e Cristoforo Buondelmonti gibi Batılı ziyaretçilerce betimlenmektedir. Ayasofya’ya özel bir önem veren Fatih Sultan Mehmet kilisenin derhal temizlenip camiye çevrilmesini emretti, fakat adını değiştirmedi. İlk minaresi onun döneminde inşa edilmiştir. Osmanlılar bu tür yapılarda taş kullanmayı tercih etmekle birlikte minarenin hızla inşa edilebilmesi amacıyla bu minare tuğladan yapılmıştır. . Minarelerden biri de sultan II. Bayezid tarafından eklenmiştir. 16. yüzyılda Kanuni Sultan Süleyman fethettiği Macaristan’daki bir kiliseden Ayasofya’ya iki dev kandil getirtmiştir ki, günümüzde bu kandiller mihrabın iki yanında yer alırlar.

II. Selim döneminde (1566–1574) yorgunluk ya da dayanıksızlık belirtileri gösterdiğinde, bina, dünyanın ilk deprem mühendislerinden biri sayılan Osmanlı baş mimarı Mimar Sinan tarafından eklenen dış istinat yapılarıyla (payanda) takviye edilerek, son derece sağlamlaştırılmıştır. Günümüzde binanın dört tarafındaki toplam 24 payandanın bir kısmı Osmanlı dönemine, bir kısmı Bizans dönemine aittir. Bu istinat yapılarıyla birlikte, Sinan ayrıca, kubbeyi taşıyan payeler ile yan duvarlar arasındaki boşlukları kemerler ile besleyerek kubbeyi iyice sağlamlaştırmış ve binaya iki geniş minare (batı kısmına), hünkar mahfili ve II. Selim’in türbesini (güneydoğu kısmına) eklemiştir (1577). III. Murat’ın ve III. Mehmed’in türbeleri ise 1600’lerde eklenmiştir. 

Ayasofya binasının içine Osmanlı döneminde eklenen diğer yapılar arasında mermerden minber, hünkar mahfiline açılan galeri, müezzin mahfili (mevlit balkonu), vaaz kürsüsü ve sayılabilir. III. Murad Bergama’da bulunmuş, helenistik dönemden kalma (MÖ IV. yüzyıl), "bektaşi taşı"ndan (İng. alabaster ) yapılma iki küpü Ayasofya'nın ana nefine (ana salon) yerleştirmiştir. I. Mahmud 1739'da binanın restore edilmesini emretti ve bir kütüphane ile binanın yanına (bahçesine) bir medrese, bir imarethane ve bir şadırvan ekletti. Böylece Ayasofya binası, civarındaki yapılarla birlikte bir külliyeye dönüştü. Bu dönemde ayrıca yeni bir sultan galerisi ve yeni bir mihrap yapıldı.

Ayasofya’nın Osmanlı dönemindeki en ünlü restorasyonlarından biri sultan Abdülmecit’in emriyle İsviçre İtalyanı olan Gaspare Fossati ve kardeşi Giuseppe Fossati’nin nezaretinde 1847 ile 1849 yılları arasında yapılmıştır. Fossati kardeşler, kubbe, tonoz ve sütunları sağlamlaştırdı ve binanın iç ve dış dekorasyonunu yeniden elden geçirdi. Üst kattaki galeri mozaiklerinin bir kısmı temizlendi, çok tahrip olanları ise sıvayla kaplandı ve altta kalan mozaik motifleri bu sıva üzerine resmedildi. Işıklandırma sistemini sağlayan yağ lambası avizeleri yenilendi. Kazasker Mustafa İzzed Efendi'nin (1801–1877) eseri olan, önemli isimlerin hat sanatıyla yazılı olduğu yuvarlak dev tablolar yenilenip sütunlara asıldı. Ayasofya’nın dışına yeni bir medrese ve muvakkithane inşa edildi. Minareler aynı boya getirildi. Bu restorasyon çalışması bittiğinde Ayasofya Camii 13 Temmuz 1849'da gerçekleştirilen bir törenle yeniden halka açıldı. Ayasofya külliyesinin Osmanlı dönemindeki diğer yapıları arasında sıbyan mektebi, şehzadeler türbesi, sebil, sultan Mustafa ve sultan İbrahim türbesi (önceden vaftizhane ) ve hazine dairesi sayılabilir.

