Serie Generale n. 66 del 19-3-1992
SUPPLEMENTI ORDINARI
DECRETO DEL PRESIDENTE DELLA REPUBBLICA 1 marzo 1992, n. 230
Regolamento di attuazione delle direttive CEE 79/109, 79/111, 80/219, 80/1098, 80/1099, 80/1274, 82/893, 83/646, 84/336, 85/586, 87/489 e 88/406, concernenti norme sanitarie in materia di scambi intracomunitari di animali della specie bovina e suina, tenuto anche conto delle direttive 84/643, 90/422 e 90/423. (GU Serie Generale n.66 del 19-03-1992 - Suppl. Ordinario n. 56)

IL PRESIDENTE DELLA REPUBBLICA

Visto l'art. 87 della Costituzione;
Visto l'art. 17, comma 2, della legge 23 agosto 1988, n. 400;
Vista la legge 9 marzo 1989, n. 86;
Vista la legge 29 dicembre 1990, n. 428, ed in particolare
l'allegato C;
Vista la legge 16 aprile 1987, n. 183;
Vista la legge 30 aprile 1976, n. 397;
Ritenuto di dover emanare le disposizioni occorrenti per
assicurare l'attuazione delle direttive 79/109/CEE, 79/111/CEE,
80/219/CEE, 80/1098/CEE, 80/1099/CEE, 80/1274/CEE, 82/893/CEE,
83/646/CEE, 84/336/CEE, 85/586/CEE, 87/489/CEE, 88/406/CEE in materia
di scambi intracomunitari di animali della specie bovina e suina,
tenuto conto anche delle direttive 84/643/CEE, 90/422/CEE e
90/423/CEE;
Vista la deliberazione del Consiglio dei Ministri, adottata nella
riunione del 26 luglio 1991;
Acquisiti i pareri delle commissioni parlamentari del Senato della
Repubblica e della Camera dei deputati;
Udito il parere del Consiglio di Stato, espresso nell'adunanza
generale del 23 gennaio 1992;
Vista la deliberazione del Consiglio dei Ministri, adottata nella
riunione del 27 febbraio 1992;
Sulla proposta del Ministro per il coordinamento delle politiche
comunitarie;

E M A N A
il seguente regolamento:
Art. 1.

1. All'art. 2, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e
successive modificazioni e integrazioni, le lettere e) ed i) sono
sostituite dalle seguenti:
" e) allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi:
l'allevamento bovino che risponde alle condizioni indicate
nell'allegato A, capitolo II lettera A, punti 1 o 1- bis;
i) zona indenne da epizoozia: la zona di un diametro di 20 km,
entro la quale, secondo accertamenti ufficiali, non si è avuto da
almeno trenta giorni prima del carico:
1) per gli animali della specie bovina: alcun caso di afta
epizootica;
2) per gli animali della specie suina: alcun caso di afta
epizootica, di peste suina, di malattia vescicolare dei suini o di
paralisi suina contagiosa (morbo di Teschen);".
2. All'art. 2, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397,
sono aggiunte, in fine, le seguenti lettere:
" n) regione: parte del territorio di superficie minima di 2000
km(Elevato al Quadrato) e comprendente almeno una delle seguenti
circoscrizioni amministrative:

- per il Belgio: Province/Provincie,
- per la Germania: Regierungbezirk,
- per la Danimarca: Amt o isola,
- per la Francia: Departement,
- per l'Italia: Provincia,
- per il Lussemburgo:
- per i Paesi Bassi: Provincie,
- per il Regno Unito:
- per l'Inghilterra, il Galles
e l'Irlanda del Nord: County,
- per la Scozia: District o Island Area,
- per l'Islanda: County;
o) azienda ufficialmente indenne da peste suina, un'azienda:
1) in cui non si sono accertati casi di peste suina almeno negli
ultimi dodici mesi;
2) in cui non sono presenti suini vaccinati contro la peste
suina negli ultimi dodici mesi;
3) in cui la vaccinazione contro la peste suina non è stata
autorizzata da almeno dodici mesi;
4) che si trovi al centro di una zona con un raggio di 2 km in
cui la peste suina, non sia stata accertata almeno negli ultimi
dodici mesi;
p) Stato membro o regione ufficialmente indenne da peste suina,
uno Stato membro o una regione:
1) in cui non si sono accertati casi di peste suina almeno negli
ultimi dodici mesi;
2) in cui la vaccinazione contro la peste suina non è stata
autorizzata da almeno dodici mesi;
3) in cui le aziende non presentano suini vaccinati contro la
peste suina negli ultimi dodici mesi;
q) Stato membro, regione o azienda indenne da peste suina, uno
Stato membro, una regione o un'azienda in cui non si sono accertati
casi di peste suina almeno negli ultimi dodici mesi;
r) allevamento indenne da leucosi bovina enzootica: un
allevamento che soddisfa le condizioni previste all'allegato G,
capitolo I, lettera A;
s) Stato membro o regione indenne da leucosi bovina enzootica:
una regione o uno Stato membro che soddisfa i requisiti fissati
nell'allegato G, capitolo I, lettera B.".

Art. 2.

1. All'art. 3, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e
successive modificazioni e integrazioni, alla lettera c), numero 2),
dopo le parole: "per gli animali della specie suina, da afta
epizootica," sono inserite le seguenti: "da malattia vescicolare dei
suini".

Art. 3.

1. All'art. 6, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e
successive modificazioni ed integrazioni, sono aggiunte, in fine, le
seguenti lettere:
" e) provenire da un allevamento indenne da leucosi bovina
enzootica;
f) oltre al requisito di cui alla lettere e), se sono di età
superiore a dodici mesi e qualora provengono da una regione o da uno
Stato membro che non abbia ricevuto la qualifica di indenne da
leucosi bovina enzootica, aver reagito negativamente ad un esame
individuale effettuato, in conformità dell'allegato G, capitolo II
nei trenta giorni precedenti la data del carico;
g) non essere soggetti ai requisiti delle lettere e) ed f),
quando si tratta di bovini di età inferiore a trenta mesi destinati
alla produzione di carne, i quali:
1) provengono da un allevamento nel quale nessun caso di leucosi
bovina enzootica è stato notificato e confermato negli ultimi 2
anni;
2) siano contrassegnati con uno speciale marchio al momento del
carico e restino sotto sorveglianza sino alla macellazione a cura del
paese destinatario per evitare l'infezione degli allevamenti
locali.".

Art. 4.

1. All'art. 7, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e
successive modificazioni ed integrazioni, dopo le parole: "indenne da
brucellosi" sono aggiunte le seguenti: "e da una azienda
ufficialmente indenne da peste suina o da una azienda indenne da
peste suina purchè, in quest'ultimo caso, siano accompagnati da un
certificato che attesti che gli animali non sono stati vaccinati.".

Art. 5.

1. Dopo l'art. 9 della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive
modificazioni ed integrazioni, è inserito il seguente:
"Art. 9-bis. - 1. La Commissione delle Comunità europee può
decidere che, in uno Stato membro o in una parte di uno Stato membro
composto da più regioni contigue in cui il 99,8% degli allevamenti
bovini è stato dichiarato ufficialmente indenne da brucellosi per
almeno dieci anni e in cui non si è constatato alcun caso di aborto
da brucellosi negli ultimi tre anni, le prove di controllo per il
mantenimento di tale qualifica possono essere effettuate in deroga
all'allegato A, capitolo II, sub ii, precisandone le modalità e
individuando eventualmente i territori.
2. La Commissione delle Comunità Europee può decidere che il
regime previsto nell'allegato A, capitolo II, lettera A, punto 1 c),
sub iii, si applichi ad una parte di uno Stato membro composta da
più regioni contigue.
3. La Commissione delle Comunità europee può decidere, che in
uno Stato membro, o in una parte di uno Stato membro composta da più
regioni contigue, in cui almeno il 99,9% degli allevamenti bovini è
stato dichiarato ufficialmente indenne da tubercolosi da almeno dieci
anni e in cui per almeno sei anni non sono stati constatati casi di
tubercolosi in numero superiore, per anno, ad uno su 10.000
allevamenti situati in detto Stato membro, o in detta parte di uno
Stato membro, purchè tutti gli animali della specie bovina che hanno
reagito positivamente ad una tubercolinizzazione e tutti gli animali
della specie bovina macellati nel territorio del detto Stato membro
abbiano subito l'ispezione post mortem da parte di un veterinario
ufficiale e, se necessario, l'esame batteriologico, i controlli per
conservare tale qualifica possono essere effettuati in deroga
all'allegato A, capitolo I, lettera b) precisandone i metodi ed
eventualmente i territori.
4. In deroga ai requisiti di cui all'allegato G, capitolo I,
lettera B, punto 2), uno Stato membro o una regione di uno Stato
membro dichiarata indenne da leucosi bovina enzootica può essere
autorizzato dalla Commissione delle Comunità europee a ridurre il
livello di controllo degli animali di più di due anni, a condizione
che gli esami abbiano permesso di constatare il rispetto dei seguenti
requisiti:
a) almeno per tre anni non siano stati constatati casi di
leucosi bovina enzootica nella proporzione di uno su 10.000
allevamenti;
b) tutti gli animali che hanno reagito positivamente ad un esame
di immunodiffusione siano stati abbattuti e l'allevamento sia restato
in regime di restrizione sino a ripristino della sua qualifica in
conformità dell'allegato G, capitolo I, lettera C, punti 1) o 2);
c) tutti gli animali macellati in detto Stato membro o in detta
regione abbiano subito l'ispezione post mortem da parte di un
veterinario ufficiale, che deve notificare tutti i tumori in vista di
un esame di laboratorio.".

Art. 6.

1. All'art. 10- bis, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n.
397, e successive modificazioni ed integrazioni, la data: "31
dicembre 1982" è sostituita dalla seguente: "31 dicembre 1991".

Art. 7.

1. All'art. 16, primo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e
successive modificazioni ed integrazioni, sono apportate le seguenti
modifiche:
a) al numero 5, tra le parole: "animali" e "devono" sono
inserite le seguenti: ", se di età superiore a 30 giorni,";
b) dopo il numero 6 sono inseriti i seguenti:
"7) bovini che non sono stati sottoposti alla
sieroagglutinazione prescritta ai punti 5) e 6), purchè soddisfino
le seguenti condizioni:
a) se si tratta di bovini destinati alla produzione di carne:
siano di età inferiore a quarantadue giorni o siano stati castrati
in età inferiore a quattro mesi e siano inoltrati sotto controllo
ufficiale, passando se necessario attraverso un centro di
svezzamento, verso un'azienda di ingrasso autorizzata da cui possano
uscire soltanto per essere macellati;
b) se si tratta di bovini da macello: siano inoltrati sotto
controllo ufficiale direttamente al macello;
8) suini da allevamento e da produzione, vaccinati contro la
peste suina, in deroga all'art. 7 e fino al 31 dicembre 1991.".

Art. 8.

1. All'art. 19, terzo comma, della legge 30 aprile 1976, n. 397, e
successive modificazioni e integrazioni, dopo la data: "19 luglio
1971" sono aggiunte le seguenti parole: "; tali garanzie non possono
però essere richieste per l'introduzione di animali provenienti da
uno Stato membro o da una regione indenni dalla leucosi bovina
enzootica".

Art. 9.

1. Dopo l'art. 33 della legge 30 aprile 1976, n. 397, e successive
modificazioni ed integrazioni, è inserito il seguente:
"Art. 33- bis .- 1. Il Ministro della sanità, con i propri
decreti, adotta regolamenti ai sensi dell'art. 17 della legge 23
agosto 1988, n. 400, per estendere al territorio nazionale le norme
sanitarie previste negli allegati".

Art. 10.

