Oral mikrobiologi - provtagning

# Mikrobiell provtagning

**Orala infektioner** innefattar **slemhinneinfektioner** och **djupa (subepiteliala) infektioner i munhålan**. Tandsjukdomar som **karies**, **parodontit**, **peri-implantit** samt **endodontiska infektioner** har en **mikrobiologisk etiologi** och räknas därför som **orala infektioner**.

# Mikrobiologisk diagnostik

**Mikrobiologisk diagnostik** kan:

* förstärka och öka kvaliteten i den kliniska diagnosen
* ge behandlingsalternativ
* användas för behandlingskontroll
* för riskutvärdering
* samt i preventionen av dessa sjukdomar

Ett annat skäl för mikrobiologisk diagnostik av munslemhinnan är att sängliggande patienter, patienter i respirator eller som är intuberade, eller patienter med defekter i andningsvägarna (kronisk obstruktiv lungsjukdom, KOL, och cystisk fibros, CF) ofta drabbas av opportunistiska övre och nedre luftvägsinfektioner som har sitt ursprung i munhålan. Etablering av dessa mikroorganismer i munhålan kan skifta från en begränsad kolonisation (bärarskap) till överväxt av dessa opportunister utan att symtomen är särskilt dramatiska. Mikrobiologisk diagnostik hjälper till att hålla kontroll på dessa opportunister; vilka de är och risken för spridning.

**Frågeställningen** inför en mikrobiologisk provtagning är avgörande för hur den mikrobiologiska **diagnostiken ska utföras och tolkas**.

**Resultatet** kan dessutom vara **vägledande** för **behandling med antimikrobiella medel** (antiseptika och antibiotika). Det **vetenskapliga underlaget** för mikrobiologisk diagnostik av orala infektioner och deras behandling med **antibiotika är begränsat**, vilket till stor del beror på att **infektionerna är polymikrobiella med låg mikrobiologisk specificitet**.

# Checkerboard / DNA-DNA hybridisering

Checerkboard eller DNA-DNA hybridisering som det också kallas är en experimentell metod för att påvisa förekomst av DNA-molekyler, eller mäta deras mängd, storlek eller lokalisation. Hybridisering innebär att två enkelkedjiga DNA-molekyler spontant paras till en dubbelkedjig DNA-molekyl. Förutsättningen är att de två kedjornas genetiska information, dvs. ordningsföljden av deras byggstenar, nukleotider, motsvarar varandra och alltså är komplementära. Den bildade dubbelkedjiga molekylen kallas en DNA-hybrid.

I regel används en märkt DNA-kedja som sökfragment eller probe. Märkningen kan utgöras av inbyggda radioaktiva isotoper eller av påkopplade molekyler, som i sin tur kan påvisas på olika sätt. En metod är att tillsätta fluorocerande ämnen till proben. Prober får vara i kontakt med DNA-kedjorna i det prov som undersöks och bildar en DNA-hybrid endast om det finns DNA-kedjor med en motsvarande (komplementär) ordningsföljd av nukleotider. Följaktligen påvisas bara hela hybrid-DNA-molekyler med en ”probe-sträng” och en ”prov-sträng” om strängarna är av samma sort. I detta fall om proben och provet består av samma bakterieart.

Mer om exakt hur det går till går att läsa i labkompendiet. (Metoden beskrivs av Socransky 1994.) Resultatet blir i alla fall att prov och probe hamnar på ett membran som kan belysas. Finns det märkta prober som bundit till DNA-strängar i provet kommer dessa hybrid-DNA att fluorescera och ge svärtning vid belysning. Förekomst av och graden av svärning (jämförs med kontroller) och ger information om bakteriers förekomst och antal. Detta läses av tolkas maskinellt.

