Serie Generale n. 168 del 20-7-1989
SUPPLEMENTI ORDINARI
MINISTERO DELL'AGRICOLTURA E DELLE FORESTE
MINISTERO DELL'AGRICOLTURA E DELLE FORESTE
DECRETO MINISTERIALE 3 febbraio 1989
Approvazione dei metodi ufficiali di analisi per le conserve vegetali - parte generale. (GU Serie Generale n.168 del 20-07-1989 - Suppl. Ordinario n. 51)

IL MINISTRO DELL'AGRICOLTURA E DELLE FORESTE
DI CONCERTO CON
I MINISTRI DELLE FINANZE, DELLA SANITÀ, DELL'INDUSTRIA, DEL
COMMERCIO E DELL'ARTIGIANATO
Visti l'art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033,
convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la
repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di
sostanze di uso agrario e di prodotti agrari e l'art. 108 del
regolamento per la esecuzione dello stesso regio decreto-legge,
approvato con regio decreto 1 luglio 1926, n. 1361, i quali
prescrivono che le analisi occorrenti in applicazione delle norme
contenute nel regio decreto-legge e nel regolamento suddetti dovranno
essere eseguite, dai laboratori incaricati, con i metodi prescritti
da questo Ministero, di concerto con quelli delle finanze e della
sanità;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 26 marzo 1980, n.
327 "Regolamento di esecuzione della legge 30 aprile 1962, n. 283 e
successive modificazioni, in materia di disciplina igienica della
produzione e della vendita delle sostanze alimentari e bevande";
Visti i decreti ministeriali 25 marzo 1961, pubblicato nella Gazzetta
Ufficiale n. 105 del 29 aprile 1961 e 12 settembre 1974, pubblicato
nella Gazzetta Ufficiale n. 29 del 30 gennaio 1975, concernenti
"Metodi ufficiali di analisi delle conserve vegetali";
Ritenuto opportuno porre a disposizione di tutti gli istituti e
laboratori pubblici idonei metodi di analisi per il controllo delle
conserve vegetali, perchè le analisi da essi compiute risultino
uniformi nei procedimenti e nei risultati;
Ritenuto altresì di procedere all'aggiornamento dei metodi di
analisi di cui ai predetti decreti ministeriali 25 marzo 1961 e 12
settembre 1974;
Sentito il parere della commissione per l'aggiornamento dei metodi
ufficiali di analisi per i prodotti agrari e per le sostanze di uso
agrario - sottocommissione conserve vegetali, di cui al decreto
ministeriale 11 febbraio 1981, pubblicato nella Gazzetta Ufficiale n.
204 del 27 luglio 1981;
Decreta:
Art. 1.
Sono approvati i "Metodi ufficiali di analisi per le conserve
vegetali - parte generale", descritti nell'allegato al presente
decreto.

Art. 2.
1. Sono abrogati i "Metodi ufficiali di analisi per le conserve
vegetali", approvati col decreto ministeriale 25 marzo 1961,
limitatamente alla parte descritta nel titolo I e nel titolo II.
2. È abrogato inoltre il decreto ministeriale 12 settembre 1974 con
cui è stato approvato il supplemento n. 1 ai predetti metodi
ufficiali di analisi.
3. Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, addì 3 febbraio 1989
Il Ministro dell'agricoltura e delle foreste
MANNINO
Il Ministro delle finanze
COLOMBO
Il Ministro della sanità
DONAT CATTIN
Il Ministro dell'industria, del commercio e dell'artigianato
BATTAGLIA

METODI UFFICIALI DI ANALISI PER LE CONSERVE VEGETALI
DISPOSIZIONI GENERALI CONCERNENTI I REATTIVI E L'APPARECCHIATURA DA
UTILIZZARE SECONDO I METODI DI ANALISI
1) Salvo specifiche indicazioni dei metodi di analisi, tutti i
reattivi devono essere di purezza analitica (p.a)
2) Le operazioni di soluzione, diluizione, risciacquo e lavaggio,
menzionate nei metodi di analisi senza precisazioni sulla natura del
solvente o del diluente, implicano l'impiego di acqua. Di norma
l'acqua deve essere distillata o demineralizzata di purezza
equivalente. In casi particolari, indicati nei metodi di analisi,
essa deve essere sottoposta a procedimenti specifici di
purificazione.
3) Tenuto conto dell'abituale equipaggiamento dei laboratori di
controllo, l'apparecchiatura descritta nei metodi di analisi si
limita agli strumenti ed agli apparecchi speciali o che impongano
esigenze specifiche.
4) Il risultato deve essere espresso secondo le indicazioni fornite
dai metodi di analisi con un numero appropriato di cifre
significative.
5) per bilancia analitica si intende una bilancia con la sensibilità
di 0,0001 g.
per bilancia tecnica si intende una bilancia con la sensibilità di
0,01 g.
ABBREVIAZIONI E SIMBOLI USATI NEL TESTO
AA = assorbimento atomico
b.m = bagno maria
C = grado centigrado
ca. = circa
conc. = concentrato
d20 = densità a 20C
kg = chilogrammo
g = grammo
GC = gas-cromatografia
h = ora
hl = ettolitro (1021)
HPLC = cromatografia liquida ad alta pressione
IR = infrarosso
l = litro
m = metro
M = fattore di molarità
mA = milli Ampere
meq = milli equivalenti
min = minuto primo
mg = milligrammo (10-3 g)
ml = millilitro (10-3 1)
nm = nanometro (10-9 m)
p.e. = punto di ebollizione
p.f. = punto di fusione
pH = logaritmo decimale dell'inverso della concentrazione
idrogenionica
m/m = massa/massa
ppm = parti per milione (10-6)
ppb = parti per miliardo (10-9)
ps = peso specifico
m/v = massa/volume
Rf = rapporto fronte macchia/solvente
s = secondo
t = temperatura
TLC = cromatografia su strato sottile
UV = ultravioletto
U.I. = unità internazionale
v/v = volume/volume
ug = gamma o microgrammo (10-6g)
um = micron o micrometro (10-6m)
(delta) = lunghezza d'onda
ul = microlitro (10-61)
(diametro) = diametro
TABELLA di corrispondenza tra i metodi descritti nel Titolo II
dell'allegato al D.M. 25 marzo 1961, ora abrogati, e quelli riportati
nel Titolo II dell'allegato al presente decreto.
TITOLO II TITOLO II
D.M. 25 marzo 1961 D.M. 3 febbraio 1989
1. 1.
2. 6. - 7.
3. 8.
4. 2.
5. 11.
6. 12.
7. 13. - 14.
8. 15.
9. 16.
10. 17.
11. 18.
12. 19. - 20. - 21. - 22. - 23.
13. 33.
14. 24. - 25. - 26.
15. 27. - 28. - 29. - 30. - 31.
16. 32.
17. 34.
18. 35.
PARTE GENERALE
TITOLO I
PRELIEVO DEI CAMPIONI DA SOTTOPORRE ALL'ANALISI
Per quanto riguarda le norme da seguirsi nel prelievo dei campioni da
sottoporre all'analisi ed alla stesura dei relativi verbali ci si
deve attenere a quanto riportato nel D.P.R. 26 marzo 1980 no 327,
Titolo I e relativo Allegato A.
TITOLO II
DETERMINAZIONI ANALITICHE DI CARATTERE GENERALE
1. - Esame macroscopico ed organolettico della merce
(Recipiente e contenuto)
Qualora si debba accertare la sterilità del prodotto ed eseguire il
conteggio delle muffe, il campione ancora chiuso deve essere inviato,
per il prelievo del materiale, al laboratorio incaricato dell'analisi
microbiologica.
Prima di aprire il campione, si deve eseguire l'esame esterno del
recipiente (etichetta, litografia, indicazioni in rilievo, spandenza,
tic-tac, gonfiore, arrugginimento, ecc.).
Devesi anche verificare l'aggraffatura prima e dopo l'apertura del
recipiente.
All'apertura si esaminano le condizioni interne del recipiente
(verniciatura, corrosione, ecc.) le caratteristiche organolettiche
del prodotto (colore, sapore, odore, consistenza) e l'eventuale
presenza di sostanze grossolane, estranee alla composizione della
conserva (piccioli, foglie, noccioli, vermi, insetti, ecc.).
Prima dell'analisi il campione deve venire accuratamente
omogeneizzato; nel caso di prodotti costituiti da parti liquide e
solide, si procede come indicato alle singole voci.
2. - Esame microscopico
1. OGGETTO
Il metodo consente di individuare la natura delle sostanze insolubili
presenti nel prodotto, siano esse elementi caratteristici di ogni
vegetale, siano parassiti animali e vegetali.
2. PRINCIPIO
L'osservazione è principalmente rivolta alla forma ed alla
dimensione delle cellule del periderma e del mesocarpo nonchè ai
vasi ed agli altri elementi caratteristici del pericarpo e dei semi.
3. REATTIVI
3.1. Liquido di Lugol. Sciogliere in 300 ml di acqua 1 g di iodio e 2
g di potassio ioduro.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Microscopio binoculare con ingrandimenti a 10 a 600 diametri.
5. MODO DI OPERARE
Allestire il preparato diluendo una piccola quantità del campione
con acqua o glicerina; 1 o 2 gocce del preparato sono posate sul
vetrino e osservate al microscopio (4.1) con adatti ingrandimenti.
Nel caso si debba evidenziare la presenza di sostanze amidacee,
diluire una piccola quantità di campione con liquido di Lugol (3.1).
3. - Determinazione del peso netto
1. OGGETTO
Il metodo permette la determinazione del peso netto del prodotto
privo del contenitore.
2. PRINCIPIO
Il peso netto si determina sottraendo dal peso lordo del contenitore
vuoto.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Bilancia tecnica
5. MODO DI OPERARE
Pesare con la bilancia tecnica (4.1) il contenitore pieno, svuotarlo,
del suo contenuto, lavarlo ed asciugarlo. Pesare il contenitore
vuoto.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore del peso netto Pn (arrotondato al grammo) è dato da:
Pn = P - p
dove:
p = peso del contenitore pieno
p = peso del contenitore vuoto
4. Determinazione del peso del prodotto sgocciolato
1. OGGETTO
Il metodo permette la determinazione del peso separato dalla parte
liquida per sgocciolamento su un setaccio di caratteristiche
determinate.
2. PRINCIPIO
Il peso sgocciolato si determina sottraendo il peso del setaccio
vuoto da quello del setaccio e del suo contenuto dopo sgocciolamento.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Setaccio no 5 della serie italiana UNI n. 2331 (1980) (luce
netta per maglia 2,8 mm) munito del piatto di raccolta (diametro 20
cm per scatole del formato fino a 1 Kg compreso, diametro 30 cm per
scatole del formato superiore a 1 Kg fino a 5 Kg compreso)
4.2. Bilancia tecnica.
5. MODO DI OPERARE
Pesare il setaccio con il piatto di raccolta (4.1) e portare il
prodotto a temperatura ambiente (20-25C). Svuotare l'intero
contenuto del recipiente sul setaccio senza piatto. Distribuire il
contenuto uniformemente su tutta la superficie del setaccio. Nel caso
di frutta sciroppata o all'acqua, i mezzi frutti presenti devono
essere posti sul setaccio con la parte convessa rivolta verso l'alto.
Inclinare leggermente il setaccio senza muovere il contenuto per
facilitare lo sgocciolamento e lasciare sgocciolare per 2 min.
Riporlo sul piatto di raccolta e pesare il tutto.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore del peso del prodotto sgocciolato Ps, arrotondato al
grammo, è dato da
Ps = P - p
p = peso del setaccio con il piatto ed il prodotto sgocciolato
p = peso del setaccio vuoto con il piatto
5. - Determinazione dei solidi totali o sostanza secca
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare i solidi totali o sostanza secca
del prodotto in esame.
2. PRINCIPIO
I solidi totali si determinano per via diretta, facendo evaporare il
prodotto a 70C a pressione ridotta, oppure sempre a 70C, a
pressione normale.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Capsula di porcellana o metallica a fondo piatto (diametro 75 mm
circa)
4.2. Bilancia analitica
4.3. Stufa a vuoto termoregolata a 70C + - 2C
4.4. Stufa ad aria termoregolata a 70C + - 2C
5. MODO DI OPERARE
5.1. Essiccazione a 70C a pressione ridotta. Pesare (4.2) una
determinata quantità di sostanza (1-2 g a seconda dell'umidita')
distribuirla uniformemente sul fondo di una capsula (4.1)
preventivamente tarata. Se la sostanza è molto pastosa si può
diluire con poca acqua, evaporando poi a b.m. l'acqua aggiunta, per
evitare che nella stufa a vuoto il prodotto entri in ebollizione
provocando spruzzi. Porre poi la capsula in stufa riscaldata a 70C
con depressione di 650-660 mm di mercurio (4.3). Essiccare per almeno
4 h, raffreddare in essiccatore e pesare.
La sostanza secca da pesare deve aggirarsi intorno a 0,5 g; tale
quantità corrisponde a circa 13 mg per cm2.
5.2. Essiccazione a 70C a pressione normale. Si opera con la
medesima tecnica descritta in (5.1) effettuando l'essiccazione in
stufa ad aria (4.4) per 4 h, prolungandone la durata se necessario.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore percentuale dei solidi totali St, arrotondato alla seconda
cifra decimale, è dato da
100 (c - a)
St =
(b - a) p
dove:
a = capsula vuota
b = capsula con il prodotto prima dell'essiccamento
c = capsula con il prodotto dopo l'essiccamento
p = peso della sostanza in g
6. Determinazione dell'umidità
1. OGGETTO
L'umidità delle conserve vegetali rappresenta convenzionalmente il
valore percentuale complementare a quello dei solidi totali e di
norma viene ottenuta per differenza.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
la percentuale in peso di umidità, espressa con due cifre decimali,
è data da:
% H2O = 100 St
dove: St = % solidi totali
7. Determinazione dell'umidità nei prodotti disidratati
1. OGGETTO
Per prodotti a basso contenuto di acqua, come gli essiccati,
l'umidità viene determinata direttamente con il metodo Karl Fischer.
2. PRINCIPIO
Determinazione dell'acqua con uno speciale reattivo iodo-solforoso in
presenza di alcool metilico con rilevamento del punto finale della
titolazione mediante metodo elettrometrico.
3. REATTIVI
3.1. Reattivo di Karl Fischer. Il reattivo si trova già pronto in
commercio o si prepara come segue: sciogliere 133 g di I2 in 425 ml
di piridina anidra in un matraccio privo di umidità e con tappo di
vetro. Aggiungere 425 ml di metanolo anidro, raffredare sotto i 4C e
fare sciogliere per gorgogliamento 102-105 g di SO2. Agitare bene e
lasciare riposare per almeno 12 h. Il reattivo è sufficientemente
stabile ma deve essere normalizzato ad ogni serie di determinazioni.
3.2. Metanolo anidro. Il reattivo si trova già pronto in commercio o
si prepara distillando su magnesio il metanolo assoluto commerciale.
3.3. Sodio tartrato biidrato. "60 mesh" (i g corrisponde a 156,6 mg
di H20).
4. APPARECCHIATURA
4.1. Titolare Karl Fischer.
5. MODO DI OPERARE
5.1. Titolazione del reattivo (3.1)
Nel recipiente di titolazione si pongono 25-50 ml di alcool metilico
anidro (3.2) fino a coprire gli elettrodi. Mettere in funzione
l'agitatore magnetico regolando la velocità in modo da ottenere una
buona agitazione, senza spruzzi, facendo in modo che l'ancoretta
introdotta nel recipiente non tocchi gli elettrodi. Si titola con il
reattivo (3.1) fino al raggiungimento del punto finale evidenziato
dal brusco innalzamento della corrente. Verso la fine titolare
lentamente, fino a che 0,1 ml di reattivo (3.1) aggiunto lascino alto
il passaggio di corrente(mA) per 60 s.
In molti apparecchi la fine della titolazione viene segnalata
automaticamente.
Si aggiungono circa 0,5 g di sodio tartrato biidrato(3.3),
esattamente pesati e si titola nuovamente.
Il titolo del reattivo (3.1) in mg H2o/ml sara':
p.0,156
f =
b - a
dove:
p = mg di sodio tartrato biidrato
a = ml del reattivo 3.1 per titolare il metanolo
b = ml del reattivo 3.1 per titolare metanolo + sodio tartrato
biidrato
5.2. Determinazione dell'H2O nel campione.
Si introducono nel recipiente di titolazione 25-50 ml di metanolo
(3.2) che si titolano col reattivo (3.1) e dopo, rapidamente si
aggiunge una quantità esattamente pesata della sostanza in esame. Si
titola come indicato sopra (vedi 5.1.).
