Serie Generale n. 162 del 12-7-1996
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 16 maggio 1996
Approvazione del metodo ufficiale di analisi per la determinazione diretta della furosina nel latte e nel formaggio. (GU Serie Generale n.162 del 12-07-1996)

L'ISPETTORE GENERALE CAPO
PER LA REPRESSIONE DELLE FRODI DEL MINISTERO
DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DI CONCERTO CON
IL DIRETTORE GENERALE
DEL DIPARTIMENTO DELLE DOGANE
E DELLE IMPOSTE INDIRETTE DEL MINISTERO DELLE FINANZE
IL DIRETTORE GENERALE
DEL DIPARTIMENTO DEGLI ALIMENTI E NUTRIZIONE E DELLA
SANITÀ PUBBLICA VETERINARIA DEL MINISTERO DELLA SANITÀ
IL DIRETTORE GENERALE
DELLA PRODUZIONE INDUSTRIALE DEL MINISTERO
DELL'INDUSTRIA, DEL COMMERCIO E DELL'ARTIGIANATO
Visto l'art. 2 della legge 4 dicembre 1993, n. 491, che istituisce
il Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali;
Visto il decreto legislativo 3 febbraio 1993, n. 29, concernente
norme per la razionalizzazione dell'organizzazione delle
amministrazioni pubbliche e revisione della disciplina in materia di
pubblico impiego, a norma dell'art. 2 della legge 23 ottobre 1992, n.
421;
Visti l'art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033,
convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la
repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di
sostanze di uso agrario e di prodotti agrari, e l'art. 108 del
regolamento per l'esecuzione dello stesso regio decreto-legge,
approvato con regio decreto 1 luglio 1926, n. 1361, i quali
prescrivono che le analisi occorrenti in applicazione delle norme
contenute nel regio decreto-legge e nel regolamento di esecuzione
suddetti dovranno essere eseguite dai laboratori incaricati con i
metodi di analisi prescritti da questo Ministero, di concerto con il
Ministero delle finanze, il Ministero della sanità ed il Ministero
dell'industria, del commercio e dell'artigianato;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 26 marzo 1980, n.
327: "Regolamento di esecuzione della legge 30 aprile 1962, n. 283",
e successive modificazioni, in materia di disciplina igienica della
produzione e della vendita delle sostanze alimentari e delle bevande;
Visto il decreto ministeriale 21 aprile 1986, pubblicato nel
supplemento ordinario alla Gazzetta Ufficiale della Repubblica
italiana n. 229 del 2 ottobre 1986, con il quale sono stati approvati
i "Metodi ufficiali di analisi per i formaggi", modificato ed
integrato con il decreto ministeriale 1 luglio 1994, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 160 dell'11 luglio
1994;
Vista la decisione del Consiglio del 14 novembre 1992, n.
92/608/CE, che stabilisce i metodi di riferimento da applicare per
l'analisi e la prova del latte trattato termicamente;
Visti i decreti ministeriali 18 marzo 1994 e 19 settembre 1994 con
i quali è stato fissato un valore massimo di furosina
rispettivamente per il formaggio mozzarella e gli altri formaggi
freschi a pasta filata e per il latte pastorizzato
perossidasi-positivo, per salvaguardare la genuinità e la qualità
di tali prodotti, pubblicati l'uno nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana n. 69 del 24 marzo 1994 e l'altro nella Gazzetta
Ufficiale della Repubblica italiana n. 227 del 28 settembre 1994;
Ritenuto pertanto necessario ufficializzare il metodo analitico, di
cui all'allegato A al citato decreto ministeriale 18 marzo 1994, al
fine di consentire il controllo quantitativo del precitato valore
limite di furosina legalmente stabilito per i formaggi freschi a
pasta filata e per il latte pastorizzato perossidasi-positivo;
Ritenuto altresì indispensabile porre a disposizione di tutti gli
istituti e laboratori pubblici idonei metodi di analisi per il
controllo del latte e dei formaggi, perchè le analisi da essi
compiute risultino uniformi nei procedimenti e nei risultati;
Sentito il parere della commissione per l'aggiornamento dei metodi
ufficiali di analisi per i prodotti agrari e le sostanze di uso
agrario - sottocommissione per i formaggi - di cui al decreto
ministeriale 11 febbraio 1981 e successive modificazioni, alla quale
con decreto ministeriale 19 dicembre 1992 è stato attribuito anche
l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi del prodotto agricolo
latte;
Ritenuto necessario modificare il testo del metodo per la
determinazione della furosina di cui all'allegato A al citato decreto
ministeriale 18 marzo 1994, apportando le modifiche approvate dalla
citata commissione per l'aggiornamento dei metodi ufficiali di
analisi;
Vista la legge 14 gennaio 1994, n. 20, contenente disposizioni in
materia di giurisdizione e controllo della Corte dei conti;
Decreta:
Art. 1.
