酶促反应动力学

总论
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* 酶促反应动力学（Enzyme Kinetics）研究的是不同条件下，酶催化一个反应的速率的规律，根据这种规律我们可以猜测酶的催化机理。
* 影响酶的催化速率的因素很多，包括：酶的浓度、底物（产物）的浓度、温度、pH、抑制剂、激活剂、金属离子，等等。（酶催化的反应大多可逆，因此产物也是底物）

## 化学基础

* 对于最基本的反应，其反应速率通常和各反应物的浓度成一定比例，比如A + B → C的反应速率通常和[A]×[B]成正比，而2A → B的反应速率通常和[A]2成正比，比例值常记为k，称为速率常数（Rate Constant），若速率与[X]n成正比，则称该反应对X是n阶反应。
* 基本反应是指经过一次粒子碰撞就能完成的反应，这种反应的反应物只有一种或两种。
* 然而绝大多数化学反应都不是基本反应，它们通常是多步反应共同组成的，若每一步的速率常数相差悬殊，则反应速率通常是由常数最小的一步决定的，这一步称为限速步骤。
* 如果每一步的速率常数相近，则反应速率对于各反应物浓度就不是简单的比例关系，而会呈现出复杂曲线，但一般情况下反应物浓度增大反应速率也增大。
* 若反应是靠多步完成的，则反应体系中一定存在少量中间物，多数情况下中间物浓度在极短时间内迅速上升，然后随之稳定在一定值（或变化幅度很小）。
* 假定中间物浓度不变的状态称为稳态（Steady State），它是简化酶促反应动力学中的微分方程的重要假定。
* 当温度升高时，一般反应速率加快。
	+ 范特霍夫（van't Hoff）指出，对于可逆（基本）反应，设平衡常数为K，则K随温度变化满足方程

	d
	ln
	⁡
	K

	d
	T

	=

	Δ

	H
	⊖

	R

	T
	2

	{\displaystyle \frac{d \ln K}{dT} = \frac{\Delta H^\ominus}{RT^2}}
	+ 然而K事实上是可逆反应的正反过程之速率常数的比值，因此我们可以写成

	d
	ln
	⁡

	k
	1

	d
	T

	−

	d
	ln
	⁡

	k

	−
	1

	d
	T

	=

	Δ

	H
	⊖

	R

	T
	2

	{\displaystyle \frac{d \ln k\_1}{dT} - \frac{d \ln k\_{-1}}{dT} = \frac{\Delta H^\ominus}{RT^2}}
	+ 据此可以假设

	d
	ln
	⁡

	k
	1

	d
	T

	=

	Δ

	H
	1
	⊖

	R

	T
	2

	λ

	{\displaystyle \frac{d \ln k\_1}{dT} = \frac{\Delta H^\ominus\_1}{RT^2} + \lambda}

	（对逆反应也有类似方程）
	+ 然而从来没有实验证据表明λ不是0，因此Arrhenius假定它就是0，由此提出了Arrhenius方程：对于每个基本化学反应，都有

	d
	ln
	⁡
	k

	d
	T

	=

	E
	a

	R

	T
	2

	{\displaystyle \frac{d \ln k}{dT} = \frac{E\_a}{RT^2}}
	+ 将两边对T积分得到

	ln
	⁡
	k
	=
	ln
	⁡
	A
	−

	E
	a

	R
	T

	{\displaystyle \ln k = \ln A - \frac{E\_a}{RT}}

	这里

	ln
	⁡
	A

	{\displaystyle \ln A}

	是积分常数。
	+ 再进一步，我们可得

	k
	=
	A

	e

	−

	E
	a

	R
	T

	{\displaystyle k = Ae^{-\frac{E\_a}{RT}}}
	+ 在Maxwell-Boltzmann能量分布模型被提出后，人们发现反应速率常数恰好和反应体系中动能大于一定值的粒子比例成正比，因而人们推测，之所以反应速率常数如是变化，是因为引起反应必须要求反应物粒子的动能超过一定值，这一定值现在称为活化能（Activation Energy）。
* 酶可以加快反应速率，正是因为酶可以降低反应的活化能，具体做到这一点的方式很复杂多样，参见常见酶促反应类型。

## 米氏方程

* 最早的酶促反应动力学几乎都是关于蔗糖酶（Invertase，催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖）的。
* 早期的关于蔗糖酶的实验，测定的都是在反应开始不同时间后，反应的速率，然而这样会得到很复杂的速率公式，这是因为蔗糖酶不但催化正反应还催化逆反应。
* Michaelis和Menten首先注意到了这个问题，他们改变策略，测定的是初始蔗糖浓度不同的情况下在反应开始后很短一段时间内的反应速率（称为初始速率，Initial Rate）；他们注意到的另外两个问题是pH会影响反应速率，反应产物葡萄糖和果糖会发生变旋。
* 根据他们的实验数据，Michaelis和Menten提出了如下蔗糖酶的速率函数模型：
	+ 蔗糖酶催化的反应是

