den fazla kişi katıldı ve bu kendisinin o güne kadar en çok katılım gerçekleşen konseri oldu. Sonraki yıl, geçmişteki hitlerinden oluşan "You Can Dance" adlı remiks albümünü yayımladı ve "Billboard" 200 listesinde 14 numaraya kadar yükseldi. Aralık 1987'deki anlaşmazlıklardan sonra Madonna, Ocak 1989'da uzlaşılamayan farklılıkları gerekçe göstererek Penn'e boşanma davası açtı.
Ocak 1989'da Madonna, alkolsüz içecek üreticisi Pepsi ile ciro anlaşması imzaladı. Madonna'nın Pepsi reklamlarından birinde "Like a Prayer" şarkısı ilk kez duyuldu. Katolik sembollerinden yanan haç ve stigmatanın yer aldığı, bir azizin sevişmek hakkındaki rüyasını içeren şarkının video klibi, Vatikan tarafından kınandı. Dini gruplar, reklamları yasaklatmak için çabaladı Pepsi ürünlerini boykot etti. Pepsi, reklamı yayından kaldırdı ve Madonna'yla yaptığı sponsorluk kontratını iptal ettirdi. Şarkı ayrıca, Patrick Leonard ve Stephen Bray ortak yazımı ile prodüktörlüğünde gelişen Madonna'nın dördüncü stüdyo albümü "Like a Prayer"a da dahil oldu. "Rolling Stone", çalışma hakkında "sanata yaklaşabildiği kadar yaklaşabilen pop müzik" yorumunu yaptı. "Like a Prayer", "Billboard" 200'da zirveye oturdu ve ABD'de 4 milyonun üzerindeki kopya satışı dahil olmak üzere dünya genelinde 15 milyondan fazla kopya sattı. ABD'de bir numaraya kadar yükselen "Like a Prayer" ile iki numaraya yükselen "Express Yourself" ve "Cherish" single'ları dahil olmak üzere albümden altı single çıktı. 1980'lerin sonunda MTV, "Billboard" ve "Musician" dergisi Madonna'yı "Son On Yılın Sanatçısı" olarak gösterdi.

Madonna, Breathless Mahoney rolüyle "Dick Tracy" (1990) filminde Warren Beatty ile birlikte başrol oyuncusu olarak yer aldı. Filmdeki performansıyla Saturn Ödülleri'nde En İyi Kadın Oyuncu kategorisinde aday gösterildi. Filme eşlik eden 1930'lar ortamı esintili film müzikleri albümü "I'm Breathless"ı aynı dönemde Madonna tarafından yayımladı. Albümde, ABD'de liste başı olan "Vogue" şarkısı ve 1991'de En İyi Özgün Şarkı Akademi Ödülü alan "Sooner or Later" şarkısı da yer aldı. Film çekimleri sırasında Madonna ile Beatty'nin bir ilişkiye başladı ancak ilişki 1990 sonunda bitti.

Nisan 1990'da Madonna, Ağustos 1990'a kadar sürecek olan Blond Ambition World Tour'u başlattı. "Rolling Stone" turneden "özenli koreografi, cinsel açıdan tahrik edici bir fantezi" şeklinde bahsetti ve "1990'ın en iyi turnesi" ilan etti. Turnedeki "Like a Virgin" performansında Madonna'nın mastürbasyon simülasyonu yapması öncesinde iki erkek dansçının vücudunu okşaması dini grupların sert tepkileriyle karşı karşıya kaldı. Anglikan Kilisesi ile Katolik Kilisesi performansı eleştirdi, Papa halktan ve Hıristiyan topluluğundan konserlere katılmamasını istedi. Kendisini "Famiglia Domani" olarak adlandıran özel bir Katolik derneği, erotizm nedeniyle turneyi boykot etti. Buna karşılık Madonna, "Hiçbir şekilde turne kimsenin duygularını incitmiyor. Bu geniş zihniyetliler için ve onlar cinselliği farklı bir şekilde görür. Kendileri ve diğerlerine ait". Turnenin Lazerdisk sürümü, 1992 yılında Madonna'ya Grammy Ödülleri'nden En İyi Uzun Müzik Videosu dalında ödül kazandırdı.

