Սեքվենավորում

Գենետիկայի և կենսաքիմիայի մեջ սեքվենավորում (), չճյուղավորված կենսապոլիմերի առաջնային կառուցվածքի որոշում։ Սեքվենավորման արդյունքը սիմվոլիկ գծային պատկեր է, որը հայտնի է որպես հաջորդականություն, որը հակիրճ ամփոփում է տրված կենսապոլիմերի կառուցվածքի մեծ մասը ատոմային մակարդակում։

Կենսապոլիմերների (սպիտակուցներ, ԴՆԹ, և այլն) սեքվենավորումը՝ դրանց ամինաթթուների կամ նուկլեոտիդների հաջորդականության որոշումն է։ Սեքվենավորման արդյունքում ստացվում է գծային մակրոմոլեկուլների առաջնային կառուցվածքի նկարագրություն՝ մոնոմերների հաջորդականության տեսքով (տեքստի տեսքով)։ ԴՆԹ-ի հաջորդականացված հատվածների չափերը սովորաբար չեն գերազանցում 100 նուկլեոտիդային զույգը (հաջորդ սերնդի սեքվենավորում) և 1000 նուկլեոտիդային զույգը՝ սեքվենավորում ըստ Սենջերի։ ԴՆԹ-ի համընկնող հատվածների հաջորդականության արդյունքում ստացվում են գեների, ամբողջական գեների, ընդհանուր mRNA-ի կամ օրգանիզմների ամբողջական գենոմների հաջորդականությունները։

Սեքվենավորման համար օգտագործվում են Էդմանի, Սենջերի և այլոց մեթոդները. ներկայումս օգտագործվում է Սենջերի մեթոդը դիդեօքսինուկլեոզիդ տրիֆոսֆատներով (-ddNTP)։ Սովորաբար, նախքան սեքվենավորելը, կատարվում է ԴՆԹ-ի մի հատվածի ամպլիֆիկացիա, որի հաջորդականությունը որոշվում է ՊՇՌ-ի միջոցով։ Ամբողջական գենոմի հաջորդականացումը սովորաբար իրականացվում է նոր սերնդի հաջորդականացման տեխնոլոգիաների ( - next-generation sequencing) օգնությամբ։

ԴՆԹ- սեքվենավորում 

ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը դա ԴՆԹ-ի տվյալ հատվածի նուկլեոտիդների հաջորդականության որոշելու գործընթացն է։ Մինչ այժմ ԴՆԹ-ի սեքվենամորման մեծ մասն իրականացվել է Ֆրեդերիկ Սենջերի կողմից մշակված շղթայի բաժանման մեթոդի միջոցով։ Այս տեխնիկան օգտագործում է ԴՆԹ-ի սինթեզի ռեակցիայի հաջորդականության հատուկ ավարտ՝ օգտագործելով փոփոխված նուկլեոտիդային սուբստրատներ։ Այնուամենայնիվ, սեքվենավորման նոր տեխնոլոգիաները, ինչպիսիք են պիրոսեկվենավորում, գրավում են սեքվենավորման շուկայի աճող մեծ մասը։ Ներկայումս ավելի շատ գենոմի տվյալներ են արտադրվում պիրոսեկվենավորման միջոցով, քան Սենջերի-ի մեթոդի միջոցով։ Պիրոսեկվենավորումը հնարավոր դարձրեց գենոմի հաջորդականության ավելի արագ բացահայտելը։

ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը կոդավորում է կենդանի էակների գոյատևման և վերարտադրության համար անհրաժեշտ տեղեկատվությունը։ Հաջորդականության սահմանումը օգտակար է ֆունդամենտալ հետազոտություններում, թե ինչու և ինչպես են ապրում օրգանիզմները, ինչպես նաև կիրառական այլ հարցերում։ Կենդանի էակների համար ԴՆԹ-ի հիմնական նշանակության պատճառով ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները իմանալը օգտակար է կենսաբանական հետազոտությունների գրեթե ցանկացած ոլորտում։ Օրինակ, Բժշկության մեջ, այն կարող է օգտագործվել գենետիկական հիվանդությունների հայտնաբերման, ախտորոշման և, հնարավոր է, անհատական բուժման մշակման համար։ Այդպես, պաթոգենների հետազոտությունը կարող է հանգեցնել վարակիչ հիվանդությունների բուժման։ Կենսատեխնոլոգիան զարգացող ոլորտ է՝ բազմաթիվ օգտակար ապրանքների և ծառայությունների ներուժով։

