Serie Generale n. 243 del 15-10-1999
LEGGI ED ALTRI ATTI NORMATIVI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI
DECRETO 10 settembre 1999, n. 356
Regolamento recante misure per la lotta obbligatoria contro il colpo di fuoco batterico ( Erwinia amylovora ), nel territorio della Repubblica. (GU Serie Generale n.243 del 15-10-1999)
Nota: note: Entrata in vigore del decreto: 16-10-1999

IL MINISTRO
PER LE POLITICHE ARICOLE
Vista la legge 18 giugno 1931, n. 987, e successive modificazioni
ed integrazioni, recante disposizioni per la difesa delle piante
coltivate e dei prodotti agrari dalle cause nemiche e sui relativi
servizi e successive modificazioni;
Visto il regolamento per l'applicazione della predetta legge,
approvato con regio decreto 12 ottobre 1933, n. 1700, e modificato
con regio decreto 2 dicembre 1937, n. 2504;
Vista la direttiva n. 77/93/CEE del Consiglio del 21 dicembre 1976,
concernente le misure di protezione contro l'introduzione negli Stati
membri di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali e
successive modificazioni;
Visto il decreto legislativo 4 giugno 1997, n. 143, recante
"Conferimento alle regioni delle funzioni amministrative in materia
di agricoltura e pesca e riorganizzazione dell'amministrazione
centrale";
Visto il decreto legislativo n. 536 del 30 dicembre 1992 che, in
attuazione della direttiva n. 91/683/CEE, istituisce il Servizio
fitosanitario nazionale;
Visto il decreto ministeriale 31 gennaio 1996, pubblicato nel
supplemento ordinario n. 33 alla Gazzetta Ufficiale n. 41 del 19
febbraio 1996, concernente le misure di protezione contro
l'introduzione e la diffusione nel territorio della Repubblica
italiana di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali;
Visto il decreto ministeriale 27 marzo 1996, pubblicato nella
Gazzetta Ufficiale n. 81 del 5 aprile 1996, concernente la lotta
obbligatoria contro il colpo di fuoco batterico (Erwinia amylovora),
nel territorio della Repubblica e successive modifiche;
Considerata la necessità di aggiornare il decreto ministeriale 27
marzo 1996 succitato, alla luce delle nuove acquisizioni
tecnicoscientifiche;
Udito il parere n. 58/98 espresso nell'adunanza dell'8 ottobre 1998
dal Consiglio superiore dell'agricoltura e delle foreste sullo schema
di decreto ministeriale concernente la lotta obbligatoria contro il
"colpo di fuoco batterico" (Erwinia amylovora);
Visto l'articolo 17, commi 3 e 4, della legge 23 agosto 1988, n.
400;
Udito il parere del Consiglio di Stato n. 52/99 espresso dalla
sezione consultiva per gli atti normativi nell'adunanza del 22 marzo
1999;
Vista la comunicazione al Presidente del Consiglio dei Ministri ai
sensi dell'articolo 17, comma 3, della legge 23 agosto 1988, n. 400,
effettuata con nota n. 7748 del 24 agosto 1999;
Acquisito il parere della conferenza Statoregioni reso nella seduta
del 27 maggio 1999;
A d o t t a il seguente regolamento:
Art. 1.
Scopo generale
1. La lotta contro il batterio Erwinia amylovora, agente del colpo
di fuoco delle pomacee, è obbligatoria nel territorio della
Repubblica italiana al fine di prevenirne la introduzione e la
diffusione.

Art. 2.
Ispezioni sistematiche
1. I servizi fitosanitari regionali devono effettuare ogni anno
indagini sistematiche mirate ad accertare la presenza del batterio
sulle specie di rosacee ospiti, coltivate e spontanee dei generi
Amelanchier, Chaenomeles , Crataegus , Cotoneaster , Cydonia,
Eriobotrya , Malus, Mespillus , Pyracantha , Pyrus , Sorbus e
Stranvaesia, con particolare attenzione ai vivai.
2. Le indagini devono consistere in ispezioni visive delle piante
ospiti, per accertare la presenza dei sintomi di colpo di fuoco, e,
se del caso, in appropriate analisi batteriologiche conformi ai
metodi specificati nell'allegato I.
3. Le ispezioni ufficiali devono essere effettuate, oltre che nei
punti della rete di monitoraggio descritta nell'allegato II, nei
vivai, nei frutteti, nei giardini, nei parchi pubblici e privati e
tra la flora spontanea.
4. I risultati di dette indagini devono essere comunicati al
Servizio fitosanitario centrale entro il 30 dicembre di ogni anno.
5. Gli allegati I e II di cui ai precedenti commi 2 e 3, potranno
essere modificati ed integrati dal Ministero per le politiche
agricole con apposito provvedimento.

