Հակադարձ տրանսկրիպտազ

Հակադարձ տրանսկրիպտազ կամ ռեվերտազ, ֆերմենտ, որը ՌՆԹ-ի հիման վրա սինթեզում է կոմպլեմենտար ԴՆԹ (կԴՆԹ)։ Այն գործում է ՄԻԱՎ-ի և հեպատիտ B վիրուսի գենոմները կրկնապատկելու, ռետրոտրանսպոզոնների պրոլիֆերացվելու և էուկարիոտ բջիջներում թելոմերները երկարացնելու համար։

Ռետրովիրուսային հակադարձ տրանսկրիպտազն ունի երեք հաջորդական կենսաքաիմիական գործառույթներ․ ՌՆԹ-կախյալ ԴՆԹ-պոլիմերազային ակտիվություն, ռինոնուկլեազային ակտիվություն և ԴՆԹ-կախյալ ԴՆԹ-պոլիմերազային ակտիվություն։ Այսպիսով, ֆերմենտը միաշղթա ՌՆԹ-ից ստանում է երկշղթա ԴՆԹ։ Ռեակցիաների նույն հաջորդականությունը կիրառվում է լաբորատորիաներում մոլեկուլային կլոնավորման, ՌՆԹ-ի սեքվենավորման, պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (ՊՇՌ) և գենոմային վերլուծության մեջ։

Պատմություն 
Հակադարձ տրանսկրիտազները հայտնաբերել է Հաուարդ Թեմինը և անջատել է Դեյվիդ Բալտիմորը։ Նրանց ձեռքբերումների համար նրանք ստացել են 1975 թվի Նոբելյան մրցանակը «Ֆիզիոլոգիա կամ բժշկություն» ոլորտում։

Լավ ուսումնասիրված հակադարձ տրանսկրիպտազներ են․

 ՄԻԱՎ-1 հակադարձ տրանսկրիպտազ
 M-MLV հակադարձ տրանսկրիպտազ (Մոլոնի մկան լեյկեմիայի վիրուս)
 AMV հակադարձ տրանսկրիպտազ (թռչնի միելոբլաստոզի վիրուս)
 Թելոմերազ հակադարձ տրանսկրիպտազ (էուկարիոտ բջիջներում ապահովում է թելոմերների կայուն երկարությունը)

Գործառույթը վիրուսներում 

Վիրուսների այն խումբը, որն օրգագործում է հակադարձ տրանսկրիպտազը սեփական գենոմը կրկնապատկելու և հետագայում տիրոջ գենոմի մեջ ներկառուցելու համար, կոչվում են ռետրովիրուսներ, եթե նրանց գենոմը ներկայացված է ՌՆԹ-ով, և հեպադնավիրուսներ, եթե նրանց գենոմը ներկայացված է ԴՆԹ-ով։ ՌՆԹ-ից ԴՆԹ-ի սինթեզը կոչվում է հակադարձ տրանսկրիպցիա կամ ռետրոտրանսկրիպցիա։

Հակադարձ տրանսկրիպցիայի ընթացք 
Հակադարձ տրանսկրիպտազը միաշղթա ՌՆԹ-ից ստանում է երկշղթա ԴՆԹ։ Եթե վիրուսը չունի ԴՆԹ-կախյալ ԴՆԹ-պոլիմերազային ակտիվություն, երկշղթա ԴՆԹ-ն սինթեզվում է տիրոջ ԴՆԹ-պոլիմերազ δ-ով, որը «շփոթում» է վիրուսային ԴՆԹ-ն սեփական բջջի դեռևս պրայմեր կապած ԴՆԹ-ի հատվածի հետ, և փոխարինում է ՌՆԹ-ն ԴՆԹ-ով։

Հակադարձ տրանսկրիպցիայի սխալ գործելու հավանականությունը բարձր է, որն էլ պայմանավորում է վիրուսների դիմակայունությունը դեղամիջոցների նկատմամբ։

Հակադարձ տրանսկրիպցիան ռետրովիրուսների մոտ 

Ռետրովիրուսները ՌՆԹ գենոմ պարունակող հակադարձ տրանսկրիպցիա իրականացնող վիրուսներ են, որոնք իրենց կրկնապատկման ցիկլում գործածում են նաև միջանկյալ ԴՆԹ։ Ռետրովիրուսներ են մարդու իմունային անբավարաության վիրուսը (ՄԻԱՎ), մարդու T լիմֆոտրոֆ վիրուսը (HTLV)։ Երկշղթա ԴՆԹ-ն գոյանում է ցիտոզոլում, և այդ գործընթացի հաջորդականությունը ներկայացված է սույն բաժնի պատկերում։

