Serie Generale n. 218 del 18-9-1990
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 1 settembre 1990
Metodi di analisi per la determinazione delle biotossine algali nei molluschi bivalvi, nonche' per la determinazione qualiquantitativa dei popolamenti fitoplanctonici nelle acque marine adibite alla molluschicoltura. (GU Serie Generale n.218 del 18-09-1990)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Vista la legge 2 maggio 1977, n. 192, concernente norme
igienico-sanitarie per la produzione, commercio e vendita dei
molluschi eduli lamellibranchi ed in particolare l'art. 12;
Visto il decreto ministeriale 27 aprile 1978 concernente i
requisiti microbiologici, biologici, chimici e fisici delle zone
acquee sedi di banchi e di giacimenti naturali di molluschi eduli
lamellibranchi e delle zone acquee destinate alla molluschicoltura ai
fini della classificazione in approvate, condizionate e precluse e
successive modificazioni;
Ritenuto di dover procedere alla emanazione dei metodi di analisi
da impiegare per la determinazione delle biotossine nei molluschi
bivalvi e dei popolamenti fitoplanctonici nelle acque adibite alla
molluschicoltura;
Visto il parere del Consiglio superiore di sanità;
Decreta:
Art. 1.
1. Sono approvate le metodiche di analisi, allegate al presente
decreto, concernenti la determinazione delle biotossine nei molluschi
bivalvi e dei popolamenti fitoplanctonici nelle acque adibite alla
molluschicoltura.
2. Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 1 settembre 1990
Il Ministro: DE LORENZO

METODO PER LA DETERMINAZIONE DELLA TOSSINA DSP
NEI MOLLUSCHI SEC. YASUMOTO
1. PRINCIPIO.
1.1. Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoneale
dell'estratto dell'epatopancreas di molluschi in topi adulti. La
presenza di tossina DSP provoca negli animali malessere generale e
morte.
2. MATERIALI.
2.1. Si utilizzano topi albini di razza Swiss del peso di 18-20 g.
3. ESTRAZIONE DELLA TOSSINA.
3.1. Prelevare g 20 di epatopancreas dai molluschi.
3.2. Estrarre in omogeneizzatore con ml 100 di acetone e mantenere
per 2 minuti a temperatura ambiente.
3.3. Filtrare per carta o per garza a più strati o centrifugare.
3.4. Riprendere il residuo, rimasto sul filtro, o il pellet e
ripetere le operazioni descritte nei punti 3.2 e 3.3 per altre due
volte, estraendo con ml 50 di acetone ogni volta.
3.5. Riunire i tre estratti e far evaporare il solvente in bagno
maria a 70 C sotto cappa o in rotavapor a 30-40 C.
3.6. Risospendere il residuo in ml 10-15 di acqua distillata.
3.7. Estrarre la sospensione acquosa con ml 50 di etere etilico.
3.8. Ripetere l'operazione del punto 7) per due volte lavando con
piccole quantità di acqua; riunire gli estratti eterei ed evaporare.
3.9. Ridisciogliere il residuo in ml 4 di Tween 60 all'1%.
4. INOCULAZIONE DEGLI ANIMALI.
4.1. Inoculare intraperitoneo tre topi con ml 1 dell'estratto
ciascuno.
4.2. Parallelamente inoculare altri tre topi con 1 ml del campione
di controllo costituito da residui dei solventi evaporati, ripresi
con ml 4 di Tween 60 all'1%.
4.3. Tenere gli animali in osservazione per 24 ore.
5. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI.
5.1. Se i tre topi muoiono entro le 24 ore, si calcola la media
dei tempi di morte e si possono avere i seguenti due casi:
5.1.1. Se il tempo medio risulta inferiore alle cinque ore indica
positività del test;
5.1.2. Se il tempo medio risulta superiore alle cinque ore, indica
che la tossina è presente nel campione in esame, ma non in quantità
tale da rappresentare un rischio per il consumatore, il test quindi
si ritiene negativo.
Nel caso però che uno dei topi sia morto tra la quarta e la
quinta ora si ritiene necessario ripetere il test.
5.2. Se due topi muoiono entro le 24 ore ed uno sopravvive oltre
tale tempo, si calcola il tempo medio di morte dei primi due topi
senza considerare il terzo.
L'interpretazione di tale tempo medio di morte è identica a
quella del punto precedente.