Art. 3.
Denuncia dei casi sospetti
1. È fatto obbligo a chiunque denunciare ogni caso sospetto di
colpo di fuoco al Servizio fitosanitario regionale che provvederà ad
effettuare ispezioni visive ed eventuali analisi batteriologiche
ufficiali.
2. Le regioni devono dare massima divulgazione alla conoscenza dei
sintomi e della pericolosità del colpo di fuoco sulle pomacee.
3. In attesa di conferma o smentita di ogni caso sospetto il
Servizio fitosanitario regionale al fine di scongiurare la
disseminazione di Erwinia amylovora può attuare interventi
cautelativi, commisurati al rischio stimato, incluso il divieto di
trasportare in altro luogo materiali vegetali, contenitori, utensili
e macchine dalla azienda, dal vivaio o dall'area in cui si è avuta
la manifestazione sospetta. La pianta o le piante sospette devono
essere contrassegnate, con divieto di contatto e rimozione.

Art. 4.
Accertamento ufficiale di un caso
1. Qualora le analisi batteriologiche ufficiali confermino la
presenza di Erwinia amylovora in un campione di materiale vegetale,
il Servizio fitosanitario regionale deve dichiarare contaminata
l'area od il campo da cui è stato raccolto il campione e provvedere
a far estirpare e distruggere immediatamente ogni pianta visibilmente
infetta. In caso di infezioni o focolai primari in zona
precedentemente indenne i servizi fitosanitari devono far estirpare e
distruggere, in considerazione del rischio fitosanitario, anche le
piante ospiti asintomatiche attorno alle piante visibilmente infette
fino ad un raggio di 10 metri.
2. In caso di vivai, il Servizio fitosanitario regionale può
disporre l'estirpazione e la distruzione delle piante ospiti
asintomatiche per un raggio superiore a 10 metri.
3. Il servizio fitosanitario regionale deve altresì istituire una
zona di sicurezza, effettuare una indagine tecnicoamministrativa per
conoscere l'origine delle piante infette e denunciare immediatamente
ogni caso accertato di colpo di fuoco al Servizio fitosanitario
centrale.

Art. 5.
Zona di sicurezza
1. La zona di sicurezza, comprendente un'area di almeno 3,5
km(elevato a)2 (elevato a) (raggio di almeno 1 km) attorno al punto
del focolaio accertato, deve essere ispezionata con cura e
frequentemente per accertare la presenza di sintomi visivi di colpo
di fuoco nel resto della stagione vegetativa in cui è avvenuto
l'accertamento e per quella successiva; alla terza stagione
vegetativa dalla scoperta, la zona di sicurezza può essere tolta se
non siano stati accertati ulteriori casi; la stessa area deve essere
ispezionata due volte all'anno nei periodi di giugnoluglio e
settembreottobre.
2. La scoperta di altri casi di colpo di fuoco in una zona di
sicurezza deve comportare l'allargamento della stessa zona per almeno
1 km di raggio dal punto di accertamento.

Art. 6.
Trattamento del focolaio
1. Il Servizio fitosanitario regionale deve ispezionare, per il
resto della stagione vegetativa in cui è avvenuto l'accertamento,
tutte le piante ospiti dell'area o del campo dichiarato contaminato,
controllando anche frequentemente le aree limitrofe.
2. Ogni pianta o parte di pianta con sintomi sospetti di colpo di
fuoco deve essere immediatamente estirpata od asportata e distrutta,
senza la necessità di analisi batteriologiche di conferma.
L'asportazione di parti sintomatiche di fusto deve essere effettuata
con taglio ad almeno cinquanta cm dal limite prossimale visibile
della lesione.
3. I servizi fitosanitari regionali devono predisporre specifici
interventi volti alla eradicazione.