Երկշղթա ԴՆԹ-ի սինթեզի պրոցեսը ներառում է շղթայի տեղափոխում, որի ժամանակ ՌՆԹ-կախյալ ԴՆԹ-պոլիմերազը սինթեզում է ԴՆԹ, որը տրանսլոկացվում է գենոմի ակցեպտորային տեղամաս, որից հետո ԴՆԹ-կախյալ ԴՆԹ-պոլիմերազը վիրուսային ԴՆԹ-ի վրա սինթեզում է երկրորդ շղթան։

Ռետրովիրուսային ՌՆԹ-ի ընթերցման ուղղությունը 5' ծայրից դեպի 3' ծայրն է։ Պրոմոտերի հետ կապվող հատվածը կոչվում է պորոմոտեր կապող տեղամաս, որի 5' ծայրը կոչվում U5, իսկ 3' ծայրը՝ առաջնորդող ծայր։ Պրոմոտեր կապող տեղամասը ավելի մոտ է 5' ծայրին, սակայն հակադարձ տրանսկրիպցիան հարուցվում է 3' ծայրից 5'→3' ուղղությամբ (նոր սինթեզված ԴՆԹ-ի նկատմամբ)։ Այսպիսով, պրայմերը և հակադարձ տրանսկրիպտազը պետք է վերադասավորվեն դեպի 3' ծայր։ Այս գործընթացը իրականացնելու համար գործում են ԴՆԹ պոլիմերազը, ռիբոնուկլեազ H-ը և այլ ֆերմենտներ, տեղի է ունենում պոլինուկլեոտիդեների ապապարուրում և այլն։

ՄԻԱՎ-ի հակադարձ տրանսկրիպտազը ունի ռիբոնուկլեազային ակտիվութուն, որով այն քայքայում է վիրուսային ՌՆԹ-ն կԴՆԹ-ի սինթեզի ընթացքում, ինչպես նաև ԴՆԹ-կախյալ ԴՆԹ-պոլիմերազային ակտիվություն, որով իմաստային (սենս) կԴՆԹ-ի շղթայի վրա սինթեզվում է հակաիմաստային (անտիսենս) շղթան։ Այսպես գոյանում է երկշղթա միջանկյալ վիրուսային ԴՆԹ-ն (վԴՆԹ)։ ՄԻԱՎ-ի ՌՆԹ-ի կառուցվածքային տարրերը կարգավորում են հակադարձ տրանսկրիպցիայի ընթացքը։

Բջջային օրգանիզմներում 
Էուկարիոտ բջիջների գենոմի ինքնակրկնապատկվող տեսամասերը, որոնք կոչվում են ռետրոտրանսպոզոններ, վերադասավորվում են գենոմի մի տեղամասից մյուսը հակադարձ տրանսկրիպցիայի միջոցով՝ կիրառելով միջանկյալ ՌՆԹ մոլեկուլ։ Ռետրոտրանսպոզոնները առկա են բույսերի և կենդանիների գենոմներում։ Թելոմերազը մարդու և շատ այլ էուկարիոտների մոտ առկա մեկ այլ հակադարձ տրանսկրիպտազ է, որն ունի իր սեփական ՌՆԹ-ն։ Վերջինս կիրառվում է որպես կաղապար ԴՆԹ-ի կրկնապատման համար։

Հակադարձ տրանսկրիպտազի առկայությունը պրոկարիոտներում ուսումնասիրվել է դեռևս 1971 թվականին (Բելյանսկին և գործընկերները) Ֆրանսիայում և մի քանի տարի անց ԽՍՀՄ-ում (Ռոմաշչենկո 1977)։ Դրանք կոդավորովում են բակտերիալ գենոմի հատուկ հաջորդականություններով՝ ռետրոններով, որոնք կիրառվում են բազմապատճեն միաշղթա ԴՆԹ-ի սինթեզի մեջ։ ԴՆԹ-ի սինթեզը սկսվում է պրայմերով, որը բակտերիաներում սինթեզվում է կրկնապատկման ժամանակ։

