film dimulai dengan perjalanan sebuah kapal laut ke kerajaan dor untuk menghadiri pergelaran royal soup day atau hari sup kerajaan.
roscuro (dustin hoffman), seekor tikus hitam, ada di kapal laut itu bersama teman manusianya pietro.
roscuro dibuat terpesona dengan aroma dari sup yang disiapkan sang koki istana dan dia pun lepas dari pietro untuk mencari sumbernya.
kemudian, dia menemukan ruang jamuan makan istana dan jatuh ke dalam sup sang ratu ketika ia pertama kali mencobanya.
sang ratu pun mengalami serangan jantung ketika melihat roscuro dan meninggal dengan wajah masuk ke mangkuk supnya.
roscuro pun dikejar oleh pengawal istana.
pengejaran berakhir ketika roscuro jatuh ke lubang dan berakhir di ruang bawah tanah.
dirundung duka, sang raja kemudian memerintahkan bahwa sup dilarang dan tikus hitam dibuang dari kerajaan, dan akhirnya kerajaan itu pun diselimuti kegelapan dan kesedihan abadi.
sementara itu roscuro bertemu dengan botticelli (ciarn hinds), sang pemimpin dunia tikus hitam.
beberapa tahun berlalu, kemudian lahirlah seekor tikus kecil putih petualang, despereaux (matthew broderick), dan tikus kecil itu berteman dengan putri pea (emma watson) yang kesepian.
waktu dewan kota tikus tahu bahwa despereaux telah melanggar aturan dengan berbicara dengan manusia, mereka membuangnya ke ruang bawah tanah, di mana dia diselamatkan oleh roscuro.
despereaux bercerita pada roscuro tentang kesedihan sang putri, cerita itu menyentuh hati roscuro.
dia jadi ingat bahwa dialah yg menyebabkan semua kesedihan di kerajaan dor, walaupun sebenarnya dia tidak sengaja melakukannya.
roscuro mencoba mendekati sang putri untuk meminta maaf, namun sang putri malah ketakutan dan mengusirnya pergi.
dengan perasaan sakit, roscuro memutuskan untuk menculik sang putri.
dia mendapat bantuan dari miggery sow (tracey ullman) salah seorang pembantu di istana, yang mana kemudian dia khianati dan menguncinya di salah satu sel penjara.
despereaux segera menyadari kalau sang putri dalam bahaya.
kembali di koloni tikus besar, roscuro menangkap siratan penyesalan di mata putri pea dan menyesali tindakannya, namun tidak bisa menghentikan para tikus-tikus besar yang ingin mencelakai sang putri.
disinimlah despereaux datang menolong, melepaskan si kucing besar dari kandangnya.
roscuro memojokan botticelli hingga jatuh ke genggaman si kucing dan menemui ajalnya.
peperangan pun berakhir, roscuro kembali meminta maaf pada sang putri atas semua yg telah terjadi baik pada masa lalu dan masa kini, dan ia dimaafkan.
pada akhirnya, mig diselamatkan oleh si sipir penjara, yg kemudian diketahui sebagai ayahnya, dan roscuro pun bertemu kembali dengan teman lamanya pietro.
sang putri dan raja akhirnya memutuskan untuk saling mengobati duka mereka dengan saling memberi dukungan.
despereaux bertemu kembali dengan keluarganya, dan tetap menjalin persahabatan dengan sang putri.
matthew broderick sebagai despereaux tilling
emma watson sebagai putri pea
robbie coltrane sebagai gregory
frances conroy sebagai antoinette
patricia cullen sebagai ratu
sam fell sebagai ned/smudge
tony hale sebagai furlough
ciarn hinds sebagai botticelli
dustin hoffman sebagai roscuro
richard jenkins sebagai principal
kevin kline sebagai andre
frank langella sebagai mayor
christopher lloyd sebagai hovis
william h. macy sebagai lester
bronson pinchot sebagai town crier
charles shaughnessy sebagai pietro
stanley tucci sebagai boldo
tracey ullman sebagai miggery "mig" sow
robin atkin downes sebagai the cat (uncredited)
sigourney weaver sebagai narator