5.3. Se un solo topo muore entro le 24 ore e gli altri due
sopravvivono il testo è da considerarsi negativo.
5.4. Infine nei casi dubbi, allo scopo di accertarsi che la morte
dei topi non sia avvenuta per altre cause, come ad esempio una
inoculazione male eseguita, è consigliabile effettuare un esame
necroscopico.
METODO BIOLOGICO PER LA DETERMINAZIONE DELLE
TOSSINE IDROSOLUBILI P.S.P. NEI MOLLUSCHI (A.O.A.C.)
1. PRINCIPIO.
1.1. Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoneale di un
estratto di molluschi in topi adulti.
La presenza di tossina PSP provoca la morte degli animali.
2. MATERIALI.
2.1. Si utilizzano topi albini di razza Swiss di peso compreso fra
i 19 e 21 g. Se il peso è R 21 o Q 19 si applica il fattore di
correzione del peso. Non si possono utilizzare topi con peso R 23 g e
topi già usati.
3. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE.
3.1. I molluschi da analizzare vengono puliti esternamente
lavandoli con acqua. Si aprono tagliando i muscoli adduttori e si
rimuovono i tessuti molli (polpa) del mollusco dalla conchiglia. Non
si debbono usare nè calore nè anestetici prima di aprire il
mollusco e bisogna evitare di danneggiare o tagliarne il corpo.
3.2. Circa 100-150 g di polpa vengono trasferiti su una retina di
plastica, dove vengono lasciati scolare per 5'.
3.3. Si omogeneizza il campione in frullatore elettrico.
4. ESTRAZIONE DEL CAMPIONE.
4.1. Si pesano 100 g di materiale omogeneizzato.
4.2. Si aggiungono 100 ml di HCl 0,1N, si agita e si verifica il
pH che deve essere inferiore a 4 (preferibilmente intorno a 3).
4.3. La miscela viene portata ad ebollizione e si lascia bollire
lentamente per 5'.
4.4. Si lascia raffreddare a temperatura ambiente e si verifica
nuovamente il valore del pH che deve essere compreso fra 2 e 4 e mai
superare 4,5. Per abbassarlo si aggiunge HCl 5 N a gocce, agitando
fino ad ottenere il valore del pH voluto. Per alzare il pH si
aggiunge alla miscela NaOH 0,1 N lasciandola cadere a gocce ed
agitando costantemente per prevenire una alcalinizzazione locale e di
conseguenza la distruzione della tossina.
4.5. Si trasferisce la miscela in un cilindro graduato da 200 ml e
si porta a volume con acqua.
4.6. Si centrifuga la miscela a 3000 r.p.m. per 5'.
4.7. Il sopranatante viene trasferito in una beuta e si controlla
di nuovo il pH.
5. INOCULAZIONE DEGLI ANIMALI.
5.1. Si inocula nel peritoneo di ciascun topo test 1 ml di
estratto acido.
5.2. Si annota con un cronometro il tempo all'inizio della
inoculazione e si osserva attentamente il topo per stabilire il tempo
di morte indicato dall'ultimo respiro.
5.3. Si può usare per l'iniziale determinazione un topo solo, ma
è preferibile usarne 2 o 3.
5.4. Se il tempo di morte o la mediana dei tempi di morte dei topi
è Q 5 minuti si fa una diluizione per ottenere un tempo di morte
compreso tra 5 e 7 minuti.
5.5. Se il tempo di morte di 1 o 2 topi a cui è stato iniettato
l'estratto non diluito risulta R 7 minuti, tre o più topi devono
essere inoculati per stabilire la tossicità del campione.
5.6. Se è necessaria una elevata diluizione, si aggiusta il pH
della soluzione aggiungendo gocce di HCl (0,1 o 0,01 N) per portare
il pH ad un valore tra 2 e 4 (mai R 4,5).
5.7. Si inoculano tre topi con la diluizione che dà un tempo di
morte di 5-7 minuti.
6. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI.
6.1. Si determina il tempo mediano di morte dei topi tenendo
presente anche quelli sopravvissuti e tramite la tabella 1 si
determinano i corrispondenti valori di unità topo.
6.2. Se il peso degli animali è Q 19 g o R 21 g si opera una
correzione per ciascun topo moltiplicando le unità topo
corrispondenti al tempo di morte per il fattore di correzione del
peso per quel topo ricavato in base alla tabella 2 ed infine si
sceglie il valore mediano delle unità topo corrette per gruppo.
