kromatografi kolom preparatif klasik berupa tabung kaca dengan diameter antara 5 mm hingga 50 mm dengan panjang 5 cm hingga 1 m dengan keran dan pengisi (dengan sumbat kaca atau serat kaca  untuk mencegah hilangnya fasa diam) pada bagian bawah.
dua metode yang umum digunakan untuk preparasi kolom adalah: metode kering dan metode basah.
pada metode kering, kolom pertama kali diisi dengan serbuk kering fasa diam, kemudian kolom dialiri fasa gerak hingga seluruh kolom terbasahi.
mulai titik ini, fasa diam tidak diperkenankan mengering.
pada metode basah, fasa diam dibasahi dengan fasa gerak hingga menjadi bubur di luar kolom, dan kemudian dituangkan perlahan-lahan ke dalam kolom.
pencampuran dan penuangan harus ekstra hati-hati untuk mencegah munculnya gelembung udara.
larutan bahan organik diletakkan di bagian atas fasa diam menggunakan pipet.
lapisan ini biasanya ditutup dengan lapisan kecil pasir atau katun atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari tuangan eluen.
eluen kemudian dialirkan perlahan melalui kolom sambil membawa sampel bahan organik.
sering kali, wadah eluen sferis atau corong pisah bersumbat yang sudah diisi eluen diletakkan di bagian atas kolom.
komponen-komponen tunggal tertahan oleh fasa diam secara berbeda satu sama lain pada saat mereka bergerak bersama eluen dengan laju yang berbeda melalui kolom.
di akhir kolom, mereka terelusi satu per satu.
selama keseluruhan proses kromatografi, eluen dikumpulkan sesuai fraksi-fraksinya.
fraksi-fraksi dapat dikumpulkan secara otomatis oleh pengumpul fraksi.
produktivitas kromatografi dapat ditingkatkan dengan menjalankan beberapa kolom sekaligus.
di sini, diperlukan pengumpul multi aliran.
komposisi aliran eluen dapat dimonitor dan masing-masing fraksi dianalisa senyawa terlarutnya, misalnya dengan kromatografi, absorpsi sinar uv atau fluoresensi.
senyawa berwarna (atau senyawa berfluoresensi di bawah lampu uv) dapat terlihat di dalam kolom sebagai pita-pita bergerak.
fasa gerak (eluen)
fasa gerak atau eluen dapat berupa pelarut murni atau campuran pelarut.
pemilihan dilakukan sedemikian rupa sehingga nilai faktor retensi senyawa yang diinginkan berada pada kisaran 0,2 - 0,3 untuk meminimalkan waktu dan jumlah eluen yang diperlukan selama kromatografi.
eluen dapat pula dipilih berdasarkan daya pisahnya sehingga senyawa yang berbeda dapat dipisahkan secara efektif.
optimasi eluen dilakukan melalui uji pendahuluan berskala kecil, biasanya menggunakan kromatografi lapisan tipis (klt) dengan fasa gerak yang sama.
ada laju aliran optimum untuk masing-masing pemisahan.
semakin cepat laju aliran eluen akan meminimalkan waktu yang dibutuhkan untuk melalui kolom sehingga meminimalkan difusi, menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
namun, laju aliran maksimum perlu dibatasi karena analit memerlukan waktu tertentu untuk berada pada kesetimbangan antara fasa diam-fasa gerak, lihat persamaan van deemter.
kolom laboratorium sederhana bekerja dengan prinsip aliran gravitasi.
laju aliran kolom semacam ini dapat dinaikkan dengan menambah eluen baru di bagian atas fasa diam, atau diturunkan dengan mengatur keran di bagian bawah.
laju aliran yang lebih cepat dapat diperoleh dengan menggunakan pompa atau gas bertekanan (misalnya: udara, nitrogen, atau argon) untuk menekan pelarut melalui kolom (kromatografi kolom kilat).still, w. c.; kahn, m.; mitra, a. j. org. chem. 1978, 43(14), 2923-2925.
(doi:10.1021/jo00408a041)laurence m. harwood, christopher j. moody (13 jun 1989).
experimental organic chemistry: principles and practice (illustrated ed.). pp. 180185.
ukuran partikel fasa diam pada kromatografi kolom kilat biasanya lebih halus daripada kromatografi kolom gravitasi.
misalnya, silika gel untuk kromatografi kilat berukuran antara 230  400 mesh (40  63 m), sementara untuk kromatografi gravitasi antara 70  230 mesh (63  200 m).normal phase column chromatography, material harvest
telah dikembangkan lembar lajur (spreadsheet) yang mendukung suksesnya pengembangan kolom kilat.
lembar lajur memperkirakan volume retensi dan pita volume analit, jumlah fraksi yang diperkirakan untuk masing-masing kandungan analit, dan resolusi antara dua puncak yang berdekatan.
informasi ini memungkinkan pengguna memilih parameter optimal untuk pemisahan berskala preparatif sebelum dicobakan pada kolom kilat.fair, j. d.; kormos, c. m. j.
a 2008, 1211(1-2), 49-54.
resolusi (kemampuan memisahkan campuran) pada sistem lplc pasti lebih rendah daripada kckt, karena bahan kemasan dalam kolom kckt dapat lebih kecil, biasnya hanya 5 mikrometer sehingga meningkatkan luas permukaan fasa diam, meningkatkan luas permukaan interaksi dan pemisahan menjadi lebih baik.
