Serie Generale n. 12 del 17-1-1994
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
ORDINANZA 13 gennaio 1994
Piano nazionale di controllo dell'arterite virale equina. (GU Serie Generale n.12 del 17-01-1994)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto il testo unico delle leggi sanitarie, approvato con regio
decreto 27 luglio 1934, n. 1265;
Visto il regolamento di polizia veterinaria, approvato con decreto
del Presidente della Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320;
Vista la legge 23 dicembre 1978, n. 833, concernente l'istituzione
del Servizio sanitario nazionale;
Vista l'ordinanza ministeriale 12 agosto 1970 concernente la
profilassi delle malattie virali respiratorie degli equini;
Visto il parere del Consiglio superiore di sanità del 22 dicembre
1993;
Considerato che i risultati delle indagini siero-epidemiologiche
effettuate nei confronti dell'arterite virale equina hanno
evidenziato la diffusione dell'infezione nel patrimonio equino
nazionale;
Ravvisata la necessità e l'urgenza di controllare l'infezione al
fine di addivenire ad un programma di eradicazione della malattia;
Ordina:
Art. 1.
1. I servizi veterinari delle unità sanitarie locali provvedono
annualmente, entro il 31 agosto, al censimento degli equidi maschi
interi di età superiore a ventiquattro mesi presenti sul territorio.
2. Tutti i riproduttori equini e asinini maschi sono sottoposti nel
periodo compreso tra il 1 settembre ed il 31 dicembre di ogni anno,
prima dell'inizio della stagione di monta, all'accertamento
sierologico nei confronti dell'arterite virale equina. Nel periodo
intercorrente fra il prelievo del campione di sangue e l'esito
dell'esame i suddetti equidi non possono essere adibiti alla monta
nè il loro sperma impiegato per l'inseminazione artificiale.
3. È vietato detenere nelle stazioni di monta maschi interi non
autorizzati alla riproduzione.

Art. 2.
1. Gli animali che, a seguito dell'accertamento di cui all'art. 1,
comma 2, sono risultati negativi possono essere destinati
all'accoppiamento ed il loro sperma utilizzato per l'inseminazione
artificiale, semprechè siano rispettati tutti gli altri requisiti
previsti dalla normativa vigente in materia di riproduzione animale.

Art. 3.
1. Gli animali risultati positivi all'accertamento sierologico
restano esclusi dalla monta ed il loro sperma non può essere
impiegato fino alla conclusione degli ulteriori accertamenti per la
ricerca del virus dell'arterite equina nello sperma. L'autorità
sanitaria locale competente per territorio provvede affinchè tali
animali vengano sottoposti nel frattempo ad idoneo isolamento.
2. Gli stalloni sieropositivi che, a conclusione degli accertamenti
di cui al comma precedente, non risultano essere eliminatori di virus
possono essere destinati alla riproduzione nel rispetto delle altre
disposizioni vigenti in materia di riproduzione animale.
L'accertamento virologico in tali soggetti dovrà essere comunque
ripetuto anche l'anno successivo al riscontro della sieropositività.
3. Gli stalloni sieropositivi eliminatori di virus sono esclusi
dalla monta ed il loro sperma non può essere impiegato per
l'inseminazione artificiale.
4. Gli animali risultati eliminatori di virus sono tenuti in
isolamento, disposto ai sensi dell'art. 10, lettera b), del
regolamento di polizia veterinaria, sottoposti a vigilanza
veterinaria in sedi o ricoveri situati a conveniente distanza dagli
animali recettivi. Le misure anzidette sono revocate qualora il
proprietario proceda a sua scelta alla macellazione od alla
castrazione degli animali.
5. Il proprietario o detentore dello stallone accertato eliminatore
di virus può richiedere la ripetizione dell'accertamento virologico
prima della successiva stagione di monta e se l'esito di tale esame
consente di escludere la persistenza dello stato di eliminatore, è
revocato l'isolamento e si applica quanto disposto nel comma 2. Nel
periodo intercorrente tra il prelievo del campione di sperma e
l'esito del nuovo accertamento virologico vige comunque il divieto di
monta e la raccolta e l'impiego dello sperma, di cui all'art. 3,
comma 3.

Art. 4.
1. Il sindaco, con apposito provvedimento, può consentire, su
domanda del proprietario o detentore, lo spostamento degli animali
sieropositivi eliminatori di virus, informandone l'autorità
sanitaria regionale o della provincia autonoma competente per
territorio e previo assenso dell'autorità sanitaria locale nonchè
regionale o della provincia autonoma di destinazione, con
l'indicazione del giorno di arrivo al fine di consentire l'idoneo
isolamento dell'animale e la relativa vigilanza veterinaria, secondo
quanto disposto nell'art. 3, comma 4.

