ekstraksiyon yönteminin geliştirilmesiydi Bu yöntem olmaksızın ırza tecavüz vakalarındaki DNA numunelerin kullanmak çok zordu.

Bu yöntemi kullanarak Jeffreys her iki cinayete ait meni örnekleri ve Buckland'dan elde edilmiş bir kan örneğini karşılaştırdı. Sonuçlar, her iki cinayetin aynı erkek tarafından işlendiğini, ama bu kişinin Buckland olmadığını kanıtladı. Jeffrey'nin sonucunu doğrulamak ve bundan sonra izlenecek yolu belirlemek için polis, FSS ile temasa geçti. Buckland, DNA parmakizlemesi ile masumiyeti kanıtlanan ilk kişi oldu. Jeffreys DNA kanıtı olmasaydı Buckland'ın suçlu bulunacağından emin olduğunu söyledi.

Leicestershire karakolu ve FSS'nin bir girişimiyle bölgeden 5000 erkeğin gönüllü olarak kan ve tükürük numunesi vermesi istendi. Bu araştırma altı ay sürdü ve numunelerin hiçbirinde eşleşme olmadı.

Daha sonra, bazı görgü şahitleri, Ian Kelly adlı bir kişinin, kendisini arkadaşı Colin Pitchfork olarak tanıtıp polise DNA numunesi vererek £200 kazanmış olmakla övünmesini duydular. 19 Eylül 1987'de Pitchfork, komşu köy olan Littlethorpe'ta tutuklandı ve kendisinden elde edilen bir DNA numunesi katilinkiyle eşleşti. Bunu takibeden sorgulamada Ptichfork kadınlara binden çok kere kendini teşhir ettiğini itiraf etti; bu dürtü ilk ergenlik yıllarında başlamıştı. Teşhircilik onu cinsel saldırıya götürmüş, ardından da kimliğini gizlemek için kurbanlarını boğmaya vardırmıştı. Sanık, iki tecavüz ve cinayet vakası için suçunu kabullendi, ayrıca başka bir cinsel tecavüz olayını da itiraf etti. Pitchfork, Lynda Mann'ın cinayeti sırasında Littlethorpe'a taşınmaya hazırlanıyordu, Dawn Ashworth'un cinayeti zamanında ise Littlethorpe'daki Haybarn Close'da yaşıyordu. Irza tecavüz ve cinayet için eşzamanlı sürelerle ömür boyu hapse mahkûm edildi; ancak asgari ceza süresi belirtilmediği için on yıl sonra erken salınma olasılığı mevcuttur.

14 Mayıs 2009'da Kraliyet Adalet Sarayı'nd