ՌՆԹ-պոլիմերազ

ՌՆԹ-պոլիմերազ,  ՌՆԹ-ի սինթեզ  իրականացնող Ֆերմենտ է։ Ավելի նեղ իմաստով  այս ֆերմենտը կոչվում է ԴՆԹ-կախյալ ՌՆԹ-պոլիմերազ, որը ԴՆԹ-ի մատրիցայի հիման վրա սինթեզում է ՌՆԹ-ի մոլեկուլ, այսինքն՝ իրականացնում է տրանսկրիպցիա։ Քիմիայի տեսանկյունից ՌՆԹ-պոլիմերազն իրենից ներկայացնում է նուկլեոտիդ-տրանսֆերազ, որը ՌՆԹ-ի շղթայի 3՛ ծայրից նուկլեոտիդներ է ավելացնում։ Այս դասին պատկանող ֆերմենտները շատ կարևոր են բջջի կենսագործունեության համար, ուստի հանդիպում են բոլոր օրգանիզմների բջիջներում և որոշ վիրուսներում։ Այն կարող է լինել որպես  Սպիտակուցային կամպլեքս (բազմաենթամիավորային ՌՆԹ-պոլիմերազ) կամ կազմված լինել մեկ ենթամիավորից (պարզ ՌՆԹ-պոլիմերազ)։ Առաջինը հայտնաբերվել է բակտերիաների, արխեաների և էուկարիոտների մոտ, իսկ երկրորդը՝ ֆագերի մոտ և էուկարիոտների քլորոպլաստներում ու միտոքոնդրիումներում։
Բակտերիաները և արխեաներն ունեն մեկ տեսակի ՌՆԹ-պոլիմերազ։ Գոյություն ունի Էուկարոտների մի քանի տեսակ ՌՆԹ-պոլիմերազ, որոնցից յուրաքանչյուրը պատասխանատու է ՌՆԹ-ի որոշակի տեսակի սինթեզի համար։
Բոլոր ՌՆԹ-պոլիմերազներն ունեն մետաղական կոֆակտորներ, դրանք են ցինկը և մագնեզիումը, որոնք իրենց մասնակցությունն ունեն տրանսկրիպցիայի գործընթացում։

Ուսումնասիրման պատմություն 
ՌՆԹ-պոլիմերազն իրարից անկախ միաժամանակ հայտնաբերել են Սեմ Վայսը և Ջերալդ Հուրվիցը 1960 թվականին։ Մինչ այդ, 1959 թվականին, Սեվերո Օխոային և Արթուր Կորնբերգին արդեն շնորհվել էր Նոբելյան մրցանակ՝ մի նյութի հայտնաբերման համար, որը կարծում էին, թե ՌՆԹ-պոլիմերազն է։ Հետագայում պարզվեց, որ այդ նյութը Ռիբոնուկլեազ Ֆերմենտն է ։

2006 թվականին Ռոջեր Կորնբերգին քիմիայի բնագավառում շնորհվեց Նոբելյան մրցանակ՝ տրանսկրիպցիայի տարբեր փուլերում ՌՆԹ-պոլիմերազի մոլեկուլի ճշգրիտ պատկերների ստացման համար։

Տրանսկրիպցիայի կարգավորում 

Գեների տրանսկրիպցիայի կարգավորումը թույլ է տալիս վերահսկել Գեների էքսպրեսիան, ինչի շնորհիվ բջիջը հարմարվում է արտաքին միջավայրի փոփոխվող պայմաններին՝ ապահովելով մետաբոլիկ գործընթացների պատշաճ մակարդակը, ինչպես նաև իրականացնում է օրգանիզմի գոյատևման համար անհրաժեշտ յուրահատուկ գործառույթներ։ Հատկանշական է, որ ՌՆԹ-պոլիմերազի աշխատանքը շատ բարդ է և կախված է բազմաթիվ գործոններից (այսպես, Escherichia coli-ի բջջում հայտնաբերվել է 100-ից ավել գործոններ, որոնք այս կամ այն կերպ ազդում են  ՌՆԹ-պոլիմերազի աշխատանքի վրա)։

