Serie Generale n. 103 del 6-5-1997
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 10 marzo 1997
Programma di controllo per le S. Enteritidis e S. Typhimurium negli allevamenti di galline ovaiole destinate alla produzione di uova da consumo. (GU Serie Generale n.103 del 06-05-1997)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto il testo unico delle leggi sanitarie, approvato con regio
decreto 27 luglio 1934, n. 1265;
Visto il regolamento di polizia veterinaria, approvato con decreto
del Presidente della Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320;
Vista la legge 23 dicembre 1978, n. 833 e successive modificazioni
ed integrazioni;
Visti i pareri a suo tempo espressi, dal Consiglio superiore di
sanità in data 7 settembre 1992 e 8 giugno 1993;
Considerato l'orientamento dell'Unione europea riguardo le
strategie di lotta contro gli agenti zoonotici specifici negli
animali;
Considerato che nella genesi delle tossinfezioni alimentari le
salmonelle rivestono un ruolo rilevante;
Ravvisata la necessità di sviluppare degli interventi di controllo
e di profilassi a partire dagli allevamenti di galline ovaiole basati
sulla profilassi igienico-sanitaria e con l'ausilio di ogni altro
mezzo disponibile;
Ravvisata, altresì, la necessità di attuare dei programmi di
costante sorveglianza epidemiologica su tutti gli allevamenti
avicoli;
Sentito il parere del Consiglio superiore di sanità espresso nella
seduta del 18 dicembre 1996;
Decreta:
Art. 1.
1. Viene attuato su tutto il territorio nazionale un programma
volontario di controllo della salmonella enteritidis e salmonella
typhimurium negli allevamenti di galline ovaiole destinate alla
produzione di uova da consumo.
2. Gli allevatori aderenti al programma devono rispettare le
condizioni igienico - sanitarie ed i controlli previsti all'allegato
II.
3. Il servizio veterinario regionale o delle province autonome
procede ad un censimento di tutte le aziende avicole e degli
incubatoi che operano sul territorio regionale trasmettendo i dati
cumulativi al Ministero della sanità.

Art. 2.
1. Gli allevatori che intendono aderire al programma devono
presentare richiesta ai servizi veterinari della azienda U.S.L.
competente territorialmente indicando quanto previsto nell'allegato I
ed utilizzando il modello riportato come allegato VI.
2. Il servizio veterinario delle aziende U.S.L., in accordo con
l'Istituto zooprofilattico sperimentale territorialmente competente,
procede alla valutazione delle caratteristiche strutturali,
igienico-sanitarie ed organizzative dell'allevamento e verifica la
conformità dell'azienda ai requisiti di cui all'allegato II.
3. Il servizio veterinario delle azienda U.S.L., dopo le verifiche
di cui al comma precedente, redige un parere che è trasmesso insieme
alla domanda presentata dall'allevatore al servizio veterinario della
regione o della provincia autonoma competente.
4. I servizi veterinari delle regioni e delle province autonome
controllano che siano rispettate le condizioni di cui al presente
decreto, prima di registrare l'adesione dell'azienda al programma di
controllo.
5. Le aziende inserite nel programma si impegnano a rispettare le
condizioni stabilite nel presente decreto.

Art. 3.
1. I servizi veterinari delle regioni e delle province autonome
attivano su domanda degli allevatori, per territori omogenei,
individuati sulla scorta delle domande pervenute, del censimento, e
sulla valutazione di rischio epidemiologico, nonchè dei flussi
commerciali interregionali, i programmi che prevedano in aggiunta ed
a supporto dei controlli igienico - sanitari riportati in allegato II
o di altri già in atto negli allevamenti, l'impiego di vaccini
inattivati regolarmente autorizzati all'immissione in commercio dal
Ministero della sanità.
2. I servizi veterinari delle regioni e delle province autonome
possono prevedere, al fine di sviluppare i meccanismi di esclusione
competitiva, anche l'impiego, nei pulcini, di flora microbica
intestinale apatogena autorizzata all'immissione in commercio dal
Ministero della sanità.

Art. 4.
1. Le modalità di vaccinazione di cui all'art. 3, devono essere
conformi a quanto stabilito nell'allegato III.
2. Il medico veterinario responsabile della realizzazione del
programma comunica alla competente azienda U.S.L. gli interventi di
vaccinazione eseguiti ed il tipo di vaccino impiegato.
3. Il servizio veterinario delle azienda U.S.L. informa la regione
sui vaccini impiegati.

Art. 5.
1. Le aziende aderenti al programma di controllo e che hanno
effettuato i controlli sanitari previsti con esito costantemente
negativo, sono accreditate, a cura dei servizi veterinari delle
azienda U.S.L., con la qualifica di: "Azienda aderente al programma
di profilassi contro la salmonella enteritidis e salmonella
typhimurium".
2. Tale qualifica non può comunque essere data prima
dell'esecuzione di due controlli ufficiali con esito negativo in
tutti i gruppi dell'azienda.
3. Le aziende che praticano la muta forzata devono, durante tale
periodo, essere sottoposte a controlli ufficiali secondo quanto
riportato nella lettera g) del paragrafo III dell'allegato II.
4. Gli accertamenti in autocontrollo dovranno essere eseguiti
presso una delle sedi degli Istituti zooprofilattici sperimentali o
in alternativa presso un laboratorio accreditato al funzionamento
secondo gli standards internazionali EN 45000.

