Serie Generale n. 90 del 16-4-1992
SUPPLEMENTI ORDINARI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO MINISTERIALE 26 marzo 1992
Attuazione della decisione n. 91/180/CEE concernente la fissazione di metodi di analisi e prova relativi al latte crudo e al latte trattato termicamente. (GU Serie Generale n.90 del 16-04-1992 - Suppl. Ordinario n. 67)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
DI CONCERTO CON
IL MINISTRO DELL'AGRICOLTURA E DELLE FORESTE
Vista la decisione n. 91/180/CEE della Commissione del 14 febbraio
1991, concernente la fissazione di metodi di analisi e di prova
relativi al latte crudo ed al latte trattato termicamente pubblicata
nella Gazzetta Ufficiale CEE n. L 93 del 13 aprile 1991;
Visto l'art. 6, comma 8, del decreto ministeriale 14 maggio 1988,
n. 212, pubblicato nel supplemento ordinario alla Gazzetta Ufficiale
n. 142 del 18 giugno 1988 con il quale è stata recepita
nell'ordinamento nazionale la direttiva del Consiglio n. 85/397/CEE
del 5 agosto 1985 concernente i problemi sanitari e di polizia
sanitaria negli scambi intracomunitari di latte trattato
termicamente;
Visti gli articoli 5, comma 1, e 6, comma 3, della legge 3 maggio
1989, n. 169, concernente la disciplina del trattamento e della
commercializzazione del latte alimentare vaccino;
Ritenuto di dover recepire nell'ordinamento nazionale le
disposizioni che formano oggetto della sopracitata decisione della
Commissione CEE;
Visto il parere della Commissione per la determinazione dei metodi
ufficiali di analisi di cui all'art. 21 della legge 30 aprile 1962,
n. 283, espresso nella seduta dell'11 giugno 1991;
Decreta:
Art. 1.
Sono approvati i metodi di analisi e di prova per il controllo del
latte crudo e del latte trattato termicamente destinato
all'alimentazione umana, riportati negli allegati.

Art. 2.
I procedimenti di analisi e prova da applicare come procedimento di
riferimento per il latte crudo sono i seguenti:
determinazione del punto di congelamento;
conteggio dei microrganismi: tenore di germi a 30 C;
conteggio delle cellule somatiche;
accertamento degli antibiotici e dei sulfamidici.

Art. 3.
I procedimenti d'analisi e prova da applicare come procedimenti di
riferimento per il latte pastorizzato sono i seguenti:
determinazione del punto di congelamento;
determinazione dell'attività fosfatasica;
determinazione dell'attività perossidasica;
conteggio dei microrganismi: tenore di germi a 30 C;
conteggio dei microrganismi: tenore di germi a 21 C;
conteggio dei coliformi: conteggio delle colonie a 30 C;
accertamento degli antibiotici e dei sulfamidici;
accertamento di microrganismi patogeni.

Art. 4.
I procedimenti di analisi e prove da applicare come procedimenti di
riferimento per il latte UHT e per il latte sterilizzato sono i
seguenti:
determinazione del punto di congelamento;
conteggio dei microrganismi: tenore di germi a 30 C;
accertamento degli antibiotici e dei sulfamidici.
Il presente decreto darà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana.
Roma, 26 marzo 1992
Il Ministro della sanità
DE LORENZO
Il Ministro dell'agricoltura e delle foreste
GORIA

ALLEGATO 1
I. DISPOSIZIONI GENERALI
1. INTRODUZIONE Sono descritte le disposizioni generali concernenti i
reattivi, le apparecchiature, l'espressione dei risultati, la
precisione e le relazioni di analisi. Le autorità competenti e i
laboratori preposti ai prelievi e alle analisi del latte devono
rispettare le disposizioni generali.
2. REATTIVI
2.1. ACQUA
2.1.1. Tutte le volte che venga fatto riferimento all'acqua ai fini
della soluzione, della diluizione o del lavaggio con acqua, salvo di-
verse indicazioni, deve essere impiegata acqua distillata, acqua
deionizzata o acqua demineralizata di purezza almeno equivalente.
Per l'analisi microbiologica l'acqua deve essere esente da sostanze
che potrebbero interessare o influenzare la crescita di microrganismi
nelle condizioni sperimentali.
2.1.2. Ove si parli, senza ulteriori precisazioni, di "soluzione" o
di "diluizione", si intende "soluzione in acqua" o "diluizione con
acqua".
2.2. SOSTANZE CHIMICHE Salvo altra indicazione, tutte le sostanze
chimiche impiegate devono avere purezza analitica riconosciuta.
3. APPARECCHIATURA
3.1. ELENCO DELLE APPARECCHIATURE L'elenco delle apparecchiature dei
vari metodi di riferimento comprende soltanto le apparecchiature
destinate a particolari impieghi o che richiedono determinate
specifiche.
3.2. BILANCIA ANALITICA Per bilancia analitica si intende una
bilancia con sensibilità di 0,1 mg.
4. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
4.1. RISULTATI
A meno che non sia specificato diversamente il risultato dichiarato
nella relazione dell'analisi deve essere la media aritmetica dei
valori ottenuti da due prove che soddisfino ai criteri di
ripetibilità (5.1.) fissati per quel dato metodo. Qualora tali
criteri non vengano rispettati occorre ripetere il saggio oppure
dichiarare non valido il risultato.
4.2. CALCOLO DELLE PERCENTUALI
Salvo altre indicazioni, i risultati devono essere calcolati come
percentuale in massa del campione.
5. CRITERI DI PRECISIONE:
RIPETIBILITÀ E RIPRODUCIBILITÀ
5.1. I criteri di precisione adottati per i vari procedimenti sono
così definiti:
5.1.1. RIPETIBILITÀ (R) è il valore al di sotto del quale dovrebbe
cadere la differenza assoluta tra due singoli risultati di prova
ottenuti con lo stesso procedimento su campioni di materiali
identici, nelle stesse condizioni (stesso operatore, stessa
apparecchiatura, stesso laboratorio e a breve distanza di tempo).
5.1.2. RIPRODUCIBILITÀ (R) è il valore al di sotto del quale
dovrebbe cadere la differenza assoluta tra due singoli risultati di
prova ottenuti con lo stesso procedimento su campioni di materiali
identici, in condizioni differenti (differenti operatori, differenti
apparecchiature, differenti laboratori e/o tempi).
5.1.3. A meno che non sia specificato diversamente i valori relativi
ai criteri di ripetibilità e riproducibilità dati nelle condizioni
relative a ciascun procedimento rappresentano intervalli al grado di
affidabilità del 95 % secondo la definizione della norma ISO 5725:2
ed. 1986. Questi sono calcolati dai risultati di prove
interlaboratorio riconosciute che sono state eseguite per valutare il
procedimento. Per alcuni di questi procedimenti però non sono state
effettuate prove interlaboratorio. In tali casi si è provveduto a
fare una stima dei valori della ripetibilità e della
riproducibiltà.
5.1.4. Le prove interlaboratorio e gli studi di cui al punto 5.1.3.
dovrebbero essere programmati e svolti conformemente agli
orientamenti internazionali.
6. RELAZIONE D'ANALISI La relazione d'analisi deve specificare il
metodo di analisi adottato ed i risultati ottenuti. Riporta inoltre
nei particolari procedimenti seguiti che non sono specificati nel
metodo di analisi o che sono facoltativi, come pure tutti i fattori
che possono aver condizionato i risultati ottenuti. La relazione
della prova riporta anche tutte le informazioni necessarie per la
completa identificazione del campione.
II. CAMPIONAMENTO DEL LATTE CRUDO E DEL LATTE TRATTATO TERMICAMENTE
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Questo procedimento descrive il metodo di riferimento per il
campionamento del latte crudo e del latte trattato termicamente.
Tale metodo, così come quelli del trasporto e la conservazione dei
campioni, si applica al latte crudo fornito direttamente dal
produttore ed a quello crudo o trattato termicamente contenuto in
cisterne adibite al deposito ed al trasporto.
I metodi di cui ai punti 2., 4.4., 5. e 6. si applicano al
campionamento del latte trattato termicamente destinato al consumo
diretto.
2. GENERALITÀ
La campionatura del latte trattato termicamente contenuto in bidoni,
cisterne, ecc. viene effettuata da personale specializzato
appositamente addestrato.
Se del caso, le autorità competenti o il laboratorio di analisi
provvedono a dare al personale una specifica formazione sulle
tecniche di campionamento atte a garantire che il campione sia
rappresentativo di tutta la partita e ad essa conforme. Le autorità
competenti o il laboratorio provvedono eventualmente ad addestrare il
personale su come etichettare il campione per poterlo identificare
senza errori.
3. APPARECCHI PER LA CAMPIONATURA
3.1. GENERALITÀ
L'attrezzatura per il campionamento deve essere fabbricato in acciaio
inossidabile o in altro materiale equivalente sufficientemente
robusto e realizzata in modo da servire adeguatamente allo scopo
(miscelazione, campionamento, ecc.). Gli stantuffi e gli agitatori
per mescolare i liquidi nei recipienti devono avere dimensioni tali
da garantire un adeguato rimescolamento del prodotto senza però
provocare lo sviluppo di rancidità. I mestoli devono essere
provvisti di un solido manico sufficientemente lungo in modo da
consentire il prelievo in qualsiasi punto del recipiente. La sua
capacità non deve essere inferiore a 50 ml. I recipienti destinati
a contenere i campioni e i relativi coperchi devono essere di vetro
oppure di un metallo o di una materia plastica adeguati.
I materiali con cui è realizzata l'attrezzatura per la campionatura
(recipienti e coperchi compresi) non devono dare luogo ad alcuna
interazione con il campione che possa alterare i risultati
dell'esame. Tutte le superfici dell'attrezzatura per il campionamento
e dei recipienti devono essere pulite ed asciutte, levigate e prive
di fessure: gli spigoli devono essere arrotondati.
3.2. ATTREZZATURA DI CAMPIONAMENTO PER L'ANALISI MICROBIOLOGICA
L'attrezzatura per il campionamento, recipienti inclusi, oltre a
soddisfare ai requisiti del punto 3.1. deve essere sterile. Se la
stessa attrezzatura viene usata per più campionamenti successivi,
essa deve essere pulita e sterilizzata dopo ciascun campionamento,
conformemente alle istruzioni o ai requisiti del laboratorio di prova
o delle autorità competenti, in modo da non condizionare i risultati
degli esami successivi.
4. TECNICA DI CAMPIONATURA
4.1. GENERALITÀ
A prescindere dal tipo di saggio da effettuare, prima del
campionamento il latte deve essere mescolato bene manualmente o
meccanicamente.
Il campione deve essere prelevato subito dopo il mescolamento, quando
il latte è ancora in movimento. Se nella stessa operazione si
preleva dalle cisterne più di un campione per prove diverse, quello
destinato all'esame microbiologico va prelevato per primo.
Il volume del campione deve essere in rapporto con le esigenze
dell'analisi. I recipienti usati per il campione devono avere una
capacità tale da risultare quasi completamente riempiti dal campione
stesso, in modo che prima della prova sia possibile mescolarne il
contenuto, evitandone però un eccessivo scuotimento durante il
trasporto.
4.2. CAMPIONAMENTO MANUALE
4.2.1. CAMPIONAMENTO DAL SECCHIO O DAL BIDONE
Per agitare, muovere rapidamente uno stantuffo su e giù nel secchio
o nel bidone accertando che il latte sia ben rimescolato e che sul
collo del bidone non aderisca della panna. Prelevare un campione
rappresentativo dell'intera partita seguendo il procedimento
descritto al punto 4.2.4.
4.2.2. CAMPIONAMENTO DA CISTERNE O VASCHE DI REFRIGERAZIONE DEL LATTE
PRESSO LA STALLA
Omogeneizzare sufficientemente il latte agitandolo meccanicamente o
manualmente.
Se il volume del latte è tale da non consentire l'impiego di un
agitatore meccanico, agitare manualmente.
4.2.3. CAMPIONAMENTO DA UN RECIPIENTE DI MISURA
È di fondamentale importanza che il latte versato in un recipiente
di misura venga opportunamente mescolato. Per essere sicuri che il
grasso si distribuisca uniformemente può essere necessaria
un'ulteriore agitazione manuale o meccanica. Se il volume della
partita da campionare è maggiore della capacità del recipiente,
prelevare un campione rappresentativo dell'intera partita seguendo il
procedimento descritto dal punto 4.2.4.
4.2.4. CAMPIONAMENTO DI UNA PARTITA CONTENUTA IN PIÙ SERBATOI
Quando la partita di latte da campionare è contenuta in più di un
serbatoio, si preleva da ciascuno di essi un campione rappresentativo
annotando la quantità di latte corrispondente. Se i campioni di
ciascun serbatoio non debbono essere esaminati separatamente,
mescolarli in quantità proporzionali al contenuto dei recipienti da
cui erano stati effettuati i rispettivi prelievi. Dopo aver
mescolato, prelevare uno o più campioni da queste quantità
proporzionali.
4.2.5. CAMPIONAMENTO DA GRANDI RECIPIENTI - SERBATOI DI STOCCAGGIO DA
AUTOCISTERNE E VAGONI CISTERNA
4.2.5.1. Prima del campionamento mescolare il latte con un metodo
adeguato.
Per mescolare il contenuto di grandi recipienti, dei serbatoi di
stoccaggio, delle autocisterne o dei vagoni cisterna, si consiglia di
ricorrere all'agitazione meccanica (4.2.5.2.). La durata della
mescolazione deve essere commisurata al periodo durante il quale il
latte è rimasto a riposo. Occorre dimostrare che il metodo di
mescolamento adottato in ciascun caso particolare è adeguato agli
scopi dell'analisi da effettuare; il criterio di efficienza del
mescolamento influisce sensibilmente sulla similarità dei risultati
delle analisi effettuate su campioni prelevati da punti diversi della
partita o dallo scarico della cisterna ad intervalli regolari durante
le operazioni di svuotamento. Un metodo per mescolare il latte è
considerato efficace se la differenza del tenore di grassi fra due
campioni, prelevati in tali condizioni, risulta inferiore allo 0,1 %.
Nei grandi serbatoi provvisti sul fondo di uno scarico si può avere
in tale punto una piccola quantità di latte non rappresentativa di
tutto il contenuto anche dopo aver proceduto al mescolamento. È
preferibile pertanto prelevare i campioni attraverso un passo d'uomo.
Per i campioni prelevati dallo scarico fare scorrere prima un
quantitativo sufficiente di latte in modo da garantire che i campioni
siano rappresentativi di tutta la partita.
4.2.5.2. Il contenuto dei grandi recipienti, dei serbatoi di
stoccaggio, delle autocisterne o dei vagoni cisterna può essere
mescolato:
- con un agitatore meccanico montato nel recipiente ed azionato
da un motore elettrico;
- con un'elica o con un agitatore sospeso nel latte, azionati da
un motore elettrico e montati nel passo d'uomo;
- nel caso di vagoni cisterna o di autocisterne facendo circolare
il latte attraverso il tubo di trasferimento collegato alle pompe
di scarico della cisterna e introdotto nel passo d'uomo.
- con aria compressa filtrata e pulita. In questo caso occorre
ridurre al minimo la pressione e il volume dell'aria onde evitare
lo sviluppo di rancidità.
4.3. CAMPIONAMENTO AUTOMATICO O SEMI AUTOMATICO
Per campionare il latte crudo consegnato dai produttori possono
essere usate apparecchiature automatiche o semiautomatiche,
conformemente alle istruzioni date da un laboratorio di analisi o da
un'altra autorità competente.
Prima dell'uso, e successivamente ad intervalli regolari, tali
apparecchiature devono essere sottoposte alle prove previste dalle
autorità responsabili. Occorre verificare l'adeguatezza dei
procedimenti di campionamento per determinare:
- il volume minimo di latte raccolto che può essere
correttamente campionato;
- la percentuale di un qualsiasi trascinamento (che è correlato
al volume minimo del campione);
- la capacità di fornire dopo corretta agitazione un campione
rappresentativo dell'intero insieme.
Nell'operazione di campionamento il volume totale del campione di
laboratorio rappresentativo della partita è di 1 litro. Questo vol-
ume si deve raccogliere sia nel campionamento manuale che automatico
o semiautomatico.
Nel campionamento automatico o semiautomatico l'operazione di
prelievo deve essere eseguita a livello di un opportuno rubinetto
inserito o inseribile nella linea di carico del latte nell'impianto.
Questo dispositivo deve essere collegato alla linea del vapore o in
maniera tale da poterlo sterilizzare prima del suo impiego.
L'apertura del condotto può essere costituita da una valvola di tipo
meccanico o a comando elettrico collegata ad un timer che a
intervallo di tempo prestabilito possa far defluire in un vaso di
raccolta un piccolo volume in modo da formare il campione
rappresentativo.
4.4. CAMPIONAMENTO DI LATTE TRATTATO TERMICAMENTE DESTINATO AL
CONSUMO DIRETTO IN CONFEZIONI AL DETTAGLIO
I campioni di latte trattato termicamente per il consumo diretto in
confezioni al dettaglio devono essere costituiti da confezioni chiuse
ermeticamente. I campioni devono essere prelevati il più presto
possibile subito dopo il trattamento, se possibile dalla macchina
confezionatrice o dalla cella frigorifera dell'impianto di
trattamento. Per il latte pastorizzato si dovrà procedere al
prelievo dei campioni il giorno stesso del trattamento.