ՌՆԹ-պոլիմերազը տրանսկրիպցիան սկսում է ԴՆԹ-ի հատուկ մասերից (սայթերից), որոնք կոչվում են պրոմոտորներ և կոմպլեմենտարության սկզբունքով ԴՆԹ-ի շղթայի համապատասխան հատվածի հիման վրա սինթեզում է ՌՆԹ-ի շղթան։

Նուկլեոտիդների միացման գործընթացը կոչվում է էլոնգացիա։ Էուկարիոտ բջիջներում ՌՆԹ-պոլիմերազը կարող է սինթեզել ավելի քան 2,4 մլն նուկլեոտիդներից կազմված շղթա (օրինակ՝ դիստրոֆին սպիտակուցը կոդավորող ամբողջական գենն ունի այդպիսի երկարություն)։

ՌՆԹ-ի շղթայի սինթեզն ավարտվում է, երբ ՌՆԹ-պոլիմերազը ԴՆԹ-ի շղթայում հանդիպում է տերմինատոր կոչվող յուրահատուկ հաջորդականության։

ՌՆԹ-պոլիմերազն ապահովում է ՌՆԹ-ի հետևյալ տարատեսակների սինթեզը՝
 Ինֆորմացիոն ՌՆԹ (ի-ՌՆԹ) — ռիբոսոմներում ընթացող սպիտակուցների սինթեզի համար կաղապար է հանդիսանում։
 Չկոդավորող ՌՆԹ կամ «գեն- ՌՆԹ» — ՌՆԹ-ն կոդավորող գեների մեծ դաս է, որոնց հիման վրա սպիտակուց չի սինթեզվում։ Այս դասի ամենահայտնի ներկայացուցիչներն են փոխադրող ՌՆԹ-Ն (փ-ՌՆԹ) և ռիբոսոմային ՌՆԹ-Ն (ռ-ՌՆԹ)։ Այնուամենայնիվ, 20-րդ դարի 90-ականներին հայտնաբերվեցին շատ այլ գեն-ՌՆԹ-ներ, ինչը թույլ տվեց ենթադրել, որ վերջիններս կատարում են ավելի կարևոր դեր, քան կարծում են։    
Փոխադրող ՌՆԹ (փ-ՌՆԹ), ամինաթթուները տեղափոխում է ռիբոսոմների վրա, որտեղ տեղի է ունենում սպիտակուցի սինթեզ տրանսլյացիա։
 Ռիբոսոմային ՌՆԹ (ռ-ՌՆԹ) — մտնում է ռիբոսոմի կազմի մեջ։
 ՄիկրոՌՆԹ — կարգավորում է գեների ակտիվությունը։
 Կատալիտիկ ՌՆԹ — օժտված է ֆերմենտային հատկությամբ։

ՌՆԹ-պոլիմերազը սինթեզի գործընթացը սկսում է զրոյից։ Դա հնարավոր է դառնում շնորհիվ այն բանի, որ այն փոխազդելով գենի առաջին նուկլեոտիդի հետ, կարողանում է ամրանալ շղթայի վրա և շարունակել հետագա աշխատանքը։ Սա, մասնավորապես, բացատրում է, թե ինչու է սովորաբար ՌՆԹ-պոլիմերազը տրանսկրիպցիան սկսում ԱԵՖ-ից, որին հաջորդւմ են ԳԵՖ-ը, ՈՒԵՖ-ը և ՑԵՖ-ը։ 
Ի տարբերություն ԴՆԹ-պոլիմերազի, ՌՆԹ-պոլիմերազն օժտված է նաև հելիկազային ակտիվությամբ։

