Serie Generale n. 160 del 11-7-1994
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 1 luglio 1994
Approvazione del metodo di analisi per il riconoscimento e il dosaggio del latte vaccino nella mozzarella di bufala per elettroforesi della caseina del formaggio. (GU Serie Generale n.160 del 11-07-1994)

L'ISPETTORE GENERALE CAPO
PER LA REPRESSIONE DELLE FRODI
DI CONCERTO CON
I MINISTERI DELLE FINANZE, DELLA SANITÀ E DELL'INDUSTRIA, DEL
COMMERCIO E DELL'ARTIGIANATO
Visto il decreto legislativo 3 febbraio 1993, n. 29, concernente
norme per la razionalizzazione dell'organizzazione delle
amministrazioni pubbliche e revisione della disciplina in materia di
pubblico impiego, a norma dell'art. 2 della legge 23 ottobre 1992, n.
421;
Visti l'art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033,
convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la
repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di
sostanze di uso agrario e di prodotti agrari, e l'art. 108 del
regolamento per l'esecuzione dello stesso regio decreto-legge,
approvato con regio decreto 1 luglio 1926, n. 1361, i quali
prescrivono che le analisi occorrenti in applicazione delle norme
contenute nel regio decreto-legge e nel regolamento di esecuzione
suddetti dovranno essere eseguite dai laboratori incaricati con i
metodi di analisi prescritti da questo Ministero, di concerto con il
Ministero delle finanze, il Ministero della sanità ed il Ministero
dell'industria, del commercio e dell'artigianato;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 26 marzo 1980, n.
327 "Regolamento di esecuzione della legge 30 aprile 1962, n. 283", e
successive modificazioni, in materia di disciplina igienica della
produzione e della vendita delle sostanze alimentari e delle bevande;
Visto il decreto ministeriale 21 aprile 1986, pubblicato nel
supplemento ordinario alla Gazzetta Ufficiale della Repubblica
italiana n. 229 del 2 ottobre 1986, con il quale sono stati approvati
i "Metodi ufficiali di analisi per i formaggi";
Visto il regolamento CEE n. 690/92 della Commissione, del 19 marzo
1992, pubblicato nella Gazzetta Ufficiale delle Comunità europee n.
L 74 del 20 marzo 1992, che definisce un metodo di riferimento per
individuare la caseina di latte vaccino nei formaggi prodotti con
latte di pecora, ed in particolare l'art. 2 che subordina l'impiego
di metodologie correnti alla rispondenza a taluni criteri;
Ritenuto necessario procedere all'integrazione delle metodiche
analitiche di cui al predetto decreto ministeriale 21 aprile 1986 con
l'inserimento del metodo per il riconoscimento e dosaggio del latte
vaccino nella mozzarella di bufala;
Ritenuto inoltre necessario abrogare il metodo n. 26 compreso
nell'allegato al suddetto decreto 21 aprile 1986, relativo al
riconoscimento del latte vaccino nei formaggi di pecora, in quanto
non rispetta il limite di sensibilità previsto all'art. 2 del citato
regolamento CEE n. 690/92 per l'individuazione della caseina di latte
vaccino nei formaggi prodotti con latte di pecora;
Ritenuto altresì indispensabile porre a disposizione di tutti gli
istituti e laboratori pubblici idonei metodi di analisi per il
controllo dei formaggi, perchè le analisi da essi compiute risultino
uniformi nei procedimenti e nei risultati;
Sentito il parere della commissione per l'aggiornamento dei metodi
ufficiali di analisi per i prodotti agrari e le sostanze di uso
agrario - sottocommissione per i formaggi - di cui al decreto
ministeriale 11 febbraio 1981 e successive modificazioni;
Visto l'art. 2 della legge 4 dicembre 1993, n. 491, che istituisce
il Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali;
Decreta:
Art. 1.
1. È approvato il metodo ufficiale di analisi n. 27 relativo al
"Riconoscimento e dosaggio del latte vaccino nella mozzarella di
bufala per elettroforesi della caseina del formaggio" descritto
nell'allegato al presente decreto.

Art. 2.
1. È abrogato il metodo ufficiale di analisi n. 26 relativo al
"Riconoscimento del latte vaccino nei formaggi di pecora" descritto
nella raccolta dei metodi ufficiali di analisi di cui all'allegato al
decreto ministeriale 21 aprile 1986 citato nelle premesse.

Art. 3.
1. Il metodo di cui all'art. 1 entra in vigore il giorno successivo
a quello di pubblicazione del presente decreto nella Gazzetta
Ufficiale della Repubblica italiana.
