Serie Generale n. 61 del 13-3-2004
SUPPLEMENTI ORDINARI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI
DECRETO 23 febbraio 2004
Approvazione dei metodi ufficiali di analisi biochimica del suolo. (GU Serie Generale n.61 del 13-03-2004 - Suppl. Ordinario n. 42)

IL MINISTRO DELLE POLITICHE
AGRICOLE E FORESTALI
Vista la legge 15 marzo 1997, n. 59, recante delega del Governo
per il conferimento di funzioni e compiti alle regioni ed enti
locali, per la riforma della pubblica amministrazione e per la
semplificazione amministrativa;
Visto il decreto legislativo 4 giugno 1997, n. 143, recante
conferimento alle regioni delle funzioni amministrative in materia di
agricoltura e pesca e riorganizzazione dell'Amministrazione centrale;
Visto in particolare l'art. 2, comma 2, della legge predetta,
laddove si stabilisce che il Ministero per le politiche agricole
svolge, tra l'altro, compiti di disciplina generale e coordinamento
nazionale in diverse materie, tra le quali la tutela della qualità
dei prodotti agroalimentari, caratteristica dipendente in buona parte
dalle condizioni di gestione del suolo e delle acque;
Visto il decreto legislativo 31 marzo 1998, n. 112, recante
conferimento di funzioni e compiti amministrativi dello Stato alle
regioni e agli enti locali, in attuazione del capo I della citata
legge n. 59 del 1996;
Visto il decreto legislativo 30 luglio 1999, n. 300, che riforma
l'organizzazione del Governo e definisce le attribuzioni del
Ministero per le politiche agricole e forestali;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 28 marzo 2000, n.
450, concernente il regolamento di organizzazione del Ministero delle
politiche agricole e forestali;
Visto il decreto ministeriale 15 marzo 2002, n. 31305/1100 che
individua gli uffici di livello dirigenziale non generali del
Ministero delle politiche agricole e forestali e definisce i relativi
compiti;
Visto in particolare l'art. 2, comma 5, del predetto decreto, che
nell'ambito del Dipartimento della qualità dei prodotti
agroalimentari e dei servizi - Direzione generale per le politiche
strutturali e lo sviluppo rurale, istituisce l'Ufficio POSR VII
conferendogli specifiche attribuzioni tra cui la ricostituzione
dell'Osservatorio nazionale pedologico;
Visto il decreto del Ministro delle politiche agricole e
forestali n. 10052 del 25 marzo 2003 con il quale è stato
ricostituito il Comitato consultivo tecnico scientifico per
l'Osservatorio nazionale pedologico e per la qualità del suolo
agricolo e forestale, con compiti di studio e consulenza e
proposizione di soluzioni operative per preservare, recuperare ed
accrescere la produttività quantitativa e qualitativa dei suoli;
Considerato che tra le linee di attività del predetto comitato
è prevista anche la standardizzazione dei metodi di analisi del
suolo;
Vista la convenzione delle Nazioni unite per la lotta contro la
desertificazione negoziata nel 1994 in seguito alle raccomandazioni
della Conferenza delle Nazioni unite tenuta a Rio de Janeiro nel
1992, convenzione che, ratificata dall'Italia con legge 4 giugno
1997, n. 170, riflettendo il capitolo 12 dell'Agenda 21 dedica una
diffusa e particolare attenzione alle problematiche di conoscenza,
difesa e salvaguardia del suolo e delle acque;
Visto il regolamento (CE) 1257/1999 del Consiglio così come
modificato dal regolamento (CE) 1783/2003 sul sostegno comunitario
allo sviluppo rurale sostenibile che, in particolare con le misure
agroambientali, è inteso a promuovere forme di conduzione dei
terreni agricoli compatibili con la tutela e con il miglioramento
delle diverse componenti ambientali;
Visti i decreti ministeriali 11 maggio 1992 e 13 settembre 1999,
con i quali sono stati approvati, riapprovati e resi ufficiali i
metodi di analisi chimica del suolo;
Visto il decreto ministeriale 10 agosto 1997 con il quale sono
stati approvati e resi ufficiali i metodi di analisi fisica del
suolo;
Visto il decreto ministeriale 23 marzo 2000 di approvazione dei
metodi ufficiali di analisi delle acque per uso agricolo e
zootecnico;
Visto il decreto ministeriale 8 luglio 2002 di approvazione dei
metodi ufficiali di analisi microbiologica del suolo;
Vista la direttiva 2001/18/CE del Parlamento europeo e del
Consiglio del 12 marzo 2001 sull'emissione deliberata nell'ambiente
di organismi geneticamente modificati;
Considerato che per una valida politica nazionale di
programmazione dell'uso del suolo e delle acque reflue per uso
irriguo va perseguita quell'approfondita conoscenza delle
caratteristiche biochimiche del suolo che oggi è del tutto carente
nei suoi vari aspetti, e che a tal fine occorre, tra l'altro, meglio
definire i metodi di analisi biochimica del suolo, nonchè acquisire
vantaggiosamente nell'ambito nazionale metodi già definiti in ambito
internazionale da istituzioni di normalizzazione come ISO e CEN;
Considerato che l'Istituto sperimentale per la nutrizione delle
piante, organismo scientifico specialistico del Ministero per le
politiche agricole e forestali, su incarico del Ministero stesso e
nell'ambito delle iniziative del Comitato tecnico scientifico per
l'Osservatorio nazionale pedologico ha definito gli accennati metodi
biochimici di analisi del suolo, giovandosi di diverse collaborazioni
esterne, in particolare delle commissioni biologia del suolo e
fertilità del suolo e nutrizione delle piante della Società
italiana per la scienza del suolo;
Considerato che il comitato tecnico scientifico sopra richiamato,
nella riunione del 17 novembre 2003, ha espresso parere positivo sui
medesimi metodi;
Ritenuto opportuno approvare e rendere ufficiali i predetti
metodi affinchè ne venga consentita la più diffusa utilizzazione
nel territorio nazionale;
Decreta:
Articolo unico
Al fine di disporre di metodi di conoscenza standardizzati per la
definizione delle caratteristiche biochimiche del suolo, utilizzabili
per gli scopi indicati nelle premesse, sono approvati e resi
ufficiali i metodi di analisi biochimica del suolo di cui
all'allegato al presente decreto, che ne costituisce parte
integrante.
Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 23 febbraio 2004
Il Ministro: Alemanno

Allegato

Metodi I.1.

DETERMINAZIONE DELLA BIOMASSA MICROBICA DEL SUOLO PER FUMIGAZIONE

1. Oggetto

Il presente documento fissa i metodi per la determinazione della
biomassa microbica del suolo.

Metodo I.1.1.

Fumigazione con cloroformio

1. Principio
I metodi che prevedono la fumigazione del terreno con cloroformio
si basano sul fatto che i vapori del fumigante provocano la lisi,
quindi la morte, delle cellule microbiche con il conseguente rilascio
di materiale citoplasmatico.

2. Reattivi
2.1. Cloroformio per cromatografia, cioè stabilizzato con amilene
(2-amino-butene);
2.2. grasso al silicone;
2.3. carta bibula.

3. Apparecchiatura
3.1. Camera termostatabile;
3.2. cappa chimica aspirante;
3.3. pompa rotante da vuoto;
3.4. apparecchiatura per la stima della capacità di campo;
3.5. essiccatore da vuoto;
3.6. beakers in vetro da 100 mL;
3.7. palline antiebollizione.

4. Procedimento
4.1. Purificazione del cloroformio stabilizzato con etanolo
Occorre lavorare sotto una cappa aspirante ben funzionante ed
avere 2 bottiglie Pirex con tappo a vite da i litro. Si introducono
500 mL di CHCl(base 3) in una bottiglia e si aggiungono 25 mL di
H(base 2)SO(base 4) concentrato (96%). Si tappa e agita energicamente
per 2-3 minuti; si versa in un imbuto separatore e si attende per
qualche secondo la separazione della fase CHCl(base 3) (superiore)
dall'acido solforico; quindi si versa il CHCl(base 3) nell'altra
bottiglia e si scarta l'acido solforico.
Impiegando ogni volta H(base 2)SO(base 4) nuovo, si ripete 3 volte
il lavaggio del cloroformio. Dopo l'ultima eliminazione dell'acido
solforico, si trasferisce il CHCl(base 3) in un beaker di vetro da 2
litri e si aggiunge circa 1 litro di acqua di rubinetto; quindi si
mescola bene con una bacchetta di vetro, si attende la separazione
delle fasi e si scarta l'acqua. Si ripete 3-4 volte cambiando ogni
volta l'acqua. Quindi si distilla il CHCl(base 3) così lavato,
avendo cura che la temperatura non superi mai i 66 gradi C. Infine si
raccoglie il distillato in bottiglia di vetro scura, si aggiungono 10
g di K(base 2)CO(base 3) anidro e si conserva in frigo. A questo
punto il CHCl(base 3) può essere usato per fumigare il terreno se
appare perfettamente limpido.

4.2. Fumigazione
La fumigazione con cloroformio consiste nel mantenere il campione
di suolo in una atmosfera di cloroformio per 20-24 ore, al buio ed a
25 gradi C. Si introduce in un ampio essiccatore un beaker di vetro
con 30-40 g di ogni campione di suolo fresco aggiustato al 50% della
capacità di ritenzione idrica. Non occorre siglare direttamente i
beaker con pennarelli poichè il CHCl(base 3) scioglie la scrittura,
ma piuttosto è bene introdurre in ogni beaker un pezzetto di carta
bibula siglato a matita. Poggiare quindi tutti i beaker con i suoli
sulla piastra di porcellana forata dell'essiccatore (circa 30 cm di
diametro), sul cui fondo sia stato già messo un beaker contenente
circa 50 mL di CHCl(base 3) per cromatografia, cioè stabilizzato con
2-amino-butene e qualche pallina antiebollizione. Si può anche
utilizzare cloroformio stabilizzato con etanolo, purchè l'alcool
venga previamente eliminato. Sul fondo e ai lati dell'essiccatore è
bene sistemare anche qualche striscia di carta bibula imbevuta di
acqua in modo da evitare l'abbassamento dell'umidità dei suoli
durante la fumigazione. Quindi azionare la pompa rotante da vuoto per
creare un'atmosfera di CHCl(base 3) all'interno dell'essiccatore. Una
volta che si formano numerose bollicine nel CHCl(base 3), si lascia
funzionare la pompa ancora per un minuto. Quindi, chiuso
l'essiccatore, si incuba per 20-24 ore al buio e a 25 gradi C. Dopo
tale lasso di tempo il CHCl(base 3) deve essere completamente rimosso
dai pori del terreno. Per questo occorre aprire l'essiccatore,
rimuovere il beaker con il CHCl(base 3) (se la fumigazione è stata
condotta bene il livello del CHCl(base 3) dopo le 24 ore si è
notevolmente abbassato), riporre i suoli fumigati dentro
l'essiccatore; quindi, sempre con la pompa da vuoto, si effettuano 8
successive evacuazioni di 2 minuti ciascuna, intercalate da
reimmissioni di aria per 30 secondi. Il cloroformio deve essere
previamente purificato dalle sostanze stabilizzanti (di solito
etanolo) con cui le ditte produttrici lo immettono sul mercato,
poichè diversamente i risultati vengono largamente sovrastimati.

Metodo I.1.2.

Determinazione del contenuto di carbonio della biomassa microbica
(Bc) col metodo Fumigazione-Incubazione (FI)

1. Principio
Nel metodo della Fumigazione-Incubazione (FI), i residui delle
cellule uccise dal cloroformio vengono mineralizzati a CO(base 2) e
NH(base 4 elevato +), durante un'incubazione di 10 giorni a 25 gradi
C, dai microrganismi sopravvissuti alla fumigazione od inoculati nel
terreno dopo l'eliminazione del cloroformio. Come controllo si usa il
terreno non fumigato con determinazione di CO(base 2) e NH (base 4
elevato +) prodotti durante un' incubazione alle stesse condizioni
sopra riportate. Il limite maggiore di questo metodo è la scelta del
controllo e del relativo periodo d'incubazione. Non è possibile,
comunque, applicare il metodo FI nel caso di terreni acidi, sommersi
o di recente ammendati con substrato organico fresco. La dimensione
del flusso di decomposizione può essere messa in relazione diretta
col contenuto in carbonio della biomassa del suolo all'inizio della
fumigazione tramite l'equazione

Bc = Fc/Kc

dove Bc è il contenuto di carbonio della biomassa microbica in
microg g(elevato -1) suolo secco, Fc è la quantità di C prodotta
come CO(base 2) durante l'incubazione del suolo fumigato sottratte
della quantità derivante dal suolo non fumigato (controllo) e
incubato alle stesse condizioni del precedente, Kc (in genere è
uguale a 0,45) è la frazione di carbonio proveniente dalla biomassa
uccisa che viene mineralizzata a CO(base 2) durante l'incubazione in
condizioni standard.

2. Reattivi
2.1. Soluzione di indicatore acido-base: sciogliere 100 mg di
fenolftaleina in 100 mL di etanolo all'80%;
2.2. soluzione di bario cloruro 0,75 N: introdurre 91,61 g di
BaCl(base 2)·2H(base 2)O in un pallone da 1000 mL, sciogliere con
circa 700 mL di H(base 2)O deionizzata e quindi portare a volume con
acqua;
2.3. soluzione di idrossido di sodio 1N: diluire una soluzione
volumetrica contenente 1 mole di NaOH fino a 1000 mL con acqua
deionizzata;
2.4. soluzione titolante di acido cloridrico 0,1N: diluire una
soluzione volumetrica contenente 0,1 moli di HC1 fino a 1000 mL con
acqua deionizzata.

3. Apparecchiatura
3.1. Camera termostatabile;
3.2. titolatore automatico (se possibile);
3.3. fiasche di vetro ermetiche di circa 1000 mL di capacità;
3.4. buretta a caricamento automatico (divisione 1/20 mL);
3.5. beakers da 250 mL, ancorette magnetiche, piastra agitante,
tavolo elevatore.

4. Procedimento
Sia il beaker contenente il suolo fumigato che quello con il suolo
di controllo vengono messi singolarmente in fiasche da 1000 mL a
chiusura ermetica, assieme a 2 beakers più piccoli, uno di plastica
contenente 4 mL di NaOH 1N (soluzione che assorbirà la CO(base 2)) e
l'altro di vetro con 4 mL di acqua (per impedire l'abbassamento di
umidità durante l'incubazione). Si chiudono tutte le fiasche e si
incubano in una camera termostata a 25 gradi C. Inoltre si incubano
anche 2 fiasche che non contengano il suolo (prova in bianco). Esse
serviranno a valutare la CO(base 2) non prodotta dal suolo ed
assorbita dalla soda durante le varie fasi della titolazione. Dopo 10
giorni di incubazione si riaprono le fiasche e si aggiungono 8 mL di
BaCl(base 2)·2H(base 2)O 0,75N nei beakers contenenti la soda (si
forma un precipitato lattiginoso di BaCO(base 3)); quindi si tappano
immediatamente con parafilm. È necessario, in ogni fase della
determinazione, non respirare al di sopra dei beaker. Quindi si
procede alla titolazione della soda residua con HC1 0,1N. Se si
dispone di un titolatore automatico, il pH di fine titolazione è
8,62. Altrimenti si devono aggiungere 2-3 gocce dell'indicatore
acido-base (dopo l'aggiunta dell'indicatore, la soluzione basica
diventa di colore rosa ed il punto di viraggio è dato dalla
scomparsa del colore rosa, cioè la soluzione ridiventa lattiginosa).

5. Espressione dei risultati
Poichè la produzione di CO(base 2) è stata evidenziata per
assorbimento su NaOH secondo la reazione

CO(base 2)+2OH(elevato a -) = CO(base 3 elevato a 2-)+H(base 2)O

la qualità di C della CO(base 2) viene così calcolata:
microg CO(base 2)-C g(elevato -1) suolo umido = (b-a) 0,1 6,
1000/peso suolo umido (g),
dove:

b è il volume (mL) di HCl 0,1N usato per titolare il bianco; a il
volume (mL) di HC1 0,1N per titolare le prove col suolo; 0,1 la
normalità del titolante; 6 il peso equivalente del carbonio (peso
atomico diviso il numero di ossidrili con cui reagisce la CO(base
2)); 1000 il fattore di conversione da mg a microg.
Il contenuto in carbonio della biomassa microbica (Bc) viene
calcolato come riportato in precedenza (Bc = Fc / Kc). Naturalmente
occorre considerare la quantità di suolo secco.

6. Note
Il problema maggiore del metodo FI è la scelta del controllo.
Esso è indispensabile poichè non tutta la CO(base 2) evoluta dal
suolo fumigato durante l'incubazione deriva dalla decomposizione dei
microorganismi lisati dal CHCl(base 3) una aliquota di essa è
infatti ascrivibile alla respirazione basale (degradazione di
substrati organici extracellulari).
Il metodo FI per la misura di Bc non è applicabile ai suoli
acidi, a quelli sommersi e a quelli che abbiano ricevuto di recente
un substrato organico fresco, in quanto si è visto che in tali
condizioni molto spesso la CO(base 2) prodotta dal controllo risulta
essere superiore quantitativamente rispetto alla CO(base 2) prodotta
dal suolo fumigato, dando così origine a valori di Bc negativi. Si
consiglia, prima della fumigazione già descritta, di pre-incubare a
temperatura ambiente i suoli per 7 giorni in presenza di alcali
(NaOH+CaO), affinchè si esaurisca la CO(base 2) derivante dalla
respirazione di frammenti di radice ancora viventi o da processi
abiotici nel caso di suoli calcarei.

Metodo I.1.3.

Determinazione dell'azoto della biomassa microbica (BN) col metodo
Fumigazione-Incubazione (FI)

1. Principio
Il metodo si basa sulla mineralizzazione ad azoto ammoniacale
delle forme organiche azotate contenute nelle cellule microbiche
lisate dal cloroformio, ad opera dei microrganismi sopravvissuti alla
fumigazione od in oculati nel suolo fumigato. Si può quindi
determinare il contenuto in azoto della biomassa microbica tramite la
relazione

BN = FN/KN

Dove:

FN è il flusso addizionale di N ammoniacale prodotto durante
l'incubazione che segue la fumigazione con cloroformio; KN è la
frazione di N contenuto nella biomassa uccisa che viene mineralizzata
sotto le particolari condizioni di incubazione usate. Quindi, FN
risulta essere la differenza tra N mineralizzato dal suolo fumigato e
incubato e l'N mineralizzato dal suolo non fumigato (controllo) e
incubato alle stesse condizioni.

2. Reattivi
2.1. magnesio ossido (MgO). Scaldare circa 200 g di MgO "pesante"
in fornace a 600-700 gradi C per 2 ore. Raffreddare il prodotto in un
essiccatore contenente granuli di KOH e conservarlo in una bottiglia
ben tappata;
2.2. soluzione estraente (potassio cloruro 1N). Introdurre 74,56 g
di KC1 in un pallone da 1 L, sciogliere con circa 700 mL di acqua
deionizzata e portare a volume con acqua;
2.3. soluzione di acido borico-indicatore. Sciogliere 20 g di
H(base 3)BO(base 3) puro in circa 700 mL di acqua calda, trasferire
la soluzione raffreddata in un pallone da 1000 mL già contenente 200
mL di etanolo e 20 mL di una miscela di indicatori preparata
sciogliendo 0,3 g di verde bromocresolo e 0,165 g di rosso metile in
500 mL di etanolo. Dopo aver miscelato (a questo punto la soluzione
appare rosa), aggiungere NaOH 0,05 N fino a comparsa del colore verde
pallido. Quindi portare a volume con acqua deionizzata (Keeney e
Nelson, 1982);
2.4. soluzione titolante di acido solforico 0,005 N. Preparare
diluendo fino a 2 L una soluzione volumetrica contenente 0,005 moli
di H(base 2)SO(base 4).

3. Apparecchiatura
3.1. Agitatore a scuotimento lineare alternato;
3.2. distillatore micro-Kjeldahl;
3.3. titolatore automatico (se possibile);
3.4. spettrofotometro (se possibile);
3.5. contenitori di plastica da 250 mL con tappo avvitabile;
3.6. imbuti, filtri di carta Whatman 42 e contenitori di plastica
da 1000 mL con tappo.

4. Procedimento
I campioni di suolo, sia fumigati che non, ed incubati per 10
giorni a 25 gradi C, utilizzati per la determinazione di Bc (la
CO(base 2) prodotta durante l'incubazione è stata assorbita dalla
soda, i suoli quindi non sono stati distrutti), vengono estratti
(agitazione per 60 minuti a velocità media e a temperatura ambiente)
con una soluzione di KCl 1N nel rapporto suolo (g): estraente (mL)
1:4. Il suolo (30 g), fumigato e non, viene trasferito dai beaker in
contenitori da 250 mL e trattato con 120 mL di KCl 1N, quindi i
contenitori vengono tappati ed agitati. Dopo estrazione le
sospensioni di suolo vengono filtrate per mezzo di imbuti contenenti
dischi di carta Whatman 42, ed il filtrato viene raccolto in
contenitori tappabili di plastica.
Il contenuto in azoto ammoniacale del filtrato può essere
determinato mediante diversi metodi: i) distillazione dell'estratto
in corrente di vapore, in presenza di MgO, con un apparato
micro-Kjeldahl e successive distillazione e titolazione; 2) con una
delle reazioni colorimetriche tipiche dell'ammonio (indofenolo,
Nessler, ecc.).