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La percentuale in peso di umidità espressa con due cifre decimali è
data da:
f (b - a)
% di H2O =
10 p
dove: f = titolo del reattivo (3.1)
a = ml del reattivo (3.1) per titolare il metanolo
b = ml del reattivo (3.1) per titolare il metanolo + il campione
p = peso in g del campione
Nota
L'apparecchiatura nuova o non usata di recente non fornisce dati
attendibili per l'umidità in essa presente; è necessario in tal
caso ripetere più volte la determinazione in modo da essiccare tutto
il sistema di titolazione.
8. - Determinazione del residuo secco solubile per via
rifrattometrica (residuo ottico)
1. OGGETTO
Il metodo permette di calcolare per via rifrattometrica il residuo
secco solubile, inteso come percentuale in peso di saccarosio di una
soluzione di saccarosio avente lo stesso indice di rifrazione del
prodotto analizzato. La presenza di aminoacidi, di sali di acidi
organici, di flavonoidi e di sostanze minerali fa variare l'indice di
rifrazione. Nel caso di diluizione del prodotto, il metodo non tiene
conto della presenza dei solidi insolubili e dell'assorbimento delle
sostanze solubili da parte di questi.
2. PRINCIPIO
Il residuo secco solubile si determina per via indiretta deducendolo
dal valore del suo indice di rifrazione.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Rifrattometro del tipo Abbe provvisto di una scala indicante le
percentuali in peso di saccarosio con una tolleranza 0,1. Esso deve
essere concepito in modo da permettere la facile e rapida
introduzione dei campioni e da poter essere agevolmente pulito. Il
rifrattometro deve essere provvisto di un termometro la cui scala si
intenda almeno da +15C a +25C nonchè di un ultratermostato a
circolazione d'acqua che permetta di effettuare le misurazioni a una
temperatura di +20C con una approssimazione di + 0,5C e di un
dispositivo di illuminazione.
Le istruzioni operative riguardanti lo strumento devono essere
osservate rigorosamente, specie per quanto riguarda la scala di
gradazione e l'intensità della fonte luminosa.
5. MODO DI OPERARE
5.1. Preparazione del campione
5.1.1. Prodotti liquidi e limpidi.
Mescolare con cura e procedere alla determinazione.
5.1.2. Prodotti semidensi, puree, succhi di frutta con sostanze in
sospensione.
Omegeneizzare il campione medio di laboratorio dopo averlo mescolato
con cura. Passare una parte del campione attraverso una garza
asciutta piegata in quattro e, dopo aver eliminato le prime gocce del
filtrato, procedere alla determinazione sul prodotto passato.
5.1.3. Prodotti densi (marmellate, gelatine, confetture, ecc.).
Se non si è potuto operare direttamente sul prodotto preventivamente
omegeneizzato, pesare 40 g del prodotto, con una tolleranza di 0,01
g, in un bicchiere da 250 ml ed aggiungere 100 ml di acqua.
Far bollire dolcemente per due o tre min agitando con una bacchettina
di vetro. Raffreddare e versare il contenuto del bicchiere in un
matraccio tarato da 200 ml, portare a volume e mescolare con cura.
Dopo aver atteso 20 min, filtrare attraverso un filtro a pieghe o
imbuto di Buchner. Effettuare la determinazione sul prodotto
filtrato.
5.1.4. Prodotti congelati.
Dopo scongelamento del prodotto e separazione dei noccioli e delle
logge carpellari, mescolare il prodotto con il liquido formatosi in
fase di scongelamento ed operare conformemente ai punti (5.1.2.) e
(5.1.3.).
5.1.5. Prodotti secchi o prodotti contenenti frutti interi o in
pezzi.
Dividere la parte del campione di laboratorio in piccoli pezzi,
eliminare i noccioli e le logge carpellari, mescolare con cura.
Pesare da 10 a 20 g del prodotto in un bicchiere con una tolleranza
di 0,01 g. Aggiungere una quantità di acqua uguale o superiore a 5
volte la massa del prodotto. Riscaldare a bagnomaria per 30 min
agitando di tanto in tanto con una bacchettina di vetro. Dopo
raffreddamento, rendere omogeneo il contenuto del bicchiere e
versarlo quindi in un matraccio tarato da 100-200 ml (secondo la
quantità del prelievo). Portare a volume e mescolare con cura.
Filtrare dopo 20 min in un recipiente asciutto ed effettuare la
determinazione sul filtrato.
5.2. Portare il campione preparato sul prisma di base del
rifrattometro avendo cura che, premendo i prismi l'uno contro
l'altro, il prelievo copra uniformemente la superficie del vetro ed
effettuare la misurazione conformemente alle istruzioni operative per
l'apparecchio utilizzato.
Leggere la percentuale in peso di saccarosio con una approssimazione
dello 0,1%.
Effettuare almeno due determinazioni sullo stesso campione preparato.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il tenore di residuo secco solubile, espresso convenzionalmente in
grammi di saccarosio per cento grammi di prodotto, viene calcolato
come segue:
6.1. Si utilizzano le indicazioni rifrattometriche in percentuale di
saccarosio a lettura diretta.
6.2. Se la lettura non è effettuata alla temperatura di + 20C, si
effettuano le correzioni indicate nella tabella allegata.
.3. Se la misurazione è stata eseguita su una soluzione diluita, il
tenore di residuo secco solubile è uguale a
100
p x
E
dove P è il peso, in grammi, di residuo secco solubile per 100
grammi
CORREZIONE DA EFFETTUARE QUANDO LA DETERMINAZIONE VIENE FATTA
AD UNA TEMPERATURA DIVERSA DA 20C E NEI LIMITI
COMPRESI FRA 15 e 25C
Saccarosio in grammmi per 100 g di prodotto
Temperatura
C 5 10 15 20 30 40 50 60 70 75
SOTTRARRE
15 0,25 0,27 0,31 0,31 0,34 0,35 0,36 0,37 0,36 0,36
16 0,21 0,23 0,27 0,27 0,29 0,31 0,31 0,32 0,31 0,23
17 0,16 0,18 0,20 0,20 0,22 0,23 0,23 0,23 0,20 0,17
18 0,11 0,12 0,14 0,15 0,16 0,16 0,15 0,10 0,12 0,09
19 0,06 0,07 0,08 0,08 0,08 0,09 0,09 0,08 0,07 0,05
AGGIUNGERE
21 0,06 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07 0,07
22 0,12 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14
23 0,18 0,20 0,20 0,21 0,21 0,21 0,21 0,22 0,22 0,22
24 0,24 0,26 0,26 0,27 0,28 0,28 0,28 0,28 0,29 0,29
25 0,30 0,32 0,32 0,32 0,34 0,36 0,36 0,36 0,36 0,37
di prodotto, indicato dal rifrattometro ed è il peso, in grammi, di
prodotto per 100 ml di soluzione.
9. - Determinazione dei solidi insolubili in acqua
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare la percentuale dei solidi totali
non solubili in acqua.
2. PRINCIPIO
Estrazione con acqua delle parti solubili ed essiccazione in stufa
del residuo ottenuto.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Bilancia tecnica
4.2. Bilancia analitica
4.3. Centrifuga da laboratorio
5. MODO DI OPERARE
Si pesano 25-50 g di prodotto (4.1) eventualmente ridotto in purea
omogeneo a mezzo di mortaio o apparecchio meccanico, e si
trasferiscono con acqua calda in un bicchiere da 400 ml; si
aggiungono 200-250 ml di acqua e si fa bollire lentamente per pochi
minuti. La sospensione si filtra quantitativamente su imbuto Buchner,
precedentemente preparato con un disco di carta da filtro (Whatman n.
4, o equivalente) lavato con acqua calda, essicato e tarato.
Una leggera aspirazione si applicherà alla beuta a vuoto sottostante
solo alla fine della filtrazione. Si lava il filtro ed il suo
contenuto con acqua calda fino a che l'acqua di lavaggio sia
perfettamente neutra al tornasole (circa 900 ml di acqua). Il filtro
viene quindi essiccato a 100C fino a peso costante, raffreddato in
essicatore e pesato (4.2).
In particolari casi in cui si abbiano difficoltà di filtrazione è
consigliabile l'impiego della centrifuga (4.3).
In tal caso circa 20 g di campione, opportunamente preparato, vengono
estratti con diverse aliquote di acqua calda centrifugando dopo
ciascuna aggiunta.
Il liquido supernatante è fatto passare attraverso un filtro tarato
posto su Buchner. Se il filtro si intasa facilmente rallentando
eccessivamente la filtrazione è opportuno continuare la filtrazione
con un secondo filtro tarato. Dopo 4 o 5 lavaggi si trasferisce
quantitativamente la sostanza insolubile residua sul filtro e
quest'ultimo (insieme all'eventuale filtro precedentemente usato)
posto in una capsula tarata viene essiccato per 2 h a 100C,
raffreddato in essiccatore e pesato con (4.2).
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore percentuale dei solidi insolubili in acqua (Si) è dato da:
100 (b - c)
Si =
a
dove: a = peso del campione
b = peso dell'insolubile più peso del filtro (o dei filtri) e della
capsula
c = peso del filtro (o dei filtri) e della capsula
10. Determinazione dei solidi solubili in acqua
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare la frazione non volatile del
prodotto priva dei solidi insolubili in acqua.
2. PRINCIPIO
I solidi solubili si determinano per via indiretta conoscendo i
solidi totali e quelli insolubili.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore dei solidi solubili Ss è data da:
Ss = St - Si
dove:
St = solidi totali
Si = solidi insolubili
11. - Determinazione del peso specifico
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare il peso specifico relativo o
densità relativa, dato dal rapporto tra il peso di un determinato
volume di sostanza in esame e il peso dello stesso volume di acqua
distillata, a 20C, pesati all'aria.
Nell'ambito delle conserve vegetali la determinazione è
correntemente eseguita solo su prodotti liquidi.
2. PRINCIPIO
Si determina mediante il picnometro o la bilancia idrostatica o la
bilancia Westaphal o i densimetri.
A) Metodo del PICNOMETRO
4. APPARECCHIATURA
4.1. Picnometro da 50 o 100 ml di capacità
4.2. Stufa a secco regolata a 100 - 105C
4.3. Bilancia analitica
4.4. Termostato regolato a 20C
5. MODO DI OPERARE
Essiccare in stufa (4.2) il piconometro (4.1.) vuoto perfettamente
pulito e risciacquato con acqua e, dopo raffreddamento in
essiccatore, pesare (4.3). Riempire il picnometro con acqua bollita
di recente e porre il tutto in termostato (4.4) per circa 30 min, in
modo tale da uniformare la temperatura a 20C.
Aggiustare accuratamente il livello dell'acqua nel picnometro ed
asciugare la parte vuota del collo del picnometro con un piccolo
rotolo di carta da filtro. Pesare quindi accuratamente. Essiccare
nuovamente in stufa il picnometro dopo averlo vuotato del suo
contenuto d'acqua. Dopo raffreddamento, riempirlo con la soluzione in
esame, ripetendo tutte le operazioni eseguite con l'acqua.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore del peso specifico ps relativo a 20C è dato da:

20C
P3 - P1
ps =
P2 - P1
dove:
P1 = peso picnometro vuoto
P2 = peso picnometro pieno d'acqua
P3 = peso picnometro pieno del liquido in esame
B) Metodo della BILANCIA IDROSTATICA
4. APPARECCHIATURA
4.1. Bagno termostatato
4.2. Bilancia idrostatica sensibilità 0,1 mg completa di pescante e
cilindro.
5. MODO DI OPERARE
Azzerare la bilancia (4.2). Riempire, fino al segno il cilindro con
il prodotto opportunamente preparato. Porre il cilindro in bagno
termostatato (4.1) a 20C in modo da portare il campione a
temperatura con il pescante immerso.
Sistemare il cilindro nella bilancia ed appendere il pescante avendo
cura che non tocchi le pareti ed il fondo del cilindro.
Effettuare la pesata.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
20C
Il valore del ps è dato direttamente dal valore letto
20C
sulla bilancia.
C) Metodo della BILABCIA DI WESTPHAL
4. APPARECCHIATURA
4.1. Bilancia di Westphal
4.2. Bagno termostato
5. MODO DI OPERARE
Equilibrare la bilancia (4.1) senza pesi e con il pescante sospeso
nell'aria. Riempire il cilindro con acqua e porlo in bagno
termostatato (4.2) a 20C in modo da portare l'acqua a temperatura.
Immergere il pescante e porre massimo all'estremità del braccio
della bilancia (4.1). In queste condizioni equilibrare la bilancia
stessa. Riempire un cilindro asciutto con il liquido in esame,
portare alla temperatura di 20C, immergere il pescante e
riequilibrare la bilancia mediante gli opportuni pesi.
La posizione dei vari pesi permette di leggere direttamente il valore
del peso specifico.
D) Metodo del DENSIMETRO
4. APPARECCHIATURA
4.1. Densimetro
4.2. Cilindri di vetro
4.3. Bagno termostatato regolato a 20C
5. MODO DI OPERARE
Porre nel cilindro (4.2) la sostanza in esame e portare il tutto in
bagno termostatato (4.3). Immergere lentamente il densimetro (4.1) ed
agitarlo lievemente per eliminare le eventuali bollicine
d'aria aderenti allo strumento. Lasciare che il densimetro si fermi
ed eseguire la lettura tenendo d'occhio il livello della superficie
del liquido senza tener conto del menisco che si forma, per
capillarità, intorno all'asta del densimetro.
NOTA
Per la determinazione del peso specifico di prodotti concentrati è
necessario utilizzare picnometri a collo lungo.
12. - Determinazione delle impurità minerali
(Sabbia, terriccio, ecc.)
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare le materie inorganiche estranee
dopo incenerimento del residuo della lisciviazione del prodotto in
esame.
2. PRINCIPIO
Si determinano, levigando una quantità nota di prodotto,
raccogliendo sul filtro senza ceneri il residuo sabbioso e
incenerendo in muffola le eventuali piccole quantità di sostanza
organica.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Levigatore costituito da un imbuto separatore da 2,5 1 circa
chiuso
con tappo a due fori per uno dei quali passa, a dolce strofinio, un
tubo di vetro (diametro 5 mm) collegato nella parte posteriore ad
un serbatoio di acqua posto a 50 cm di altezza, mentre per l'altro
foro passa un tubo di vetro di efflusso.
In sostituzione del dispositivo descritto può essere impiegato un
analogo apparecchio di levigazione.
4.2. Crogiuolo
4.3. Muffola
5. MODO DI OPERARE
Spappolare una determinata quantità di prodotto (pesata esattamente)
in 500 ml di acqua riscaldata a 60 - 70C e trasportare il tutto
quantitativamente nel separatore (4.1). Lasciare riposare per 20 min.
Far pescare per 3 mm circa il tubo di efflusso e porre il tubo di
afflusso 3 cm sotto il livello della sospensione. Iniziare la
levigazione. Abbassare gradatamente questo tubo mano a mano che il
liquido si chiarifica. Proseguire fino ad eliminazione completa del
materiale cellulosico (6-8 h). Trasferire quantitativamente il
materiale sabbioso su un filtro senza ceneri, portare il filtro nel
crogiuolo (4.2), bruciare, incenerire in muffola (4.3), raffreddare
in essiccatore e pesare.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore percentuale delle impurità minerali Im è dato da:
(p - p)
Im = ---------- x 100
g
dove:
P = peso del crogiuolo con il residuo
p = peso del crogiuolo vuoto
g = peso del prodotto prelevato per la determinazione
Le impurità minerali per alcuni prodotti possono essere espresse in
percento di residuo secco, eventualmente al netto di sale aggiunto.
13. - Determinazione delle ceneri
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare il residuo della combustione a
525C del campione precedentemente essiccato.
2. PRINCIPIO
Combustione della materia organica e mineralizzazione del prodotto.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Capsula di quarzo o di platino a fondo piatto (diametro 80 mm
circa)
4.2. Bilancia analitica
4.3. Bagno maria o stufa termostatica
4.4. Muffola
5. MODO DI OPERARE
Una determinata quantità di campione viene esattamente pesata (4.2)
in capsula (4.1) previamente tarata. Riscaldare a 100-105C
evaporando a secchezza mediante (4.3). Si aggiunge al residuo secco
qualche goccia di olio di oliva e si carbonizza cautamente alla
fiamma o sotto essiccattore IR fino a che il prodotto cessa di
rigonfiarsi. Si pone la capsula in muffola (4.4) portata alla
temperatura di circa 525C (porre attenzione a non superare questa
temperatura per evitare la fusione delle ceneri) e si lascia fino a
che il residuo della combustione sia diventato bianco. Raffreddare la
capsula in essiccatore e pesare velocemente.
Se durante l'incenerimento la massa carboniosa non brucia
completamente, le ceneri vanno riprese con acqua, evaporate di nuovo
e incenerite nelle muffola.
Per conserve contenenti cloruro sodico aggiunto è necessario
riprendere il residuo della mineralizzazione con acqua, filtrare il
liquido, su filtro senza ceneri, bruciare il filtro ed il residuo
carbonioso sino ad incenerimento completo, aggiungere la soluzione
filtrata, evaporare ed incenerire di nuovo fino a peso costante.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il contenuto di ceneri è espresso per 100 g di prodotto.
