Serie Generale n. 135 del 11-6-1996
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 10 aprile 1996
Approvazione del metodo ufficiale di analisi relativo al "Riconoscimento e dosaggio del siero di latte vaccino nel latte di bufala e nei formaggi prodotti con l'impiego totale o parziale di latte di bufala mediante RP-HPLC delle sieroproteine specifiche". (GU Serie Generale n.135 del 11-06-1996)

L'ISPETTORE GENERALE CAPO
PER LA REPRESSIONE DELLE FRODI DEL MINISTERO
DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESALI
DI CONCERTO CON
IL DIRETTORE GENERALE
DEL DIPARTIMENTO DELLE DOGANE E DELLE
IMPOSTE INDIRETTE DEL MINISTERO DELLE FINANZE
IL DIRETTORE GENERALE
DEL DIPARTIMENTO DEGLI ALIMENTI E NUTRIZIONE E DELLA
SANITÀ PUBBLICA VETERINARIA DEL MINISTERO DELLA SANITÀ
IL DIRETTORE GENERALE
DELLA PRODUZIONE INDUSTRIALE DEL MINISTERO
DELL'INDUSTRIA, DEL COMMERCIO E DELL'ARTIGIANATO
Visto l'art. 2 della legge 4 dicembre 1993, n. 491, che istituisce
il Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali;
Visto il decreto legislativo 3 febbraio 1993, n. 29, concernente
norme per la razionalizzazione dell'organizzazione delle
amministrazioni pubbliche e revisione della disciplina in materia di
pubblico impiego, a norma dell'art. 2 della legge 23 ottobre 1992, n.
421;
Visti l'art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033,
convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la
repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di
sostanze di uso agrario e di prodotti agrari, e l'art. 108 del
regolamento per l'esecuzione dello stesso regio decreto-legge,
approvato con regio decreto 1 luglio 1926, n. 1361, i quali
prescrivono che le analisi occorrenti in applicazione delle norme
contenute nel regio decreto-legge e nel regolamento di esecuzione
suddetti dovranno essere eseguite dai laboratori incaricati con i
metodi di analisi prescritti da questo Ministero, di concerto con il
Ministero delle finanze, il Ministero della sanità ed il Ministero
dell'industria, del commercio e dell'artigianato;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 26 marzo 1980, n.
327: "Regolamento di esecuzione della legge 30 aprile 1962, n. 283",
e successive modificazioni, in materia di disciplina igienica della
produzione e della vendita delle sostanze alimentari e delle bevande;
Visto il decreto ministeriale 21 aprile 1986, pubblicato nel
supplemento ordinario alla Gazzetta Ufficiale della Repubblica
italiana n. 229 del 2 ottobre 1986, con il quale sono stati approvati
i "Metodi ufficiali di analisi per i formaggi", modificato ed
integrato con il decreto ministeriale 1 luglio 1994, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 160 dell'11 luglio
1994;
Vista la decisione del Consiglio del 14 novembre 1992, n.
92/608/CE, che stabilisce i metodi di riferimento da applicare per
l'analisi e la prova del latte trattato termicamente;
Ritenuto necessario disporre di un metodo che, tramite il dosaggio
delle proteine sieriche specifiche, consenta di accertare l'impiego
di latte vaccino nel latte di bufala e nei formaggi derivanti dalla
trasformazione di detto latte di bufala;
Sentito il parere della Commissione per l'aggiornamento dei metodi
ufficiali di analisi per i prodotti agrari e le sostanze di uso
agrario - sottocommissione per i formaggi - di cui al decreto
ministeriale 11 febbraio 1981, e successive modificazioni, alla quale
con decreto ministriale 19 dicembre 1992 è stato attribuito anche
l'aggiornamento dei metodi ufficiali di analisi del prodotto agricolo
latte;
Ritenuto altresì indispensabile porre a disposizione di tutti gli
istituti e laboratori pubblici idonei metodi di analisi per il
controllo del latte e dei formaggi, perchè le analisi da essi
compiute risultino uniformi nei procedimenti e nei risultati;
Vista la legge 14 gennaio 1994, n. 20, contenente disposizioni in
materia di giurisdizione e controllo della Corte dei conti;
Decretano:
Art. 1.
1. È approvato il metodo ufficiale di analisi relativo al
"Riconoscimento e dosaggio del siero di latte vaccino nel latte di
bufala e nei formaggi prodotti con l'impiego totale o parziale di
latte di bufala mediante RP-HPLC delle sieroproteine specifiche",
descritto nell'allegato al presente decreto.
2. Il metodo sopracitato è applicabile al controllo di prodotti
nazionali.
3. Detto metodo integra la raccolta dei metodi ufficiali di analisi
di cui all'allegato al decreto ministeriale 21 aprile 1986, citato
nelle premesse, acquisendo il numero progressivo 29.