5. Espressione dei risultati
Il contenuto di azoto ammoniacale in ogni suolo, fumigato e non,
viene calcolato come segue:

microg NH(base 4 elevato a +)-N g(elevato a -1) suolo umido = V ·
0,005 · 14 · 1000/b

dove:

V è il volume (mL) di H(base 2)SO(base 4) usato per la
titolazione, 0,005 è la normalità del titolante, 14 il peso
equivalente dell'azoto, 1000 il fattore di conversione da mg a
microg, b i grammi di suolo umido corrispondenti al volume di
estratto in base al rapporto di estrazione usato. Così, se sono
stati usati 25 mL di estratto, in base al rapporto di estrazione 1:4
(g:mL), b sarà uguale a 6,25.
Il flusso di mineralizzazione dell'azoto dopo fumigazione, FN,
sarà uguale alla differenza tra NH(base 4 elevato a +)-N scambiabile
presente nel fumigato dopo 10 giorni d'incubazione meno il
corrispettivo accumulato nel non fumigato (controllo). Assumendo KN =
0,54, ne consegue la relazione:

BN = FN/0,54

Analogamente a Bc, i dati così ottenuti devono essere riportati a
g(elevato -1) suolo secco.

Metodo I.1.4.

Determinazione di BN e Bc col metodo Fumigazione-Estrazione (FE)

1. Principio
Il metodo della fumigazione-estrazione si basa sul fatto che i
composti cellulari rilasciati in seguito alla lisi cellulare, indotta
dalla fumigazione, possono essere estratti da una soluzione salma. Si
è accertato che esiste una stretta correlazione fra il contenuto in
C della biomassa misurato col metodo FI (Bo) e il contenuto di C
estratto con K(base 2)SO(base 4) 0,5 M dopo fumigazione, secondo
l'equazione:

Bc = 2,64 · Ec

dove:

Ec è la differenza fra il C organico estratto dal suolo fumigato
e quello estratto dal suolo non fumigato (controllo).
Inoltre è stata osservata una correlazione lineare molto
significativa tra l'azoto totale estratto con una soluzione salma,
dopo fumigazione con CHCl(base 3), e l'FN valutato secondo il metodo
FI. Da questa correlazione si è potuta ricavare la relazione

BN = 2,22 · EN

dove BN è il contenuto in N della biomassa microbica; EN è
l'azoto totale estratto con K(base 2)SO(base 4) 0.5 M dal suolo
fumigato meno quello estratto dal suolo non fumigato (controllo);
2,22 è un fattore di proporzionalità empiricamente determinato e
basato su una stima di BN ottenuta ponendo KN uguale a 0,57.
Assumendo, invece, un valore di KN di 0,68 il fattore di
proporzionalità diventa 1,85.

2. Reattivi
2.1. Soluzione estraente (dipotassio solfato 0,5 M). Introdurre
87,13 g di K(base 2)SO(base 4) in un pallone da 1000 mL, sciogliere
con circa 700 mL di acqua deionizzata e portare a volume con acqua;
2.2. acido solforico al 3% e al 96%;
2.3. soluzione di rame solfato 0,29 M. Introdurre 4,63 g di
CuSO(base 4) in un pallone da 1000 mL, sciogliere con circa 70 mL di
acqua deionizzata e portare a volume con acqua;
2.4. sodio idrossido 9 N. Introdurre 360 g di NaOH a scaglie in un
beaker di plastica da 1000 mL, sciogliere con circa 700 mL di acqua
deionizzata (porre il beaker in acqua fredda per facilitare il
raffreddamento della soluzione) e portare a volume con acqua;
2.5. soluzione di acido borico-indicatore. Preparare come in
1.3.3.3;
2.6. soluzione titolante di acido solforico 0,005 N. Preparare
come in 1.3.3.3;
2.7. acido fosforico 85%;
2.8. ossido di mercurio (HgO);
2.9. dicromato di potassio 0.4 N. Sciogliere 19,613 g di K2Cr2O7
(essiccato a 105 gradi C) in 200 mL di acqua deionizzata e portare a
1 litro con acqua. Conservare a temperatura ambiente; il titolo è
molto stabile;
2.10. soluzione titolante di sale di Mohr 33,3 mN. In un pallone
da 1000 mL introdurre 13,06 g di Fe[NH(base 4](base 2)SO(base
4)·6H(base 2)O e 50 mL di H(base 2)SO(base 4) 96%; dopo che il sale
è sciolto, portare a volume con acqua deionizzata. A causa della
lenta ossidazione dello ione ferroso a ferrico, tale soluzione deve
essere titolata al momento dell'uso con dicromato;
2.11. soluzione indicatore redox (complesso
1,10-fenantrolina-FeSO(base 4) 25 mM). Sciogliere 1,485 g di
1,10-fenantrolina monoidrata e 0,695 g di FeSO(base 4)·7H(base 2)O in
100 mL di acqua deionizzata.

3. Apparecchiatura
3.1. Agitatore a scuotimento lineare alternato;
3.2. titolatore automatico (se possibile);
3.3. bagnomaria con agitazione;
3.4. distillatore micro-Kjeldahl;
3.5. contenitori di plastica da 250 mL, palloni in vetro da 100
mL, parafilm, carta stagnola, palline antiebollizione di vetro;
3.6. imbuti, filtri di carta Whatman 42 e contenitori da 100 mL di
plastica con tappo.

4. Procedimento
I campioni di suolo, fumigati e non, preparati come per il metodo
FI, non devono essere incubati ma immediatamente estratti con K(base
2)SO(base 4) 0,5 M nel rapporto suolo (g):estraente (mL) 1:4 per 30
minuti a temperatura ambiente ed agitazione media, e quindi filtrati
con carta Whatman 42. Gli estratti così ottenuti possono essere
analizzati per il contenuto di C organico, N totale e di altri
elementi. Da notare che anche col metodo FE è consigliato di portare
i suoli al 50% della capacità di ritenzione idrica prima della
fumigazione.

4.1. Determinazione del contenuto in N della biomassa microbica

Per determinare il contenuto in N della biomassa microbica occorre
analizzare il contenuto in N totale degli estratti. Operando sotto
cappa aspirante, 20 mL di estratto vengono introdotti in tubi da
digestione da 75 mL (è indispensabile mantenere tali tubi
nell'idoneo supporto metallico per evitare un riscaldamento
disomogeneo durante la successiva fase di digestione); quindi si
aggiungono per ogni tubo 4 mL di H(base 2)SO(base 4) al 96%, 0,5 mL
di CuSO(base 4) 0,29 M e qualche pallina antiebollizione di vetro.
Quindi i tubi vengono trasferiti, tramite supporto metallico, in un
digestore monoblocco di alluminio e, al fine di eliminare l'eccesso
di acqua, condurre due pre-digestioni, una di 2 ore a 120 gradi C e
l'altra di un'ora a 180 gradi C. Quindi si opera una digestione
finale a 360 gradi C per 3 ore. Il numero e la durata delle
pre-digestioni può variare in funzione del tipo di digestore usato.
Naturalmente durante la digestione a caldo, i tubi devono essere
collegati con un sistema di aspirazione per la condensazione dei fumi
acidi. Se si dispone di un titolatore automatico, si digerisce anche
un bianco che differisce dai campioni solo poichè l'estratto di
suolo è sostituito con un volume uguale di soluzione estraente (20
mL K(base 2)SO(base 4) 0,5 M). Finita la digestione, si lascia
raffreddare, si aggiungono ad ogni tubo 15 mL di acqua deionizzata,
si scuotono i tubi con il Vortex per staccare l'eventuale sedimento
minerale attaccato sul fondo, e quindi si porta a volume (75 mL) con
acqua deionizzata. Si tappano i tubi con Parafilm e si miscela
energicamente. Quindi, con un apparato micro-Kjeldahl distillare 25
mL del surnatante limpido dei 75 mL contenuti in ogni tubo,
aggiungendo 8 mL di NaOH 9 N. Naturalmente, per non far volatilizzare
NH3, la soda deve essere aggiunta attraverso l'imbuto raccoglitore
dopo che il pallone di distillazione è stato ben avvitato. Per gli
accorgimenti durante la distillazione, la raccolta del distillato e
la titolazione, seguire la procedura adottata col metodo FI per la
determinazione dell'azoto ammoniacale. Al solito, disponendo di un
titolatore automatico, il punto di fine titolazione sarà il pH della
soluzione di raccolta del distillato del bianco (di solito circa
5,4).
4.2. Espressione dei risultati
Il contenuto in N totale estratto da ogni suolo, prima e dopo
fumigazione, sara':

microg N g(elevato -1) suolo umido = V · 0,005 · 14 · 3 · 1000/5

dove:

V è il volume (in mL) di H(base 2)SO(base 4) usato per la
titolazione, 0,005 la normalità del titolante, 14 il peso
equivalente dell'azoto, 3 rapporta i 25 mL distillati ai 75 totali
del tubo da digestione, 1000 converte i mg a microg e 5 sono i grammi
di suolo umido corrispondenti a 20 mL di estratto usati per la
digestione, in base al rapporto di estrazione usato.
Il flusso addizionale di N totale estraibile indotto dalla
fumigazione, EN, è uguale alla differenza in microg N g(elevato -1)
suolo tra suolo fumigato e non (controllo).

4.3. Determinazione del contenuto in C della biomassa microbica

Al fine di stimare il contenuto in C della biomassa microbica
occorre determinare il contenuto in C organico degli estratti di
suolo, sia fumigato che non fumigato. Tale determinazione si effettua
per ossidazione in ambiente acido a caldo. Si introducono 8 mL di
estratto, 2 mL di K2Cr2O7 0,4 N, 70 mg di HgO (evita la formazione di
composti in grado di interferire col tipo di determinazione), 10 mL
H(base 2)SO(base 4) al 96% e 5 mL H3PO4 all'85% in palloncini da 100
mL. Si prepara anche un bianco che invece dell'estratto di suolo
contiene la soluzione estraente (8 mL K(base 2)SO(base 4) 0,5 M).
Quindi si tappa con carta stagnola e si mantengono i palloni a 160
gradi C per 30 minuti, preferibilmente sotto blanda agitazione. Dopo
raffreddamento si porta a volume con acqua deionizzata, si agita
finchè la soluzione diventa omogenea, e si titola il dicromato che
non ha reagito con Fe[NH(base 4](base 2)SO(base 4)·6H(base 2)O (sale
di Mohr) 33,3 mN in ambiente acido, usando come indicatore redox il
complesso 1,10-fenantrolina-FeSO(base 4) 25 mM. Più precisamente, in
un beaker da 250 mL si introducono 25 mL dei 100 mL di ogni pallone,
50 mL di H(base 2)SO(base 4) al 3% e 2-3 gocce di indicatore. Quindi,
sotto agitazione si aggiunge goccia a goccia il titolante. Il punto
di fine titolazione è dato dal viraggio della soluzione da arancione
a rosa-rosso (bastano poche gocce affinchè la miscela di
titolazione, dopo aver raggiunto una colorazione incolore-azzurro
pallido, passi ad una rosa-rosso).

4.4. Espressione dei risultati

Poichè il C organico viene ossidato dal dicromato secondo la
reazione

2Cr(base 2)O(base 7 elevato a 2-)+3C+16H(elevato a +) =
4Cr(elevato a 3+)+3CO(base 2)+8H(base 2)O

il contenuto in C organico di ogni estratto si ricava dalla seguente
relazione:

microg C g(elevato -1) suolo umido = (b - a)·0,0333·3·4·1000/2

dove:

b è il volume di titolante (mL) necessario a titolare il bianco;
a il volume di titolante (mL) usato per il campione; 0,0333 la
normalità del sale di Mohr; 3 il peso equivalente del C; 4 rapporta
i 25 mL titolati ai 100 totali nel pallone; 1000 converte i mg a
microg; 2 sono i grammi di suolo corrispondenti a 8 mL di estratto,
in base al rapporto di estrazione usato.
Il flusso addizionale di C organico totale estraibile causato
dalla fumigazione, Ec, è uguale alla differenza in microg C
g(elevato -1) suolo tra suolo fumigato e non (controllo).
4.5. Determinazione del contenuto di zolfo della biomassa
microbica (Bs) con il metodo Fumigazione-Estrazione (FE)
È possibile estrarre i composti organici dello zolfo dal terreno,
fumigato e non, con NaHCO3 0,1M o CaCl(base 2) 10 mM nel rapporto
suolo (g)/estraente (mL) 1:5.
4.6. Espressione dei risultati
Il valore di Bs può essere stimato, se si usa il NaHCO3 come
estraente, dalla seguente relazione:

Bs = Fs/Ks

dove Bs sono i microg di S della biomassa g(elevato -1) suolo, Fs
sono i microg di S totale estratti dal suolo fumigato sottratti di
quelli estratti dal suolo non fumigato (controllo) e Ks è la
proporzione di S-biomassa aggiunto, rilasciato con la fumigazione e
quindi estratto. Usando come estraente il CaCl(base 2), il valore di
Ks è 0,412.
Analogamente alla determinazione di Bc e BN, la stima del
contenuto di Bs si riduce alla valutazione del flusso addizionale di
S totale causato dalla fumigazione.
4.7. Determinazione del fosforo contenuto nella biomassa microbica
(Bp) col metodo Fumigazione-Estrazione (FE)
Anche in questo caso si procede all'estrazione del terreno
fumigato e non. Si determina quindi il flusso addizionale (Fp) di
fosforo inorganico (Pi) causato dalla fumigazione con CHCl(base 3)
per 24 ore. Il valore di Fp è dato dal Pi rilasciato dal suolo
fumigato sottratto del Pi rilasciato dal suolo non fumigato.
Si predispongono 3 coppie di aliquote di 10 grammi di suolo; si
fumiga la prima coppia per 24 ore a 25 gradi C, e si incubano
aerobicamente a 25 gradi C per 24 ore, la seconda e terza coppia.
Quindi estrarre le prime due coppie di suoli con 200 mL di NaHCO3 0,5
M (pH 8,5) e la terza con 200 mL della stessa soluzione addizionata
di 250 microg di Pi.
4.8. Espressione dei risultati
Il contenuto in P della biomassa microbica si ricava dalla
relazione:

Bp = microg Pi g(elevato -1) suolo = [25·(B-A)]/[0,4·(c-a)]

dove a sono i microg Pi g(elevato -1) suolo estratti dal suolo non
fumigato, b i microg Pi g(elevato -1) suolo estratti dal suolo
fumigato (seconda e prima coppia di suoli, rispettivamente), c sono i
microg Pi g(elevato -1) suolo estratti dalla terza coppia di suoli.
Il contenuto in Pi di ogni estratto di suolo può essere
determinato colorimetricamente dopo aggiunta di ammonio molibdato e
acido ascorbico.

Metodo I.2.

DETERMINAZIONE DELL'ATP ESTRATTO CON ACIDO FOSFORICO

1. Oggetto
Il presente documento fissa un mtodo per la determinazione
dell'ATP estratto dal suolo.

2. Principio
Il contenuto di ATP (adenosina 5'-trifosfato) nel suolo può
essere utilizzato come un indice della biomassa microbica o come
indice della attività microbiologica presente. Se il campione di
suolo fresco viene analizzato subito dopo il prelievo, il contenuto
di ATP rappresenta un indice dell'attività microbica. Se invece il
campione di suolo fresco viene preincubato per 5-7 giorni a 25 gradi
C ad umidità costante prima di essere analizzato, il contenuto di
ATP rappresenta il contenuto di biomassa microbica.

3. Reattivi
3.1. Estraente: Soluzione A (Es A) - 0.67 M H3PO4, 2M urea, 20%
(in volume) DMSO, 0.02% (in peso) adenosina, 20 mM EDTA (sale
bisodico); Soluzione B (Es B) - Differisce dalla soluzione A poichè
viene aggiunto, a quest'ultima, ATP (in quantità tale da raggiungere
un contenuto di 5-10 ng nella cuvetta di misurazione dell'ATP) come
"spike" (standard interno).
3.2. Tampone: Tris 0.2 M, EDTA 4mM ed acetato di Mg 15 mM portato
a pH 10.2 - 10.8 con NaOH 1 M; il pH finale del tampone dipende dalla
quantità di soluzione estraente impiegata per la determinazione
dell'ATP dovendo il valore di pH della soluzione impiegata nel
luminometro oscillare tra 7.3 e 7.8.
3.3. Sistema enzimatico luciferina/luciferasi (Monitor Reagent,
BioOrbit, Turku Finland).
3.4. ATP standard interno (ATP Standard, BioOrbit, Turku Finland).

4. Apparecchiatura
4.1. Luminometro e cuvette;
4.2. beakers (50 mL);
4.3. sistema di agitazione a temperatura determinata;
4.4. ultrasonicatore con frequenza massima di 20 KHz;
4.5. bagno di ghiaccio.

5. Procedimento
5.1. Estrazione dell'ATP dal suolo
I campioni di suolo vengono setacciati immediatamente dopo il
prelievo e pesati (1-2 g) nei beakers di analisi. Si aggiunge
l'estraente (1:20, rapporto suolo: estraente) ed il miscuglio viene
omogeneizzato su agitatore magnetico e sonicato per 2.5 minuti al 60%
della frequenza massima esercitata dalla sonda di medio formato di un
sonicatore. Il beaker durante tali operazioni è tenuto in bagno di
ghiaccio. Dopo averlo chiuso con parafilm, il beaker, contenente la
soluzione del suolo, viene posto in bagno a 4 gradi C ed agitato a
150 colpi min(elevato alla -1) per 30 minuti; quindi, la mistura
viene filtrata su filtro a pieghe (Whatman 42). L'estratto (da 0.01 a
0.15 mL) viene diluito a 0.8 mL con tampone Tris-EDTA-Mg acetato sino
ad avere un pH finale di 7.3 - 7.8. Lo stesso procedimento viene
seguito impiegando lo stesso suolo ma con la soluzione estraente B
per quantificare l'efficienza di estrazione.

5.2. Determinazione dell'ATP

Una aliquota (0.2 mL) di Monitor Reagent viene aggiunta
all'estratto tamponato (0.8 mL), fresco o conservato a -15 gradi C,
in una provetta di polietilene e quindi il tutto leggermente agitato.
Si consiglia di effettuare la lettura su tre ripetizioni per ciascun
estratto tamponato di suolo e la luce emessa da ogni campione viene
misurata per mezzo di un Luminometro 1250 (LKB-WALLAC, Finland) con
letture integrate, da tre a sei, (periodo di integrazione 10
secondi). Dopo ciascuna determinazione si aggiunge alla stessa
provetta una aliquota nota di ATP (p. es.: 50.7 ng) quale standard
interno per correggere l'influenza dell'estratto sull'emissione di
luce.

6. Espressione dei risultati
Il contenuto di ATP del terreno viene prima quantificato
attraverso il procedimento dello standard interno e poi, considerando
l'efficienza di estrazione, ricalcolato secondo quest'ultima
grandezza.

Per cui

b - a
ATP = ----- x d
c

dove:

a = valore del bianco (estratto tamponato);
b = valore del campione (dopo l'aggiunta del monitor reagent);
c = valore misurato dopo l'aggiunta dello standard interno
(diminuito del valore b); d= quantità di ATP standard aggiunto.

Efficienza di estrazione dell'ATP = (ATP con Es B) - (ATP con Es A)
-------------------------------
ATP aggiunto in Es B

Metodi II.1.

DETERMINAZIONE DELLA RESPIRAZIONE DEL SUOLO

1. Oggetto

Il presente documento fissa i metodi per la determinazione della
respirazione del suolo

Metodo II.1.1.

Determinazione della CO(base 2) sviluppata dalla biomassa
microbica del suolo per metodo titrimetrico

1. Principio
Durante l'incubazione del suolo all'interno di un sistema chiuso,
la CO(base 2) evoluta viene intrappolata da una soluzione di NaOH e
successivamente titolata con HC1.

2. Reattivi
2.1. H(base 2)O distillata (CO(base 2)-free);
2.2. NaOH 1 N;
2.3. HCl 0.1 N;
2.4. BaCl(base 2) 0.75 N;
2.5. indicatore fenolftaleina (sol. all'1% in etanolo 95% v/v) se
non si dispone di un titolatore automatico.

3. Apparecchiatura
3.1.Recipienti in vetro con tappo a vite a chiusura ermetica da i
L;
3.2.termostato settato a 25 gradi C;
3.3.titolatore automatico e materiale di corredo o buretta in
vetro con rubinetto per titolazione;
3.4. beakers in vetro da 50 mL;
3.5.recipienti in plastica da 50 mL circa.