14. - Determinazione dell'alcalinità delle ceneri
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare la quantità di acido necessaria a
neutralizzare l'alcalinità delle ceneri fino a viraggio
dell'indicatore specifico.
2. PRINCIPIO
Si determina per titrimetria con acido cloridrico, dopo aggiunta di
acqua e riscaldamento, impiegando l'indicatore prescritto.
3. REATTIVI
3.1. Acido cloridrico soluzione 0,1 M
3.2. Sodio idrossido soluzione 0,1 M
3.3. Indicatore al metilarancio (0,05%): si disciolgono 0,5 g di
metil arancio in acqua e si diluisce ad 1 litro.
5. MODO DI OPERARE
Si introduce una quantità misurata di HC1 0,1 M (3.1) nella capsula
contenente le ceneri. Si riscalda a bagno maria evitando di portare a
secco. Si raffredda la soluzione, si aggiungono poche gocce di
metilarancio (3.3) e si titola con NaOH 0,1 M (3.2).
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
L'alcalinità delle ceneri è data dal numero di ml di acido 0,1 M
impiegati per neutralizzare le ceneri di 100 g di campione. Il numero
di alcalinità è dato dal numero di ml di acido M impiegati per
neutralizzare 1 g di ceneri.
15. - Determinazione dell'acidità totale
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare l'acidità titolabile con soluzione
alcalina.
2. PRINCIPIO
Si determina per titolazione con sodio idrossido in presenza di
fenolftaleina o per via potenziometrica.
3. REATTIVI
3.1. Sodio idrossido 0.1 M
3.2. Soluzione alcolica di fenolftaleina: 1% in alcol etilico a 95%.
4. APPARECCHIATURA (solo per 5.2)
4.1. pH-metro
4.2. Elettrodo a vetro
5. MODO DI OPERARE
5.1. Metodo all'indicatore
Una parte aliquota del campione se liquido, oppure, se solido, di
soluzione da esso preparata, viene diluita con circa 250 ml di acqua
precedentemente bollita.
Si titola con la soluzione alcalina (3.1) in presenza dell'indicatore
(3.2), fino a colorazione rosa, persistente per 30 sec. Se il
campione è fortemente colorato, per meglio apprezzare il viraggio,
sarà opportuno eseguire ulteriori diluizioni o impiegare il metodo
potenziometrico.
5.2. Metodo potenziometrico
Prima della determinazione tarare l'apparecchio (4.1) con le
soluzioni tampone standard e lavare l'elettrodo (4.2) diverse volte
con acqua. Si immerge quindi l'elettrodo e si inizia la titolazione
agitando moderatamente. La soluzione alcalina (3.1) è aggiunta
abbastanza rapidamente fino a pH 6 procedendo quindi più lentamente
fino a pH 7.
Si procede quindi alla titolazione, aggiungendo quattro gocce alla
volta fino a pH 8,1.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
L'acidità totale può essere espressa in ml di soluzione alcalina
0,1 M per 100 g 0100 ml oppure in meq per 1 o Kg di prodotto
originale.
Molto spesso, nelle conserve vegetali, l'acidità totale viene anche
espressa in grammi di acido citrico monoidrato per 100 g di prodotto
ad eccezione delle conserve all'aceto e di quelle fermentate dove si
esprime rispettivamente in grammi di acido acetico o di acido lattico
per 100 g di liquido di governo o prodotto. Si applicano i seguenti
fattori:
ml 1 di NaOH 0,1 M = g 0,007 di acido citrico monoidrato
ml 1 di NaOH 0,1 M = g 0,006 di acido acetico
ml 1 di NaOH 0,1 M = g 0,009 di acido lattico
16. - Determinazione dell'acidità volatile
1. OGGETTO
Il metodo descritto permette la determinazione degli acidi volatili
che distillano in corrente di vapore.
2. PRINCIPIO
L'acidità volatile si determina per titolazione degli acidi separati
per distillazione in corrente di vapore.
3. REATTIVI
3.1. Sodio idrossido 0,1 M
3.2. Soluzione alcolica di fenoftaleina: 1% in alcol etilico a 95%.
4. APPARECCHIATURA
Apparecchio di distillazione composto da un generatore di vapor
d'acqua, da un gorgogliatore nel quale è posta la sostanza da
analizzare, da un raccordo e da un refrigerante.
È opportuno usare un apparecchio del tipo illustrato nella fig. 1.
La parte inferiore della camicia interna del distillatore deve avere
una capacità di circa 150 ml.
5. MODO DI OPERARE
Alimentare il generatore di vapore con acqua distillata, bollita per
qualche minuto allo scopo di eliminare l'anidride carbonica
disciolta. Porre nel gorgogliatore il prodotto opportunamente
preparato. Raccogliere circa 150 ml distillati in 30 min e titolare
l'acidità con la soluzione alcalina (3.1) in presenza di indicatore
(3.2).
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
L'acidità volatile si esprime in grammi di ac. acetico per 100 g di
prodotto, 1 ml NaOH 0,1 M = 0,006 g di acido acetico.

----&gt; Vedere Immagine a Pag. 43 del S.O. &lt;----

17. - Determinazione del pH (concentrazione idrogenionica)
1. OGGETTO
Il metodo permette di determinare il logaritmo decimale dell'inverso
della concentrazione idrogenionica o pH.
2. PRINCIPIO
Si determina misurando la differenza di potenziale tra una coppia di
elettrodi immersi nel liquido in esame di cui uno con potenziale
fisso e noto.
3. REATTIVI
3.1. Soluzione tampone a pH 3,00
3.2. Soluzione tampone a pH 7,00
3.3. Soluzione satura di potassio cloruro
4. APPARECCHIATURA
4.1. pH-metro
4.2. Elettrodi
5. MODO DI OPERARE
Effettuare l'azzeramento dello strumento (4.1) seguendo le
indicazioni allegate all'apparecchio utilizzato. Immergere gli
elettrodi o l'elettrodo combinato (4.2) nella soluzione tampone (3.1)
e tarare
l'apparecchio tenendo conto della temperatura. Togliere la
soluzione tampone, lavare accuratamente gli elettrodi con acqua.
Ripetere l'operazione con la soluzione tampone (3.2). Dopo aver
nuovamente pulito gli elettrodi eseguire la misurazione sul campione.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Il valore di pH viene espresso alla prima cifra decimale.
18. - Determinazione degli zuccheri
1. OGGETTO
I metodi sotto desfritti permettono la determinazione degli zuccheri
riduttori e del saccarosio da soli o in miscela tra di loro.
A. Dosaggio degli zuccheri riduttori
(per tenori in zuccheri inferiori al 5%).
2. PRINCIPIO (metodo di Luff-Schoorl)
La soluzione zuccherina viene portata all'ebolizione, in condizioni
standard, in presenza di una soluzione di rame rameico che viene
ridotto a rameoso. L'eccesso di rame rameico viene titolato per
iodometria.
3. REATTIVI
3.1. Soluzione di Carrez I: sciogliere in acqua 4 g di zinco acetato
biidrato a 3 g di acido acetico glaciale portando a 100 ml con acqua.
3.2. Soluzione di Carrez II: sciogliere in acqua 10,6 g di potassio
ferrocianuro portando a 100 ml con acqua.
3.3. Reattivo di Luff-Schoorl
Soluzione "A": 25 g di rame solfato(ico) pentaidrato, esente da
ferro, in 100 ml di acqua.
Soluzione "B": 50 g di acido citrico monoidrato in 50 ml di acqua.
Soluzione "C": 143,8 g di sodio carbonato anidro in 300 ml di acqua,
sciogliere a caldo e raffreddare.
Aggiungere, agitando lentamente, la soluzione "B" alla soluzione "C"
fino a scomparsa dello sviluppo gassoso e successivamente la
soluzione "A" portando al volume di 1000 ml con acqua. Lasciare
riposare una notte e poi filtrare e controllare il reattivo così
ottenuto.
3.3.1. Controllo del reattivo di Luff-Schoorl
3.3.1.1 Aggiungere a 25 ml di reattivo 10 ml di soluzione di potassio
ioduro (3.7) e 25 di acido solforico 3 M (3.6), titolare con sodio
tiosolfato 0,1 M (3.4) in presenza di salda d'amido (3.5) che si
aggiunge verso la fine della titolazione. La quantità utilizzata
di sodio tiosolfato 0,1 M deve essere di 25 ml.
3.3.1.2. Versare 10 ml di reattivo in un matraccio tarato da 100 ml e
portare a volume con acqua.
3.3.1.3. Mescolare in un matraccio 10 ml di reattivo diluito
(3.3.1.2) con 25 ml di acido cloridrico 0,1 M (3.11) e riscaldare per
1 h in bagno d'acqua bollente. Raffreddare, riportare al volume
iniziale e titolare con sodio idrossido 0,1 M (3.10) in presenza di
fenolftaleina. La quantità di sodio idrossido utilizzata deve essere
compresa tra 5,5 e 6,5 ml.
3.3.1.4. Titolare con acido cloridico 0,1 M, in presenza di
fenolftaleina, 10 ml di reattivo diluito (3.3.1.2). La quantità di
acido cloridrico 0,1 M utilizzata deve essere compresa tra 6 e 7 ml.
3.3.1.5. Il reattivo deve avere un pH compreso tra 9,3 e 9,4 a 20C.
3.4. Soluzione di sodio tiosolfato 0,1 M.
3.5. Salda d'amido: stemperare 5 g di amido solubile in 50 ml di
acqua e portare ad 1 l con acqua bollente, far bollire per 3 min,
lasciare raffreddare ed aggiungere, eventualmente, 10 g di mercurio
ioduro come stabilizzante.
3.6. Acido solforico 3 M
3.7. Soluzione di potassio ioduro 30% (m/v)
3.8. Granelli di pietra pomice bolliti in acido cloridrico, lavati
con acqua ed essiccati.
3.9. Iso-pentanolo
3.10. Sodio idrossido 0,1 M
3.11. Acido cloridrico 0,1 M
3.12. Soluzione di fenolftaleina 1% (m/v) in alcol etilico 95%.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Matraccio a fondo piatto della capacità di 300 ml con collo a
smeriglio munito di refrigerante a riflusso.
4.2. Omogeneizzatore
4.3. Rete metallica provvista di uno schermo di amianto munito di un
foro corrispondente al diametro del fondo del matraccio.
4.4. Bilancia tecnica.
5. MODO DI OPERARE
Pesare 10 g di campione precedentemente omogeneizzato o una quantità
precisata nella parte speciale, su bilancia tecnica (4.4),
riprenderli con acqua e versarli in matraccio tarato da 200 ml fino a
portare il volume a circa 150 ml. Aggiungere dopo qualche ora di
riposo, per permettere la solubilizzazione degli zuccheri, 5 ml della
soluzione di Carrez I (3.1) e 5 ml della soluzione dì Carrez II
(3.2), agitando dopo ogni aggiunta. Portare a volume e filtrare su
filtro a pieghe. Il filtrato dovrà essere diluito, prendendo nota
della diluizione, in modo che 25 ml della soluzione finale contengano
una quantità di zucchero riduttore compresa tra 15 e 60 mg; nel caso
di presenza di lattosio la quantità limite sarà 85 mg. Prevalere
quindi con una pipetta tarata 25 ml di reattivo, preparato a
controllato come in (3.3) e versare nel matraccio (4.1) aggiungendo
poi 25 ml della soluzione zuccherina finale diluita, esattamente
misurati con buretta:
Aggiungere 2 granelli di pietra pomice (3.8) inserire il refrigerante
(4.1), mettere il matraccio sulla rete metallica (4.3) e portare il
liquido all'ebollizione entro 2 min ca. A partire da questo momento
far bollire cautamente per 10 min esatti. Raffreddare subito in acqua
fredda e dopo circa 5 min operare come segue: aggiungere 10 ml della
soluzione di potassio ioduro (3.7) e subito dopo e con cautela, per
evitare la formazione di schiuma, 25 ml di acido solforico 3 M (3.6).
Titolare quindi con sodio tiosolfato 0,1 M (3.4) fino a comparsa di
un colore giallo smorto, aggiungere 5 ml di salda d'amido (3.5) e
completare la titolazione fino a scomparsa della colorazione blu.
Effettuare un saggio in bianco sostituendo i 25 ml di soluzione
zuccherina con 25 ml di acqua. Dai ml di tiosolfato 0,1 M consumati
nella prova in bianco vanno detratti i ml di tiosolfato impiegati
nella determinazione. Il numero corretto di ml di tiosolfato 0,1 m
viene indicato con la lettera (a).
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Con l'aiuto della tabella allegata si stabiliscono i mg dello
zucchero riduttore, presenti in 25 ml di soluzione zuccherina,
corrispondenti ad (a).
Tenendo conto delle diluizioni effettuate si calcola il tenore
percentuale di zucchero riduttore presente nel campione.
7. OSSERVAZIONE
Prima dell'acidificazione con acido solforico 3 M può essere utile
aggiungere 1 ml circa di iso-pentanolo (3.9) onde evitare la
formazione di schiuma.
B. DOSAGGIO DEGLI ZUCCHERI RIDUTTORI
(per tenori in zucchero superiori al 5%)
2. PRINCIPIO (metodo volumetrico Fehling)
La soluzione zuccherina viene titolata con un volume noto di una
soluzione standard di rame rameico (liquido di Fehling), portata
all'ebollizione, fino a riduzione totale in presenza di blu di
metilene come indicatore. Il blu di metilene ha infatti la proprietà
di decolorarsi a caldo in presenza di uno zucchero riduttore, in
soluzione alcalina.
Tabella per 25 ml del reattivo di Luff-Schoorl
ml di 0,1 M Na2 S2O3 a 2 minuti di riscaldamento, 10 minuti di
ebollizione
0,1 M Glucosio, fruttosio
Na2S2O3 zuccheri invertiti Lattosio Maltosio 0,1 M
C6H12O6 C12H22O11 C12H22O11 Na2S2O3
ml mg differenza mg differenza mg differenza ml
1 2,4 2,4 3,6 3,7 3,9 3,9 1
2 4,8 2,4 7,3 3,7 7,8 3,9 2
3 7,2 2,5 11,0 3,7 11,7 3,9 3
4 9,7 2,5 14,7 3,7 15,6 4,0 4
5 12,2 2,5 18,4 3,7 19,6 3,9 5
6 14,7 2,5 22,1 3,7 23,5 4,0 6
7 17,2 2,6 25,8 3,7 27,5 4,0 7
8 19,8 2,6 29,5 3,7 31,5 4,0 8
9 22,4 2,6 33,2 3,8 35,5 4,0 9
10 25,0 2,6 37,0 3,8 39,5 4,0 10
11 27,6 2,7 40,8 3,8 43,5 4,0 11
12 30,3 2,7 44,6 3,8 47,5 4,1 12
13 33,0 2,7 48,4 3,8 51,6 4,1 13
14 35,7 2,8 52,2 3,8 55,7 4,1 14
15 38,5 2,8 56,0 3,9 59,8 4,1 15
16 41,3 2,9 59,9 3,9 63,9 4,1 16
17 44,2 2,9 63,8 3,9 68,0 4,2 17
18 47,1 2,9 67,7 4,0 72,2 4,3 18
19 50,0 3,0 71,7 4,0 76,5 4,4 19
20 53,0 3,0 75,7 4,1 80,9 4,5 20
21 56,0 3,1 79,8 4,1 85,4 4,6 21
22 59,1 3,1 83,9 4,1 90,0 4,6 22
23 62,2 3,1 88,0 94,6 23
3. REATTIVI
3.1. Soluzione defacante: soluzione satura di piombo acetato neutro
3.2. Sodio ossalato o potassio ossalato
3.3. Liquido di Fehling:
Fehling "A": sciogliere in acqua 69,278 g di rame solfato (ico)
pentaidrato e portare a volume di 1000 ml.
Felhing "B": sciogliere 346 g di sale di Seignette (sodio e potassio
tartrato) e 100 g di sodio idrossido. Portare a 1000 ml. Le due
soluzioni si conservano in bottiglie di vetro chiuse.
