Serie Generale n. 37 del 14-2-1996
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 31 gennaio 1996
Lotta obbligatoria contro il marciume anulare della patata (Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus). (GU Serie Generale n.37 del 14-02-1996)

IL MINISTRO DELLE RISORSE
AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
Vista la legge 18 giugno 1931, n. 987, recante disposizioni per la
difesa delle piante coltivate e dei prodotti agrari dalle cause
nemiche e sui relativi servizi, e successive modificazioni;
Visto il regolamento per l'applicazione della predetta legge,
approvato con regio decreto 12 ottobre 1933, n. 1700 e modificato con
regio decreto 2 dicembre 1937, n. 2504;
Vista la direttiva del Consiglio delle Comunità economiche europee
del 21 dicembre 1976, n. 77/93/CEE, concernente le misure di
protezione contro l'introduzione negli Stati membri di organismi
nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali, e successive
modificazioni;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 24 luglio 1977, n.
616, in virtù del quale è stata confermata allo Stato la
determinazione degli interventi obbligatori in materia fitosanitaria
(art.71, comma 1, lettera c));
Visto il decreto legislativo n. 536 del 30 dicembre 1992 che, in
attuazione della direttiva n. 91/683/CEE, istituisce il Servizio
fitosanitario nazionale;
Visto l'art. 20, comma 1, della legge 16 aprile 1987, n. 183;
Vista la direttiva del Consiglio del 24 giugno 1980, n. 80/665/CEE,
concernente le misure contro il marciume anulare della patata;
Visto il decreto ministeriale 5 novembre 1982, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale n. 326 del 26 novembre 1982, concernente la lotta
obbligatoria contro il marciume anulare della patata (Corynebacterium
sepedonicum);
Vista la direttiva n. 93/85/CEE del Consiglio del 4 ottobre 1993,
concernente la lotta contro il marciume anulare della patata;
Considerata la necessità di conformarsi alla direttiva n.
93/85/CEE sopraindicata che prevede la lotta contro il Clavibacter
michiganensis (Smith) Davis et al., ssp. sepedonicus (Spieck Kotth.)
Davis et al. (precedente denominazione: Corynebacterium sepedonicum),
agente causale della malattia batterica denominata "marciume anulare
della patata";
Considerato il rischio esistente per la coltivazione della patata,
se non si attuano interventi efficaci contro il marciume anulare
della patata, per evitare la sua introduzione e diffusione, per
localizzarlo e, qualora venisse individuato, per prevenirne la
disseminazione e combatterlo ai fini della sua eradicazione;
Decreta:
Art. 1.
La lotta contro Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, agente
del marciume anulare della patata è obbligatoria e consiste nella
attuazione di interventi in territorio italiano atti a:
a) localizzarlo e determinarne la distruzione;
b) prevenire la comparsa e la disseminazione;
c) qualora venga individuato, prevenirne la disseminazione e
combatterlo ai fini della sua eradicazione.

Art. 2.
I servizi fitosanitari regionali provvedono ad effettuare indagini
sistematiche riguardo all'organismo nocivo su tuberi e, se del caso,
su piante di patata (Solanum tuberosum L.) per confermare l'assenza
di detto organismo.
Per queste indagini, vanno prelevati campioni di tuberi-seme e di
tuberi di patata destinati ad altri usi, preferibilmente da partite
immagazzinate, sottoponendoli a prove di laboratorio utilizzando il
metodo di cui all'allegato I per l'individuazione e la diagnosi
dell'organismo nocivo. Se del caso, si può inoltre effettuare su
altri campioni un'ispezione visiva.
Nel caso di piante, queste indagini devono essere effettuate con i
metodi idonei ed i campioni sottoposti alle opportune prove ufficiali
o condotte sotto controllo ufficiale.
Il Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
provvede a definire le modalità di campionamento in base a fondati
principi scientifici e statistici ed ai dati biologici relativi
all'organismo nocivo, tenendo altresì conto dei sistemi regionali di
produzione della patata.
Il numero dei campionamenti effettuati ed i risultati di dette
indagini devono essere comunicati al servizio fitosanitario centrale
entro la fine di ogni anno solare.

Art. 3.
Ogni qualvolta nel territorio di una regione si sospetti o venga
confermata la presenza dell'organismo nocivo nelle piante e nei
tuberi-seme o nei tuberi raccolti, immagazzinati o commercializzati,
il servizio fitosanitario regionale deve immediatamente segnalare il
caso al servizio fitosanitario centrale.

Art. 4.
Qualora abbia luogo una manifestazione sospetta, il servizio
fitosanitario regionale competente per territorio provvede ad
effettuare prove di laboratorio ufficiali utilizzando il metodo di
cui all'allegato I e secondo quanto disposto nell'allegato II, punto
1, al fine di confermare o smentire la manifestazione sospetta; nel
primo caso si applicano le disposizioni dell'allegato II, punto 2.
Per i casi sospetti di cui al primo comma, nei quali siano stati
individuati sintomi diagnostici visivi della malattia, oppure, sia
risultata positiva una prova di immunofluorescenza quale specificata
nell'allegato I, o un'altra prova idonea, i servizi fitosanitari
regionali competenti per territorio, in attesa dei risultati delle
analisi:
vietano il movimento di tutte le partite o spedizioni da cui sono
stati prelevati i campioni, a meno che non avvenga sotto il controllo
dei servizi regionali stessi e purchè sia stata accertata
l'inesistenza di rischi effettivi di disseminazione dell'organismo
nocivo;
attuano interventi opportuni per risalire all'origine della
manifestazione sospetta;
introducono altri provvedimenti cautelativi commisurati al rischio
stimato, onde scongiurare la disseminazione dell'organismo nocivo.
Tali provvedimenti possono comprendere in particolare il controllo
ufficiale del trasporto di tutti gli altri tuberi o piante entro o da
qualsiasi impianto associato alla manifestazione sospetta.

Art. 5.
Qualora le prove di laboratorio ufficiali o condotte sotto
controllo ufficiale, utilizzando il metodo di cui all'allegato I,
confermino la presenza dell'organismo nocivo in un campione di
tuberi, piante o parti di piante, i servizi fitosanitari regionali
sulla base di fondati principi scientifici, dei dati biologici
relativi all'organismo nocivo e dei sistemi particolari di
produzione, lavorazione e commercializzazione regionali:
dichiarano contaminati i tuberi o le piante, una spedizione e/o
una partita, i macchinari, i veicoli, i battelli, il magazzino, o
relative parti, nonchè qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali
di imballaggio, da cui è stato prelevato il campione e, se del caso,
il luogo o i luoghi di produzione e l'appezzamento o gli appezzamenti
dove sono stati raccolti i tuberi o le piante;
determinano, tenuto conto delle disposizioni dell'allegato III,
punto 1, l'entità della contaminazione probabile avvenuta tramite
contatto prima o dopo la raccolta o attraverso un nesso tra il ciclo
produttivo e la contaminazione dichiarata;
delimitano una zona in base alla dichiarazione di contaminazione
di cui al secondo comma, alla determinazione dell'entità della
contaminazione probabile di cui al terzo comma e alla potenziale
disseminazione dell'organismo nocivo, tenuto conto delle disposizioni
dell'allegato III, punto 2.

Art. 6.
I servizi fitosanitari regionali prescrivono che, se dei tuberi o
delle piante sono stati dichiarati contaminati ai sensi dell'art. 5,
secondo e terzo comma, le prove di cui all'art. 4, primo comma, vanno
fatte su scorte di patate che hanno una relazione clonale con quelle
contaminate.
Le prove sono eseguite sul numero di tuberi o piante necessario per
stabilire l'origine probabile dell'infezione e l'entità della
contaminazione probabile, preferibilmente secondo il grado di
rischio.
Una volta effettuate le prove si procede, se del caso, a una nuova
dichiarazione di contaminazione, alla determinazione dell'entità
della contaminazione probabile ed alla delimitazione di una zona, ai
sensi dell'art. 5.