4. Procedimento
Si pesano 20 g di suolo setacciato (al 55% WHC) in un beaker e si
posiziona il beaker sul fondo della fiasca. Si pipettano 4 mL di NaOH
1 N nel recipiente di plastica che viene riposto nell'interno della
fiasca adiacente al beaker con il suolo. Si chiude immediatamente il
tappo a vite e si accerta che la fiasca sia chiusa ermeticamente.
Si preparano 3-5 controlli costituiti dalle fiasche chiuse
ermeticamente con all'interno il recipiente con 4 mL di NaOH senza il
beaker contenente il suolo.
Si incubano tutte le fiasche a 25 gradi C per un periodo massimo
di 3 giorni (un periodo più lungo potrebbe creare una condizione di
anaerobiosi).
Al termine dell'incubazione si aprono le fiasche, si preleva il
recipiente con NaOH, si aggiungono 8 mL di BaCl(base 2) 0.75 N e tre
o quattro gocce dell'indicatore fenolftaleina. Si titola il contenuto
del recipiente con HCl 0.1 N fino al viraggio dal colore rosa al
bianco neutro. Se si dispone di un titolatore automatico si imposta
un pH di fine titolazione pari a 8.8. Infatti, a questo valore di pH
la solubilità del BaCO3 equivale a 4,88·10-4; valori di pH minori
porterebbero a solubilizzare quantità apprezzabili di BaCO3 e quindi
una parte dell'HCl consumato sarebbe da ascrivere alla titolazione
del CO32-.

5. Espressione dei risultati
La quantità di C-C02 prodotta è calcolata secondo la seguente
equazione:

mg C-CO(base 2) g s.s.-1 h(elevato -1) = (Vo-V) x M x E
--------------
20 x h inc
dove:

g s.s. = grammi di suolo (peso secco)

Vo = mL di HCl necessari per titolare NaOH del controllo (media
di tutti i controlli)
V = mL di HCl necessari per titolare NaOH del campione
h inc = durata incubazione espressa in ore

M = 1,1 - Molarità del titolante HCl

E = Peso equivalente del carbonio nella CO(base 2). E=6 se i
risultati vengono espressi in termini di C (ad es. mg di C-
CO(base 2)); E=22 se i risultati vengono espressi in termini
di CO(base 2) (ad es. mg di CO(base 2)).

Metodo II.1.2.

Determinazione della respirazione del suolo nel SAPROMAT

1. Principio
Questa stima è basata sulla misura dell'O(base 2) assorbito
durante l'incubazione del suolo in un sistema chiuso. L'O(base 2) è
rilasciato da un sistema elettrochimico.

2. Procedura
L'apparato Sapromat tipo B6 o B12, consiste in un bagno ad acqua a
temperatura regolabile contenente gli strumenti di misura e un
sistema di registrazione dei risultati. Il sistema di misura è
costituito da un recipiente contenente una soluzione (NaOH) che
assorbe la CO(base 2), un sistema che produce O(base 2) e un
misuratore di pressione. I recipienti sono collegati con tubi di
gomma a formare un circuito chiuso per cui i cambiamenti della
pressione atmosferica al di fuori del sistema non influenzano le
misure di assorbimento dell'O(base 2).
L'assorbimento di O(base 2) durante la respirazione del suolo
causa una diminuzione di pressione indicato da un misuratore che
regola la produzione elettrolitica di ossigeno come anche la
visualizzazione e la registrazione dei risultati.

3. Espressione dei risultati
L'assorbimento di O(base 2) viene visualizzato sul display in mg
di O(base 2).

4. Note
Si consiglia di usare 50-100 g di suolo incubati a temperature che
vanno da 20 grafi C a 30 gradi C e al 55% della WHC (Capacità di
ritenzione idrica). L'assorbimento di O(base 2) non viene registrato
nelle prime 2 ore al fine di consentire al sistema di equilibrarsi.
Il rapporto CO(base 2)/O(base 2) della fase gassosa sopra il campione
di suolo deve rimanere costante per tutto il periodo di misurazione.
In questo modo vengono evitate le condizioni di anaerobiosi.

Metodo II.1.3.

Stima della respirazione del suolo con l'apparato WCESTHOFF 1.
Principio
Il metodo si basa sulla determinazione della CO(base 2) con
l'analizzatore Wcesthoff Ultragas 3.

2. Procedimento
I tubi per i campioni sono riempiti con suolo umido e setacciato
(100g al 55% della WHC) e si incuba a 22 gradi C (Anderson and Domsch
1978b). Ad intervalli di 1 ora viene insuffiata aria senza CO(base 2)
attraverso il suolo e la concentrazione di CO(base 2) viene misurata
per 10 minuti.

3. Espressione dei risultati
L'analizzatore di gas Ultragas 3 misura variazioni di
conducibilità elettrolitica (diminuzione) causate dalla reazione
della CO(base 2) con la soluzione acquosa di NaOH presente in un
recipiente all'interno dell'analizzatore. Queste variazioni sono
proporzionali alla concentrazione di CO(base 2) e si possono
registrare i risultati ottenuti.

4. Note
La versione più moderna dell'Ultragas US4-CO(base 2) è
caratterizzata da una alta sensibilità e pertanto è consigliabile
operare a basse concentrazioni di CO(base 2). Concentrazioni anche
inferiori ad 1 ppm di CO(base 2) possono essere facilmente
determinate su di una scala da 0 a 50 ppm.

Metodo II.1.4.

Analisi del gas evoluti dalla biomassa microbica del suolo
mediante la tecnica a infrarossi

1. Principio
Il metodo si basa sulla stima automatica della CO(base 2)
attraverso un analizzatore di gas infrarosso (IRGA). I campioni di
suolo sono insuffiati con aria così che problemi di diffusione e
accumulo di CO(base 2) possono essere evitati.

2. Procedimento
Un sistema di entrata dell'aria realizzato in tubi di PVC (32 mm)
è installato a 12 m da terra (o comunque a i m al di sopra del
tetto) per assicurare un apporto continuo di aria pulita esterna e
con concentrazione stabile. Il sistema è formato da 24 linee di
campionamento, indipendenti le une dalle altre, in modo da poter
variare il flusso in ciascuna da 100 a 1000 mL min(elevato alla -1).
Ogni circuito contiene una pompa per gas a membrana, una bottiglia di
lavaggio per gas da 500 mL con acqua deionizzata acidificata che
funziona da umidificatore e un tubo (25x4cm) di campionamento di
perspex nel quale è posto il campione di suolo. Il tubo è chiuso ai
lati da cuscinetti di polistirene e collegato al sistema da raccordi
in gomma.
Valvole a spillo sono regolate individualmente per impostare lo
stesso flusso sulla linea del campione indipendentemente se sia o no
diretto all'IRGA.

3. Espressione dei risultati
Un flussimetro misura la velocità di flusso del gas e un IRGA
viene usato per misurare le concentrazioni di CO(base 2) (Heinemeyer
et al. 1989). L'intero sistema è computerizzato e un tubo senza
suolo viene usato come controllo. I quantitativi di suolo utilizzati
sono generalmente di 100 g al 55% della WHC e tutto il sistema è
mantenuto a 22 gradi C.

4. Note
La linearità nell'evoluzione di CO(base 2) è assicurata per
quantità di suolo da 5 a 100 g. Si possono usare anche diverse
temperature d'incubazione. Questo sistema risulta essere molto più
sensibile del Sapromat e gode di una buona riproducibilità.

Metodi II.2.

DETERMINAZIONE DEL POTERE MINERALIZZANTE DEL SUOLO

1. Oggetto
Tale documento fissa i metodi per la determinazione del potere
mineralizzante del suolo.

Metodo II.2.1.

Metodo di estrazione con acqua bollente

1. Principio
Questo metodo consente l'estrazione dell'azoto presente nel suolo
e la sua determinazione quantitativa utilizzando la procedura
Kjeldahl.

2. Reattivi
2.1. Acido solforico (H(base 2)SO(base 4)) concentrato;
2.2. miscela di solfato di potassio (K(base 2)SO(base 4)), solfato
di rame (CuSO(base 4)) e selenio (Se) (rapporto p/p 10: 1: 0.1);
2.3. idrossido di sodio (NaOH) 10N;
2.4. acido solforico (H(base 2)SO(base 4)), 0.005N standard;
2.5. soluzione indicatrice di acido borico. Sciogliere 20 g di
acido borico puro (H(base 3)BO(base 3)) in circa 700 mL di acqua
calda e trasferire la soluzione raffreddata in un pallone da i litro
contenente 200 mL di etanolo e 20 mL di indicatore (ottenuto
sciogliendo 0.300 g di verde bromocresolo e 0.165 g di rosso di
metile in 500 mL di etanolo). Dopo aver omogeneizzato accuratamente
si porta a volume aggiungendo lentamente NaOH 0.05 N fino a che,
prendendo 1 mL della soluzione e trattandolo con 1 mL di acqua, non
si riscontri una variazione di colore da rosa a verde pallido.

3. Apparecchiature
3.1. Condensatore Liebig;
3.2. apparecchiatura Kjeldahl.

4. Procedimento
Mettere 10 g di suolo in un matraccio Erlenmeyer e trattare con 60
mL di acqua. Collegare il matraccio con un condensatore Liebig
verticale e riscaldare per mantenere la miscela acqua-suolo in
ebollizione per 60 minuti. Raffreddare la miscela, filtrarla sotto
vuoto (carta da filtro Whatman No 42) e, se necessario, rifiltrare
per rimuovere il materiale sospeso.
Determinare il contenuto di azoto nel filtrato con la procedura
semimicro Kjeldahl: riscaldare 20 mL del filtrato con 2 mL di acido
solforico concentrato e 0.7 g di una miscela di K(base 2)SO(base 4),
CuSO(base 4) e Se (rapporto p/p 10: 1:0.1) in un pallone Kjeldahl da
50 mL utilizzato per la distillazione in corrente di vapore.
Riscaldare il pallone in un sistema di digestione microKjeldahl fino
alla limpidezza. Dopo la chiarificazione continuare la digestione per
1 ora.
Distillare successivamente il contenuto del pallone in corrente di
vapore con 10 mL di NaOH 10N e raccogliere l'ammonio liberato durante
la distillazione in un matraccio contenente una soluzione indicatrice
di acido borico.
Determinare l'ammonio per titolazione con acido solforico 0.005 N.

Metodo II.2.2.

Metodo del permanganato di potassio in ambiente acido

1. Principio
Il metodo prevede l'ossidazione e l'idrolisi dell'azoto organico
da parte di soluzioni di permanganato di potassio in ambiente acido.
Il permanganato acido permette di estrarre l'azoto dal pool
dell'azoto organico del suolo per ossidazione ed idrolisi.

2. Reattivi
2.1. Soluzioni di permanganato di potassio (KMnO4) 0.05, 0.1 e 0.2
N in H(base 2)SO(base 4) 1N;
2.2. acido solforico (H(base 2)SO(base 4)) 1N.

3. Apparecchiatura
3.1. Apparato per la distillazione in corrente di vapore

4. Procedimento
La procedura di estrazione è praticamente equivalente a quella
proposta da Stanford e Smith ma gli estratti ottenuti dopo
centrifugazione a seguito della iniziale, agitazione dei campioni di
suolo con una soluzione di H(base 2)SO(base 4) 1N, vengono conservati
per l'analisi dell'azoto ammoniacale.
Preparare le soluzioni estraenti di permanganato acido nel giorno
dell'estrazione sciogliendo aliquote di KMnO4 in soluzioni 1N di
H(base 2)SO(base 4) tali da ottenere una normalità finale di KMnO4
pari a 0.05, 0.1 e 0.2.
La procedura di estrazione è la seguente: porre 2 g di campione
di suolo in tubi da centrifuga e tenere in agitazione con 50 mL di
H(base 2)SO(base 4) 1N per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo la
centrifugazione a 1000 g analizzare il surnatante per la
determinazione di N-NH(base 4 elevato a +) mediante la distillazione
in corrente di vapore usando NaOH come alcalinizzante.
I residui di suolo vanno posti in agitazione con 50 mL di una
soluzione acida di KMnO(base 4) per i ora a temperatura ambiente e
successivamente centrifugare. Analizzare il surnatante raccolto per
la determinazione di NH (base 4 elevato +) come descritto sopra.

Metodo II.2.3.

Metodo di estrazione con una soluzione di CaCl(base 2) in
autoclave

1. Principio
Questo metodo si basa sulla determinazione dell'N-NH(base 4
elevato a +) formato quando un campione di suolo viene trattato in
autoclave a 121 gradi C per 16 ore.

2. Reattivi
2.1. Soluzione di cloruro di calcio (CaCl(base 2)) 0.01M.
Sciogliere 1.5 g di CaCl(base 2) x 2H(base 2)O in 1 litro d'acqua;
2.2. soluzione di cloruro di potassio (KCl) 4M. Sciogliere 300 g
di KCl in 1 litro d'acqua;
2.3. ossido di magnesio. Riscaldare MgO in una muffola elettrica a
600-700 gradi C per 2 ore. Raffreddare il prodotto in un disseccatore
contenente idrossido di potassio (KOH) in gocce e conservare in una
bottiglia a tenuta d'aria;
2.4. soluzione indicatrice di acido borico.

3. Apparecchiatura
3.1. Apparato per la distillazione;
3.2. palloncino da distillazione da 150 mL;
3.3. microburetta, 5 mL, graduata a intervalli di 0.01 mL.

4. Procedimento
Porre 10 g di suolo in un tubo di pyrex da 50 mL, aggiungere 25 mL
di CaCl(base 2) 0.01M ed agitare delicatamente per mescolare il
contenuto. Coprire con un foglio di alluminio e porre il tubo in
autoclave. Portare la temperatura a 121 gradi C ed effettuare il
trattamento in autoclave per 16 ore. Lasciare quindi il tubo a
raffreddare a temperatura ambiente e trasferire quantitativamente la
miscela suolo-CaCl(base 2) in un pallone da distillazione da 150 mL.
L'uso di circa 25 mL di KCl 4M facilita il trasferimento. Aggiungere
0.2-0.3 g di MgO e determinare L'ammontare di N-NH(base 4 elevato a
+) liberato dalla distillazione in corrente di vapore dopo quattro
minuti. Determinare il contenuto di azoto ammoniacale presente nel
suolo prima dell'incubazione secondo la procedura utilizzata per
l'analisi della miscela autoclavata e calcolare l'azoto disponibile
per differenza fra i risultati di queste due analisi.

Metodo II.2.4.

Metodo biochimico di Bremner

1. Principio
Il campione di suolo è mescolato con sabbia di quarzo in rapporto
1:3 e la miscela è inumidita con acqua ed incubata a 30 gradi C per
due settimane in condizioni che permettano un'adeguata aereazione del
campione senza perdite d'acqua. L'ammontare di azoto nitroso, nitrico
ed ammoniacale del campione incubato viene poi stimato mediante
estrazione con KCl 2N e successiva determinazione dell'azoto
ammoniacale prodotto per mezzo di una distillazione, in corrente di
vapore ed in presenza di ossido di magnesio e lega di Devarda. La
quantità di azoto nitroso, nitrico ed ammoniacale presente nella
miscela suolo-sabbia di quarzo prima dell'incubazione è determinata
con lo stesso procedimento. L'azoto mineralizzabile nel campione di
suolo viene calcolato dalla differenza tra i risultati di queste due
analisi.

2. Reattivi
2.1. Lega di Devarda. Preparare questo reagente macinando una lega
di buona qualità (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, o J.T. Baker
Chemical Co., Phillipsburg, N.Y.) fino a che il prodotto non passi
attraverso un setaccio di 100 mesh e per almeno il 75% attraverso uno
di 300 mesh. Conservare la lega così prodotta in una bottiglia a
tenuta d'aria;
2.2. soluzione indicatrice di acido borico (vedi II.2.1., 2.5.);
2.3. acido solforico H(base 2)SO(base 4) 0.005N standard;
2.4. soluzione di cloruro di potassio (KCl) 2N: sciogliere 1.5 g
di KCl in 10 litri d'acqua;
2.5. ossido di magnesio (MgO) (vedi II.2.1., 2.5.).

3. Apparecchiatura
3.1. Apparato per la distillazione in corrente di vapore;
3.2. palloni da distillazione;
3.3. microburetta, 5 mL, graduata a intervalli di 0.01 mL.

4. Procedimento
Mescolare 10 g di suolo con 30 g di sabbia di quarzo in un beaker
da 100 mL di capacità e trasferire la miscela in una bottiglia a
collo largo da 250 mL contenente 6 mL di acqua. Distribuire la
miscela uniformemente sul fondo della bottiglia, chiuderne l'apertura
con del parafilm ed incubare a 30 gradi C per 14 giorni. Alla fine di
questo periodo di incubazione aggiungere 100 mL di KCl 2N ed agitare
per un'ora. Lasciare sedimentare e pipettare un'aliquota del
surnatante liquido (circa 20 mL) in un palloncino da distillazione.
Determinare il contenuto di azoto nitroso, nitrico ed ammoniacale
nella miscela suolo-sabbia di quarzo mediante raccolta e titolazione
dell'ammoniaca liberata dalla distillazione in corrente di vapore in
presenza di MgO e lega di Devarda. Determinare l'ammontare di azoto
nitroso, nitrico ed ammoniacale presente nella miscela suolo-sabbia
di quarzo prima dell'incubazione seguendo la stessa metodologia
applicata alla miscela incubata e calcolare l'azoto mineralizzabile
del campione di suolo dalla differenza esistente fra i risultati
delle due analisi.

Metodo II.2.5.

Metodo biochimico di Stanford e Smith

1. Principio
Una miscela di suolo e sabbia di quarzo viene incubata in
condizioni idriche e di temperatura ottimali per l'attività
microbica. L'azoto minerale formato viene rimosso e determinato ad
intervalli di tempo prefissati per la durata di 30 settimane.

2. Reattivi
2.1. Lega di Devarda;
2.2. soluzione indicatrice di acido borico (vedi II.2.1., 2.5.);
2.3. acido solforico [H(base 2)SO(base 4)] 0.005N standard;
2.4. soluzione dilavante di cloruro di calcio (CaCl(base 2))
0.01M;
2.5. soluzione nutritiva [0.002 M CaSO(base 4) x 2H(base 2)O;
0.002 M MgSO(base 4); 0.005 M Ca(HPO(base 4)2 X H(base 2)O e 0.0025 M
K(base 2)SO(base 4)];
2.6. sabbia di quarzo.

3. Apparecchiatura
3.1. Tubi da dilavamento da 50 mL o imbuti buchner di porcellana
(diametro = 13 cm);
3.2. apparato per la distillazione in corrente di vapore;
3.3. palloni da distillazione;
3.4. microburetta, 5 mL, graduata a intervalli di 0.01 mL.

4. Procedimento
4.1. Metodo con tubi di dilavamento
Un campione di 15 g di suolo essiccato all'aria e vagliato a 2 mm
viene mescolato con sabbia di quarzo in rapporto 1:1 ed inserito in
tubi da dilavamento da 50 mL al fondo dei quali è sistemato un
filtro di lana di vetro.
Rimuovere l'azoto minerale inizialmente presente mediante
dilavamento con 100 mL di CaCL(base 2) 0.01 M, seguito dalla
somministrazione di 25 mL di una soluzione nutritiva priva di azoto
(0.002 M Caso(base4) * 2H(base 2)O; 0.002 M MgSO(base4); 0.005 M
Ca[(HPO(base 4)](base 2) x H(base 2)O e 0.0025 M K(base 2)SO(base
4)). Allontanare l'acqua in eccesso sotto vuoto (60 cm Hg). Tappare i
tubi ed incubare a 35 gradi C. Lo scambio gassoso attraverso la
porzione aperta del tubo di dilavamento è sufficiente a mantenere un
sistema aerobico. Dopo due settimane raccogliere l'azoto minerale
mediante dilavamento con CaCl(base 2) 0.01 M e con la soluzione
nutritiva priva di azoto, seguita dall'applicazione del vuoto come
descritto sopra.
Rimettere i tubi ad incubare ed effettuare i dilavamenti dopo 2,
4, 8, 12, 16, 22 e 30 settimane).
Ripristinare il contenuto ottimale di acqua nel suolo ad ogni
dilavamento.
Il dilavato viene trasferito in palloni Kjeldahl da 800 mL e
diluito con 300 mL di acqua distillata. In seguito all'aggiunta della
lega di Devarda (0.5 g) e di NaOH 10N (2 mL), l'azoto minerale
(NO(base3 elevato a -), NO(base2 elevato a -), NH(base 4 elevato a
+)) viene determinato mediante titolazione acida con H(base 2)SO(base
4) 0.005N dopo distillazione con acido borico.