Art. 7.
Trasporti vietati
1. Per i 12 mesi successivi alla scoperta dell'ultimo caso
accertato è vietato trasportare fuori dalla zona di sicurezza o
mettervi a dimora piante ospiti di Erwinia amylovora o loro parti
senza preventiva autorizzazione del servizio fitosanitario regionale.
2. Per i 12 mesi successivi alla scoperta dell'ultimo caso
accertato è vietato trasportare fuori dall'area o dal campo
dichiarato contaminato materiale vegetale di piante ospiti di Erwinia
amylovora (inclusi legname, polline, frutti e semi) senza preventiva
autorizzazione del servizio fitosanitario regionale.
3. In deroga al primo comma, il servizio fitosanitario regionale
può autorizzare la commercializzazione di piante ospiti di Erwinia
amylovora o loro parti verso zone non protette dell'Unione europea o
verso Paesi terzi.

Art. 8.
Movimentazione alveari
1. È vietato lo spostamento di alveari, nei periodi a rischio, da
aree o campi contaminati verso aree indenni.
2. I servizi fitosanitari regionali determineranno annualmente i
periodi a rischio e le aree interessate al divieto di movimentazione.

Art. 9.
Distruzione dalle piante infette
1. L'estirpazione di piante, l'asportazione di parti di piante e la
loro distruzione devono essere effettuate a spese del proprietario o
del conduttore sotto il controllo del servizio fitosanitario
regionale. Le parti di piante devono essere accatastate nel punto di
estirpazione delle piante infette o in area limitrofa, e bruciate
fino all'incenerimento.
2. Le piante infette o loro parti non possono essere trasportate
fuori dall'area o dal campo dichiarato contaminato.
3. Al termine delle operazioni tutti gli strumenti di taglio devono
essere sterilizzati in loco per via chimica o fisica.

Art. 10.
Indagine epidemiologica
1. Il servizio fitosanitario regionale, immediatamente dopo
l'accertamento ufficiale di un focolaio primario su vegetali messi a
dimora nei due anni prima in un territorio precedentemente indenne,
deve effettuare un'ispezione presso i vivai delle ditte da cui
provengono le piante infette trovate nell'area o nel campo dichiarato
contaminato, estendendola anche al territorio circostante per un
raggio di 2 km.
2. Fino al termine della stagione vegetativa dell'anno di
accertamento del caso, il servizio fitosanitario regionale deve
effettuare altre due ispezioni nonchè due nell'anno seguente, nei
periodi maggioluglio e settembreottobre. Qualora i vivai della ditta
si trovino in altra regione, deve essere avvertito il servizio
fitosanitario regionale competente per territorio che effettuerà le
dovute ispezioni.
3. I servizi fitosanitari regionali devono trasmettere al servizio
fitosanitario centrale i risultati della indagine epidemiologica.
4. Il servizio fitosanitario regionale competente per territorio
deve rilevare le destinazioni delle altre spedizioni effettuate, a
partire dal mese di settembre dell'anno precedente l'accertamento del
focolaio, dalle ditte di cui al primo comma, dandone comunicazione ai
servizi fitosanitari delle regioni di destinazione.

Art. 11.
Detenzione di colture
1. È vietata la detenzione e la manipolazione di colture di
Erwinia amylovora.
2. Chiunque per mezzo di analisi batteriologiche effettuate in
Italia od all'estero identifichi come Erwinia amylovora un batterio
associato a materiale vegetale presente o prodotto in territorio
italiano deve comunicare immediatamente l'avvenuta identificazione al
servizio fitosanitario regionale competente che provvederà alla
conferma (allegato I).

Art. 12.
D e r o g h e
1. Il servizio fitosanitario centrale può autorizzare, fatte salve
le disposizioni della direttiva 77/93/CEE, deroghe alle disposizioni
dell'articolo 10 del presente decreto per prove o scopi scientifici,
nonchè lavori di selezione varietale purchè tali deroghe non
compromettano il controllo dell'organismo nocivo e non creino rischio
di disseminazione dello stesso (allegato I).

