Serie Generale n. 125 del 30-5-1996
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 15 dicembre 1995, n. 592
Regolamento concernente il piano nazionale per la eradicazione della tubercolosi negli allevamenti bovini e bufalini. (GU Serie Generale n.125 del 30-05-1996)
Nota: note: Entrata in vigore del decreto: 14-6-1996

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
DI CONCERTO CON
IL MINISTRO DELLE RISORSE
AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
Visto il decreto del Presidente dalla Repubblica 8 febbraio 1954,
n. 320, concernente il regolamento di polizia veterinaria;
Visto l'art. 2, comma 6, della legge 9 giugno 1964, n. 615,
concernente la bonifica sanitaria degli allevamenti dalla tubercolosi
e dalla brucellosi;
Vista la legge 23 gennaio 1968, n. 33, concernente modifiche alla
predetta legge n. 615;
Vista la legge 23 dicembre 1978, n. 833, concernente la istituzione
del Servizio sanitario nazionale;
Vista la legge 28 maggio 1981, n. 296, che attua le direttive CEE
77/391, 78/52 e 79/110 e stabilisce norme per l'accelerazione della
bonifica sanitaria degli allevamenti dalla tubercolosi e dalla
brucellosi;
Visto l'art. 17, comma 3, della legge 23 agosto 1988, n. 400,
concernente la disciplina dell'attività di Governo e ordinamento
della Presidenza del Consiglio dei Ministri;
Visto il decreto ministeriale 1 giugno 1968, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale n. 233 del 13 settembre 1968, concernente il piano
nazionale di profilassi della tubercolosi bovina, e successive
modifiche;
Considerato che con decreto del Presidente della Repubblica 1 marzo
1992, n. 230, è stato pubblicato il regolamento di attuazione delle
direttive CEE 79/109, 79/111, 80/219, 80/1098, 80/1099, 80/1274,
82/893, 83/646, 84/336, 85/586, 87/489 e 88/406, concernenti norme
sanitarie in materia di scambi intracomunitari di animali della
specie bovina e suina, tenuto anche conto delle direttive 84/643,
90/422 e 90/423;
Considerato che l'art. 9 del decreto del Presidente della
Repubblica n. 230 recita: "Il Ministro della sanità, con propri
decreti, adotta regolamenti ai sensi dell'art. 17 della legge 23
agosto 1988, n. 400, per estendere al territorio nazionale le norme
sanitarie previste negli allegati";
Visto l'art. 13 del decreto legislativo 30 dicembre 1992, n. 502,
concernente il riordino della disciplina in materia sanitaria;
Vista la decisione del Consiglio CEE n. 87/58 del 22 dicembre 1986
che istituisce un'azione complementare della Comunità per
l'eradicazione della brucellosi, della tubercolosi e della leucosi
dei bovini;
Vista l'ordinanza ministeriale 2 gennaio 1993 concernente norme
integrative per l'eradicazione della tubercolosi dagli allevamenti
bovini, pubblicata nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana
n. 13 del 18 gennaio 1993;
Sentita la commissione prevista dall'art. 2 della legge 23 gennaio
1968, n. 33, nella seduta del 14 giugno 1994;
Visto il parere del Consiglio superiore di sanità, espresso nella
seduta del 18 gennaio 1995;
Udito il parere del Consiglio di Stato reso nell'adunanza generale
dell'8 giugno 1995;
Vista la comunicazione alla Presidenza del Consiglio dei Ministri
eseguita in data 30 settembre 1995;
A D O T T A
il seguente regolamento:
Art. 1.
Obiettivi
1. Il presente regolamento stabilisce le misure sanitarie da
applicare agli allevamenti di bovini e bufalini dell'intero
territorio nazionale per conseguire la eradicazione della tubercolosi
bovina.
2. Il piano nazionale di profilassi della tubercolosi bovina ha
l'obiettivo di eradicare in tre anni la tubercolosi dagli allevamenti
bovini e bufalini ai fini della tutela della salute pubblica e della
protezione degli allevamenti ufficialmente indenni.

Art. 2.
Definizioni
1. Ai sensi del presente regolamento si intende per:
a) bovino e bufalino da macello: l'animale della specie bovina o
bufalina destinato ad essere inviato al macello direttamente o dopo
essere passato attraverso un mercato o un centro di raccolta
riconosciuto, per esservi macellato nelle condizioni stabilite
dall'art. 6 della direttiva n. 64/432/CEE recepita con legge 30
aprile 1976, n. 397, e successive modificazioni;
b) bovini o bufalini da riproduzione, da allevamento e da
ingrasso: gli animali della specie bovina e bufalina diversi da
quelli menzionati al punto a) destinati ad essere avviati verso il
luogo di destinazione direttamente o dopo essere passati per un
mercato o per un centro di raccolta riconosciuto;
c) allevamento bovino o bufalino ufficialmente indenne da
tubercolosi: l'allevamento che soddisfa le condizioni di cui al
capitolo IV art. 12 del presente regolamento;
d) azienda: il complesso agricolo o la stalla del commerciante
ufficialmente autorizzata e controllata situati nel territorio
nazionale, nei quali sono tenuti od allevati abitualmente bovini e/o
bufalini da riproduzione, da ingrasso o da macello;
e) veterinario ufficiale: il veterinario dipendente dal Ministero
della sanità, dalle regioni, dalle province autonome, o dalle unità
sanitarie locali, o libero professionista formalmente incaricato
dell'esecuzione delle operazioni di risanamento;
f) eradicazione: l'eliminazione della tubercolosi e del relativo
agente eziologico dagli allevamenti bovini e bufalini tramite le
opportune operazioni di profilassi;
g) mercato o centro di raccolta riconosciuto: qualsiasi luogo,
diverso dall'azienda, in cui vengono venduti o acquistati, e/o in cui
sono stati raccolti, caricati od imbarcati bovini e/o bufalini, che
sia conforme all'art. 9 della legge 30 aprile 1976, n. 397;
h) prove diagnostiche: tutti gli accertamenti effettuati secondo
gli allegati 1 e 2 al presente regolamento per confermare o escludere
l'infezione tubercolare o la presenza dei suoi agenti eziologici;
i) animale infetto: quello che risponde positivamente alla prova
diagnostica ufficiale eseguita conformemente alle modalità riportate
nell'allegato 1 al presente regolamento o riconosciuto infetto
secondo quanto previsto dall'art. 7;
l) animali allo stato brado: gli animali che vivono in libertà
in un determinato territorio nel quale alimentazione, riproduzione e
movimenti sono liberi senza governo diretto da parte dell'uomo se non
in occasione della cattura per la marcatura, per l'avvio al mercato,
per trattamenti prifilattico-terapeutici e per l'alimentazione
integrativa quali-quantitativa. Tali animali hanno tuttavia un
proprietario.
2. Ai sensi del presente regolamento secondo le disposizioni di cui
al decreto del Presidente della Repubblica 1 marzo 1992, n. 230, la
parte minima del territorio nazionale a cui può essere attribuita la
qualifica sanitaria di "ufficialmente indenne" deve avere
un'estensione non inferiore a 2000 km(Elevato al Quadrato) e
comprendere almeno il territorio di una provincia. Per l'Italia tale
area è identificabile col territorio di una provincia.

