Serie Generale n. 81 del 5-4-1996
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 27 marzo 1996
Lotta obbligatoria contro il colpo di fuoco batterico (Erwinia amylovora), nel territorio della Repubblica. (GU Serie Generale n.81 del 05-04-1996)

Il MINISTRO DELLE RISORSE
AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
Vista la legge 18 giugno 1931, n. 987, e successive modificazioni
ed integrazioni, recante disposizioni per la difesa delle piante
coltivate e dei prodotti agrari dalle cause nemiche e sui relativi
servizi e successive modificazioni;
Visto il regolamento per l'applicazione della predetta legge,
approvato con regio decreto 12 ottobre 1933, n. 1700, e modificato
con regio decreto 2 dicembre 1937, n. 2504;
Vista la direttiva n. 77/93/CEE del Consiglio del 21 dicembre 1976,
concernente le misure di protezione contro l'introduzione negli Stati
membri di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali e
successive modificazioni;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 24 luglio 1977, n.
616, in virtù del quale è stata confermata allo Stato la
determinazione degli interventi obbligatori in materia fitosanitaria
(art. 71, comma 1, lettera c));
Visto il decreto legislativo n. 536 del 30 dicembre 1992 che, in
attuazione della direttiva 91/683/CEE, istituisce il servizio
fitosanitario nazionale;
Visto il decreto ministeriale 31 gennaio 1996, pubblicato nel
supplemento ordinario n. 33 alla Gazzetta Ufficiale n. 41 del 19
febbraio 1996, concernente le misure di protezione contro
l'introduzione e la diffusione nel territorio della Repubblica
italiana di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali;
Considerato che in alcune zone del territorio italiano è stata
accertata su pomacee coltivate la comparsa di focolai della malattia
denominata colpo di fuoco causata dal batterio Erwinia amylovora
(Burrill) Winslow et al.;
Considerato che l'agente causale può essere disseminato a breve ed
a grande distanza con i materiali vegetali di vivaio;
Considerato che l'agente causale può essere disseminato a breve
distanza per mezzo di strumenti contaminati nel corso di operazioni
colturali e per mezzo di vettori naturali quali insetti
impollinatori, e da correnti aeree trasportanti aerosol liquidi
generati da pioggia od irrigazione e da aerosol solidi derivanti da
essudati batterici disseccati sulle piante ammalate;
Considerato che numerose specie di rosacee, coltivate e spontanee
dei generi Amelanchier, Chaenomeles, Crataegus, Cotoneaster, Cydonia,
Eriobotrya, Malus, Mespilus, Potentilla, Pyracantha, Pyrus, Rubus,
Sorbus e Stranvaesia, possono esser colpite da Erwinia amylovora e
che il contenimento efficace o la sua eradicazione in un nuovo
territorio sono possibili solo con interventi tempestivi e drastici
sui focolai primari;
Considerato che l'agente causale può sopravvivere almeno trenta
giorni alla superficie di organi vegetali e rimanere per almeno un
anno all'interno di piante ospite senza causare sintomi visibili;
Considerato che per pubblica utilità è necessario distruggere sia
le piante infette che quelle in loro immediata vicinanza perchè
contaminate da germi di Erwinia amylovora epifiti o endofiti,
potenziali agenti di nuove infezioni;
Udito il parere n. 28/95 espresso nell'adunanza del 23 gennaio 1996
dal Consiglio superiore delle risorse agricole, alimentari e
forestali sullo schema di decreto ministeriale concernente la lotta
obbligatoria contro il "colpo di fuoco batterico" (Erwinia
amylovora);
Decreta:
Art. 1.
Scopo generale
La lotta contro il batterio Erwinia amylovora, agente del colpo di
fuoco delle pomacee, è obbligatoria nel territorio della Repubblica
italiana al fine di prevenirne la introduzione e la diffusione.

