Serie Generale n. 167 del 19-7-1995
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
MINISTERO DELLE RISORSE AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DECRETO 22 maggio 1995
Approvazione dei "Metodi di analisi per il controllo ufficiale degli alimenti per animali" - Supplemento n. 12. (GU Serie Generale n.167 del 19-07-1995)

IL MINISTRO DELLE RISORSE
AGRICOLE, ALIMENTARI E FORESTALI
DI CONCERTO CON
I MINISTRI DELLE FINANZE, DELLA SANITÀ E DELL'INDUSTRIA, DEL
COMMERCIO E DELL'ARTIGIANATO
Visto l'art. 2 della legge 4 dicembre 1993, n. 491, che istituisce
il Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali;
Visto il decreto legislativo 3 febbraio 1993, n. 29, concernente
norme per la razionalizzazione dell'organizzazione delle
amministrazioni pubbliche e revisione della disciplina in materia di
pubblico impiego, a norma dell'art. 2 della legge 23 ottobre 1992, n.
421;
Visti l'art. 43 del regio decreto-legge 15 ottobre 1925, n. 2033,
convertito nella legge 18 marzo 1926, n. 562, riguardante la
repressione delle frodi nella preparazione e nel commercio di
sostanze di uso agrario e di prodotti agrari, e l'art. 108 del
regolamento per l'esecuzione dello stesso regio decreto-legge,
approvato con regio decreto 1 luglio 1926, n. 1361, i quali
prescrivono che le analisi occorrenti in applicazione delle norme
contenute nel regio decreto-legge e nel regolamento di esecuzione
suddetti dovranno essere eseguite dai lavoratori incaricati con i
metodi di analisi prescritti da questo Ministero, di concerto con il
Ministero delle finanze, il Ministero della sanità ed il Ministero
dell'industria, del commercio e dell'artigianato;
Vista la direttiva 93/117/CE della Commissione del 17 dicembre
1993, pubblicata nella Gazzetta Ufficiale delle Comunità europee n.
L 329 del 30 dicembre 1993, che stabilisce i metodi di analisi
comunitari per la determinazione del contenuto in robenidina e
metil-benzoquato negli alimenti per animali;
Vista la direttiva 94/14/CE della Commissione del 29 marzo 1994,
pubblicata nella Gazzetta Ufficiale delle Comunità europee n. L 94
del 13 aprile 1994, che modifica la direttiva 76/372/CE relativa ai
metodi di analisi comunitari da applicare per il dosaggio
dell'aflatossina BfB0121 negli alimenti per animali;
Visto il decreto ministeriale 9 novembre 1971, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 308 del 6 dicembre
1971, con il quale sono stati approvati i "Metodi ufficiali di
analisi degli alimenti per uso zootecnico", modificato ed integrato
da ultimo con decreto ministeriale 13 aprile 1994 - supplemento n.
11;
Visto il decreto ministeriale 11 aprile 1994, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 92 del 21 aprile
1994, ed in particolare il metodo di analisi descritto nel relativo
allegato - Supplemento n. 9, concernente il dosaggio per
cromatografia liquida ad alta risoluzione dell'aflatossina BfB0121 ;
Ritenuto necessario adottare le opportune disposizioni per
conformare le norme nazionali a quelle delle predette direttive
comunitarie;
Sentito il parere della Commissione per l'aggiornamento periodico
dei metodi ufficiali di analisi per i prodotti agrari e le sostanze
di uso agrario - sottocommissione per i mangimi - di cui al decreto
ministeriale 11 febbraio 1981 e successive modificazioni;
Vista la legge 14 gennaio 1994, n. 20, concernente disposizioni in
materia di giurisdizione e controllo della Corte dei conti;
Decreta:
Art. 1.
1. Sono approvati i "Metodi di analisi per il controllo ufficiale
degli alimenti per animali" descritti nel supplemento n. 12, allegato
al presente decreto.
2. Il metodo "Determinazione dell'aflatossina BfB0121 - metodo B
per cromatografia liquida ad alta risoluzione", descritto nel
supplemento n. 9 di cui al decreto ministeriale 11 aprile 1994 citato
nelle premesse, è integrato, relativamente alle modalità di
preparazione del campione, conformemente a quanto descritto
nell'allegato al presente decreto.

Art. 2.