Madonna'nın ilk greatest-hits derleme albümü "The Immaculate Collection", Kasım 1990'da "Justify My Love" ve "Rescue Me" adlarındaki iki yeni şarkı eşliğinde yayımlandı. Albüm RIAA tarafından elmas sertifikaya layık görüldü ve dünya genelinde 30 milyondan fazla kopya satarak tarihte bir solo sanatçıya ait en çok satan derleme albüm oldu. "Justify My Love", ABD'de bir numaraya yükseldi ve dünya genelinde birçok ülkede ilk on içinde yer aldı. Şarkıya sadomazoşizm, bondage, eşcinsel öpüşmesi ve kısa çıplaklık sahneleri içeren bir video klip eşlik etti. MTV videoyu çok müstehcen kabul etti ve yayınlanmasına yasak getirdi. İkinci single "Rescue Me", Hot 100 tarihinde o zamana kadar en yüksek sıradan giriş yapan kadın şarkısı oldu, 15 numaradan giriş yaptı ve dokuz numaraya kadar yükselebildi.

Aralık 1990'da Madonna, oynamayı kabul ettiği Jennifer Lynch filmi "Boxing Helena"dan yapımcılarına herhangi bir haber vermeksizin ayrıldı. Bu sıralarda, rapçi Vanilla Ice ile yaşadığı sekiz aylık bir ilişkisi vardı; ancak yazdığı "Sex" adlı kitabı nedeniyle ilişkisi sonlandı. Madonna, "" (Kuzey Amerika dışında "In Bed with Madonna" adıyla bilinir) adını verdiği ilk belgesel filmini 1991 ortasında piyasaya sürdü. Belgesel, kendisinin Blond Ambition World Tour adlı turnesini anlattı.

1992'de Madonna, tamamı kadınlardan oluşan bir beyzbol takımının oyuncusu olarak Mae Mordabito adıyla "A League of Their Own" filminde rol aldı. Filmin tema şarkısı olarak kaydettiği "This Used to Be My Playground", Hot 100 listesinde bir numaraya yükselen bir hit oldu. Şarkıcı aynı yıl plak şirketi (Maverick Records), film yapım şirketi (Maverick Films), müzik yayımcılığı, televizyon yayıncılığı, kitap yayımcılığı ve mağazacılık bölümleri olan eğlence şirketi Maverick'i kurdu. Şirket Time Warner ortaklığında ortaya çıktı ve Madonna $60 milyon avans ödedi. Bu durum sayesinde müzik işletmelerinde %20 telif hakkı aldı; bu oran, Michael Jackson'ın Sony ile bir önceki yıl yaptığı anlaşmadan sonra sektördeki en yüksek oran olarak kayıtlara geçti. Şirketin ilk çalışması, Madonna'nın "Sex" adlı kitabının yayımlanması oldu. Kitap, Steven Meisel tarafından çekilen tahrik edici cinsel ve açık fotoğraflardan oluştu. Medya ve kamuoyu kitap için olumsuz yönde sert tepkiler dile getirdi ancak birkaç gün içinde her biri $50 tutarında olmak üzere 1.5 milyon kopya satışı yaptı. Bu sıralarda beşinci Madonna stüdyo albümü "Erotica" yayımlandı ve "Billboard" 200 listesine iki numara giriş yaptı. Aynı adlı şarkı ise "Billboard" Hot 100'da üç numaraya kadar yükseldi. Daha sonra "Erotica"dan beş single daha çıktı: "Deeper and Deeper", "Bad Girl", "Fever", "Rain" ve "Bye Bye Baby". Madonna 1990'larda filmlerde oynamaya sadomazoşizm ve bondage sahneleri içeren erotik gerilim film "Kanıt Vücutlar" ile devam etti. Eleştirmenler çalışmayı yetersiz kabul etti. Ayrıca Kuzey Amerika'da videosu yayımlanan "Dangerous Game" filminde başrol oyuncusu olarak yer aldı. "The New York Times" filmi "kızgın ve acı verici, ve acıyı gerçekten hissettirici" şeklinde tarif etti.

Eylül 1993'te Madonna, BDSM ögeleriyle çevrili The Girlie Show World Tour'u başlattı. Turnedeki gösteriler, özellikle Porto Riko'daki konserde ülkenin bayrağını bacaklarının arasına sürmesinden sonra birçok olumsuz tepkiyle karşı karşıya kaldı. Mart 1994'te "Late Show with David Letterman"da konuk olarak yer aldı, burada televizyonda sansürlenen birçok küfür kullandı, Letterman'a iç çamaşırına ellettirdi ve ona kokusunu sordu. Müstehcen filmler, albümler ve kitaplar yayımlaması, Letterman'de agresif bir görünüm sergilemesi, yapılan eleştirilerin tamamında Madonna'ya cinsel dönüşüm hakkında sorular sorulmasına sebep oldu. Madonna, eleştirmenler ve hayranlarının sert olumsuz tanıtımlarıyla karşı karşıya kaldı, kimisi "çok ileri gittiği" ve bu yüzden kariyerinin bitme noktasına geldiği yorumunu yaptı.

