Serie Generale n. 291 del 13-12-1993
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLA SANITA'
MINISTERO DELLA SANITA'
ORDINANZA 7 dicembre 1993
Limiti di Listeria monocytogenes in alcuni prodotti alimentari. (GU Serie Generale n.291 del 13-12-1993)

IL MINISTRO DELLA SANITÀ
Visto l'art. 5, lettera c), della legge 30 aprile 1962, n. 283;
Vista l'ordinanza ministeriale 11 ottobre 1978, recante i limiti di
cariche microbiche tollerabili in determinate sostanze alimentari e
bevande, e le successive modifiche ed integrazioni;
Visto il parere del Consiglio superiore di sanità espresso in data
2 novembre 1993;
Vista la direttiva n. 93/43/CEE del Consiglio sull'igiene dei
prodotti alimentari;
Tenuto conto delle diverse tecnologie impiegate nella preparazione,
trasformazione e conservazione dei prodotti alimentari;
Ritenuto necessario ed urgente, ai fini di tutela della salute
pubblica nel rispetto della libera circolazione dei prodotti
alimentari nel mercato unico CEE, di adottare i limiti relativi alla
presenza di Listeria monocytogenes in alcuni prodotti alimentari;
Rilevato che i citati motivi di urgenza precludono il conformarsi a
tutte le modalità procedurali concernenti l'informazione della CEE
prevista dalla direttiva del Consiglio del 29 marzo 1983, n.
83/189/CEE, e ferma restando la disponibilità a valutare ogni
eventuale osservazione della CEE e ad emanare gli atti aggiuntivi che
si rendessero all'occorrenza necessari;
Visto l'art. 32 della legge 28 dicembre 1978, n. 833;
Ordina:
Art. 1.
1. La tabella A dell'ordinanza ministeriale 11 ottobre 1978 viene
integrata con l'aggiunta, alla fine della tabella stessa, di quanto
riportato nell'allegato 1.

Art. 2.
1. La tabella B dell'ordinanza ministeriale 11 ottobre 1978 viene
integrata con l'aggiunta, alla fine della tabella stessa, di quanto
riportato nell'allegato 2.

Art. 3.
1. Il primo periodo della tabella C dell'ordinanza ministeriale 11
ottobre 1978 è sostituito dal periodo seguente:
" a) MODALITÀ DI PRELIEVO DEI CAMPIONI DELLE SOSTANZE ALIMENTARI
DI CUI ALLA TABELLA B, PUNTO II LETTERA A) (grandi confezioni di
prodotti d'uovo), PUNTO III, LETTERA A), PUNTO IV, LETTERA A) (grandi
confezioni o confezioni multidosi di gelati e di preparati per
gelati) E PUNTO V, LETTERE B) E C) (grandi confezioni o pezzature)".
2. La tabella C dell'ordinanza ministeriale 11 ottobre 1978 viene
integrato con l'inserzione, alla fine della lettera b), di quanto
segue:
"3. Campioni di alimenti sfusi o preconfezionati destinati per loro
natura ad essere consumati previa cottura o che rechino sulla
confezione la dizione 'da consumare previa cotturà (esclusi il latte
e derivati del latte).
Gli alimenti crudi non sottoposti a trattamento di riscaldamento e
gli alimenti precotti o pastorizzati devono essere mantenuti ad una
temperatura non superiore a + 4 C per tutto il periodo intercorrente
tra il prelevamento o l'espletamento delle analisi. Gli alimenti
congelati o surgelati devono essere mantenuti ad una temperatura non
superiore a - 18 C per tutto il periodo intercorrente tra il
prelevamento e l'espletamento delle analisi".
3. La tabella C dell'ordinanza ministeriale 11 ottobre 1978 viene
integrata con l'aggiunta, al termine del punto IV, di quanto
riportato nell'allegato 3.
La presente ordinanza sarà pubblicata nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana.
Roma, 7 dicembre 1993
Il Ministro: GARAVAGLIA

ALLEGATO 1
V. - ALIMENTI SFUSI O PRECONFEZIONATI DESTINATI PER LORO NATURA AD
ESSERE CONSUMATI PREVIA COTTURA O CHE RECHINO SULLA CONFEZIONE
LA DIZIONE "DA CONSUMARSI PREVIA COTTURA" (ESCLUSI IL LATTE E
I DERIVATI DEL LATTE).
=====================================================================
Prodotti Determinazioni
alimentari analitiche N (*) Limiti di
tolleranza
_____________________________________________________________________
a) Alimenti crudi non
sottoposti a
trattamento di
riscaldamento Listeria
monocytogenes 3 u.c. non oltre 11/g
in 1 u.c.
non oltre 110/g
in 2 u.c.
b) Alimenti congelati
o surgelati Listeria
monocytogenes 5 u.c. non oltre 11/g
in 2 u.c.
non oltre 110/g
in 3 u.c.
c) Alimenti precotti
o pastorizzati Listeria
monocytogenes 5 u.c. non oltre 11/g
in 4 u.c.
non oltre 110/g
in 1 u.c.

