调控RNA

总论
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* 调控RNA（Regulatory RNA）控制RNA的翻译，也有其它功能。

## 细菌和古菌的CRISPR

* 大部分细菌和古菌的基因组中有结构如图5所示的CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）结构。
* 每个基因组中可以有不止一个CRISPR结构。
* CRISPR是原核生物的免疫系统。
* CRISPR由高度保守的Repeat序列和高度自由的Spacer序列交替构成。
* Repeat和Spacer的长度都约为30 bp。
* CRISPR的一端有Leader序列，长约500 bp，富含A-T。
* 在Leader序列方向有若干编码蛋白质的基因，这些蛋白质与CRISPR功能有关。
* 上述基因中最保守的是cas1和cas2。
* 细菌被噬菌体或质粒感染时，感染者DNA的一部分（靠近一种叫PAM的序列）被写入靠近Leader序列的一端。
* CRISPR结构的转录启动子在Leader序列内。
* 整个CRISPR结构被转录为一个RNA，称为pre-crRNA。
* pre-crRNA被切割为若干crRNA。
* 每个crRNA的5'端为8个Repeat序列的碱基，中间为一个Spacer序列，3'端为下一个Repeat序列剪去8个碱基。
* crRNA随后与一个蛋白质复合体结合，识别外来核酸。如配对正确，则蛋白质复合体将外来核酸在配对处切开。
* CRISPR系统中的Cas9蛋白可用于一切生物的基因组编辑。

## 真核生物的RNA干扰（RNA Interference，RNAi）

* 真核生物的部分非编码RNA通过RNA干扰机制调控基因表达。（图9）
* 若上述RNA与mRNA结合紧密，则mRNA被立刻水解。
* “结合紧密”的关键是RNA的第9~11个核苷酸。
* 若上述RNA与mRNA结合不紧密，则mRNA先被抑制翻译，然后被水解。
* 若上述RNA与正在转录的RNA结合，则引起DNA构象改变，抑制其转录。
* 上述RNA有三类：siRNA、miRNA、piRNA，长度均约为20 nt，统称为小RNA（Small RNA，注意不是sRNA）。（piRNA略长）

### miRNA

* miRNA参与细胞自身基因表达调控。
* miRNA由pri-miRNA经两次剪切产生。
* 绝大部分pri-miRNA源于基因的内含子或外显子，由RNA聚合酶II转录，此时pri-miRNA是mRNA。
* 基因组中5'端有Alu元素、MWIR元素、tRNA的pri-miRNA由RNA聚合酶III转录。
* miRNA在pri-miRNA中呈柄环结构。（图10、11）
* 每个pri-miRNA可含1~6个miRNA。
* 细胞核中，pri-miRNA被DGCR8蛋白（无脊椎动物中称为Pasha蛋白）识别，然后被Drosha酶（属于RNase III）将柄环结构剪切为pre-miRNA。
* DGCR8蛋白和Drosha酶共同构成“微处理”复合体（Microprocessor Complex）。
* pre-miRNA长约为70 nt。
* miRNA出现于柄环结构中柄的上半部分。
* pre-miRNA利用Exportin-5通过核孔进入细胞质。
* 细胞质内，Dicer酶将pre-miRNA从中间切下22 nt左右，切下部分为dsRNA。（下文暂称此RNA为pro-miRNA）
* pre-miRNA和pro-miRNA的每条链的3'端多出2个核苷酸。（RNase III切割的特征）
* 如果pre-miRNA富含G，可能形成G四联体结构，则不被Dicer酶处理。
* 植物细胞中产生miRNA的过程与上述略有不同，见图13。（它们的进化起源可能不同）
	+ 植物的miRNA处理不经过Drosha酶切。
	+ 植物的miRNA通常不在基因内，动物的miRNA通常在内含子内。
	+ 动物的miRNA主要与mRNA的3'端不翻译区结合，次要与外显子结合，少数与内含子结合。
	+ 植物的miRNA一般与外显子结合。
* RISC复合体结合Dicer酶切下的dsRNA，使它变性，抛弃其中一条链，另一条链成为miRNA，此过程称为RISC复合体的成熟（Maturation）。
* 若切下的dsRNA只有一条链成为miRNA，此链称为Guide Strand，另一条链称为Passenger Strand。（也可能两条链都成为miRNA）

### siRNA

* siRNA帮助细胞抵抗外来RNA。
* siRNA绝大部分产生于外源的dsRNA，极少数产生于细胞转录的dsRNA。
* siRNA是双链结构，而pre-miRNA是发夹结构。（区分siRNA和miRNA的唯一标准）
* Dicer酶处理dsRNA产生新的dsRNA（暂称为pro-siRNA），它与RISC复合体结合。（类似于pro-miRNA）

### Dicer酶（图12）

* Dicer酶由2个RNase III亚基、1个PAZ亚基组成。
* Dicer酶既可切割发夹结构，也可切割双链结构，但每条链一3'端要多出2个核苷酸。
* PAZ亚基固定3'端的2个核苷酸。
* 两个RNase III的切割位点距离PAZ亚基约20个核苷酸长，从而切下的dsRNA每条链也约为此长度。

