Serie Generale n. 277 del 24-11-1992
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 10 novembre 1992
Produzione, acquisto e distribuzione dell'antigene di brucella tamponato (SAR) e dell'antigene per l'effettuazione della fissazione del complemento ai fini delle diagnosi della brucellosi ovi-caprina. (GU Serie Generale n.277 del 24-11-1992)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto il testo unico delle leggi sanitarie, approvato con regio
decreto 27 luglio 1934, n. 1265;
Vista la legge 9 giugno 1964, n. 615, riguardante la bonifica degli
allevamenti dalla tubercolosi e dalla brucellosi;
Vista la legge 23 gennaio 1968, n. 33, recante modifiche alla legge
9 giugno 1964, n. 615, sulla bonifica sanitaria degli allevamenti
dalla tubercolosi e dalle brucellosi;
Vista la legge 23 giugno 1970, n. 503, art. 2, modificata dalla
legge 23 dicembre 1975, n. 745;
Visto il regolamento di polizia veterinaria approvato con decreto
del Presidente della Repubblica dell'8 febbraio 1954, n. 320;
Vista la legge 23 dicembre 1978, n. 833;
Vista l'ordinanza ministeriale del 19 febbraio 1991, pubblicata
nella Gazzetta Ufficiale n. 46 del 23 febbraio 1991, recante norme
per l'eradicazione della brucellosi dagli allevamenti ovini e caprini
del territorio nazionale, secondo le procedure previste dalla
decisione del Consiglio n. 90/242/CEE del 21 maggio 1990;
Considerato che le spese necessarie per l'attuazione dei piani
nazionali di profilassi e risanamento dalla brucellosi gravano sul
cap. 5941 - Tesoro - Fondo sanitario nazionale;
Ritenuto opportuno indicare gli istituti produttori e stabilire il
prezzo di cessione dell'antigene di brucella tamponato per la siero-
agglutinazione rapida e dell'antigene per la fissazione del
complemento ai fini della vagliatura degli allevamenti e del
controllo individuale dei singoli soggetti, nell'ambito del piano di
eradicazione della brucellosi ovi-caprina;
Visto il parere espresso dal Consiglio superiore di sanità nella
seduta del 17 ottobre 1990, secondo cui, condizione indispensabile
per una corretta attuazione e fattibilità dei piani di profilassi è
l'adozione, tra l'altro, di un antigene unico da utilizzare su tutto
il territorio nazionale;
Sentita la Commissione centrale;
Decreta:
Art. 1.
L'antigene da impiegare per l'esecuzione delle prove di siero-
agglutinazione rapida ai fini della diagnosi della brucellosi ovina e
caprina, prevista dalla legge 23 gennaio 1968, n. 33, citata in
premessa, è l'antigene acido al Rosa Bengala (S.A.R.-Ag: RB)
titolato sul 2nd International Standard anti-brucella abortus Serum
di Weybridge (2nd ISaBS).
L'antigene per la fissazione del complemento miniaturizzata
(FdC-mi) per la diagnosi della brucellosi, è prodotto con il ceppo
Brucella Abortus 99.
Le modalità di produzione, standardizzazione e controllo
dell'antigene al Rosa Bengala e dell'antigene per la fissazione del
complemento miniaturizzata devono corrispondere a quanto stabilito
nell'allegato capitolato tecnico.

Art. 2.
Sono incaricati della produzione degli antigeni di cui all'art. 1 i
seguenti istituti:
1) Istituto zooprofilattico sperimentale dell'Abruzzo e del Molise
"G. Caporale", con sede in Teramo, per l'antigene al Rosa Bengala
(SAR-Ag: RB).
Il prezzo di cessione del prodotto è fissato in L. 45 a dose oltre
I.V.A.
2) Istituto zooprofilattico sperimentale della Lombardia e
dell'Emilia, con sede in Brescia, per l'antigene per la fissazione
del complemento miniaturizzata.
Il prezzo di cessione è fissato in L. 4,5 per dose oltre I.V.A.
I prezzi indicati ai punti 1 e 2 decorrono dal 1 gennaio 1992.

