Serie Generale n. 66 del 21-3-2005
ESTRATTI, SUNTI E COMUNICATI
MINISTERO DELLA SALUTE
MINISTERO DELLA SALUTE
COMUNICATO
Comunicato relativo alle metodologie diagnostiche per le malattie degli equidi riproduttori maschi ai fini della disciplina della riproduzione animale. (GU Serie Generale n.66 del 21-03-2005)

Agli Assessorati alla Sanità delle regioni e province autonome
Agli Istituti zooprofilattici sperimentali
e p.c.:
Al Centro di referenza nazionale per le malattie degli equidi presso
Istituto zooprofilattico sperimentale del Lazio e della Toscana
L'attuale normativa vigente, costituita dall'O.M. 13 gennaio
1994, relativa al piano nazionale di controllo dell'arterite equina,
dal decreto 4 dicembre 1976, relativo alla profilassi dell'anemia
infettiva degli equini e il decreto 19 luglio 2000, n. 403, recante:
«Approvazione del nuovo regolamento di esecuzione della legge 15
gennaio 1991, n. 30, concernente disciplina della riproduzione
animale», stabilisce i requisiti sanitari che gli equidi destinati
alla riproduzione naturale o artificiale devono rispettare per essere
autorizzati allo svolgimento di tali attività.
Con tali provvedimenti si è inteso garantire, attraverso il
controllo delle malattie della sfera riproduttiva, lo sviluppo e la
tutela del patrimonio nazionale dei riproduttori.
Al fine di uniformare e di rendere più facilmente gestibili
tecnicamente le operazioni volte al controllo sanitario degli
stalloni, si ritiene necessario fornire precise indicazioni circa le
metodologie diagnostiche e i protocolli d'intervento delle seguenti
malattie nei produttori equini maschi.
Si confida nella massima diffusione e si rappresenta l'urgenza,
stante l'imminente inizio della stagione di monta equina.
Roma, 14 marzo 2005
Il direttore generale della sanità veterinaria e alimenti Narabelli

Metodi diagnostici per l'accertamento sierologico dell'infezione da
virus della rinopolmonite equina negli equidi riproduttori maschi

Con il termine rinopolmonite vengono comprese le infezioni
sostenute dagli herpesvirus equini tipo 1 (EHV-1) e tipo 4 (EHV-4);
entrambi responsabili di forme di malattia a carico dell'apparato
respiratorio, solo il primo di aborti e forme neurologiche.
Il riscontro di anticorpi specifici per i due virus è frequente
sia per la diffusione dell'infezione (con maggiori prevalenze nei
confronti dell'EHV 4), sia per l'impiego di vaccini.
Pertanto, ai fini del rilascio dell'autorizzazione alla monta,
risulta prioritario effettuare la verifica documentale, relativa alle
eventuali profilassi immunizzanti, e condurre un'accurata visita
clinica contestualmente sia sugli stalloni, sia sui soggetti
sensibili presenti presso le stazioni di monta/aziende dove questi
siano mantenuti.
Per la definizione dello stato sanitario dei riproduttori si
applicano i seguenti protocolli e linee direttrici:
1. Visita clinica, verfica delle vaccinazioni e prelievo dei
campioni.

Effettuare in via preliminare la visita clinica dei riproduttori
maschi e di eventuali altri soggetti presenti.
Controllare i passaporti degli stalloni e verificare se presente
l'attestazione di avvenuta vaccinazione relativa all'anno in corso.
In assenza di sintomatologia clinica, da almeno quindici giorni,
riconducibile a malattie respiratorie, di aborti e/o di forme
neurologiche, anche negli altri animali eventualmente presenti presso
la stazione di monta/allevamento, può essere rilasciata
l'autorizzazione alla monta ai fini della presente infezione. In caso
vi siano soggetti con sintomatologia clinica, effettuare un prelievo
di sangue agli stalloni ed a tutti gli animali presenti presso la
stazione di monta/allevamento. Indicare nella scheda di
accompagnamento dei campioni eventuali interventi vaccinali
effettuati nell'anno in corso. Ripetere i prelievi fra il
quindicesimo ed il trentesimo giorno dal primo controllo per
verificare l'eventuale presenza di sieroconversioni.
Al fine di poter effettuare una comparazione oggettiva dei
risultati, inviare i campioni di sangue dei due prelievi allo stesso
laboratorio dell'Istituto Zooprofilattico, specificando il motivo del
prelievo sulla scheda di accompagnamento.
In ogni caso i prelievi di sangue devono essere effettuati
sterilmente.
Riferimenti.

Manual of Diagnostic Tests and Vacines for Terrestrial Animals
OIE 2004, Parte seconda, Sezione 2.5, Capitolo 2.5.7.
2. Prova di sieroneutralizzazione (SN).

Fra i diversi metodi diagnostici che possono essere impiegati per
gli accertamenti sierologici della rinopolmonite equina, solo la
prova di sieroneutralizzazione, eseguita contestualmente nei
confronti dell'EHV- 1 e dell'EHV-4, è in grado di differenziare le
infezioni sostenute dai due virus e di rilevare la presenza di
anticorpi anche a distanza di lunghi periodi dall'infezione e,
trattandosi di una determinazione quantitativa, di evidenziare
sieroconversioni in caso di infezioni recenti.
Principio.