Art. 3.
Obblighi
1. Il piano di eradicazione della tubercolosi dagli allevamenti
bovini e bufalini è obbligatorio su tutto il territorio nazionale
secondo la procedura prevista dalla legge 23 gennaio 1968, n. 33, e
successive modifiche ed integrazioni, nonchè dal presente
regolamento.
2. Con l'entrata in vigore del presente regolamento tutti gli
allevamenti bovini e bufalini e tutti i capi devono essere
identificati e registrati in modo da permettere di risalire
all'allevamento, all'azienda o al centro di provenienza o di
passaggio dei singoli soggetti. In tutti gli allevamenti bovini e
bufalini che non siano destinati esclusivamente all'ingrasso, anche
se allo stato brado, i capi superiori a sei settimane di età devono
essere posti sotto controllo con le modalità previste dall'allegato
1 al presente regolamento, con l'obiettivo di pervenire alla
eradicazione della tubercolosi.
3. Negli allevamenti da ingrasso devono essere introdotti soltanto
capi provenienti da allevamenti ufficialmente indenni e scortati
dalla relativa certificazione. Per questi allevamenti le regioni e
province autonome predispongono, in collaborazione con gli istituti
zooprofilattici sperimentali, specifici piani di sorveglianza;
attività pianificate di controllo devono essere altresì intraprese
in tale ambito quando si intendono attivare canali di esportazione,
ai fini della rispondenza ad eventuali requisiti richiesti dai Paesi
di destinazione.
4. Entro il 30 aprile di ogni anno i titolari di allevamenti bovini
e bufalini devono notificare al servizio veterinario della unità
sanitaria locale competente per territorio il proprio domicilio e la
sede legale, la ragione sociale della ditta, nonchè la sede e la
consistenza dell'allevamento, l'età e la categoria dei capi. Essi
devono altresì comunicare, entro otto giorni, la costituzione di una
nuova azienda od ogni eventuale trasferimento o variazione numerica
dei capi allevati e comunque ogni mutamento di ditta, ragione o
denominazione sociale che si verifichi successivamente alla notifica.
5. Entro il 30 giugno di ogni anno il servizio veterinario della
unità sanitaria locale provvede, previa verifica, a redigere
l'elenco completo degli allevamenti esistenti nel territorio di
competenza.

Art. 4.
Identificazione
1. Il codice di identificazione dell'allevamento, dei bovini e dei
bufalini, è riportato nelle singole schede di allevamento (mod.
2/33), che devono essere conservate in apposito schedario della
unità sanitaria locale competente per territorio. Una copia di tali
schede deve essere conservata dal titolare dell'azienda presso la
sede dell'allevamento per almeno due anni.
2. Con l'entrata in vigore del presente regolamento sono ritenuti
comunque validi i contrassegni già applicati nel corso di piani di
profilassi ufficiali attuati in precedenza. Sono altresì ritenuti
validi i contrassegni applicati agli animali iscritti ai libri
genealogici o sottoposti ai controlli funzionali ufficiali.

Art. 5.
Prove diagnostiche e competenze
1. Le prove ufficiali per la diagnosi della tubercolosi sono quelle
indicate nell'allegato 1 che fa parte integrante del presente
regolamento.
2. Gli interventi diagnostici di cui al presente regolamento sono
effettuati dai veterinari ufficiali.
3. È vietato allontanare per qualsiasi motivo i bovini e i
bufalini sottoposti alle prove diagnostiche, prima della avvenuta
diagnosi, salvo autorizzazione della unità sanitaria locale
competente per territorio qualora si prospetti la necessità di una
macellazione.
4. A prescindere dalla sede legale o di residenza dei titolari
degli allevamenti, le operazioni di controllo diagnostico nei
confronti degli animali che effettuano alpeggio, transumanza o
monticazione devono essere eseguite, di norma, a cura dei servizi
veterinari delle unità sanitarie locali dove esistono strutture di
ricovero o, comunque, dove gli animali stazionano per il periodo più
lungo.
5. Salvo che per l'invio al macello, a partire dall'entrata in
vigore del presente regolamento possono spostarsi, per le ragioni di
cui al comma 4 del presente articolo, soltanto i bovini e i bufalini
appartenenti ad allevamenti ufficialmente indenni da tubercolosi. Gli
uffici veterinari regionali provvedono per tempo ad emanare
specifiche disposizioni per regolamentare la materia.
6. L'esito degli accertamenti è riportato per ogni singolo animale
sull'apposita scheda di stalla (mod. 2/33).

Art. 6.
Animali sospetti
1. Un bovino o un bufalino è considerato sospetto di infezione
tubercolare quando:
a) viene in contatto con capi di allevamenti infetti;
b) le prove diagnostiche effettuate secondo l'allegato 1 al
presente regolamento ed interpretate dal veterinario ufficiale sono
da considerarsi dubbie.
2. I casi di sospetto di tubercolosi nei bovini e nei bufalini
devono essere ufficialmente segnalati alla unità sanitaria locale
competente per territorio ai sensi dell'art. 2 del decreto del
Presidente della Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320.
3. Nei confronti degli animali di cui al comma 1 del presente
articolo devono essere immediatamente applicate opportune misure di
isolamento al fine di evitare ogni possibile contagio nell'attesa
della diagnosi definitiva.
4. Nessun bovino o bufalino può entrare o uscire da un allevamento
in cui vi siano animali sospetti d'infezione tubercolare salvo
autorizzazione per l'uscita di animali destinati all'immediata
macellazione, da rilasciarsi ai sensi del decreto del Presidente
della Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320, e successive modifiche,
nell'attesa della diagnosi definitiva.

Art. 7.
Animali ed allevamenti infetti
1. Un bovino o un bufalino è considerato infetto da tubercolosi
quando:
a) reagisce positivamente alle prove diagnostiche ufficiali;
b) anche in presenza di un esito negativo alle prove diagnostiche
ufficiali, la malattia risulta clinicamente manifesta o l'infezione
è evidenziata dall'esito positivo di adeguate ricerche di
laboratorio (allegato 2).
2. Un allevamento è considerato infetto da tubercolosi qualora uno
o più capi sono dichiarati infetti in base ai riscontri diagnostici
in vita di cui al comma 1 o effettuati post-mortem.
3. I casi di tubercolosi nei bovini o nei bufalini devono essere
ufficialmente segnalati alla unità sanitaria locale competente per
territorio ai sensi dell'art. 2 del decreto del Presidente della
Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320.
4. Qualora gli animali riconosciuti infetti provengano da aziende
ubicate nel territorio di competenza di altra unità sanitaria
locale, il servizio veterinario della unità sanitaria locale che
tramite i veterinari dipendenti ha operato la diagnosi notifica
l'episodio infettivo alla unità sanitaria locale di provenienza e
alla regione. Se gli animali provengono dall'estero l'unità
sanitaria locale inoltra immediato avviso all'Assessorato regionale
alla sanità e al Ministero della sanità - Direzione generale dei
servizi veterinari.
5. I medici veterinari delle unità sanitarie locali addetti
all'ispezione delle carni devono segnalare tempestivamente ogni
riscontro di lesioni tubercolari, negli animali da macello, tramite
l'apposito modello (mod. 10/33), fatta eccezione per i bovini o
bufalini abbattuti in applicazione del piano di profilassi di Stato
contro la tubercolosi bovina, per i quali è prevista la compilazione
del modello 9/33.
6. Al più presto, e comunque entro otto giorni dalla avvenuta
macellazione, il modello 10/33, debitamente compilato in ogni sua
parte e vistato dal responsabile del servizio veterinario dell'unità
sanitaria locale dove ha sede il macello, deve essere trasmesso ai
servizi veterinari dell'unità sanitaria locale e della regione ove
ha sede l'allevamento di origine dell'animale infetto. Nel caso in
cui l'allevamento di provenienza ha sede nel territorio di competenza
della medesima unità sanitaria locale dove è avvenuta la
macellazione, il modello 10/33 deve comunque essere inviato alla
regione competente. L'unità sanitaria locale competente provvede a
svolgere, non oltre quindici giorni, le opportune indagini e le prove
diagnostiche, previste dall'allegato 1 al presente regolamento,
nell'allevamento di provenienza trasmettendo al servizio veterinario
regionale una sintetica relazione sull'attività svolta e sui
provvedimenti adottati.

