Serie Generale n. 16 del 20-1-1995
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 27 dicembre 1994
Modalita' di attuazione del controllo ufficiale, al fine della verifica dei requisiti di qualita', sulle partite di materiale seminale congelato a qualsiasi titolo distribuito, in applicazione dell'art. 32 del regolamento di esecuzione della legge 15 gennaio 1991, n. 30, approvato con decreto ministeriale 13 gennaio 1994, n. 172. (GU Serie Generale n.16 del 20-01-1995)

IL MINISTRO DELLE RISORSE
AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
Vista la legge 15 gennaio 1991, n. 30, sulla "Disciplina della
riproduzione animale";
Visto il decreto ministeriale 13 gennaio 1994, n. 172, recante il
Regolamento di esecuzione della predetta legge n. 30/1991 ed, in
particolare, l'art. 32 che prevede che le regioni ed il Ministero
delle risorse agricole, alimentari e forestali effettuino, tramite
l'Istituto sperimentale italiano "Lazzaro Spallanzani", le analisi
sulle partite di materiale seminale a qualsiasi titolo distribuito
sulla base delle direttive tecniche emanate dal Ministero delle
risorse agricole, alimentari e forestali, sentito il Ministero della
sanità;
Ritenuto opportuno stabilire direttive tecniche in merito alle
dimensioni del controllo ufficiale, modalità di campionamento e di
analisi, comunicazioni agli enti ed amministrazioni interessati ai
risultati dei controlli medesimi;
Sentito il Ministero della sanità che in data 15 dicembre 1994 ha
espresso parere favorevole sulle direttive tecniche proposte dal
Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali;
Ritenuto altresì di favorire la qualificazione del materiale
seminale nazionale attraverso il riferimento sulle certificazioni
rilasciate dai centri di produzione di materiale seminale del sistema
di controlli ufficiali sul materiale seminale medesimo;
Decreta:
Art. 1.
1. Il controllo ufficiale al fine della verifica dei requisiti di
qualità delle partite di materiale seminale congelato dei
riproduttori animali di interesse zootecnico, a qualsiasi titolo
distribuite, nel quadro dell'applicazione del decreto ministeriale 13
gennaio 1994, n. 172, recante: "Regolamento di esecuzione della legge
n. 30/1991 sulla disciplina della riproduzione animale", è attuato,
a posteriori e dopo scongelamento del materiale seminale medesimo,
dall'Istituto sperimentale italiano "Lazzaro Spallanzani",
successivamente indicato come "Istituto", secondo le modalità del
presente decreto.
AVVERTENZA:
Il testo delle note qui pubblicato è stato redatto ai
sensi dell'art. 10, comma 3, del testo unico delle
disposizioni sulla promulgazione delle leggi,
sull'emanazione dei decreti del Presidente della Repubblica
e sulle pubblicazioni ufficiali della Repubblica italiana,
approvato con D.P.R. 28 dicembre 1985, n. 1092, al solo
fine di facilitare la lettura delle disposizioni di legge
alle quali è operato il rinvio. Restano invariati il
valore e l'efficacia degli atti legislativi qui trascritti.

Art. 2.
1. Il controllo di cui al precedente art. 1 consiste:
a) nell'accertamento dell'appartenenza del materiale seminale in
esame al riproduttore maschio la cui matricola è riportata sulla
fiala o altro contenitore sigillato, secondo le metodiche ed i
criteri riportati nell'allegato 1;
b) nelle analisi di qualità previste all'art. 32 del regolamento
di esecuzione della legge n. 30/91 secondo i criteri e le metodiche
riportate nell'allegato 2;
c) nella verifica a riscontro dei risultati delle analisi
certificati dal centro di produzione con le risultanze delle
determinazioni di cui alle precedenti lettere a) e b).

Art. 3.
1. Il controllo ufficiale è effettuato mediante analisi a campione
su almeno il 10% delle partite distribuite. I centri di produzione
dello sperma ed i recapiti devono consentire il prelevamento delle
dosi campione al personale dell'Istituto. Il costo delle dosi
campionate è a totale carico dei centri di produzione e dei
recapiti.
2. Sulla base delle informazioni relative all'art. 30 commi 4 e 5
del regolamento di esecuzione della legge n. 30/91, il Ministero
delle risorse agricole, alimentari e forestali, sentite le regioni,
comunica all'Istituto il numero minimo di partite da analizzare per
anno di esercizio per ciascun centro di produzione, nonchè i criteri
di campionamento.
3. Il Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali, le
regioni e qualsiasi altro organismo competente possono richiedere
all'Istituo ulteriori determinazioni relative al controllo di
qualità del materiale seminale coprendo il relativo costo.