Art. 2.
Ispezioni sistematiche
I servizi fitosanitari regionali devono effettuare ogni anno
indagini sistematiche mirate ad accertare la presenza del batterio
sulle specie di rosacee ospiti, coltivate e spontanee dei generi
Amelanchier, Chaenomeles, Crataegus, Cotoneaster, Cydonia,
Eriobotrya, Malus, Mespilus, Pyracantha, Pyrus, Sorbus e Stranvaesia,
con particolare attenzione ai vivai.
Le indagini devono consistere in ispezioni visive delle piante
ospiti, per accertare la presenza dei sintomi di colpo di fuoco, e,
se del caso, in appropriate analisi batteriologiche conformi ai
metodi specificati nell'allegato I.
Le ispezioni ufficiali devono essere effettuate, oltre che nei
punti della rete di monitoraggio descritta nell'allegato II, nei
vivai, nei frutteti, nei giardini, nei parchi pubblici e privati e
tra la flora spontanea.
I risultati di dette indagini devono essere comunicati al servizio
fitosanitario centrale entro il 30 novembre di ogni anno.

Art. 3.
Denuncia dei casi sospetti
È fatto obbligo a chiunque denunciare ogni caso sospetto di colpo
di fuoco al Servizio fitosanitario regionale che provvederà ad
effettuare ispezioni visive ed eventuali analisi batteriologiche
ufficiali.
Le regioni devono dare massima divulgazione alla conoscenza dei
sintomi e della pericolosità del colpo di fuoco sulle pomacee.
In attesa di conferma o smentita di ogni caso sospetto il servizio
fitosanitario regionale al fine di scongiurare la disseminazione di
Erwinia amylovora può attuare interventi cautelativi, commisurati al
rischio stimato, incluso il divieto di trasportare in altro luogo
materiali vegetali, contenitori, utensili e macchine dalla azienda,
dal vivaio o dall'area in cui si è avuta la manifestazione sospetta.
La pianta o le piante sospette devono essere contrassegnate, con
divieto di contatto e rimozione.

Art. 4.
Accertamento ufficiale di un caso
Qualora le analisi batteriologiche ufficiali confermino la presenza
di Erwinia amylovora in un campione di materiale vegetale, il
servizio fitosanitario regionale deve dichiarare contaminata l'area
od il campo da cui è stato raccolto il campione e provvedere a far
estirpare e distruggere immediatamente ogni pianta visibilmente
infetta e, attorno ad essa, ogni altra pianta ospite asintomatica per
un raggio di dieci metri. L'estirpazione e la distruzione sono a cura
e spese dei proprietari o conduttori dei terreni a qualsiasi titolo,
sotto il controllo del servizio fitosanitario regionale.
In caso di vivai, il servizio fitosanitario regionale può disporre
l'estirpazione e la distruzione delle piante ospiti asintomatiche per
un raggio superiore a dieci metri.
Il servizio fitosanitario regionale deve altresì istituire una
zona di sicurezza, effettuare una indagine tecnico-amministrativa per
conoscere l'origine delle piante infette e denunciare immediatamente
ogni caso accertato di colpo di fuoco al servizio fitosanitario
centrale.

Art. 5.
Zona di sicurezza
La zona di sicurezza, comprendente un'area di almeno 3,5 km(Elevato
al Quadrato) (raggio di almeno 1 km) attorno al punto del focolaio
accertato, deve essere ispezionata con cura e frequentemente per
accertare la presenza di sintomi visivi di colpo di fuoco nel resto
della stagione vegetativa in cui è avvenuto l'accertamento e per
quella successiva; alla terza stagione vegetativa dalla scoperta, la
zona di sicurezza può essere tolta se non siano stati accertati
ulteriori casi; la stessa area deve essere ispezionata due volte
all'anno nei periodi di giugno-luglio e settembre-ottobre.
La scoperta di altri casi di colpo di fuoco in una zona di
sicurezza deve comportare l'allargamento della stessa zona per almeno
1 km di raggio dal punto di accertamento.