Art. 6.
1. I servizi veterinari delle regioni e delle province autonome in
collaborazione con gli osservatori epidemiologici veterinari, ove
istituiti, o con gli Istituti zooprofilattici sperimentali valutano
l'andamento del programma per zone omogenee in base ai mezzi di
profilassi diretta e indiretta impiegati ed in base ai risultati dei
controlli effettuati conformemente al paragrafo III dell'allegato II,
con particolare riferimento a quelli effettuati al primo giorno di
vita, a due settimane prima dell'entrata in deposizione, nel periodo
di muta forzata nonchè ad altri eventuali controlli ritenuti
necessari.
2. I servizi veterinari delle regioni e delle province autonome,
entro dodici mesi dall'entrata in vigore del presente decreto e
successivamente ogni anno, inviano una relazione sull'andamento del
programma, in base alle risultanze di cui al precedente comma,
indicando il numero delle aziende che hanno aderito al programma ed
il numero delle aziende accreditate.

Art. 7.
1. I servizi veterinari delle regioni e delle province autonome con
gli osservatori epidemiologici veterinari, ove istituiti, o con gli
Istituti zooprofilattici sperimentali elaborano un piano regionale
per la sorveglianza e la ricerca delle salmonelle negli allevamenti
avicoli, esteso a tutti gli indirizzi produttivi e tenendo conto
delle caratteristiche dell'avicoltura regionale.
2. Nell'elaborazione dei piani di sorveglianza devono essere
definiti e predisposti gli aspetti di collaborazione con i servizi di
igiene pubblica e gli osservatori epidemiologici medici regionali ove
istituiti, per gli opportuni flussi informativi.
3. Il piano va trasmesso, entro un anno dall'entrata in vigore
della presente ordinanza al Dipartimento alimenti, nutrizione e
sanità pubblica veterinaria del Ministero del sanità.
4. Il Ministero della sanità avvalendosi del Centro di referenza
nazionale per l'epidemiologia veterinaria ed in collaborazione con il
laboratorio di epidemiologia e biostatistica dell'Istituto superiore
di sanità, identifica gli indici e gli indicatori per la valutazione
dei piani, dei loro risultati e dei relativi flussi informativi.
5. Le regioni e le province autonome comunicano annualmente i
risultati dei piani al Dipartimento alimenti, nutrizione e sanità
pubblica veterinaria del Ministero della sanità.

Art. 8.
Il presente decreto sarà inviato alla Corte dei conti per la
registrazione ed entra in vigore il trentesimo giorno successivo a
quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblcia italiana.
Roma, 10 marzo 1997
Il Ministro: Bindi
Registrato alla Corte dei conti il 16 aprile 1997
Registro n. 1 Sanità, foglio n. 101

Allegato I
I. ADESIONE VOLONTARIA DEI PRODUTTORI
AL PROGRAMMA DI CONTROLLO
1. Il titolare dell'azienda che intende aderire al programma, deve
presentare formale richiesta al servizio veterinario della azienda
U.S.L. competente per territorio di seguito denominato servizio
veterinario ufficiale, indicando:
a) dati anagrafici dell'insediamento produttivo, del titolare
dell'azienda e del conduttore dell'allevamento;
b) caratteristiche strutturali, produttive e gestionali
dell'impianto (numero e tipo ricoveri, numero animiali, indirizzo
produttivo, organizzazione aziendale, provenienza dell'alimento,
etc.);
c) il veterinario responsabile della realizzazione del
programma, specificando la natura del rapporto professionale con
l'azienda;
d) il laboratorio di analisi, di cui al comma 4 dell'art. 5, in
cui vengono effettuati gli esami nell'ambito del programma di
controllo che devono comunque essere eseguiti secondo le metodiche
riportate nell'allegato V.
2. Il titolare dell'azienda ed il veterinario responsabile del
programma devono impegnarsi formalmente a:
a) applicare i controlli e le misure sanitarie previste dal
programma;
b) riportare in un apposito registro, a disposizione del
servizio veterinario della azienda U.S.L. competente per territorio,
i risultati degli accertamenti di laboratorio effettuati;
c) comunicare al servizio veterinario ufficiale competente per
territorio la data di accasamento di nuovi animali, con almeno 48 ore
feriali di anticipo, indicando la consistenza della partita e
l'allevamento o l'incubatoio di origine;
d) segnalare al servizio veterinario ufficiale i risultati
sfavorevoli per salmonella enteritidis o salmonella typhimurium degli
esami di laboratorio effettuati nell'ambito del programma di
controllo;
e) adottare tempestivamente, in caso di isolamento di salmonella
enteritidis o typhimurium negli animali di gruppi sottoposti a
controllo, appropriate misure igienico - sanitarie per limitare i
rischi di una loro diffusione ad altri allevamenti ed all'uomo.
Il servizio veterinario ufficiale, ricevuta la comunicazione di cui
al punto d), dispone delle opportune misure da adottare e preleva i
campioni conformemente alla lettera c), paragrafo III, allegato II,
che sono esaminati dall'Istituto zooprofilattico sperimentale
competente per la conferma della diagnosi. Le uova degli animali dei
gruppi di volatili risultati positivi per salmonella enteritidis o
typhimurium devono essere distrutte in loco o trasferite previa
appropriata marcatura degli imballaggi o contenitori (riportanti in
numero di riconoscimento dello stabilimento destinatario) e sotto
controllo veterinario, ad uno stabilimento autorizzato per il
trattamento di ovoprodotti per esservi sottoposte a trattamento
termico ai sensi del decreto legislativo 4 febbraio 1993, n. 65 o
smaltite ai sensi del decreto legislativo 14 dicembre 1992, n. 508.
Tale provvedimento decade dopo l'esecuzione di due controlli
ufficiali con esito negativo.