Art. 3.
Le spese per l'acquisto degli antigeni di cui all'art. 2 sono
sostenute dagli istituti zooprofilattici sperimentali impegnati, ai
sensi della legge n. 745 del 23 dicembre 1975 citata in premessa, ad
effettuare le prove diagnostiche per la siero-diagnosi della
brucellosi con i fondi ai medesimi assegnati sul Fondo sanitario
nazionale (cap. 5941-Tesoro).

Art. 4.
Per la preparazione, i controlli di efficacia, di innocuità e di
sterilità nonchè il confezionamento dell'antigene brucellare al
Rosa Bengala, l'istituto produttore deve attenersi a quanto indicato
nell'allegato capitolato tecnico.
Il presente decreto entrerà in vigore il giorno successivo a
quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della
Repubblica italiana.
Roma, 10 novembre 1992
p. Il Ministro: AZZOLINI

ALLEGATO
CAPITOLATO TECNICO CONCERNENTE LA PRODUZIONE ED IL CONTROLLO DEGLI
ANTIGENI "UNICI" E DEL SIERO NAZIONALE DI RIFERIMENTO PER LA
DIAGNOSI DELLA BRUCELLOSI (B. Melitensis) PREVISTI DAL REGOLAMENTO
DEL PIANO NAZIONALE DI ERADICAZIONE NEGLI ALLEVAMENTI OVINI E
CAPRINI.
Il regolamento concernente il piano nazionale per la eradicazione
della brucellosi (B. Melitensis) negli allevamenti ovini e caprini
adotta, quali prove diagnostiche sierologiche, la siero-
agglutinazione rapida con antigene acido al Rosa Bengala (SAR-Ag: RB)
e la fissazione del complemento miniaturizzata (F.d.C.-mi),
controllate con un siero nazionale di riferimento (SNdR), calibrato
sul secondo siero internanzionale standard di Weybridge (2nd-ISaBS).
I) PRODUZIONE, STANDARDIZZAZIONE E CONTROLLO DELL'ANTIGENE "UNICO" AL
ROSA BENGALA PER LA REAZIONE DI SIERO-AGGLUTINAZIONE RAPIDA.
L'antigene per la reazione SAR per la diagnosi della brucellosi
ovi-caprina è unico su tutto il territorio nazionale e viene fornito
da un solo istituto produttore sotto la sorveglianza dell'Istituto
superiore di sanità.
1) Produzione:
L'antigene al Rosa Bengala viene prodotto con il ceppo "Brucella
Abortus 99", mediante fermentatori.
L'allestimento delle colture di partenza per la semina dei terreni
di produzione in fermentatore avviene ricostituendo una fiala del
ceppo liofilizzato, rivitalizzato per 2-3 ore a 37 C, clonato,
identificato e controllato per la purezza e la fase (S).
La moltiplicazione dell'antigene avviene in brodo-coltura
specifica in fermentatori muniti di processi di agitazione e
aerazione convenzionali a 37 C.
La coltura ottenuta viene controllata per la purezza e la fase
inattivata al calore e addizionata con fenolo allo 0,5%.
La coltura preparata viene posta a maturare a 4 C per venti
giorni, successivamente si procederà ad una serie di lavaggi e
centrifugazioni per allontanare il terreno di coltura.
La sospensione batterica raccolta viene sottoposta a colorazione
con Rosa Bengala e quindi sottoposta ad una serie finale di lavaggi e
centrifugazioni e ripresa con diluente tamponato (BBA) a PH 3,65 +
0,05.
La sospensione madre deve essere sottoposta ad un controllo di
sterilità ed inattivazione.
2) Standardizzazione dell'antigene concentrato.
Procedere ad una prova qualitativa dell'antigene mediante siero-
agglutinazione rapida su vetrino con 8 sieri positivi e 8 negativi
per brucellosi, di origine ovina o caprina.
La siero-agglutinazione rapida deve essere effettuata nel modo
seguente: porre 0,03 ml di antigene a fianco a 0,03 ml di siero su
una piastra bianca; mescolare accuratamente; agitare con movimento
rotatorio per 4 minuti; leggere in buone condizioni di illuminazione:
in mancanza di agglutinazione la prova è considerata negativa.
