Serie Generale n. 279 del 29-11-1995
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 31 luglio 1995
Metodiche di analisi per la determinazione dei coliformi fecali, di Escherichia coli, delle salmonelle, delle biotossine algali PSP (Paralytic Shellfish Poison), delle tossine DSP (Diarrhetic Shellfish Poison), del mercurio e del piombo nei molluschi bivalvi. (GU Serie Generale n.279 del 29-11-1995)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto il decreto legislativo 30 dicembre 1992, n. 530, recante
attuazione della direttiva 91/492/CEE che stabilisce le norme
sanitarie applicabili alla produzione e commercializzazione dei
molluschi bivalvi vivi;
Visto il decreto legge 21 luglio 1995, n. 294;
Visti i pareri favorevoli del Consiglio superiore di sanità in
data 21 settembre 1993 e 12 aprile 1995;
Decreta:
Art. 1.
1. Sono approvate le metodiche di analisi allegate al presente
decreto concernenti la determinazione dei coliformi fecali, di
Escherichia coli, delle salmonelle, delle biotossine algali PSP
(Paralytic Shellfish Poison), delle tossine DSP (Diarrhetic Shellfish
Poison), del mercurio e del piombo nei molluschi bivalvi.
2. Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 31 luglio 1995
Il Ministro: GUZZANTI
Registrato alla Corte dei conti il 30 ottobre 1995
Registro n. 1 Sanità, foglio n. 349

ALLEGATO 1
METODICHE DI ANALISI
A) Determinazione dei coliformi fecali
I campioni prelevati da sottoporre ad analisi devono essere
costituiti da 50-200 invertebrati per aliquota, con criterio inverso
alla dimensione delle varie specie.
I molluschi, al momento del controllo, vengono isolati, spazzolati
in modo da togliere il fango, le incrostazioni, nonchè epifiti,
epizoi, ecc., eventualmente presenti, lavati con acqua colorata
(circa 20 ppm) raffreddata con ghiaccio, sciacquati con acqua
distillata sterile.
Ogni singolo mollusco viene aperto con idoneo utensile sterile ed
il contenuto (corpo e liquido intervalvare) viene lasciato cadere in
un recipiente sterile.
Preparare un omogeneizzato con un minimo di 10 individui, ed
accantonarne una quantità compresa tra 50 e 100 g complessivi.
Preparare quindi le seguenti diluizioni dal precedente
omogeneizzato:
diluizione A: 10 g di omogeneizzato + 90 g di sol. fisiologica
sterile equivalenti a 0,1 q camp./g;
diluizione B: 1 ml di diluizione A + 9 ml di sol. fisiologica
sterile equivalenti a 0,01 q camp./g;
diluizione C: 1 ml di diluizione B + 9 ml di sol. fisiologica
sterile equivalenti a 0,001 q camp./g.
Seminare le diluizioni di cui sopra secondo il seguente schema:
ml 1 diluizione A per provetta, in 5 provette contenenti 9 ml di
brodo A1 ciascuna;
ml 1 diluizione B per provetta, in 5 provette contenenti 9 ml di
brodo A1 ciascuna;
ml 1 diluizione C per provetta, in 5 provette contenenti 9 ml di
brodo A1 ciascuna.
In caso di molluschi presumibilmente poco contaminati, al fine di
una maggiore accoratezza nella valutazione dei risultati, si
suggerisce la semina diretta di 1 g di omogeneizzato e delle
successive diluizioni A e B. In tal caso i valori riportati in
tabella 1 dovranno essere divisi per un fattore 10.
Le provette, una volta inoculate, vanno incubate a 37 più o meno
0,5 C (gradi) per 3 ore (rivitalizzazione dei germi stressati) e
quindi poste a 44 più o meno 0,1 C (gradi).
Tutte le provette in cui si siano formati, dopo 24 ore di
incubazione complessiva, torbidità e una qualsiasi quantità di gas
sono considerate positive per coliformi fecali e debbono essere
sottoposte alla determinazione successiva. In base al numero delle
provette positive si risale al numero più probabile di coliformi
fecali/100 g di molluschi applicando la tabella 1.
B) Determinazione di Escherichia coli
Dalle provette di brodo A1 risultate positive per la ricerca di
coliformi fecali, seminare 0,1 ml della brodocoltura in una provetta
contenente 10 ml di acqua triptonata.
Incubare a 44 C (gradi) per 24 ore.
La ricerca di Escherichia coli risulterà positiva se si rileverà
la formazione di indolo nelle provette contenenti acqua triptonata.
La ricerca dell'indolo viene eseguita aggiungendo a ciascuna
provetta di acqua triptonata 0,5 ml di reattivo di Kovacs. La
reazione è positiva se, dopo breve agitazione, si separa sulla
superficie del terreno uno strato colorato di rosso ciliegia.
In base al numero dalle provette positive si risale al numero più
probabile di Escherichia coli/100 g di molluschi applicando la
tabella 1.
PREPARAZIONE DEI TERRENI DI COLTURA PER LA DETERMINAZIONE DEI
COLIFORMI NEI MOLLUSCHI.
Terreno di coltura A1
Il terreno A1, che è anche commercializzato in forma disidratata, ha
la seguente composizione:
lattosio g 5
Triptone g 20
NaC1 g 5
Salicina g 0,5
Acqua distillata q.b. a ml 1000.
Dopo aver disciolto i componenti del terreno si aggiunge 1 ml di
Triton X-100 e si aggiusta il pH a 6,9 più o meno 0,1.