(Considerare il tempo di morte dei sopravvissuti come R 60 minuti o
equivalente a Q 0,875 U.T. nel calcolo della mediana).
6.3. Si convertono le U.T. in mcg di tossina/ml moltiplicandole
per il valore del fattore di conversione (CF). Quest'ultimo è dato
dal rapporto tra mcg di tossina PSP della soluzione di riferimento
inoculata in peritoneo e l'U.T. corretta:
mcg di tossina/100 g di polpa = (mcg/ml) x fattore di diluizione
x 200 + 20%
7. STANDARDIZZAZIONE DEL METODO BIOLOGICO.
7.1. Preparare una soluzione standard di lavoro di PSP,
utilizzando una soluzione madre USA (stabile indefinitamente in
ambiente fresco), fino ad ottenere una concentrazione di 1 mcg/ml. Si
ottiene portando 1 ml di soluzione standard madre a 100 ml con acqua
distillata. Questa soluzione è stabile numerose settimane a 3-4 C.
7.2. Calcolo del valore del C.F. (fattore di conversione).
7.2.1. Si diluiscono aliquote di 10 ml di soluzione standard di
lavoro (1 mcg/ml) con 10-15-20-25-30 ml di H2O. Il pH delle
diluizioni deve essere compreso fra 2 e 4 e non deve mai superare
4,5.
7.2.2. Viene scelta quella diluizione che iniettata in tre o più
topi per via intraperitoneale alla dose di 1 ml determina la morte
degli animali in un tempo mediano di 5-7 minuti.
7.2.3. La diluizione scelta viene provata con variazioni di + 1 ml
di H2O (ad esempio se 10 ml di standard diluiti con 25 ml di H2O
uccidono i topi in 5-7 minuti, si provano soluzioni diluite 10 + 24 e
10 + 26). Si inietta un gruppo di topi con 1 ml di ciascuna delle 2 o
3 diluizioni che determinano la morte nel tempo mediano di 5-7
minuti.
7.2.4. Si inietta una dose di 1 ml a ciascun topo per via
intraperitoneale e si determina il tempo di morte corrispondente al
tempo trascorso fra l'esecuzione della iniezione e l'ultimo respiro
del topo.
7.2.5. Si ripete la prova 1 o 2 giorni più tardi usando le
diluizioni preparate come sopra descritto, che differiscono per
variazioni di + 1 ml di H2O rispetto alla diluizione usata.
7.2.6. Si ripete poi l'intero test partendo con nuove diluizioni
ottenute dalla soluzione standard di lavoro (1 mcg/ml) preparata
fresca prima dell'uso.
7.2.7. Si calcola il tempo mediano di morte per ciascun gruppo di
10 topi utilizzati e per ciascuna delle diluizioni preparate. Se
tutti i gruppi di 10 topi iniettati con qualunque diluizione danno
tempi mediani di morte Q 5 o R 7 minuti non si tiene conto dei
risultati di questa diluizione nei calcoli successivi. D'altra parte
se anche per uno solo dei gruppi di 10 topi iniettati con una
qualsiasi diluizione si verifica un tempo mediano di morte compreso
tra 5 e 7 minuti, si includono nei calcoli tutti i gruppi di 10 topi
usati con questa diluizione anche se alcuni dei tempi mediani di
morte sono Q 5 o R 7 minuti.
7.2.8. Dal tempo mediano di morte per ciascun gruppo di 10 topi di
ciascuna delle diluizioni selezionate si determina il tempo mediano
di U.T./ml tramite la tabella 1.
7.2.9. Si dividono i mcg di tossina calcolati per 1 ml per le
U.T./ml al fine di ottenere il fattore di conversione (C.F.) il quale
esprime i mcg di tossina equivalenti ad 1 U.T.
7.2.10. Si calcola il valore medio del C.F. e si usa tale valore
come punto di riferimento per controllare le prove di routine.
7.2.11. I valori di C.F. possono variare in modo significativo
nell'ambito dello stesso laboratorio se le tecniche e i topi non sono
rigidamente controllati.
8. USO DELLO STANDARD PER PROVE DI ROUTINE SUI MOLLUSCHI.
8.1. Si controlla periodicamente il valore del C.F.
8.1.1. Se i molluschi sono analizzati meno di una volta a
settimana si determina il valore del C.F. in ciascun giorno in cui
sono effettuate le prove, iniettando 5 topi con opportune diluizioni
dello standard di lavoro.
