Serie Generale n. 3 del 4-1-1995
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 1 dicembre 1994
Controlli di Stato sui vaccini anti-epatite A. (GU Serie Generale n.3 del 04-01-1995)

IL DIRETTORE GENERALE
DEL SERVIZIO FARMACEUTICO
Visto il decreto legislativo 29 maggio 1991, n. 178, recante norme
di recepimento delle direttive della Comunità economica europea in
materia di specialità medicinali;
Visto, in particolare l'art. 20, commi 5 e 6, del predetto decreto
legislativo, con il quale vengono stabilite norme in materia di
controlli di Stato sui vaccini vivi e sulle relative procedure
tecniche di esecuzione;
Visto il decreto legislativo 30 giugno 1993, n. 267;
Visto il parere favorevole, alle prescrizioni e alle procedure
tecniche per l'esecuzione dei previsti controlli di Stato indicate
dall'Istituto superiore di sanità, espresso dal Consiglio superiore
di sanità nella seduta dell'11 maggio 1994;
Decreta:
Art. 1.
L'Istituto superiore di sanità - ai sensi dell'art. 1, comma 2,
lettera e) del decreto legislativo 30 giugno 1993, n. 267 - effettua
i controlli sui vaccini anti-epatite A.

Art. 2.
Le spese del controllo sono a carico del produttore nella misura
prevista della normativa vigente.

Art. 3.
Le procedure tecniche per l'esecuzione del controllo di Stato sul
predetto vaccino, elaborate dall'Istituto superiore di sanità sono
allegate al presente decreto e ne costituiscono parte integrante.
Roma, 1 dicembre 1994
Il direttore generale: SCIOTTI
Registrato alla Corte dei conti il 24 dicembre 1994
Registro n. 1 Sanità, foglio n. 365

NORME RELATIVE ALLA PRODUZIONE ED AL CONTROLLO
DEL VACCINO DELL'EPATITE A INATTIVATO
Il vaccino antiepatite A è costituito da una sospensione acquosa
dall'aspetto opalescente, di virus dell'epatite A (HAV), ottenuto in
colture di cellule diploidi, o altre colture cellulari idonee ed
inattivato mediante procedimenti che ne permettano la intatta
conservazione delle caratteristiche antigeniche ed immunogeniche. Il
vaccino può contenere un prodotto adiuvante, una sostanza ad
attività preservativa ed antimicrobica, ed una sostanza
stabilizzante.
Preparazione di riferimento: la preparazione di riferimento è
costituita da una frazione di un lotto di vaccino che sia risultato,
in studi clinici, in grado di indurre non meno del 95% di
sieroconversione dopo un ciclo completo di immunizzazione in giovani
adulti.
PREPARAZIONE.
La preparazione del vaccino viene effettuata partendo da un lotto
di semenza, derivato dalla replicazione di un ceppo virale
caratterizzato dal punto di vista biologico e clinico. Devono essere
definite le informazioni relative all'origine del ceppo ed alle
successive manipolazioni e deve essere preventivamente autorizzato
dall'Istituto superiore di sanità.
Non dovranno essere effettuati ulteriori passaggi rispetto a
quelli effettuati per la preparazione vaccinale di riferimento,
saggiata con esito soddisfacente, relativamente a sicurezza ed
efficacia in prove di laboratorio ed in studi clinici.
Controlli sulla semenza virale: la sospensione di semenza virale,
impiegata nella produzione, deve essere controllata con risultati
soddisfacenti, con saggi appropriati, per quanto concerne l'identità
e la concentrazione virale e per quanto concerne l'assenza di agenti
contaminanti, secondo le norme della Farmacopea ufficiale italiana.
La moltiplicazione del virus deve effettuarsi con le dovute
precauzioni di asepsi in cellule umane diploidi approvate per
l'impiego nella produzione dei vaccini.
Controlli sul ceppo cellulare e sulla banca di cellule: il ceppo
cellulare e la banca di cellule devono essere approvati dall'Istituto
superiore di sanità.
Devono essere caratterizzati rispetto all'origine, alle
caratteristiche di crescita, sopravvivenza durante la conservazione,
mantenimento del cariotipo di origine e caratteristiche morfologiche.
Il ceppo cellulare deve risultare adatto alla crescita virale.
Le cellule devono risultare, in saggi effettuati "in vivo" esenti
da contaminati virali avventizi.