ՌՆԹ-պոլիմերազի գործողություններ

Կապում և տրանսկրիպցիայի ինդուկցում 

ԴՆԹ-ի շղթային ՌՆԹ-պոլիմերազի միանալու գործընթացում մասնակցում են α-ենթամիավորը և σ-ֆակտորը։ α-ենթամիավորը ճանաչում է ԴՆԹ-ի՝ գենին նախորդող համապատասխան հատվածը, որը գտնվում է -40…-70 քայլ առաջ, իսկ և σ-ֆակտորը՝ −10…-35 քայլ առաջ գտնվող հատվածը։ Գոյություն ունեն մեծ թվով σ-ֆակտորներ, որոնք ճանաչում են տարբեր պրոմոտորներ, օրինակ՝ σ70  ենթամիավորը գեների էքսպրեսիան ապահովում է նորմալ պայմաններում և ՌՆԹ-պոլիմերազին հնարավորություն է տալիս միանալ նորմալ պայմաններում ընթացող գործընթացների համար պատասխանատու գեներին (այսպես կոչված Տնային գեներ), իսկ  σ32 ենթամիավորն ապահովում է ՌՆԹ-պոլիմերազի միացումը բարձր ջերմաստիճանում գործող գեների պրոմոտորներին (Ջերմային շոկի սպիտակուցները կոդավորող գեներ)։ Հայտնվելով պրոմոտորի վրա, ՌՆԹ-պոլիմերազը վերջինիս հետ կազմում է փակ պրոմոտորային կոմպլեքս, որտեղ ԴնԹ-ն դեռ պահպանում է երկշղթա վիճակը։ Այս վիճակում ՌՆԹ-պոլիմերազը չի կարող սինթեզել ՌՆԹ։ ՌՆԹ-պոլիմերազ-պրոմոտոր կոմպլեքսը անկայուն է, հեշտ քայքայվում է իոնային ուժի մեծանալու դեպքում։ 
ԴՆԹ-ին միանալուց հետո ՌՆԹ-պոլիմերազի փակ կառուցվածքը դառնում է բաց։ Այս փոխակերպման արդյունքում հնարավոր է դառնում ԴՆԹ-ի երկպարույրի ապապարուրումը մոտավորապես 13 քայլի չափով։ Այնուհետև ռիբոնուկլեոտիդները հաջորդաբար միանում են իրար՝ որպես կաղապար ընդունելով ԴՆԹ-ի հիմնական շղթան։ ԴՆԹ-ի մոլեկուլի գերպարուրումը առանցքային դեր ունի ՌՆԹ-պոլիմերազի գործունեության մեջ․ քանի որ ՌՆԹ-պոլիմերազի առջևում ԴՆԹ-ն ապապարուրված է, նրանում առկա են դրական կոմպենսացնող գերպարույրներ, իսկ հետնամասում, որտեղ ԴՆԹ-ի շղթաները նորից սկսում են պարուրվել, գտնվում են բացասական գերպարույրներ։

