Serie Generale n. 14 del 19-1-1993
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 13 gennaio 1993
Metodi di analisi per la valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione delle acque minerali naturali e modalita' per i relativi prelevamenti dei campioni. (GU Serie Generale n.14 del 19-01-1993)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto il decreto legislativo 25 gennaio 1992, n. 105, recante
disposizioni per l'attuazione della direttiva n. 80/777/CEE relativa
alla utilizzazione e alla commercializzazione delle acque minerali
naturali.
Visto in particolare l'art. 2, terzo comma, del citato decreto n.
105, che, ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali,
prevede l'emanazione di norme concernenti i metodi di analisi per la
valutazione delle caratteristiche microbiologiche e di composizione
delle acque minerali stesse e le modalità per i relativi
prelevamenti di campioni.
Visto l'art. 34 del regio decreto 28 settembre 1919, n. 1924.
Visto l'art. 6, lettera t), della legge 23 dicembre 1978, n. 833.
Visti gli articoli 1 e 3 del D.C.G. 7 novembre 1939, n. 1856.
Sentito il parere del Consiglio superiore di sanità in data 24
giugno 1992.
Decreta:
Art. 1.

Ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali, le
analisi microbiologiche debbono essere eseguite secondo le seguenti
modalita':
1) Carica microbica.
Seminare in Plate Count Agar (tecnica agar germi) aliquote da 1 ml
del campione in quattro piastre di Petri. Incubare due piastre a 37
C (Più o Meno) 1 per 24h (Più o Meno) 2h e due piastre a 20 C
(Più o Meno) 1 per 72h (Più o Meno) 2h. Procedere alla conta delle
colonie.
2) Coliformi in 250 ml:
A) Metodo con terreno liquido. Seminare due beute provviste di
campanula, contenenti ml 125 di brodo lattosato a tripla
concentrazione, rispettivamente con ml 250 del campione. Incubare a
37 C (Più o Meno) 1 per 48h (Più o Meno) 2h. Le beute positive
(torbidità e presenza di gas) debbono essere sottoposte a subcolture
in brodo lattosato-bile verde brillante da incubare a 37 C (Più o
Meno) 1 per 48h (Più o Meno) 2h ed a 44 C (Più o Meno) 0,5 per
48h (Più o Meno) 2h. Dalle colture positive procedere 2h ed a 44 C
(Più o Meno) 0,5 per 48h (Più o Meno) 2h. Dalle colture positive
procedere all'isolamento su agar Mac Conkey e alle prove biochimiche
di conferma (H2S, indolo, ornitina decarbossilasi).
B) Metodo con membrane filtranti. Filtrare due aliquote di 250 ml
ciascuna di campione attraverso membrane filtranti (0.45u). Porre le
due membrane, rispettivamente, su piastre di "agar lattosato al
tergitolo 7" da incubare a 36 C (Più o Meno) 1 per 24h (Più o
Meno) 2h e di "agar lattosato al tergitolo 7 + cloruro di
trifeniltetrazolio" da incubare a 44 C (Più o Meno) 0,5 per 24h
(Più o Meno) 2h. Prelevare le colonie gialle su AT7 e quelle dal
giallo al rosso su AT7 + TTC e seminarle in brodo lattosato-bile
verde brillante da incubare rispettivamente a 36 C (Più o Meno) 1
per 48h (Più o Meno) 2h e a 44 C (Più o Meno) 0,5 per 48h (Più o
Meno) 2h. Dalle colture positive procedere alle prove di conferma
come per il metodo in terreno liquido.
3) Streptococchi fecali in 250 ml:
A) Metodo con terreno liquido. Seminare 2 beute contenenti ml 125
di brodo glucosio-azide a tripla concentrazione rispettivamente con
ml 250 del campione. Incubare a 37 C (Più o Meno) 1 per 48h (Più
o Meno) 2h. Le beute positive (intorbidamento del terreno) debbono
essere sottoposte alle prove di conferma mediante striscio in agar
bile esculina-azide. Inbubare a 44 C (Più o Meno) 0,5 per 44h
(Più o Meno) 4h. Considerare positive le colonie nere catalasi nega-
tive.
B) Metodo con membrane filtranti. Filtrare due aliquote di 250 ml
ciascuna del campione attraverso membrane filtranti. Porre le due
membrane, rispettivamente, su due piastre di "KF streptococcus agar"
da incubare a 37 C (Più o Meno) 1 per 44h (Più o Meno) 4h.
Sottoporre le colonie sospette, rosse o rosa, alle prove di conferma
come per il metodo in terreno liquido.
4) Spore di clostridi solfito-riduttori in 50 ml.
Riscaldare ml 50 del campione a 80 C per 10 minuti. Raffreddare
rapidamente e filtrare per membrana. Porre la membrana su agar SPS
ricoprendo con altri 10 ml di SPS a 45 C. Incubare a 37 C (Più o
Meno) 1 per 24h (Più o Meno) 1h in giare per anaerobiosi. La prova
viene considerata positiva quando si sviluppano colonie nere.
Identificazione presuntiva di Cl. perfrigens.
Prelevare le colonie sospette (nere) e seminarle in tubi contenenti
brodo tioglicollato previamente riscaldato a 100 C per 10 minuti e
rapidamente raffreddato. Incubare a 37 C (Più o Meno) 1 per 24h
(Più o Meno) 2h ed eseguire subcolture in:
agar nutritivo a becco di clarino, da incubare a 37 C (Più o
Meno) 1 per 24h (Più o Meno) 2h in giare per anaerobiosi, per
verificare la negatività della catalisi;
provetta di latte tornasolato ricoperto con ml 2 di vaselina, da
incubare a 37 C (Più o Meno) 1 per 24-48h, per verificare
l'acidificazione e la formazione di coagulo frammentato.
5) Pseudomonas aeruginosa in 250 ml.
Filtrare ml 250 del campione e porre la membrana su agar-cetrimide.
Incubare a 37 C (Più o Meno) 1 per 48h (Più o Meno) 2h. Prelevare
le colonie sospette (verdi-bluastre e/o fluorescenti agli UV) e
trasferirle su nutrient agar a becco di clarino. Incubare a 42 C
(Più o Meno) 0,5 per 48h (Più o Meno) 2h. Dalla patina procedere:
alla verifica della positività della ossidasi su cartine alla
bimetil-p-fenilendiamina;
alla identificazione mediante "galleria" di test biochimici (API
20 NE o equivalenti).
Nei casi dubbi eseguire anche:
l'evidenziazione della produzione di piocianina a 30 C in terreno
di King A;
la prova di crescita in Nutrient broth in b.m. a 42 C (ripetuta
tre volte);
il test di ossidazione del glucosio a 37 C (Terreno al blu di
bromotimolo).
6) Staphilococcus aureus in 250 ml.
Filtrare ml 250 del campione e porre la membrana su Baird-Parker
agar. Incubare a 37 C (Più o Meno) 1 per 24h (Più o Meno) 2h.
Prelevare le colonie sospette (nere, generalmente con alone) e
seminarle in Brain-Heart infusion broth. Incubare a 37 C (Più o
Meno) 1 per 24h (Più o Meno) 2h. Dalla brodocoltura eseguire:
preparato microscopico previa colorazione di Gram;
semina in profondità in provetta di agar di Mossel e Martin per
evidenziare il tipo respiratorio;
test della coagulasi.