Art. 6.
Trattamento del focolaio primario
Il servizio fitosanitario regionale deve ispezionare ogni quindici
giorni, per il resto della stagione vegetativa in cui è avvenuto
l'accertamento, tutte le piante ospite dell'area o del campo
dichiarato contaminato, controllando anche frequentemente le aree
limitrofe.
Ogni pianta o parte di pianta con sintomi sospetti di colpo di
fuoco deve essere immediatamente estirpata od asportata e distrutta,
senza la necessità di analisi batteriologiche di conferma.
L'asportazione di parti sintomatiche di fusto deve essere effettuata
con taglio ad almeno quaranta cm dal limite prossimale visibile della
lesione.
Ad inizio inverno, a vegetazione quiescente, tutte le piante
dell'area o del campo dichiarato contaminato devono essere trattate
con un appropriato principio attivo su indicazione del servizio
fitosanitario competente.

Art. 7.
Trasporti vietati
Per i dodici mesi successivi alla scoperta dell'ultimo caso
accertato è vietato trasportare fuori dalla zona di sicurezza o
mettervi a dimora piante ospiti di Erwinia amylovora o loro parti
senza preventiva autorizzazione del servizio fitosanitario regionale.
Per i dodici mesi successivi alla scoperta dell'ultimo caso
accertato è vietato trasportare fuori dall'area o dal campo
dichiarato contaminato materiale vegetale di piante ospiti di Erwinia
amylovora (inclusi polline, frutti e semi) senza preventiva
autorizzazione del servizio fitosanitario regionale.
Gli alveari di api presenti all'interno della zona di sicurezza,
che viene istituita secondo quanto previsto all'art. 4, possono
essere rimossi e trasportati altrove solo a partire dal mese di
ottobre dell'anno di accertamento del caso. Detti alveari andranno
comunque allontanati almeno di 5 km prima dell'inizio della
successiva fioritura delle piante ospiti.
È vietato introdurre alveari di api nelle zone di sicurezza.
In deroga al primo comma, il servizio fitosanitario regionale può
autorizzare la commercializzazione di piante ospiti di Erwinia
amylovora o loro parti verso zone non protette dell'Unione europea o
verso Paesi terzi.

Art. 8.
Distruzione delle piante infette
L'estirpazione di piante, l'asportazione di parti di piante e la
loro distruzione devono essere effettuate a spese del proprietario o
del conduttore sotto il controllo del servizio fitosanitario
regionale. Le parti di piante devono essere accatastate nel punto di
estirpazione delle piante infette o in area limitrofa, e bruciate
fino all'incenerimento.
Le piante infette o loro parti non possono essere trasportate fuori
dall'area o dal campo dichiarato contaminato.
Il servizio fitosanitario regionale, al termine delle operazioni,
deve accertare che tutti gli strumenti di taglio siano stati
sterilizzati in loco per via chimica o fisica.

Art. 9.
Indagine epidemiologica
Il servizio fitosanitario regionale, immediatamente dopo
l'accertamento ufficiale di un focolaio, deve effettuare un'ispezione
presso i vivai delle ditte da cui provengono le piante infette
trovate nell'area o nel campo dichiarato contaminato, estendendola
anche al territorio circostante per un raggio di 2 km.
Fino al termine della stagione vegetativa dell'anno di accertamento
del caso, il servizio fitosanitario regionale deve effettuare altre
due ispezioni nonchè due nell'anno seguente, nei periodi
maggio-luglio e settembre-ottobre. Qualora i vivai della ditta si
trovino in altra regione, deve essere avvertito il servizio
fitosanitario regionale competente per territorio che effettuerà le
dovute ispezioni.
I servizi fitosanitari regionali devono trasmettere al servizio
fitosanitario centrale i risultati della indagine epidemiologica.
Il servizio fitosanitario regionale competente per territorio deve
rilevare le destinazioni delle altre spedizioni effettuate, a partire
dal mese di settembre dell'anno precedente l'accertamento del
focolaio, dalle ditte di cui al primo comma, dandone comunicazione ai
servizi fitosanitari delle regioni di destinazione.

Art. 10.
Detenzione di colture
È vietata la detenzione e la manipolazione di colture di Erwinia
amylovora.
Chiunque per mezzo di analisi batteriologiche effettuate in Italia
od all'estero identifichi come Erwinia amylovora un batterio
associato a materiale vegetale presente o prodotto in territorio
italiano deve comunicare immediatamente l'avvenuta identificazione al
servizio fitosanitario regionale competente che provvederà alla
conferma (allegato I).