Il presente decreto è inviato alla Corte dei conti per il
controllo preventivo di legittimità ed entrerà in vigore il giorno
successivo a quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 22 maggio 1995
L'ispettore generale capo
per la repressione delle frodi
del Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
DI SALVO
Il direttore generale del Dipartimento delle dogane
e imposte indirette del Ministero delle finanze
SAPIENZA
Il direttore generale dei servizi veterinari
del Ministero della sanità
MARABELLI
Il direttore generale della produzione industriale
del Ministero dell'industria, del commercio
e dell'artigianato
AMMASSARI
Registrato alla Corte dei conti il 26 giugno 1995
Registro n. 2 Risorse agricole, foglio n. 145

ALLEGATO
METODI DI ANALISI PER IL CONTROLLO UFFICIALE
DEGLI ALIMENTI PER ANIMALI
Supplemento n. 12
- Determinazione della robenidina
- Determinazione del metil-benzoquato
- Determinazione dell'aflatossina BfB0121 - integrazione al metodo
B per cromatografia liquida ad alta risoluzione
DETERMINAZIONE DELLA ROBENIDINA
1,3-bis ((4-clorobenziliden ammino) guanidina cloridrato
1. Scopo e campo d'applicazione
Il metodo serve a determinare la robenidina nei mangimi. Il
limite inferiore di determinazione è 5 mg/kg.
2. Principio
Il campione viene estratto con metanolo acidificato.
Un'aliquota dell'estratto viene sottoposta a purificazione su
una colonna di allumina. La robenidina, eluita dalla colonna
con metanolo, concentrata a piccolo volume, viene ripresa con
la soluzione della fase mobile fino ad un preciso volume. Il
tenore di robenidina viene determinato mediante cromatografia
liquida ad alta risoluzione (HPLC) su fase inversa,
utilizzando un rivelatore UV.
3. Reattivi
3.1. Metanolo
3.2. Metanolo acidificato
Trasferire 4,0 ml di acido cloridrico (d30 = 1,18) in un
pallone tarato da 500 ml, portare a volume con metanolo (3.1)
e agitare. Questa soluzione deve essere preparata al momento
dell'uso.
3.3. Acetonitrile, per HPLC
3.4. Setacci molecolari
Tipo 3A, sferette 8-12 mesh (1,6-2,5 mm, alluminosilicato
cristallino, diametro dei pori 0,3 nm).
3.5. Allumina acida, attività I per cromatografia su colonna
Trasferire 100 g di allumina acida in adatto contenitore e
aggiungere 2,0 ml di acqua. Tappare e agitare per circa 20
minuti. Conservare in un contenitore ben chiuso.
3.6. Soluzione di fosfato di potassio monobasico, 0,025 M:
sciogliere 3,40 g di fosfato di potassio monobasico anidro in
acqua per HPLC in un pallone tarato da 1 000 ml, portare a
volume e agitare.
3.7. Soluzione di fosfato di sodio bibasico, 0,025 M:
sciogliere 3,55 g di fosfato di sodio bibasico anidro (o 4,45
g di diidrato, o 8,95 di dodecaidrato) in acqua per HPLC in un
pallone tarato da 1 000 ml, portare a volume e agitare.
3.8. Fase mobile per HPLC
Miscelare i seguenti reagenti:
650 ml di acetonitrile (3,3),
250 ml di acqua per HPLC,
50 ml di soluzione di fosfato di potassio monobasico (3,6),
50 ml di soluzione di fosfato di sodio bibasico (3,7).
Filtrare attraverso un filtro da 0,22 (mgreco)m (4.6) e
degassare la soluzione (per esempio, mediante trattamento in
bagno ultrasuoni).
3.9. Standard analitico:
Robenidina pura, 1,3-bis ((4-clorobenziliden) ammino)
guanidina cloridrato.
3.9.1. Robenidina, soluzione standard madre: 300 (mgreco)g/ml.
Pesare 30 (più o meno) 0,1 mg di robenidina standard (3.9).
Sciogliere con metanolo acidificato (3.2) in un pallone tarato
da 100 ml, portare a volume con lo stesso solvente e agitare.
Avvolgere il pallone in un foglio di alluminio e conservarlo
al buio.
3.9.2. Robenidina, soluzione standard intermedia: 12 (mgreco)g/ml.
Trasferire 10,0 ml della soluzione standard madre (3.9.1) in
un pallone tarato da 250 ml, portare a volume con la fase
mobile (3,8) e agitare. Avvolgere il pallone in foglio di
alluminio e conservarlo al buio.
