Serie Generale n. 285 del 5-12-1996
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 22 novembre 1996
Lotta obbligatoria contro il virus della tristezza degli agrumi "Citrus Tristeza Virus". (GU Serie Generale n.285 del 05-12-1996)

IL MINISTRO DELLE RISORSE
AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
Vista la legge 18 giugno 1931, n. 987, e successive modificazioni
ed integrazioni, recante disposizioni per la difesa delle piante
coltivate e dei prodotti agrari dalle cause nemiche e sui relativi
servizi, e successive modificazioni;
Visto il regolamento per l'applicazione della predetta legge,
approvato con regio decreto 12 ottobre 1933, n. 1700, e modificato
con regio decreto 2 dicembre 1937, n. 2504;
Vista la direttiva n. 77/93/CEE del Consiglio del 21 dicembre 1976,
concernente le misure di protezione contro l'introduzione negli Stati
membri di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali, e
successive modificazioni;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 24 luglio 1977, n.
616, in virtù del quale è stata confermata allo Stato la
determinazione degli interventi obbligatori in materia fitosanitaria
(art. 71, comma 1, lettera c));
Visto il decreto legislativo n. 536 del 30 dicembre 1992 che, in
attuazione della direttiva 91/683/CEE, istituisce il Servizio
fitosanitario nazionale;
Visto il decreto ministeriale 31 gennaio 1996, pubblicato nel
supplemento ordinario n. 33 alla Gazzetta Ufficiale n. 41 del 19
febbraio 1996, concernente le misure di protezione contro
l'introduzione e la diffusione nel territorio della Repubblica
italiana di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali;
Considerato che in alcune regioni sono state segnalate infezioni
del virus della tristezza degli agrumi Citrus Tristeza Virus in
materiale di propagazione introdotto nel territorio nazionale;
Considerato che una seria minaccia incombe sulle coltivazioni di
agrumi presenti nel territorio nazionale in quanto il virus può
essere diffuso localmente da vettori naturali (afidi) e facilmente a
distanza con il materiale di propagazione ed il commercio delle
piante ornamentali;
Considerato che l'arancio amaro, portinnesto molto suscettibile al
CTV è il più diffuso negli agrumeti italiani;
Considerato che a tutt'oggi non esiste alcun metodo sicuro di lotta
diretta contro il CTV e che, pertanto, la difesa deve essere
impostata sulla prevenzione delle infezioni;
Udito il parere n. 31/96 espresso nell'adunanza del 29 ottobre dal
Consiglio superiore delle risorse agricole, alimentari e forestali
sullo schema di decreto ministeriale concernente la lotta
obbligatoria contro il Citrus Tristeza Virus;
Decreta:
Art. 1.
Scopo generale
La lotta contro il virus della tristezza degli agrumi Citrus
Tristeza Virus è obbligatoria nel territorio della Repubblica
italiana.

Art. 2.
Ispezioni sistematiche
I servizi fitosanitari regionali devono effettuare ogni anno
indagini sistematiche mirate ad accertare la presenza del virus sulle
specie e ibridi coltivati a fini produttivi, su piante ornamentali e
frangiventi di Citrus L., Fortunella Swingle, Poncirus Raf.
Le ispezioni ufficiali devono essere effettuate, oltre che nei
vivai, negli agrumeti, nei giardini, negli orti botanici, nelle
collezioni varietali, nei parchi pubblici e privati, su tutto il
materiale introdotto anche per scopi scientifici secondo i criteri di
cui all'allegato I.
Le indagini devono consistere in ispezioni visive delle piante
ospiti e, nel caso di ospiti asintomatici, in appropriate analisi, in
particolare saggi immunoenzimatici, confermati ove occorra da saggi
biologici.
Detti saggi devono essere eseguiti dai servizi fitosanitari
regionali che potranno avvalersi di laboratori specializzati. I saggi
di conferma e di caratterizzazione dei ceppi sono demandati ai
laboratori ufficiali autorizzati dal Ministero delle risorse
agricole, alimentari e forestali.
I risultati di dette indagini devono essere comunicati al servizio
fitosanitario centrale entro il 30 novembre di ogni anno.