Art. 11.
D e r o g h e
Il servizio fitosanitario centrale può autorizzare, fatte salve le
disposizioni della direttiva 77/93/CEE, deroghe alle disposizioni
dell'art. 10 del presente decreto per prove o scopi scientifici,
nonchè lavori di selezione varietale purchè tali deroghe non
compromettano il controllo dell'organismo nocivo e non creino rischio
di disseminazione dello stesso (allegato I).

Art. 12.
Cessazione zone di sicurezza
Nelle aree non riconosciute più come "zone protette", ai sensi
della direttiva 77/93/CEE e successive modificazioni, non sussiste
l'obbligo di costituire zone di sicurezza.

Art. 13.
Denuncia degli inadempienti
In caso di mancata applicazione delle disposizioni di cui al
presente decreto, gli inadempienti saranno denunciati alla autorità
giudiziaria a norma dell'art. 500 del codice penale.
Il presente decreto entrerà in vigore il giorno successivo alla
sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Roma, 27 marzo 1996
Il Ministro: LUCHETTI

ALLEGATO I
MATERIALI E METODI
1. Isolamento ed identificazione.
1.1. Prelievo dei tessuti infetti dal materiale sintomatico.
Nel corso della stagione vegetativa il materiale sintomatico può
consistere in fiori, frutti, foglie, germogli, branche e tronchi, in
presenza od in assenza di essudato. In presenza di essudato,
prelevarne con ansa qualche gocciola e sospenderlo in 3 ml di acqua
distillata sterile fino ad ottenere una sospensione leggermente
opalescente. In assenza di essudato, si trova il limite delle lesioni
e si asportano con bisturi sterile cinque pezzetti di corteccia al
bordo dei tessuti infetti, dopo aver asportato gli strati
superficiali suberificati. Si preferiscano aree umide ed isole
arrossate su branche e tronchi, aloni idropici su fiori e frutti.
1.2. Isolamento.
Macerare cinque pezzetti di tessuto (isodiametrici, di circa 3 mm)
in acqua distillata sterile in mortaio, dapprima in 0,1 ml e poi dopo
aggiunta di 0,4 ml. Preparare una diluizione decimale in acqua
distillata sterile (1:9; v:v) della sospensione dei pezzetti o delle
gocce di essudato. Inseminare le sospensioni concentrate e le loro
diluizioni decimali su piastre di agar nutritivo al saccarosio (ANS)
e mettere le piastre ad incubare in aerobiosi a 27 C. Dopo
quarantotto ore individuare le colonie biancastre, aventi 3-5 mm di
diametro, elevate a forma di cupola, lucenti e di aspetto mucoso.
Siffatte colonie diconsi comunemente levaniformi. Purificare le
colonie levaniformi su piastre di ANS con almeno due trapianti
successivi di colonia singola a morfologia tipica. Ottenere da ogni
isolamento almeno cinque colture pure.
Conservare le colture pure a XX 80 C in brodo nutritivo-glicerina
(15%) od a 4 C liofilizzate.
1.3. Identificazione.
Sottoporre le colture pure ai saggi: presenza di ossidasi,
produzione di pigmento fluorescente, ipersensibilità su foglie di
tabacco, patogenicità su pere ed agglutinazione su vetrino con
antisiero specifico per Erwinia amylovora.
Le colture a colonie levaniformi, ossidasi negative, non producenti
pigmento fluorescente, causanti ipersensibilità su tabacco, marciume
ed essudato su pere ed agglutinate dall'antisiero specifico possono
essere identificate provvisoriamente come Erwinia amylovora.
L'identificazione provvisoria è necessaria e sufficiente per la
definizione di una zona contaminata.
1.4. Conferma della identificazione.
Chiunque identifichi come Erwinia amylovora un batterio isolato da
materiale vegetale deve inviare la coltura pura ad uno dei seguenti
centri diagnostici nazionali per la conferma della identificazione:
Istituto di patologia vegetale
Laboratorio di fitobatteriologia
Via Filippo Re, 8 - 40126 - Bologna
Istituto di patologia vegetale
Via Valdisavoia, 5 - 95123 - Catania
Per la spedizione ogni coltura pura, fresca o liofilizzata, deve
essere imballata entro un incavo di pannello di polistirolo di
adeguato spessore, pressato ai lati da due pezzi di cartone incollati
tra loro lungo i bordi mediante nastro adesivo. La coltura pura
imballata deve essere messa in sacchetto di polietilene sigillato e