Tali saggi devono essere effettuati in almeno 10 topini neonati di
età inferiore a 24 ore, 10 topi adulti, 5 cavie, 5 conigli e 10 uova
embrionate di pollo di 9-11 giorni.
Le cellule devono risultare libere da eterotransplantabilità e
sono adatte alla produzione del vaccino se gli animali inoculati,
rimangono sani e sopravvivono al periodo di osservazione in
percentuale non inferiore all'80%, se nessun animale o uovo
embrionato mostra presenza di un agente contaminante avventizio e se
nessun animale mostra insorgenza di tumore. Devono, inoltre,
corrispondere ai requisiti di sterilità batterica micotica ed
essenza di micoplasmi con saggi conformi alla Farmacopea ufficiale
italiana.
I liquidi di coltura devono essere saggiati, con risultati
soddisfacenti, in saggi atti a definire l'assenza di agenti
contaminanti avventizi.
Il siero fetale bovino, usato come fattore di crescita delle
colture cellulari, deve corrispondere ai requisiti di sterilità
batterica, micotica, ed assenza di micoplasmi e di virus bovini.
CONTROLLO DELLE SINGOLE RACCOLTE DI SOSPENSIONE VIRALE PRIMA
DELLA MISCELAZIONE.
Possono essere considerate singole raccolte di sospensione virale
una, o più raccolte miscelate, derivanti dalla stessa produzione di
cellule. Il siero di origine animale usato come fattore di crescita
delle colture cellulari deve essere approvato e non di origine umana.
Il siero stesso e la tripsina usati nelle preparazioni devono
risultare esenti da agenti contaminanti estranei. Le concentrazioni
dell'indicatore di PH (rosso fenolo) e degli antibiotici devono
essere ai minimi livelli di efficacia ed approvate. Deve essere
tenuta una preparazione di cellule di controllo in quantità non
inferiore a 500 ml.
Sulle singole raccolte di sospensione virale, prima della
chiarificazione, dovranno essere eseguite le seguenti prove:
a) controllo di sterilità batterica e micotica con saggi
conformi alla Farmacopea ufficiale italiana;
b) almeno 20 topi adulti devono essere inoculati per via
peritoneale con 0.5 ml e per via cerebrale con 0.03 ml di sospensione
e devono essere tenuti in osservazione per ventuno giorni;
c) almeno 20 topi neonati devono essere inoculati per via
peritoneale con 0.03 ml e per via cerebrale con 0.01 ml di
sospensione e devono essere tenuti in osservazione per quattordici
giorni;
d) almeno 5 cavie del peso 300-400 grammi devono essere
inoculate per via peritoneale con 5 ml e per via cerebrale con 0.10
ml di sospensione e devono essere tenute in osservazione per
quarantadue giorni;
e) almeno 5 conigli del peso di 1500-2000 grammi devono essere
inoculati per via intraendemica con 1 ml e per via sottocutanea con 2
ml di sospensione e devono essere tenuti in osservazione per almeno
trenta giorni.
Gli animali di cui ai punti b), c), d), e), che muoiono nelle
prime 24 ore possono essere sostituiti. Quelli che muoiono durante il
periodo di osservazione saranno sottoposti ad autopsia e gli organi
verranno esaminati istologicamente. Il controllo è favorevole se
almeno l'80% degli animali sopravvive e nessuno di essi presenta
segni locali o generali di infezione dovuta ad un agente
trasmissibile presente nella sospensione virale;
f) 20 piastre con terreno solido devono essere inoculate con
0.01 ml di sospensione ciascuna e 4 tubi, contenenti 10 ml di terreno
liquido con 1 ml; entrambi i terreni devono essere adatti alla
crescita di micoplasmi. I campioni da esaminare devono essere
incubati a +40 C se per un periodo non eccedente le 24 ore,
altrimenti devono essere posti a - 20 C;
g) almeno 50 ml devono essere inoculati, dopo neutralizzazione
del virus mediante siero iperimmune (non prodotto nell'uomo o nella
scimmia), in cellule sensibili al virus SV40 e che devono essere
osservate per un periodo di ventotto giorni, con la possibilità di
eseguire una subcoltura al quattordicesimo giorno.
La singola raccolta di sospensione virale deve inoltre essere
sottoposta ai seguenti controlli:
saggi di identità virale mediante appropriato metodo
immunochimico con l'impiego di anticorpi specifici;
saggi di sterilità batterica e micotica su almeno 10 ml di
sospensione;
determinazione del contenuto antigenico mediante un adatto metodo
immunochimico per il monitoraggio della conformità di produzione.