### piRNA

* piRNA只出现于动物细胞内，帮助细胞抑制转位子。（植物用siRNA对抗转位子）
* piRNA几乎只在生殖细胞中表达。
* piRNA源于细胞转录出的ssRNA，具体产生过程尚不清楚，但Dicer酶一定不参与。
* piRNA的5‘端一般是U，3'端磷酸基团的3'羟基一般变为氧甲基。
* 细胞核内也有piRNA，作用不明。

### RISC复合体及其它

* 5'端的核苷酸以A或U为主的链更容易被选为Guide Strand。
* RISC复合体的核心是Argonaute酶。
* Argonaute酶将与Guide Strand紧密配对的RNA剪断，从而阻止翻译。（图14）
* Argonaute酶亦可抑制RNA翻译。（图15）
* 植物（包括真菌）、低等动物（不包括果蝇）的细胞内有以RNA为模板的RNA聚合酶（RdRP）。
* 未与RISC复合体结合的小RNA可直接与mRNA结合，此时RdRP以小RNA为引物，合成一条链，组成dsRNA。
* 上述dsRNA可被Dicer酶处理，形成新小RNA，从而放大RNAi现象。

### RNAi与生物技术

* 转基因技术中，导入同一基因的多个拷贝会引起共抑制现象（Cosuppresion）。
* 共抑制现象原因尚不清楚，但转录组研究显示细胞产生了对应于多拷贝基因的miRNA。
* RNAi被用于人工基因表达调控：
	+ 最早，先在试管内合成特定dsRNA，然后注入秀丽隐杆线虫细胞。
	+ 随后，发现直接将秀丽隐杆线虫浸泡在dsRNA溶液里也能注入dsRNA。（但哺乳动物细胞不行）
	+ 后来，先将dsRNA对应的DNA导入大肠杆菌的质粒，使大肠杆菌产生dsRNA，然后给线虫喂食大肠杆菌。
	+ 哺乳动物细胞中，以上方法成功率都不高，因为较长的dsRNA易引起干扰素（Interferon）反应，进而细胞凋亡。
	+ 现代，先将构造的DNA序列导入动物细胞的基因组中，该序列转录产生自动折叠为柄环结构的RNA（shRNA），模仿pre-RNA的功能。
	+ 此方法可使线虫的全部细胞永久具有该dsRNA的干扰效果。

## 真核生物的长非编码RNA（lncRNA）

* lncRNA指长度大于200 nt的非编码RNA。
* lncRNA的功能非常复杂，包括：
	+ 抑制或激活特定基因的转录；
	+ 控制通用转录因子（General Transcription Factor）或RNA聚合酶本身；（此类lncRNA多由RNA聚合酶III转录）
	+ 控制mRNA剪接（Slicing）；
	+ 控制mRNA翻译；（此现象在神经细胞中尤为明显）
	+ 控制表观遗传。（典型：Xist控制形成巴氏小体，见下文）

### Xist

* 雌性胎盘动物（后兽亚纲和真兽亚纲）在胚胎有32~64个细胞时，每个细胞中两条X染色体中任意一条变为异染色质（失活），称为巴氏小体（Barr's Body）。
* 若失活的X染色体来自父方（母方），则该细胞分裂产生的所有细胞中失活的X染色体都来自父方（母方）。
* 正常的X染色体记作Xa，失活的X染色体记作Xi。
* 后兽亚纲动物中，总是来自父方的X染色体变为异染色质。
* 老鼠胚胎有2~4个细胞时，来自父方的X染色体因染色体印记而失活，但在囊胚早期此染色体复活。（但胚外组织，包括胎盘，其细胞中此X染色体永久失活）
* X染色体上有XIC区域（X-inactivation Center）。
* XIC区域包含4个基因：Xist、Tsix、Jpx、Ftx。
* Xist和Tsix互为反义RNA，互相抑制转录。
* 胚胎初期，所有细胞少量转录Xist。
* 胚胎达到32细胞时，每个细胞中其中一个X染色体不再转录Xist，另一个大量转录Xist。
* Xist有3'端多聚A，要经历剪接，但不编码蛋白质，属于伪基因（Pseudogene）。
* Xist是唯一Xa不表达，Xi大量表达的基因。
* Xist先逐步包裹转录出它的X染色体。（尚不清楚为何不包裹另一条X染色体）
* Xist吸引其它蛋白质（如PRC2）对X染色体进行修饰。
* X染色体失活修饰包括：高DNA甲基化、低组蛋白乙酰化、低H3K4甲基化、高H3K9甲基化。
* 只有失活X染色体中出现一种罕见组蛋白macroH2A（又名H2AFY），替代正常组蛋白H2A。
* 将XIC区域移入其它染色体，该染色体也会出现上述失活现象。

## 参考文献

* 《Molecular Biology of the Cell》第7章
* 《Molecular Biology of the Gene》第20章