Art. 13.
Cessazione zone di sicurezza
1. Nelle aree non riconosciute più come "zone protette", ai sensi
della direttiva 77/93/CEE, e successive modificazioni, non sussiste
l'obbligo di costituire zone di sicurezza.

Art. 14.
Contributi per l'estirpazione
1. Le regioni al fine di prevenire gravi danni per l'economia di
una zona agricola possono stabilire interventi di sostegno alle
aziende per l'estirpazione dei frutteti colpiti dalla malattia.

Art. 15.
Denuncia degli inadempienti
1. Fatta salva l'applicazione dell'articolo 500 del codice penale
è facoltà delle regioni stabilire sanzioni amministrative per gli
inadempienti alle disposizioni di cui al presente decreto.
2. Il decreto ministeriale 27 marzo 1996, e successive modifiche,
citato nelle premesse è abrogato.

Art. 16.
Entrata in vigore
Il presente regolamento entra in vigore il giorno successivo alla
sua pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Il presente decreto, munito del sigillo dello Stato, sarà inserito
nella Raccolta ufficiale degli atti normativi della Repubblica
italiana. È fatto obbligo a chiunque spetti di osservarlo e di farlo
osservare.
Roma, 10 settembre 1999
Il Ministro: De Castro
Visto, il Guardasigilli: Diliberto
Registrato alla Corte dei conti il 4 ottobre 1999
Registro n. 2 Politiche agricole e forestali, foglio n. 265