Art. 3.
Denuncia dei casi sospetti
È fatto obbligo a chiunque denunciare ogni caso sospetto di
infezione da virus della tristezza al servizio fitosanitarlo
regionale che provvede ad effettuare ispezioni visive ed eventuali
analisi virologiche ufficiali.
Le regioni devono dare massima divulgazione alla conoscenza dei
sintomi e della pericolosità del virus della tristezza.
In attesa di conferma o smentita di ogni caso sospetto il servizio
fitosanitario regionale al fine di scongiurare la disseminazione di
Citrus Tristeza Virus può attuare interventi cautelativi,
commisurati al rischio stimato, incluso il divieto di trasportare in
altro luogo materiali vegetali dal vivaio o dall'area in cui si è
avuta la manifestazione sospetta. La pianta o le piante sospette
devono essere contrassegnate, con divieto di rimozione.

Art. 4.
Accertamento ufficiale di un caso
Qualora le analisi virologiche ufficiali confermino la presenza di
Citrus Tristeza Virus in un campione di materiale vegetale, il
servizio fitosanitario regionale deve dichiarare contaminato il campo
da cui è stato raccolto il campione e le piante a dimora, in vivaio
ed in contenitori, risultate infette, devono essere immediatamente
estirpate e distrutte.
Le altre piante della stessa specie e partita e quelle dei campi
limitrofi per un raggio di m 500 devono essere saggiate per almeno
tre anni secondo lo schema operativo di cui all'allegato 1.
Ove la percentuale di piante infette risulti uguale o superiore al
30% l'intero impianto deve essere estirpato e distrutto.
Nei vivai ove si riscontri presenza di piante infette, l'intero
assortimento di piante del lotto, della varietà o del portinnesto
interessati dalla malattia deve essere estirpato e distrutto.
Il servizio fitosanitario regionale deve altresì istituire una
zona di sicurezza, effettuare una indagine tecnico-amministrativa per
conoscere l'origine delle piante infette e denunciare immediatamente
ogni caso accertato di Citrus Tristeza Virus.
L'estirpazione e la distruzione dei materiali infetti deve avvenire
a cura ed a spese dei proprietari o conduttori a qualunque titolo e
sotto il controllo del servizio fitosanitario regionale.

Art. 5.
Campi di piante madri
Nei campi di piante madri ove si riscontri la presenza di piante
infette si deve procedere alla distruzione delle stesse e sospendere
il prelievo del materiale di propagazione fino a quando ripetuti
saggi abbiano dato esito negativo per almeno tre anni.
Dai campi di piante madri ubicati nel raggio di m 500 da un
focolaio di CTV non può essere prelevato materiale di propagazione
sino a quando il focolaio non sarà eradicato e comunque dopo
specifica autorizzazione del servizio fitosanitario regionale.
Le piante di agrumi di campi limitrofi a quelli con infezioni da
CTV non possono essere utilizzate per il prelievo di materiale di
propagazione fino a quando non saranno tutte preventivamente
controllate per almeno tre anni e saggiate singolarmente.

Art. 6.
Fonti di approvvigionamento
del materiale di propagazione
È fatto obbligo a chiunque di denunciare al servizio fitosanitario
regionale l'ubicazione ed il numero delle fonti di approvvigionamento
nazionali del materiale di propagazione almeno quattro mesi prima del
prelievo del materiale medesimo.
Tali fonti di approvvigionamento del portinnesto e della varietà
devono essere sottoposte a controlli preventivi mediante rilievi
visivi per accertare lo stato sanitario generale e saggi
immunoenzimatici e ove necessario, biologici per accertare l'assenza
di infezioni da CTV.
È fatto obbligo a chiunque metta a dimora piante di agrumi, di
utilizzare piante certificate esenti da CTV.
Qualora il materiale di propagazione e le piante di agrumi siano
provenienti da un Paese estero è fatto obbligo di comunicarne
l'origine al servizio fitosanitario regionale prima dell'innesto e
della messa a dimora.

Art. 7.
Detenzione piante infette
È vietata a chiunque la detenzione e la manipolazione di piante
infette da Citrus Tristeza Virus.
È fatto obbligo a chiunque detenga piante infette da Citrus
Tristeza Virus di darne comunicazione al servizio fitosanitario
regionale che ne informerà il servizio fitosanitario centrale.

