Serie Generale n. 69 del 24-3-1994
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 18 marzo 1994
Determinazione di un valore massimo di furosina per il formaggio mozzarella e per gli altri formaggi freschi a pasta filata. (GU Serie Generale n.69 del 24-03-1994)

IL MINISTRO DELLE RISORSE
AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
Visto il regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033, convertito
nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la repressione delle
frodi nella preparazione e nel commercio di sostanze di uso agrario e
di prodotti agrari, ed in particolare l'art. 32 con il quale si
stabiliscono le materie prime consentite nella produzione di
formaggi;
Vista la legge 11 aprile 1974, n. 138, ed in particolare l'art. 1
concernente il divieto di ricostituzione del latte in polvere per
l'alimentazione umana, nonchè l'impiego di latte in polvere o di
latte comunque concentrato nella produzione di formaggi;
Considerato che il formaggio mozzarella e gli altri formaggi
freschi a pasta filata ottenuti sia da latte vaccino che bufalino,
hanno assunto una vasta diffusione nei consumi alimentari;
Considerato altresì, che tecnicamente è possibile ottenere la
mozzarella e gli altri formaggi freschi a pasta filata anche da
materie prime diverse dal latte liquido naturale quali, in
particolare latte in polvere, caseine e caseinati, derivati essiccati
di origine lattiera, formaggi fusi e prodotti caseari di diversa
origine;
Considerato che l'impiego, nella fabbricazione di mozzarella e di
altri formaggi freschi a pasta filata, di materie prime non
consentite reca grave pregiudizio alla commercializzazione dei citati
caratteristici formaggi italiani e che costituisce una frode a danno
dei consumatori;
Considerato che recenti ricerche scientifiche hanno evidenziato
come la furosina sia presente in piccole quantità nel latte crudo e
nel latte pastorizzato, nonchè nella mozzarella e negli altri
formaggi freschi a pasta filata ottenuti sia con processi industriali
che artigianali, secondo buona pratica tecnologica, e come assuma
consistenti valori, qualora vengano utilizzate le sopra specificate
materie prime;
Ritenuto necessario salvaguardare la genuinità e la qualità del
formaggio mozzarella e degli altri formaggi freschi a pasta filata, a
tutela del consumatore e del mercato dei citati prodotti;
Ritenuto pertanto necessario, in conformità dei risultati delle
citate ricerche scientifiche, fissare sin d'ora un valore massimo di
furosina consentito nella mozzarella e negli altri formaggi freschi a
pasta filata e, in attesa dell'ufficializzazione, assumere
urgentemente un metodo di analisi;
Decreta:
Art. 1.
1. Il valore massimo di furosina, nel formaggio mozzarella e negli
altri formaggi freschi a pasta filata prodotti da latte vaccino e/o
bufalino, è fissato in 12 milligrammi su 100 grammi di sostanza
proteica, ferme restando tutte le altre condizioni produttive e le
caratteristiche previste dalle vigenti disposizioni per i citati
formaggi.
2. In attesa dell'adozione del metodo ufficiale di analisi per la
determinazione del valore della furosina, è assunto il metodo di cui
all'allegato A al presente decreto.

Art. 2.
1. Il presente decreto entra in vigore il giorno successivo alla
sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Roma, 18 marzo 1994
Il Ministro: DIANA

ALLEGATO A
METODO PER LA DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA FUROSINA
(e-FUROILMETIL-LISINA) NEL LATTE E NEL FORMAGGIO.
1. Scopo e campo di applicazione.
Il metodo qui specificato permette di determinare
quantitativamente la furosina nel latte crudo o trattato termicamente
e nel formaggio.
2. Riferimenti.
Norma FIL-IDF 50B: 1986. Latte e prodotti lattieri - Metodi di
campionamento.
Norma ISO 707: 1985. Latte e prodotti lattieri - Metodi di
campionamento.
3. Definizione.
Quantità di furosina, espressa in mg per 100 g di proteine,
rilevabile nel latte o nel formaggio, nelle condizioni specificate da
questo metodo.
4. Principio del metodo.
4.1. Attraverso determinazione della furosina viene valutata
l'intensità della fase iniziale della reazione di Maillard, a sua
volta collegata ai processi termici subiti dalle materie prime o
introdotti in lavorazione.