Կարլսոնի կորը տերմին է, որը ստեղծվել է The Economist-ի կողմից՝ Մուրի օրենքի կենսատեխնոլոգիական համարժեքը նկարագրելու համար և անվանվել է հեղինակ Ռոբ Կարլսոնի անունով։ Կառլսոնը ճշգրիտ կանխատեսեց, որ ԴՆԹ-ի սեքվենավորման տեխնոլոգիաների կրկնապատկման ժամանակը (չափվում է արժեքով և կատարողականությամբ) կլինի առնվազն նույնքան արագ, որքան Մուրի օրենքը։ Կարլսոնի կորերը ցույց են տալիս ծախսերի արագ նվազում և տարբեր տեխնոլոգիաների արտադրողականության բարձրացում, ներառյալ ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը, ԴՆԹ-ի սինթեզը և մի շարք ֆիզիկական և հաշվողական գործիքներ, որոնք օգտագործվում են սպիտակուցային կառուցվածքների որոշում համար ։

Սեքվենավորում ըստ Սենջերի 

Շղթայի տերմինատորի սեքվենավորման ժամանակ () երկարացումը սկսվում է ԴՆԹ-ի կաղապարի որոշակի հատվածում ՝ օգտագործելով կարճ օլիգոնուկլեոտիդային պրայմեր այդ հատվածին կոմպլեմենտար մատրիցա։ Օլիգոնուկլեոտիդային պրայմերը երկարացվում է ԴՆԹ-պոլիմերազի միջոցով՝ ֆերմենտ, որը կրկնօրինակում է ԴՆԹ-ն։ Պրայմերը և ԴՆԹ-պոլիմերազը ներառում են չորս դեզօքսինուկլեոտիդային հիմքեր (ԴՆԹ-ի կառուցվածքային բլոկներ), ինչպես նաև ավարտական շարքը նուկլեոտիդի ցածր կոնցենտրացիան (առավել հաճախ՝ դի-դեզօքսինուկլեոտիդ)։ Այն չունի ռիբոզային մոլեկուլի ինչպես 2', այնպես էլ 3' դիրքում գտնվող OH խումբ, այնպես որ, երբ դրանք տեղադրվեն ԴՆԹ մոլեկուլ, դրանք կանխում են դրա հետագա երկարացումը։ Այս սեքվենատորի մեջ օգտագործվում են չորս տարբեր անոթներ, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է ընդամենը չորս դիդեօքսիռիբոնուկլեոտիդներ՝ ԴՆԹ պոլիմերազի կողմից շղթան ավարտող նուկլեոտիդների պատահական դիրքի ներառումը հանգեցնում է տարբեր չափերի մի շարք հարակից ԴՆԹ բեկորների, որոնք ավարտվում են տվյալ դիդեօքսիռիբոնուկլեոտիդով։ Այնուհետև հատվածները բաժանվում են ըստ չափի ՝ օգտագործելով էլեկտրոֆորեզը։

