Serie Generale n. 240 del 15-10-2003
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SALUTE
MINISTERO DELLA SALUTE
DECRETO 23 luglio 2003
Recepimento della direttiva 2002/69/CE della Commissione del 30 luglio 2002 relativa ai metodi di campionamento e d'analisi per il controllo ufficiale di diossine e la determinazione di PCB diossina-simili nei prodotti alimentari. (GU Serie Generale n.240 del 15-10-2003)

IL MINISTRO DELLA SALUTE

Vista la direttiva 2002/69/CE della Commissione del 30 luglio 2002
che stabilisce i metodi di campionamento e d'analisi per il controllo
ufficiale di diossine e la determinazione di PCB diossina-simili nei
prodotti alimentari;
Visto il regolamento CE n. 466/2001 della Commissione dell'8 marzo
2001 che definisce i tenori massimi di taluni contaminanti presenti
nelle derrate alimentari;
Visto il regolamento CE n. 2375/2001 del Consiglio del 29 novembre
2001 recante modifica del regolamento CE n. 466/2001 che definisce i
tenori massimi di taluni contaminanti presenti nelle derrate
alimentari;
Visto l'art. 21 della legge 30 aprile 1962, n. 283;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 26 marzo 1980, n.
327, ed in particolare l'art. 9;
Visto il parere della Commissione per la determinazione dei metodi
ufficiali di analisi di cui all'art. 21 della legge 30 aprile 1962,
n. 283, espresso nella seduta del 5 giugno 2003;
Decreta:
Art. 1.
1. Il controllo ufficiale di diossine e la determinazione di PCB
diossina-simili nei prodotti alimentari deve essere effettuato
secondo i metodi di campionamento e di analisi riportati negli
allegati.
Il presente decreto sarà trasmesso alla Corte dei conti per la
registrazione e sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana.
Roma, 23 luglio 2003
Il Ministro: Sirchia

Registrato alla Corte dei conti l'11 settembre 2003
Ufficio di controllo preventivo sui Ministeri dei servizi alla
persona e dei beni culturali, registro n. 4, foglio n. 325

Allegato 1

METODI DI CAMPIONAMENTO PER IL CONTROLLO UFFICIALE DEI LIVELLI DI
DIOSSINE (PCDD/PCDF) E LA DETERMINAZIONE DI PCB DIOSSINA-SIMILI IN
TALUNI PRODOTTI ALIMENTARI

1. Oggetto e campo d'applicazione
I campioni destinati al controllo ufficiale del tenore di
diossine (PCDD/PCDF) e PCB diossina-simili (1) nei prodotti
alimentari devono essere prelevati secondo le modalità di seguito
indicate. I campioni globali così ottenuti sono considerati
rappresentativi delle partite o sottopartite da cui sono stati
prelevati. La conformità al tenore massimo stabilito dal regolamento
(CE) n. 466/2001 e successive modifiche è determinata in base ai
valori riscontrati nelle aliquote.
2. Definizioni
2.1. Partita: quantitativo di prodotto alimentare identificabile,
consegnato in un'unica volta, per il quale è stata accertata,
dall'addetto al controllo ufficiale, la presenza di caratteristiche
comuni, quali l'origine, la varietà, il tipo di imballaggio, il
confezionatore, lo spedizioniere o la marcatura. Nel caso di partite
di prodotti della pesca si deve tenere conto anche della dimensione
del pesce stesso.
2.2. Sottopartita: porzione di una partita designata per
l'applicazione delle modalità di prelievo. Ciascuna sottopartita
deve essere fisicamente separata e identificabile.
2.3. Campione elementare: quantitativo di materiale prelevato in
un solo punto della partita o della sottopartita.
2.4. Campione globale: campione ottenuto riunendo tutti i
campioni elementari prelevati dalla partita o dalla sottopartita.
2.5. Campione di laboratorio: campione destinato al laboratorio
da suddividere in cinque aliquote da destinare alle analisi.
2.6. Aliquota: porzione ottenuta dal campione di laboratorio e
corrispondente ad un quinto del campione di laboratorio.
--------
(1) Si riporta la tabella TEF del rischio stabilita dall'OMS
sulla base delle conclusioni dell'incontro di Stoccolma del
15-18 giugno 1997 [Van den Berg et al., 1998, «Toxic Equivalency
Factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for Humans and for Wildlife»,
Environmental Health Perspectives, 106 (12) pag. 775].