4.2. La e-deossilattulosil-lisina, primo prodotto stabile della
reazione di Maillard nel latte e derivati, viene convertita a
furosina sottoponendo il latte o il formaggio ad idrolisi acida a
caldo. La furosina viene quindi determinata mediante HPLC in coppia
ionica e fase inversa con rilevamento a 280 nm. La quantificazione
viene effettuata mediante standardizzazione esterna con furosina di
sintesi.
5. Reattivi.
5.1. Acqua distillata.
5.2. Acido cloridrico 10.6 N, ottenuto miscelando 8 volumi di
acido cloridrico concentrato con 1 volume di acqua distillata.
5.3. Acido cloridrico 8 N, ottenuto miscelando 2 volumi di acido
cloridrico concentrato con 1 volume di acqua distillata.
5.4. Acido cloridrico 3 N, ottenuto miscelando 1 volume di acido
cloridrico concentrato con 3 volumi di acqua distillata.
5.5. Metanolo.
5.6. Eluenti per cromatografia: acqua, acido acetico glaciale e
cloruro di potassio, tutti di purezza HPLC.
5.7. Furosina di sintesi (Neosystem Laboratoire - Rue de Boulogne,
7 - 67100 Strasbourg - France, o di altro produttore).
5.8. Azoto per gascromatografia.
Tutti i reattivi se non altrimenti specificato devono essere puri
per analisi.
6. Apparecchiatura.
6.1. Cartucce C18 da 500 mg per estrazione in fase solida.
6.2. Cromatografo liquido ad alta prestazione con iniettore
biocompatibile, provvisto di loop da 20 e 50 (Micron(l e di forno per
la termostatazione della colonna.
6.3. Spettrofotometro per rivelazione in continuo a 280 nm e a
0.010 AUFS.
Nelle condizioni cromatografiche indicate e con loop di iniezione
da 20 (Micron(l, il rapporto segnale/disturbo, rilevabile per un
picco corrispondente a 10 picoMoli di furosina sintetica iniettata,
deve essere non inferiore a 10.
6.4. Colonna Alltech "Furosina dedicata", 250 mm x 4.6 mm i.d.
(Alltech-Italia, Sedriano-Milano) o colonna equivalente che permetta
di eluire la furosina separata sulla linea di base e senza
interferenze di altri picchi.
6.5. Registratore potenziometro-integratore.
6.6. Sistema di degasaggio degli eluenti.
6.7. Bilancia di precisione.
6.8. Stufa termostatabile a 110 C.
6.9. Provette pyrex da 10 ml provviste di tappo a vite con
guarnizione in teflon o di altro sistema di chiusura ermetica
resistente al calore.
6.10. Vetreria di laboratorio.
6.11. Filtri di carta a media velocità di filtrazione.
6.12. Siringa in vetro da 5 ml.
6.13. Apparecchiatura secondo Kjeldahl per la mineralizzazione e
la distillazione dell'azoto.
7. Preparazione campione.
7.1. Latte: pipettare in provetta pyrex (6.9) 2 ml di latte e
addizionare 6 ml di acido cloridrico 10.6 N (5.2).
Formaggio: pesare in provetta pyrex (6.9) una quantità di
formaggio corrispondente a circa 50 mg di proteina e addizionare 8 ml
di acido cloridrico 8 N (5.3).
7.2. Gorgogliare nella provetta azoto (5.9) per circa due minuti.
Chiuderla strettamente e porla in stufa (6.8) a 110 C per ventitre
ore. Agitare la provetta dopo la prima ora di idrolisi.
7.3. Filtrare l'idrolizzato (7.2) su filtro di carta (6.11).
7.4. Il filtrato può essere conservato a +4 C per alcuni giorni
o congelato; su 2 ml di filtrato (7.3) determinare il contenuto di
azoto totale secondo Kjeldahl. Calcolare il contenuto proteico
moltiplicando per 6.38.
8. Preparazione della soluzione standard di furosina.
8.1. Preparare una soluzione di furosina sintetica (5.7) in acido
cloridrico 3 N (5.4), che contenga circa 1 nanoMole per ml. Tale
soluzione è stabile a XX 20 C.
9. Procedimento.
9.1. Purificazione del filtrato (7.3) mediante estrazione in fase
solida (SPE).
