bağı içeren inhibitörlerden daha kararlı olabilir, çünkü peptidazlar için substrat değildir ve yıkıma uğrama olasılığı daha düşüktür.

İlaç tasarımında hedef enzimin gördüğü substrat konsantrasyonunu göz önüne almak önemlidir. Örneğin, bazı protein kinaz inhibitörlerinin kimyasal yapısı, bu enzimin substratlarından biri olan adenozin trifosfatınkine benzer. Ancak, basit yarışmalı inhibitör olan ilaçların hücredeki yüksek ATP konsantrasyonu ile yarışması gerekir. Protein kinazlar, kinazın substrat proteini ile etkileştiği bağlanma yeri için yarışarak da inhibe olabilir ve çoğu proteinin hücre içindeki konsantrasyonu ATP konsantrasyonundan çok daha düşüktür. Dolayısıyla, eğer iki protein kinaz inhibitörü aktif bölgeye benzer afinite ile bağlanırsa, ama biri ATP ile yarışmak zorunda ise, proteine bağlanan yerdeki yarışmalı inhibitör, enzimi daha etkili şekilde inhibe edecektir.

Tersinmez inhibitörler genelde bir enzimi kovalent olarak değişime uğratır (modifiye eder) ve dolayısıyla inhibisyon geriye döndürülemez. Tersinmez inhibitörler çoğu zaman reaktif fonksiyonel gruplar taşırlar, örneğin 
nitrojen mustard, aldehitler, haloalkanlar, alkenler, Michaelis akseptörü, fenil sülfonat, fluorofosfonatlar. Bu elektrofilik gruplar amino asit yan zincirleri ile tepkiyip kovalent katımlar ("adduct") oluştururlar. Değişime uğrayan amino asit kalıntıları, yan zincirleri hidroksil veya sulfhidril grubu gibi nükleofiller içerenlerdir. Bu amino asitler arasında serin (DFP ile reaksiyona girer), sistein, treonin veya tirozin sayılabilir.

Tersinmez inhibisyon, tersinmez enzim inaktivasyonundan farklıdır. Tersinmez inhibitörler genelde belli bir enzim sınıfına özgüldür (spesifiktir) ve tüm proteinleri inaktive etmezler; protein yapısını bozarak değil, hedeflerinin aktif bölgesini spesifik olarak değişime uğratarak çalışırlar. Örneğin aşırı pH veya sıcaklıklar genelde tüm protein yapısının denatürasyonuna neden olur ama bu spesifik olmayan bir etkidir. Benzer şekilde, bazı non-spesifik (spesifik olmayan) kimyasal işlemler protein yapısını imha eder: örneğin derişik hidroklorik asit peptit bağları hidroliz edip proteini parçalar.

Tersinmez inhibitörler zamana bağlı inhibisyon gösterir ve dolayısıyla %50 inhibisyon sağlayan bir konsantrasyon ile nitelenemezler. Belli bir konsantrasyonda tersinmez inhibitör ile bulunan aktif enzim miktarı, inhibitörün enzim ile ne kadar süre bekletildiğine (inkübe edildiğine) bağlı olacaktır. Onun yerine, "k"/["I"] değerleri kullanılır, burada "k", gözlemlenen psödo-birinci derece inaktivasyon hızıdır, aktivite yüzdesinin logaritmasını zamana göre grafikleyerek elde edilir) ve ["I"] , inhibitörün konsantrasyonudur. "k"/["I"] parametresi, inhibitörün enzime bağlanması doyuma ulaşmadıkça geçerlidir (doyuma ulaşması hâlinde "k" = "k") .

Soldaki şekilde gösterildiği gibi, tersinmez inhibitörler enzim (EI veya ESI) ile önce tersinir, kovalent olmayan bir kompleks oluşturur, sonra bu reaksiyona girip kovalent değişime uğramış tersinmez kompleks EI*'yi oluşturur. EI*'nin oluşma hızına inaktivasyon hızı denir ve bu hız, "k" katsayısı ile belirtilir. EI'nin oluşumu ES ile yarışabileceği için, tersinmez inhibitörlerin bağlanması bir substrat ile, veya ikinci, tersinir bir inhibitör ile engellenebilir. Bu koruyucu etki, tersinmez inhibitörün aktif bölge ile spesifik reaksiyonuna iyi bir kanıt sayılır.