1. Gli allegati alla legge 30 aprile 1976, n. 397, sono soppressi
e vengono sostituiti dagli allegati al presente regolamento.
Il presente decreto, munito del sigillo dello Stato, sarà
inserito nella Raccolta ufficiale degli atti normativi della
Repubblica italiana. È fatto obbligo a chiunque spetti di osservarlo
e di farlo osservare.
Dato a Roma, addì 1 marzo 1992

COSSIGA

ANDREOTTI, Presidente del Consiglio
dei Ministri
ROMITA, Ministro per il
Coordinamento delle politiche
comunitarie
Visto, il Guardasigilli: MARTELLI
Registrato nalla Corte dei conti il 13 marzo 1992
Atti di Governo, registro n. 85, foglio n. 11

ALLEGATO A (1) (3)

I. ALLEVAMENTI BOVINI INDENNI DA TUBERCOLOSI

È considerato ufficialmente indenne da tubercolosi un allevamento
bovino nel quale:
a) tutti i bovini sono esenti da manifestazioni chimiche di
tubercolosi;
b) tutti i bovini di età superiore a cinque settimane hanno
avuto una reazione negativa ad almeno due
intradermotubercolinizzazioni ufficiali praticate secondo le
disposizioni dell'allegato B, che hanno luogo la prima sei mesi dopo
la fine delle operazioni di risanamento dell'allevamento, la seconda
sei mesi dopo la prima e le successive ad un anno di intervallo.
Quando in uno Stato membro o in una regione di uno Stato membro, nel
quale tutti i bovini sono soggetti alle misure ufficiali di lotta
contro la tubercolosi, la percentuale degli allevamenti bovini
infettati da tubercolosi non è superiore ad 1 in occasione di due
controlli succedentisi ad intervallo di un anno, tale intevallo può
essere portato a due anni. Quando la percentuale degli allevamenti
bovini infettati non è superiore a 0,2 in occasione di due controlli
succedentisi ad intervallo di due anni, l'intervallo tra le
tubercolinizzazioni può essere portato a tre anni.
Qualora la percentuale degli allevamenti bovini infetti non sia
superiore allo 0,1 in occasione di due controlli successivi ad
intervallo di tre anni, l'intervallo tra le tubercolinizzazioni suc-
cessive può essere portato a quattro anni e/o l'età alla quale gli
animali dovranno essere sottoposti a tali controlli può essere
portata a ventiquattro mesi;
c) non è stato introdotto alcun bovino senza attestato di un
veterinario ufficiale in cui si certifichi che detto animale proviene
da un allevamento bovino ufficialmente indenne da tubercolosi e, se
è di età superiore a sei settimane, ha avuto una reazione negativa
all'intradermotubercolinizzazione valutata secondo i criteri
dell'allegato B , 31 a):
i) tuttavia, l'intradermotubercolinizzazione non è richiesta in
uno Stato membro in cui la percentuale degli allevamenti bovini
infettati da tubercolosi è inferiore allo 0,2 e che risulta da un
attestato del veterinario ufficiale che l'animale:
1) è debitamente identificato;
2) proviene da un allevamento ufficialmente indenne da
tubercolosi di questo Stato membro;
3) in occasione del trasporto non è entrato in contatto con
bovini non provenienti da allevamenti bovini ufficialmente indenni da
tubercolosi;
ii) l'attestato previsto al punto 1) può non essere richiesto
in uno Stato membro in cui, da almeno quattro anni:
- almeno il 99,80% degli allevamenti bovini è ufficialmente
riconosciuto indenne da tubercolosi e in cui
- gli allevamenti non ufficialmente indenni si trovano sotto
controllo ufficiale, ed è vietato il trasferimento di bovini da tali
allevamenti salvo che gli stessi siano portati direttamente al
macello sotto controllo ufficiale.
Qualora in un allevamento bovino ufficialmente indenne da
tubercolosi, la reazione di un animale ad una tubercolinizzazione di
routine sia considerata positiva o qualora, nello stesso allevamento,
sia diagnosticato un caso clinico di tubercolosi nel corso
dell'ispezione post mortem di routine su un animale proveniente da un
allevamento ufficialmente indenne da tubercolosi, la qualifica
'ufficialmente indennè deve essere sospesa fintanto che tutti i
rimanenti animali, di età superiore alle sei settimane, non avranno
reagito negativamente ad almeno due intradermotubercolinizzazioni
ufficiali conformemente all'allegato B, la prima delle quali
effettuata almeno due mesi dopo l'eliminazione dell'animale
dall'allevamento in questione, e la seconda ad almeno quarantadue
giorni di distanza.
II. ANIMALI DELLA SPECIE SUINA E ALLEVAMENTI BOVINI E SUINI INDENNI
DA BRUCELLOSI
A. Allevamenti bovini.
1. È da considerare ufficialmente indenne da brucellosi un
allevamento bovino in cui:
a) non vi sono animali della specie bovina vaccinati contro la
brucellosi, salvo che non si tratti di femmine che siano state
vaccinate da almeno tre anni;
b) tutti i bovini sono immuni da manifestazioni chimiche di
brucellosi da almeno sei mesi;
c) tutti i bovini di età superiore a dodici mesi:
i) hanno presentato, in occasione di due sieroagglutinazioni
praticate ufficialmente ad intervalli di tre mesi almeno e di dodici
mesi al massimo e secondo le disposizioni dell'allegato C, paragrafo
A, un tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinati per
millilitro, rimanendo inteso che;
- la prima sieroagglutinazione può essere sostituita da tre
prove dell'anello (ring test) effettuate ad intervalli di tre mesi
purchè tuttavia la seconda sieroagglutinazione sia effettuata almeno
sei settimane dopo la terza prova dell'anello;
- le prove di sieroagglutinazione di cui al primo paragrafo
possono essere sostituite da due prove ufficiali all'antigene di
brucella tamponato o da due prove di microagglutinazione effettuate
conformemente alle disposizioni dell'allegato C, punti D e G.
Anche queste prove devono essere effettuate ad intervalli non
inferiori a tre mesi e non superiori a dodici mesi;
ii) sono controllati annualmente per stabilire l'assenza di
brucellosi mediante tre prove dell'anello, oppure tre saggi ELISA su
latte, effettuati ad intervalli di almeno tre mesi o mediante due
prove dell'anello, o due saggi ELISA su latte, effettuati a
intervalli di almeno tre mesi e una prova sierologica (prova di
sieroagglutinazione, prova all'antigene di Brucella tamponato, prova
di plasmoagglutinazione, prova dell'anello di latte su plasma
sanguigno, prova di microagglutinazione o saggio singolo ELISA su
sangue) effettuata non meno di sei settimane dopo la seconda prova
dell'anello o il secondo saggio ELISA su latte. Se non vengono
effettuate le prove dell'anello o il saggio ELISA sul latte, si
devono effettuare ogni anno due prove sierologiche (prova di
sieroagglutinazione, prova all'antigene di Brucella tamponato, prova
di plasmoagglutinazione, prova dall'anello di latte su plasma
sanguigno, prova di microagglutinazioneo saggio singolo ELISA su
sangue) ad un intervallo non inferiore a tre mesi e non superiore a
sei mesi.
Se in uno Stato membro o in una regione di uno Stato membro in cui
tutti gli allevamenti bovini sono sottoposti ad operazioni ufficiali
di lotta contro la brucellosi la percentuale degli allevamenti di
bovini infetti non supera l'1%, è sufficiente effettuare ogni anno
due prove dell'anello o due saggi ELISA su latte a intervalli di
almeno tre mesi, oppure una prova sierologica (prova di
sieroagglutinazione, prova all'antigene di Brucella tamponato, prova
di plasmoagglutinazione, prova dell'anello di latte su plasma
sanguigno, prova di microagglutinazione o saggio ELISA su sangue).
In caso di controllo mediante prove dell'anello sulle cisterne gli
esami di cui ai commi precedenti devono essere raddoppiati e gli
intervalli tra le prove devono essere ridotti della metà;
iii) si può rinunciare alle prescrizioni relative al controllo
animale dell'assenza di brucellosi previsto dal comma ii) in ogni
Stato membro in cui il 99,8% almeno del patrimonio bovino è
riconosciuto ufficialmente indenne da brucellosi da almeno quattro
anni: in tal caso l'intervallo tra i controlli può essere portato a
due anni e i controlli devono essere effettuati mediante una delle
prove sierologiche menzionate nel comma ii);
d) non è stato introdotto alcun bovino senza un attestato di un
veterinario ufficiale che certifichi che detto animale proviene da un
allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi e, se è di
età superiore a dodici mesi, che ha presentato un tasso brucellare
inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro alla siero-
agglutinazione praticata secondo le disposizioni dell'allegato C nei
trenta giorni che precedono l'introduzione nell'allevamento;
i) tuttavia la siero-agglutinazione può non essere richiesta
nello Stato membro o in parte di uno Stato membro composta da più
regioni contigue in cui la percentuale di allevamenti bovini
infettati da brucellosi non è, da almeno due anni, superiore a 0,2 e
se risulta dall'attestato del veterinario ufficiale che l'animale:
1) è debitamente identificato;
2) proviene da un allevamento bovino di questo Stato membro
ufficialmente indenne da brucellosi;
3) in occasione del suo trasporto non è entrato in contatto
con bovini non provenienti da allevamenti bovini ufficialmente
indenni;
ii) l'attestato previsto al punto i) può non essere richiesto
nello Stato membro in cui da quattro anni almeno:
- il 99,8% almeno degli allevamenti bovini è riconosciuto
ufficialmente indenne da brucellosi e in cui:
- gli allevamenti che non sono ufficialmente indenni si trovano
sotto controllo ufficiale, ed è vietato il trasferimento dei bovini
da tali allevamenti, salvo che gli stessi siano portati direttamente
al macello sotto controllo ufficiale.
1- bis. È parimenti considerato ufficialmente indenne da
brucellosi un allevamento bovino:
- che si trova in uno Stato membro in cui alla data del 1 gennaio
1979 non è stato ufficialmente constatato alcun caso di brucellosi
bovina da almeno dieci anni;
- che ha soddisfatto in questo periodo le disposizioni del
paragrafo 1, tranne, se tutti gli allevamenti bovini dello Stato
membro in questione sono stati sottoposti periodicamente a esami di
controllo ufficali durante lo stesso periodo, quelle di cui alla
lettera c).
2. Un allevamento bovino è considerato indenne da brucellosi
quando:
a) non comprende maschi vaccinati contro la brucellosi;
b) tutte le femmine della specie bovina, o una parte di esse,
sono state vaccinate:
- entro i primi sei mesi di età, con vaccino vivo Buck19 o con
altri vaccini autorizzati secondo la procedura dell'art. 12;
- entro i primi quindici mesi di età, con vaccino ucciso con
adiuvante 45/20, controllato e riconosciuto ufficialmente;
c) tutti i bovini soddisfano le condizioni indicate nel punto
1), lettere b) e c), rimenendo inteso che i bovini di età inferiore
a trenta mesi, vaccinati con vaccino vivo Buck19, possono presentare
un tasso brucellare pari o superiore a 30 unità internazionali
agglutinanti per millilitro, ma inferiore a 80 unità internazionali
agglutinanti per millilitro, semprechè presentino, alla reazione di
fissazione del complemento:
- un tasso inferiore a 30 unità CEE, se si tratta di femmine
vaccinate da almeno dodici mesi;
- un tasso inferiore a 20 unità CEE in tutti gli altri casi.
Le prove di sieroagglutinazione di cui al punto 1) c) i), primo
trattino, possono essere sostituite da prove all'antigene di brucella
tamponato effettuate conformemente alle disposizioni dell'allegato
C), lettera D, o da prove di microagglutinazione effettuate
conformemente alle disposizioni dell'allegato C, lettera G;
d) non è stato introdotto nessun bovino senza un attestato del
veterinario ufficiale con cui si certifichi che l'animale risponde
alle condizioni previste al numero 1, lettera d), oppure che esso
proviene da un allevamento riconosciuto indenne da brucellosi e, in
questo caso, se è di età superiore a dodici mesi, ha presentato nei
trenta giorni precedenti l'introduzione nell'allevamento, secondo le
disposizioni dell'allegato C), un tasso brucellare inferiore a 30
u.i. agglutinanti per millilitro e una reazione negativa di
fissazione del complemento. Tuttavia, un bovino vaccinato con vaccino
vivo 19 e, di età inferiore a trenta mesi può presentare un tasso
brucellare uguale o superiore a trenta u.i. agglutinanti per
millilitro ma inferiore a 80 u.i. agglutinanti per millilitro,
purchè alla reazione di fissazione del complemento presenti:
- un tasso inferiore a 30 unità CEE, se si tratta di una
femmina vaccinata da meno di dodici mesi;
- un tasso inferiore a 20 unità CEE dopo il dodicesimo mese
successivo alla vaccinazione.
3. Un allevamento bovino indenne da brucellosi può essere
qualificato allevamento bovino ufficialmente indenne da brucellosi
dopo un termine minimo di tre anni se:
a) non vi si trova alcun animale vaccinato contro la brucellosi
da meno di tre anni;
b) durante questi tre anni sono state rispettate senza
interruzione le condizioni di cui al numero 2, lettera c);
c) al termine del terzo anno gli animali di più di dodici mesi
hanno presentato un tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinanti
per millilitro alla siero-agglutinazione ed una reazione negativa
alla fissazione del complemento. Tali prove sono praticate secondo le
disposizioni dell'allegato C).
4. In un allevamento bovino ufficialmente riconosciuto indenne da
brucellosi possono essere introdotti anche bovini provenienti da un
allevamento indenne da brucellosi quando:
- al momento della loro introduzione hanno un'età di almeno
diciotto mesi;
- nel caso in cui siano stati vaccinati contro la brucellosi, la
vaccinazione è stata effettuata da oltre un anno;
- entro i trenta giorni che precedono la loro introduzione,
conformemente alle disposizioni dell'allegato C), hanno presentato un
tasso brucellare inferiore a 30 u.i. agglutinanti per millilitro e
una reazione negativa alla fissazione del complemento.
Se un bovino è introdotto, conformemente al primo comma, in un
allevamento ufficialmente riconosciuto indenne da brucellosi,
quest'ultimo, ai fini degli scambi intracomunitari, è considerato
indenne da brucellosi per un periodo di due anni a decorrere dalla
data di introduzione dell'animale.
5. Se in un allevamento ufficialmente indenne da brucellosi si
constata un sospetto di brucellosi presso uno o più bovini, la
qualifica di questo allevamento può essere provvisoriamente sospesa
piuttosto che ritirata, purchè l'animale o gli animali siano
immediatamente eliminati o isolati.
La sospensione provvisoria può essere tolta qualora due siero-
agglutinazioni, praticate secondo le disposizioni dell'allegato C)
con intervalli da sei ad otto settimane su tutti gli animali d'età
superiore a dodici mesi, diano un tasso inferiore a 30 u.i.
agglutinanti per millilitro.
Gli animali possono essere reintrodotti nell'allevamento se,
nell'intervallo dalle sei alle otto settimane, due siero-
agglutinazioni hanno dato un tasso inferiore a 30 u.i. agglutinanti
per millilitro e due fissazioni del complemento hanno dato risultato
negativo. Tali prove sono praticate secondo le disposizioni
dell'allegato C.
Le disposizioni di cui sopra sono applicabili altresì agli
allevamenti indenni da brucellosi quando un sospetto di tale malattia
è constatato presso uno o più bovini d'età superiore a trenta
mesi.
6. Le disposizioni di cui sopra, relative agli animali
appartenenti ad un allevamento indenne da brucellosi, si applicano
anche agli animali che sono stati vaccinati ad un'età compresa fra i
cinque e gli otto mesi prima della data di applicazione delle
disposizioni della presente direttiva in ciascuno degli Stati membri.
7. Le prove di cui ai paragrafi da 1 a 6 non sono richieste per
gli animali maschi castrati in età inferiore a quattro mesi.