8.1.2. Se le prove vengono effettuate in giorni diversi
nell'ambito di una settimana è necessario fare soltanto un controllo
settimanale con diluizioni di standard tali che il tempo mediano di
morte risulti compreso tra 5 e 7 minuti. Il valore del C.F. così
determinato dovrebbe essere compreso nel valore medio del C.F. + 20%.
8.1.2. Se il controllo non cade in questo ambito si completa un
gruppo di 10 topi (aggiungendone 5 ai 5 già iniettati) e si inocula
un secondo gruppo di 10 topi con la stessa diluizione di standard.
8.1.3. Si media il valore del C.F. per il secondo gruppo con
quello del primo e si prende il risultato come nuovo valore di C.F.
Variazioni del C.F. R 20% rappresentano una significativa
modificazione della risposta dei topi alla tossina o alle tecniche di
laboratorio. Modificazioni di questo tipo richiedono un cambiamento
del valore del C.F.
8.1.4. Controlli ripetuti del valore dl C.F. di solito conducono a
risultati compresi in una variazione del + 20%. Se si riscontrano
frequentemente variazioni più ampie sarebbe opportuno procedere ad
un controllo di tutta la tecnica prima di continuare con le normali
prove di routine.
TABELLA 1
DETERMINAZIONE TOSSINE IDROSOLUBILI - P.S.P.
=====================================================================
Tempo di morte U.T.
(minuti)
____________________________________________________________________
1:00 100
10 66.2
15 38.3
20 26.4
25 20.7
30 16.5
35 13.9
40 11.9
45 10.4
50 9.33
55 8.42
2:00 7.67
05 7.04
10 6.52
15 6.06
20 5.66
25 5.32
30 5.00
35 4.73
40 4.48
45 4.26
50 4.06
55 3.88
3.00 3.70
05 3.57
10 3.43
15 3.31
20 3.19
25 3.08
30 2.98
35 2.28
40 2.79
45 2.71
50 2.63
55 2.56
4:00 2.50
05 2.44
10 2.38
15 2.32
20 2.26
25 2.21
30 2.16
35 2.12
40 2.08
45 2.04
50 2.00
55 1.96
5:00 1.92
05 1.89
10 1.86
15 1.83
20 1.80
30 1.74
40 1.69
45 1.67
50 1.64
6:00 1.60
15 1.54
30 1.48
45 1.43
7:00 1.39
15 1.35
30 1.31
45 1.28
8:00 1.25
15 1.22
30 1.20
45 1.18
9:00 1.16
30 1.13
10:00 1.11
30 1.09
11:00 1.075
30 1.06
12:00 1.05
13 1.03
14 1.015
15 1.000
16 0.99
17 0.98
18 0.972
19 0.965
20 0.96
21 0.954
22 0.948
23 0.942
24 0.937
25 0.934
30 0.917
40 0.898
60 0.875
TABELLA 2
DETERMINAZIONE TOSSINE IDROSOLUBILI - P.S.P.
====================================================================
Fattori di correzione del peso
____________________________________________________________________
Peso del topo (g) Unità topo
____________________________________________________________________
10 0.50
10.5 0.53
11 0.56
11.5 0.59
12 0.62
12.5 0.65
13 0.675
13.5 0.70
14 0.73
14.5 0.76
15 0.785
15.5 0.81
16 0.84
16.5 0.86
17 0.88
17.5 0.905
18 0.93
18.5 0.95
19 0.97
19.5 0.985
20 1.000
20.5 1.015
21 1.03
21.5 1.04
22 1.05
22.5 1.06
23 1.07

METODO BIOLOGICO PER LA DETERMINAZIONE DELLE TOSSINE LIPOSOLUBILI
N.S.P. NEI MOLLUSCHI (Mc FARREN).
1. PRINCIPIO.
1.1. Il metodo si basa sulla inoculazione intraperitoneale in topi
adulti di un residuo estratto dai mitili con etere etilico.
La presenza di tossina NSP provoca in un determinato tempo la
morte del topo.
1.2. La tossicità è espressa in termini di U.T. Una Unità Topo
è quella quantità di residuo tossico che in media uccide il 50%
degli animali test in 930 minuti.