Art. 2.
Il presente decreto è inviato alla Corte dei conti per il
controllo preventivo di legittimità ed entrerà in vigore il giorno
successivo a quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 10 aprile 1996
L'ispettore generale capo per la repressione
delle frodi del Ministero delle risorse agricole
alimentari e forestali
DI SALVO
Il direttore generale del Dipartimento delle dogane
e delle imposte indirette del Ministero delle finanze
SAPIENZA
Il direttore generale del Dipartimento degli alimenti
e nutrizione e della sanità pubblica veterinaria
del Ministero della sanità
MARABELLI
Il direttore generale della produzione industriale
del Ministero dell'industria
del commercio e dell'artigianato
AMMASSARI
L'ispettore generale capo per la repressione delle frodi
del Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
(Subentrato nell'incarico dal gennaio 1996)
PILO
Registrato alla Corte dei conti il 17 maggio 1996
Registro n. 1 Risorse agricole, foglio n. 134

ALLEGATO
29) RICONOSCIMENTO E DOSAGGIO DEL SIERO DI LATTE VACCINO NEL LATTE
DI BUFALA E NEI FORMAGGI PRODOTTI CON L'IMPIEGO TOTALE O
PARZIALE DI LATTE DI BUFALA MEDIANTE RP-HPLC DELLE
SIEROPROTEINE SPECIFICHE
1. Scopo e campo di applicazione
Il metodo descritto permette di identificare e dosare il
siero di latte vaccino nel latte bufalino sulla base delle
loro sieroproteine specifiche. Dal contenuto in siero di
latte vaccino è possibile risalire al contenuto in latte
vaccino nel latte di bufala e nei formaggi prodotti con
l'impiego totale o parziale di latte di bufala.
2. Riferimenti
-"Metodi Ufficiali di analisi dei formaggi". Modalità per il
prelievo e la preparazione dei campioni di formaggio,
formaggio fuso e ricotta da sottoporre ad analisi (Norma I),
D.M. 21 aprile 1986.
- Decisione n. 92/608/CE che stabilisce metodi di analisi e
prova relativi al latte trattato termicamente.
3. Principio del metodo
Il metodo proposto si basa sul riconoscimento mediante
separazione per HPLC in fase inversa della
Beta-lattoglobulina A (beta) -LG A), sieroproteina presente
nel latte di vacca, ma assente in quello di bufala e quindi
anche nei formaggi derivanti dalla lavorazione di
quest'ultimo.
4. Reattivi
4.1 Acido cloridrico 2 N.
4.2 Acido Acetico glaciale.
4.3 Acetato di sodio.
4.4 Tampone acido acetico/acetato di sodio 0.2 M, pH 4.6.
4.5 Eluenti per HPLC: acqua, acetonitrile, acido trifluoroacetico,
tutti di purezza per HPLC.
Nota. Tutti i reattivi, se non altrimenti specificato, devono
essere puri per analisi. L'acqua deve essere distillata o di
purezza equivalente.
5. Apparecchiatura
5.1 Sistema HPLC
5.1.1 Cromatografo liquido ad alta prestazione provvisto di forno
per la termostatazione della colonna.
5.1.2 Spettrofotometro per rivelazione a 205 nm a 0.1 AUFS.
5.1.3 Colonna impaccata con polistirene-divinil-benzene non
derivatizzato (es. colonna PLRP-S della Polymer Laboratories
UK, 150 mm x 4.6 mm, 8 (i greca) m, 300 A).
5.1.4 Registratore-integratore in grado di effettuare misurazioni
di aree e altezze.
5.2 pHmetro al centesimo.
5.3 Centrifuga refrigerata capace di raggiungere 12000 g.
5.4 Bilancia analitica.
5.5 Bagnomaria.
5.6 Agitatore magnetico.
5.7 Pipette di precisione.
5.8 Vetreria da laboratorio
5.9 Filtri di carta a filtrazione rapida
5.10 Filtri con membrana da 0.22 (i greca)m.
6. Campionamento
Vedi punto 2.
7. Procedimento
7.1 Preparazione del campione di latte
Portare il latte alla temperatura di 37(gradi)C. 100 ml circa
di latte vengono acidificati sotto agitazione a pH 4.6 con
acido cloridrico (4.1) e lasciati a riposo per 15 min. Segue
una centrifugazione a 2000 g per 15 min a 4(gradi)C.
Raccogliere e filtrare (5.9) il siero acido surnatante. Il
filtrato viene diluito 1: 10 con tampone acetato (4.4),
filtrato su membrana (5.10) ed iniettato nel cromatografo.
7.2 Preparazione del campione di formaggio.
4 g circa di formaggio sminuzzato vengono centrifugati a
12000 g per 15 min a 4(gradi)C. Il surnatante è addizionato,
sotto agitazione, di eguale volume di tampone acido
acetico/acetato di sodio (4.4). Dopo una sosta di 20 min il
liquido viene centrifugato a 2000 g per 15 min a 4(gradi)C.
Il nuovo surnatante viene filtrato su membrana (5.10) ed
iniettato nel cromatografo.
7.3 Preparare con le stesse modalità del punto 7.1 o 7.2 una
prova in bianco sostituendo il latte o la fase acquosa del
formaggio con acqua distillata.
7.4 Preparazione degli standard.
7.4.1 La preparazione dei campioni standard ottenuti da latte di
bufala e di vacca verrà effettuata a cura del Dipartimento
di Scienza degli Alimenti dell'Università degli Studi
"Federico II" di Napoli - Portici. La distribuzione ai
laboratori interessati avverrà a cura dell'Ispettorato
Centrale Repressione Frodi, Ufficio di Portici, Via Moretti
82, 80055 Portici (NA).
7.5 Determinazione cromatografica
7.5.1 Condizioni cromatografiche
Eluente A: acido trifluoroacetico 0.1% in acqua (v/v).
Eluente B: acido trifluoroacetico 0.1% in acetonitrile (v/v).
Gradiente: tempo (min) %A %B
0.0 65 35
1.0 65 35
8.0 62 38
17.0 58 42
25.0 54 46
25.5 0 100
26.0 0 100
26.5 65 35
Flusso: 1.0 ml/min
Temperatura colonna: 40(gradi)C
Tempo di analisi: 40 min
Nota. Il gradiente di eluizione riportato è indicativo potendo
essere modificato in modo tale da ottenere la risoluzione
cromatografica richiesta (fig. 1).
7.5.2 Equilibrazione della colonna.
Prima di ogni serie di analisi equilibrare la colonna a 1.0
ml/min con 100% di eluente B per 5 - 10 min; in seguito
portare il sistema cromatografico alle condizioni iniziali di
analisi (A : B = 65 : 35) fino a stabilità della linea di
base.
7.5.3 Effettuare una analisi cromatografica completa iniettando 20
(i greca)l della prova in bianco (7.3).
7.5.4 Effettuare la separazione cromatografica degli standard
(7.4.1) e dei campioni (7.1 e 7.2) iniettando 20 (i greca)l
di ciascuno di essi. Nelle condizioni analitiche descritte,
le sieroproteine del siero di latte di bufala e del siero di
latte di vacca devono essere cromatograficamente risolte come
mostrato nella fig. 1.
Nota. Nel caso di una prolungata conservazione dei formaggi possono
comparire nel tracciato cromatografico picchi di
neoformazione che vengono eluiti nella zona di
Proteoso-peptoni (PP) e (alfa) -Lattalbumina ((alfa) -La),
mentre non vi è alcuna interferenza nella zona delle
(beta)-Lattoglobuline (beta) -LG).
8. Calcolo ed espressione dei risultati
8.1 Per gli standard contenenti da 1% a 15% di siero di latte
vaccino calcolare l'altezza dei picchi (beta)-LG A e Bx
secondo i criteri indicati nella figura 2.
8.1.1 Costruire una curva di taratura riportando in grafico il
rapporto altezza picco (beta) -LG A