ALLEGATO B

NORME PER LA FABBRICAZIONE E L'UTILIZZAZIONE
DELLE TUBERCOLINE BOVINE ED AVIARIE

1. Le tubercolinizzazioni controllate ufficalmente devono essere
effettuate mediante tubercoline PPD o tubercoline preparate
sinteticamente e concentrate a caldo ('tubercoline sintetiche').
Lo Stato membro che, alla data di adozione della presente
direttiva, impiega, per il controllo delle tubercoline cosiddette
'sintetichè, una tubercolina standard conforme al campione
internazionale della vecchia tubercolina, può, in deroga alle
disposizioni dell'allegato B, punto 1 della direttiva 64/432/CEE,
continuare ad utilizzare questo metodo fino all'applicazione di norme
internazionali più perfezionate.
2. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle
tubercoline PPD bovine e delle tubercoline cosiddette 'sintetichè
devono essere titolati in unità tubercoliniche comunitarie (UTC)
mediante prove biologiche secondo le norme CEE per la tubercolina
standard CEE.
3. Gli standard di fabbricazione per il controllo delle
tubercoline aviarie devono essere espressi in unità internazionali e
titolati per via biologica, secondo lo strandard CEE della
tubercolina PPD aviaria.
4. Lo standard CEE per la tubercolina PPD bovina è fornito dal
'Centraal Diergeneeskundig Instituut', Afdeling Rotterdam, Paesi
Bassi.
5. Lo standard CEE per la tubercolina 'sinteticà bovina è
fornita dall''Institut Pasteur' di Parigi, Francia.
6. Lo standard CEE per la tubercolina aviaria è fornito dal 'Cen-
tral Veterinary Laboratory', Weybridge, Surrey, Regno Unito.
7. Le tubercoline bovine devono essere preparate con uno dei ceppi
di Mycobacterium bovis indicati qui di seguito:
a) An5;
b) Vallee.
8. Le tubercoline aviarie devono essere preparate con uno dei
ceppi di Mycobacterium avium indicati qui di seguito:
a) D4ER;
b) TB56.
9. Il pH delle tubercoline deve essere compreso fra 6,5 e 7,5.
10. Per quanto concerne l'aggiunta alle tubercoline di conservanti
antimicrobici o di altre sostanze, deve risultare dimostrato, a
giudizio dell'istituto statale responsabile del controllo ufficiale
della tubercolina, che tale aggiunta non altera l'innocuità nè
l'efficacia del prodotto.
Le concentrazioni massime consentite per il fenolo e la glicerina
sono le seguenti:
a) fenolo - 0,5% M/v;
b) glicerina - 10% v/v.
11. Superata con esito favorevole l'ultima prova di attività, le
tubercoline, conservate a temperature comprese fra 2 C e 8 C ed al
riparo dalla luce, rimangono valide per tutta la durata dei periodi
sotto indicati:
a) tubercoline PPD liquide: due anni;
tubercoline PPD liofilizzate: otto anni;
b) tubercoline 'sintetichè diluite: due anni.
12. Nei rispettivi Paesi, gli istituti statali seguenti sono
incaricati del controllo ufficiale delle tubercoline:
a) Germania: Paul-Ehrlich-Institut, Frankfurt/Main;
b) Belgio: Institut d'hygiene et d'epidemiologie, rue J. Wytsman
14, B 1050 Bruxelles;
c) Francia: Laboratoire national des medicaments veterinaires,
Fougeres;
d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore;
e) Italia: Istituto superiore di sanità, Roma;
f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling
Rotterdam;
g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn
V;
h) Irlanda: Istituto del paese fornitore;
i) Regno Unito: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge,
Surrey;
j) Grecia: Kthniat Inshtouton Loimvdvn Kai Parasiokvn Noshmatan
1era odos75 Auhnai 301;
k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de
Granada;
l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria
- Lisboa.
13. Ciascuna partita di tubercoline infialate e pronte per l'uso
deve essere oggetto di un controllo ufficiale.
14. Le tubercoline devono essere controllate con metodi biologici
e chimici.
15. Le tubercoline devono essere sterili. Le prove di sterilità
devono essere effettuate secondo le norme della farmacopea europea.
16. Le tubercoline devono risultare esenti da proprietà tossiche
od irritanti in base a una prova effettuata secondo le norme della
farmacopea europea.
17. Le tubercoline devono essere sottoposte a un'analisi chimica
per determinare l'esatta concentrazione della glicerina e/o del
fenolo, nonchè la concentrazione di altri eventuali conservanti.
18. Una prova di non sensibilizzazione alla tubercolina deve
essere effettuata secondo le norme della farmacopea europea.
19. L'attività delle tubercoline deve essere valutata con i
metodi biologici, applicabili alle tubercoline PPD e a quelle
'sintetichè e basati sul confronto delle tubercoline in esame con
tubercoline standard.
20. Il contenuto proteico delle tubercoline PPD
(tubercoloproteina) si ottiene secondo il metodo di Kjeldahl. Il
fattore di conversione dell'azoto in tubercoloproteine è 6,25.
21. Lo standard CEE per la tubercolina 'sinteticà bovina ha
un'attività di 65.000 unità tubercoliniche comunitarie (UTC)
provvisorie per ml, e viene distribuito in fiale da 5 ml.
22. Lo standard CEE, per la tubercolina PPD bovina ha un'attività
di 50.000 UTC per mg di PPD, e viene distribuito alla stato
liofilizzato in fiale contenenti 1,8 mg di PPD (0,00002 mg di PPD
corrispondono cioè ad 1 unità tubercolinica comunitaria di
attivita').
23. La tubercolina PPD aviaria della norma CEE ha un'attività di
50.000 unità internazionali (UI) per mg di derivato proteico
purificato essiccato e viene distribuita allo stato liofilizzato in
fiale contenenti 10 mg di PPD più 26,3 mg di sali (0,0000726 mg
dello standard corrispondono cioè ad 1 unità internazionale di
attivita').
24. Le tubercoline che i fabbricanti presentano per il controllo
agli istituti statali di cui al paragrafo 12 devono essere state
oggetto di una prova biologica di attività in paragone con gli
opportuni standard elencati ai paragrafi 2 e 3.
25. a) Prove di attività su cavie.
La prova deve essere effettuata su cavie albine di peso fra g 400
e 600. Tali cavie devono essere in buona salute al momento
dell'inoculazione della tubercolina. Per ciascuna prova vanno
impiegate non meno di otto cavie. La prova deve essere effettuata a
non meno di un mese di distanza dalla sensibilizzazione.
aa) Per il controllo delle tubercoline bovine, le cavie devono
essere sensibilizzate con uno dei metodi seguenti:
1) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5, ucciso col
calore, in coadiuvante oleoso;
2) iniezione di Mycobacterium bovis del ceppo AN5 vivo in
emulsione salina fisiologica:
3) iniezione di vaccino BCG.
bb) Per il controllo delle tubercoline aviarie, le cavie devono
essere sensibilizzate mediante inoculazione di 2 mg, di micobatteri
tubercolari del tipo aviario, uccisi col calore, sospesi in 0,5 ml di
paraffina liquida sterile, ovvero mediante inoculazione di
micobatteri tubercolari vivi del tipo aviario in emulsione salina
fisiologica, Il ceppo da impiegare è quello del tipo aviario D4.
cc) Qualunque tubercolina esaminata deve essere titolata
mediante inoculazione intradermica in paragone con l'opportuna
tubercolina standard, impiegando gruppi di cavie opportunamente
sensibilizzate.
Le cavie devono essere tosate su due fianchi. La prova deve essere
effettuata confrontando le reazioni indotte da una serie di
inoculazioni intracutanee di dosi da 0,2 ml al massimo di diluizioni
della tubercolina standard in soluzione salina isotonica tamponata
contenente lo 0,0005% di Tween 80, con una corrispondente serie di
inoculazioni della tubercolina in esame. Le diluizioni devono essere
preparate in serie geometrica ed essere iniettate nelle cavie secondo
una distribuzione irregolare in quadrato latino (otto iniezioni, da
praticarsi in quattro punti su ciascun lato). Il diametro delle aree
di reazione su ciascun lato deve essere misurato e registrato dopo
24-28 ore.
Per ciascun campione di tubercolina sotto prova deve essere
effettuata una valutazione dell'attività relativa e dei suoi limiti
di affidabilità, basata su metodi statistici, impiegando come
metametri i diametri delle aree di reazione e dei logaritmi delle
dosi. L'attività della tubercolina bovina in esame è accettabile
se, in base alla valutazione, ogni dose destinata ai bovini risulta
contenere 2.000 UTC (+/- 25%). L'attività di qualunque
tubercolina in esame deve essere espressa, secondo i casi, in unità
tubercoliniche comunitarie o in UI/ml.
b) Controllo dell'attività sui bovini.
Un controllo dell'attività delle tubercoline bovine può essere
effettuato periodicamente su bovini infetti da tubercolosi per via
naturale o artificiale. Dette prove di attività, da praticarsi su
gruppi di bovini tubercolotici, devono essere effettuate per
inoculazione intradermica della tubercolina in esame in quattro o sei
punti, in paragone con l'opportuno standard; l'attività della
tubercolina deve essere valutata con metodi statistici come nella
prova su cavie.
26. Per l'etichettatura dei contenitori e degli imballaggi delle
tubercoline devono essere rispettate le seguenti norme.
L'etichetta del contenitore e quella dell'imballaggio devono
indicare:
- il nome del preparato:
- per i preparati liquidi, il volume totale del contenitore;
- il numero di unità comunitarie o di unità internazionali per
ml o per mg;
- il nome del fabbricante;
- il numero della partita;
- per i preparati liofilizzati, la natura e la quantità del
liquido di ricostituzione.
L'etichetta del contenitore o dell'imballaggio deve indicare:
- data di scadenza;
- condizioni di conservazione;
- denominazione e, se possibile, proporzione di ogni sostanza
aggiunta;
- tipo di bacillo dal quale è stata ricavata la tubercolina.
27. Dei laboratori comunitari designati conformemente all'art. 3
verranno incaricati di controlli complementari delle tubercoline
normalmente utilizzati nei vari Stati membri per assicurare che
l'attività di ciascuna di queste tubercoline sia conforme a quella
della corrispondente tubercolina standard comunitaria. Tali analisi
devono essere effettuate su bovini tubercolotici, su cavie
opportunamente sensibilizzate e mediante appropriate reazioni
chimiche.
28. Sono riconosciute ufficialmente le seguenti tecniche di
intradermotubercolinizzazione:
a) intradermotubercolinizzazione unica: inoculazione singola di
tubercolina bovina;
b) intradermotubercolinizzazione comparativa: inoculazione
simultanea delle due tubercoline (aviaria e bovina).
29. La dose di tubercolina inoculata non deve essere inferiore:
1) a 2.000 UTC di tubercolina bovina;
2) a 2.000 u.i. di tubercolina aviaria.
Il volume di ciascuna dose non deve superare 0,2 ml.
30. La tubercolinizzazione deve essere effettuata inoculando la
tubercolina, o le tubercoline, nella pelle del collo. I punti di
inoculazione devono trovarsi al limite tra il terzo anteriore ed il
terzo mediano del collo. Quando nello stesso animale vengono inocu-
late ambedue le tubercoline il punto di iniezione della tubercolina
aviaria deve trovarsi a 10 cm circa dalla cresta del collo ed il
punto di inoculazione della tubercolina bovina a 12,5 cm al di sotto
di una linea approssimativamente parallela a quella delle spalle, o
su diversi punti del collo; negli animali giovani, sul cui collo non
vi è abbastanza spazio per effettuare le due inoculazioni a distanza
sufficiente sullo stesso lato, ciascuna inoculazione va praticata su
uno dei due lati del collo, in punti identici, al centro del terzo
mediano del collo.
31. Tecnica ed interpretazione delle reazioni di
tubercolinizzazione.
a) Tecnica.
Tosare e pulire i punti di inoculazione. Prendere fra il pollice e
l'indice una piega di pelle in ciascuna delle zone depilate,
misurarne lo spessore con calibro e annotarne il risultato.
Introdurre obliquamente negli strati più profondi della pelle,
tenendo il taglio trasversale della punta rivolto verso l'esterno, un
ago corto sterile, collegato ad una siringa graduata caricata con la
tubercolina in esame. Iniettare la dose di tubercolina.
L'inoculazione è avvenuta in modo corretto se la palpazione rivela
un piccolo gonfiore, delle dimensioni di un pisello, in ciascun punto
di inoculazione. A distanza di 22 ore dall'inoculazione, misurare
nuovamente lo spessore della piega cutanea in ciascun punto di
inoculazione e annotarne il risultato.
b) Interpretazione delle reazioni.
- L'interpretazione delle reazioni deve essere fondata su
osservazioni cliniche e sulla registrazione dell'aumento, o degli
aumenti, dello spessore della piega cutanea nei punti di
inoculazione, 72 ore dopo l'inoculazione della tubercolina o delle
tubercoline;
ba) reazione negativa: si osserva solo un gonfiore circoscritto
con aumento di spessore della piega cutanea non superiore a 2 mm
senza segni clinici, quali edema diffuso od esteso, esudazione,
necrosi, dolore o infiammazione dei dotti linfatici della regione o
dei linfonodi.
bb) reazione dubbia: non si osservano segni clinici del tipo di
quelli menzionati al punto ba), e l'aumento dello spessore della
piega cutanea è superiore a 2 mm ed inferiore a 4 mm.
bc) reazione positiva: si osservano segni clinici del tipo di
quelli menzionati al punto ba), si riscontra un aumento di 4 mm o
più dello spessore della piega cutanea nel punto di iniezione.
32. Interpretazione delle intradermotubercolinizzazioni ufficiali:
a) Intradermotubercolinizzazione singola:
positiva: reazione secondo la definizione del par. 31 bc);
dubbia: reazione secondo la definizione del par. 31 bb);
negativa: reazione secondo la definizione del par. 31 ba).
Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione singola
non dà esito conclusivo devono essere sottoposti ad un'altra prova a
distanza di almeno quarantadue giorni.
Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova
devono essere ritenuti positivi.
Gli animali che risultano positivi
all'intradermotubercolinizzazione singola possono essere sottoposti
ad un'intradermotubercolinizzazione comparativa.
b) Intradermotubercolinizzazione comparativa per il
riconoscimento degli allevamenti ufficialmente indenni da tubercolosi
e per il mantenimento di tale qualifica:
positiva: reazione bovina positiva, superiore di oltre 4 mm alla
reazione alla tubercolina aviaria, ovvero presenza di segni clinici;
dubbia: reazione bovina positiva o dubbia, superiore da 1 a 4 mm
alla reazione alla tubercolina aviaria, ed assenza di segni clinici;
negativa: reazione bovina negativa, ovvero reazione bovina
positiva o dubbia, ma di intensità pari o inferiore ad una reazione
positiva o dubbia alla tubercolina aviaria ed assenza di segni
clinici in ambedue i casi.
Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione
comparativa non dà esito conclusivo devono essere sottoposti ad
un'altra prova a distanza di almeno quarantadue giorni.
Gli animali che non risultano negativi a questa seconda prova
devono essere ritenuti positivi.
c) Per gli allevamenti dove siano presenti animali per i quali si
ritenga che:
1) abbiano avuto una reazione dubbia ad una
intradermotubercolinizzazionesingola,
2) siano risultati positivi all'intradermotubercolinizzazione
singola, ma che sono in attesa di un nuovo controllo per
intradermotubercolinizzazione comparativa,
3) abbiano avuto una reazione dubbia ad una
intradermotubercolinizzazionecomparativa,
la qualifica di allevamento ufficialmente indenne da 'tubercolosì
può essere sospesa fino al momento in cui sia chiarito lo stato
degli animali di cui sopra.
33. Gli animali destinati al commercio intracomunitario devono
essere sottoposti a intradermotubercolinizzazione singola nei trenta
giorni precedenti lo spostamento; gli animali che mostrano un aumento
dello spessore della piega cutanea superiore a 2 mm o la presenza di
segni clinici non possono essere ammessi allo scambio
intracomunitario.
Gli animali provenienti dagli allevamenti di cui al par. 32,
lettera c), sono esclusi dagli scambi intracomunitari fino a quando
non sarà stato chiarito lo stato sanitario degli animali ivi
contemplati.