I campioni devono essere prelevati per ciascun tipo di trattamento
termico (pastorizzazione, UHT e sterilizzazione) in numero
corrispondente alle analisi previste e conformemente alle istruzioni
del laboratorio preposto alle analisi o di altre autorità
competenti.
5. IDENTIFICAZIONE DEL CAMPIONE
Il campione deve essere contrassegnato secondo le modalità di cui
all'articolo 7 del D.P.R. 26 marzo 1980, n. 327 (2.).
6. TRASPORTO E DEPOSITO DEI CAMPIONI
Le istruzioni relative alle condizioni di trasporto e di deposito e
al tempo che deve intercorrere tra il campionamento e l'analisi del
latte devono essere fornite dal laboratorio di analisi a seconda del
tipo di latte e del metodo di analisi applicato. Dette istruzioni
debbono essere impartite di concerto con l'autorità nazionale
competente.
Nelle istruzioni debbono figurare i seguenti punti:
- durante il trasporto e il deposito debbono essere prese
opportune misure per evitare l'esposizione ad odori sgradevoli o
alla luce solare diretta. I contenitori dei campioni, se
trasparenti devono essere conservati al buio.
- i campioni di latte crudo destinati all'analisi microbiologica
devono essere trasportati e conservati ad una temperatura
compresa fra 0 e 4 C. Il periodo che intercorre tra il
campionamento e l'analisi deve essere il più breve possibile e
in ogni caso non superiore alle 36 ore. L'autorità competente
può accettare una temperatura di deposito compresa fra 0 e 6 C
se il periodo che intercorre tra il campionamento e l'analisi non
è superiore alle 24 ore.
- i campioni di latte pastorizzato destinati all'analisi
microbiologica debbono essere trasportati e conservati ad una
temperatura compresa fra 0 e 4 C. Il tempo che intercorre fra
il campionamento e l'analisi deve essere il più breve possibile
ed in ogni caso non superiore alle 24 ore.
- i campioni di latte diversi dal latte crudo e dal latte
pastorizzato destinati all'analisi microbiologica debbono essere
conservati in laboratorio in condizioni di refrigerazione e il
tempo che intercorre fra il campionamento e l'analisi deve essere
il più breve possibile.
Le precauzioni speciali da prendere per alcune analisi vengono indi-
cate nella descrizione dei diversi metodi utilizzati.

ALLEGATO 2
I. DETERMINAZIONE DEL PUNTO DI CONGELAMENTO
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento fissa il metodo ufficiale per la
determinazione del punto di congelamento del latte intero crudo,
pastorizzato, uperizzato e sterilizzato, del latte parzialmente
scremato e del latte scremato mediante una apparecchiatura (il
crioscopio a termistori) in cui il bagno controllato
termostaticamente è raffreddato per refrigerazione elettrica, e il
termometro a mercurio viene sostituito da una sonda a termistore.
Esistono due tipi di strumenti: uno consente di ottenere il punto di
congelamento massimo in corrispondenza del "plateau" della curva di
congelamento, mentre l'altro, per motivi commerciali è regolato, in
modo da effettuare la lettura ad un dato istante dopo l'inizio del
congelamento. Poichè le curve di congelamento possono differire da
un latte a un altro e tra il latte e le soluzioni standard usate per
la taratura, questo metodo ufficiale richiede l'uso di strumenti di
ricerca del plateau. Nel caso di misure di routine per lo screening
del latte possono essere usati strumenti per la lettura a un tempo
prefissato. Il punto di congelamento può servire a valutare la
percentuale di acqua addizionata nel latte, purchè l'acidità del
campione non sia superiore a 0,18 g di acido lattico per 100 ml (cfr.
7.4).
2. DEFINIZIONE
Si definisce PUNTO DI CONGELAMENTO DEL LATTE il valore espresso IN
GRADI CELSIUS (C) ottenuto effettuando la misurazione secondo il
procedimento descritto.
3. PRINCIPIO
Si raffredda un'aliquota di analisi del latte ad una determinata
temperatura, dipendente dallo strumento, e si innesca la
cristallizzazione per vibrazione meccanica provocando così un rapido
aumento di temperatura fino al plateau che corrisponde al punto di
congelamento del campione.
Lo strumento viene tarato regolandolo in modo da ottenere delle
letture esatte per due soluzioni standard, usando lo stesso
procedimento seguito per i campioni di latte. In tali condizioni il
plateau dà il punto di congelamento del latte in gradi Celsius.
4. APPARECCHIATURA E VETRERIA
Attrezzatura di uso corrente in laboratorio e segnatamente:
4.1. CRIOSCOPIO
Il crioscopio è costituito da un bagno frigorifero termostato, da
una sonda a termistore (un termometro a resistenza a semiconduttore)
con relativo circuito e un galvanometro o "lettore", da un agitatore
del campione, da un dispositivo per innescare il congelamento e dalle
provette contenenti il campione.
4.1.1. BAGNO FRIGORIFERO
Possono essere usati due tipi di bagno frigorifero.
4.1.1.1. TIPO A IMMERSIONE: è costituito da un bagno ben isolato
contenente un liquido di raffreddamento appropriato che viene agitato
in modo che la differenza di temperatura tra due punti qualsiasi del
liquido non superi 0,2 C. La temperatura del liquido non deve
variare di +- 0,5 C, rispetto al valore nominale dichiarato dal
fabbricante. È importante che il liquido del bagno sia mantenuto ad
un livello costante. Tutta la superficie della provetta al di sotto
della tacca di taratura del volume deve essere coperta dal liquido di
raffreddamento.
4.1.1.2. TIPO A CIRCOLAZIONE. Un flusso continuo di un opportuno
liquido refrigerante circola intorno alla provetta. Le fluttuazioni
della temperatura del liquido intorno al valore nominale fissato dal
fabbricante non devono superare gli +- 0,5 C. Un liquido
refrigerante adatto può essere costruito da una soluzione acquosa al
33% (v/v) di 1,2 - etandiolo (glicol etilenico).
4.1.2. TERMISTORE E CIRCUITO RELATIVO
Il termistore deve essere del tipo a sonda di vetro, con diametro
massimo di 1,80 +- 0,2 mm e con un diametro della biglia non
superiore a 0,31 mm. La costante di tempo del termistore deve essere
inferiore a 2 secondi e il valore di beta (cfr. nota) deve essere
elevato. La tensione di lavoro, la corrente e la costante di
dissipazione devono essere tali che quando la temperatura della zona
circostante è - 0,512 C la temperatura del termistore non deve
superarla di oltre 0,0005 C.
La tolleranza massima per la resistenza deve essere di +- 5%.
Quando la sonda è in posizione di lavoro nel crioscopio,
l'estremità della parte in vetro deve trovarsi sull'asse della
provetta e a 44,6 +- 0,1 mm sotto l'estremità superiore del tubo
(cfr. fig. 1). Occorre quindi disporre di una sagoma che consenta
all'utilizzatore di posizionare la sonda correttamente.
NOTE - (beta) definisce le caratteristiche resistenza/temperatura
del termistore in base alla formula:
- dR 1 (beta)
-- x - = ------
dT R T2
dove
T è la temperatura in K
R è la resistenza in ohm alla temperatura T
- dR 1 (beta)
-- x - = ------ è il coefficiente di temperatura.
dT R T2
(beta) è una costante che dipende dal materiale di costruzione del
termistore. Di solito si raccomanda un valore di (beta) superiore a
3.000.
4.1.3. MISURAZIONE E APPARECCHIO DI LETTURA
4.1.3.1. PRINCIPIO DI MISURAZIONE. L'apparecchio usato deve operare
secondo il principio della ricerca del primo "plateau" della curva
del punto di congelamento. Per plateau si intende la parte della
curva in cui la temperatura rimane costante a +- 0,002 C per almeno
20 secondi.
4.1.3.2. FUNZIONAMENTO MANUALE. La resistenza del termistore deve
essere equilibrata per mezzo di un ponte di Whetstone o di un
dispositivo analogo, utilizzando dei resistori stabili di qualità
superiore con tolleranza massima di +- 10 % ed il cui coefficiente di
temperatura non superi 2 x 10 (alla meno 5) C. La variabilità
della resistenza in tutto il campo di lavoro non deve discostarsi
della linearità più dello 0,3% del suo valore massimo.
Deve essere possibile regolare i resistori per la taratura.
L'intervallo di graduazione della scala di lettura non deve essere
superiore a 0,001 C.
4.1.3.3. FUNZIONAMENTO AUTOMATICO. Il dispositivo di lettura deve
essere tale da poter apprezzare almeno 0,001 C nell'intervallo da 0
a -1 C.
Il dispositivo di lettura ed il relativo circuito devono avere una
stabilità tale che indicazioni successive della stessa temperatura
non varino di oltre 0,001 C.
La linearità del circuito deve essere tale che, se lo strumento è
correttamente usato, non si producano errori superiori a +- 0,0001 C
in nessun punto dell'intervallo compreso tra 0,400 e -0,600 C.
4.1.4. AGITATORE
Per agitare l'aliquota di analisi si usa un filo metallico inerte
rispetto al latte del diametro di 1 - 1,5 mm.
L'agitatore deve essere regolato in ampiezza e deve essere
posizionato verticalmente con la sua estremità inferiore allo stesso
livello della punta della sonda a termistore. È consentita una
tolleranza di circa 1,5 mm rispetto a tale posizione.
L'agitatore deve vibrare lateralmente con un'ampiezza sufficiente
fissata dal fabbricante (non inferiore a +- 1,5 mm) per assicurare
che la temperatura nellaliquota di analisi si mantenga uniforme per
tutta la determinazione. Durante il funzionamento l'agitatore non
deve mai venire a contatto con la sonda a termistore o con le pareti
della provetta.
4.1.5. APPARECCHIATURA PER INNESCARE IL CONGELAMENTO
Si può ricorrere a qualsiasi apparecchiatura che funzionando
inneschi istantaneamente il congelamento dell'aliquota di analisi in
modo da portarne la temperatura in prossimità del punto di
congelamento. A tale scopo può essere usato l'agitatore; un metodo
consiste nell'aumentare l'ampiezza delle vibrazioni per 1 - 2 secondi
in modo che l'agitatore tocchi la parete della provetta.
4.1.6. PROVETTE CONTENENTI IL CAMPIONE
Le provette per il campione (cfr. fig. 1) devono essere di vetro di
50,8 +- 0,1 mm con un diametro esterno di 16,0 +- 0,1 mm e un
diametro interno di 13,5 +- 0,1 mm. Nella provetta lo spessore della
parete non deve variare di oltre 0,1 mm.
La provette devono recare una tacca di taratura a 29,8 mm sotto il
bordo (21 mm sopra la base) in corrispondenza di un volume del
campione di 2,5 +- 0,1 ml.
4.1.7. ALIMENTAZIONE ELETTRICA
La tensione di alimentazione deve essere stabilizzata sia all'interno
dell'apparecchio, sia esternamente in modo che le fluttuazioni non
superino il +- 1 % del valore nominale quando l'alimentazione
principale varia del +- 6 %.
4.2. BILANCIA ANALITICA
4.3. PALLONI TARATI DA 1.000 ml, CLASSE A.
4.4. STUFE AD ESSICCAZIONE, ben ventilate, termostatabili ad una
temperatura di 130 +- 1 C
oppure
FORNO ELETTRICO, ventilato, termostatabile a una temperatura di 300
+- 25 C.
4.5. ESSICCATORE
5. REATTIVI
5.1. ACQUA DISTILLATA IN UN APPARECCHIO DI VETRO AL BOROSILICATO,
bollita e raffreddata a 20 +- 2 C in un pallone provvisto di un tubo
per l'assorbimento del biossido di carbonio.
5.2. CLORURO DI SODIO, di qualità analitica, finemente polverizzato,
essiccato per 5 ore in un forno a 300 +- 25 C oppure in alternativa
in una stufa a 130 +- 1 C per almeno 24 ore e raffreddato a
temperatura ambiente in un essiccatore efficace.
5.3. PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI STANDARD Pesare la quantità
opportuna (cfr. tabella 1) di cloruro di sodio essiccato (5.2.) in un
pesafiltri. Sciogliere in acqua distillata (5.1.), trasferire
quantitativamente in un pallone tarato da 1.000 ml e portare a volume
con acqua a 20 +- 2 C. Conservare per non più di 2 mesi a circa 5
C in bottiglie di polietilene ben tappate di capacità non superiore
a 250 ml.
TABELLA 1 - PUNTO DI CONGELAMENTO DELLE SOLUZIONI DI CLORURO DI SODIO
a 20 C
g NaCl/l C
6,859 - 0,408
7,818 - 0,464
8,149 - 0,483
8,314 - 0,492
8,480 - 0,502
8,646 - 0,512
8,811 - 0,521
8,977 - 0,531
9,143 - 0,541
10,155 - 0,600
Prima di usare una soluzione standard, capovolgere dolcemente e
ruotare più volte la bottiglia per mescolarne completamente il
contenuto. Non agitare energicamente la soluzione standard per
evitare che venga inglobata dell'aria.
I campioni di una soluzione standard devono essere prelevati dalla
bottiglia versando la soluzione in un bicchiere pulito e asciutto.
Non utilizzare pipette.
Non usare soluzioni contenute in flaconi vuoti per più di tre quarti
nè soluzioni avanti più di due mesi, se non sono conservate con un
fungicida (ad esempio una soluzione di tiomersale a 10 g/l).
6. TARATURA DEL CRIOSCOPIO A TERMISTORE
Il crioscopio deve essere posizionato in modo tale che la temperatura
dell'aria circostante non si discosti di oltre 1 C dalla temperatura
di taratura. Il crioscopio non deve essere esposto alla luce solare o
a correnti d'aria e la temperatura ambiente non deve superare i 26-27
C.
Verificare che il crioscopio sia in buono stato di funzionamento,
conformente alle indicazioni del fabbricante e che sia stato azionato
da almeno 12 ore prima di procedere alla taratura.
Verificare la posizione della sonda, l'ampiezza di vibrazione
dell'agitatore e la temperatura dei liquidi refrigeranti.
Scegliere due soluzioni standard (cfr. tabella 1) che delimitino da
vicino il valore presunto del punto di congelamento dei campioni di
latte da analizzare. È preferibile che la differenza dei punti di
congelamento delle due soluzioni non sia inferiore a - 0,100 C.
(In alcuni tipi diffusi di crioscopio il circuito di termistore è
tale da raggiungere l'equilibrio per un determinato valore del punto
di congelamento all'interno del campo di misurazione dello strumento.
In tali casi l'impiego fra le altre soluzioni di taratura di una
soluzione standard avente tale punto di congelamento rende più
facili le operazioni di taratura; il fabbricante deve fornire tale
valore). Pipettare 2,5 +- 0,1 ml di una soluzione standard in una
provetta per campioni pulita e asciutta e fare funzionare il
crioscopio.
NOTE - Le provette per i campioni usate durante la taratura devono
essere dello stesso tipo di vetro di quelle usate durante l'analisi
dei campioni di latte e devono essere lavate e sciacquate
contemporaneamente ad esse con acqua demineralizzata.
Le temperature delle soluzioni standard devono essere uguali a quelle
dei campioni di latte.
Procedere ai controlli di taratura, seguendo le istruzioni del
fabbricante, fino a quando la lettura del crioscopio coincide con il
punto di congelamento della soluzione standard. Ripetere il
procedimento con l'altra soluzione standard, e continuare ad
alternarle in questo modo fino a quanto due letture successive danno
per ciascuna soluzione il corretto valore del rispettivo punto di
congelamento senza ulteriori aggiustamenti. Il crioscopio è così
pronto per l'impiego ed indicherà direttamente, senza alcuna
correzione, il punto di congelamento del campione di latte.
7. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER L'ANALISI
7.1. Se occorre, conservare i campioni ad una temperatura compresa
tra 0 e 5 C.
7.2. Eliminare dal campione i corpi estranei visibili ad occhio nudo
o le particelle di materia grassa e solida, filtrando eventualmente
in un recipiente asciutto e pulito, e mescolare dolcemente il
campione. L'eventuale filtro deve essere inerte rispetto al latte e
risultare efficiente alla temperatura di laboratorio.
7.3. Il latte può essere analizzato alla temperatura di
conservazione (tra 0 e 5 C) oppure può essere portato alla
temperatura di laboratorio prima di iniziare l'analisi. In ogni caso
la soluzione standard ed i campioni di latte al momento della loro
utilizzazione devono essere alla stessa temperatura.
7.4. Determinare l'acidità titolabile del latte per quanto possibile
contemporaneamente alla determinazione del punto di congelamento. Non
si possono analizzare campioni con acidità superiore a 0,18 g di
acido lattico per 100 ml di latte.
7.5. Prima dell'analisi il latte UHT e quello sterilizzato devono
riposare in recipiente aperto per almeno 20 minuti.
8. PROCEDIMENTO
8.1. VERIFICHE PRELIMINARI
Verificare che il livello e la temperatura del liquido refrigerante
sia quello previsto dalle istruzioni del fabbricante e che, se
occorre, la sonda a termistore sia collocata in una provetta vuota
nell'alloggiamento destinato al campione. Mettere in funzione il
crioscopio ed accertare che il liquido refrigerante secondo il caso
sia adeguatamente agitato o circoli correttamente. Dopo almeno 12 ore
di funzionamento, verificare la temperatura del liquido refrigerante
nonchè la posizione e l'ampiezza di vibrazione dell'agitatore.