altezza picco Bx
in funzione della percentuale di siero di latte vaccino
presente in miscela con il siero di latte di bufala.
8.2 Per gli standard contenenti da 16% a 100% di siero di latte
vaccino calcolare le aree dei picchi (beta)-LG A e (beta)-LG
B secondo i criteri indicati nella figura 3.
8.2.1 Costruire una curva di taratura riportando in grafico il
rapporto area picco (beta) -LG A

area picco (beta) -LG B
in funzione della percentuale di siero di latte vaccino
presente in miscela con il siero di latte di bufala.
8.3 Calcolare per ogni campione incognito il rapporto
altezza picco (beta) -LG A

altezza picco Bx
od il rapporto
area picco (beta) -LG A

area picco (beta) -LG B
8.4 Ricavare per ogni campione incognito il contenuto in siero di
latte vaccino od in latte vaccino confrontando i rapporti
suddetti con le rispettive curve di calibrazione (8.1.1 e
8.2.1). I risultati quantitativi vengono espressi, nel caso
si analizzi latte, in percentuale volumetrica di siero di
latte vaccino presente nel latte di bufala; nel caso si
analizzi formaggio prodotto con l'impiego totale o parziale
di latte di bufala, in percentuale volumetrica presente nel
latte caseificato.
9. Sensibilità del metodo
Il metodo permette di quantificare siero di latte vaccino nel
latte di bufala, anche dopo caseificazione, a partire da 1%.
10. Precisione
Ripetibilità. La differenza tra i risultati di due
determinazioni effettuate in rapide successione dallo stesso
analista sullo stesso materiale e nelle stesse condizioni non
deve essere superiore al 20% della media dei due risultati.
Riproducibilità. La differenza tra i risultati di due
determinazioni individuali ottenuti da due diversi analisti
in laboratori diversi sullo stesso materiale non deve essere
superiore al 20% della media dei due risultati.
Bibliografia
L. Pellegrino, I. De Noni, A. Tirelli, P. Resmini -
Determinazione del latte di vacca nei formaggi di specie
minori mediante HPLC delle sieroproteine. Nota 1a -
Applicazione alla Mozzarella di Bufala. Sci. Tecn. Latt.-Cas.
42, (2), 87-101 (1991).

----&gt; Vedere DIAGRAMMI da Pag. 20 a Pag. 22 della G.U. &lt;----