3.9.3. Soluzioni standard di calibrazione
In unsa serie di palloni graduati da 50 ml trasferire 5.0,
10.0, 15.0, 20.0, e 25,0 ml di soluzione standard intermedia
(3.9.2). Portare a volume con la fase mobile (3.8) e agitare.
Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 1.2, 2.4,
3.6, 4.8 e 6.0 (mgreco)g/ml di robenidina. Queste soluzioni
devono essere preparare al momento dell'uso.
4. Apparecchiatura
4.1. Colonna di vetro:
in vetro ambra, dotata di rubinetto e serbatoio da circa 150
ml, diametro interno 10-15 mm, lunghezza 250 mm;
4.2. Agitatore con piattaforma rotante;
4.3. Evaporatore rotante;
4.4. Apparecchiatura per HPLC con rivelatore UV a lunghezza d'onda
variabile oppure con rilevatore a diodi in serie, lunghezza
d'onda 250-400 (mgreco)m;
4.4.1. Colonna per cromatografia liquida, 300 mm x 4, mm C18, con
fase stazionaria 0,10 (mgreco)m, o colonna equivalente;
4.5. Carta da filtro in fibra di vetro (Whatman GF/A o
equivalente);
4.6. Filtri a membrana 0,22 (mgreco)m;
4.7. Filtri a membrana 0,45 (mgreco)m;
5. Procedimento
Nota: La robenidina è sensibile alla luce. Usare vetreria
ambrata in tutte le operazioni, oppure coprire la vetreria con
fogli di alluminio.
5.1. Fattore di recupero
5.1.1. Analizzare un campione di mangime in bianco, per accertare
l'assenza di robenidina o di altre sostanze che possono
interferire.
5.1.2. Procedere a una prova di recupero, analizzando un campione del
mangime in bianco addizionato di una quantità di robenidina
simile a quella presente nel campione. Per raggiungere il
livello di 60 mg/kg, trasferire 3,0 ml della soluzione
standard madre (3.9.1) in una beuta da 250 ml. Evaporare la
soluzione fino a circa 0,5 ml in corrente d'azoto. Aggiungere
1.5 g del mangime in bianco, mescolare per 10 minuti prima di
procedere all'estrazione (5.2).
Nota: Il mangime in bianco deve avere una composizione simile
a quella del campione.
5.2. Estrazione
Introdurre in una beuta da 250 ml (più o meno) 0,1 g del
campione, aggiungere 100,0 ml di metanolo acidificato (3.2),
tappare e agitare per un'ora sull'agitatore (4.2). Filtrare la
soluzione attraverso un filtro in fibra di vetro (4.5) e
raccogliere tutto il filtrato in una beuta da 150 ml.
Aggiungere e raccogliere tutto il filtrato in una beuta da 150
ml. Aggiungere 7.5 g di setacci molecolari (3.4), tappare e
agitare per cinque minuti. Filtrare immediatamente attraverso
un filtro in fibra di vetro. Conservare questa soluzione per
la fase di purificazione (5.3).
5.3. Purificazione
5.3.1. Preparazione della colonna di allumina:
introdurre un piccolo batuffolo di lana di vetro
all'estremità inferiore della colonna (4.1) e comprimerlo con
un'asta di vetro. Prelevare 11,0 g di allumina (3,5) e
trasferirli nella colonna. In questa operazione fare
attenzione a minimizzare l'esposizione all'atmosfera. Battere
delicatamente la colonna caricata alla sua estremità
inferiore per compattare l'allumina.
5.3.2. Purificazione del campione:
trasferire sulla colonna, mediante pipetta, 5,0 ml
dell'estratto del campione preparato in 5.2. Posizionare la
punta della pipetta in prossimità della parere della colonna
e far assorbire la soluzione sull'allumina. Eluire la
robenidina con 100 ml di metanolo (3.1) alla velocità di 2-3
ml/min raccogliendo l'eluato in un pallone da 250 ml.
Evaporare a secchezza a pressione ridotta e a 40 gradi
centigradi mediante l'evaporatore rotante (4.3).
Ridisciogliere il residuo in 3-4 ml di fase mobile (3.8) e
trasferirlo quantitativamente in un pallone graduato da 10 ml.