spedito con urgenza entro busta foderata. Una spedizione può
comprendere più colture. Il centro diagnostico deve essere informato
della spedizione con almeno tre giorni di anticipo.
Il direttore dell'istituto, cui afferisce il centro diagnostico,
comunica per iscritto agli interessati l'esito dei saggi di conferma
entro 14 giorni dal ricevimento delle colture pure. La risposta può
essere ritardata di 7 giorni in caso di contaminazione delle colture.
Presso i centri diagnostici la identificazione è confermata
mediante saggi comparativi dei profili elettroforetici delle proteine
cellulari totali o dei profili degli esteri metilici dei grassi
cellulari totali o per la presenza di peculiari sequenze
nucleotidiche mediante loro amplificazione con reazione a catena
della polimerasi conformemente alle tecniche più aggiornate ed
affidabili indicate dalla letteratura specialistica.
1.5. Standard di riferimento.
Ogni saggio morfologico, fisiologico, patogenetico, immunologico e
molecolare di identificazione deve essere fatto in presenza di
appropriati controlli positivi e negativi, rappresentati da colture
pure o loro estratti.
I protocolli della tecnica di isolamento e dei saggi di
identificazione sono oggetto di corsi di addestramento a numero
chiuso presso i centri diagnostici, che provvedono a predisporre,
conservare ed inviare su richiesta gli standard di riferimento.
Le spese per la partecipazione ai corsi di addestramento e per
l'acquisizione degli standard di riferimento sono a carico degli
interessati.
2. Formulario e protocolli.
2.1. Agar-acqua.
Ha la seguente composizione: agar 0,5 g; acqua distillata, 100 ml.
Sterilizzare in autoclave a 121 C per quindici minuti.
2.2. YDC-agar.
Ha la seguente composizione: estratto di lievito, 1 g; glucosio, 2
g; carbonato di calcio (polvere finissima; Merck 2063) 2 g; agar 1,5
g; acqua distillata, 100 ml. Sterilizzare in autoclave a 121 C per
quindici minuti. Agitare bene per tenere in sospensione il carbonato
di calcio prima di farla solidificare a becco di clarino in tubo.
2.3. Colture batteriche.
Le colture pure dei batteri isolati e le colture di riferimento
possono essere coltivate ordinariamente su strisci di YDC-agar in
tubo incubate a 25-27 C e conservate temporaneamente a temperature
ambiente o più a lungo a 4 C. Su YDC agar Erwinia amylovora ha
buona crescita già dopo ventiquattro ore. Per il saggio presenza di
ossidasi si allevino le colture su strisci di KB agar (vedi
produzione di pigmento fluorescente).
2.4. Agar nutritivo al saccarosio (ANS).
Aggiungere 50 g di saccarosio ad ogni litro di agar CM3 (Oxoid) e
sterilizzare in autoclave a 121 C per quindici minuti;
alternativamente preparare il substrato aggiungendo 8 g di
Bacto-Nutrient Broth (Difco; cat. 0003-17-8), 50 g di saccarosio e 15
g di agar ad 1 lt di acqua distillata. Dopo aver sciolto l'agar a 100
C, regolare a pH 7 con aggiunta di 3N NaOH. Sterilizzare in
autoclave a 121 C per quindici minuti.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Pseudomonas fluorescens.
Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae producono su
ANS colonie levaniformi.
2.5. Presenza di ossidasi.
Preparare 10 ml di soluzione 1% di tetrametil-p-fenilendiammonio
cloruro (es. Merck 821102) (TMFD) in acqua distillata entro un tubo
accuratamente pulito. Ritagliare pezzetti (circa 3 x 3 cm) di carta
Whatman n. 1 pulita e riporli entro una capsula petri sterile. Dopo
aver posto un pezzetto di carta su una superficie di vetro pulita
sterile, depositare al centro del pezzetto una goccia della soluzione
di TMFD. Mentre la soluzione sta diffondendo radialmente e la carta
è ben impregnata, spalmare al centro dell'area umida una ansata
della coltura pura da identificare, avente 18-24 ore di età. Usare
una ansa di platino. In presenza di ossidasi, entro dieci secondi
compare una macchia porpora violacea scura nell'areola dove è stata
deposta la massa batterica. Si ha reazione debolmente positiva quando
la macchia compare dopo 10-30 secondi. Se non compare macchia entro
30 secondi, la reazione è negativa.