1930 ile 1935 yılları arasında restorasyon çalışmaları nedeniyle halka kapatılan Ayasofya’da Mustafa Kemal Atatürk’ün emriyle bir dizi çalışmalar yapıldı. Bu çalışmalar arasında çeşitli restorasyonlar, kubbenin demir kuşak ile çevrilmesi ve mozaiklerin ortaya çıkarılıp temizlenmesi sayılabilir. Restorasyon sırasında Ayasofya'nın, yeni Türkiye Cumhuriyeti'nin laiklik ilkesi doğrultusunda, yapılış amacı olan kiliseye tekrar çevrilmesi konusunda fikirler ortaya atılmışsa da; bölgede yaşayan Hristiyan sayısının çok az olmasından dolayı oluşan talep yetersizliği, bölgede bu denli görkemli bir kiliseye karşı yapılabilecek muhtemel provakasyonlar ve mimarinin tarihi önemi gözönüne alınarak Bakanlar Kurulu’nun 24 Kasım 1934 tarih ve 7/1589 sayılı kararıyla müzeye çevrilmiştir. 1 Şubat 1935’te ziyarete açılan müzeyi Atatürk 6 Şubat 1935 tarihinde ziyaret etmiştir. Yüzyıllar sonra mermer zemindeki halıların kaldırılmasıyla zemin döşemesi ve insan figürlü mozaikleri örten sıvanın kaldırılmasıyla da muhteşem mozaikler tekrar gün ışığına çıkarılmıştır.
Ayasofya’nın sistemli olarak incelenmesi, restorasyonu ve temizlenmesi ABD’deki Bizans Enstitüsü (the Byzantine Institute of America) adlı kurumun 1931'deki ve Dumbarton Oaks Alan Komitesi’nin 1940’lı yıllardaki girişimiyle sağlanmıştır. Bu kapsamda yapılan arkeolojik çalışmalar K. J. Conant, W. Emerson, R. L. Van Nice, P.A. Underwood, T. Whittemore, E. Hawkins, R. J. Mainstone and C. Mango tarafından sürdürülmüş ve Ayasofya’nın tarihine, yapısını ve dekorasyonuna ilişkin başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Ayasofya’da çalışmalarda bulunmuş diğer isimlerden bazıları A. M. Schneider, F. Dirimtekin ve Prof. A. Çakmak’tır. Bizans Enstitüsü ekibi mozaik arama ve temizleme işleriyle uğraşırken, R. Van Nice yönetimindeki bir ekip de, binanın, taş taş ölçülerek rölövelerini çıkarma çalışmasına girişmiştir. Çalışmalar halen çeşitli uluslardan bilim insanlarınca sürdürülmektedir.

Temmuz 2016'da Ayasofya Müzesi'nde düzenlenen Kadir Gecesi programında, 85 yıl aradan sonra sabah namazı ezanı okundu. TRT Diyanet TV'nin Ramazan ayı boyunca Ayasofya'dan "Bereket Vakti Ayasofya" adlı sahur programını ekranlara getirmesine Yunanistan'dan tepki geldi. Ekim 2016'da Müze'nin ibadete açık olan bölümü Hünkar Kasrı'na, Diyanet İşleri Başkanlığı tarafından uzun yıllardan sonra ilk kez asaleten imam atandı.

Ayasofya, mimari bakımdan, bazilika planı ile merkezî planı birleştiren, kubbeli bazilika tipinde bir yapı olup kubbe geçişi ve taşıyıcı sistem özellikleriyle mimarlık tarihinde önemli bir dönüm noktası olarak ele alınır.

Ayasofya, her şeyden önce boyutu ve mimari yapısıyla önem taşır. Yapıldığı dönemin dünyasında hiçbir bazilika planlı yapı Ayasofya'nın kubbesinin boyutundaki bir kubbe ile örtülebilmiş ve böylesine büyük bir iç mekâna sahip değildi. Ayasofya’nın kubbesi Roma’daki Panteon'un kubbesinden küçük olmakla birlikte Ayasofya’da uygulanan yarım kubbe, kemer ve tonozlardan oluşan karmaşık ve sofistike sistem, kubbenin çok daha geniş bir mekânı örtebilmesini sağlayarak kubbeyi daha etkileyici kılmaktadır. Taşıyıcı olarak beden duvarlarına oturtulmuş önceki yapıların kubbeleriyle kıyaslandığında, sadece dört payeye oturtulmuş bu denli büyük bir kubbe mimarlık tarihinde gerek teknik, gerekse estetik bakımdan bir devrim sayılmaktadır.

