Serie Generale n. 50 del 29-2-2012
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 13 dicembre 2011
Linee guida per l'esecuzione di analisi fitosanitarie sui campi di piante madri dei materiali di moltiplicazione vegetativa della vite, ai sensi del decreto 7 luglio 2006, allegato I. (12A02164) (GU Serie Generale n.50 del 29-02-2012)

IL DIRETTORE GENERALE
della competitività per lo sviluppo rurale

Vista la direttiva 68/193/CEE del Consiglio relativa alla
commercializzazione dei materiali di moltiplicazione vegetativa della
vite e successive modifiche;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 24 dicembre 1969,
n. 1164, recante norme sulla produzione e sul commercio dei materiali
di moltiplicazione vegetativa della vite;
Visto il decreto ministeriale 4 luglio 1970 recante norme per
l'applicazione del decreto del Presidente della Repubblica 24
dicembre 1969, n. 1164, relativo alla disciplina della produzione e
del commercio dei materiali di moltiplicazione vegetativa della vite;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 29 luglio 1974, n.
543, recante norme regolamentari per l'applicazione del decreto del
Presidente della Repubblica 24 dicembre 1969, n. 1164, recante norme
sulla produzione e sul commercio dei materiali di moltiplicazione
vegetativa della vite;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 18 maggio 1982, n.
518, relativo all'attuazione delle direttive 71/140/CEE, 74/648/CEE,
74/649/CEE, 77/629/CEE, 78/55/CEE e 78/692/CEE relative alla
produzione ed al commercio dei materiali di moltiplicazione
vegetativa della vite;
Vista la legge 19 dicembre 1984, n. 865, relativa all'attuazione
della direttiva 82/331/CEE della Commissione del 6 maggio 1982 che
modifica la direttiva 68/193/CEE del Consiglio del 9 aprile 1968
relativa alla produzione ed al commercio dei materiali di
moltiplicazione vegetativa della vite;
Visto il decreto ministeriale 2 luglio 1991, n. 290, istitutivo del
regolamento recante l'indicazione supplementare in etichetta per i
materiali di moltiplicazione della vite;
Visto il decreto ministeriale 24 giugno 1997 recante norme di
produzione e commercializzazione di materiali di moltiplicazione di
categoria standard di varietà di viti portinnesto;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 29 ottobre 1997,
n. 432, che emana il regolamento recante modificazioni al decreto del
Presidente della Repubblica 24 dicembre 1969, n. 1164, in materia di
produzione e di commercio dei materiali di moltiplicazione vegetativa
della vite;
Visto il decreto ministeriale 22 dicembre 1997 che stabilisce il
protocollo tecnico per la micropropagazione dei materiali di
moltiplicazione di varietà di portinnesto della vite;
Visto il decreto ministeriale 30 maggio 2001 che modifica il
decreto ministeriale 24 giugno 1997 relativo alle norme di produzione
e commercializzazione di materiali di moltiplicazione di categoria
standard di varietà di viti portinnesto;
Vista la direttiva 2002/11/CE del Consiglio del 14 febbraio 2002
che modifica la direttiva 68/193/CEE relativa alla
commercializzazione dei materiali di moltiplicazione vegetativa della
vite e che abroga la direttiva 74/649/CEE;
Visto il decreto ministeriale 8 febbraio 2005 «Norme di
commercializzazione dei materiali di moltiplicazione vegetativa della
vite» ed in particolare gli articoli 4 e 5;
Vista la direttiva 2005/43/CE della Commissione del 23 giugno 2005
che modifica gli allegati della direttiva 68/193/CEE del Consiglio;
Visto il decreto ministeriale 7 luglio 2006 recante recepimento
della direttiva 2005/43/CE della Commissione del 23 giugno 2005 che
modifica gli allegati della direttiva 68/193/CEE del Consiglio
relativa alla commercializzazione dei materiali di moltiplicazione
vegetativa della vite;
Ritenuto di dover indicare linee guida per l'esecuzione dei
controlli previsti dalla normativa di commercializzazione dei
materiali di moltiplicazione vegetativa della vite;
Sentita l'Unità di coordinamento di cui all'art. 4 del decreto
ministeriale 8 febbraio 2005, ed acquisito il suo parere favorevole
nel corso della riunione del 3 novembre 2011;

Decreta:

Art. 1


Campo di applicazione

1. Il presente decreto riguarda le procedure di controllo
virologico previste dal decreto ministeriale 7 luglio 2006, allegato
I, punto 5 e si applica agli impianti di piante madri per marze e
portainnesto.