Art. 8.
Provvedimenti per gli animali infetti
1. I bovini o bufalini dichiarati infetti devono essere subito
isolati e macellati, sotto controllo ufficiale, al più presto e
comunque non oltre trenta giorni dalla notifica ufficiale al
proprietario o al detentore. In via eccezionale, quando
l'abbattimento riguarda un numero di capi superiore a trenta,
l'unità sanitaria locale competente per territorio, previo parere
favorevole del servizio veterinario regionale e sentito il Ministero
della sanità - Direzione generale dei servizi veterinari, può
autorizzare un programma di abbattimento differito che comunque non
si protragga oltre novanta giorni dalla data della notifica.
Nell'eventualità che l'allevatore non provveda a macellare tutti gli
animali infetti, entro il termine massimo fissato nel programma di
abbattimento, il sindaco, su proposta del servizio veterinario
competente per territorio, adotta apposita ordinanza di abbattimento
per i capi rimasti.
2. I capi destinati all'abbattimento devono essere marcati
immediatamente, all'atto dell'accertamento diagnostico a cura del
veterinario ufficiale, in corrispondenza della parte mediana del
margine inferiore dell'orecchio (di norma il destro) con
asportazione, a mezzo di apposita tenaglia, di un lembo del
padiglione auricolare a forma di T, iscritto in un quadrato avente il
lato di cm. 2,3 con l'asta disposta normalmente al margine del
padiglione medesimo, adottando opportune misure per limitare al
massimo dolore e sofferenza agli animali.
3. L'invio al macello dei bovini infetti deve avvenire sotto
vincolo sanitario presso impianti della provincia ove ha sede il
focolaio o nei macelli di altra provincia della stessa regione su
autorizzazione del servizio veterinario della unità sanitaria locale
competente, qualora sia dimostrata l'impossibilità di procedere alla
macellazione nella provincia di origine del focolaio o per problemi
legati alla commercializzazione delle carni. Nei predetti impianti la
macellazione deve avvenire in modo tale da garantire la sicurezza
degli addetti alle operazioni i quali devono essere preventivamente
informati.
4. Qualora venga diagnosticata la tubercolosi in bovini che abbiano
avuto contatti con soggetti di altri allevamenti, in particolare al
pascolo, o all'alpeggio, l'autorità sanitaria competente dispone che
tali allevamenti siano considerati tutti sospetti di infezione e
siano sottoposti alle prove diagnostiche ufficiali di cui
all'allegato 1 che fa parte integrante del presente regolamento.
5. Inoltre, dopo l'eliminazione dei bovini di cui all'art. 7 del
presente regolamento e le relative disinfezioni:
a) vengono effettuate nell'allevamento infetto le prove
ufficiali, previste dall'allegato 1 al presente regolamento per
confermare l'avvenuta eliminazione della malattia;
b) il ripopolamento di tale allevamento può avvenire soltanto
dopo che i soggetti, di età superiore a sei settimane, abbiano
fornito risultato negativo ad almeno due prove ufficiali, la prima
delle quali eseguita ad almeno quarantadue giorni dalla eliminazione
dell'ultimo capo infetto, come indicato all'art. 11 del presente
regolamento.

Art. 9.
Provvedimenti
1. Negli allevamenti dichiarati infetti ai sensi del presente
regolamento si adottano le seguenti disposizioni:
a) accurata indagine epidemiologica da parte del veterinario
ufficiale in collaborazione con gli osservatori epidemiologici
regionali veterinari, mirata a individuare l'origine della malattia e
gli eventuali contatti avvenuti con altri allevamenti;
b) segnalazione al servizio di igiene pubblica dell'unità
sanitaria locale territorialmente competente della presenza
dell'infezione, unitamente alle misure urgenti adottate per impedire
il contagio all'uomo;
c) censimento per specie e categoria di tutti gli animali
esistenti nell'allevamento;
d) isolamento e sequestro degli animali infetti e sospetti dal
resto dell'effettivo dell'allevamento;
e) macellazione degli animali infetti entro i termini indicati al
punto 1 del precedente art. 8;
f) accurata pulizia e disinfezione ai sensi dell'art. 10 del
presente regolamento;
g) divieto di monta;
h) la mungitura degli animali sospetti o infetti deve essere
effettuata separatamente e comunque dopo la mungitura dei soggetti
sani, seguita da accurato lavaggio, pulizia e disinfezione delle
attrezzature e dei locali adibiti alla mungitura con le modalità
previste dall'art. 10 del presente regolamento;
i) divieto di qualsiasi movimento da e per l'allevamento infetto,
salvo autorizzazione per l'uscita di animali destinati all'immediata
macellazione, da rilasciarsi ai sensi del decreto del Presidente
della Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320, e successive modificazioni;
l) i vitelli o annutoli nati da madri infette devono essere
allevati in condizioni di isolamento e sottoposti alle opportune
prove diagnostiche previste dall'allegato 1 al presente regolamento
al fine di escludere l'eventuale trasmissione della malattia;
m) impiego del latte delle bovine infette prima
dell'abbattimento, qualora non venga distrutto, unicamente per
l'alimentazione animale, previo trattamento di risanamento
nell'ambito dello stesso allevamento;
n) rimozione dall'allevamento del latte di animali sani
appartenenti ad allevamenti infetti in contenitori separati,
identificati con appositi contrassegni e utilizzato esclusivamente
per la fabbricazione di latte trattato termicamente o di prodotti a
base di latte, dopo essere stato sottoposto ad un idoneo trattamento
termico da effettuarsi sotto il controllo delle autorità competenti.
Tuttavia detto latte può essere risanato direttamente nell'azienda
di produzione, a condizione che l'azienda stessa sia in possesso di
specifico impianto per il risanamento del latte autorizzato
dall'autorità sanitaria locale e sotto il costante controllo del
servizio veterinario della unità sanitaria locale competente per
territorio;
o) sistemazione del letame proveniente dai ricoveri o da altri
locali di stabulazione utilizzati dagli animali in luogo
inaccessibile agli animali dell'allevamento; il letame raccolto deve
essere sottoposto ad appropriata disinfezione o conservato per almeno
cinque mesi prima dell'uso. Parimenti devono essere sottoposti ad
adeguati trattamenti secondo gli allegati al presente regolamento, i
liquami provenienti dai ricoveri o da altri locali di stabulazione
utilizzati dagli animali, qualora non vengano raccolti
contemporaneamente al letame.

Art. 10.
Disinfezioni
1. Entro sette giorni dall'eliminazione dei capi di cui all'art. 7
e comunque prima di ricostituire l'allevamento, i ricoveri e gli
altri locali di stabulazione, nonchè tutti i contenitori, le
attrezzature e gli utensili usati per gli animali, devono essere
puliti e disinfettati sotto controllo ufficiale secondo l'allegato 3
al presente regolamento; il veterinario rilascia il relativo
certificato di disinfezione. Il reimpiego dei pascoli sui quali
hanno precedentemente pascolato tali animali non può aver luogo
prima di sessanta giorni dall'allontanamento degli stessi.
2. Tutti i mezzi di trasporto, i contenitori e le attrezzature
devono essere puliti e disinfettati, sotto controllo ufficiale, dopo
ogni trasporto di animali provenienti da un allevamento infetto,
nonchè di prodotti, avanzi, materiale e sostanze provenienti da tali
animali e che comunque siano stati a contatto con essi. Le aree di
carico e di scarico degli animali devono essere pulite e disinfettate
dopo l'uso.
3. Le disinfezioni previste per l'attuazione del presente
regolamento sono effettuate sotto controllo della unità sanitaria
locale competente per territorio utilizzando, ove presenti, le
stazioni mobili di disinfezione.