Art. 7.
I servizi fitosanitari regionali vietano la messa a dimora di
tuberi o piante:
dichiarati contaminati ai sensi dell'art. 5, primo e secondo
comma, e dispongono che essi, sotto il loro controllo siano distrutti
o siano altrimenti eliminati, nel quadro di interventi sotto
controllo ufficiale, secondo quanto disposto nell'allegato IV, punto
1, sempre che sia stata accertata l'inesistenza di rischi
identificabili di disseminazione dell'organismo nocivo.
ritenuti probabilmente contaminati ai sensi dell'art. 5, primo e
secondo comma e, restando salvi i risultati delle prove, di cui
all'art. 6, per le scorte di piante in relazione clonale, provvedono
affinchè, sotto il loro controllo, detti tuberi o piante siano
destinati ad un'utilizzazione idonea o vengano eliminati secondo
quanto disposto nell'allegato IV, punto 2, in condizioni tali da
escludere qualsiasi rischio identificabile di disseminazione
dell'organismo nocivo.
I servizi fitosanitari regionali prescrivono che i macchinari, i
veicoli, i battelli, il magazzino, o relative parti, nonchè
qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali d'imballaggio,
dichiarati contaminati ai sensi dell'art. 5, primo e secondo comma, o
ritenuti probabilmente contaminati ai sensi dell'art. 5, primo e
secondo comma, siano distrutti, ovvero puliti e disinfettati secondo
metodi adeguati di cui all'allegato IV, punto 3. Dopo la
disinfezione, gli oggetti suindicati non sono più considerati
contaminati.
Fatte salve le misure messe in atto a norma del primo e secondo
comma del presente articolo, i servizi fitosanitari regionali
prescrivono una serie di interventi, quali sono specificati
nell'allegato IV, punto 4, da attuare nella zona delimitata ai sensi
dell'art. 5, primo e quarto comma.

Art. 8.
I servizi fitosanitari regionali dispongono che i tuberi-seme di
patata debbano essere conformi ai requisiti della direttiva 77/93/CEE
e derivare direttamente da materiali ottenuti nell'ambito di un
programma ufficialmente approvato nel quale sono risultati esenti
dall'organismo nocivo in prove ufficiali o eseguite sotto controllo
ufficiale, utilizzando il metodo di cui all'allegato I.
Dette prove sono eseguite:
sulle piante del materiale clonale di partenza, qualora la
contaminazione colpisca una produzione di tuberi-seme di patata;
sulle piante del materiale clonale di partenza o su campioni
rappresentativi dei tuberi-seme di base o degli stadi anteriori,
negli altri casi.

Art. 9.
È vietata la detenzione e la manipolazione dell'organismo nocivo.

Art. 10.
Fatte salve le disposizioni della direttiva 77/93/CEE, il servizio
fitosanitario centrale può autorizzare deroghe alle disposizioni
degli articoli 6, 7 e 9 del presente decreto per prove o scopi
scientifici, nonchè per lavori di selezione varietale, purchè tali
deroghe non compromettano il controllo dell'organismo nocivo e non
creino un rischio di disseminazione dello stesso.

Art. 11.
Il servizio fitosanitario centrale può adottare, qualora risultino
necessarie, disposizioni supplementari o più rigorose per combattere
l'organismo nocivo e per prevenirne la disseminazione, sempre che
siano conformi alle disposizioni della direttiva 77/93/CEE.
Le disposizioni addizionali previste al primo comma possono
comprendere la prescrizione che siano messi a dimora solo tuberi-seme
di patate ufficialmente certificati o ufficialmente controllati per
l'osservanza delle pertinenti norme fitosanitarie. Ciò si applica in
particolare qualora gli agricoltori siano autorizzati ad usare, nella
loro azienda, tuberi-seme di patate ottenute dal loro proprio
raccolto e quando siano messi a dimora tuberi-seme di produzione
propria.

Art. 12.
In caso di mancata applicazione delle disposizioni, di cui al
presente decreto, gli inadempienti saranno denunciati all'autorità
giudiziaria a norma dell'art. 500 del codice penale.

Art. 13.
Il decreto 5 novembre 1982 citato nelle premesse è abrogato.
Il presente decreto entrerà in vigore il giorno successivo alla
sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Roma, 31 gennaio 1996
Il Ministro: LUCHETTI

ALLEGATO I
METODO PER L'INDIVIDUAZIONE E LA DIAGNOSI DEL BATTERIO DEL MARCIUME
ANULARE DELLA PATATA, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL.
IN SERIE DI TUBERI DI PATATA
1. Rimozione del cono ombelicale
1.1. Lavare 200 tuberi in acqua corrente e rimuovere l'epidermide
dal cono ombelicale di ogni tubero usando un bisturi
regolarmente disinfettato o un pelapatate; la disinfezione
deve essere effettuata immergendo il pelapatate in una
soluzione di etanolo al 70% ed esponendolo alla fiamma.
1.2. Rimuovere accuratamente nuclei di tessuto dal cono ombelicale
con un bisturi o un pelapatate. Ridurre al minimo il tessuto
non vascolare in eccedenza. Una volta rimossi, i coni
ombelicali devono essere trattati entro 24 ore (paragrafo 3),
ovvero conservati a - 20 gradi centigradi per non più di due
settimane.
2. Indagine visiva ad accertare sintomi di marciume anulare
Dopo aver rimosso il cono ombelicale, tagliare
trasversalmente ogni tubero e verificare la presenza di
eventuali sintomi di marciume anulare.
Spremere i tuberi e osservare i tessuti macerati che
fuoriescono dal tessuto vascolare:
I primi sintomi sono una leggera trasparenza o
semitrasparenza del tessuto senza rammollimento attorno al
sistema vascolare, soprattutto in prossimità del cono
ombelicale. L'anello vascolare sul cono ombelicale può
presentare un colore leggermente più scuro del normale. Il
primo sintomo facilmente riscontrabile è rappresentato da
una colorazione giallastra dell'anello vascolare e da
masserelle di consistenza cascosa che fuoriescono da vasi del
tubero se quest'ultimo è spremuto leggermente. Tale
essudazione contiene milioni di batteri. In questa fase il
tessuto vascolare può assumere un colore bruno. Inizialmente
questi sintomi possono interessare solo una parte
dell'anello, non necessariamente vicino alla parte apicale,
ed in seguito estendersi gradualmente all'intero anello. Con
il progredire dell'infezione si verifica la distruzione del
tessuto vascolare; la corteccia esterna può separarsi da
quella interna. In fase di contaminazione avanzata compaiono
screpolature sulla superficie del tubero che, ai bordi, sono
spesso bruno-rossicce. In seguito, un'invasione fungina o
batterica può mascherare i sintomi rendendo difficile, se
non impossibile, la distinzione tra i sintomi di uno stadio
avanzato del marciume anulare e quelli di altre cancrene
della patata.
3. Preparazione di campioni per colorazione di Gram, colorazione
di immunofluorescenza (IF) e prove su melanzane
3.1. Omogeneizzare il cono ombelicale fino a completa macerazione
in un diluente di nota atossicità per il Corynebacterium
sepedonicum, ad esempio tampone fosfato isotonico (PBS) 0,05
M a pH 7,0 ad una temperatura inferiore a 30 gradi
centigradi; si consiglia di aggiungere un deflocculante
atossico e può essere altresì necessario un antischiumogeno
atossico (appendici 1 e 2). È da evitare un'eccessiva
macerazione.
3.2. Estrarre i batteri dall'omogeneizzato con uno dei metodi
seguenti (1):
A. a) Centrifugare per 10 minuti senza superare i 180 g.
b) Centrifugare il sopranatante per 10 minuti a non meno
di 4 000 g. Lasciar decantare e scartare il
sopranatante.
B. a) Lasciar riposare il macerato per 30 minuti affinchè i
frammenti di tessuto si depositino. Lasciar decantare
il sopranatante senza disturbare il sedimento.
b) Filtrare il sopranatante mediante carta filtrante
(Whatman n. 1) posta in un filtro di vetro sinterizzato
(n. 2 = 40 - 100 (micro)m) utilizzando una pompa a
vuoto. Raccogliere il filtrato in un tubo da
centrifuga. Lavare il filtro con un PBS sterile fino ad
un volume massimo di filtrato pari a 35 ml.
c) Centrifugare il filtro per 20 minuti a non meno di 4
000 g.
3.3. Sospendere il precipitato in un tampone fosfato sterile 0,01
M a pH 7,2 (appendice 2) per ottenere un volume totale pari a
circa 1 ml. Dividere in due parti uguali e conservarne una di
riferimento mediante congelamento a - 20 gradi centigradi (2)
o liofilizzazione. Dividere a metà l'altra parte,
utilizzando una parte per la prova di immunofluorescenza e di
colorazione Gram e l'altra per le prove sulle melanzane.