La prova di sieroneutralizzazione è impiegata per individuare la
presenza in sieri di anticorpi capaci di neutralizzare l'infettività
virale. La neutralizzazione dell'attività infettante del virus
dell'arterite virale equina si evidenzia attraverso l'assenza di
effetto citopatico sul substrato cellulare sensibile impiegato.
Reagenti, terreni e materiali.

Terreno di crescita per il substrato cellulare.
Soluzione antibiotata per terreno colturale.
Siero fetale bovino.
Micropiastre sterili a 96 pozzetti a fondo piatto per colture
cellulari con coperchio.
Materiali di riferimento.

Antigeni preparati con gli stipiti di referenza EHV-1 ed EHV-4.
Si raccomanda di mantenere le aliquote del virus titolato in
condizioni che ne consentano il mantenimento del titolo.
Siero Positivo di Lavoro.
Siero Negativo di Lavoro.
Substrati biologici.

Sospensioni di cellule RK 13 per l'EHV-l e di derma equino (ED)
per l'EHV-4, in concentrazione tale da assicurare la presenza di un
monostrato confluente entro il giorno successivo all'utilizzo
(indicativamente 105' cellule/ml).
Procedura.

Al fine di evitare contaminazioni crociate nel corso delle prove
si raccomanda di eseguire le SN per EHV-l ed EHV-4 separatamente.
Inattivare i sieri in esame ed i Sieri Positivi e Negativi di
Lavoro in bagnomaria a 56° per 30 minuti.
Preparare il terreno di coltura aggiungendo 1'1% di soluzione
antibiotata per la diluizione dei sieri e dell'antigene.
La prova si effettua in 2 repliche: per ogni siero eseguire
diluizioni scalari in base 2 partendo dalla diluizione 1/2 (dopo
l'aggiunta del virus diluizione finale 1/4). Si opera impiegando
volumi di 25 \mu l dei sieri e del diluente.
Per ogni siero effettuare un controllo della tossicità alla
diluizione minima saggiata, omettendo l'aggiunta del virus e portando
a volume con 25 \mu 1 del diluente.
Aggiunta dell'antigene e delle cellule.

Preparare le sospensioni dei due diversi virus, impiegando come
diluente il terreno per colture cellulari antibiotato, contenente 100
dosi infettanti tessuto coltura /25 \mu l (TCID50).
Distribuire 25 \mu l delle sospensioni virali in ogni pozzetto ad
eccezione di quelli utilizzati per il controllo della tossicità dei
sieri.
Le dosi infettanti del virus sono verificate mediante titolazione
inversa in base 10, fino a 0 TCID50/25 \mu l, partendo dalla
concentrazione d'uso dell'antigene, effettuando almeno quattro
repliche per diluizione.
Ricoprire le piastre ed agitare delicatamente per facilitare la
miscelazione del siero e del virus.
Incubare le micropiastre per un'ora a 37 °C in atmosfera umida al
5% di CO2.
Terminata l'incubazione, distribuire 50 \mu l delle sospensioni
di cellule contenente siero fetale bovino in tutti i pozzetti,
compresi quelli della piastra dei controlli. Agitare delicatamente ed
incubare in termostato a 37 °C in atmosfera umida al 5% di CO2.
La lettura dei controlli e dei sieri in esame si effettua dopo la
quarta o la quinta giornata.
Validità dei risultati.

Il test è valido se:
il controllo del virus presenta un titolo da 30 a 300 dosi
infettanti/25 \mu l;
il titolo del Siero Positivo di Lavoro ricade nell'intervallo
atteso rispetto al suo titolo noto.
Lettura dei risultati.

È considerata positiva la diluizione del siero in cui sia
presente una riduzione dell'effetto citopatico del 100%
confrontandola con quella dei pozzetti della più bassa diluizione
del controllo delle dosi infettanti del virus. Il titolo del Sieri
Positivi di Lavoro e dei sieri in esame corrisponde alla diluizione
più alta in cui si ha ancora assenza totale dell'effetto citopatico
in entrambe le repliche.
Interpretazione dei risultati.

Si è in presenza di sieroconversione negli stalloni quando si ha
un aumento del titolo di almeno log. 10 10' 1,2 tra i campioni del
primo e del secondo prelievo ovvero anche solo in alcuni dei soggetti
mantenuti presso gli stessi allevamenti o stazioni di monta,
controllati in caso di riscontro di sintomatologia clinica riferibile
a rinopolmonite.
Metodi diagnostici per l'accertamento sierologico dell'infezione da
virus dell'anemia infettiva degli equini L'immunodiffusione in
gel di agar (AGID) ed i test immunoenzimatici (ELISA) sono i metodi
di attuale impiego per la diagnosi sierologica dell'anemia infettiva
degli equidi.
Tuttavia questi metodi non sono in grado di rilevare anticorpi
nelle prime settimane dell'infezione, o, più raramente, nel corso di
malattia in forma acuta quando il virus in circolazione è in grado
di neutralizzare gli anticorpi presenti nel sangue.
Sebbene i test ELISA siano in grado di mettere in evidenza
anticorpi più precocemente ed a concentrazioni più basse, sono
state talvolta osservate delle false positività. Pertanto le
positività sierologiche in ELISA devono essere confermate per mezzo
dell'AGID. Quest'ultimo metodo, che rileva principalmente anticorpi
nei confronti della proteina virale p26, ha il vantaggio di
distinguere fra le linee di precipitazione quelle specifiche
(reazione di identita).
Le positività sierobogiche possono anche essere confermate
mediante tecnica di immunoblotting.
Per la diagnosi sierologica si applicano le linee direttrici ed i
metodi di seguito riportati:
1. Prelievo dei campioni.