Allegato I
MATERIALI E METODI
1. Isolamento ed identificazione.
1.1. Prelievo dei tessuti infetti dal materiale sintomatico.
Nel corso della stagione vegetativa il materiale sintomatico può
consistere in fiori, frutti, foglie, germogli, branche e tronchi, in
presenza od in assenza di essudato. In presenza di essudato,
prelevarne con ansa qualche gocciola e sospenderlo in 3 ml di acqua
distillata sterile fino ad ottenere una sospensione leggermente
opalescente. In assenza di essudato, si trova il limite delle lesioni
e si asportano con bisturi sterile 5 pezzetti di corteccia al bordo
dei tessuti infetti, dopo aver asportato gli strati superficiali
suberificati. Si preferiscano aree umide ed isole arrossate su
branche e tronchi, aloni idropici su fiori e frutti.
1.2. Isolamento.
Macerare 5 pezzetti di tessuto (isodiametrici, di circa 3 mm) in
acqua distillata sterile in mortaio, dapprima in 0,1 ml e poi dopo
aggiunta di 0,4 ml. Preparare una diluizione decimale in acqua
distillata sterile (1:9; v:v) della sospensione dei pezzetti o delle
gocce di essudato. Inseminare le sospensioni concentrate e le loro
diluizioni decimali su piastre di agar nutritivo al saccarosio (ANS)
e mettere le piastre ad incubare in aerobiosi a 27 C. Dopo 48 ore
individuare le colonie biancastre, aventi 3-5 mm di diametro, elevate
a forma di cupola, lucenti e di aspetto mucoso. Siffatte colonie
diconsi comunemente levaniformi. Purificare le colonie levaniformi su
piastre di ANS con almeno due trapianti successivi di colonia singola
a morfologia tipica. Ottenere da ogni isolamento almeno 5 colture
pure.
Conservare le colture pure a --80 C in brodo nutritivoglicerina
(15%) od a 4 C liofilizzate.
1.3. Identificazione.
Sottoporre le colture pure ai saggi: presenza di ossidasi,
produzione di pigmento fluorescente, ipersensibilità su foglie di
tabacco, patogenicità su pere ed agglutinazione su vetrino con
antisiero specifico per Erwinia amylovora.
Le colture a colonie levaniformi, ossidasi negative, non producenti
pigmento fluorescente, causanti ipersensibilità su tabacco, marciume
ed essudato su pere ed agglutinate dall'antisiero specifico possono
essere identificate provvisoriamente come Erwinia amylovora.
L'identificazione provvisoria è necessaria e sufficiente per la
definizione di una zona contaminata.
1.4. Conferma della identificazione.
Chiunque identifichi come Erwinia amylovora un batterio isolato da
materiale vegetale deve inviare la coltura pura ad uno dei seguenti
centri diagnostici nazionali per la conferma della identificazione.
Istituto di patologia vegetale - Laboratorio di fitobatteriologia
Via Filippo Re, 8 - 40126 Bologna
Istituto di patologia vegetale
Via Valdisavoia, 5 - 95123 Catania
Dipartimento di protezione delle piante dalle malattie
Via Amendola, 165/A - 70126 Bari
Per la spedizione ogni coltura pura, fresca o liofilizzata, deve
essere imballata entro un incavo di pannello di polistirolo di
adeguato spessore, pressato ai lati da due pezzi di cartone incollati
tra loro lungo i bordi mediante nastro adesivo. La coltura pura
imballata deve essere messa in sacchetto di polietilene sigillato e
spedito con urgenza entro busta foderata. Una spedizione può
comprendere più colture. Il centro diagnostico deve essere informato
della spedizione con almeno tre giorni di anticipo.
Il direttore dell'istituto, cui afferisce il centro diagnostico,
comunica per iscritto agli interessati l'esito dei saggi di conferma
entro 14 giorni dal ricevimento delle colture pure. La risposta può
essere ritardata di 7 giorni in caso di contaminazione delle colture.
Presso i centri diagnostici la identificazione è confermata
mediante saggi comparativi dei profili elettroforetici delle proteine
cellulari totali o dei profili degli esteri metilici dei grassi
cellulari totali o per la presenza di peculiari sequenze
nucleotidiche mediante loro ampliflicazione con reazione a catena
della polimerasi conformemente alle tecniche più aggiornate ed
affidabili indicate dalla letteratura specialistica.
1.5. Standard di riferimento.
Ogni saggio morfologico, fisiologico, patogenetico, immunologico e
molecolare di identificazione deve essere fatto in presenza di
appropriati controlli positivi e negativi, rappresentati da colture
pure o loro estratti.
I protocolli della tecnica di isolamento e dei saggi di
identificazione sono oggetto di corsi di addestramento a numero
chiuso presso i centri diagnostici, che provvedono a predisporre,
conservare ed inviare su richiesta gli standard di riferimento.
Le spese per la partecipazione ai corsi di addestramento e per
l'acquisizione degli standard di riferimento sono a carico degli
interessati.
2. Formulario e protocolli.
2.1. Agaracqua.
Ha la seguente composizione: Agar 0,5 g; Acqua distillata, 100 ml.
Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti.
2.2. YDC-agar.
Ha la seguente composizione: Estratto di lievito, 1 g; Glucosio, 2
g; Carbonato di calcio (Polvere finissima; Merck 2063), 2 g; Agar 1,5
g; Acqua distillata, 100 ml. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15
minuti. Agitare bene per tenere in sospensione il carbonato di calcio