Art. 5.
1. Degli stalloni sieropositivi eliminatori di virus nonchè di
quelli sieropositivi non eliminatori di virus deve essere data
tempestiva segnalazione, assieme a tutti i dati identificativi, ai
competenti organi veterinari regionali o delle province autonome.
Le regioni, assessorati alla sanità, e le province autonome
provvedono ad istituire un elenco aggiornato degli stalloni
sieronegativi, sieropositivi non eliminatori ed eliminatori di virus
e lo trasmettono al Ministero della sanità - Direzione generale dei
servizi veterinari, agli assessorati all'agricoltura regionali e
delle province autonome nonchè all'UNIRE.

Art. 6.
1. A parziale deroga del divieto di cui all'art. 3, comma 3, per
gli stalloni sieropositivi eliminatori di virus riconosciuti di
particolare pregio zootecnico, previa acquisizione del parere
motivato dell'UNIRE, il Ministero della sanità - Direzione generale
dei servizi veterinari può autorizzarne, su richiesta del
proprietario l'impiego nella riproduzione a particolari e specifiche
condizioni volte ad impedire la diffusione del virus.
2. Resta in ogni caso escluso l'impiego del loro sperma congelato
per l'inseminazione artificiale. L'impiego dello sperma fresco e/o
refrigerato può essere consentito invece alle condizioni stabilite
nell'autorizzazione di cui al comma 1.
3. Il servizio veterinario della unità sanitaria locale controlla
il rispetto delle condizioni stabilite nelle singole autorizzazioni
concesse.

Art. 7.
1. Le fattrici inseminate da stalloni eliminatori di virus, in
applicazione del disposto dell'art. 6, commi 1 e 2, non possono
essere accoppiate con altri stalloni sieronegativi o sieropositivi
non eliminatori di virus nel corso della stessa stagione di monta. Le
prescrizioni sanitarie che devono essere osservate nell'inseminazione
delle fattrici e nel periodo successivo, sono riportate nella stessa
autorizzazione prevista all'art. 6, comma 1, e sono fatte osservare
dall'autorità sanitaria locale competente.
2. Tali animali continuano ad essere sottoposti nel corso dello
stesso anno dell'inseminazione a vigilanza veterinaria ed il loro
spostamento avviene, durante tale periodo, previo parere favorevole
del servizio veterinario della unità sanitaria locale competente per
territorio, che ne informa l'autorità sanitaria locale e regionale o
della provincia autonoma di destinazione.

Art. 8.
1. Un allevamento di equidi, stazione di monta pubblica o privata,
un centro di inseminazione artificiale o di produzione di sperma di
equidi è riconosciuto indenne da arterite virale quando:
a) nessun soggetto ha manifestato sintomi clinici riferibili ad
arterite virale equina negli ultimi sei mesi;
b) tutti gli equidi di età superiore a sei mesi sono risultati
negativi a due prove sierologiche nei confronti dell'arterite virale
equina eseguite con un intervallo di quaranta giorni e
successivamente una volta l'anno;
c) nell'allevamento o altro impianto vengono introdotti solo
animali provenienti da:
allevamenti o altri impianti indenni;
allevamenti o altri impianti non sottoposti a provvedimenti di
polizia veterinaria per l'arterite virale equina; in tale caso gli
animali da introdurre devono essere stati sottoposti da non oltre
quindici giorni ad una prova sierologica con esito negativo nei
confronti dell'arterite virale equina e ad un'ulteriore prova
sierologica con esito negativo a quaranta giorni di distanza dalla
introduzione.
2. Per gli allevamenti o impianti riconosciuti indenni da arterite
virale equina viene rilasciata annualmente apposita attestazione da
parte dell'autorità sanitaria locale competente da trasmettersi alla
rispettiva autorità sanitaria regionale o della provincia autonoma
ed al Ministero della sanità - Direzione generale dei servizi
veterinari.

Art. 9.
1. Allo scopo di verificare l'evoluzione dell'infezione ed in vista
di un programma di eradicazione, vengono predisposti dalle regioni e
province autonome appositi piani di controllo sierologico nei
confronti dell'arterite virale equina sulla restante popolazione di
equidi, con il coordinamento del Ministero della sanità.