Art. 2


Definizioni

1. Ai fini del presente decreto si intende per:
a) «Certificazione»: l'autorizzazione al prelievo di talee o marze
dagli impianti di piante madri;
b) «Impianto di piante madri»: l'impianto corrispondente ad un rigo
della denuncia di produzione (domanda di controllo e certificazione
dei materiali di moltiplicazione vegetativa della vite);
c) «Servizio di controllo»: il Centro di ricerca per la viticoltura
- CRA-VIT di Conegliano per i materiali di moltiplicazione delle
categorie «Iniziale» e di «Base», i competenti uffici regionali per i
materiali della categoria «Certificato» e «Standard»;
d) «Campione pool»: campione multiplo costituito da materiali
prelevati da non più di cinque piante, se non diversamente
specificato;
e) «Responsabile del campo»: il titolare o il rappresentante della
ditta vivaistica che presenta la denuncia di produzione;
f) «Costitutore» o «Proponente»: si intendono, ai fini del presente
decreto, i responsabili dell'identità varietale e clonale nonchè
dello stato sanitario dei materiali di moltiplicazione delle
categorie «Iniziale» e «Base» delle varietà e cloni da loro
costituiti.

Art. 3


Metodi di campionamento e di analisi

1. Le attività di campionamento e di analisi svolte ai fini dei
controlli ufficiali oggetto del presente decreto sono conformi a
quanto di seguito specificato.
2. Le analisi di laboratorio finalizzate ai controlli ufficiali per
la ricerca dei virus indicati all'allegato I del decreto ministeriale
7 luglio 2006, devono seguire il protocollo di analisi riportato
all'allegato 1 del presente decreto.
3. Eventuali modifiche o integrazioni agli allegati tecnici al
presente decreto sono adottate mediante nota tecnica del responsabile
del Servizio fitosanitario centrale, sentita l'Unità nazionale di
coordinamento.

Art. 4


Sospensione dell'utilizzo degli impianti di piante madri

1. Gli impianti di piante madri per poter essere certificati devono
essere sottoposti a campionamento ed analisi ufficiali nel rispetto
dei tempi e delle scadenze previste all'allegato I del decreto
ministeriale 7 luglio 2006.
2. Qualora un impianto di cui al comma precedente, giunto alle
scadenze previste all'allegato I del decreto ministeriale 7 luglio
2006, non è oggetto di utilizzazione, può usufruire di una proroga
dei termini per una sola annualità.
3. Il responsabile del campo di piante madri deve comunque inserire
l'impianto nella denuncia annuale e deve altresì segnalare, prima
del periodo dei controlli, che non sono state effettuate le analisi
previste in quanto non intende utilizzare l'impianto medesimo.
4. Per la campagna in questione l'impianto non viene autorizzato
per il prelievo di materiale di moltiplicazione e resta quindi
«sospeso».
5. L'impianto di piante madri tenuto «sospeso» secondo le procedure
di cui ai commi precedenti, può essere riammesso al controllo ed
alla certificazione solo a seguito della effettuazione delle analisi
fitosanitarie previste e nel rispetto del biennio di controllo
indicato dalle norme sugli organismi nocivi di quarantena di cui al
decreto legislativo 19 agosto 2005, n. 214.

Art. 5


Certificati di analisi e documenti accessori

1. Entro il 30 giugno di ogni anno, secondo le modalità indicate
all'allegato 2 al presente decreto, il responsabile del campo di
piante madri presenta al servizio di controllo, il certificato di
analisi, recante la firma del responsabile dell'analisi e la data del
rilascio, integrato con le seguenti informazioni, riportate sul
certificato medesimo o in un documento allegato:
il riferimento al campo di piante madri sottoposto a test;
la data del prelievo;
il nome di chi ha effettuato il prelievo;
il numero di piante sottoposte a prelievo;
il numero di piante per campione, nel caso di campione pool;
il codice del campione;
informazioni che consentano il collegamento tra campione e pianta o
le piante del campione pool da cui è stato prelevato;
il laboratorio che ha effettuato l'analisi con test ELISA;
il protocollo di analisi seguito con specifica degli antisieri
utilizzati.
2. Le disposizioni di cui al comma 1 si applicano anche alle
analisi delle piante madri effettuate precedentemente all'adozione
del presente decreto; in tal caso, l'intervallo di cinque o sei anni,
rispettivamente per gli impianti di categoria «Iniziale» e «Base»,
decorrono dalla data di rilascio del certificato di analisi e la
comunicazione al servizio di controllo può essere priva dei seguenti
elementi:
codice del campione;
nome di chi ha effettuato il prelievo;
la data del prelievo, fermo restando l'obbligo di citare almeno
l'anno e il mese del campionamento.

Art. 6


Criteri operativi

1. Tutte le piante del campo di piante madri di categoria
«Iniziale» e «Base», sia per marze, sia per portinnesto devono essere
sottoposte ai test per la verifica dello stato virologico, secondo
quanto indicato all'allegato 2 al presente decreto.
2. Il costitutore del clone o suo delegato effettua il
campionamento secondo le modalità indicate all'allegato 2 al
presente decreto e provvede altresì ad effettuare le analisi o a
farle effettuare presso un laboratorio di propria fiducia, in
conformità a quanto stabilito all'art. 3 del presente decreto.
3. Il costitutore può delegare al responsabile del campo le
proprie attribuzioni previste dal presente decreto.
4. Nel caso di campi di piante madri realizzati in Italia con cloni
costituiti in altri Paesi dell'Unione europea, i campioni raccolti
possono essere analizzati anche presso un laboratorio operante in un
altro Paese membro, purchè il protocollo di analisi, in particolare
per quanto riguarda gli antisieri utilizzati, sia equivalente a
quello riportato all'allegato 1.