prima di farla solidificare a becco di clarino in tubo.
2.3. Colture batteriche.
Le colture pure dei batteri isolati e le colture di riferimento
possono essere coltivate ordinariamente su strisci di YDC-agar in
tubo incubate a 25-27 C e conservate temporaneamente a temperature
ambiente o più a lungo a 4 C. Su YDC agar Erwinia amylovora ha buona
crescita già dopo 24 ore. Per il saggio presenza di ossidasi si
allevino le colture su strisci di KB agar (vedi produzione di
pigmento fluorescente).
2.4. Agar nutritivo al saccarosio (ANS).
Aggiungere 50 g di saccarosio ad ogni litro di agar CM3 (Oxoid) e
sterilizzare in autoclave a 121 C per 15 minuti; alternativamente
preparare il substrato aggiungendo 8 g di Bacto-Nutrient Broth
(Difco; Cat. 0003-17-8), 50 g di saccarosio e 15 g di Agar ad 1 lt di
acqua distillata. Dopo aver sciolto l'agar a 100 C, regolare a pH 7
con aggiunta di 3N NaOH. Sterilizzare in autoclave a 121 C per 15
minuti.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Pseudomonas fluorescens.
Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae producono su
ANS colonie levaniformi.
2.5. Presenza di ossidasi.
Preparare 10 ml di soluzione 1% di tetrametilpfenilendiammonio
cloruro (es. Merck 821102) (TMFD) in acqua distillata entro un tubo
accuratamente pulito. Ritagliare pezzetti (circa 3 X 3 cm) di carta
Whatman n. 1 pulita e riporli entro una capsula petri sterile. Dopo
aver posto un pezzetto di carta su una superficie di vetro pulita
sterile, depositare al centro del pezzetto una goccia della soluzione
di TMFD. Mentre la soluzione sta diffondendo radialmente e la carta
è ben impregnata, spalmare al centro della area umida una ansata
della coltura pura da identificare, avente 18-24 ore di età. Usare
una ansa di platino. In presenza di ossidasi, entro 10 secondi
compare una macchia porpora violacea scura nell'areola dove è stata
deposta la massa batterica. Si ha reazione debolmente positiva quando
la macchia compare dopo 10-30 secondi. Se non compare macchia entro
30 secondi, la reazione è negativa.
Controllo negativo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo positivo: Pseudomonas fluorescens.
2.6. Produzione di pigmento fluorescente.
Si saggia sull'agar nutritivo B di King, Ward e Raney (KB agar)
avente la seguente composizione: Proteose Peptone (Difco, Cat.
0122-17-4), 20 g; Glicerina 10 g; K 2 HPO 4 , 1,5 g; MgSO 4 .7H 2 O,
1,5 g; Agar 15 g; Acqua distillata, 1 litro.
Dopo aver sciolto l'agar a 100 (elevato a)0 C, regolare a pH 7,2
con aggiunta di 3N NaOH. Sterilizzare in autoclave a 121 (elevato a)0
C per 15 minuti.
Attorno alle colonie delle pseudomonadi fluorescenti cresciute su
questo substrato si ha diffusione radiale di pigmenti gialli o verdi
o bruni che a luce ultravioletta hanno fluorescenza verde o bleu.
L'alone fluorescente è visibile spesso anche alla luce normale di
laboratorio. Si tenga presente che certi isolati di Pseudomonas
syringae non producono pigmento fluorescente su KB agar o lo
producono con ritardo e la loro reazione può essere interpretata
come negativa.
La presenza di aloni fluorescenti deve essere osservata dopo almeno
3 giorni di incubazione a 27 C.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Xanthomonas campestris pv. pruni.
2.7. Patogenicità su pera.
Si usino pere immature di cv. Passa Crassana o Conference da 1-2
settimane dopo la caduta dei petali fino a 2-3 settimane prima della
maturità fisiologica. Le piccole pere verdi (maggior diametro di 2-3
cm) possono essere raccolte, immerse in soluzione di ipoclorito
sodico per 5 minuti, sciacquate in acqua distillata sterile,
asciugate con carta bibula sterile e conservate in frigorifero a 4 C
entro contenitori chiusi per parecchi mesi (non oltre gennaio
dell'anno successivo). Durante questo periodo esse tendono a maturare
gradualmente e divengono man mano meno idonee al saggio. Possono
esser usate anche pere delle stesse cultivar conservate nei
frigoriferi industriali. Per il saggio si usino perine intere
immature oppure fette trasversali tagliate, capsule Petri aventi sul
fondo carta bibula immersa in 2-3 mm di acqua distillata. Le perine
siano deposte sulla cavità di piccole capsule Petri già predisposte
sulla carta bibula in modo che il frutticino non sia a contatto con
l'acqua. Le fette di pera, aventi spessore di circa 1 cm, vanno
adagiate su uno strato di agar acqua sterile solidificato al fondo di
capsule Petri di adeguate dimensioni. La conservazione entro queste
capsule Petri assicura alle perine (od alle fette) una adeguata
camera umida postinoculazione.
Per l'inoculazione si conficchi per 3-4 mm la punta di un ago
attraverso una goccia di 10 m l di sospensione batterica
(concentrazione 10(elevato a)8 batteri/ml) entro i tessuti della
perina (o della fetta). Su ogni perina (o fetta) possono aversi 4
punti di inoculazione per isolato. Dopo l'inoculazione le capsule
Petri siano conservate a 27 C entro sacchetti di polietilene chiusi.
In presenza di Erwinia amylovora si può osservare sulle perine (o
sulle fette) dopo 3-5 giorni la presenza di gocciole lattiginose di
essudato. Una perina inoculata con Erwinia amylovora tende a marcire