Art. 4.
1. Il campione è costituito da 3 ml di materiale seminale (6 dosi
se in contenitore da 0,5 ml o 12 dosi se in contenitori da 0,25 ml)
appartenenti ad una unica partita ed è così composto:
1 ml di materiale seminale viene utilizzato dall'Istituto per
l'effettuazione delle analisi previste;
1 ml di materiale seminale viene tenuto, per almeno trenta giorni,
dal centro a disposizione dell'Istituto per lo svolgimento delle
analisi "in doppio" previste al successivo art. 5;
1 ml di materiale seminale viene tenuto dal centro a disposizione
dello stesso per eventuali ulteriori accertamenti.
2. Del campionamento è redatto apposito verbale.

Art. 5.
1. Nel caso di campioni le cui determinazioni analitiche non
soddisfino i "criteri di accettabilita'" riportati nell'allegato 1
e/o nell'allegato 2 del presente decreto, l'Istituto ne deve dare
immediata comunicazione al centro di produzione dello sperma da cui i
campioni analizzati provengono.
2. Il centro di produzione dello sperma, ricevuta la comunicazione
di non accettabilità, deve darne immediata informativa ai recapiti
collegati ed inviare entro cinque giorni all'Istituto il secondo
campione.
3. Qualora anche le determinazioni analitiche ripetute sulle dosi
"in doppio" non rientrino nei "criteri di accettabilita'" riportati
nell'allegato 1, la partita di provenienza delle dosi analizzate
viene calssificata come "identificazione errata" (I.E.).
4. Qualora anche le determinazioni analitiche ripetute sulle dosi
"in doppio" non rientrano nei "criteri di accettabilita'" riportati
nell'allegato 2, la partita di provenienza delle dosi analizzate
viene classificata come "autocertificazione errata" (A.E.).

Art. 6.
1. Una partita classificata "I.E." non deve essere commercializzata
e tutte le dosi già distribuite o vendute devono essere ritirate dal
commercio e distrutte dal centro di produzione dello sperma (o
secondo le indicazioni dello stesso) entro sette giorni dalla
comunicazione dei risultati delle determinazioni analitiche ripetute
in doppio dall'Istituto.

Art. 7.
1. Una partita classificata "A.E." può essere commercializzata, ma
il centro di produzione dello sperma che ha distribuito la partita in
questione deve correggere la relativa autocertificazione e porre in
essere le raccomandazioni tecniche riportate nell'allegato 3.

Art. 8.
1. L'Istituto comunica:
al Ministro delle risorse agricole, alimentari e forestali ed alle
regioni: per ogni centro di produzione dello sperma, il numero totale
di partite analizzate annualmente, nonchè il numero totale di
partite classificate "I.E." ed "A.E.";
alla regione competente per territorio: le partite classificate
"I.E." e "A.E." entro sette giorni dall'effettuazione delle analisi
in doppio;
alle regioni: il mancato adempimento da parte dei centri di
produzione e dei recapiti degli adempimenti ed obblighi previsti dal
presente decreto.

Art. 9.
1. I centri di produzione dello sperma possono indicare sulle
autocertificazioni di cui all'art. 10, comma 1, lettera n), del
decreto ministeriale n. 172 del 13 gennaio 1994, la dizione
"Autocertificazione sotto controllo ufficiale - decreto ministeriale
27 dicembre 1994" e sulle singole dosi di materiale seminale
stampigliare la sigla "A.C.U." (Autocertificazione sotto controllo
ufficiale).
Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana.
Roma, 27 dicembre 1994
Il Ministro: POLI BORTONE

ALLEGATO 1
CRITERI E METODICHE PER LA VERIFICA DI CORRETTA
IDENTIFICAZIONE DEL MATERIALE SEMINALE
1.1 Definizione di partita.
Una "partita" di materiale seminale è l'insieme di dosi di
materiale seminale congelato prodotto giornalmente da un unico
eiaculato o da più eiaculati di un unico riproduttore opportunamente
miscelati prima del congelamento e del confezionamento nell'apposito
contenitore siglato.
La partita si intende univocatamente individuata dalle seguenti
informazioni riportate sui contenitori sigillati costituenti le dosi
ai sensi dell'art. 10, comma 1, lettera m), del regolamento di
esecuzione della legge n. 30/91: a) data di raccolta dello sperma; b)
matricola del riproduttore; c) codice del centro di produzione dello
sperma.
Per ogni partita campionata almeno 1 ml di materiale seminale deve
essere analizzato.
1.2 Il tipo di analisi.
La verifica della corretta identificazione del materiale seminale
contenuto nella dose si effettua per confronto tra sequenze di DNA.
In particolare: il DNA estratto dai leucociti del sangue del
riproduttore in questione (sequenze di riferimento), viene
confrontato con analoghe sequenze di DNA estratto da una delle dosi
della partita aventi stampigliata sul contenitore sigillato la
matricola identificativa del riproduttore stesso.
1.3 Criterio di accettabilità.
La partita di provenienza della dose analizzata è accettata se il
confronto del tracciato elettroforetico ottenuto dal DNA estratto dal
materiale seminale della dose risulta NON INCOMPATIBILE con il
tracciato elettroforetico ottenuto dal DNA estratto dal sangue
prelevato dal riproduttore la cui matricola è stampigliata sulla
dose analizzata.
1.4 Le metodiche.
Il DNA (nei casi previsti come necessari) viene estratto dai
leucociti del campione di sangue di riferimento con il metodo
Goossens e Kan (1981, Methods in enzimology, vol. 76: 805-817) e deve
essere conservato dall'Istituto per almeno 10 anni dalla data di
nascita del riproduttore.
Il DNA viene estratto dal materiale seminale della dose analizzata
con il metodo di Jeffreys et al. (1985, Nature, 316: 76-79) e
successive modificazioni.
La scelta delle regioni genomiche ed i protocolli tecnici per
l'amplificazione mediante DNA-polimerasi verranno definiti
dall'Istituto che ne documenterà il livello di accuratezza in
relazione ai suddetti criteri di accettabilità.
Eventuali nuove metodiche di estrazione e/o analisi del DNA
potranno essere usate dall'Istituto documentandone le caratteristiche
tecniche e/o le fonti bibliografiche.