Art. 7


Autorizzazione al prelievo di materiale di moltiplicazione
«Iniziale» e «Base» e verifiche del servizio di controllo


1. Il servizio di controllo, sulla base dei certificati di analisi
presentati dal costitutore o da suo delegato, autorizza, se del caso,
il prelievo di materiale dagli impianti di piante madri, secondo le
procedure indicate all'allegato 2 al presente decreto.
2. Il servizio di controllo effettua annualmente test di verifica
mediante l'analisi di almeno cento campionamenti dei campi di piante
madri già verificati dal costitutore l'anno precedente ed
autorizzati al prelievo di materiale.
3. Detti test di verifica, costituiti da campioni singoli o
multipli (campioni «pool») riguardano i virus previsti all'allegato I
del decreto ministeriale 7 luglio 2006.

Art. 8


Prima denuncia di impianti di piante madri
di categoria «Iniziale»

1. Il responsabile del campo di piante madri di categoria
«Iniziale» che inserisce per la prima volta l'impianto nella denuncia
di produzione deve accompagnare tale denuncia di produzione con il
certificato delle analisi, effettuate secondo le modalità descritte
dal presente decreto, attestante l'assenza dei virus previsti
dall'allegato I del decreto ministeriale 7 luglio 2006, compreso il
virus della maculatura infettiva della vite (GFkV Fleck) per i
portinnesti.
2. La certificazione d'analisi include le informazioni specificate
all'art. 5 del presente decreto.
3. Il certificato di analisi deve riferirsi ad un prelievo
effettuato entro il quarto anno solare precedente a quello in cui è
presentata la denuncia di produzione.

Art. 9

Prima denuncia di impianti di piante madri di categoria «Iniziale»
per la produzione di materiale di categoria «Base»

1. Per i cloni di nuova iscrizione al Registro nazionale delle
varietà di viti è consentito realizzare un impianto di piante madri
per la produzione di materiale di moltiplicazione della categoria
«Base» contestualmente alla prima denuncia del primo impianto di
piante madri per la produzione di materiale di moltiplicazione di
categoria «Iniziale», utilizzando piante della stessa categoria
«Iniziale».
2. A detti impianti per la produzione di materiale di categoria
«Base» si applicano le medesime condizioni indicate all'art. 8 per i
nuovi impianti di piante madri di categoria «Iniziale».

Art. 10


Materiali di categoria «certificato»

1. Le piante del campo di piante madri destinate alla produzione di
materiali di moltiplicazione della categoria certificato devono
essere sottoposte periodicamente ad analisi per la verifica dello
stato fitosanitario secondo quanto indicato all'allegato 3 al
presente decreto.
2. I servizi di controllo regionali dispongono il campionamento
ufficiale che deve essere realizzato sotto loro responsabilità,
secondo le modalità indicate all'allegato 3 al presente decreto. I
servizi medesimi provvedono ad effettuare o fare effettuare per loro
conto le analisi presso un laboratorio in conformità a quanto
stabilito all'art. 3 del presente decreto.

Art. 11


Autorizzazione al prelievo di materiale certificato

1. Il servizio di controllo, sulla base dei risultati delle analisi
effettuate, autorizza, se del caso, il prelievo di materiale dagli
impianti di piante madri, secondo le procedure indicate all'allegato
3 al presente decreto.

Art. 12


Comunicazioni e coordinamento

1. I servizi di controllo devono presentare annualmente, entro il
31 dicembre, all'Unità nazionale di coordinamento, di cui all'art. 4
del decreto ministeriale 8 febbraio 2005, presso il Ministero delle
politiche agricole alimentari e forestali, una relazione
sull'attività di controllo di cui all'art. 1 che riporta almeno:
il numero e la superficie degli impianti giunti a scadenza per
essere sottoposti a test;
quelli effettivamente sottoposti a test ed eventualmente le ragioni
per cui determinati impianti non sono stati controllati;
le contestazioni ed i risultati delle analisi di verifica
effettuate dal servizio di controllo ed i provvedimenti presi;
eventuali particolari situazioni o problematiche riscontrate.
2. Qualora, sulla base di tali informazioni o in assenza di esse,
emergono gravi ritardi e carenze funzionali del servizio di
certificazione, il Ministero delle politiche agricole alimentari e
forestali, su indicazione dell'unità di coordinamento, può disporre
adeguata attività ispettiva ed indicare le opportune misure
correttive atte a superare le disfunzioni rilevate.
Il presente decreto sarà inviato all'organo di controllo per la
registrazione e sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana al fine di assicurarne una diffusa conoscenza
nell'intero territorio nazionale.