Si sterilizza in autoclave a 121 C (gradi) per 10 minuti.
Il terreno può essere conservato anche per 7 mesi se mantenuto al
buio ed in frigorifero.
Acqua triptonata:
Triptone g 10
NaC1 g 5
Acqua distillata q.b. a ml 1000
Distribuire in provette e sterilizzare a 121 C (gradi) per 10 minuti.
Reattivo di Kovacs:
P-dimetilaminobenzaldeide g 5
alcool amilico ml 75
HC1 concentrato ml 25
Sciogliere l'aldeide nell'alcool amilico a b.m. a 50-55 C (gradi).
Raffreddare e aggiungere l'acido cloridrico. Conservare a +4 (gradi)
al buio.. Il colore della soluzione al momento della preparazione è
giallo tendente al bruno.
Nota
La ricerca dei coliformi nei molluschi bivalvi può essere
effettuata mediante la prova del Numero Più Probabile o mediante
qualsiasi altro procedimento batteriologico che presenti lo stesso
grado di precisione.
TABELLA MPN TABELLA 1

| Numero dei tubi positivi |Indice MPN |
| | |
| |per 100 g |
| | |
|5x1 g dil. A 5x1 g dil. B 5x1 g dil. C | |
|(0,1g campione) (0,01g campione) (0,001g campione)| |
| | |
| | |
| 0 0 1 | 200 |
| 0 1 0 | 200 |
| 0 2 0 | 400 |
| 1 0 0 | 200 |
| 1 0 1 | 400 |
| 1 1 0 | 400 |
| 1 1 1 | 600 |
| 1 2 0 | 600 |
| 2 0 0 | 500 |
| 2 0 1 | 700 |
| 2 1 0 | 700 |
| 2 1 1 | 900 |
| 2 2 0 | 900 |
| 2 3 0 | 1200 |
| 3 0 0 | 900 |
| 3 0 1 | 1100 |
| 3 1 0 | 1100 |
| 3 1 1 | 1400 |
| 3 2 0 | 1400 |
| 3 2 1 | 1700 |
| 3 3 0 | 1700 |
| 4 0 0 | 1300 |
| 4 0 1 | 1700 |
| 4 1 0 | 1700 |
| 4 1 1 | 2100 |
| 4 1 2 | 2600 |
| 4 2 0 | 2200 |
| 4 2 1 | 2600 |
| 4 3 0 | 2700 |
| 4 3 1 | 3300 |
| 4 4 0 | 3400 |
| 5 0 0 | 2300 |
| 5 0 1 | 3100 |
| 5 0 2 | 4300 |
| 5 1 0 | 3300 |
| 5 1 1 | 4600 |
| 5 1 2 | 6300 |
| 5 2 0 | 4900 |
| 5 2 1 | 7000 |
| 5 2 2 | 9400 |
| 5 3 0 | 7900 |
| 5 3 1 | 10900 |
| 5 3 2 | 14100 |
| 5 3 3 | 17500 |
| 5 4 0 | 13000 |
| 5 4 1 | 17200 |
| 5 4 2 | 22100 |
| 5 4 3 | 27800 |
| 5 4 4 | 34500 |
| 5 5 0 | 24000 |
| 5 5 1 | 34800 |
| 5 5 2 | 54200 |
| 5 5 3 | 91800 |
| 5 5 4 | 160900 |
| | |
C) Determinazione delle salmonelle con metodo rapido
1. MSRV (Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis Medium)
Con tale sistema vengono individuate solo le salmonelle mobili,
le quali sono comunque la maggioranza (oltre il 99%).
Modalità di esecuzione:
- prelevare 25 g di polpa e liquido intervalvare di mollusco,
omogeneizzare in 225 ml di acqua peptonata tamponata. Incubare a 37
C (gradi) per 20 ore (fase di prearricchimento).
Precedere all'arricchimento selettivo direttamente in piastre di
MSRV secondo la seguente procedura:
- depositare tre gocce (0,1 ml circa) della coltura di
prearricchimento in punti separati (e lontani tra loro) della
superficie di una piastra di terreno MSRV senza spatolare
(effettuare 2 repliche),
- incubare, senza rovesciare la piastra, a 42 C (gradi) per 20-24
ore,
- osservare, intorno ai punti di deposizione delle gocce eventuali
aloni di crescita (il colore azzurro del terreno appare
leggermente rischiarato): essi sono dovuti a batteri mobili che si
riproducono bene nel terreno; gli aloni dovuti a sviluppo di
salmonelle sono di grandi dimensioni e spesso intercettato il bordo
della piastra. La semplice osservazione di un tale alone conferisce
alla prova una presuntività di presenza di salmonelle, mentre
l'assenza di aloni o la presenza di aloni molto ristretti (omega
minore di 1,5 cm) permette di escludere la presenza di salmonelle
mobili,
- in caso di positività, procedere comunque ad un accertamento
preliminare rapido sul materiale più esterno dell'alone mediante
il test di agglutinazione al lattice con sieri anti-H,
- lo stesso materiale più esterno dell'alone può essere prelevato
per le subcolture destinate alle prove di identificazione.
Terreno di coltura MSRV:
Triptosio g 4,59
Isdrolizzato di caseina (acido) g 4,59
Cloruro di sodio g 7,34
Potassio fosfato monobasico g 1,47
Cloruro di magnesio (anidro) g 10,93
Verde malachite ossalato g 0,037
Agar g 2,7
Acqua distillata q.b. a ml 1,000
pH 5,2 più o meno 0,2
La ricerca delle salmonelle può essere effettuata anche
utilizzando altri metodi rapidi equipollenti, reperibili in
commercio, che presentino lo stesso grado di precisione.