Էլոնգացիա 
Տրանսկրիպցիայի այս փուլի ընթացքում շղթայի ծայրից ավելանում են նուկլեոտիդներ։ Այդ ընթացքում ԴՆԹ-ի՝ ՌՆԹ-պոլիմերազի առաջնամասում գտնվող հատվածը շարունակում է ապապարուրվել, և 13 զույգ նուկլեոտիդներից կազմված բաց համակարգը վերածվում է 17 զույգից կազմված տրանսկրիպտային համակարգի։ Այդ պահին ավարտվում է պրոմոտորը (ԴՆԹ-ի −10…-35 քայլից կազմված հատված), և ՌՆԹ-պոլիմերազից անջատվում է σ-գործոնը, ինչը  ՌՆԹ-պոլիմերազիn թույլ է տալիս սկսել շաժվել դեպի առաջ (σ-գործոնը վերջինիս պահում էր տեղում կապված)։ 
17 զույգ նուկլեոտիդներից կազմված համակարգը պարունակում է ԴՆԹ-ի և  ՌՆԹ-ի հիբրիդ, որն իրենից ներկայացնում է ԴՆԹ-ի կաղապար հանդիսացող շղթային միացած ՌՆԹ-ի 8 քայլից կազմված հատված։ Տրանսկրիպցիայի ընթացքում ՌՆԹ-պոլիմերազը ԴՆԹ-ի շղթայի երկայնքով շարժվում է առաջ, և սինթեզվող ՌՆԹ-ի 3'-ծայրից ավելանում են նուկլեոտիդներ։ Չնայած ՌՆԹ-պոլիմերազի մոտ չի հայտնաբերվել ԴՆԹ-պոլիմերազին բնորոշ 3'-էկզոնուկլեազային ակտիվություն, կան տեղեկություններ այն մասին, որ ՌՆԹ-պոլիմերազը կանգ է առնում և ԴՆԹ-ՌՆԹ նուկլեոտիդայի զույգի սխալ ձևավորման դեպքում ուղղումներ է կատարում։
ԴՆԹ- ի և ՌՆԹ-ի պոլիմերիզացման մեխանիզմներ իրար շատ նման են։ ՌՆԹ-պոլիմերազի կազմում գտնվող ասպարագինաթթվային մնացորդները միանում են Mg2+-ի իոններին, որոնք իրենց հերթին կոորդինացնում են նուկլեոտիդների ֆոսֆատային խմբերը, այսպես՝ առաջին Mg2+ իոնը պահում է նուկլեոտիդեռֆոսֆատի α-ֆոսֆատը, որը պետք է միանա ՌՆԹ-ի շղթային։ Դա թույլ է տալիս, որ նուկլեոտիդը միանա ՌՆԹ-ի 3' OH-խմբին։ Երկրորդ Mg2+ իոնը պահում է նուկլեոտիդեռֆոսֆատի կազմում գտնվող պիրոֆոսֆատը։ Ընդհանուր հավասարումն ունի հետևյալ տեսքը՝
 
(ՆՄՖ)n + ՆԵՖ --> (ՆՄՖ)n+1 + PPi

Տերմինացիա 

Բակտերիաների մոտ ՌՆԹ-պոլիմերազի տերմինացիան կարող է լինել  ρ-անկախ կամ ρ-կախյալ։

ρ-կախյալ տերմինացիան տեղի է ունենում  ρ -ֆակտորի վրա, որը խախտում է ԴՆԹ-ՌՆԹ կապը՝ անջատելով ՌՆԹ-ն։

ρ-անկախ տերմինացիան իրականացվում է ԴՆԹ-ի պալինդրոմային հատվածի վրա։ ԴՆԹ-ի պալինդրոմային հատվածի տրանսկրիպցիայի արդյունքում ՌՆԹ-ի շղթայում ձևավոևվում է կանթ, որը հարուստ է Գուանինով և Ցիտոզինով, ինչը նրան ավելի կայուն է դարձնում, քան ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդը։ Արդյունքում 8 զույգից կազմված ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդը կրճատվում է մինչև 4 զույգ։ Այն դեպքում, եթե այդ վերջին 4 զույգերը կազմված են թույլ Ադենինից և ՈՒրացիլից, ՌՆԹ- մոլեկուլը անջատվում է։

Բակտերիալ ՌՆԹ-պոլիմերազ 

Բակտերիաների բջջում միևնույն ֆերմենտը կատալիզում է երեք տիպի ՌՆԹ-ների՝ ի- ՌՆԹի, ռ-ՌՆԹի և փ- ՌՆԹի սինթեզը։