Allegato II
REQUISITI STRUTTURALI E LINEE GUIDA COMPOR-TAMENTALI PER GLI
ALLEVAMENTI DI GALLINE OVAIOLE ADERENTI AL PROGRAMMA DI CONTROLLO.
I. Requisiti degli allevamenti.
Pollastre ed ovaiole in deposizione:
a) i locali di allevamento per i quali viene richiesta
l'adesione al programma e le relative strutture (compresi i silos, i
sistemi di alimentazione, le linee di raccolta uova etc.) devono
essere costruiti e congegnati in modo da consentire un'efficace
azione di pulizia, lavaggio e disinfezione e gestiti secondo il
criterio del tutto pieno tutto vuoto;
b) i capannoni devono essere forniti di reti di protezione
antipassero;
c) nella zona servizi antistante i ricoveri e, comunque, prima
dell'accesso agli animali, debbono essere previste attrezzature che
consentano il lavaggio disinfezione delle mani e delle calzature e la
possibilità di indossare calzature di protezione;
d) vestiario o vestiti di protezione e calzari devono essere
tenuti a disposizione del personale;
e) il magazzino per la raccolta e lo stoccaggio delle uova e dei
materiali di imballaggio deve essere fisicamente separato dai pollai
e deve essere dotato di una sala per la conservazione temporanea
delle uova in condizioni di temperatura di 4 C. ed igiene
controllata;
f) la sala di conservazione delle uova deve essere sottoposta a
pulizia e disinfezione almeno una volta la settimana.
II. Personale.
a) La responsabilità della conduzione dell'allevamento deve
essere affidata a persona nominativamente designata dal titolare.
b) Il personale che opera in allevamento non deve venire a
contatto con polli o altri volatili ne deve possederne. Prima di
entrare nell'unità produttiva, deve comunque utilizzare il vestiario
di cui al precedente paragrafo I. lettera d).
c) Il personale deve possedere sufficienti conoscenze tecniche ed
igienico-sanitarie in ordine al tipo di allevamento praticato ed al
mantenimento degli impianti e delle attrezzature per il perseguimento
delle migliori condizioni igieniche.
d) Alla raccolta e lavorazione delle uova non deve essere adibito
personale addetto all'allevamento. In casi particolari, o ove ciò
non sia possibile, può essere utilizzato il medesimo personale a
condizione che questo, prima di recarsi alla lavorazione delle uova,
provveda al cambio di vestiario ed al lavaggio e disinfezione delle
mani.
e) Il personale addetto ai controlli ufficiali deve fare uso del
vestiario di protezione e dei calzari tenuti a disposizione
dell'azienda ed adottare comunque le misure di protezione igienico -
sanitarie attivate nell'allevamento.
III. Controlli sanitari.
1. Il titolare dell'allevamento deve impegnarsi a far prelevare, a
sue spese, i campioni da far analizzare nel laboratorio indicato
nella domanda secondo le metodiche indicate nell'allegato V. In ogni
gruppo i campioni devono essere prelevati rispettando i livelli
minimi di campionatura di seguito riportati:
a) almeno dieci giorni prima dell'accasamento: esecuzione di
tamponi ambientali su pareti, gabbie, ventilatori, mangiatoie,
attrezzi vari nei punti imbrattati da residui di feci, mediante
tamponi singoli costituiti da bacchette flessibili di plastica o di
legno lunghe circa 10 cm e portanti ad una estremità del cotone
idrofilo imbevuto di terreno costituito da latte scremato a doppia
concentrazione. Controllo degli animali sinantropici eventualmente
presenti all'interno o nelle vicinanze dell'allevamento (uccelli
stanziali, piccoli roditori, insetti etc.); dimensionare il campione
in relazione all'entità delle strutture e all'entità numerica della
fauna presente nella zona;
b) 1 giorno (accasamento): prelievo delle carte che rivestono il
fondo delle scatole di trasporto (1 carta ogni 500 pulcini, fino ad
un massimo di 10 carte), di tutti i pulcini morti all'arrivo e di
almeno 60 pulcini vivi. Su questi ultimi deve essere effettuata anche
la ricerca di sostanze inibenti secondo la metodica riportata in
allegato IX. La positività per salmonella enteritidis o typhimurium
o per sostanze inibenti comporta l'esclusione del gruppo dal
programma;
c) 4 settimane (prima dell'eventuale intervento vaccinale):
prelevare gli animali morti, soggetti di scarto e un campione
composito di feci o di tamponi cloacali. Questo campione deve essere
costituito da n. 60 tamponi cloacali o n. 60 prelievi separati di
feci fresche, ciascuno dei peso di almeno 1 grammo, effettuati a caso
in diversi punti dell'edificio nel quale sono custoditi i volatili;
prelievo di almeno 30 campioni di sangue per l'esecuzione di esami
sierologici nei confronti di salmonella enteritidis e typhimurium; in
caso di positività sierologica, si effettua un controllo ufficiale
batteriologico (secondo le indicazioni sopra riportate), se la
positività è confermata batteriologicamente il gruppo è escluso
dal programma;
d) 12 settimane: prelievo di volatili morti, soggetti di scarto
e un campione composito di feci o tamponi cloacali prelevato secondo
quanto previsto alla precedente lettera c);
e) 2 settimane prima dell'entrata in deposizione: volatili
morti, soggetti di scarto, un campione composito di feci fresche o
tamponi cloacali, raccolto seguendo le modalità di cui alla
precedente lettera c), e, nel caso sia stata autorizzata la
vaccinazione dei soggetti, 30 campioni di sangue prelevati da
altrettanti soggetti vaccinati per verificare l'efficacia del
trattamento immunizzante;
f) fase di deposizione - ogni 10 settimane: volatili morti,
soggetti di scarto e un campione composito di feci fresche e / o
tamponi cloacali raccolto seguendo le modalità di cui alla
precedente lettera c); ogni 20 settimane prelievo di 30 campioni di
sangue per l'esecuzione di esami sierologici tendenti ad accertare la
persistenza della immunità vaccinale;
g) in fase di muta forzata prelievo di volatili morti, soggetti
di scarto e un campione composito di feci o tamponi cloacali
prelevato con le modalità previste alla precedente lettera c);
h) in fase di deposizione devono essere effettuati controlli per
verificare la presenza di salmonelle nelle uova e la carica mesofila
totale secondo le modalità allegate, nonchè la verifica delle
condizioni igieniche della sala mediante tamponi ambientali.
2. I campioni effettuati al momento dell'accasamento (1 giorno di
vita) e due settimane prima dell'entrata in deposizione e durante la
muta forzata sono prelevati a cura del servizio veterinario ufficiale
competente per territorio ed esaminati dall'Istituto zooprofilattico
sperimentale competente ai fini della valutazione dell'efficacia del
programma e del conferimento della qualifica, ed utilizzando il
modello di cui all'allegato VII. Quest'ultimo comunica gli esiti
delle analisi al Servizio veterinario ufficiale ed all'azienda
utilizzando il modello che figura quale allegato VIII.
IV. Disinfezioni e disinfestazioni.
a) L'insieme delle installazioni deve permettere pulizia,
disinfezioni e disinfestazioni efficaci.
b) Dopo la partenza degli animali i locali occupati dall'unità
produttiva e le relative attrezzature sono puliti, lavati e
disinfettati.
c) Almeno sette giorni prima dell'arrivo dei nuovi animali,
debbono essere eseguiti controlli ambientali per verificare
l'efficacia delle disinfezioni.
d) Un vuoto sanitario deve essere osservato prima dell'immissione
dei volatili nella unità di allevamento. Comunque l'immissione è
consentita solo dopo che i controlli eseguiti abbiano dato esito
negativo.
e) Tutti i materiali di scarto (imballaggi, sacchi, ecc.) debbono
essere distrutti e le lettiere e le deiezioni trattate secondo le
norme vigenti.
f) Debbono essere effettuate periodiche derattizzazioni,
disinfezioni e disinfestazioni utilizzando le metodiche ritenute più
efficaci, anche all'esterno dei ricoveri. Tali interventi devono
essere registrati.
g) Le spoglie degli animali debbono essere conservate in appositi
contenitori, raccolte ed inviate alla distruzione secondo le
disposizioni delle autorità sanitarie.