2. MATERIALI.
2.1. Si utilizzano topi adulti di razza Swiss del peso di 20 + 1
g. Non si possono usare topi di peso inferiore a 10 g o superiore a
25 g, nè topi precedentemente utilizzati.
3. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE.
3.1. I molluschi vengono puliti esteriormente.
3.2. Dopo aver aperto i molluschi, drenare il liquido interno ed
omogeneizzare le parti molli totali.
4. ESTRAZIONE DELLA TOSSINA.
4.1. 100 g di campione in esame omogeneizzato vengono trasferiti
in un beker tarato da 400 ml e si aggiungono ml 1 di HC1 concentrato
e g 5 di NaC1.
4.2. Si lascia bollire per 5' quindi si raffredda a temperatura
ambiente.
4.3. Si trasferisce l'omogenato bollito in una provetta da
centrifuga da 250 ml.
4.4. Si aggiungono 100 ml di etere etilico, si chiude e si agita
vigorosamente per 5 minuti (sfiatare frequentemente).
4.5. Si centrifuga a 2000 r.p.m. per 10-15 minuti e si trasferisce
l'estratto etereo (sopranatante) in un imbuto separatore da 1000 ml.
4.6. L'omogenato di mollusco viene estratto tre volte con 100 ml
di etere etilico e si trasferisce ciascun strato etereo, dopo
centrifugazione, nell'imbuto separatore.
4.7. Drenare qualsiasi emulsione dell'estratto etereo
eventualmente formatosi nell'imbuto separatore.
4.8. Si trasferisce quindi l'estratto etereo in un beker da 400
ml.
4.9. Si effettua una prima evaporazione dell'etere in un bagno di
vapore sotto cappa.
4.10. Si trasferisce il rimanente estratto etereo in un palloncino
da 100 ml già tarato.
4.11. Si evapora completamente l'etere rimasto in un essiccatore a
vuoto rotante (Rotavapor) con temperatura del bagno fra 85 e 95 C.
4.11.1. Assicurarsi che non rimanga etere dopo la finale
evaporizzazione.
5. INOCULAZIONE DEGLI ANIMALI.
5.1. Si pesa accuratamente il residuo oleoso. Supponendo che la
densità del residuo sia la stessa dell'olio di cotone (0,917 g - 1
ml), si porta con olio il residuo a 9,17 g (equivalente a 10 ml).
5.2. La risultante soluzione della tossina in olio di cotone può
essere facilmente manipolata, quindi tutte le seguenti diluizioni
possono essere fatte volumetricamente. (N.B.: mescolare bene dopo
ogni diluizione prima di iniettare).
5.3. Si inietta 1 ml della miscela del residuo in olio di cotone
nel peritoneo di ciascuno dei due topi di peso approssimativo di 20
g.
5.4. Si segna il tempo di iniezione e si osserva il topo per 24 h.
A ciascun topo che sopravvive ad un dato periodo di osservazione
(15,5 h) viene assegnato un tempo di morte di 930 minuti.
5.5. Se i primi due topi non muoiono entro 360 minuti si inoculano
altri tre o più topi e si osservano i cinque topi per 24 h.
5.6. Se i due topi muoiono in meno di 110' si fa una diluizione
dell'estratto e si inoculano altri due topi (per esempio una
diluizione di 1:1,25 aggiungendo 2 ml di olio di cotone al residuo di
8 ml).
5.7. Quando si trova una diluizione che causa la morte dei topi in
un tempo compreso tra i 110 e 360' dopo l'iniezione, altri tre o più
topi sono ancora inoculati ed osservati per 24 h.
5.8. 10 U.T./100 g di parte edibile di mollusco è la minima
quantità di tossina che usualmente può essere quantificata usando
topi di peso di 20 g e per un tempo di continua osservazione di 15,5
h (930 minuti).
5.9. Nel caso di analisi di routine, tale limite di sensibilità
sarà di 20 U.T., corrispondente ad un tempo di continua osservazione
di 360 minuti.
6. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI.
6.1. Si determina il numero di U.T. per ml, corrispondente al
tempo di morte per ciascuno dei cinque topi inoculati mediante la
tabella 1.
6.2. Si correggono le U.T. per il fattore di correzione del peso
di quel topo (tabella 2).
6.3. Se viene rilevato il 100% di mortalità e vengono determinati
i tempi di morte, si calcola il numero medio delle U.T./ml.