4.2. Metodo con imbuti buchner

50 g di suolo vengono miscelati con 50 g di sabbia di quarzo e
disposti in un imbuto buchner di porcellana (diametro esterno 13 cm)
sul fondo del quale è stato sistemato un filtro di stoffa di
acetato. La miscela deve formare uno strato omogeneo di uno spessore
non superiore ai 2 cm. Particolare attenzione va posta alla
granulometria della sabbia di quarzo che dovrà essere sempre
compresa tra 0.2-0.8 mm poichè, agendo sull'aereazione del campione
influisce in modo decisivo sui risultati analitici. La soluzione
estraente di CaCl(base 2) è stata sostituita con CaSO(base 4) saturo
per rendere gli estratti leggibili anche con metodi potenziometrici
date le note interferenze che lo ione cloro esercita in questo tipo
di misure. Infine è stata apportata una modifica alla temperatura di
incubazione che è stata abbassata dai 35 gradi C proposti da
Stanford e Smith a 30 gradi C per avere una migliore correlazione con
la realtà di campo. L'umidità viene ripristinata mediante una pompa
aspirante.
Su una aliquota degli estratti dopo filtrazione con filtro a
pieghe viene determinato il contenuto in N- NO(base3 elevato a -),
N-NH(base 4 elevato a +) ed N- NO(base2 elevato a -) con i metodi
più convenienti (colorimetrico, potenziometrico, ecc).

Metodi II.3.

ATTIVITÀ AZOTOFISSATRICE

1. Oggetto
Il presente documento fissa i metodi per la determinazione della
attività azotofissatrice nel suolo.

Metodo II.3.1.

Determinazione dell'attività azotofissatrice su campioni di
terreno

1. Principio
La riduzione dell'acetilene (C(base 2)H(base 2)) ad etilene
(C(base 2)H(base 4)) è in genere utilizzata per una stima
dell'attività nitrogenasica nei sistemi naturali. Entrambi i
composti, infatti, possono venire facilmente dosati, anche a
concentrazioni molto basse, con tecniche gas-cromatografiche e la
reazione è altamente specifica perchè nessun altro sistema
enzimatico è in grado di ridurre l'acetilene.

2. Reattivi
2.1. N(base 2) se risulta necessario prevenire l'esposizione di
campioni all'ossigeno;
2.2. C(base 2)H(base 2) o (elevato a 15)N(base 2) adatta (vedi
note tecniche) per esperimenti in campo;
2.3. fonte di gas con funzione di standard (vedi note tecniche) se
desiderato;
2.4. sorgente di Ar o He;
2.5. fonte di O(base 2);
2.6. gas vettore N(base 2) per analisi con C(base 2)H(base 2).

3. Apparecchiatura
3.1. Bottiglie con tappo a tenuta di gas, beute o barattoli in
vetro con tappo a tenuta;
3.2. sacchi in plastica a bassa permeabilità. I sacchetti possono
essere fermati per mezzo di tubi con tappo a tenuta o possono avere
direttamente saldata alla superficie una pallina di silicone oppure
setti in gomma siliconica o butilica per mezzo dei quali sia
possibile inserire un ago di siringa;
3.3. spatole;
3.4. provette portacampioni per il trasferimento dei sedimenti;
3.5. pinzette;
3.6. forbici;
3.7. bisturi;
3.8. guanti;
3.9. sacchetti di plastica;
3.10. siringhe di taglia appropriata per l'addizione di C(base
2)H(base 2) o (elevato a 15)N(base 2) al campione in esame;
3.11. siringa per prelievo gas;
3.12. siringhe monouso in plastica da i mL ed ago con o senza
valvola in teflon;
3.13. pompa a vuoto elettrica o manuale;
3.14. gas-cromatografo con detector a ionizzazione di fiamma;
3.15. colonna C18 in Porapak (R);
3.16. per analisi con (elevato a 15)N(base 2) occorre uno
spettrometro di massa.

4. Procedimento
Trasferire il campione scelto per l'analisi nell'opportuno
contenitore. Campioni come pezzetti di radice possono essere
trasferiti intatti o tagliati in pezzetti più corti ma prima devono
essere superficialmente sterilizzati con appropriate soluzioni
(ipoclorito, acqua ossigenata, clorammina T, nitrato di argento). È
raccomandabile per materiali biologicamente molto attivi (piante o
animali) che il rapporto tra il volume occupato dalla fase gassosa
(mm3) rispetto al peso fresco del campione (grammi) sia almeno pari a
300, così da minimizzare i cambiamenti rapidi della composizione
dell'atmosfera durante l'analisi. Il peso esatto del campione
introdotto può essere convenientemente determinato dopo la
determinazione del contenuto di umidità.
Può essere necessario aggiustare l'umidità del campione di suolo
o sedimento, può essere fornita un opportuna fase acquosa a parti di
piante acquatiche, se occorre stimolare l'attività azotofissatrice
può essere necessario aggiungere fonti organiche di carbonio o azoto
combinato.
Prima dell'incubazione occorre chiudere i contenitori con tappi
appropriati o saldare le superfici dei sacchetti di plastica.
Occorre stabilire l'atmosfera appropriata per l'analisi. Nel caso
del saggio di riduzione dell'C(base 2)H(base 2) l'atmosfera del
sistema non dovrebbe essere alterata; se occorre una riduzione delle
concentrazioni di O(base 2), il sistema deve essere saturato con una
miscela di N(base 2)-O(base 2) o di un parziale arricchimento
dell'atmosfera con N(base 2). Quando si impiega (elevato a 15)N(base
2) è necessario rimuovere completamente dall'atmosfera l'N(base 2) e
sostituirlo, con un'atmosfera di Ar o He, con (elevato a 15)N(base
2).
Per introdurre C(base 2)H(base 2) o (elevato a 15)N(base 2) nel
sistema si deve rimuovere con una siringa un volume di atmosfera
uguale a quello del gas che dovrà essere introdotto. In seguito si
inietta C(base 2)H(base 2) in quantità tale da ottenere una
pressione parziale di 0,05-0,1 atm (una concentrazione maggiore può
essere necessaria alla saturazione della nitrogenasi in alcuni
sistemi contenenti microrganismi e in particolari tipi di sedimenti),
o (elevato a 15)N(base 2) in quantità tale da ottenere una pressione
parziale di almeno 0,4 atm.
Introdurre un gas con funzione di standard interno, se desiderato
(vedi Note), quindi incubare in situ, o a temperatura controllata in
laboratorio. Condizioni di luce/buio possono essere utilizzate in
base all'obiettivo preposto.
Alla fine dell'incubazione campionare la fase gassosa ad
intervalli di tempo, utilizzando una siringa (0,1-1,0 mL) per analisi
gascromatografiche. La frequenza di campionamento dipende
dall'attività del campione e dalle condizioni di campionamento,
anche se analisi ogni 1-4 ore sono quelle maggiormente desiderabili;
attività mediamente basse possono richiedere campionamenti numerosi,
per periodi di tempo più lunghi.

Metodo II.3.2.

Determinazione dell'attività azoto fissatrice effettuata su
carote
1. Principio
L'uso di carote di suolo o sedimenti, con o senza piante intatte,
ha il vantaggio di limitare gli agenti di disturbo rispetto allo
studio di parti isolate dal sistema. Ciò è vero soprattutto per
campioni racchiusi nei contenitori di prelevamento.

2. Reattivi

2.1. Una fonte di C(base 2)H(base 2) o di (elevato a 15)N(base 2)
adatta (vedi Note) per esperimenti in campo;
2.2. una fonte di gas con funzione di standard (vedi Note) se
desiderato; una siringa riservata unicamente a questo scopo;
2.3. sorgente di Ar o He;
2.4. sorgente di 02.

3. Apparecchiatura
3.1. Trivelle o tubi cilindrici in acciaio o altro materiale di
almeno 10 cm di diametro, di lunghezza variabile (usualmente 15-20
cm) che possono avere i bordi inferiori affilati. Per alcuni
esperimenti può essere desiderabile chiudere il fondo del cilindro
di campionamento con fogli plastificati o metallici saldati con
opportuni cementi, gomma butilica o siliconica;
3.2. camera di analisi. Deve essere sufficientemente ampia per
contenere il campione intatto, o nel caso di campioni con fondo
ermeticamente chiuso deve essere saldata opportunamente alla parte
superiore del portacampione. La camera può essere in vetro, in
metallo rigido a tenuta gassosa, o in plastica e deve avere un setto
per l'iniezione ed il prelievo della fase gassosa;
3.3. siringhe di taglia appropriata per l'addizione di C(base
2)H(base 2) o (elevato a 15)N(base 2) al campione in esame;
3.4. siringhe per il campionamento. Le siringhe più convenienti
da utilizzare sono siringhe monouso in plastica da 1 mL munite di ago
con o senza valvola in teflon. Siringhe di vetro con o senza valvole
possono ugualmente essere utilizzate, ma sono generalmente più
costose. Se si presenta la necessità di conservare i campioni, fare
riferimento a quanto riportato nelle note tecniche;
3.5. pompa a vuoto elettrica o manuale.

4. Procedimento
Quando viene effettuato il carotaggio, può essere desiderabile
campionare piante individuali o campioni "at random" con vegetazione
più o meno uniforme. Per alcuni sistemi (p. es. zone salmastre) può
risultare notevolmente più pratico utilizzare sezioni orizzontali di
suolo piuttosto che il metodo del carotaggio.
Si chiude il campione apponendo la base sul fondo e la camera di
misurazione sul coperchio o chiudendo l'intera carota in un
contenitore separato. Quindi, si stabilisce l'atmosfera appropriata
per l'analisi: si introduce C(base 2)H(base 2) o (elevato a 15)N(base
2), come descritto per i campioni isolati dal sistema, ed un gas con
funzione di standard interno, se desiderato (vedi Note).
Quindi si incuba in situ o a temperatura controllata in
laboratorio. Condizioni di luce/buio possono essere utilizzate in
base all'obiettivo preposto.
Alla fine dell'incubazione si campiona la fase gassosa ad
intervalli di tempo con siringa (0,1-1,0 mL) per le analisi gas
cromatografiche. La frequenza di campionamento dipende dall'attività
del campione e dalle condizioni di campionamento. Il manifestarsi
della fase stazionaria è meno frequente, in questo tipo di analisi
rispetto a quella effettuata sui campioni separati dal sistema,
perchè le perturbazioni sono minimizzate. Periodi di incubazione di
2-6, 10-24 o 10-48 ore sono i più appropriati per questo tipo di
analisi.
Per analisi dell'(elevato a 15)N(base 2) la percentuale di atomi
di 15N in eccesso dell'atmosfera sperimentale e il campionamento di
N(base 2) fissato devono essere determinati ad intervalli
appropriati.
Nelle analisi di campioni provenienti da incubazioni con (elevato
a 15)N(base 2) si deve escludere la presenza di CO(base 2) e N(base
2)O al fine di evitare interferenze nella determinazione dei diversi
isotopi dell'azoto. L'arricchimento in (elevato a 15)N(base 2) nel
campione prelevato viene determinato come descritto da Bergensen
(1980).

5. Espressione dei risultati
In molti casi la presentazione dei dati in base alla superficie o
al volume è adeguata e deve essere calcolata dalle dimensioni note
del campione. I dati possono inoltre essere convertiti sulla base dei
pesi freschi o secchi dei campioni di suolo o radici, eseguendo la
determinazione dell'umidità.

Metodo II.3.3.

Misura dell'attività azotofissatrice in situ con sistema aperto

1. Principio
Il principio su cui si basa è relativamente semplice: in un
recipiente chiuso, inserito nel suolo, viene iniettato acetilene ed
un opportuno gas che funge da standard interno; ad appropriati
intervalli di tempo, vengono prelevati campioni di gas da analizzare
con il gas-cromatografo.

2. Reattivi
2.1. Fonte di gas da utilizzarsi come standard interno;
2.2. Fonte di C(base 2)H(base 2). CaC(base 2) o C(base 2)H(base 2)
in bombola.

3. Apparecchiatura
3.1. Recipienti cilindrici di grandezza appropriata (10-30 cm di
diametro e 15-30 cm di altezza, in dipendenza del sito di analisi,
del contenuto di acqua, ecc.) in plastica acrilica o in materiale
metallico. Ciascun tipo di recipiente deve avere sul bordo superiore
una scanalatura contenente acqua o un altro sistema che serva per
l'inserimento della parte superiore da sigillare a tenuta. La parte
superiore può essere rigida (fogli o cilindri in plastica acrilica)
o flessibile (semplici fogli o sacchi in plastica a bassa
permeabilità o polietilene). Essa è mantenuta attaccata alla parte
inferiore o per inserimento nella scanalatura del cilindro inferiore
per mezzo di un bordo rinforzato e rigido in PVC oppure fissata
utilizzando gomma siliconica, butilica o collanti simili. In ogni
caso, questa copertura presenta setti in gomma o palline di silicone
che permettono di prelevare campioni di atmosfera contenuti nel
sistema, per mezzo di siringa.
3.2. Una siringa della capacità di almeno 500 mL è richiesta se
viene utilizzato C(base 2)H(base 2) in bombola;
3.3. Siringa riservata per standard.
3.4. Termometro per la misurazione della temperatura all'interno
del sistema.
3.5. Siringhe per il campionamento. Le siringhe più convenienti
da utilizzare sono siringhe monouso in plastica da 1 mL ed ago con o
senza valvola di teflon. Siringhe di vetro con o senza valvole
possono ugualmente essere utilizzate, ma sono generalmente più
costose. Se si presenta la necessità di conservare i campioni, fare
riferimento a quanto riportato nelle note tecniche.

4. Procedimento
Scegliere il luogo di analisi ed inserire il cilindro nel suolo.
La scelta di campioni rappresentativi, può rivelarsi difficile o
addirittura impossibile per vegetazioni naturali, dove è preferibile
un posizionamento "casuale" all'interno delle comunità tipo. In
studi diurni, le analisi devono essere iniziate in momenti diversi
del giorno.
Introdurre nel cilindro un termometro (se desiderato) e un beaker
o una beuta contenente carburo di calcio sufficiente per generare 0,1
atm di C(base 2)H(base 2), se viene scelta questa forma di produzione
di acetilene.
Applicare la parte superiore del recipiente e sigillare con acqua
o altro materiale opportuno.
Introdurre C(base 2)H(base 2) attraverso iniezione dell'opportuno
volume prelevato da bombola o versando acqua sul carburo subito prima
di fissare la parte superiore del dispositivo alla parte sottostante
(prima dell'iniezione di C(base 2)H(base 2) un volume di atmosfera
pari a quello di C(base 2)H(base 2) introdotto deve essere prelevato,
ma questo non risulta sempre strettamente necessario).
Introdurre propano o un altro tipo di gas con funzione di standard
interno.
Campionare la fase gassosa ad intervalli di tempo con siringa
(0,1-1,0 mL) per le analisi gascromatografiche. La frequenza di
campionamento dipende dal sistema oggetto di studio ma è
raccomandabile che i campioni siano prelevati dopo 0,5; 1,0; 2,0;
5,0; 24 e 48 ore, così che possano essere osservate variazioni nel
tempo.
Campionamenti rapidi della durata di 2-5 ore sono preferibili per
minimizzare i cambiamenti nell'atmosfera e la perdita di C(base
2)H(base 2) dal sistema. Se si presenta la necessità di conservare i
campioni, fare riferimento a quanto riportato nelle note tecniche.

5. Espressione dei risultati
Un esempio di calcolo che coinvolge uno standard interno gassoso
è fornito nelle note tecniche. I tassi calcolati di C(base 2)H(base
4) prodotto possono essere messi semplicemente in relazione all'area
di saggio o, per alcune applicazioni, la massa radicale presente
nell'area di saggio deve essere prelevata e i tassi messi in
relazione al peso secco delle radici.

6. Note
6.1. Atmosfere necessarie per il saggio della riduzione del C(base
2)H(base 2).
Nei suoli che sono dotati di moderata porosità la saturazione dei
siti di azotofissazione avviene facilmente con una pressione parziale
di C(base 2)H(base 2) di 0,05 atm ma, a causa dell'alta solubilità
del C(base 2)H(base 2), anche 0,2 atm possono essere richieste in
suoli saturi di acqua. In alcuni casi, per es. in radici isolate da
un ambiente caratterizzato da basse pressioni di ossigeno, si può
verificare l'inattivazione della nitrogenasi; tale inconveniente può
essere eliminato riducendo il più possibile l'esposizione del
campione all'aria e riducendo la pressione parziale dell'O(base 2) ad
un valore intorno a 0,1-0,05 atm.
6.2. Standard interni
In molti casi lo stesso C(base 2)H(base 2) può fungere da
standard interno. Tuttavia in campioni dotati di una significante
fase acquosa o per saggi da effettuarsi in situ, sarebbe meglio
utilizzare altri gas dotati di solubilità e di caratteristiche di
diffusione vicine a quelle possedute da C(base 2)H(base 2), come
etano, propilene e propano. Nella tabella i sono riportate alcune
proprietà di questi gas comparati con quelle di C(base 2)H(base 2) e
C(base 2)H(base 4).
Essi differiscono non solo in relazione alla solubilità in acqua
ma anche nel grado di eluizione dalle colonne Porapak utilizzate
comunemente nell'analisi dei campioni; inoltre, il loro assorbimento
nel suolo decresce nell'ordine seguente: propilene&gt; metano&gt; etano&gt;
propano. La scelta dello standard interno deve essere fatta molto
accuratamente considerando il tipo di campione da sottoporre
all'analisi e la compatibilità con il sistema di gas cromatografia
utilizzato.

Tabella 1. Alcune proprietà di gas standard interni comparate
con quelle di acetilene ed etilene. da Knowels (1980).
====================================================================
Proprietà Metano Acetilene Etilene Etano Propilene Propano
====================================================================
Solubilità
in acqua a
20 gradi C* 0,036 1,05 0,122 0,0496 0,22 0,0394
--------------------------------------------------------------------
Ordine di
eluizione
su:
Porapak R 1 3 2 3 4 5
Porapak N 1 4 2 3 5 5
Porapak Q 1 2 3 4 5 6
--------------------------------------------------------------------
*La solubilità è espressa in cm3 di gas per cm3 di acqua a 20
gradi C.

I calcoli, assumendo di utilizzare quale standard interno il
propano, possono essere eseguiti nel modo seguente (Balandreau e
Dommergues, 1973):

R=e2V2-elV1 - elV1 : a(t2-t1)

dove R è la quantità di C(base 2)H(base 4) prodotta in mol
m(elevato alla -2) h(elevato alla -1), el ed e2 le concentrazioni di
C(base 2)H(base 4) dei campioni presi ai tempi t1 e t2 in mol
mL(elevato alla -1), V1 e V2 i volumi in mL occupati dai gas ai tempi
t1 e t2.
Poiche':

V1 = P/p1 e V2 = P/p2

dove
p1 e p2 sono le concentrazioni di C3 H8 dei campioni presi ai
tempi t1 e t2 in mol(elevato alla -1) mL(elevato alla -1),
P la quantità di C(base 3)H(base8) iniettata in moli,
a la superficie inclusa in m2,
t1 e t2 i tempi in ore dei campionamenti.
Sara':

R=e2P/p2 - el P/p1 : a(t2-t1) = P/a(t2-t1) x (e2/p2 - el/p1)

La sensibilità relativa del gas cromatografo a C(base 2)H(base 2)
e a C(base 3)H(base8) può essere determinata iniettando quantità
equimolari dei due gas.
Se e/p' è il rapporto delle altezze dei picchi di C(base 2)H(base
4) e di C(base 3)H(base8) (con l'attenuazione inclusa) ottenuta in
tale calibrazione e he1 / hp1 e he2 / hp2 sono i rapporti delle
altezze dei picchi di C(base 2)H(base 4) e di C(base 3)H(base8)
ottenuti nei campioni ai tempi t1 e t2 allora:

R=Pp'/ae(t2-t1) x (h e2 / hp2 -h el /hp1)

In questo caso, per ciascun particolare esperimento in cui la
quantità di propano iniettata e la sensibilità del gas-cromatografo
sono costanti, sono necessari solo i rapporti delle altezze dei
picchi dei campioni di gas da analizzare.

6.3. Atmosfere necessarie per il saggio con (elevato a 15)N(base
2)
Per questo saggio è necessario rimuovere l'N(base 2) presente
nell'atmosfera e sostituirlo con la maggior quantità di (elevato a
15)N(base 2) possibile. Perciò è necessario far fluire nel campione
da analizzare una corrente di Ar o He seguita dall'aggiunta della
necessaria quantità di (elevato a 15)N(base 2). La pressione
parziale di (elevato a 15)N(base 2) dovrebbe essere compresa tra
0,4-1,0 atm.

6.4. Approvvigionamenti di gas per usi in campo
Assai spesso, in questo tipo di analisi, risultano utili piccoli
contenitori per gas in metallo o palloni in gomma. Tuttavia, C(base
2)H(base 2) può essere generato anche a partire da CaC(base 2)
(carburo di calcio). L'(elevato a 15)N(base 2) viene preparato
precedentemente in laboratorio a partire da [(elevato alla 15)NH(base
4](base 2)SO(base 4) ed eventualmente trasportato in campo in
siringhe di vetro a tenuta.