3.4. Soluzione di blu di metilene all'1% (m/v). Controllare la
concentrazione della soluzione con una soluzione all'1% (m/v) dei
glucosio solido anidro; 2 gocce di blu di metilene devono essere
decolorate da 0,1 ml di tale soluzione.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Matraccio a fondo piatto della capacità di 300 ml
4.2. Bagno ad acqua termoregolato
4.3. Omogeneizzatore
4.4. Bilancia tecnica
5. MODO DI OPERARE
Pesare 20 g di campione precedentemente omogeneizzato, o una
quantità precisata nella parte speciale, su bilancia tecnica (4.4),
riprendere con acqua e versarli in matraccio tarato da 200 ml. Lavare
con acqua fino a portare il volume a ca. 150 ml. Dopo un certo tempo
di riposo per permettere la solubilizzazione degli zuccheri,
aggiungere mediante pipetta tarata 10 ml della soluzione defecante
(3.1) e, dopo 15 min., eliminare l'accesso di piombo con l'aggiunta
della quantità minima necessaria di sodio ossalato o di potassio
ossalato (3.2), agitando dopo ogni aggiunta. Portare a volume,
agitare e filtrare. Diluire il filtrato, prendendo nota delle
diluizioni, in modo che la concentrazione zuccherina finale, in
zuccheri riduttori, della soluzione sia circa dell'1%. Versare in un
matraccio a fondo piatto da 300 ml 5 ml di Fehling "A" (3.3), 5 ml di
Fehling "B" (3.3), 40 ml di acqua ed alcune palline di vetro o
granelli di pomice. Scaldare fino ad incipiente ebollizione ed
aggiungere, mediante buretta, un volume della soluzione zuccherina
finale diluita, di poco inferiore a quello necessario per la completa
decolorazione del liquido di Fehling (*); a questo punto continuare
l'ebollizione della soluzione per il numero di minuti prescritti per
ciascuno zucchero (3 min per glucosio, fruttosio e zucchero
invertito; 4 min per il maltosio e 6
(*) Per individuare questa quantità occorre eseguire una prova
orientativa preliminare.
min per il lattosio) previa aggiunta di due gocce di blu metilene
(3.4) e, sempre con il liquido in ebollizione, far cadere entro
l'ultimo min dei tempi sopra citati, goccia a goccia, altra soluzione
zuccherina fino a scomparsa della colorazione azzurra
dell'indicatore.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
% di zucchero riduttore f x d

a-0,1
dove:
f = fattore dovuto al potere riducente dello zucchero determinato
glucosio = 4,945
fruttosio = 5,350
invertito = 5,150
lattosio = 6,760
d = diluizione della soluzione zuccherina
a = numero di ml della soluzione zuccherina impiegati nella
titolazione
0,1 = ml impiegati dal blu di metilene
C. DOSAGGIO DEL SACCAROSIO
(in presenza di zuccheri riduttori)
2. PRINCIPIO
Il tenore in saccarosio viene calcolata determinando gli zuccheri
riduttori prima e dopo inversione acida o per via chimica volumetrica
o per via polarimetrica applicando la formula di Clerget.
C1. METODO VOLUMETRICO FEHLING
3. REATTIVI
3.1. Tutti quelli previsti in (B.3)
3.2. Soluzione alcolica di fenolftaleina 1% (m/v)
3.3. Soluzione di acido cloridrico d20 = 1,10
3.4. Soluzione di acido acetico 1:1 (v:v)
3.5. Soluzione di sodio idrossido 30% (m/v) ca.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Tutta quella prevista in (B.4)
4.2. Bagno ad acqua termostatato
5. MODO DI OPERARE
Prelevare con pipetta 50 ml di soluzione preparata per il dosaggio
degli zuccheri come in (A) o (B), secondo il caso, e introdurli in
matraccio tarato da 100 ml. Addizionare 5 ml di acido cloridrico
(3.3). Immergere il matraccio per 15 min nel bagno ad acqua (4.2)
termostatato a 70C. Raffreddare rapidamente ed aggiungere alcune
gocce di fenolftaleina (3.2). Con poche gocce di soluzione di sodio
idrossido (3.5) portare fino a debole colorazione rosa e subito
decolorare la soluzione con la minima quantità di acido acetico
diluito (3.4). Portare a volume con acqua e procedere come descritto
in B.5.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
% di saccarosio = (A-a)x0,95
dove:
A = tenore percentuale degli zuccheri riduttori dopo inversione
a = tenore percentuale degli zuccheri riduttori prima dell'inversione
C2. METODO POLARIMETRICO
3. REATTIVI
3.1. Soluzione defacante: soluzione satura di piombo acetato neutro
3.2. Spiombante: sodio ossalato o potassio ossalato anidro
3.3. Soluzione di acido cloridrico al 32% circa (d20=1,14)3.4.
Soluzione all'1% (m/v) di fenolftaleina in alcol etilico 95%s
3.5. Soluzione di acido acetico 1:1 (v/v)
3.6. Soluzione di sodio idrossido al 30% (m/v)
4. APPARECCHIATURA
4.1. Saccarimetro o polarimetro con sorgente luminosa costituita da
una lampada a vapori di sodio. L'apparecchio deve essere installato
in un locale la cui temperatura sia prossima a 20C.
4.2. Tubi polarimetrici della lunghezza di 200 mm +- 0,03
4.3. Bagno ad acqua termostatabile
4.4. Bilancia tecnica
5. MODO DI OPERARE
Pesare 20 g campione precedentemente omogeneizzato, o una quantità
precisata nella parte speciale, su bilancia tecnica (4.4), riprendere
con acqua, versarli in matraccio tarato da 200 ml e lavare con acqua
fino a portare il volume a 150 ml ca. Dopo qualche ora di riposo, per
consentire la solubilizzazione completa degli zuccheri, aggiungere
mediante pipetta tarata 10 ml di soluzione defecante (3.1) e, dopo 15
min eliminare l'eccesso di piombo con l'aggiunta della quantità
minima necessaria di sodio ossalato o di potassio ossalato (3.2).
Portare a volume, agitare, lasciare in riposo per 30 min e filtrare
su filtro a pieghe (soluzione "A").
Prelevare 50 ml della soluzione "A", introdurli in matraccio tarato
da 100 ml ed addizionare 5 ml di acido cloridrico (3.3). Immergere il
matraccio per 15 min nel bagno ad acqua termostatato (4.3) a 70C e
dopo raffreddare rapidamente. Aggiungere alla soluzione fredda in
presenza di fenolftaleina (3.4) alcune gocce di sodio idrossido (3.6)
fino a debole colorazione rossa decolorando infine con la minima
quantità di soluzione di acido acetico (3.5). Portare a volume con
acqua (sol. "B"). Riempire due tubi polarimetrici (4.2)
rispettivamente con la soluzione "A" e con la soluzione "B" ed
effettuare le letture delle polarizzazioni, prendendo nota della
temperatura.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
6.1. Per polarimetro con scala in gradi cerchio si applica la
seguente formula di Clerget:
75.19 (P-P1)
% saccarosio = ------------
142,66-0,5t
dove:
P = polarizzazione prima dell'inversione riferita a 100 g di sostanza
P1 = polarizzazione dopo l'inversione riferita a 100 g di sostanza
t = temperatura, in gradi centigradi, delle soluzioni al momento
della lettera polarimetrica
D. DOSAGGIO DEL LATTOSIO IN PRESENZA DI ALTRI ZUCCHERI RIDUTTORI
2. PRINCIPIO (metodo microbiologico)
La soluzione zuccherina viene sottoposta a fermentazione con
Saccharomyces Cerevisiae del lievito di birra che lascia intatto il
lattosio, mentre distrugge tutti gli altri zuccheri riduttori. Dopo
chiarificazione e filtrazione della soluzione, il lattosio viene
determinato con il metodo luff-Schoorl (metodo A), gli altri zuccheri
riduttori vengono determinati, assieme al lattosio, con il metodo
(A); per differenza tra le due determinazioni si risale alla
quantità degli altri zuccheri riduttori.
3. REATTIVI
Tutti i reattivi previsti al punto (A) con la stessa numerazione da
(3.1) a (3.11).
3.12. Sospensione di Saccharomyces Cerevisiare: 25 g di livieto di
birra fresco si stemperano in 100 ml di acqua. La sospensione si
conserva in frigorifero per una settimana al massimo.
4. APPARECCHIATURA
Tutte le apparecchiature previste al punto 5 del metodo (A) con la
stessa numerazione da (4.1) ad (4.4).
4.5. Stufi termostatata a 38 - 40C.
5. MODO DI OPERARE
5.1. Determinazione del lattosio
Pesare 20 g del prodotto precedentemente omogeneizzato, o la
quantità precisata nella parte speciale, su bilancia tecnica (4.4),
riprendere con acqua e versarli in un matraccio tarato da 200 ml,
diluendo a circa 150 ml, lasciare a riposo per qualche ora e poi
portare a volume, con acqua. Prelevare 50 ml della soluzione
zuccherina in matraccio tarato da 200 ml e portare a volume con
acqua. Tale soluzione costituisce la soluzione madre "M" che
opportunamente diluita deve essere utilizzata sia per il dosaggio del
lattosio, sia per quello degli altri zuccheri (glucosio, zucchero
invertito, fruttosio). Introdurre 50 ml della soluzione "M" in
matraccio da 200 ml, addizionare 5 ml della sospensione di lievito
(3.12) mescolando bene e porre il tutto per 2 h alla temperatura di
39 - 40C nella stufa (4.5). Raffreddare la soluzione a 20C,
aggiungere 5 ml di Carrez I (3.1) e 5 ml di Carrez II (3.2), agitare
dopo ogni aggiunta, portare a volume di 200 ml, agitare nuovamente e
filtrare con imbuto di vetro su filtro a pieghe. Effettuare la
determinazione del lattosio su 25 ml della soluzione zuccherina
filtrata e diluita (contenuto in lattosio compreso fra 10 e 85 mg)
procedendo da questo momento secondo il metodo (1), effettuando
ugualmente la prova in bianco e indicando con L1 la differenza tra i
ml della prova in
bianco ed i ml di tiosolfato utilizzati per la determinazione del
lattosio.
5.2. Determinazione degli altri zuccheri
Effettuare la determinazione degli zuccheri riduttori totali secondo
il medoto (A) a partire da 50 ml della soluzione 'M' ottenuta come
descritto (5.1) e con la stessa diluizione effettuata per la
determinazione del lattosio; eseguire regolarmente la prova in bianco
ed indicare con Lt la differenza tra i ml della prova in binaco ed i
ml di tiosolfato utilizzati per la determinazione degli zuccheri
riduttori.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Lt = L1 + L2
dove
Lt = ml relativi agli zuccheri riducenti totali
L1 = ml relativi al lattosio
L2 = ml relativi agli zuccheri riducenti diversi dal lattosio
Con l'aiuto della tabella allegata si stabiliscono i mg di lattosio
corrispondenti a L1, e i mg degli altri zuccheri riduttori
corrispondenti a L2 presenti in 25 ml della soluzione zuccherina
diluita.
Tenendo conto della diluizione effettuata si calcola il tenore
percentuale degli zuccheri riduttori presenti nel campione.
E. DETERMINAZIONE DEI MONO E DISACCARIDI MEDIANTE HPLC
2. PRINCIPIO
La determinazione contemporanea dei mono e disaccaridi viene eseguita
mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC).
3. REATTIVI
3.1. Fase mobile, acetonitrile per HPLC: acqua (80:20) v:v
I costituenti debbono essere filtrati sotto vuoto separatamente (4.2)
(l'acqua con filtro di cellulosa, l'acetonitrile con filtro di
teflon) e successivamente miscelati. Con la filtrazione sotto vuoto
si ottiene anche il degasaggio dell'eluente.
3.2. Soluzione acquosa standard contenente 0,5% di ciascuno zucchero.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Cromatografo liquido ad alta pressione costituito da:
- pompa a pressione regolabile
- valvola d'iniezione a loop
- registratore con eventuale sistema di integrazione
- rivelatore ad indice di rifrazione
- colonna cromatografica ad alta risoluzione, impaccata con fase
legata NH2, specifica per carboidrati o similare con granilometria 10
um
4.2. Sistema sotto vuoto per filtrazione dell'eluente costituito da:
- Pompa da vuoto a caduta d'acqua
- matraccio per filtrazione sotto vuoto a smerigliatura normalizzata
- imbuto con gambo a smerigliatura normalizzata a setto poroso
- filtri in cellulosa con porosità 0,45 um
- filtri in teflon con porosità 0,45 um
4.3. Siringa per microfiltrazione dei campioni con setti filtranti
intercambiabili, porosità 0,45 um
5. MODO DI OPERARE
5-10 G di campione, se solido preventivamente omogeneizzato in acqua
cosi'' da portare in soluzione tutti gli zuccheri, sono
successivamente diluiti sino ad ottenere un contenuto di ogni singolo
zucchero compreso tra 0,25 e 1%. La soluzione così ottenuta viene
filtrata prima con filtro a pieghe e successivamente mediante
l'apposita siringa (4.3). Iniettare 10 ul del filtrato nel
cromatografo regolato con flusso dell'eluente di circa 2 ml/min.
Alle stesse condizioni operative si iniettano 10 ul delle soluzioni
standard. I singoli zuccheri sono identificati dal loro tempo di
ritenzione secondo la sequenza: fruttosio - glucosio - saccarosio -
maltosio - lattosio.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La concentrazione per ogni singolo zucchero si ricava dal rapporto
tra le aree dei picchi dello standard e quelle del campione
applicando la formula
Ac. Cst. d
Cc = ------------
Ast
dove:
Cc = concentrazione dello zucchero nel campione in %
Ac = area relativa allo zucchero nel cromatogramma del campione
Cst = concentrazione dello standard in %
d = diluizione del campione
Ast = area del picco relativo allo zucchero nel cromatogramma dello
standard
19. - Ricerca della saccarina
1. OGGETTO
Il metodo permette la ricerca e l'identificazione della saccarina
eventualmente aggiunta.
2. PRINCIPIO
Estrazione della saccarina con etere etilico dal prodotto previamente
acidificato e suo riconoscimento mediante saggi organolettici (A) o
mediante trasformazione di acido salicidico (B).
3. REATTIVI
3.1. Acido cloridrico 2M
3.2. Etere etilico
3.3. Acido solforico (d=1,84) 1:3 v/v
3.4. Soluzione di potassio permanganato al 5%
3.5. Acido cloridrico al 37% (d=1,19)
3.6. Sodio idrossido in gocce
3.7. Soluzione di ferro clururo (ico) 0,5%
4. APPARECCHIATURA
4.1. Capsula di platino
4.2. Stufa a secco regolata a 210-215C
4.3. Imbuti separatori da 500 ml
Se il prodotto è liquido, se ne acidificano 50 ml con acido
cloridrico (3.1); se il prodotto è solido o semisolido, se ne
acidifica l'estratto acquoso ottenuto da 50-100 g di prodotto. Si
estrae 3 volte in imbuto separatore (4.3) con porzioni di 25 ml di
etere (3.2). Si lavano gli estratti eterei riuniti con 5 ml di acqua,
si trasferisce l'estratto etereo in una capsula (4.1) e si lascia
evaporare all'aria.
A. SAGGIO ORGANOLETTICO
Si assaggia il residuo dell'evaporazione. La presenza di 20 mg di
saccarina per litro o per chilogrammo di prodotto può essere svelata
dal sapore dolce del residuo.
B. TRASFORMAZIONE IN ACIDO SALICILICO
Il residuo all'eveporazione viene disciolto in poca acqua calda
(circa 10 ml) si aggiungono 2 ml di acido solforico (3.3); si
riscalda all'ebollizione e si aggiunge goccia a goccia un leggero
eccesso di soluzione potassio per manganato (3.4). Si raffredda la
soluzione e vi si scioglie circa 1 g di sodio idrossido (3.6); si
filtra in una capsula (4.1). Si evapora a secchezza e si scalda per
20 min a 210-215C (4.2); si scioglie il residuo in acqua, si
acidifica con acido cloridrico (3.5) e si saggia la presenza di acido
salicilico aggiungendo una goccia di soluzione di ferro cloruro
(3.7). La formazione di acido salicilico è rivelata da una
colorazione violetta. Con questo procedimento l'acido salicilico,
eventualmente presente viene distrutto, mentre si possono svelare con
certezza 5 mg/l di saccarina.
20. - Determinazione della saccarina
1. OGGETTO
Il metodo consente il dosaggio della saccarina.
2. PRINCIPIO
La saccarina viene determinata come solfato di bario previa fusione
alcalina ed ossidazionne con acqua di bromo.
3. REATTIVI
3.1. Acido acetico glaciale
3.2. Acido fosforico 85% (d=1,70)
3.3. Etere etilico
3.4. Sodio carbonato, soluzione al 10%
3.5. Potassio carbonato polvere
3.6. Acqua di bromo
3.7. Bario cloruro, soluzione al 10%
3.8. Piombo acetato neutro, soluzione al 20%
3.9. Sodio carbonato in polvere
3.10.Acido cloridrico (d=1,19) diluito 1:2 (v/v)
4. APPARECCHIATURA
4.1 Imbuti separatori da 500 ml
4.2. Bagno maria
4.3. Capsule di platino
4.4. Crogiuolo di platino
5. MODO DI OPERARE
5.1. Preparazione del campione
5.1.1. Sciroppi e succhi di frutta.
Si portano 100-150 g di prodotto in matraccio tarato da 250 ml con
poca acqua, si diluisce fino a circa 200 ml, si aggiungono 5 ml di
acido acetico (3.1) e si agita, quindi si tratta con 5 ml di
soluzione di piombo acetato neutro (3.8) e si agita di nuovo. Si
porta a volume, si agita e si filtra.