D) Determinazione delle biotossine algali PSP (Paralytic Shellfish
Poison)
1. PRINCIPIO
1.1 Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoneale di un
estratto di molluschi in topi adulti. La presenze di tossina PSP
provoca la morte degli animali.
2. MATERIALI
2.1 Si utilizzano topi albini di razza Swiss di peso compreso fra i
19 e 21 g. Se il peso è maggiore di 21 o minore di 19 si applica
il fattore di correzione del peso. Non si possono utilizzare topi
con peso maggiore a 23 g e topi già usati.
3. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
3.1 I molluschi da analizzare vengono puliti esternamente lavandoli
con acqua. Si aprono tagliando i muscoli adduttori e si rimuovono i
tessuti molli (polpa) del mollusco dalla conchiglia. Non si debbono
usare nè colore nè anestetici prima di aprire il mollusco e
bisogna evitare di danneggiare o tagliarne il corpo.
3.2 Circa 100-150 g di polpa vengono trasferiti su una retina di
plastica, dove vengono lasciati scolare 5'.
3.3 Si omogeneizza il campione in frullatore elettrico.
4. ESTRAZIONE DEL CAMPIONE
4.1 Si pesano 100 g di materiale omogeneizzato.
4.2 Si aggiungono 100 ml di HC1 0,25 N, si agita e si verifica che
il pH non sia compreso fra 2 e 2,5.
4.3 La miscela viene portata ad ebollizione e si lascia bollire
lentamente per 5'.
4.4 Si lascia raffreddare a temperatura ambiente e si verifica
nuovamente il valore del pH che deve essere compreso fra 2 e 2,5.
Per abbassarlo si aggiunge HC1 5 N, agitando fino ad ottenere il
valore del pH voluto. Per alzare il pH si aggiunge alla miscela
NoaH 0,1 N lasciandola cadere a gocce ed agitando costantemente per
prevenire una alcalinizzazione locale e di conseguenza la
distruzione della tossina.
4.5 Si trasferisce la miscela in un cilindro graduato da 200 ml e
si porta a volume con acqua.
4.6 Si centrifuga la miscela a 3000 r.p.m. per 5'.
4.7 Il sopranatante viene trasferito in una beuta e si controlla di
nuovo il pH.
5. INOCULAZIONE DEGLI ANIMALI
5.1 Si inocula nel peritoneo di ciascun topo test 1 ml di estratto
acido.
5.2 Si annota con un cronometro il tempo all'inizio della
inoculazione e si osserva attentamente il topo per stabilire il
tempo di morte indicato dall'ultimo respiro.
5.3 Si può usare per l'iniziale determinazione un topo solo, ma
è preferibile usarne 2 o 3.
5.4. Se il tempo di morte o la mediana dei tempi di morte dei topi
e minore di 5 minuti si fa una diluizione per ottenere un tempo di
morte compreso tra 5 e 7 minuti.
5.5 Se il tempo di morte di 1 o 2 topi a cui è stato iniettato
l'estratto non diluito risulta maggiore di 7 minuti, tre o più
topi devono essere inoculati per stabilire la tossicità del
campione.
5.6 Se è necessaria una elevata diluizione, si aggiusta il pH
della soluzione aggiungendo gocce di HC1 (0,1 o 0,01 N) per portare
il pH ad un valore tra 2 e 2,5.
5.7 Si inoculano tre topi con la diluizione che da un tempo di
morte di 5-7 minuti.
6. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
6.1 Si determina il tempo mediano di morte dei topi tenendo
presente anche quelli sopravvissuti e tramite la tabella 2 si
determinano i corrispondenti valori di unità topo.
6.2 Se il peso degli animali è minore di 19 g o maggiore di 21 g
si opera una correzione per ciascun topo moltiplicando le unità
topo corrispondenti al tempo di morte per il fattore di correzione
del peso per quel topo ricavato in base alla tabella 3 ed infine si
sceglie il valore mediano delle unità topo corrette per gruppo
(considerare il tempo di morte dei sopravvissuti come maggiore di
60 minuti o equivalente e minore di 0,875 U.T. nel calcolo della
mediana).
6.3 Si convertono le U.T. in microgrammi di tossina/ml
moltiplicandole per il valore del fattore di conversione (C.F.).
Quest'ultimo è dato dal rapporto tra microgrammi di tossina PSP
della soluzione di riferimento inoculata in peritoneo e l'U.T.
corretta:
microgrammi di tossina/100 g di polpa = (microgrammi/ml) x fattore
di diluizione x 200.
7. STANDARDIZZAZIONE DEL METODO BIOLOGICO
7.1 Preparare una soluzione standard di lavoro di PSP, utilizzando
una soluzione madre USA, fino ad ottenere una concentrazione di 1
microgrammi/ml. Si ottiene portando 1 ml di soluzione standard
madre a 100 ml con acqua distillata. Questa soluzione è stabile
numerose settimane a 3-4 C (gradi).
7.2 Calcolo del valore del C.F. (fattore di conversione).
7.2.1 Si diluiscono aliquote di 10 ml di soluzione standard di
lavoro ( 1 microgrammo /ml) con 10-15-20-25-30 ml di H2O. Il pH
delle diluizioni deve essere compreso fra 2 e 4 e non deve mai
superare 4,5.