Tabella TEF

=====================================================================
Congenere | Valore TEF
=====================================================================
Policlorodibenzodiossine (PCDD) |
2,3,7,8-TCDD |1
1,2,3,7,8-PeCDD |1
1,2,3,4,7,8-HxCDD |0,1
1,2.3,6,7,8-HxCDD |0,1
1,2,3,7,8,9-HxCDD |0,1
1,2,3,4,6,7,8-HpCDD |0,01
OCDD |0,0001
Dibenzofurani (PCDF) |
2.3,7,8-TCDF |0,1
1,2,3,7,8-PeCDF |0,05
2,3,4,7,8-PeCDF |0,5
1,2,3,4,7,8-HxCDF |0,1
1,2,3,6,7,8-HxCDF |0,1
1,2,3,7,8,9-HxCDF |0,1
2,3,4,6,7,8-HxCDF |0,1
1,2,3,4,6,7,8-HpCDF |0,01
1,2,3,4,7,8,9-HpCDF |0,01
OCDF |0,0001
PCB diossina-simili Non orto PCB + Mono orto PCB |
Non orto PCB |
PCB 77 |0,0001
PCB 81 |0,0001
PCB 126 |0,1
PCB 169 |0,01
Mono orto PCB |
PCB 105 |0,0001
PCB 114 |0,0005
PCB 118 |0,0001
PCB 123 |0,0001
PCB 156 |0,0005
PCB 157 |0,0005
PCB 167 |0,00001
PCB 189 |0,0001

Abbreviazioni: T = tetra; Pe = penta; Hx = esa; Hp = epta; O =
octa; CDD = clorodibenzodiossina; CDF = clorodibenzofurano; CB =
clorobifenile.
3. Disposizioni generali
3.1. Personale.
Il prelievo dei campioni deve essere effettuato da personale
qualificato che deve operare secondo le modalità del presente
allegato.
3.2. Prodotto da campionare.
Ciascuna partita da controllare è oggetto di campionamento
separato.
3.3. Precauzioni da prendere.
Durante il campionamento e la preparazione dei campioni di
laboratorio è necessario evitare qualsiasi alterazione che possa
modificare il tenore di diossine e di PCB diossina-simili e
compromettere l'analisi o la rappresentatività del campione globale.
3.4. Preparazione dei campioni elementari.
I campioni elementari devono essere prelevati, per quanto
possibile, in vari punti distribuiti nella partita o sottopartita.
Qualsiasi deroga a tale norma deve essere segnalata nel verbale di
cui al punto 3.8.
3.5. Preparazione del campione globale.
Il campione globale deve avere il peso di almeno un chilo, a meno
che ciò non sia possibile, come nel caso di campionamento di
prodotti alimentari in confezioni singole. In quest'ultimo caso si
applicano le disposizioni della tabella 2.
3.6. Preparazione del campione di laboratorio.
Il campione di laboratorio, rappresentativo del campione globale,
deve essere suddiviso in aliquote uguali conformemente alle
disposizioni di cui ai punti 3.7 e 3.8 del presente allegato.
3.7. Preparazione delle aliquote.
Le dimensioni di ciascuna aliquota devono essere tali da
consentire almeno lo svolgimento di analisi in duplicato.
Ogni aliquota deve essere collocata in un recipiente pulito, di
materiale inerte, che la protegga adeguatamente contro qualsiasi
fattore di contaminazione, da perdita di analiti per assorbimento
nella parete interna del recipiente e dai danni che potrebbero essere
causati dal trasporto.
3.8. Sigillatura ed etichettatura delle aliquote.
Ogni aliquota viene sigillata sul luogo del prelievo e
identificata secondo le modalità del decreto del Presidente della
Repubblica n. 327/1980. Per ciascun prelievo di campione, si redige
un verbale di campionamento che consenta di identificare con certezza
la partita campionata, la data e il luogo di campionamento, nonchè
qualsiasi informazione supplementare che possa essere utile
all'analista.
4. Modalità di prelievo di campioni
Il metodo di prelievo applicato deve assicurare che il campione
globale sia rappresentativo della partita che deve essere
controllata.
4.1. Numero dei campioni elementari.
Nel caso del latte e degli oli per i quali è lecito presumere
che i contaminanti siano distribuiti in modo omogeneo nelle partite,
è sufficiente prelevare tre campioni elementari per partita che
costituiscono il campione globale di ogni partita.
Per gli altri prodotti alimentari, il numero minimo di campioni
elementari da prelevare per partita è indicato alla tabella 1.
Il peso del campione globale che raggruppa tutti i campioni
elementari deve essere almeno di 1 kg (cfr. punto 3.5). I campioni
elementari devono avere un peso analogo. Il peso di un campione
elementare deve essere almeno 100 grammi e dipende dalle dimensioni
dei componenti della partita. Qualsiasi deroga a tale norma va
segnalata nel verbale di cui al punto 3.8. Secondo quanto disposto
dalla decisione 97/747/CE della Commissione, del 27 ottobre 1997, che
fissa i livelli e le frequenze di prelievo di campioni, previsti
dalla direttiva 96/23/CE recepita con il decreto legislativo 4 agosto
1999, n. 336.
Un campione di uova di gallina è costituito da almeno 12 uova.
Nel caso di partite sfuse e di partite formate da confezioni
singole, si vedano le tabelle 1 e 2.