Biyografi yazarı J. Randy Taraborrelli, "I'll Remember" (1994) baladını Madonna'nın provokatif imajını yumuşatmak için bir girişim olarak tanımladı. Şarkı, Alek Keshishian filmi "İnsanlık Yolu" için kaydedilmişti. Letterman ile ödül törenlerinde düşük bir görünüm sergiledi ve "The Tonight Show with Jay Leno"ya konuk olduktan sonra, popülerliğini devam ettirmek için müzikal yönünü değiştirsinin gerekli olduğunu fark etti. Altıncı stüdyo albümü "Bedtime Stories" (1994), kamuoyu algısını geliştirip denemek için Madonna'ya daha yumuşak bir imaj getirdi. Albüm "Billboard" 200 listesine üç numaradan dahil oldu, "Secret" ve Hot 100'da yedi hafta bir numarada kalarak Madonna'nın bu sırada en fazla kalan single'ı olan "Take a Bow" dahil olmak üzere dört single üretti. Bu sıralarda fitness eğitmeni Carlos Leon ile romantik bir yakınlaşma içine girdi. Madonna'nın daha önce kaydedilen balad şarkılarını barındıran bir koleksiyon olan "Something to Remember", Kasım 1995'te satışa sunuldu. Ayrıca albüm üç yeni şarkı içerdi: "You'll See", "One More Chance" ve ilk kez Marvin Gaye tarafından seslendirilen "I Want You".

1996'da Madonna'nın Eva Perón rolünü oynadığı "Evita" filmi yayımlandı. Madonna, uzun bir süredir Perón rolünü oynamak istiyordu, hatta rolde mükemmel olacağını yönetmen Alan Parker'a da yazarak açıkladı. İsteğiyle ilgili olarak şunları söyledi: "Bu rolü oynamak için doğmuşum. Bu işe her şeyimi koydum çünkü bir filmde bir rolü canlandırmak daha da fazlasıdır. Heyecan verici ve aynı zamanda korkutucu... Ve yaptığım başka bir şeyden Evita kadar gurur duyamam." Film yapımcılarının güvenini kazandıktan sonra vokal eğitimi aldı, Arjantin tarihini ve Perón'un geçmişini öğrendi. Çekimlerde birçok kez hasta oldu, gerekli olan duygusallıkları yakalayabilmekte yoğun çaba harcadı. Sonradan, çekimler sırasında hamile kaldığını anladı: "Her çekim sonrasında soluksuz kaldım. On dakikada bir baş dönmem olduğu için kanepede yatmak zorunda kaldım ve bunun için yalan söyledim. Bebeğimin üzerine çok titriyordum ve bir şekilde zarar görmesinden çok korkuyordum." Bununla birlikte Madonna, sorunların olumlu bir yanını bulduğunu günlüğüne not düşerek, duygularındaki güvenlik açıklığı ve zayıflığın filmde kendisine yardımcı olduğunu belirtti.

"Evita" yayımlandıktan sonra olumlu eleştiriler topladı."Time" dergisinden Zach Conner, film için ""Evita"nın oldukça güzel olduğunu rahatça söyleyebilirim, iyi ekip ve harikulade görsellik. Madonna bir kez daha beklentileri boşa çıkarmadı. Dokunaklı bir yorgunlukla "Evita"da oynamış ve yıldızlığının kalitesinden sadece biraz daha var. Madonna-Eva'yı sev ya da nefret et, o tüm gözler için bir mıknatıs." yorumunu yaptı. Madonna, rolüyle Altın Küre Ödülleri'nden En İyi Kadın Oyuncu Altın Küre Ödülü Müzikal veya Komedi ödülünü kazandı. Daha sonradan "Evita" film müziği albümününden 1997'de Akademi Ödülleri'nden En İyi Orijinal Şarkı Ödülü kazanan "You Must Love Me" ve "Don't Cry for Me Argentina" dahil olmak üzere üç single yayımlad