Serie Generale n. 38 del 15-2-1990
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
DECRETO 19 gennaio 1990
Modificazioni e aggiornamento del decreto ministeriale 30 agosto 1962 sulla registrazione e controllo di Stato di vaccini poliomielitici preparati con virus vivi attenuati. (GU Serie Generale n.38 del 15-02-1990)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto il decreto ministeriale 10 agosto 1962, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale n. 224 del 5 settembre 1962, recante disposizioni
sulla registrazione e sul controllo di Stato dei vaccini
poliomielitici per uso orale preparati con virus vivi attenuati;
Ravvisata l'opportunità di apportare modifiche e aggiornamenti
alle disposizioni del predetto decreto, nonchè alle "istruzioni"
tecniche ad esso allegate;
Viste le proposte dell'Istituto superiore di sanità;
Udito il Consiglio superiore di sanità nella seduta del 25
novembre 1988;
Visti gli articoli 161, 162, 180 e 181 del testo unico delle leggi
sanitarie approvato con regio decreto 27 luglio 1934, n. 1265, e
successive modificazioni;
Visti i regolamenti approvati con regi decreti 18 giugno 1905, n.
407 e 3 marzo 1927, n. 478;
Decreta:
Art. 1.
All'art. 1 del decreto ministeriale 10 agosto 1962, pubblicato
nella Gazzetta Ufficiale n. 224 del 5 settembre 1962, sono aggiunti i
commi seguenti:
"Il controllo preventivo di Stato può essere effettuato, partita
per partita, anzichè su campioni del prodotto, sui protocolli di
produzione e controllo dell'azienda produttrice, purchè l'Istituto
superiore di sanità, sulla base dei dati di laboratorio e di
periodiche visite ispettive per l'accertamento della corretta
applicazione delle norme di buona fabbricazione, abbia riconosciuto
costantemente idonea la qualità della produzione.
In ogni caso l'azienda produttrice è tenuta a trasmettere
all'Istituto superiore di sanità, unitamente ai protocolli di cui al
comma precedente, campioni delle singole partite, per eventuali
analisi.
Per i vaccini provenienti dall'estero, l'azienda interessata dovrà
inviare, per la verifica da parte dell'Istituto superiore di sanità,
anche i protocolli di controllo dell'autorità sanitaria responsabile
del controllo nel Paese d'origine.
Se il vaccino proviene da Paesi che non riconoscono come validi i
controlli effettuati dall'autorità sanitaria italiana, l'Istituto
superiore di sanità procede anche al controllo sui campioni finiti e
prelevati in corso di produzione.
È fatta, in ogni caso, salva la facoltà dell'Istituto superiore
di sanità di effettuare ispezioni alle officine produttrici, anche
estere".

Art. 2.
Il primo comma dell'art. 3 del richiamato decreto ministeriale 10
agosto 1962 è sostituito dal seguente:
"Le ditte che richiedono l'autorizzazione a produrre vaccino
poliomielitico con virus vivi attenuati dovranno preventivamente
sottomettere ad esame presso l'Istituto superiore di sanità la
storia e le caratteristiche dei ceppi di virus con cui intendono
preparare il vaccino, allegando la seguente documentazione:
notizie sull'origine dei ceppi e sulle tecniche usate per la loro
attenuazione: come prova biochimica di identificazione è
raccomandato che sia registrata con il laboratorio nazionale di
controllo una mappa T1 degli oligonucleotidi;
proprietà antigeniche dei ceppi;
neuro-virulenza dei ceppi per le scimmie;
dati sulla stabilità genetica ed elencazione, per ogni singolo
ceppo, dei cosiddetti marcatori virologici".

Art. 3.
L'art. 4 del decreto ministeriale 10 agosto 1962 è sostituito dal
seguente:
"Le ditte che, in base al dispositivo dell'art. 3, hanno ottenuto
l'approvazione dei ceppi virali che intendono impiegare nella
preparazione del vaccino, devono costituire una scorta di 'semenza
viralè sufficiente alla necessità di produzione del vaccino almeno
per dieci anni, da conservare in adatti congelatori.
Tale semenza deve essere preparata separatamente per ciascuno dei
tipi di virus poliomielitico 1, 2 e 3, e deve costituire una
sospensione virale omotipica ed unitaria ottenuta in un contenitore
unico.
È necessario preparare i vaccini, in tutti i casi e
particolarmente per i vaccini di tipo 3, dal lotto di semenza virale
al più basso livello di passaggio dal virus originale e deve essere
reso disponibile un lotto di semenza virale di un soddisfacente basso
passaggio. La semenza virale originaria potrà essere impiegata, per
la preparazione del vaccino, non oltre il terzo passaggio in coltura
di tessuti per i tipi 1 e 2, e non oltre il secondo passaggio per il
tipo 3. I lotti di semenza virale devono essere conservati ad una
temperatura inferiore a - 60 C.
Un campione di 100 ml di semenza virale, per ciascun tipo di virus,
deve essere depositato presso l'Istituto superiore di sanità,
insieme con 10 ml di antisiero omologo a titolo noto".

Art. 4.
L'importo del rimborso delle spese per controllo delle semenze
virali da parte dell'Istituto superiore di sanità, previsto
dall'art. 6 del decreto ministeriale 10 agosto 1962, è aumentato a
lire 50 milioni.

Art. 5.
L'importo del rimborso delle spese per controllo di ogni serie di
vaccino da parte dell'Istituto superiore di sanità, previsto dal
secondo comma dell'art. 7 del decreto ministeriale 10 agosto 1962, è
aumentato a lire 30 milioni.

Art. 6.
Al terzo comma dell'art. 8 del decreto ministeriale 10 agosto 1962,
è aggiunta, in fondo, la seguente frase: "o la data della
determinazione effettuata presso la ditta produttrice, nel caso in
cui il controllo di Stato venga effettuato sui protocolli, salva
restando la discrezionalità dell'Istituto superiore di sanità di
eseguire la determinazione del titolo virale del vaccino a posteriori
sul prodotto finito".

Art. 7.
L'art. 11 del decreto ministeriale 10 agosto 1962 è sostituito dal
seguente:
"L'inottemperanza alle disposizioni del presente decreto, ferma
restando, se del caso, l'applicazione di sanzioni penali, sarà
valutata, ai sensi delle disposizioni vigenti, ai fini dell'eventuale
revoca dell'autorizzazione alla produzione e all'immissione in
commercio del vaccino".

Art. 8.
L'allegato al decreto ministeriale 10 agosto 1962 è sostituito
dall'allegato al presente decreto, contenente un testo aggiornato di
istruzioni sulla produzione, controllo e conservazione del vaccino
vivo attenuato contro la poliomielite, per uso orale.

Art. 9.
Il presente decreto entra in vigore il quindicesimo giorno
successivo a quello della sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, addì 19 gennaio 1990
Il Ministro: DE LORENZO

ISTRUZIONI RIGUARDANTI LA PRODUZIONE, IL CONTROLLO E LA CONSERVAZIONE
DEL VACCINO VIVO ATTENUATO CONTRO LA POLIOMIELITE, PER USO ORALE.