Պրայմերի պիտակավորման այլընտրանքը տերմինատորների պիտակավորումն է, փոխարենը, որը սովորաբար կոչվում է «ներկերի տերմինատորի սեքվենավորում»։ Այս մեթոդի հիմնական առավելությունն այն է, որ սեքվենավորման ամբողջական փաթեթը կարող է կատարվել մեկ ռեակցիայով, այլ ոչ թե չորսի, որոնք անհրաժեշտ են պիտակավորված պրայմերով մոտեցման համար։ Դա ձեռք է բերվում դիդեօքսինուկլեոտիդային վերջավոր շղթաներից յուրաքանչյուրը պիտակավորելով առանձին լումինեսցենտ ներկով, որը լուսավորում է տարբեր ալիքի երկարություններում։ Այս մեթոդը ավելի պարզ և արագ է, քան ներկերի պրայմերի մոտեցումը, բայց կարող է հանգեցնել տվյալների ավելի անհավասար ծայրերի (տարբեր բարձրությունների)՝ ներկերի շղթայի մեծ վերջավորիչների ներառման օրինաչափությունից կախված տարբերության պատճառով։ Այս խնդիրը զգալիորեն կրճատվել է նոր ֆերմենտների և ներկերի ներդրմամբ, որոնք նվազագույնի են հասցնում ներառման փոփոխականությունը։ Այս մեթոդը ներկայումս օգտագործվում է սեքվենավորման ռեակցիաների ճնշող մեծամասնության համար, քանի որ այն և՛ ավելի պարզ է, և՛ ավելի մատչելի։ Դրա հիմնական պատճառն այն է, որ պրայմերները պարտադիր չէ, որ առանձին պիտակավորվեն (ինչը կարող է զգալի ծախս լինել մեկանգամյա օգտագործման պրայմերի համար), թեև դա ավելի քիչ կարևոր է սովորաբար օգտագործվող "Ունիվերսալ" պրայմերների համար։

Պիրոսեկվենավորում 
Պիրոսեկվենացման մեթոդը հիմնված է նուկլեոտիդի ներառման ժամանակ պիրոֆոսֆատի արտազատման հայտնաբերման վրա։ Պիրոսեկվենավորում կատարելուց առաջ հաջորդականության համար ԴՆԹ-ի շարանը պետք է ամպլիֆիկացնել ՊՇՌ-ով։ Այնուհետև ընտրվում է այն կարգը, որով նուկլեոտիդները պետք է ավելացվեն սեքվենատոր (այսինքն ՝ G-A-T-C): Հատուկ նուկլեոտիդ ավելացնելիս, եթե ԴՆԹ պոլիմերազը այն ներառում է աճող շղթայի մեջ, պիրոֆոսֆատը ազատվում է և վերածվում ԱԵՖ-ի ՝ ԱԵՖ սուլֆուրիլազով։ ԱԵՖ-ն ակտիվացնում է լյուցիֆերազի օքսիդացումը լյուցիֆերազի միջոցով; այս ռեակցիան առաջացնում է լուսային ազդանշան, որը գրանցվում է որպես պիրոգրամի գագաթ։ Այսպիսով, նուկլեոտիդի ներառումը փոխկապակցված է ազդանշանի հետ։ Լույսի ազդանշանը համաչափ է ԴՆԹ-ի շղթայի սինթեզի ընթացքում ներառված նուկլեոտիդների քանակին (այսինքն՝ ներառված երկու նուկլեոտիդները համապատասխանում են պիրոգրամի երկու գագաթներին)։ Երբ ավելացված նուկլեոտիդները ներառված չեն ԴՆԹ-ի մոլեկուլում, ազդանշանը չի գրանցվում. ապիրազ ֆերմենտը հեռացնում է ռեակցիայի մեջ մնացած ցանկացած չներառված նուկլեոտիդ։ Այս մեթոդը չի պահանջում ոչ լյումինեսցենտ պիտակավորված նուկլեոտիդներ, ոչ էլ գել էլեկտրոֆորեզ։