ALLEGATO C

BRUCELLOSI

A. Siero-agglutinazione.
1. Il siero agglutinante tipo deve essere conforme al siero
campione preparato dal Veterinary Laboratory Weybridge - Surrey,
Inghilterra.
L'ampolla deve contenere 1.000 unità internazionali (UI)
agglutinanti provenienti dalla liofilizzazione di 1 ml di siero
bovino.
2. La fornitura del siero tipo deve essere assicurata dal
Bundesgesundheitsamt, Berlino.
3. Il tasso delle agglutine brucellari di un siero deve essere
espresso in unità internazionali per ml (ad es.: siero X - 80 u.i.
per ml).
4. La lettura della siero-agglutinazione lenta in tubi deve
avvenire al 50% o al 75% di agglutinazione; l'antigene utilizzato
dovrà essere stato titolato nelle identiche condizioni in presenza
di siero tipo.
5. L'agglutinabilità dei vari antigeni nei confronti del siero
tipo deve essere compresa entro i seguenti limiti:
- se la lettura è fatta al 50%: tra 1/600 e 1/1000;
- se la lettura è fatta al 75%: tra 1/500 e 1/750.
6. Per la preparazione dell'antigene destinato alla siero-
agglutinazione in tubi (metodo lento) devono essere utilizzati i
ceppi Weybridge n. 99 e USDA 1119 o qualsiasi altro ceppo di
sensibilità equivalente.
7. I terreni di coltura utilizzati sia per la conservazione del
ceppo nel laboratorio che per la produzione dell'antigene devono
essere scelti in modo da non favorire la dissociazione batterica
(S-R); si dovrà impiegare di preferenza l'agarpatata.
8. L'emulsione batterica deve essere effettuata con soluzione
fisiologica (NaCI 8,5%) fenicato allo 0,5%. Non deve essere usato il
formolo.
9. Si devono incaricare del controllo ufficiale degli antigeni i
seguenti istituti ufficiali:
a) Germania: Bundesgesundheitsamt, Berlino;
b) Belgio: Institut national de recherches ve'te'rinaires,
Bruxelles;
c) Francia: Laboratoire central de recherches ve'te'rinaires,
Alfort;
d) Granducato del Lussemburgo: Istituto del paese fornitore;
e) Italia: Istituto superiore di sanità, Roma;
f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling
Rotterdam;
g) Danimarca: Statens veterinaere Serumlaboratorium, Kobenhavn
V;
h) Irlanda: The Veterinary Research Laboratory Departement of
Agricolture and Fisheries, Thorndale Beaumont Road, Dublin 9;
i) Regno Unito: - Gran Bretagna: The Central Veterinary Labora-
tory, Weybridge, Surrey England;
- Island del Nord: The Veterinary Research Laboratory, Stormont,
Belfast;
j) Grecia: Kthniatrikon Institoytoy Lovvdvn Kai Parasitikvn
Noshmatvn 1era odow75 Auhnai 301;
k) Spagna: Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de
Granada;
l) Portogallo: Laboratorio Naccional de Investigacao veterinaria
- Lisboa.
10. Gli antigeni possono essere forniti concentrati purchè il
coefficiente di diluizione richiesto sia indicato sull'etichetta del
flacone.
11. Per effettuare una siero-agglutinazione occorre preparare
almeno tre diluizioni per ogni siero. Le diluizioni del siero
sospetto devono essere affermate in modo che la lettura della
reazione al limite di infezione avvenga nel tubo mediano. In caso di
reazione positiva in questo tubo il siero sospetto conterrà quindi
almeno la quantità di 30 UI agglutinanti per millilitro.
B. Reazione di fissazione del complemento.
1. Come siero standard vale lo stesso substandard del siero della
brucellosi di cui al punto A 1 del presente allegato. Oltre alle
unità di agglutinazione internazionali (UAI), devono essere presenti
in un millilitro di questo siero della brucellosi liofilizzato 1.000
unità sensibilizzanti che fissano il complemento. Queste unità
sensibilizzanti sono denominate unità sensibilizzanti CEE (USC).
2. La fornitura del siero standardizzato è assicurata dal
BundesgesundheitSamt di Berlino.
3. Il tenore di anticorpi che fissano il complemento, in un siero,
va espresso in unità sensibilizzanti CEE (USC) (es.: siero x = USC
ml).
4. Un siero contenente in 1/ml 20 unità sensibilizzanti CEE (il
che corrisponde ad un'attività del 20% dell'attività del siero di
riferimento) o più, deve essere considerato positivo.
5. I sieri devono essere inattivati come segue:
a) bovini: 56 - 60C per 30-50 minuti;
b) suini: 60C per 30-50 minuti.
6. Per la produzione dell'antigene si devono usare i ceppi
Weybridge n. 99 o USDA 1119.
L'antigene è costituito da un'emulsione batterica in soluzione
fisiologica allo 0,85% o in soluzione tampone veronal.
7. Per la reazione si deve usare una dose di complemento che sia
maggiore della dose minima necessaria per una emolisi totale.
8. Nell'esecuzione della reazione, si devono effettuare ogni volta
i seguenti controlli:
a) controllo dell'effetto anticomplementare del siero;
b) controllo dell'antigene;
c) controllo delle emazie sensibilizzate;
d) controllo del complemento;
e) controllo di sensibilità della reazione con l'aiuto di un
siero positivo;
f) controllo della specificità della reazione con l'aiuto di un
siero negativo.
9. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri standard e
degli antigeni sono affidati agli organismi di cui al punto A 9 del
presente allegato.
10. Gli antigeni possono essere forniti in forma concentrata,
purchè sull'etichetta sia indicato il coefficiente di diluizione
necessario.
C. Prova dell'anello (Ring Test).
1. La prova dell'anello deve essere effettuata sul contenuto di
ogni bidone di latte o sul contenuto di ogni grande contenitore
dell'azienda.
2. L'antigene tipo da impiegare deve provenire da uno degli
istituti elencati al punto A 9, lettere da a) a j). Si raccomanda di
impiegare antigeni standardizzati secondo le raccomandazioni
dell'OMS/FAO.
3. L'antigene può essere colorato solo con ematossilina o
tetrazolo; occorre dare la preferenza all'ematossilina.
4. Se non sono utilizzati metodi di conservazione, la reazione
deve essere effettuata tra la 18a e la 24a ora successiva alla
mungitura. Qualora la prova sul latte debba essere effettuata oltre
24 ore dopo il prelievo del campione, si devono adottare sistemi di
conservazione. Come conservanti si possono utilizzare il formolo o il
cloruro mercurico; in tal caso, la prova deve essere effettuata entro
14 giorni successivi al giorno in cui è stato prelevato il campione.
In caso di utilizzazione del formolo, la concentrazione finale nel
campione di latte deve essere dello 0,2%; la proporzione tra la
quantità del latte e la soluzione di formolo da aggiungere deve
essere almeno di 10 a 1.
Al posto del formolo si può utilizzare il cloruro mercurico;
anche in tal caso la concentrazione finale nel latte deve essere
dello 0,2% e la proporzione tra la quantità di latte e la soluzione
del cloruro mercurico da aggiungere, di 10 a 1.
5. La reazione deve essere effettuata secondo uno dei seguenti
metodi:
- su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol-
ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,03 ml di uno degli
antigeni standardizzati colorati;
- su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol-
ume di latte di 1 ml cui sono stati aggiunti 0,05 ml di uno degli
antigeni standardizzati colorati;
- su un volume di latte di 8 ml cui sono stati aggiunti 0,08 ml
di uno degli antigeni standardizzati colorati;
- su una colonna di latte di almeno 25 mm di altezza e su un vol-
ume di latte di 2 ml cui sono aggiunti 0,05 ml di uno degli antigeni
standardizzati colorati.
6. La miscela di latte e di antigeni deve essere tenuta in
termostato a 37 C per almeno 45 e al massimo per 60 minuti. La prova
deve essere valutata entro 15 minuti dalla rimozione della soluzione
dal termostato.
7. La reazione deve essere valutata secondo il seguente criterio:
a) reazione negativa: latte colorato, crema decolorata;
b) reazione positiva: latte e crema colorati in modo identico o
latte decolorato e crema colorata.
D. Prova dell'antigene di Brucella tamponato.
La prova all'antigene di Brucella tamponato può essere effettuata
secondo uno dei seguenti metodi:
A. METODO MANUALE.
1. Come siero standard è impiegato il secondo siero
internazionale standard anti-Brucella abortus, fornito dal Central
Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey, Inghilterra.
2. L'antigene è preparato senza riferimento alla concentrazione
delle cellule, ma la sua sensibilità deve essere standardizzata
rispetto al secondo siero internazionale standard anti-Brucella
abortus, in modo tale che l'antigene dia reazione positiva con un
siero diluito 1:47,5 e reazione negativa con un siero diluito 1:55.
3. L'antigene deve essere sospeso in diluente per l'antigene di
Brucella tamponato a pH 3,65 (Più o Meno) 0,5, e può essere stato
colorato mediante rosa Bengala.
4. Per la preparazione dell'antigene devono essere utilizzati il
ceppo Weybridge n. 99 oppure l'USDA 1119 o qualunque altro ceppo di
sensibilità equivalente.
5. I terreni di coltura impiegati per la conservazione del ceppo
in laboratorio e per la produzione dell'antigene devono essere tali
da non provocare la dissociazione batterica (S-R); sono
raccomandabili il terreno agarpatata oppure i metodi di coltura
continua.
6. L'antigene deve essere controllato nei confronti di 8 sieri
liofilizzati riconosciuti rispettivamente positivi e negativi.
7. La sorveglianza e il controllo ufficiale dei sieri e degli
antigeni standard sono effettuati dagli organismi ufficiali elencati
nell'allegato C, punto A 9.
8. L'antigene deve essere fornito pronto per l'uso.
9. La prova dell'antigene di Brucella tamponato deve essere
effettuata nel modo seguente:
a) porre una goccia (0,03 ml) di antigene a fianco di una goccia
(0,03 ml) del siero su una piastra bianca;
b) mescolare con un agitatore, prima di linea retta, poi
tracciando dei cerchi del diametro di 10-12 mm circa;
c) agitare la piastra alternativamente per 4 minuti (circa 30
movimenti al minuto);
d) effettuare la lettura della prova in buone condizioni
d'illuminazione: in mancanza di agglutinazione la prova sarà
considerata negativa; qualsiasi grado di agglutinazione va
considerato positivo, salvo quando appare chiara un'eccessiva
essiccazione intorno ai margini.
B. METODO AUTOMATIZZATO.
Il metodo automatizzato deve essere sensibile ed esatto almeno
quanto il metodo manuale.
E. Prova dell'anello di latte, effettuata su plasma sanguigno.
A. PRELIEVO DEL PLASMA SANGUIGNO.
Le provette con il sangue teso non coagulabile mediante aggiunta
di EDTA sono centrifugate per 3 minuti a 3000 giri al minuto e poi
conservate per 12-24 ore a 37 C.
B. IMPOSTAZIONE DIAGNOSTICA.
Si versano 0,2 di plasma stabilizzato in una provetta contenente 1
ml di latte crudo. Dopo aver agitato, si aggiunge una goccia (0,05
ml) di antigene ABR e si agita nuovamente. L'antigene è
standardizzato rispetto ad un antigene standard messo a disposizione
dall'istituto menzionato al punto A 9 a).
Dopo aver lasciato riposare per 45 minuti ad una temperatura di
37 C, si esamina il risultato entro 15 minuti. La prova è
considerata positiva se l'anello di latte ha la stessa colorazione o
una colorazione più pronunciata di quella della colonna di latte.
F. Agglutinazione del plasma sanguigno.
Il plasma sanguigno ottenuto conformemente al metodo di cui alla
sezione E, punto A, può essere utilizzato immediatamente dopo
centrifugazione senza che sia necessario procedere alla
stabilizzazione termica.
Si mescolano 0,05 ml di plasma con 1 ml di antigene per la
sieroagglutinazione al 50%, il che corrisponde ad un titolo di
diluizione 1:20 nel caso della sieroagglutinazione. Si esamina il
risultato dopo aver lasciato riposare per 18-24 ore alla temperatura
di 37 C. La prova è considerata positiva se l'aggiudicazione è
uguale o superiore al 50%.
G. Prova di microagglutinazione.
1. Il diluente è preparato da una soluzione salina fisiologica
0,85% fenicata allo 0,5%.
2. L'antigene preparato nel modo descritto nei punti 6,7 e 8
dell'allegato C, punto A, e titolato nel modo descritto al punto A5
dell'allegato C. Al momento dell'uso dell'antigene si aggiunge
safranina 0 alla 0,02% (diluizione finale).
3. Il siero standard è lo stesso siero di cui al punto A1
dell'allegato C.
4. La fornitura del siero standard è assicurata dal
Bundesgesundheitsamt di Berlino.
5. La prova di microagglutinazione utilizza piastre fornite di
pozzetti a fondo conico e della capacità di 0,250 ml. La prova viene
eseguita nella maniera seguente:
a) prediluizioni dei sieri: a ciascun pozzetto di una piastra
contenente 0,075 ml di diluente si aggiungono 0,050 ml di ogni siero
in esame. Le mescolanze vengono agitate per 30 secondi.
b) Diluizioni scalari dei sieri: per ogni siero preparare almeno
tre diluizioni. A tale scopo a partire dalle prediluizioni (1:2,5) si
prelevano 0,025 ml di ciascun siero e si trasferiscono su una piastra
contenente 0,025 ml di diluizione. In tal modo la prima diluizione
viene portata dal valore di 1:5 e le successive vengono eseguite per
raddoppio.
c) Aggiunta dell'antigene: nei singoli pozzetti contenenti le diverse
diluizioni dei sieri in esame si aggiunge antigene in volume di 0,025
ml. Previa agitazione per 30 secondi le piastre vengono chiuse con i
rispettivi coperchi e poste a 37 C per 20-24 ore in
atmosfera umidificata.
d) Lettura dei risultati: si valuta il quadro della
sedimentazione dell'antigene mediante esame del fondo del pozzetto
riflesso da uno specchio concavo posto al di sotto di esso. Nel caso
di prova negativa l'antigene sedimenta sotto forma di un bottone
compatto, a margini netti e di colore rosso intenso. In caso di
positività si forma invece un velo diffuso, di colorito rosa ed
uniformemente distribuito. Le diverse percentuali di agglutinazione
vengono determinate per raffronto con controlli dell'antigene
indicanti 0,25, 50, 75 e 100% di agglutinazione. Il titolo di ciascun
siero viene espresso in UIA/ml. Nella prova è opportuno inserire
controlli costituiti da siero negativo e siero positivo diluito in
modo da contenere 30 UIA/ml.
H. Il saggio ELISA per la brucellosi bovina come descritto
all'allegato G.