Allegato III
I. PROGRAMMA DI VACCINAZIONE
1. I trattamenti immunizzanti devono essere eseguiti sotto il
controllo veterinario.
Debbono essere effettuati almeno due interventi vaccinali con
vaccino inattivato contro la salmonella enteritidis e / o
typhimurium.
Il primo intervento si effettua di regola sulle pollastre fra la
quarta e la sesta settimana di vita e comunque non prima dell'esito
di un esame sierologico.
Il secondo intervento va effettuato oltre la 14 settimana di età.
I dati relativi al trattamento immunizzante ed ai risultati degli
esami batteriologici e sierologici relativi alla risposta vaccinale
devono essere comunicati al competente servizio veterinario
ufficiale.
2. Gli allevamenti vaccinati che alla fine del ciclo produttivo
risultassero negativi a tutti i controlli eseguiti per salmonella
enteritidis e typhimurium, possono essere sottoposti alla muta
forzata e rivaccinati prima del nuovo ciclo produttivo con uno o due
interventi di richiamo; durante la nuova fase produttiva saranno
effettuati i controlli come previsto per il precedente ciclo.

Allegato IV
I. ESAME DEI CAMPIONI PRELEVATI PER LA RICERCA DELLA SALMONELLA
1. I campioni prelevati in allevamento per l'invio al laboratorio
devono essere identificati indicando:
data prelievo;
tipo e numero campioni prelevati;
nome del responsabile dell'allevamento e del veterinario
responsabile dei programma;
nome ed indirizzo dell'allevamento, specificando il gruppo di
animali da cui i campioni sono stati prelevati;
riportare sulla richiesta: "Ricerca di salmonella enteritidis e
typhimurium"; eventuali interventi terapeutici effettuati sugli
animali, schema vaccinale previsto ed interventi vaccinali già
eseguiti.
2. Gli esami microbiologici devono essere effettuati utilizzando
la metodica riportata nell'allegato V.
3. I campioni di feci fresche o i tamponi cloacali possono essere
esaminati dopo essere stati raggruppati in pool costituiti al massimo
da 10 campioni di feci (60 campioni = 6 pool).
La eventuale positività ai test sierologici effettuati prima
della vaccinazione del gruppo deve essere confermata dall'isolamento
di salmonella enteritidis o typhimurium.