Art. 11.
Controlli
1. Negli allevamenti riconosciuti infetti, i controlli su tutti i
bovini e bufalini di età superiore a sei settimane riprendono dopo
almeno sei settimane dall'eliminazione o l'allontanamento dei capi
infetti e relative disinfezioni. Il ripopolamento è consentito dopo
che tali animali abbiano reagito negativamente a due controlli
tubercolinici distanziati di almeno sei settimane. Le misure di cui
all'art. 9 del presente regolamento rimangono in vigore fino a che la
seconda prova non abbia dato esito negativo.

Art. 12.
Allevamento bovino o bufalino
ufficialmente indenne da tubercolosi
1. È riconosciuto come allevamento ufficialmente indenne da
tubercolosi l'allevamento in cui:
a) tutti i capi sono esenti da manifestazioni cliniche di
tubercolosi;
b) tutti gli animali di età superiore a sei settimane hanno
avuto una reazione negativa ad almeno due prove diagnostiche
ufficiali eseguite la prima sei mesi dopo la fine delle operazioni di
risanamento di cui all'art. 11, la seconda sei mesi dopo la prima e
le successive ad un anno di intervallo. Quando sul territorio
nazionale o in una sua regione, in cui tutti i capi sono soggetti
alle misure ufficiali di lotta contro la tubercolosi, la percentuale
degli allevamenti infetti da tubercolosi non è superiore all'1% in
occasione di due controlli succedentisi a distanza di un anno, tale
intervallo può essere portato a due anni. Quando la percentuale
degli allevamenti infetti non è superiore allo 0,2% in occasione di
due controlli succedentisi a distanza di due anni, l'intervallo tra
le prove può essere portato a tre anni. Quando la percentuale degli
allevamenti infetti non è superiore allo 0,1% in occasione di due
controlli successivi a distanza di tre anni, l'intervallo tra le
prove può essere portato a quattro anni e/o l'età alla quale gli
animali devono essere sottoposti a tali controlli può essere portata
a ventiquattro mesi. Le regioni, su parere conforme del Ministero
della sanità, possono aumentare l'intervallo tra i controlli previa
predisposizione di specifici piani di sorveglianza in collaborazione
con l'osservatorio epidemiologico regionale veterinario, o in
mancanza di questo con l'istituto zooprofilattico sperimentale
territorialmente competente;
c) non è stato introdotto alcun bovino o bufalino senza la
prevista certificazione (mod. D) di un veterinario ufficiale in cui
si attesti che detto animale proviene da un allevamento ufficialmente
indenne da tubercolosi. Ogni capo deve essere sottoposto all'arrivo
nella nuova azienda a prova tubercolinica non prima di quindici
giorni e non oltre quarantadue giorni dopo la partenza
dall'allevamento di origine. Durante il periodo necessario per
eseguire la prova allergica l'animale deve essere tenuto in
isolamento.
2. Gli animali che si spostano nell'ambito di un territorio con
qualifica di "ufficialmente indenne da tubercolosi", da almeno due
anni e con il 99,8% di allevamenti in possesso della qualifica
medesima, non sottostanno all'obbligo dell'effettuazione della prova
diagnostica di cui alla lettera c) del precedente comma.
3. La prova diagnostica di cui alla lettera c) del comma 1, non è
richiesta quando sul territorio nazionale la percentuale degli
allevamenti infetti da tubercolosi è inferiore allo 0,2% e risulti
da un attestato del veterinario ufficiale che l'animale:
a) è debitamente identificato;
b) proviene da un allevamento ufficialmente indenne da
tubercolosi;
c) in occasione del trasporto non è entrato in contatto con
bovini o bufalini non provenienti da allevamenti ufficialmente
indenni da tubercolosi.
4. L'attestato previsto alla lettera c) del comma 1, può non
essere richiesto quando sul territorio nazionale da almeno 4 anni
almeno il 99,8% degli allevamenti è ufficialmente riconosciuto
indenne da tubercolosi e in cui gli allevamenti non ufficialmente
indenni si trovano sotto controllo ufficiale, ed è vietato il
trasferimento di capi da tali allevamenti salvo che gli stessi siano
portati direttamente al macello sotto controllo ufficiale.

Art. 13.
Attestazione sanitaria
1. Per gli allevamenti bovini o bufalini riconosciuti ufficialmente
indenni il servizio veterinario della unità sanitaria locale
competente per territorio rilascia una apposita attestazione di
"allevamento ufficialmente indenne da tubercolosi sotto il controllo
dello Stato" (mod. E). Tale attestazione ha una validità di un anno.
2. Per i singoli bovini e bufalini o per gruppi di tali animali
appartenenti ad allevamenti ufficialmente indenni il servizio
veterinario della unità sanitaria locale competente per territorio
rilascia, su richiesta degli interessati, uno speciale certificato
comprovante che gli animali provengono da un allevamento
ufficialmente indenne da tubercolosi sotto controllo dello Stato
(modello D). Tale attestazione ha una validità di quindici giorni.

Art. 14.
Province e regioni ufficialmente indenni da tubercolosi
1. Il Ministro della sanità può dichiarare ufficialmente indenne
da tubercolosi bovina il territorio delle singole province, di una o
più regioni, qualora tutti gli allevamenti presenti sul territorio
sono sottoposti a controllo ufficiale e il 99,8% degli allevamenti
risulta ufficialmente indenne durante l'anno.
2. Per tutto il 1995, al fine di consentire agli uffici interessati
il graduale adeguamento alla disposizione di cui sopra, per la
concessione della qualifica in oggetto è sufficiente che la
percentuale di infezione sia inferiore all'1%, calcolato sulla base
di tutti gli allevamenti riscontrati infetti durante l'anno.
3. Una regione può essere dichiarata ufficialmente indenne da
tubercolosi solo qualora tutte le sue province godano di tale
qualifica.

Art. 15.
Riscontro di tubercolosi
in allevamenti già ufficialmente indenni
1. Qualora in un allevamento bovino o bufalino ufficialmente indenne
da tubercolosi un solo animale risulti positivo ad una prova
diagnostica o qualora nello stesso allevamento sia diagnosticato un
caso di tubercolosi nel corso dell'ispezione post-mortem, la
qualifica deve essere sospesa fintanto che, eliminato entro otto
giorni il capo infetto, tutti i rimanenti animali di età superiore
alle sei settimane non abbiano reagito negativamente ad almeno due
prove diagnostiche, la prima delle quali effettuata almeno due mesi
dopo l'eliminazione dell'animale in questione, e la seconda ad almeno
sei settimane di distanza.
2. Qualora in un allevamento bovino o bufalino ufficialmente
indenne, più capi risultino positivi alle prove diagnostiche o
all'ispezione post-mortem, la qualifica di ufficialmente indenne è
revocata fintanto che tutti i rimanenti animali abbiano reagito
negativamente ad almeno due prove diagnostiche, la prima delle quali
effettuata sei mesi dopo la fine delle operazioni di risanamento di
cui all'art. 11, la seconda sei mesi dopo la prima.

Art. 16.
Provvedimenti relativi all'infezione in animali di altre specie
1. Nei casi in cui l'unità sanitaria locale competente per
territorio ritiene che l'eventuale presenza di animali infetti di
altra specie può compromettere l'esito dei programmi di eradicazione
della tubercolosi, deve adottare nei confronti di ciascuna specie le
misure previste dalle specifiche norme vigenti.
2. Allorchè, nel corso dei controlli periodici, si sospetti che le
persone, alle quali è affidata la custodia degli animali o che hanno
contatti diretti o indiretti con essi, rappresentino un pericolo di
diffusione del contagio, il servizio veterinario della unità
sanitaria locale competente per territorio deve darne comunicazione
al servizio di igiene pubblica.