7.2.2 Viene scelta quella diluizione che iniettata in tre o più
topi per via intraperitoneale alla dose di 1 ml determina la morte
degli animali in un tempo mediano di 5-7 minuti.
7.2.3 La diluizione scelta viene provata con variazioni di +1 ml di
H2O (ad esempio se 10 ml di standard diluiti con 25 ml di H2O
uccidono i topi in 5-7 minuti, si provano soluzioni diluite 10 + 24
e 10 + 26). Si inietta un gruppo di topi con 1 ml di ciascuna delle
2 o 3 diluizioni che determinano la morte nel tempo mediano di 5-7
minuti.
7.2.4 Si inietta una dose di 1 ml a ciascun topo per via
intraperitoneale e si determina il tempo di morte corrispondente al
tempo trascorso fra l'esecuzione della iniezione e l'ultimo respiro
del topo.
7.2.5 Si ripete la prova 1 o 2 giorni più tardi usando le
diluizioni preparate come sopra descritto, che differiscono per
variazioni di + 1 ml di H2O rispetto alla diluizione usata.
7.2.6 Si ripete poi l'intero test partendo con nuove diluizioni
ottenute dalla soluzione standard di lavoro (1 microgrammi/ml)
preparata fresca prima dell'uso.
7.2.7 Si calcola il tempo mediano di morte per ciascun gruppo di 10
topi utilizzati e per ciascuna delle diluizioni preparate. Se
tutti i gruppi di 10 topi iniettati con qualunque diluizione danno
tempi mediani di morte minore di 5 o maggiore di 7 minuti non si
tiene conto dei risultati di questa diluizione nei calcoli
successivi. D'altra parte, se anche per uno solo dei gruppi di 10
topi iniettati con una qualsiasi diluizione si verifica un tempo
mediano di morte compreso tra 5 e 7, minuti si includono nei
calcoli tutti i gruppi di 10 topi usati con questa diluizione,
anche se alcuni dei tempi mediani di morte sono minori di 5 o
maggiori di 7 minuti.
7.2.8 Dal tempo mediano di morte per ciascun gruppo di 10 topi di
ciascuna delle diluizioni selezionate si determina il tempo mediano
di U.T./ml tramite la tabella 2.
7.2.9 Si dividono i microgrammi di tossina calcolati per 1 ml per
le U.T./ml al fine di ottenere il fattore di conversione (C.F.) il
quale esprime i microgrammi di tossina equivalenti ad 1 U.T.
7.2.10 Si calcola il valore medio di C.F. e si usa tale valore come
punto di riferimento per controllare la prove di routine.
7.2.11 I valori di C.F. possono variare in modo significativo
nell'ambito dello stesso laboratorio se le tecniche e i topi non
sono ripidamente controllati.
8. USO DELLO STANDARD PER PROVE DI ROUTINE SUI MOLLUSCHI
8.1 Si controlla periodicamente il valore del C.F.
8.1.1 Se i molluschi sono analizzati meno di una volta a settimana,
si determina il valore del C.F. in ciascun giorno in cui sono
effettuate le prove, iniettando 5 topi con opportune diluizioni
dello standard di lavoro.
8.1.2 Se le prove vengono effettuate in giorni diversi nell'ambito
di una settimana, è necessario fare soltanto un controllo
settimanale con diluizioni di standard tali che il tempo mediano di
morte risulti compreso tra 5 e 7 minuti. Il valore del C.F. cosi
determinato dovrebbe essere compreso nel valore medio del C.F. più
o meno 20 %.
8.1.3 Se il controllo non cade in questo ambito, si completa un
gruppo di 10 topi (aggiungendone 5 ai 5 già iniettati) e si
inocula un secondo gruppo di 10 topi con la stessa diluizione di
standard.
8.1.4 Si media il valore del C.F. per il secondo gruppo con quello
del primo e si prende il risultato come nuovo valore di C.F.
Variazione del C.F. maggiore del 20% rappresentano una
significativa modificazione della risposta dei topi alla tossina o
alle tecniche di laboratorio. Modificazioni di questo tipo
richiedono un cambiamento del valore del C.F.
8.1.5 Controlli ripetuti del valore di C.F. di solito conducono a
risultati compresi in una variazione del più o meno 20%. Se si
riscontrano frequentemente variazioni più ampie sarebbe opportuno
procedere ad un controllo di tutta la tecnica prima di continuare
con le normali prove di routine.