Allegato V
I. RICERCA DELLA SALMONELLA NELLE FECI
1. Le feci, prelevate con cucchiai sterili o mediante tamponi e
poste in adatti recipienti, devono essere seminate entro due ore dal
prelievo, altrimenti devono essere conservate in terreni di trasporto
fra i quali si consiglia quello di Amies (6 ml) che viene mescolato
con un egual volume di feci, mentre i tamponi vengono direttamente
immersi in esso.
In laboratorio il campione di feci viene direttamente seminato in
terreno di arricchimento Rappaport-Vassiliadis (RV) nel rapporto di
1:10 e nel brodo selenite - cistina (10/100) mentre i tamponi vengono
immersi direttamente in provette con 10 ml degli stessi terreni.
Se il campione è in terreno di trasporto, semimare 2 ml di
sospensione feci+terreno in 10 ml di Rappaport - Vassiliadis.
I terreni seminati vengono incubati a 41 C per 15 - 18 ore; segue
un isolamento su Brilliant green agar (BGA) ed un altro terreno
selettivo - differenziale a scelta fra i seguenti:
Desossicolato-citratolattosio agar (DCLA), Hektoen agar (HA), Xilosio
- lattosio-desossicolato - agar (XLDA), incubando le piastre per 24 -
48 ore a 37 C ed effettuando una prima lettura a 24 ore.
II. RICERCA DELLA SALMONELLA NEGLI ORGANI
1. Gli organi prelevati da soggetti morti o sacrificati (fegato,
rene, ovaie, intestino cieco, ovidutto) vengono raccolti in pool per
soggetto o per organo (almeno 25 g), pesati ed omogeneizzati in mixer
con 9 parti di acqua peptonata tamponata (BPW). L'omogenato si versa
in una beuta sterile da 300 ml e si incuba a 37 C per 24 ore. Segue
un arricchimento in Rappaport - Vassiliadis (0,1 ml / 10) e Brodo
selenito - cistina (10 ml / 100), incubando il primo a 41 C per 15 -
18 ore e il secondo a 37 C per lo stesso tempo. Dai due terreni di
arricchimento si esegue un isolamento su BGA e su un altro terreno a
scelta, come indicato per le feci, incubando a 37 C per 48 ore ed
eseguendo una prima lettura a 24 ore.
III. RICERCA DELLA SALMONELLA NELLE UOVA
1. Lavare e disinfettare il guscio delle uova, quindi separare
sterilmente il contenuto dell'uovo dal guscio facendolo defluire
attraverso la camera d'aria; omogeneizzare in mixer con BPW nel
rapporto di 1:10 ed incubare a 37 C per 18 - 24 ore
(prearricchimento).
L'arricchimento e l'isolamento si eseguono come indicato al punto
II.
IV. RICERCA DELLA SALMONELLA NEI MANGIMI
1. Il prelievo dei mangimi dai grossi recipienti, (silos, sacchi
etc.) si effettua con particolari sonde (sonda Nobbe) per piccoli
recipienti e sufficiente la tecnica del sacchetto rovesciato. Dai
campione si prelevano 50 g e si versano in una beuta da 1000 ml
contenente 500 ml di BPW, incubando per 24 ore a 37 C, dopo aver
omogeneizzato la sospensione per 1 ora su shaker. Segue un
arricchimento in Rappaport - Vassiliadis (0,1 / 10) e in brodo
selenito - cistina (10 / 100) incubando il primo a 41 C per 15 - 18
ore e il secondo a 37 C per lo stesso tempo, quindi un isolamento su
BGA e un altro terreno a scelta, come indicato al punto II.
V. ANALISI DELLE COLONIE E IDENTIFICAZIONE
Su BGA le colonie di salmonella si presentano di dimensioni medio
- grandi, biancorosate, traslucide, con intenso alone di viraggio
rosso - viola per alcalinizzazione del terreno. Le specie del genere
Proteus appaiono ugualmente biancorosate ma sono più gracili e con
alone di viraggio meno intenso.
I coliformi lattosio positivo appaiono gialli.
Su DCLA le salmonelle si presentano piccole, rugiadose, incolori e
con centro nero. I coliformi lattosio positivi lenti fermentatori
danno colonie incolori con centro rosso, i lattosio positivi rapidi
danno colonie rosse, le specie del genere Proteus danno colonie
incolori, le klebsielle danno colonie mucose, grandi, rosse. Su
Hektoen agar le salmonelle appaiono blu-verdi, con o senza centro
nero.
Su XLDA le salmonelle appaiono rosse.
Da entrambi i terreni scelti per l'isolamento si prelevano almeno
5 colonie fra le più tipiche e si seminano su terreno di Kligler per
infissione nel fondo e rigo centrale sulla parte inclinata. Incubare
per 24 ore a 37 C. La salmonella su tale terreno fermenta il glucosio
facendo virare al giallo il fondo mentre la parte inclinata resta
invariata o alcalinizza leggermente. Si osserva spesso annerimento
diffuso per la produzione di H 2 S. Colture in KIigler con reazione
diversa devono essere scartate. La conferma della diagnosi di
salmonella viene fatta biochimicamente con le gallerie API 20 E e
sierologicamente con i sieri immuni anti - salmonella reperibili in
commercio.
VI. CONTROLLI IGIENICI SULLE UOVA:
CARICA MESOFILA TOTALE
Partendo dalla sospensione 1 / 10 utilizzata per il
prearricchimento in BPW, effettuare alcune diluizioni in base 10 con
soluzione fisiologica triptonata e seminare 1 ml di ciascuna
diluizione in doppio in piastre di tryptose agar o trypticase agar,
incubando per 48 ore a 37 C. Le uova, conservate in buone condizioni
igieniche, sono quasi sterili.
VII. CONTROLLI SIEROLOGICI
Come indicato nel paragrafo III - Controlli sanitari -
dell'allegato II vengono effettuati prelievi di sangue da almeno 30
soggetti per seguire l'andamento della produzione di anticorpi a
seguito della vaccinazione.
A tale scopo usare una delle seguenti tecniche a seconda del
vaccino utilizzato:
1) test rapido di agglutinazione su vetrino con antigene colorato
per pullurosi che cross - reagisce con salmonella enteritidis,
prelevando almeno 2 ml di sangue con siringa dalla piega dell'ala e
lasciando sierare;
2) test di sieroagglutinazione lenta in provetta o in
micrometodo. Diluire i sieri per raddoppio fino a 1/320, in doppia
serie, quindi aggiungere a parti uguali (0,25+0,25) l'antigene
somatico e l'antigene flagellare ciascuno per ogni serie. Il primo si
allestisce raccogliendo la patina batterica di una coltura del ceppo
in esame su agar nutritivo con 2 ml di alcol assoluto, facendo agire
per 4 - 6 ore a temperatura ambiente, quindi centrifugando e
sostituendo l'alcol con soluzione fisiologica fenolata 0,5% in modo
da ottenere una concentrazione di circa 10(elevato a)8 /ml; il
secondo si prepara esaltando la mobilità del ceppo su agar molle
(0,3%), coltivando in brodo nutritivo per 12 - 18 ore a 37 C ed
inattivando con formaldeide (0,5%).
3) test Elisa per salmonella enteritidis.
Allestire un test Elisa indiretto aderendo l'antigene ai pozzetti
di una piastrina microtiter. Esistono in commercio svariati tipi di
antigene, quali LPS, antigeni flagellari, antigeni fimbriali,
proteine esterne di membrana, etc. Il più usato è il
lipolisaccaride (LPS). Saturare le piastrine con sieroalbumina bovina
(BSA) al 2% in PBS. Distribuire quindi i sieri da testare diluiti
serialmente e i rispettivi controlli positivi e negativi; aggiungere
anti - gammaglobuline di pollo coniugate con fosfatasi alcalina ed il
relativo substrato. Bloccare la reazione con una soluzione stoppante
e leggere l'assorbenza con un lettore automatico a 450 nm.
Controlli. Allestire un siero di controllo positivo mediante
inoculazione intramuscolare di 4 pulcini SPF di una settimana con una
sospensione 10(elevato a)6 di S. enteritidis; allestire un siero di
controllo negativo costituito da un pool di sieri provenienti da
almeno 50 pulcini di una settimana sicuramente indenni da infezione
da salmonella.