per intero entro una settimana. L'area di perina che Erwinia
amylovora riesce ad infettare a seguito di inoculazione sperimentale
è tanto più grande quanto più giovane è il frutto; di conseguenza
le lesioni tendono ad essere circoscritte man mano si avvicina la
maturità di raccolta.
Gli isolati di Pseudomonas syringae causano entro 1-7 giorni sulle
perine (o sulle fette) aree imbrunite di aspetto secco attorno al
foro d'inoculazione, senza alcuna produzione di essudato. Per gli
isolati di piante ospiti diverse da biancospino e pero è opportuno
ripetere a dose doppia le prove di patogenicità su perine o fette di
pera, nei casi in cui la prima inoculazione non causa alcun sintomo
riferibile ad Erwinia amylovora.
Controllo positivo: Erwinia amylovora (Ceppo padano).
Controllo negativo I: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo II: Acqua distillata.
2.8. Antisiero.
Si usi un antisiero od anticorpi monoclonali preparati usando come
antigene una coltura pura o molecola purificata di Erwinia amylovora,
messi a punto per la reazione di agglutinazione, di cui sia stata
saggiata la specificità con un congruo numero di batteri saprofiti
associati a pomacee.
Antisiero o anticorpi monoclonali possono essere richiesti ai
centri diagnostici od acquistati in commercio da ditte specializzate.
L'antisiero e gli anticorpi monoclonali devono essere conservati ed
usati secondo le indicazioni dei centri diagnostici o delle ditte
produttrici.
2.9. Agglutinazione su vetrino.
Si usino vetrini portaoggetto per microscopia, trasparenti, puliti,
ma non troppo sgrassati per evitare che le gocce d'acqua depositate
sopra si espandano troppo e creino un film troppo sottile.
Depositare separatamente su uno stesso vetrino una goccia di
antisiero specifico diluito circa da 1:20 a 1:30 (v:v) con soluzione
fisiologica (0,85 g di NaCI in 100 ml di acqua distillata) ed una
goccia di sospensione densa di cellule del batterio da identificare.
La sospensione deve essere lattiginosa, ben visibile ad occhio nudo,
ed avere una concentrazione dell'ordine di 10(elevato a)10
batteri/ml. Mescolare delicatamente con ansa sterile le due gocce e
poi imprimere al vetrino un movimento di oscillazione. In caso di
agglutinazione, si nota la formazione di flocculi biancastri entro
1-2 minuti.
Se la flocculazione è immediata, i flocculi sono vistosi e
grossolani. Se la flocculazione è ritardata (dopo circa 30 secondi),
i flocculi sono piccoli e minuti, osservabili facendo scorrere a film
lungo il vetrino la mistura di reazione.
Controllo positivo: Erwinia amylovora (ceppo padano).
2.10. Ipersensibilità su foglie di tabacco o baccelli verdi di
fagiolo.
Il saggio si effettua su foglie adulte di piante di tabacco
(Nicotiana tabacum L.), preferibilmente delle cultivar Samsun o White
Burley.
Si prepari in acqua distillata sterile in provetta di vetro una
sospensione di coltura pura, avente concentrazione dell'ordine di
10(elevato a)8 batteri/ml. La coltura deve essere ben cresciuta ed
avere 24h di età. Questa concentrazione è riconoscibile con buona
approssimazione allorchè osservando controluce si nota che la
torbidità è uniforme ed intensa e che, agitando la provetta, i
vortici generati dalle cellule sospese sono facilmente distinguibili;
i vortici non sono più osservabili quando la concentrazione è di
10(elevato a)7 batteri/ml o di 10(elevato a)9 batteri/ml.
Al mattino, con siringa da 1 ml ed ago sottile (numeri da 16 a 20)
si infiltri la sospensione appena preparata in zona circoscritta di
una area internervale di foglia; più colture possono essere
infiltrate in altrettante aree internervali di una stessa foglia.
L'area internervale infiltrata deve essere marcata con appropriata
etichetta autoadesiva al bordo della foglia.
Durante l'infiltrazione è opportuno disporre sotto alle foglie ed
attorno alla pianta fogli di materiale assorbente (es. carta bibula,
giornali pluristratificati) in modo da raccogliere eventuali gocce
disperse.
Dopo l'infiltrazione, asciugata la superficie della foglia da
eventuali gocce residue di sospensione batterica con pezzetti di
carta bibula, le piante siano conservate a temperatura di 22-28 C con
alternanza di ore di luce (da 8 a 14) e di buio.
In caso di ipersensibilità, già dopo 24 ore si osserva che la
intera zona internervale infiltrata con la coltura pura è collassata
ed imbrunita. Questa risposta è comunemente indicata come necrosi
ipersensibile confluente. Nei giorni successivi la zona ipersensibile
dissecca ulteriormente ed assume consistenza papiracea.
Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. syringae (od altre
patovar), ma non i batteri saprofiti, causano necrosi confluente
ipersensibile.
Controllo positivo: Pseudomonas syringae pv. syringae.
Controllo negativo: Acqua distillata.
2.11. Distruzione dei materiali infetti o contaminati.
I campioni di piante infette, le piante o le foglie di tabacco, le
perine o le fette di pera usati per gli isolamenti e
l'identificazione, tutti i materiali assorbenti contaminati e
qualsiasi altro oggetto venuto in contatto con i germi di Erwinia
amylovora devono essere raccolti in sacchetti autoclavabili e
sterilizzati in autoclave a 121 C per 15 minuti.