CONTROLLO DEL LOTTO DI PREPARAZIONE VIRALE E CHIARIFICAZIONE.
Il lotto di preparazione virale può essere costituito da una
miscela delle singole "raccolte". La chiarificazione deve essere
eseguita con metodo che assicuri l'allontanamento di ogni detrito
cellulare. La sospensione virale deve presentare requisiti
soddisfacenti per quanto concerne: concentrazione virale, attività
specifica quantitativo residuo di sieroalbumina bovina e quantitativo
di DNA derivante dal substrato cellulare, mediante l'applicazione dei
seguenti saggi:
a) Determinazione della concentrazione virale: la concentrazione
virale deve essere determinata con adatto metodo in coltura di
tessuto per il monitoraggio della conformità di produzione. La
determinazione effettuata in questa fase costituisce il punto di
partenza per la valutazione della curva di inattivazione virale.
b) Determinazione dell'attività specifica: l'attività specifica
deve essere determinata con adatto metodo immunochimico. Il rapporto
del contenuto di antigene di HAV rispetto al totale contenuto
proteico non deve essere inferiore a quello approvato.
c) Determinazione del contenuto di siero albumina bovina: il
contenuto di sieroalbumina bovina deve essere determinato con metodo
immunochimico e non deve eccedere 5 ng/dose singola.
d) Determinazione del DNA cellulare residuo: il DNA cellulare
residuo deve essere determinato con metodo appropriato. Il
quantitativo presente non deve eccedere 10 pg/singola dose.
INATTIVAZIONE VIRALE.
Il metodo di inattivazione virale deve risultare idoneo al
mantenimento delle caratteristiche antigeniche ed immunogeniche del
virus e deve essere approvato dall'Istituto superiore di sanità.
L'inattivazione virale può essere effettuata sul lotto di
produzione virale dopo chiarificazione e deve essere preceduta da una
procedura di allontanamento degli aggregati di particelle virali.
Ciascun lotto di produzione deve essere controllato attraverso la
valutazione di una curva di inattivazione, comprendente misurazioni
in almeno tre intervalli di tempo, per il monitoraggio della
conformità di produzione.
Deve inoltre essere valutata, per ciascun lotto, l'effettiva
inattivazione virale mediante un saggio di amplificazione per la
valutazione dell'infettività residua che preveda l'inoculo in
colture cellulari, dello stesso tipo di quelle di produzione, di una
quantità equivalente a non meno di 1500 dosi singole e dopo
l'effettuazione di almeno due passaggi. Il metodo di rilevamento
dell'attività virale deve corrispondere a requisiti di sensibilità.
Il risultato è valutato positivamente se non è presente, al termine
del processo di inattivazione, alcuna evidenza di moltiplicazione
virale. Il saggio deve includere i controlli della suscettibilità
cellulare e dell'assenza di interferenza.
Il lotto di produzione virale dopo l'inattivazione deve essere
controllato, per: a) sterilità batterica e micotica secondo le norme
descritte nella Farmacopea italiana; b) per il contenuto di antigene
di HAV mediante metodo immunochimico; c) per il contenuto di
preservativo antimicrobico, che deve essere compreso nei limiti
dell'85-115% di quanto dichiarato in etichetta.
PRODOTTO FINITO.
Sul prodotto finito ed infialato devono essere eseguiti i seguenti
controlli:
a) controllo di identità con l'impiego di anticorpi specifici e
l'applicazione di un metodo immunochimico o di rilevamento di
immunogenicità in topo;
b) controllo di sterilità e tossicità conformemente alle norme
della Farmacopea ufficiale italiana;
c) controllo del contenuto di endotossine batteriche. Tale
contenuto deve essere inferiore a 2 UI per dose;
d) controllo del contenuto di alluminio. Tale contenuto deve
essere conforme alle norme della Farmacopea italiana;
e) controllo dell'attività mediante saggio di immunogenicità
in topo. Tale controllo deve essere effettuato in parallelo ad una
preparazione di riferimento secondo il metodo seguente:
dovrà essere impiegato un adatto ceppo di topi dell'età di 5
settimane e dello stesso sesso. Il vaccino e la preparazione di
riferimento dovranno essere saggiati in almeno tre diluizioni tali da
comprendere il valore di ED50. Gli animali devono essere inoculati,
in gruppi di almeno sette per via sottocutanea con 1 ml del vaccino e
della preparazione di riferimento, diluiti in una soluzione
fisiologica contenente l'adiuvante. Deve essere presente un gruppo di
animali non inoculati di controllo.