Bu reaksiyonun bağlanma ve inaktivasyon adımlarının tahkiki için enzim, inhibitörle birlikte bekletilir (inkübe edilir) ve kalan aktivitesi zaman içinde ölçülür. Aktivite zamana bağlı şekilde azalır, genelde üssel azalma göstererek. Bu ölçüm değerleri bir hız denklemine uydurularak inhibitörün bu konsantrayonu için inaktivasyon hızı bulunur. Bu işlem inhibitörün birkaç farklı konsantrasyonu için yapılır. Eğer tersinir bir EI kompleksi varsa, inaktivasyon hızı doymalı olacaktır ve bu eğriye uydurarak "k" ve "K" elde edilir.

Bu analizlerde yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem kütle spektrometresidir. Burada, değişime uğrmamamış enzimin ve inaktive olmuş eznimin kütlelerinin hassas ölçümü, inhibitör ile reaksiyon sonucu meydana gelen kütle artışını verir ve reaksiyonun stokyometresini verir. Bu ölçüm genelde bir MALDI-TOF kütle spektrometresi ile yapılır. Tamamlayıcı bir teknik olan, peptit kütle parmakizlemesinde, asıl ve değişime uğramış protein, tripsin gibi bir proteaz ile sindirilir. Sindirim sonucu, kütle spektrometresi ile analiz edilebilecek bir peptitler kümesi elde edilir. İnhibitör ile reaksiyon sonucu kütlesi değişen peptit, modifikasyon yerini içerir.

Tüm tersinmez inhibitörler hedef enzimleri ile kovalent katım ürünleri oluşturmazlar. Bazı tersinir inhibitörler hedef enzimlerine o kadar sıkı bağlanırlar ki tersinmez inhibitör gibidirler. Bu sıkı bağlanan inhibitörler, kovalent tersinmez inhibitörlere benzer kinetik özelliklere sahip olabilir. Bu durumlarda, bu inhibitörlerin bazıları enzime düşük afiniteli bir EI kompleksi oluşturacak şekilde bağlanır, bu kompleks sonra yavaş bir değişime uğrayıp sıkı bağlanmalı bir EI* kompleksi oluşturabilir (yukarıdaki şekle bakınız). Bu kinetik davranışa yavaş bağlanma denir. Bağlanmayı takiben enzimin bu şekilde yeniden yapılanması çoğu zaman bir konformasyon değişimi içerir, çoğu durumda enzim inhibitör molekülün etrafına sarılır. Yavaş bağlanan inhibitör örneklerinden metotraksat, allopurinol, ve asiklovir (acyclovir)'in aktive olmuş hâli sayılabilir.

Diizopropilfluorofosfat (DFP) yukarıda sağdaki resimde tersinmez bir proteaz inhibitörü örneği olarak gösterilmiştir. Enzim fosfor-flor bağını hidrolizler ama kalan fosfat, aktif bölgedeki serine bağlı kalır ve enzimi inaktive eder. Benzer şekilde, DFP nöronların sinapslarındaki asetilkolin esteraz enziminin aktif bölgesi ile reaksiyona girer ve dolayısıyla güçlü bir nörotoksindir, öldürücü dozu 100 mg'ın altındadır.

İntihar inhibisyonu, olağan dışı bir inhibisyon türüdür, enzim aktif bölgesinde inhibitörü onun aktif biçimine dönüştürür. Bir örnek, poliamin biozentezinin inhibitörü α-difluorometilornitin veya DFMO, ornitin amino asidinin bir analogudur ve uyku hastalığının tedavisi için kullanılır. Ornitin dekarboksilaz DFMO'nun dekarboksilasyonunu katalizleyebilir, yukarıda gösterildiği gibi. Ancak, bu dekarboksilasyon reaksiyonunu, flor atomunun eliminasyonu izler, bu flor, katalitik ara ürünü son derece elektrofilik olan bir konjüge imin'e dönüştürür. DFMO'nun bu reaktif biçimi sonra aktif bölgedeki bir sistein veye lizin kalıntısı ile tepkiyip enzimi tersinmez olarak inaktive eder.