namun, penggunaan media berkemasan kecil ini menyebabkan tekanan balik yang tinggi dan itulah mengapa disebut kromatografi cair tekanan tinggi.
kolom lplc biasanya dikemas dengan silika sekitar 50 mikrometer, sehingga mengurangi tekanan balik dan resolusi, tetapi juga menghilangkan kebutuhan pompa bertekanan tinggi yang mahal.
pabrikan juga sekrang mulai berpindah kepada sistem kromatografi kilat bertekanan tinggi dan memberinya nama sistem kromatografi cair tekanan menengah (
perhitungan resolusi kromatogram
sebagai contoh, jika kita ingin memisahkan dua protein yang berbeda dengan kapasitas ikatan terhadap kolom yang berbeda dari suatu larutan, jenis detektor yang baik adalah spektrofotometer dengan panjang gelombang 280 nm.
semakin tinggi konsentrasi protein yang melalui kolom, semakin besar absorbansinya pada panjang gelombang tersebut.
oleh karena kromatografi kolom mempunyai aliran tetap untuk semua eluat yang melalui detektor dengan berbagai macam konsentrasi, harus dibuat plot dari detektor antara konsentrasi sampel terelusi melawan waktu.
plot konsentrasi sampel versus waktu ini disebut dengan kromatogram.
tujuan utama kromatografi adalah untuk memisahkan komponen yang berbeda dari suatu campuran larutan.
resolusi menyatakan daya pemisahan antar komponen dalam campuran.
semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin baik pemisahan sampel yang dihasilkan oleh kolom.
data ini adalah cara terbaik menentukan sifat pemisahan kolom untuk sampel tertentu.
resolusi dapat dihitung dari kromatogram.
kurva terpisah dalam diagram mewakili profil konsentrasi elusi sampel yang berbeda selama proses, berdasarkan afinitasnya terhadap resin kolom.
untuk menghitung resolusi, diperlukan waktu retensi dan lebar kurva.
waktu retensi: waktu dari awal sinyal terdeteksi oleh detektor hingga titik puncak profil konsentrasi elusi masing-masing sampel yang berbeda.
lebar kurva: lebar kurva profil konsentrasi sampel yang berbeda dalam kromatogram dalam satuan waktu.
metode yang sudah disederhanakan dalam menghitung resolusi kromatogram adalah menggunakan model pelat.harrison et al.
bioseparations science and engineering.
oxford university press.
new york, new york. 2003 model pelat berasumsi bahwa kolom dapat dibagi menjadi sejumlah seksi tertentu, atau pelat, dan kesetimbangan massa dapat dihitung untuk masing-masing pelat tunggal.
pendekatan ini memperkirakan kurva kromatogram sebagai kurva distribusi gaussian.
dengan melakukan ini, lebar kurva diperkirakan 4 kali standar deviasi kurva, 4.
waktu retensi adalah waktu dari awal deteksi sinyal hingga waktu di titik puncak kurva gaussian.
dari variabel dalam gambar di atas, resolusi, jumlah pelat, dan tinggi pelat model pelat kolom dapat dihitung menggunakan persamaan:
kesetimbangan adsorpsi kolom
untuk sebuah kolom adsorpsi, resin kolom (fasa diam) tersusun atas butiran mikro (microbead).
bahkan partikel-partikel yang lebih kecil seperti protein, karbohidrat, ion logam, atau senyawa kimia lainnya berkonjugasi pada microbead ini.
masing-masing partikel yang terikat pada microbead diasumsikan dapat mengikat solut sampel yang akan dimurnikan atau dipisahkan dengan rasio 1:1, dialirkan melalui kolom.
ikatan antara molekul target yang akan dipisahkan dengan molekul yang terikat pada microbead dapat dituliskan sebagai reaksi kesetimbangan sederhana keq =
berdasarkan ini, tiga kondisi isotermal yang berbeda dapat digunakan untuk menjelaskan dinamika ikatan kromatografi kolom: linear, langmuir, dan freundlich.
isotermal linear terjadi ketika konsentrasi solut yang akan dimurnikan relatif sangat kecil dibandingkan molekul terikat.
oleh karena itu, kesetimbangannya dapat didefinisikan sebagai:
[cs] = keq[c].
untuk penggunaan skala industri, total molekul terikat pada butiran resin harus diperhitungkan karena ruang-ruang kosong harus diperhitungkan.
isotermal langmuir dan isotermal freundlich berguna untuk menjelaskan kondisi kesetimbangan ini.
[cs] = isotermal freundlich:
[cs] = keq[c]1/n
isotermal freundlich digunakan ketika kolom dapat mengikat banyak sampel yang berbeda dalam larutan yang akan dimurnikan.
oleh karena banyak sampel berbedah memiliki tetapan ikatan terhadap butiran yang berbeda, akan muncul banyak keq. oleh karenanya, isotermal langmuir bukan merupakan model yang bagus untuk kasus ikatan ini.
kromatografi, artikel pendahuluan yang mencakup seluruh teknik kromatografi.
kromatografi cair kinerja tinggi (kckt) untuk kromatografi kolom menggunakan tekanan tinggi.
kromatografi cair protein cepat (kcpc) untuk pemisahan protein menggunakan kromatografi kolom.
flash column chromatography guide (pdf)