2. Il metodo sopracitato è applicabile al controllo dei prodotti
nazionali.

Art. 4.
1. Il presente decreto sarà pubblicato nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 1 luglio 1994
Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
L'ispettore generale capo
per la repressione delle frodi
GRIMALDI
Ministero delle finanze
Il direttore generale
del dipartimento delle dogane e imposte indirette
FAVALE
Ministero della sanità
Il direttore generale
per l'igiene degli alimenti e la nutrizione
SILANO
Ministero dell'industria, del commercio e dell'artigianato
Il direttore generale della produzione industriale
AMMASSARI

ALLEGATO
27) RICONOSCIMENTO E DOSAGGIO DEL LATTE VACCINO NELLA "MOZZARELLA DI
BUFALA" PER ELETTROFORESI DELLA CASEINA DEL FORMAGGIO.
1 - Scopo e campo di applicazione.
Il metodo descritto permette di identificare e dosare l'aggiunta
di latte vaccino o di caseina vaccina al latte di bufala nella
preparazione della mozzarella di bufala.
2 - Principio del metodo.
Il metodo si fonda sulla diversa mobilità elettroforetica delle
frazioni caseiniche fB015afB012s1 del latte di vacca e del latte di
bufala. Infatti, analogamente a quanto osservato per i latti,
sottoponendo ad elettroforesi le proteine del formaggio solubilizzate
in opportune condizioni, si ottengono profili diversi a seconda che
il prodotto sia stato ottenuto da latte di bufala o da latte di
vacca. Tali differenze sono ancora evidenziabili anche nel caso di
formaggi provenienti dalla lavorazione di miscele di latte delle due
specie.
La separazione elettroforetica può essere condotta utilizzando
come supporto sia striscia di acetato di cellulosa (I) che gel di
poliacrilammide-agarosio (II).
I. ELETTROFORESI SU ACETATO DI CELLULOSA.
3 - Reattivi I.
3.1. Soluzione tampone sodio-veronal: sciogliere 41.236 g di
sodio-veronal in 2000 ml di acqua distillata. Portare la soluzione a
pH 8,2 con 600 ml di HCl 0,1 N.
3.2. Soluzione tampone agli elettrodi per la migrazione: portare
300 ml della soluzione 3.1. a 1000 ml con acqua distillata.
3.3. Soluzione tampone sodio-veronal-urea 5M per strisce di
acetato di cellulosa: sciogliere 300 g di urea con la soluzione 3.2.
portando a volume di 1000 ml.
3.4. Soluzione tampone sodio-veronal-urea 8,5 M per la
dissoluzione del campione: sciogliere 51 g di urea con la soluzione
3.2. portando a volume di 100 ml.
3.5. Soluzione colorante: sciogliere 0,5 g di Blu di Coomassie 250
R in una miscela di alcole metilico: acqua: acido acetico glaciale
(45:45:10 v/v).
3.6. Soluzione decolorante: miscela di alcool metilico: acqua:
acido acetico (47,5:47,5:5,0 v/v).
3.7. Soluzione diafanizzante: soluzione diacetonilalcool: acqua
(30:70 v/v).
3.8. Strisce di acetato di cellulosa già pronte per l'uso 4 x 17
cm, spessore circa 200 (Micron(m.
Conservare le soluzioni 3.1, 3.2 e 3.3 a 4 C.
4 - Apparecchiatura I.
4.1. Alimentatore per elettroforesi a voltaggio costante capace di
erogare 200 V.
4.2. Camera umida per elettroforesi con relativi accessori.
4.3. Depositore multiplo semimicro o micropipette.
4.4. Vaschette di plastica con coperchio per condizionamento,
colorazione, decolorazione e diafanizzazione delle strisce.
4.5. Centrifuga da laboratorio.
4.6. Densitometro in trasmissione con integratore delle aree dei
plichi.
5 - Campionamento e preparazione.
Vedi norma 1 Metodi ufficiali di analisi dei formaggi del
Ministero dell'agricoltura e delle foreste.
6 - Procedure I.
6.1. Estrazione.
6.1.1. Aggiungere a 1,5 g di formaggio finemente sminuzzato 4 ml
della soluzione 3.4. Agitare con una bacchettina di vetro fino a
completa dispersione del campione.
6.1.2. Travasare la miscela in provetta da centrifuga e
centrifugare a circa 2000 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
6.1.3. Eliminare il grasso in superficie trasferendo una parte
della soluzione in una seconda provetta.