ALLEGATO D

ANALISI DEL LATTE

1. Tutte le analisi del latte devono essere effettuate in
laboratori ufficialmente autorizzati.
2. I campioni di latte devono essere prelevati osservando le
seguenti condizioni:
a) i capezzoli devono essere disinfettati precedentemente con
alcool al 70%;
b) durante la riempitura i tubi devono essere mantenuti in
posizione iclinata;
c) i campioni di latte devono essere prelevati all'inizio della
mungitura, dopo l'eliminazione dei primi getti di ogni capezzolo;
d) un campione dev'essere prelevato su ogni quarto mammario; il
latte di tali campioni non può essere mescolato;
e) ogni campione deve comportare almeno 10 ml di latte;
f) qualora sia necessario un conservativo, si dovrà impiegare
l'acido borico allo 0,5%;
g) ogni tubo dev'essere munito di etichetta comprendente le
seguenti indicazioni:
il numero del contrassegno auricolare o qualsiasi altro mezzo
d'identificazione dell'animale;
la designazione del quarto mammario;
la data e l'ora del prelevamento;
h) i campioni devono essere accompagnati da un documento
contenente le seguenti indicazioni:
il nome e l'indirizzo del veterinario ufficiale;
il nome e l'indirizzo del proprietario;
gli elementi di identificazione dell'animale;
lo stadio di lattazione.
3. L'analisi del latte dev'essere praticata non oltre 30 giorni
prima del carico e deve sempre comportare un esame batteriologico
nonchè un White Side Test (WST) o un California-Mastiris-Test (CMT).
I risultati di ambedue gli esami devono essere negativi, fatte
salve le seguenti disposizioni:
a) se il risultato dell'esame batteriologico è positivo - anche
in mancanza di uno stato infiammatorio caratteristico - mentre il
risultato del WST o del CMT è negativo, deve essere effettuato un
secondo esame batteriologico almeno quaranta giorni dopo - entro il
termine di trenta giorni summenzionato. Questo secondo esame deve
stabilire:
aa) la scomparsa dei germi patogeni;
bb) l'assenza di antibiotici.
Inoltre, l'assenza di uno stato infiammatorio deve essere
accertata da un nuovo WST (o un nuovo CMT) che deve dare risultato
negativo;
b) qualora il risultato dell'esame batteriologico sia negativo,
mentre il WST (o CMT) è positivo, si deve procedere ad un esame
citologico completo che deve dare risultato negativo.
4. L'esame batteriologico deve comportare:
a) l'inseminazione del latte, su agar con sangue di bue o di
montone in piastre di Petri;
b) l'inseminazione del latte in terreno TKT o in terreno di
Edwars. L'esame batteriologico ha lo scopo di identificare qualsiasi
germe patogene e non può essere limitato a mettere in evidenza
streptococchi e stafilococchi specificamente patogeni. A tale scopo,
l'identificazione delle colonie sospette, ottenute mediante
inseminazione sui terreni suddetti, deve essere effettuata mediante
le classiche tecniche batteriologiche di differenziazione, quali
l'uso del terreno di Chapman per l'identificazione dei stafilococchi
e di vari terreni selettivi per l'isolamento degli enterobatteri.
5. L'esame citologico completo è destinato a mettere in evidenza,
eventualmente, uno stato infiammatorio caratteristico,
indipendentemente da qualsiasi sintomo clinico.
Questo stato infiammatorio viene rilevato quando la numerazione
leucocitaria secondo la tecnica di Breed raggiunge 1 milione di
leucociti per ml e il rapporto tra mononucleati e polinucleati è
inferiore a 0,5.

ALLEGATO E
Sono sogette a denuncia obbligatoria le malattie seguenti:
a) Malattie della specie bovina:
rabbia;
tubercolosi;
brucellosi;
afta epizootica;
carbonchio ematico;
peste bovina;
pleuropolmonite;
leucosi bovina enzootica.
b) Malattie della specie suina:
rabbia;
brucellosi;
carbonchio ematico;
afta epizootica;
paralisi contagiosa dei suini (morbo di Teschen);
peste suina;
malattia vescicolosa dei suini;
peste suina africana.