DETERMINAZIONE TOSSINE IDROSOLUBILI - P.S.P. TABELLA 2

| Tempo di morte | U.T. | Tempo di morte | U.T. |
| (minuti) | | (minuti) | |
| | | | |
| | | | |
| 1:00 | 100 | 5:00 | 1,92 |
| 10 | 66,2 | 05 | 1,89 |
| 15 | 38,3 | 10 | 1,86 |
| 20 | 26,3 | 15 | 1,83 |
| 25 | 20,7 | 20 | 1,80 |
| 30 | 16,5 | 30 | 1,74 |
| 35 | 13,9 | 40 | 1,69 |
| 40 | 11,9 | 45 | 1,67 |
| 45 | 10,4 | 50 | 1,64 |
| 50 | 9,33 | | |
| 55 | 8,42 | 6:00 | 1,60 |
| | | 15 | 1,54 |
| 2:00 | 7,67 | 30 | 1,48 |
| 05 | 7,04 | 45 | |
| 10 | 6,52 | | |
| 15 | 6,06 | 7:00 | 1,39 |
| 20 | 5,66 | 15 | 1,35 |
| 25 | 5,32 | 30 | 1,31 |
| 30 | 5,00 | 45 | 1,28 |
| 35 | 4,73 | | |
| 40 | 4,48 | 8:00 | 1,25 |
| 45 | 4,26 | 15 | 1,22 |
| 50 | 4,06 | 30 | 1,20 |
| 55 | 3,88 | 45 | 1,18 |
| | | | |
| 3:00 | 3,70 | 9:00 | 1,16 |
| 05 | 3,57 | 30 | 1,13 |
| 10 | 3,43 | | |
| 15 | 3,31 | 10:00 | 1,11 |
| 20 | 3,19 | 30 | 1,09 |
| 25 | 3,08 | | |
| 30 | 2,98 | 11:00 | 1,075 |
| 35 | 2,28 | 30 | 1,06 |
| 40 | 2,79 | | |
| 45 | 2,71 | 12:00 | 1,05 |
| 50 | 2,63 | | |
| 55 | 2,56 | 13 | 1,03 |
| | | 14 | 1,015 |
| 4:00 | 2,50 | 15 | 1,000 |
| 05 | 2,44 | 16 | 0,99 |
| 10 | 2,38 | 17 | 0,98 |
| 15 | 2,32 | 18 | 0,972 |
| 20 | 2,26 | 19 | 0,965 |
| 25 | 2,21 | 20 | 0,96 |
| 30 | 2,16 | 21 | 0,954 |
| 35 | 2,12 | 22 | 0,948 |
| 40 | 2,08 | 23 | 0,942 |
| 45 | 2,04 | 24 | 0,937 |
| 50 | 2,00 | 25 | 0,934 |
| 55 | 1,96 | 30 | 0,917 |
| | | 40 | 0,898 |
| | | 60 | 0,875 |
| | | | |
TABELLA 3
DETERMINAZIONE TOSSINE IDROSOLUBILI - P.S.P.

| Fattori di correzione del peso |
| |
| Peso del topo (g) | Unità topo |
| | |
| | |
| 10 | 0,50 |
| 10,5 | 0,53 |
| 11 | 0,56 |
| 11,5 | 0,59 |
| 12 | 0,62 |
| 12,5 | 0,65 |
| 13 | 0,675 |
| 13,5 | 0,70 |
| 14 | 0,73 |
| 14,5 | 0,76 |
| 15 | 0,785 |
| 15,5 | 0,81 |
| 16 | 0,84 |
| 16,5 | 0,86 |
| 17 | 0,88 |
| 17,5 | 0,905 |
| 18 | 0,93 |
| 18,5 | 0,95 |
| 19 | 0,97 |
| 19,5 | 0,985 |
| 20 | 1,000 |
| 20,5 | 1,015 |
| 21 | 1,03 |
| 21,5 | 1,04 |
| 22 | 1,05 |
| 22,5 | 1,06 |
| 23 | 1,07 |
| | |
E) Determinazione delle tossine DSP (Diarrhetic Shellfish Poison)
1. PRINCIPIO
1.1 Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoneale
dell'estratto dell'epatopancreas di molluschi in topi adulti.
La presenza di tossina DSP provoca negli animali malessere generale
e morte.
2. MATERIALI
2.1 Si utilizzano topi albini di razza Swiss del peso di 18-20 g.
2.2 Introdurre gli animali nelle strutture di stabulazione nelle
stesse condizioni ambientali in cui si svolgerà il saggio per
almeno cinque giorni prima dello stesso.
3. ESTRAZIONE DELLA TOSSINA
3.1 Pulire esternamente con acqua una quantità opportuna di
molluschi, prelevare g 25 di epatopancreas e trasferirli su una
retina di plastica dove vengono lasciati sgocciolare per 5 minuti.
3.2 Omogeneizzare gli epatopancreas con omogeneizzatore a
cavitazione; pesare g 20 di omogeneizzato ed estrarli con ml 100 di
acetone mantenendoli per 2 minuti a temperatura ambiente.
3.3 Filtrare per carta da filtro comune.
3.4 Riprendere il residuo rimasto sul filtro e ripetere le
operazioni descritte nei punti 3.2 e 3.3 per altre due volte,
estraendo con 50 ml di acetone ogni volta.
3.5 Riunire i tre estratti e far evaporare l'acetone in evaporatore
rotante a 30-40 C (gradi). Non è necessario eliminare anche
l'acqua residua.
3.6 Risospendere il residuo in ml 10-15 di acqua distillata.
3.7 Estrarre la sospensione acquosa con ml 50 di etere etilico.
Nel caso si formi, all'interfaccia delle due fasi, un'emulsione non
risolubile, questa va separata, addizionata con 10 ml di acqua e
riestratta con 25 ml di etere; l'eventuale ulteriore emulsione
viene eliminata. Riunire le fasi eteree.
3.8 Ripetere l'operazione del punto 3.7 per due volte lavando con
piccole quantità di acqua; riunire gli estratti eterei ed
evaporare.
3.9 Sospendere il residuo in ml 4 di Tween 60 all'1%. Curare la
formazione di un'emulsione omogenea e senza grumi, eventualmente
con l'uso di ultrasuoni.
4. INOCULAZIONE DEGLI ANIMALI
4.1 Pesare i topi ed annotare il peso di ciascuno, indi inoculare
intraperitoneo tre topi con 1 ml della sospensione dell'estratto.
4.2 Tenere gli animali in osservazione per 6 ore, controllando il
loro stato ogni 15 minuti. Assumere come tempo di sopravvivenza
l'intervallo tra l'inoculazione e l'ultimo controllo in cui
risultavano vivi.
5. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
5.1 Correggere in funzione del pese dei singoli topi i relativi
tempi di sopravvivenza osservati, moltiplicandoli per i fattori di
correzione riportati nella tabella 4.
5.2 Se almeno due topi hanno un tempo di sopravvivenza inferiore
alle 5 ore il saggio risulta positivo.
5.3 Se almeno due topi hanno un tempo di sopravvivenza superiore
alle 5 ore il saggio risulta negativo.
5.4 Se si verifica quanto previsto al punto 5.3, ma il terzo topo ha
un tempo di sopravvivenza inferiore alle 3 ore, il saggio viene
ripetuto su 4 topi, aumentando in proporzione la quantità di
epatopancreas di partenza ed il volume della soluzione di Tween. Si
determina la mediana dei sette tempi di sopravvivenza registrati
complessivamente: se questa è inferiore alle 5 ore il saggio si
considera positivo.
TABELLA 4
FATTORI DI CORREZIONE

| Peso del topo | Fattore |
| (g) | |
| | |
| | |
| 18,0 | 1,14 |
| 18,5 | 1,10 |
| 19,0 | 1,06 |
| 19,5 | 1,03 |
| 20,0 | 1,00 |
| | |
F) Metodo di analisi per la determinazione del mercurio nei
molluschi bivalvi (Decisione 90/515/CEE della Commissione del 26
settembre 1990)
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il metodo di analisi consente la determinazione del contenuto
totale di mercurio nei molluschi.
2. PRINCIPIO
Il campione è mineralizzato con miscela solfonitrica; lo ione
mercurio è ridotto allo stato metallico con cloruro stannoso ed
estratto dalla soluzione in corrente di aria. I vapori di mercurio
sono convogliati in cella cilindrica con finestra di quarzo posta
nel cammino ottico di uno spettrofotometro per assorbimento atomico
e la determinazione si esegue misurando l'assorbimento alla
lunghezza d'onda di 253,6 nanometri.
3. APPARECCHIATURA
3.1 Omogenizzatore ad immersione in acciaio inox
3.2 Digestore costituito da un pallone della capacità di 100 ml
munito di collo smeriglio su cui è innestato un refrigerante in
vetro borosilicato (fig. 1).
3.3 Dispositivo per la riduzione del mercurio e trascinamento dei
vapori, costituito da un sistema chiuso di gorgogliamento e di
una pompa peristaltica per la generazione della corrente d'aria
(fig.2).
3.4 Spettrofotometro per assorbimento atomico munito di cella
cilindrica con finestra di quarzo avente cammino ottico di 100 mm e
diametro interno di 20 mm, e di lampada a mercurio (a scarica o a
catodo cavo).
4. REATTIVI
4.1. Soluzione di riferimento contente 1000 microgrammi/ml di
mercurio
Diluire questa soluzione, al momento dell'uso, con acido
solforico 1 N in modo da ottenere una concentrazione di 1
microgrammi/ml di mercurio.
4.2. Miscela solfonitrica (1 : 1)
Miscelare volumi uguali di acido nitrico concentrato 65% ed
acido solforico concentrato 98%.
4.3 Soluzione di cloridrato di idrossilamina (concentrazione 12%
p/v)
Sciogliere 12 g di cloruro di sodio e 12 g di cloridrato di
idrossilamina in acqua e portare a volume di 100 ml.
4.4 Soluzione di cloruro stannoso biidrato (concentrazione 10% p/v)
Sciogliere 10 g di cloruro stannoso biidrato in acido solforico
1 N (4.5) e portare a volume di 100 ml con lo stesso acido
solforico.
4.5 Soluzione di acido solforico 1 N
Diluire opportunamente acido solforico al 98% puro per analisi
di metalli in tracce.
5. PROCEDIMENTO
5.1 Mineralizzazione
5.1.1 Pesare direttamente nel pallone del digestore circa 3 g (con
la precisione di più o meno 0,01 g) del campione accuratamente
omogeneizzato ed aggiungere 10 ml di miscela solfonitrica (4.2).
Agitare e lasciare a temperatura ambiente per circa 10 minuti e
riscaldare quindi cautamente con microfiamma regolandola
temperatura in modo da mantenere la soluzione solfonitrica sempre
in ebollizione incipiente. Proseguire il riscaldamento fino ad
ottenere una soluzione limpida. Raffreddare il pallone ed
aggiungere dall'alto del refrigerante 30-40 ml di acqua. Far
bollire per altri 20 minuti per l'eliminazione degli ossidi di
azoto. Raffreddare, lavare il refrigeratore con 20 ml di
acqua distillata, trasferire in pallone tarato da 100 e portare a
volume con acqua distillata.

----&gt; Vedere Figura a Pag. 41 della G.U. &lt;----

5.2 Determinazione quantitativa
5.2.1 Lettura spettrofotometrica
Predisporre lo strumento nelle seguenti condizioni operative:
Lunghezza d'onda: 253,6 nanometri.
Lettura: con registratore
trasferire 5 ml di soluzione del campione mineralizzato nella
boccia di gorgogliamento. Aggiungere 0,5 ml cloridrati di
idrossilamina e collegare il paltoncino al sistema di
gorgogliamento. Versare dall'imbuto di carico 1 ml di cloruro
stannoso ed iniziare immediatamente il gorgogliamento dell'aria.