1) PERSONALE
Il personale addetto alla produzione deve essere limitato ad un
numero indispensabile di persone adibite solo a questo scopo,
tecnicamente molto ben preparate, sane. Devono essere sottoposte a
visita medica a intervalli regolari e devono rispettare rigorosamente
le seguenti norme:
a) devono essere immuni contro la poliomielite in modo da non
diventare escretori di poliovirus o anche di altri microorganismi
significativi per la sicurezza del vaccino; inoltre, non devono
essere affetti da tubercolosi;
b) devono fare la doccia ed indossare biancheria ed indumenti
sterilizzati tutte le volte che entrano in laboratorio, inclusi
guanti, calzature, maschere e cappelli;
c) devono rimanere nel laboratorio o stabulario durante i turni
di lavoro e non uscire per alcuna ragione; non deve essere concesso
di fumare, mangiare o bere;
d) un ispettore dovrebbe avere la responsabilità di registrare
malattie insolite fra il personale, e di assicurarsi che tutte le
lesioni sono trattate appropriatamente. Nessun lavoratore che abbia
tagli o abrasioni su aree esposte del corpo potrà entrare nei
laboratori o stabulari di produzione. Inoltre, qualsiasi malattia
febbrile non spiegata, in periodo non lavorativo, dovrà essere
considerata come parzialmente legata al tipo dell'impiego. Se tali
malattie sono frequenti, numerose o di particolare gravità, dovrà
essere data comunicazione all'autorità sanitaria di controllo per
prendere misure cautelative.
2) AMBIENTI
Il laboratorio per la produzione di vaccino poliomielitico vivo
attenuato deve essere costituito da quattro gruppi di ambienti
destinati esclusivamente a questo scopo:
a) stabulario per la segregazione delle scimmie da utilizzarsi
per la produzione del vaccino;
b) locali per la produzione del vaccino;
c) locali per il controllo del vaccino in coltura di tessuti;
d) locali per il controllo del vaccino in animali.
Lo stabulario per la segregazione delle scimmie deve assicurare il
più completo isolamentto degli animali dai locali adibiti alla
produzione del vaccino e deve essere dotato di un opportuno sistema
di filtrazione dell'aria in uscita ed entrata.
I reni prelevati agli animali nello stabulario di segregazione
vanno posti in un recipiente sterile e introdotti, attraverso una
piccola finestra nel locale di produzione.
Il locale di produzione deve essere fornito di stanze in cui si
lasciano gli indumenti che il personale indossa fuori del
laboratorio.
Nessuna comunicazione deve esistere fra i locali adibiti alla
produzione ed i laboratori adibiti al controllo.
Prima dell'inizio della produzione di ciascuna serie i locali
vanno lavati accuratamente, sterilizzati con nebulizzazione di
sostante antisettiche e prolungata accensione di lampade U.V.
A visitatori e personale non appartenente direttamente ai processi
di produzione non deve essere permesso di entrare nelle aree di
produzione.
3) SCIMMIE
COLTURE DI TESSUTO PER LA PREPARAZIONE DELLA SEMENZA VIRALE
E DEL VACCINO
Le scimmie da cui prelevare i reni per la produzione della semenza
virale e del vaccino vero e proprio debbono appartenere ai generi
Macaca, Cercopithecus, Patas o ad altri preventivamente approvati
dall'I.S.S., debbono essere in buona salute e non devono essere state
usate precedentemente per scopi sperimentali. Gli animali devono
essere mantenuti in segregazione preventiva per almeno sei settimane.
Durante tale periodo gli animali debbono rimanere in gabbie spaziate
da separazioni più ampie possibili, a pareti piene da tutti i lati,
tranne che sul fronte e debbono essere prese precauzioni per evitare
infezioni crociate; in tali gabbie non vanno mai messi piu di due
animali che non vanno intercambiati.
Qualora si verifichi nel gruppo (un gruppo in quarantena è una
colonia di scimmie selezionate, sane, tenute in uno stabulario con
cibo separato, e facilità di pulizia, e che non abbiano contatto con
altre scimmie) una mortalità, in qualsiasi momento della quarantena
(o segregazione) superiore al 5% (esclusi eventi accidentali o cause
non dovute a malattie infettive), il periodo di quarantena va
raddoppiato.
Al momento dell'uccisione, per il prelievo dei reni, gli animali
devono essere accuratamente esaminati dal veterinario per escludere
qualsiasi sintomo di malattia con particolare riguardo alla
tubercolosi e a lesioni herpes-simili intorno alle labbra o nella
cavità boccale.
Se una scimmia mostra una qualsiasi lesione patologica rilevante
per l'uso dei suoi reni nella preparazione di un lotto di semenza o
vaccino, questa scimmia non dovrà essere usata, e nessuna delle
scimmie rimanenti del gruppo di quarantena dovrà essere usato
finchè non venga dimostrato che il loro uso non è pericoloso per la
sicurezza del prodotto.
Le scimmie usate non devono avere anticorpi contro i virus SV40 e
SAIDS. Se una ditta produttrice usa colture di tessuto diverse dai
reni di scimmia sopra menzionati (per es. cellule diploidi umane),
deve comunicarlo al Ministero della sanità ed ottenere
l'approvazione dell'I.S.S. che stabilirà anche le norme per la
produzione ed il controllo. Nessuna altra coltura cellulare, diversa
da quella approvata dall'ISS, per la produzione del vaccino deve
essere introdotta o maneggiata nell'area di produzione.
4) PRODUZIONE
A) SEMENZA VIRALE.
Prima di iniziare la produzione vera e propria del vaccino bisogna
preparare un congruo quantitativo di "Semenza virale" di ciascuno dei
tre tipi di virus; tale "Semenza virale" dovrà essere conservata a
temperature inferiori a - 60 C suddivisa in piccoli contenitori,
ognuno dei quali servirà, nei dieci o più anni successivi, come
inoculo per la produzione delle serie singole; prima di venire usata,
essa dovrà essere sottoposta ai seguenti controlli:
1) identità;
2) sterilità per schizomiceti, miceti e micoplasma;
3) assenza di agenti avventizi in colture cellulari ed in
animali;
4) costanza dei caratteri biologici dimostrabili con le colture
di tessuto in rapporto a una sospensione di virus di riferimento;
5) costanza dei caratteri biologici dimostrabili mediante
l'inoculazione in scimmie per via intraspinale (test di
neurovirulenza), in confronto con una sospensione di virus di
riferimento, secondo i requisiti del WHO (WHO Expert Committee on
Biological Standardization, Thirty-third Report, Technical Report
Series 687, WHO, Geneva 1983) e suoi successivi aggiornamenti;
6) si raccomanda che un test di identificazione biochimica quale
quello della mappa T1 degli oligonucleotidi, sia eseguito d'accordo
con l'I.S.S.