Lavare il pallone con più porzioni da 1-2 ml di fase mobile e
trasferire i lavaggi nel pallone graduato. Portare a volume
con lo stesso solvente e agitare. Un'aliquota viene filtrata
attraverso un filtro da 0,45 (mgreco)m (4.7). Riservare questa
soluzione per la determinazione in HPLC (5.4).
5.4. Determinazione mediante HPLC
5.4.1. Condizioni di lavoro:
i parametri qui riportati sono di riferimento. Possono essere
tuttavia utilizzate altre condizioni cromatografiche in grado
di dare risultati equivalenti.
Colonna: (4.4.1)
Fase mobile: (3.8)
Flusso: 1,5 - 2 ml/min
Lunghezza d'onda di rivelazione: 317 nm
Volume iniettato: 20-50 (mgreco)l
Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando
parecchie volte la soluzione di calibrazione (3.9.3)
contenente 3,6 (mgreco)g/ml fino a ottenimento di altezze dei
picchi e tempi di ritenzione costanti.
5.4.2. Curva di calibrazione:
iniettare ciascuna soluzione di calibrazione (3.9.3) parecchie
volte e misurare le altezze (aree) dei picchi per ciascuna
concentrazione. Tracciare una curva di calibrazione riportando
le altezze medie dei picchi o le aree medie delle soluzioni di
calibrazione sulle ordinate e le corrispondenti concentrazioni
in (mgreco)m/ml sulle ascisse.
5.4.3. Soluzione del campione in esame:
iniettare parecchie volte l'estratto del campione (5.3.2)
usando lo stesso volume delle soluzioni di calibrazione e
determinare l'altezza (area) media dei picchi di robenidina.
6. Calcolo dei risultati
Dall'altezza (area) media dei picchi di robenidina della
soluzione campione calcolare la concentrazione della soluzione
campione in (mgreco)g/ml per confronto con la curva di
calibrazione (5.4.2.).
Il contenuto di robenidina, p (mg/kg) del campione è dato
dalla formula seguente:
c x 200
w = ------------
m
dove:
c = concentrazione di robenidina della soluzione campione in
(mgreco)g/ml.
m = massa della porzione di sostanza analizzata, in grammi.
7. Convalida dei risultati
7.1. Identità
L'identità dell'analita può essere confermata mediante
co-cromatografia oppure usando un rivelatore di diodi in serie
in cui vengono confrontati gli spettri dell'estratto di
campione e della soluzione di calibrazione (3.9.3) contenente
6 (mgreco)g/ml.
7.1.1. Co-cromatografia
Un estratto di campione viene rinforzato mediante aggiunta di
soluzione standard intermedia (3.7.2). Il quantitativo di
metil-benzoquato aggiunto deve essere analogo a quello stimato
di metil-benzoquato trovato nell'estratto del campione. Solo
l'altezza del picco del metil-benzoquato dovrebbe risultare
aumentata dopo aver tenuto conto sia della qualità di
metil-benzoquato aggiunta che della diluizione dell'estratto.
La larghezza del picco, a metà della sua altezza massima, non
deve discostarsi più del (più o meno) 10% dalla larghezza
originale.
7.1.2. Rivelazione a serie di diodi
I risultati sono valutati con i seguenti criteri:
a) le lunghezze d'onda del massimo di assorbimento degli
spettri relativi al campione ed allo standard, registrate
all'apice del picco, devono essere le stesse entro una
tolleranza determinata dal potere di risoluzione del
sistema di rivelazione. Per la rivelazione a serie di
diodi, questa è tipicamente (più o meno) 2 mm;
b) tra 220 e 350 nm, gli spettri relativi al campione ed allo
standard, registrati all'apice del picco cromatografico,
non devono essere differenti per le parti dello spettro
comprese tra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa.
Questo criterio viene rispettato quando sono presenti gli
stessi massimi e quando in nessun punto osservato la
deviazione tra i due spettri supera il 15% dell'assorbanza
dell'analita standard;
c) tra 220 e 350 nm, gli spettri relativi all'estratto del
campione, registrati nel tratto ascendente, all'apice e nel
tratto discendente del picco cromatografico, non devono
essere differenti per quelle parti dello spettro comprese
tra il 10 ed il 100% dell'assorbanza relativa. Questo
criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi
massimi e quando in nessun punto osservato la deviazione
tra gli spettri supera il 15% dell'assorbanza dello spettro
dell'apice.
Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza
dell'analita non è confermata.
7.2. Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele
effettuate sullo stesso campione non deve superare: 10%
relativo al valore più elevato dei due risultati per
contenuti di metil-benzoquato compresi tra 4 e 20 mg/kg.
7.3 Recupero
Per il campione in bianco rinformato, il recupero deve essere
pari ad almeno il 90%.
8. Risultato di uno studio in collaborazione
Cinque campioni sono stati analizzati da 10 laboratori. Su
ciascun campione sono state eseguite analisi in doppio.
Risultati
_____________________________________________________________________
| | | | |
| Bianco | Farina 1 | Pellet 1 | Farina 2 | Pellet 2
_______________|________|__________|__________|__________|___________
| | | | |
media | n.d. | 4,50 | 4,50 | 8,90 | 8,70
| | | | |
Sr (mg/kg) | __ | 0,30 | 0,20 | 0,60 | 0,50
| | | | |
CVr (%) | __ | 6,70 | 4,40 | 6,70 | 5,70
| | | | |
SR (mg/kg) | __ | 0,40 | 0,50 | 0,90 | 1,00
| | | | |
CVR (%) | __ | 8,90 | 11,10 | 10,10 | 11,50
| | | | |
Rec. (%) | __ | 92,00 | 93,00 | 92,00 | 89,00
| | | | |
_______________|________|__________|__________|__________|___________
Sr = deviazione standard della ripetibilità,
CVr = coefficiente di variazione della ripetibilità,
SR = deviazione standard della riproducibilità,
CVR = coefficiente di variazione delle riproducibilità.
_____________________________________________________________________
DETERMINAZIONE DEL METIL-BENZOQUATO
7-benzilossi-6-butil-3-metossicarbonil-4-chinolone
1. Scopo e campo d'applicazione
il metodo serve a determinare il metil-benzoquato nei mangimi.
Il limite inferiore di determinazione è 1 mg/kg.
2. Principio
Il metil-benzoquato viene estratto dal campione con una
soluzione metanolica di acido metansulfonico. L'estratto viene
purificato con diclorometano, mediante cromatografia a scambio
ionico e poi nuovamente con diclorometano. Il tenore di
metil-benzoquato viene determinato mediante cromatografia
liquida ad alta risoluzione (HPLC) su fase inversa,
utilizzando un rivelatore UV.
3. Reattivi
3.1. Diclorometano
3.2. Metanolo per HPLC
3.3. Fase mobile per HPLC
miscela di metanolo (3.2) e acqua per HPLC 75 + 25 (V + V).
Filtrare attraverso un filtro da 0,22 (mgreco)m (4.5) e
degassare la soluzione (per esempio mediante trattamento con
ultrasuoni per 10 minuti).
3.4. Soluzione di acido metansulfonico; (s greco)= 2%
Diluire 20,0 ml di acido metansulfonico a 1 000 ml con
metanolo (3.2).
3.5. Soluzione di acido cloridrico, (S greco) = 10 %
Diluire 100 ml di acido cloridrico (d 20 ca. 1,18 g/ml) a 1
000 ml con acqua.
3.6. Resina scambiatrice di cationi Amberlite CG-120 (Na), 100-200
mesh
La resina viene pretrattata prima dell'uso: sospendere 100 g
di resina con 500 ml di soluzione di acido cloridrico (3.5) e
portare ad ebollizione su piastra calda continuando ad
agitare. Lasciare raffreddare e decantare l'acido. Filtrare
attraverso carta da filtro sotto vuoto. Lavare due volte la
resina con porzioni da 500 ml di acqua e poi con 250 ml di
metanolo (3.2). Risciacquare la resina con un'ulteriore
porzione da 250 ml di metanolo ed essiccarla facendo passare
aria attraverso il panello del filtro. Conservare la resina
essiccata in una bottiglia tappata.
3.7. Sostanza standard: mesil-benzoquato (7-benzilossi-6-butil-3-
metossicarbonil-4-chinolone).
3.7.1. Metil-benzoquato, soluzione madre standard, 500 (mgreco)g/ml
Pesare, con l'approssimazione di 0,1 mg, 50 mg di sostanza
standard (3.7), scioglierli nella soluzione di acido
metansulfonico (3.4) in un pallone graduato da 100 ml, portare
a volume e miscelare.