Art. 2.

Ai fini del riconoscimento delle acque minerali naturali, le
analisi chimiche e fisico chimiche debbono essere eseguite secondo i
seguenti metodi di misura:

1) Residuo fisso a 180 C Metodo gravimetrico
2) Ossidabilità Digestione al permanganato di potassio
3) Anidride carbonica Titrimetria a pH 3,8 con indicatore o
potenziometro
4) Silice Spettrofotometria di assorbimento
molecolare
5) Bicarbonati Titolazione con pHmetro
6) Cloruri Titrimetria con indicatore o
potenziometro
Titrimetria con nitrato di mercurio
Volumetria sec. Mohr
7) Solfati Gravimetria con cloruro di bario
Metodo turbidrimetrico
8) Sodio Spettrofotometria di assorbimento
atomico o di emissione
9) Potassio Spettrofotometria di assorbimento
atomico o di emissione
10) Calcio Spettrofotometria di assorbimento
atomico
Titrimetria con EDTA
11) Magnesio Spettrofotometria di assorbimento
atomico
Titrimetria con EDTA
12) Ferro disciolto Spettrofotometria di assorbimento
atomico
Spettrofotometria di assorbimento
molecolare con l'1-1 o. fenantrolina
13) Fluoro Determinazione con elettrodo specifico
Spettrofotometria molecolare del
complesso alizarina-lantanio o con
alizarina-zirconio
14) Azoto ammoniacale Spettrofotometria di assorbimento
molecolare con indofenolo o reattivo d
Nessler
(se necessario dopo distillazione)
15) Fosforo totale Spettrofotometria di assorbimento
molecolare
16) Solfuri Spettrofotometria di assorbimento
molecolare con ossalato
di p. dimetilamminoanilina
17) Stronzio Spettrofotometria di assorbimento
atomico
18) Litio Spettrofotometria di assorbimento
atomico
19) Alluminio Spettrofotometria di assorbimento
atomico
20) Bromo Titrimetria
Spettrofotometria d'assorbimento
molecolare
21) Iodio Titrimetria
Spettrofotometria d'assorbimento
molecolare
22) Cianuri Titrimetria con nitrato d'argento e
p - dimetilamminobenzilidenrodanina
Spettrofotometria molecolare con
cloramina T e successiva reazione
con piridina
Metodo con elettrodo specifico
23) Fenoli (esclusi quelli Spettrofotometria molecolare con
naturali che non reagiscono 4-aminoantipirina o p. nitroanilina
con il cloro) Determinazione GC e HPLC
24) Agenti tensioattivi Metodo spettrofotometrico al
(MBAS anionici) blu di metilene
25) Oli minerali - idrocar- Estrazione e determinazione con
buri disciolti o emulsionati spettrofotometria infrarossa
26) Idrocarburi aromatici Spettrofotometria di fluorescenza
policiclici dopo purificazione su strato sottile
27) Pesticidi e bifenili Determinazione per via gas-
policlorurati cromatografica
28) Composti organoalogenati Determinazione per via gas-
che non rientrano nella voce cromatografica dopo estrazione e con
pesticidi la tecnica dello spazio di testa
29) Arsenico Spettrofotometria di assorbimento
atomico con la tecnica degli idruri
Spettrofotometria molecolare con
dietilditiocarbammato di argento
30) Bario Spettrofotometria di assorbimento
atomico
Metodo turbidimetrico
31) Borati Spettrofotometria molecolare con
acido carminico
Spettrofotometria di assorbimento
atomico
32) Cadmio Spettrofotometria di assorbimento
atomico
33) Cromo VI Spettrofotometria molecolare con
difenilcarbazide
Spettrofotometria di assorbimento
atomico
35) Manganese Spettrofotometria di assorbimento
atomico
Spettrofotometria di assorbimento
molecolare con formalossima o
persolfato di ammonio
36) Nitrati Spettrofotometria molecolare al
salicilato di sodio
Spettrofotometria molecolare
diretta all'u.v. 210 nm
37) Nitriti Spettrofotometria molecolare con acido
solfanilico e ammina
38) Piombo Spettrofotometria di assorbimento
atomico
39) Rame Spettrofotometria di assorbimento
atomico
40) Selenio Spettrofotometria di assorbimento
atomico con la tecnica degli idruri
Spettrofotometria molecolare al
2.3 diaminonaftalene
Per eseguire le analisi del presente articolo si può utilizzare,
quando possibile, la cromatografia ionica.

Art. 3.
Il prelevamento dei campioni delle acque minerali naturali, da
analizzare ai fini della valutazione delle caratteristiche
microbiologiche e di composizione delle stesse, è effettuato dal
personale tecnico laureato del laboratorio che esegue le analisi.

Art. 4.

Il prelevamento è effettuato alla presenza dell'autorità
sanitaria competente per territorio, che redige il verbale di
prelevamento.

Art. 5.

Il verbale di prelevamento deve indicare l'ora e la data del
prelevamento stesso, le generalità e le qualifiche dei presenti, la
descrizione dell'opera di captazione e la sua esatta ubicazione nel
territorio, le modalità di prelevamento, i risultati delle
determinazioni eseguite sul posto, i dati meteorologici e
pluviometrici, anche relativi ai giorni precedenti, precisando in
particolare la data e la durata delle ultime precipitazioni, ed ogni
altro elemento ritenuto utile; il verbale è firmato dai presenti al
prelevamento.

Art. 6.
Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica.
Roma, 13 gennaio 1993
p. Il Ministro: AZZOLINI