B) SERIE DI VACCINO.
Per la produzione della semenza virale e del vaccino si usa la
sospensione cellulare ottenuta mediante tripsinizzazione dei reni
(che non mostrino segni patologici) di scimmia, risospesa nell'adatto
terreno di crescita, distribuita in bottiglie e messa ad incubare a
37 C. Se viene usato siero animale nel terreno di crescita, il
terreno di mantenimento, dopo la inoculazione del virus, non lo
dovrà contenere. Possono essere usati antibiotici adatti che non
siano penicillina e streptomicina, ed un indicatore di pH non tossico
come il rosso fenolo ad una concentrazione di 0.002%. Tali sostanze
devono essere approvate dalle autorità sanitarie di controllo.
Bisogna inoltre assicurarsi che la tripsina ed il siero bovino usati
nella preparazione della sospensione cellulare e per i terreni di
crescita non abbiano agenti estranei.
Dopo il cambio del terreno, le bottiglie vanno tenute in
osservazione per tre giorni prima di essere inoculate.
Il gruppo di colture proveniente da ciascuna scimmia va inoculato
solamente se, dopo tale tempo, in nessuna delle bottiglie si
riscontra il sia pur minimo fenomeno riportabile alla presenza di
virus estranei nelle cellule.
Inoculare quindi solo il 75% di ciascun gruppo mentre il 25% deve
essere tenuto come controllo (è preferibile che questa percentuale
di cellule venga distribuita in piccole bottiglie onde facilitare
l'osservazione microscopica). Tutte le colture vanno mantenute a 37
C dopo il cambio del terreno. Passati i primi tre giorni di
osservazione, si inocula il virus piuttosto diluito (1:1000).
Le bottiglie inoculate sono incubate a 34 C (33-35 C con una
variazione non superiore a (Più o Meno)0.5 C) mentre quelle di
controllo devono essere messe a 37 C.
L'effetto citopatogeno da virus poliomielitico si verifica dopo
tre/quattro giorni. È consigliabile non aspettare che tutte le
cellule siano cadute nel liquidi e, pertanto, prima che ciò si
verifichi, mettere le bottiglie a - 30 C.
C) CONTROLLO.
a) Controllo da eseguire sul liquido proveniente dalle bottiglie non
inoculate di una singola scimmia.
I) Saggi da effettuare sulle colture cellulari usate per la
produzione di vaccino.
Nel giorno dell'inoculazione con la semenza virale viene prelevato
un campione di almeno 20 ml di terreno miscelato proveniente dalle
colture cellulari dei reni di ciascuna scimmia, terreno che deve
essere diviso in due parti uguali. Una parte del terreno miscelato
sarà saggiato in colture cellulari di rene di scimmia preparate
dalla medesima specie, ma non del medesimo animale di quello usato
per la produzione del vaccino. L'altra parte di terreno miscelato
sarà saggiato in colture cellulari di rene di scimmia di un'altra
specie tenendo conto che le prove sui terreni miscelati devono essere
fatti in colture cellulari di almeno una specie conosciuta essere
sensibile al virus SV40, tranne nei Paesi in cui la specie per la
produzione è sensibile al virus SV40. Il terreno miscelato deve
essere inoculato in bottiglie di colture cellulari in modo che la sua
diluizione nel terreno di crescita sia di una parte in quattro parti;
l'area del tappeto cellulare deve essere almeno di 3 cm(Elevato al
Quadrato) per ml di terreno miscelato. Almeno una bottiglia di
ciascun tipo di coltura cellulare deve rimanere non inoculata e deve
servire come controllo. In alcuni Paesi il virus può essere fatto
crescere in colture cellulari secondarie di rene di scimmia, in
questo caso l'I.S.S. deve dare la sua approvazione dopo che siano
stati effettuati monitoraggi cromosomici.
Le colture devono essere incubate ad una temperatura di 37 C e
devono essere osservate per un periodo totale di almeno quattro
settimane. Durante questo periodo di osservazione e dopo non meno di
due settimane di incubazione, da ciascuna di queste colture deve
essere fatta almeno una subcoltura del terreno nel medesimo sistema
di coltura cellulare. Le subcolture devono essere osservate per
almeno due settimane.
Un ulteriore campione di almeno 10 ml del terreno miscelato deve
essere saggiato per escludere la presenza dell'herpesvirus B ed altri
virus in colture cellulari di rene di coniglio. Il siero usato nel
terreno di crescita di questa coltura deve essere esaminato per
escludere la presenza di inibitori del virus B (l'herpesvirus umano
può essere usato come indicatore). Questo campione deve essere
inoculato in bottiglie di queste colture cellulari, in modo che il
terreno miscelato nel terreno di crescita sia di uno a quattro e
l'area del tappeto cellulare sia almeno di 3 cm(Elevato al Quadrato)
per ml di terreno miscelato. Almeno una bottiglia della colture
cellulari deve rimanere non inoculata e servire come controllo. Le
colture devono essere incubate ad una temperatura di 37 C e devono
essere osservate per un periodo di almeno due settimane.
Deve essere aggiunto a queste prove, un ulteriore campione del
terreno miscelato prelevato dalle colture cellulari nel giorno di
inoculazione della semenza virale, affinchè sia saggiato per la
presenza di agenti avventizi (estranei) mediante l'inoculazione di 10
ml in colture cellulari umane o altre preventivamente autorizzate
dall'I.S.S. sensibili al virus del morbillo.
Perchè le prove siano valide, almeno l'80% delle bottiglie devono
essere disponibili ed adatte per la valutazione alla fine dei
rispettivi periodi di osservazione.
Se da queste prove si rileva la presenza di un agente avventizio,
la singola raccolta (dell'intero gruppo di colture cellulari
relative) non può essere usata per la produzione del vaccino.
Se viene dimostrata la presenza del virus B, la produzione del
vaccino poliomielitico orale deve essere interrotta e le autorità
sanitarie di controllo devono essere informate. La produzione non
può essere ricominciata finchè non sia espletata una investigazione
completa e finchè non si siano prese tutte le precauzioni contro la
ricomparsa dell'infezione, e soltanto dopo l'approvazione
dell'autorità sanitaria di controllo.
Se questi esami non vongono eseguiti immediatamente, i campioni
presi devono essere tenuti ad una temperatura di - 60 C ad eccezione
del campione per l'esame del virus B che deve essere tenuto a 4 C,
purchè il saggio sia eseguito entro sette giorni dal prelievo.
II) Prove sulle colture cellulari.
Al momento della raccolta dei virus poliomielitici nessuna delle
bottiglie (il 25%) tenute come controllo deve presentare fenomeni
citopatologici che facciano sospettare la presenza di virus avventizi
(estranei).
Perchè le prove siano valide, non più del 20% delle colture
cellulari di controllo possono essere scartate per ragioni
accidentali, non specifiche. A tali bottiglie di controllo dopo una
settimana si cambia il terreno di cui si congela un campione a - 30
C e si tengono in osservazione un'altra settimana.