Tabella 1: Numero minimo di campioni elementari da prelevare da una
partita

=====================================================================
| Numero minimo di campioni elementari da
Peso della partita (in kg)| prelevare
=====================================================================
&lt; 60 |3
---------------------------------------------------------------------
da 50 a 500 |5
---------------------------------------------------------------------
&gt; 500 |10

Se la partita è costituita da confezioni singole, il numero di
confezioni che va prelevato per formare un campione globale è
indicato nella tabella 2.

Tabella 2: Numero di confezioni (campioni elementari) da prelevare
per formare un campione globale se la partita consiste in confezioni
singole.

=====================================================================
Numero di confezioni o unità | Numero minimo di confezioni o
della partita | unità da prelevare per aliquota
=====================================================================
da 1 a 25 |1 confezione o unità
---------------------------------------------------------------------
|Circa il 5%, almeno due confezioni
da 26 a 100 |o unità
---------------------------------------------------------------------
|Circa il 5%, fino ad un massimo di
&gt; 100 |10 confezioni o unità

5. Conformità della partita o sottopartita alle specifiche.
La partita è conforme se il risultato dell'analisi cade al di
sotto del 20% del tenore massimo stabilito dal regolamento (CE) n.
466/2001, e successive modifiche; viceversa la partita non è
conforme se tale risultato cade al di sopra del 20%.
Nel caso in cui il risultato dell'analisi sia compreso tra þ20%
del tenore massimo ammissibile, il laboratorio del controllo
ufficiale deve ripetere l'analisi sull'aliquota e calcolare la media
dei risultati così ottenuti. La partita è conforme se il valore
della media è uguale o inferiore al livello massimo ammissibile
fissato dal regolamento (CE) n. 466/2001 e successive modifiche.

Allegato II

PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E SPECIFICHE PER I METODI D'ANALISI
IMPIEGATI NEL CONTROLLO UFFICIALE DEI LIVELLI DI DIOSSINE (PCDD/PCDF)
E NELLA DETERMINAZIONE DI PCB DIOSSINA-SIMILI IN TALUNI PRODOTTI
ALIMENTARI