6.4. Se viene rilevato il 100% di mortalità, ma non vengono
determinati i tempi di morte, si calcola il numero mediano delle
U.T./ml.
6.5. Se viene rilevato meno del 100% di mortalità, si calcola il
numero mediano delle U.T./ml; in questo caso bisogna includere nel
calcolo anche i sopravvissuti.
6.7. Si calcola il numero totale di U.T./100 g di carne di
mollusco nel modo seguente:
6.7.1 Si moltiplica la media o il numero mediano di U.T. per ml
iniettato per il fattore di diluizione (se applicato) e per 10
(residuo originale portato fino a 10 ml con olio di cotone).
U.T./100 g di parte edibile di mollusco = U.T./ml x fattore di
diluizione x 10.
6.8. Quando la relativa tossicità è stata determinata, si indica
il numero di U.T./100 g di parte edibile di mollusco.
6.9. Quando la relativa tossicità è indeterminata (es. Q 10
U.T./100 g di carne di mollusco) indicare:
6.9.1. Numero di topi morti entro le 24 h: tossina rilevabile Q 10
U.T./100 g di carne di mollusco.
6.9.2. Se i topi non muoiono nelle 24 h: tossina non rilevabile Q
10 U.T./100 g di carne di mollusco.
____________
TABELLA 1
DETERMINAZIONE TOSSINE LIPOSOLUBILI
====================================================================
Tempo di morte - Relazione U.T.
____________________________________________________________________
Tempo di morte (min) Unità topo
____________________________________________________________________
8 10
10 9
12 8
14 7
16 6
18 5
20 4.5
30 4
38 3.8
45 3.6
60 3.4
83 3.2
105 3.0
140 2.8
180 2.6
234 2.4
300 2.2
360 2.0
435 1.8
540 1.6
645 1.4
780 1.2
930 1.0
TABELLA 2
DETERMINAZIONE TOSSINE LIPOSOLUBILI
====================================================================
Fattori di correzione del peso
____________________________________________________________________
Peso del topo (g) Unità topo
____________________________________________________________________
10 0.39
11 0.45
12 0.51
13 0.57
14 0.63
15 0.69
16 0.75
17 0.81
18 0.87
19 0.94
20 1.00
21 1.06
22 1.12
23 1.18
24 1.24
25 1.30
26 1.36
27 1.39
28 1.41
29 1.42
30 1.43

METODI PER LA CONTA DI FITOPLANCTON
IN CAMPIONI DI ACQUA MARINA
ANALISI QUANTITATIVA.
Metodo di raccolta.
Per la raccolta di campioni di acqua di mare destinata alla conta
del fitoplancton ci si avvale, soprattutto per campioni da
raccogliere in profondità, di apposite bottiglie preleva-campioni a
chiusura automatica o a rovesciamento, delle quali esistono in
commercio vari modelli (Niskin, Ruttner, Nansen, Petterson, etc.). La
capacità di tali campionatori non deve comunque essere inferiore a
800 mL.
Conservazione del campione.
I campioni, una volta raccolti, debbono essere fissati con
soluzione di Lugol, così composta: 5 g di iodio puro, 10 g di KI e
10 ml di acido acetico glaciale in 100 mL di acqua distillata. In
alternativa si può usare aldeide formica (soluzione al 40%),
stabilizzata e neutralizzata a pH 7,0 - 7,2 con tetraborato di sodio,
aggiunta in modo da ottenere una concentrazione finale dello 0,4%,
nel campione da fissare (ad esempio 2 mL di conservante ogni 100 mL
di campione). La soluzione di Lugol ha il vantaggio di aumentare il
peso delle cellule e quindi di ridurre i tempi di sedimentazione, ma
l'aldeide formica sembra migliore per rilevare alcune alghe, tra cui
anche quelle del genere Dinophysis.
Il volume del campione da conservare è bene che non sia inferiore
a 500 ml, e ciò per permettere, in presenza di popolamenti
fitoplanctonici particolarmente scarsi, di poter operare
concentrazioni fino a raggiungere una densità rappresentativa.
Concentrazione del campione.
Nel caso si debbano contare alghe poco rappresentate,
numericamente, nel volume di acqua di mare prelevato e fissato, come
è, in genere per Dinophysis, si può ricorrere alla concentrazione
per centrifugazione, utilizzando bassi regimi di giri (ad es.: 1.000
rpm). Si possono così operare concentrazioni 20 volte (o anche piu')
superiori a quelle del campione originario (concentrando, ad es.: 500
mL in 25 mL).