9.1.1. Inserire sulla siringa (6.13) una cartuccia per estrazione
in fase solida (6.1), attivare la stessa eluendo in successione 5 ml
di metanolo (5.4) e 10 ml di acqua (5.1) evitando la disidratazione
della cartuccia tra un passaggio e l'altro.
9.1.2. Pipettare nella siringa 0.5 ml di filtrato (7.3) ed
iniettarlo lentamente nella cartuccia, scartando il corrispondente
eluato ma evitando di introdurre aria nella cartuccia.
9.1.3. Pipettare nella siringa 3 ml di HCl 3 N (5.3), eluire
lentamente fino a completa disidratazione della cartuccia
raccogliendo l'eluato (filtrato purificato) che deve presentarsi
incolore. Agitare e conservare a bassa temperatura il filtrato
purificato che è stabile a - 20 C per una settimana.
9.2. Determinazione cromatografica.
9.2.1. Condizioni cromatografiche:
Eluente A: 0.4% di acido acetico in acqua (v/v).
Eluente B: 0.3% potassio cloruro in eluente A (p/v).
Gradiente di eluizione:
Gradiente di eluizione:
Tempo (min) % A % B
__ __ __
0 100 0
13.5 100 0
20.5 50 50
22.0 50 50
23.0 100 0
32.0 100 0
o equivalente, in funzione della colonna utilizzata.
Flusso: 1.2 ml/min.
Temperatura della colonna: ad un valore costante compreso fra 30 e
35 C in funzione della colonna utilizzata.
9.2.2. Equilibrazione del sistema cromatografico.
Flussare la colonna per alcuni minuti a 1.2 ml/min con una
soluzione A: B = 50: 50; in seguito portare il sistema cromatografico
alle condizioni iniziali di analisi (9.2.1) fino a stabilità della
linea di base.
9.2.3. Effettuare una corsa cromatografica completa iniettando 20
(Micron(l di acido cloridrico 3 N (5.3) per controllare la purezza
degli eluenti. Dopo equilibrio finale il valore della linea di base
deve ritornare a quello iniziale.
9.2.4. Effettuare la separazione cromatografica del filtrato
purificato (9.1.3) e successivamente della soluzione standard di
furosina (8.1). La separazione del picco della furosina deve avvenire
sulla linea di base e con tempo di ritenzione compreso tra 21 e 24
minuti.
10. Calcolo ed espressione dei risultati.
10.1. Integrare sulla linea di base l'area del picco della
furosina ottenuto per il filtrato purificato del campione (9.1.3) e
per la soluzione standard (8.1).
10.2. La quantità di furosina nel campione, espressa in mg per
100 g di proteine, viene così calcolata:
Cs 1 6 x 254 8
Ac x ____ x ____ x ____ ____ x ____
As v 0,95 10 mx4
Ac = area del picco della furosina nel campione
Cs = quantità di furosina standard iniettata, in picoMoli
As = area del picco della furosina nello standard
v = volume del loop di iniezione, in (Micron(l
6 = fattore di diluizione conseguente all'estrazione in fase
solida
0.95 = fattore di recupero della furosina dall'estrazione in fase
solida
254 = peso molecolare della furosina
m = contenuto in proteina di 2 ml di idrolizzato, in mg.
11. Precisione.
Ripetibilita': due determinazioni eseguite presso lo stesso
laboratorio su un medesimo campione non devono differire più del 10%
del loro valore medio.
Riproducibilita': due determinazioni eseguite in laboratori
diversi su un medesimo campione non devono differire più del 15% del
loro valore medio.
12. Riferimenti bibliografici.
12.1. Resmini P., Pellegrino L., Battelli G. - Accurate
quantification of furosine in milk and dairy products by a direct
HPLC method. It. J. Food Sci. 3, 173-183 (1990).
12.2. Resmini P., Pellegrino L., Masotti F., Tirelli A., Prati F.
- Determinazione del latte in polvere ricostituito nel latte crudo ed
in quello pastorizzato, mediante HPLC della furosina. Sci. Tecn.
Latt.-Cas. 43, 169-186 (1992).
12.3. Pellegrino L., Oreglio M. e De Noni I. - Riconoscimento del
latte in polvere nel formaggio mozzarella mediante valutazione
dell'intensità della reazione di Maillard. Atti del Convegno I
Ciseta. Parma, 18-20 ottobre 1993. Chiriotti editore Pinerolo.
Il Ministro delle risorse agricole
alimentari e forestali
DIANA