ALLEGATO 2
CAMPIONAMENTO DELLE SOSTANZE ALIMENTARI
V. - ALIMENTI SFUSI O PRECONFEZIONATI DESTINATI PER LORO NATURA
AD ESSERE CONSUMATI PREVIA COTTURA O CHE RECHINO SULLA
CONFEZIONE LA DIZIONE "DA CONSUMARSI PREVIA COTTURA" (ESCLUSI
IL LATTE E I DERIVATI DEL LATTE).
a) Alimenti crudi non sottoposti a trattamento di riscaldamento.
Selezionare da un lotto un campione casuale costituito da 12
elementi o confezioni; formare le quattro aliquote di campione (A, B,
C e D) e contrassegnare ciascun u.c. dell'aliquota con un numero
d'ordine progressivo.
b) Alimenti congelati o surgelati.
1) Grandi confezioni o pezzature: selezionare da un lotto un
campione casuale costituito da 5 pezzi o confezioni che vengono
successivamente contrassegnati con un numero d'ordine progressivo
secondo quanto illustrato nella tabella illustrativa di
campionamento. Eseguire con cautela di asepsi da ciascuno dei 5 pezzi
o confezioni una serie di 4 prelievi (u.c.) di non meno di 200 g
ciascuno (complessivamente 5 serie) collocando ognuno di tali
prelievi in un distinto recipiente sterile. Contrassegnare i 4
recipienti dei prelievi provenienti da un medesimo contenitore con
una stessa lettera (cfr. punto II della tabella illustrativa di
campionamento). Formare le 4 aliquote di campione in modo che
ciascuna aliquota risulti costituita da n. 5 prelievi (cfr. punto III
della tabella illustrativa di campionamento) ognuno dei quali deve
essere scelto da ciascuna delle 5 serie di cui sopra.
2) Piccole confezioni o pezzature: prelevare un campione casuale
di 20 confezioni o 2000 g da ripartire con il criterio della
casualità in quattro aliquote (5 confezioni o 5 u.c. da 100 g
ciascuna).
c) Alimenti precotti o pastorizzati.
Procedere come per i prodotti di cui alla lettera b).