1. Oggetto e campo d'applicazione
Queste specifiche si applicano all'analisi di prodotti alimentari
nell'ambito del controllo uficiale del tenore di diossine
[policlorodibenzodiossine (PCDD) e policlorodibenzofurani (PCDF)] e
della determinazione di PCB diossina-simili.
Il controllo della presenza di diossine nei prodotti alimentari
può essere effettuato mediante una strategia che preveda un metodo
di screening per selezionare quei campioni i cui livelli di diossine
e di PCB diossina-simili siano superiori ai tenori massimi consentiti
dal regolamento n. 466/2001 e successive modifiche o inferiori non
oltre il 30-40% di tali tenori. Occorre poi determinare/confermare la
concentrazione di diossine in tali campioni tramite un metodo di
conferma.
I metodi di screening sono impiegati per rilevare la presenza di
diossine e PCB diossina-simili ai livelli consentiti. Essi sono
dotati di una grande capacità di trattamento di campioni, il che
consente di passare al vaglio un'elevata quantità di campioni per
ricercare quelli che potrebbero rivelarsi positivi. Questi metodi
sono specialmente concepiti in modo da evitare i falsi negativi.
I metodi di conferma forniscono informazioni complete o
complementari che consentono di individuare e quantificare in maniera
inequivocabile le diossine e i PCB diossina-simili al livello
consentito.
2. Contesto
Poichè i campioni ambientali e biologici (inclusi i campioni di
prodotti alimentari) generalmente contengono miscele complesse di
diversi congeneri di diossine, per agevolare la valutazione dei
rischi è stato elaborato il concetto di fattori di tossicità
equivalente (TEF). Tali TEF consentono di esprimere concentrazioni di
miscele di PCDD e PCDF sostituiti alle posizioni 2,3,7,8 e, di
recente, alcune forme di PCB non orto e orto clorosostituiti aventi
proprietà simili a quelle delle diossine in equivalenti tossici (TE)
di 2,3,7,8-TCDD (cfr. nota 1, allegato I).
Le concentrazioni delle singole sostanze in un dato campione
vengono dapprima moltiplicate per il corrispondente TEF e poi sommate
per ottenere la concentrazione totale dei composti diossina-simili
espressa in TE.
Per il calcolo del «valore superiore», si suppone che il
contributo al TE di ogni congenere non qualificato sia uguale alla
soglia di determinazione.
Per il calcolo del «valore inferiore», si suppone che il
contributo al TE di ogni congenere non quantificato sia uguale a
zero.
Per il calcolo del «valore intermedio», si suppone che il
contributo al TE di ogni congenere non quantificato sia uguale alla
metà della soglia di quantificazione.
3. Requisiti per la garanzia della qualità da applicarsi nella
preparazione dei campioni
Occorre adottare tutte le precauzioni possibili per evitare
qualsiasi contaminazione durante ogni fase del campionamento e
dell'analisi.
I campioni devono essere conservati e trasportati in appositi
contenitori di vetro, illuminio, polipropilene o polietilene, dopo
avere rimosso eventuali tracce di polvere di carta dal contenitore.
Gli strumenti in vetro devono essere risciacquati con solventi
sottoposti a un controllo volto a determinare la presenza di
diossine. In generale i contenitori devono essere preferibilmente
«monouso».
La conservazione e il trasporto devono svolgersi in modo da
preservare l'integrità del campione alimentare.
Se necessario, triturare e mescolare bene ogni aliquota
ricorrendo a un metodo che garantisca una completa omogeneizzazione
(ad esempio, la triturazione deve consentire al materiale di passare
attraverso un setaccio a maglie di 1 mm); prima della triturazione, i
campioni devono essere essiccati, nel caso il livello di umidità sia
troppo elevato.
Il peso del campione utilizzato per l'estrazione deve essere tale
da rispondere ai requisiti relativi alla sensibilità del metodo.
Esistono numerose procedure specifiche per la preparazione dei
campioni, che possono essere impiegate in modo soddisfacente per i
prodotti considerati. Le procedure devono essere convalidate in base
a orientamenti riconosciuti sul piano internazionale.
Occorre fare un'analisi del bianco, ovvero effettuare l'intera
procedura analitica senza il campione.
4. Requisiti applicabili ai laboratori
I laboratori devono dimostrare la validità del metodo
nell'intervallo di tolleranza del livello considerato, ad esempio,