8.2. VERIFICA DI ROUTINE DELLA TARATURA
Prima di ciascuna serie di determinazioni, misurare il punto di
congelamento di una soluzione standard di cloruro di sodio (ad es.:
una soluzione con un punto di congelamento -0,512 C) fino a quando
la differenza fra due determinazioni consecutive non sia maggiore di
0,001 C. Se la media di questi due valori differisce dal punto di
congelamento della soluzione standard di più di 0,002 C, effettuare
nuovamente la taratura del crioscopio come descritto al paragrafo 6.
Se il crioscopio viene utilizzato in continuo, effettuare la verifica
di routine della taratura almeno ogni ora, tenendo conto anche delle
istruzioni del fabbricante.
8.3. DETERMINAZIONE DEL PUNTO DI CONGELAMENTO DEL LATTE Capovolgere
dolcemente e far ruotare più volte il recipiente con il campione di
latte in modo da mescolarne il contenuto. Evitare comunque di agitare
violentemente il campione per non fare inglobare aria.
Pipettare 2,5 e +- 0,1 ml di latte in una provetta pulita e asciutta
prelevando l'eventuale quantità in eccesso con una pipetta.
Verificare che la sonda e l'agitatore siano puliti ed asciutti
strofinandoli, se occorre, attentamente dal basso verso l'alto con
una salviettina morbida, pulita e che non lasci peli. Inserire la
provetta nel crioscopio tarato seguendo le istruzioni del
fabbricante. Il latte deve essere raffreddato e il congelamento deve
innestarsi alla temperatura specificata dal fabbricante con una
tolleranza di +- 0,1 C.
(Su alcuni strumenti automatici questa temperatura può essere
rilevata su un lettore digitale; negli strumenti manuali la
precisione richiesta si ottiene verificando che il congelamento inizi
quando l'ago o il filo del galvonometro coincide con la tacca
specifica).
Se per qualche motivo di congelamento è iniziato prima o dopo il
livello di temperatura indicata, interrompere l'analisi e
ricominciarla con un'altra aliquota di analisi del latte. Se anche
questa seconda aliquota congela prima della temperatura indicata,
riscaldare a 45 C un'ulteriore aliquota di analisi e mantenerla per
cinque minuti a questa temperatura per far fondere la materia grassa
cristallina.
Raffreddare quindi alla temperatura della prova e procedere
immediatamente al nuovo saggio. La temperatura del latte dopo
l'innesco del congelamento aumenta rapidamente sino ad un valore che
si mantiene praticamente costante per un certo periodo prima di
abbassarsi nuovamente. Il punto di congelamento corrisponde alla
temperatura più elevata raggiunta durante tale periodo ed è questo
il valore da registrare.
NOTA - Il periodo in cui la temperatura si mantiene costante e
l'intervallo di tempo che intercorre tra l'innesco del congelamento e
l'istante in cui si raggiunge la temperatura più elevata variano da
un campione all'altro e per l'acqua e le soluzioni standard di
cloruro di sodio sono notevolmente più brevi che per il latte. È
essenziale annotare la temperatura più elevata.
Una volta effettuata la misura in modo soddisfacente, estrarre la
provetta e lavare con acqua la sonda a termistore e l'agitatore
asciugandoli dal basso verso l'alto con una salviettina morbida
pulita e che non lasci peli; effettuare quindi una seconda
determinazione su un'altra aliquota di analisi del latte. Se la
differenza fra i punti di congelamento ottenuti è maggiore del
valore di riperibilità (0,004 C) eseguire una seconda
determinazione su un'altra aliquota. Purchè le due determinazioni
non differiscano di più di 0,004 C registrare i valori ottenuti e
utilizzarli per calcolare il risultato definitivo.
8.4. RAFFREDDAMENTO DELLA SONDA
Dopo aver utilizzato l'apparecchio, collocare una provetta vuota
nell'alloggiamento destinato al campione ed abbassare il mandrino in
modo da mantenere la sonda fredda.
(Nei tipi di crioscopio in cui ciò non sia possibile prima di
procedere alle misurazioni è indispensabile accertare che la sonda
sia adeguatamente raffreddata effettuando, ad esempio, alcune
determinazioni fittizie fino ad ottenere delle letture costanti).
9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
9.1. CALCOLO
Se la verifica di routine della taratura conferma la validità di
quest'ultima, calcolare la media dei valori accettabili del punto di
congelamento ottenuti con determinazioni effettuate in doppio,
approssimata a meno della terza cifra decimale. Se la somma dei due
valori accettabili ottenuti con determinazioni effettuate in doppio
è un numero dispari, la media dev'essere arrotondata al numero pari
più vicino come mostra l'esempio seguente:
PUNTO DI CONGELAMENTO (C)
Valori delle determinazioni in doppio Media
- 0,544 - 0,545 - 0,544
- 0,545 - 0,546 - 0,546
9.2. PRECISIONE
9.2.1. RIPETIBILITÀ (R) : 0,002 C.
9.2.2. RIPRODUCIBILITÀ (R) : 0,006 C.
Particolare del crioscopio a termistore 4.1 (posizione della provetta
rispetto alla biglia del termistore e all'agitatore)

----&gt; Vedere Figura a Pag. 28 del S.O. &lt;----

II. DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ FOSFATASICA
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la
determinazione dell'attività fosfatasica nel latte pastorizzato.
2. DEFINIZIONE
2.1. L'attività fosfatasica è una misura della quantità di
fosfatasi alcalina attiva presente nel prodotto ed espressa come
quantità di fenolo, in mocrogrammi, liberata da 1 ml di latte
pastorizzato nelle condizioni specificate nel metodo.
2.2. L'ATTIVITÀ FOSFATASICA di un latte si considera negativa se
risulta inferiore a 4 ug/ml.
3. PRINCIPIO
L'attività fosfatasica è determinata dalla quantità di fenolo
liberata dal fenilfosfato disodico addizionato al campione. Il fenolo
liberato reagisce con dibromochinoneclorimide dando dibromoindofenolo
(di colore azzurrognolo) che viene determinato per colorimetria a 610
nm. Si effettua quindi un confronto con un campione in cui l'enzima
fosfatasi è stato precedentemente distrutto.
4. REATTIVI
4.1. TAMPONE DI BORATO E DI IDROSSIDO DI BARIO
4.1.1. Sciogliere in acqua 50,0 g di idrossido di bario (Ba
(OH)2.8H2O) e portare a 1.000 ml.
4.1.2. Sciogliere in acqua 22,0 g di acido borico (H3BO3) e portare a
1.000 ml.
4.1.3. Scaldare 500 ml di ciascuna soluzione a 50 C, mescolare le
soluzioni, agitare, raffreddare rapidamente a circa 20 C e regolare
eventualmente il pH a 10,6 +- 0,1 con la soluzione 4.1.1. o con la
4.1.2. Filtrare. Conservare la soluzione in un recipiente
ermeticamente chiuso.
4.1.4. Prima dell'uso, diluire la soluzione con uguale volume di
acqua.
4.2. TAMPONE PER LO SVILUPPO DEL COLORE
Sciogliere in acqua 6,0 g di metaborato sodico (NaBO2) oppure 12,6 g
di NaBO2.4H2O e 20,0 g di cloruro di sodio (NaCl) e portare a 1.000
ml.
4.3. TAMPONE DEL COLORE DILUITO
Sciogliere con acqua 10 ml del tampone per lo sviluppo del colore
(4.2.) portando il volume a 100 ml.
4.4. SUBSTRATO TAMPONATO
Sciogliere 0,1 g di fenilfosfato disodico disidratato esente da
fenolo in 100 ml di tampone (4.1.3.) oppure sciogliere 0,5 g di
fenilfosfato disodico in 4,5 ml di soluzione tampone per lo sviluppo
del colore (4.2.). Aggiungere due gocce di soluzione BQC (4.6.) e
lasciare in riposo a temperatura ambiente per trenta minuti.
Estrarre il colore così formatosi con 2,5 ml di butan-1-olo.
Lasciar riposare fino alla separazione del botan-1-olo. Togliere il
butan-1-olo e eliminarlo.
Dopo la separazione scartare il butan-1-olo. Ripetere, se necessario,
l'estrazione.
La soluzione può essere conservata in frigorifero per quanche
giorno; prima dell'uso sviluppare il colore ed estrarre di nuovo.
Preparare il substrato tamponato subito prima dell'uso diluendo 1 ml
di questa soluzione a 100 ml con la soluzione tampone di borato e di
idrossido di bario (4.1.3.).
4.5. PRECIPITANTE AL RAME-ZINCO
Sciogliere in acqua 3,0 gi di solfato di zinco (ZnSO4. 7H2O) e 0,6 g
di solfato rameico (CuS04. 5H20) e portare a 100 ml.
4.6. SOLUZIONE 2,6-DIBROMOCHINONECLORIMIDE (SOLUZIONE BQC)
Sciogliere 40 +- 1 mg di 2,6-dibromochinoneclorimide (BQC)
(C6H2Br2CNO6) in 10 ml di etanolo al 96% (v/v). Conservare in
frigorifero in bottiglia di colore scuro. Il reattivo va buttato via
se cambia colore o se è stato preparato da più di un mese.
4.7. SOLUZIONE DI SOLFATO RAMEICO (II)
Sciogliere in acqua 0,05 g di solfato rameico (II) (CuSO4.5H20) e
portare a 100 ml.
4.8. SOLUZIONE STANDARD DI FENOLO
4.8.1. Pesare 200 +- 2 mg di fenolo puro anidro, e portare con acqua
a 100 ml in un pallone tarato mescolando. Questa soluzione madre può
essere conservata per diversi mesi in frigorifero.
4.8.2. Diluire 10 ml della soluzione madre a 100 ml con acqua e
mescolare. 1 ml contiene 200 ug di fenolo.
5. APPARECCHIATURA E VETRERIA
Note: a) Tuttavia la vetreria, i tappi e gli attrezzi per
il campionamento devono essere accuratamente puliti. È
consigliabile risciacquarli con acqua distillata bollita di
recente o passarli a vapore.
b) Alcuni tipi di tappi di plastica possono cedere fenolo e
non devono quindi essere usati.
Attrezzatura di uso corrente in laboratorio ed in particolare:
5.1. BILANCIA ANALITICA
5.2. BAGNOMARIA, termostatabile a 37 +- 1 C.
5.3. SPETTROFOTOMETRO, per letture ad una lunghezza d'onda di 610 nm.
5.4. PROVETTE PER LA PROVA, da 16 o 18 mm x 150 mm, preferibilmente
graduate sui 5 e 10 ml.
5.5. PIPETTE
5.6. IMBUTI DI VETRO di dimensioni appropriate, ad esempio con
diametro di 5 cm.
5.7. FILTRI PIEGHETTATI con diametro di almeno 9 cm per velocità di
filtrazione media.
5.8 Palloni tarati per la preparazione delle soluzioni standard.
6. PROCEDIMENTO
Note:
a) Evitare, nel corso della determinazione, l'esposizione
diretta alla luce solare.
b) Devono essere evitate tracce di saliva o di sudore che
possono dare risultati falsamente positivi. Prendere di
conseguenza le necessarie precauzioni nel pipettare il
campione.
6.1. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DA ANALIZZARE
6.1.1. Effettuare l'analisi subito dopo il campionamento. In caso
contrario conservare il campione in frigorifero, ma per non più di 2
giorni.
6.2. ALIQUOTA DI ANALISI
Pipettare in ciascuna delle due provette per la prova (5.4.) 1 ml del
campione da analizzare, usando una provetta come controllo o per la
prova in bianco.
6.3. DETERMINAZIONE
6.3.1. Scaldare il bianco per 2 minuti in acqua bollente; coprire la
provetta e il becher contenente l'acqua bollente con un foglio di
alluminio, per essere certi che tutta la provetta venga scaldata.
Raffreddare rapidamente fino a temperatura ambiente.
6.3.2. A partire da questo momento trattare il bianco ed il campione
in esame nello stesso modo. Aggiungere 10 ml di substrato tamponato
(4.4.) e mescolare.
6.3.3. Porre subito in incubazione i campioni nel bagnomaria (5.2.)
per 60 minuti, mescolando di tanto in tanto (almeno 4 volte) il
contenuto della provetta.
6.3.4. Scaldare in acqua bollente per 2 minuti come descritto al
precedente punto 6.3.1. Raffreddare quindi rapidamente fino alla
temperatura ambiente.
6.3.5. Aggiungere 1 ml del precipitante rame-zinco (4.5.) a ciacuna
provetta e mescolare accuratamente.
6.3.6. Filtrare su carta da filtro asciutta, scartare i primi 2 ml e,
se necessario, filtrare di nuovo sino ad ottenere un filtrato
limpido; raccogliere 5 ml di filtrato in una provetta.
6.3.7. Aggiungere 5 ml del tampone per lo sviluppo del colore (4.2.).
6.3.8. Addizionare 0,1 ml della soluzione BQC (4.6.), mescolare e
lasciare sviluppare la colorazione per 30 minuti a temperatura
ambiente.
6.3.9. Misurare l'assorbanza rispetto al controllo o al bianco nello
spettrofotometro (5.3.) alla lunghezza d'onda di 610 nm.
6.3.10. Se l'assorbanza misurata in 6.3.9. è superiore a quella
della soluzione standard, contenente 20 ug di fenolo per provetta,
misurata al punto 6.4.4., ripetere la determinazione diluendo
opportunamente il campione. Preparare tale diluizione mescolando 1
volume del campione in esame con un appropriato volume di una
aliquota dello stesso campione portata con precauzione
all'ebollizione per inattivare la fosfatasi.
6.4. PREPARAZIONE DELLA CURVA DI TARATURA
6.4.1. A partire dalla soluzione standard di fenolo 4.8.2., preparare
una serie appropriata di soluzioni standard diluite contenenti 0
(controllo o bianco), 2, 5, 10 e 20 ug di fenolo per millilitro e
pipettare rispettivamente 1 ml di acqua e 1 ml delle quattro
soluzioni standard di fenolo in ciascuna delle cinque provette.
6.4.2. Aggiungere a ciascuna provetta 1 ml della soluzione di solfato
rameico (II) (4.7.), 5 ml del tampone del colore diluito (4.3.), 3 ml
di acqua e 0,1 ml della soluzione BQC (4.6.); mescolare.
6.4.3. Lasciare sviluppare il colore per 30 minuti a temperatura
ambiente.
6.4.4. Misurare l'assorbanza rispetto al controllo o al bianco nello
spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 610 nm.
6.4.5. A partire dai valori di assorbanza (6.4.4.) ottenuti per
ciascuna quantità di fenolo addizionata (6.4.1.), calcolare la retta
di regressione con il metodo dei minimi quadrati.
7. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
7.1. CALCOLO E FORMULA
7.1.1. Partendo dalla lettura dell'assorbanza (6.3.9.) determinare la
quantità di fenolo utilizzando la retta di regressione ottenuta
(6.4.5.).
7.1.2. Calcolare l'attività fosfatasica, espressa in microgrammi di
fenolo per millilitro di latte pastorizzato con la seguente formula:
Attività fosfatasica = 2,4 x A x D
dove
A è la quantità di fenolo in macrogrammi ottenuto come indicato in
7.1.1.; D è il fattore di diluizione della diluizione effettuata
come indicato in 6.3.10. (in assenza di diluizione, D = 1).
Il fattore 2,4 è il fattore di diluizione (5/12 di 1 ml del campione
in esame) - cfr. 6.2. ed ancora 6.3.2., 6.3.5. e 6.3.6.
7.2. PRECISIONE
7.2.1. RIPETIBILITÀ (r): 2 ug. fenolo/ml.
7.2.2. RIPRODUCIBILITÀ (R): 3 (iniziale) ug. fenolo/ml.
7.2.3. Se si è proceduto ad una diluizione come indicato in 6.3.10.,
le tolleranze di cui ai punti 7.2.1. e 7.2.2. si applicano ai
risultati ottenuti sul campione diluito.
III. DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ PEROSSIDASICA
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per la
determinazione della presenza o assenza dell'enzima perossidasico nel
latte come controllo della pastorizzazione.
2. DEFINIZIONE
REAZIONE PEROSSIDASICA POSITIVA:
Se il latte è stato pastorizzato in modo corretto dopo aver
mescolato comparirà entro 30 secondi una colorazione azzurra.
REAZIONE PEROSSIDASICA NEGATIVA:
Nei 30 secondi che seguono la miscelazione, non appare alcuna
colorazione.
3. PRINCIPIO
L'enzima perossidasico decompone il perossido di idrogeno.
L'ossigeno atomico liberato ossida l'1.4-fenilenediammina che è
incolore trasformandolo in indofenolo di colore rosso porpora (test
di Storchs). L'intensità del colore è proporzionale alla
concentrazione dell'enzima.
4. REATTIVI
4.1. SOLUZIONE DI 1,4-FENILENEDIAMMINA
Sciogliere in acqua calda (50 C) 2 g di 1,4-fenilenediammina (C6 H8
N2) e portare a 100 ml. Versare la soluzione in una bottiglia scura
chiusa con un tappo di vetro e conservarla al fresco e al riparo
dalla luce. Uno o due giorni dopo la preparazione una soluzione di
1,4-fenilenediammina forma un deposito e non è più utilizzabile.
4.2. SOLUZIONE DI PEROSSIDO DI IDROGENO
Diluire con acqua 9 ml di perossido di idrogeno al 30% e portare a
100 ml. Per stabilizzare aggiungere 1 ml di acido solforico
concentrato per litro di soluzione.