Registrare il segnale dell'assorbanza che cresce gradatamente fino
ad un massimo e quindi diminuisce lentamente; effettuare la
lettura in corrispondenza del massimo.
5.2.2 Curva di taratura
Trasferire in 5 palloni tarati da 100 ml, rispettivamente, 10 ml
di miscela solfonitrica e 0 ml - 1 ml - 2 ml - 3 ml - 4 ml di
soluzione di riferimento contenente 1 microgrammo/ml di mercurio.
Portare al volume di 100 ml con acqua distillata ciascun
palloncino.
Eseguire su queste soluzioni la misura dell'assorbanza come
descritto al punto 5.2.1.
Con i valori ottenuti si costruisce la curva di taratura.
5.2.3 Calcolo
Riportare sulla curva di taratura la misura dell'assorbanza
eseguita al punto 5.2.1 e calcolare la concentrazione del mercurio
nella soluzione. Il valore ottenuto diviso per il peso del campione
prelevato (5.1.1) espresso in grammi dà il contenuto in mercurio
dei molluschi espresso in microgrammi per grammo.
G) Metodo di analisi per la determinazione del piombo nei molluschi
bivalvi (Decisione 90/515/CEE della Commissione del 26 settembre
1990)
1. OGGETTO E CAMPO DI APPLICAZIONE
Il metodo di analisi consente la determinazione del contenuto
totale di piombo nei molluschi.
2. PRINCIPIO DEL METODO
Il contenuto totale di piombo nei molluschi è determinato
mediante la Spettrofotometria di assorbimento atomico, in fornetto
di gratifica. Allo scopo di ridurre gli effetti interferenti della
matrice durante la misura spettrofotometrica è utilizzato il
metodo delle addizioni standards.
La mineralizzazione del campione è condotta mediante incenerimento
a secco.
3. REATTIVI
3.1 Acido nitrico 65% puro per analisi, metalli in tracce
3.2 Acido cloridrico 37%
3.3 Acido nitrico 65%
3.4 Fosfato biacido di ammonio (NH4H2PO4)
3.5 Nitrato di magnesio (Mg(NO3) 2)
3.6 Modificante di matrice: sciogliere 4 g di fosfato biacido di
ammonio (3.4) e 0,2 g di nitrato di magnesio (3.5) in acqua a
portare a 100 ml.
3.7 Soluzione concentrata di riferimento di piombo (100 mg Pb/L);
sciogliere 159,9 mg di nitrato di piombo (Pb (NO3) 2) in acqua in
un pallone tarato da 1000 ml, aggiungere 10 ml di acido nitrico
(3.1), portare al volume di 1L ed agitare.
Mantenere la soluzione in bottiglia di vetro borosilicato.
3.8 Soluzione di riferimento di piombo (1 mg Pb/L): pipettare 1,0
ml della soluzione di riferimento (3.7), in un pallone tarato da
100 ml. Aggiungere 1 ml di acido nitrico (3.1) e portare al volume
di 100 ml con acqua ed agitare.
3.9 Soluzione diluita di riferimento di piombo (10,0 e 20,0
microgrammi Pb/L): pipettare 1,0 e 2,0 ml della soluzione di
riferimento (3.8) in palloni tarati da 100 ml, aggiungere a
ciascuno 1 ml di acido nitrico (3.1) e portare al volume di 100 ml
con acqua ed agitare.
Mantenere la soluzione in bottiglia di polietilene.
Preparare le soluzioni fresche ogni giorno.
3.10 Argon ultrapuro.
4. APPARECCHIATURE, VETRERIA E MATERIALE VARIO
4.1 Omogeneizzazione
4.2 Capsule di platino a fondo piatto, o capsule di quarzo
4.3 Piastra riscaldante, termoregolabile
4.4 Forno a muffola, rivestito internamente in quarzo, con
programmatore elettronico di temperatura
4.5 Bilancia analitaca
4.6 Palloni tarati, capacità 100 e 1000 ml, con tappi a smeriglio
in vetro
4.7 Pipette tarate, di volumi differenti (da 50 microgrammiL e 5
ml) con puntali di plastica
4.8 Bottiglie di polietilene, capacità 100 ml
4.9 Spettrofotometro ad assorbimento atomico, munito di fornace di
grafite, correttore del fondo, autocampionatore con cuvette in
teflon, stampante, lampada a catodo cavo per piombo, tubi di
grafite pirolizzati piattaforme del L'vov ecc.
Nota
Tutta la vetreria deve essere di vetro borosilicato o vetro di
qualità simile. Prima dell'uso la vetreria deve essere lavata a
caldo con una soluzione di acido cloridrico (3.2) 1 : 3 (V/V),
quindi risciacquata con acqua distillata, trattata a caldo con una
soluzione di acido nitrico (3.3) 1 :3 (V/V), e infine risciacquate
con acqua bidistillata.
La vetreria deve essere asciugata e conservata in un luogo al
riparo da possibili contaminazioni. Le cuvette in teflon devono
essere trattate nello stesso modo.
5. PRETRATTAMENTO DEL CAMPIONE
5.1 Campione
Il campione deve essere conservato in modo tale che la sua
composizione non sia alterata per disidratazione, condensazione o
alterazione.
5.2 Campione per analisi
Il campione per l'analisi deve essere rappresentativo
dell'interno campione. Esso deve essere preparato rapidamente
macinando 100 g di prodotto fino a completa omogeneizzazione.