ALLEGATO F (3) (5) (6)

MODELLO I
Certificato sanitario (1) per gli scambi tra gli Stati membri della
CEE
- Bovini da allevamento o da produzione -

N. .............
Paese speditore: ..................................................
Ministero competente: ..............................................
Servizio territoriale competente: ..................................
I. Numero di animali: ..............................................
II. Identificazione degli animali.



| | | |
Numero | Vacca, toro, | Razza | Età | Contrassegni ufficiali,
degli | bue, giovenca, | | |altri contrassegni o dati
animali| vitello | | | segnaletici (indicare
| | | | numero e posto)
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |



III. Provenienza degli animali.
Gli animali hanno soggiornato almeno 3 mesi prima del giorno del
carico o sin dalla nascita nel territorio dello Stato membro
speditore.
IV. Destinazione degli animali.
Gli animali saranno spediti:
da ............................................................
(Luogo di spedizione)
a ............................................................
(Paese e luogo di destinazione)

a mezzo di (2): ferrovia (3), autocarro (3), aereo (3), nave (3).
Nome e indirizzo dello speditore: ..............................
....................................................................
Nome e indirizzo del destinatario: ..............................
....................................................................
V. Informazioni sanitarie.
Il sottoscritto certifica che gli animali sopraindicati rispondono
alle seguenti certificazioni:
a) sono stati esaminati in data odierna e non presentano alcun
sintomo clinico di malattia;
b) ( 4 )- sono stati vaccinati entro i termini prescritti di
almeno quindici giorni e non più di 4 mesi ( 5 ) contro i tipi A, O
e C del virus aftoso con un vaccino inattivato, ufficialmente
autorizzato e controllato (2 );
- sono stati rivaccinati contro i tipi A, O e C del virus aftoso
negli ultimi dodici mesi (5) con un vaccino inattivato, ufficialmente
autorizzato e controllato (2);
- non sono stati vaccinati contro l'afta epizootica (2);
c) provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne da
tubercolosi.
Il risultato dell'intradermotubercolinizzazione praticata nel
termine prescritto di trenta giorni (5) è stato negativo (2) (7);
d) - provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne
da brucellosi (2 );
- provengono da un allevamento bovino indenne da brucellosi (2);
- non provengono nè da un allevamento bovino ufficialmente
indenne da brucellosi nè da un allevamento bovino indenne da
brucellosi (2) (10).
La sieroagglutinazione praticata nel termine prescritto di trenta
giorni (5), ha rivelato un tasso brucellare inferiore a trenta unità
internazionali agglutinanti per millilitro (2) (8).
e) - sono stati mantenuti negli ultimi dodici mesi (5) o sedi
età inferiore a dodici mesi, dalla nascita, in un allevamento in
cui, nel corso degli ultimi tre anni (5), ha conoscenza del
sottoscritto e secondo le assicurazioni date dal proprietario, non è
stato accertato alcun caso di leucosi bovina enzootica (2) (12);
- provengono da un allevamento in cui nulla ha consentito di
desumere l'esistenza di casi di leucosi bovina enzootica (2);
- alla data dell'esame, tutti i bovini dell'allevamento di età
superiore a ventiquattro mesi sono stati sottoposti (2) (12) nel
corso degli ultimi 12 mesi (5) con risultato negativo, ad un esame
sierologico (10);
- hanno reagito negativamente (2) (9) (11) entro il termine
prescritto di trenta giorni (5) ad esame sierologico (10) per la
ricerca della leucosi bovina enzootica;
- sono stati destinati all'ingrasso (2);
f) non presentano alcun sintomo clinico di mastite; l'analisi -
la seconda analisi (2) - del latte praticata nel termine prescritto
di trenta giorni (5) non ha rivelato nè uno stato infiammatorio
caratteristico, nè germi patogeni specifici, nè inoltre - nel caso
di una seconda analisi - la presenza di antibiotici (2) (8);
g) non si tratta di animali che debbono essere eliminati nel
quadro di un programma nazionale di eradicazione delle malattie
contagiose;
h) negli ultimi trenta giorni (5) hanno soggiornato in
un'azienda situata nel territorio dello Stato membro speditore, nella
quale non è stata constatata ufficialmente, durante detto periodo,
alcuna delle malattie contagiose dei bovini soggette a denuncia
obbligatoria ai sensi delle disposizioni applicabili agli scambi
intracomunitari.
L'azienda è inoltre situata al centro di una zona indenne da
epizoozia e, secondo costatazioni ufficiali, è risultata essere
indenne, negli ultimi tre mesi (5), da afta epizootica e da
brucellosi bovina;
i) essi sono stati acquistati:
- presso un'azienda (2),
- su un mercato di animali da allevamento o da produzione
autorizzato ufficialmente per la spedizione verso un altro Stato
membro.............................. (2);
(Designazione del mercato)

j) sono stati trasportati direttamente passando - senza passare
(2 ) - per un luogo di raccolta:
- dall'azienda (2);
- dall'azienda al mercato e da questo (2) sul luogo esatto di
carico senza entrare in contatto con animali biungulati che non
fossero animali da allevamento o da produzione delle specie bovina e
suina rispondenti alle condizioni previste per gli scambi
intracomunitari, impiegando mezzi di trasporto e di contenzione
previamente puliti e disinfettati con un disinfettante ufficialmente
autorizzato.
Il luogo esatto in cui avviene il carico è situato al centro di
una zona indenne da epizoozia.
VI. Il consenso necessario per quanto riguarda:
- il punto V, lettera b), secondo termine dell'alternativa (2),
- il punto V, lettera b), terzo termine dell'alternativa (2),
- il punto V, lettera d), secondo termine dell'alternativa (2),
- il punto V, lettera d), terzo termine dell'alternativa (2),
è stato dato dal:
- Paese destinatario (2),
- Paese destinatario e da quelli di transito (2).
VII. La validità del presente certificato è di dieci giorni a
decorrere dalla data di carico
Fatto a .............................., addì ....................
(Giorno del carico)

Timbro
(Firma)
........................................................
Nome in lettere maiuscole e qualifica del firmatario (1)


(1) Ciascun certificato sanitario deve riferirsi al numero di
animali trasportati in uno stesso carro ferroviario, autocarro, aereo
o nave, provenienti dalla stessa azienda e aventi lo stesso
destinatario.
(2) Cancellare l'indicazione se essa è inutile o in caso di
deroga.
(3) Per i carri ferroviari e gli autocarri indicare il numero di
immatricolazione, per gli aerei il numero di volo e per le navi il
nome.
(4) In Belgio "Inspecteur veterinaire" oppure "Inspecteur
Dierenarts"; in Francia "Directeur des services veterinaires du
departement"; in Germania "Beamteter Ticrarzt"; in Italia
"Veterinario provinciale"; nel Lussemburgo "Inspecteur veterinaire";
nei Paesi Bassi: "Inspecteur districtshoofd"; in Danimarca:
"Autoriseret Dyrlaged"; in Irlanda "Veterinary Inspector"; nel Regno
Unito "Veterinary Inspector"; in Spagna: "Inspector veterinario; in
Portogallo: " Inspector Veterinario"; in Grecia: (Dicitura in lingua
greca)
(5) Il termine è riferito al giorno del carico.
(6) L'indicazione è necessaria solo per i bovini di età
superiore a quattro mesi.
(7) L'indicazione è necessaria solo per i bovini di età
superiore a sei settimane.
(8) L'indicazione è necessaria solo per i bovini di età
superiore a dodici mesi, salvo che non si tratti di bovini di cui
alla nota (10).
(9) L'indicazione è necessaria solo per le vacche lattifere.
(10) Questa deroga è possibile solo per i bovini di età
inferiore a trenta mesi, alla condizione che sul corpo di tali
animali sia marcato un contrassegno speciale e che essi siano
sorvegliati in modo speciale nel Paese destinatario.
(11) Questa eccezione è consentita solo per gli animali maschi di
età inferiore a trenta mesi destinati all'ingrasso, semprechè tali
animali rechino un contrassegno distintivo e siano sottoposti ad un
controllo particolare nel Paese di destinazione.
(12) L'esame sierologico è stato effettuato conformemente
all'allegato G della direttiva 64/422/CEE.



MODELLO II
Certificato sanitario (1 ) per gli scambi tra gli Stati membri della
CEE
- Bovini da macello (2) -

N. ..................
Paese speditore: ..................................................
Ministero competente: ..............................................
Servizio territoriale competente: ..................................
I. Numero di animali: ..............................................
II. Identificazione degli animali.



| |
Numero | Vacca, toro, | Contrassegni ufficiali,
degli | bue, giovenca, | altri contrassegni o dati
animali | vitello | segnaletici (indicare
| | numero e posto)
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |



III. Provenienza degli animali.
Gli animali hanno soggiornato almeno 3 mesi prima del giorno del
carico o sin dalla nascita nel territorio dello Stato membro
speditore.
IV. Destinazione degli animali.
Gli animali saranno spediti:
da ............................................................
(Luogo di spedizione)
a ............................................................
(Paese e luogo di destinazione)

a mezzo di (3): ferrovia (4), autocarro (4), aereo (4), nave (4).
Nome e indirizzo dello speditore: ..............................
....................................................................
Nome e indirizzo del destinatario: ..............................
....................................................................
V. Informazioni sanitarie.
Il sottoscritto certifica che gli animali sopraindicati rispondono
alle seguenti condizioni:
a) sono stati esaminati in data odierna e non presentano alcun
sintomo clinico di malattia;
b) (6) - sono stati vaccinati entro i termini prescritti di
almeno quindici giorni e non più (7) di dodici mesi;
quattro mesi, contro i tipi A, O e C del virus aftoso con un
vaccino inattivato, ufficialmente autorizzato e controllato (3);
- non sono stati vaccinati contro l'afta epizootica (3);
c) (6) - provengono da un allevamento bovino ufficialmente
indenne da tubercolosi (3 );
- non provengono da un allevamento bovino ufficialmente indenne
da tubercolosi; la intradermorubercolinizzazione praticata nel
termine prescritto di trenta giorni (7) è risultata negativa (3);
d) (6) - provengono da un allevamento bovino ufficialmente
indenne da brucellosi o da un allevamento bovino indenne da
brucellosi (3);
- non provengono nè da un allevamento bovino ufficialmente
indenne da brucellosi, nè da un allevamento bovino indenne da
brucellosi; la sieroagglunitazione, praticata nel termine prescritto
di trenta giorni (7), ha rivelato un tasso brucellare:
- inferiore a 30 Ul/ml (3),
- di 30 Ul/ml o più (3);
e) non si tratta di animali che debbono essere eliminati nel
quadro di un programma nazionale di eradicazione delle malattie
contagiose;
f) non provengono nè da un'azienda nè da una zona situata nel
territorio dello Stato membro speditore che, per la specie bovina,
sono oggetto di misure di divieto per motivi di polizia sanitaria ai
sensi della direttiva del Consiglio relativa a problemi di polizia
sanitaria in materia di scambi intracomunitari di animali delle spe-
cie bovina e suina;
g) sono stati acquistati:
- in un'azienda (3);
- su un mercato di animali da macello autorizzato ufficialmente
per la spedizione verso un altro Stato membro............ (3);
h) sono stati trasportati direttamente passando - senza passare
(3 ) - per un luogo di raccolta:
- dall'azienda (3);
- dall'azienda al mercato e da questo (3),
sul luogo esatto di carico, senza entrare in contatto con animali
biungulati che non fossero animali da macello delle specie bovina e
suina rispondenti alle condizioni previste per gli scambi
intracomunitari, impiegando mezzi di trasporto e di contenzione
previamente puliti e disinfettati con un disinfettante ufficialmente
autorizzato.
Il luogo esatto in cui avviene il carico è situato al centro di
una zona indenne da epizoozia.
VI. (6) Se del caso, l'accordo necessario concernente:
- il punto V, lettera b), secondo trattino (3);
- il punto V, lettera d) (tasso brucellare di 30 Ul/ml o piu')
(3),
è stato dato dal
- Paese destinatario (3),
- Paese destinatario e Paesi di transito (3).
VII. La validità del presente certificato è di dieci giorni a
decorrere dalla data di carico
Fatto a................................., addì...................
(Giorno del carico)

Timbro
.......................................................
(Firma)
Nome in lettere maiuscole e qualifica del firmatario
(1)


(1) Ciascun certificato sanitario deve riferirsi al numero di
animali trasportati in uno stesso carro ferroviario, autocarro, aereo
o nave, provenienti dalla stessa azienda e aventi lo stesso
destinatario.
(2) Bovini da macello: bovini destinati, subito dopo il loro
arrivo nel paese destinatario, ad essere condotti direttamente al
macello o a un mercato.
(3) Cancellare l'indicazione se essa è inutile o in caso di
deroga.
(4) Per i carri ferroviari e gli autocarri indicare il numero di
immatricolazione, per gli aerei il numero del volo e per le navi il
nome.
(5) In Belgio "Inspecteur ve'te'rinaire" oppure "Inspecteur
Dierenarts"; in Francia "Directeur des services ve'te'rinaires du
de'partement"; in Germania "Deamteter Tierarzt"; in Italia
"Veterinario provinciale"; nel Lussemburgo "Inspecteur
ve'te'rinaire"; nei Paesi Bassi: "Inspecteur districtshoold"; in
Danimarca: "Autoriseret Dyrlaged"; in Irlanda "Veterinary Inspector";
nel Regno Unito "Veterinary Inspector"; in Grecia: O Pro/'sta'menow
th(Paragrafo)w Kthniatrikhw(Paragrafo) (Esponenziale)Yphres/'aw
toy(Paragrafo) shme/'oy ejo'doy"; in Spagna: "Inspector Veterinario";
in Portogallo: "Inspector veterina'rio".
(6) Per i vitelli di età inferiore a quattro mesi non devono
essere fornite le indicazioni del punto V, lettere b), c) e d), del
precedente certificato.
(7) Il termine si riferisce al giorno del carico.

