واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز  که مخفف آن پی‌سی‌آر است، فنی در زیست‌شناسی مولکولی برای تکثیر یک نسخهٔ منفرد یا نسخه‌های کمی از یک قطعه دی‌اِن‌اِی با توالی خاص، به‌شمار هزار یا میلیون‌ها نسخه است. این فن ابزاری آسان و ارزان‌قیمت برای تکثیر یک تکهٔ خاص از دی‌اِن‌اِی است و برای اهدافی همچون تشخیص و نظارت بر بیماری‌های ژنتیکی، شناسایی مجرمان (در زمینهٔ پزشکی قانونی) و مطالعهٔ کارکرد یک بخش هدف از دی‌اِن‌اِی به‌کار می‌رود.

کلیات 
این فن در سال ۱۹۸۳ توسط کری مالیس ابداع شد. هم‌اکنون پی‌سی‌آر یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاه‌های بالینی و آزمایشگاه‌های پژوهشی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد. این کاربردها شامل کلون‌کردن دی‌اِن‌اِی برای توالی‌یابی، فیلوژنی بر پایهٔ دی‌اِن‌اِی، تحلیل کارکرد ژن‌ها، تشخیص بیماری‌های ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل بیماری‌زا در آزمایش‌های نوکلئیک اسید برای تشخیص بیماری‌های عفونی است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت جایزهٔ نوبل شیمی را برای کار روی پی‌سی‌آر دریافت کردند.

اساس فن پی‌سی‌آر چرخه‌های دمایی است. این چرخه‌ها شامل چرخه‌های گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب دی‌اِن‌اِی و تکثیر آنزیمی دی‌اِن‌اِی است. پرایمرها (قطعات کوتاه دی‌اِن‌اِی) که دارای توالی مکمل ناحیهٔ هدف‌اند به همراه یک دی‌ان‌ای پلیمراز، اجزای اصلی واکنش پی‌سی‌آر برای انتخاب و تکثیر قطعهٔ مورد نظر را تشکیل می‌دهند. در فرایند پی‌سی‌آر الگوی دی‌اِن‌اِی به صورت لگاریتمی تکثیر می‌شود و دی‌اِن‌اِی تکثیرشده خود به‌عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده می‌شود. پی‌سی‌آر می‌تواند به شکل گسترده‌ای برای انجام مراحل مختلف در دستکاری‌های ژنتیکی استفاده شود.

تقریباً در همهٔ کاربردهای پی‌سی‌آر از یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز مقاوم به حرارت مانند تک پلیمراز (آنزیمی که از باکتری ترموس آکواتیکوس جداسازی شده) استفاده می‌شود. این دی‌اِن‌اِی پلیمراز از یک دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک پرایمرها و با به‌کارگیری نوکلئوتیدها که بلوک‌های ساختاری دی‌اِن‌اِی هستند، یک رشته دی‌اِن‌اِی جدید می‌سازد. در بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر از چرخه‌های دمایی یعنی گرم و سردکردن متناوب نمونه‌های پی‌سی‌آر بنابر مراحل دمایی مشخص استفاده می‌شود.

در مرحلهٔ نخست، دو رشتهٔ مارپیچ دی‌اِن‌اِی دورشته‌ای در یک دمای بالا، در فرایندی که ذوب دی‌اِن‌اِی نامیده می‌شود از یکدیگر جدا می‌شوند. در مرحلهٔ دوم، دما پایین آورده شده و هریک از دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی به عنوان الگو عمل می‌کنند. ساخته شدن رشتهٔ جدید از روی الگو توسط دی‌اِن‌اِی پلیمراز انجام می‌شود. پرایمرها بر اساس توالی قطعه‌ای از دی‌اِن‌اِی که موردنظر است، طراحی می‌شوند.

اصول واکنش پی‌سی‌آر 
پی‌سی‌آر یک ناحیهٔ خاص از رشتهٔ دی‌اِن‌اِی هدف را تکثیر می‌کند. به‌طور معمول بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر این قابلیت را دارند تا قطعات دی‌اِن‌اِی بین ۱/۰ و ۱۰ کیلوجفت‌باز (kbp) را تکثیر کنند. هرچند فنون دیگر می‌توانند قطعاتی با اندازه‌های بالاتر از ۴۰ کیلوجفت باز را نیز تکثیر کنند. مقدار تکثیر محصول توسط سوبسترای موجود در واکنش که پیشرفت واکنش را محدود می‌کند تعیین می‌شود.