Allo scadere di tale settimana si preleva un altro campione da
ogni bottiglia di controllo, si inoculano ml 0.5 sia dal primo che
dal secondo campione di dieci colture in provette di rene di scimmia
dello stesso tipo di quella adoperata per la produzione, ma ottenuta
da un altro animale, in dieci colture di rene di scimmia di una
specie diversa sensibile al virus SV40, e in dieci colture di reni di
coniglio.
Tali colture vengono mantenute in osservazione per due settimane
alla temperatura di 37 C. Allo scadere del tempo, con le colture di
rene di scimmia, si eseguirà la prova dell'emoadsorbimento, che
dovrà risultare negativa. La prova deve essere fatta con emazie
conservate per non più di sette giorni e nel terreno non vi devono
essere ioni di calcio e magnesio. La prova si può eseguire con
emazie di cavia, umane (gruppo IV 0), scimmia, pollo o altri volatili
in aggiunta alle emazie di cavia.
È necessario fare una prova per la presenza di agenti estranei su
un ulteriore campione di terreni miscelati prelevati dalle colture di
controllo inoculando 10 ml in colture cellulari umane o altre
sensibili al virus del morbillo.
I volumi di vaccino da utilizzarsi per i controlli vanno invece
conservati ad almeno - 60 C, tranne quelli per il controllo di
assenza del virus B, che devono essere mantenuti a 4 C.
I congelatori ed i frigoriferi in cui si conservano tali
sospensioni di virus per i controlli non devono contenere altro
materiale.
b) Controlli da eseguire sulla sospensione di virus prodotta da ogni
singola scimmia:
1) controllo del titolo infettante che dovrebbe essere maggiore o
uguale a 10(elevato alla 7a)TCID50/ml;
2) sterilità per miceti, schizomiceti, micoplasma per un volume
di 10 ml o almeno lo 0.5% di ciascuna raccolta singola. Ciascuna
raccolta singola dovrebbe essere saggiata anche per escludere la
presenza del Mycobacterium tubercolosis mediante metodi colturali
appropriati e del micoplasma usando terreni solidi e liquidi che si
siano mostrati adatti alla crescita di micoplasmi, che richiedono
steroli o no, ed usando almeno 10 ml di ciascuna raccolta singola per
ciscun gruppo di saggi;
3) prove di singole raccolte neutralizzate in colture cellulari
di rene di scimmia, per il controllo di identità e di assenza di
altri virus.
Un campione di almeno10 ml di ciascuna singola raccolta sarà
neutralizzato da antisiero preparato in animali che non siano
scimmie. Nel preparare antisieri per questo scopo gli antigeni
immunizzanti devono essere di colture cellulari non di scimmia. Il
siero deve essere monospecifico e ad altro titolo.
La metà (corrispondente ad almeno 5 ml di raccolta singola) della
sospensione neutralizzata sarà saggiata in colture cellulari di rene
di scimmia della stessa specie, ma non del medesimo animale usato per
la produzione del vaccino. L'altra metà della sospensione
neutralizzata sarà saggiata in colture cellulari di rene di scimmia
di un'altra specie sensibile al virus SV40.
Le sospensioni neutralizzate devono essere inoculate in bottiglie
di queste colture cellulari in modo che la diluizione della
sospensione nel terreno di mantenimento sia di uno a quattro; l'area
del tappeto cellulare deve essere almeno di 3 cm(Elevato al Quadrato)
per ml di sospensione neutralizzata. Almeno una bottiglia di ciascun
tipo di coltura cellulare deve rimanere non inoculata come controllo
e deve contenere il terreno di mantenimento con la medesima
concentrazione di siero specifico usato per la neutralizzazione.
Può essere usato nel terreno di crescita siero animale che non
contenga anticorpi o altri inibitori contro il virus SV40, mentre nel
terreno di mantenimento non vi sarà altro siero che quello
neutralizzante i poliovirus. Le colture devono essere incubate ad una
temperatura di 37 C e devono essere osservate per un periodo totale
di almeno quattro settimane. Durante questo periodo di osservazione
e, dopo non meno di due settimane di incubazione, da ciascuna di
queste colture deve essere fatta almeno una subcoltura del terreno
nel medesimo sistema di colture cellulari. Le subcolture devono
essere osservate anche per almeno due settimane.
Un ulteriore campione di raccolta singola neutralizzata di 10 ml,
deve essere inoculata in colture di cellule umane o altre sensibili
al virus del morbillo.
Perchè le prove siano valide, almeno l'80% delle bottiglie di
coltura devono essere disponibili ed adatte per la valutazione alla
fine dei rispettivi periodi di osservazione.
Se si osserva qualsiasi cambiamento citopatologico in qualcuna
delle colture le cause di questi cambiamenti devono essere indagati;
se sono dovuti a poliovirus non neutralizzato la prova deve essere
ripetuta. Se vi è evidenza della presenza del virus SV40 o altri
agenti avventizi attribuibili alla raccolta singola, questa non deve
essere usata per la produzione del vaccino.
Prove in colture cellulari di rene di coniglio per il virus B
(herpesvirus 1
cercopitecocida) ed altri virus.
Un campione di almeno 20 ml di ciascuna raccolta singola deve
essere saggiata per escludere la presenza del virus B ed altri virus
nelle colture di rene di coniglio. Il siero usato nel terreno di
crescita di queste colture non deve contenere inibitori. Le modalità
di inoculazione, la bottiglia non inoculata di controllo, la
temperatura di incubazione (37 C) ed il periodo di osservazione (due
settimane) sono come quelle descritte precedentemente, anche per
quanto riguarda la validità della prova (l'80% delle bottiglie di
coltura devono essere indenni), e per quanto riguarda le precauzioni
da prendere in caso di evidenza di virus B o di eventuali altri
virus.
Prove in animali.
Anche se meno capaci di svelare agenti estranei delle colture
cellulari, esse pure devono essere eseguite, specie per quanto
riguarda il controllo della semenza virale.
c) Controllo della sospensione del miscuglio omotipico prodotto
finito prima della filtrazione - Sospensione del miscuglio
omotipico.
Ciascuna sospensione del miscuglio omotipico deve essere saggiato
in animali per la presenza degli agenti avventizi, a meno che queste
prove siano state già fatte sulle raccolte singole.
I campioni per saggiare la sospensione del miscuglio omotipico
prima della filtrazione devono essere presi subito dopo che la
sospensione è stata preparata e, se non saggiati immediatamente,
devono essere tenuti ad una temperatura inferiore a - 60 C finchè
le prove per la presenza di microorganismi avventizi sia eseguita. I
campioni per le prove della ricerca del virus B, come descritto
precedentemente, devono essere tenuti a 4 C se la prova è eseguita
entro sette giorni dalla conservazione.
1) Prove in conigli.