5.1.2. Prodotti solidi o semisolidi.
Si portano 50-75 g di prodotto con poca acqua in un matraccio tarato
da 250 ml, si aggiunge acqua bollente fino a ca. 200 ml. Si lascia
riposare 2 h agitando di tanto in tanto, si aggiungono 5 ml di acido
acetico (3.1), si agita, quindi aggiunge un leggero eccesso di
soluzione di piombo acetato neutro (3.8), si lascia a riposo per 20
min, si porta a volume, si agita e si filtra.
5.2. Determinazione
150 ml di filtrato ottenuto come in (5.1) sono posti in un imbuto
separatore ed acidificati con acido fosforico (3.2). Si estrae tre
volte con porzioni di 80 ml di etere etilico (3.3) agitando ogni
volta per 2 min. Gli estratti eterei vengono riuniti e lavati con 5
ml di acqua. Si elimina l'etere per distillazione e si trasferisce il
residuo in un crogiuolo di platino (4.4), aiutandosi con poco etere
ed eventualmente con poca acqua. Si evapora l'etere su b.m. (4.2) e
si aggiungono al residuo 2-3 ml di soluzione di sodio carbonato al
10% (3.4), in modo che tutta la saccarina sia in contatto con la
soluzione e si evapora nuovamente su b.m. (4.2).
Al residuo secco nel crogiuolo (4.4) sono aggiunti 4 g di una miscela
in parti uguali di sodio carbonato (3.9) e potassio carbonato (3.5).
Si scalda cautamente fino a fusione entro 30 min. Si lascia
raffreddare la massa fusa, si scioglie con acqua e si aggiungono 5 ml
di acqua di bromo (3.6). Si acidifica con acido cloridrico (3.10) e
si filtra, lavando il filtro con poca acqua e portando a 200 ml ca.
Si scalda all'ebollizione e si aggiunga lentamente un eccesso di
soluzione di bario cloruro (3.7). Il precipitato, lasciato depositare
per una notte, viene lavato, filtrato, essiccato e calcinato in
crogiuolo (4.4) previamente tarato.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La quantità di saccarina si ottiene moltiplicando il peso del bario
solfato, corretto della prova in bianco dei reattivi, per il fattore
0,7844.
21. - Determinazione dei ciclammati
1. OGGETTO
Il metodo consente l'identificazione dei ciclammati in assenza di
anidride solforosa.
2. PRINCIPIO
Formazione in ambiente acido di un precipitato bianco di bario
solfato per aggiunta di sodio nitrito.
3. REATTIVI
3.1. Bario cloruro
3.2. Acido cloridrico conc. (d=1,19)
3.3. Sodio nitrito
5. MODO DI OPERARE
Aggiungere 2 g di bario cloruro (3.1) a 100 ml di campione o di
estratto acquoso; lasciare riposare per 5 min e filtrare. Acidificare
con 10 ml di acido cloridrico (3.2) ed aggiungere 0,2 di sodio
nitrito (3.3); la comparsa di un precipitato bianco di bario solfato
indica la presenza di ciclammato (cicloesilsolfammato).
22. - Determinazione dei ciclammati di sodio e di calcio
1. OGGETTO
Il metodo consente il dosaggio dei ciclammati di sodio e di calcio.
2. PRINCIPIO
Sotto pressione ed in ambiente acido il ciclammato viene idrolizzato
a cicloesilammina, che, estratta con cloroformio, viene fatta reagire
con p-chinone etanolico formando un prodotto colorato: il
2-(cicloesilammino)-1,4-benzochinone.
3. REATTIVI
3.1. Sodio ciclammato e calcio ciclammato essiccato in stufa a 100C
per 4 h.
3.2. Soluzione per sviluppo del colore (da preparare al momento
dell'uso):
0,30 g di p-chinone in 100 ml di alcol etilico assoluto
3.3. Cloroformio
3.4. Acido cloridrico conc. (d=1,19)
4. APPARECCHIATURA
4.1. Autoclave capace di funzionare a 2 atm assolute (121C)
4.2. Omogeneizzatore funzionante a circa 18.500 giri al min
4.3. Miscelatore ad alta velocità
5. MODO DI OPERARE
Introdurre 100 g del campione nell'omogeneizzatore (4.2) ed
omogeneizzare per 2-3 min. Pesare esattamente una quantità di
omogeneizzato, con un presunto contenuto di 15-30 mg di ciclammato,
in un bicchiere da 100 ml; in altro bicchiere da 100 ml pesare
accuratamente lo standard contenente una quantità di ciclammato
circa equivalente a quella presunta del campione. Diluire campione e
standard a circa 40 ml con acqua, aggiungere 13 ml di acido
cloridrico (3.4) e diluire ancora fino a circa 60 ml con acqua; porre
ciascun bicchiere in un altro da 400 ml coperto con vetrino
d'orologio e mettere in autoclave per sette-otto h a 2 atm ass.
(121C).
Trasferire quantitativamente il campione e lo standard raffreddati
(aiutandosi con acqua) in provette da centrifuga da 250 ml e
centrifugare a 1800 giri al min; filtrare i surnatanti su lana di
vetro e raccogliere i friltrati in matraccio tarato da 250 ml. Lavare
due volte per centrifugazione i residui con 40 ml di acqua
raccogliendo i surnatanti nei matracci e portare a volume.
Pipettare 25 ml di ciascuna soluzione (campione e standard) in imbuti
separatori da 150 ml e portare a pH = 12 con sodio idrossido 10 M
(bastano 12 gocce, ma è consigliabile aggiungere 3-4 gocce in
eccesso). Aggiungere a ciascun imbuto separatore 25 ml di cloroformio
(3.3), agitare energicamente e trasferire 20 ml dell'estratto
cloroformico in un matraccio tarato da 50 ml; aggiungere 10 ml della
soluzione etanolica di p-chinone (3.2).
In modo analogo prepare il bianco.
Mettere su b.m. a 60C per due ore al riparo della luce le tre
soluzioni (campione, standard e bianco). Raffreddare, portare a
volume con cloroformio e leggere l'assorbanza a 493 nm contro il
bianco.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
A P'
% Sodio ciclammato = --------
À P 10
A = assorbanza campione
À = assorbanza standard
P' = peso standard in mg
P = peso campione in g
N.B. Per convertire in calcio ciclammato anidro moltiplicare per
0,995.
23. - Determinazione dell'aspartame mediante HPLC
1. OGGETTO
Il metodo descritto consente la determinazione del dolcificante
artificiale "aspartame" (estere metilico del
L-aspartil-L-fenil-alanina).
2. PRINCIPIO
Separazione e determinazione per HPLC dell'aspartame.
3. REATTIVI
3.1. Fase mobile: Soluzione 0,1 M di acido citrico e 0,5 M di sodio
perclorato.
Sciogliere 32,1 g di sodio perclorato e 10,5 g di acido citrico
monoidrato in 300 ml di acqua in matraccio tarato da 500 ml. Portare
a volume e mescolare. Trasferire la soluzione in un matraccio da
vuoto da 1000 ml con sbarretta magnetica e porre su agitatore
magnetico. Aggiungere sodio idrossido al 50% fino a pH = 4,7. Tappare
il matraccio da vuoto, collegare con la pompa (4.2) e degasare
l'eluente per aspirazione sotto agitazione per 5 min. Filtrare la
soluzione su carta Whatman 1 a pressione ridotta.
3.2. Soluzione standard di aspartame 2 mg/ml.
La soluzione va preparata quotidianamente.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Cromatografo liquido ad alta pressione, costituito da:
- pompa a pressione regolabile
- valvola di iniezione a loop
- colonna cromatografica ad alta risoluzione in acciaio: 1 m x 2,1
mm, impaccata con silice legata a scambiatore cationico forte SCX,
granulometria 10 um
- rivelatore spettrofotometrico a 254 nm
- registratore con eventuale sistema di integrazione
4.2. Sistema sotto vuoto per filtrazione della fase mobile costituito
da:
- pompa da vuoto ad acqua
- matraccio per filtrazione sotto vuoto a smerigliatura normalizzata
- imbuto con gambo a smerigliatura normalizzata e setto poroso
- filtri in cellulosa con porosità 0,45 um.
4.3. Siringa per microfiltrazione dei campioni con filtri di
cellulosa, porosità 0,45 um intercambiabili.
5. MODO DI OPERARE
5.1. Preparazione del campione.
Prodotti liquidi o sulubili in acqua: prelevare un campione e diluire
in modo da ottenere una concentrazione presunta di aspartame fra 0,05
e 2 mg/ml.
Filtrare con siringa (4.3).
Prodotti parzialmente solubili in acqua: Trattare ripetutamente il
campione con metanolo, filtrando dopo ogni estrazione. Evaporare a
temperatura ambiente in corrente d'azoto la soluzione metanolica, e
disciogliere il residuo nella quantità d'acqua necessaria ad
ottenere una concentrazione d'aspartame entro il campo di
sensibilità.
5.2. Analisi cromotografica. Regolare la pompa del cromotografo (4.1)
a un flusso di 0,5 ml/min e operare a temperatura ambiente. Iniettare
25 ul di campione per mezzo della siringa (4.3) e lavare
successivamente la valvola di iniezione con 2-3 ml di acqua fra
un'iniezione e l'altra.
L'aspartame in questa condizione viene rivelato a 254 nm ed ha un
tempo di ritenzione di circa 7 min.
5.3 Curva di taratura. Nelle stesse condizioni operative si iniettano
soluzioni standard di aspartame fra 0,05 e 2 mg/ml.
Si costruisce una curva di taratura mettendo in ascisse le
concentrazioni ed in ordinate le aree dei picchi.
La curva è rettilinea nell'intervallo di concentrazioni utilizzate.
6 ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La concentrazione dell'aspartame si ricava dal rapporto tra l'area
del picco dello standard e quella del campione applicando la formula
Ac . Cst . d
Cc = -----------
Ast
dove:
Cc = concentrazione del'aspartame nel campione in mg/ml
Ac = area relativa all'aspartame nel cromotogramma del campione
Cst = concentrazione dello standard in mg/ml
d = diluizione del campione
Ast = area del picco relativo all'aspartame nel cromatogramma dello
standard
24. - Determinazione della presenza di coloranti artificiali
1. OGGETTO
Il metodo permette la ricerca di coloranti artificiali.
2 PRINCIPIO
I coloranti artificiali vengono fissati su lana, sulubilizzati con
ammoniaca o con acido cloridrico.
3. REATTIVI
3.1. Soluzione di potassio solfato acido al 10%
3.2. Acido cloridrico d=l, 19, diluito 1:9 (v/v)
3.3. Ammoniaca al 37% diluita 1:9 (v/v)
3.4. Fibre di lana di pecora sgrassata
3.5. Soluzione di sodio di idrossido al 5%
3.6. Soluzione di ammoniaca al 5%
Sgrassare le fibre di lana non candeggiate per estrazione in un
apparecchio di Soxhlet con etere di petrolio (p.e. 40-60C) (25-30
passaggi). Dopo asciugata, la lana viene fatta bollire per 30 min in
un bicchiere con soluzione di sodio idrossido (3.5) e poi immersa per
1 h in una soluzione di ammoniaca (3.6) a 80C. La lana viene quindi
accuratamente lavata con acqua ed asciugata all'artia. Le fibre
sgrassate non devono essere toccate con le mani.
5. MODO DI OPERARE
Una soluzione o sospensione ottenuta come descritto nella parte
speciale, si neutralizza, se necessario, con ammoniaca (3.3), si
aggiungono 5 ml di potassio solfato acido 3.1) e si scalda
all'ebollizione su b.m. immergendovi un fiocco di lana bianca
sgrassata (3.4). Dopo 5-15 min si estrae la lana e si lava con acqua;
si acidifica quindi la soluzione con 3-4 gocce di acido cloridrico
(3.2) per ogni 100 ml di soluzione e si scalda ancora per 10-20
minuti immergendovi un nuovo fiocco di lana. La presenza di coloranti
artificiali è indicata dalla colorazione che la lana assume dopo
questi trattamenti. I coloranti basici sono meglio fissati dalla lana
in
ambiente neutro o debolmente ammoniacale e sono evidenti sul primo
fiocco. I coloranti acidi vengono fissati in soluzione neutra o
meglio in soluzioni acide. Nel caso che il fiocco di lana, trattato
in soluzione neutra o acida, indichi la presenza di coloranti acidi,
lo si lava bene con acqua e quindi lo si fa bollire per pochi minuti
in una capsula immerso in una soluzione di ammoniaca (3.6). Si toglie
il fiocco di lana, strizzandolo per raccogliere il liquido aderente.
Si travasa il liquido in capsula di porcellana, si porta a secco su
b.m., si riprende con poche gocce d'acqua. In presenza di coloranti
acidi la soluzione appare colorata.
25. - Identificazione dei coloranti artificiali
1. OGGETTO
Il metodo permette la identificazione dei coloranti artificiali.
2. PRINCIPIO
I coloranti artificiali vengono fissati su lana, solubilizzati con
soluzione diluita di ammoniaca e separati per cromatografia su strato
sottile.
3. REATTIVI
Tutti quelli previsti al metodo precedente da (3.1) a (3.4).
3.5. Eluente I:
Soluzione di sodio citrato (tribasico) 2% in ammoniaca al 5%.
L'eluente deve essere preparato di fresco.
3.6. Eluente II:
Alcool butilico terziario, acido propionico, soluzione allo 0,4% di
potassio cloruro (50:12:3) v/v.
3.7. Standard: Rosso naftolo e Azorubina S. (soluzione alcolica 1%).
3.8. Cellulosa MN300 per TLC oppure lastre pronte all'uso
stratificate con la stessa (spessore 0,25 mm).
4. APPARECCHIATURA
4.1. Apparecchiatura per TLC
4.2. Camera di sviluppo
4.3. Microsiringhe da 50 ul
4.4. Soffieria ad aria calda e fredda
5. METODO DI OPERARE
5.1. Separazione dei coloranti per TLC: 20 ul della soluzione
preparata come nel metodo precedente vengono depositati sulle lastre
(3.8) ad una distanza di 2 cm dal bordo inferiore. A fianco si
depositano analogamente 5 ul delle soluzioni standard contenenti i
coloranti probabilmente presenti.
Si pone la lastra nella camera di sviluppo (4.2) saturata previamente
con la miscela eluente e si sviluppa con l'eluente I (3.5) fino a
circa 1 cm dal bordo superiore.
Le stesse operazioni sono effettuate con l'eluente II (3.6).
Si asciugano le lastre in corrente d'aria calda (4.4) e si confronta
la posizione delle macchie separate con quelle della miscela
standard.
N.B. Con l'eluente II (3.6) lo sviluppo deve essere effettuato al
buio a temperatura di 20C.
26. - Ricerca ed identificazione dei coloranti naturali.
1. OGGETTO
I metodi descritti consentono di identificare i coloranti naturali
idrosolubili (antociani, betanina, flavonoidi, ecc.) e liposolubili
(carotenoidi, clorofille, ecc.).
A) - COLORANTI IDROSOLUBILI
2. PRINCIPIO
I coloranti idrosolubili sono estratti con una soluzione metanolica
di acido cloridrico, quindi separati per TLC ed identificati.
3. REATTIVI
3.1. Soluzione di acido cloridrico in metanolo all'1%
3.2. Cellulosa microcristallina per TLC o lastre già pronte
(spessore 0.1 mm)
3.3. Resina a scambio cationico forte Dowex 50 W o similare
3.4. Eluente I: Isopropanolo, etanolo, acido formico, acqua
(40:35:5:30) v/v
3.5. Eluente II: metanolo, acido cloridrico (d=l,19) (98:2) v/v
3.6. Soluzione standard: enocianina, betanina e altri antociani
all'1% in metanolo
3.7. Ammoniaca 25% (d=0,91)
4. APPARECCHIATURA
4.1. Apparecchiatura per TLC
4.3. Microsiringa da 50 ul
4.4. Centrifuga da laboratorio con provette da 100 ml
4.5. Omogeneizzatore
4.6. Evaporatore rotativo sotto vuoto
4.7. Bombola di azoto
5. MODO DI OPERARE
Estrazione
Tutte le operazioni vanno effettuate a luce ridotta
5.1. Sostanze liquide
10 g di prodotto sono addizionati con ca 50 ml di soluzione (3.1). Si
lascia riposare per ca un'ora. Si centrifuga (4.4) per 10 min. Si
raccoglie il surnatante in matraccio da 250 ml previa filtrazione su
lana di vetro. Si lava ripetutamente il residuo per centrifugazione
fino a completa decolorazione raccogliendo i surnatanti nello stesso
matraccio e si porta a volume. Si prosegue come in (5.3) nel caso di
succhi o prodotti zuccherini oppure direttamente come in (5.4).