Roma, 13 dicembre 2011

Il direttore generale: Blasi

Registrato alla Corte dei conti il 30 gennaio 2012
Ufficio di controllo atti MISE - MIPAAF, registro n. 1, foglio n. 274

Allegato 1

METODICA DI CAMPIONAMENTO ED ANALISI


Parte I
Campionamento

Per la diagnosi dei cinque virus della vite previsti dalla
certificazione la matrice da utilizzare in tutti i protocolli è il
tessuto floematico ottenuto da materiale legnoso raccolto nel periodo
invernale.
Un corretto campionamento è un presupposto fondamentale per
l'attendibilità del risultato di qualsiasi saggio diagnostico e
anche lo stato di degradazione del materiale vegetale costituente il
campione può influire sul risultato dell'analisi di laboratorio.
Il corretto campionamento prevede quindi:
il prelievo del campione vegetale nel periodo idoneo;
la raccolta di materiale vegetale esente da alterazioni dovute a
fattori abiotici o a fattori biotici di altra natura;
il corretto mantenimento del campione vegetale sino alla consegna
al laboratorio;
la rapida spedizione al laboratorio di diagnosi.
Norme da osservare per i prelievi in campo:
periodo: tutto il periodo di riposo vegetativo;
matrice: la matrice migliore è costituita da tralci lignificati
dell'anno;
tipologia del campione: raccogliere almeno una porzione legnosa
lunga circa 60 cm dalla parte basale di tralci dell'anno. I campioni
legnosi devono essere integri e non devono presentare alterazioni
dovute a fattori abiotici o a fattori biotici di altra natura;
mantenimento del campione: il materiale vegetale deve essere
asciutto, deve essere posto in buste di plastica da conservare a
basse temperature o in luoghi freschi tali da evitare eventuale
disidratazione;
rintracciabilità del campione: ogni campione deve essere
opportunamente siglato sulla busta e sulla pianta;
spedizione del campione: i campioni raccolti devono arrivare al
laboratorio di diagnosi entro 72 ore preferibilmente in borse
termiche.
Norme da osservare in laboratorio.
I campioni legnosi possono essere mantenuti a 4 °C non oltre i 60
giorni, evitandone la disidratazione. Conservazioni più lunghe
possono inficiare il risultato del saggio diagnostico.
Tutti i campioni vegetali che manifestano imbrunimenti o inizio
di muffa o seccumi non devono essere processati.

Parte II
Saggio sierologico ELISA - Modalità generali

L'ELISA consiste in una reazione specifica antigene
(virus)-anticorpo che avviene su un supporto solido, i pozzetti di
una piastra ELISA, e che viene visualizzata mediante una reazione
colorimetrica.
Strumentazione, materiali e reagenti necessari.
Strumentazione:
1) agitatore magnetico;
2) bilancia analitica;
3) distillatore;
4) frigorifero e congelatore;
5) incubatore termostatico (37 °C);
6) lavatore di piastre automatico (opzionale);
7) lettore piastre ELISA (fotometro);
8) micro pipette dedicate e calibrate (P10, P20, P50, P200,
P1000, P5000);
9) pipetta multicanale (opzionale);
10) fresa per polverizzazione del legno o omogeneizzatore
(opzionale);
11) pH metro;
12) bisturi o coltelli.
Reagenti:
1) kit sierologico ELISA;
2) reagenti chimici per i tamponi (PBS, PBS-T, tampone carbonato,
tampone di estrazione, tampone coniugato, tampone per substrato);
3) substrato (para-nitro-fenilfosfato - PNP);
4) controllo positivo, sicuramente infetto dai virus target ed
appartenente alla stessa specie vegetale saggiata;
5) controllo negativo, sicuramente esente da infezione dai virus
target ed appartenente alla stessa specie vegetale saggiata.
Materiali:
1) acqua distillata;
2) fogli di carta per ricoprire i banchi da lavoro;
3) carta da laboratorio;
4) rotoli di carta di alluminio;
5) guanti monouso;
6) pellicola trasparente;
7) mortai e pestelli;
8) piastre polistirene a novantasei pozzetti per ELISA ad alta
capacità di legame con gli anticorpi;
9) puntali per micro pipette di tutti i volumi adeguati alle
pipette sopra indicate;
10) vetreria varia o materiale plastico monouso;
11) lame da bisturi;
12) azoto liquido (opzionale).
L'efficienza del saggio riportata dalla ditta produttrice è
correlata ai test di qualità effettuati nelle condizioni di lavoro
espressamente riportate nel foglietto di istruzioni.
Seguire, quindi, attentamente tutte le istruzioni della ditta
produttrice del kit sierologico utilizzato. In particolare effettuare
scrupolosamente tutte le diluizioni dei reagenti riportate.
Utilizzare la diluizione del campione nel rapporto 1/10
peso/volume. Non modificare i tamponi indicati.