1. Il metodo di analisi di cui all'allegato A al decreto
ministeriale 18 marzo 1994, citato nelle premesse, è approvato quale
metodo ufficiale per la "Determinazione diretta della furosina
(e-furoilmetil-lisina) nel latte e nel formaggio", nella versione di
cui al testo descritto nell'allegato al presente decreto.
2. Il presente metodo non si applica ai formaggi e al latte
provenienti dagli altri Stati membri e dai Paesi aderenti all'accordo
sullo spazio economico europeo.
3. Tale metodo integra la raccolta dei metodi ufficiali di analisi
di cui all'allegato al decreto ministeriale 21 aprile 1986 citato
nelle premesse, acquisendo il numero progressivo 28.

Art. 2.
Il presente decreto è inviato alla Corte dei conti per il
controllo preventivo di legittimità ed entrerà in vigore il giorno
successivo a quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 16 maggio 1996
L'ispettore generale capo per la repressione delle frodi
del Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
DI SALVO
Il direttore generale del Dipartimento delle dogane
e delle imposte indirette del Ministero delle finanze
SAPIENZA
Il direttore generale del Dipartimento degli alimenti
e nutrizione e della sanità pubblica veterinaria
del Ministero della sanità
SILANO
Il direttore generale della produzione industriale
del Ministero dell'industria
del commercio e dell'artigianato
AMMASSARI
L'ispettore generale capo per la repressione delle frodi
del Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
(subentrato nell'incarico dal gennaio 1996)
PILO
Registrato alla Corte dei conti il 26 giugno 1996
Registro n. 2 Risorse agricole, foglio n. 64

ALLEGATO
28) METODO PER LA DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA FUROSINA
(e-FUROILMETIL-LISINA) NEL LATTE E NEL FORMAGGIO.
1. Scopo e campo di applicazione.
Il metodo qui specificato permette di determinare
quantitativamente la furosina nel latte crudo o trattato termicamente
e nel formaggio.
2. Riferimenti.
D.M. 21 aprile 1986 "Metodi ufficiali di analisi dei formaggi".
Modalità per il prelievo e la preparazione dei campioni di
formaggio, formaggio fuso e ricotta da sottoporre ad analisi (Norma
I), G.U.R.I. suppl. ord. n. 88 del 2 ottobre 1986; decisione del
Consiglio n. 92/608/CE concernente la fissazione dei metodi di
analisi e di prova relativi al latte trattato termicamente - Allegato
1, Cap. II campionamento, G.U. CE n. L 407 del 31 dicembre 1992.
3. Definizione.
Quantità di furosina, espressa in mg per 100 g di proteine,
rilevabile nel latte o nel formaggio, nelle condizioni specificate da
questo metodo.
4. Principio del metodo.
4.1. Attraverso determinazione della furosina viene valutata
l'intensità della fase iniziale della reazione di Maillard, a sua
volta collegata ai processi termici subiti dalle materie prime o
introdotti in lavorazione.
4.2. La e-deossilattulosil-lisina, primo prodotto stabile della
reazione di Maillard nel latte e derivati, viene convertita a
furosina sottoponendo il latte o il formaggio ad idrolisi acida a
caldo. La furosina viene quindi determinata mediante HPLC in coppia
ionica e fase inversa con rilevamento a 280 nm. La quantificazione
viene effettuata mediante standardizzazione esterna con furosina di
sintesi.
5. Reattivi.
5.1. Acqua distillata.
5.2. Acido cloridrico 10.6 N ottenuto miscelando 8 volumi di acido
cloridrico concentrato con 1 volume di acqua distillata (5.1).