یک واکنش پی‌سی‌آر پایه‌ای نیازمند چندین جزء است. این اجزاء شامل موارد زیر است:
 دی‌اِن‌اِی الگو که دارای ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر است.
 تک پلیمراز که یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز مقاوم به گرما است.
 دو پرایمر دی‌اِن‌اِی که مکمل انتهای ۳’ رشته‌های سنس و آنتی‌سنس دی‌اِن‌اِی الگو هستند (بدون پرایمرها، جایگاه آغاز دورشته‌ای که دی‌اِن‌اِی پلیمراز بتواند به آن متصل شود شناخته نمی‌شود). پرایمرهای خاصی که مکمل دی‌اِن‌اِی هدف هستند از قبل انتخاب شده و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته یا از تأمین‌کنندگان خریداری می‌شوند.
 دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوک‌های ساختاری هستند که دی‌اِن‌اِی پلیمراز با استفاده از آن‌ها رشته‌های جدید را می‌سازد.
 یک محلول بافری که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری دی‌اِن‌اِی پلیمراز فراهم می‌کند.
 کاتیون‌های دوظرفیتی مانند منیزیم (Mg) یا منگنز (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداول‌تر است. همچنین کاتیون Mn2+ می‌تواند برای جهش‌زایی دی‌اِن‌اِی حاصل از پی‌سی‌آر استفاده شود و غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش می‌دهد.
 کاتیون‌های تک‌ظرفیتی، معمولاً یون‌های پتاسیم (K)
 بافر 10X
واکنش معمولاً در حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله‌های کوچک واکنش (با حجم ۲/۰–۵/۰ میلی‌لیتر) و در یک چرخهٔ حرارتی انجام می‌شود. چرخه‌های حرارتی لوله‌های واکنش را به منظور فراهم کردن دمای لازم در هر مرحله سرد و گرم می‌کنند. بسیاری از چرخه‌های حرارتی پیشرفته از اثر پلتیر (Peltier effect) که اجازهٔ گرم و سردکردن لوله‌های پی‌سی‌آر را به‌وسیلهٔ معکوس کردن جریان الکتریکی می‌دهد؛ استفاده می‌کنند.

روش 
به‌طور کلی پی‌سی‌آر شامل مجموعه‌ای از ۴۰–۲۰ بار تغییر دمایی تکرارشونده به نام سیکل است که هر سیکل به‌طور متداولً از دو یا سه مرحلهٔ دمایی مستقل تشکیل شده‌است. مراحل مشترک بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر عبارت است از:

 آغاز: این مرحله برای دی‌اِن‌اِی پلیمرازی که نیازمند فعال‌سازی گرمایی توسط Hot-start PCR است لازم است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا دمای ۹۶–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۵–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) یا ۹۸ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸ درجهٔ فارنهایت) برای پلیمرازهای بسیار مقاوم به حرارت است. این مرحله ۱۰–۱ دقیقه به طول می‌انجامد.
 دناتوراسیون: این مرحله نخستین مرحلهٔ سیکل است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا ۹۸–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۳۰–۲۰ ثانیه می‌شود که به‌وسیلهٔ شکستن پیوندهای دورشته‌ای بین بازهای مکمل باعث ذوب شدن یا دناتوراسیون دی‌اِن‌اِی الگوی دورشته‌ای شده و به این ترتیب دو مولکول دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای حاصل می‌شود.
 اتصال: در این مرحله دمای واکنش به مدت ۴۰–۲۰ ثانیه به ۶۵–۵۰ درجهٔ سانتی‌گراد کاهش می‌یابد که باعث می‌شود پرایمرها به هریک از الگوهای تک‌رشتهً دی‌اِن‌اِی متصل شوند. اتصال معمولاً حدود ۵–۳ درجهٔ سانتی‌گراد زیر دمای ذوب (Tm پرایمرها انجام می‌شود. در طول این فرایند دی‌اِن‌اِی پلیمراز به ترکیبی از الگو و پرایمر متصل و شروع به ایجاد رشته‌های جدید می‌کند).
 گسترش/ طویل شدن: در این مرحله دما برای عملکرد دی‌اِن‌اِی پلیمراز لازم است؛ دمای بهینهٔ یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز ۸۰–۷۵ درجهٔ سانتی‌گراد است. با این وجود معمولاً دمای ۷۲ درجهٔ سانتی‌گراد برای این آنزیم استفاده می‌شود. در این مرحله دی‌اِن‌اِی پلیمراز یک رشتهٔ دی‌اِن‌اِی جدید که مکمل رشتهٔ الگو است را در جهت ’۵ به ’۳ سنتز می‌کند. زمان لازم برای افزایش طول بستگی به دی‌اِن‌اِی پلیمراز استفاده‌شده و طول ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر دارد.
فرایندهای دناتوراسیون، اتصال و طویل شدن، یک سیکل را تشکیل می‌دهند. برای تکثیر دی‌اِن‌اِیِ هدف تا میلیون‌ها نسخه، سیکل‌های متعددی نیاز است.
 طویل شدن نهایی: این تک‌مرحله اختیاری است و پس از آخرین سیکل پی‌سی‌آر برای اطمینان از طویل شدن کامل هر تک‌رشتهٔ دی‌اِن‌اِی در یک دمای ۷۴–۷۰ درجهٔ سانتی‌گراد (۱۶۵–۱۵۸ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۱۵–۵ دقیقه انجام می‌شود.
 نگهداری نهایی: مرحلهٔ نهایی سرد کردن محفظهٔ واکنش تا ۱۵–۴ درجهٔ سانتی‌گراد برای یک زمان نامحدود است و ممکن است این مرحله برای ذخیره‌سازی کوتاه‌مدت محصولات پی‌سی‌آر استفاده شود.