Fil:Tileshop.fcgi.jpeg

# qPCR

Bakterier kan också isoleras och identifieras med hjälp av genteknisk PCR-teknik. PCR står för Polymeras Chain Reaction. En variant på PCR är ”quantitative real-time polymerase chain reaction” eller qPCR. Metoden kallas också realtids-PCR. qPCR kombinerar PCR-amplifieringsteget och detektionen i ett enda steg. Detta eliminerar behovet av att detektera vilka produkter som bildats med hjälp av gelelektrofores. Metoden är verkligt kvantitativ. Med qPCR används fluorescerande ämnen för att märka PCR-produkter under varje termisk cykling. Realtids-PCR mäter och visar ackumuleringen av fluorescerande signal under den exponentiella fasen av reaktionen. Det ger en snabb och exakt kvantifiering av de PCR-produkter som bildas.

Bra video på det här:
http:**media.invitrogen.com.edgesuite.net/ab/applications-technologies/real-time-pcr/real-time-polymerase-chain-reaction/index.html**

## Ytliga infektioner / slemhinneprov

**Provtagning**

* Vid **ytliga infektioner i slemhinnan** tas provet med fördel som '***skrapprov.'*** Provet tas med vasst instrument, till exempel en "**amalgam carver"** och förs över till transportmedium för att sedan analyseras med odling.
* Provet kan kompletteras med ett **skrapprov för mikroskopi** för analys av **svamphyfer,** som är ett tecken på **svampinfektion**.

Frågeställningen blir i dessa fall om det förekommer något onormalt eller inte.

Vid **kariesdiagnostik** är **salivprov** det vanligaste även om ett **skrapprov av plack kan vara av värde**.

De **vanligaste mikroorganismerna som förekommer i dessa opportunistiska infektioner finns i tabellen nedan**. Gemensamt för dessa mikroorganismer är dessutom att de **utvecklar resistens och betecknas som multiresistenta**. Behandling med **antibiotika är därför inte alltid indicerad** och ofta **helt verkningslöst så länge som patienterna står på immunosuppressiva medel**.

## Endodontiska infektioner

**Mikrobiell flora**
Endodontiska infektioner är akuta eller kroniska. I bägge fallen är rotkanalen nekrotisk och infekterad. De akuta är oftast polymikrobiella med dominans av anaeroba orala bakterier (anaeroba streptokocker, Prevotella spp., Fusobacterium spp., Porphyromonas spp., Campylobacter spp., Treponema spp. med flera). Infektionen tränger ofta ut i den omgivande periapikala vävnaden med abscessbildning och tydliga kliniska symtom. Risk för spridning föreligger dock vanligtvis via fistel till munhålan. De kroniska infektionerna är oftast kliniskt symtomlösa men med en röntgenologiskt iakttagbar periapikal inflammation vid rotspetsen. Inflammationen är associerad till kvarstående (”persisterande”) bakterier i rotkanalen under och efter behandling. Gram-positiva och fakultativa bakterier (streptokocker, laktobaciller, propionibakterier, Actinomyces) är dominerande och mer effektiva antiseptika anses nödvändiga för att eliminera dem. Vid förekomst av E. faecalis har desinfektion med starka jodlösningar anbefallts.

**Provtagning**
Prov från rotkanalen har den stora fördelen att man kan göra detta aseptiskt och minimera risken för kontamination och falska positiva resultat. Det förutsätter att tanden isoleras med kofferdam och desinficeras. Kontroll att det inte finns läckage vid anslutningen ska göras. Provet tas med papperspoints och förs i transportmedium till laboratorium för analys.

**Analys och tolkning**
Primärt sker en analys av odling (växt/icke växt) på flytande och fasta medier. I allmänhet sker ingen djupare mikrobiologisk identifiering av de vanligtvis dominerande orala streptokockerna och anaeroberna med selektivmedier om det inte uppträder mer ovanliga fynd (exempelvis E. faecalis, S. aureus, enterobakterier eller Candida) som kan kräva annan behandlingsstrategi.