6.5. Conservazione dei campioni di gas prelevati per analisi
La conservazione dei campioni da sottoporre all'analisi
gas-cromatografica può essere fatta con uno dei modi seguenti:

- in siringhe di vetro (p. es. Glaspak) dotate di valvola per ridurre
le perdite;
- in tubi tipo Vacutainer o bottigliette in cui sia stato fatto il
vuoto precedentemente;
- iniettando i campioni da analizzare in bottigliette riempite con
acqua in cui l'acqua in eccedenza esce da un secondo ago inserito
nel setto; in questo caso può essere necessaria una correzione per
la solubilità dei componenti di interesse nell'acqua contenuta nel
recipiente.

Metodo II.3.4.

Misura simultanea dell' azotofissazione e della denitrificazione

1. Principio
Poichè l'azotofissazione e la denitrificazione possono avvenire
contemporaneamente nello stesso suolo, può essere utile determinare
contemporaneamente C(base 2)H(base 4) e N(base 2)O. Poichè in
presenza di C(base 2)H(base 2) la riduzione di N(base 2)O è
completamente inibita, la misura dell'accumulo di N(base 2)O presente
nel sistema risulta essere una stima del grado di denitrificazione
totale di un suolo.

2. Procedimento
Per effettuare la contemporanea determinazione di C(base 2)H(base
4) e di N(base 2)O sono necessari tipi di detector diversi da quelli
impiegati per la determinazione dell'etilene, che devono risultare
più sensibili all'N(base 2)0, come quelli a conduttività termica,
ad ultrasuoni, a ionizzazione di elio o a cattura di elettroni. La
determinazione contemporanea dei due gas può essere ottenuta ponendo
una derivazione a forma di T dietro l'iniettore per i gas: un braccio
del T è connesso ad una colonna adatta per la separazione del N(base
2)O (p. es. una colonna di 2-3 m x 3 mm Porapak Q, di 80-100 di
porosita) e termina ad un detector a conduttività termica (TCD).
L'altro braccio è connesso ad una colonna adatta per la separazione
degli idrocarburi (per es. una colonna di 2 m x 3 mm Porasil
C/isocianato di metile, di 80-100 di porosita) e termina con un
detector a ionizzazione di fiamma (FID). Il flusso del gas di
trasporto (elio) è regolato a circa 16 mL min1 per il FID e a 46 mL
min(elevato alla -1) per il TCD. La temperatura della colonna è
mantenuta a 50 gradi C e i due detector sono connessi con due pennini
per registrare i dati.

Metodo II.4.

ATTIVITÀ AMMONIOSSIDANTE

1. Oggetto
Il presente documento fissa i metodi per la determinazione della
attività ammonio ossidante del suolo.

Metodo II.4.1.

Misura dell'attività nitrificante potenziale (PNA)

1. Principio
La misura della PNA viene determinata secondo le modalità di
Belser e Mays, 1980 e, dato che si svolge in un tempo ristretto,
viene presa come un indice istantaneo della popolazione ammonio
ossidante attiva.

2. Procedimento
20 g di suolo vengono pesati in una beuta Erlemayer di 250 mL; si
aggiungono 50 mL di tampone fosfato 2mM (pH 7.2 - 7.5) contenente
[NH(base 4](base 2)SO(base 4) alla concentrazione di 0.5 o 1mM; la
sospensione viene incubata a 26 gradi C su un agitatore rotante. La
produzione di nitriti o di nitriti più nitrati viene misurata ad
intervalli regolari durante un periodo di 4-6 ore prelevando
un'aliquota della sospensione (1 o più mL) e centrifugandola a 15000
x g per 5 minuti; il surnatante viene addizionato con un volume
identico di 2M KCl per arrestare la nitrificazione. Per la lettura
dei soli nitriti aggiungere alla sospensione 1 mL di 1M KClO3.
Per determinare la PNA massima in funzione del pH, aggiungere 1N
HCl o 1N NaOH alla sospensione al fine di ottenere una gamma di pH
tra 4.5 e 8.5 con intervalli di 0.5.
L'acetilene (conc.~10Pa) inibisce la nitrificazione autotrofa, ma
non quella eterotrofa; questo consente, eliminando il clorato dalla
sospensione, di misurare la produzione di NO (base 3 elevato a -) in
presenza ed in assenza di acetilene: la differenza rappresenta il
valore della nitrificazione eterotrofa.
La determinazione di nitriti, nitrati e ammonio nei suoli viene
misurata in estratti da soluzioni 1:5 (suolo: 2 M KCl).

3. Espressione dei risultati
La PNA si stabilisce determinando la produzione di NO3 o NO (base
2 elevato a -) da NH (base 4 elevato +) mediante l'Autoanalyzer o con
procedure spettrofotometriche dirette utilizzando il reattivo di
GriessIlloway.

Metodi II.5.

VALUTAZIONE DELL'ATTIVITÀ DENITRIFICANTE DEL SUOLO

1. Oggetto
Il presente documento fissa i metodi per la determinazione della
attività denitrificante del suolo.

Metodo II.5.1.

Valutazione dell'attività denitrificante in situ

1. Principio
La determinazione dell'attività denitrificante può esprimere,
secondo quale sia la metodologia adottata, la reale intensità del
processo nel suolo in un determinato momento o la sua potenzialità
(potenziale di denitrificazione).
Tale metodo permette la determinazione dell'N(base 2)O svolto
dalla superficie indisturbata del suolo, tramite A.I.T. e dispositivi
infissi nel suolo (cover-box).

2. Reattivi
2.1. carburo di calcio in granuli; 2.2. cloruro di rame CuCl2 in
soluzione acquosa all'8%.

3. Apparecchiatura
3.1. Cilindri in acciaio di 40 cm di diametro e 35 cm di altezza,
aperti inferiormente e muniti superiormente di coperchio mobile in
plexiglas, a tenuta di gas e provvisto di un foro con setto
perforabile;
3.2. siringhe monouso da 10 mL e da 1 mL; siringhe di precisione
per gas cromatografia da 0,1 mL, 0,5 mL e 1 mL;
3.3. vial da 5 mL, con tappo perforabile e ghiera di protezione in
alluminio (tipo flacone per antibiotici) a tenuta di vuoto, riempiti
con cloruro di calcio granulare (pezzatura 1-2 mm);
3.4. sistema per vuoto;
3.5. contenitori monouso in alluminio, di forma tronco conica e,
superiormente di 8 cm ca. di diametro;
3.6. gas cromatografo con rivelatore a cattura di elettroni (ECD),
equipaggiato con colonna di acciaio, lunga 2 m e con diametro interno
di 2 mm, impaccata con Poropak Q 80-100 mesh.

4. Procedimento
Dopo aver inserito nel suolo i cilindri metallici (non meno di due
per ogni trattamento) alla profondità di 5 cm, si procede alla
somministrazione dell'acetilene ponendo all'interno di ogni cilindro
un contenitore di alluminio con 25 mL di soluzione di cloruro di rame
in cui si versano 8 g di carburo. Questa operazione consente lo
sviluppo della quantità di acetilene necessaria per raggiungere una
concentrazione della medesima nel suolo mediamente non inferiore al
4-5%. Si chiude rapidamente il cilindro con il coperchio e si attende
mezzora circa per favorire la completa diffusione dell'acetilene
prodotta nella reazione. Trascorso tale tempo si effettua un primo
prelievo di atmosfera all'interno del cilindro tramite perforazione
del setto di gomma inserito nel coperchio con una siringa da 10 mL,
per valutare l'N(base 2)O presente al tempo zero e si ripete il
prelievo dopo due ore. In entrambi i casi il campione gassoso
prelevato viene rapidamente trasferito nei vial sotto vuoto e il cui
contenuto di cloruro di calcio permette l'elimazione del vapore
acqueo che disturba le analisi. Queste potranno essere effettuate
entro breve tempo dal campionamento o anche dopo diversi giorni,
avendo cura però di conservare i vial a 5 gradi C.
L'analisi della miscela gassosa viene effettuata per via gas
cromatografica con rivelatore a cattura di elettroni dopo passaggio
in colonna con Poropak Q con un flusso di elio di 40 mL x min(elevato
alla -1) e make-up di azoto con flusso di 20 mL x min(elevato alla
-1). La quantità di miscela gassosa immessa in colonna è di 1 mL,
tramite siringa monouso corredata di ago in acciaio per gas
cromatografia. Le condizioni strumentali più convenienti sono
risultate essere quelle che seguono: temperatura all'iniettore 225
gradi C, temperatura della camera 50 gradi C, temperatura al
rivelatore 350 gradi C; tensione d'impulso (pulse width) i
microSiemens, tensione di eccitazione 50 Volt; la corrente che regola
la frequenza può variare tra i e 1,5 nA e a questa deve
corrispondere una frequenza non inferiore a 4000 Hertz.

5. Espressione dei risultati
Le concentrazioni di N(base 2)O misurate dallo strumento vengono
calcolate tramite riferimento ad una retta di taratura eseguita
preventivamente. La trasformazione delle concentrazioni in quantità
assolute di N(base 2)O richiede la conoscenza del volume libero
interno dei cilindri. Questo può essere calcolato in modo molto
approssimativo, qualora la superficie del suolo sia quasi
perfettamente piana, misurando l'altezza media da terra del cilindro,
o in maniera esatta tramite delle prove in bianco con un gas di
riferimento (p. es. il propano) che viene introdotto nel cilindro in
quantità nota.

6. Note
L'esecuzione della prova deve essere evitata nelle ore più calde
della giorno dato l'effetto radiante che i cilindri metallici possono
svolgere con conseguente notevole aumento della temperatura e
dell'umidità dell'atmosfera al loro interno. Qualora non sia
possibile procedere alle prove nelle prime ore del mattino (che sono
risultate essere le più valide anche al fine dell'estrapolazione dei
risultati alle 24 ore) è necessario procedere alla coibentazione dei
cilindri con vari accorgimenti. Tra questi il più valido risulta
essere quello di rivestire il cilindro con schiuma poliuretanica e
schermare il coperchio con paglia o simili.
Data l'elevata solubilità dell'N(base 2)O in acqua nel caso di
suoli saturi o prossimi alla saturazione è opportuno procedere al
calcolo del protossido di azoto disciolto nell'acqua del suolo che va
aggiunto a quello misurato nello spazio di testa. Il calcolo può
essere fatto usando il coefficiente di Bunsen nella seguente
equazione:

M=Cg[Vg + v(base 1)alfa]

dove M è la quantità totale di N(base 2)O (nell'acqua e nella
fase gassosa), Cg la concentrazione di N(base 2)O nella fase gassosa,
Vg il volume della fase gassosa, V1 il volume della fase liquida ed
alfa il coefficiente di Bunsen. Per comodità del lettore si
riportano alcuni valori di questo coefficiente relativi al protossido
di azoto.

Temp. coeff. di
gradi C Bunsen

10 0,882
15 0,743
20 0,632
25 0,544

Metodo II.5.2.

Valutazione della denitrificazione potenziale del suolo D.E.A.

1. Principio
Tale saggio, tramite A.I.T. ed incubazione di un campione di suolo
in anaerobiosi, permette di determinare del potenziale enzimatico
denitrificante del suolo (Denitrifying Enzyme Activity, D.E.A.).

2. Reattivi
2.1. Acqua sterile;
2.2. soluzione 1,4 mM di KNO(base 3);
2.3. soluzione 1 mM di cloramfenicolo;
2.4. acetilene PP in bombola;

3. Apparecchiatura
3.1. Beute Pyrex, con collo senza bordo, da 50mL;
3.2. tappi perforabili in gomma al silicone, con bordo
ribaltabile;
3.3. siringhe monouso da 1 e da 10 mL;
3.4. iringhe per gas cromatografia da 0,1 mL, 0,5 mL e 1 mL;
3.5. contenitori portatili per gas da 1,5 L, a volume variabile;
3.6. plastigas;
3.7. vial da 5 mL, con tappo perforabile e ghiera di protezione in
alluminio (tipo flacone per antibiotici) a tenuta di vuoto, riempiti
con cloruro di calcio granulare (pezzatura 1-2 mm);
3.8. sistema per vuoto;
3.9. cabina per anaerobiosi, con atmosfera di N(base 2) (80%),
CO(base 2) (15%), H(base 2) (5%);
3.10. gas cromatografo con rivelatore a cattura di elettroni
(ECD), equipaggiato con colonna di acciaio, lunga 2 m e con diametro
interno di 2 mm, impaccata con Poropak Q 80-100 mesh.

4. Procedimento
Campioni di 20 g di suolo (nel caso dei suoli agrari o degli
orizzonti minerali) o di 10 g (nel caso degli orizzonti organici dei
suoli agrari) vengono disposti in beute da 50 mL ed umidificati
preventivamente fino al 50% della loro capacità di ritenuta idrica
con acqua sterile.
Quindi si trasferiscono le beute nella cabina per anaerobiosi e si
procede alla aggiunta di 10 mL di soluzione costituita da una miscela
delle soluzioni di nitrato di potassio e di cloramfenicolo in modo da
ottenere una concentrazione del primo pari a 20 µg per g di suolo e
pari a 300 µg per g di suolo del secondo.
Si tappano le beute e si aggiunge C(base 2)H(base 2) con una
siringa da 10 mL per raggiungere la concentrazione di questa del 10 %
v/v. Terminata quest'ultima operazione si dispongono le beute su un
agitatore orbitale a 120 r.p.m. in modo da ottenere una fanghiglia.
Questo consente di favorire al massimo le reazioni tra il substrato e
la carica enzimatica denitrificante presente nel suolo e di ridurre
al massimo la durata della prova. Da questo momento si inizia a
calcolare il tempo di incubazione (2 h) nel corso del quale si
effettuano tre prelievi del gas nello spazio di testa delle beute: il
primo immediatamente all'avvio dell'incubazione (tempo zero), il
secondo dopo un ora e il terzo dopo due ore. I campioni gassosi
prelevati vengono trasferiti nei vial, come descritto anche nella
metodica precedente, e ivi conservati in attesa dell'analisi al gas
cromatografo.
La metodologia analitica gas cromatografica non differisce da
quella descritta sopra per la valutazione dell'attività
denitrificante in situ e ad essa si rimanda, tenendo presente che, in
questo caso, è sempre necessario procedere al calcolo dell'N(base
2)O disciolto nella fase acquosa.

Metodi III.1.

DETERMINAZIONE DEL POTENZIALE NITRIFICANTE

1. Oggetto
Il presente documento fissa i metodi per la determinazione del
potenziale nitrificante del suolo.

Metodo III.1.1.

Determinazione del potenziale nitrificante del suolo condizionato
alla capacità di campo

1. Principio
Il metodo, si basa sull'incubazione del suolo trattato con ammonio
solfato e sulla misura del contenuto di nitrati prodotti dopo 3
settimane di incubazione a 25 gradi C.

2. Reattivi
Nel corso dell'analisi si utilizzano acqua distillata e reagenti di
qualità analitica riconosciuta.
2.1. Ammonio solfato, [NH(base 4](base 2)SO(base 4), soluzione 0,2
mol/L: in un becher da 1000 mL si sciolgono 26,428 g di [NH(base
4](base 2)SO(base 4) con circa 700 mL di acqua. Si travasa in un
matraccio tarato da 1000 mL e quindi si porta a volume con acqua;
2.2. soluzione estraente di potassio solfato 0,5 mol/L o di potassio
cloruro 2 mol/L: si sciolgono 87,13 g di K(base 2)SO(base 4) o 149,12
g di KCl con circa 700 mL di acqua in un becher da 1000 mL. Si
travasa in un matraccio tarato da 1000 mL e si porta a volume con
acqua.

3. Apparecchiatura
Corrente attrezzatura da laboratorio e in particolare:
3.1. centrifuga;
3.2. agitatore meccanico;
3.3. camera termostatica.

4. Procedimento

4.1. Determinazione del contenuto iniziale di azoto nitrico presente
nel suolo
Si pesano 20 g di suolo fresco in una bottiglia di polietilene da 250
ml, si aggiungono 100 mL della soluzione estraente e si agita per 60
minuti. Si centrifuga, si filtra (Whatman n. 42) e nell'estratto
limpido si determina il contenuto di azoto nitrico.

4.2. Incubazione
Si pesano 100 g di suolo fresco in un becher e si aggiungono 2 mL
della soluzione di [NH(base 4](base 2)SO(base 4) 0,2 mol/L ed acqua
in quantità sufficiente per portare il suolo alla capacità di
campo. Si tappa il becher con un velo di parafilm leggermente forato,
si pesa e si pone in incubatore a 25 gradi C in assenza di luce per 3
settimane. È necessario pesare il becher settimanalmente e, se
occorre, aggiungere acqua allo scopo di mantenere l'umidità del
suolo alla capacità di campo.

4.3. Prova in bianco
Si effettua parallelamente una prova in bianco nelle stesse
condizioni, omettendo il solfato di ammonio.

4.4. Estrazione dell'azoto nitrico
Alla fine dell'incubazione si pesano 20 g di suolo in una bottiglia
di polietilene da 250 mL e si aggiungono 100 mL di soluzione
estraente. Si agita su agitatore meccanico per 60 minuti a
temperatura ambiente, si centrifuga a 4.000 giri/min per 5-10 minuti
(oppure si lascia in riposo 30 minuti) e quindi si filtra su filtro
Whatman n. 42. Su un'aliquota del filtrato si dosa poi l'azoto
nitrico.

5. Espressione dei risultati
I risultati vengono espressi in microg di N-NO (base 3 elevato a -)
g(elevato -1) di suolo seccato in stufa a 105 gradi C.
Il valore dell'attività nitrificante "potenziale" sarà ricavato per
differenza:

No = Nt-Ni

dove:
No è l'attività nitrificante potenziale;
Nt è il contenuto di azoto nitrico nel campione trattato con solfato
di ammonio;
Ni è il contenuto iniziale di azoto nitrico.
Il valore dell'attività nitrificante "attuale" sarà ricavato per
differenza:

Nc = Nn-Ni

dove:
Nc è l'attività nitrificante attuale;
Nn è il contenuto di azoto nitrico nel campione non trattato (prova
in bianco);
Ni è il contenuto iniziale di azoto nitrico.

Metodo III.1.2.

Misura del potenziale nitrificante sulla sospensione del suolo (a)

1. Principio
In questo metodo, i campioni di suolo sono trattati con un eccesso
di liquido (soil slurry) ed incubati per 24 ore sotto agitazione
continua in condizioni ottimali di umidità, aerazione e contenuto di
fosforo e azoto ammoniacale. Il contenuto di nitrati viene misurato
sulla sospensione del suolo prelevata ad intervalli di tempo
prestabiliti.

2. Reattivi
Nel corso dell'analisi si utilizzano acqua distillata e reagenti
di qualità analitica riconosciuta.
2.1. Ammonio solfato, [NH(base 4](base 2)SO(base 4), soluzione 50
mmol/L: in un becher da 1000 mL si sciolgono 6,607 g di [NH(base
4](base 2)SO(base 4) con circa 700 mL di acqua. Si travasa in un
matraccio tarato da 1000 mL e quindi si porta a volume con acqua.
2.2. Fosfato bipotassico, K(base2)HPO (base 4), soluzione 0,2
mol/L: in un becher da 100 mL si sciolgono 3,484 g di K(base2)HPO
(base 4) con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio tarato
da 100 Ml e quindi si porta a volume con acqua.
2.3. Fosfato monopotassico, KH(base2)PO (base 4), soluzione 0,2
mol/L: in un becher da 100 mL si sciolgono 2,722g di KH(base2)PO
(base 4) con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio tarato
da 100 mL e quindi si porta a volume con acqua.
2.4. Soluzione tampone a pH 7,2 (1,5 mmol/L di NH (base 4 elevato
+) e 1 mmol/L di PO4-3): si prelevano 3,5 mL della soluzione di
K(base2)HPO (base 4), 1,5 mL della soluzione di KH(base2)PO (base 4)
e 15 mL della soluzione di [NH(base 4](base 2)SO(base 4) e si
introducono in un matraccio tarato da 1000 mL. Si porta a volume con
acqua dopo aver aggiustato il pH a 7,2 con una soluzione diluita di
H(base 2)SO(base 4) o di NaOH. La soluzione è chimicamente stabile
ma occorre riprepararla dopo un certo periodo perchè può essere
contaminata da crescita microbica. Conservare le soluzioni in
frigorifero.

3. Apparecchiatura
Corrente attrezzatura da laboratorio e in particolare:
3.1. Centrifuga.
3.2. Agitatore oscillante.
3.3. Camera termostatica.

4. Procedimento
4.1. Incubazione
Si pesano 15 g di suolo fresco (10 g se il suolo presenta un
contenuto elevato di sostanza organica) in una beuta da 250 mL e si
aggiungono 100 mL di soluzione tampone a pH 7,2. Si chiude la beuta
con un tappo di cotone o di gomma forato e si agita per 24 ore a 25
gradi C.