MODELLO III
Certificato sanitario (1) per gli scambi tra gli Stati membri della
CEE
- Suini da allevamento o da produzione -

N. .............
Paese speditore: ..................................................
Ministero competente: ..............................................
Servizio territoriale competente: ..................................
I. Numero di animali: ..............................................
II. Identificazione degli animali.



| | | |
Numero | Vacca, toro, | Razza | Età | Contrassegni ufficiali,
degli | bue, giovenca, | | |altri contrassegni o dati
animali| vitello | | | segnaletici (indicare
| | | | numero e posto)
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |
| | | |



III. Provenienza degli animali.
Gli animali hanno soggiornato almeno 3 mesi prima del giorno del
carico o sin dalla nascita nel territorio dello Stato membro
speditore.
IV. Destinazione degli animali.
Gli animali saranno spediti:
da ............................................................
(Luogo di spedizione)
a ............................................................
(Paese e luogo di destinazione)

a mezzo di (2): ferrovia (3), autocarro (3), aereo (3), nave (3).
Nome e indirizzo dello speditore: ..............................
....................................................................
Nome e indirizzo del destinatario: ..............................
....................................................................

V. Informazioni sanitarie.
Il sottoscritto certifica che gli animali suindicati rispondono
alle seguenti condizioni:
a) sono stati esaminati in data odierna e non presentano alcun
sintomo clinico di malattia;
b) provengono da un allevamento suino indenne da brucellosi:
- nel termine prescritto di trenta giorni (5) hanno rivelato un
tasso brucellare inferiore a 30 Ul/ml alla siero-agglutinazione e una
reazione negativa alla fissazione del complemento (2) e (6);
c) provengono:
- da un'azienda ufficialmente indenne da peste suina (2);
- da un'azienda indenne da peste suina (2);
e
i) non sono stati vaccinati contro la peste suina (2);
ii) sono stati vaccinati contro la peste suina;
un'autorizzazione del Paese destinatario è stata all'uopo
concessa (2).
d) non si tratta di animali che debbono essere eliminati nel
quadro di un programma nazionale di eradicazione delle malattie
contagiose;
e) negli ultimi trenta giorni (5 ) hanno soggiornato in
un'azienda situata nel territorio dello Stato membro speditore nella
quale, durante detto periodo, non è stata constatata ufficialmente,
nessuna delle malattie contagiose dei suini soggette a denuncia
obbligatoria ai sensi delle disposizioni applicabili agli scambi
intracomunitari.
Detta azienda, inoltre, è situata al centro di una zona esente da
epizoozia, e, secondo costatazioni ufficiali, è risultata essere
indenne, negli ultimi tre mesi (5), da afta epizootica, da malattia
vescicolosa dei suini da brucellosi bovina e suina, da peste suina e
da paralisi contagiosa dei suini (morbo di Teschen);
f) sono stati acquistati:
- presso un'azienda (2),
- su un mercato di animali da allevamento o da produzione
ufficialmente autorizzato per la spedizione verso un altro Stato
membro........................ (2);
Designazione del mercato)

g) sono stati trasportati direttamente passando - senza passare
(2 ) - per un luogo di raccolta:
- dall'azienda (2);
- dall'azienda al mercato e dal mercato (2) sul luogo esatto di
carico senza entrare in contatto con animali biungulati che non
fossero animali da allevamento o da produzione delle specie bovina o
suina rispondenti alle condizioni previste per gli scambi
intracomunitari, impiegando mezzi di trasporto ed eventualmente di
contenzione previamente puliti e disinfettati con un disinfettante
ufficialmente autorizzato.
Il luogo esatto del carico è situato al centro di zona indenne da
epizoozia.
VII. La validità del presente certificato è di dieci giorni a
decorrere dalla data di carico
Fatto a................................. , addì..................
(Giorno del carico)

Timbro
.......................................................
(Firma)
Nome in lettere maiuscole e qualifica del firmatario
(1)


(1) Ciascun certificato sanitario deve riferirsi al numero di
animali trasportati in uno stesso carro ferroviario, autocarro, aereo
o nave, provenienti dalla stessa azienda e aventi lo stesso
destinatario.
(2) Cancellare l'indicazione se essa è inutile o in caso di
deroga.
(3) Per i carri ferroviari e gli autocarri indicare il numero di
immatricolazione, per gli aerei il numero di volo e per le navi il
nome.
(4) In Belgio "Inspecteur veterinaire" oppure "Inspecteur
Dierenarts"; in Francia "Directeur des services veterinaires du
departement"; in Germania "Deamteter Terarzt"; in Italia "Veterinario
provinciale"; nel Lussemburgo "Inspecteur veterinaire"; nei Paesi
Bassi: "Inspecteur districtshoold"; in Danimarca: "Autoriseret
Dyrlaged"; in Irlanda "Veterinary Inspector"; nel Regno Unito
"Veterinary Inspector"; in Spagna: "Inspector veterinario; in
Portogallo: Inspector Veterinario"; in Grecia: (Dicitura in lingua
greca)".
(5) Il termine si riferisce al giorno del carico.
(6) La siero-agglutinazione e la reazione alla fissazione del
complemento sono praticate soltanto per i suini di peso superi 25
chilogrammi.


MODELLO IV
Certificato sanitario (1 ) per gli scambi tra gli Stati membri della
CEE
- Suini da macello (2) -

N. ..................
Paese speditore: ..................................................
Ministero competente: ..............................................
Servizio territoriale competente: ..................................
I. Numero di animali: ..............................................
II. Identificazione degli animali.



| |
Numero | Suini o , | Contrassegni ufficiali,
degli | suinetti | altri contrassegni o dati
animali | | segnaletici (indicare
| | numero e posto)
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |



III. Provenienza degli animali.
Gli animali hanno soggiornato almeno 3 mesi prima del giorno del
carico o sin dalla nascita nel territorio dello Stato membro
speditore.
IV. Destinazione degli animali.
Gli animali saranno spediti:
da ............................................................
(Luogo di spedizione)
a ............................................................
(Paese e luogo di destinazione)

a mezzo di (3): ferrovia (4), autocarro (4), aereo (4), nave (4).
Nome e indirizzo dello speditore: ..............................
....................................................................
Nome e indirizzo del destinatario: ..............................
....................................................................
V. Informazioni sanitarie.
Il sottoscritto certifica che gli animali suindicati rispondono
alle seguenti condizioni:
a) sono stati esaminati in data odierna e non presentano alcun
sintomo clinico di malattia;
b) non si tratta di animali che debbono essere eliminati nel
quadro di un programma nazionale di eradicamento delle malattie
contagiose dei suini;
c) non provengono nè da un'azienda nè da una zona situata nel
territorio dello Stato membro speditore che, per la specie suina,
sono oggetto di misure di divieto per motivi di polizia sanitaria ai
sensi della direttiva del Consiglio relativa a problemi di polizia
sanitaria in materia di scambi intracomunitari di animali delle spe-
cie bovina e suina;
d) sono stati acquistati:
- in un'azienda (3),
- su un mercato di animali da macello autorizzato ufficialmente
per la spedizione verso un altro Stato membro...................(3);
(Designazione del mercato

e) sono stati trasportati direttamente passando - senza passare
(3) - per un luogo di raccolta:
- dall'azienda (3);
- dall'azienda al mercato e dal mercato (3),
al luogo esatto di carico, senza entrare in contatto con animali
biungulati che non fossero animali da macello delle specie bovina e
suina rispondenti alle condizioni per gli scambi intracomunitari,
impiegando mezzi di trasporto ed eventualmente di contenzione
previamente puliti e disinfettati con un disinfettante ufficialmente
autorizzato.
Il luogo esatto in cui avviene il carico è situato al centro di
una zona indenne da epizoozia.
VII. La validità del presente certificato è di dieci giorni a
decorrere dalla data di carico
Fatto a................................. , addì..................
(Giorno del carico)

Timbro
.......................................................
(Firma)
Nome in lettere maiuscole e qualifica del firmatario
(1)


(1) Ciascun certificato sanitario deve riferirsi al numero di
animali trasportati in un solo carro ferroviario, autocarro, aereo o
nave, provenienti dalla stessa azienda ed avente lo stesso
destinatario.
(2) Suini da macello: suini destinati, subito dopo il loro arrivo
nel paese destinatario, ad essere condotti direttamente al macello o
a un mercato.
(3) Cancellare l'indicazione se è inutile o in caso di deroga.
(4) Per i carri ferroviari e gli autocarri indicare il numero di
immatricolazione, per gli aerei il numero del volo e per le navi il
nome.
(5) In Belgio "Inspecteur veterinaire" oppure "Inspecteur
Dierenarts"; in Francia "Directeur des services veterinaires du
departement"; in Germania "Deamteter Tierarzt"; in Italia
"Veterinario provinciale"; nel Lussemburgo "Inspecteur veterinaire";
nei Paesi Bassi: "Inspecteur districtshoold"; in Danimarca:
"Autoriseret Dyrlaged"; in Irlanda "Veterinary Inspector"; nel Regno
Unito "Veterinary Inspector"; in Spagna: "Inspector Veterinario"; in
Portogallo: "Inspector veterinario"; in Grecia: (Dicitura in lingua
greca)".

ALLEGATO G

Capitolo I

ALLEVAMENTI, STATI MEMBRI O REGIONI INDENNI DA LEUCOSI BOVINA
ENZOOTICA
A. Allevamento indenne da leucosi bovina enzootica.
1) Un allevamento nel quale:
i) nessun caso di leucosi bovina enzootica sia stato constatato,
clinicamente oppure come risultato degli esami effettuati
conformemente al capitolo II, nè confermato nel corso degli ultimi
due anni; e
ii) tutti gli animali di età superiore ai ventiquattro mesi
abbiano, nel corso dei precedenti dodici mesi, reagito negativamente
a due esami praticati conformemente al presente allegato ad un
intervallo di almeno quattro mesi; e
iii) al termine degli esami di cui al sottopunto ii), si trovino
unicamente gli animali nati in detto allevamento o che provengano da
un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica; e nel quale, dopo
la sua qualifica, gli animali di più di ventiquattro mesi abbiano
continuato a reagire negativamente ad uno degli esami praticati
conformemente al capitolo II ad un intervallo di tre anni e le
condizioni previste ai punti i) e iii) continuino ad essere
soddisfatte.
2) Un allevamento situato in uno Stato membro o in una regione
indenne da leucosi bovina enzootica.
B. Stato membro o regione indenne da leucosi bovina enzootica.
Uno Stato membro o una regione ai sensi dell'art. 2, lettera o),
di tale Stato membro:
1) nel quale o nella quale:
a) almeno il 99,8% degli allevamenti bovini siano indenni da
leucosi bovina enzootica ai sensi della lettera s), oppure
b) da un lato, durante gli ultimi cinque anni precedenti la
data di notifica della presente direttiva o durante gli ultimi tre
anni successivi a tale data, non sia stato notificato nè confermato
in alcun modo un caso di leucosi bovina enzootica e, dall'altro, nel
corso degli ultimi due anni,
i) i controlli estemporanei praticati in tutto il territorio
conformemente al capitolo II, effettuati per un periodo di due anni
su tutti gli animali di età superiore ai ventiquattro mesi in almeno
il 10% degli allevamenti abbiano dato risultati negativi; e
ii) tutti gli animali di età superiore ai ventiquattro mesi
abbiano reagito negativamente almeno una volta ad uno degli esami di
cui al capitolo II;
2) nel quale o nella quale, dopo aver soddisfatto le condizioni
di cui al punto 1):
i) ogni anno, un campione a caso con un tasso di certezza del
99% abbia dimostrato che meno dello 0,2% degli allevamenti era stato
infettato, oppure almeno il 20% di bovini di età superiore ai due
anni abbia reagito negativamente ad uno degli esami praticati in
conformità del capitolo II, e
ii) siano sempre soddisfatti i requisiti di cui al punto A 1).
C. Sospensione della qualifica di indennità dopo l'insorgere della
leucosi.
1. Se in un allevamento indenne da leucosi bovina enzootica un
animale ha reagito positivamente ad uno degli esami di cui al punto
ii) viene sospesa la qualifica di tale allevamento fino a quando
non vengano adottate le seguenti misure:
i) l'animale che ha reagito positivamente e, se si tratta di una
vacca, l'eventuale vitello debbono abbandonare l'allevamento ed
essere macellati sotto il controllo delle autorità veterinarie;
ii) gli altri animali debbono essere sottoposti ad un esame
sierologico individuale, che deve dare un risultato negativo,
effettuato conformemente al capitolo II almeno tre mesi dopo
l'eliminazione dell'animale positivo e della sua eventuale
discendenza;
iii) un'indagine epidemiologica deve essere svolta e gli
allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto
debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto ii).
Tuttavia, l'autorità competente può concedere una deroga
all'obbligo della macellazione del vitello di una vacca infetta,
qualora il vitello sia stato separato dalla madre dopo il parto. In
questo caso il vitello è sottoposto ai requisiti di cui al punto 2)
ii).
2) Se più di un animale di un allevamento indenne da leucosi
bovina enzootica ha reagito positivamente, viene sospesa la qualifica
di tale allevamento fino a quando non vengano adottate le seguenti
misure:
i) gli animali infetti e, se si tratta di vacche infette - salvo
deroga concessa dall'autorità competente a norma del punto 1) iii),
secondo comma -, i loro eventuali vitelli devono abbandonare
l'allevamento ed essere macellati sotto il controllo delle autorità
veterinarie;
ii) gli altri animali - compresi eventualmente i vitelli degli
animali infetti - di età inferiore a sei mesi debbono, previa
identificazione, restare nell'azienda fino a quando non siano
soddisfatte le condizioni relative agli esami di cui al punto A 1)
ii);
iii) l'allevamento deve restare sotto controllo ufficiale fino a
quando non siano nuovamente soddisfatte le condizioni di cui ai punti
A 1) ii) e iii);
iv) d'evessere effettuata un'indagine epidemiologica e gli
allevamenti epidemiologicamente collegati all'allevamento infetto
debbono essere sottoposti alle misure di cui al punto A 1) ii).
3) Se la leucosi bovina enzootica è stata constatata e
confermata su più dello 0,2% degli allevamenti della regione o dello
Stato membro, viene sospesa la loro qualifica e, oltre alle misure di
cui al punto 1) o 2), il 20% degli altri allevamenti della regione o
dello Stato membro deve essere soggetto ad uno degli esami di cui al
capitolo II, entro i termini fissati al punto A 1) ii).
La qualifica viene ripristinata in caso di risultato negativo di
tali esami.