Qualsiasi grado di agglutinazione va considerato positivo, salvo
quando appare chiara una eccessiva essiccazione ai margini della
reazione.
Standardizzare l'antigene al Rosa Bengala concentrato mediante il
secondo siero internazionale standard di Weybridge (2nd-ISaBS).
La diluizione d'uso dell'antigene deve dare agglutinazione
visibile (+) alla diluizione di 1:47,5; reazione negativa alla
diluizione 1:50 del 2nd-ISaBS di Weybridge.
Diluire la sospensione madre dell'antigene secondo il titolo
ottenuto; controllare nuovamente l'antigene pronto per l'uso;
controllare il PH finale; procedere al confezionamento.
3) Controllo dell'antigene al Rosa Bengala, standardizzato.
Il controllo dell'antigene al Rosa Bengala viene effettuato
dall'Istituto superiore di sanità presso la sede dell'istituto
produttore al fine di poter utilizzare gli stessi materiali di
standardizzazione.
Si effettua allestendo una serie di reazioni di siero-
agglutinazione rapida con il secondo siero internazionale standard
diluito in soluzione fisiologica 1:30, 1:35, 1:40, 1;45, 1:47,5,
1:50, 1:55.
L'antigene pronto per l'uso deve dare reazione positiva alla
diluizione 1:47,5 e negativa 1:50 del 2nd-ISaBS.
L'Istituto superiore di sanità dovrà inoltre effettuare il
controllo di inattivazione dell'antigene pronto per l'uso e le
operazioni di riconoscimento dell'antigene controllato come antigene
unico nazionale per effettuare la reazione di siero-agglutinazione
rapida con antigene al Rosa Bengala (SAR-Ag: RB) per la diagnosi
sierologica della brucellosi ovi-caprina.
L'antigene deve essere fornito pronto per l'uso ed avere la
validità di due anni.
L'etichetta di confezionamento deve riportare le seguenti diciture
di riconoscimento:
antigene "unico" al Rosa Bengala per la siero-agglutinazione
rapida, pronto per l'uso;
serie, data di produzione e scadenza;
preparazione riservata agli istituti zooprofilattici.
L'Istituto superiore di sanità si riserva la sorveglianza sul
campo dell'uso specifico dell'antigene "unico" al Rosa Bengala per la
reazione di siero-agglutinazione rapida e su piastra, e delle rela-
tive modalità di impiego.
II) PRODUZIONE, STANDARDIZZAZIONE E CONTROLLO DELL'ANTIGENE
"UNICO" PER LA REAZIONE DI FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO
MINIATURIZZATA (F.d.C.-mi).
L'antigene per la reazione di fissazione del complemento
miniaturizzata per la diagnosi della brucellosi ovi-caprina è unico
su tutto il territorio nazionale e viene fornito da un solo istituto
produttore sotto la sorveglianza dell'Istituto superiore di sanità.
1) Produzione:
L'antigene per la F.d.C. viene prodotto con il ceppo brucella
abortus 99 mediante fermentatore.
L'allestimento delle colture di partenza per la semina dei terreni
di produzione procede da una singola colonia in fase dissociata (fase
S) di B. Abortus, opportunamente clonata ed indentificata per ogni
serie di produzione.
La moltiplicazione dell'antigene avviene insemenzando una brodo-
coltura specifica, tenuta sotto agitazione ed aerazione per 48 ore a
37 C in unità di fermentazione.
La coltura ottenuta viene controllata per la purezza attraverso
semina in terreno nutritivo con successivo striscio e osservazione
microscopica dopo colorazione di Gram e per la verifica della fase
non dissociata.
L'antigene ottenuto viene inattivato mediante l'aggiunta di acido
fenico alla concentrazione dello 0,5% fatto agire a 37 C per 48 ore.
Il controllo dell'inattivazione viene eseguito seminando l'antigene
trattato in un terreno nutritivo e controllando che per sette giorni
non sia avvenuta alcuna crescita.