La soluzione di perossido di idrogeno è stabile per un mese se viene
tenuta al fresco e al riparo dalla luce in un bottiglia con tappo di
vetro evitando qualsiasi contatto con composti organici.
5. PROCEDIMENTO
5.1. Introdurre 5 ml del campione di latte in una provetta pulita
munita di chiusura adeguata.
5.2. Aggiungere 5 ml della soluzione di 1,4-fenilenediammina (4.1).
5.3. Aggiungere 2 gocce di soluzione di perossido di idrogeno (4.2.).
5.4. Controllare la colorazione nei 30 secondi che seguono la
miscelazione. Se la colorazione azzurra si ottiene più di 30 secondi
dopo l'addizione dei reagenti la reazione non è specifica.
IV. NUMERAZIONE DEI MICRORGANISMI - CONTEGGIO IN PIASTRA A 30 C.
1. OGGETTO E CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per la
numerazione dei microrganismi con la tecnica del conteggio delle
colonie a 30 C. Il metodo si applica al latte crudo, al latte
pastorizzato, nonchè al latte uperizzato e sterilizzato dopo
preincubazione a 30 C per 15 gg.
2. DEFINIZIONE
Con il termine "microorganismi" si intendono gli organismi che
formano colonie numerabili se posti in incubazione aerobica nelle
condizioni di seguito specificate.
3. PRINCIPIO
In alcune piastre di Petri si mescola un volume definito del campione
di latte con il terreno colturale incubando a 30 C per 72 ore. Si
contano quindi le colonie e si calcola il numero di microrganismi per
1 ml nel caso del latte crudo o pastorizzato e per 0,1 ml nel caso
del latte uperizzato o sterilizzato preincubato.
4. APPARECCHIATURA E VETRERIA
Attrezzatura di uso corrente in laboratorio e in particolare:
4.1. Apparecchiatura
4.1.1. STUFA AD ARIA CALDA, in grado di operare a 170-175 C.
4.1.2. AUTOCLAVE, termostatabile a 121 +- 1 C.
4.1.3. TERMOSTATO, regolabile ad una temperatura uniforme di 30 +- 1
C.
4.1.4. PHMETRO, con compensazione della temperatura e con una
precisione di +- 0,1 unità pH.
4.1.5. BAGNOMARIA, regolabile a 45 +- 1 C
4.1.6. LENTE, ingrandimento 2-4x.
4.1.7. LENTE, ingrandimento 8-10x.
4.1.8. APPARECCHIO CONTACOLONIE
4.1.9. MESCOLATORE in grado di mescolare 1 ml del campione di latte o
della diluizione decimale con 9 ml del diluente e il cui
funzionamento sia basato sul principio della rotazione eccentrica del
contenuto della provetta.
4.2. Vetreria
4.2.1. PROVETTE con chiusura opportuna e di capacità sufficiente a
contenere 10 ml della prima diluizione o delle diluizioni decimali
successive lasciando lo spazio necessario per la miscelazione.
4.2.2. PALLONI da 150 - 250 ml o PROVETTE, da circa 20 ml, per
contenere il terreno colturale.
4.2.3. PIPETTE sterili (chiuse ad una estremità con un batuffolo di
cotone) in vetro o materiale sintetico con punta a foro normale,
della capacità nominale di 1 ml, aventi un foro di scorrimento del
diametro di 1, 75 - 3 mm.
4.2.4. PIASTRE DI PETRI sterili, in vetro trasparente e in colore o
materiale sintetico sterile, con diametro interno del fondo della
scatola di circa 90-100 mm. L'altezza interna deve essere di almeno
10 mm. Il fondo non deve presentare alcuna irregolarità che possa
interferire con il conteggio delle colonie.
4.2.5. STERILIZZAZIONE DELLA VETRERIA
La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei seguenti metodi:
a) mantenendola a 170 - 175 C in una stufa ad aria calda
(4.1.1.) per almeno un'ora.
b) mantenendola a 121 +- 1 C in autoclave (4.1.2.) per almeno
20 minuti.
Fare particolare attenzione a che nell'autoclave si abbia un'adeguata
penetrazione del vapore - ad esempio se l'attrezzatura è
sterilizzata in contenitori questi non devono essere chiusi
ermeticamente e i tappi dei palloni non devono essere serrati.
La vetreria sterilizzata nell'autoclave deve essere asciugata facendo
scaricare il vapore.
Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa ad aria calda
(4.1.1.).
5. TERRENO COLTURALE - LATTE AGARIZZATO PER IL CONTEGGIO IN PIASTRA
5.1. COMPOSIZIONE
Estratto di lievito 2,5 g
Triptone 5,0 g
Glucosio D(+) o destrosio 1,0 g
Latte scremato in polvere 1,0 g
Agar da 10 a 15 g a seconda delle
proprietà gelatinizzanti
dell'agar impiegato
Acqua 100 ml
Il latte scremato in polvere deve essere esente da sostanze inibenti.
Ciò deve essere verificato con delle prove comparative utilizzando
un latte scremato in polvere che sia riconosciuto esente da sostanze
inibenti.
PREPARAZIONE
Disperdere e sciogliere gli ingredienti in acqua nel seguente ordine:
estratto di lievito, triptone, glucosio ed infine latte scremato in
polvere. Questa operazione risulterà più facile riscaldando la
sospensione. Aggiungere l'agar e portare ad ebollizione, agitando in
continuazione sino a quando l'agar è completamente disciolto oppure
riscaldare a vapore per circa 30 minuti.
Filtrare eventualmente su carta da filtro.
Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4.) ed aggiustarlo eventualmente
con una soluzione (almeno 0,1 mol/1) di idrossido di sodio o di acido
cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, il pH a 25 C sia 6,9
+- 0,1.
5.2. DISTRIBUZIONE, STERILIZZAZIONE E CONSERVAZIONE DEL TERRENO DI
COLTURA.
Suddividere il terreno (5.1.) in quantità di 100 - 150 ml per
pallone o di 12 - 15 ml per provetta (4.2.2.). Tappare i palloni e le
provette.
Sterilizzare in autoclave (4.1.2.) a 121 +- 1 C per 15 minuti.
Controllare il pH del terreno.
Se il terreno non deve essere usato immediatamente, conservarlo al
riparo dalla luce a una temperatura compresa tra 1 e 5 C per non
più di un mese dopo la preparazione.
5.3. TERRENO COLTURALE DISIDRATATO DISPONIBILE IN COMMERCIO
Il terreno di coltura (5.1.) può essere preparato a partire da un
terreno disidratato disponibile in commercio. Seguire in tal caso le
istruzioni del fabbricante aggiungendo, prima della dissoluzione, il
latte scremato in polvere, nel caso che questo non sia indicato fra
gli ingredienti.
Aggiustare il pH a 6,9 +- 0,1 a 25 C come descritto al punto 5.1. e
ripartire nei contenitori, sterilizzare e conservare il terreno come
descritto al punto 5.2.
6. DILUENTI
6.1. SOLUZIONE SALINA/PEPTONE
COMPOSIZIONE
Peptone 1,0 g
Cloruro di sodio (NaCl) 8,5 g
Acqua 1.000 ml
PREPARAZIONE
Sciogliere gli ingredienti in acqua, riscaldando, se necessario.
Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4.) e aggiustare eventualmente
il pH con una soluzione (almeno 0,1 mol/1) di idrossido di sodio o di
acido cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, il pH a 25 C
risulti 7,0 +- 0,1.
6.2. DISTRIBUZIONE, STERILIZZAZIONE E CONSERVAZIONE DEL DILUENTE
Distribuire il diluente (6.1.) nelle provette (4.2.1.) in quantità
tali che a sterilizzazione avvenuta ciascuna provetta ne contenga 9,0
ml. +- 0,2. Tappare le provette.
Sterilizzare in autoclave (4.1.2.) a 121 +- 1 C per 15 minuti.
Verificare il pH del diluente.
Se non deve essere usato immediatamente, conservare il diluente, al
riparo della luce, a una temperatura compresa tra 1 e 5 C, per non
più di un mese dopo la preparazione.
6.3. DILUENTI DISIDRATATI DISPONIBILI IN COMMERCIO
Il diluente (6.1.) può essere preparato a partire da compresse o
polveri disidratate disponibili in commercio. Seguire in tal caso le
istruzioni del fabbricante. Aggiustare il pH come descritto al punto
6.1. e distribuire, sterilizzare e conservare i diluenti come
descritto in 6.2.
7. PROCEDIMENTO
7.1. FUSIONE DEL TERRENO NUTRITIVO
Prima di procedere all'esame microbiologico, far fondere rapidamente
la quantità di terreno necessaria e raffreddare il terreno a 45 +- 1
C in bagnomaria (4.1.5.).
7.2. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LATTE
Mescolare a fondo il campione di latte, in modo che i microrganismi
siano distribuiti il più uniformemente possibile, capovolgendo
rapidamente per 25 volte il contenitore del campione. Evtare la
formazione di schiuma oppure lasciarla disperdere. Tra la
miscelazione ed il prelievo dell'aliquota di analisi non devono
trascorrere più di tre minuti.
7.3. PREPARAZIONE DELLA PRIMA DILUIZIONE (10 (alla meno uno)) (latte
crudo e pastorizzato). Aggiungere con una pipetta sterile (4.2.3.) 1
ml del campione del latte (7.2.) crudo o pastorizzato a 9 ml di
diluente (6.1.) evitando di toccare il diluente con la pipetta. La
temperatura del diluente deve essere approssimativamente uguale a
quaella del campione di latte. Mescolare accuratamente questa prima
diluizione nel mescolatore (4.1.9.) per 5-10 secondi.
Si ottiene così una prima diluizione 10 (alla meno uno).
7.4. PREPARAZIONE DELLE DILUIZIONI DECIMALI SUCCESSIVE (LATTE CRUDO E
PASTORIZZATO)
Trasferire con una pipetta sterile (4.2.3.), 1 ml della prima
diluizione (7.3.) in 9 ml di diluente (6.1.), secondo le istruzioni
del punto 7.3.
Si ottiene così la diluizione 10 (alla meno due). Ripetere queste
operazioni per ottenere diluizioni decimali successive fino ad
ottenere un numero adeguato di microrganismi (8.1.).
7.5. SEMINA DELLE PIASTRE DI PETRI
7.5.1. LATTE CRUDO: trasferire con una pipetta sterile (4.2.3.), 1 ml
del campione e/o della diluizione decimale appropriata in una piastra
(4.2.4.). L'esame deve essere effettuato almeno su due
diluizioni.Preparare una piastra per ciascuna delle diluizioni
ritenute appropriate (8.1.1.).
7.5.2. LATTE PASTORIZZATO: trasferire con una pipetta sterile
(4.2.3.), 1 ml del campione e/o della diluizione decimale appropriata
in una piastra (4.2.4.). L'esame deve essere effettuato almeno su due
diluizioni. Per ciascuna diluizione ritenuta appropriata (8.1.1.)
preparare due piastre.
7.5.3. LATTE UHT E STERILIZZATO (analizzato dopo 15 giorni di
preincubazione a 30 C - Allegato A, parte III del decreto
ministeriale 14 maggio 1988, n. 212, pubblicato nel S.O. alla
Gazzetta Ufficiale n. 142 del 18 giugno 1988, (5)): Trasferire con
una pipetta sterile (4.2.3.), 0,1 ml del campione di latte (7.2.) in
una piastra (4.2.4.). Preparare due piastre.
7.6. DISTRIBUZIONE DEL TERRENO Versare circa 15-18 ml del terreno
(7.1.) in ciascuna delle piastre seminate. Mescolare immediatamente
il terreno facendo ruotare la piastra di Petri in modo tale che dopo
l'incubazione si ottenga una distribuzione uniforme delle colonie.
Il tempo che intercorre tra la fine della preparazione del campione e
la miscelazione dell'aliquota di analisi o, a seconda del tipo di
latte, della sua diluizione con il terreno non deve superare i 15
minuti.
Lasciare solidificare su una superficie orizzontale fredda e pulita.
7.7 INCUBAZIONE DELLE PIASTRE DI PETRI
Mettere le piastre, capovolte, in un termostato (4.1.3.). Non
impilarne più di sei alla volta. Le pile di piastre non devono
toccarsi l'una con l'altra e non devono venire a contatto con le
pareti o con la parte superiore del termostato. Incubare a 30 +- 1
C per 72 +- 2 ore.
7.8 CONTEGGIO DELLE COLONIE
Contare le colonie nelle piastre di Petri che contengono al massimo
300 colonie.
Esaminare le piastre con una luce attenuata. Per agevolare il
conteggio si può ricorrere a un'opportuna lente (4.1.6.) e/o a un
apparecchio contacolonie (4.1.8). Evitare di confondere le particelle
di precipitato nelle piastre con le colonie puntiformi. In caso di
dubbio esaminarle con attenzione usando eventualmente una lente
d'ingrandimento più forte (4.1.7.), in modo da poter distinguere le
colonie dalle sostanze estranee.
Le colonie invasive vanno considerate come singole colonie. Se queste
ricoprono meno di un quarto della piastra, contare le colonie sulla
restante parte e calcolare il numero corrispondente per l'intera
piastra. Scartare invece la piastra se le colonie invasive ne
ricoprono più di un quarto.
8. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI
8.1. LATTE CRUDO E PASTORIZZATO
8.1.1. Utilizzare i risultati relativi alle piastre contenenti da 10
a 300 colonie. (cfr. 8.1.3. e 8.1.4.).
8.1.2. Il numero di microrganismi in 1 ml di latte crudo o
pastorizzato è dato dalla formula:
sigma C
---------------
(n1 + 0,1 n2)d
dove
sigma C è la somma del numero di colonie contate secondo 8.1.1., (n1
+ 0,1 n2)d è uguale al volume di campione inoculato con:
n1 è il numero di piastre utilizzate per la prima diluizione,
n2 è il numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione,
d è il fattore di diluizione relativo ai primi conteggi effettuati.
Il risultato ottenuto viene approssimato a due cifre significative.
Se la cifra da arrotondare è un 5, effettuare l'approssimazione in
modo che il numero immediatamente a sinistra sia un numero pari.
Esempio (latte pastorizzato)
diluizione 10 (alla meno due) 278 e 290 colonie
10 (alla meno tre) 33 e 28 colonie
numero/ml 278+290+33+28
= ----------------------------
(2+0,1x2) 10 (alla meno due)
629
= ------ = 28590 = 29000 = 2,9x10 (alla quarta)
0,022
8.1.3. Se tutti i calcoli danno meno di 10, indicare che il numero di
microrganismi per millilitro è "inferiore a 10 x d per ml", dove "d"
è il reciproco del fattore di diluizione più basso.
8.1.4. Se tutti i calcoli danno più di 300 colonie ma il conteggio
è possibile, procedere ad una stima e moltiplicare tale valore per
il reciproco del fattore di diluizione. Riportare il risultato come
"numero stimato di microrganismi per ml".
8.2. LATTE UHT E STERILIZZATO
Conteggi in piastra di più di 10 colonie per 0,1 ml non soddisfano
ai requisiti del decreto ministeriale 14 maggio 1988, n. 212,
pubblicato nel S.O. alla Gazzetta Ufficiale n. 142 del 18 giugno
1988.
9. PRECISIONE
Non si dispone ancora di risultati di prove interlaboratorio
riconosciute a livello internazionale.
V. NUMERAZIONE DEI MICRORGANISMI - CONTEGGIO IN PIASTRA A 21 C
1. SCOPO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per la
enumerazione dei microrganismi con la tecnica del conteggio delle
colonie a 21 C, nel latte pastorizzato dopo incubazione dello stesso
a 6 C per 5 giorni al fine di determinare il grado di contaminazione
del latte pastorizzato con microrganismi psicrotrofi in grado di
moltiplicarsi nel latte a 6 C.
2. DEFINIZIONE
Con il termine "microrganismi" si intendono gli organismi che se
posti in incubazione aerobica nelle condizioni di seguito specificate
formano colonie numerabili.
3. PRINCIPIO
Viene preincubato il latte pastorizzato a 6 C per 5 giorni. Si
mescola quindi una aliquota definita del campione di latte con il
terreno di coltura in alcune piastre di Petri che vengono incubate a
21 C per 25 ore. Si contano quindi le colonie e si calcola il numero
di microrganismi per 1 ml di latte pastorizzato.
4. APPARECCHIATURA E VETRERIA
Materiale di uso comune in laboratorio e in particolare
4.1. Apparecchiatura
4.1.1. STUFA AD ARIA CALDA, in grado di funzionare a 170-175 C.
4.1.2. AUTOCLAVE termostatabile a 121 +- C.
4.1.3. TERMOSTATO, regolabili ad una temperatura uniforme di:
a) 6 +- 0,2 C.
b) 21 +- 1 C
4.1.4. PHMETRO, con compensazione della temperatura e con una
precisione di +- 0,1 unità pH.
4.1.5. BAGNOMARIA, regolabile a 45 +- 1 C.
4.1.6. LENTE, ingrandimento 2-4x.
4.1.7. LENTE, ingrandimento 8-10x.
4.1.8. APPARECCHIO CONTACOLONIE.
4.1.9. MESCOLATORE, in grado di mescolare 1 ml del campione di latte
o della diluizione decimale con 9 ml del diluente ed il cui
funzionamento sia basato sul principio della rotazione eccentrica del
contenuto della provetta.
4.2. VETRERIA
4.2.1. PROVETTE, con opportuna chiusura, di capacità sufficiente a
contenere 10 ml della prima diluizione, oppure delle diluizioni
decimali successive, (lasciando lo spazio necessario per la
miscelazione).