Art. 8.
D e r o g h e
Il servizio fitosanitario centrale può autorizzare, fatte salve le
disposizioni della direttiva 77/93/CEE, deroghe alle disposizioni
dell'art. 7 del presente decreto per prove o scopi scientifici,
nonchè lavori di selezione varietale purchè tali deroghe non
compromettano il controllo dell'organismo nocivo e non creino rischio
di diffusione dello stesso.
Le piante infette dal virus CTV devono essere conservate in
apposite serre a rete anti-insetto, di cui all'allegato II e
qualsiasi movimento del materiale deve essere registrato su apposito
registro vidimato dal servizio fitosanitario regionale.

Art. 9.
Denuncia degli inadempimenti
In caso di mancata applicazione delle disposizioni di cui al
presente decreto, gli inadempienti saranno denunciati all'autorità
giudiziaria a norma dell'art. 500 del codice penale.
Il presente decreto entrerà in vigore il giorno successivo alla
sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Roma, 22 novembre 1996
Il Ministro: PINTO

SCHEMA DI MONITORAGGIO
PER IL VIRUS DELLA TRISTEZZA DEGLI AGRUMI
A) METODOLOGIA DI CAMPIONAMENTO.
La metodologia di campionamento di seguito proposta è mirata ad
accertamenti individuali nel caso di piante madri e ad accertamenti a
campione nel caso di vivai e di impianti commerciali.
Le indagini sistematiche dovranno riguardare le collezioni
scientifiche e i giardini pubblici e privati; i vivai di piante di
agrumi da frutto e ornamentali; gli impianti commerciali.
1. Collezioni scientifiche, giardini pubblici, privati.
* Redigere una mappa che consenta la rapida individuazione delle
piante di agrumi esistenti, specificandone la specie e la cultivar.
Nel caso di specie esotiche accertarne la provenienza.
* Prelevare dalle quattro esposizioni di ciascuna pianta un
campione costituito da quattro rametti con corteccia verde (cm. 10
circa) e conservare a 4 C fino al momento del saggio.
* Ciascun campione dovrà essere saggiato singolarmente in due
pozzetti ELISA.
* Nel caso di infezioni da CTV:
a) estirpare e bruciare le piante infette;
b) sospendere il prelievo di marze delle altre piante presenti
nel campo per un periodo di almeno tre anni ripetendo i saggi ogni
anno;
c) controllare le altre piante di agrumi presenti nei campi
adiacenti;
d) individuare eventuali distribuzioni di materiale di
propagazione prelevato da piante infette a vivaisti, privati, ecc.
2. Vivai di piante da frutto e ornamentali.
2.1. Piante madri.
* Redigere una mappa e saggiare individualmente tutte le piante,
prelevando campioni costituiti da quattro rametti/pianta (vedi punto
1).
* Nel caso si rinvenissero piante madri infette:
a) estirpare e bruciare le piante infette;
b) sospendere il prelievo di marze delle altre piante presenti
nel campo per un periodo di almeno tre anni ripetendo i saggi ogni
anno;
c) saggiare i semenzali di portinnesti e le piante in piantonaio
e in nestaio ottenute per propagazione (diretta o indiretta) da
piante risultate infette. Allo scopo, operare su campioni compositi
costituiti da cinque rametti (un rametto/pianta). Saggiare ciascun
campione in un pozzetto ELISA. Nel caso di campioni infetti,
estirpare e bruciare le cinque piante che costituiscono il campione;
d) individuare le aziende che hanno acquistato piante della
stessa specie, cultivar e partita rinvenute infette e saggiare almeno
il 10% delle piante.
2.2 Piante destinate alla vendita.
* Effettuare controlli a campione iniziando dai lotti di piante di
cui non sono identificate le piante madri.
* Per ciascun lotto omogeneo di 2.500 piante prelevare, in modo
ordinato, 25 campioni (un rametto/pianta), riunire i rametti in
gruppi di cinque e saggiare i 5 campioni ottenuti, ciascuno in un
pozzetto ELISA (5 pozzetti ELISA per ciascun lotto di 2.500 piante).