Art. 17.
Misure per le stalle dei commercianti
1. I commercianti di bovini e bufalini da riproduzione sono tenuti
ad attivare apposite stalle nettamente separate da quelle adibite
agli animali da macello. Tali stalle, completamente isolate,
igienicamente idonee e dotate di personale, automezzi ed attrezzature
destinati esclusivamente ad animali provenienti da allevamenti
ufficialmente indenni da tubercolosi, indenni o ufficialmente indenni
da brucellosi ed indenni da leucosi e scortati dalle certificazioni
nazionali od internazionali previste per gli scambi di animali da
allevamento, sono sottoposte a controlli veterinari almeno mensili da
parte della unità sanitaria locale competente per territorio; in
tali stalle deve essere altresì prevista un'adeguata separazione tra
animali indenni e ufficialmente indenni da brucellosi; esse devono
essere dotate inoltre delle attrezzature necessarie per la regolare
pulizia e disinfezione dei locali di ricovero del bestiame.
2. I commercianti di cui al comma 1 sono altresì obbligati ad
annotare su idoneo registro di carico e scarico, da tenere a
disposizione per almeno un anno del servizio veterinario, la data di
ingresso e di uscita degli animali nonchè i relativi contrassegni di
identificazione, gli estremi del modello 4 (decreto del Presidente
della Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320) e copia del relativo
certificato sanitario.
3. I certificati sanitari di cui all'art. 13 possono essere
rinnovati per ulteriori quindici giorni da parte del veterinario
ufficiale se sono rispettate le misure previste dal presente
articolo.

Art. 18.
Conferma qualifiche precedenti
1. Per l'applicazione delle disposizioni della legge 9 giugno 1964,
n. 615, e successive modificazioni, nonchè delle norme del presente
regolamento, restano valide le qualifiche sanitarie acquisite nel
corso di operazioni di bonifica e profilassi già effettuate per
conto dello Stato.

Art. 19.
Indennità di abbattimento
1. Ai proprietari di animali abbattuti o macellati è corrisposta
una indennità ai sensi della legge 23 gennaio 1968, n. 33, da
corrispondersi secondo norme e criteri previsti dal decreto
ministeriale 14 giugno 1968, e successive modificazioni, e del
presente regolamento.
2. Per ottenere l'indennità di abbattimento gli interessati devono
far macellare o abbattere tutti gli animali infetti al più presto e
non oltre i termini stabiliti dal comma 1 dell'art. 8 del presente
regolamento, e consegnare i relativi certificati di abbattimento
(modello 9/33) alla unità sanitaria locale competente per territorio
non oltre sessanta giorni dalla data dell'ultimo abbattimento
unitamente alla richiesta di indennizzo.
3. Il servizio veterinario della unità sanitaria locale competente
per territorio, su parere conforme dell'assessorato regionale alla
sanità e dell'istituto zooprofilattico sperimentale competente per
territorio, può disporre l'eliminazione di animali negativi alle
prove ufficiali qualora la situazione epidemiologica, all'interno
dell'allevamento, sia tale da farli ritenere infetti. Di tale
operazione la regione dà comunicazione alla Direzione generale dei
servizi veterinari del Ministero della sanità.
4. Le indennità di cui al presente articolo devono essere
corrisposte entro novanta giorni dalla data di presentazione della
domanda di indennizzo. Agli allevatori a cui non vengono corrisposte,
senza giustificato motivo, le indennità, sono dovuti gli interessi
legali maturati dopo il novantesimo giorno dalla presentazione della
domanda stessa.

Art. 20.
Introduzione di animali in allevamenti sprovvisti di qualifica
1. Negli allevamenti sottoposti ad operazioni di risanamento che non
abbiano ancora raggiunto la qualifica sanitaria di "ufficialmente
indenne" ai sensi del presente regolamento, è vietata l'introduzione
di bovini o bufalini non scortati da certificazione comprovante che
provengono da allevamento riconosciuto ufficialmente indenne da
tubercolosi e che non sono stati sottoposti, con esito negativo, ad
un esame ufficiale per la tubercolosi secondo quanto previsto
all'art. 12, comma 1, lettera c), del presente regolamento.
2. All'atto dell'introduzione tali animali perdono comunque la
qualifica posseduta.
3. Gli allevamenti di nuova costituzione devono essere formati
esclusivamente con capi ufficialmente indenni e pertanto acquisiscono
la qualifica propria degli animali introdotti.

Art. 21.
Adempimenti
1. L'allevatore o il detentore è tenuto ad offrire la massima
collaborazione per l'esecuzione delle operazioni di risanamento ed in
particolare deve provvedere al contenimento degli animali e
rispettare tutti gli obblighi previsti dal presente regolamento.
2. Gli allevatori che non sottopongono i propri animali alle
operazioni di eradicazione nei confronti della tubercolosi e della
brucellosi, non possono:
a) accedere a qualsiasi forma di contribuzione e/o prestiti
agevolati erogati da una pubblica amministrazione, ivi compresi
quelli di natura comunitaria;
b) commercializzare i prodotti lattiero caseari per
l'alimentazione umana.
3. In caso di inadempienza le operazioni di risanamento sono
eseguite d'ufficio, con addebito delle spese a carico dei
trasgressori.
4. Negli allevamenti bovini e bufalini nonchè nelle stalle dei
commercianti è vietato:
a) l'uso di vaccini e di prodotti terapeutici e/o profilattici
antitubercolari, nonchè di qualsiasi altro prodotto o farmaco capace
di alterare il risultato della prova allergica;
b) l'esecuzione di prove tubercoliniche, se non previamente
autorizzate dal servizio veterinario della unità sanitaria locale
competente per territorio;
c) l'impiego di personale di stalla affetto da tubercolosi.

Art. 22.
Disposizioni finanziarie
1. Le regioni e le province autonome sostengono con i fondi loro
assegnati dal Fondo sanitario nazionale le spese relative
all'esecuzione delle operazioni di cui al presente regolamento, e
cioe':
a) le spese per la gestione di stazioni mobili di disinfezione;
b) le spese per i corsi di addestramento e formazione riservati
ai medici veterinari destinati ad operare per l'applicazione delle
norme del presente regolamento;
c) la gestione del sistema informativo e la sorveglianza
epidemiologica;
d) tutte le altre spese ritenute necessarie per l'eradicazione
della tubercolosi dagli allevamenti, nonchè il pagamento delle
prestazioni dei medici veterinari liberi professionisti autorizzati
ad operare nell'ambito dei piani di profilassi e delle indennità di
abbattimento dei capi riscontrati infetti ai sensi del presente
regolamento.
2. Qualora le operazioni di profilassi e di risanamento dalla
tubercolosi vengano effettuate contestualmente ai controlli per la
brucellosi bovina e per la leucosi enzootica viene corrisposto ai
veterinari ufficiali un unico compenso per allevamento controllato
come previsto dalla normativa vigente.

Art. 23.
Pianificazione nazionale e regionale
1. Il Ministero della sanità, sentite le regioni, identifica le
risorse disponibili, gli obiettivi da raggiungere, adotta un piano
triennale per l'eradicazione della tubercolosi bovina e individua la
sorveglianza epidemiologica come attività essenziale per la
programmazione e la verifica delle attività svolte. Nel piano
vengono altresì stabilite le caratteristiche del sistema informativo
specifico per la tubercolosi e gli indicatori da utilizzare per la
verifica dei risultati e la riprogrammazione delle attività. Il
piano è oggetto di aggiornamento annuale sulla base dei risultati
raggiunti nell'anno, determinati dall'analisi degli indicatori di cui
sopra. Per la definizione e la gestione del sistema nazionale di
sorveglianza e del sistema informativo il Ministero della sanità si
avvale del Centro nazionale di referenza per lo studio e la ricerca
in epidemiologia, programmazione e informazione veterinaria di cui al
decreto del Ministro della sanità 2 novembre 1991.
2. Le regioni, sulla base delle indicazioni del piano nazionale,
preparano i piani triennali di eradicazione e li aggiornano
annualmente sulla base delle eventuali modifiche del piano nazionale,
nonchè dei risultati raggiunti nell'anno, determinati dall'analisi
di specifici indicatori.