3.7.2. Metil-benzoquato, soluzione standard intermedia, 50
(mgreco)g/ml
Trasferire 5,0 ml della soluzione madre standard (3.7.1) in un
pallone graduato da 50 ml, portare a volume con metanolo (3.2)
e miscelare.
3.7.3. Soluzioni di taratura
In una serie di palloni graduati da 25 ml, trasferire 1,0 -
2,0 - 3,0 - 4,0 - 5,0 ml di metil-benzoquato soluzione
standard intermedia (3.7.2). Portare a volume con la fase
mobile (3.3) e miscelare. Queste soluzioni hanno
concentrazioni di 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 - 10,0 (mgreco)g/ml di
metil-benzoquato rispettivamente. Queste soluzioni devono
essere preparate al momento dell'uso.
4. Apparecchiature
4.1. Agitatore da laboratorio
4.2. Evaporatore rotante a film
4.3. Colonna di vetro (250 mm x 15 mm) dotata di rubinetto e
serbatoio della capacità di circa 200 ml
4.4. Apparecchiatura per HPLC con rivelatore UV a lunghezza d'onda
variabile oppure con rivelatore a serie di diodi
4.4.1. Colonna per cromatografia liquida: 300 mm x 4 mm C18, con
riempimento da 10 (mgreco)m, o colonna equivalente
4.5. Filtri a membrana 0,22 (mgreco)m
4.6. Filtri a membrana 0,45 (mgreco)m;
5. Procedimento
5.1. Generalità
5.1.1. Analizzare un campione di mangime in bianco, per accertare
l'assenza del metil-benzoquato o di altre sostanze che possono
interferire.
5.1.2. Procedere a una prova di recupero, analizzando un campione
bianco del mangime addizionato con una quantità di
metil-benzoquato simile a quella presente nel campione. Per
aumentare il livello a 15 mg/kg, aggiungere 600 (mgreco)l
della soluzione madre standard (3.7.1) a 20 g del bianco del
mangime, mescolare per 10 minuti prima, di procedere
all'estrazione (5.2).
Nota: ai fini del presente metodo, il bianco del mangime deve
avere una composizione simile a quella del campione, ed
all'analisi il metil-benzoquato non deve risultare presente.
5.2. Estrazione
Pesare circa 20 g del campione preparato con
un'approssimazione di 0,01 g e trasferirli in una beuta da 250
ml. Aggiungere 100,0 ml di soluzione di acido metansulfonico
(3.4) e agitare in agitatore, meccanico (4.1) per 30 minuti.
Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro e conservare
il filtrato per la fase di riparazione liquido-liquido (5.3).
5.3. Riparazione liquido-liquido
In un imbuto separatore da 500 ml contenente 100 ml di
soluzione di acido-cloridrico (3.5), trasferire 25,0 ml di
filtrato ottenuto in (5.2). Aggiungere 100 ml di diclorometano
(3.1) all'imbuto e agitare per 1 minuto. Lasciare separare gli
strati e versare lo strato inferiore (diclorometano) in un
pallone da 500 ml. Ripetere l'estrazione della fase acquosa
con due ulteriori porzioni da 40 ml diclorometano e combinare
queste porzioni con il primo estratto nel pallone. Evaporare a
secchezza l'estratto in diclorometano sull'evaporatore rotante
(4.2) a 40 gradi centigradi sotto pressione ridotta.
Sciogliere il residuo in 20 - 25 ml di metanolo (3.2), tappare
il pallone e conservare tutto l'estratto per la cromatografia
a scambio ionico (5.4).
5.4. Cromatografia a scambio ionico
5.4.1. Preparazione della colonna a scambio cationico
Inserire un tappo di lana di vetro nell'estremità inferiore
di una colonna di vetro (4.3). Preparare una sospensione di
5,0 g della resina a scambio di cationi trattata (3.6) con 50
ml di acido cloridrico (3.5), versare nella colonna di vetro e
far decantare. Scaricare l'eccesso di acido fino ad appena
sopra la superficie della resina e lavare la colonna con acqua
fino a quando l'effluente è neutro al tornasole. Trasferire
50 ml di metanolo (3.2) sulla colonna e drenare fino alla
superficie della resina.