Quando fra gli equidi mantenuti fossero presenti soggetti con
febbre o sintomatologia clinica riconducibile a malattie infettive,
il prelievo di sangue dovrà essere ripetuto trascorsi almeno 20
giorni dal primo prelievo.
2. Prova di immunodiffusione in gel di agar.

Principio del metodo.
L'AGID è basata sulla diffusione contemporanea dell'antigene e
degli anticorpi del siero in esame, uno verso l'altro nel substrato
impiegato. In presenza di anticorpi si forma una linea di
precipitazione tra i pozzetti dell'antigene e del siero. La linea è
ritenuta specifica ed è definita come linea di identità quando si
presenta continua con la linea di precipitazione che si forma tra
l'antigene ed il siero positivo di controllo.
I campioni di sangue prelevati nelle prime 2-3 settimane
dall'infezione possono risultare negativi al test.
Riferimenti.

Manual of Diagnostic Tests and Vacines for Terrestrial Animals
OIE 2004, Parte seconda, Sezione 2.5, Capitolo 2.5.4.
Reagenti, terreni e materiali.

Piastre petri di diametro da 100 mm.
Tampone fosfato (PBS) pH 7,2.
Agar Noble disciolto in tampone borato* pH 8,6 alla
concentrazione dell'1%.
Acqua distillata.
* Formula Tampone borato:
NaOH 2 gr;
H3BO3 9 gr;
H2O distillata portare a volume di 1000 ml.
Stampo punzone con una rosetta da 7 pozzetti di cui uno centrale
e 6 periferici del diametro di 5,3 mm. La distanza tra i pozzetti è
di 2,4 mm.
Materiali di riferimento.

Antigene preparato con virus ceppo Wyoming (American Type Culture
Collection VR - 778).
L'antigene può essere prodotto a partire da un'estratto di milza
di equidi con infezione acuta o da colture di tessuto. Allo scopo
possono essere impiegate cellule di rene fetale equino, di derma
equino e di timo canino.
Possono essere inoltre impiegate proteine ricombinanti, espresse
in batteri o baculovirus, di antigeni del capside.
Siero positivo di lavoro.
I materiali di riferimento, prima del loro utilizzo, devono
essere approvati dal Centro di Referenza per l'Anemia Infettiva degli
Equini.
Procedura.

Distribuire 15 ml di terreno agar Noble in piastre petri poste su
un piano livellato.
Dopo solidificazione punzonare tramite stampo l'agar per avere
una serie di rosette di pozzetti per piastra. Aspirare l'agar da
ciascun pozzetto.
Distribuire, fino a riempimento dei pozzetti:
a) l'antigene nel pozzetto centrale;
b) il siero positivo di lavoro in tre pozzetti periferici
alternati;
c) i sieri in esame nei rimanenti pozzetti.
Incubare per 24 - 48 ore a temperatura ambiente in camera umida.
Lettura della reazione.

La lettura si effettua successivamente alla quarantottesima ora
d'incubazione impiegando una lampada a luce incidente. Verificare la
formazione delle linee di precipitazione tra i pozzetti del siero
positivo di lavoro e dell'antigene.
Il siero in esame è considerato positivo quando forma una linea
di precipitazione che presenta identità con la linea di
precipitazione tra l'Antigene ed il Siero Positivo di Lavoro o quando
ne determina 1'incurvamento.
I sieri con alti titoli di anticorpi precipitanti possono formare
linee di precipitazione più spesse che tendono a far dissolvere la
linea formata fra i pozzetti contenenti i materiali di riferimento,
anche fino a circa la metà della posizione normale, e tendono a
scomparire con il tempo. Per confermare la positività di tali sieri,
gli stessi devono essere nuovamente esaminati, previa diluizione di
1/2 e 1/4 in soluzione di Tampone fosfato. In caso di formazione di
una linea d'identità si devono considerare come positivi.
Un siero è considerato negativo quando non forma una linea
d'identità con l'Antigene e non induce l'incurvamento o
l'interruzione della linea di precipitazione tra l'Antigene ed il
Siero Positivo di Lavoro.
Gli equidi che abbiano contratto recentemente l'infezione possono
non fornire una reazione positiva al test di AGID. È pertanto
necessario effettuare un nuovo controllo a distanza di 2 settimane.
3. Prove immunoenzimatiche.