Controllo negativo: Pseudcmonas syringae pv. syringae.
Controllo positivo: Pseudomonas fluorescens.
2.6. Produzione di pigmento fluorescente.
Si saggia sull'agar nutritivo B di King, Ward e Raney (KB agar)
avente la seguente composizione: Proteose Peptone (Difco, cat.
0122-17-4), 20 g; glicerina 10 g; K2HP04, 1,5 g; MgS04. 7H20, 1,5 g;
agar 15 g; acqua distillata, 1 litro.
Dopo aver sciolto l'agar a 100 C, regolare a pH 7,2 con aggiunta
di 3N NaOH. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti.
Attorno alle colonie delle pseudomonadi fluorescenti cresciute su
questo substrato si ha diffusione radiale di pigmenti gialli o verdi
o bruni che a luce ultravioletta hanno fluorescenza verde o bleu.
L'alone fluorescente è visibile spesso anche alla luce normale di
laboratorio. Si tenga presente che certi isolati di Pseudomonas
syringae non producono pigmento fluorescente su KB agar o lo
producono con ritardo e la loro reazione può essere interpretata
come negativa.
La presenza di aloni fluorescenti deve essere osservata dopo
almeno tre giorni di incubazione a 27 C.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Xanthomonas campestris pv. pruni.
2.7. Patogenicità su pera.
Si usino pere immature di cv. Passa Crassana o Conference da 1-2
settimane dopo la caduta dei petali fino a 2-3 settimane prima della
maturità fisiologica. Le piccole pere verdi (maggior diametro di 2-3
cm) possono essere raccolte, immerse in soluzione di ipoclorito
sodico per cinque minuti, sciacquate in acqua distillata sterile,
asciugate con carta bibula sterile e conservate in frigorifero a 4C
entro contenitori chiusi per parecchi mesi (non oltre gennaio
dell'anno successivo). Durante questo periodo esse tendono a maturare
gradualmente e divengono man mano meno idonee al saggio. Possono
essere usate anche pere delle stesse cultivar conservate nei
frigoriferi industriali. Per il saggio si usino perine intere
immature oppure fette trasversali tagliate, capsule Petri aventi sul
fondo carta bibula immersa in 2-3 mm di acqua distillata. Le perine
siano deposte sulla cavità di piccole capsule Petri già predisposte
sulla carta bibula in modo che il frutticino non sia a contatto con
l'acqua. Le fette di pera, aventi spessore di circa 1 cm, vanno
adagiate su uno strato di agar acqua sterile solidificato al fondo di
capsule Petri di adeguate dimensioni. La conservazione entro queste
capsule Petri assicura alle perine (od alle fette) una adeguata
camera umida post-inoculazione.
Per l'inoculazione si conficchi per 3-4 mm la punta di un ago
attraverso una goccia di 10 (Micron(l di sospensione batterica
(concentrazione 108 batteri/ml) entro i tessuti della perina (o della
fetta). Su ogni perina (o fetta) possono aversi 4 punti di
inoculazione per isolato. Dopo l'inoculazione le capsule Petri siano
conservate a 27 C entro sacchetti di polietilene chiusi. In presenza
di Erwinia amylovora si può osservare sulle perine (o sulle fette)
dopo 3-5 giorni la presenza di gocciole lattiginose di essudato. Una
perina inoculata con Erwinia amylovora tende a marcire per intero
entro una settimana. L'area di perina che Erwinia amylovocra riesce
ad infettare a seguito di inoculazione sperimentale è tanto più
grande quanto più giovane è il frutto; di conseguenza le lesioni
tendono ad essere circoscritte man mano si avvicina la maturità di
raccolta.
Gli isolati di Pseudomonas syringae causano entro 1-7 giorni sulle
perine (o sulle fette) aree imbrunite di aspetto secco attorno al
foro d'inoculazione, senza alcuna produzione di essudato. Per gli
isolati di piante ospiti diverse da biancospino e pero è opportuno
ripetere a dose doppia le prove di patogenicità su perine o fette di
pera, nel caso in cui la prima inoculazione non causa alcun sintomo
riferibile ad Erwinia amylovora.
Controllo positivo: Erwinia amylovora (ceppo padano).
Controllo negativo I: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo II: acqua distillata.
2.8. Antisiero.
Si usi un antisiero od anticorpi monoclonali preparati usando come
antigene una coltura pura o molecola purificata di Erwinia amylovora,