0,5x, 1x e 2x il livello considerato, con un coefficiente di
variazione accettabile per analisi ripetute. Per ulteriori
informazioni su criteri di validità, cfr. il punto 5.
Il limite di quantificazione per un metodo di conferma non deve
essere superiore a un quinto del livello considerato, per garantire
coefficienti di variazione accettabili nell'intervallo summenzionato.
Si devono costantemente effettuare controlli in bianco ed
esperimenti o analisi dei campioni di controllo con l'aggiunta di
indicatori (di preferenza, se disponibile, materiale di riferimento
certificato), quali misure interne di garanzia della qualità.
La riuscita partecipazione a studi condotti in collaborazione con
altri laboratori che valutano la competenza del laboratorio è il
modo migliore per dimostrarne la perizia nell'ambito di analisi
specifiche. Tuttavia, il buon esito della partecipazione a studi
condotti con altri laboratori, ad esempio, su campioni di terreno o
di acque residue, non dimostra necessariamente che il laboratorio sia
altrettanto competente a trattare campioni di prodotti alimentari o
mangimi, caratterizzati da livelli di contaminazione minore. È
pertanto requisito imprescindibile la partecipazione regolare a studi
condotti in collaborazione con altri laboratori sulla determinazione
di diossina e di PCB diossina-simili nelle corrispondenti matrici di
prodotti alimentari/mangimi.
In conformità con quanto prescritto dal decreto legislativo
26 maggio 1997, n. 156 i laboratori devono essere accreditati da un
organismo riconosciuto, che certifichi l'applicazione della garanzia
della qualità relativamente ai metodi d'analisi. I laboratori devono
essere accreditati in base alla norma ISO/IEC/17025:1999.
5. Requisiti applicabili alla procedura d'analisi
Requisiti di base di validità delle procedure d'analisi:
elevata sensibilità e limiti di rilevabilità bassi. Per
quanto concerne le PCDD e i PCDF, le quantità rilevabili devono
essere dell'ordine del picogrammo di TE (10 12 g), data l'estrema
tossicità di alcuni di questi composti. È noto che i PCB si
presentano in quantità più elevate rispetto alle PCDD e ai PCDF.
Per quanto concerne la maggior parte dei congeneri di PCB, una
sensibilità dell'ordine del nanogrammo (10 9 g) è sufficiente.
Tuttavia, per la determinazione dei congeneri più tossici di PCB
diossina-simili (in particolare i congeneri non orto sostituiti) si
deve ottenere la stessa sensibilità delle PCDD e dei PCDF;
elevata selettività (specificita). Occorre distinguere le
PCDD, i PCDF, i PCB diossina-simili da una moltitudine di altri
composti che, estratti simultaneamente dal campione e suscettibili
d'interferire, sono presenti in concentrazioni di molto superiori a
quelle degli analiti da rilevare. Per quanto concerne i metodi di
gascromatografia/spettrometria di massa (GC/MS), è necessario
distinguere tra vari congeneri, in particolare tra quelli tossici (ad
esempio, i diciassette PCDD e PCDF sostituiti alle posizioni 2,3,7,8
e i PCB diossina-simili) e altri congeneri. Mediante saggio biologico
dovrebbe essere possibile determinare selettivamente i valori di TE,
quale somma di PCDD, PCDF e PCB diossina-simili;
elevata accuratezza (esattezza e precisione). La determinazione
deve fornire una stima valida della concentrazione reale presente in
un campione. È necessario porre estrema cura (accuratezza della
misurazione: grado di concordanza tra il risultato di una misurazione
e il valore reale o assegnato del misurando) per evitare che i
risultati dell'analisi di un campione siano respinti a causa della
scarsa affidabilità della stima dei TE. L'accuratezza è la
risultante di esattezza (differenza tra il valore medio misurato per
un analita in un materiale certificato, espressa in percentuale di
tale valore) e precisione (la precisione viene generalmente calcolata
sotto forma di scarto-tipo; essa include la ripetibilità e la
riproducibilità e indica il grado di concordanza tra i risultati
ottenuti applicando ripetutamente la procedura sperimentale in
determinate condizioni).
I metodi di screening possono comprendere saggi biologici e
metodi GC/MS, mentre i metodi di conferma sono costituiti dalla
gascromatografia ad alta risoluzione e dalla spettrometria ad alta
risoluzione (HRGC/HRMS).
Si devono osservare i seguenti criteri per il valore totale in
TE:

=====================================================================
|Metodi di screening|Metodi di conferma
=====================================================================
Percentuale di falsi negativi |&lt; 1% |
---------------------------------------------------------------------
Esattezza | |- 20% a + 20%
---------------------------------------------------------------------
CV (coefficiente di | |
variazione) |&lt; 30% |&lt; 15%

6. Requisiti specifici applicabili ai metodi d'analisi GC/MS con
finalità di screening o di conferma.
Quale primo passo dell'analisi, da effettuare, ad esempio prima
dell'estrazione per convalidare la procedura d'analisi, occorre
aggiungere standard interni di PCDD/F clorosostituti alla posizione
2,3,7,8 e marcati con 13C (e standard interni di PCB diossina-simile
marcati con 13C, se si devono determinare PCB diossina-simili). Va
aggiunto almeno un congenere per ciascun gruppo omologo di PCDD/F da
tetra a octaclorati (e almeno un congenere per ciascun gruppo omologo
di PCB diossina-simile, se si devono determinare PCB diossina-simili)
(in alternativa, è possibile aggiungere almeno un congenere per
ciascuna funzione di registrazione di ioni selezionati tramite
spettrografia di massa utilizzata per il controllo di PCDD/F e PCB
diossina-simile. Si consiglia vivamente, soprattutto per i metodi di
conferma, di utilizzare l'insieme dei 17 standard interni di PCDD/F
clorosostituiti alle posizioni 2,3,7,8 marcati con 13C, nonchè la
totalità dei dodici standard interni di PCB diossina-simile marcati
con 13C (nel caso si debbano determinare PCB diossina-simili).
Vanno inoltre determinati i fattori di risposta relativa per quei
congeneri ai quali non è stato aggiunto alcun analogo marcato con
13C, utilizzando soluzioni di taratura adeguate.
Per i prodotti alimentari d'origine vegetale e per i prodotti
alimentari d'origine animale con un contenuto di grasso inferiore al
10%, l'aggiunta di standard interni prima dell'estrazione è
obbligatoria. Per i prodotti d'origine animale con un contenuto di
grasso superiore al 10% gli standard intemi possono essere aggiunti o
prima dell'estrazione o dopo l'estrazione del grasso. Occorre
convalidare adeguatamente l'efficacia dell'estrazione, a seconda
della fase in cui sono stati introdotti gli standard interni e del
modo in cui i risultati sono riportati (sulla base del prodotto o del
grasso).
Prima dell'analisi GC/MS, occorre aggiungere l o 2 standard di
recupero.
È necessario effettuare il controllo del recupero. Per i metodi
di conferma, i recuperi di singoli standard interni devono essere
compresi tra il 60% e il 120%. Recuperi inferiori o superiori per
singoli congeneri, in particolare alcune dibenzodiossine e alcuni
dibenzofurani epta e octaclorati, sono accettabili, purchè il loro
contributo al valore TE non superi il 10% del valore totale TE
(tenendo conto unicamente di PCDD/F). Per quanto concerne i metodi di
screening, i recuperi devono essere compresi tra il 30% e il 140%.
È opportuno separare le diossine dai composti clorurati
interferenti, quali i PCB e gli eteri clorurati di difenile,
ricorrendo ad adeguate tecniche cromatografiche (di preferenza
tramite una colonna di florisil, d'allumina e/o di carbone).
La separazione gascromatografica degli isomeri deve essere
adeguata (overlapping &amp;60; 25% tra 1,2,3,4,7,8-HxCDD e
1,2,3,6,7,8-HxCDD).
Per la determinazione, si consiglia di fare riferimento al metodo
«EPA Method 1613, Revision B: Tetra-trough Octachlorinated Dioxins
and Furans by Isotope Dilution HRGC-HRMS», o ad un altro metodo con
criteri di rendimento equivalenti.
La differenza tra il livello massimo e il livello minimo non deve
essere superiore al 20% per i prodotti alimentari con una
contaminazione da diossina di circa 1 pg. WHO/TE/g di base lipidica
(tenendo conto unicamente di PCDD/PCDF). La stessa prescrizione si
applica ai prodotti alimentari a basso contenuto di grasso che
presentano livelli di contaminazione dell'ordine di circa 1 pg.
WHO/TE/g di prodotto. Per livelli di contaminazione inferiori, ad