5.3. Acido cloridrico 8 N, ottenuto miscelando 2 volumi di acido
cloridrico concentrato con 1 volume di acqua distillata (5.1).
5.4. Acido cloridrico 3 N, ottenuto miscelando 1 volume di acido
cloridrico concentrato con 3 volumi di acqua distillata (5.1).
5.5. Metanolo.
5.6. Eluenti per cromatografia: acqua, acido acetico glaciale e
cloruro di potassio, tutti di purezza per HPLC.
5.7. Furosina di sintesi cromatograficamente pura ed a titolo noto
(es. Neosystem Laboratoire, via A. Panizzi n. 10 - 20146 Milano, o di
altro produttore).
5.8. Azoto per gascromatografia.
Tutti i reattivi se non altrimenti specificato devono essere puri
per analisi.
6. Apparecchiatura.
6.1. Cartucce C18 da 500 mg per estrazione in fase solida.
6.2. Cromatografo liquido ad alta prestazione con iniettore
biocompatibile, provvisto di loop da 20 o 50 (Micron)l e di forno per
la termostatazione della colonna.
6.3. Spettrofotometro per rivelazione in continuo a 280 nm e con
una sensibilità di almeno 0.010 AUFS.
Nelle condizioni cromatografiche indicate e con loop di iniezione
da 20 (Micron)l, il rapporto segnale/disturbo, rilevabile per un
picco corrispondente a 10 picoMoli di furosina sintetica iniettata,
deve essere non inferiore a 10.
6.4. Colonna in fase inversa tipo C8 che permetta di eluire la
furosina separata sulla linea di base e senza interferenze di altri
picchi (es. colonna Alltech "Furosine dedicated", 250 mm x 4,6 mm
i.d., Alltech-Italia, Sedriano-Milano).
6.5. Registratore potenziometrico-integratore.
6.6. Sistema di degasaggio degli eluenti.
6.7. Bilancia di precisione.
6.8. Stufa termostatabile a 110 (gradi)C.
6.9. Provette pyrex da 10 ml provviste di tappo a vite con
guarnizione in teflon o di altro sistema di chiusura ermetica
resistente al calore.
6.10. Vetreria di laboratorio.
6.11. Filtri di carta a media velocità di filtrazione.
6.12. Siringa in vetro da 5 ml.
6.13. Apparecchiatura secondo Kjeldahl per la mineralizzazione e
la distillazione dell'azoto.
7. Campionamento.
Vedi punto 2.
8. Procedimento.
8.1. Prepazione del campione.
Latte: pipettare in provetta pyrex (6.9) 2 ml di latte e
addizionare 6 ml di acido cloridrico 10.6N (5.2).
Formaggio: pesare in provetta pyrex (6.9) una quantità di
formaggio corrispondente a circa 50 mg di proteina e addizionare 8 ml
di acido cloridrico 8 N (5.3).
8.1.1. Gorgogliare nella provetta azoto (5.8) per circa 2 minuti.
Chiuderla strettamente e porla in stufa (6.8) a 110 (gradi)C per 23
ore. Agitare la provetta dopo la prima ora di idrolisi.
8.1.2. Filtrare l'idrolizzato (8.1.1) su filtro di carta (6.11).
Il filtrato può essere conservato a -4 (gradi)C per alcuni giorni o
congelato.
8.1.3. Su 2 ml di filtrato (8.1.2) determinare il contenuto di
azoto totale secondo Kjeldahl. Calcolare il contenuto proteico
moltiplicando per 6,38.
8.2. Preparazione della soluzione standard di furosina.
Preparare una soluzione di furosina sintetica (5.7) in acido
cloridrico 3 N (5.4), che contenga circa 1 nanoMole per ml. Tale
soluzione è stabile a -20 (gradi)C.
8.3. Purificazione del filtrato (8.1.2) mediante estrazione in
fase solida (SPE).
8.3.1. Inserire sulla siringa (6.12) una cartuccia per estrazione
in fase solida (6.1), attivare la stessa eluendo in successione 5 ml
di metanolo (5.5) e 10 ml di acqua (5.1) evitando la disidratazione
della cartuccia tra un passaggio e l'altro.