messi a punto per la reazione di agglutinazione, di cui sia stata
saggiata la specificità con un congruo numero di batteri saprofiti
associati a pomacee.
Antisiero o anticorpi monoclonali possono essere richiesti ai
centri diagnostici od acquistati in commercio da ditte specializzate.
L'antisiero e gli anticorpi monoclonali devono essere conservati
ed usati secondo le indicazioni dei centri diagnostici o delle ditte
produttrici.
2.9. Agglutinazione su vetrino.
Si usino vetrini portaoggetto per microscopia, trasparenti,
puliti, ma non troppo sgrassati per evitare che le gocce d'acqua
depositate sopra si espandano troppo e creino un film troppo sottile.
Depositare separatamente su uno stesso vetrino una goccia di
antisiero specifico diluito circa da 1:20 a 1:30 (v:v) con soluzione
fisiologica (0,85 g di NaCl in 100 ml di acqua distillata) ed una
goccia di sospensione densa di cellule del batterio da identificare.
La sospensione deve essere lattiginosa, ben visibile ad occhio nudo,
ed avere una concentrazione dell'ordine di 1010 batteri/ml. Mescolare
delicatamente con ansa sterile le due gocce e poi imprimere al
vetrino un movimento di oscillazione. In caso di agglutinazione, si
nota la formazione di flocculi biancastri entro 1-2 minuti.
Se la flocculazione è immediata, i flocculi sono vistosi e
grossolani. Se la flocculazione è ritardata (dopo circa trenta
secondi), i flocculi sono piccoli e minuti, osservabili facendo
scorrere a film lungo il vetrino la mistura di reazione.
Controllo positivo: Erwinia amylovora (ceppo padano).
2.10. Ipersensibilità su foglie di tabacco.
Il saggio si effettua su foglie adulte di piante di tabacco
(Nicotiana tabacum L.), preferibilmente delle cultivar Samsun o White
Burley.
Si prepari in acqua distillata sterile in provetta di vetro una
sospensione di coltura pura, avente concentrazione dell'ordine di 108
batteri/ml. La coltura deve essere ben cresciuta ed avere 24h di
età. Questa concentrazione è riconoscibile con buona
approssimazione allorchè osservando controluce si nota che la
torbidità è uniforme ed intensa e che, agitando la provetta, i
vortici generati dalle cellule sospese sono facilmente distinguibili;
i vortici non sono più osservabili quando la concentrazione è di
107 batteri/ml o di 109 batteri/ml.
Al mattino, con siringa da 1 ml ed ago sottile (numeri da 16 a 20)
si infiltri la sospensione appena preparata in zona circoscritta di
una area internervale di foglia; più colture possono essere
infiltrate in altrettante aree internervali di una stessa foglia.
L'area internervale infiltrata deve essere marcata con appropriata
etichetta autoadesiva al bordo della foglia.
Durante l'infiltrazione è opportuno disporre sotto alle foglie ed
attorno alla pianta fogli di materiale assorbente (es. carta bibula,
giornali pluristratificati) in modo da raccogliere eventuali gocce
disperse.
Dopo l'infiltrazione, asciugata la superficie della foglia da
eventuali gocce residue di sospensione batterica con pezzetti di
carta bibula, le piante siano conservate a temperatura di 22-28 C
con alternanza di ore di luce (da 8 a 14) e di buio.
In caso di ipersensibilità, già dopo ventiquattro ore si osserva
che la intera zona internervale infiltrata con la coltura pura è
collassata ed imbrunita. Questa risposta è comunemente indicata come
necrosi ipersensibile confluente. Nei giorni successivi la zona
ipersensibile dissecca ulteriormente ed assume consistenza papiracea.
Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae (od altre
patovar), ma non i batteri saprofiti, causano necrosi confluente
ipersensibile.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Acqua distillata.
2.11. Distruzione dei materiali infetti o contaminati.
I campioni di piante infette le piante o le foglie di tabacco, le
perine o le fette di pera usati per glì isolamenti e
l'identificazione, tutti i materiali assorbenti contaminati e
qualsiasi altro oggetto venuto in contatto con i germi di Erwinia
amylovora devono essere raccolti in sacchetti autoclavabili e
sterilizzati in autoclave a 121 C per quindici minuti.