(1) Un metodo alternativo di estrazione è fornito da Dinesen, 1984.
(2) È provato (Janse e Van Vaerenberg, 1987) che il congelamento
più ridurre la vitalità del batterio Corynebacterium
sepedonicum. Si più ovviare al problema sospendendo il
precipitato in una soluzione di glicerolo al 10%.
3.4. È necessario che i controlli di C. sepedonicum che hanno
dato esito positivo e i campioni siano trattati separatamente
per evitare la contaminazione. Ciò è valido per i vetrini
di immunofluorescenza e per le prove sulle melanzane.
4. Colorazione di Gram
4.1. Preparare colorazioni di Gram per tutte le diluizioni di
precipitato (5.2.1) e per ogni tubero tagliato (2) che
presenti trasparenze, marciume o altri sintomi sospetti. I
campioni devono essere prelevati dal bordo di tessuti
infetti.
4.2. Preparare colorazioni di Gram per colture note di C.
sepedonicum e, se possibile, per tessuti contaminati
naturalmente (5.1).
4.3. Individuare i campioni che contengono cellule corineformi
Gram positive tipiche. In genere le cellule di C. sepedonicum
misurano 0,8-1,2 (micro)m di lunghezza e 0,4-0,6 (micro)m di
larghezza.
Un procedimento di colorazione adeguato è descritto
nell'appendice 3.
I preparati basati su contaminazioni naturali o su colture
isolate recenti mostrano spesso una predominanza di
bastoncelli coccoidi che di solito sono leggermente più
piccoli delle cellule di coltura in agar più vecchie. Nella
maggior parte dei terreni di coltura le cellule di C.
sepedonicum sono bastoncelli pleomorfi corineformi e possono
presentare reazioni Gram variabili. Le cellule sono singole e
si presentano a coppie con caratteristici "gomiti" tipici di
divisione angolata e, occasionalmente, in gruppi irregolari,
spesso definiti "cellule a palizzata" o "lettere cinesi".
5. Descrizione schematica delle prove IF
5.1. Utilizzare un antisiero con un ceppo noto di C. sepedonicum
ATCC 33113 (NCPPB 2137), O NCPPB 2140, la cui concentrazione
IF dovrebbe essere superiore a 1: 600. Includere un controllo
PBS nel vetrino di prova al fine di verificare se il
coniugato costituito da immunoglobulina anti-coniglio e
isotiocianato di fluoresceina (FITC) si combini in modo non
specifico con le cellule batteriche. Il Corynebacterium
sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) dovrebbe
essere utilizzato come controllo con antigene omologo in un
vetrino separato. Nei casi in cui sia possibile si dovrebbe
utilizzare tessuto contaminato naturalmente (conservato
mediante liofilizzazione o congelamento a - 20 gradi
centigradi ) come controllo analogo nello stesso vetrino
(figura 2).
5.2. Procedimento
5.2.1. Preparare tre diluizioni seriate 1 : 10 (10 1, 10 2, 10 3)
del precipitato finale in acqua distillata (figura 1).
5.2.2. Trasferire con una pipetta un volume standard di ogni
diluizione di precipitato sufficiente a coprire il pozzetto
del vetrino (circa 25 (micro)l), o un volume di sospensione
di C. sepedonicum (circa 10 6 cellule/ml) sufficiente per i
pozzetti di un vetrino multiplo, come illustrato nella figura
1.

----&gt; Vedere figure alle Pagg. 15 - 16 della G.U. &lt;----

5.2.3. Far seccare ad aria a 37 gradi centigradi circa e procedere
al fissaggi con una soluzione di etanolo al 95% o mediante
esposizione alla fiamma.
5.2.4. Coprire i vetrini con l'antisiero di C. sepedonicum alle
diluizioni raccomandate, ossia PBS 0,01 M a pH 7,2 (appendice
2), come illustrato in figura 1. (Utilizzare il PBS per il
controllo FTTC.) La diluizione di lavoro dell'antisiero
dovrebbe essere circa la metà della concentrazione IF.
Qualora si debbano prevedere altre diluizione di antisiero,
è necessario approntare un vetrino separato per ogni
diluizione.
5.2.5. Procedere all'incubazione in una camera umida a temperatura
ambientale per 30 minuti.
5.2.6. Sciacquare accuratamente con un PBS 0,01 M, a pH 7,2. Lavare
per 5 minuti con tre cambi di PBS 0,01 M, a pH 7,2.
5.2.7. Eliminare accuratamente l'umidità in eccesso.
5.2.8. Coprire ogni vetrino con un coniugato di FITC alla stessa
diluizione utilizzato per determinare la concentrazione e
procedere all'incubazione in una camera umida mantenuta al
buio a temperatura ambiente per 30 minuti.
5.2.9. Sciacquare e lavare come sopra indicato.
5.2.10. Applicare 5-10 (micro)l circa di tampone fosfato glicerinico
0,1 M a pH 7,6 (o con un mezzo di contrasto analogo che abbia
un pH non inferiore a 7,6) su ogni vetrino e chiudere con il
coprioggetti (appendice 2).
5.2.11. Esaminare con un microscopio predisposto per la luce
epifluorescente e dotato di filtri idonei per il coniugato
FITC. L'ingrandimento richiesto è dell'ordine di 400-1 000.
Esaminare il controllo ripetuto per i vetrini su 2 diametri
ad angolo retto e attorno al perimetro dei vetrini.
Individuare le cellule fluorescenti nei controlli positivi e
determinarne la concentrazione. Verificare la presenza di
cellule fluorescenti nel vetrino del controllo FTTC/PBS e,
qualora non ve ne siano, passare al vetrino di prova.
Determinare almeno in 10 campi di microscopio il numero medio
di cellule fluorescenti a morfologia tipica esistenti in ogni
campo e calcolare il numero di cellule per ml di precipitato
non diluito (appendice 4).
La prova di immunofluorescenza presenta alcuni inconvenienti.
- Nei precipitati di patata è possibile che si manifesti la
presenza di una popolazione di fondo di cellule
fluorescenti con morfologia atipica e di batteri saprofiti
a reazione incrociata simili per dimensioni e morfologia al
Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicum. Considerare
soltanto le cellule fluorescenti aventi dimensioni e
morfologia tipiche.
Vista la possibilità di reazioni incrociate, i campioni
che hanno dato un esito positivo alla prova di
immunofluorescenza dovrebbero essere sottoposti ad
un'ulteriore prova utilizzando un altro antisiero.
- Il limite tecnico di rivelazione di questo metodo si
attesta tra 10 3 e 10 4, cellule per ml di precipitato non
diluito, i campioni con conteggi di cellule IF tipiche al
limite di rivelazione risultano in genere negativi per il
C. m. ssp. sepedonicus, ma possono essere utilizzati per
le prove sulle melanzane.
Ogni campione che non presenta cellule fluorescenti
morfologicamente tipiche costituisce una prova di
immunofluorescenza negativa. I campioni si considerano non
contaminati da Clavibacter michiganensi ssp. sepedonicus.
La prova sulle melanzane non è richiesta.
Ogni campione che presenta cellule fluorescenti
morfologicamente tipiche costituisce una prova di
immunofluorescenza positiva.
I campioni che hanno dato esito positivo alla prova di
immunofluorescenza effettuata con entrambi gli antisieri sono
considerati potenzialmente contaminati dai Clavibacter
michiganensis ssp. sepedonicus.
La prova sulle melanzane è richiesta per tutti i campioni
potenzialmente contaminati.
6. Prova sulle melanzane
Per i dettagli relativi alla coltura si veda l'appendice 5.
6.1. Distribuire il precipitato di cui al precedente paragrafo 3.3
tra almeno 25 melanzane allo stadio fogliare (appendice 5),
utilizzando uno dei metodi seguenti (6.2, 6.3 o 6.4).
6.2. Inoculazione per incisione I
6.2.1. Mantenere ogni vaso in posizione orizzontale mediante un
supporto (per un vaso di 10 cm si può utilizzare un
blocchetto di polistirolo espanso con un incavo avente le
seguenti dimensioni: 5 cm di profondità, 10 cm di larghezza
e 15 cm di lunghezza (figura 3)). Fissare una striscia di
lamina di alluminio sterile tra lo stelo e il blocchetto in
ogni campione da esaminare. La pianta può essere tenuta
ferma mediante un nastro di gomma attorno al blocchetto.
6.2.2. Usando un bisturi praticare tra i cotiledoni e la prima
foglia un taglio longitudinale o leggermente diagonale della
lunghezza di 0,5-1,0 cm e di profondità pari a circa tre
quarti del diametro dello stelo.
6.2.3. Tenere l'incisione aperta con la punta del bisturi e
spennellare l'interno con l'inoculo mediante un idoneo
pennellino impregnato di precipitato. Distribuire il
precipitato rimanente tra le melanzane.
6.2.4. Sigillare il taglio con vaselina sterile utilizzando una
siringa da 2 ml.