Capitolo II
ESAMI PER LA RICERCA DELLA LEUCOSI BOVINA ENZOOTICA

La ricerca della leucosi bovina enzootica è effettuata mediante
un'esame di immunodiffusione come descritto nelle lettere A e B o
meidante un saggio di immunoassorbimento anzimatico (ELISA) come
descritto nella lettera C.
L'esame di immunodiffusione è effettuato solo in esami
individuali.
In caso di contestazione debitamente motivata del risultato degli
esami, si effettua un controllo complementare mediante un esame di
immunodiffusione.
A. Reazione di immunodiffusione su gel di agar.
1. L'antigene da impiegare nella prova deve contenere
glicoproteine del virus della leucosi bovina. Esso va standardizzato
rispetto a un siero di riferimento (siero E 1) fornito dal
laboratorio sierologico veterinario statale danese di Copenaghen.
2. La responsabilità della standardizzazione degli antigeni di
laboratorio rispetto al siero ufficiale CEE di riferimento (siero E
1) fornito dal laboratorio sierologico veterinario di Stato di
Copenaghen è affidata ai seguenti istituti:
a) Germania: Bundesforschungsanstaltfur Viruskrankheiten der
Tiere - Tubingen;
b) Belgio: Institut national de recherches veterinaires,
Bruxelles;
c) Francia: Laboratoire national des medicamentes veterinaires,
Fouge'res;
d) Granducato di Lussemburgo;
e) Italia: Istituto zooprofilattico sperimentale, Perugia;
f) Paesi Bassi: Centraal Diergeneeskundig Instituut, Afdeling
Rotterdam;
g) Danimarca: Statens Veterinare Serumlaboratorium, Kobenhavn;
h) Irlanda: Veterinary Research Laboratory, Abborstown, Dublin;
i) Regno Unito;
1) Gran Bretagna: The Central Veterinary Laboratory, Weybridge,
England;
2) Irlanda del Nord: The Veterinary Research Laboratory,
Stormont, Belfast;
j) Spagna: Subdireccion general de sanidad animal. Laboratorio
de sanidad i produce animal Algete (Madrid).
k) Portogallo: Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria,
Lisboa.
3. Gli antigeni standard di laboratorio devono essere presentati
almeno una volta all'anno ai laboratori di riferimento CEE elencati
al paragrafo 2 per essere esaminati in rapporto al siero CEE.
Indipendentemente da detta standardizzazione, l'antigene in uso può
essere standardizzato secondo la tecnica descritta alla lettera B.
4. I reattivi da impiegare sono i seguenti:
a) antigene: esso dovrà contenere le glicoproteine specifiche
del virus della leucosi bovina enzootica standardizzato rispetto al
siero ufficiale CEE;
b) siero in esame;
c) siero di controllo riconosciuto positivo;
d) gel di agar
0,8% di agar
8,5 di NaCl
tampone Tris 0,05 M a pH 7,2;
versare 15 ml di questo terreno in una scatola Petri del diametro di
85 mm, in modo da ottenere uno strato dello spessore di 2,6 mm.
5. Nell'agar sul fondo della scatola ricavare sette pozzetti,
esenti da umidità e distribuiti come segue: un pozzetto centrale e 6
pozzetti disposti in cerchio attorno ad esso; diametro del pozzetto
centrale: 4 mm, diametro dei pozzetti periferici: 6 mm, distanza fra
il pozzetto centrale e i pozzetti periferici: 3 mm.
6. Riempire il pozzetto centrale con l'antigene standard, i
pozzetti periferici 1 e 4 (vedi lo schema) con un siero riconosciuto
come positivo e i pozzetti 2, 3, 5 e 6 con i sieri in esame. Il
riempimento va effettuato fino a scomparsa del menisco.

1
o
6 o o 2
o
5 o o 3
o
4
7. Le quantità di reattivi da impiegare sono dunque le seguenti:
antigene: 32 microlitri,
siero di controllo: 73 microlitri,
sieri in esame: 73 microlitri.
8. Incubare per 72 ore a temperatura ambiente (20-27 C), in
atmosfera confinata ed umida.
9. La lettura può essere effettuata dopo 24 e 48 ore, ma non è
possibile ottenere il risultato finale prima di 72 ore.
a) Il siero in esame è positivo se forma una linea specifica di
precipitine con l'antigine del virus della LBE e una linea completa
di identità con il siero di riferimento;
b) il siero in esame è negativo se non forma una linea
specifica di precipitazione con l'antigene della LBE e se non provoca
l'incurvamento della linea del siero di riferimento;
c) la reazione è considerata non conclusiva:
i) se la linea del siero di riferimento si incurva verso
l'antigene della LBE senza formare con l'antigene una linea di
precipitine visibile, ovvero
ii) se non può essere, interpretata come negativa o positiva.
Quando la reazione non è conclusiva, la prova può essere ripetuta e
può essere impiegato siero concentrato.
B. Metodo per la standardizzazione dell'antigene.
Soluzioni e materiali necessari:
1. 40 ml di agarosio all'1,6% in tampone Tris/HC1 0,05m a pH 7,2,
contenente l'8,5% di NaCl;
2. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle
sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:10 in
tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl;
3. 15 ml di siero della leucosi bovina, contenente anticorpi delle
sole glicoproteine del virus della leucosi bovina, diluito 1:5 in
tampone Tris/HCl 0,05m a pH 7,2 contenente l'8,5% di NaCl;
4. 4 scatole Petri in plastica, del diametro di 85 mm;
5. un punzone del diametro di 4-6 mm;
6. antigene di riferimento;
7. antigene da standardizzare;
8. bagnomaria (56 C).
Modo da operare:
Sciogliere l'agarosio (1,6%) nel tampone Tris/HCI, riscaldando
cautamente a 100 C. Mettere in bagnomaria a 56 C per circa 1 ora.
Porre in bagnomaria a 56 C anche le deluizioni di siero della
leucosi bovina.
Mescolare 15 ml della soluzione di agarosio a 56 C con 15 ml di
siero della leucosi bovina (1:10), agitare rapidamente e versare due
porzioni da 15 ml della miscela in due scatole Petri. Ripetere il
procedimento con il siero della leucosi bovina diluito 1:5.
Quando l'agarosio si è solidificato, praticare i pozzetti secondo
il seguente schema:



Parte di provvedimento in formato grafico





Aggiunta di antigene
I. Scatole Petri 1 e 3:
pozzetto A - antigene di riferimento non diluito,
pozzetto B - antigene di riferimento, diluito 1:2,
pozzetto C + E - antigene di riferimento,
pozzetto D - antigene da controllare, non diluito.
II. Scatole Petri 2 e 4:
pozzetto A - antigene in esame, non diluito,
pozzetto B - antigene in esame, diluito 1:2,
pozzetto C - antigene in esame, diluito 1:4,
pozzetto D - antigene in esame, diluito 1:8.
Istruzioni complementari
1. Per realizzare una precipitazione ottimale, l'esperimento va
effettuato con due diluizioni di siero (1:5 e 1:10).
2. Se il diametro di precipitazione è troppo piccolo ad ambedue
le diluizioni, il siero va ulteriormente diluito.
3. Se la precipitazione per ambedue le diluizioni è indistinta e
il diametro è troppo grande, per il siero va scelta una diluizione
inferiore.
4. La concentrazione finale dell'agarosio deve essere dello 0,8%;
quella dei sieri deve essere rispettivamente del 5% e del 10%.
5. Riportare i diametri misurati sull'accluso sistema di assi
coordinati. La diluzione di lavoro deve corrispondere alla diluzione
dell'antigene sotto prova che ha lo stesso diametro dell'antigene di
riferimento.


|
13 -|
|
12 -|
|
11 -|
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10 -|
|
9 -|
|
8 -|
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7 -|
|
6 -|
|
5 -|
|
4 -|
|
3 -|
|
2 -|
|
1 -|
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| | 1 : 3 |1 : 5 1 : 6 1 : 7 |


1 : 1 1 : 2 1 : 4 1 : 8
Diluizioni dell'antigene
C. Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la ricerca
della leucosi bovina enzootica.
1. Per procedere al saggio ELISA occorrono le attrezzature e i
reattivi qui indicati:
a) micropiastre, cuvette o qualsiasi altro recipiente per la
fase solida;
b) l'antigene è fissato sulla fase solida con o senza l'ausilio
di anticorpi leganti policlonali o monoclonali. Se la fase solida è
rivestita direttamente dall'antigene, tutti i campioni in esame che
presentano reazione positiva devono essere riesaminati facendo
riferimento all'antigene di controllo. Nel caso dell'E.B.L.
l'antigene di controllo dovrebbe essere identico all'antigene in
questione, fatta eccezione per gli antigeni del virus della leucosi
bovina. Se gli anticorpi leganti sono distribuiti sulla fase solida,
gli anticorpi non devono reagire ad antigeni diversi da quelli del
virus della leucosi bovina;
c) il fluido biologico da esaminare;
d) controlli positivi e controlli negativi corrispondenti;
e) il coniugato;
f) un substrato adatto all'enzima impiegato;
g) una soluzione di arresto, se necessario;
h) soluzioni per la diluizione dei campioni per la preparazione
dei reattivi e per il lavaggio;
i) un sistema di lettura corrispondente al substrato impiegato.
2. Standardizzazione e sensibilità della prova:
a) Per la leucosi bovina enzootica la sensibilità del saggio
ELISA deve essere di livello tale che il siero E4 risulti positivo
quando è diluito 10 volte (campioni di siero) o 250 volte (campioni
di latte) più della diluizione ottenuta da singoli campioni presi
congiuntamente.
Nelle prove in cui i campioni (siero e latte) sono esaminati
individualmente, il siero E4 diluito nella proporzione di 1:10: (nel
siero negativo) o di 1:250 (nel latte negativo) deve presentare una
reazione positiva quando è esaminato in una diluizione di prova
uguale a quella impiegata per le prove individuali. Gli istituti
ufficiali indicati nel punto A.2 sono responsabili del controllo di
qualità del metodo ELISA, in particolare per determinare, per ogni
lotto di produzione, il numero di campioni da mettere in comune in
funzione del titolo ottenuto per il siero E4.
Il siero E4 è fornito dal laboratorio veterinario nazionale di
Copenaghen.
b) Per la brucellosi:
1) i campioni di latte sfuso vengono classificati negativi se
danno una reazione inferiore al 50% di quella data da una diluizione
1:10.000 del secondo siero standard internazionale della brucellosi
diluito in latte negativo;
2) i campioni singoli di siero vengono classificati negativi se
danno una reazione inferiore al 10% di quella data da una diluizione
di 1:200 del secondo siero standard internazionale della brucellosi
diluito in soluzione salina o qualsiasi altra soluzione riconosciuta
secondo la procedura prevista all'articolo 12 previo parere del
Comitato scientifico veterinario. Gli standard ELISA della brucellosi
devono essere quelli specificati nell'allegato C, punti A.1 e A.2 (da
usare alle diluizioni indicate sull'etichetta).
3. Condizioni di impiego del saggio ELISA per la ricerca della
leucosi bovina enzootica e della brucellosi bovina:
Il metodo ELISA può esser utilizzato su un campione di latte o
di siero prelevato dal latte proveniente da un'azienda in cui almeno
il 30% delle vacche da latte sono in lattazione.
In caso di ricorso alla facoltà precitata devono essere prese
misure per assicurare una corrispondenza tra i campioi prelevati e
gli animali da cui provengono il latte o i sieri esaminati.
In caso di risultato positivo su uno dei campioni, sono
applicabili le disposizioni previste nell'allegato A, capitolo II,
punto A1 c) i) per quanto concerne la brucellosi bovina e nel
presente all'allegato, capitolo I, punto A1 per quanto concerne la
EBL.