Fra i diversi test ELISA messi a punto, è raccomandabile l'uso
di metodi che prevedano l'impiego della proteina capsidica p26 per
l'elevato grado di conservazione antigenica della stessa nei virus
circolanti.
Gli esiti positivi in ELISA devono essere controllati mediante
AGID o immunoblotting.
I sieri che abbiano fornito risultati di difficile
interpretazione, nonchè tutti quelli risultati positivi alle prove
d'immunodiffusione ed immunoenzimatica devono essere inviati al
Centro di Riferimento per l'Anemia Infettiva degli Equini per la
conferma diagnostica.
Metodi diagnostici per l'accertamento dell'infezione da virus
dell'arterite virale negli equidi riproduttori maschi

Per gli accertamenti sierologici e virologici si applicano le
linee direttrici ed i metodi di seguito riportati:
A. Accertamenti sierologici.
1. Prelievo dei campioni.
Effettuare il prelievo di sangue sterilmente.
Qualora fra i riproduttori o fra gli equidi mantenuti assieme
fossero presenti soggetti con febbre o sintomatologia clinica
riconducibile a malattie infettive, il prelievo di sangue dovrà
essere effettuato trascorsi 15 giorni dall'ultimo caso di malattia.
Riferimenti.

Manual of Diagnostic Tests and Vacines for Terrestrial Animals
OIE 2004, Parte seconda, Sezione 2.5, Capitolo 2.5.10.
2. Prova di sieroneutralizzazione.

Principio.
La prova di sieroneutralizzazione è impiegata per individuare la
presenza in sieri di anticorpi capaci di neutralizzare l'infettività
virale. La neutralizzazione dell'attività infettante del virus
dell'arterite virale equina si evidenzia attraverso l'assenza di
effetto citopatico sul substrato cellulare sensibile impiegato.
Reagenti, terreni e materiali.

Terreno di crescita per il substrato cellulare.
Complemento di cavia.
Soluzione antibiotata per terreno colturale.
Siero fetale bovino.
Micropiastre sterili a 96 pozzetti a fondo piatto per colture
cellulari con coperchio.
Materiali di riferimento.

Antigene preparato con lo stipite di referenza CVL-Bucyrus
(Weybridge). Si raccomanda di mantenere le aliquote del virus
titolato in condizioni che ne consentano il mantenimento del titolo.
Siero Positivo di Lavoro.
Siero Positivo di Lavoro a basso titolo.
Siero Negativo di Lavoro.
Substrati biologici.

Sospensione di cellule RK 13 in concentrazione (indicativamente
105 cellule/ml) tale da assicurare la presenza di un monostrato
confluente entro il giorno successivo al loro utilizzo.
Procedura.

Inattivare i sieri in esame ed i Sieri di Lavoro in bagnomaria a
56° per 30 minuti.
Preparare il terreno di coltura aggiungendo 1'1% di soluzione
antibiotata per la diluizione dei sieri e dell'antigene.
La prova si effettua in 2 repliche: per ogni siero eseguire
diluizioni scalari in base 2 partendo dalla diluizione 1/2 (dopo
l'aggiunta del virus diluizione finale 1/4). Si opera impiegando
volumi di 25 \mu l dei sieri e del diluente.
Per ogni siero effettuare un controllo della tossicità alla
diluizione minima saggiata, omettendo l'aggiunta del virus e portando
a volume con 25 \mu l del diluente.
Aggiunta dell'antigene e delle cellule.

Preparare la sospensione del virus contenente da 100 a 300/25 \mu
l dosi infettanti tessutocoltura (TCID50) impiegando come diluente il
terreno per colture cellulari antibiotato contenente complemento di
cavia alla concentrazione finale del 10%.
Distribuire 25 \mu l della soluzione contenente la sospensione
virale in ogni pozzetto ad eccezione di quelli utilizzati per il
controllo della tossicità dei sieri.
Le dosi infettanti del virus sono verificate mediante titolazione
inversa in base 10, fino a 0 TCID50/25 \mu l, partendo dalla
concentrazione d'uso dell'antigene, effettuando almeno quattro
repliche per diluizione. Ricoprire le piastre ed agitare
delicatamente per facilitare la miscelazione del siero e del virus.
Incubare le micropiastre per un'ora a 37 °C in atmosfera umida al
5% di CO2.
Verificare, dopo una notte d'incubazione, il controllo delle
cellule e di citotossicità dei sieri in esame.
Terminata l'incubazione, distribuire 100 \mu l della sospensione
di cellule contenente siero fetale bovino in tutti i pozzetti,
compresi quelli della piastra dei controlli. Agitare delicatamente ed
incubare in termostato, a 37 °C in atmosfera umida al 5% di CO2.
La lettura dei controlli e dei sieri in esame è effettuata dopo
la seconda o la terza giornata.
Validità dei risultati.

Il test è valido se:
il controllo del virus presenta un titolo da 30 a 300 dosi
infettanti/25 \mu l;
i titoli dei Sieri Positivi di Lavoro ricadono nell'intervallo
di 0,3 log.10 rispetto ai titoli noti.
Lettura dei risultati.