* Nel caso si dovessero accertare infezioni da CTV:
a) estirpare e distruggere l'intero lotto;
b) estendere i saggi ai lotti vicini, per accertare un'eventuale
diffusione naturale.
3. Agrumeti commerciali.
* Su una carta delle coltivazioni agrumicole individuare gli
appezzamenti da saggiare (due ettari circa ogni dieci ettari di
superficie).
* Prelevare ordinatamente un rametto/pianta da 100 piante ubicate
sul confine dell'appezzamento prescelto.
* Riunire i rametti a gruppi di cinque in modo da costituire venti
campioni/appezzamento, saggiare i campioni in pozzetti singoli (venti
pozzetti per ciascun appezzamento di due ettari).
* Nel caso di infezioni da CTV:
a) saggiare individualmente le cinque piante comprese nel
campione infetto;
b) estirpare e bruciare le piante infette;
c) intensificare le indagini nell'appezzamento prelevando altri
50 campioni (due rametti/campione). Se le piante infette superano il
30% estirpare l'intero appezzamento.
B) DIAGNOSI DI CITRUS TRISTEZA VIRUS MEDIANTE TEST DAS-ELISA
(double antibody sandwich Enzyme Linked Immunosorbent
Assay).
Il monitoraggio per il virus della tristezza degli agrumi (CTV)
andrà eseguito sottoponendo a test immunoenzimatici (ELISA) campioni
di corteccia di giovani rametti ancora verdi, prelevati nel periodi
maggio-giugno e settembre-ottobre, allorchè le temperature medie
sono comprese fra 18 e 22 C. I saggi immunoenzimatici saranno
confermati, ove occorra, dai saggi biologici.
Per le finalità dell'indagine si raccomanda di utilizzare
antisieri policlonali di provata affidabilità.
- Diluire l'anticorpo nel tampone (coating buffer) alla
diluizione raccomandata.
- Disporre 200 (Micron(l di questa preparazione per pozzetto.
- Coprire la piastra e porla ad incubare per 4 ore a 37 C.
- Lavare la piastra con tampone di lavaggio (PBS-T) per 3 volte.
- Preparare gli estratti vegetali di ciascun campione da
saggiare, più un campione di controllo negativo ed uno di controllo
positivo come di seguito descritto:
- prelevare la corteccia verde dai giovani rametti;
- ridurre i tessuti in pezzetti minuti mediante un bisturi e
porli in una provetta;
- aggiungere tampone di estrazione nel rapporto 1/10 w/v (1 g di
tessuto/10 ml di tampone;
- estrarre il succo vegetale mediante un omogeneizzatore
cinematico (tipo Ultraturrax);
- filtrare il succo attraverso garza.
- Disporre 200 (Micron(l di estratto vegetale per ciascun
pozzetto.
- Incubare per una notte a 4 C.
- Lavare la piastra con tampone di lavaggio (PBS-T) per 3 volte.
- Diluire l'anticorpo coniugato con fosfatasi alcalina nel
tampone (Conjugate buffer) alla diluizione raccomandata.
- Disporre 200 (Micron(l della preparazione in ciascun pozzetto
- Coprire la piastra e porla ad incubare per 2-4 ore a 37 C.
- Lavare la piastra con tampone di lavaggio (PBS-T) per 3 volte.
- Sciogliere il substrato PNP (para-nitro-fenilfosfato) nel
tampone (substrate buffer) alla diluizione di 1 mg/1 ml.
- Disporre 200 (Micron(l di questa preparazione per ciascun
pozzetto
- Incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti.
- Aggiungere in ciascun pozzetto 50 (Micron(l di NaOH 3 M.
- La valutazione dei risultati può essere fatta:
a) visivamente: entro 60 minuti dalla distribuzione della
soluzione di substrato i pozzetti corrispondenti al testimone infetto
assumono progressivamente una colorazione gialla, mentre quelle del
testimone sano rimangono incolori;
b) allo spettrofotometro: entro 60 minuti dalla distribuzione
del substrato si confrontano i valori di assorbanza a 405 nm.
Si considerano positivi tutti i campioni che hanno un valore di
assorbanza pari al doppio del valore medio di assorbanza dei
controlli sani.
Tampone di lavaggio (PBS-T).
Sciogliere in 1000 ml di acqua distillata:
Sodio cloruro (NaC1) 8 g;
Sodio fosfato bibasico anidro (Na2HPO4) 1,15 g;
Sodio fosfato monobasico (KH2PO4) 0,2 g;
Potassio cloruro (KC1) 0,2 g;
Sodio azotidrato (NaN3) 0,2 g;
Tween - 20 0,5 g;
Correggere il pH a 7,4.
Tampone per anticorpo (coating Buffer).
Sciogliere in 1000 ml di acqua distillata:
Sodio carbonato (Na2CO3) 1,59 g;
Sodio bicarbonato (NaHCO3) 2,93 g;
Sodio azotidrato (NaN3) 0,2 g.
Correggere il pH a 9,6.
Conservare a 4 C.
Tampone di estrazione.
Sciogliere in 1000 ml di tampone di lavaggio (PBS-T):
polivinilpirrolidone (PVP) MW 24-40.000 20 g.
Conservare a 4 C.
Tampone per coniugato (conjugate buffer).
Sciogliere in 1000 ml di tampone di lavaggio (PBS-T):
polivinilpirrolidone (PVP) MW 24-40.000 20 g;
albumina bovina da siero (BSA) 2 g.
Conservare a 4 C.
Tampone per substrato (Substrate buffer).
Dietanolammina 97,0 ml.
Acqua distillata 800,0 ml.
Sodio azotidrato (NaN3) 0,2 g.
Correggere il pH a 9,8 con HC1 concentrato.
Portare il volume finale a 1000 ml con acqua distillata.
Conservare a 4 C.
C) SAGGIO BIOLOGICO.
1. Piante indicatrici.
* Semenzali di limetta messicana (Citrus aurantifolia (Christm.
Swing) per la diagnosi di tutti i componenti di CTV.
* Semenzali di arancio amaro (Citrus aurantium L.) per la
caratterizzazione di isolati di giallume dei semenzali (seedling
yellows).
* Semenzali di pompelmo (Citrus paradisi Macf.) o di arancio dolce
(Citrus sinensis) (L. Osbeck) cv. Madame Vinous per la
caratterizzazione di isolati di butteratura del legno (stem pitting).
2. Modalità di inoculazione.
* Innestare nella parte basale della pianta indicatrice 2-3
porzioni di corteccia prive di gemme prelevate dalla pianta da
saggiare.
* Eliminare la maggior parte delle foglie basali.
* Capitozzare l'indicatrice a 25-30 cm di altezza dal suolo.
* Dopo 3 settimane dall'inoculazione accertarsi che le gemme
innestate siano vive.
3. Condizioni di allevamento.
* Le piante devono essere allevate in un terriccio idoneo ad
assicurare una crescita vigorosa e continua ed essere prive di
carenze e di infezioni dell'apparato radicale che potrebbero
mascherare i sintomi.
* Per tutta la durata del saggio le piante devono essere allevate
in serra termocondizionata opportunamente chiusa con rete a prova di
insetto.
* La temperatura max diurna deve essere compresa fra 24 e 28 C.
* La temperatura min notturna deve essere compresa fra 17
e 21 C.
4. Manifestazione dei sintomi.
* Sull'indicatrice limetta messicana i primi sintomi compaiono
dopo 3-5 settimane dall'inoculazione; la malattia si manifesta sulle
foglie con aree decolorate delle nervature (vein clearing) e nei casi
di isolati molto virulenti con suberificazione delle nervature (vein
corking); dopo 2-3 mesi asportando la corteccia dai rametti della
nuova vegetazione si osserva la butteratura del legno (stem pitting).
* Su arancio amaro i sintomi di giallume dei semenzali si
manifestano dopo 10 settimane dall'inoculazione; la malattia induce
riduzione di sviluppo, nanismo, le foglie sono più piccole del
normale e di colore giallo.
* Su pompelmo o arancio dolce Madame Vinous la butteratura del
legno si manifesta entro quattro mesi dall'inoculazione, la gravità
delle scanalature è da correlare alla virulenza del ceppo.

CARATTERISTICHE TECNICHE DELLE SERRE A RETE ANTI-INSETTO NECESSARIE
PER LA CONSERVAZIONE DELLE PIANTE INFETTE DA CTV.
Le serre devono garantire il massimo isolamento tra l'ambiente
interno e l'esterno.
- In particolare devono essere realizzate:
* con una doppia parete in rete, di dimensioni tali da impedire
l'ingresso di insetti vettori (afidi), in tutte le sue parti (pareti
laterali, tetto e doppio ingresso);
* Ingresso con vestibolo di circa m 1 con doppia porta,
possibilmente scorrevole, quella esterna munita di serratura.