Tersinmez inhibisyon genelde kovalent olmayan bir EI kompleksinin oluşumunu greektirdiği için, bazen bir inhibitör bir enzime birden çok şekilde bağlanabilir. Örneğin, yukarıda tripanotiyon redüktaz enzimini gösteren resimde, "kuinakrin mustard" adı verilen bir inhibitörün iki molekülü enzimin aktif bölgesine bağlıdır. Üstteki molekül tersinir bağlanmıştır ama alttaki kovalent bağlıdır çünkü nitrojen mustard grubu ile bir amino asit kalıntısı ile reaksiyona girmiştir.

Yeni ilaçlar, uzun bir ilaç geliştirme sürecinin ürünüdür, bu sürecin ilk adımı çoğu zaman bir enzim inhibitörünün keşfidir. Geçmişte bu yeni inhibitörlerin keşfinin tek yolu deneme ve yanılmaydı: onbinlerce kimyasal bileşikten oluşan koleksiyonlar taranarak hedef enzime etki eden faydalı bir adayın ortaya çıkması umidedilirdi. Bu kaba kuvvete dayalı yaklaşım hâlâ başarılıdır ve kombinatoryal kimya yaklaşımı ile genişletilirek kısa sürede çok sayıda yeni bileşikler üretimini sağlar. Muazzam kimyasal "koleksiyonlar" içinden, yüksek hacimli tarama teknolojileri kullanılarak kısa sürede faydalı inhibitörler tespit edilebilir.

Daha yakın zamanda alternatif bir yaklaşım yaygınlaşmıştır: rasyonel ilaç tasarımında, bir enzimin aktif bölgesinin üç boyutlu yapısını kullanarak hangi moleküllerin inhibitör olabileceğini öngörülür. Bu öngörüler sonra deneysel olarak sınanır ve test edilen bileşiklerden birinin yeni bir inhibitör olduğu bulunabilir. Bunun ardından, bu molekülün aktif bölgeye nasıl bağlandığını görebilmek için bu yeni inhibitörün enzime bağlanarak oluşturduğu kompleksin yapısı çözülmeye çalışılır. Bu sayede inhibitörün moleküler yapısında değişiklikler yapılarak enzime bağlanması optimize edilebilir. Bu deneme ve iyileştirme döngüsü yeterince güçlü bir inhibitör bulunana kadar tekrar edilir. Bir inhibitörün bir enzime olan afinitesinin Bilgisayara dayalı yöntemler ile öngürüsü, örneğin moleküler yanaştırma ("docking") ve moleküler mekanik, hâlen üzerinde yoğun çalışılan araştırma konularından biridir.

Enzim inhbitörleri doğada bulunur, ayrıca farmakoloji ve biyokimya araştırmalarının bir sonucu olarak tasarlanır ve üretilir. Doğal zehirler genelde bir bitki veya hayvanın doğal düşmanlarına karşı kendini korumasını sağlayacak şekilde evrimleşmiştir. Bu doğal toksinler arasında, bilinen en zehirli bileşikler bulunur. Yapay inhibitörler genelde ilaç olarak kullanılır, ama insektisit (malatyon gibi), herbisit (gliyofosat gibi) veya dezenfektan (triklosan gibi) de olabilirler.

Enzim inhibitörlerinin en yaygın kullanımı, hastalık tedavisi için ilaç olaraktır. Bu inhibitörlerin çoğunda bir insan enzimini hedeflenir ve patolojik bir durumun düzeltilmesi amaçlanır. Ancak, her ilaç bir enzim inhibitörü değildir. Bazıları, örneğin anti-epileptik ilaçlar, enzimden daha çok veya daha az üretilmesini sağlayarak enzim aktivitesine etki ederler. Bu tür etkilere enzim indüksiyonu ve inhibisyonu denir, burada söz konusu olan enzim inhbisyonundan farklı olarak, bunlar gen ifadesini değiştirir. Diğer ilaçlar enzim olmayan hücresel hedeflerle, örneğin iyon kanalları ve membran reseptörlerle, etkileşir.

Tıbbi amaçlı bir enzim inhibitörü örneği sildenafil (Viagra)'dır, bu erkek ereksiyon bozukluğu için yaygın bir ilaçtır. Bu bileşik cGMP spesifik fosfodiesteraz tip 5 için güçlü bir inhibitördür, bu enzim sinyal molekülü siklik guanozin monofosfatın yıkımını yapar. Bu sinyalleme molekülü düz kas gevşemesini tetikleyip ve penisteki corpus cavernosum içine kan akmasını sağ