Allegato II
1. Rete nazionale di monitoraggio.
Deve essere approntata secondo le indicazioni della circolare
ministeriale del 4 agosto 1991, integrate da quelle del presente
allegato.
La rete nazionale si compone di tre reti interregionali
continentali (settentrionale, tirrenica e adriatica) e di due reti
insulari (Sardegna e Sicilia). La rete interregionale settentrionale
è composta dalle reti delle regioni Emilia-Romagna, Friuli-Venezia
Giulia, Liguria, Lombardia, Marche, Piemonte, Val d'Aosta, Veneto e
delle province autonome di Trento e di Bolzano. La rete
interregionale tirrenica è composta dalle reti delle regioni:
Calabria, Campania, Lazio, Toscana ed Umbria. La rete interregionale
adriatica è composta dalle reti delle regioni Abruzzo, Lucania,
Molise e Puglia.
2. Reti regionali di monitoraggio.
Ogni rete regionale è costituita da punti e linee, è gestita dal
servizio fitosanitario regionale e si avvale di un centro
diagnostico.
2.1. Punti di monitoraggio.
Sono piante ospite di Erwinia amylovora, singole od a gruppi,
distanti tra loro circa km 5. Devono essere disposte preferibilmente
lungo vie di comunicazione ed essere facilmente identificabili da un
ispettore in auto. Ogni punto ha una propria scheda su cui sono
annotati coordinate geografiche, punti di riferimento, fotografie,
strade di accesso e risultati delle ispezioni.
2.2. Linee di monitoraggio.
Sono costituite da piante ospite di Erwinia amylovora distribuite
continue od a breve interdistanza su lunghi tratti di strade,
autostrade, corsi d'acqua e linee ferroviarie. Ogni linea ha una
propria scheda come i punti.
2.3. Ispettori.
Sono membri del servizio fitosanitario regionale o persone da esso
autorizzate a compiere le ispezioni dei punti e delle linee.
2.4. Ispezioni.
Sono fatte in auto lungo itinerari prestabiliti secondo la
distribuzione dei punti e delle linee di monitoraggio nel territorio.
Ogni punto o linea è ispezionato due volte all'anno, nei periodi
maggioluglio e settembreottobre.
2.5. Centri diagnostici.
Ogni rete regionale ha un centro diagnostico cui gli ispettori
inviano i campioni sospetti. I centri effettuano l'analisi
batteriologica dei campioni, comprendente l'isolamento di Erwinia
amylovora e la sua identificazione provvisoria per la costituzione
delle zone contaminate.