Allegato VI
Fac-simile di domanda
Spettabile Azienda sanitaria
locale - Servizi veterinari
.......................
.......................
Il sottoscritto ..................................................
nato a .......................................... il ................
e residente ................................ prov. ................,
in qualità di titolare dell'allevamento di (specificare se di
pollastre o di galline o di ambedue) ................................
sito in .................................... prov. ................,
condotto dal sig. ...................................................
nato a ..................................... prov. .................
il ....................., e residente in ............................
visto il decreto ministeriale n. ....................
Chiede
di aderire al programma di controllo per la salmonella enteritidis e
la salmonella typhimurium.
Chiede inoltre di essere inserito nel programma regionale di cui
all'art. 3 del decreto ministeriale in esame comunicando altresì di
voler impiegare, in affinità ai controlli igienico - sanitari già
previsti dal piano l'uso di
_
|_| vaccino
_
|_| flora
A tal fine, e sotto la propria responsabilità, dichiara:
1) l'insediamento produttivo consiste di ........ unità
produttive (indicare il numero di capannoni) che rispondono ai
requisiti previsti nell'allegato II, punto 1 del decreto ministeriale
.....................;
il numero medio annuo di galline (o di pollastre) presenti in
allevamento è di ................. capi circa (pari a ..............
per capannone);
le galline vengono allevate in batteria (oppure: le pollastre
vengono allevate ........................);
la superficie totale utilizzabile di ciascuna unità produttiva
è pari a mq ..................;
al ricovero e cura degli animali prowedono n. ...............
addetti;
il mangime viene fornito da .....................................
2) L'azienda segue già un piano di profilassi igienico
sanitaria SI NO
Se si, indicare il tipo di piano .................................
. ...................................................................
3) Il veterinario responsabile della realizzazione del programma
è il dott. .........................................................
nato a ............................................................ ,
e residente in .............................. prov. ................
(indicare se dipendente o consulente esterno);
4) Il laboratorio accreditato presso cui verranno effettuati gli
esami previsti dal decreto ministeriale ............. e': ...........
Si riporta in allegato la dichiarazione del laboratorio sulle
metodiche microbiologiche e sierologiche utilizzate.
Tutto ciò premesso, il sottoscritto .............................
ed il veterinario responsabile dott. ................................
si impegnano formalmente a:
- rispettare e far rispettare le linee guida comportamentali che
figurano nell'allegato II, punto 2, del decreto ministeriale .......;
- riportare in un apposito registro, a disposizione del servizio
veterinario di codesta Azienda U.S.L., i risultati degli accertamenti
di laboratorio effettuati;
- comunicare al settore veterinario di codesta Azienda U.S.L. la
data di accasamento di nuovi animali, con almeno 48 ore feriali di
anticipo, indicando la consistenza della partita e l'allevamento (o
l'incubatoio) di origine;
- segnalare al servizio veterinario i risultati sfavorevoli per
salmonella enteritidis e typhimurium degli esami di laboratorio
effettuati nell'ambito del programma di autocontrollo.
Firma del titolare
............................
Firma del veterinario responsabile
........................................