4.2.2 PALLONI, da 150 à 250 ml oppure PROVETTE, da circa 20 ml, per
contenere il mezzo di coltura.
4.2.3. PIPETTE, chiuse ad una estremità con un batuffolo di cotone
in vetro o in materiale sintetico sterile, con punta, della capacità
nominale di 1 ml aventi un foro di scorrimento del diametro di 1,75 -
3 mm.
4.2.4. PIASTRE DI PETRI, in vetro trasparente incolore o in materiale
sintetico sterile, con un fondo avente un diametro interno di circa
90-100 mm. L'altezza interna deve essere di almeno 10 mm. Il fondo
non deve presentare alcuna irregolarità che possa interferire con le
colonie da contare.
4.2.5. STERILIZZAZIONE DELLA VETRERIA:
La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei seguenti metodi:
a) mantenendola a 170 - 175 C in una stufa ad aria calda (4.1.1.)
per almeno 1 ora;
b) mantenendola a 121 +- 1 C in autoclave (4.1.2.) per almeno 20
minuti.
Fare particolare attenzione a che nell'autoclave si abbia una
adeguata penetrazione del vapore - ad esempio se l'attrezzatura è
sterilizzata in recipienti, questi non devono essere chiusi
ermeticamente e i tappi dei palloni non devono essere serrati.
La vetreria sterilizzata in autoclave deve essere asciugata facendo
scaricare il vapore.
Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa ad aria calda
(4.1.1.).
5. TERRENO COLTURALE - LATTE AGARIZZATO PER IL CONTEGGIO IN PIASTRA
5.1. Composizione
Estratto di lievito 2,5 g
Triptone 5,0 g
Glucosio D(+) o destrosio 1,0 g
Latte screm. in polvere 1,0 g
Agar da 10 a 15 g, a seconda delle
proprietà gelatinizzanti
dell'agar impiegato
Acqua 1,000 ml
Il latte scremato in polvere deve essere esente da sostanze inibenti.
Ciò deve essere verificato con prove comparative usando un latte
scremato in polvere che sia stato accertato esente da sostanze
inibenti.
PREPARAZIONE:
Disperdere e sciogliere gli ingredienti in acqua nel seguente ordine:
estratto di lievito, triptone, glucosio ed infine latte scremato in
polvere. Tale operazione risulterà più facile riscaldando la
sospensione. Aggiungere l'agar e portare ad ebollizione agitando in
continuazione fino a sciogliere completamente l'agar oppure
riscaldare a vapore per circa 30 minuti.
Filtrare eventualmente su carta da filtro.
Verificare il pH con pHmetro (4.1.4) ed aggiustarlo evenutalmente con
una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o di acido
cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, si abbia a 25 C un pH
6,9 +- 0,1.
5.2. DISTRIBUZIONE, STERILIZZAZIONE E CONSERVAZIONE DEL TERRENO DI
COLTURA
Distribuire il terreno (5.1.) con aliquote di 100 - 150 ml per
pallone o di 12 - 15 ml per provetta (4.2.2.). Tappare i palloni e le
provette.
Sterilizzare in autoclave (4.1.2.) a 121 +- C per 15 minuti.
Verificare il pH del terreno.
Se il terreno di colture non deve essere immediatamente utilizzato,
conservarlo al riparo dalla luce ad una temperatura compresa fra 0 e
5 C per non più di un mese dopo la preparazione.
5.3. TERRENO DI COLTURA DISIDRATATO DISPONIBILE IN COMMERCIO
Il terreno di coltura (5.1.) può essere preparato a partire da un
terreno disidratato reperibile in commercio. Seguire in questo caso
le istruzioni del fabbricante aggiungendo, prima dalla dissoluzione,
se non fosse presente fra gli ingredienti il latte scremato in
polvere.
Aggiustare il pH a 6,9 +- 0,1 a 25 C come descritto al punto 5.1. e
distribuire, sterilizzare e conservare il terreno secondo il
procedimento di cui al punto 5.2.
6. DILUENTI
6.1. Soluzione salina/peptone
COMPOSIZIONE
Peptone 1,0 g
Cloruro di sodio (NaCl) 8,5 g
Acqua 1.000 ml
PREPARAZIONE
Sciogliere gli ingredienti in acqua, riscaldando se occorre.
Verificare con un pHmetro (4.1.4.) il pH ed aggiustarlo eventualmente
con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o acido
cloridrico in modo che, dopo sterilizzazione, il pH a 25 C sia 7,0
+- 0,1.
6.2. DISTRIBUZIONE, STERILIZZAZIONE E CONSERVAZIONE DEL DILUENTE
Distribuire il diluente (6.1.) nelle provette (4.2.1.) in quantità
tali che a sterilizzazione avvenuta ciascuna provetta contenga, 9,0
ml +- 0,2 di diluente. Tappare le provette.
Sterilizzare in autoclave (4.1.2.) a 121 +- C per 15 minuti.
Verificare il pH del diluente.
Se non deve essere usato immediatamente, conservare il diluente al
riparo dalla luce e ad una temperatura compresa tra 1 e 5 C per non
più di un mese dopo la preparazione.
6.3. DILUENTI DISIDRATATI DISPONIBILI IN COMMERCIO
I diluenti (6.1.) possono essere preparati a partire da compresse o
polveri disidratate disponibili in commercio. Seguire le istruzioni
del fabbricante. Aggiustare il pH come descritto al punto 6.1. e
distribuire, sterilizzare e conservare i diluenti come descritto in
6.2.
7. PROCEDIMENTO
7.1. FUSIONE DEL TERRENO DI COLTURA
Prima di procedere all'esame microbiologico, far fondere rapidamente
la quantità di terreno necessaria e portare quindi il terreno a 45
+- 1 C in bagnomaria (4.1.5.).
7.2. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LATTE
7.2.1. Mettere a preincubare una confezione non aperta di latte
pastorizzato o, se non è possibile un campione rappresentativo di
non meno di 100 ml in un termostato (4.1.3.a.) a 6 C per 120 +- 2
ore.
7.2.2. Al termine della preincubazione mescolare a fondo,
capovolgendo rapidamente per 25 volte il contenitore del campione di
latte, in modo che i microorganismi siano distribuiti il più
uniformemente possibile. Evitare la formazione di schiuma oppure
lasciare che si disperda. Tra la miscelazione ed il prelievo
dell'aliquota di analisi non devono trascorrere più di 3 minuti.
7.3. PREPARAZIONE DELLA PRIMA DILUIZIONE (10(alla -1)) Aggiungere con
una pipetta sterile (4.2.3.), 1 ml del campione di latte (7.2.2.) a 9
ml di diluente (6.1), evitando di toccare il diluente con la pipetta.
La temperatura del diluente deve essere approssimativamente uguale a
quella del campione di latte. Mescolare accuratamente la prima
diluizione con il mescolatore (4.1.9.) per 5 - 10 secondi.
Si ottiene così la prima diluizione 10(alla -1).
7.4. PREPARAZIONE DELLE DILUIZIONI DECIMALI SUCCESSIVE Trasferire con
una pipetta sterile (4.2.3.), 1 ml della prima diluizione (7.3.) in 9
ml di diluente (6.1.), seguendo le istruzioni date in 7.3.
Si ottiene così la diluizione 10 (alla -2).
Ripetere queste operazioni per ottenere ulteriori diluizioni decimali
sino a quando si ritiene di avere ottenuto un numero adeguato di
microrganismi (8.1.).
7.5. SEMINA DELLE PIASTRE DI PETRI
Trasferire con una pipetta sterile (4.2.3.), 1 ml del campione e/o
della diluizione decimale appropriata in una piastra (4.2.4.).
L'esame deve essere effettuato su almeno due diluizioni. Per ciascuna
diluizione scelta come appropriata (8.1.) preparare due piastre.
7.6. DISTRIBUZIONE DEL TERRENO DI COLTURA
Versare circa 15-18 ml del terreno (7.1.) in ciascuna delle piastre
inoculate.
Appena versato il terreno di coltura mescolare facendo ruotare la
piastra di Petri in modo da ottenere dopo l'incubazione una
distribuzione uniforme delle colonie.
Tra la fine della preparazione del campione di latte e la
miscelazione della diluizione con il terreno non devono trascorrere
più di 15 minuti. Lasciare quindi solidificare su una superficie
orizzontale pulita e fredda.
7.7. INCUBAZIONE DELLE PIASTRE DI PETRI
Mettere in termostato (4.1.3.b) le piastre capovolgendole. Non
impilare più di sei piastre alla volta. Le pile di piastre non
devono venire a contatto tra di loro nè con le pareti o con la parte
superiore del termostato.
Mettere a incubare a 21 +- 1 C per 25 ore.
7.8. CONTEGGIO DELLE COLONIE
Contare le colonie delle piastre di Petri che non contengono più di
300 colonie.
Esaminare le scatole a luce attenuata. Per contare più facilmente si
possono usare opportune lenti (4.1.6.) e/o un apparecchio
contacolonie (4.1.8.). Evitare di confondere particelle di
precipitato nelle piastre con le colonie puntiformi. In caso di
dubbio, esaminarle con attenzione ricorrendo eventualmente ad una
lente d'ingrandimento più forte (4.1.7.) per distinguere le colonie
dalle sostanze estranee.
Le colonie invasive devono essere contate come singole colonie. Se
queste ricoprono meno di un quarto della piastra contare le colonie
sulla parte restante della stessa calcolando quindi il numero
corrispondente per l'intera piastra. Scartare invece la piastra se le
colonie invasive ne ricoprono più di un quarto.
8. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI
8.1. Utilizzare i risultati relativi a quelle piastre che contengono
da 10 a 300 colonie (cfr. 8.3. e 8.4.).
8.2. Il numero di microrganismi in 1 ml di latte pastorizzato è dato
dalla formula:
sigma C
--------------
(n1 + 0,1 n2)d
dove
sigma C è la somma del numero di colonie contate secondo il
procedimento di cui al punto 8.1.,
(n1 + 0,1 n2)d è uguale al volume di campione inoculato in cui:
n1 è il numero di piastre utilizzate per la prima diluizione,
n2 è il numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione,
d è il fattore di diluizione relativo ai primi conteggi effettuati.
Il risultato è approssimato a due cifre significative. Quando la
cifra che deve essere arrotondata è 5, effettuare l'approssimazione
in modo che la cifra immediatamente a sinistra sia un numero pari.
Esempio
diluizione 10(alla -2) : 278 e 290 colonie
10(alla -3) : 33 e 28 colonie
numero/ml 278+290+33+28
= ----------------------------
(2+0,1x2) 10(alla -2)
629
= ----- = 28590 = 29000 = 2,9x10(alla quarta)
0,022
8.3. Se tutti i calcoli danno meno di 10 colonie, indicare che il
numero di microrganismi per millilitro è "inferiore a 10 x d per
ml"; dove "d" è il reciproco del fattore di diluizione più basso.
8.4. Se tutti i calcoli danno più di 300 colonie ma il conteggio è
possibile, procedere ad una stima e moltiplicare tale valore per il
reciproco del fattore di diluizione. Riportare il risultato come
"numero probabile di microrganismi per ml".
9. PRECISIONE
Non sono disponibili risultati di prove interlaboratorio accettate a
livello internazionale.
VI. NUMERAZIONE DEI COLIFORMI - CONTEGGIO DELLE COLONIE A 30 C
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la
enumerazione dei coliformi nel latte pastorizzato con la tecnica del
conteggio delle colonie a 30 C.
2. DEFINIZIONE
Con il termine "coliformi" si intendono i batteri che a 30 C formano
colonie caratteristiche o non caratteristiche che fermentano il
lattosio con formazione di gas nelle condizioni descritte.
3. PRINCIPIO
Si mescola un volume definito del campione di latte con il terreno di
coltura nelle piastre di Petri che vengono messe a incubare a 30 C
per 24 ore. Si contano le colonie caratteristiche e se necessario si
conferma l'identità di quelle non caratteristiche dopo verifica
della loro capacità di fermentare il lattosio. Si calcola quindi il
numero di coliformi per 1 ml di latte pastorizzato.
4. APPARECCHIATURA E VETRERIA
Materiale di uso comune in laboratorio e in particolare:
4.1. APPARECCHIATURA
4.1.1. STUFA AD ARIA CALDA, in grado di operare a 170-175 C.
4.1.2. AUTOCLAVE, termostatabile a 121 +- C.
4.1.3. TERMOSTATO, regolabile ad una temperatura uniforme di 30 +- 1
C.
4.1.4. PHMETRO, con compensazione automatica della temperatura e
precisione di +- 0,1 unità pH.
4.1.5. BAGNOMARIA, in grado di funzionare a 45 +- 1 C.
4.1.6. ANSA METALLICA in platino-iridio o nickel-cromo.
4.2. VETRERIA
4.2.1. PROVETTE con chiusure appropriate da 20 ml per contenere il
terreno di coltura per la conferma (5.2.) e TUBI DI FERMENTAZIONE DI
DURHAM di dimensioni adatte all'impiego con le provette.
4.2.2. PALLONI da 150 a 250 ml per contenere il terreno di coltura
solido selettivo (5.1.).
4.2.3. PIPETTE, con una estremità chiusa con batuffolo di cotone in
vetro o in materiale sintetico sterile, con punta a foro normale,
della capacità nominale di 1-10 ml, con diametro del foro di
scorrimento compreso tra 1,76 e 3 mm.
4.2.4. PIASTRE DI PETRI, in vetro trasparente incolore o in materiale
sintetico sterile, con diametro interno del fondo della scatola di
circa 90-100 mm. L'altezza interna deve essere di almeno 10 mm. Il
fondo non deve presentare irregolarità che possano interferire con
le colonie da contare.
4.2.5. STERILIZZAZIONE DELLA VETRERIA
La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei metodi seguenti:
a) mantenendola alla temperatura di 170-175 C per almeno 1 ora in
una stufa ad aria calda (4.1.1.);
b) mantenendola in autoclave (4.1.2.) a 121 +- 1 C per almeno 20
minuti;
Fare attenzione a che nell'autoclave si abbia un'adeguata
penetrazione del vapore; ad esempio gli eventuali recipienti nei
quali si pone il materiale da sterilizzare non devono essere chiusi
ermeticamente e i tappi dei palloni non devono essere serrati.
La vetreria sterilizzata in autoclave deve essere asciugata facendo
fuoruscire il vapore.
Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa ad aria calda
(4.1.1.).
5. TERRENI COLTURALI
5.1. "VIOLET RED BILE LACTOSE AGAR" (Agar VRBL). Terreno colturale
solido selettivo.
Composizione
Peptone 7 g
Estratto di lievito 3 g
Lattosio (C12H22O11.H2O) 10 g
Cloruro di sodio (NaCl) 5 g
Sali biliari 1,5 g
Rosso neutro 0,03 g
Cristalvioletto 0,002 g
Agar 10-15 g (a seconda delle proprietà
gelatinizzanti dell'agar usato)
Acqua 1.000 ml
PREPARAZIONE
Disperdere e sciogliere gli ingredienti in acqua e lasciare riposare
per alcuni minuti. Mescolare quindi energicamente.
Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4.) ed aggiustarlo eventualmente
con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o acido
cloridrico, in modo che ad ebollizione avvenuta si abbia a 25 C un
pH 7,4.
Portare rapidamente ad ebollizione, agitando di tanto in tanto e
distribuire immediatamente il terreno in ragione di 100 - 150 ml. in
palloni sterili (4.2.2.). Raffreddare quindi in bagnomaria (4.1.5.)
a 45 +- 1 C.
Controllare la sterilità del terreno al momento dell'uso (cfr.
6.4.).
Impiegare il terreno entro 3 ore dalla preparazione.
5.2. "BRILLIANT GREEN LACTOSE BILE BROTH". Terreno colturale di
conferma.
COMPOSIZIONE
Peptone 10 g
Lattosio (C12 H22 O11.H2O) 10 g
Bile di bue disidratata 20 g
Verde brillante 0,0133 g
Acqua 1.000 ml
PREPARAZIONE
Sciogliere gli ingredienti in acqua portando ad ebollizione.
Verificare il pH con un pHmetro (4.1.4.) ed eventualmente aggiustarlo
con una soluzione (almeno 0,1 mol/l) di idrossido di sodio o di acido
cloridrico in modo che, a sterilizzazione avvenuta, si abbia a 25 C
un pH 7,2 +- 0,1.
Distribuire il terreno in ragione di 10 ml nelle provette contenenti
i tubi di Durham. Chiudere le provette.
Sterilizzare per 15 minuti in autoclave (4.1.2.) a 121 +- C.
Dopo la sterilizzazione i tubi di Durham non devono contenere bolle
d'aria.
Verificare il pH del terreno colturale.
Se non è utilizzato subito, conservare il terreno al riparo dalla
luce per non più di un mese dopo la preparazione, ad una temperatura
compresa tra 0 e 5 C.
5.3. TERRENI DI COLTURA DISIDRATATI DISPONIBILI IN COMMERCIO
I terreni di coltura (5.1., 5.2.) possono essere preparati a partire
da terreni disidratati reperibili in commercio. Seguire in tal caso
le istruzioni del fabbricante. Aggiustare il pH e distribuire,
bollire o sterilizzare e conservare i terreni secondo i procedimenti
descritti in 5.1. e 5.2.
6. PROCEDIMENTO
6.1. TERRENO CULTURALE
Usare il terreno (agar VRBL) come descritto al punto 5.1.