----&gt; Vedere figura a Pag. 17 della G.U. &lt;----

6.3. Inoculazione per incisione II
6.3.1. Tenendo la pianta con due dita, versare mediante una pipetta
una goccia (5-10 (micro)l circa) del precipitato sospeso
sullo stelo tra cotiledoni e la prima foglia.
6.3.2. Usando un bisturi sterile, praticare un'incisione diagonale
(con un angolo di 5 gradi circa) lunga 1,0 cm e di
profondità pari a circa 2/3 dello spessore dello stelo. Il
taglio deve iniziare al disotto della goccia di precipitato.
6.3.3. Sigillare il taglio con vaselina sterile mediante siringa.
6.4. Inoculazione mediante siringa
6.4.1. Al fine di ridurne il turgone, le melanzane non devono essere
lavate il giorno precedente all'inoculazione.
6.4.2. Inoculare gli steli di melanzana immediatamente sopra i
cotiledoni usando una siringa con ago ipodermico (non
inferiore a 23G). Distribuire il precitato tra le melanzane.
6.5. Inoculare in 25 piante una coltura nota di C. sepedonicum e,
se possibile, tessuto di tuberi naturalmente contaminati
(5.1) con lo stesso metodo di inoculazione (6.2, 6.3 o 6.4).
6.6. Inoculare un PBS sterile 0,05 M in 25 piante con lo stesso
metodo di inoculazione (6.2, 6.3 o 6.4).
6.7. Mantenere le piante in incubazione in condizioni adeguate
(appendice 5) per 40 giorni. Esaminare periodicamente per
vedere se appaiono sintomi ogni otto giorni. Contare il
numero di piante che manifestano sintomi di contaminazione.
Nelle melanzane di C. sepedonicum provoca avvizzimento delle
foglie, che può iniziare sotto forma di flaccidità lungo il
bordo o fra le nervature. Il tessuto avvizzito può apparire
inizialmente verde scuro o chiazzato, ma si schiarisce prima
di divenire necrotico. La zona avvizzita fra le nervature ha
spesso un aspetto viscido e impregnato d'acqua. Il tessuto
necrotico ha sovente un bordo giallo vivo. Le piante non sono
necessariamente morte; quanto più lungo è il periodo che
precede la manifestazione dei sintomi, tanto maggiore è la
possibilità di sopravvivenza. Le piante possono superare
l'infezione. Le piante di melanzane giovani predisposte sono
molto più sensibili alle basse popolazioni di C. sepedonicum
rispetto alle piante più vecchie; è pertanto necessario
utilizzare piante che abbiano raggiunto o stiano per
raggiungere lo stadio fogliare 3.
L'avvizzimento può anche essere provocato da popolazioni di
altri batteri o funghi presenti nel precipitato di tessuto di
tubero, fra i quali si annoverano l'Erwinia carotovora,
sottospecie carotovora e l'E. carotovora, sottospecie
atroseptica, la Phoma exiqua, varieta foveata, nonchè ampie
popolazioni di batteri saprofiti. Tale avvizzimento può
essere distinto da quello provocato dal C. sepedonicum in
quanto intere foglie o intere piante avvizziscono
rapidamente.
6.8. Preparare una colorazione di Gram (4) per tutte le serie di
melanzane che manifestano sintomi di contaminazione,
utilizzando sezioni di tessuto di foglie avvizzite e di
tessuto dello stelo delle piante e isolarle su un adeguato
terreno nutritivo (7). Disinfertare la superficie delle
foglie e degli steli di melanzana strofinandole con etanolo
al 70%.
6.9. In talune circostanze, in particolare quando le condizioni di
crescita non sono ottimali, è possibile che la
contaminazione da C. sepedonicum rimanga latente fra le
melanzane anche dopo il periodo d'incubazione di 40 giorni.
Tali contaminazioni possono provocare un arresto della
crescita e mancanza di vigore nelle piante assoggettate
all'inoculazione. Se la prova di IF è considerata positiva,
può essere ritenuto necessario eseguire altre prove. A tal
fine è essenziale confrontare i tassi di crescita di tutte
le piante di melanzane sottoposte alla prova con i PBS
sterili 0,05 M come controllo negativo e sorvegliare le
condizioni ambientali della serra.
Per le ulteriori prove si raccomanda di:
6.9.1. Recidere lo stelo sopra al punto in cui è stata effettuata
l'inoculazione e asportare le foglie.
6.9.2. Macerare gli steli in un PBS 0,05 M a pH 7,0, come indicato
ai punti 3.1 e 3.2.
6.9.3. Usare metà del precipitato per effettuare una colorazione di
Gram (4) e una prova di immunofluorescenza.
6.9.4. Usare l'altra metà del precipitato per effettuare
un'ulteriore prova sulle melanzane se la colorazione di Gram
e/o la prova di immunofluorescenza sono positive. Usare una
coltura di C. sepedonicum nota e PBS sterili 0,05 M come
controllo negativo. Se nella prova successiva non si
osservano sintomi, il campione deve essere considerato
negativo.
7. Isolamento del C. sepedonicum
La diagnosi può essere confermata solo se il C. sepedonicum
è isolato e individuato come tale (8). Benchè il C.
sepedonicum sia un organismo esigente, esso può essere
isolato dal tessuto sintomatico. Tale contaminazione può
tuttavia essere superata in presenza di batteri saprofiti a
crescità rapida e pertanto non è raccomandato l'isolamento
direttamente dal precipitato di tessuto di tubero (3.3). Le
melanzane costituiscono un ottimo terreno di arricchimento
selettivo per la crescita del C. sepedonicum e rappresentano
inoltre un eccellente ospite per una prova di conferma.
L'isolamento deve essere effettuato su tutti i tuberi e le
melanzane sintomatici (4, 6). La macerazione degli steli
delle melanzane deve essere effettuata, se del caso, come
indicato ai punti 3 e 6.9.
7.1. Applicare la sospensione su uno dei seguenti terreni di
coltura (le formule figurano nell'appendice 6):
agar nutritivo con destrosio (solo per subcolture);
agar con lievito peptone glucosio;
agar nutritivo con lievito destrosio;
yeast extract mineral salts agar.
Mantenere in incubazione a 21 gradi centigradi per un massimo
di 20 giorni.
Il C. sepedonicum cresce lentamente, producendo di solito
colonie puntiformi a cupola, di color bianco panna entro 10
giorni.
Riapplicare per ottenere la purezza.
I tassi di crescita sono migliori con le subcolture. Le
colonie tipiche sono di color bianco panna o avorio, di forma
arrotondata a cupola convessa, liscia, in rilievo, di
consistenza viscoso-fluida con bordi continui e un diametro
di 1-3 mm.
Individuazione
Molti batteri corineformi Gram-positivi, le cui colonie
presentano caratteristiche analoghe a quelle del C.
sepedonicum possono essere isolati su patate e melanzane sane
o infette. In questo contesto il C. sepedonicum deve essere
individuato con le seguenti prove:
prova di immunofluorescenza (5.1);
prova sulle melanzane;
prove nutrizionali e fisiologiche (appendice 7):
- prova di ossidazione/fermentazione (O/F),
- prova dell'ossidasi,
- crescita a 37 gradi centigradi,
- produzione di ureasi,
- idrolisi dell'esculina,
- idrolisi dell'amido,
- tolleranza ad una soluzione di cloruro di sodio al 7%;
- prova dell'indolo,
- prova della catalasi,
- produzione di H2S,
- utilizzazione del citrato,
- idrolisi della gelatina,
- acidi derivati dal glicerolo, dal lattosio, dal ramnosio e
dalla salicina,
- colorazione di Gram.
Tutte le prove devono comprendere un campione di controllo
noto di C. sepedonicum. Le prove nutrizionali e fisiologiche
dovrebbero essere effettuate inoculando sostanze ricavate
dalle subcolture su agar nutritivo con destrosio.
Per la prova di immunofluorescenza le popolazioni di cellule
dovrebbero essere utilizzate con una densità di 10 6
cellule/ml. Il titolo di immunofluorescenza dovrebbe essere
analogo a quello della coltura nota di C. sepedonicum.
Per la prova sulle melanzane le popolazioni di cellule
dovrebbero avere una densità di circa 10 7 cellule/ml. Le
prove sulle melanzane dovrebbero essere effettuate
utilizzando dieci piante per ciascuno degli organismi della
prova, usando nuovamente controlli di coltura di C.
sepedonicum e di acqua sterile; nel caso di colture pure il
tipico avvizzimento dovrebbe manifestarsi entro venti giorni,
ma le piante che non mostrano sintomi dopo questo periodo
dovrebbero essere mantenute in incubazione per un totale di
trenta giorni a temperature che permettano la crescita delle
melanzane, ma che non siano superiori a 30 (grandi
centigradi)C (appendice 5). Se, trascorsi trenta giorni, non
si manifestano sintomi di infezione, non è possibile
confermare che la coltura sia una forma patogena di
Corynebacterium sepedonicum.
Prova C. sepedonicum
O/F Inerte o debolmente ossidativo
Ossidasi -
Catalasi +
Riduzione del nitrato -
Attività dell'ureasi -
Produzione di H2S -
Produzione di indolo -
Utilizzazione del citrato -
Idrolisi dell'amido - o debole
Crescita a 37 (gradi centigradi) C -
Crescita in una soluzione
di NaCL al 7% -
Idrolisi della gelatina -
Idrolisi dell'esculina +
Acidi derivati da:
- glicerolo -
- lattosio - o debole
ramnosio -
salicina -
Appendice 1
FORMULA DEL FLUIDO DI MACERAZIONE RACCOMANDATO DA LELLIOTT E SELLAR,
1976
Antischiuma al silicone (Hopking &amp; Williams
Ltd, Cat No 9964-25, Chadwell Heath, Essex,
Inghilterra) 10 ml
Scaglie antiemulsionanti (ICI Ltd) 0,5 g
Pirofosfato tetrasodico 1 g
Tampone fosfato isotonico 0,05 M a pH 7,0
(appendice 2) 1 litro