Parte III
Procedura del saggio

Preparazione dei tamponi.
Il tampone carbonato per la sensibilizzazione delle piastre, il
tampone coniugato ed il tampone PBS (che può essere preparato alla
concentrazione 10× da utilizzare come stock di partenza) possono
essere preparati precedentemente e mantenuti in laboratorio, a
temperatura ambiente. Controllare accuratamente il pH del tampone
carbonato perchè è determinante per l'adesione degli anticorpi alla
plastica dei pozzetti.
Il tampone per il substrato può essere preparato prima e
mantenuto a 4 °C al riparo dalla luce.
Il tampone di estrazione deve essere sempre preparato poco prima
dell'utilizzo e mantenuto a 4 °C o in ghiaccio.
È importante utilizzare i tamponi entro trenta giorni dalla
preparazione. È possibile arrivare fino a sei mesi se i tamponi
vengono aggiunti di sodio azide (0,2 g/L).
Preparazione del saggio ELISA.
Stabilire il numero di piastre ELISA necessario e preparare un
opportuno schema cartaceo per piastra (allegato 1), in cui vengono
riportati tutti i dati dell'esperimento.
Per ogni piastra è possibile caricare quarantuno campioni più
un controllo sano, uno infetto ed un bianco secondo lo schema
allegato.
Come controllo positivo e negativo possono essere utilizzati
quelli forniti dai kit commerciali oppure possono essere utilizzati
campioni di materiale vegetale, appartenenti alla stessa matrice e
alla stessa specie dei campioni saggiati, provenienti da una vite
sicuramente infetta dai virus oggetto di studio e da una vite
sicuramente esente da virus, rispettivamente. In questo caso i
controlli devono essere macerati congiuntamente ai campioni da
saggiare.
Il controllo bianco è costituito da tampone di estrazione da
caricare al posto del campione vegetale.
Ciascun campione deve essere replicato su due pozzetti, compresi
il controllo sano, quello infetto ed il tampone.
Otto pozzetti di bordo (evidenziati in grigio nell'allegato 1)
saranno riempiti con tampone, i valori però non saranno considerati
nel calcolo del rumore di fondo (vedi il capitolo «Valutazione dei
risultati»).
Pulire accuratamente e disinfettare il piano di lavoro e coprirlo
con fogli di carta, da sostituire ad ogni fase.
Estrazione del virus dal campione da analizzare.
La matrice utilizzata per il saggio di tutti i virus è il
tessuto floematico, ottenuta seguendo le fasi di seguito elencate:
fase 1: rimozione dello strato corticale esterno (ritidoma) fino
a mettere a nudo il tessuto floematico;
fase 2: prelievo del floema mediante raschiamento con bisturi o
coltellino;
fase 3: il tessuto floematico ottenuto deve essere posto in
mortaio e polverizzato con azoto liquido e successivamente aggiunto
del tampone di estrazione o, in alternativa, direttamente macerato
con pestello in presenza di tampone di estrazione nel rapporto
peso/volume 1/10;
fase 4: lasciare macerare il floema ottenuto dalla fase 3 a
contatto con il tampone di estrazione per 2-3 ore a freddo (4 °C o in
ghiaccio).
In alternativa è possibile l'utilizzo di una fresa per
macinare/polverizzare il campione:
fase 1: il campione può essere trattato in due modi: con
rimozione dello strato corticale esterno (ritidoma) oppure trattato
integralmente. In questo caso l'unica accortezza è di aumentare la
quantità di campione a contatto con il tampone di estrazione;
fase 2: prelievo del floema, congiuntamente agli altri tessuti
del tralcio legnoso, mediante macinazione/polverizzazione tramite una
fresa (tipo Granex o artigianale), con raccolta del materiale
campionato in contenitori di plastica;
fase 3: aggiungere il tampone di estrazione ai tessuti campionati
in rapporto 1/10; macerare direttamente a freddo (4 °C o in ghiaccio)
per 2-3 ore oppure (opzionale) omogeneizzare meccanicamente prima di
lasciare a freddo (4 °C o in ghiaccio) per 2-3 ore.
È necessario siglare sempre ogni singolo campione.
durante le operazioni di preparazione mantenere i mortai in
ghiaccio o in cella fredda a 4 °C;
mantenere i campioni via via macerati in ghiaccio o a 4 °C.
Valutazione dei risultati.
Seguire l'evoluzione della reazione colorimetrica con attenzione
nelle prime fasi, prendendo come riferimento il controllo positivo.
I risultati sono attendibili fino a che i controlli negativi, una
volta sottratto il valore di fondo (bianco), non superano
l'assorbanza di 0,2 OD.
Quantificare la colorazione tramite lettura visiva (+/-) e in un
apposito fotometro a 405 nm. Fare almeno tre letture a partire
dall'inizio della colorazione del controllo positivo (o del primo
campione risultato infetto) e proseguire fino a che il controllo
negativo non supera l'assorbanza di 0,2 OD.
Lo sviluppo del colore può essere bloccato aggiungendo 50
µl/pozzetto di NaOH 3M.



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INTERPRETAZIONE DELLE LETTURE CON FOTOMETRO

Background o rumore di fondo (A) = media dei valori dell'assorbanza
dei controlli negativi

Threshold o limite soglia (B) = A x 2,5 se questo valore risulta
superiore o uguale a 0,1 OD, in caso contrario il valore soglia sarà
pari a 0,1 OD.