6.2. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LATTE
Rimescolare completamente il campione di latte capovolgendo
rapidamente per 25 volte il recipiente contenente il campione in modo
che i microrganismi siano distribuiti il più uniformemente
possibile. Evitare la formazione di schiuma o lasciare che si
disperda. Tra la miscelazione ed il prelievo dell'aliquota di analisi
non devono trascorrere più di 3 minuti.
6.3. SEMINA DELLE PIASTRE DI PETRI
Seminare 3 ml del campione di latte (6.2.) trasferendo con una
pipetta sterile (4.2.3) 1 ml del campione di latte in ciascuna delle
tre piastre (4.2.4.).
6.4. DISTRIBUZIONE DEL TERRENO COLTURALE
Versare 12 ml circa di agar VRBL (6.1.) in ciascuna delle inseminate.
Appena versato il terreno colturale mescolare facendo ruotare la
piastra di Petri in modo da ottenere dopo l'incubazione una
distribuzione uniforme delle colonie.
Tra la fine della preparazione del campione di latte e la
miscelazione dell'aliquota di analisi con il terreno non devono
trascorrere più di 15 minuti.
Preparare come controllo per la sterilità una piastra non seminata
versandovi 12 ml dell'Agar VRBL usato per le piastre seminate.
Lasciare riposare su una superficie orizzontale pulita e fredda sino
a quando il terreno non si sia solidificato.
A solidificazione completamente avvenuta versare almeno 4 ml di agar
VRBL (6.1.) sulla superficie del terreno inoculato.
Lasciare solidificare.
6.5. INCUBAZIONE DELLE PIASTRE DI PETRI
Trasferire le piastre nel termostato (4.1.3.), capovolgendole. Non
impilare più di sei piastre alla volta. Le pile di piastre non
devono venire a contatto tra di loro nè con le pareti o con la parte
superiore del termostato.
Incubare a 30 +- 10C per 24 +- 2 ore.
6.6. CONTA DELLE COLONIE
6.6.1. Contare le colonie nelle piastre di Petri contenenti non più
di 150 colonie. Contare le colonie di colore rosso scuro aventi un
diametro di almeno 0,5 mm, con o senza precipitato intorno,
caratteristiche per i coliformi.
6.6.2. Se tutte le colonie o parte di esse hanno un aspetto non
caratteristico (ad es. differiscono nel colore, nelle dimensioni o
nella formazione di precipitato dalle colonie tipiche effettuare un
saggio di conferma (6.7.).
6.7. SAGGIO DI CONFERMA
Sulla base delle indicazioni date in 6.6.2., effettuare un saggio di
conferma su un adeguato numero (p. es. 3-5) di colonie non
caratteristiche inoculandole, con un'ansa metallica (4.1.6.), in
provette di brodo "Brilliant Green Lactose Bile" (5.2). Mettere ad
incubare le provette a 30 +- 1 C per 24 +- - 2 ore.
Considerare coliformi quelle colonie che nel tubo di Durham producono
gas.
7. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI
7.1. Utilizzare i risultati delle conte (cfr. 7.4.) relative alle
piastre che contengono non più di 150 colonie
7.2. Nel caso del saggio di conferma, calcolare il numero di colonie
di coliformi in base alla percentuale di colonie di coliformi
confermate.
7.3. Il numero di coliformi in 1 ml di latte pastorizzato è dato
dalla formula:
sigma C
-------
n
dove
sigma C è il numero totale di colonie di coliformi (7.1 in relazione
con 7.2) risultato dall'esame del campione di latte (3 ml).
n è il numero di millilitri del campione esaminato (6.31) (3 ml).
Quando si hanno più di 100 colonie il risultato è approssimato a
due cifre significative. Quando la cifra da arrotondare è 5,
arrotondare in modo che la cifra immediatamente a sinistra sia un
numero pari.
7.4. Se si ottengono soltanto conteggi con numero di colonie
superiore a 150 indicare il risultato come "numero probabile di
coliformi in 1 ml di prodotto".
8. PRECISIONE
Non sono disponibili risultati di prove interlaboratorio accettate a
livello internazionale.
VII. NUMERAZIONE DELLE CELLULE SOMATICHE
Il presente procedimento descrive due metodi come metodi di
riferimento per la enumerazione delle cellule somatiche.
A. IL METODO MICROSCOPICO
B. IL METODO FLUORO-OPTO-ELETTRONICO
A. METODO MICROSCOPICO
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la
enumerazione delle cellule somatiche nel latte crudo. Il presente
procedimento descrive il metodo per la determinazione del numero di
cellule nel campione di latte per tarare e verificare l'accuratezza
del metodo fluoro-opto-elettronico (cfr. B.1).
2. DEFINIZIONE
Ai fini del prsente metodo per cellule somatiche si intendono quelle
cellule, quali leucociti e cellule epiteliali, i cui nuclei possono
essere distintamente colorati con il blu di metilene.
3. PRINCIPIO
0,01 ml di latte vengono distribuiti su un'area di 1 cm alla seconda
di vetrino. Il film viene quindi essiccato e colorato. Per il
conteggio si usa un microscopio. Il numero di cellule contenute in 1
ml si ottiene moltiplicando il numero di cellule somatiche contate in
un'area determinata per il fattore di lavoro.
4. REATTIVI
Le sostanze usate devono essere di purezza analitica.
SOLUZIONE COLORANTE:
COMPOSIZIONE
Blu di metilene 0,6 g
Etanolo - 99 % 54 ml
1,1,1-tricloroetano oppure tetracloroetano 40 ml
Acido acetico glaciale 6 ml
AVVERTENZA: il tetracloroetano è velenoso. Nel caso venga usato, la
preparazione del colorante e l'applicazione sul vetrino devono essere
effettuate sotto cappa.
PREPARAZIONE
Mescolare l'etanolo con l'1,1,1,-tricoloroetano o il tetracloroetano
in una bottiglia e riscaldare a bagnomaria a 60-70 C. Addizionare il
blu di metilene, mescolare accuratamente, raffreddare in frigorifero
a 4 C per 12-24 ore ed aggiungere acido acetico glaciale. Filtrare
su filtro con diametro dei pori non superiore ai 10-12 micron e
conservare la soluzione colorante in una bottiglia a tenuta d'aria.
Se si sono formati granelli o sedimenti, prima dell'uso filtrare
nuovamente.
5. APPARECCHIATURA E VETRERIA
5.1. MICROSCOPIO, con ingrandimento di 500-1.000.
5.2. MICROSIRINGA 0,01 ml con precisione non inferiore a +/- 2 %.
5.3. VETRINO con campo delimitato di 20 mm x 5 mm per il film, oppure
un vetrino standard ed una sagoma di 20 mm x 5 mm delimitante il
campo per il film.
5.4. PIASTRA RISCALDANTE LIVELLATA, (30-50 C) per essiccare i
vetrini.
5.5. PHON per asciugare il film.
5.6. BAGNOMARIA, termostatabile a 30-40 C per riscaldare il campione
di latte.
5.7. VETRINO MICROMETRICO di riferimento, con intervalli di 0,01 mm.
6. PROCEDIMENTO
6.1. CAMPIONE DI LATTE
Il campione di latte deve essere analizzato entro 6 ore dal
campionamento. La temperatura di conservazione non deve superare i 6
C. Occorre evitare il congelamento.
6.2. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE NEL LABORATORIO
Riscaldare il campione in bagnomaria (5.6.) a 30-40 C. Mescolare
quindi con cura. Raffreddare alla temperatura alla quale è stata
tarata la microsiringa (5.2.), ad esempio 20 C.
6.3. PRE-TRATTAMENTO DEI VETRINI
Pulire i vetrini (5.3.), ad esempio con etanolo, asciugare con carta
che non lasci particelle, esporre alla fiamma e raffreddare.
Conservare in una scatola per evitare la polvere.
6.4. PREPARAZIONE DEL FILM
Prelevare con una microsiringa (5.2.) 0,01 ml di latte dal campione
preparato come descritto. Pulire accuratamente la parte esterna della
siringa che viene a contatto con il latte. Portare la siringa sul
vetrino (5.3.) seguendo dapprima il contorno del rettangolo (20 mm x
5 mm) e ricoprendo quindi tutta la superficie il più uniformemente
possibile. Porre il vetrino su una piastra riscaldante livellata
(5.4.) fino a essiccazione completa.
Per ciascun campione di latte devono essere preparati ed analizzati
almeno due film.
6.5. COLORAZIONE DEI FILM
Immergere nella soluzione colorante (4.) per 10 minuti. Essiccare,
completando eventualmente con il phon (5.5.). Immergere i film in
acqua di rubinetto fino ad asportare tutto il colore in eccesso.
Essiccare quindi nuovamente e conservare al riparo dalla polvere.
6.6. TARATURA DEL CAMPO MICROSCOPICO
Sulla base dell'ingrandimento scelto (500x-1000x) determinare il
diametro del campo microscopico con il vetrino micrometrico di
riferimento.
7. CONTEGGIO E CALCOLO
7.1. CONTA DELLE CELLULE
Con il microscopio (5.1.). Contare anzichè le cellule soltanto i
loro nuclei. Questi sono chiaramente riconoscibili e per la conta
almeno la metà del nucleo deve essere visibile nel campo
microscopico.
Contare le strisce o i campi nel terzo centrale del film, evitando di
prendere in considerazione quelli che ricadono esclusivamente nelle
zone periferiche del film. L'accuratezza con cui sono stati preparati
i film e quindi l'attendibilità dei risultati, deve essere
controllata almeno una volta al mese eseguendo la conta in varie
parti del film.
Il conteggio può essere anche effettuato contando i campi
microscopici ripartiti in modo tale che tutte le parti del film siano
ugualmente rappresentate.
7.2. NUMERO MINIMO DI CELLULE DA CONTARE Poichè la conta delle
cellule somatiche al microscopio può essere anche usata per la
standardizzazione dei procedimenti di conteggio automatico e
meccanizzato, il coefficiente di variazione delle conte su campioni
identici non deve risultare più elevato di quello ottenuto con
strumenti elettronici. Il coefficiente di variazione per un campione
di latte contenente 400.000 - 600.000 cellule/ml non deve superare il
5 %.
Per ottenere questo valore di ripetibilità il numero di cellule
somatiche da contare per ciascun campione deve essere, in base alle
caratteristiche della distribuzione di Poisson, di almeno 400. La
distribuzione di Poisson presuppone
M = V = s(alla seconda),
dove
M è il valore medio
V è la varianza e
s è la deviazione standard.
Il coefficiente di variazione è :
s x 100 100 100
CV = ------- % oppure CV = --- % oppure CV = ------------------ %
M s (radice quadrata)M
dove M (media) indica il numero di particelle (cellule) che sono
state contate (cioè 400 per CV = 5 %).
7.3. CALCOLO DEL FATTORE DI LAVORO
Nel caso di 0,01 ml di latte il fattore di lavoro è calcolato
secondo 7.3.1. o 7.3.2.
7.3.1. CONTEGGIO DELLE STRISCE TRACCIATE TRASVERSALMENTE AL FILM
La lunghezza di ciascuna striscia su cui effettuare la conta è di 5
mm mentre la larghezza corrisponde al diametro del campo microscopico
delimitato dal vetrino micrometrico di riferimento (5.7.).
20 x 100
Fattore di lavoro = --------
d x b
dove
d è il diametro del campo microscopico in mm, delimitato dal vetrino
micrometrico di riferimento
b è il numero di strisce su cui la conta è stata effettuata per
intero.
7.3.2. EFFETTUANDO LA CONTA DEI CAMPI MICROSCOPICI NEL TERZO CENTRALE
DEL FILM OPPURE MEDIANTE LA GRIGLIA
20 x 5 x 100 12732
Fattore di lavoro : ---------------- = -------------------
d2 d(alla seconda) x s
pigreca x -- x s
4
dove
d è il diametro del campo microscopico in mm delimitato dal vetrino
micrometrico di riferimento (5.7.)
s è il numero di campi in cui è stata effettuata la conta.
7.4. CALCOLO DEL TENORE IN CELLULE
Si moltiplica il numero di cellule somatiche contate (7.1. e 7.2.)
per il fattore di lavoro (7.3.), ottenendo il numero di cellule per
ml di latte.
7.5. PRECISIONE
Il coefficiente di variazione (cfr. 7.2.) non deve essere superiore
al 5 %.
Per la precisione non sono disponibili risultati di prove
interlaboratorio accettate a livello internazionale.
7.6. RIPRODUCIBILITÀ (R)
La deviazione standard (coefficiente di variazione) (cfr. 7.2.) non
deve essere superiore al 10 %.
B. METODO FLUORO-OPTO-ELETTRONICO
1. OGGETTO E CAMPO D'APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento che, dopo
opportuna taratura (cfr. A.1), può essere usato per la conta di
cellule somatiche nel latte crudo - con o senza conservanti chimici.
2. DEFINIZIONE
Ai fini del presente metodo con il termine cellule somatiche si
intendono le particelle aventi una intensità di fluorescenza minima
dovuta alla colorazione del DNA del nucleo.
3. PRINCIPIO
Si mescola a fondo una parte del campione (ad es. 0,2 ml) con una
soluzione tampone ed una soluzione fluorescente. Parte di tale
miscela viene trasferita sotto forma di un film sottile su un disco
rotante che funge da piano portaoggetti per il microscopio.
Ogni cellula produce un impulso elettrico che viene amplificato e
registrato. Il numero di cellule somatiche viene espresso in migliaia
per ml.
4. REATTIVI
Salvo altre indicazioni i reattivi devono essere di purezza
analitica. L'acqua deve essere distillata, deionizzata o di purezza
equivalente.
4.1. SOLUZIONE TAMPONE
COMPOSIZIONE
Ftalato acido di potassio 51,0 g
Idrossido di potassio 13,75 g
Polietileneglicol-mono-p-(1,1,3,3 -tetrametilbutil)-fenil-etere (ad
es. Triton X-100), all'1 %
in volume 10,0 ml
pH 5,7 - 5,9. Portare con acqua distillata a 10 000 ml.
PREPARAZIONE
Miscelare i vari ingredienti. Può essere conservata in recipienti a
tenuta d'aria per non oltre 7 giorni. 4.2. SOLUZIONE FLUORESCENTE
(SOLUZIONE MADRE)
COMPOSIZIONE
Brumuro di etidio 1,0 g
Portare con acqua a 1.000 ml
PREPARAZIONE
Si scioglie in acqua il bromuro di etidio. La soluzione può essere
conservata al massimo per 2 mesi in una bottiglia a tenuta di luce e
d'aria.
4.3. SOLUZIONE FLUORESCENTE (SOLUZIONE DI LAVORO)
Portare a 1 000 ml con la soluzione tampone (4.1.) 20 ml della
soluzione madre (4.2) e mescolare. La soluzione di lavoro deve essere
utilizzata entro 7 giorni.
4.4. SOLUZIONE DETERGENTE
COMPOSIZIONE
Soluzione tampone (4.1.) 10 ml
Polietileneglicol-mono-p-
(1,1,3,3-tetrametilbutil)-
fenil-etere (ad es.
Triton X-100), all'1 % in volume 10 ml
Ammoniaca, 25 % in volume 25 ml
Portare con acqua a 10 000 ml.
PREPARAZIONE
Miscelare i vari ingredienti. Conservare al massimo per 30 giorni.
5. APPARECCHIATURA E VETRERIA
5.1. CONTATORE, funzionante in base al principio ottico della
fluorescenza.
NOTA - Lo strumento deve essere tarato prima dell'uso. Si
determina quindi la relazione tra il volume delle
particelle da contare e la soglia oltre la quale viene
effettuato il conteggio. La taratura dell'apparecchiatura
è effettuata secondo le istruzioni del fabbricante usando
campioni il cui numero di cellule è stato precedentemente
determinato con il metodo microscopico (A).
5.2. BAGNOMARIA, con circolazione d'acqua, regolabile a 40 +- 1 C.
5.3. PROVETTA, con opportuna chiusura, da circa 15 ml.
6. IL CAMPIONE DI LATTE
6.1. Il campione deve essere conservato a bassa temperatura in una
provetta (5.3.). Se il campione è privo di conservanti chimici, la
conta non può essere effettuata nelle 24 ore successive alla
mungitura in quanto si otterrebbero valori troppo bassi. La
temperatura di conservazione non deve superare i 6 C.
6.2. CONSERVAZIONE
La conservazione chimica deve essere effettuata entro 24 ore.
6.2.1. La conservazione chimica dei campioni può essere effettuata
addizionando uno dei seguenti conservanti :
- ACIDO ORTOBORICO
La concentrazione finale dell'acido ortoborico nel campione non
deve superare 0,6 g/100 ml. I campioni così addizionati possono
essere conservati al massimo per altre 24 ore a 6-12 C.
- DICROMATO DI POTASSIO
La concentrazione finale del dicromato di potassio non deve super-
are 0,2 g/100 ml. I campioni così addizionati possono essere
conservati al massimo per altre 72 ore alla temperatura di 6-12 C.
- SODIO AZIDE
Il campione può essere conservato con azoturo di sodio ad una
concentrazione finale di 0,024 g/100 ml, a condizione che venga
raffreddato a 6 - 12 C subito dopo il campionamento e che la conta
venga effettuata entro 48 ore dal campionamento stesso.
- BRONOPOL
Il campione può essere conservato con bronopol ad una
concentrazione finale di 0,05 g/100 ml, purchè venga raffreddato
alla temperatura di 6 - 12 C subito dopo il campionamento e la conta
venga effettuata entro 72 ore dallo stesso.