Վալերիան Դոլյան պնդում է, որ վիրուսները, իրենց բազմազանության շնորհիվ, շատ կարևոր ներդրում են ունեցել բջջային կյանքի ձևավորման մեջ, և հակադարձ տրանսկրիպտազը կենտրոնական դեր է կատարել։

Կառուցվածք 
Հակադարձ տրանսկրիպտազը, ինչպես այլ վիրուսային նուկլեինաթթուների պոլիմերզները, նման է աջ ձեռքի։ Բացի պոլիմերազից, հակադարձ տրանսկրիպտազն ունի նաև ռիբոնուկլեազ H, որը քայքայելով ՌՆԹ կաղապարը՝ հնարավոր է դարձնում ԴՆԹ-ի մյուս շղթայի սինթեզը։ Քայքայման որոշ ֆրագմենտներ պրայմերի դեր են կատարում ԴՆԹ-պոլիմերազի համար (կա՛մ հակադարձ տրանսկրիպտազի, կա՛մ տեր բջջի)։

Կրկնապատկման ճշտություն 
Ռետրովիրուսի կենսական ցիկլում գործում են կրկնապատկման երեք տարբեր համակարգեր։ Առաջինը վիրուսային ՌՆԹ-ից կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի սինթեզն է հակադարձ տրանսկրիպտազով։ Երկրորդն արդեն իսկ տեր բջջի գենոմում ինտեգրված վիրուսային ԴՆԹ-ի կրկնապատկումն է տիրոջ ԴՆԹ-պոլիմերազով։ Երրորդը նախավիրուսային ԴՆԹ-ի տրանսկրիպցիան է ՌՆԹ պոլիմերազ II-ով և ՌՆԹ մոլեկուլի ստացումն է։ Այս ՌՆԹ-ն հետագայում «փաթեթավորվելու» է վիրիոններում։ Կրկնապատկման փուլերից մեկում կամ մի քանիսում հնարավոր է մուտացիաների առաջացումը։

Հակադարձ տրանսկրիպտազն ունի սխալ գործելու բարձր հավանականություն, քանի որ, ի տարբերություն այլ ԴՆԹ-պոլիմերազների, այն չունի սրբագրման հատկություն։ Սա հանգեցնում է մուտացիաների ավելի արագ կուտակման համեմատած կրկնապատման սրբագրվող փուլերի։ Promega-ի արտադրության կոմերցիոն օգտագործման հակադարձ տրանսկրիպտազների համար նշվում է սխալի հաճախականությունը, որը հավասար է 1:17,000-ի AMV-ի հակադարձ տրանսկրիպտազի և 1:30,000-ի M-MLV-ի հակադարձ տրանսկրիպտազի համար։

Միանուկլեոտիդային պոլիմորֆիզմներ գոյացնելուց բացի հակադարձ տրանսկրիպտազները դերակատարում ունեն հիբրիդային տրանսկրիպտների սինթեզի, էքզոնների նոր կոմբինացիաների ստեղծման և արհեստական հակաիմաստային (անտիսենս) տրանսկրիպտների սինթեզի մեջ։ Ենթադրվում է, որ հակադարձ տրանսկրիպտազի կաղապարի փոփոխման հատկությունը, որը հնարավոր է ուսումնասիրել միայն in vivo պայմաններում, հանդիսանում է մոդելային օրգանիզմների գենոմում հազարավոր չանոտացված տրանսկրիպտների հայտնաբերման պատճառը։