Campione positivo: &gt; = B
Campione negativo: &lt; B

Nel caso in cui le due repliche non siano entrambe al di sopra o al
di sotto della soglia B, il campione deve essere considerato dubbio e
va analizzato di nuovo, utilizzando lo stesso omogenato, se
conservato in frigo, entro 48 ore dalla sua preparazione, in caso
contrario estratto di nuovo.
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Parte IV
ELISA diretta o DAS-ELISA (per i virus ArMV, GFLV, GLRaV-1 e GLRaV-3)

1. Sensibilizzazione della piastra ELISA con gli anticorpi specifici:
diluire gli anticorpi secondo quanto riportato sull'etichetta del
kit in tampone carbonato 1×;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
distribuire la soluzione di anticorpi per ciascun pozzetto nella
quantità indicata dalla ditta produttrice del kit specifico
(generalmente 100 o 200 µl);
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone carbonato.
2. Estrazione del virus dai campioni:
seguire quanto sopra indicato nelle procedure del saggio.
3. Lavaggio della piastra:
dopo l'incubazione della piastra con gli anticorpi, iniziare il
lavaggio;
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
4. Distribuzione dei campioni:
caricare i campioni (100 o 200 µl per pozzetto, secondo quanto
riportato dalla ditta produttrice del kit) seguendo lo schema
(eliminare gli otto pozzetti esterni), replicando ciascun campione in
due pozzetti. Includere un controllo positivo, un controllo negativo
(pianta sana) e un controllo bianco (caricare il tampone di
estrazione al posto del campione). Se ci sono pozzetti inutilizzati
non lasciarli asciutti, ma riempirli col tampone di estrazione;
riempire con tampone anche i pozzetti di bordo in grigio nello
schema (vedi allegato 1);
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Quando si preleva la soluzione macerata fare attenzione a non
versare nei pozzetti residui vegetali solidi.
5. Lavaggio della piastra:
lavare la piastra con PBS-T fino a completa rimozione di ogni
residuo di tessuto vegetale;
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
Questa fase di lavaggio è molto critica e va fatta con
attenzione.
6. Distribuzione anticorpo specifico coniugato:
diluire il coniugato alla diluizione e nel tampone riportato
dalla ditta produttrice;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
caricare 100 o 200 µl della soluzione ottenuta per ciascun
pozzetto;
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone coniugato.
7. Preparazione del substrato:
preparare il substrato cinque minuti prima dell'uso;
aggiungere al tampone substrato cinque minuti prima dell'uso il
4-Nitrophenyl phosphate disodium salthexahydrate alla concentrazione
di 1 mg/1 ml. Si consiglia di utilizzarlo nella formulazione
commerciale in tavolette;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
mantenere il substrato al buio prima dell'uso.
8. Lavaggio della piastra:
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di
tampone.
Questa fase di lavaggio è molto critica e va fatta con
attenzione.
9. Caricamento del substrato:
caricare 100 o 200 µl della soluzione di substrato per ciascun
pozzetto. Coprire la piastra con un foglio di alluminio ed incubarla
a temperatura ambiente fino alla comparsa della colorazione.
10. Valutazione dei risultati:
seguire le modalità sopra indicate nelle procedure generali
del saggio.

Parte V
ELISA indiretta o DASI-ELISA (per il virus GVA)

1. Sensibilizzazione della piastra ELISA con gli anticorpi specifici:
diluire gli anticorpi, secondo quanto riportato sull'etichetta in
tampone carbonato 1×;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
distribuire la soluzione di anticorpi per ciascun pozzetto nella
quantità indicata dalla ditta produttrice del kit specifico
(generalmente 100 o 200 µl);
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone carbonato
2. Estrazione del virus dai campioni:
seguire quanto sopra indicato nelle procedure del saggio.
3. Lavaggio della piastra:
dopo l'incubazione della piastra con gli anticorpi, iniziare il
lavaggio;
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
4. Distribuzione dei campioni:
caricare i campioni (100 o 200 µl per pozzetto secondo quanto
previsto dalla ditta produttrice) seguendo lo schema (eliminare gli
otto pozzetti esterni), replicando ciascun campione in due pozzetti.
Includere un controllo positivo, un controllo negativo (pianta sana)
e un controllo bianco (caricare il tampone di estrazione al posto del
campione);
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone di estrazione.
5. Lavaggio della piastra:
lavare la piastra con PBS-T fino a completa rimozione di ogni
residuo di tessuto vegetale;
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
Questa fase di lavaggio è molto critica e va fatta con
attenzione.
6. Distribuzione del secondo anticorpo specifico:
diluire il secondo anticorpo alla diluizione e nel tampone
riportato dalla ditta produttrice;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
caricare 100 o 200 µl della soluzione ottenuta per ciascun
pozzetto;
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone coniugato
7. Lavaggio della piastra:
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
8. Distribuzione dell'anticorpo coniugato:
diluire il coniugato alla diluizione e nel tampone riportato
dalla ditta produttrice;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
caricare 100 o 200 µl della soluzione ottenuta per ciascun
pozzetto;
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone coniugato.
9. Preparazione del substrato:
preparare il substrato cinque minuti prima dell'uso;
aggiungere al tampone substrato cinque minuti prima dell'uso il
4-Nitrophenyl phosphate disodium salthexahydrate alla concentrazione
di 1 mg/1 ml. Si consiglia di utilizzarlo nella formulazione
commerciale in tavolette;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
mantenere il substrato al buio prima dell'uso.
10. Lavaggio della piastra:
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
Questa fase di lavaggio è molto critica e va fatta con
attenzione.
11. Caricamento del substrato:
caricare 100 o 200 µl della soluzione di substrato per ciascun
pozzetto. Coprire la piastra con un foglio di alluminio ed incubarla
a temperatura ambiente fino alla comparsa della colorazione.
12. Valutazione dei risultati:
seguire le modalità sopra indicate nelle procedure generali
del saggio.