6.2.2. Il campione già trattato con acido ortoborico può essere
conservato per altre 48 ore usando dicromato di potassio.
NOTA - Per i campioni trattati con dicromato di potassio
devono essere rispettate le norme locali relative allo
scarico degli effluenti.
7. PROCEDIMENTO
7.1. PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE
Dopo la mungitura il latte da esaminare deve essere conservato per
almeno 24 ore a circa 2-6 C. Se i campioni non sono stati
pretrattati, si sconsiglia di effettuarne il conteggio il giorno
stesso della mungitura perchè si potrebbero ottenere risultati
troppo bassi. Qualora si debba assolutamente procedere al conteggio,
il campione deve essere pretrattato per almeno tre ore con dicromato
di potassio (cfr. 6.2.1.).
7.2. Preparazione
Si riscalda in bagnomaria (5.2.) termostatato a circa 40 C il
campione pretrattato (cfr. 7.1.) o il campione non trattato munto da
almeno un giorno. Lo si mantiene quindi a temperatura ambiente sino a
conta ultimata.
7.3. Conta delle cellule
La conta va effettuata con il contatore (5.1.) entro 15 minuti dalla
fine del trattamento termico (cf. 7.2.). Il campione deve essere
mescolato a fondo subito prima della conta al fine di ottenere una
distribuzione delle cellule somatiche che sia la più omogenea
possibile.
L'ulteriore diluzione e la preparazione del campione si effettuano
automaticamente nello strumento.
8. PRECISIONE
Non si dispone di valori della ripetibilità (r) e della
riproducibilità (R) ottenuti con prove interlaboratorio accettate a
livello internazionale. In futuro verranno fissati dei valori per
quanto riguarda la precisione.
Sulla base dei dati disponibili a livello nazionale si possono
effettuare le seguenti stime; numero delle cellule compreso fra
400.000 e 500.000/ml
- deviazione standard per la ripetibilità
S2 = 20.000 cellule/ml
(pari ad un coefficiente di variazione del 5% - 4%)
- deviazione standard per la riproducibilita':
SR = 40.000 cellule/ml
(pari ad un coefficiente di variazione del 10% - 8%)
9 CONTROLLO DELL'ACCURATEZZA
Il controllo dell'accuratezza è effettuato usando campioni il cui
tenore di cellule (P) è noto essendo stato determinato per conteggio
delle cellule al microscopio in un laboratorio nazionale di
riferimento.
VIII. RICERCA DI ANTIBIOTICI E SULFAMIDICI
OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo di riferimento per la
ricerca di antibiotici e sulfamidici nel latte crudo e nel latte
trattato termicamente.
Il metodo di riferimento si suddivide in :
METODO QUALITATIVO
È il metodo che consente una prima selezione dei campioni di latte
contenenti antibiotici e sulfamidici. Il metodo descritto è uno di
quei metodi, simili fra loro, che si basano sull'uso del BACILLUS
STEAROTHERMOPHILUS, VARIETÀ CALIDOLACTIS, ATCC 10149 come
microrganismo-test. Il metodo è stato scelto come rappresentativo di
questo tipo di prove.
METODO DI CONFERMA ED IDENTIFICAZIONE DELLA PENICILLINA
Il presente metodo deve essere usato per confermare i risultati del
procedimento qualitativo, per identificare la penicillina e
determinarne la concentrazione.
A. METODO QUALITATIVO
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il procedimento descrive la tecnica di ricerca qualitativa, nel latte
crudo ed in quello trattato termicamente, degli antibiotici e dei
sulfamidici presenti in concentrazione superiore ai limiti fissati
nella tabella :
Limiti di rivelazione di vari antibiotici e sulfamidici (*)
---------------------------------------------------------------------
: Sensibilità della prova :
:-------------------------------------:
: Completamente Completamente :
: negativo positivo :
:-------------------------------------:
Benzilpenicillina : 0,02 0,006 :
Ampicillina : 0,002 0,005 :
Cloxacillina : 0,015 0,035 :
Nafcillina : 0,006 0,011 :
Tetraciclina : 0,10 0,40 :
Ossitetraciclina : 0,20 0,45 :
Clortetraciclina : 0,15 0,50 :
Cloramfenicolo : ( 7 15 :
Diidrostreptomicina : ( 4 13 :
Neomicina : ( 1 22 :
Kanamicina : ( 9 28 :
Bacitracina : 0,06 0,14 :
Eritromicina : 1 2,25 :
Rifamicina : 0,01 0,14 :
Diafenilsolfone : 0,01 0,1 :
Sulfametazina, Sulfadimidina : 0,5 1 :
---------------------------------------------------------------------
* La benzilpenicillina e la bacitracina sono espressi in UI/ml, tutti
gli altri antibiotici in ug/ml.
2. DEFINIZIONE
Se il colore del terreno colturale non cambia (cfr. 7.1.) il latte
contiene antibiotici o sulfamidici.
3. PRINCIPIO
Un campione di latte viene aggiunto con i nutrienti ad un gel di agar
contenente un indicatore di pH e spore di BACILLUS
STEAROTHERMOPHILUS, varietà CALIDOLACTIS ATCC 10149 (cfr. 5.4.1.),
che nel complesso ha una buona sensibilità ed è particolarmente
sensibile all'effetto inibente della penicillina. L'incubazione che
provoca la normale crescita dell'organismo e sua produzione di acido
fa cambiare il colore dell'indicatore di pH da rosso porpora a
giallo.
La presenza nel latte di sostanze che inibiscono la crescita
dell'organismo fanno sì che l'indicatore di pH mantenga il colore
rosso porpora.
4. APPARECCHIATURA E VETRERIA
Materiale di uso comune in laboratorio e in particolare:
4.1. APPARECCHIATURA
4.1.1. TERMOSTATO, regolabile a 64 +- 1 C
4.1.2. BAGNOMARIA termostatato a 64 +- 1 C
4.1.3. RASTRELLIERA per le provette o le fiale
4.1.4. PIPETTA con punta monouso per campionamento e dosaggio di 0,1
ml
4.1.5. PINZE O PINZETTE
4.1.6. STUFA AD ARIA CALDA funzionante a 170-175 C
4.1.7. AUTOCLAVE regolata a 121 +- 1 C
4.1.8. PH METRO
4.2. VETRERIA
4.2.1. BOTTIGLIE PER CAMPIONI con adeguate chiusure
Nota: Certi tappi di gomma possono rilasciare sostanze
inibenti sulle pareti del collo della bottiglia.
4.2.2. PIASTRE DI PETRI in vetro incolore trasparente o in materiale
sintetico sterile con fondo piatto di spessore uniforme, e diametro
interno minimo di circa 140 mm
4.2.3. BOTTIGLIE da 250 ml
4.2.4. PIPETTE, (con una estremità chiusa da un batuffolo di cotone)
sterili in vetro o di materiale sintetico sterile della capacità
nominale di 1 ml e di 10 ml
4.2.5. SPATOLE DI VETRO
4.2.6. PROVETTE O AMPOLLE, con diametro interno di circa 8 mm, con
cappuccio o tappo
4.2.7 STERILIZZAZIONE DELLA VETRERIA
La vetreria deve essere sterilizzata con uno dei seguenti metodi:
a) mantenendola in una stufa ad aria calda (4.1.6.) alla temperatura
di 170-175 C per almeno un'ora;
b) mantenendola in autoclave (4.1.7.) a 121 C +- 1 C per almeno 20
minuti.
Fare particolare attenzione a che nell'autoclave si abbia una
adeguata penetrazione di vapore (ad esempio gli eventuali recipienti
nei quali si pone il materiale da sterilizzare non devono essere
chiusi ermeticamente e i tappi dei palloni e delle bottiglie non
debbono essere serrati).
La vetreria sterilizzata in autoclave deve essere asciugata facendo
fuoriuscire il vapore.
Le pipette devono essere sterilizzate in una stufa a secco.
5. TERRENI COLTURALI, SOLUZIONI, ORGANISMO-TEST, ETC.
Gli ingredienti dei terreni colturali devono essere del tipo per
batteriologia. L'acqua usata deve essere distillata su vetro oppure
demineralizzata di purezza almeno equivalente. Non deve inoltre
contenere sostanze che inibiscano i microorganismi-test.
5.1. TERRENI COLTURALI
5.1.1. AGAR NUTRITIVO
COMPOSIZIONE
Estratto di lievito 2 g
Peptone 5 g
Estratto di carne 1 g
Cloruro di sodio 5 g
Agar 10-15 g
Acqua 1000 ml
PREPARAZIONE
Sciogliere in acqua i componenti. Portare ad ebollizione agitando di
tanto in tanto. Aggiustare il pH in modo che a sterilizzazione
avvenuta sia di 7,4 +- 0,1 a 25 C.
Distribuire con aliquote da 10 ml in provette per ottenere un terreno
solidificato a becco di clarino oppure con aliquote da 1000 ml in
bottiglie.
Sterilizzare a 121 +- 1 C per 15 minuti:
5.1.2. TERRENO AGARIZZATO
COMPOSIZIONE
Cloruro di sodio 2 g
Agar 15 g
Acqua 1000 ml
Soluzione di trimetoprim o tetroxoprim
(cf. 5.1.3.) (*) 10 ml
(*) L'utilizzazione dei terreni di cultura contenenti sostanze anti-
folati deve essere effettuata nel rispetto delle regole relative ai
brevetti che le proteggono.
PREPARAZIONE
Sciogliere in acqua tutti i componenti eccetto il trimetoprim o il
tetroxoprim. Portare ad ebollizione agitando di tanto in tanto.
Aggiungere trimetoprim o tetroxoprim e sterilizzare a 121 +- 1 C per
15 minuti; aggiustare il pH in modo che, a sterilizzazione avvenuta,
risulti a 25 C di 7,0 +- 0,1.
5.1.3. SOLUZIONE DI TRIMETOPRIM O TETROXOPRIM
Trimetoprim o tetroxoprim 5 mg/30 mg
Etanolo al 96 % 5 ml/30 ml
Acqua fino a 1000 ml
Sciogliere il trimetoprim o tetroxoprim in etanolo (5 ml/ 30 ml) e
diluire con acqua.
5.1.4. TERRENO NUTRITIVO
Estratto di lievito 0,75 mg
Glucosio 5,0 mg
Amido solubile 8,0 mg
Porpora di bromocresolo 0,025 g
Acqua fino a 50 ml
Sciogliere in acqua, eventualmente riscaldando, i nutrienti e
l'indicatore e sterilizzare per filtrazione.
Il terreno nutritivo agarizzato è disponibile in commercio in
compresse.
5.2. SOLUZIONI STANDARD DI PENICILLINA
5.2.1. Preparare, in una bottiglia sterile opportunamente tappata,
una SOLUZIONE DI PENICILLINA DA 60 UG/ML = (100 UI/ML) sciogliendo
con benzilpenicillato di potassio o di sodio cristallino in acqua
distillata sterile.
5.2.2. Preparare una SOLUZIONE DI LAVORO DI PENICILLINA portando a
1000 ml con acqua distillata sterile 1,25 ml della soluzione di
penicillina (5.2.1.). Tale soluzione di lavoro contiene 0,075 ug/ml
(= 0,125 UI/ml).
5.2.3. Preparare 75 ml di una SOLUZIONE STANDARD DI PENICILLINA
contenente 0,004 ug/ml (= 0,0067 UI/ml) di penicillina aggiungendo 71
ml di latte esente da sostanze inibenti (5.3.) a 4 ml di soluzione di
lavoro di penicillina (5.2.2.) e mescolando.
5.2.4. Le soluzioni di penicillina descritte ai punti 5.2.1. -
5.2.3. devono essere preparate lo stesso giorno in cui viene
effettuato il saggio.
5.3. LATTE ESENTE DA SOSTANZE INIBENTI Preparare come controllo un
LATTE ESENTE DA SOSTANZE INIBENTI sciogliendo in acqua distillata
sterile latte scremato (10% m/V), in cui sia stata previamente
constatata l'assenza di sostanze inibenti. In alternativa si possono
preparare alcune bottiglie di latte fresco in massa, in cui sia stata
verificata l'assenza di sostanze inibenti, riscaldandolo per 1 ora a
100 C e conservandolo quindi in frigorifero a 0-6 C per non più di
una settimana.
5.4. ORGANISMO-TEST
5.4.1. Come organismo-test di prova si usa il BACILLUS
STEAROTHERMOPHILUS, varietà CALIDOLACTIS, ceppo ATCC 10149. Il ceppo
ATCC 10149 è identico al C 953.
5.4.2. Preparare una COLTURA MADRE per conservare la coltura di
analisi. Questa è mantenuta su agar nutritivo solidificato a becco
di clarino (5.1.1). Inoculare il terreno con uno striscio sulla
superficie dell'agar usando un'ansa di coltura di analisi e incubare
in condizioni aerobiche per 48 ore a 63 +- 1 C. Dopo incubazione,
chiudere ermeticamente la provetta con un tappo di gomma sterile. La
soluzione madre così ottenuta può essere conservata in frigorifero
per diversi mesi a 0-5 C.
5.5. PREPARAZIONE DELLA COLTURA DI ANALISI (SOSPENSIONE DI SPORE)
5.5.1. Versare, in asepsi, 20 ml di agar nutritivo (5.1.1.) in una
piastra di Petri sterile (4.2.2.) e raffreddare a temperatura
ambiente.
5.5.2. Versare con una pipetta sterile (4.2.4.) 5 ml di acqua
distillata sterile in una delle provette contenenti la coltura madre
(5.4.2.) e lavare con un'ansa sterile l'agar a becco di clarino per
prelevare le spore. Tale sospensione di spore deve essere mantenuta a
0-5 C ed usata entro 36 ore.
5.5.3. Trasferire con una pipetta sterile (4.2.4.) 0,5 ml della
sospensione di spore (5.5.2.) su una piastra preparata (5.5.1.) e
spandere bene l'inoculo su tutta la superficie con una bacchetta di
vetro piegata ad una estremità. Incubare al 63 +- 1 C (4.1.1.) per
16-18 ore.
Quando si usano una coltura madre (4.3.2.) o una coltura preparata da
più di 36 ore, occorre ripetere almeno due volte il procedimento di
inoculo con un intervallo di non più di 36 ore fra due subcolture
successive.
5.5.4. Con una pipetta sterile (4.2.4.), versare 10 ml di acqua
distillata sulla piastra (5.5.3.) e trasferire le spore della
superficie nella sospensione servendosi di una bacchetta di vetro.
Versare la sospensione di spore in una bottiglia (4.2.3.) contenente
250 ml di acqua distillata sterile. Chiudere la bottiglia ed agitarla
accuratamente. Le colture che non è possibile replicare subito
devono essere conservate in frigforifero a 0-6 C.
5.5.5. La sospensione di spore deve dare una conta di colonie vive
comprese tra 5 e 10 milioni per millilitro dopo incubazione a 63 +- 1
C per 16-18 ore su terreno agarizzato per il conteggio in piastra.
La sospensione di spore deve essere uniformemente torbida e se
contiene flocculazioni o un sedimento deve essere scartata e
sostituita con una nuova sospensione preparata con la coltura madre
(4.3.2.).
5.6. PREPARAZIONE DELLE PROVETTE/AMPOLLE
5.6.1. Fondere il terreno agarizzato (5.1.2.) e lasciarlo raffreddare
a 55 C.
5.6.2. Aggiungere una parte della sospensione di spore preparata da
poco (5.5.4.) a 5 parti del terreno agarizzato (5.6.1.) in una
provetta o una bottiglia e mescolare accuratamente.
5.6.3. Trasferire in una provetta o una ampolla sterili (4.2.6.) 0,3
ml del terreno colturale inoculato (5.6.2.) calcolato in modo da
formare uno strato dello spessore di 5 mm e chiudere con un tappo o
un cappuccio oppure saldando l'estremità alla fiamma. Lasciare
raffreddare le provette/ampolle in posizione verticale facendo
solidificare il terreno e lasciare poi a riposo per almeno 12 ore.
5.6.4. Le provette/ampolle possono essere usate lo stesso giorno, ma
possono essere conservate per diversi mesi se vengono raffreddate
subito dopo la preparazione e conservate a 0-6 C.
6. PROCEDIMENTO
6.1. I campioni devono essere analizzati al più presto possibile,
preferibilmente entro 24 ore dal campionamento, mantenendoli nel
frattempo alla temperatura di 0-5 C. Nel caso non sia possibile
analizzarli entro 24 ore, i campioni devono essere conservati in un
surgelatore (da -30 C a -15 C) per ridurre al massimo
l'inattivazione della penicillina.
6.2. Contrassegnare ciascuna provetta/ampolla (5.6.) in modo
leggibile e indelebile. Togliere il cappuccio o il tappo. Porre in
un'opportuna rastrelliera (4.1.3.) il numero necessario di
provette/ampolle per i campioni per la prova e quelli di controllo
(5.2 e 5.3) da esaminare.
6.3. Aggiungere ad ogni provetta/ampolla 50 mcl della sostanza
nutritiva di cui al punto 5.1.4..
6.4. Mescolare a fondo il campione di latte e trasferirne con la
siringa (4.1.4.) 0,1 ml nella provetta/ampolla con l'etichetta
corrispondente. Usare una punta monouso pulita per ciascun campione
da trasferire.
6.5. Ripetere in doppio l'operazione di cui al punto 6.4 usando
invece del campione di latte (5.2.3.) la soluzione standard di
penicillina contenente 0,004 ug/ml (= 0,0067 ui(ml) di penicillina.