5.4.2. Cromatografia in colonna
Mediante una pipetta, trasferire accuratamente l'estratto
ottenuto in (5.3) sulla colonna. Risciacquare il pallone con
due porzioni da 5 - 10 ml di metanolo (3.2) e trasferire
questi lavaggi nella colonna. Scaricare l'estratto fino alla
superficie della resina e lavare la colonna con 50 ml di
metanolo facendo attenzione che la portata non superi i 5 ml
al minuto. Scartare l'effluente. Eluire il metil-benzoquato
dalla colonna con l'utilizzo di 150 ml di soluzione di acido
metansulfonico (3.4) e raccogliere l'eluato della colonna in
una beuta da 250 ml.
5.5. Ripartizione liquido-liquido
Trasferire l'eluato ottenuto in (5.4.2) in un imbuto
separatore da 1 litro. Risciacquare la beuta con 5 - 10 ml di
metanolo (3.2) e combinare i lavaggi con il contenuto
dell'imbuto separatore. Aggiungere 300 ml di soluzione di
acido cloridrico (3.5) e 130 ml di diclorometano (3.1).
Agitare per 1 minuto e lasciar separare le fasi. Versare lo
strato inferiore (diclorometano) in un pallone da 500 ml.
Ripetere l'estrazione della fase acquosa con due ulteriori
porzioni da 70 ml di diclorometano e combinare questi estratti
con il primo nel pallone.
Evaporare a secchezza in evaporatore rotante (4.2) l'estratto
di diclorometano a 40 gradi centigradi a pressione ridotta.
Sciogliere il residuo contenuto nel pallone con circa 5 ml di
metanolo (3.2) e trasferire quantitativamente questa soluzione
in un matraccio graduato da 10 ml. Risciacquare il pallone con
ulteriori 2 porzioni da 1-2 ml di metanolo e trasferire anche
queste nel matraccio graduato. Portare a volume con il
metanolo e miscelare. Un'aliquota viene filtrata attraverso un
filtro a membrana (4.6). Conservare questa soluzione per la
determinazione mediante HPLC (5.6).
5.6. Determinazione mediante HPLC
5.6.1. Parametri
i parametri qui riportati sono di riferimento, ma possono
venire applicate altre condizioni purchè producano risultati
equivalenti.
Colonna per cromatografia liquida (4.4.1)
Fase mobile per HPLC: miscela metanolo-acqua (3.3)
Portata: 1 - 1,5 ml/min
Lunghezza d'onda di rivelazione: 265 nm
Volume iniettato: 20-50 (mgreco)l
Verificare la stabilità del sistema cromatografico iniettando
parecchie volte la soluzione di calibrazione (3.7.3)
contenente 3,6 (mgreco)g/ml fino a ottenimento di altezze o
aree dei picchi e tempi di ritenzione costanti.
5.6.2. Curva di calibrazione
Iniettare ciascuna soluzione di calibrazione (3.7.3) parecchie
volte e misurare le altezze (aree) dei picchi per ciascuna
concentrazione. Tracciare una curva di calibrazione riportando
in ordinate l'altezza media o l'area media dei picchi delle
soluzioni di calibrazione e in ascisse le corrispondenti
concentrazioni in (mgreco)m/ml.
5.6.3. Soluzione campione
Iniettare parecchie volte l'estratto del campione (5.5) usando
lo stesso volume usato per le soluzioni di calibrazione e
determinare l'altezza (area) media dei picchi del
meltil-benzoquato.
6. Calcolo dei risultati
Dall'altezza (area) media dei picchi del metil-benzoquato
della soluzione campione dedurre la concentrazione della
soluzione campione in (mgreco)g/ml per confronto con la curva
di calibrazione (5.6.2.).
Il contenuto di metil-benzoquato P (mg/kg) del campione è
dato dalla formula seguente:
c x 40
P = ------------
m
dove:
c = concentrazione del metil-benzoquato nella soluzione
campione in (mgreco)g/ml,
m = massa della porzione di sostanza analizzata, in grammi.
7. Convalida dei risultati
7.1. Identità
L'identità dell'analita può essere confermata mediante
co-cromatografia oppure usando un rivelatore a serie di diodi
in cui vengono confrontati gli spettri dell'estratto del
campione e della soluzione di calibrazione (3.7.3) contenente
10 (mgreco)g/ml.
7.1.1. Co-cromatografia
Un estratto di campione viene "rinforzato" mediante aggiunta
di un quantitativo adeguato di soluzione di calibrazione
(3.9.3). Il quantitativo di robenidina aggiunto deve essere
analogo a quello stimato di robenidina trovato nell'estratto
del campione.