5.2. Sostanze solide
10 g di prodotto sono addizionati di circa 50 ml della soluzione di
acido cloridrico (3.1) ed omogeneizzati per qualche minuto, lasciati
riposare e quindi centrifugati (4.4) per 10 min. Si raccoglie il
surnatante in matraccio da 250 ml previa filtrazione su lana di
vetro. Sul residuo si ripete l'estrazione fino a completa
decolorazione raccogliendo gli estratti nello stesso matraccio;
quindi si porta a volume. Si prosegue come in (5.4).
5.3. Per succhi e prodotti zuccherini conviene prima allontanare
l'eccesso di zuccheri. 25 ml di estratto si portano con NaOH 0.1 M a
pH 6 e si fanno percolare su colonna di resina scambiatrice (3.3). Si
allontanano gli zuccheri per ulteriore lavaggio con circa 50 ml di
acqua, quindi si recuperano i pigmenti eluendo con una soluzione
all'1% di HCL in metanolo fino a decolorazione.
5.4. 25 ml di estratto sono concentrati sottovuoto con evaporatore
rotativo (4.6) fino a qualche ml. Da 10 a 25 ul (a seconda
dell'intensità di colore del concentrato) sono depositati a circa 2
cm dal bordo inferiore della lastra ed essicati in corrente di azoto
(4.7). A fianco si depongono le soluzioni standard. Si sviluppa al
buio con l'eluente I (3.4) fino a che il fronte è avanzato di circa
6 cm. Dopo essiccamento in corrente di azoto (4.7) la lastra viene
sviluppata in un'altra camera di sviluppo con l'eluente II (3.5).
Dopo essiccamento in corrente di azoto, le macchie separate si
confrontano con gli standard. Gli antociani possono essere distinti
dalla betanina esponendo la lastra a vapori di ammoniaca (3.7).
Gli antociani virano al blu, mentre la betanina rimane viola.
B) - COLORANTI LIPOSOLUBILI
2. PRINCIPIO
I coloranti liposolubili sono estratti con miscela di acetone ed
etere di petrolio, quindi separati per TLC ed identificati.
3. REATTIVI
3.1. Etere di petrolio p.e. 40-60C
3.2. Acetone
3.3. Eluente: etere di petrolio (p.e. 40-60C), acetato di etile,
metanolo (70:25:5) v/v
3.4. Gel di silice G per TLC o lastre già pronte (spessore 0,25 mm)
3.5. Sodio solfato anidro
3.6. Ammonio solfato (soluzione satura)
3.7. Soluzione standard di B-carotene, clorofille ed altri
carotenoidi all'1% in etere di petrolio (3.1).
Come standard si può anche usare un estratto di spinaci preparato
secondo (5.2).
4. APPARECCHIATURA
4.1. Apparecchiatura per TLC
4.2. Camera di sviluppo
4.3. Microsiringa da 50 ul
4.4. Centrifuga da laboratorio con provette da 100 ml
4.5. Omogeneizzatore
4.6. Imbuto separatore da 500 ml
4.7. Evaporatore rotativo sotto vuoto
4.8. Bombola di azoto
5. MODO DI OPERARE
Tutte le operazioni devono essere effettuate a luce ridotta.
5.1. Sostanze liquide
10 g di liquido diluito a 200 ml con soluzione (3.6) sono estratti
ripetutamente in imbuto separatore con porzioni di 50 ml di etere di
petrolio (3.1) fino a completa decolorazione dello strato inferiore.
Si procede quindi come in (5.3).
5.2. Sostanze solide
10 g di prodotto sono addizionati di circa 25 ml di acetone (3.2)
omogeneizzati (4.2) in corrente di azoto (4.8) per qualche minuto e
quindi centrifugati (4.4) per 10 minuti. Si raccoglie il surnatante
in imbuto separatore (4.6) contenente etere di petrolio (3.1)
stratificato sulla soluzione (3.6) e si ripete l'estrazione sul
residuo fino a decolorazione completa. Gli estratti si diluiscono con
soluzione satura di solfato di ammonio (3.6), si lasciano
stratificare e si scarta la fase acquosa.
5.3. La fase eterea viene filtrata su filtro a pieghe contenente
sodio solfato anidro (3.5). Il filtrato viene concentrato in
evaporatore rotativo (4.7) fino a qualche ml (a seconda
dell'intensità del colore).
20-30 ul vengono depositati in striscia sottile sulla lastra a circa
m dal bordo inferiore, sono essicati in corrente di azoto (4.8);
a fianco, sulla stessa lastra, si depositano le soluzioni standard.
Si sviluppa con l'eluente (3.3) nella camera di sviluppo (4.1) al
buio fino a che il fronte è avanzato di circa 10 cm. I relativi
pigmenti vengono identificati dal loro caratteristico colore dopo
essiccamento in corrente di azoto (4.8) dalla lastra.
Ordine di sviluppo sulla lastra a partire dal fronte del solvente:
B-carotene (Rf = 0.95) arancio
criptoxantine (Rf =fra 0.80 e 0.85) giallo-arancio
apocarotenale (Rf =0.80) arancio
feofitina a (Rf = 0.70) grigio
feofitina b (Rf = 0.61) bruno
cantaxantina (Rf = 0.58) giallo arancio
clorofilla a (Rf = 0.45) verde bluastro
clorofilla b (Rf = 0.40) verde oliva
luteina (Rf = 0.20) giallo arancio
altre xantofille
(violaxantina etc.) (Rf = 0.10-0.20) giallo arancio di diverse
gradazioni
27. - Ricerca globale di alcuni conservanti
1. OGGETTO
Il metodo descritto consente di identificare contemporaneamente la
presenza di acido sorbico, acido benzonico, acido p-idrossibenzoico e
suoi esteri, acido p-clorobenzoico e acido salicilico.
2. PRINCIPIO
I conservanti vengono estratti con etere, separati per cromotografia
su strato sottile (TLC) ed identificativi nell'UV.
3. REATTIVI
3.1. Poliammide in polvere per TLC
3.2. Indicatore fluorescente UV 254
3.3. Miscela etere di petrolio (p.e. 40-60C) - Etere etilico (1:1)
v:v
3.4. Etanolo 96% (v:v)
3.5. Metanolo
3.6. Acetone
3.7. Benzene
3.8. Acido acetico glaciale
3.9. n-pentano, per cromatografia (p.e. 34-36C)
3.10. n-esano, per cromatografia (p.e. 68-69C)
3.11. Sodio solfato anidro
3.12. Sodio carbonato acido
3.13. Acido solforico ca: 20%
3.14. Eluente A per la separazione degli acidi: benzene, acetone,
acido acetico glaciale (60:30:1) v:v
3.15. Eluente B per la separazione degli esteri dell'acido
p-idrossibenzoico: n-pentano, n-esano, acido acetico (10:10:3) v:v
Il n-pentano e il n-esano possono essere sostituiti da etere di
petrolio con p.e. compreso nei limiti sopra riportati.
3.16. Soluzioni di riferimento: soluzioni alcoliche diverse
contenenti ciascuna 0,1% di acido sorbico, acido clorobenzoico, acido
salicilico, acido p-idrossibenzoico e suoi esteri. Soluzione alcolica
allo 0,2% di acido benzoico.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Attrezzatura base per cromatografia su strato sottile costituita
da:
- stratificatore
- piastra TLC 20x20 cm oppure 20x5 cm
Le piastre con indicatore fluorescente incorporato si trovano già
pronte in commercio.
Mescolare intimamente, dopo essiccazione, 12 g di polvere di
poliammide (3.1) con 0,3 g di indicatore (3.2). Aggiungere 60 ml di
metanolo (3.5) e agitare fortemente. Stendere la miscela sulle
piastre per uno spessore di 0,25 mm. Lasciare asciugare a temperatura
ambiente.
- Camera di sviluppo
4.2 Micropipette
4.3. Lampada UV con doppio campo spettrale a 254 nm. e 350 nm (o due
lampade separate).
4.4. Soffieria ad aria calda e fredda.
5. MODO DI OPERARE
Omogeneizzare 50 g di prodotto disperdendolo in acqua se necessario.
Acidificare con 10 ml di acido solforico (3.13) ed estrarre in imbuto
separatore per 3 volte con porzioni di 20 ml ciascuna della miscela
di etere etilico ed etere di petrolio (3.3). Riunire gli estratti
eterei e lavarli con pochi ml di acqua. Essiccare su sodio solfato
(3.11), filtrare ed eliminare la maggior parte del solvente per
evaporazione su b.m.; i rimanenti 2-3 ml di solvente sono rimossi a
temperatura ambiente con una leggera corrente d'aria. Sciogliere il
residuo con 1 ml di etanolo (3.4); depositare 3-5 (immagine) sulla
piastra in macchie o striscie. Depositare contemporaneamente sulla
stessa piastra 3 (immagine) delle soluzioni di riferimento (3.16).
Porre la piastra nella camera di sviluppo presaturata con l'eluente A
(3.14) ed eluire fino a 5 cm ca dal bordo superiore. Asciugare a
temperatura ambiente.
Preparare in modo analogo una seconda piastra ed eluire in altra
camera con l'eluente B (3.15) come precedentemente descritto.
Porre le piastre sotto la lampada U.V. (4.3) a 254 nm. L'acido
salicilico appare come una macchia blu brillante mentre gli altri
conservanti come macchie brune su fondo giallo-verde fluorescente. I
valori orientativi di Rf sono i seguenti:
Valori di Rf Eluente Eluente
A B
Acido sorbico 47 89
Acido benzoico 40 83
Acido p-clorobenzoico 32 80
Acido p-idrossibenzoico 3 4
Acido salicilico 8 26
p-idrossibenzoato di metile 24 8
p-idrossibenzoato di etile 32 12
p-idrossibenzoato di propile 36 15
p-idrossibenzoato di butile 41 19
28. - Determinazione degli acidi benzoico e sorbico mediante HPLC
(in assenza di p-idrossibenzoato)
1. OGGETTO
Il metodo permette il dosaggio contemporaneo degli acidi benzoico e
sorbico in assenza di p-idrossibenzoati.
2. PRINCIPIO
Separazione e dosaggio mediante cromatografia liquida ad alta
pressione.
3. REATTIVI
3.1. Solvente di estrazione per campioni solidi e semisolidi:
soluzione idroalcolica allo 0,5% di acido metafosforico: sciogliere 5
g di acido metafosforico in 250 ml di acqua e portare a 1000 ml con
etanolo 95% (v:v).
3.2. Eluente: Soluzione tampone a pH 7: sciogliere 2,5 g di potassio
fosfato bibasico triidrato (K2HPO4. 2H2O) e 2,5 g di potassio fosfato
monobasico (KH2PO4) in acqua e portare a 1000 ml. Filtrare sotto
vuoto su filtro di cellulosa (4.2).
3.3. Standard
3.3.1. Per campioni liquidi: soluzione acquosa contenente 100 ppm di
acido benzoico + 100 ppm di acido sorbico.
3.2. Per campioni solidi: soluzione in solvente di estrazione (3.1)
contenente 100 ppm di acido benzoico + 100 ppm di acido sorbico).
4. APPARECCHIATURA
4.1. Apparecchio per HPLC costituito da:
- Pompa a pressione regolabile
- Valvola d'iniezione a loop
- Rivelatore spettrofotometrico con possibilità di lettura a 235 nm
- Colonna per HPLC impaccata con fase inversa silice-ottodecilsilano
(C18)
- Registratore con eventuale sistema di integrazione
4.2. Sistema per filtrazione sotto vuoto dell'eluente costituito da:
- Pompa da vuoto ad acqua
- Beuta per filtrazione sotto vuoto a smerigliatura normalizzata
- Imbuto con gambo a smerigliatura normalizzata e setto poroso
- Filtri in cellulosa con porosità di 0.45 um
4.3. Siringa per microfiltrazioni di campioni con filtri di cellulosa
intercambiabili, porosità 0,45 um
5. MODO DI OPERARE
5.1. Prodotti liquidi: filtrare mediante la siringa (4.3) 10 ml di
campione. Proseguire come indicato in (5.3).
5.2. Prodotti solidi: omogeneizzare 5-10 g di campione esattamente
pesati, con 50-60 ml di soluzione idroalcolica di acido metafosforico
(3.1).
Portare quantativamente al volume finale di 100 ml. Filtrare prima
con filtro a pieghe e successivamente un'aliquota con la siringa
(4.3). Proseguire come indicato in (5.3).
5.3. Iniettare 25 (immagine) del filtrato con flusso dell'eluente
(3.2) di 2 ml/min. Effettuare la rivelazione alla lunghezza d'onda di
235 nm.
Iniettare nelle stesse condizioni operarive 25 um della soluzione
standard (3.3.1 o 3.3.2) secondo i casi. Identificare gli
antifermentativi dal loro tempo di ritenzione secondo la sequenza:
acido benzoico, acido sorbico.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La concentrazione per singolo antifermentativo è data da:
A Cst d
C = ----------
Ast
dove:
C = concentrazione in ppm dell'antifermentativo nel campione
A = area del piccolo relativo all'antifermentativo nel cromatogramma
del campione
Cst = concentrazione in ppm dell'antifermentativo nello standard
d = diluizione del campione
Ast = area del picco relativo all'antifermentativo nel cromatogramma
dello standard.
29. - Determinazione degli esteri dell'acido p-idrossibenzoico
mediante HPLC
1. OGGETTO
Il metodo permette il dosaggio contemporaneo degli esteri metilico,
etilico e propilico dell'acido p-idrossibenzoico anche in presenza di
acido sorbico e acido benzoico.
2. PRINCIPIO
Separazione e dosaggio mediante cromatografia liquida ad alta
pressione.
3. REATTIVI
3.1. Solvente di estrazione per campioni solidi e semisolidi:
Soluzione idroalcolica allo 0,5% di acido metafosforico: sciogliere 5
g di acido metafosforico in 250 ml di acqua e portare a 1000 ml con
etanolo 95% (v:v).
3.2. Eluenti: fase mobile A - Soluzione tampone fosfato pH 7:
sciogliere 2,5 g di potassio fosfato bibasico triidrato (K2HPO4.
3H2O) e 2,5 g di potassio fosfato monobasico (KH2PO4) in acqua e
portare a 1000 ml. Filtrare sottovuoto con filtro di cellulosa (4.2).
Fase del mobile B: metanolo purissimo per HPLC.
3.3. Standard: Soluzione alcolica contenente 100 ppm di acido
benzoico + 100 ppm di acido sorbico + 100 ppm di p-idrossibenzoato di
metile + 100 ppm di p-idrossibenzoato di etile + 100 ppm di
p-idrossibenzoato di propile.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Apparecchio per HPLC costituito da:
- programmatore di gradiente
- pompa doppia a pressione regolabile (oppure due pompe singole a
pressione regolabile)
- Rivelatore spettrofotometrico con lettura 235 nm
- Colonna per HPLC impaccata con fase inversa silice-ottodecilsilano
(C18)
- Registratore con eventuale sistema di integrazione
4.2. Sistema per filtrazione sottovuoto dell'eluente costituito da:
- Pompa da vuoto ad acqua
- Beuta per filtrazione sottovuoto a smerigliatura normalizzata
- Imbuto con gambo a smerigliatura normalizzata e setto poroso
- Filtri in cellulosa con porosità di 0.45 um
4.3. Siringa per microfiltrazione di campioni con filtri di cellulosa
intercambiabile, porosità 0,45 um
5. MODO DI OPERARE
5.1. Prodotti liquidi: filtrare mediante la siringa (4.3) 10 ml di
campione. Proseguire come indicato in 5.3.
5.2. Prodotti solidi: omogeneizzare 5-10 g di campione esattamente
pesati, con 50-60 ml di soluzione idroalcolica di acido metafosforico
(3.1).
Portare quantativamente al volume finale di 100 ml. Filtrare prima
con un filtro a pieghe e successivamente una aliquota con la siringa
(4.3). Proseguire come indicato in 5.3.
5.3. Determinazione: iniettare 25 um del filtrato. Effettuare la
rivelazione alla lunghezza d'onda di 235 nm. Iniettare nelle stesse
condizioni operative 25 (immagine) della soluzione standard (3.3).
Identificare gli antifermentativi dal loro tempo di ritenzione.
5.3.1. Analisi dei p-idrossibenzoati in assenza di acido sorbico e
acido benzoico.
Eluizione isocratica con miscela delle fasi mobili A e B (40:60),
velocità di flusso 1,2 al minuto. Entro 8-10 minuti si separano
nell'ordine: p-idrossibenzoato di metile, p-idrossibenzoato di etile,
p-idrossibenzoato di propile.
5.3.2. Analisi dei p-idrossibenzoati, in presenza di acido benzoico e
acido sorbico.