6.2. Preparazione del supporto.
6.2.1. Condizionamento: collocare la striscia di acetato di
cellulosa (3.8) con la parte porosa (opaca) rivolta verso l'alto in
una vaschetta contenente il tampone 3.3. Far assorbire il tampone per
almeno 10 minuti. Non superare di molto il tempo indicato in modo da
evitare la deacetilazione del supporto.
6.2.2. Estrarre la striscia dalla vaschetta ed asciugarla premendo
dolcemente tra due fogli di carta da filtro onde evitare deformazioni
del supporto.
6.2.3. Posizionare la striscia sul ponte elettroforetico con la
parte porosa rivolta verso l'alto e fissarla ben tesa sul ponte.
6.3. Elettroforesi. Corsa elettroforetica.
6.3.1. Depositare sulla striscia fissata come descritto in 6.2.3 e
con depositore (4.3) l'estratto (6.1) in posizione catodica a circa 2
cm dal margine del ponte.
6.3.2. Posizionare il ponte nella camera elettroforetica
contenente la soluzione tampone 3.2 ed applicare per 120 minuti un
voltaggio di 80 V costanti misurati sulla striscia.
6.4. Colorazione.
6.4.1. Al termine della migrazione, estrarre il ponte, togliere la
striscia ed immergerla in una vaschetta contenente la soluzione 3.5
per 15 minuti. Volendo conservare la striscia colorata immergerla in
una vaschetta contenente una soluzione al 5% di acido acetico.
6.4.2. Trasferire la striscia in una prima vaschetta contenente la
soluzione 3.6. Dopo 20 minuti effettuare altri 2-3 lavaggi di pochi
minuti fino a completa decolorazione.
6.4.3. Immergere la striscia decolorata per 5 minuti in una
vaschetta contenente la soluzione 3.7. Togliere la striscia
riponendola, con la parte porosa verso l'alto, su di una lastra di
vetro. Asciugare la striscia con aria calda (50-60 C) fino a
completa diafanizzazione della stessa.
II. ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMMIDE-AGAROSIO.
3 - Reattivi II.
3.1. Tampone di equilibrazione del gel: a 9 g di Tris, 4,65 g di
glicina e 270 g di urea aggiungere 600 ml di acqua distillata. Dopo
dissoluzione aggiustare il pH ad 8,6 con acido cloridrico 2N e
portare al volume di un litro con acqua distillata.
3.2. Tampone agli elettrodi per la migrazione: a 2,4 g di Tris,
50,0, g di glicina aggiungere 1600 ml di acqua distillata. Dopo
completa dissoluzione, aggiustare il pH ad 8,6 con NaOH 2N e portare
al volume di 2 litri con acqua distillata.
3.3. Soluzione di agarosio per il campione: pesare 4 g di Agarosio
C in una beuta di 200 ml ed aggiungere 100 ml di acqua distillata. La
soluzione viene realizzata per immersione della beuta in acqua
bollente per circa 10 minuti.
3.4. Soluzione di agarosio per la preparazione di tre piastre:
pesare 1,2 g di agarosio in una beuta di 200 ml ed aggiungere 75 ml
di acqua distillata. Porre in bagno maria bollente per circa 30
minuti fino a scomparsa dei grumi. Di seguito porre in bagno maria a
55 C e lasciare equilibrare per circa 15 minuti.
3.5. Soluzione di acrilammide e di bis-acrilammide per la
preparazione del gel: in una beuta da 200 ml pesare 7,5 g di
acrilammide e 0,240 g di bis-acrilammide ed aggiungere 75 ml di acqua
distillata. Porre ad equilibrare in bagno maria a 55 C.
3.6. Soluzione colorante: ad una soluzione acquosa allo 0,2% (p/v)
di Coomassie G 250 aggiungere un egual volume di acido solforico 2N.
Dopo agitazione la soluzione viene lasciata a riposo per almeno tre
ore. L'eventuale precipitato viene eliminato per filtrazione su carta
Whatman n. 1 e viene misurato il volume del filtrato. A nove volumi
di filtrato limpido viene aggiunto un volume di KOH 10 N. Si mescola
bene su agitatore magnetico aggiungendo successivamente acido
tricloroacetico solido in ragione del 12% (p/v). La soluzione può
essere utilizzata più volte purchè il pH si mantenga al di sotto di
1.
3.7. Tracciante per la migrazione elettroforetica: soluzione
acquosa allo 0,5% di Blu di Bromofenolo.
4 - Apparecchiatura II.
4.1. Alimentatore per elettroforesi come al 4.1 del metodo I.
4.2. Apparecchio per elettroforesi orizzontale provvisto di un
bagno di acqua a circolazione forzata raffreddabile a circa 10 C.