به منظور بررسی میزان موفقیت پی‌سی‌آر انجام‌شده، از الکتروفورز بر روی ژل (به منظور جداسازی محصولات پی‌سی‌آر و بررسی اندازهٔ قطعات، استفاده می‌شود).

در طراحی پرایمر برای واکنش پی‌سی‌آر باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلاً حتماً بخش ۳' از پرایمر می‌بایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش ۵' الزامی نیست. همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر، حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی‌های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آن‌ها تا حد معمول استفاده نشود. معمولاً از گرم‌کردن و سردکردن مخلوط واکنش برای جدا شدن دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی و چسبیدن آغازگرها یا Annealing استفاده می‌شود. در نتیجهٔ این چرخه‌ها میلیون‌ها نسخه از قطعهٔ کوتاهی از دی‌اِن‌اِی تولید می‌شود.

روش‌های پی‌سی‌آر 

 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ (Realtime PCR) یا (qPCR)

 تاچ‌داون پی‌سی‌آر (Touchdown)
 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس (Reverse Transcription-PCR) یا (RT- PCR)
 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز نامتقارن(Asymmetric PCR)
 پی‌سی‌آر AFLP
 پی‌سی‌آر In-silico
 پی‌سی‌آر آشیانه (Nested)
 پی‌سی‌آر ویژه آلل (Allele specific PCR) یا (Tetra-primer ARMS PCR)
 پی‌سی‌آر کلونی (Colony PCR)
 پی‌سی‌آر دژنره (Degenerate PCR)
 پی‌سی‌آر هات استارت (Hotstart PCR)
 پی‌سی‌آر معکوس (Inverse PCR)
 پی‌سی‌آر مینی پرایمر (Miniprimer PCR)
 پی‌سی‌آر چندگانه (Multiplex PCR)
 پی‌سی‌آر Alu
 پی‌سی‌آر Assembly
 پی‌سی‌آر ISSR
 پی‌سی‌آر LATE
 پی‌سی‌آر Long Range
 پی‌سی‌آر Methylation-specific
 پی‌سی‌آر rep
 پی‌سی‌آر ARMS
 پی‌سی‌آر Core sample
 پی‌سی‌آر Dial-out
 پی‌سی‌آر Digital
 پی‌سی‌آر Droplet Digital
 پی‌سی‌آر Ligation-mediated
 پی‌سی‌آر Suicide
 پی‌سی‌آر Helicase-dependent amplification
 پی‌سی‌آر Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
 پی‌سی‌آر TAIL
 پی‌سی‌آر High Fidelity
 پی‌سی‌آر GC-Rich
 پی‌سی‌آر Nano
 پی‌سی‌آر فاز جامد (SP-PCR)

جستارهای وابسته 
 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ
 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس

منابع 

واکنش زنجیره پلیمراز (PCR) و مکانیسم آن. کتاب دانش سال راه رشد سامان میسمی.

پیوندها 
 آموزش PCR

ویکی‌پدیای انگلیسی
 آنزیم پی‌سی‌آر امپلیکن 

اختراع‌های آمریکایی
تقویت‌کننده‌ها
تکنیک‌های آزمایشگاهی
زیست‌شناسی مولکولی
زیست‌شناسی
زیست‌فناوری در ۱۹۸۳ (میلادی)
زیست‌فناوری
ژنتیک مولکولی
ژنتیک
فنون زیست‌شناسی مولکولی
معرفی‌شده‌های ۱۹۸۳ (میلادی)
واکنش زنجیره پلیمراز
هوفمان-لا روش