6. PROCEDURA
6.1 Incenerimento a secco
2,00 g del prodotto accuratamente omogeneizzato e pesato in
capsula di platino, sono sottoposti ad essiccamento e quindi a
carbonizzazione su piastra riscaldante in maniera lenta e graduale
al fine di evitare perdite per proiezione di matrice. Il residuo
carbonioso, trasferito in muffola, viene incenerito per 8 ore alla
temperatura di 400 + 10 C (gradi)
Dopo tale trattamento le ceneri devono risultare perfettamente
bianche. Nel caso contrario il residuo, trattato con poche gocce di
HNO3 e nuovamente essiccato. Viene sottoposto ad un nuovo ciclo di
incenerimento per almeno 4 ore.
Le ceneri riprese con 1 ml di HNO3, (3.1), vengono riscaldate fino
a completa dissoluzione trasferite in un palloncino tarato da 50 ml
e portare a volume con H2O bidistillata.
6.2 Bianco
Condurre l'intero procedimento di mineralizzazione, omettendo la
porzione del campione da analizzare.
6.3 Determinazione spettrofotometrica
6.3.1 Condizioni strumentali
La misura strumentale è eseguita mediante uno Spettrofotometro
di assorbimento atomico, munito di fornace di grafite ed
autocampionatura, gestiti da un computer completo di stampante
grafica.
I parametri strumentali per il piombo sono i seguenti:
Misura strumentale: Assorbanza
Metodi di calibrazione: Addizioni standards
Modo di misura: Area di picco
Fenditura (nm): 0,7
Lunghezza d'onda: 283,3
Introduzione del campione: campionatore automatico
Tempo di misura, durante
l'atomizzazione (sec.): 3
Repliche: 3
Correttore del fondo: inserito durante
l'atomizzazione
Tubicini pirolitici di grafite con piattaforma del L'vov
Parametri del fornetto di grafite
Stadio Temperatura Rampa Tempo Flusso gas
Numero ('C) Isoterma (ml/min)
1 90 10 10 300
2 130 10 20 300
3 450 15 20 300
4 800 15 20 300
5 1800 0 3 0
6 2500 2 2 300
7 20 2 2 300
Parametri dell'autocampionatore
Volumi (microgrammiL)
Standard Campione Bianco Modifican.
(20 microgrammiL Pv) di matrice
Mg (NO3) 2+NH2PO4
Bianco --- --- 40 5
Campione --- 20 20 5
1 addizione 10 20 10 5
2 addizione 20 20 --- 5
6.3.2 Misura strumentale
Se lo Spettrofotometro dispone di un computer, la concentrazione
del piombo nella soluzione del campione è calcolata direttamente
dallo strumento con il metodo delle aggiunte standards, e riportata
sulla stampante.
Se lo strumento non dispone di un computer, è necessario costruire
la retta di taratura con il metodo della aggiunte standards,
riportando in ascisse il valore di concentrazione e in ordinata le
assorbanze corrispondenti.
Riportati i tre punti corrispondenti alle tre letture,
rispettivamente del campione, del campione più la prima aggiunta e
del campione più la seconda aggiunta, costruire la retta passante
per i tre punti e prolungarla fino ad intercettare l'asse della X.
Il valore di concentrazione corrispondente all'intercetta
rappresenta il valore di concentrazione di piombo, nella soluzione
del campione.
Nota
Il metodo delle aggiunte standards è applicato correttamente
se i valori di assorbanza del campione e del campione con le due
aggiunte rientrano nel campo della linearità.
6.3.3 Calcolo
Il contenuto del piombo nel campione è calcolato mediante la
seguente formula:
c . V
C= --------
1000 . m
C= contenuto di piombo espresso in mg/kg del campione analizzato
c= contenuto di piombo espresso in microgrammi/L nella soluzione
del campione
V= il volume della soluzione espresso in ml
m= la porzione del campione per l'analisi espressa in grammi
7. Accuratezza
L'accuratezza del metodo è in funzione della disponibilità di
adeguati materiali standards di riferimento. Qualora non siano
disponibili materiali simili alla matrice alimentare da analizzare
è necessario ricorrere a prove di recupero sulla matrice
opportunatamente addizionata dell'analista.
8. Limite di rivelabilità
Il limite di rivelabilità del metodo, utilizzando il
procedimento di incenerimento a secco, per una porzione di campione
di 5 g, è pari a 0,020 mg/kg.
9. Riproducibilità
a) per concentrazioni fino a 100 microgrammi/kg il CV è inferiore
a 0,20
b) per concentrazioni tra 100 microgrammi/kg e 1000 microgrammi/kg
il CV è inferiore a 0,15;
c) per concentrazioni maggiori di 1000 microgrammi/kg il CV è
inferiore a 0,10.
H) Modalità di costituzione del campione di molluschi bivalvi
destinato alle analisi
1. Il campione di molluschi bivalvi da sottoporre ad analisi deve
essere costituito da 50-300 invertebrati per aliquota in relazione
al tipo di analisi ed alla specie di molluschi oggetto del
prelievo, con criterio inverso alla dimensione dei molluschi.
2. Ciascuna delle aliquote di cui al punto 1 può essere utilizzata
per un solo tipo di accertamento analitico (microbiologico,
chimico, biotossicologico, fisico).
3. I campioni dei molluschi bivalvi devono essere mantenuti, dal
momento del prelievo al momento in cui viene iniziata la prima
analisi, a temperatura non superiore a +6 C (gradi).
4. I controlli microbiologici vengono eseguiti con le modalità
previste dall'art. 4 del decreto legislativo 3 marzo 1993, n. 123.