Appendice 2
TAMPONI
Tampone fosfato isotonico 0,05 M a pH 7,0
Questo tampone può essere usato per la macerazione del tessuto dei
tuberi (2.1)
Na2HPO4 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
NaCl 8,0 g
Acqua distillata 1 litro
Tampone fosfato isotonico 0,01 M a pH 7,2
Questo tampone è utilizzato per diluire antisieri e per lavare i
vetrini utilizzati per l'IF
Na2HPO4: 12H2O 2,7 g
NaH2PO4: 2H2O 0,4 g
NaCl 8,0 g
Acqua distillata 1 litro
Tampone fosfato aggiunto di glicerina 0,1 M a pH 7,6
Questo tampone è utilizzato come mezzo di contrasto per aumentare la
fluorescenza delle prova di IF
Na2HPO4: 12H2O 3,2 g
NaH2PO4: 2H2O 0,15 g
Glicerina 50 ml
Acqua distillata 100 ml
Appendice 3
PROCEDURA PER LA COLORAZIONE DI GRAM (MODIFICA DI HUCKER) (DOETSCH,
1981)
Soluzione di cristavioletto
Sciogliere 2 g di cristalvioletto in 20 ml di etanolo al 95%.
Sciogliere 0,8 g di ossalato di ammonio in 80 ml di acqua distillata.
Mescolare le due soluzioni.
Soluzioni di Lugol
Iodio 1 g
Ioduro di potassio 2 g
Acqua distillata 300 ml
Polverizzare insieme gli elementi solidi in un mortaio con il
pestello. Aggiungere all'acqua e mescolare per disciogliere in un
recipiente chiuso.
Soluzione per colorazione alla safranina
Soluzione di riserva:
Safranina O 2,5 mg
Etanolo al 95% 100 ml
Mescolare e mettere da parte.
Diluire in una proporzione 1: 10 per ottenere una soluzione adeguata.
Procedimento di colorazione
1. Preparare gli strisci, seccare ad aria e fissare mediante calore.
2. Bagnare il vetrino con la soluzione al cristalvioletto per un
minuto.
3. Lavare rapidamente con acqua corrente.
4. Bagnare con soluzione di Lugol per un minuto.
5. Lavare con acqua corrente e asciugare tamponando.
6. Decolorare con etanolo al 95%, aggiungendolo goccia a goccia
finchè non si verifica più alcuna decolorazione, oppure
immergendovi lo striscio e scuotendo con cautela per 30 secondi.
7. Lavare in acqua corrente e asciugare tamponando.
8. Bagnare con la soluzione di safranina per 10 secondi.
9. Lavare con acqua corrente e asciugare tamponando.
I battenti Gram-positivi si colorano di blu-violetto, i batteri
Gram-negativi di rosa-rosso.
ALLEGATO I
METODO PER L'INDIVIDUAZIONE E LA DIAGNOSI DEL BATTERIO DEL MARCIUME
ANULARE DELLA PATATA, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (SMITH) DAVIS ET AL.
IN SERIE DI TUBERI DI PATATA
Appendice 4
DETERMINAZIONE DELLA POPOLAZIONE DI CELLULE POSITIVE
ALL'IMMUNOFLUORESCENZA
Superficie del pozzetto del vetrino per immunofluorescenza
(pi greco)D2
= (1)
4
in cui D = diametro del pozzetto.
Superficie del campo dell'obiettivo
(pi greco)d 2
= (2)
4
in cui d = diametro dell'obiettivo.
Calcolare d misurando direttamente o mediante le seguenti formule:
(pi greco)i 2
s = (3)
G 2 K 2 x 4
dove i = coefficiente di campo (dipende dal tipo di oculare e varia
da 8 a 24),
K = coefficiente del microscopio (1 o 1,25),
G = ingrandimento dell'obiettivo (100 volte, 40 volte, ecc.).
Da (2)d = VEDERE FORMULA A PAG. 23
Da (3)d = VEDERE FORMULA A PAG. 23
Conteggiare il numero di cellule IF tipiche per campo (c).
Calcolare il numero di cellule IF tipiche per pozzetto (C).
S
C = c
s
Calcolare il numero di cellule IF tipiche per ml di precipitato (N)
1 000
N = C x x F
y
in cui y = volume del precipitato sul pozzetto
in cui F = fattore di diluizione del precipitato.
Appendice 5
COLTURA SU MELANZANE
Seminare i semi di melanzana (Solanum melongena, varietà Black
Beauty) in terra da semina pastorizzata. Trapiantare le piantine con
cotiledoni completamente sviluppati (10-14 giorni) in terra da
piantare in vaso pastorizzata.
Usare le melanzane ad uno stadio fogliare 3, quando due e non più di
tre foglie si sono completamente aperte.
Le melanzane dovrebbero essere coltivate in una serra nelle seguenti
condizioni ambientali:
luce: 14 ore o lunghezza naturale del giorno se maggiore;
temperatura: diurna: 21-24 gradi centigradi;
notturna: 15 gradi centigradi.
NB: Il C. sepedonicum non si svilupperà a temperature &gt; 30 gradi
centigradi. Se le temperature notturne non scendono a 15 gradi
centigradi, può verificarsi una degradazione del marcatore
fluorescente.
Danni alle radici causati da larve di sciaride possono essere
evitati applicando un insetticida appropriato.
Le melanzane Black Beauty possono essere ottenute presso:
1. AB Hammenhogs Frò
270 50 Hammenhog
Svezia
2. HURST Seeds Ltd
Avenue Road
Witham
Essex CM8 2DX
Inghilterra
3. ASGRO Italia S.p.A.
Corso Lodi, 23
Milano
4. KUPPER
Mitteldeutsche Samen GmbH
Hessenring 22
D-37269 Esdchwege
Appendice 6
TERRENI DI COLTURA PER LA CRESCITA E L'ISOLAMENTO DEL C.
SEPEDONICUM
Agar nutriente (NA)
Agar nutriente difco bacto in acqua distillata nella concentrazione
fornita dal produttore. Sterilizzare in autoclave a 121 gradi
centigradi per 15 minuti.
Agar nutriente al destrosio (NDA)
Agar nutriente difcto bacto contenente l'1% di D (+) glucosio
(monoidrato). Sterilizzare in autoclave a 115 gradi centigradi per 20
minuti.
Agar lievito peptone glucosio (YPGA)
Estratto di lievito difco bacto (n. 0127) 5 g
Peptone difco bacto (n. 0118) 5 g
D(+)glucosio (monoidrato) 10 g
Agar purificato difco bacto (n. 0560) 15 g
Acqua distillata 1 litro
Sterilizzare volumi di mezzo litro di terreno di coltura in
autoclave a 115 gradi centigradi per 20 minuti.
Terreno di coltura all'estratto di lievito e ai sali minerali (YGM)
Difco bacto estratto di lievito 2,0 g
D (+) glucosio (monoidrato) 2,5 g
K2HPO4 0,25 g
KH2PO4 0,25 g
MgSO4 . 7H2O 0,1 g
MnSO4 . H2O 0,015 g
NaCI 0,05 g
FeSO4 . 7H2O 0,005 g
Agar purificato difco bacto 18 g
Acqua distillata 1 litro
Sterilizzare volumi di mezzo litro di terreno di coltura in
autoclave a 115 gradi centigradi per 20 minuti.
Appendice 7
PROVE NUTRITIVE E FISIOLOGICHE PER L'INDIVIDUAZIONE DEL C.
SEPEDONICUM
Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere messi in incubazione a
21 gradi centigradi esaminati dopo 6 giorni. Se non si è verificata
alcuna crescita, incubare fino a 20 giorni.
- Prova di ossidazione e fermentazione (Hugh &amp; Leifson, 1953) -
prova O/F
Terreno di coltura basale:
KCl 0,2 g
MgSO4 . 7H2O 0,2 g
NH4H2PO4 1,0 g
Peptone difco bacto 1,0 g
Agar purificato difco bacto 3,0 g
D(+)-Glucosio (monoidrato) 10,0 g
Azzurro di bromotimolo 0,03 g
Acqua distillata 1 litro
Miscelare e dosare fino a raggiungere pH 7,0 - 7,2 con 1N KOH.
Preparare in provette di coltura pirex di 16 mm x 100 mm (capacità
12 ml) in volumi di 5 ml e 10 ml.
Sterilizzare in autoclave a 115 gradi centigradi per 10 minuti.
Inoculare per infissione provette di 5 ml e di 10 ml per ciascuna
coltura. Aggiungere asetticamente 1-2 ml di paraffina liquida sterile
nella provetta da 10 ml. Mettere in incubazione.
Reazione positiva