	E
	A
	⇌
	E
	A
	→
	E
	P

	{\displaystyle \mathrm{E + A \rightleftharpoons EA \rightarrow E + P}}

	，这里E是游离的酶，A是底物，EA是酶与底物结合的中间物，P是产物。
	+ 假定初始时底物浓度为a0，酶的浓度为e0，且a0远大于e0。
	+ 因为假定酶的浓度远小于底物的浓度，所以在反应初始的一段时间中底物浓度几乎不变。
	+ 假定中间物EA的浓度为x，并且形成中间物的可逆反应速率极快（比第二步快得多），x迅速达到一定值并保持不变（稳态假设），根据化学平衡原理这一定值是[E]\*[A]/K。
	+ 注意到[E] = e0 - x，而[A] ≈ a0，那么

	x
	=

	(

	e
	0

	−
	x
	)

	a
	0

	K

	{\displaystyle x = \frac{(e\_0 - x)a\_0}{K}}
	+ 整理这个方程，得到

	x
	=

	e
	0

	K

	a
	0

	1

	{\displaystyle x = \frac{e\_0}{\frac{K}{a\_0} + 1}}
	+ 现在生成产物的速率是中间物的浓度乘以第二个反应的速率常数k2，所以有

	v
	=

	k
	2

	x
	=

	k
	2

	e
	0

	a
	0

	K

	a
	0

	{\displaystyle v = k\_2x = \frac{k\_2e\_0a\_0}{K + a\_0}}
* Briggs和Haldane改进了Michaelis和Menten的工作。
	+ Michaelis和Menten假定了反应的第二步比第一步慢很多，而Briggs和Haldane认为这个条件并不需要。
	+ 他们提出，一般的酶催化的反应可以写为

	E
	A

	⇌

	k

	−
	1

	k
	1

	E
	A

	→

	k
	2

	E
	P

	{\displaystyle \mathrm{E + A \rightleftharpoons^{k\_1}\_{k\_{-1}} EA \rightarrow^{k\_2} E + P}}
	+ 反应开始一小段时间后，EA浓度稳定不变，此时应有

	d
	x

	d
	t

	=

	k
	1

	(

	e
	0

	−
	x
	)
	a
	−

	k

	−
	1

	x
	−

	k
	2

	x
	=
	0

	{\displaystyle \frac{dx}{dt} = k\_1(e\_0 - x)a - k\_{-1}x - k\_2x = 0}
	+ 据此关系可推出

	x
	=

	k
	1

	e
	0

	a

	k

	−
	1

	k
	2

	k
	1

	a

	{\displaystyle x = \frac{k\_1e\_0a}{k\_{-1} + k\_2 + k\_1a}}
	+ 再根据v = k2x可得

	v
	=

	k
	2

	e
	0

	a

	k

	−
	1

	k
	2

	k
	1

	a

	{\displaystyle v = \frac{k\_2e\_0a}{\frac{k\_{-1} + k\_2}{k\_1} + a}}
	+ 这个方程现在称之为米氏方程，k2e0通常用Vmax表示，它不是一个常数，而是与酶的浓度成正比；分母上的常数则称为米氏常数，用Km表示，它是一种酶的特征指标，常用于区分同一种酶的不同亚型。
	+ 当底物浓度很大很大时，反应速率几乎等于Vmax。
	+ 当底物浓度恰好等于Km时，反应速率是Vmax的一半。
	+ 当底物浓度很小很小（但仍需远大于e0！）时，反应速率对底物呈一阶反应，速率常数为k2e0/Km，这个值常记作KA，称为专一性常数（Specificity Constant）。
	+ 因为e0和Km都是可以在实验中测得的，所以k2也是可知的，这个值有时记作kcat，它称为酶的转化数（Turnover Number）。
* 根据反应图示和稳态假设建立一般的酶促反应速率的函数模型的方法：
	1. 假设初始时底物浓度为a0，酶的浓度为e0，且a0远大于e0，即反应过程中底物浓度几乎不变。
	2. 假设各反应中间物的浓度为x1,x2,x3,...，且它们在反应过程中固定于一定值。
	3. 根据各可逆反应的平衡常数建立微分方程，将中间物的浓度用a0和e0表示出来。
	4. 假设生成产物的直接一步反应是不可逆的，将相关中间物浓度乘以该步反应速率常数，整理方程。
* 测出Km的方法：
	+ 如果直接将v对a0作图，则得到的是双曲线的一部分，很难准确拟合Km和Vmax的值。
	+ Michaelis和Menten采用的手段是将v对log a0作图，如图1，很容易估算出曲线的最大斜率k，它与Vmax的关系是k = 0.576 Vmax，得到Vmax后根据a0 = Km时v = 1/2 Vmax可找出Km的值。
	+ Lineweaver和Burk采用了双倒数作图法（Double Reciprocal Plot），它是将1/v对1/a0作图，这是因为根据米氏方程有