Un campione della sospensione del miscuglio deve essere saggiato
per la presenza di virus B o di altri virus mediante iniezioni in
almeno dieci conigli sani del peso tra kg 1.5-2.5. Il campione deve
essere almeno di 100 ml. Ciascun coniglio deve ricevere non meno di
10 ml e non più di 20 ml di cui 1 ml per via intradermica in più
siti ed i rimanenti per via sottocutanea. Il periodo di osservazione
deve essere almeno di tre settimane per osservare morte o segni di
malattia.
Il campione può essere dell'1% del miscuglio purchè questo sia
non minore di 100 ml, e non superiore a 500 ml, ed il periodo di
osservazione dei conigli è di quattro-cinque settimane.
Tutti i conigli che muoiono dopo le prime ventiquattro ore del
test devono essere esaminati mediante autopsia, con la rimozione del
cervello e di organi per eseguire un dettagliato esame che stabilisca
la causa della morte; gli animali che mostrano segni di malattia
devono essere uccisi e sottoposti al medesimo esame autoptico.
L'esame del miscuglio è favorevole se almeno l'80% dei conigli
inoculati rimane sano e sopravvive durante il periodo di osservazione
e se nessuno dei conigli mostra segni di infezioni da virus B o da
altri agenti avventizi o lesioni di qualsiasi tipo attribuibili alla
sospensione del miscuglio.
Se viene dimostrata la presenza di virus B, si adotteranno tutte
le misure e precauzioni descritte precedentemente.
2) Prove in topi adulti.
Un campione della sospensione del miscuglio sarà saggiata per la
presenza di agenti patogeni avventizi per il topo mediante la
inoculazione intracerebrale di 0.03 ml ed inoculazione
intraperitoneale di almeno 0.5 ml della sospensione in ciascuno di
almeno venti topi adulti, del peso di 15-20 g. I topi devono essere
osservati per almeno tre settimane. Tutti i topi che muoiono dopo le
prime ventiquattro ore e che mostrano segni di malattia devono essere
esaminati per escludere infezioni virali; questo dovrà essere fatto
sia macroscopicamente mediante l'osservazione diretta che mediante la
subinoculazione di appropriate sospensioni di tessuto per via
intracerebrale ed intraperitoneale in almeno cinque altri topi, i
quali devono essere osservati per tre settimane. Il risultato è
favorevole se almeno l'80% degli animali inoculati rimangono sani
durante tutto il periodo di osservazione e nessuno dei topi mostra
segni di infezione da agenti avventizi attribuibili alla sospensione
del miscuglio.
3) Prova in topini neonati.
Va saggiata la presenza di agenti estranei patogeni per topini
neonati di meno di ventiquattro ore provenienti da più di una
covata, inoculando un campione della sospensione del miscuglio di
0.01 ml intracerebro di almeno 0.1 ml intraperitoneo in almeno dieci
topini.
I topini devono essere osservati tutti i giorni per almeno
quattordici giorni. Tutti i topini che muoiono dopo le prime
ventiquattro ore dall'inizio della prova o che mostrano segni di
malattia devono essere esaminati per escludere infezioni virali;
questo deve essere fatto sia mediante osservazione macroscopica
diretta che microscopica e sia mediante subinoculazione di
sospensioni di tessuti appropriati per via intracerebrale ed
intraperitoneale in almeno altri cinque topini neonati, i quali
dovranno essere osservati giornalmente per quattordici giorni.
Il risultato è favorevole se almeno l'80% dei topi
originariamente inoculati rimane sano e sopravvive per tutto il
periodo di osservazione senza che nessuno di essi mostri segni di
infezione da agenti estranei attribuibili alla sospensione del
miscuglio.
4) Prove in cavie.
Un campione della sospensione del miscuglio deve essere saggiata
petr escludere la presenza del Mycobacterium tuberculosis o di altri
agenti estranei inoculando per via intraperitoneale 5.0 ml in
ciascuna di almeno cinque cavie del peso di 350-500 g. Gli animali
devono essere osservati per almeno quarantadue giorni durante i quali
nessuna deve morire o mostrare segni di malattia. Tutte le cavie che
muoiono nelle prime ventiquattro ore dalla prova o che mostrano segni
di malattia devono essere esaminate macroscopicamente ed i tessuti
devono essere esaminati sia microscopicamente che con metodi
colturali per mettere in evidenza infezioni da M. tuberculosis. Gli
animali che sopravvivono dopo il periodo di osservazione devono
essere osservati macroscopicamente mediane autopsia.
Il risultato è favorevole se almeno l'80% delle cavie inoculate
rimangono sane e sopravvivono durante il periodo di osservazione
senza mostrare segni di infezione con M. tuberculosis o altri agenti
avventizi attribuibili alla sospensione del miscuglio.
La prova può essere eseguita anche usando il pellet ottenuto
centrifugando 100 ml di sospensione del miscuglio e risospendendolo
in 30 ml del supernatante. Va misurata giornalmente la temperatura
rettale delle cavie per le prime tre settimane.
Si possono usare anche terreni colturali per mettere in evidenza
la presenza del M. tuberculosis.
d) Controllo della sospensione del miscuglio dopo la filtrazione.
La sospensione del miscuglio deve essere filtrata attraverso un
filtro che trattenga batteri ed altri grandi microorganismi.
Il campione della sospensione del miscuglio da filtrare deve
essere preso immediatamente dopo la filtrazione e, se non è
esaminato immediatamente, deve essere tenuto ad una temperatura
inferiore a - 20 C finchè le prove descritte più sotto non siano
espletate.
a) Prova di identità.
Il tipo di poliovirus nella sospensione del miscuglio filtrato
deve essere identificato sierologicamente, assicurandosi che i sieri
usati siano monospecifici mediante titolazione di questi contro i
virus omo - ed eterotipici di titolo conosciuto.
b) Concentrazione virale.
La determinazione della quantità di poliovirus infettante per ml
della sospensione del miscuglio filtrato deve essere eseguita in
colture cellulari. La determinazione può essere fatta come PFU/ml o
come TCID50/ml ed essere basata sull'uso di intervalli di diluizione
di dieci volte con dieci tubi per diluizione in tubi o piatre per
microtitolazioni che diano la medesima precisione.
La concentrazione del virus determinata da questa prova deve
essere la base per la quantità del virus usato nelle prove di
neurovirulenza in scimmie e per preparare il miscuglio finale. Si
raccomandano i dettagli adeguati per eseguire la prova (Appendix 4
del WHO Thirty-third Report Technical Report Series No. 687, 1983,
pag. 155).
c) Prova per accertare la costanza delle caratteristiche del virus.
Il poliovirus nella sospensione del miscuglio filtrato deve essere
esaminato confrontandolo o con il lotto della semenza virale o con
una preparazione di virus di referenza (come descritto a pag. 114 del
sopracitato Thirty-third Report del WHO) con riguardo a
caratteristiche sicure, come descritto nelle seguenti sottosezioni.
L'obiettivo di queste prove è quello di assicurarsi che il virus
vaccinale non ha subito cambiamenti durante la sua replicazione nella
preparazione del vaccino.