Parte VI
ELISA con pre-sensibilizzazione con proteina A per il virus GVA

1. Pre-sensibilizzazione con proteina A:
diluire la proteina A, secondo quanto riportato sull'etichetta in
tampone carbonato 1×;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
distribuire la soluzione di proteina A per ciascun pozzetto nella
quantità indicata dalla ditta produttrice del kit specifico (200
µl);
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Per la migliore ripetibilità del saggio è consigliabile lo
stoccaggio della proteina A suddivisa in aliquote minime (es.: per
una piastra) o in alternativa utilizzare in un'unica soluzione tutto
il contenuto della proteina A e sensibilizzare le piastre relative
che potranno essere conservate a -20 °C. È questo un passaggio
fondamentale dal momento che la proteina A va incontro ad un
degradamento se congelata e scongelata più volte.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone carbonato
2. Lavaggio della piastra:
dopo l'incubazione della piastra iniziare il lavaggio;
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
3. Sensibilizzazione della piastra ELISA con anticorpi specifici:
diluire gli anticorpi secondo quanto riportato sull'etichetta in
tampone carbonato 1×;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
distribuire la soluzione di anticorpi per ciascun pozzetto nella
quantità indicata dalla ditta produttrice del kit specifico (200
µl);
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
4. Estrazione del virus dai campioni:
seguire quanto sopra indicato nelle procedure del saggio.
5. Lavaggio della piastra:
dopo l'incubazione della piastra con gli anticorpi, iniziare il
lavaggio;
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
6. Distribuzione dei campioni:
caricare 200 µl di ogni campione per pozzetto seguendo lo schema
(eliminare gli otto pozzetti esterni), replicando ciascun campione in
due pozzetti. Includere un controllo positivo, un controllo negativo
(pianta sana) e un controllo bianco (caricare il tampone di
estrazione al posto del campione);
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone di estrazione.
7. Lavaggio della piastra:
lavare la piastra con PBS-T fino a completa rimozione di ogni
residuo di tessuto vegetale;
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
Questa fase di lavaggio è molto critica e va fatta con
attenzione.
8. Distribuzione degli anticorpi specifici coniugati:
diluire il secondo anticorpo alla diluizione e nel tampone
riportato dalla ditta produttrice;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
caricare 200 µl della soluzione ottenuta per ciascun pozzetto;
coprire la piastra con pellicola trasparente o con l'apposito
coperchio;
incubare in camera umida alla temperatura e per il tempo
richiesti dalla ditta produttrice.
Se ci sono pozzetti inutilizzati non lasciarli asciutti, ma
riempirli col tampone coniugato.
9. Preparazione del substrato:
preparare il substrato cinque minuti prima dell'uso;
aggiungere al tampone substrato cinque minuti prima dell'uso il
4-Nitrophenyl phosphate disodium salthexahydrate alla concentrazione
di 1 mg/1 ml. Si consiglia di utilizzarlo nella formulazione
commerciale in tavolette;
mescolare bene la soluzione ottenuta;
mantenere il substrato al buio prima dell'uso.
10. Lavaggio della piastra:
fare il numero di lavaggi con PBS-T riportato sulle istruzioni
per il tempo indicato;
asciugare la piastra battendola su carta da laboratorio, fino ad
eliminare bolle o residui di tampone.
11. Caricamento del substrato:
caricare 200 µl della soluzione di substrato per ciascun
pozzetto. Coprire la piastra con un foglio di alluminio ed incubarla
a temperatura ambiente fino alla comparsa della colorazione.
12. Valutazione dei risultati:
seguire le modalità sopra indicate nelle procedure generali
del saggio.