4.3. Bagno maria a temperatura regolabile.
4.4. Omogeneizzatore ad asta ruotante.
4.5. Densitometro come in 4.6 del metodo I.
5 - Campionamento e preparazione.
Vedi norma 1 Metodi ufficiali di analisi dei formaggi del
Ministero dell'agricoltura e delle foreste.
6 - Procedure II.
6.1. Estrazione.
6.1.1. Aggiungere a circa 8 grammi di formaggio finemente
sminuzzato, posti in bicchiere di plastica di 100 ml, 25 ml di urea 9
M ed omogeneizzare il campione con l'apparecchio di cui al punto 4.4.
6.1.2. Travasare circa 5 ml della miscela in provetta di
centrifuga ed operare come ai punti 6.1.2 e 6.1.3 del metodo I.
6.2. Preparazione del supporto.
6.2.1. Esso viene preparato con l'aiuto di uno stampo di vetro
così ottenuto. Ad una lastra di vetro delle dimensioni di 225 x 360
mm viene sovrapposta una seconda lastra di dimensioni 125 x 225. Tra
le due piastre in corrispondenza degli angoli della lastra di vetro
superiore, vengono posti quattro rettangolini di vetro dello spessore
di 1 mm. Fissare le due lastre con carta adesiva posta agli angoli
della lastra superiore.
6.2.2. Porre la soluzione di cui al punto 3.4 in bagno maria a 55
C e lasciar equilibrare per almeno 15 minuti.
6.2.3. Aggiungere alla soluzione di cui al punto 3.5, 90 (Micron(l
di TEMED e 30 mg di ammonio persolfato. Agitare fino a dissoluzione
completa del persolfato.
6.2.4. Versare la soluzione 6.2.3 nella soluzione 6.2.2 facendo
scorrere il liquido lungo le pareti per evitare la formazione di
bolle. Travasare da un recipiente all'altro ancora due volte operando
sempre all'interno della stufa regolata a 55 C.
6.2.5. Versare la soluzione risultante sulla lastra inferiore dei
tre stampi tenuti in posizione orizzonatale in stufa a 55 C in modo
tale da riempire per capillarità lo spazio tra le due lastre di
vetro.
6.2.6. Lasciare polimerizzare a 55 C per 35 minuti e quindi porre
le piastre in frigorifero a 4 C per almeno un'ora.
6.2.7. Togliere il gel dallo stampo con l'ausilio di una spatola
metallica e versarlo in circa due litri di acqua distillata posta in
un recipiente rettangolare di opportuna capacità e lasciare tutto in
frigo per una notte.
6.2.8. Dopo 12 ore il gel è pronto per essere posto nel tampone
di equilibrazione 3.1. Esso può essere utilizzato dopo permanenza in
questo tampone per almeno 12 ore. Il gel può essere così conservato
anche per alcuni mesi in frigorifero senza alcuna perdita di
capacità di risoluzione.
6.3. Elettroforesi. Corsa elettroforetica.
6.3.1. Posizionare il gel sulla piastra elettroforetica e con una
lama da rasoio eliminare le parti eccedenti la superficie dello
stampo.
6.3.2. Praticare lungo il lato maggiore del gel, a circa 2 cm dal
margine prospiciente il catodo, una serie di pozzetti rettangolari di
circa 2 x 10 mm distanziati tra loro di circa 5 mm, servendosi ad
esempio di un foratappi metallico, schiacciato ai poli.
6.3.3. Il gel reciso viene allontanato a mezzo di una pinzetta a
punte ricurve.
6.3.4. Trasferire 100 (Micron(l della soluzione 3.3 in un tubo di
vetro di circa 5 ml e porre ad equilibrare in bagno maria a circa 55
C per almeno 5 minuti.
6.3.5. Aggiungere a questa soluzione un identico volume di
soluzione proteica 6.1.2 e 2 (Micron(l di 2-mercaptoetanolo; agitare
per qualche secondo.
6.3.6. Prelevare circa 20 (Micron(l della soluzione 6.3.5 e
versarla nel pozzetto sul gel.
6.3.7. Dopo che tutti i pozzetti sono stati riempiti con i
campioni, iniettare a livello della linea di applicazione dei
campioni 2 (Micron(l della soluzione 3.7, per seguire visivamente il
fronte di migrazione della corsa elettroforetica.
6.3.8. Versare nelle vaschette del catodo e dell'anodo la
soluzione tampone 3.2.
6.3.9. Posizionare sull'estremità del gel, in corrispondenza del
catodo e dell'anodo, due strisce di carta Whatman 3MM imbevute della
soluzione tampone 3.2. come ponti tra gli elettrodi e la piastra
elettroforetica.