| |
Provetta | Colore | Interpretazione
| |
| |
aperta | giallo | | fermentazione
chiusa | giallo | |
| | |
| |
aperta | giallo | | ossidazione
chiusa | verde-azzurro | |
| | |
| |
aperta | verdastro | | ossidazione o inerte
chiusa | verde-azzurro | |
| | |
| |
- Prova di ossidasi (Kovacs, 1956)
Reagente ossidasico di Kovacs:
L'1% di soluzione acquosa di tetrametil parafenilnediammina di
idrocloruro (BDH n. 30386) in acqua distillata.
Questo reagente dovrebbe essere preparato all'istante in volumi di
1 ml ma può essere conservato in una bottiglia di vetro marrone a 5
gradi centigradi per 1-4 settimane.
Mettere una goccia di reagente su carta da filtro in una scatola di
Petri pulita. Raschiare una parte della coltura di prova utilizzando
un'ansa di platino.
Reazione positiva: sviluppo di una colorazione purpurea entro 10
secondi. Le colture con tempi di colorazione di 10-30 secondi sono
moderatamente positive.
NB: È essenziale utilizzare un'ansa di platino e colture di NA in
quanto tracce di ferro o un elevato tenore di zucchero nel
terreno di coltura impiegato per la crescita possono fornire
falsi risultati positivi.
- Produzione di acido in base a lattosio, ramnosio, salicina,
glicerina
Preparare il terreno di coltura O/F Hugh &amp; Leifson senza il
glucosio. Distribuire in volumi di 5 ml in provette. Sterilizzare
in autoclave a 115 gradi centigradi per 10 minuti. Aggiungere
asetticamente alla base sciolta, a 45 gradi centigradi, 0,5 ml di
soluzione acquose al 10%, sterilizzare a filtro, di glicerina o
lattosio o ramnosio o salicina. Miscelare accuratamente.
Reazione positiva: se il colore passa dal verde-azzurro al giallo
ciò significa che vi è produzione di acido.
- Test della catalasi
Mettere una goccia di acqua ossigenata (volume 30) su un vetrino
pulito ed emulsionare con un'ansa piena di terreno di coltura
utilizzando un'ansa di platino.
Reazione positiva: la produzione di bollicine di ossigeno nella
goccia indica la presenza di catalasi.
- Attività nitrato riduttasi e denitrificazione (Bradbury, 1970)
Terreno di coltura:
KNO3 (libero da nitrito) 1 g
Estratto di lievito difco bacto 1 g
K2HPO4 5 g
Acqua distillata 1 litro
Preparare in volumi di 10 ml e versare in bottiglie da 20 ml.
Sterilizzare in autoclave a 121 gradi centigradi per 15 minuti.
Reagente A:
H2SO4 8 g
5N acido acetico 1 litro
Reagente B:
Naftilammina 5 g
5N acido acetico 1 litro
Inoculare un duplice terreno di coltura al nitrato. Effettuare una
prova dopo 10 e 20 giorno aggiungendo una goccia di soluzione di
Lugol, 0,5 ml di reagente A e 0,5 ml die reagente B. Se il terreno
di coltura non diventa rossastro, aggiungere circa 50 mg di polvere
di zinco. Osservare la reazione cromatica.
Reazione positiva: Reazione cromatica
Fase 1 Fase 2
Nessuna riduzione del nitrato incolore rosso
Riduzione del nitrato fino al
nitrito (solo nitrito reduttasi) rosso -
Riduzione del nitrato oltre il
nitrito (denitrificazione - nitrato
e nitrito reduttasi) incolore incolore
- Produzione di ureasi (Lelliot, 1966)
Terreno di coltura basale:
Oxoid urea agar base (CM53) 2,4 g
Acqua distillata 95 ml
Sterilizzare in autoclave a 115 gradi centigradi per 20 minuti.
Raffreddare la base sciolta fino a raggiungere la temperatura di 50
gradi centigradi e aggiungere asetticamente a 5 ml di soluzione
acquosa di urea al 40% sterilizzata a filtro (Ossoide SR20).
Miscelare bene.
Distribuire in volumi di 6 ml in provette sterili (16 x 100 ml) e
lasciare solidificare in posizione inclinata con un buon supporto.
Reazione positiva: il terreno di coltura-giallo. arancione assume
un colore rosso ciliegia o magenta se l'attività di ureasi ha
avuto luogo.
Utilizzazione di citrato (Christensen) (Skerman, 1967)
Base agar al citrato (Merck 2503) 23 g
Acqua distillata 1 litro
Miscelare e dissolvere con calore. Preparare in volumi di 6 ml come
per il terreno di coltura per l'urea. Sterilizzare in autoclave a
121 gradi centigradi per 15 minuti e lasciare solidificare in
posizione inclinata.
Reazione positiva: l'utilizzazione del citrato è indicata da un
cambiamento del colore del terreno di coltura dall'arancione al
rosso.
- Produzione di acido solfidrico (Ramamurthi, 1959)
Terreno di coltura:
Triptone difco bacto (n. 0123) 10 g
K2HPO4 1 g
NaCI 5 g
Acqua distillata 1 litro
Dissolvere e preparare in volumi di 6 ml che vanno collocati in
provette da 16 x 100 mm. Sterilizzare in autoclave a 115 C (gradi
centigradi) per 10 minuti.
Inoculare e sospendere asetticamente una carta all'acetato di
piombo (Merck 9511) dall'orlo della provetta. Tenere fermo con il
coperchio. Incubare fino a 20 giorni.
Reazione positiva: La produzione di H2S dal triptone è indicata
dal fatto che la carta reattiva assume un colore nero-marrone.
- Produzione di indolo (Ramamurthi, 1959)
Terreno di coltura:
come per la prova H2S.
Togliere la carta all'acetato di piombo e aggiungere 1 - 2 ml di
etere di dietile e scuotere lievemente. Aspettare che gli strati si
separino (5 minuti). Aggiungere prudentemente 0,5 ml di reagente di
Kovacs (Merck 9293), all'interno della provetta inclinata.
Reazione positiva: la presenza di indolo è indicata
dall'apparizione di colore rosso all'interno dello strato giallo tra
l'etere e le frazioni acquose.
- Crescita a 37 gradi centigradi (Ramamurthi, 1959)
Terreno di coltura:
Brodo nutritivo difco bacto (n. 0003) 8 g
Acqua distillata 1 l
Mescolare, sciogliere e distribuire in provette di 6 ml di volume.
Sterilizzare in autoclave a 121 gradi centigradi per 15 minuti.
Inoculare e procedere all'incubazione a 37 gradi centigradi.
Reazione positiva: controllo della crescita.
- Crescita in cloruro di sodio al 7% (Ramamurthi, 1959)
Terreno di coltura:
Brodo nutritivo difco bacto 8 g
NaCI 70 g
Acqua distillata 1 litro
Mescolare, sciogliere e distribuire in provette di 6 ml di volume.
Sterilizzare in autoclave a 121 gradi centigradi per 15 minuti.
Reazione positiva: controllo della crescita.
- Idrolisi della gelatina (Lelliot, Billing &amp; Hayward, 1966)
Terreno di coltura:
Gelatina difco bacto (n. 0143) 120 g
Acqua distillata 1 litro
Mescolare, sciogliere con calore e distribuire in provette di 6 ml
di volume.
Sterilizzare in autoclave a 121 gradi centigradi per 15 minuti.
Reazione positiva: liquefazione della gelatina anche se mantenuta a
5 gradi centigradi per 30 minuti.
- Idrolisi dell'amido
Terreno di coltura:
Agar nutriente difco bacto (fuso) 1 litro
Amido solubile difco bacto (n. 0178) 2 g
Miscelare e sterilizzare in autoclave a 115 gradi centigradi per 10
minuti.
Applicare sulle piastre. Inoculare la reazione delle piastre.
Una volta verficatasi una buona crescita (10 - 20 giorni),
rimuovere parte di essa e irrigare con iodio Lugol.
Reazione positiva: l'idrolisi dell'amido è caratterizzata da zone
chiare al disotto o attorno alla crescita batterica; il resto del
terreno mostra una colorazione porpora.
- Idrolasi dell esculina (Sneath &amp; Collins, 1974)
Terreno di coltura:
Peptone difco bacto 10 g
Esculina 1 g
Citrato ferrico (Merck 3862) 0,05 g
Citrato di sodio 1 g
Acua distillata 1 l
Miscelare e far sciogliere e dividere in volumi da 6 ml versando la
soluzione nei tubi. Sterilizzare in autoclave a 115 C (gradi
centigradi) per 10 minuti.
Il terreno è chiaro ma ha una fluorescenza bluastra.
Reazione positiva: l'idrolasi dell'esculina è indicata da un
colore bruno e dalla scomparsa della fluorescenza. Ciò può essere
verificato usando una lampada a radiazione ultravioletta.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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from plants. Rev. Pl. Path., 49, 213-218.
Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diagnosis of Corynebacterium
sepedonicum from diseased potato tubers. EPPO Bull. 14 (2), 147-152.
Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods of light microscopy. In:
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fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various
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Janse, J. D. and Van Vaerenbergh, J. The interpretation of the EC
method for the detection of latent ring rot infections
(Corynebacterium sepedonicum) in potato. EPPO Bull., n. 17, 1987, p.
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Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic coryneform bacteria. J.
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Lelliott, R. A., Billing, E. and Hayward, A. C., 1966. A
determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic
pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489.
Lelliott, R. A., and Sellar, P. W, 1976. The detection of latent ring
rot (Corynebacterium sepedonicum) (Spiek. et Kotth) Skapt. et Burkh.)
in potato stocks. EPPO Bull., 6 (2), 101-106.
Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studies on some Gram-positive
phytopathogenic bacteria and their relationship to the
Corynebacteria. Mem. Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 p.
Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the identification of the genera
of bacteria. 2nd ed., William and Wilkins Company, Baltimore.
Sneath, P. H. A. and Collins, V. G., 1974. A study in test
reproductibility between laboratories: report of Pseudomonas working
party. Antonie van Leeuwenhoek, 40, 481-527.