Allegato VII
Modello da utilizzare
per la trasmissione dei campioni
All'istituto zooprofilattico di .........................
Ai sensi dell'allegato II, paragrafo 3, del decreto ministeriale
.............. si trasmettono, per la ricerca di:
_
|_| salmonella enteritidis
_
|_| salmonella typhimurium
_
|_| sostanze inibenti (limitatamente ai pulcini)
i seguenti campioni che sono stati prelevati a cura del veterinario
responsabile dott. ..................................................
il giorno ................. alle ore ......... presso
l'allevamento .............. sito in ................................
unità produttiva n. ............., autorizzato all'attuazione del
programma di controllo per la S. enteritidis e la S. typhimurium:
- carta scatole n. ............
- pulcini morti all'arrivo n. ............
- pulcini vivi n. ............
- pollastre morte n. ............
- pollastre di scarto n. ............
- feci fresche campioni n. ............
- tamponi cloacali n. ............
- campioni di sangue n. 30
- campioni prelevati durante la fase di muta forzata ............
Eventuali interventi vaccinali già eseguiti: .......................
in data .......................
Schema vaccinale previsto: .......................................
Eventuali interventi terapeutici effettuati: .....................
Timbro e firma del responsabile
del Servizio veterinario della A.S.L.
Data e ora di consegna .........................

Allegato VIII
Al servizio veterinario della A.S.L.
di ...............................
Alla ditta .........................
Programma di controllo per le Salmonelle enteritidis e typhimurium
negli allevamenti di galline ovaiole destinate alla produzione di
uova da consumo.
Esito delle analisi effettuate sui campioni prelevati presso
l'allevamento .......................................................
sito in ........................................................... ,
unità produttiva n. .....................
Salmonella enteritidis: ..........................................
Salmonella typhimunum: ...........................................
Sostanze inibenti (limitatamente ai pulcini): ....................
Esiti esami sierologici sul sangue: ..............................
Timbro e firma del responsabile del laboratorio