Parte VII
Punti critici dell'ELISA

a) Essendo l'ELISA una reazione antigene-anticorpo che avviene su
un supporto solido la scelta della piastra è molto importante
perchè influisce sul legame degli anticorpi e sull'eventuale
background della reazione. Esistono diversi tipi di piastre ELISA in
commercio: a fondo piatto o a fondo conico, ad alta, media e bassa
capacità di legame con gli anticorpi, dovuta a pre-trattamenti del
materiale plastico. Si consiglia di cambiare il tipo di piastra o il
lotto utilizzato nel caso si osservino fenomeni ripetuti di
background (giallo diffuso sui controlli negativi) o reazioni molto
deboli. Accertarsi, comunque, che la piastra sia specifica per il
saggio ELISA (esistono in commercio molti tipi di piastre a
novantasei pozzetti dedicate ad altri scopi).
b) Nello schema del test riportare anche il numero di lotto del
kit sierologico (può essere determinante per la uniformità di
alcuni risultati).
c) Utilizzare il kit sierologico entro la data di scadenza.
d) Rispettare scrupolosamente le condizioni di conservazione di
tutti i reagenti.
e) Controllare con accuratezza il pH dei tamponi utilizzati,
perchè è determinante per la loro efficienza.
f) Controllare almeno una volta al mese la taratura delle micro
pipette utilizzate.
g) L'efficienza del test ELISA è strettamente dipendente da una
buona macerazione del campione vegetale, effettuare con molta cura le
operazioni di preparazione del campione.
h) La reazione di legame antigene-anticorpo che avviene
all'interno dei pozzetti della piastra ELISA è efficiente e
specifica solo se ad ogni passaggio vengono eliminati i reagenti che
non si sono legati. Le fasi di lavaggio sono, quindi, molto
importanti per la buona riuscita del test. Il lavaggio manuale
mediante uso di una bottiglia a spruzzo è il più efficiente. Se si
utilizzano macchinari per il lavaggio automatico delle piastre ELISA
è necessario controllare ogni settimana la perfetta pulizia ed
efficienza di ogni canale di lavaggio. In particolare, dopo il
caricamento dei campioni fare molta attenzione ad eliminare qualunque
residuo di materiale vegetale (le piastre devono risultare
assolutamente trasparenti).
i) Controllare sempre le etichette dei reagenti del kit ed i
fogli di istruzione della ditta produttrice prima di effettuare le
opportune diluizioni (possono variare in funzione del lotto
utilizzato).
j) Le soluzioni di anticorpo o coniugato devono essere effettuate
secondo le istruzioni, in contenitori di vetro o di polietilene (o
opportuna plastica a bassa capacità di legame delle proteine) poco
prima dell'uso.
k) Tenere le piastre ELISA sempre coperte con pellicola
trasparente o l'apposito coperchio durante le incubazioni.
l) Controllare sempre la pulizia e le condizioni asettiche dei
contenitori in cui vengono preparati e mantenuti i tamponi.
m) Utilizzare guanti per la manipolazione delle piastre ELISA o
fare molta attenzione a non toccare il fondo delle piastre.
n) I pozzetti delle righe e colonne esterne della piastra possono
essere soggetti al cosiddetto «effetto bordo», dovuto al contatto con
l'aria, che si evidenzia con la colorazione gialla dei pozzetti
indipendentemente dall'avvenuta reazione antigene-anticorpo. Caricare
i campioni sempre su doppio pozzetto in modo da evitare che entrambi
risultino collocati solo su tali righe e colonne. Se l'effetto bordo
si ripete costantemente, usare per il saggio solo i pozzetti centrali
ed eliminare i pozzetti di bordo, riempiendoli con tampone.

Parte VIII
Tamponi necessari per l'effettuazione del test ELISA



Parte di provvedimento in formato grafico

Allegato 2

ANALISI FITOSANITARIE DI IMPIANTI DI PIANTE MADRI PER LA PRODUZIONE
DI MATERIALI DI MOLTIPLICAZIONE DELLE CATEGORIE «INIZIALE» E
«BASE».

Parte I
Anno di primo campionamento

La tabella seguente indica sinteticamente l'anno di effettuazione
del primo campionamento in funzione dell'anno di impianto del campo
di piante madri.
In conseguenza della prassi consolidata del controllo annuale
degli impianti, relativamente agli impianti di piante madri di
categoria «Base», la prima analisi di laboratorio per la ricerca dei
virus previsti dalla normativa, può essere effettuata quando
l'impianto ha sei anni di età (informazione rilevabile dalla
denuncia di produzione).


Parte di provvedimento in formato grafico



Parte II
Ulteriori informazioni per il campionamento, l'analisi
ed i rapporti con il servizio di controllo



Parte di provvedimento in formato grafico

Allegato 3

ANALISI FITOSANITARIE DI IMPIANTI DI PIANTE MADRI PER LA PRODUZIONE
DI MATERIALI DI MOLTIPLICAZIONE DI CATEGORIA «CERTIFICATO».

Parte I
Anno di primo campionamento

In conseguenza della prassi consolidata del controllo annuale
degli impianti, anche a seguito delle disposizioni previste dalla
normativa fitosanitaria sulle malattie di quarantena, la prima
analisi di laboratorio per la ricerca dei virus previsti dalla
normativa, può essere effettuata quando l'impianto ha dieci anni di
età (informazione rilevabile dalla denuncia di produzione).
Per semplificare la pianificazione dei prelievi negli impianti di
piante madri si riporta, nella sottostante tabella, un quadro delle
scadenze in relazione all'anno d'impianto dei vigneti di piante
madri:


Parte di provvedimento in formato grafico



Parte II
Ulteriori informazioni per il campionamento, l'analisi
ed i rapporti con il servizio di controllo



Parte di provvedimento in formato grafico

Allegato 4

ELENCO DEI LABORATORI PUBBLICI AUTORIZZATI DAL MINISTERO PER LE
FINALITÀ DI CUI AL DECRETO MINISTERIALE 2 LUGLIO 1991, N. 290
(INDICAZIONE SUPPLEMENTARE IN ETICHETTA) E DEI LABORATORI PUBBLICI
PARTECIPANTI AL PROGETTO ARNADIA.


Parte di provvedimento in formato grafico