ALLEGATO II
Per ogni manifestazione sospetta per la quale sia stata praticata una
prova di immunofluorescenza positiva secondo il metodo di cui
all'allegato I, e per la quale si attenda la conferma o la smentita
attraverso il suddetto metodo, è necessario mantenere e conservare
in condizioni adeguate:
- tutti i campioni di tuberi o piante, ove possibile, e
- ogni estratto residuo e i vetrini di immunofluorescenza
supplementari preparati,
fino al termine delle prove condotte secondo il suddetto metodo,
Qualora venga confermata la presenza dell'organismo nocivo, è
necessario mantenere e conservare in condizioni adeguate:
- il materiale di cui al paragrafo 1,
- un campione conservato del materiale di melanzana infetto inoculato
con il tubero o con l'estratto e
- la coltura isolata dell'organismo,
per almeno un mese dalla notifica di cui all'articolo 5, paragrafo 2
della direttiva.

ALLEGATO III
1. Per determinare l'entità della contaminazione probabile, di
cui all'articolo 5, paragrafo 1, lettera b) della direttiva,
è necessario tenere conto dei seguenti elementi:
- tuberi o piante coltivati in un luogo di produzione
dichiarato contaminato ai sensi dell'articolo 5, paragrafo
1, lettera a);
- luogo o luoghi di produzione o imprese che abbiano qualche
collegamento nel ciclo produttivo con i tuberi o le piante
vegetali dichiarati contaminati ai sensi dell'articolo 5,
paragrafo 1, lettera a) compresi quelli dove vengono
condivisi macchinari e dispositivi di produzione
indirettamente o attraverso un imprenditore comune;
- tuberi o piante prodotti nel luogo o nei luoghi di
produzione di cui al precedente trattino, o presenti in tali
luoghi di produzione nel periodo in cui i tuberi o le piante
dichiaranti contaminati ai sensi dell'articolo 5, paragrafo
1, lettera a) erano presenti nelle imprese o nei luoghi di
produzione di cui al primo trattino;
- magazzini centrali adibiti alla manipolazione di patate
provenienti dai luoghi di produzione di cui sopra;
- macchinari, veicoli, contenitori, magazzini, o relative
parti, e qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali
d'imballaggio, che possano essere stati in contatto con i
tuberi o le piante dichiarati contaminati ai sensi
dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a), durante i dodici
mesi precedenti, oppure laddove se ne ravvisi la necessità;
- tuberi o piante immagazzinati o entrati in contatto con una
qualsiasi delle strutture o degli oggetti elencati nel
precedente trattino prima della pulizia o della disinfezione
di tali strutture o oggetti;
- dopo le prove di cui all'articolo 6, tuberi o piante che
abbiano la stessa origine clonale dei tuberi o delle piante
dichiarati contaminati ai sensi dell'articolo 5, paragrafo
1, lettera a) e per i quali le indagini facciano ritenere
probabile la contaminazione.
2. Per determinare la potenziale disseminazione di cui
all'articolo 5, paragrafo 1, lettera c) della presente
direttiva, è necessario tenere conto dei seguenti elementi:
- la vicinanza di altri luoghi di produzione della patata o di
altre piante ospiti dell'organismo nocivo;
- l'esistenza di scorte comuni di tuberi-seme di patata.
3. I particolari della notifica di cui all'articolo 5, paragrafo
2, primo comma della presente direttiva comprendono:
- per ogni spedizione o partita di patate dichiarate
contaminate, i certificati prescritti dagli articoli 7 o 8
della direttiva 77/93/CEE, il numero di passaporto o di
registrazione, a seconda dei casi;
- il nome della varietà delle scorte di tuberi-seme e per
tutti gli altri casi, ove possibile;
- una descrizione degli elementi relativi alla dichiarazione
di contaminazione e alla delimitazione della zona;
- la disponibilità di un estratto, dei vetrini di
immunofluorescenza preparati, del materiale di melanzana
infetto e di una coltura isolata dell'organismo nocivo
provenienti dalle prove in cui è stata confermata la
presenza di detto organismo.