Dai risultati di queste prove per le successive preparazioni dei
miscugli del vaccino può essere fatto un accertamento critico di
costanza della qualità del vaccino (come descritto a pag. 140 del
sopracitato Thirty-third Report del WHO). L'autorità sanitaria
nazionale di controllo deve avere le preparazioni di lavoro
internazionali di referenza per la neurovirulenza; l'autorità di
controllo ed il produttore devono ciascuno eseguire almeno due prove
per ottenere i dati di linea di base necessari per confrontare la
neurovirulenza dei vaccini da saggiare.
c1) Prove di neurovirulenza in scimmie.
Le scimmie usate per le prove di neurovirulenza dovranno avere gli
stessi requisiti di quelle descritte a pag. 17 del sopracitato
documento del WHO di peso non inferiore a kg 1.5 e non superiore a
2.5-3 kg. La patogenicità della sospensione del miscuglio filtrato
per scimmie Macaca o Cercopithecus deve essere confrontata con quella
di una preparazione virale di referenza, per analizzare la
neurovirulenza, inoculando nella regione lombare del SNC. Un campione
di siero ottenuto da ciascuna scimmia non dovrà contenere anticorpi
alla diluizione di 1:4 quando esaminato contro non più di 1000
TCID50 di ciascuno dei tre tipi di virus.
La prova di neurovirulenza sarà eseguita una volta soltanto. Essa
può essere eseguita solo dal produttore, dopo aver informato
l'autorità sanitaria di controllo (cioè l'ISS) della data della
prova; si dovrà stabilire che i reperti autoptici, le inclusioni e/o
le sezioni istologiche siano resi disponibili per l'ispezione (o
controllo) da parte dell'ISS; se la prova di neurovirulenza è
eseguita dal laboratorio nazionale di controllo le stesse norme
varranno per la ditta produttrice.
1) Numero di scimmie.
Il numero di scimmie inoculate deve essere tale che almeno undici
scimmie positive siano da includere nella valutazione del vaccino ed
almeno undici scimmie positive devono essere incluse per la
preparazione di referenza per i virus di tipo uno e di tipo due. Per
il virus di tipo tre, vi devono essere almeno diciotto scimmie
positive per la referenza ed altre diciotto scimmie positive per il
vaccino. Con la medesima referenza omotipica può essere analizzato
più di un lotto di vaccino. Quando possibile, le scimmie dovrebbero
provenire dallo stesso gruppo di quarantena e dovrebbero essere
distribuite a random tra le preparazioni. Quando non è possibile
usare scimmie provenienti dal medesimo gruppo di quarantena per la
referenza omotipica e per il vaccino da esaminare, un uguale numero
di scimmie provenienti dai due gruppi di quarantena devono essere
inclusi nelle prove con ciascuna delle preparazioni.
Per avere undici e diciotto scimmie positive, di solito si
inoculano dodici e venti scimmie rispettivamente.
Una scimmia positiva è quella in cui le lesioni neuronali
specifiche per il poliovirus sono viste nel SNC. le scimmie sono
addormentate con idrocloruro di chetamina od ogni altra sostanza che
si dimostri adatta. Se una prova viene eseguita in due giorni
differenti, un uguale numero di scimmie devono essere inoculate con
il vaccino e la referenza omotipica in ciascun giorno di lavoro.
2) Quantità di virus contenuti nelle semenze, nelle preparazioni di
referenza e nei vaccini inoculati.
La quantità del virus del vaccino e della preparazione omotipica
di referenza devono essere aggiustate per essere quanto più vicine
possibili e devono contenere tra 10(elevato a 5.5) e 10(elevati a
6.5) TCID 50/0.1ml.
Negli animali deve essere inoculato soltanto una concentrazione
singola di virus.
Deve essere determinato il titolo del virus di un campione della
semenza o della referenza del vaccino che deve essere inoculato nelle
scimmie.
Sarebbe auspicabile che un metodo standard della titolazione della
preparazione del virus venisse scelto mediante uno studio
internazionale di collaborazione.
3) Osservazione delle scimmie.
Tutte le scimmie devono essere osservate per diciasette-ventidue
giorni per i sintomi indicativi di poliomielite o di altra infezione
virale. le scimmie che sopravvivono le prime ventiquattro ore ma
muoiono prima dell'undicesimo giorno dopo l'inoculazione devono
essere autopsizzate per determinare se la poliomielite è stata la
causa della morte. Quelle che sono morte per cause diverse dalla
poliomielite devono essere escluse dalla valutazione. Gli animali
moribondi o che sono gravemente paralizzati devono essere uccisi e
deve essere fatta l'autopsia.
Tutte le scimmie che sopravvivono durante il periodo di
osservazione devono, alla fine, essere uccise e fatta l'autopsia.
Perchè la prova sia valida, almeno l'80% degli animali in ciascun
gruppo deve rimanere sano e sopravvivere durante il periodo di
osservazione.
4) Numero di sezioni esaminate.
L'esame istologico deve essere fatto sul midollo lombare, midollo
cervicale, bulbo superiore ed inferiore, mesencefalo, talamo,
cervelletto, ponte e corteccia cerebrale motrice di ciascuna scimmia.
Le sezioni devono essere tagliate ad uno spessore di
10-15m(Micron) e colorate con gallocianina. Il numero minimo di
sezioni esaminate devono essere:
dodici sezioni prese in modo da rappresentare tutto il
rigonfiamento lombare;
dieci sezioni prese in modo da rappresentare l'intero
rigonfiamento cervicale;
due sezioni dal bulbo (superiore ed inferiore);
una sezione dal ponte e cervelletto;
una sezione dal mesencefalo;
una sezione ciascuna, destra e sinistra, del talamo;
una sezione ciascuna, destra e sinistra, della corteccia
cerebrale.
5) Conteggio dell'attività virale.
Nel valutare l'attività virale nelle emisezioni del midollo
spinale e dell'encefalo, deve essere usato un punteggio di gravità.
Il danno specifico è importante sia che si tratti di infiltrazione
cellulare che di distruzione dei neuroni.
Il sistema di punteggio deve essere:
1) soltanto infiltrazione cellulare (questo non è sufficiente
per considerare le scimmie come positive);
2) infiltrazione cellulare con minimo danno neuronale;
3) infiltrazione cellulare con esteso danno neuronale;
4) danno neuronale massivo con o senza infiltrazione cellulare.
I punteggi ottenuti devono essere registrati su una scheda
standard per il produttore e per l'autorità nazionale sanitaria di
controllo. (Vedi appendice 5 e 7 a pag. 157 e 163-164 rispettivamente
del WHO Technical Report Series No. 687, 1983).
Una scimmia con lesioni neuronali nelle sezioni, ma che non mostra
il tragitto dell'ago, deve essere considerata positiva. Una scimmia
che mostra il tragitto dell'ago nelle sezioni, ma non le lesioni
neuronali, non deve essere considerata positiva.