È considerata positiva la diluizione del siero in cui sia
presente una riduzione dell'effetto citopatico del 100%
confrontandola con quella dei pozzetti della più bassa diluizione
del controllo delle dosi infettanti del virus. Il titolo finale del
siero è calcolato con il metodo di Spearman/Karber.
Quando a causa di neutralizzazione parziale o in presenza di
tossicità del siero si renda difficile stabilire se un campione sia
negativo alle diluizioni più basse, il problema può essere superato
riesaminado il campione risultato tossico effettuando la
sieroneutralizzazione su monostrato confluente di RK-13 allestito il
girono precedente. In alternativa, l'effetto tossico può essere
ridotto o eliminato adsorbendo per un ora a 37 °C il siero da
esaminare con un numero di cellule in numero almeno doppio rispetto a
quello previsto per la prova di sieroneutralizzazione. Al termine
dell'incubazione far precipitare le cellule mediante centrifugazione
e riesaminare il campione come da procedura. Nel caso persistesse
l'effetto citotossico successivamente ai trattamenti descritti,
richiedere la ripetizione dei prelievo del campione ed inviarlo per
la conferma diagnostica, unitamente al primo, al Centro di Referenza
Nazionale per le Malattie Equini.
Interpretazione dei risultati.

Uno stallone è considerato positivo se al test di
sieroneutralizzazione viene riscontrato un titolo uguale o superiore
a 1/4. Gli stalloni siero positivi devono essere sottoposti al
prelievo di sperma per poter escludere l'eliminazione del virus.
B. Isolamento ed identificazione del virus dell'arterite virale
equina in tessutocoltura e ricerca del genoma virale mediante PCR.

1. Prelievo dei campioni di sperma.
Il prelievo di sperma deve essere effettuato mediante vagine
artificiali a fondo cieco ed impiegando materiali monouso per la
raccolta.
Al fine di poter escludere lo stato di eliminatore del virus
negli stalloni sieropositivi devono essere effettuati tre prelievi di
sperma ad intervalli di almeno 10 giorni. In caso di negatività, i
controlli dovranno comunque essere ripetuti anche l'anno successivo.
Per evitare l'inattivazione del virus eventualmente presente,
controllare che la temperatura della camera interna della vagina
artificiale non sia superiore a 40 °C ed assicurarsi che non siano
stati impiegati antisettici o disinfettanti per la cura o la pulizia
dei genitali esterni prima dell'effettuazione del prelievo.
Ai fini dell'isolamento virale i campioni devono contenere la
frazione ricca di sperma cui il virus è associato negli animali
portatori ed eliminatori.
I campioni di sperma devono essere mantenuti refrigerati
immediatamente dopo il prelievo e devono essere consegnati al più
presto al laboratorio. Quando non fosse possibile effettuare
tempestivamente la consegna, conservare i campioni a temperatura \leq
-- 20 °C.
2. Verifica dell'idoneità del campione in laboratorio.

Prima di procedere alla preparazione del campione verificare al
microscopio la presenza/assenza di spermatozoi. Quando
all'osservazione gli spermatozoi siano assenti o rari il campione è
da ritenersi non idoneo; richiedere quindi al Veterinario Ufficiale
la ripetizione del prelievo.
In attesa dell'esecuzione delle prove i campioni devono essere
mantenuti congelati a temperatura \leq -- 20 °C.
3. Isolamento del virus in tessutocoltura.

L'isolamento in tessutocoltura è il metodo ufficiale per la
definizione dello stato di eliminatore di virus degli stalloni
sieropositivi.
Substrati biologici.

Cellule renali di coniglio in linea continua RK-13 (clone ATCC
CCL-37). Si raccomanda l'uso di cellule a basso numero di passaggi
poichè l'età della linea cellulare risulta essere critica rispetto
alla sensibilità della stessa all'infezione.
Reagenti, terreni e materiali.

Terreno per colture cellulari a diversa composizione in relazione
al tipo di sistema di coltivazione impiegato (sistema chiuso in
fiasche o in piastre in atmosfera al 5% di CO2).
Soluzione di antibiotici per colture cellulari.
Siero fetale bovino.
Carbossimetilcellulosa a media densità.
Fiasche per colture cellulari o piastre a fondo piatto a pozzetti
multipli.
Preparazione del campione.

Prima di procedere all'inoculazione su colture cellulari,
sottoporre il campione di sperma a tre cicli di trattamento con
ultrasuoni di 15 secondi, procedendo quindi a centrifugare a 4° C a
1000 g per 10 minuti per precipitare la frazione cellulare.
Procedura.