6.3.10. Coprire il gel con una striscia di polietilene per evitare
evaporazione di acqua durante la corsa elettroforetica.
6.3.11. Applicare per i primi 15 minuti un voltaggio di 100V alla
temperatura della piastra di circa 10 C, portare quindi il voltaggio
a 200V e mantenerlo costante per 2h e 15 minuti.
6.4. Colorazione.
6.4.1. Al termine della migrazione, porre il gel in una vaschetta
contenente la soluzione 3.6 e lasciare a contatto per circa 3 ore.
Dopo tale termine recuperare il colorante ed aggiungere nella
vaschetta acqua di rubinetto. La permanenza in acqua per 2-3 ore
intensifica la colorazione delle bande elettroforetiche. L'analisi
densitometrica può essere eseguita sia sulla piastra così ottenuta
sia dopo essiccazione della stessa.
6.4.2. Per l'essiccazione di una piastra si rimuovono dal gel le
sostanze solide solubili presenti nel gel mediante ripetuti lavaggi
in acqua nella stessa vaschetta usata per la colorazione. La piastra
viene quindi posta tra due fogli umidi di cellophane distesi e poi
ripiegati su uno stampo in vetro di adatte dimensioni.
7 - Interpretazione dei risultati.
7.1. Interpretazione qualitativa.
7.1.1. Il confronto tra il tracciato elettroforetico delle
proteine totali della Mozzarella di bufala e quello della Mozzarella
prodotta con solo latte bovino nonchè con miscele dei latti delle
due specie mostra che nel primo sono sempre assenti frazioni
proteiche corrispondenti alle caseine aS1 bovine. Conseguentemente la
presenza nel profilo elettroforetico di bande con velocità
elettroforetica pari alla caseina aS1 bovina è indice certo di un
prodotto ottenuto dalla miscela di latte delle due specie.
7.2. Interpretazione quantitativa.
7.2.1. La interpretazione quantitativa dei risultati può essere
effettuata sia per scansione densitometrica che per confronto visivo
dei tracciati elettroforetici dei campioni analizzati con quelli di
riferimento ottenuti da miscele di caseinato standard di latte di
bufala e di latte di vacca ottenuti come al punto 10. Nella
miscelazione quantitativa dei caseinati è necessario tener conto del
maggiore contenuto in caseina del latte di bufala rispetto a quello
di vacca essendo il rapporto bufala: vacca = 1,25. Esempio: per la
preparazione di una miscela al 50%, pesare esattamente 50 mg di
caseinato di bufala e 50/1,25 mg di caseinato bovino.
7.2.2. Nel caso di determinazione quantitativa mediante scansione
densitometrica si fa riferimento ad una serie di miscele preparate
con percentuali diverse di caseina bovina e bufalina che riproducono
miscele a titolo diverso di latte bovino e bufalino. La scansione
densitometrica viene effettuata in trasmittanza ad una lunghezza
d'onda di 630 nm avendo cura di effettuare la scansione di tutte le
bande con migrazione anodica esclusa la zona di deposizione. La curva
di taratura, si ottiene riportando in grafico la percentuale di
caseina aS1 bovina (% di area densitometrica sull'area totale del
tracciato) in funzione della percentuale di latte bovino in miscela
con latte di bufala. Può essere utilizzato inoltre il rapporto fra
le aree dei picchi aS1 bovino e aS1 di bufala.
7.2.3. Per la determinazione quantitativa mediante confronto
visivo vengono analizzati sul medesimo supporto miscele di
riferimento insieme ai campioni sotto indagine.
8 - Sensibilità del metodo.
8.1. Il metodo permette di identificare con entrambi i supporti
elettroforetici l'aggiunta di latte bovino al latte di bufala con una
minima quantità rilevabile del 5% e con una precisione di (Più o
Meno) 5 unità percentuali.
9 - Espressione dei risultati.
9.1. I risultati quantitativi vengono espressi in percentuale in
volume di latte bovino presente nel latte caseificato.
10 - Caseinati standard.
10.1. La preparazione dei caseinati standard ottenuti da latte di
bufala e di vacca, secondo Hammarstein verrà effettuata a cura
dell'Istituto di industrie agrarie della facoltà di agraria
dell'Università di Napoli - Portici. La distribuzione ai laboratori
interessati avverrà a cura dell'Ispettorato centrale repressione
frodi - Ufficio di Portici - Via Moretti - 80055 Portici.
Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
L'ispettore generale capo per la repressione delle frodi
GRIMALDI