	1
	v

	=

	1

	V

	m
	a
	x

	K
	m

	V

	m
	a
	x

	⋅

	1

	a
	0

	{\displaystyle \frac{1}{v} = \frac{1}{V\_{max}} + \frac{K\_m}{V\_{max}} \cdot \frac{1}{a\_0}}
	+ 如图2，用一条直线拟合双倒数作图，则直线的横截距为-1/Km，而纵截距为1/Vmax，很容易估计出两个参数的值。
	+ 双倒数作图的缺陷是v或a很小时误差会很大，因此拟合时通常将距离原点较远的点的权重降低。
	+ 后来还出现了a0/v对a0作图和v对v/a0作图，能较好控制误差，如图3和图4。
	+ 一种特殊的方法是直接作图法，解释见图5，它的缺点是作出的直线很难交在一点。

## 酶的抑制

* 酶的抑制分可逆抑制（Reversible）和不可逆抑制（Irreversible）两类。
* 不可逆抑制是指抑制剂和酶形成共价键或发生化学反应使之永久失去催化功能，相当于按一定比例减少酶的物质的量。
* 可逆抑制是指抑制剂和酶可逆结合（一般都是非共价结合），它对速率函数的影响往往很复杂。
* 可逆抑制中有两类特例：线性抑制（Linear Inhibition）和双曲线抑制（Hyperbolic Inhibition）。
* 线性抑制指的是抑制剂浓度充分大时酶完全失去催化活性，“线性”是指一般此时表观Km（Apparrent Km，在抑制剂存在条件下通过实验测定的Km）与催化剂浓度呈线性关系。
* 对应地，双曲线抑制指的是抑制剂浓度充分大时酶仍有一定的催化活性。
* 线性抑制：
	+ 最常见的线性抑制是竞争性抑制（Competitive Inhibition），得名于表观Km上升而Vmax不变，本质上是KA下降。
	+ 一般的生化课本中介绍的竞争性抑制机制见图7上部，需要注意的是这不是竞争性抑制的唯一方式，如图7下部。
	+ 线性抑制条件下，Km的变化与抑制剂浓度呈线性关系，因此通常假设

	K
	m

	a
	p
	p

	=

	K
	m

	(
	1

	i

	K

	i
	c

	)

	{\displaystyle K\_m^{app} = K\_m(1 + \frac{i}{K\_{ic}})}

	。这里i是抑制剂浓度，Kic称为竞争性抑制常数。
	+ 本质上，竞争性抑制是降低表观KA：

	K
	A

	a
	p
	p

	=

	K
	A

	1

	i

	K

	i
	c

	{\displaystyle K\_A^{app} = \frac{K\_A}{1 + \frac{i}{K\_{ic}}}}
	+ 另一类线性抑制称为混合型抑制（Mixed Inhibition），意思是KA和Vmax都会变化，本质上是Vmax和KA同时下降，涉及两个参数Kic和Kiu，见图6。
	+ 当Kic和Kiu相等时，呈现出表观Vmax下降而Km不变，在早期研究中这被认为是与竞争性抑制相对立的抑制方式，称为非竞争性抑制（Noncompetitive Inhibition），但实际上这种抑制方式非常罕见，有时见于H+、金属离子、一些阴离子对酶的抑制。
	+ 很多生化教材以α-葡萄糖对蔗糖酶的抑制、多种物质对精氨酸酶（Arginase）的抑制为例介绍非竞争性抑制，但后来更精确的实验都指出它们不是非竞争性抑制。
	+ 最后还有一种线性抑制，与竞争性抑制相反，称为反竞争性抑制（Uncompetitive Inhibition），本质是Vmax下降而KA不变。
	+ 用双倒数作图很容易区分竞争性抑制、反竞争性抑制、混合型抑制，见图8。
	+ Dixon指出了一种统一的测定Kic和Kiu的方法：
		- 首先将抑制剂作用下的米氏方程改写为

		v
		=

		V

		m
		a
		x

		a

		K
		m

		(
		1

		1

		K

		i
		c

		)
		a
		(
		1

		1

		K

		i
		u

		)

		{\displaystyle v = \frac{V\_{max}a}{K\_m(1 + \frac{1}{K\_{ic}}) + a(1 + \frac{1}{K\_{iu}})}}
		- 然后在两个不同的固定的初始底物浓度a1和a2条件下，分别改变抑制剂浓度，将1/v对抑制剂浓度i作图，得到两条直线，这两天直线的交点的横坐标满足

		(

		1

		a
		1

		−

		1

		a
		2

		)
		(
		1

		i

		K

		i
		c

		)
		=
		0

		{\displaystyle (\frac{1}{a\_1} - \frac{1}{a\_2})(1 + \frac{i}{K\_{ic}}) = 0}
		- 据此可以算出Kic的值，若该值不存在，则作出的直线是平行的。
		- Kiu的值可由相似的方法得到，作图是a/v对i。
* 双曲线抑制：
	+ 本质上是抑制剂与酶结合后没有完全消除其活性，而是形成另一催化活性降低的构象。
	+ 双曲线抑制很难定量研究，故在此处不作讨论。
	+ 当抑制剂浓度变化时，有时双曲线抑制反而会变成双曲线激活，即酶的活性提高。