Per l'isolamento impiegare un monostrato di cellule confluenti di
età compresa fra 3 e 5 giorni. Indipendentemente dal supporto di
crescita impiegato, il rapporto tra superficie del monostrato da
infettare e volume di materiale da inoculare deve essere di
2,5cm2/0,1 ml.
Effettuare diluizioni loganitmiche in base 10 del sopranatante
del campione di sperma da 10-1' a 10-3' in terreno di coltura di
mantenimento contenente antibiotici e siero fetale bovino al 2%.
Inoculare, in almeno 2 repliche, le tessutocolture con le
diluizioni del campione effettuate in precedenza.
Allestire contemporaneamente controlli della prova, seguendo lo
stesso procedimento, utilizzando campioni di sperma positivi o un
ceppo virale di controllo a titolo noto.
Chiudere le fiasche o coprire le piastre a pozzetti multipli e,
con movimento circolare, distribuire l'inoculum omogeneamente su
tutta la superficie.
Incubare a 37 °C per un'ora in sistema chiuso od in atmosfera
umida al 5% di CO2 rispettivamente le fiasche o le piastre a pozzetti
multipli.
Dopo l'incubazione coprire la superficie dei supporti di crescita
con una soluzione di cabossimetilcellulosa allo 0,75% in terreno di
coltura contenente la soluzione antibiotata, senza rimuovere
l'inoculo.
Porre le colture ad incubare a 37 °C. Osservare al microscopio
per la presenza di effetto citopatico che di norma, in presenza di
virus, compare tra la seconda e la sesta giornata.
Al 5° - 7° giorno, in assenza di evidente effetto citopatico,
inoculare nuovi monostrati cellulari con il sopranatante delle
colture senza danneggiare.
Addizionare le diluizioni del campione (da 10-1' a 10-3' ) con
polietilene glicole in modo da ottenere una concentrazione finale di
quest'ultimo al 10%, lasciando per una notte a + 4 °C e sottoponendo
a leggera agitazione.
Centrifugare a 2000 g per 30 minuti ed eliminare il sopranatante.
Risospendere il precipitato in un volume pari ad un decimo di i
monostrati.
Dopo aver asportato il sopranatante colorare i monostrati con una
soluzione di cristalvioletto contenente formalina tamponata alla
concentrazione dello 0,1 % per mettere in evidenza la presenza di
eventuali placche.
I campioni che comportano delle difficoltà diagnostiche sono
inviati al Centro di Referenza Nazionale per le Malattie degli
Equini.
Alcuni campioni di sperma possono risultare tossici per il
substrato cellulare specie alle diluizioni più basse saggiate. In
tali casi procedere al trattamento dei campioni di sperma con
polietilene glicole con peso molecolare 6000, prima di inoculare il
substrato cellulare, secondo le modalità di seguito riportate:
quello delle diluizioni originarie in terreno colturale di
mantenimento, ed omogeneizzare.
Sottoporre a centrifugazione l'omogeneizzato a 2000 g per 30
minuti, ed impiegare il sopranatante per l'esecuzione della prova
secondo le modalità sopra descritte.
Qualora i campioni dovessero risultare citotossici anche
successivamente al trattamento, richiedere la ripetizione del
prelievo.
Identificazione e caratterizzazione del virus.

Considerato che nei campioni di sperma possono essere presenti
anche altri agenti virali, qualsiasi isolato deve essere sottoposto
ad identificazione.
L'identificazione dei virus isolati deve essere effettuata
mediante test di neutralizzazione, o mediante immunofluorescenza
impiegando sieri monospecifici o anticorpi monoclonali.
In ogni caso, ogni virus isolato deve essere inviato al Centro di
Referenza Nazionale per le Malattie degli Equini per la conferma
dell'identificazione e per l'esecuzione di ulteriori prove per di
caratterizzazione.
Interpretazione dei risultati.

Uno stallone riproduttore sieropositivo è considerato
eliminatore quando il virus, isolato da almeno uno dei tre prelievi,
è identificato come virus dell'arterite virale equina.
C. Ricerca del genoma virale mediante trascrizione inversa-nestedpcr
(RT-NPCR).

L'isolamento del virus è ancora oggi l'unico test riconosciuto a
livello internazionale per gli scambi di equidi; pertanto altri test,
quali quelli che prevedono la ricerca dell'acido nucleico virale da
campioni di sperma, possono essere unicamente impiegati come
eventuali prove di supporto o collaterali per lo svolgimento di
indagini o ricerche. E opportuno sottolineare che il rilevamento
dell'acido nucleico virale mediante RT-PCR, non essendo in grado di
distinguere virus infettante da virus non infettante e particelle
virali incomplete, non può dare indicazioni relativamente
all'effettiva capacità di diffondere l'infezione da parte di uno
stallone o di un campione di sperma, fattore considerato di estrema
importanza ai fini degli scambi degli equidi e/o del seme. Tuttavia
occorre anche considerare che la PCR, a differenza dell'isolamento su
colture cellulari, permette di rilevare un'eventuale positività
anche in campioni non prelevati o conservati correttamente, dove
l'infettività del virus può essere compromessa.
La sensibilità della RT-nPCR può essere notevolmente
influenzata dalla selezione degli oligonucleotidi da impiegare nella
prova. Pertanto la scelta dovrà essere rivolta a quelli in grado di
riconoscere le regioni del genoma virale per le quali è stata
accertato il maggior grado di conservazione. Fra queste sono state
individuate quelle codificanti la proteina nucleocapsidica N e una
delle proteine (M) dell'envelope virale.
Procedura.