ALLEGATO IV
1. Gli interventi sotto controllo ufficiale previsti dall'articolo
7, paragrafo 1 della direttiva per l'eliminazione di tuberi o
piante dichiarati contaminati ai sensi dell'articolo 5,
paragrafo 1, lettera a) della stessa direttiva sono:
- la destinazione alla trasformazione industriale, attraverso
la consegna diretta e immediata a uno stabilimento dotato di
apposite strutture per l'eliminazione dei rifiuti che
escludano qualsiasi rischio identificabile di disseminazione
dell'organismo nocivo e provvisto di dispositivi per la
disinfezione delle aree di magazzinaggio e dei veicoli in
uscita; o
- altri interventi, semprechè sia stato accertato che non
esiste alcun rischio effettivo di disseminazione
dell'organismo nocivo; tali interventi vengono notificati
alla Commissione e agli altri Stati membri.
2. L'utilizzazione o l'eliminazione idonee di tuberi o piante
probabilmente contaminati ai sensi dell'articolo 5, paragrafo
1, lettera b), di cui all'articolo 7, paragrafo 2, da
effettuarsi sotto il controllo degli organismi ufficiali
responsabili dello Stato membro, comprendono:
- il loro impiego quali patate da consumo, in imballaggi
pronti per la consegna diretta e l'utilizzazione senza
necessità di reimballaggio, e destinate a tale consegna
diretta e utilizzazione;
- il loro impiego quali patate di consumo destinate alla
trasformazione industriale e consegnate direttamente e
immediatamente ad uno stabilimento dotato di strutture
apposite per l'eliminazione dei rifiuti e la disinfezione;
- altri impieghi o forme di eliminazione, sempre che sia
accertato che non esiste alcun rischio identificabile di
disseminazione dell'organismo nocivo.
3. I metodi adeguati di pulizia e disinfezione di tutti gli
oggetti di cui all'articolo 7, paragrafo 3 sono quelli che
escludono qualsiasi rischio identificabile di disseminazione
dell'organismo nocivo e che vengono applicati sotto il
controllo degli organismi ufficiali responsabili degli Stati
membri.
4. La serie di interventi che gli Stati membri attuano nella zona
delimitata ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera c) e
di cui all'articolo 7, paragrafo 4 della presente direttiva,
comprende quanto segue:
4.1 nei luoghi di produzione dichiarati contaminati ai sensi
dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a):
a) in un appezzamento dichiarato contaminato ai sensi
dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera ):
i) - per almeno i tre anni vegetativi successivi a quello
in cui la contaminazione è stata dichiarata:
- si attuano interventi intesi ad eliminare le piante
di patate spontanee e altre piante ospiti naturali
dell'organismo nocivo;
- è vietato mettere a dimora tuberi, piante o semi
di patata propriamente detti, o altre piante ospiti
naturali dell'organismo nocivo, o colture per le
quali sussiste un rischio effettivo di
sopravvivenza o di disseminazione di detto
organismo, fino a quando l'appezzamento non risulta
privo di piante di patate spontanee per almeno due
anni vegetativi consecutivi;
- nel primo periodo di raccolta delle patate che segue
il periodo indicato al trattino precedente,
tuberi-seme ufficialmente certificti sono messi a
dimora unicamente per la produzione di patate di
consumo e viene effettuato un accertamento ufficiale
come precisato all'articolo 2, paragrafo 1;
- nel periodo di raccolta dalle patate successivo a
quello indicato al trattino precedente, e in seguito
a un appropriato ciclo di rotazione, tuberi-seme
ufficialmente certificati sono messi a dimora per la
produzione sia a scopo di consumo che di semina e
viene effettuato un accertamento ufficiale come
precisato all'articolo 2, paragrafo 1; oppure
ii) - nei quattro anni vegetativi successivi a quello in
cui la contaminazione è stata dichiarata:
- si attuano interventi intesi ad eliminare le piante
di patate spontanee e altre piante ospiti naturali
dell'organismo nocivo; e
- l'appezzamento viene messo e tenuto o a maggese
completo oppure a pascolo permanente e si
effettuano frequenti falciature a raso oppure
l'appezzamento viene adibito a pascolo intensivo;
- nel primo periodo di raccolta delle patate che segue
il periodo indicato al trattino precedente,
tuberi-seme ufficialmente certificati sono messi a
dimora per la produzione sia di piante che di patate
da consumo e viene effettuato un accertamento
ufficiale come precisato all'articolo 2, paragrafo 1;
b) negli altri appezzamenti:
- nell'anno vegetativo successivo a quello della
contaminazione dichiarata:
- è vietato mettere a dimora tuberi, piante o semi di
patata propriamente detti o altre piante ospiti
naturali dell'organismo nocivo, e vengono attuati
interventi per eliminare eventualmente le piante di
patate spontanee; oppure
- tuberi-seme di patate ufficialemente certificati
possono essere messi a dimora soltanto per la
produzione di patate da consumo, a condizione che gli
organismi ufficiali competenti abbiano la certezza che
il rischio di piante di patate spontanee e altre piante
ospiti naturali dell'organismo nocivo sia stato
eliminato;
- almeno nei primi due anni vegetativi successivi a quello
precisato al trattino precedente, sono messi a dimora
soltanto tuberi-seme ufficialmente certificati, sia a
scopo di consumo che di semina;
- in ciascuno degli anni vegetativi precisati nei trattini
precedenti, si attuano gli interventi diretti ad
eliminare piante di patate spontanee e altre piante
ospiti naturali dell'organismo e si effettuano gli
accertamenti ufficiali di cui all'articolo 2, paragrafo
1;
- ove tuberi-seme di patata ufficialmente certificati siano
messi a dimora per la produzione di patate nell'anno
vegetativo successivo a quello in cui la contaminazione
è stata dichiarata la crescita delle patate è
sottoposta a controlli nei momenti opportuni e si
effettuano prove sulle piante di patata spontanee per
individuare la presenza dell'organismo nocivo;
c) non appena è avvenuta la dichiarazione di contaminazione
ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a) e in
ciascuno degli anni vegetativi successivi fino al primo
periodo di raccolta possibile delle patate
nell'appezzamento o negli appezzamenti dichiarati
contaminati, come specificato alla lettera a), tutti i
macchinari e le strutture di immagazzinamento presenti sul
luogo di produzione e associati al ciclo produttivo delle
patate sono opportunamente puliti e disinfettati con i
metodi adeguati, conformemente al punto 3;
d) nei sistemi di produzione che rendono possibile la
sostituzione completa del substrato colturale:
- è vietato mettere a dimora tuberi, piante o semi
propriamente detti a meno che l'unità di produzione sia
stata sottoposta a interventi sotto controllo ufficiali
intesi ad eliminare l'organismo nocivo e a rimuovere
qualsiasi patata o altro materiale di Solanacee, compresi
almeno il cambiamento completo del substrato colturale e
la pulizia e la disinfezione dell'unità di produzione e
di tutte le attrezzature, e purchè gli organismi
ufficiali responsabili abbiano successivamente
autorizzato la produzione di patate;
- la produzione di patate si effettua a partire da
tuberi-seme di patate ufficialmente certificati, o da
microtuberi o piantine ottenuti da fonti controllate;
4.2. all'interno della zona delimitata, fatti salvi gli interventi
previsti al punto 4.1, gli Stati membri:
a) immediatamente dopo la contaminazione dichiarata e per
almeno tre periodi vegetativi:
- garantiscono il controllo, attraverso i propri organismi
ufficiali responsabili, delle imprese dove viene
effettuata la coltivazione, il magazzinaggio o la
manipolazione dei tuberi di patata, nonchè delle imprese
che gestiscono, su base contrattuale, i macchinari
occorrenti;
- esigono la pulizia e la disinfezione dei macchinari e dei
magazzini presenti in tali imprese, se del caso,
utilizzando i metodi adeguati precisati al punto 3,
- esigono l'impiego esclusivo di semi certificati per tutte
le colture di patata comprese in tale zona;
- prescrivono che la manipolazione delle patate da semina
raccolte sia separata da quella delle patate da consumo,
in tutte le imprese della zona;
- effettuano gli accertamenti ufficiali di cui all'articolo
2, pararagrafo 1;
b) stabiliscono se del caso un programma volto a sostituire
tutte le scorte di tuberi-seme in un lasso di tempo
adeguato.
Gli interventi attuati ai sensi del punto 4.2, unitamente ai
numeri di registrazione dei produttori, dei magazzini
collettivi e dei centri di spedizione situati nella zona
delimitata, vengono notificati ogni anno agli altri Stati
membri e alla Commissione.