ՌՆԹ- սեքվենավորում 

ՌՆԹ-ն ավելի քիչ կայուն է բջիջում, ինչպես նաև ավելի հակված է փորձարարական նուկլեազի հարձակմանը։ Քանի որ ՌՆԹ-ն առաջանում է ԴՆԹ-ից արտագրման միջոցով, տեղեկատվությունն արդեն առկա է բջջի ԴՆԹ-ում։ Այնուամենայնիվ, երբեմն ցանկալի է սեքվենավորել ՌՆԹ մոլեկուլները։ Մինչ ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը տալիս է օրգանիզմի գենետիկական պրոֆիլը, ՌՆԹ-ի սեքվենավորումը արտացոլում է միայն այն հաջորդականությունները, որոնք ակտիվորեն արտահայտվում են բջիջներում։ ՌՆԹ-ի սեքվենավորման համար սովորական մեթոդը նախ բաղկացած է նմուշից մեկուսացված ՌՆԹ-ի հակադարձ արտագրումից։ Այնուհետև այն կարող է սեքվենավորվել, ինչպես նկարագրված է վերևում։ Բջիջներում արտահայտված ՌՆԹ-ի հիմնական մասը ռիբոսոմային ՌՆԹ-ներն են կամ միկրո ՌՆԹ-ները, որոնք վնասակար են բջջայի տրանսլացիայի համար, բայց հաճախ հետազոտության առարկա չեն։ Այնուամենայնիվ, այս հատվածը կարող է հեռացվել in vitro եղանակով։ Էկզոններից ստացված այս mRNA-ները հետագայում պետք է վերածվեն սպիտակուցների, որոնք աջակցում են բջջային հատուկ գործառույթներին։ Այսպիսով, արտահայտման պրոֆիլը ցույց է տալիս բջջային գործունեությունը, ինչը հատկապես ցանկալի է հիվանդությունների, բջջային վարքի, ռեակտիվների կամ գրգռիչների նկատմամբ ռեակցիաների ուսումնասիրության ժամանակ։ Էուկարիոտիկ ՌՆԹ-ի մոլեկուլները պարտադիր չէ, որ գծային լինեն իրենց ԴՆԹ կաղապարի նկատմամբ, քանի որ ինտրոնները կտրվում են։ Սա ստեղծում է որոշակի բարդություն ընթերցված հաջորդականությունները գենոմի հետ համընկնելու և դրանով իսկ որոշելու դրանց ծագումը։ Սա նշանակում է, որ գենոմի հաջորդականությունները պետք է համընկնեն գենի հետ։

Սպիտակուցի սեքվենավորում 

Սպիտակուցների սեքվենավորման եղանակները ներառում են․

 Էդմանի Դեգրադացիան
 Պեպտիդների զանգվածային Մատնահետքեր
 Զանգվածային սպեկտրոմետրիա
 Պրոտեազի մարսում
Եթե հայտնի է սպիտակուցը կոդավորող գենը, ներկայումս շատ ավելի հեշտ է ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը և որոշել սպիտակուցի հաջորդականությունը։ Վերոնշյալ մեթոդներից մեկի կողմից սպիտակուցի ամինաթթուների հաջորդականության մի մասի որոշումը (հաճախ մեկ ծայրը) կարող է բավարար լինել տվյալ գենը կրող հաջորդականությունը հայտնաբերելու համար։

Պոլիսախարիդների սեքվենավորում

Չնայած պոլիսախարիդները նույնպես կենսապոլիմերներ են, բայց պոլիսախարիդի սեքվենավորման մասին այդքան էլ հաճախ չի խոսվում մի քանի պատճառներով։ Չնայած շատ պոլիսախարիդներ գծային են, շատերն ունեն ճյուղեր։ Կարելի է օգտագործել բազմաթիվ տարբեր հղումներ (առանձին մոնոսախարիդներ) և դրանք կապել տարբեր ձևերով։ Այնուամենայնիվ, հիմնական տեսական պատճառն այն է, որ մինչ այստեղ թվարկված մյուս պոլիմերները հիմնականում ձևավորվում են "մատրիցայից կախված" եղանակով մեկ պրոցեսիոն ֆերմենտի միջոցով, պոլիսախարիդի յուրաքանչյուր առանձին միացություն կարող է ձևավորվել մեկ այլ ֆերմենտի կողմից։ Այսպիսով, պոլիսախարիդը կարող է ձևավորվել մեկ այլ ֆերմենտի միջոցով։ Շատ դեպքերում միացումը միանշանակ սահմանված չէ; կախված նրանից, թե որ ֆերմենտն է գործում, կարող է ներառվել մի քանի տարբեր միավորներից մեկը։ Սա կարող է հանգեցնել նմանատիպ մոլեկուլների ընտանիքի ձևավորմանը։ Սա հատկապես ճիշտ է բուսական պոլիսախարիդների համար։ Օլիգոսախարիդների և պոլիսախարիդների կառուցվածքի որոշման մեթոդները ներառում են NMR սպեկտրոսկոպիա և մեթիլացման վերլուծություն։

Ծանոթագրություններ

Արտաքին հղումներ 
 https://www.nature.com/subjects/sequencing

Մոլեկուլային կենսաբանություն
Գենետիկա
Մոլեկուլային կենսաբանության մեթոդներ
Կենսաինֆորմատիկա