ALLEGATO 2
CRITERI E METODICHE PER L'ANALISI
QUALITATIVA DEL MATERIALE SEMINALE
2.1 I tipi di analisi e le misure.
I centri di produzione dello sperma devono effettuare, ai fini
dell'autocertificazione attestante la qualità delle partite di
materiale seminale prodotto o importato ed in forza dell'art. 32,
comma 1, del regolamento di esecuzione della legge n. 30/91, almeno
le seguenti analisi effettuate dopo scongelamento delle dosi:
concentrazione totale (CT), misurata come numero totale (in
milioni) di spermatozoi per dose;
motilità progressiva (MP), misurata come percentuale di
spermatozoi per dose che si muovono con moto tendenzialmente
rettilineo;
concentrazione di spermatozoi progressivamente mobili, definita
come numero (in milioni) di spermatozoi progressivamente mobili
(NSPM) dopo scongelamento per dose, da calcolare nel modo seguente:
NSPM = CT x MP/100
Per quanto riguarda le anomalie morfologiche totali e percentuali,
è facoltà dei centri misurare e autocertificare la percentuale ed
il numero totale per dose degli spermatozoi morfologicamente
anormali.
Per ogni partita di materiale seminale prodotto od importato, il
centro deve autocertificarne la qualità riportando nel certificato
di cui all'art. 10, comma 1, lettera n), del decreto ministeriale 13
gennaio 1994, n. 172, almeno il valore analitico medio stimato per i
seguenti parametri:
CT, MP, NSPM
Per il parametro NSPM, oltre al valore analitico medio, si deve
riportare sul certificato anche il valore minimo ed il valore massimo
che si stima possa assumere NSPM in una qualsiasi dose della partita
in questione.
2.2 Criterio di accettabilità.
La partita è accettata se la dose campionata e analizzata
dall'Istituto Spallanzani ha:
a) motilità progressiva (MP) superiore al 10%;
b) la concentrazione di spermatozoi progressivamente mobili
(NSPM) con valore superiore o uguale al valore minimo dell'intervallo
definito dal centro di produzione dello sperma e documentato
nell'autocertificazione della partita in questione.
2.3 Le metodiche.
Per la concentrazione si usera':
a) camera di Burker (media di misure ripetute su almeno due
aliquote), tramite metodica standard;
b) contatore elettronico di particelle (solo per bovini) (media
di misure ripetute su almeno due aliquote) seguendo la metodica di
Parks et al, J. Dairy Sci., 68:2329, 1985.
Per la cinetica si userà un analizzatore automatico di immagini
dedicato all'analisi seminologica settato e parametrizzato secondo
criteri documentati dall'Istituto.
Eventuali nuove metodiche potranno essere usate dall'Istituto
documentandone le caratteristiche tecniche e/o le fonti
bibliografiche.

ALLEGATO 3
RACCOMANDAZIONI TECNICHE PER LA PRODUZIONE
DI DOSI DI MATERIALE SEMINALE CONGELATO
Il massimo numero di dosi ottenibili per partita prodotta da uno o
più eiaculati dello stesso riproduttore, si ottiene applicando il
seguente criterio semplificato.
Sia:
VOL i = volume (in ml) dell' i-mo eiaculato;
CON i = concentrazione (in milioni/ml) dell' i-mo eiaculato;
PMMP = rapporto percentuale medio della motilità progressiva
(dopo scongelamento) misurata sugli ultimi 4 lotti prodotti dello
stesso riproduttore in attività continuativa;
NSPM = numero di spermi progressivamente mobili che si vogliono
ottenere dopo scongelamento della dose.
Allora, il numero di dosi (ND) ottenibili dall' i-mo eiaculato e':
ND i = (VOLi x CONCi x PMMP) /NSPM
il volume del mestruo (VM) da aggiungere al seme preventivamente
tamponato e':
VM = (ND x VD) - VT
con:
VD = volume unitario (in ml) delle dosi da confezionare;
VT = volume (in ml) del mestruo utilizzato per tamponare il seme
dopo il prelievo.
Si possono usare, per le formule precedenti, unità di misura
diverse, fatte le relative trasformazioni.