Art. 24.
Abrogazioni
1. Il presente regolamento sostituisce ed abroga il decreto
ministeriale 1 giugno 1968, e successive modificazioni, concernente
"Piano nazionale per la profilassi della tubercolosi bovina".
Il presente decreto, munito del sigillo dello Stato, sarà inserito
nella Raccolta ufficiale degli atti normativi della Repubblica
italiana. È fatto obbligo a chiunque spetti di osservarlo e di farlo
osservare.
Roma, 15 dicembre 1995
Il Ministro della sanità
GUZZANTI
Il Ministro delle risorse
agricole, alimentari e forestali
LUCHETTI
Visto, il Guardasigilli: CAIANIELLO
Registrato alla Corte dei conti il 21 maggio 1996
Registro n. 1 Sanità, foglio n. 108

ALLEGATO 1
ESECUZIONE ED INTERPRETAZIONE
DELLE PROVE DIAGNOSTICHE UFFICIALI
Operazioni preliminari:
Il veterinario ufficiale provvede alle seguenti operazioni:
1) verifica della registrazione ufficiale dell'allevamento e
controllo degli esiti delle prove diagnostiche precedentemente
effettuate e del rispetto degli eventuali provvedimenti emanati;
2) raccolta e registrazione sulla scheda ufficiale delle seguenti
informazioni relative all'allevamento e di ogni altro dato utile alla
formazione dei rilievi diagnostici ed epidemiologici:
- tipologia produttiva dell'allevamento;
- consistenza totale dell'effettivo e numero degli animali di
età superiore a sei settimane;
- qualifica sanitaria attribuita all'allevamento;
- movimenti di capi in entrata ed uscita dopo l'ultimo controllo
di stalla;
3) esame clinico (semiologia della collettivita') ed
identificazione dei singoli soggetti.
L'identificazione va estesa a tutti i soggetti presenti, compresi
quelli sotto età diagnostica che devono comunque essere registrati
sulla scheda ufficiale.
L'identificazione va praticata con tatuaggio o marca auricolare o
altro metodo apposito, approvati dalla competente regione o provincia
autonoma, secondo codici ufficiali di identificazione che contengano
anche l'indicazione dell'U.S.L. e della provincia in cui ha sede
l'allevamento.
L'identificazione deve essere individuale e deve consentire di
risalire all'allevamento di origine.
Tecnica ed interpretazione delle prove ufficiali.
Sono riconosciute ufficialmente le seguenti prove per la diagnosi
in vita di tubercolosi:
a) intradermotubercolinizzazione unica: inoculazione singola di
tubercolina PPD bovina (5000 UTC in 0,1 ml);
b) intradermotubercolinizzazione comparativa: inoculazione
contemporanea, in punti diversi distanti fra loro circa 12 cm
disposti uno sotto l'altro, delle due tubercoline, aviare e bovina
(5000 UTC di tubercolina bovina in 0,1 e 5000 U.I. di tubercolina
aviare in 0,2 ml).
Negli animali giovani, sul cui collo non vi è abbastanza spazio
per effettuare l'inoculazione delle due tubercoline a distanza
sufficiente sullo stesso lato, potrà risultare conveniente praticare
le inoculazioni ai due lati del collo in due punti corrispondenti;
c) la tubercolinizzazione deve essere effettuata nella cute del
collo al limite fra il terzo anteriore e il terzo mediano.
Tecnica ed interpretazione delle reazioni di tubercolinizzazione.
Tecnica: tosare e pulire i punti di inoculazione, prendere fra il
pollice e l'indice una piega della pelle in ciascuna delle zone
depilate, misurare lo spessore con un cutimetro a molla ed annotarne
il risultato. Introdurre obliquamente negli strati più profondi
della pelle un ago corto montato su siringa graduata in 0,1 ml ed
iniettare la dose di tubercolina. Non è autorizzata l'inoculazione
della tubercolina con tecniche o strumenti diversi da quelli
indicati. L'inoculazione è avvenuta in modo corretto se la
palpazione rivela un piccolo gonfiore, delle dimensioni di un
pisello, nel punto di inoculazione. A distanza di 72 ore misurare
nuovamente lo spessore della piega cutanea in ciascun punto e
annotare il risultato. Tra una prova tubercolinica e la successiva
deve intercorrere un periodo di tempo non inferiore alle sei
settimane.
Interpretazione delle reazioni: l'interpretazione delle reazioni
deve essere fondata su osservazioni cliniche e sulla registrazione
mediante cutimetro a molla dell'aumento di spessore della piega
cutanea nei punti di inoculazione, 72 ore dopo la prova:
a) reazione negativa: si osserva solo un gonfiore circoscritto,
con aumento di spessore della piega cutanea non superiore a 2 mm
senza segni clinici, quali edema locale diffuso, essudazione,
necrosi, dolore o infiammazione dei dotti linfatici regionali o dei
linfonodi;
b) reazione dubbia: non si osservano segni clinici come quelli
descritti al punto a) e l'aumento di spessore della piega cutanea è
compresa fra 2 e 4 mm;
c) reazione positiva: si osservano segni clinici, come quelli
descritti al punto a) o si riscontra un aumento di 4 mm o più dello
spessore della piega cutanea nel punto d'inoculazione.
Gli animali per i quali l'intradermotubercolinizzazione singola
non dà esito conclusivo devono essere sottoposti ad un'altra prova a
distanza di almeno 42 giorni.
Gli animali che non risultano negativi alla seconda prova devono
essere ritenuti positivi.
In casi particolari, per approfondimento diagnostico, il servizio
veterinario dell'U.S.L. valuta l'opportunità di ricorrere alla
intradermotubercolinizzazione comparativa, secondo i seguenti criteri
interpretativi.
Reazione bovina negativa, ovvero reazione bovina positiva o dubbia
ma di intensità pari o inferiore alla reazione aviare ed assenza di
segni clinici in entrambi i casi = negativa.
Reazione bovina positiva o dubbia superiore da 2 a 4 mm alla
reazione aviare ed assenza di segni clinici in entrambi i casi =
dubbia.
Reazione bovina positiva, superiore di oltre 4 mm alla reazione
aviare, ovvero presenza di segni clinici nel primo caso = positiva.

ALLEGATO 2

UTILIZZO DI TECNICHE ISTOPATOLOGICHE, IMMUNOISTOCHIMICHE E MOLECOLARI
PER L'EVIDENZIAZIONZE DI LESIONI E DI MICOBATTERI TUBERCOLARI SU
MATERIALE FRESCO E TESSUTI FISSATI DI ANIMALI INFETTI MACELLATI O
MORTI; DA EFFETTUARSI OVE RICHIESTO.