Eluizione in gradiente lineare della miscela delle fasi mobili con
B crescente dal 20% all'80% entro un minuto, velocità di flusso 2
ml/min. Entro 8-10 minuti si separano nell'ordine acido benzoico,
acido sorbico, p-idrossibenzoato di metile, p-idrossibenzoato di
etile, p-idrossibenzoato di propile.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La concentrazione per singolo antifermentativo è data da:
A Cst d
C = ----------
Ast
dove:
C = concentrazione in ppm dell'antifermentativo nel campione
A = area del picco relativo all'antifermentativo nel cromatogramma
del campione
Cst = concentrazione in ppm dell'antifermentativo nello standard
d = diluizione del campione
ast = area del picco relativa all'antifermentativo nel cromatogramma
dello standard.
30. - Determinazione dell'anidride solforosa
1. OGGETTO
I metodi sottoriportati permettono la determinazione dell'anidride
solforosa in via generale (A) e nei prodotti disidratati in presenza
di altri composti solforati volatili (B).
A. Determinazione dell'anidride solforosa per distillazione.
2. PRINCIPIO
Distillazione dell'anidride solforosa e sua titolazione dopo
ossidazione ad acido solforico mediante acqua ossigenata.
3. REATTIVI
3.1. Acido cloridrico soluzione al 15%
3.2. Acqua ossigenata soluzione allo 0,2%, preparata diluendo il
perossido d'idrogeno al 30% con acqua distillata
3.3. Metanolo puro per analisi
3.4. Sodio idrossido soluzione 0, 1 M
3.5. Sodio idrossido soluzione 0, 01 M
3.6. Indicatore misto, preparato nel seguente modo: 100 ml di
soluzione alcolica di rosso di metile allo 0,03% sono mescolati con
100 ml di soluzione alcolica allo 0,05% di blu di metilene e
filtrati. In ambiente acido si ha un viraggio al rosso, in ambiente
alcalino al verde.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Apparecchi di distillazione secondo la figura 2
4.2. Bombola di azoto
4.3. Bottiglia di lavaggio
5. MODO DI OPERARE
20-50 g di campione sono spappolati in acqua distillata e introdotti
nel pallone di distillazione, insieme con 50 ml di metanolo (3.3).
Un'apertura laterale del pallone è collegata alla bombola dell'azoto
(4.2), il gas proviene da una bombola con valvola di riduzione e
passa attraverso la bottiglia di lavaggio (4.3) riempita con sodio
idrossido (3.4); l'altra apertura laterale è chiusa con un imbuto
separatore contenente 40 ml di acido cloridrico (3.1).
Nel recipiente di raccolta si mettono 10 ml di perossido d'idrogeno
(3.2) e 60 ml di acqua, quindi alcune gocce dell'indicatore (3.6). Si
titola con sodio idrossido (3.5) fino a viraggio al verde, quindi di
collega il recipiente di raccolta all'apertura centrale del pallone,
nonchè, per sicurezza, ad una bottiglia di lavaggio contenente
anch'essa soluzione acquosa neutralizzata di perossido d'idrogeno.
All'inizio della distillazione si toglie il tappo smerigliato che si
trova sul collettore, per il tempo di scorrimento dell'acido
clororidrico (3.1). Dopo aver rimesso il tappo, si fa passare
nell'apparecchio una corrente di azoto (4.2) e il liquido è
riscaldato con una piccola fiamma fino all'ebollizione. Si prosegue
l'ebollizione per 45 minuti. La corrente d'azoto (4.2) dev'essere
abbastanza veloce ma non tumultuosa.
Avvenuta la distillazione, si toglie il collettore lavando con acqua
distillata il tubo che pesca nel collettore stesso. L'acido solforico
formatosi per ossidazione dell'anidride solforosa è titolato con
sodio idrossido (3.5) fino a ricomparsa della colorazione verde
iniziale.
Prima di effettuare una nuova determinazione è indispensabile lavare
l'apparecchio con una corrente d'azoto (4.2) per 5 o 10 minuti (in
una prova in bianco il liquido nel recipiente di raccolta non deve
cambiar colore).
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Si esprimono in anidride solforosa (SO2) usando i fattori: 1 ml di
NaOH 0,01 M = 0,32 mg SO2.
B. Determinazione dell'anidride solforosa per via colorimetrica
2. PRINCIPIO
Reazione colorimetrica dell'anidride solforosa con la p-rosanilina
decolorata.
3. REATTIVO
3.1. Soluzione di aldeide formica 0,015%: si prepara da una soluzione
di aldeide formica al 40% mediante diluizione in due tempi: da 10 a
1000 e da 75 a 2000.

----&gt; Vedere Immagine a Pag. 102 del S.O. &lt;----

3.2 Soluzione di p-rosanilina cloridrato decolorata: porre 100 mg di
p-rosalina cloridrato e 200 ml di acqua in un matraccio tarato da
1000 ml; aggiungere 160 ml di acido cloridrico (1:1) (v/v) e portare
a volume; lasciar riposare 12 h prima dell'uso.
3.3. Soluzione di sodio tetracloromercurato: porre 23,50 g di sodio
cloruro e 54,30 g di mercurio cloruro (ico) in un matraccio tarato da
2000 ml; sciogliere in circa 1900 ml di acqua e portare a volume.
3.4. Soluzione standard di anidride solforosa: sciogliere circa 150
mg di sodio metabisolfito in acqua e portare a volume in un matraccio
di 100 ml; controllare il titolo dell'anidride solforosa con
soluzione 0,005 M di iodio prima dell'uso (circa 100 mg SO2/ml).
3.5. Soluzione di sodio idrossido 0,5 M
3.6. Soluzione di iodio 0,005 M
3.7. Soluzione di acido solforico 0,25 M
4. APPARECCHIATURA
4.1. Spettrofotometro UV-visibile oppure fotocolorimetro con filtro a
550 nm.
4.2. Omogeneizzatore
5. MODO DI OPERARE
5.1. Preparazione della curva di taratura:
Porre 5 ml di reagente al mercurio (3.3) in una serie di matracci da
100 ml; aggiungere poi 0,1,2,3.... ml di soluzione standard di
anidride solforosa (3.4), portare a volume ed agitare. Trasferire
aliquote di 5 ml in tubi da saggio da 200 mm contenenti 5 ml di
reagente alla p-rosanilina (3.2). Aggiungere 10 ml della soluzione di
aldeide formica (3.1), agitare e tenere a temperatura ambiente per 30
min. Leggere l'assorbimento a 550 nm a confronto con il bianco e
tracciare la curva di taratura.
5.2. Determinazione
Pesare 10 + - 0,02 g di prodotto e porli in un omogeneizzatore (4.2)
con 290 ml di acqua; coprire e mescolare per 2 min. Prelevare una
porzione dell'omogeneizzato con una pipetta tarata da 10 ml a
sgocciolamento e trasferire in un matraccio tarato da 100 ml
contenente 4 ml di sodio idrossido (3.5). Agitare energicamente per
15-30 sec; aggiungere 4 ml di acido solforico (3.7) e 20 ml di
reagente al mercurio (3.3) e portare a volume.
Per il bianco utilizzare 10 ml di acqua in sostituzione dell'estratto
del campione.
Trasferire 2 ml della soluzione in esame in un tubo da saggio da 200
mm contenente 5 ml di reagente alla p-rosanilina (3.2); aggiungere 10
ml di soluzione di aldeide formica (3.1), mescolare e tenere 30 min a
temperatura ambiente. Leggere l'assorbimento a 550 nm contro il
bianco (adoperando la medesima vaschetta per prove successive,
occorre lavarla dopo ogni uso con acido cloridrico 1:1 (v/v) e
acqua).
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
Riferendosi alla curva di taratura convertire il risultato in ppm di
anidride solforosa.
31. - DOSAGGIO DELLA NISINA PER DIFFUSIONE IN AGAR
1. OGGETTO
Il presente metodo consente di dosare la nisina addizionata agli
alimenti e di differenziarla da altri inibenti eventualmente
presenti.
2. PRINCIPIO
Il campione viene diluito con HCL 5 M; l'estratto viene quindi
portato all'ebollizione, rapidamente raffreddato a t.a., e
centrifugato. Il surnatante ottenuto dopo refrigerazione
dell'estratto per solidificare la parte grassa, viene filtrato:
l'attività antibiotica del campione è determinata misurando la
diffusione della nisina su in terreno agarizzato, insemenzato con
Micrococcus flavus.
La diffusione è rivelata dalla formazione di aloni di inibizione del
microrganismo. Si ammette che il diametro di tali aloni sia
direttamente proporzionale al logaritmo della concentrazione di
antibiotico nel campo delle concentrazioni utilizzate.
Per dimostrare l'assenza di sostanze interferenti vengono effettuati
i seguenti controlli: a) un'aliquota del surnatante viene sottoposta
ad ulteriore ebollizione e saggiata; b) un'aliquota del surnatante
viene portata a pH alcalino con NaOH, scaldata, riacidificata e
sottoposta al saggio.
3. REATTIVI
3.1. Micrococcus flavus ATCC 10240*
3.1.1. Conservazione del ceppo
Insemenzare con Micrococcus flavus il terreno colturale (4.1)
distribuito in provette a becco di clarino. Incubare a 30C per 48
ore, conservare in frigorifero a 4C e trapiantare ogni 15 giorni.
3.1.2. Preparazione della sospensione batterica
Lavare la patina di una coltura recente in agar a becco con 10 ml di
soluzione Ringer a 1/4 (3.3). Misurare la trasmittanza luminosa
* ATCC = The American Culture Collection - 12301 Parklawn Drive
Rockville, Maryland 20852
della sospensione e diluire con (3.3) fino ad ottenere un valore del
50% (=0,3 D.O.) misurato a 650 nm sotto lo spessore di 1 cm in
confronto con la soluzione di Ringer a 1/4 (3.3).
3.2. Terreno di prova:/
Peptone 10,0 g
Lab. lemco 3,0 g
Sodio cloruro 3,0 g
Estratto di lievito 1,5 g
Agar 10,0 g
Zucchero di canna grezzo 1,0 g
Acqua distillata 1000 ml
pH 7,5 (prima della sterilizzazione).
3.3. Soluzione di Ringer 1/4:
Sodio cloruro 9,0 g
Potassio cloruro 0,42 g
Calcio cloruro anidro 0,24 g
Sodio bicarbonato 0,20 g
Acqua distillata 1000 ml
Ad una parte della soluzione aggiungere 3 parti di acqua distillata.
Sterilizzare a 121C per 15 min.
/ Si può usare qualsiasi terreno del commercio che dia gli stessi
risultati
3.4. HCl 0,02 M
3.5. HCl 5 M
3.6. NaOH 5 M
3.7. Soluzione di Tween 20 al 50%
Tween 20 (poliossietilen-sorbitanmonolaurato) 50 ml
Acqua distillata 50 ml
Mantenere per 30 min a 50C prima dell'uso.
3.8. Sostanza di riferimento: nisina ad attività nota (espressa in
U.I.).*
3.8.1. Soluzioni di riferimento
Sciogliere in HCl 0,02 M (3.4) una quantità esattamente pesata della
sostanza di riferimento (3.8); portare all'ebollizione in bagno maria
bollente per 5 minuti, raffreddare rapidamente a 20+5 lasciar
riposare 2 ore, indi diluire con HCl 0,02 M in modo da ottenere una
soluzione madre contenente 1000 U.I. di nisina per ml.
Se conservata in frigorifero in bottiglia chiusa questa soluzione è
stabile per 7 gg. A partire da questa soluzione preparare per
diluizioni successive (1:1) con l'estratto D (4.1) le seguenti
soluzioni:
S8 10 UI/ml
S4 5 UI/ml
* 1 mg di nisina equivale a 1000 U.I.
S2 2,5 UI/ml
S1 1,25 UI/ml
4. MODO DI OPERARE
4.1. Preparazione degli estratti e delle soluzioni
Pesare 40 g del campione, aggiungere 160 ml di HCl(3.4) e agitare
(Stomacher o altro omogeneizzatore) fino a completa dispersione.
Portare il pH a 2 con HCl 5 M (3.5), indi porre in bagno maria
bollente e mantenere per 5 minuti dal momento in cui il campione ha
raggiunto almeno i 98C.
Raffreddare rapidamente a 20+5C e portare il volume a 200 ml con HCL
0,02 M (3.4). Centrifugare per almeno 10 min a 2500 giri/min e porre
il surnatante in frigorifero fino a solidificazione della fase
grassa.
Decantare la fase sottostante lo strato di grasso e filtrare su lana
di vetro. (Estratto A).
Prelevare 20 ml dell'esratto A e porli in bagno maria bollente per 5
minuti; raffreddare rapidamente a 20C +- 5 e portare a 200 ml con
acqua distillata (Estratto B).
Prelevare 60 ml dell'estratto A e portarli a pH 11 con NaOH 5 M
(3.6); scaldare per 20 minuti a 63C (o 2 ore a 44C), raffreddare a
20C+-5 e portare a pH 2 con HCl 5 M (estratto C).
Prelevare 40 ml dell'estratto B ed addizionare 120 ml di HCl 0,02 M
(Estratto D); questa soluzione viene usata come diluente sia per il
campione che per lo standard.
Preparare per diluzioni successive (1:1) le diluzioni del campione
(Estratto A, B, C).
4.2. Dosaggio
4.2.1. Inoculazione del terreno di coltura
Il terreno di cui in 3.2 disciolto in bagno maria e reffreddato a
50C viene addizionato del 2% della soluzione 3.7 ed insemenzato con
il 2% della sospensione batterica di cui in 3.1.2. Agitare evitando
la formazione di bolle; per rimuovere la schiuma eventualmente
formatasi, il terreno insemenzato può essere mantenuto per qualche
minuto a bagno maria a 48-50C.
4.2.2. Preparazione delle piastre
La diffusione in agar si effettua su almeno 3 piastre con 4
concentrazioni della soluzione di riferimento (S8, S4, S2, S1), 4
concentrazioni del campione (Estratto A) e 4 concentrazioni del
campione ritrattato al calore (Estratto B); su una piastra con le
diluzioni del campione (Estratto A) e le concentrazioni del campione
trattato a pH alcalino (Estratto C). A tale scopo utilizzare piastre
di dimensioni tali che si possano praticare nel terreno agarizzato
almeno 8 pozzetti del diametro di 10 mm, in cui centri non siano
distanti tra loro meno di 30 mm.
Versare nelle piastre una quantità di terreno (3.2) insemenzato come
indicato in 4.2.1, che permetta di ottenere uno strato dello spessore
di circa 3 mm.
Lasciare solidificare, praticare i pozzetti e disporvi dei volumi
esattamente misurati della soluzione di riferimento del campione
(Estratto A), del campione ritrattato termicamente (Estratto B) e del
campione alcanizzato (Estratto C).
4.2.3. Incubazione
Incubare le piastre per 16-18 ore a 30C +- 2C.
5. VALUTAZIONE DEI RISULTATI
Misurare il diamentro degli aloni di inibizione con l'approssimazione
di 0,1 mm. Per ogni concentrazione, registrare le misure medie su
carta semilogaritmoica riportando il logaritmo delle concentrazioni
in funzione del diametro dell'alone di inibizione. Tracciare le rette
più appropriate per la soluzione di riferimento e per l'estratto
procedendo ad esempio come segue.
Determinare il punto più appropriato per il livello più basso della
soluzione di riferimento (SL) mediante la formula:
7S1 + 4S2 + S4 - 2S8
(a) SL = -------------------
10
Determinare il punto più appropriato per il livello più elevato
della soluzione di riferimento (SH) mediante la formula:
7S8 + 4S4 + S2 - 2S1
(b) SH = -------------------
10
Determinare allo stesso modo i punti più appropriati per il campione
al livello più basso (UL) ed al livello più alto (UH) sostituendo
nelle formule sopra riportate i valori S1, S2, S4 e S8 con quelli u1,
u2, u4 e u8.
Riportare i valori di SL ed SH sullo stesso grafico. Congiungendo i
due punti si ottiene la retta più appropriata per la soluzione
standard. Procedendo allo stesso modo per UL ed UH si ottiene la
retta più appropriata per l'estratto.
In mancanza di interferenze, le rette dovrebbero essere parallele. In
pratica, esse sono considerate parallele allorchè (SH - SL) ed (UH -
UL) non differiscono fra loro di più del 10% della loro media.
Se le rette non sono parallele, è possibile eliminare sia u1 ed s1,
sia u8 e s8. In queseto caso, i valori SL, SH, UL ed UH che
permettono di ottenere le rette più appropriate vanno calcolati
mediante le formule seguenti:
5S1 + 2S2 - S4 5S2 + 2S4 - S8
(a) SL = -------------- o --------------
6 6
5S4 + 2S2 - S1 5S8 + 2S4 - S2
(b) SH = -------------- o --------------
6 6
e mediante formule analoghe per UL ed UH. Se si utilizza questa
alternativa, bisogna verificare il parallelismo delle rette nel modo
sopra descritto. Se il risultato è stato ottenuto a partire da tre
punti, ciò va indicato sul certificato di analisi.