Կաղապարի փոփոխություն 
Ռետրովիրուսային յուրաքանչյուր մասնիկում տեղակայված են երկու ՌՆԹ գենոմներ, սակայն վարակումից հետո յուրաքանչյուր մասնիկ գոյացնում է միայն մեկ նախավիրուս (պրովիրուս)։ Վարակումից հետո հակադարձ տրանսկրիպցիան ուղեկցվում է հակադարձ տրանսկիրպտազի կաղապարների փոփոխությամբ (ռեկոմբինացիա)՝ մի գենոմից մյուսը։ Գոյություն ունեն երկու մոդելներ, որոնք բացատրում են այս երևույքը։ Առաջինը՝ հարկադրված ընտրության մոդելը, ենթադրում է, որ հակադարձ տրանսկրիպտազը փոխում է իր կաղապարը, երբ այն հանդիպում է խոչընդոտի, հետևաբար գենոմի անբողջականության պահպանման համար ռեկոմբինացիան պարտադիր է։ Երկրորդը՝ դինամիկ ընտրության մոդելը, ենթադրում է, որ կաղապարի փոփոխությունը տեղի է ունենում, երբ ռիբոնուկլեազային ակտիվության արագությունը չի համապատասխանում պոլիմերազային ակտիվության արագությանը, հետևաբար ռեկոմբինացիան տեղի է ունենում պատահականորեն և չի գործում ի պատասխան գենոմային վնասների։ Ռոսոնի և գործընկեների ուսումնասիրությունները հիմավորել է այս երկու մոդելները։ Յուրաքանչյուր ռեպլիկացիոն ցիկլի ընթացքում գենոմի փոփոխությունը տեղի է ունենում 5-14 անգամ։ Կաղապարի փոփոխությունը (ռեկոմբինացիան) անհրաժեշտ է գենոմի ամբողջականությունը պահպանելու համար և կարծես «փրկում» է վնասված գենոմը՝ նորոգելով այն։

Կիրառումներ

Հակավիրուսային դեղամիջոցներ 
Քանի որ ՄԻԱՎ-ը կրկնապատկում է իր գենոմը հակադարձ տրանսկրիպտազով և այդպես բազմանում ՝ գոյացնելով վիրուսային նոր մասնիկներ, ստեղծվել են յուրահատուկ դեղամիջոցներ, որոնք ընտրողաբար արգելակում են հակադարձ տրանսկրիցիան։ Այս դեղամիջոցները կոչվում են հակադարձ տրանսկրիպտազի արգելակիչներ, որոնցից են նուկլեոզիդների և նուկլեոտիդների անալոգ զիդովուդինը (առևտրային անվանումը Ռետրովիր), լամիվուդինը (առևտրային անվանումը Էպիվիր) և տենոֆովիրը (առևտրային անվանումը Վիրեադ), ինչպես նաև ոչ նուկլեոզիդային արգելակիչ նևիրապինը (առևտրային անվանումը Վիրամուն)։

Մոլեկուլային կենսաբանություն 
Հակադարձ տրանսկրիպտազը հնարավորություն է տալիս պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան կիրառել ՌՆԹ-ի համար (հակադարձ տրանսկրիպտազի կիրառումով պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա՝ ՀՏ-ՊՇՌ/RT-PCR)։ Դասական ՊՇՌ-ն կիրառվում է միայն ԴՆԹ-ի դեպքում, սակայն հակադարձ տրանսկրիպտազի օգնությամբ ՌՆԹ-ն տրանսկրիպտվում է ԴՆԹ-ի, այսպիսով հնարավոր դարձնելով ՌՆԹ մոլեկուլների ՊՇՌ անալիզը։ իՌՆԹ-ից կԴՆԹ-ի դարանների ստեղծման գործում նույնպես կիրառվում է հակադարձ տրանսկրիպտազը։ Շուկայում հակադարձ տրանսկրիպտազի հայտնվելը նպաստել է մոլեկուլային կենսաբանության զարգացմանը, հատկապես ՌՆԹ-ի կլոնավորման, սեքվենավորման և բնութագրման համար։

Տես նաև 

 ԴՆԹ-պոլիմերազ
 ՌՆԹ-պոլիմերազ
 Թելոմերազ

Ծանոթագրություններ

Արտաքին հղումներ 

 RNA+Transcriptase at the U.S. National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
 animation of reverse transcriptase action and three reverse transcriptase inhibitors
 Molecule of the month  (September 2002) at the RCSB PDB
 HIV Replication 3D Medical Animation. (Nov 2008). Video by Boehringer Ingelheim.
 
 Overview of all the structural information available in the PDB for UniProt: P03366 (Human immunodeficiency virus Reverse transcriptase) at the PDBe-KB.
 TWiV 904: 50 years of reverse transcriptase Vincent Racaniello travels to Cold Spring Harbor Laboratory to speak with David Baltimore, John Coffin (scientist), and Harold Varmus about the discovery in 1970 of retroviral reverse transcriptase and its impact on life sciences research.

Մոլեկուլային կենսաբանություն
Գենետիկա
Ֆերմենտներ
Վիրուսներ
Ամառային երիտասարդական վիքիճամբարի հոդվածներ