ՌՆԹ-պոլիմերազն բավականին մեծ մոլեկուլ է։ Ֆերմենտի հիմնական մասը (core enzyme) կազմված է 5 ենթամիավորից (~400 կԴա)։
 α2: այս ենթամիավորը մեծությամբ երրորդն է։ Երկու α-ենթամիավորները կապում են ֆերմենտի մնացած տարրերը և ճանաչում կարգավորող ֆակտորները։ Յուրաքանչյուր ենթամիավոր կազմված է երկու դոմենից՝  αCTD (С-ծայրային դոմեն), որը միանում է պրոմոտորի առաջին տարրին և αNTD (N-ծայրային դոմեն), որը կապվում է ֆերմենտի մնացած կոմպոնենտներին։
 β': ամենամեծ ենթամիավորն է։ Այստեղ է գտնվում ՌՆԹ-ի սինթեզ իրականացնող ակտիվ կենտրոնի մի մասը։ Նաև պարունակում է որոշ հատվածներ ԴՆԹ-ի և սինթեզվող ՌՆԹ-ի հետ ոչ սպեցիֆիկ եղանակով միանալու համար։
 β: մեծությամբ երկրորդն է։ Պարունակում է ՌՆԹ-ի սինթեզ իրականացնող ակտիվ կենտրոնի  և ԴՆԹ-ի ու սինթեզվող ՌՆԹ-ի հետ ոչ սպեցիֆիկ եղանակով միանալու համար հատվածների մյուս մասը։ 
 ω: ամենաքոքր ենթամիավորն է։ Նպաստում է ՌՆԹ-պոլիմերազի հավաքմանը, նաև նպաստում է նրա կայունության պահպանմանը։ Mycobacterium smegmatis-ի մոտ հայտնաբերվել է նաև β'-ենթամիավորի վրա նրա պաշտպանական /շապերոնային նշանակությունը/։

ԴՆԹ-ի պրոմոտորային հատվածի հետ կապվելու համար հիմնական ֆերմենտին պետք է ևս մեկ ենթամիավոր՝ սիգմա (σ)։ σ- ֆակտորը զգալիորեն իջեցնում է ԴՆԹ-ի ոչ յուրահատուկ հատվածների նկատմամբ ՌՆԹ-պոլիմերազի խնամակցությունը՝ միաժամանակ մեծացնելով նրա զգայունությունը որոշակի պրոմոտորների նկատմամբ (կախված իր կառուցվածքից)։ Շնորհիվ այս ենթամիավորի, տրանսկրիպցիան սկսվում է ԴՆԹ-ի ճիշտ հատվածից։

Այսպիսով, ամբողջական ֆերմենտը կազմված է 6 ենթամիավորից՝ α2ββ'σω (~480 կԴա)։
ՌՆԹ-պոլիմերազի կառուցվածքի մեջ կա 55 Å (5,5 նմ) երկարությամբ և 25 Å (2,5 նմ) լայնությամբ ակոս։ Հենց այդ ակոսի մեջ էլ տեղավորվում է ԴՆԹ-ի՝ 20 Å (2 նմ) լայնությամբ երկպարույրը։ Ակոսի երկարությամբ տեղավորվում է 16 նուկլեոտիդ։

ՌՆԹ-պոլմերազի մոլեկուլները ցիտոպլազմայում գտնվում են չլուծված վիճակում։ Երբ այն չի մասնակցում սինթեզին, միանում է ԴՆԹ-ի ոչ յուրահատուկ հատվածներին՝ սպասելով ակտիվ պրոմոտորի բացվելուն։

Էուկարիոտ բջիջների ՌՆԹ-պոլիմերազ  
 
Էուկարիոտ օրգանիզմների մոտ հայտնի է ՌՆԹ-պոլիմերազի մի քանի տիպեր՝
 ՌՆԹ-պոլիմերազ I— սինթեզում է պրո-ռՌՆԹ 45S(խմորասնկերի մոտ՝35S), որը վերափոխվում է 28S, 18S և 5.8S ռ-ՌՆԹ-ների, որոնք հետագայում կազմում են ռիբոսոմի մեծ ենթամիավորը։
 ՌՆԹ-պոլիմերազ II— սինթեզում է պրո-իՌՆԹ, ինչպես նաև փոքր կորիզային ՌՆԹ-ների և միկրոՌՆԹ-ների մեծ մասի նախատիպերը։ Սա ՌՆԹ-պոլիմերազի համեմատաբար ամենալավ ուսումնասիրված տիպն է։ Հաշվի առնելով այն, որ տրանսկրիպցիան պետք է ընթանա խիստ հսկողության տակ, ՌՆԹ-պոլիմերազ II-ին անհրաժեշտ է տրանսկրիպցիոն ֆակտորների մեծ հավաքածու։
 ՌՆԹ-պոլիմերազ III— սինթեզում է փՌՆԹ, 5S ռՌՆԹ և այլ փոքր կորիզային ՌՆԹ-ներ։
Էուկարիոտ բջիջների քլորոպլաստների և բակտերիաների ՌՆԹ-պոլիմերազները շատ նման են իրար։ Նրանք օգտագործում են σ-ֆակտորները, որոնք կոդավորվում են կորիզային գեներով։