Quando le rette sono considerate parallele, calcolare il logaritmo
dell'attività relativa (log. A) con una delle formule seguenti:
(U1+U2+U4+U8-S1-S2-S4-S8) x 0,602
(c) log a = --------------------------------
U4+U8+S4+S8-U1-U2-S1-S2
Per 3 punti
(U1+U2+U4-S1-S2-S4) x 0,401
(d) log A = --------------------------
U4+S4-U1-S1
(U2+U4+U8-S2-S4-S8) x 0,401
(d) log A = --------------------------
U8+S8-U2-S2
Attività dell'estratto del campione = attività dello standard
corrispondente x A. (U8 = S8 x A).
Se l'attività relativa si trova al di fuori della gamma di valori
compresi fra 0,5 e 2,0 ripetere la determinazione procedendo ad
opportune regolazioni delle concentrazioni dell'estratto o,
eventualmente, delle soluzioni di riferimento. Quando tale attività
non può essere ricondotta nella gamma di valore richiesta, il
risultato deve essere considerato approssimativo a tale indicazione
deve figurare sul certificato di analisi.
Allorchè le rette non sono considerate parallele, ripetere la deter
minazione. Se in base a questa nuova determinazione non è ancora
possibile ottenere il parallelismo, la determinazione deve essere
considerata insoddisfacente. Esprimere il risultato in mg di
nisina/Kg di alimento.
6. RIPETIBILITÀ
La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate sullo
stesso campione dallo stesso analista non deve superare il 10% del
risultato più elevato.
32. Determinazione della Pectina
1. OGGETTO
Il metodo permette la determinazione della pectina solubile.
2. PRINCIPIO
La pectina, espressa come acido galatturonico o acido pectico, dopo
opportune saponificazioni e precipitazioni viene determinata
spettrofotometricamente con m-idrossi di fenile.
3. REATTIVI
3.1. Etanolo al 95% v/v
3.2. Etanolo al 63% v/v
3.3. Sodio tetraborato 0,0125 M in H2SO4: sciogiere 0,4767 g di sodio
tetraborato decaidrato in 100 ml di H2SO4 98% (d20=1,84).
3.4. m-idrossidifenile: soluzione allo 0,15% in sodio idrossido allo
0,5%.
La soluzione deve essere tenuta in frigorifero proteggendola dalla
luce con un foglio di alluminio. Ha una durata di 20 giorni.
3.5. Acido D-galatturonico
3.6. Sodio idrossido 0,05 M
3.7. Sodio idrossido 1 M
4. APPARECCHIATURA
4.1. Spettrofotometro o colorimetro
4.2. Sistema filtrante Millipore sotto vuoto con filtro da 0,45 um
tipo HA
4.3. Agitatore per provette tipo Vortex
5. MODO DI OPERARE
5.1. Estrazione e purificazione delle pectine.
Una opportuna quantità di prodotto (avente un contenuto di acido
galatturonico tra 50-400 mg) pesata e, se necessario omogeneizzata,
viene miscelata con ca. 350 ml di acqua ed il tutto si fa bollire per
60 min, sostituendo con nuova acqua quella evaporata. Si trasferisce
il tutto in un matraccio tarato da 500 ml, si raffredda, si porta a
volume e si filtra.
10 ml di filtrato vengono aggiunti a 75 ml di etanolo (3.1) caldo. Si
fa bollire per 15 min, si filtra sotto vuoto su Millipore (4.2) e si
lava il residuo con 100 ml di etanolo (3.2).
Il residuo viene disciolto sul filtro con tre porzioni di ca. 30 ml
di sodio idrossido (3.6); il filtrato, raccolto nella beuta
sottostante, viene travasato quantitativamente in un palloncino
tarato da 100 ml, aggiunto di 5 ml di sodio idrossido (3.7) e portato
a volume. La soluzione viene lasciata a riposo per almeno 15 min
prima di procedere alla reazione colorimetrica.
5.2. Reazione colorimetrica
Si introduce 1 ml della soluzione da analizzare in una provetta da 15
ml munita di tappo a vite, posta in un bagno refrigerato
acqua-ghiaccio, dove viene lasciata per 15 min. Si aggiungono poi 6
ml di soluzione solforica di tetraborato (3.3) e si agita
immediatamente la provetta con l'agitatore (4.3), rimettendola quindi
nel bagno refrigerante e lasciandovela per 15 min. Dopo questa sosta,
la provetta è trasferita in b.m. bollente (98 - 100C) per 10 min,
si riporta quindi nel bagno refrigerante per 15 min. Si aggiungono
0,1 ml di m-idrossidifenile (3.4) e si agita subito per 30 sec. con
l'agitatore (4.3). Dopo una sosta di 15-20 min, fino alla completa
scomparsa delle bollicine d'aria formatesi nell'agitazione, si legge
l'estinzione della soluzione contro un bianco preparato nello stesso
modo mettendo al posto del campione 1 ml di acqua distillata. La
lettura viene eseguita in vaschette di vetro di 1 cm di spessore, ad
una lunghezza d'onda di 525 mm.
5.3. Curva di taratura
La curva di taratura si costruisce preparando una serie di soluzioni
di acido D-galatturonico (3.5) nell'intervallo di concentrazione di
10-80 ppm. I relativi valori di estinzione si ricavano secondo la
procedura descritta in 5.2.
6. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
La quantità in mg di acido galatturonico contenuta nel campione si
ottiene moltiplicando per 5 il valore ottenuto nella reazione
colorimetrica. La quantità deve essere riportata a 100 g di
sostanza. Il valore di acido pectico si otterrà moltiplicando il
risultato ottenuto per il fattore 0,907.
33. - Determinazione del cloruro di sodio
1. OGGETTO
Il metodo permette la determinazione del contenuto di cloruri
espressi come cloruro di sodio.
2. PRINCIPIO
Il cloruro di sodio si determina secondo il metodo VOLHARD: i cloruri
sono precipitati da un eccesso di nitrato d'argento che viene
titolato con solfecianato di ammonio.
3. REATTIVI
3.1. Argento nitrato soluzione 0,1 M
3.2. Ammonio solfecianato soluzione 0,1 M
3.3. Acido nitrico concentrato (d20 = 1,40)
3.4. Soluzione satura di allume ferrico (indicatore)
5. MODO DI OPERARE
Pesare una parte aliquota del campione preparato, aggiungere 1 ml di
acido nitrico concentrato (3.3) ed una quantità esattamente misurata
di argento nitrato (3.1) in eccesso rispetto ai cloruri presenti.
Si scalda per far coagulare il cloruro di argento formatosi e si
lascia raffreddare al buio (la coagulazione avviene anche a freddo
per aggiunta di alcune gocce di nitrobenzene). Aggiungere alcuni ml
di indicatore (3.4) e titolare con ammonio solfocianato (3.2) fino a
colorazione rossa.
6. ESPRESSIONE DEL RISULTATO
Il valore in g del cloruro di sodio nella aliquota pesata è dato da
(N - n) x 0,005845
dove
N = ml di argento nitrato 0,1 M
n = ml di ammonio solfocianato 0,1 M
34. Determinazione dei metalli
1. OGGETTO
Il metodo consente la determinazione di Cadmio, Calcio, Ferro,
Piombo, Potassio, Rame, Sodio, Stagno e Zinco.
2. PRINCIPIO
La determinazione dei metalli è esegiuta mediante Spettrofotometria
di Assorbimento Atomico sul campione opportunamente preparato.
3. REATTIVI
3.1. Acido nitrico 65% ultrapuro
3.2. Soluzione di riferimento: soluzione contenenti 1 mg/ml di Cd,
Ca, Fe, Pb, K, Cu, Na, Sn, Zn.
3.3. Soluzione al 4% di cesio cloruro: sciogliere in acqua
bidistillata 40 g di cesio cloruro e portare al volume di 1000 ml.
3.4. Soluzione al 5% di lantanio: sciogliere in acqua bidistillata
134 g di lantanio cloruro (LaCl3.7H2O) e portare al volume di 1000
ml.
3.5. Acido solforico conc. (d20 = 1,84) ultrapuro.
4. APPARECCHIATURA
4.1. Spettrofotometro A.A. con fornetto di grafite ed accessori
4.2. Capsule di platino 0 cm 10, altezza cm 3, fondo piatto.
4.3. Muffola e piastra riscaldante.
4.4. Lampada a radiazione infrarossa
4.5. Vetreria decontaminata
5. MODO DI OPERARE
5.1. Preparazione del campione
5.1.1. Mineralizzazione del campione
5.1.1.1. Digestione per via umida. Pesare 1-2 g del campione solido o
comunque pastoso, secondo la presunta quantità di metallo, in un
pallone Kjeldhal. Nel caso di prodotti liquidi pesare 10 g e
concentrarli fino a piccolo volume (2-3 ml). Aggiungere 10 ml di
acido nitrico (3.1) e 2,5 ml di acido solforico (3.5) ed iniziare
quindi il riscaldamento in modo blando, protraendolo fino a comparsa
di fumi bianchi. A questo punto la soluzione dovrebbe essere liquida
ed incolore. Se ciò non si verifica, aggiungere cautamente alcune
gocce di acido nitrico (3.1) e riscaldare fino alla comparsa dei fumi
bianchi. Completata la distruzione della sostanza organica, travasare
la soluzione (il cui volume è ridotto a 2-3 ml) in un matraccio
tarato da 25 ml e portare a volume con acqua bidistillata.
I campioni così preparati sono analizzati per confronto con le
soluzioni standard al 10% di acido solforico (3.5).
5.1.1.2. Incenerimento per via secca. Pesare 5-10 g del campione,
secondo la quantità di metallo presunta, in capsula di platino
(4.2).
Essiccare in muffola o su piastra riscaldante (4.3) o sotto lampada
infrarossa (4.4) procedendo ad un riscaldamento cauto e graduale al
fine di evitare perdite per fuoriuscite di materiale carbonioso.
Porre il residuo in muffola già predisposta alla temperatura di
400C ed incenerire per almeno 6 h. Nel caso del cadmio è opportuna
l'aggiunta di alcune gocce di acido fosforico o solforico. Qualora le
ceneri non fossero completamente bianche, umettare con poche gocce di
acido nitrico (3.1), portare completamente a secco sotto lampada
infrarossa (4.4) fino a scomparsa dei fumi bianchi e ripetere il
trattamento in muffola per almeno 4 h. Riprendere le ceneri con 1 ml
di acido nitrico (3.1), trasferire in matraccio tarato da 50 ml e
portare a volume con acqua bidistillata.
5.1.2. Determinazione per via diretta
È possibile effettuare direttamente, senza la mineralizzazione del
campione, la determinazione di Na, K, Ca nei succhi o in altri
prodotti liquidi. Eseguire la determinazione di Na e K, sia per i
campioni, sia per gli standard, in presenza di cesio cloruro allo
0,4% diluendo la soluzione (3.3).
Eseguire la determinazione del Ca, in presenza di lantanio allo 0,5%
diluendo la soluzione (3.4).
5.2. Determinazione
Diluire le soluzioni campione in modo che la concentrazione del
metallo da analizzare sia compresa nell'intervallo di concentrazione
della retta di taratura.
5.2.1. Cadmio = 228,8 nm
Temperatura di incenerimento 250C
Temperatura di atomizzazione 2100C
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura col metodo delle aggiunte
In tre matracci da 10 ml porre 5 ml della soluzione campione per
ciascuno. Diluire la prima aliquota a 10 ml con acqua
bidistillata.Aggiungere alla seconda e alla terza rispettivamente 1
ml e 2 ml di una soluzione standard di cadmio alla concentrazione di
50 ppm e portare entrambe al volume di 10 ml. Esse risulteranno
addizionate rispettivamente di 5 e 10 ppm di cadmio (*).
Determinare l'assorbanza per ciascuna soluzione e costruire la retta
di lavoro secondo il metodo delle aggiunte. La intercetta sull'asse
delle concentrazioni rappresenta la concentrazione di cadmio nella
soluzione del campione diluito.
5.2.2. Calcio = 422,7 nm
Fiamma: aria/acetilene
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura
Prendere 4 matracci da 10 ml e porre in ciascuno 1 ml di acido
nitrico (3.1) ed 1 ml di una soluzione al 5% in lantanio
(3.4).Introdurre, inoltre, in ciascun matraccio rispettivamente 0 ml,
1 ml, 3 ml, 5 ml di una soluzione contenente 10 ppm di calcio e
portare quindi al volume di 10 ml con acqua bidistillata.
Determinare l'assorbanza per ciascuna soluzione e costruire la retta
di taratura, dopo aver sottratto il valore del bianco da quelli degli
standard.
(*) Tali indicazioni sono orientative e le quantità di cadmio da
aggiungere sono rispettivamente uguali e doppie di quelle che si
presumono contenute nella soluzione da analizzare.
5.2.3. Ferro (delta) = 248,3 nm
Fiamma: aria/acetilene
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura
Operare come in (5.2.6) utilizzando lo standard del Fe.
5.2.4. Piombo (delta) = 283,3 nm
Fornace di grafite
Temperatura di incenerimento 400
Temperatura di atomizzazione 2500C
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura col metodo delle agguinte
In 3 matracci da 10 ml porre 5 ml di soluzione campione per ciascuno.
Diluire la prima aliquota a 10 ml con acqua bidistillata. Aggiungere
alla seconda e alla terza aliquota rispettivamente 1 ml e 2 ml di una
soluzione standard di piombo (3.2) alla concentrazione di 200 ppm e
portare entrambe al volume di 10 ml. Queste due soluzioni
risulteranno quindi, addizionate rispettivamente di 20 e 40 ppm.
Determinare l'assorbanza per ciascuna soluzione e costruire la retta
di lavoro secondo il metodo delle aggiunte. La intercetta sull'asse
delle concentrazioni rappresenta la concentrazione del piombo nella
soluzione del campionediluito.
5.2.5. Potassio (delta) = 766,5 nm
Fiamma: aria/acetilene
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura
In 4 matracci da 50 ml porre su ciascuno 1 ml di acido nitrico (3.1)
e 10 di una soluzione di cesio ottenuta per diluizione della
soluzione (3.3). Introdurre quindi in ciascun matraccio
rispettivamente o ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml di una soluzione di potassio
alla concentrazione di 5 ppm e portare al volume di 50 ml. Le
concentrazioni di potassio nei quattro matracci saranno
rispettivamente 0 ppm, 0,50 ppm, 1,00 ppm, 2,00 ppm.
Determinare per ciscuna soluzione l'assorbanza e costruire la retta
di taratura, dopo aver sottratto il valore del bianco da quello degli
standard.
5.2.6. Rame (delta) = 324,8 nm
Fiamma: aria/acetilene
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura
In 4 matracci da 50 ml porre 1 ml di acido nitrico (3.1) e
rispettivamente 0 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, di una soluzione di rame
alla concetrazione di 10 ppm e portare quindi a volume di 50 ml.
Le concentrazioni in rame nei 4 matracci saranno rispettivamente 0
ppm, 1 ppm, 3 ppm, 5 ppm.
Determinare l'assorbanza per ciascuna soluzione e costruire la retta
di taratura, dopo aver sottratto il valore del bianco da quello degli
standard di rame.
5.2.7. Sodio (delta) = 589,0 nm
Fiamma: aria/acetilene
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura
Operatore come in (5.2.5.).
5.2.8. Stagno (delta) = 224, 6 nm
Fornace di grafite
Temperatura di incenerimento 700
Temperatura di atomizzazione 2500C
Compesatore di fondo
Preparazione della retta di taratura
in 4 matracci da 50 ml porre 1 ml di acido nitrico (3.1) per ciascuno
e rispettivamente 0 ml, 5 ml, 10 ml, 15 ml di una soluzione di stagno
alla concentrazione di 500 ppm e portare al volume di 50 ml. Le
concentrazioni in stagno nei quattro matracci saranno riapettivamente
0 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm.
Determinare l'assorbanza per ciascuna soluzione e costruire la retta
di taratura, dopo aver sottratto il valore del bianco da quello degli
standard di stagno.
5.2.9. Zinco (delta) = 213,8
Fiamma aria/acetilene
Compensatore di fondo
Preparazione della retta di taratura
In 4 matracci da 50 ml porre 1 ml di acido nitrico (3.1) per ciascuno
e rispettivamente di 0 ppm, 0,25 ppm, 0,50 ppm, 1,00 ppm.
Determinare l'assorbanza per ciascuna soluzione e costruire la retta
di taratura, dopo aver sottratto il valore del bianco da quello degli
standard di zinco.
AVVERTENZA
Diluire il campione in modo che la concentrazione del metallo da
analizzare sia compresa nell'intervallo di concentrazioni della retta
di taratura.
35. - Altre determinazioni
Per quanto riguarda altre determinazioni che dovessero essere
effettuate (proteine, grassi, fibra grezza) si rimanda ai Metodi
Ufficiali di Analisi dei Mangimi.