L'antigene inattivato viene lavato e concentrato tramite uso di
una ultracentrifuga a flusso continuo in grado di realizzare una
velocità di centrifugazione di 15.000 RPM. La patina batterica
ottenuta viene risospesa con soluzione fisiologica fenicata allo 0,5%
e costituisce la sospensione madre concentrata dell'antigene.
2) Standardizzazione dell'antigene concentrato.
Procedere alla titolazione del complemento e della emolisina
mediante la tecnica a croce in micropiastra.
Utilizzare per il sistema emolitico, globuli rossi di montone al
2% pari ad una concentrazione globulare di 54 x 10 per millilitro.
Allestire la prova di standardizzazione in micropiastra secondo il
seguente schema:
a) diluire l'antigene concentrato a partire da 1:40 a 1:1280 e
distribuire ogni diluizione in triplo, in senso orizzontale alla
piastra, in quantità di 25(Micron(l per pozzetto;
b) prediluire 1:10 il secondo siero internazionale standard di
Weybridge; inattivare a 58 C per 30'; preparare le relative
diluizioni di 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 1:250 e distribuire a croce
sull'antigene, in quantità di 25(Micron(l di diluizione/pozzetto;
c) aggiungere 25(Micron(l di complemento (2 unità H100) per
pozzetto;
d) agitare ed incubare a bagnomaria a 37 C per 30';
e) aggiungere 25(Micron(l di sistema emolitico preparato in
parti uguali di globuli rossi (2%) ed emolisina (2 unità CH 100);
f) agitare ed incubare in bagnomaria a 37 C per 30';
g) lettura: la diluizione di antigene che produce il 50% (++) di
fissazione alla diluizione di 1:200 del secondo siero internazionale
standard di Weybridge, rappresenta il titolo d'uso.
L'antigene deve essere stoccato concentrato 10 volte il titolo
d'uso.
3) Controllo dell'antigene standardizzato.
Si effettua allestendo una prova di fissazione del complemento
miniaturizzata per verificare il titolo d'uso dell'antigene.
Il controllo viene allestito saggiando l'antigene con il secondo
siero internazionale standard, il siero nazionale di riferimento ed
il siero di lavoro dell'istituto produttore dell'antigene. I sieri
saggiati devono dimostrare il contenuto di unità sensibilizzanti
dichiarato.
Il controllo dell'antigene viene effettuato dall'Istituto
superiore di sanità presso la sede dell'istituto produttore al fine
di poter utilizzare gli stessi materiali di standardizzazione.
L'Istituto superiore di sanità dovrà inoltre effettuare il
controllo di inattivazione dell'antigene confezionato e le operazioni
di riconoscimento dell'antigene controllato come antigene "unico"
nazionale per la reazione di fissazione del complemento
miniaturizzata per la diagnosi sierologica della brucellosi ovi-
caprina.
L'antigene deve essere fornito confezionato in boccette di vetro
scuro in quantità di 20 ml ed avere un anno di validità.
L'etichetta di confezionamento deve riportare le seguenti
diciture:
antigene "unico" per la fissazione del complemento miniaturizzata
per siero-diagnosi di brucellosi ovi-caprina;
coefficiente di diluizione d'uso;
serie, data di produzione e scadenza;
preparazione riservata agli istituti zooprofilattici.
L'Istituto superiore di sanità si riserva la sorveglianza sul
campo dell'uso specifico dell'antigene "unico" per la F.d.C.-mi e
delle relative modalità d'impiego.
III) PRODUZIONE E CONTROLLO DEL SIERO NAZIONALE DI RIFERIMENTO
Il siero nazionale di riferimento deve essere prodotto da uno
degli istituti produttori degli antigeni "unici" nazionali.
Il siero nazionale di riferimento deve essere calibrato sul
secondo siero internazionale standard di Weybridge.
Il controllo ufficiale del siero nazionale di riferimento deve
essere effettuato dall'Istituto superiore di sanità e deve
dimostrare le unità sensibilizzanti il complemento dichiarate
dall'istituto produttore.