Protocollo per l'esecuzione della RT-nPCR.
Vengono di seguito riportati i protocolli consigliati per
l'estrazione dell'RNA virale e le sequenze degli oligonucleotidi da
impiegare.
La metodica deve essere eseguita adottando opportune misure e
buone pratiche di laboratorio finalizzate alla riduzione dei rischi
di contaminazione tra campioni e da prodotti di PCR.
Estrazione dell'RNA da campioni di sperma:

In due tubi trasferire rispettivamente 150\mu l di supernatante
tal quale, ottenuto dalla sonicazione e centrifugazione del seme ai
fini dell'isolamento virale su colture cellulari, e i 150\mu l di una
diluizione 1/10 in acqua a grado reagente sterile trattata con
dietilpirocarbonato (H20 -DEPC);
Aggiungere 400\mu l di tiocianato di guanidinio (GuSCN) 6M;
Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti;
Aggiungere 225\mu l di NaCl 5M sterile, 400 \mu l di
cloroformio (CHC13) saturo con H2O -DEPC ed agitare vigorosamente;
Incubare in ghiaccio per 10 minuti;
Centrifugare a 13000g a 4 °C per 10 minuti;
Ripetere, se necessario, l'estrazione con CHC13 saturo con
H2O-DEPC fino ad ottenere un'interfase pulita;
Trasferire la fase acquosa (circa 600 \mu l) in un nuovo tubo e
aggiungere 1 \mu l di glicogeno 20 \mu g/\mu l;
Aggiungere 360 \mu l di etanolo al 95%, conservato a -- 20 °C.
Incubare a --20° C;
fino al giorno successivo;
Centrifugare a 13000g a 4 °C per 30 minuti;
Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di etanolo al 70%,
conservato a -- 20 °C;
Centrifugare a 13000g a 4 °C per 15 minuti;
Eliminare il supernatante e lasciare asciugare il precipitato;
Risospendere il precipitato in 50\mu l di H2O-DEPC;
Impiegare l'RNA estratto per la reazione di trascrizione
inversa.
Possono essere in alternativa utilizzati altri metodi di
estrazione purchè ne sia stata preliminarmente verificata
l'efficienza in comparazione al metodo descritto.
Oligonucleotidi impiegati per l'esecuzione della RT-nPCR

----&gt; Vedere Tabella a pag. 62 della G.U. &lt;----

Temperature di annealing:
PCR-1: 57 °C per i primi 5 cicli di amplificazione; 52 °C per i
successivi;
PCR-2: 55 °C per i primi 5 cicli di amplificazione; 50 °C per i
successivi.
Nel caso in cui un campione dovesse risultare positivo al test
della RT-nPCR e negativo all'isolamento su colture cellulari,
richiedere al Veterinario Ufficiale la ripetizione del prelievo ed
inviare al Centro di Referenza Nazionale per le Malattie degli Equini
i campioni per la conferma diagnostica.
Metodo diagnostico per la ricerca di Taylorella equigenitalis negli
equidi riproduttori maschi Il metodo ufficiale di prova per la
ricerca di T. equigenitalis, agente eziologico della Metrite
Contagiosa Equina (CEM), riconosciuto ai fini degli scambi
internazionali è l'esame colturale, non essendo stati descritti
metodi sierologici validi in grado di definire lo status di
positività nei soggetti infetti/portatori.
Il microrganismo, al di fuori dell'apparato genitale degli
Equidi, è particolarmente sensibile alle condizioni ambientali e
risulta inoltre di difficile coltivazione. È necessaria quindi
l'adozione di particolari precauzioni nelle fasi di prelievo e di
trasporto dei campioni da sottoporre ad accertamenti.
Riferimenti.

Manual of Diagnostic Tests and Vacines for Terrestrial Animals
OIE 2004, Parte Seconda, Sezione 2.5, Capitolo 2.5.1
Per il prelievo dei campioni e gli accertamenti microbiologici si
applicano le seguenti linee direttrici ed il metodo di seguito
riportati:
1. Prelievo dei campioni.
All'inizio della stagione di monta, tutti gli stalloni devono
essere sottoposti a ricerca di T. equigenitalis, attraverso prelievo
di singoli tamponi con terreno di trasporto tipo Amies con carbone
attivo (necessario per l'adsorbimento di prodotti del metabolismo
batterico), da:
uretra, fossa uretrale, prepuzio. Tale prelievo va ripetuto a
distanza di non meno di 7 giorni;
i tamponi debbono essere conservati in condizione di
refrigerazione e debbono essere inviati agli Istituti Zooprofilattici
Sperimentali entro le 24-48 ore dal momento prelievo;
i tamponi pervenuti in laboratorio senza terreno di trasporto,
o con terreno privo di carbone attivo, o dopo le 48 ore dal prelievo,
non sono idonei per l'esame colturale per T. equigenitalis.
Al momento del prelievo, il Veterinario Ufficiale deve accertarsi
che non siano stati effettuati trattamenti locali dell'apparato
genitale con disinfettanti o chemioantibiotici, o che siano trascorsi
almeno 21 giorni dall'ultimo trattamento. È necessario sospendere
terapie con chemioantibiotici di qualsiasi genere, per via generale,
almeno 7 giorni prima di iniziare i prelievi genitali per CEM.
2. Ricerca di Taylorella equigenitalis.