ALLEGATO II
1. Rete nazionale di monitoraggio.
Deve essere approntata secondo le indicazioni della circolare
ministeriale del 4 agosto 1991, integrate da quelle del presente
allegato.
La rete nazionale si compone di tre reti interregionali
continentali (settentrionale, tirrenica e adriatica) e di due reti
insulari (Sardegna e Sicilia). La rete interregionale settentrionale
è composta dalle reti delle regioni Emilia-Romagna, Friuli-Venezia
Giulia, Liguria, Lombardia, Marche, Piemonte, Val d'Aosta, Veneto e
delle province autonome di Trento e di Bolzano. La rete
interregionale tirrenica è composta dalle reti delle regioni
Calabria, Campania, Lazio, Toscana ed Umbria. La rete interregionale
adriatica è composta dalle reti delle regioni Abruzzo, Lucania,
Molise e Puglia.
2. Reti regionali di monitoraggio.
Ogni rete regionale è costituita da punti e linee, è gestita dal
servizio fitosanitario regionale e si avvale di un centro
diagnostico.
2.1. Punti di monitoraggio.
Sono piante ospite di Erwinia amylovora, singole od a gruppi,
distanti tra loro circa km 5. Devono essere disposte preferibilmente
lungo vie di comunicazione ed essere facilmente identificabili da un
ispettore in auto. Ogni punto ha una propria scheda su cui sono
annotati coordinate geografiche, punti di riferimento, fotografie,
strade di accesso e risultati delle ispezioni.
2.2. Linee di monitoraggio.
Sono costituite da piante ospite di Erwinia amylovora distribuite
continue od a breve interdistanza su lunghi tratti di strade,
autostrade, corsi d'acqua e linee ferroviarie. Ogni linea ha una
propria scheda come i punti.
2.3. Ispettori.
Sono membri del servizio fitosanitario regionale o persone da esso
autorizzate a compiere le ispezioni dei punti e delle linee.
2.4. Ispezioni.
Sono fatte in auto lungo itinerari prestabiliti secondo la
distribuzione dei punti e delle linee di monitoraggio nel territorio.
Ogni punto o linea è ispezionato due volte all'anno, nei periodi
maggio-luglio e settembre-ottobre.
2.5. Centri diagnostici.
Ogni rete regionale ha un centro diagnostico cui gli ispettori
inviano i campioni sospetti. I centri effettuano l'analisi
batteriologica dei campioni, comprendente l'isolamento di Erwinia
amylovora e la sua identificazione provvisoria per la costituzione
delle zone contaminate.