6.6. Ripetere in doppio l'operazione del punto 6.4. usando invece del
campione di latte il latte di controllo esente da inibitori (5.3.).
6.7. Chiudere le provette/ampolle e sistemare la rastrelliera che le
contiene in bagnomaria a 63 +- 1 C (4.1.2.) per almeno 2 1/2 - 2 3/4
ore.
6.8. Estrarre dal bagnomaria la rastrelliera contenente le
provette/fiale.
6.9. Osservare il colore del substrato del saggio (cfr.7).
7. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
7.1. Una colorazione purpurea del terreno di coltura di prova in una
provetta/ampolla contenente il campione di latte o il latte di
controllo indica la presenza nel campione di antibiotici o di
sulfamidici esattamente o vicino al livello "totalmente positivo"
indicato nella tabella 1. Il permanere della colorazione purpurea
nelle provette/ampolle contenenti la soluzione standard di
penicillina (6.5.) dimostra che il terreno di coltura adottato per il
saggio è sufficientemente sensibile.
7.2. La colorazione purpurea solo di una parte del terreno di coltura
o la colorazione irregolare di una delle provette/fiale contenenti il
campione di latte indicano la presenza nel campione di sostanze
inibenti comprese fra i livelli indicati nella tabella 1.
7.3 Una colorazione giallastra del terreno di coltura in una delle
provette/ampolle del campione di latte o del latte di controllo
indica l'assenza di sostanze che inibiscono la crescita
dell'organismo-test.
7.4. Se tutte le provette/ampolle, compresa quella con il latte di
controllo, acquistano una colorazione purpurea, queste non contengono
spore vive ed occorre ripetere il saggio sui campioni usando sostanze
preparate di recente.
8. CONFERMA DEI RISULTATI
8.1. Effettuare su tutti i campioni che danno le reazioni descritte
in 7.1. e 7.2. la prova di conferma secondo il "metodo B". Se prima
della prova di conferma è necessario procedere al deposito dei
campioni di latte questi ultimi debbono essere surgelati per impedire
la degradazione degli antibiotici.
B. METODO PER LA CONFERMA DELLE PENICILLINE E LA DETERMINAZIONE DELLA
CONCENTRAZIONE
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il procedimento descrive il saggio di conferma per penicilline o per
antibiotici diversi dalle penicilline ed il metodo per determinare la
concentrazione della penicillina nei campioni di latte con reazione
positiva (A.7.1.) o incerta (A.7.2.).
SENSIBILITÀ DEL METODO AI VARI ANTIBIOTICI
Cfr. A.1.
2. DEFINIZIONE
2.1. Il campione di latte CONTIENE ANTIBIOTICI, SULFAMIDICI COMPRESI,
quando con il metodo descritto il campione presenta attorno al disco
un alone di inibizione largo almeno 2 mm.
2.2. Se un campione contenente antibiotici, sulfamidici compresi
(2.1.), cui è stata aggiunta penicillinasi (betalattamasi) non dà
alone oppure dà un alone di diametro inferiore a quello del campione
senza penicillinasi, LA SOSTANZA INIBENTE E'LA PENICILLINA CON O
SENZA UN ALTRO ANTIBIOTICO, SULFAMIDICI COMPRESI.
2.3. Se la zona non viene inattivata dalla penicillinasi (2.2.), la
sostanza inibente nel campione di latte NON E'PENICILLINA, ma può
essere un altro residuo (cfr. direttiva 85/397/CEE allegato A,
capitolo VI, A.1.f e 2b, allegata al decreto ministeriale 14 maggio
1988, n. 212) pubblicato nel S.O. alla Gazzetta Ufficiale n. 142 del
18 giugno 1988.
Alcune penicilline semisintetiche, ad esempio la sodio cloxacillina
socica, non sono, o sono soltanto in parte, inattivate dalla
penicillinasi oppure sono completamente resistenti e non sono quindi
identificate come penicillina (cfr. 7.3.).
3. PRINCIPIO
Un disco di carta bibula impregnato del latte in esame è posto sulla
superficie di un terreno agarizzato inoculato con BACILLUS
STEAROTHERMOPHILUS, varietà CALIDOLACTIS. Quando con l'incubazione
si ha un normale crescita dell'organismo l'agar diventa opaco. La
presenza nel latte di sostanze che inibiscono lo sviluppo degli
organismi è indicata da un alone attorno al disco. La dimensione
dell'alone dipende, tra l'altro, dalla concentrazione e dal tipo di
sostanze inibenti presenti nel latte.
4. APPARECCHIATURA, VETRERIA E ATTREZZATURA
4.1. APPARECCHIATURA
4.1.1. Cfr. A.4.1.
4.1.2. BAGNOMARIA, regolabile a 80 +- 1 C.
4.2. VETRERIA
Cfr. A.4.2.
4.3. DISCHI DI CARTA, esenti da sostanze inibenti, di 9-13 mm di
diametro, in grado di assorbire circa 130 mg di latte (di preferenza
conservati in un essiccatore).
5. TERRENI COLTURALI, SOLUZIONI STANDARD, SOLUZIONE DI PENICILLINASI,
REAGENTI, ORGANISMO-TEST, ECC.
Gli ingredienti dei terreni colturali devono essere del tipo per
batteriologia. L'acqua usata deve essere distillata su vetro o
demineralizzata di purezza almeno equivalente e non deve contenere
sostanze che possono inibire la crescita del microrganismo-test.
5.1 TERRENI COLTURALI
5.1.1. AGAR NUTRITIVO (A.5.1.1.)
5.1.2. TERRENO DI COLTURA PER LA RICERCA DI SOSTANZE INIBENTI
COMPOSIZIONE
Estratto di lievito 2,5 g
Triptone 5 g
Glucosio 1 g
Soluzione di trimetoprim o tetroxoprim
(A.5.1.3.) 10 ml
Agar 10-15 g
(a seconda del potere gelatinizzante)
Acqua 1000 ml
PREPARAZIONE
Sciogliere completamente gli ingredienti solidi in acqua riscaldando
ed agitando prima di aggiungere la soluzione di trimatoprim o di
tetroxoprim. Aggiustare quindi il pH in modo che dopo la
sterilizzazione il suo valore a 25 C sia 8,0 + 0,1. Sterilizzare il
terreno per 15 minuti a 121 + 1 C.
5.2 SOLUZIONI STANDARD DI PENICILLINA NEL LATTE
(cfr A.5.2)
Per quantificare le sostanze inibenti (8.) preparare delle soluzioni
standard di penicillina con latte esente da sostanze inibenti
(A.5.3.) alle seguenti concentrazioni :
a) 0,004 ug/ml (0,0067 ui/ml)
b) 0,006 ug/ml (0,01 ui/ml)
c) 0,03 ug/ml (0,05 ui/ml)
d) 0,06 ug/ml (0,1 ui/ml)
5.3. SOLUZIONE DI PENICILLINASI
5.3.1. Sciogliere in acqua distillata sterile una quantità di
penicillinasi (betalattamasi) sufficiente a dare una concentrazione
di 1000 U/ml. Tal soluzione, di preferenza ripartita in piccola
aliquota, può essere conservata a 0-5 C al massimo per 4 settimane.
NOTA : Non esiste uno standard internazionale per la
penicillinasi. Per il presente metodo si assume che 10
unità di penicillinasi siano sufficienti ad inattivare 0,6
ug (= 1 lU) di penicillina. Per le preparazioni di
penicillinasi di cui non si conosce la concentrazione
occorrerà verificare se tale supposizione è valida.
In caso contrario, occorrerà correggere opportunamente la
concentrazione della soluzione di penicillinasi.
5.3.2. Invece della soluzione di penicillinasi, possono essere usati
dischi reperibili in commercio preparati con penicillinasi a
condizione che venga effettuato un controllo per verificare che
contengano un'adeguata quantità di penicillinasi.
5.4. ORGANISMO-TEST
Cfr. A.5.4.
5.5. COLTURA PER IL SAGGIO (SOSPENSIONE DI SPORE)
Cfr. A.5.5.
5.6. PREPARAZIONE DELLE PIASTRE PER IL SAGGIO
5.6.1. Far fondere il terreno di coltura per la ricerca delle
sostanze inibenti (5.1.2.) e lasciare raffreddare a 55 C.
5.6.2. In una bottiglia aggiungere una parte della sospensione di
spore preparata da poco (5.5.) a tante parti del terreno colturale
per la ricerca delle sostanze inibenti (5.1.2.) quante sono
necessarie per ottenere un'opportuna densità delle colonie nel
substrato inoculato e mescolare a fondo.
5.6.3. Trasferire in una piastra di Petri sterile (A.4.2.2.),
previamente riscaldata a 55 C, il terreno di coltura inoculato
(5.6.2.), in modo da formare uno strato dello spessore da 0,6 a 0,8
mm. In una piastra di Petri del diametro interno di 140 mm occorrono
circa 15 ml del terreno di coltura per ottenere uno spessore di 0,8
mm.
5.6.4. Trasferire le piastre di Petri su una superficie orizzontale
fredda controllata precedentemente con una livella a bolla d'aria,
togliere i coperchi e lasciare solidificare il terreno agarizzato.
Appena il substrato è solidificato, ricoprire le piastre con i
coperchi e capovolgerle per ridurre al massimo la condensazione sulla
superficie del terreno agarizzato.
5.6.5. Le piastre così preparate devono essere usate di preferenza
il giorno stesso, ma possono essere utilizzate entro due settimane
purchè appena preparate vengano immediatamente conservate a 5 C in
un sacchetto di polietilene sigillato.
5.6.6. Contrassegnare il fondo delle piastre per poter identificare i
campioni.
6. PROCEDIMENTO
6.1. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
6.1.1. I campioni che danno risultati positivi o incerti con il
"metodo A" (A.7.1 e A.7.2.) devono essere nuovamente esaminati, per
identificare e quantificare la penicillina.
6.1.2. Riscaldare inizialmente questi campioni di latte a 80 +- 1 C
per 10 minuti, in modo da evitare l'influenza di sostanze inibenti
termolabili non specifiche.
6.1.3. Dopo aver mescolato energicamente, trasferire circa 10 ml del
latte in esame riscaldato in un'appropriata bottiglia sterile a collo
largo. Addizionare circa 0,4 ml della soluzione di penicillinasi
(5.3.) e mescolare a fondo.
6.2. RICERCA DELLE SOSTANZE INIBENTI
6.2.1. Immergere un disco di carta (4.3.) nel campione di latte
(6.1.2.) usando un paio di pinzette pulite e asciutte. Eliminare il
latte in eccesso premendo il disco contro le pareti della bottiglia
contenente il campione. Deporre il disco in piano sulla superficie
della piastra (5.6) e premere leggermente con le pinzette.
6.2.2. I dischi preparati con i vari campioni di latte devono essere
posti ad una distanza di almeno 20 mm l'uno dall'altro e di almeno 10
mm dal bordo.
6.2.3. Per il controllo della sensibilità, occorre porre a caso tra
i dischi del campione di latte alcuni dischi (4.3.) precedentemente
immersi nella soluzione standard di penicillina (5.2.a.); questi
devono essere almeno il 2% di quelli del campione di latte e per
ciascun saggio ne devono essere impiegati almeno 5.
6.2.4. Dopo aver disposto a caso tutti i dischi sul terreno
agarizzato ed averli contrassegnati, capovolgere le piastre ed
incubarle a 63 +- 1 C per 2,5-5 ore.
6.2.5. Dopo l'incubazione le piastre vengono esaminate contro
un'opportuna sorgente luminosa per individuare gli aloni di
inibizione attorno ai dischi di carta. Si misurano quindi tali aloni.
6.2.6. Gli aloni attorno ai dischi contenenti la soluzione standard
di penicillina (6.2.3) devono essere larghi almeno 2 mm.
6.2.7. L'esistenza di aloni chiari attorno ai dischi contenenti il
campione di latte di grandezza pari o maggiore a quella di cui in
6.2.6. indica la presenza di sostanze inibenti l'organismo test.
6.3. IDENTIFICAZIONE E DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLA SOSTANZA
INIBENTE
6.3.1. Effettuare in doppio il procedimento 6.2.1. su un campione di
latte riscaldato (6.1.2.) e su un campione trattato con penicillinasi
(6.1.3.). Invece di aggiungere penicillinasi a 10 ml del campione di
latte si può immergere in questo campione un disco preparato con
penicillinasi (5.3.2.) per poi disporlo nella piastra per il saggio.
6.3.2. Effettuare in doppio il procedimento 6.2.1. per ciascuna delle
soluzioni standard di penicillina elencate in 5.2.a-d.
6.3.3. Determinare i diametri medi degli aloni di inibizione per il
campione di latte, per il controllo di penicillinasi e per le
soluzioni standard di penicillina.
7. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (cfr. 2)
7.1. Se l'alone non si forma attorno al disco contenente il controllo
di penicillinasi ma si forma attorno a quello che contiene il
campione di latte ed ha dimensioni uguali o maggiori a quelle
dell'alone che circonda il disco imbibito di soluzione standard di
penicillina (5.2.a.), la sostanza inibente presente nel campione di
latte corrisponde ad una concentrazione di almeno 0,004 ug/ml di
benzilpenicillina sodica o potassica.
7.2. Se il diametro medio dell'alone attorno al disco contenente la
penicillinasi è uguale al diametro medio dell'alone attorno al disco
contenente il campione di latte, il latte contiene sostanze inibenti
che non possono essere inattivate con le concentrazioni di
penicillinasi usate nel presente procedimento.
7.3. Se il diametro medio dell'alone attorno al disco contenente la
penicillinasi è inferiore al diametro medio dell'alone attorno al
disco contenente soltanto il campione di latte, riscaldato come
descritto in 6.1.2., il campione di latte contiene penicillina
associata ad altri antibiotici, sulfamidici compresi, oltre a
penicillina o penicillina semi-sintetica, che non può essere
identificata con la concentrazione di penicillinasi usata nel
presente procedimento. Le penicilline sintetiche, quali la
cloxacillina sodica, non possono essere inattivate dalla
penicillinasi nelle condizioni del saggio e possono pertanto essere
classificate come sostanze inibenti diverse dalla penicillina. Nota:
Le sostanze inibenti diverse dalla penicillina possono eventualmente
essere identificate ricorrendo ad opportuni metodi.
8. DETERMINAZIONE DEL TENORE DI PENICILLINA
8.1. Il tenore di penicillina può essere determinato tracciando una
curva standard oppure può essere calcolato dalle dimensioni
dell'alone ottenuto con le soluzioni standard di penicillina nel
latte (5.2.a-d).
8.2. DETERMINAZIONE DELLA CURVA STANDARD
Poichè si ha una correlazione lineare tra il log10 della
concentrazione della penicillina ed il diametro degli aloni di
inibizione, la curva standard può essere tracciata su carta
semilogaritmica con le concentrazioni di penicillina in ordinata e
gli aloni di inibizione in ascissa. Questi vengono calcolati come me-
dia delle prove in doppio. I diametri degli aloni di inibizione
vengono riportati in funzione delle concentrazioni standard di
penicillina e si ottiene la curva standard.
8.3. CALCOLO
Le concentrazioni di penicillina nel campione di latte possono essere
calcolate dai diametri degli aloni usando l'equazione o la curva
standard. Per prove precise il raggio degli aloni di inibizione deve
essere non inferiore a due volte e non superiore a cinque volte il
raggio dei dischi.
9. ESPRESSIONE DEI RISULTATI
9.1. I risultati si esprimono come tenore di penicillina uguale o
superiore a 0,004 ug/ml (oppure indicando la concentrazione
determinata) oppure come tenore di sostanze inibenti diverse dalla
penicillina.
9.2. RIPETIBILITÀ (r) E RIPRODUCIBILITÀ (R)
I valori relativi non sono disponibili nè sarebbero significativi
dato che si effettua il confronto utilizzando uno standard.
IX. DETERMINAZIONE DEL TENORE LIPOPOLISACCARIDE BATTERICO - SAGGIO
LPS
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il presente procedimento descrive il metodo ufficiale per la
determinazione del tenore di lipopolisaccaridi (LPS) del latte. Il
metodo si applica al latte UHT ed al latte sterilizzato.
2. DEFINIZIONE
L'esame deve essere effettuato per le specie batteriche che sono più
frequentemente causa di malattie trasmesse con gli alimenti.
La pastorizzazione è un trattamento che protegge dalla presenza di
agenti patogeni non termoresistenti nel latte. Se le norme fissate
nell'allegato A, parte II del decreto ministeriale 14 maggio 1988,
n.212, pubblicato nel S.O. alla Gazzetta Ufficiale n. 142 del 18
giugno 1988 per la conta delle colonie a 30 e a 21 C, per la
fosfatasi e per i coliformi sono rispettate, un saggio specifico per
gli agenti patogeni è necessario soltanto nel caso si sospetti che
il latte sia all'origine dell'insorgenza di casi di intossicazione
alimentare.
3. PROCEDIMENTO
Per la ricerca dei microrganismi patogeni si applicano, se esistono,
i criteri ed i metodi riconosciuti a livello internazionale.
4. RELAZIONE DEI RISULTATI
Per ogni microrganismo patogeno per il quale è stato effettuato
l'esame il risultato deve essere espresso nel modo seguente : numero
per ml di latte oppure "presenza" o "assenza" nel volume di latte
pastorizzato richiesto per il metodo adottato.
La relazione deve descrivere chiaramente il metodo adottato.