Allegato IX
RICERCA DI INIBENTI
Il metodo permette di rilevare la presenza di sostanze
antibatteriche nei mangimi, carni, uova ed eventuali altre matrici.
I campioni vengono saggiati su terreni colturali agarizzati
insemenzati con diversi microrganismi.
La presenza di sostanze antibatteriche è rilevata dalle
formazioni di un alone di inibizione della crescita dei
microrganismi.
1. Ceppi di riferimento:
a) B. subtilis BGA = Sensibili ai sulfamidici;
b) B. cereus K250 = Resistente alle tetracicline;
c) B. cereus ATCC 11778 = Sensibile alle tetracicline;
d) M. luteus = Sensibilità generale.
2. Terreno colturale:
nutrient agar g 25;
glucosio g 4;
NaCI g 10;
fosfato potassico monobasico g 1;
H2O distillata cc 1000;
pH 7,2.
Distribuire 13 ml in provette e autoclavare a 121 (gradi
centigradi) per 15',
oppure:
terreno (Biolife 2450);
biomeat g 6,25;
estratto di lievito g 3,75;
glucosio g 4,00;
NaC11 g 10,00;
potassio fosfato bibasico g 1,00;
agar g 13,00;
H2O distillata ml 1000,
pH finale 7,2.
Distribuire 13 ml in provette e autoclavare a 121 (gradi
centigradi) per 15'.
3. Conservazione dei ceppi:
Insemenzare Tryptic Soy Agar a becco di clarino con una
sospensione di microrganismi ed incubare a 30 per 24h. Conservare le
colture in frigorifero a + 4 (gradi centigradi). Trapiantare ogni 20
giorni circa.
Terreno di coltura:
tryptic casein bios g15;
soia peptone g 5;
NaCl g 5;
agar g 15;
H 2 O distillata ml 1.000,
pH 7,2,
Sterilizzare a 121 (gradi centigradi) per 15'.
4. Preparazione delle sospensioni di spore di B. subtilis e B.
cereus:
Insemenzare con una sospensione ricca di cellule di B. subtilis e
B. cereus (ottenuta raccogliendo la patina nei tubi a becco di
clarino (3) con 4 cc di soluzione fisiologica) l'agar nutritivo (4.1)
distribuito in bottiglie di Roux (300 ml) e incubare a 30 (gradi
centigradi) per 10 giorni e raccogliere la patina con 15 ml di
etanolo al 20% e omogeneizzare. (Circa 10(elevato a)7 germi / ml).
4.1 Terreno per la preparazione delle spore:
glucosio g 1;
peptone triptico g 10;
estratto di carne g 1,5;
estratto di lievito g 3;
agar g 30;
tween 80 ml 1;
tampone fosfato pH 5,5 ml 10;
acqua distillata fino a ml 1000;
pH dopo sterilizzazione 5,8.
5. Preparazione della sospensione M. luteus:
Seminare due provettoni contenenti agar nutritivo (5.1) con il
ceppo e incubare a 37 (gardi centigradi) per 24h. Per l'allestimento
delle piastre si deve impegnare una coltura preparata di recente.
5.1 Terreno per asporigeni:
infliso di cuore di bue g 5,0;
infliso di cervello g 12,5;
peptone g 10,0;
NaCl g 5,0;
glucosio g 2,0;
Na2HPO4 g 2,5;
acqua ml 1.000;
pH 7,4.
6. Sospensioni d'uso:
Le sospensioni alla concentrazione di 10(elevato a)7 germi / ml
già pronte, da utilizzare per la semina dei terreni, si possono
conservare alla temperatura di +5 (gradi centigradi) per almeno 5
mesi.
L'agar - germi (8) pronto per l'uso si può conservare a +5 (gradi
centigradi) per 10 giorni ca.
7. Soluzione di trimethoprim:
Il trimethoprim è aggiunto al terreno per aumentare la
sensibilità nei confronti dei sulfamidici.
Disciogliere 10 mg di trimethoprim in 10 ml di etanolo e agitare
fino a completo discioglimento.
Diluire ulteriormente fino 1:200 con acqua distillata fino alla
concentrazione di 5 (micron) g/ml. Per ogni 100 ml di terreno
colturale aggiungere 1 ml di soluzione di trimethoprim (0,05 (micron)
TMP/ml agar).
8. Preparazione delle piastre.
8.1 Depositare su piastre Petri 0,2 ml per ogni ceppo atterico in
modo da avere una concentrazione di 10(elevato a)4 spore/mI. e
colonie/ml.
8.2 Sciogliere il terreno di coltura preparato in precedenza in
provette (2), raffreddarlo a 50(gradi), depositarlo nelle piastre e
mescolarlo con i ceppi.
8.3 Far raffreddare le piastre.
A) Inibenti nelle carni:
a) depositare in ogni piastra preparata (7) un pezzetto di
muscolo, rene o fegato del diametro di 8 mm circa;
b) incubare le piastre con i ceppi B. subtilis e B. cereus alla
temperatura di 30 (gradi centigradi), e quelle con M. luteus a 37
(gardi centigradi) C per 24 ore.
Interpretazione dei risultati: sono ritenuti positivi per inibenti
i campioni che presentano un alone di inibizione &gt; 2 mm.
B) Inibenti nelle uova:
separare tuorlo e albume;
diluire ciascuno 1:3 in tampone fosfato - metanoi'o (2:1) (9);
omogenare e congelare i campioni;
scongelarli e centrifugarli a 4.000 g per 15';
riscaldare i campioni a 65 (gradi centigradi) per 15' per
inattivare il lisozima;
fare in ciascuna piastra preparata (8) due pozzetti per campione,
seminando in uno 0,2 ml di albume e nell'altro 0,2 ml di tuorlo;
incubare le piastre con i ceppi B. subtilis e B. cereus alla
temperatura di 30 (elevato a)0 C, e quelle con M. luteus a 37
(elevato a)0 C per 24 ore.
Interpretazione dei risultati: sono ritenuti positivi per inibenti
i campioni che presentano un alone di inibizione &gt; 2 mm.
C) Inibenti nei mangimi.
9. Estrazione.
Tre aliquote da 10 g del mangime vengono aggiunte rispettivamente
a 50 ml di ciascun solvente di estrazione (10).
Le mescolanze vengono mantenute a temperatura ambiente per almeno
2h.
Preparare le piastre secondo il punto 8.
Praticare nello spessore dell'agar 3 pozzetti per piastra del
diametro di 13 mm.
Depositare in ogni pozzetto 0,1 ml di ciascun estratto.
Incubare le piastre con i ceppi B. subtilis e B. cereus alla
temperatura di 30 (gardi centigradi), e quelle con M. luteus a 37
(gradi centigradi) per 24 ore.
Interpretazione dei risultati: sono ritenuti positivi per inibenti
i campioni che presentano un alone di inibizione &gt; 2 mm.
10. Preparazione dei solventi:
tampone fosfato - bicarbonato (pH 8):
fosfato bipotassico g 16,73;
fosfato monopotassico g 0,523;
carbonato monosodico g 20;
acqua distillata fino a cc 1.000.
Solvente 1 = metanolo + tampone bicarbonato pH 8 (1:1) (v:v).
Solvente 2 = acqua distillata + tampone bicarbonato pH 8 (3:7)
(v:v).
Solvente 3 = metanolo.