Orta nefin yarısını örten ana (merkezî) kubbe, doğu ve batısına eklenen yarım kubbelerle çok geniş bir dikdörtgen biçimli iç mekân yaratacak şekilde öylesine genişletilmiştir ki, zeminden bakıldığında, gökyüzüne asılı gibi duran, tüm iç mekâna hakim bir kubbe olarak algılanır.

Doğu ve batı açıklıklarını kapatan yarım kubbelerden de daha küçük yarım kubbeli eksedralara geçiş yapılarak sistem tamamlanmıştır. Küçük kubbelerden başlayarak ana kubbe tacıyla tamamlanan bu kubbeler hiyerarşisi antik zamanlarda örneği görülmemiş bir mimari sistemdir. Yapının bazilika planı dahice tümüyle “gizlenmiş” durumdadır.

İnşa sırasında duvarlarda tuğladan ziyade harç kullanılmış ve kubbe yapı üzerine kondurulduğunda kubbenin ağırlığı alt kısmı nemli kalmış harçla oluşturulan duvarların dışa doğru bükülmesine yol açmıştı. 558 depremi sonrasında yapılan ana kubbenin yeniden yapımı sırasında genç İsidorus kubbeyi taşıyabilmeleri için önce duvarları yeniden dikleştirmiştir. Bütün bu hassas çalışmalara rağmen kubbenin ağırlığı yüzyıllarca bir problem olmaya devam etti, kubbenin ağırlık baskısı binayı bir çiçeğin açılması gibi dört yanından dışa doğru açılmaya zorluyordu. Bu problem de binaya dışarıdan istinat unsurlarının eklenmesiyle çözüldü.

Osmanlı döneminde mimarlar bir binada kayma olup olmadığını anlamak için ya yapımı sırasında elle döndürülebilecek küçük bir dikey sütun eklerlerdi ya da duvardaki 20-30 santimetrlik iki sabit nokta arasına cam yerleştirirlerdi. Sütun artık döndürülemediğinde veya söz konusu cam çatladığında binada kaymanın belli bir dereceye geldiği anlaşılmış olurdu. Ayasofya’nın üst kat duvarlarında ikinci yöntemin izleri halen görülebilir. Döndürülen sütun ise Topkapı Sarayı’nın harem bölümünde mevcuttur.

İç yüzeyler tuğla üzerine çokrenkli mermer, kırmızı ya da mor porfirler ve yapımında altın kullanılmış mozaiklerle kaplıdır. Bu, geniş payelerin daha ışıklı ve kamufle olmasını da sağlayan bir yöntemdir. 19. yüzyılda restorasyon çalışmaları sırasında bina dıştan Fossati tarafından sarı ve kırmızı renklere boyanmıştır. Ayasofya, Bizans mimarisinin başyapıtı olmakla birlikte, pagan, Ortodoks, Katolik, İslam etkilerinin sentez olduğu bir yapıdır.

Tonlarca altının kullanıldığı Ayasofya mozaiklerinin yapımında altının yanı sıra, gümüş, renkli cam, pişmiş toprak ve renkli mermer gibi taş parçaları kullanılmıştır. 726’da III. Leo’nun tüm ikonaların yok edilmesi emriyle, tüm ikona ve heykeller Ayasofya’dan kaldırılmıştır. Dolayısıyla Ayasofya’da günümüzde görülen, surat tasvirleri içeren mozaiklerin hepsi ikonoklazm dönemi sonrasında yapılan mozaiklerdir. Bununla birlikte Ayasofya’da surat tasviri içermeyen mozaiklerden az bir kısmı 6. yüzyılda yapılan ilk mozaiklerdir.

1453’te kilise camiye dönüştürüldükten sonra insan figürleri içerenlerin bir kısmı ile ince bir sıvayla kaplanmış ve yüzyıllarca sıva altında kalan mozaikler bu sayede doğal ve yapay tahribattan kurtulabilmiştir. İstanbul’u ziyaret eden 17. yüzyıl gezginlerinin raporlarından Ayasofya’nın camiye çevrilmesini izleyen ilk yüzyıllarda insan figürü içermeyenler ile içerenlerden bir kısmının sıvayla kaplanmadan bırakılmış oldukları anlaşılmaktadır. Ayasofya mozaiklerinin tamamen kapatılması 842’de ya da 18. yüzyılın sonlarına doğru gerçekleşmiştir. 1755’te İstanbul’a gelen Baron De Tott artık tüm mozaiklerin badana altında kalmış olduğunu belirtmiştir.

Sultan Abdülmecid’in isteği üzerine 1847 ile 1849 yılları arasında Ayasofya’da çeşitli restorasyon çalı