Una sezione che mostra danno dovuto al trauma, ma non mostra
lesioni specifiche da virus, non è inclusa nel punteggio. Le
severità dei punteggi sono basate sulle letture delle emisezioni
delle sezioni istologiche lombari (L), cervicali (C) e del cervello
(B). I punteggi delle lesioni (LS) = Lesion Score per ciascuna
scimmia positiva sono calcolati come segue:
Sommatoria Sommatoria Sommatoria
(di punteggi La) (di punteggi C) (di punteggi B)
LS = ---------------- + --------------- + ----------------- :3
N. di emisezioni N. di emisezioni N. di emisezioni
e viene calcolata una media di punteggi di lesioni per ciascun gruppo
di scimmie positive.
6) Valutazioni del test di neurovirulenza.
La valutazione dell'attività virale nella preparazione del
vaccino ed in quella di referenza deve essere confrontata con
l'attività nel rigonfiamento lombare del midollo ed il grado di
diffusione dell'attività da questa regione al rigonfiamento
cervicale e al cervello.
L'accettabilità o il rifiuto del vaccino deve essere basato sul
punteggio totale di tutti gli animali saggiati. Gli animali singoli
che mostrano un'attività insolitamente alta, sia nella regione
lombare o nella diffusione, devono essere anche presi in
considerazione nella valutazione finale.
Le prove del miscuglio filtrato sono favorevoli se il numero
richiesto di animali è positivo e se nessuno dei reperti clinici ed
istopatologici mostrano differenze significative nella patogenicità
tra il virus vaccinale ed il materiale di referenza.
Prima si valuta se la referenza utilizzata nel controllo ha dato
risultati compatibili con precedenti saggi della referenza stessa
(sono necessari almeno quattro saggi), quindi si valuta se la
differenza osservata tra la referenza e il vaccino è superiore a
opportuni coefficienti costruiti utilizzando la varianza che si
ottiene considerando le prime prove della referenza ("varianza
combinata") seguendo il seguente schema:
a) verifica della validità della referenza: si calcola la media
delle medie del punteggio delle lesioni delle referenze precedenti,
M, e la varianza combinata, S(Elevato al Quadrato), quindi si
considerano i limiti superiore ed inferiore che per i tipi 1 e 2 sono
M(Più o Meno)S, essendo S la radice quadrata della varianza
combinata, mentre per il tipo 3 sono M+S e M-(1/2)S. La referenza del
controllo viene accettata se è compresa nei due limiti fissati;
b) sempre utilizzando la varianza combinata si calcolano i
coefficienti di C1 = 2.3 x radice quadrata 2S/N1,C2 = 2.6 x radice
quadrata 2S/N1e C3 = 1.6 x radice quadrata 2S/N2 essendo N1 il numero
di scimmie inoculate per la prova di neurovirulenza del vaccino da
controllare e N2 il numero di scimmie usate in due prove se il primo
deve essere ripetuto. Se la differenza tra la media del "punteggio
delle lesioni", X test, del vaccino da controllare e la media del
"punteggio delle lesioni", X ref, della referenza del vaccino attuale
è inferiore a C1 il vaccino è accettato; se la differenza è
compresa tra C1 e C2 è necessario effettuare un'altra prova di
neurovirulenza con il vaccino da controllare e con la referenza,
quindi si considerano le medie corrispondenti per la referenza e per
il vaccino combinando le due prove e se la differenza è inferiore a
C3 il vaccino si accetta, se la differenza è maggiore di C3 non ha
superato il controllo.
(Le linee guida per la determinazione dell'accettabilità dei
vaccini sono esemplificate nell'appendice 6, pag. 158-162, del WHO
Technical Report Series No. 687, 1983).
Prove in vitro.
Il virus nella sospensione del miscuglio filtrato deve essere
esaminato per la proprietà che ha di riprodursi alle temperature di
36 C e 40 C per i tipi 1 e 2 e 36 C e 40.3 C per il tipo 3
(rct/40 marker) in confronto o con il lotto di semenza virale o con
una preparazione di virus di referenza per le prove del marcatore e
con gli adatti ceppi di poliovirus rct/40- e rct/40+ del medesimo
tipo. Le temperature di incubazione usate in questa prova devono
essere controllate all'interno di (Più o Meno) 0.1 C.
La sospensione del miscuglio filtrato dà risultato favorevole se
sia il virus della sospensione del miscuglio che quello nel materiale
della appropriata referenza hanno un titolo, determinato a 36 C, di
almeno centomila volte superiore rispetto a quello determinato alla
temperatura più elevata. A meno che i titoli ottenuti per tutti i
virus di referenza non mostrino i valori aspettati, la prova deve
essere ripetuta.
Il titolo del virus, alla più alta temperatura, non deve essere
superiore a 10 TCID50/ml o 10PFU/ml.
Deve essere inclusa nella prova una temperatura intermedia nella
regione tra 39.2-39.5 C in cui il titolo del materiale di referenza
deve essere ridotto di un fattore tra mille e centomila volte il suo
valore a 36 C.
Lo scopo è di ottenere rapporti definiti per le capacità
riproduttive della sospensione del miscuglio e del materiale di
referenza in gamme di temperature in modo tale che possa essere fatto
un più accurato confronto. Le autorità sanitarie nazionali di
controllo dovranno approvare le preparazioni dei virus di referenza
ed i ceppi di virus appropriati rct/40+ per questa prova, o meglio,
fornirli alle ditte produttrici (come previsto dal WHO Technical
Report Series, Thirty-third, 687, 1983, pagine 114-115).
Inoltre, le ditte produttrici devono eseguire almeno un'altra
prova per un marcatore genetico, poichè può avvenire un cambiamento
genetico che può non essere svelato dalla sola prova del marker
rct/40. Le altre prove usate di solito sono quelle basate sullo
studio del carattere antigenico del ceppo, o le prove per la
sensibilità di riproduzione a differenti concentrazioni di
bicarbonato di sodio (d-marker).
La preparazione del miscuglio finito deve essere eseguita in modo
tale da evitare la contaminazione del prodotto. La diluizione e le
procedure di mescolamento devono essere approvate dalle autorità
sanitarie nazionali di controllo.
Ogni sostanza che può essere aggiunta al prodotto nel preparare
il miscuglio finale deve essere approvata dall'autorità nazionale di
controllo e deve essere usata ad una concentrazione tale da non
diminuire la sicurezza e l'efficacia del vaccino.
Devono essere eseguite prove per la sterilità verso i batteri e
miceti (secondo quanto stabilito dal WHO Technical Report Series, No.
530, 1973, pag. 48).
I requisiti concernenti la riempitura ed i contenitori del vaccino
liquido devono essere quelli dati dal WHO (Technical Report Series,
No. 687, alle pagine 135-136-137-138-139 e ai riferimenti precedenti,
ivi riportati.
Prove di controllo sul prodotto finito.
Devono essere presi campioni da ciascun lotto riempito per le
seguenti prove:
1) Prova di identita':
il tipo o i tipi di poliovirus devono essere sierologicamente
identificati. Ci si assicura che i sieri usati siano monospecifici
titolandoli contro i virus omotipici ed eterotipici di titolo
conosciuto.