Արխեաների ՌՆԹ-պոլիմերազն 
Արխեաների մոտ կա միայն մեկ տեսակի ՌՆԹ-պոլիմերազ, որն, այնուամենայնիվ, շատ նման է բակտերիալ և էուկարիոտիկ ՌՆԹ-պոլիմերազներին, մասնավորապես, շատ նման է ՌՆԹ-պոլիմերազ II-ին։ Արխեաների ՌՆԹ-պոլիմերազը հայտնաբերվել է վերջերս։ Արխեալ ՌՆԹ-պոլիմերազի առաջին անալիզը կատարվել է 1971 թվականին, երբ առանձնացվել և մաքրվել է էքստրեմալ հալոֆիլ Halobacterium cutirubrum-ի ՌՆԹ-պոլիմերազը։ Որոշ գիտնականներ կարծում են, որ արխեալ ՌՆԹ-պոլիմերազը համարվում է եուկարիոտիկ ՌՆԹ-պոլիմերազի էվոլյուցիոն նախնին։

Վիրուսային ՌՆԹ-պոլիմերազ 

Շատ վիրուսներ պարունակում են ՌՆԹ-պոլիմերազ։ Ամենից լավ ուսումնասիրված է Т7 բակտերիոֆագի ՌՆԹ պոլիմերազը։ Դա մեկ ենթամիավորից կազմված ֆերմենտ է, որը շատ նման է միտոքոնդրիալ և քլորոպլաստային ՌՆԹ-պոլիմերազին, ինչպես նաև ԴՆԹ-պոլիմերազին։
Ենթադրվում է, որ վիրուսային պոլիմերազների մեծ մասը առաջացել են ԴՆԹ-պոլիմերազից։ 
Վիրուսների մեծ մասի մոտ գործում է մեկ ենթամիավորից կազմված ԴՆԹ-կախյալ ՌՆԹ-պոլիմերազը, որը կառուցվածքով և ֆունկցիոնալ մեխանիզմներով նման է էուկարիոտների քլորոպլաստային և միտոքոնդրիալ մեկ ենթամիավորանոց ՌՆԹ-պոլիմերազին, ավելի հեռու է ԴՆԹ-պոլիմերազից և հակադարձ տրանսկրիպտազ ֆերմենտից։
Մյուս վիրուսներն օգտագործում են ՌՆԹ-կախյալ ՌՆԹ-պոլիմերազ(ՌՆԹ-պոլիմերազ,որը որպես մատրիցա ԴՆԹ-ի փոխարեն օգտագործում է ՌՆԹ-ն)

ՌՆԹ-պոլիմերազի ստացումը 
ՌՆԹ-պոլիմերազը կարելի է անջատել հետևյալ մեթոդներով՝
 Ֆոսֆոցելյուլոզային խողովակի վրա։
 Գլիցերինային գրադիենտի վրա իրականացվող ցենտրիֆուգմամբ։
 ԴՆԹ-ի խողովակների օգտագործմամբ։
 Իոնափոխանակային քրոմատոգրաֆիայի միջոցով։
Ինչպես նաև այս մեթոդների միացմամբ։

Ծանոթագրություններ

Գրականություն 
 Lehninger Principles of Biochemistry, 4th edition, David L. Nelson & Michael M. Cox

Արտաքին հղումներ 
 DNAi — DNA Interactive: информация и Flash-ролики об РНК-полимеразе.
  animation of RNA Polymerase Transcription - анимация РНК-полимераза в действии

Գեների էքսպրեսիա
ՌՆԹ
Ֆերմենտներ