Conta al microscopio.
Ci si avvale del microscopio a rovesciamento, di cilindri e di
camere di sedimentazione a volume variabile (da 5 a 100 mL). I
cilindri o le camere di sedimentazione più alte, offrendo una
maggiore superficie alle specie algali, possono consentirne la
adesione anche lungo le pareti verticali con ciò introducendo errori
nelle conte. Tuttavia, se è preferibile usare cilindri o camere di
sedimentazione basse, la scelta deve esser mutuata dalla quantità
dell'alga da enumerare e dalla superficie di fondo che si intende
esaminare al microscopio. Nel caso della ricerca di alghe del genere
Dinophysis, implicate nei fenomeni di DSP, si possono usare camere di
sedimentazione da 25 mL, operando o sul campione originario o su
quello concentrato per centrifugazione. Nel primo caso, soprattutto,
proprio perchè l'alga è scarsamente rappresentata all'interno del
campione, occorrerà contare tutta la superficie di fondo destinata
alla sedimentazione.
Dal campione conservato si prelevano, dopo agitazione non violenta
ma prolungata, una o più subcampioni di volume scelto in modo da
ottenere una sedimentazione ottimale sul fondo della vaschetta. Come
regola principale, il numero di cellule rilevate sul fondo del
recipiente, in cui avviene le sedimentazione, da cui si effettuerà
la conta, deve essere sufficientemente elevato, ma non tale che si
verifichino sovrapposizioni degli esemplari algali, tali da rendere
difficile la conta.
Per quanto concerne la durata della sedimentazione si consigliano
3 h per ogni cm di altezza del cilindro.
Per il riconoscimento delle specie e la enumerazione delle cellule
è consigliabile l'osservazione microscopica in contrasto di fase.
Per un lavoro di routine è sufficiente un ingrandimento intorno a
200x.
Il fondo della camera di sedimentazione può essere contato
parzialmente (una serie di transetti radiali) o integralmente o per
metà della sua intera superficie. La scelta dipende dal numero di
fitoplanctonti presenti, ma anche dalla quantità dell'alga ricercata
e dalle sue dimensioni. Per alghe di grandi dimensioni, infatti, come
Dinophysis, poco numerose nel campione, occorrerà osservare l'intera
superficie della camera di sedimentazione, muovendo semplicemente
orizzontalmente o verticalmente le viti per lo spostamento del
tavolino che sostiene la camera di sedimentazione. L'ingrandimento da
usare è 100 X.
In caso di lettura dell'intera camera di un cilindro di
sedimentazione da 25 mL, si dovrà semplicemente moltiplicare il
numero di cellule algali per 40, per riportare il numero di cellule
contate effettivamente, al loro titoli in 1 L di acqua campionata.
Qualora il conteggio delle cellule algali si riferisca a specie di
più piccola dimensione, si prenderanno in considerazione due
transetti diametrali, ortogonali tra loro, con un ingrandimento di
400 X.
In tal caso il numero di individui contati (n) si riporta al litro
del campione originale (N) con la seguente formula:
N= n x A/(a.i) x 40
in cui:
A = l'area del fondo del pozzetto;
a = l'area del campo osservato a 400 X;
i = il numero dei campi visivi contenuti in due transetti.
Le alghe di più, grandi dimensioni, contate in precedenza ad
ingrandimento 100 X sull'intera camera, si sommano a quelle più
piccole contate su parte di essa all'ingrandimento di 400 X.
Per valutare l'area "a" si definisce, una volta per tutte, per
ciascun ingrandimento il diametro del transetto, utilizzando un
micrometro obiettivo che serve per misurare l'ampiezza del campo
visivo. Il micrometro obiettivo è un vetrino, su cui è inciso un
tratto di 2 mm, diviso in 200 parti.
Qualora sia stata eseguita una concentrazione del campione,
originariamente raccolto e fissato, occorrerà dividere "N" per il
fattore di concentrazione.