8.3.2. Pipettare nella siringa 0,5 ml di filtraggio (8.1.2) ed
iniettarlo lentamente nella cartuccia, scartando il corrispondente
eluato ma evitando di introdurre aria nella cartuccia.
8.3.3. Pipettare nella siringa 3 ml di HCl 3 N (5.4), eluire
lentamente fino a completa disidratazione della cartuccia
raccogliendo l'eluato (filtrato purificato) che deve presentarsi
incolore. Agitare e conservare a bassa temperatura il filtrato
purificato che è stabile a -20 (gradi)C per una settimana.
8.4. Determinazione cromatografica.
8.4.1. Condizioni cromatografiche.
Eluente A: 0,4% di acido acetico in acqua (v/v).
Eluente B: 0,3% potassio cloruro in eluente A (p/v).
Gradiente di eluizione:
tempo (min) % A % B
-- -- --
0 100 0
13.5 100 0
20.5 50 50
22.0 50 50
23.0 100 0
32.0 100 0
o equivalente, in funzione della colonna utilizzata.
Flusso: 1,2 ml/min.
Temperatura della colonna: ad un valore costante compreso fra 30 e
35 (gradi)C in funzione della colonna utilizzata.
8.4.2. Equilibrazione del sistema cromatografico.
Equlibrare la colonna per alcuni minuti a 1,2 ml/min. con una
soluzione A: B = 50: 50; in seguito portare il sistema cromatografico
alle condizioni iniziali di analisi (8.4.1) fino a stabilità della
linea di base.
8.4.3. Effettuare una corsa cromatografica completa iniettando
20 (Micron)l di acido cloridrico 3 N (5.4) per controllare la purezza
degli eluenti. Dopo equilibrio finale il valore della linea di base
deve ritornare a quello iniziale.
8.4.4. Effettuare la separazione cromatografica del filtrato
purificato (8.3.3) e successivamente della soluzione standard di
furosina (8.2). La separazione del picco della furosina deve avvenire
sulla linea di base e con tempo di ritenzione compreso tra 21 e 24
minuti.
9. Calcolo ed espressione dei risultati.
9.1. Integrare sulla linea di base l'area del picco della furosina
ottenuto per il filtrato purificato del campione (8.3.3) e per la
soluzione standard (8.2).
9.2. La quantità di furosina nel campione, espressa in mg per 100
g di proteine, viene così calcolata:
Cs 1 6 254 8
Ac x __ x ___ x ____ x ___ x _____
As v 0,95 10 m x 4
dove:
Ac = area del picco della furosina nel campione
Cs = quantità di furosina standard iniettata, in picoMoli
As = area del picco della furosina nello standard
v = volume del loop di iniezione, in (Micron(l
6 = fattore di diluizione conseguente all'estrazione in fase
solida
0,95 = fattore di recupero della furosina dall'estrazione in fase
solida
254 = peso molecolare della furosina
m = contenuto in proteine di 2 ml di idrolizzato, in mg,
determinato come al punto (8.1.3).
10. Precisione.
Ripetibilita': due determinazioni eseguite presso lo stesso
laboratorio su un medesimo campione non devono differire più del 10%
del loro valore medio.
Riproducibilita': due determinazioni eseguite in laboratori
diversi su un medesimo campione non devono differire più del 15% del
loro valore medio.
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Riferimenti bibliografici.
- RESMINI P., PELLEGRINO L., BATTELLI G. - Accurate quantification
of furosine in milk and dairy products by a direct HPLC method. It.
J. Fodd. Sci. 3, 173-183 (1990).
- RESMINI P., PELLEGRINO L., MASOTTI F., TIRELLI A., PRATI F. -
Determinazione del latte in polvere ricostituito nel latte crudo ed
in quello pastorizzato, mediante HPLC della furosina. Sci. Tecn.
Latt.-Cas. 43, 169-186 (1992).
- PELLEGRINO L., OREGLIO M. e DE NONI I. - Riconoscimento del
latte in polvere nel formaggio Mozzarella mediante valutazione
dell'intensità della reazione di Maillard. Atti del Convegno I
Ciseta. Parma, 18-20 ottobre 1993. Chiriotti Editore Pinerolo.