Terreno di Coltura.
È necessario utilizzare per l'esame colturale chocolate agar,
costituito da una base nutritiva con controllo di Qualità che
garantisca la crescita1' di T. equigenitalis: CEMO Agar.
Composizione:
Peptone di soia g 5;
Idrolisato enzimatico di caseina g 15;
Sodio cloruro g 5;
L-cistina g 0,3;
Sodio solfito g 0,2;
Agar A g 12
pH 7,3 \pm 0,2 a 25 °C;
-----
1' Ad esempio C.E.M.O. Agar, Mast Diagnostics, UK.
Preparazione.

Pesare 37,5 g di base nutritiva e versare in una beuta e
sospendere in 1 litro di acqua distillata.
Riscaldare fino a completo scioglimento.
Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
Raffreddare a 50 °C.
Aggiungere sterilmente sangue equino per avere una concentrazione
finale del 5%.
Mescolare accuratamente e riscaldare il terreno ad 80 °C per 10
minuti agitando occasionalmente fino a quando non raggiunge un colore
bruno cioccolato.
Raffreddare a 50 °C ed aggiungere sterilmente trimethoprim 0,001
g/l, clindamicina 0,005 g/l ed amfotericina B 0,005 g/l.
Distribuire il terreno in piastre sterili.
Controlli di Qualità.

Controllo positivo: si effettua utilizzando Taylorella
equigenitalis (ATCC 35865) esito: crescita.
Controllo negativo: assenza di crescita di microorganismi su
terreno non inoculato.
Procedura.

Seminare il tampone per strisciamento su CEMO agar.
Incubare la piastra di CEMO agar in termostato a 37 °C con
atmosfera al 5-10% CO2. In alternativa, incubare in giara con
apposito CO2 generating kit in analoghe condizioni di percentuale di
CO2 e di temperatura. In tal caso, per verificare le condizioni di
microaerofilia, è necessario incubare in giara anche una piastra di
CEMO con il controllo positivo.
Lasciare in incubazione almeno 48 h prima di procedere
giornalmente ad una lettura preliminare fino al decimo giorno di
incubazione in cui si effettua una lettura definitiva.
Lettura.

Valutare la presenza su CEMO agar di colonie riferibili a T.
equigenitalis.
Le colonie di T. equigenitalis si rendono visibili su CEMO agar
solo dopo 48 h, sono puntiformi, di diametro fino a 2-3 mm, lisce con
margini arrotondati, acquose, opache e di colore giallo-grigiastro.
Identificazione.

Esame microscopico.
T. equigenitalis si presenta come un batterio Gram negativo di
piccole dimensioni, di forma bacillare o coccobacillare, spesso
pleomorfo (talvolta fino a 6 \mu m di lunghezza) e può esibire
colorazione bipolare.
Test biochimici.

Sottoporre le colonie sospette per le suddette caratteristiche
colturali e di crescita ai test di catalasi, ossidasi, fosfatasi.
Test della catalasi: T. equigenitalis è catalasi positivo.
Test dell'ossidasi: T. equigenitalis è ossidasi positivo.
Test della fosfatasi alcalina: T. equigenitalis è fosfatasi
positivo.
Test della fosfatasi alcalina:

prelevare 0,5 ml di soluzione tampone Tris (pH 8) con una
pipetta Pasteur sterile e versare in una provetta sterile con tappo a
vite. Prelevare con un'ansa sterile una o più colonie sospette e
sospenderle nella soluzione tampone Tris. Prelevare 0.5 ml di
soluzione di p-nitrofenilfosfato disodico 1 mg/ml con una pipetta
Pasteur sterile e versarla nella sospensione. Incubare a 37 °C per 2
ore.
Lettura e conferma dei risultati.

La formazione di colore giallo indica la positività della prova.
T. equigenitalis è fosfatasi positivo.
Se il profilo (condizioni di crescita, morfologia macroscopica e
microscopica, test biochimici) è compatibile con T. equigenitalis,
è necessario confermare l'identificazione presuntiva attraverso
identificazione sierologica con anticorpi policlonali specifici.
Il microorganismo isolato sarà inviato per conferma e per
un'ulteriore caratterizzazione al Centro di Referenza delle Malattie
degli Equini.
Interpretazione dei risultati.

L'esito dell'esame colturale deve essere espresso in termini di
presenza/assenza oppure di risultato inconclusivo (per presenza di
flora contaminante a livello tale da impedire il rilevamento di T.
equigenitalis nel campione esaminato). In tal caso, è necessario
effettuare un nuovo prelievo.
Ai fini dell'autorizzazione alla riproduzione, ogni stallone
risultato positivo al controllo ufficiale per CEM deve essere
trattato con chemioantibiotici per via generale e con disinfettanti
locali e deve risultare negativo ad un successivo prelievo da
effettuarsi non prima di 21 giorni dall'ultimo trattamento.