I campioni di siero sono prelevati da ciascun animale dopo 28-32
giorni dall'inoculazione, per la determinazione del titolo
anticorpale specifico mediante adatto saggio immunologico.
Il calcolo del titolo viene effettuato secondo gli usuali metodi
statistici per una determinazione quantitativa. Il dosaggio deve
essere determinato in parallelo ad una preparazione di referenza,
deve essere espresso come valore relativo e deve risultare in ogni
caso non inferiore ad 1 rispetto alla preparazione di riferimento.
CONSERVAZIONE - SCADENZA.
Il vaccino conservato ad una temperatura compresa tra 2 C e 10
C, mantiene la propria attività per almeno tre anni dalla data di
effettuazione, con esito soddisfacente, del saggio di controllo di
attività.
ETICHETTE.
Oltre alle indicazioni di cui alla monografia "Vaccini"
(Farmacopea ufficiale italiana) l'etichetta sul recipiente e
sull'imballaggio deve riportare il dato relativo all'origine
biologica delle cellule usate per la preparazione del vaccino.
DOCUMENTAZIONE DA INVIARE
ALL'ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ
1) Domanda in carta legale con la quale viene richiesto che il
vaccino sia sottoposto a controllo di Stato, nella quale sia
precisato il numero di serie e di partita del vaccino. Tale domanda,
indirizzata al Ministero della sanità, dovrà essere presentata agli
assessorati alla sanità, regionali delle province autonome di Trento
e Bolzano, tramite le unità sanitarie locali, ove funzionanti.
Per la regione Sicilia la domanda dovrà essere presentata agli
uffici dei medici provinciali.
2) Copie dei protocolli di tutte le operazioni di produzione e dei
controlli effettuati sulla serie. Nella documentazione, debitamente
firmata dal direttore tecnico responsabile, devono essere altresì
precisate, in occasione del controllo di Stato della semenza, la
storia e le caratteristiche del ceppo usato e il numero di passaggi
cui il ceppo originale è stato sottoposto per la preparazione della
semenza.
3) Copia del verbale di prelevamento dei campioni: nel verbale,
munito delle firme del direttore tecnico e del medico capo della
struttura sanitaria o di un incaricato, alla presenza del quale viene
eseguito il prelevamento dei campioni, secondo le norme previste
dall'art. 15 del regio decreto 18 giugno 1905, n. 407, devono
figurare, fra gli altri dati, il numero di serie, il numero
complessivo delle dosi costituenti la partita, la data di
preparazione della partita e il numero delle dosi costituenti il
campione destinato all'Istituto superiore di sanità.
4) Se trattasi di vaccino di provenienza estera, i protocolli
relativi alla produzione ed ai controlli effettuati, devono essere
vistati dall'autorità sanitaria del Paese di origine del vaccino ed
accompagnati da una dichiarazione giurata attestante che il vaccino
giunto in dogana, debitamente contrassegnato da un numero progressivo
di serie, proviene tutto da un'unica partita. Tutti i documenti
devono esser vistati da console italiano per la circoscrizione ove si
produce il vaccino.
5) Quietanza comprovante il versamento a favore dell'Istituto
superiore di sanità presso la sezione di tesoreria provinciale della
somma di L. 5.000.000 per la sospensione indiluita; L. 1.500.000 per
il prodotto finito.
6) Campioni della semenza e della serie di vaccino che si
intendono sottoporre a controllo di Stato: quantitativi da inviare
all'Istituto superiore di sanità dovranno essere di: 200 ml per la
sospensione virale non diluita prima della chiarificazione; 100 fiale
del prodotto finito.
DOCUMENTAZIONE DA INVIARE AL MINISTERO DELLA
SANITÀ DIREZIONE GENERALE SERVIZIO FARMACEUTICO.
A) Copia della domanda di cui al sopraindicato punto 1);
B) Copia del verbale di prelevamento dei campioni di cui al punto
3).
VACCINO SOTTOPOSTO A CONTROLLO DI STATO
CON ESITO FAVOREVOLE
In base al risultato favorevole del controllo, comunicato
dall'Istituto superiore di sanità, l'autorità sanitaria competente
per territorio provvederà allo svincolo della serie per la
distribuzione viste le norme dell'art. 16 e seguenti del regio
decreto 18 giugno 1905, n. 407.