A. Esame anatomo-isto-patologico.
Il medico veterinario deve eseguire una accurata e meticolosa
necroscopia del bovino o bufalino abbattuto dopo la reazione
tubercolinica positiva.
La sua attenzione deve essere volta in particolare agli organi di
entrata del micobatterio e cioè polmone, intestino e fegato e
soprattutto sui relativi linfonodi regionali. Su di essi devono
essere eseguiti più tagli paralleli al fine di evidenziare
l'eventuale presenza di tubercoli miliari o submiliari che altrimenti
potrebbero sfuggire all'esaminatore.
Una volta riscontrata la o le lesioni sospetta/e una parte di esse
deve essere fissata in formalina tamponata al 10% per gli esami
istopatologici al fine di accertare la diagnosi o, eventualmente, di
eseguire una diagnosi differenziale da lesioni simili, da parte del
laboratorio autorizzato. Il laboratorio dovrà eseguire sulla sezione
istopatologica la ricerca dei micobatteri mediante colorazione di
Ziehl-Neelsen.
B. Tecniche immunoistochimiche.
Mediante l'utilizzo di anticorpi policlonali e monoclonali è
possibile evidenziare la presenza di antigeni di micobatteri
tubercolari in sezioni di tessuto opportunamente fissate in formalina
tamponata al 10% e incluse in paraffina; il prelievo va eseguito
subito dopo la macellazione dell'animale, su tessuti con lesioni
possibilmente non calcificate.
La tecnica consiste in una colorazione immunoistochimica del tipo
immunoperossidasi indiretta, in cui l'anticorpo policlonale (diretto
contro antigeni comuni ai vari tipi di micobatteri) o monoclonale
(diretto contro antigeni specifici dei vari micobatteri) si lega ai
rispettivi antigeni presenti nel tessuto. I tessuti infetti
presentano pertanto una positività finemente granulare nel
citoplasma delle cellule giganti, dei macrofagi e nelle aree
necrotiche.
Il metodo immunoistochimico presenta numerosi vantaggi. Infatti
consente innanzitutto di diagnosticare un'infezione tubercolare molto
più rapidamente rispetto all'isolamento. In secondo luogo presenta
una maggiore specificità e sensibilità rispetto ai metodi di
colorazione istochimica quali la Ziehl-Neelsen, in quanto rileva
antigeni di micobatteri, frammenti di microrganismi morti o
micobatteri con pareti "difettive" (a differenza della colorazione
Ziehl-Neelsen che evidenzia solo micobatteri intatti) e con un
notevole vantaggio sull'isolamento, che richiede comunque
microrganismi vivi.
C. Tecniche di patologia molecolare.
C1. Ibridazione in situ.
Il metodo dell'ibridazione in situ si basa sull'osservazione che
una catena singola di un frammento di DNA o RNA contenente una
sequenza complementare si lega al DNA o RNA cellulare se esistono
appropriate condizioni di temperatura, forza ionica e pH. Se poi il
frammento di DNA o RNA viene preventivamente marcato con sostanze che
segnalino l'avvenuta reazione (marcanti radioattivi oppure biotina e
sistema ABC) avremo la possibilità di una localizzazione morfologica
precisa.
Tale tecnica effettuata su materiale fissato in formalina ed
incluso in paraffina è in grado di abbinare l'elevata specificità
dell'evidenziazione della presenza di DNA o RNA di micobatteri alla
localizzazione nella reazione in cellule specifiche.
C2. Reazione a catena della polimerasi (PCR).
Questa tecnica è una metodica di amplificazione di un segmento di
DNA. Essa si basa sull'osservazione che per la sintesi di una nuova
catena nucleotidica, una sequenza di DNA complementare, chiamato
"primer", deve legarsi agli estremi 3' e 5' terminali del segmento di
DNA da amplificare (DNA stampo). In questo modo la sintesi della
nuova doppia catena di DNA avverrà ad opera di una DNA-polimerasi
termostabile, attraverso l'addizione di nucleotidi complementari alla
catena-stampo, nella regione di DNA posta tra i due "primers". Dal
momento che la nuova catena di DNA complementare è in grado di
legare i "primers", in ogni ciclo replicativo la quantità di DNA
sintetizzato doppia rispetto al ciclo precedente, con conseguente
incremento logaritmico della sequenza di DNA da studiare. I vantaggi
di questa tecnica sono rappresentati dalla purezza del DNA prodotto,
dalla elevatissima specificità, dalla rapidità con cui possono
essere ottenuti risultati altamente attendibili e dalla possibilità
di amplificare sequenze piccolissime di DNA (fino a 1 ng).
Quest'ultima caratteristica può essere utilizzata per tipizzare i
diversi micobatteri patogeni e non presenti in un determinato
campione sulla base di minime differenze specie-specifiche della
sequenza nucleotidica del DNA.
Per l'effettuazione della reazione deve essere disponibile, almeno
nelle fasi iniziali dello studio, materiale fresco o congelato
(-20(gradi) C/-80(gradi) C) entro un'ora dalla morte dell'animale.

TECNICHE DI ISOLAMENTO E DI IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI

1. Raccolta e trasporto dei campioni.
La diagnosi definitiva di tubercolosi, o di altre micobatteriosi,
richiede che i micobatteri siano isolati dal materiale inviato al
laboratorio per la coltura.
L'efficacia diagnostica non dipende solo dai metodi usati per la
coltura dei micobatteri ma anche dal modo con cui i campioni sono
stati raccolti e trasportati.
1.1. Raccolta.
Tessuti, linfonodi, organi: pezzi di tessuto sospetti di contenere
micobatteri vengono raccolti asetticamente e messi in contenitori
sterili senza conservanti o fissativi.
1.2. Trasporto.
Il campione da esaminare deve arrivare il prima possibile e nelle
condizioni migliori al laboratorio.
Per i tessuti, qualora l'invio al laboratorio non sia immediato,
sarà necessario conservare il materiale a 4 (Più o Meno) 2 (gradi)
C un massimo di quattro giorni.
Diversamente il campione va congelato.
2. Tecniche di colorazione.
La presenza dei micobatteri nei materiali clinici può essere
dimostrata con l'esame microscopico di strisci colorati utilizzando
la tecnica di Ziehl-Neelsen.
3. Operazioni preliminari alla semina: metodi di decontaminazione.
Il materiale clinico sospetto di contenere micobatteri, è spesso
contaminato anche da altre specie microbiche. Pertanto prima di
procedere alla semina, i campioni dovranno essere decontaminati con
tecniche a diverso grado di lesività per micobatteri, rispettando
strettamente i tempi di contatto con i rispettivi decontaminanti.
Le tecniche sotto descritte possono essere impiegate in
alternativa.
3.1. Idrossido di sodio 4%.
- Trattare l'omogeneato con ugual volume di NaOH al 4%
- Mantenere in termostato a 37 (gradi) C per 30'
- Neutralizzare il sedimento con acido solforico al 10% goccia a
goccia utilizzando il rosso fenolo come indicatore di pH
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000
g
- Eliminare il surnatante
- Risospendere il sedimento con 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e
inoculare i terreni di coltura con 1 ml; destinare l'altro
millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione
degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova
biologica.
3.2. Sodiododecilsolfato di sodio (Laurilsolfato di sodio) (SDS)
3,16% + NaOH 1%
- Trattare l'omogenato con ugual volume di decontaminante (SDS
3,16% + NaOH 1%)
- Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 40'
- Aggiungere acido fosforico 1,43% e Porpora di bromocresolo
0,006% fino a viraggio dell'indicatore al giallo arancio
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi ) C o per 20' a 2.000
g
- Eliminare il surnatante
- Risospendere il sedimento in 10 ml di soluzione fisiologica
sterile
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000
g
- Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e
inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro
millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione
degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova
biologica.
3.3. Esadecilpiridiniocloruro (HPC) (Cetilpiridiniocloruro CCP) 1,5%
- Trattare l'omogenato con ugual volume di HPC 1,5%
- Mantenere a temperatura ambiente in agitazione per 30'
- Centrifugare per 15' a 3.000 g a 20 (gradi) C o per 20' a 2.000
g
- Risospendere il sedimento in 2 ml di tampone fosfato pH 6,8 e
inoculare con 1 ml i terreni di coltura; destinare l'altro
millilitro, diluito 1/10 in tampone fosfato pH 6,8 alla inoculazione
degli animali da esperimento, qualora si voglia ricorrere alla prova
biologica.
4. Semina e terreni di isolamento.
La semina viene effettuata in ragione di 0,2 ml del preparato
utilizzando i seguenti terreni colturali solidi preparati a becco di
clarino a diversa selettivita':
- 2 provette di Lowenstein-Jensen
- 1 provetta di Lowenstein-Jensen senza glicerina con 0,5% di
piruvato di sodio o una provetta ai Stonebrink
5. Incubazione delle colture.
I terreni inoculati vanno posti in termostato a 37 (gradi) C e una
delle due provette di Lowenstein-Jensen a 43 (gradi) C.
È preferibile usare un'atmosfera al 5-10% di CO2.
Le colture vanno esaminate in prima lettura dopo 2-5 giorni ed in
seguito settimanalmente per 6-12 settimane.
6. Inoculazione di animali da esperimento.
Generalmente l'inoculazione in animali viene poco usata, esistendo
numerose tecniche in vitro per l'isolamento e l'identificazione più
specifiche.
Alla prova biologica si può ricorrere in parallelo all'esame
colturale, nel caso in cui si sospetti la presenza di micobatteri in
scarso numero nel campione o una forte contaminazione di questo.
Può essere utilizzata anche a fini identificativi (vedi tabella).
La prova biologica classica si effettua inoculando
contemporaneamente 1 ml di omogenato decontaminato nel muscolo
della coscia di 2 cavie, 1 ml per via intraperitonale in due
conigli e 1 ml per via endovenosa in due polli adulti.