## Mikrobiologisk diagnostik vid parodontit/ peri-implantit

**Mikrobiell flora**
Kronisk och aggressiv parodontit är kliniska diagnoser som har likartad mikrobiologi och karakteriseras som **polymikrobiella anaeroba infektioner**. En lång rad bakteriearter är **typiska för den bakteriella ekologin vid en parodontit.** Majoriteten är **gram-negativa** och **proteinspjälkande** och utgör på **ett sätt markörer för en ”sjuk”** **mikroflora**. Dit hör det så kallade **röda komplexet** bestående av '***Porphyromonas gingivalis'***, '***Tannerella forsythia'*** och '***Treponema denticola'*** (spirocheter) och det **orangea komplexet** med '***Prevotella intermedia'***, '***Parvimonas micra,** **Campylobacter rectus'*** och '***Fusobacterium nucleatum'***, men även andra som '***Porphyromonas endodontalis'***, '***Filifactor alocis'*** och '***Prevotella tannerae.'***

Variationen och mängden varierar avsevärt från fall till fall, men en dominerande förekomst av dessa är liktydigt med att icke friska förhållanden råder i tandköttsfickan. '***Aggregatibacter actinomycetemcomitans'*** har i första hand förknippats med **aggressiv parodontit på unga** och är då **ofta den enda markören** i dessa parodontitlesioner. A. actinomycetemcomitans förekommer sällan i den dominerande floran och ställer därför krav på en känsligare metodik. Det är därför viktigt att **sjukdomen upptäcks i ett tidigt stadium** (det vill säga **begynnande parodontal fästeförlust i tidiga tonåren**) och att behandling kan ges omedelbart. Diagnostik av '***A. actinomycetemcomitans'*** i tidigt skede är alltså avgörande för den kliniska diagnosen och behandlingen.

# Peri-implantit

Den mikrobiella floran vid peri-implantit har stora likheter med den vid parodontit. Dock finns det belägg för att peri-implantit är mer aggressiv (snabbare bennedbrytning och pusbildning) och med invasion av bakterierna i vävnaden.

## Djupa infektioner

**Djupa infektioner** innebär förekomst av mikroorganismer i **vävnad som normalt sett är steri**l varför **alla** **mikrobiologiska fynd** är av **intresse**. Vid provtagningen kan det här vara svårt att undvika kontamination från ytan (slemhinna eller tandyta) och saliven vilket ställer stora krav och god insikt om svårigheterna hos provtagaren. Att skicka in extraherade tänder är inte meningsfullt.

Med djupa infektioner avses här **dento-alveolära abscesser** och **beninfektioner** (**osteiter, osteomyeliter, infektioner** i **nekrotiskt ben** efter **strålning** eller behandling med **bisfosfonater**, **infektioner** vid **frakturer** och **trauma**) och **maxillo-faciala abscesser**.

Dessa infektioner är ofta **akuta med risk för spridning och komplikationer**. Just risken för svåra komplikationer skall inte negligeras, och **snabb diagnostik och behandling är nödvändig**. Infektionerna har ofta ett **odontogent ursprung via tandköttsficka eller rotkanal varför dessa vanligtvis anaeroba infektioner domineras av orala bakterier**.

**Mikrobiologisk diagnostik** av dessa infektioner är svår av flera skäl. Infektionerna är **ofta akuta** och om **spridningsrisk finns måste behandling**, till exempel med **incision och antibiotika**, ske **omedelbart innan den mikrobiologiska diagnosen är klar**. Den mikrobiologiska diagnostiken **fördröjs dessutom** genom den **nödvändiga anaeroba odlingen**. Ofta hinner **infektionen kureras innan diagnostiken är kla**r.