4.2. Campionamento
Si effettuano 4 campionamenti (2, 4, 22 e 24 ore) al fine di
esaminare la cinetica del processo. Si prelevano, nel momento in cui
cessa l'agitazione, 10 mL della sospensione omogenea o una quantità
superiore, nel caso che la sospensione venga filtrata, con una
pipetta automatica provvista di puntale con apertura adeguata. Si
centrifuga in tubi da centrifuga da 15 mL a 8000 giri/min per 8
minuti oppure si filtra su filtri Whatman n. 42.
Sull'estratto limpido si determina il contenuto di azoto nitrico

5. Espressione dei risultati
I risultati vengono espressi in µg di N-NO (base 3 elevato a -)
h(elevato -1) g(elevato -1) di suolo seccato in stufa a 105 gradi C
(NO (base 3 elevato a -) h(elevato -1) g-1: 3=pedice; -=apice;
-1=apice).
Alcuni consigliano di determinare anche la concentrazione di N-NO
(base 2 elevato a -) e di sommare questo valore a quello dell'azoto
nitrico al fine di calcolare la velocità di nitrificazione (NO (base
2 elevato a -): 2=pedice; -=apice).

Metodo III.1.3.

Misura del potenziale nitrificante sulla sospensione del suolo (b)

1. Principio
Tale metodo prevede l'incubazione per 6 ore di campioni di suolo
trattati con una soluzione (soil sluriy) contenente fosforo, ammonio
e sodio clorato. In presenza di clorato la quantità di nitrito che
si accumula corrisponde alla quantità di azoto ammoniacale ossidato.
Il contenuto di nitriti viene misurato sulla sospensione del suolo
prelevata ad intervalli di tempo prestabiliti.

2. Reattivi
Nel corso dell'analisi si utilizzano acqua distillata e reagenti
di qualità analitica riconosciuta.
2.1. Potassio cloruro, KCl, soluzione 4 mol/L: in un becher da
1000 mL si sciolgono 298 g di KCl con circa 700 mL di acqua. Si
travasa in un matraccio tarato da 1000 mL e quindi si porta a volume
con acqua. 2.2. Fosfato bipotassico, K(base2)HPO (base 4), soluzione
0,2 mol/L: in un becher da 100 mL si sciolgono 3,484 g di K(base2)HPO
(base 4) con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio tarato
da 100 mL e quindi si porta a volume con acqua.
2.3. Fosfato monopotassico, KH(base2)PO (base 4), soluzione 0,2
mol/L: in un becher da 100 mL si sciolgono 2,722 g di KH(base2)PO
(base 4) con circa 70 mL di acqua. Si travasa in un matraccio tarato
da 100 mE e quindi si porta a volume con acqua.
2.4. Soluzione stock A: si prelevano 28 mL di soluzione di
K(base2)HPO (base 4) e si introducono in un matraccio tarato da 100
mL, si aggiungono 72 mL di soluzione di KH(base2)PO (base 4) e si
porta a volume con acqua.
2.5. Soluzione stock B: Sodio clorato, NaC1O3, soluzione 1M: in un
becker da 100 mL si sciolgono 10,64 g di NaClO3 con circa 70 mL di
acqua Si travasa in un matraccio tarato da 100 mL e quindi si porta a
volume con acqua.
2.6. Soluzione tampone a pH circa 7,2: si prelevano 10 mL della
soluzione stock A e si introducono in un matraccio tarato da un
litro. Si aggiungono 15 mE della soluzione stock B e 0,5 g di
[NH(base 4](base 2)SO(base 4). Si porta a volume con acqua.

3. Apparecchiatura
Corrente attrezzatura da laboratorio e in particolare:
3.1. Centrifuga.
3.2. Agitatore oscillante (175 rpm).
3.3. Camera termostatica.

4. Procedimento
4.1. Incubazione
Si pesano 25 g di suolo fresco in una beuta da 250 mL e si
aggiungono 100 mL di soluzione tampone a pH 7,2. Si chiude la beuta e
si agita per 6 ore a 25 gradi C.

4.2. Campionamento
Dopo 2 e 6 ore si prelevano, nel momento in cui cessa
l'agitazione, in modo da mantenere costante il rapporto suolo:
soluzione, 2 mL della sospensione in un tubo da centrifuga e si
aggiungono 2 mL di KCl.
Si centrifuga a 3000 giri/min per 2 minuti, se necessario si
filtra con carta Whatman n. 42. Sull'estratto limpido si determina il
contenuto di N-NO (base 2 elevato a -).

5. Espressione dei risultati
I risultati vengono espressi in ng di N-NO (base 2 elevato a -)
min(elevato alla -1) g(elevato -1) di suolo seccato in stufa a 105
gradi C.

Note

Se la determinazione del contenuto di N-NO (base 2 elevato a -)
richiede una maggiore quantità di estratto, si consiglia di
utilizzare 10 mL di slurry per ogni campionamento e di prelevare il
surnatante dopo sedimentazione.
In questo caso, la centrifugazione o la filtrazione potrebbero non
essere necessarie.
Se non è possibile effettuare immediatamente l'analisi gli
estratti devono essere conservati in frigorifero a 4-8 gradi C per
non più di 24 ore. Si consiglia di non congelare gli estratti.
Se vengono utilizzati fanghi il contenuto di ossigeno dello slurry
potrebbe essere limitante; in questo caso occorre aerare i
contenitori o aggiungervi direttamente ossigeno.

6. Note
I nitrati negli estratti di suolo possono essere determinati per
via colorimetrica, per distillazione in corrente di vapore o mediante
l'uso di un elettrodo specifico.
Per la dettagliata descrizione dei metodi di determinazione,
rimando al Manuale di Metodi Chimici della medesima collana.

Metodi III.2.

ATTIVITÀ AMMONIFICANTE POTENZIALE

1. Oggetto
Il presente documento fissa i metodi per la determinazione della
attività ammonificante del suolo.

Metodo III.2.1.

Metodo della piastra di terra

1. Principio
Il metodo si basa sull'aggiunta ad un campione di suolo di una
quantità nota di sostanza azotata proteica misurandone ogni giorno
la quantità di ammoniaca liberata nell'atmosfera.

2. Reattivi
2.1. Polvere di sangue essiccato;
2.2. acido solforico N/50;
2.3. idrossido di sodio N/50.

3. Procedimento
Distribuire sul fondo di una piastra Petri di 10 cm di diametro
senza coperchio 50 g di suolo e 0.5 g di polvere di sangue essiccato.
Aggiungere 12 mL di acqua (25% di umidita). Porre la piastra Petri in
una di dimensioni maggiori (15 cm di diametro). Versare nella piastra
più grande 10 mL di acido solforico N/50 esattamente misurati e
qualche goccia di rosso di metile come indicatore di viraggio.
Chiudere la piastra grande con il suo coperchio ed incubare a 28
gradi C. Ripetere tre volte ciascuna determinazione. Ogni giorno
titolare la quantità di ammoniaca liberata nel seguente modo:

- levare dalla piastra più grande quella contenente il suolo;
- sciacquare al di sopra della piastra grande il fondo di quella più
piccola con una spruzzetta;
- titolare l'acido solforico con della soda N/50;
- scolare e rimpiazzare i 10 mL di acido solforico N/50 per la
titolazione del giorno dopo.

Si incuba per un periodo di 12 giorni (di solito la produzione
dell'ammoniaca alla fine di questo periodo è molto debole).

4. Espressione dei risultati
Si traccia una curva dello sviluppo quotidiano di ammoniaca su un
foglio di carta millimetrata riportando sull'ascisse il tempo
(giorni) e sulle ordinate la quantità di ammoniaca titolata
(millilitri di soda N/50 oppure azoto od ammoniaca). La curva di
ammonificazione ha il suo massimo in genere intorno al quinto giorno.
In modo analogo si calcola la quantità totale di ammoniaca
liberata durante tutta la durata dell'esperimento.

Metodo III.2.2.

Metodo della caseina lattica

1. Principio
Il metodo si basa sull'aggiunta al suolo di una macromolecola
proteica la cui mineralizzazione coinvolge tutti i microrganismi
ammonizzanti. In particolare un campione di suolo viene incubato per
6 settimane in presenza di un eccesso di caseina lattica. Il suolo
viene lisciviato ad intervalli di tempo definiti e l'azoto
ammoniacale determinato colorimetricamente.

2. Reattivi
2.1. Soluzione satura di CaSO(base 4)
2.2. soluzione nutritiva esente da azoto (0.002 M CaSO(base
4)*2H(base 2)O, 0.005 M Ca(H(base 2)PO(base 4)), 0.0025 M K(base
2)SO(base 4), 0.002 M MgSO(base 4)).

3. Procedimento
Il suolo (50 g), miscelato in parti uguali con sabbia di quarzo e
disposto in buchner (diametro esterno di 13 cm) su uno strato di
circa 2 cm, viene incubato alla temperatura di 30 gradi C ± 0.5 ed al
60% della WHC previa aggiunta di azoto nella quantità di 250 mg/kg
sotto forma di caseina lattica. Mantenendo costante l'umidità, ad
intervalli di tempo di 7 giorni si procede a lisciviare il suolo con
900 mL di una soluzione satura di CaSO(base 4) e, successivamente, a
reintegrare gli elementi nutritivi trattando il terreno con 100 mL di
una soluzione esente da azoto (0.002 M CaSO(base 4)*2H(base 2)O,
0.005 M Ca(H(base 2)PO(base 4)), 0.0025 M K(base 2)SO(base 4), 0.002
M MgSO(base 4).
Nei percolati viene determinato, per via colorimetrica, sia
l'azoto nitrico (che dovrebbe risultare in tracce) che quello
ammoniacale. La durata dell'incubazione è di 6 settimane.
Parallelamente viene allestita una prova in bianco del tutto analoga
alla precedente fatta eccezione per l'aggiunta della caseina lattica.

4. Espressione dei risultati
La quantità di ammonio proveniente dall'ammonizzazione della
sostanza organica endogena del suolo (detta "A" ed espressa in mg di
azoto per g di suolo) dovrà essere sottratta di volta in volta dalla
quantità sviluppata dalla tesi con aggiunta di caseina lattica
(detta "B") secondo la seguente formula:

B-A
% NH(base 4 elevato a +)/(g suolo x 7 giorni) = ------ x 100
250

Metodo III.2.3.

Metodo dell'arginina

1. Principio
Tale metodo, utilizzato adottando delle modifiche tecniche minori,
si basa, come il precedente, sull'aggiunta al suolo di una quantità
nota di sostanza organica azotata in eccesso e misurando la quantità
di ammoniaca prodotta dopo incubazione.

2. Reattivi
2.1. Soluzione di arginina allo 0.2%. Sciogliere 2 g di arginina
in 1000 mL di acqua distillata. Conservare in frigorifero a +4 gradi
C;
2.2. soluzione di KCl 2M. Sciogliere 149.1 g di KCl in 1000 mL di
acqua distillata.

3. Procedimento
In 3 bottiglie di polietilene da 150 mL si pesano il corrispettivo
di 10 g di suolo secco all'aria, si aggiungono 2.5 mL di arginina
allo 0.2% e si incubano a 33 gradi C per 2-3 ore prima di congelare.
Ripetere l'operazione inoculando altri 3 sottocampioni con 2.5 mL di
acqua distillata. Si scongelano i campioni, si estraggono con 50 mL
di KCl 2M,si agita per 1 ora, si filtra su Whatman N. 42 e si
conserva in frigorifero a + 4 gradi C. È prevista la determinazione,
a parte, del contenuto in acqua dei campioni.

4. Espressione dei risultati
Il contenuto in NH (base 4 elevato +) scambiabile può essere
determinato colorimetricamente e esprime i risultati secondo la
seguente espressione:

mgNH(base 4 elevato a +)/(g suolo x ora)=

(NH(base 4 elevato a +) - C - NH (base 4 elevato +) - B) x (ml KCl +
ml Arg + ml H(base 2)O campione)
----------------------------------------------------------
g suolo X ore incubazione

Metodo III.3.

RESPIRAZIONE DEL SUOLO INDOTTA DALL'AGGIUNTA DI SUBSTRATO (METODO
SIR)

1. Oggetto
Il presente documento fissa un metodo per la determinazione della
respirazione del suolo.

2. Principio
Il metodo si basa sulla determinazione della respirazione del
suolo mediante il consumo di ossigeno o la produzione della CO(base
2) immediatamente dopo l'aggiunta di substrato a concentrazioni
saturanti. Il SIR è calibrato utilizzando uno dei metodi della
fumigazione per la determinazione della biomassa microbica.

3. Procedimento
La determinazione del SIR può essere eseguita seguendo tecniche
diverse riportate in letteratura da vari autori e di seguito
descritte.
In linea generale il metodo SIR prevede le seguenti fasi:

- preparazione del campione;
- aggiunta al suolo della concentrazione saturante di glucosio in
soluzione o in polvere ed omogeneizzazione del substrato nel suolo.
Se il glucosio è utilizzato in polvere si aggiunge un materiale
inerte (talco) per facilitarne la dispersione;
- incubazione del suolo (generalmente a 25 gradi C) per un periodo di
5-6 ore;
- determinazione della respirazione massima iniziale seguendo una
delle tecniche riportate di seguito;
- calcolo dell'aliquota di CO(base 2) prodotta per ora di incubazione
per 100 grammi di suolo (peso secco) e calcolo della biomassa
microbica equivalente alla respirazione massima iniziale
utilizzando l'equazione descritta in (4).

3.1. Preparazione del campione
Il campione di suolo viene setacciato (&lt; 2 mm) per eliminare i
residui delle radici e la macrofauna presente. Il setacciamento rende
il suolo maggiormente omogeneo facilitando sia la dispersione del
glucosio sia il rilascio della CO(base 2) evoluta.
La stima del SIR in suoli seccati all'aria non risulta corretta in
quanto una parte della biomassa microbica potrebbe essere inattivata
o uccisa. In suoli naturalmente secchi o con un basso contenuto di
umidità è comunque possibile applicare il metodo SIR per la stima
della biomassa microbica senza dover ricorrere all'umidificazione o
alla pre-incubazione.
3.2. Aggiunta al suolo della concentrazione saturante di glucosio
in soluzione o in polvere L'aggiunta del substrato può avvenire
utilizzando il glucosio in soluzione o in polvere. In quest'ultimo
caso il glucosio viene disperso in talco (0.5 g di talco per 100 g di
suolo) al fine di rendere più omogenea la concentrazione del
glucosio nel suolo. La concentrazione ottimale di glucosio da
aggiungere al suolo deve essere stabilita di volta in volta eseguendo
degli esperimenti preliminari; la concentrazione ottimale di glucosio
è generalmente compresa tra 1 e 8 mg g(elevato -1) a seconda delle
tipologie di suolo. Se il substrato è disciolto in acqua la
concentrazione della soluzione varia da 8 a 30 mg Ml-1.

3.3. Incubazione del suolo
Un'aliquota di suolo pari a 1 g di suolo secco, al quale è stato
aggiunto il substrato, viene posta in un recipiente di vetro che a
sua volta è inserito in bottiglie il cui volume è di 28-30 mL o in
siringhe con un volume di 60 ml. Le bottiglie o le siringhe, chiuse
ermeticamente per impedire gli scambi gassosi con l'atmosfera,
vengono incubate a 25 gradi C per circa 5-6 ore dopo l'aggiunta del
substrato.

3.4. Determinazione della respirazione massima iniziale
Le determinazioni della CO(base 2) sono eseguite sia sui suoli a
cui non è stato aggiunto il substrato (controllo) sia sui suoli
lasciati incubare per 5-6 ore dall'aggiunta di glucosio.
Per la determinazione della CO(base 2) possono essere utilizzate
varie apparecchiature, le più comunemente utilizzate sono:
3.4.1. gas cromatografo (GC);
3.4.2. sistema a flusso di aria;
3.4.3. respirometro (Sapromat);
3.4.4. ultragas 3 (Wosthoff analizzatore di CO(base 2)
3.4.5. analizzatore ad infrarossi.
3.4.1. Gas cromatografia
La determinazione della CO(base 2) mediante l'uso della tecnica
della gas cromatografia è semplice e veloce e consente di leggere
circa 40 campioni per ora.
Il campione di gas prelevato dallo spazio di testa mediante una
siringa è generalmente di 1 mL. I gas cromatografi hanno la fase
stazionaria costituita da colonne Poropak (T, Q) in acciaio
inossidabile di 1.5-2.2 m, diametro interno di 1-2 mm e utilizzano
come gas di trasporto l'elio (He). I detector per la determinazione
della CO(base 2) sono generalmente quelli a termoconducibilità
(TCD). La calibrazione dello strumento è eseguita mediante l'uso di
standard di CO(base 2) a concentrazione nota.

3.4.2. Sistema a flusso di aria
Il sistema per la determinazione della CO(base 2) consiste in un
apparato costituito da beute (125 mL) contenenti 30 g di suolo,
all'interno delle quali viene insuffiata aria priva di CO(base 2). Il
gas in uscita dalle beute (flusso pari a 50-80 mL min(elevato alla
-1)) viene fatto passare attraverso 50 mL di NaOH 10-20 mM in modo
che la CO(base 2) liberata dal suolo possa essere trasportata dalla
corrente di aria e catturata dalla soluzione alcalina. Si aggiunge il
glucosio in soluzione portando il suolo al 120 % della capacità di
campo in quantità pari a 8 mg g(elevato -1) di suolo. La quantità
di CO(base 2) catturata dalla soluzione di NaOH fu determinata,
previa precipitazione dei carbonati con l'aggiunta di BaCl(base 2),
mediante la titolazione a pH 8.6 con HCl a molarità nota ed
utilizzando come indicatore di pH la fenolftaleina.

3.4.3. Respirometro (Sapromat)
I respirometri sono considerati sistemi di misura migliori
rispetto ai sistemi statici della gas cromatografia nelle
determinazioni su suoli alcalini. Infatti, a seguito della cattura
della CO(base 2) in soluzione alcalina il sistema provvede alla
misurazione sia del consumo di O(base 2) sia della produzione di
CO(base 2), così come è stato descritto nello specifico capitolo
relativo alla respirazione del suolo.
Si Utilizzano 0.5 g di suolo posti in un volume di 19 mL e 0.3 mL
di KOH 5 M per intrappolare la CO(base 2) prodotta. 1 mL di glucosio
è aggiunto al suolo in soluzione (30 mg mL(elevato alla -1)) e la
respirazione è misurata ogni 30 minuti leggendo direttamente le
variazioni di pressione al micromanometro.

3.4.4. Ultragas 3 (Wosthoff) analizzatore di CO(base 2)
Lo strumento l'Ultragas 3 (Wosthoff), analizzatore di CO(base 2),
consente di sottrarre la CO(base 2) dall'ambiente in cui è stata
prodotta mediante una corrente di aria, dopo di che la CO(base 2)
viene catturata da una soluzione di NaOH 0.04 N. La conducibilità
della soluzione alcalina varia in funzione della quantità di CO(base
2) catturata e pertanto le letture di conducibilità dopo essere
state registrate vengono automaticamente convertite in concentrazione
di CO(base 2).
La quantità di suolo necessaria per ogni campione è di circa 100
g a cui viene aggiunto il glucosio in polvere mescolato con talco nel
rapporto di 1:3. Il suolo e il substrato vengono omogeneizzati
assicurando una distribuzione uniforme del glucosio nel suolo. I
campioni da analizzare vengono posti in provette di plastica (25 x 4
mm) chiuse con tappi di poliuretano e collegate con l'analizzatore di
CO(base 2).
Il flusso di aria priva di CO(base 2) è intermittente (ogni ora,
per circa 20 minuti) e il tasso di respirazione viene misurato per 10
minuti.

3.4.5. Analizzatore ad infrarossi
L'analizzatore di gas a infrarossi è un metodo per la
determinazione della CO(base 2) molto sensibile ed è stato
utilizzato anche per la determinazione della respirazione del suolo.

4. Espressione dei risultati
La differenza tra la respirazione dopo 5-6 ore di incubazione dei
suoli a cui è stato aggiunto glucosio e quella basale (controllo) è
espressa come µmol CO(base 2) g(elevato -1) suolo secco h(elevato
alla -1).

x =(X6-X0)/h

dove

X = mL di CO(base 2) 100 g(elevato -1) h(elevato -1) (respirazione
indotta dall'aggiunta di substrato-SIR);

X6 = mL di CO(base 2) dopo 6 ore di incubazione dall'aggiunta di
substrato;

Xo = mL di CO(base 2) relative alla respirazione basale (controllo);

h = ore di incubazione (5 o 6).

Metodi IV.1.

ATTIVITÀ UREASICA DEI SUOLI

1. Oggetto
Il presente documento fissa i metodi per la determinazione della
attività ureasica del suolo.

Metodo IV.1.1.

Determinazione mediante la misura dell'urea non consumata

1. Principio

Il metodo di determinazione prevede l'incubazione, per un tempo
prefissato, di un campione di suolo con una soluzione non tamponata
di urea e la misura della quantità di urea non trasformata mediante
determinazione colorimetrica.
L'incubazione va effettuata in assenza di un batteriostatico.