PATOGENICITÀ DEI MICOBATTERI
NEGLI ANIMALI DA LABORATORIO


_____________________________________________________________________
| Cavia | Pollo | Coniglio
__________________|_____________|_______________|____________________
M. bovis | + | - | +
MAI complex | - | + | +
M. tuberculosis | + | - | -
__________________|_____________|_______________|____________________
* M. avium-intracellulare complex



7. Identificazione.
Per identificare i micobatteri è necessario basarsi su diversi
caratteri:
- l'acido resistenza
- tempo, temperatura e aspetto di crescita
- assenza di pigmento nei principali micobatteri di interesse
veterinario
- tests biochimici
7.1. Tab. 2.

IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA


_____________________________________________________________________
| | | | |
Micobatteri | Crescita | Ureasi |Riduzione |Riduzione |Niacina
|__________| | | |
| 37 43 | | tellurito | nitriti |
|gradi gradi | | |
_______________|__________|_________|___________|___________|________
| | | | |
M. bovis | L _ | (+ o -) | (+ o -) | _ | _
MAI complex | L _ | _ | + | _ | _
M. tuberculosis| L _ | (+ o -) | (+ o -) | + | +
Micobatteri | | | | |
rapida crescita| R _ | + | + | (+ o -) | (+ o -)
_______________|__________|_________|___________|___________|________

L = Crescita lenta &amp;gt 7 gg
R = Crescita rapida &amp;lt 7 gg


Tutte le prove devono essere eseguite a partire da colture
abbondanti in attiva fase di crescita e vanno sempre accompagnate da
controllo positivo e negativo.
7.2. Ureasi.
- Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 4 ml di brodo contenente
urea (2%), glucosio (0,1%) e rosso fenolo (0,0012%) (colorazione
rosso-arancio) e incubare a 37 (gradi) C per 3 giorni
- La reazione è positiva per viraggio del colore del terreno
verso il rosso porpora
7.3. Riduzione del tellurito.
- Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 5 ml di brodo Middlebrook
7H9 e incubare a 37 (gradi) C per 7 o più giorni, fino a crescita
visibile
- Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di potassio tellurito
allo 0,2% e reincubare per 4 giorni
- La reazione è positiva quando compare un precipitato nero
7.4. Riduzione dei nitrati.
- Inoculare 1 o 2 ansate di coltura in 1 ml di substrato (Nitrato
di sodio 0,01 M in tampone fosfato 1/45 M pH 7) e incubare per 2 ore
per 37 (gradi) C
- Aggiungere 0,1 ml di una soluzione acquosa di acido sulfanilico
allo 0,8% e acido acetico al 28,5% e 0,1 ml di una soluzione acquosa
di N,N-Dimetil-1-naftilammina allo 0,6% e acido acetico al 28,5%
- La reazione è positiva per comparsa di colore rosso
- La reazione è negativa se il colore rosso compare solo dopo
aggiunta di polvere di zinco
7.5. Niacina.
- Aggiungere 1 ml di acqua distillata sterile ad una coltura in
Lowenstein-Jensen, lasciare per 2 ore a temperatura ambiente
affinchè avvenga l'estrazione dal terreno
- Trasferire 0,5 ml dell'estratto in una provetta, aggiungere un
ugual volume di soluzione alcoolica di anilina al 4% e quindi
aggiungere 0,5 ml di bromuro di cianogeno al 10% (da non inalare o
mettere a contatto con la cute ed eliminare solo dopo
alcalinizzazione con NaOH)
- Un immediato sviluppo di colore giallo indica la positività
della reazione
Un'alternativa al metodo sopra descritto è l'utilizzo di strisce
per il test Niacina reperibili in commercio.

ALLEGATO 3
TUBERCOLOSI
Resistenza dei micobatteri nell'ambiente.
Locali: fino a 2 anni.
Acqua: fino ad 1 anno.
Terreno: fino a 2 anni.
Pascoli: fino a 2 anni.
Letame fino a 2 anni.
Resistono a pH fortemente acido (pH 1) e fortemente alcalino.
Sono rapidamente inattivati dalla luce solare.
Fra i microorganismi non sporigeni sono i più resistenti ai
disinfettanti chimici.
Disinfettanti efficaci.
Fenoli:
fenoli sintetici (ortofenilfenolo);
cresoli (cresoli saponati = lisolo).
Aldeidi:
formaldeide;
glutaraldeide (az + lenta).
Cloro:
ipocloriti;
cloramine.
Iodio: iodofori.
Tensioattivi anfoteri: azione parziale.
Peracidi: acido peracetico.
Ossido di etilene.
Disinfettanti non efficaci.
Acidi:
minerali;
organici.
Alcali: idrato sodico ecc.
Biguanidi: clorexidina.
Tensioattivi cationici: ammoni quaternari.
Disinfezioni nella pratica.
Il trattamento deve interessare tutte le superfici con particolare
riguardo a:
mangiatoie;
tazze d'abbeverata e abbeveratoi;
centraline per distribuzione automatica di mangime.
1 trattamento con soluzione al 3% di fenoli sintetici in
idropulitrice con acqua a 70/80(gradi)C; tempo di contatto = 1 h.
2 con pompa irroratrice soluzione 6/8% di formalina (formaldeide
1,8-2,4%); tempo di contatto 3-4 h; oppure glutaraldeide soluzione
2%; tempo di contatto = 5 h.
In ambienti sigillabili auspicabile trattamento aggiuntivo con
formaldeide gas oppure con termonebulizzatore.
Lasciare agire per una notte ed arieggiare per 24 h.
Stalle di montagna raggiungibili a piedi.
Trattamento con fenoli (pompe a spalla) seguito subito dopo da
fumigazioni con termonebulizzatore (formaldeide + paraclorofenolo).
Stalle con presenza di animali.
Ripetuti interventi con soluzioni di acido peracetico allo 0,3%;
T.C. = pochi minuti; ipotizzabile anche l'impiego di alcool etilico
70% in acqua.
Paddocks in terra.
Asportare deiezioni ed un sottile strato di terreno; spargere uno
strato uniforme di calcio cloruro in polvere, quindi arare e rullare.
Consigliati anche trattamenti con formalina 10%, acido peracetico
1-2%.
Sale di mungitura.
Ipoclorito di sodio 3% - T.C. = 1/2 ora.
Iodofori 3% - T.C. 1/2 ora.
Cloramina T 1% - T.C. = 1 ora.