esempio 0,50 pg. TE/g di prodotto, la differenza tra il livello
massimo e il livello minimo può essere dell'ordine del 25-40%.
7. Metodi d'analisi di screening.
7.1. Introduzione.
Il metodo di screening consente di applicare vari approcci
analitici: un approccio puramente di screening e un approccio
quantitativo.
Approccio di screening.
La risposta dei campioni è confrontata con quella di un campione
di riferimento al livello considerato. I campioni la cui risposta è
inferiore a quella del campione di riferimento sono considerati
negativi, mentre quelli con risposta superiore sono ritenuti
positivi.
Requisiti:
In ogni serie di prove si devono includere un campione di
riferimento e uno in bianco, estratti e analizzati allo stesso tempo
e alle medesime condizioni. Il campione di riferimento deve
presentare una risposta nettamente superiore a quella del bianco.
Si devono includere campioni di riferimento supplementari con
concentrazione pari a 0,5x e 2x il livello considerato, per
dimostrare l'efficacia del saggio nell'intervallo considerato per il
controllo del livello considerato.
Qualora si analizzino altre matrici, occorre dimostrare la
validità dei campioni di riferimento, utilizzando di preferenza
campioni il cui livello di TE, stabilito tramite HRGC/HRMS, sia
equivalente a quello del campione di riferimento o di un bianco
arricchito.
Poichè nel saggio biologico non si possono utilizzare standard
interni, i saggi di ripetibilità sono estremamente importanti per
ottenere informazioni sullo scarto-tipo nell'ambito di una serie di
saggi. Il coefficiente di variazione deve essere inferiore al 30 %.
Per quanto concerne i saggi biologici, occorre definire quali
sono i composti-bersaglio, le potenziali interferenze e il valore
massimo tollerato per il bianco.
Approccio quantitativo.
L'approccio quantitativo comprende obbligatoriamente una serie di
diluizioni-tipo, un processo di purificazione e di misurazione doppio
o triplo, nonchè analisi in bianco e controlli di recupero. Il
risultato può essere espresso in TE, dando per scontato che i
composti responsabili del segnale soddisfano il principio di TE. A
tal fine, si può impiegare la TCDD (o una miscela-tipo di
diossine/furani) per elaborare una curva di taratura che consenta di
calcolare il livello di TE nell'estratto e, di conseguenza, nel
campione. Tale risultato è poi corretto con il livello di TE
calcolato per un campione in bianco (per tenere conto di impurezze
derivanti dai solventi e dalle sostanze chimiche utilizzate) e per il
recupero (quest'ultima quantità è calcolata a partire dal livello
di TE in un campione di controllo qualità la cui concentrazione è
equivalente a quella del livello massimo considerato). È
fondamentale tenere conto che una parte della perdita apparente del
recupero può essere dovuta agli effetti della matrice e/o alle
differenze tra i valori dei TEF nei biotest e i valori dei TEF
ufficiali stabiliti dall'OMS.
7.2. Requisiti per i metodi d'analisi utilizzati per lo screening.
Lo screening può essere effettuato tramite metodi d'analisi
GC/MS e saggi biologici. Ai metodi GC/MS si applicano le prescrizioni
stabilite al punto 6. Prescrizioni specifiche sono stabilite al punto
7.3 per i saggi biologici in vitro, e al punto 7.4 per i saggi
biologici realizzati con kit.
Si devono fornire informazioni sul numero di risultati falsi
positivi e falsi negativi di un'ampia serie di campioni al di sopra e
al di sotto dei livelli massimi o dei valori delle soglie
d'intervento, raffrontati al contenuto di TE determinato tramite
metodo analitico di conferma. La percentuale reale di falsi negativi
deve essere inferiore all'1%. Affinchè il metodo di screening
risulti vantaggioso, la percentuale di campioni falsi positivi deve
essere sufficientemente bassa.
I risultati positivi devono essere sempre convalidati tramite un
metodo analitico di conferma (HRGC/HRMS). I campioni corrispondenti a
una vasta gamma di TE devono inoltre essere confermati tramite
HRGC/HRMS (circa 2-10% dei campioni negativi). Si devono fornire dati
sulle corripondenze tra i risultati dei saggi biologici e quelli