Per specie algali presenti in numero esiguo si raccomanda l'esame
dell'intera area di fondo della camera di sedimentazione (questo può
essere il caso più frequente per Dinophysis, dove già un numero di
200 cellule/L può rappresentare un rischio per quanto attiene la
concentrazione di possibili tossine diarroiche all'interno di
molluschi filtratori). Le specie appartenenti al genere Dinophysis
diffuse nel mare Mediterraneo sono elencate in allegato. Di queste le
specie di cui, allo stato attuale delle conoscenze, si conoscono
varietà tossiche sono contrassegnate con asterisco. Alcuni
ricercatori sostengono, però, che tutte le specie del genere
Dinophysis possono includere varietà produttrici di tossine DSP,
pertanto l'attenzione dovrà essere estesa a tutto il genere. Nel
caso dei controlli mirati alla individuazione di cellule algali
potenzialmente produttrici di tossine DSP, occorrerà enumerare anche
le alghe del genere Prorocentrum. Queste, però, sono in genere più
numerose di Dinophysis.
ANALISI QUALITATIVA.
Ad integrazione dei sistemi di conta per la stima quantitativa
della intera biomassa fitoplanctonica, in alcuni Paesi, si associa
una valutazione qualitativa, volta, però, a definire
quantitativamente il genere Dinophysis, che è il maggiore implicato
nei fenomeni di DSP. Allo scopo, 50 L di acqua di mare, raccolti
nello stesso punto e, preferibilmente, in verticale, sulla intera
colonna di acqua, sono filtrati attraverso un retino di fitoplancton
con maglie da 20 (Micron(m. Il concentrato, portato a circa 800 mL,
viene sottoposto al procedimento di fissazione, come descritto per
l'analisi quantitativa e successivamente riportato a 1 L con acqua di
mare filtrata. Volumi di 1 mL di questo concentrato possono essere
esaminati al microscopio, usando la camera Sedwick-Rafter, per
verificare la presenza di alghe possibilmente produttrici di tossine.
Con tale procedura si ottiene una magnificazione anche di specie
inizialmente scarsamente presenti: date 200 cellule/L nell'acqua
iniziale è possibile visualizzare in 1 mL di concentrato 10 cellule.
La lettura va eseguita sull'intera camera utilizzando un usuale
microscopio. Questa analisi non consente la definizione dell'intera
popolazione algale.
BIBLIOGRAFIA.
Per il riconoscimento delle specie di Dinoflagellati si può fare
riferimento a:
SCHILLER J. 1933-1937 "Dinoflagellatae". Rabenhorst's
Kryptogamenflora 10 (3) I e II. Akad. Verl. Leipzig.
DODGE J.D. 1985 "Atlas of dinoflagellates. A scanning electron
microscope survey". Farrand Press London.
RAMPI L., BERNHARD M. 1980 Chiave per la determinazione delle
Peridinee pelagiche mediterranee CNEN. RT/BIOS (80) 8.
SPECIE MEDITERRANEE DEL GENERE DINOPHYSIS (da L. Rampi, M. Bernhard:
Chiave per la determinazione delle peridinee pelagiche mediterranee.
CNEN. RT/BIO (80) 8)
*Dinophysis acuminata
*Dinophysis acuta
Dinophysis acutoides (= D. acutum)
Dinophysis alata
Dinophysis amandula (=Ph. ovum = D. amygdala)
Dinophysis apicata
Dinophysis argus
Dinophysis biceps
Dinophysis caudata var. caudata/Dinophysis caudata var.
acutiformis
Dinophysis circumsuta
Dinophysis cuneus
Dinophysis dens
Dinophysis dentata
Dinophysis diegensis
Dinophysis dolichopterygium
Dinophysis doryphora
Dinophysis elongata
Dinophysis expulsa
Dinophysis fava
*Dinophysis fortii
Dinophysis gigantea
Dinophysis hastata
Dinophysis hindemarchi
Dinophysis infundibulus
Dinophysis mitra
Dinophysis odiosa
Dinophysis operculata
Dinophysis operculoides
Dinophysis ovata
Dinophysis ovum
Dinophysis parva
Dinophysis parvula
Dinophysis paulseni (=D. mucronata)
Dinophysis planiceps
Dinophysis porodictyum
Dinophysis pugiunculus
Dinophysis pulchella
Dinophysis pulchra
Dinophysis punctata
Dinophysis pusilla
Dinophysis rapa
Dinophysis recurva
Dinophysis rotundata
*Dinophysis sacculus
Dinophysis schroederi
Dinophysis schuetti
Dinophysis similis
Dinophysis sphaerica
Dinophysis striata
Dinophysis tripos
Dinophysis umbosa
Dinophysis uracantha