**Resistensen** hos många **anaeroba bakteriearter ökar** varför **resistensbestämning kan vara indicerat oftare än vad som görs inom tandvården idag**. Dessutom förekommer tillräckligt ofta infektioner med mer **specifika mikroorganismer** som till exempel '***S. aureus'***, '***E. faecalis'***, '***enterobakterier'*** ('***E. coli'***, '***Pseudomonas-arter'***) och svamp ('***Candida)'***, särskilt då hos immunosupprimerade patienter, varför mikrobiologisk diagnostik kan vara direkt vägledande för terapin.

Ett annat problem som föreligger är den stora **risk för kontamination från saliv och slemhinnor som finns**. Om **möjligt ska prov tas med spruta genom slemhinnan innan incision**, eller **via rotkanalen där kontroll av kontaminationen är möjlig**. Prov **via tandköttsfickan ska undvikas**.

Vid infektioner då ingen abscess är kliniskt iakttagbar och man måste göra någon form av uppklaffning, är risken för kontamination överhängande samtidigt som det kan vara svårt att lokalisera själva infektionshärden. Prov från olika former av beninfektioner är mikrobiologiskt svårdiagnostiserade genom att de inte uppvisar någon, eller mycket liten, bakterieväxt. För prov från **djupa infektioner är allmänodling det mest informativa,** och **resistensbestämning kan sedan göras** på för infektionen relevanta mikroorganismer. **Provet tas efter uppklaffning med points eller bomullspellets och provet förs ned i transportmedium**. Användning av provtagningspinnar och kommersiella provtagningsset bör undvikas då de inte håller anaeroba bakterier viabla under transporten.

## Resistensbestämning

**Resistensbestämning** av för infektionerna relevanta mikroorganismer utförs vid de flesta mikrobiologiska laboratorier. Det finns ingen konsensus om vilka antibiotika som ska testas. De **oral-mikrobiologiska laboratorierna testar primärt mot antibiotika som används inom tandvården** (till exempel penicillin, amoxicillin, tetracyklin, erytromycin, klindamycin och metronidazol). Vid vissa laboratorier görs en **utökad resistensbestämning** med olika cefalosporiner och kinoloner i fall av multresistenta bakterier (exempelvis enterobakterier). **Resistensbestämning av antimykotika** (till exempel flukonazol) kan också **utföras på begäran**.

# Olika metoder för resistensbestämning

**Dilutionsmetoder**
Det finns olika metoder för resistensbestämning. Antingen används dilutionsmetoder (spädningsmetoder) eller diffusionsmetoder. **Dilutionsmetoder** (spädningsmetoder), är **kvantitativa och ger direkt ett värde på hur känslig bakterien är för olika antibiotika**. Metoden innebär att man **odlar bakterien i olika koncentrationer av antibiotika, antingen på agar eller i buljong**. **Efter inkubering** **avläses** resultatet som '***den lägsta koncentrationen av ett visst antibiotikum som krävs för att hämma bakterieväxt'*** ('***Minimum Inhibitory Concentration, MIC'***).

**Diffusionsmetoder**
**Diffusionsmetode**r (diskdiffusion, ’lapp-metoder’) är **kvalitativa eller semikvantitativa**. Bakteriestammen som ska **testas stryks ut på en speciell agarplatta och filterlappar eller tabletter med en bestämd koncentration antibiotika läggs på plattan**. Antibiotika kommer då att **diffundera ut i mediet** och resultatet avläses efter inkubering som d**iametern på den hämningszon som finns runt lappe**n. Genom extrapolering från standardkurvor (regressionslinjer mellan zondiameter och MIC för olika testade bakterier) kan den hämmande koncentrationen indirekt skattas, förutsatt att testbetingelserna är exakt som för standardkurvan. Diffusionsmetoder är indirekta eftersom man är beroende av standardkurvor i tolkningen.

Protokoll som vi fyllde i på labben. Manuell mätning av hämningszonen mättes på odlade plattor där olika tabletter placerats ut, det gav resistensbestämning.

**Resistensbestämning** sker med **disc-diffusionstest** och känsligheten anges med **SIRsystemet**

* S = känslig
* I = intermediär
* R = resistent