Solo l'altezza del picco della robenidina dovrebbe risultare
aumentata dopo aver tenuto conto sia della qualità di
robenidina aggiunta che della diluizione dell'estratto. La
larghezza del picco, a metà della sua altezza massima, deve
discostarsi al massimo del (più o meno) 15% dalla larghezza
originale.
7.1.2. Rivelazione di diodi in serie
I risultati sono valutati con i seguenti criteri:
a) le lunghezze d'onda del massimo di assorbimento degli
spettri relativi al campione ed allo standard, registrate
all'apice del picco, devono essere le stesse entro un
margine determinato dal potere di risoluzione del sistema
di rivelazione. Per la rivelazione mediante diodi in serie,
questo è tipicamente (più o meno) 2 mm;
b) tra 250 e 400 nm, gli spettri relativi al campione ed allo
standard, registrati all'apice del picco cromatografico,
non devono essere differenti per le parti dello spettro
comprese tra il 10 e il 100% dell'assorbanza relativa.
Questo criterio viene soddisfatto quando sono presenti gli
stessi massimi e quando in nessun punto osservato la
deviazione tra i due spettri supera il 10% dell'assorbanza
dell'analita standard;
c) tra 250 e 400 nm, gli spettri relativi all'estratto del
campione, registrati nel tratto ascendente, all'apice e nel
tratto discendente del picco cromatografico, non devono
essere differenti per quelle parti dello spettro comprese
tra il 10 ed il 100% dell'assorbanza relativa. Questo
criterio è soddisfatto quando sono presenti gli stessi
massimi e quando in nessun punto osservato la deviazione
tra gli spettri supera il 10% dell'assorbanza dello spettro
dell'apice.
Se uno di questi criteri non è soddisfatto, la presenza
dell'analita non è confermata.
7.2. Ripetibilità
La differenza tra i risultati di due determinazioni parallele
effettuate sullo stesso campione non deve superare il 10% del
valore più elevato dei due risultati, per contenuti di
robenidina superiori a 15 mg/kg.
7.3 Recupero
Per il campione in bianco addizionato il recupero deve essere
pari ad almeno l'85%.
8. Risultato di uno studio collaborativo
La CEE ha organizzato uno studio collaboratico in cui quattro
campioni di alimenti per polli e per conigli, in forma di
farina o di pellet, sono stati analizzati da 12 laboratori.
Per ogni campione sono state eseguite analisi in doppio.
Risultati
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| |
| Polli | Conigli
|_______________________|_______________________
| | | |
| Farina | Pellet | Farina | Pellet
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| | | |
media mg/kg | 27,00 | 27,99 | 43,6 | 40,1
| | | |
Sr (mg/kg) | 1,46 | 1,26 | 1,44 | 1,66
| | | |
CVr (%) | 5,4 | 4,5 | 3,3 | 4,1
| | | |
Sr (mg/kg) | 4,36 | 3,36 | 4,61 | 3,91
| | | |
CVR (%) | 16,1 | 12,0 | 10,6 | 9,7
| | | |
Recupero (%) | 90,0 | 93,3 | 87,2 | 80,2
| | | |
_____________________|__________|____________|____________|__________
Sr = deviazione standard della ripetibilità,
CVr = coefficiente di variazione della ripetibilità,
SR = deviazione standard della riproducibilità,
CVR = coefficiente di variazione della riproducibilità.
_____________________________________________________________________
DETERMINAZIONE DELL'AFLATOSSINA B1 - INTEGRAZIONE AL METODO B
PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA RISOLUZIONE
Preparazione del campione: sgrassatura
I campioni contenenti più del 5% di sostanze grasse devono essere
sgrassati con etere di petrolio (punto di ebollizione 40-60 gradi)
dopo la preparazione del campione indicata al punto 5.1. del metodo
B. In questi casi, i risultati devono essere riferiti al peso del
campione non sgrassato.
NOTA: il metodo B per cromatografia liquida ad alta risoluzione è
descritto nell'allegato al D.M. 11 aprile 1994 - Supplemento n.
9, pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica
Italiana n. 92 del 21 aprile 1994.
L'ispettore generale capo per la repressione delle frodi
del Ministero delle risorse agricole, alimentari e forestali
DI SALVO