2. Reattivi
Utilizzare acqua bidistillata o ultrapura e reagenti di grado
analitico:
2.1. soluzione di urea 2 mg ML-1 in acqua: sciogliere 2.0 g di
urea in circa 700 mL di acqua, e portare a volume finale di 1 litro
con acqua;
2.2. soluzione di acetato di fenilmercurio (PMA) 50 mg L-1 in
acqua;
2.3. soluzione di fenilmercurio acetato e cloruro potassico
(KCl-PMA) (2 M KCl-5 mg L-1 PMA): sciogliere 1.5 g di KCl in 9 litri
di acqua e aggiungere i litro di soluzione di PMA (2.2.);
2.4. soluzione di diacetilmonossima (DAM): sciogliere 2.5 g di DAM
in 100 mL di acqua;
2.5. soluzione di tiosemicarbazide (TSC): sciogliere 0.25 g di TSC
in 100 mL di acqua;
2.6. soluzione acida: aggiungere 300 mL di acido fosforico (H3PO4)
all'85% e 10 mL di acido solforico concentrato (H(base 2)SO(base 4))
a 100 mL di acqua e portare a volume finale di 500 mL con acqua;
2.7. soluzione colorante: mescolare immediatamente prima dell'uso
25 mL di soluzione di diacetilmonossima (2.4.) e 10 mL di soluzione
di tiosemicarbazide (2.5.) con 500 mL di reagente acido (2.6.);
2.8. soluzione standard di urea (250 mg/mL: sciogliere 0.5 g di
urea in circa 1500 mL di soluzione di KCl-PMA (2.3.), e diluire a 2
litri con la stessa soluzione. Tale soluzione contiene 250 µg di urea
miL-1, se l'urea utilizzata è pura.
Tutti i reattivi sono stabili per parecchie settimane se
conservati a 4 gradi C in frigorifero, tranne il reattivo colorante
(2.7.) che deve essere preparato immediatamente prima dell'uso.

3. Apparecchiatura
Normale attrezzatura da laboratorio e in particolare:
3.1. beute tarate da 50 mL, provviste di tappo di vetro;
3.2. bagno termostatico;
3.3. bagnomaria bollente;
3.4. imbuti filtranti da vuoto (di polietilene);
3.5. spettrofotometro o colorimetro.

4. Procedimento
4.1. Saggio di attività
Incubare in una bottiglia di vetro chiusa 5 g di suolo umido cioè
non seccato all'aria, preventivamente setacciato (&lt;2 mm sulla base di
un campione seccato in stufa), con 5 mL di soluzione di urea 2 mg
ML-1 (10 mg di urea) per 5 ore a 37 gradi C in bagno termostatico.
Alla fine dell'incubazione, rimuovere il tappo e aggiungere 50 mL di
reagente 3. Chiudere di nuovo la bottiglia e agitare per 1 ora.
Filtrare la sospensione di suolo, sotto vuoto, utilizzando un filtro
di carta Whatman n. 42.
Effettuare il saggio in tre repliche.
4.2. Determinazione colorimetrica dell'urea
Pipettare una aliquota (1-2 mL) di estratto ottenuto dopo
filtrazione, contenente al massimo 200 µg di urea in una beuta tarata
da 50 mL, portare a un volume di 10 mL con la soluzione KCl-PMA, e
aggiungere 30 mL della soluzione colorante (2.7.). Agitare
vigorosamente per alcuni secondi per mescolare bene i componenti e
porre in bagnomaria bollente. Dopo 30 minuti di incubazione,
raffreddare immediatamente la beuta sotto acqua corrente per almeno
15 minuti (o ponendo in bagno di acqua fredda a 12-20 gradi C).
Portare il volume a 50 mL con acqua e mescolare accuratamente.
Misurare l'intensità della colorazione rossa prodotta a 500-550 nm
(il massimo di assorbimento è riportato a 527 nm) con lo
spettrofotometro (nel caso che venga usato un colorimetro usare un
filtro verde n. 54).
4.3. Preparazione di una curva di calibrazione
Diluire 10 mL di soluzione standard di urea (2.8.) a 100 mL con la
soluzione (KCl-PMA) (2.3.) in una beuta tarata e mescolare
accuratamente. Pipettare, poi, 0, 1, 2, 4, 6, e 8 mL di tale
soluzione in tante beute tarate da 50 mL, aggiustare il volume a 10
mL la soluzione KCl PMA e procedere esattamente come descritto
precedentemente per la determinazione dell'urea nell'estratto di
suolo. I vari campioni conterranno rispettivamente 0, 25, 50, 100,
150 e 200 µg di urea.

5. Espressione dei risultati
L'attività ureasica si esprime in quantità (g o moli) di urea
idrolizzata da 1 g di suolo in 1 ora di incubazione.
Calcolare la quantità di urea rimasta (A) mediante la curva di
calibrazione preparata utilizzando la soluzione standard di urea. La
quantità di urea idrolizzata da 1 g suolo in 1 ora di incubazione
sarà data dalla differenza fra i g di urea inizialmente aggiunti (10
g) e quelli misurati nell'estratto (A), il tutto diviso per 5 (g di
suolo incubati) e ancora per 5 (ore totali di incubazione).

Attività ureasica = (10-A)/5 x 5

Metodo IV.1.2.

Determinazione mediante misura dell'ammoniaca prodotta

1. Principio

Il metodo di determinazione prevede l'incubazione per un tempo
prefissato di un campione di suolo con una soluzione non tamponata o
tamponata di urea. Sul filtrato del campione si effettua la misura
della quantità di ammoniaca prodotta mediante determinazione
colorimetrica.
L'incubazione va effettuata in assenza di un batteriostatico.
L'ammoniaca formatasi reagisce con il sodio salicilato in presenza
di sodio dicloroisocianurato e in condizioni alcaline forma un
complesso stabile di colore verde. La presenza del sodio
nitroprussiato nella miscela di incubazione agisce da catalizzatore e
aumenta la sensibilità del metodo di circa 10 volte.

2. Reattivi
Utilizzare acqua bidistillata o ultrapura e reagenti di grado
analitico:
2.1. soluzione concentrata di urea (0.72 M) in acqua: sciogliere
43.2 g di urea in circa 700 mL di acqua, e portare a volume finale di
1 litro con acqua;
2.2. soluzione diluita di urea (0.08 M) in acqua: sciogliere 4.8 g
di urea in 700 mL di acqua e portare a volume finale di 1 litro con
acqua oppure diluire la soluzione 0.72 M alla molarità finale 0.08 M
(fattore di diluizione 9);
2.3. soluzione di cloruro potassico e acido cloridrico (1 N
KCl-0,01 N HCl): sciogliere 74.56 g di KCl in 1 litro di 0.01 N HCl;
2.4. tampone borato pH 10: mescolare 50 mL di 0.025 M Na2B4O7 x 10
H(base 2)O (9.525 g L-1) con 18.3 mL di NaOH 0.1 M e diluire a 100 mL
con acqua;
2.5. soluzione di sodio salicilato: mescolare al momento dell'uso
100 mL di sodio nitroprussiato 0.12% (1.2 g L-1), 100 mL di sodio
salicilato 17% (170 g L-1) e 100 mL di acqua distillata;
2.6. soluzione di dicloroisocianurato sodico 0.1%: sciogliere 1 g
di dicloroisocianurato sodico in 1 litro di acqua;
2.7. soluzione standard di NH4Cl (NH(base 4 elevato a +)-N, 1 mg
ML-1): sciogliere 3.8207 g di NH4Cl in 1 litro di acqua.

3. Apparecchiatura
Normale attrezzatura da laboratorio e in particolare:
3.1. beute tarate da 100 mL, provviste di tappo di vetro;
3.2. bagno termostatico;
3.3. agitatore meccanico;
3.4. imbuti filtranti da vuoto (di polietilene);
3.5. spettrofotometro o colorimetro.

4. Procedimento
4.1. Saggio di attività

a) Saggio in assenza di tampone: 5 g di suolo (campioni di suolo
fresco-umido preventivamente setacciati (&lt;2 mm) e conservati in
buste di polietilene a 4 gradi C) vengono posti in beute da 100 mL
e umettati con 2.5 mL di soluzione 0.08 M di urea (2.2.). Le
beute, chiuse con tappo di vetro, vengono incubate per 2 ore a 37
gradi C in bagno termostatico. Dopo incubazione, i tappi vengono
rimossi e ai campioni vengono aggiunti 50 mL di soluzione KCl/HCl
(2.3.) e le miscele vengono tenute in agitazione su agitatore
meccanico per almeno 30 minuti. Le risultanti sospensioni sono poi
filtrate sotto vuoto usando filtri di carta Whatman n. 42. Sui
filtrati si effettua la determinazione colorimetrica
dell'ammoniaca. Il saggio va effettuato in triplicato.
b) Saggio in presenza di tampone: A 5 g di suolo, posti in beute da
100 mL, vengono aggiunti 2.5 mL di soluzione concentrata di urea
0.72 M (2.1.) e 20 mL di tampone borato pH 10.0 (2.4.). I campioni
vengono incubati per 2 ore a 37 gradi C, trattati con 30 ml di
soluzione di KCl/HCl (2.3.) e successivamente filtrati come
descritto precedentemente. I filtrati ottenuti vengono poi
analizzati per il contenuto di ammoniaca. Il saggio va effettuato
in triplicato.

Per ambedue i metodi si allestiscono campioni di controllo
incubando il suolo con 2.5 mL di acqua distillata e aggiungendo urea
alla fine dell'incubazione e immediatamente prima dell'aggiunta della
soluzione KCl/HCL.
4.2. Determinazione colorimetrica dell'ammoniaca
1 mL di filtrato viene diluito a 10 mL con acqua distillata e si
aggiungono in successione 5 mL della soluzione di sodio salicilato
(2.5.) e 2 mL di soluzione di sodio dicloroisocianurato (2.6.). Si
incuba a temperatura ambiente per 30 minuti e si legge l'assorbanza a
690 nm. Il colore è stabile per almeno 8 ore a temperatura ambiente.
4.3. Preparazione di una curva di calibrazione
La standardizzazione del metodo si effettua allestendo una curva
di calibrazione utilizzando la soluzione standard di NH4Cl. Campioni
contenenti 0, 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 µg per mL di NH(base 4 elevato a
+)-N vengono sottoposti al procedimento prima descritto.

5. Espressione dei risultati
L'attività ureasica si esprime in quantità (g o moli) di
ammoniaca prodotta da 1 g di suolo in 2 ore di incubazione.
Calcolare la quantità di ammoniaca prodotta mediante la curva di
calibrazione preparata utilizzando la soluzione standard di cloruro
di ammonio. Nel calcolo vanno considerate le diluizioni operate per
l'estrazione dell'ammoniaca e successiva determinazione
colorimetrica.

Metodi IV.2.

ATTIVITÀ PROTEOLITICA DEL SUOLO

1. Oggetto

Il presente documento fissa i metodi per la determinazione
dell'attività proteolitica del suolo.

Metodo IV.2.1.

Attività proteasica verso substrati di alto peso molecolare

1. Principio

Il metodo si basa sulla determinazione di amminoacidi rilasciati
dopo incubazione del suolo in presenza di caseina.

2. Reattivi
2.1. Soluzione tampone (Tris 50 mM a pH 8.1). Si sciolgono 6.05 g
di Tris (idrossimetil) amminometano in 700 mL di acqua distillata e
quindi si aggiusta il valore di pH della soluzione a 8,1 con una
soluzione di HCl; si diluisce infine ad 1 l con acqua distillata;
2.2. soluzione di caseina. Si sospendono 10 g di caseinato sodico
in acqua distillata calda (circa 50 gradi C) e dopo agitazione per
almeno 1 ora si porta a 500 mL con acqua distillata. Se si dispone di
caseina si consiglia di sospendere 10 g del composto in tampone tris
(1) e di portare eventualmente il valore di pH a 8,1 con una
soluzione di NaOH; dopo aver agitato la sospensione per almeno i ora
si porta a 500 mL con tampone tris;
2.3. soluzione di acido tricloroacetico. Si sciolgono 75 g di
acido tricloroacetico (TCA) in circa 300 mL di acqua distillata e
quindi si diluisce a 500 mL con acqua distillata;
2.4. soluzione di carbonato sodico. Si sciolgono 50 g di Na2CO3 in
60 mL di una soluzione di NaOH 1N che sono stati in precedenza
diluiti con acqua distillata; infine si diluisce ad 1 L;
2.5. soluzione di solfato rameico. Si sciolgono 0,5 g di CuSO(base
4).5H(base 2)O in acqua distillata e si porta il volume della
soluzione a 100 mL con acqua distillata;
2.6. soluzione di tartrato sodico. Si scioglie 1 g di tartrato
sodico (C4H4KNaO6.4H(base 2)O) in acqua distillata e si diluisce a
100 mL con acqua distillata;
2.7 soluzione di carbonato sodico, solfato rameico e tartrato
sodico. Si diluiscono 1000 mL della soluzione di carbonato (4) con 20
mL della soluzione 5 e con 20 mL della soluzione 6;
2.8. soluzione di Folin-Ciocalteau. Si diluiscono 167 mL del
reagente di Folin con 500 mL di acqua distillata. La soluzione è
instabile e deve essere preparata immediatamente prima dell'uso;
2.9. soluzione standard di tirosina. Si sciolgono 50 mg di
tirosina in circa 70 mL di tampone tris (soluzione) e si diluisce a
100 mL con tampone tris.

3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofotometro;
3.2. bagno ad acqua con dispositivo per agitare e controllare la
temperatura;
3.3. centrifuga.

4. Procedimento
4.1. Saggio di attività
Si pone 1 g di suolo fresco in un tubo da centrifuga e quindi si
aggiungono 5 mL di tampone Tris e 5 mL della soluzione di caseina.
Dopo aver tappato il tubo da centrifuga, si mescola il contenuto e si
incuba per 2 ore a 50 gradi C sotto agitazione in un bagno
termostatato. Alla fine della incubazione si aggiungono 5 mL di TCA e
si agita il contenuto. Per la preparazione del controllo si segue lo
stesso protocollo sperimentale della prova con la sola eccezione di
aggiungere la soluzione di caseina alla fine della incubazione ed
immediatamente prima dell'aggiunta di TCA. Si consiglia di replicare
il saggio. Quindi si centrifuga la sospensione (10.000-20.000 g) per
10 minuti.
4.2. Determinazione colorimetrica degli aminoacidi
Vengono aggiunti 5 mL del surnatante a 7,5 mL della soluzione di
carbonato sodico, solfato rameico e trartrato sodico; si incuba per
15 minuti a temperatura ambiente e poi si aggiungono 5 mL della
soluzione di Folin. Si filtra la sospensione e dopo un'ora si
determina la densità ottica a 700 nm; si consiglia di eseguire
diverse determinazioni prima di ottenere un valore costante.
4.3. Preparazione della curva di taratura
Si pipettano 0, 1, 2, 3, 4 e 5 mL della soluzione di tirosina in
palloni volumetrici della capacità di 10 mL; si aggiungono 5 mL
della soluzione di caseina in ciascun pallone volumetrico e quindi si
porta a volume con il tampone tris. Si determina la densità ottica
come descritto in precedenza.

5. Espressione dei risultati
L'attività proteasica si esprime in quantità (g) di tirosina
prodotta da 1 g di terreno secco in 2 ore di incubazione.
Si sottrae la densità ottica del controllo da quella delle prove
e si calcola la quantità di tirosina prodotta mediante la curva di
calibrazione preparata utilizzando la soluzione standard di tirosina.
Dopo si calcola l'attività proteasica del campione di suolo
secondo la seguente formula:

C x 15
µg tirosina/g terreno secco/2 ore = -----------------------------
peso secco di 1 g di suolo

dove 15 rappresenta il volume finale della soluzione dopo
l'aggiunta del TCA e C è la concentrazione di tirosina determinata
sulla curva di calibrazione.

Metodo IV.2.2.

Determinazione dell'attività proteasica verso un substrato a basso
peso molecolare

1. Principio

Il metodo si basa sulla determinazione dell'ammoniaca liberata per
catalisi di un derivato dipeptidico (N-alfa-benzoil-L-argininamide,
BAA) mediante misure potenziometriche.
Il metodo può essere applicato per tutti i tipi di suolo,
compresi quelli fortemente organici.

2. Reattivi
2.1 Tampone K(base2)HPO (base 4)/KH(base2)PO (base 4) 0.1 M pH
7.00;
2.2. soluzione A: disciogliere g 27.8 di KH(base2)PO (base 4) in
1000 mL di acqua deionizzata;
2.3. soluzione B: disciogliere g 53.65 di K(base2)HPO (base 4).
7H(base 2)O o g 71.7 di K(base2)HPO (base 4) 12H(base 2)O in 1000 mL;
2.4. miscelare 390 mL di A con 610 mL di B e diluire a 2000 mL: pH
7.00;
2.5. NaOH 10 M: sciogliere 40 g di idrossido di sodio (NaOH,
esente da ammoniaca) in 80 mL di acqua deionizzata, lasciare
raffreddare e diluire a 100 mL;
2.6. (substrato): N-alfa-benzoil L-argininammide idrocloruro
monoidrato 0.03 M. Il substrato deve essere conservato a 4 gradi C
(stabile per circa 2 settimane);
2.7. KCl 2 M: sciogliere 149.1 g di sale anidro in 1000 mL di
acqua;
2.8. soluzione concentrata di NH4Cl 1000 mg/L; pesare, con
l'approssimazione di +/- 1 mg, 3.819 g di cloruro di ammonio anidro
(NH4Cl) seccato a 110 gradi C, sciogliere in acqua e diluire ad 1
litro;
2.9. soluzione standard di NH4Cl 10 mg/mL. Dalla soluzione
concentrata di cloruro ammonio si prepara per diluizione una
soluzione a 10 mg/L e una a 1 mg/L per tarare lo strumento.

3. Apparecchiatura
3.1. Potenziometro munito di elettrodo selettivo per ammoniaca;
3.2. bagno (ad acqua) oscillante, riscaldato e termostatato;
3.3. agitatore magnetico;
3.4. pH-metro;
3.5. vetreria da laboratorio.

4. Procedimento
È preferibile, come in tutti i saggi enzimatici eseguire prove in
triplo, compreso i controlli.
4.1. Saggio di attività
Il suolo (1g) viene posto in un beaker da 25 mL; si aggiungono 4
mL di tampone fosfato e 1 mL di substrato. Nel controllo si aggiunge
solo tampone fosfato (il substrato si aggiunge dopo l'incubazione,
prima della determinazione di ammoniaca). Si pone ad incubare in
bagno termostatato per 2 ore a 40 gradi C; è necessario tappare con
"parafilm" o altro per impedire l'evaporazione del solvente. Si
toglie dal bagno e si aggiungono 4 mL di KCl 2M (volume finale 10
mL). Si eseguono le determinazioni di ammoniaca liberata dalla
idrolisi enzimatica del BAA direttamente nei recipienti di
incubazione contenenti suolo e 10 mL di soluzione. La determinazione
viene eseguita al potenziometro come qui di seguito riportato
(taratura dello strumento).
4.2. Taratura dello strumento
È preferibile l'uso di potenziometri provvisti della funzione
"CONCENTRAZIONE" oltre che della scala dei mV, in quanto
operativamente più semplici. Possono comunque essere utilizzati
tutti gli elettrometri in grado di apprezzare variazioni di +/- 0.5
mV.
Prima dell'uso assicurarsi della efficienza dell'elettrodo
selettivo e in particolare della integrità della membrana (attenersi
al manuale di istruzione della ditta costruttrice). In generale i
controlli da eseguire sono:

- pendenza della retta di taratura - concentrazione di NH (base 4
elevato +) e potenziale (è funzione della temperatura);
- tempo di risposta (è funzione della concentrazione di ammoniaca);
- riproducibilità (intervallo di concentrazione con risposta
lineare).

Si esegue la determinazione della soluzione standard 10 mg/L; si
utilizzano circa 10 mE di soluzione in un beaker da 25 mL, si immerge
per 3-5 mm l'elettrodo nella soluzione, si agita con agitatore
elettromagnetico (senza creare vortici), si aggiungono 0.1-0.2 mL di
NaOH 10 M (pH intorno a 11). Si registrano i valori in mV
corrispondenti a questa concentrazione di ammoniaca; si esegue quindi
la determinazione del potenziale dato dalla soluzione avente la
concentrazione di 1 mg/L. Le soluzioni ammoniacali che differiscono
di un valore 10 in concentrazione danno approssimativamente pendenze
di 57 mV a 18 gradi C e 59 mV a 25 gradi C.
Se si lavora con un apparecchio provvisto della funzione "CONC",
si imposta il valore dello standard (p. es. 1 mg/L) a cui corrisponde
un valore costante nel tempo in mV sulla scala dello strumento; si
imposta la pendenza trovata nelle condizioni sperimentali e lo
strumento è pronto per ulteriori determinazioni, che saranno date in
concentrazione di NH (base 4 elevato +) (mg/L). Se lo strumento non
è provvisto della funzione "CONC", si riportano i valori in mV
corrispondenti ai vari campioni su una retta di taratura che fornisce
le concentrazioni di ammoniaca (mg/L) in corrispondenza dei valori di
potenziale (mV). Dopo 10 determinazioni circa, e osservando le
istruzioni operative dello strumento, si deve controllare la
concentrazione di uno standard e immergere l'elettrodo in una
soluzione a pH 4 per rimuovere eventuale depositi di idrossidi
colloidali od altro e sporcizia sulla membrana. Queste precauzioni
sono prese a discrezione dell'operatore e compatibilmente con la
velocità di "risposta" dell'elettrodo e del tipo di suolo in esame.
5. Espressione dei risultati
I valori di concentrazione di NH (base 4 elevato +) (mg/L)
misurati direttamente al potenziometro per i singoli campioni devono
essere sottratti dei rispettivi controlli.
Quindi si calcola l'attività enzimatica in base alla seguente
espressione:

Attività enzimatica (µgN-NH4/g h(elevato alla -1)) =

µgN-NH4/mL
------------------------------------- x 10 mL
peso secco suolo x ore di incubazione

Metodi IV.3.

DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ FOSFATASICA DEL SUOLO

1. Oggetto

Il presente documento fissa i metodi per la determinazione
dell'attività fosfatica del suolo.

Metodo IV.3.1.

Metodo per la determinazione della fosfomonoesterasi

1. Principio

Il principio del metodo per la determinazione delle
fosfomono-esterasi consiste nel determinare spettrofotometricamente a
400 nm il p-nitrofenolo rilasciato quando il suolo emesso ad incubare
con soluzioni tamponate di p-nitrofenilfosfato di sodio
(fosfomonoesterasi) eventualmente in presenza di toluene come agente
sterilizzante.

2. Reattivi
2.1. Tampone Universale Modificato (TUM-soluzione madre; vedi
"Commenti"): sciogliere 12,1 g di tris(idrossimetil)amminometano,
11,6 g di acido maleico, 14,0 g di acido citrico e 6,3 g di acido
borico in 488 mL di NaOH 1N, quindi diluire la soluzione ad un litro
con H(base 2)O distillata (conservare in frigorifero);
2.2. tampone Universale Modificato a pH 6,5 ed a pH 11,0 (TUM-6,5
e TUM-11): porre 200 mL di TUM-soluzione madre in un beker da 500 mL,
portare il pH a 6,5 con una soluzione di HCl 0,1N e quindi diluire ad
un litro con H(base 2)O (TUM-6,5). Prelevare altri 200 mL di
TUM-soluzione madre, portare a pH 11,5 con una soluzione di NaOH 0,1
N e quindi diluire ad un litro con H(base 2)O (TUM-11);
2.3. p-Nitrofenil fosfato (p-NP) 0,025 M: in un matraccio da 50 mL
solubilizzare 0,420 g di p-nitrofenil fosfato tetraidrato (sale
bisodico) in 40 mL di TUM-6,5 per saggi di fosfomonoesterasi acida o
in 40 mL di TUM-11 per saggi di fosfomonoesterasi alcalina, portare
quindi a volume con il TUM utilizzato per la solubilizzazione;
2.4. cloruro di calcio 0,5 M: in un matraccio da un litro
solubilizzare 73,5 g di CaCl(base 2).H(base 2)O con circa 700 mL di
H(base 2)O, quindi portare a volume con H(base 2)O;
2.5. idrossido di sodio 0,5 M: in un matraccio da un litro
sciogliere 20 g di NaOH con circa 700 mL di acqua, quindi portare a
volume con acqua;
2.6. soluzione standard di p-nitrofenolo: sciogliere 1,0 g di
p-nitrofenolo con circa 70 mL di H(base 2)O, diluire ad un litro con
H(base 2)O (conservare in frigorifero).

3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofotometro UV-VIS;
3.2. pHmetro.

4. Procedimento
Porre 1g di terreno in un matraccio da 50 mL, aggiungere 0,2 mL di
toluene, 4 mL di TUM-6,5 per i saggi di fosfomonoesterasi acida o di
TUM-11 per quelli di fosfomonoesterasi alcalina, ed 1 mL della
soluzione contenente p-nitrofenil fosfato nello stesso tampone.
Agitare per alcuni secondi, chiudere il matraccio e porlo in
incubatore a 37 gradi C per un'ora. Bloccare la reazione mediante
aggiunta di 1 mL di CaCl(base 2) 0,5 M e di 4 mL di NaOH 0,5 M.
Agitare il tutto per alcuni secondi quindi filtrare la sospensione su
un filtro a fascia blu (o Whatman n. 2). Eseguire la lettura
spettrofotometrica del filtrato a 400 nm contro un "bianco"
costituito da tutti i reagenti tranne la soluzione del p-nitrofenil
fosfato sostituendola con 1 mL del TUM appropriato.
Contemporaneamente ai saggi di attività va eseguito un saggio di
controllo con lo stesso procedimento, ma aggiungendo la soluzione di
p-nitrofenil fosfato solo dopo aver aggiunto le soluzioni di
CaCl(base 2) 0,5 M e di NaOH 0,5 M (cioè immediatamente prima della
filtrazione della sospensione di terreno).
La concentrazione del p-nitrofenolo contenuto nel filtrato viene
eseguito tramite una retta di taratura costruita con le densità
ottiche di soluzioni standard contenenti 0, 10, 20, 30, 40 e 50 µg di
p-nitrofenolo. (Preparare tali soluzioni diluendo 1 mL di soluzione
di p-nitrofenolo 0,025 M a 100 mL con il TUM appropriato, e
prelevando da questa soluzione aliquote di 0, 1, 2, 3, 4 e 5 ml. Dopo
aver aggiustato il volume a 5 mL con H(base 2)O addizionare a
ciascuna soluzione 1 mL di CaCl(base 2) 0,5 M e 4 mL di NaOH 0,5 M,
filtrare la sospensione ottenuta e sul filtrato eseguire la lettura
spettrofotometrica a 400 nm).

5. Espressione dei risultati
I risultati sono espressi in termini di µg di p-nitrofenolo
g(elevato -1) h(elevato alla -1).

Metodo IV.3.2.

Metodo per la determinazione della fosfodiesterasi

1. Principio

Il principio del metodo per la determinazione delle
fosfodiesterasi consiste nel determinare spettrofotometricamente a
400 nm il p-nitrofenolo rilasciato quando il suolo è messo ad
incubare con soluzioni tamponate di bis-p-nitrofenilfosfato di sodio
(fosfodiesterasi), eventualmente in presenza di toluene come agente
sterilizzante.

2. Reattivi
2.1. Tampone tris-(idrossimetil)-amminometano 0,05 M a pH 8,0
(TRIS-8): sciogliere 6,1 g di tris-(idrossimetil)-amminometano in
circa 800 mL di H(base 2)O ed aggiustare il pH ad 8,0 con una
soluzione di H(base 2)SO(base 4) 0,2 N, quindi diluire fino ad un
litro;
2.2. bis-p-Nitrofenil fosfato (b-PNP) 0,005 M: sciogliere 0,1811 g
di bis-p-nitrofenil fosfato di sodio con circa 80 mL di tampone
TRIS-8, quindi diluire a 100 mL con il tampone (conservare in
frigorifero);
2.3. soluzione estraente di
tris-(idrossimetil)-amminometano-idrossido di sodio 0,1 M a pH 12
(TRIS-NaOH): sciogliere 12,2 g di tris-(idrossi-metil)-amminometano
con circa 800 mL di H(base 2)O ed aggiustare il pH a 12 con NaOH 0,5
N, quindi diluire ad un litro con H(base 2)O;
2.4. cloruro di calcio 0,5 M: sciogliere 73,5 g di CaCl(base
2).H(base 2)O con circa 700 mL di H(base 2)O, quindi diluire fino ad
un litro con H(base 2)O;
2.5. soluzione di tris-(idrossimetil)-amminometano 0,1 M a pH 10
(TRIS-l0): sciogliere 12,2 g di tris-(idrossimetil)-amminometano con
circa 800 mL di H(base 2)O, quindi diluire fino ad un litro con
H(base 2)O;
2.6. soluzione standard di p-nitrofenolo (vedi fosfomonoesterasi).

3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofotometro UV-VIS;
3.2. pHmetro.

4. Procedimento
Porre 1 g di terreno in un matraccio da 50 mL, aggiungere 0,2 mL
di toluene, 4 mL di tampone TRIS-8 ed 1 mL della soluzione di b-PNP
0,005 M. Agitare per alcuni secondi la miscela di reazione. Chiudere
il matraccio e porlo in un incubatore a 37 gradi C per 1 ora.
Bloccare la reazione mediante aggiunta di 1 mL di CaCl(base 2) 0,5 M
e 4 mL di TRIS-NaOH. Agitare il tutto per alcuni secondi, quindi
filtrare la sospensione su di un filtro a fascia blu (o Whatman n.
2). Eseguire la lettura spettrofotometrica sul filtrato a 400 nm
operando come descritto per le fosfomonoesterasi.

5. Espressione dei risultati
I risultati sono espressi in termini di µg di p-nitrofenolo
g(elevato -1) h(elevato alla -1).

Metodo IV.3.3.

Metodo per la determinazione della pirofosfatasi

1. Principio

Il principio del metodo per la determinazione della pirofosfatasi
consiste nel determinare spettrofotometricamente a 700 nm il fosfato
rilasciato quando il suolo è messo ad incubare con una soluzione
tamponata di pirofosfato di sodio.

2. Reattivi
2.1. Idrossido di sodio 1 N;
2.2. acido solforico 0,1 N;
2.3. tampone Universale Modificato (TUM-soluzione madre) (vedi
fosfomonoesterasi);
2.4. TUM a pH 8,0 (TUM-8): prelevare 200 mL di TUM-soluzione madre
e portarli a pH 8,0 con HCl 0,1 N, diluire quindi fino ad un litro
con H(base 2)O;
2.5. soluzione di pirofosfato di sodio 50 mM: sciogliere 2,23 g di
Na4P2O7.10H(base 2)O con 20 mL di TUM-8; aggiustare il pH ad 8,0 con
una soluzione di HCl 0,1 N, quindi diluire fino a 100 mL con H(base
2)O (preparare la soluzione giornalmente);
2.6. soluzione di acido ascorbico 0,1 M-acido tricloroacetico 0,5
M (Reagente A): sciogliere 8,8 g di acido ascorbico a 41 g di acido
tricloroacetico con circa 400 mL di H(base 2)O quindi aggiustare il
volume a 500 mL (preparare la soluzione giornalmente);
2.7. ammonio molibdato tetraidrato 0,0 15 M (reagente B):
sciogliere 9,3 g di (NH4)6Mo7O(base 2).4H(base 2)O con circa 450 mL
di H(base 2)O, quindi diluire fino a 500 mL con H(base 2)O;
2.8. citrato di sodio (0,15 M)-arsenito di sodio (0,3 M)-acido
acetico (7,5 %) (reagente C): sciogliere 44,1 di citrato di sodio e
39 g di Na3AsO3 con circa 800 mL di H(base 2)O, aggiungere 75 mL di
acido acetico glaciale (99,9%) e diluire fino ad i litro con H(base
2)O;
2.9. soluzione standard di fosfato: sciogliere 0,439 g di
KH(base2)PO (base 4) con circa 700 mL di H(base 2)O e diluire quindi
fino ad 1 litro sempre con H(base 2)O (tale soluzione contiene 100 µg
di P-PO4-3/mL).

3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofometro UV-VIS;
3.2. pHmetro.

4. Procedimento
Porre 1 g di terreno in un tubo da centrifuga da 50 ml, aggiungere
3 mL della soluzione di pirofosfato di sodio 50 mM ed agitare per
alcuni secondi, chiudere il tubo e porlo ad incubare a 37 gradi C per
5 ore. Dopo incubazione aggiungere immediatamente 3 mL di TUM-8 e 25
mL di H(base 2)SO(base 4) 1 N. Agitare la miscela per almeno 3
minuti, quindi centrifugare la sospensione per 30 secondi a 12.000
rpm. Porre 1 mL di supernatante in un matraccio da 25 mL contenente
10 mL di reagente A, successivamente aggiungere 2 mL di reagente B e
5 mL di reagente C. Dopo agitazione portare a volume con H(base 2)O.
Dopo quindici minuti fare la lettura allo spettofotometro a 700 nm.
La concentrazione in P-PO4-3 viene determinata tramite una retta
di taratura costruita con le densità ottiche di soluzioni standard
contenenti 0, 5, 10, 15, 20 e 25 µg di P-PO4-3. (Preparare tali
soluzioni diluendo 0, 5, 10, 15, 20 e 25 mL della soluzione standard
di fosfato in matracci da 100 mL e portando a volume con H(base 2)O).

5. Espressione dei risultati I risultati sono espressi in termini
di µg di P-PO4-3 g-1h(elevato alla -1).

Metodo IV.4.

DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ SOLFATASICA DEL SUOLO

1. Oggetto

Il presente documento fissa un metodo per la determinazione
dell'attività solfatasica del suolo.

Metodo IV.4.1.

Metodo per la determinazione della arilsolfatasi

1. Principio
Il principio del metodo, consiste nel determinare
spettrofoto-metricamente il p-nitrofenolo rilasciato quando il suolo
è messo ad incubare con una soluzione tamponata di
pnitrofenilsolfato di sodio eventualmente in presenza di toluene come
agente sterilizzante.

2. Reattivi
2.1. Toluene;
2.2. tampone acetato 0,5 M a pH 5,8: sciogliere 68 g di
CH3COONa.3H(base 2)O con circa 700 mL di H(base 2)O, aggiungere 1,70
mL di acido acetico glaciale (99%) e diluire ad un litro con H(base
2)O;
2.3. soluzione di p-nitrofenilsolfato di potassio 0,025 M:
sciogliere 0,312 g di p-nitrofenilsolfato di potassio con circa 40 mL
di tampone acetato, quindi diluire fino a 50 mL con il tampone.
(Conservare la soluzione in frigorifero);
2.4. cloruro di calcio (CaCl(base 2)) 0,5 M. Preparare come

descritto per le fosfomonoesterasi;
2.5. idrossido di sodio (NaOH) 0,5 M. Preparare come descritto per
le fosfomonoesterasi;
2.6. soluzione standard di p-nitrofenolo. Preparare come descritto
per le fosfomonoesterasi.

3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofotometro UV-VIS;
3.2. pHmetro.

4. Procedimento
Porre 1 g di terreno in un matraccio da 50 mL, aggiungere 0,25 mL
di toluene, 4 mL di tampone acetato ed 1 mL di soluzione di
p-nitrofenil solfato di potassio. Agitare la miscela per alcuni
secondi quindi porla ad incubare a 37 gradi C per un'ora. Bloccare la
reazione mediante aggiunta di 1 mL di CaCl(base 2) 0,5 M e 4 mL di
NaOH 0,5 M agitando la miscela per alcuni secondi, quindi filtrare la
sospensione su filtro a fascia blu (o Whatman n. 2). Sul filtrato
eseguire la valutazione del p-nitrofenolo rilasciato seguendo le
modalità descritte per le fosfomonoesterasi.

5. Espressione dei risultati
I risultati sono espressi in termini di mg di p-nitrofenolo
g(elevato -1) h(elevato alla -1).

Metodi IV.5.

DETERMINAZIONE DELL'ATTIVITÀ DEIDROGENASICA DEL SUOLO

1. Oggetto

Il presente documento fissa i metodi per la determinazione
dell'attività deidrogenasica del suolo.

Metodo IV.5.1.

Determinazione dell'attività deidrogenasica con
iodo-nitrofenilformazano

1. Principio
Il metodo si basa sulla determinazione del prodotto di reazione,
iodo-nitrofenilformazano (INTF) dopo incubazione per 2 ore di 1 g di
suolo con una soluzione di iodo nitrotetrazoliocloruro (INT). Le
determinazioni vanno eseguite entro poche ore dal prelievo, in quanto
l'attività può variare considerevolmente con il tempo ed il tipo di
suolo.

2. Reattivi
2.1. Substrato: 2 (p-iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-fenil
tetrazolio cloruro (iodonitrofeniltetrazolio, INT).
2.2. 500 mg di INT sono miscelati con 2 mL di
N,N-dimetilformammide, agitati vigorosamente, trasferiti in un
matraccio da 100 mL, portati a volume con acqua distillata e tappati;
si disciolgono con ultrasuoni. La soluzione viene preparata al
momento dell'uso e tenuta al buio;
2.3. tampone: TRIS 0.1 M, pH 7.0;
2.4. sciogliere 12.1g di Tris (idrossimetil) aminometano (TRIS) in
800 mL di acqua distillata; neutralizzare con HCl diluito fino a pH
7.0, e portare ad 1 L;
2.5. soluzione estraente del formazano: N,N-dimetilformammide /
etanolo (1:1);
2.6. soluzione standard di iodonitrofenilformazano (INTF): valori
compresi nell'intervallo 0,30 mg/mL(elevato alla -1) rientrano nel
tratto lineare della retta standard.

3. Apparecchiatura
3.1. Spettrofotometro;
3.2. bagno termostatico;
3.3. agitatore;
3.4. pH-metro.

4. Procedimento
1 g di suolo umido prelevato di fresco è posto in una provetta,
miscelato con 1.5 mL di tampone TRIS 1 M, Ph 7.0 e 2 mL di substrato
INT 0.5 %; per determinare l'attività deidrogenasica "naturale", si
aggiunge acqua invece del tampone. Le provette vengono tappate,
agitate leggermente e incubate a 40 gradi C al buio per 2 ore. Viene
preparato un controllo con suolo autoclavato a 121 gradi C per 20
minuti e trattato come i campioni. Le analisi si preparano in triplo.
Dopo 2 ore di incubazione, i campioni vengono trattati con 10 mL
della miscela N,N-dimetilformammide/etanolo, al buio e agitando
vigorosamente ogni 20 minuti per 1 ora, per estrarre l'INTF prodotto.
La soluzione ottenuta viene filtrata e immediatamente si eseguono
le letture allo spettrofotometro a 464 nm, usando la soluzione
estraente come bianco. Il colore è stabile per circa 3 ore; se
occorre, si può diluire con la stessa soluzione estraente, per
abbassare i valori delle letture.
La concentrazione di INTF prodotto viene calcolata da una retta di
taratura che riporta l'assorbanza in funzione di concentrazioni note
di INTF.

5. Espressione dei risultati
I valori delle assorbanze relativi ai controlli (che rappresentano
la riduzione "chimica" o "abiotica" del substrato) si sottraggono da
quelli delle prove.
L'attività deidrogenasica viene espressa in nmoli INTF g(elevato
-1) suolo secco x 2 ore.

Metodo IV.5.2.

Metodo di determinazione dell'attività deidrogenasica semplificato

1. Principio
Il metodo si basa sulla determinazione del prodotto di reazione,
iodo-nitrofenilformazano (INTF) dopo incubazione per 20 ore di 1 g di
suolo con una soluzione di iodo nitrotetrazoliocloruro (INT).

2. Procedimento
Le determinazioni nei campioni e nei controlli vengono eseguiti in
triplo. È preferibile eseguire le determinazioni entro poche ore dal
prelievo, in quanto l'attività può variare considerevolmente con il
tempo e a seconda del suolo. Il suolo (1 g) prelevato di fresco viene
pesato, posto in provette di vetro pirex, e umidificato al 60% della
sua capacità di ritenzione idrica. Si aggiungono 0.2 mL di INT,
disciolto allo 0.4% in acqua distillata (per sciogliere l'INT in
acqua occorre agitare vigorosamente o utilizzare ultrasuoni). Si pone
ad incubare al buio per 20 ore a temperatura ambiente o, se
disponibile, in camera buia termostatata a 20 gradi C. Si aggiungono
10 mL di una soluzione estraente composta da tetracloroetilene e
acetone (1/1.5), si agita energicamente a mano per 1 minuto
(l'estraente si addiziona subito prima di agitare), si filtra su
carta Watmann N. 41 (se possibile si centrifuga a 4000 giri
min(elevato alla -1), per 5 minuti).
La concentrazione di INTF estratto si determina mediante lettura
spettrofotometrica a 490 nm, utilizzando come bianco la soluzione
estraente.

3. Espressione dei risultati
Le letture di assorbanza delle prove, sottratte dei valori
relativi ai controlli, vengono trasformate in mg INTF mL(elevato alla
-1) mediante una retta di taratura preparata con concentrazioni note
di INTF (1, 2, 2.5, 5.0, 10 mg mL(elevato alla -1)) disciolto nella
soluzione estraente. L'attività deidrogenasica si esprime come mg di
INTF prodotto per g di suolo secco (considerando il contenuto di
umidita) per ora di incubazione (mg INTF g(elevato -1) h(elevato alla
-1)).

Calcolo:

----&gt; INSERIRE IMMAGINE PAGINA 63 &lt;----

v* = volume di acqua necessario per mantenere il suolo al 60% della
sua capacità massima di ritenzione idrica + volume di substrato
aggiunto.