della HRGC/HRMS.
7.3. Requisiti specifici per i saggi biologici in vitro.
Quando si effettua un saggio biologico, si deve utilizzare in
ogni prova una serie di concentrazioni di riferimento di TCDD o una
miscela di diossine/furani (curva di risposta con un R2 &amp;62; 0,95 per
una dose completa). Tuttavia, ai fini dello screening, si può
utilizzare nell'analisi dei campioni a bassa concentrazione una curva
dettagliata nei livelli bassi.
Per i risultati del saggio biologico in un intervallo di tempo
costante, è opportuno usare una concentrazione di riferimento di
TCDD (circa 3x il limite di determinazione) su un modulo di controllo
della qualità. In alternativa, si può utilizzare la risposta
relativa di un campione di riferimento paragonata a un curva di
taratura di TCDD, dato che la risposta delle cellule può dipendere
da molteplici fattori.
Si raccomanda di compilare e verificare i grafici del controllo
della qualità (QC) per ogni tipo di materiale di riferimento, per
garantire che il risultato sia conforme alle linee guida indicate.
La risposta indotta dalla diluizione utilizzata per il campione
deve situarsi nella parte lineare della curva di risposta, in
particolare per i calcoli quantitativi. I campioni che non rientrano
nella parte lineare della curva di risposta devono essere diluiti e
nuovamente analizzati. Si consiglia pertanto di analizzare almeno 3
diluizioni alla volta.
Lo scarto percentuale-tipo non deve essere superiore al 15%
quando si effettua una determinazione tripla per ogni diluizione del
campione, nè superiore al 30% fra tre esperimenti indipendenti.
È possibile scegliere come limite di rilevamento un valore
equivalente a 3 volte lo scarto-tipo della soluzione di solvente in
bianco o della risposta di fondo. Un altro metodo consiste
nell'applicare una risposta che sia superiore alla risposta di fondo
(fattore d'induzione 5 volte il solvente in bianco) calcolata dalla
curva di taratura del giorno. È possibile scegliere come limite di
quantificazione un valore equivalente a 5-6 volte lo scarto-tipo
della soluzione di solvente in bianco o della risposta di fondo
oppure applicare una risposta che sia nettamente superiore alla
risposta di fondo (fattore d'induzione 10 volte il solvente in
bianco) calcolata dalla curva di taratura del giorno.
7.4. Requisiti specifici per i saggi biologici effettuati con kit
(1).
Occorre seguire le istruzioni del fabbricante relative alla
preparazione dei campioni e alle analisi.
Il kit non deve essere utilizzato oltre la data di scadenza
indicata.
Non si devono utilizzare materiali o componenti previsti per
altri kit.
I kit vanno conservati e utilizzati alle condizioni di
temperature di conservazione e di impiego indicate.
Il limite di rilevazione per gli immunodosaggi è pari alla somma
della media e 3x lo scarto tipo, basandosi su 10 analisi ripetute del
bianco, diviso per il valore della pendenza dell'equazione di
regressione lineare.
È opportuno impiegare standard di riferimento per le prove di
laboratorio, al fine di garantire che la risposta allo standard
rientri in un intervallo di valori accettabile.
8. Comunicazione dei risultati.
A condizione che il metodo d'analisi impiegato lo consenta, i
risultati dell'analisi devono contenere i livelli dei singoli
congeneri di PCDD/F e PCB, nonchè essere indicati come limite
inferiore, limite superiore e valore intermedio, onde fornire la
maggiore quantità di dati possibile e permettere così di
interpretare i risultati in base alle prescrizioni specifiche.
La relazione deve inoltre menzionare il contenuto lipidico del
campione e il metodo impiegato per l'estrazione del grasso.
I recuperi dei singoli standard interni devono essere forniti se
si situano al di fuori dell'intervallo menzionato al punto 6 e
qualora eccedano il livello massimo; negli altri casi, dietro
richiesta.
(1) I kit per saggi biologici attualmente in commercio non hanno
dato prove sufficienti di sensibilità e affidabilità, tali da
poterli utilizzare per rilevare la presenza di diossine ai livelli
richiesti nei campioni di prodotti alimentari e mangimi.