2) Prove di sterilità per batteri e miceti:
tali prove devono ottenere l'approvazione dell'autorità
sanitaria nazionale di controllo.
3) Titolazione del virus o dei virus:
la determinazione del titolo del poliovirus deve essere fatta
come stabilito dai requisiti del WHO Technical Report Series, No.
687, 1983, pagine 130-131. Nel caso di vaccino contenente più di un
tipo di poliovirus, ciascun tipo deve essere titolato separatamente
usando appropriati sieri monospecifici per ciascun tipo presente. La
concentrazione dei virus come determinata da questa prova deve
essere, sulla base dei rapporti riguardanti la quantità di virus di
ciascun tipo, riferita ai requisiti stabiliti nell'etichettamento.
Per il vaccino finito trivalente la quantità totale dei tre tipi di
poliovirus deve essere per 1 ml non inferiore a 10(elevato a 6.6) e
non superiore a 10(elevato a 7.6); per il tipo 1 tra 10(elevato a
6.4) -10(elevato a 7.4); per il tipo 2 tra 10(elevato a 5.5
-10(elevato a 6.5; per il tipo 3 tra 10(elevato a 6.2 -10(elevato a
7.2 (FDA, 21, 1/4, 1974).
4) Prove di innocuita':
inoculare dieci topi con ml 0.5 e cinque cavie con ml 5 di
vaccino per via endoperitoneale. Gli animali devono sopravvivere
durante tutto il periodo di osservazione di sette giorni.
5) Prove di stabilita':
deve essere determinato dall'autorità sanitaria nazionale di
controllo il più basso limite consentito del titolo del virus nel
vaccino, durante e dopo il periodo di incubazione a 37 C per sette
giorni.
Etichette.
Oltre ai requisiti stabiliti (nel WHO Technical Report Series, No.
323, 1966, pag. 18) si devono aggiungere le seguenti informazioni
nell'etichetta sul contenitore:
la designazione dei ceppi di poliovirus contenuti nel vaccino;
indicare la coltura di tessuto usata (cioè il rene di quale
scimmia);
il tipo e la quantità di qualsiasi stabilizzante o preservante
presente nel vaccino;
il tipo e la quantità di qualsiasi antibiotico usato nella
preparazione del vaccino;
la quantità di virus di ciascun tipo contenuti in una dose umana
raccomandata.
Nel foglietto illustrativo devono essere anche descritti gli
effetti collaterali e il rarissimo evento (No. di casi/No. di
soggetti vaccinati) di una paralisi vaccino-associata sia per i
riceventi il vaccino che per i contatti.
Inoltre, va precisato, che il vaccino liquido, una volta
surgelato, può essere mantenuto ad una temperatura fra + 2 C e + 8
C per trenta giorni; tale vaccino può essere mantenuto per più
lunghi periodi di tempo se è stato aggiunto, durante la lavorazione,
uno stabilizzante adeguato (per es. MgC12B 2M 1ml/ml di vaccino).
Conservazione e data di scadenza.
Il vaccino antipoliomielitico vivo attenuato deve essere
conservato a temperatura non superiore a - 20 C.
Conservato in tali condizioni, "senza mai essere rimosso", sia
pure temporaneamente, il vaccino conserva la validità per due anni a
partire dall'ultima soddisfacente determinazione del titolo eseguita
o stabilita dall'autorità sanitaria nazionale di controllo.
Dal momento in cui viene portato fuori dai congelatori della ditta
produttrice per essere distribuito la durata delle validità è di
dodici mesi, purchè conservato a temperatura non superiore a - 5 C.
Durante il trasporto è necessario che il vaccino sia sempre
mantenuto congelato. La validità del vaccino antipoliomielitico vivo
attenuato è perciò di mesi dodici, a decorrere dal momento in cui
viene portato fuori dalla ditta di produzione, sempre che tale
periodo di dodici mesi rientri nel limite massimo di due anni, come
detto in precedenza.
Ai produttori può essere permesso prolungare la data di scadenza
del vaccino (preparazioni "madri" monotipiche) se i dati appropriati
(titolazione, modalità di conservazione, ecc.) sono sottoposti
all'autorità sanitaria nazionale di controllo.
Campioni per il controllo di Stato.
Il prelevamento della semenza virale e dei campioni di vaccino
antipolio, durante le varie fasi di preparazioni e come prodotto
finito deve essere compiuto da un ufficiale sanitario (per es. medico
regionale, funzionario dell'autorità sanitaria nazionale di
controllo, o altro).
La quantità di ogni campione da prelevare sarà stabilita in base
alle necessità tecniche e comunicata alla ditta interessata.
Per quanto riguarda le ditte estere, saranno esse stesse a
provvedere direttamente all'invio della semenza virale e dei campioni
di vaccino provenienti dalle varie fasi di lavorazione, accompagnati
dai relativi protocolli (di produzione, di controllo della ditta, di
controllo dell'autorità sanitaria di controllo del paese di origine)
e da dichiarazioni giurate.
Una dichiarazione firmata dal funzionario del laboratorio
nazionale di controllo deve essere fornita insieme alla richiesta
degli stabilimenti di produzione e deve certificare se il lotto in
questione incontra tutti i requisiti nazionali come stabiliti dal WHO
Thirty-third Report Technical Report Series No. 687, 1983, pagg.
107-174, WHO Espert Committee on Biological Standardization.
Il certificato deve, inoltre, stabilire la data dell'ultima
determinazione soddisfacente della concentrazione virale, il numero
del lotto, il numero sotto il quale il lotto è stato liberato, ed il
numero che compare sulle etichette dei contenitori; dovrà essere
unita, in aggiunta, una copia del documento ufficiale della
liberazione nazionale.
Lo scopo del certificato è per facilitare lo scambio dei vaccini
poliomielitici (orali) tra i paesi (nazioni).
Liberazione e certificazione.
Un lotto di vaccino deve essere liberato soltanto se adempie ai
requisiti del WHO sopra riportati. Prima della liberazione di ogni
(di qualunque) lotto di vaccino da uno stabilimento di produzione
devono essere applicati i requisiti di costanza della produzione
stabiliti nella parte A, sezione 9.1 dei revised Requirements for
Biological Substances No. I (General Requirements for Manufacturing
Establishments and Control Laboratories) (WHO Technical Report
Series, No. 323, 1966, pag. 19).
Si deve intendere che tali requisiti stabiliti nei WHO Technical
Report Series, precedentemente citati, sono riesaminati ogni due anni
circa e possono mutare, a seconda dei progressi scientifici raggiunti
negli anni, in una o più parti; per tale motivo i controlli e le
disposizioni possono subire modifiche che dovrebbero poter essere
inserite in sostituzione o in aggiunta a queste già stabilite: si
dovrebbe poter procedere alla modifica con una semplice richiesta al
Ministro della sanità - Direzione generale servizio farmaceutico.