Art. 10.
1. L'autorità sanitaria regionale o della provincia autonoma
coordina le attività previste dalla presente ordinanza.
2. Il prelievo dei campioni è effettuato dai veterinari delle
unità sanitarie locali o da veterinari autorizzati appositamente
istruiti, sotto il controllo del servizio veterinario
territorialmente competente.
3. I campioni vengono inviati per gli accertamenti agli istituti
zooprofilattici sperimentali competenti per territorio che provvedono
preliminarmente all'istruzione tecnica per i prelievi nonchè a
concordare con i servizi veterinari delle unità sanitarie locali
l'afflusso temporale e numerico dei campioni.
4. I compensi dovuti per il prelievo dei campioni e per gli
accertamenti diagnostici sierologici e virologici sono a carico dei
privati in base alle tariffe stabilite dai tariffari unici regionali
per il personale del Servizio sanitario nazionale ed a quelle che
verranno stabilite con decreto del Ministro della sanità ai sensi
dell'art. 5, comma 1, del decreto legislativo 30 giugno 1993, n. 270.

Art. 11.
1. Gli esami sierologici e l'accertamento dello stato di
eliminatore di virus sono eseguiti secondo i protocolli e le
metodiche riportate nell'allegato.

Art. 12.
1. I risultati dei controlli effettuati secondo le modalità
stabilite nella presente ordinanza sono sottoposti annualmente alla
valutazione del Ministero della sanità - Direzione generale dei
servizi veterinari.

Art. 13.
1. Per l'anno 1993 il censimento di cui all'art. 1, comma 1, è
limitato agli equidi maschi destinati alla riproduzione ed è basato
sugli elenchi degli stalloni approvati.
2. Per la stagione di monta 1994 gli accertamenti di cui all'art.
1, comma 2, sono eseguiti entro il 15 febbraio 1994.

Art. 14.
1. Le disposizioni concernenti l'arterite virale equina contenute
nella ordinanza ministeriale 12 agosto 1970 non si applicano agli
animali riscontrati sieropositivi a seguito dei controlli effettuati
sulla base del piano previsto dalla presente ordinanza nè agli altri
animali presenti nello stesso allevamento o impianto quando la
sieropositività non sia attribuibile ad infezione in atto.
2. È abrogato l'art. 3, comma 2, dell'ordinanza ministeriale 12
agosto 1970.

Art. 15.
1. La presente ordinanza entra in vigore il giorno successivo alla
sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Roma, 13 gennaio 1994
Il Ministro: GARAVAGLIA

ALLEGATO

METODI DIAGNOSTICI PER L'ACCERTAMENTO DELLA
ARTERITE VIRALE NEGLI EQUIDI RIPRODUTTORI MASCHI

Per gli accertamenti sierologici e virologici si applicano le
linee direttrici ed i criteri minimi di seguito riportati.

A) IDENTIFICAZIONE DEGLI ANTICORPI NEI CONFRONTI DEL VIRUS
DELL'ARTERITE VIRALE EQUINA IN CAMPIONI DI SANGUE

1. Raccolta dei campioni di sangue.
Per la diagnosi sierologica il prelievo di sangue deve essere
effettuato da riproduttori in buono stato di salute utilizzando
provette sterili.
Qualora fra gli equini mantenuti assieme ai riproduttori fossero
presenti soggetti con sintomatologia clinica riferibile a malattie
infettive, il prelievo di sangue dovrà essere effettuato trascorsi
quindici giorni dall'ultimo caso di malattia.
2. Prova di sieroneutralizzazione.
Si utilizzano cellule renali di coniglio in linea continua (RK 13)
e come terreno di crescita Eagle Minimum Essential Medium (MEM)
addizionato di antibiotici e siero fetale bovino al 5%.
La prova viene eseguita su piastre microtiter a 96 pozzetti a
fondo piatto.
I sieri, inattivati a 56 C per 30 minuti, vengono diluiti in base
2 da 1:2 a 1:256 in Eagle MEM, effettuando 4 repliche per ogni
campione.
Ad ogni diluizione viene aggiunto un eguale volume di sospensione
virale contenente 100 TCID50 dello stipite di referenza Bucyrus. Il
virus viene diluito in MEM antibiotato addizionato di complemento ad
una concentrazione pari al 10% della soluzione.
Dopo un contatto di 60 minuti a 37 C in atmosfera umida al 5% di
CO2, ad ogni pozzetto contenente la miscela siero-virus ed ai
relativi controlli viene aggiunto un volume di sospensione cellulare
contenente 2 x 10 '5 cellule/ml, pari a quello della miscela siero-
virus.
La lettura viene eseguita dopo 48-72 ore. 3. Interpretazione dei
risultati (con metodo statistico).
Una diluizione del siero è positiva quando è presente una
riduzione dell'effetto citopatico maggiore o uguale al 75%, comparata
a quella evidenziabile nei pozzetti della più bassa diluizione del
controllo del virus.
Uno stallone è considerato sieropositivo se al test di
sieroneutralizzazione viene riscontrato un titolo anticorpale uguale
o superiore a 4.

B) ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE DEL VIRUS
DELL'ARTERITE VIRALE EQUINA IN COLTURE CELLULARI

1. Raccolta dei campioni di sperma.
Per l'isolamento del virus è essenziale disporre dello sperma
degli stalloni.
Lo sperma deve essere raccolto mediante vagina artificiale a fondo
cieco (tipo Colorado o Missouri).
Per il lavaggio dei genitali dello stallone prima del prelievo non
devono essere impiegate soluzioni disinfettanti e la temperatura
interna della vagina artificiale non deve essere superiore a 40 C.
Ai fini dell'isolamento virale è necessario raccogliere campioni
di sperma contenenti sia la parte liquida sia la frazione cellulare
dell'eiaculato.
Il campione deve essere quindi conservato in ghiaccio secco e
comunque trasportato immediatamente al laboratorio in regime di
refrigerazione.
2. Isolamento del virus.
L'isolamento del virus dai campioni di sperma, raccolti secondo le
indicazioni di cui al punto 1, viene effettuato su colture di cellule
renali di coniglio in linea continua sensibili (RK13, ATCC, CCL37).
Il campione di sperma deve essere sottoposto ad esame non appena
pervenuto al laboratorio oppure immediatamente congelato.
Dopo trattamento con ultrasuoni (3 cicli di 15 secondi a distanza
di 2 minuti) e centrifugazione (1000 RPM x 10 minuti), si effettuano
diluizioni logaritmiche in base 10 del plasma seminale con terreno
Eagle MEM addizionato di antibiotici e fungizone e si pongono ad
incubare a + 4 C x 2 ore.
Come controllo del sistema, si allestiscono diluizioni di un
campione positivo a titolo noto.
Le diluizioni da 10 ' - 1 a 10 ' - 4 del plasma seminale si
inoculano su monostrati cellulari confluenti della linea RK13,
precedentemente lavati con soluzione salina antibiotata, effettuando
almeno quattro repliche per diluizione.
Dopo un'ora di contatto in atmosfera umida al 5% di CO2 a 37 C
aggiungere terreno Eagle MEM antibiotato contenente
carbossimetilcellulosa allo 0,75% (a media viscosita') e siero fetale
bovino all'1%, senza asportare l'inoculo.
Le colture inoculate vengono esaminate per 6-7 giorni al fine di
evidenziare l'effetto citopatico del virus.
In caso di negatività si inoculano colture cellulari fresche con
il sopranatante del primo passaggio.
In caso di positività si procede all'identificazione del virus
isolato mediante test di neutralizzazione o test di
immunofluorescenza diretta.
3. Interpretazione dei risultati.
Uno stallone sieropositivo viene considerato eliminatore quando il
virus, isolato da almeno uno dei tre campioni di sperma prelevati a
distanza di 10-15 giorni, viene identificato come virus dell'arterite
equina.
Uno stallone sieropositivo non è da considerare eliminatore se
dai tre campioni di sperma, di cui al precedente paragrafo, non viene
isolato il virus dell'arterite equina.

C) PROVA DELL'ACCOPPIAMENTO (BREEDING TEST)

1. Modalità della prova.
In alternativa alla ricerca diretta del virus dell'arterite equina
nei campioni di sperma degli stalloni risultati sieropositivi, lo
stato di eliminatore può essere accertato mediante la prova di
accoppiamento (breeding test).
Lo stallone risultato sieropositivo deve montare 2 cavalle
sieronegative almeno 2 volte al giorno per 2-4 giorni consecutivi.
Le cavalle devono essere mantenute in isolamento e controllate sia
clinicamente che sierologicamente, secondo la metodica descritta al
capo B), al 14 e 28 giorno dall'ultimo accoppiamento.
2. Interpretazione dei risultati.
Qualora nessuna delle cavalle manifesti alcun sintomo riferibile
ad arterite equina e risulti negativa al test sierologico del 28
giorno, lo stallone può essere considerato non eliminatore di virus.
Se vengono riscontrati sintomi di malattia e/o sieroconversione
nelle cavalle accoppiate con lo stallone sieropositivo, lo stallone
deve essere considerato eliminatore di virus.