ALLEGATO 3
V. - ALIMENTI SFUSI O PRECONFEZIONATI DESTINATI PER LORO NATURA AD
ESSERE CONSUMATI PREVIA COTTURA O CHE RECHINO SULLA CONFEZIONE
LA DIZIONE "DA CONSUMARSI PREVIA COTTURA" (ESCLUSI IL LATTE E
I DERIVATI DEL LATTE).
Numerazione della Listeria monocytogenes mediante la tecnica
dell'MPN:
1) prelevare da ciascuna u.c. 10 g del prodotto;
2) addizionare 90 ml di Buffer Peptone Water;
3) omogeneizzare in Stomacher o in Mixer per 2-3';
4) allestire diluizioni scalari fino a 10 elevato a -3;
5) seminare in triplice 1 ml delle diluizioni (10 elevato a -1,
10 elevato a -2 e 10 elevato a -3) in 9 ml di Fraser Broth.
N.B. - Per gli alimenti surgelati o comunque sottoposti ad un
trattamento termico, seminare in triplice 1 ml di ciascuna diluizione
in 9 ml di TSE + YE e, dopo incubazione per le 18-20 ore a 32 C,
subculturare 1 ml di ciascuna provetta in 9 ml di Fraser Broth;
6) incubare a 32 C per 24-48 ore;
7) dalle brodocolture positive (annerimento del terreno)
prelevare un'ansata ed eseguire strisci su Listeria selective agar
base (Oxford);
8) incubare a 37 C per 24-48 ore;
9) selezionare almeno 5 colonie caratteristiche (colonie brune
circondate da alone scuro) e seminare in Tryptone Soya agar con lo
0.6% di estratto di lievito; incubare a 37 C per 24 ore;
10) sottoporre le colonie selezionate alla colorazione del gram e
al test della catalasi:
prelevare con ansa una colonia tipica e sospenderla in una
goccia di una soluzione di acqua ossigenata al 3%. La reazione
positiva al test della catalasi è dimostrata dalla formazione di
bolle di gas;
11) seminare per infissione le colonie gram positive e catalasi
positive in piastre di Columbia agar base addizionato con il 5% di
sangue di montone;
12) incubare a 37 C per 24 ore;
13) dalle colonie emolitiche procedere alla semina in Tryptone
Soya Broth con lo 0,6% di estratto di lievito;
14) incubare a 37 C per 24 ore;
15) utilizzare la brodocoltura per le seguenti prove:
fermentazione degli zuccheri (mannitolo, ramnosio e xilosio):
seminare un'ansata nel brodo e incubare a 37 C per 1-7 giorni;
mobilita': seminare per infissione in terreno semisolido
incubare a temperatura ambiente per 2-5 giorni;
test biologico: inoculare 5 topini Swiss per via
intraperitoneale con 0.1 ml del sedimento di una brodocoltura di 24
ore centrifugata a 4000 rpm per 30 minuti, risospeso in 1 ml di
soluzione fisiologica;
16) confrontare il numero delle brodocolture di cui al punto 5,
risultate positive ai test di conferma, con la tabella dell'MPN di
cui alla presente ordinanza ministeriale e ricavare il numero di
Listeria monocytogenes presenti nel campione.
TERRENI DI COLTURA
1. Buffered Peptone Water
Peptone................................. 10,0 g/L
Sodio cloruro........................... 5,0 g/L
Sodio fosfato monoacido................. 3,5 g/L
Potassio fosfato biacido................. 1,5 g/L
Sterilizzare a 121 C per 15 minuti; pH finale: 7,2 +/- 0.2.
2. Listeria Fraser Broth base
Proteose peptone......................... 5,0 g/L
Triptone................................. 5,0 g/L
Lab-Lemco (estratto di carne)............. 5,0 g/L
Estratto di lievito....................... 5,0 g/L
Sodio cloruro............................. 20,0 g/L
Sodio fosfato monoacido................... 12,0 g/L
Potassio fosfato monoacido................. 1,35 g/L
Esculina................................... 1,0 g/L
Litio cloruro.............................. 3,0 g/L
Sterilizzare a 121 C per 15 minuti; pH finale: 7,2 +/- 0,2.
Prima dell'uso aggiungere:
Acido nalidixico......................... 20,0 mg/L
Acriflavina.............................. 25,0 mg/L
Ferro ammonio citrato.................... 500,0 mg/L
3. Listeria selective agar base (Oxford)
Columbia Elcod agar base.................. 39,0 g/L
Esculina.................................. 1,0 g/L
Ferro ammonio citrato...................... 0,5 g/L
Litio cloruro.............................. 15,0 g/L
Sterilizzare a 121 C per 15 minuti; pH finale: 7,0 +/- 0,2.
Far raffreddare a 50 C e aggiungere:
Cicloeximide............................. 400,0 mg/L
Colistina solfato......................... 20,0 mg/L
Acriflavina............................... 5,0 mg/L
Cefotetan................................ 2,0 mg/L
Fosfomicina.............................. 10,0 mg/L
4. Tryptone Soya agar + 0,6% estratto di lievito
Triptone................................ 16,0 g/L
Peptone di soia.......................... 5,0 g/L
Sodio cloruro........................... 5,0 g/L
Agar.................................... 15,0 g/L
Estratto di lievito..................... 6,0 g/L
Sterilizzare a 121 C per 15 minuti; pH finale: 7,3 +/- 0,2.
5. Columbia Blood agar base
Paptone................................... 23,0 g/L
Amido..................................... 1,0 g/L
Sodio cloruro............................. 5,0 g/L
Agar..................................... 10,0 g/L
Sterilizzare a 121 C per 15 minuti; pH finale: 7,3 +/- 0,2.
Raffreddare a 50 C e aggiungere il 5-7% di sangue di montone sterile
defibrinato.
6. Tryptone Soya Broth + 0,6% di estratto di lievito
Digerito pancreatico di caseina.......... 17,0 g/L
Digerito papainico di farina di soia...... 3,0 g/L
Sodio cloruro............................. 5,0 g/L
Potassio fosfato monoacido................ 2,5 g/L
Destrosio................................ 2,5 g/L
Estratto di lievito...................... 6,0 g/L
Sterilizzare a 121 C per 15 minuti; pH finale: 7,3 +/- 0,2.
7. Brodo per l'utilizzazione dei carboidrati
Proteose peptone........................ 10,0 g/L
Lab Lemco (estratto di carne)............ 1,0 g/L
Sodio cloruro........................... 5,0 g/L
Bromocresol porpora..................... 0,2 g/L
Bollire e distribuire 9 ml in provetta; sterilizzare a 121 C per 15
minuti;
pH finale: 7,3 +/- 0,2.
Far raffreddare a 50 C e aggiungere:
1 ml di una soluzione di mannitolo al 5%;
1 ml di una soluzione di ramnosio al 5%;
1 ml di una soluzione di xilosio al 5%.
Le soluzioni di zuccheri vanno sterilizzate per filtrazione.
8. Terreno per la mobilità
Peptone di caseina...................... 20,0 g/L
Peptone di carne........................ 6,1 g/L
Agar.................................... 3,5 g/L
Distribuire 6 ml del terreno in provette e sterilizzare a 121 C per
15 minuti; pH finale: 7,3 +/- 0,2.