Serie Generale n. 116 del 21-5-2003
DECRETI, DELIBERE E ORDINANZE MINISTERIALI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI
MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE E FORESTALI
DECRETO 8 maggio 2003
Metodi ufficiali di analisi per i fertilizzanti (supplemento n. 8). (GU Serie Generale n.116 del 21-05-2003)

L'ISPETTORE GENERALE CAPO
dell'ispettorato centrale repressione frodi

Vista la legge 7 agosto 1986, n. 462, con la quale è stato, tra
l'altro, istituito l'Ispettorato centrale repressione frodi per
l'esercizio delle funzioni inerenti alla prevenzione e alla
repressione delle infrazioni nella preparazione e commercio dei
prodotti agro-alimentari e delle sostanze di uso agrario e forestale;
Visto l'art. 3 della legge 9 marzo 2001, n. 49, riguardante
«Ulteriori interventi per fronteggiare l'emergenza derivante
dall'encefalopatia spongiforme bovina», secondo il quale, nell'ambito
delle disposizioni in materia di controlli e di personale,
l'Ispettorato centrale repressione frodi, posto alle dirette
dipendenze del Ministro delle politiche agricole e forestali, opera
con organico proprio ed autonomia organizzativa ed amministrativa e
costituisce un autonomo centro di responsabilità di spesa;
Visto il decreto del Presidente della Repubblica 18 gennaio 1988
che, tra le funzioni attribuite alle divisioni dell'Ispettorato
centrale repressione frodi, prevede l'elaborazione e l'aggiornamento
dei metodi ufficiali di analisi per i prodotti agro-alimentari e le
sostanze di uso agrario e forestale;
Visti gli articoli 8 e 9 della legge 19 ottobre 1984, n. 748,
concernente: «Nuove norme per la disciplina dei fertilizzanti», i
quali prescrivono che i concimi e gli ammendanti e correttivi vengano
controllati con i metodi di campionamento e di analisi adottati con
decreto del Ministro dell'agricoltura e delle foreste, sentito il
parere della Commissione di cui agli articoli 110, 111 e 112 del
decreto del Presidente della Repubblica 12 febbraio 1965, n. 162;
Visto altresì l'art. 115 del citato decreto del Presidente della
Repubblica 12 febbraio 1965, n. 162;
Visti i decreti ministeriali 24 marzo 1986, 19 luglio 1989,
23 gennaio 1991, 10 marzo 1993, 28 settembre 1993, 5 dicembre 1995,
21 dicembre 2000 e 17 giugno 2002, relativi all'approvazione dei
«Metodi ufficiali di analisi per i fertilizzanti», pubblicati
rispettivamente nei supplementi ordinari alla Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana n. 180 del 5 agosto 1986, n. 196 del
23 agosto 1989, n. 29 del 4 febbraio 1991, nella Gazzetta Ufficiale
della Repubblica italiana n. 73 del 29 marzo 1993, nella Gazzetta
Ufficiale della Repubblica italiana n. 238 del 9 ottobre 1993, nella
Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 18 del 23 gennaio
1996, nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 21 del
26 gennaio 2001 e nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana
n. 220 del 19 settembre 2002;
Ritenuto necessario aggiornare i metodi di analisi approvati con
i succitati decreti ministeriali;
Sentito il parere della commissione per l'aggiornamento dei
metodi ufficiali di analisi - sottocommissione fertilizzanti,
rinnovata col decreto ministeriale 20 settembre 2000, pubblicato
nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n. 236 del
9 ottobre 2000, modificata da ultimo, per quanto attiene la
sottocommissione fertilizzanti, col decreto ministeriale 28 settembre
2000 pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana n.
249 del 24 ottobre 2000;
Visto il decreto legislativo 30 marzo 2001, n. 165, concernente
norme generali sull'ordinamento del lavoro alle dipendenze delle
amministrazioni pubbliche;
Vista la direttiva 98/34/CE, concernente le procedure
d'informazione nel settore delle norme e regolamentazioni tecniche, e
successive modificazioni, attuata con decreto legislativo 23 novembre
2000, n. 427;
Decreta:
Art. 1.
1. Sono approvati i «Metodi ufficiali di analisi per i
fertilizzanti - Supplemento n. 8» descritti nell'allegato al presente
decreto;
2. I metodi di analisi riportati in allegato al presente decreto
si applicano ai concimi nazionali.

Art. 2.
Il presente decreto entra in vigore il giorno successivo alla sua
pubblicazione nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica italiana.
Roma, 8 maggio 2003
L'ispettore generale capo: Lo Piparo

ALLEGATO

Metodo per identificare la presenza di "Sangue" nei fertilizzanti

1. Oggetto

Il presente documento fissa un metodo quali-quantitativo per
identificare e determinare la presenza di "sangue" nei fertilizzanti.

2. Campo d'applicazione

Il metodo è applicabile ai concimi organici azotati "sangue
secco" e "sangue fluido".
La stessa metodica può essere utilizzata anche per verificare
(analisi qualitativa) la presenza di "sangue" nei seguenti
fertilizzanti: "Miscela di concimi organici N e NP" e nei concimi
organo-minerali contenenti "sangue secco" e "sangue fluido".

3. Principio

La proteina più importante e caratteristica presente nel sangue
è l'emoglobina. Si tratta di una proteina globulare caratterizzata
dalla presenza del gruppo prostetico eme che contiene ferro (Fe 2+),
facilmente rilevabile per via spettrofotometrica nello spettro del
visibile. Nel presente metodo, il gruppo eme dell'emoglobina del
sangue viene estratto mediante una soluzione di trietanolammina e
caratterizzato per via spettrofotometrica. Il massimo di assorbanza
dell'emoglobina si ha per alfa = 406,8 nm. Il contenuto di emoglobina
nei concimi organici azotati è determinato confrontando l'assorbanza
a 406,8 nm dell'estratto in trietanolammina con quello di uno
standard di emoglobina. Per l'accertamento qualitativo della presenza
di "Sangue" in concimi contenenti oltre al sangue altre matrici
organiche è necessario eseguire uno spettro di assorbimento nella
regione di lunghezza d'onda (alfa) compresa fra 340 e 500 nm. Dalla
derivata prima [f'(x)] di questo spettro di assorbimento è possibile
determinare la presenza di emoglobina osservando la presenza di un
picco caratteristico a 420 nm.

4. Reattivi

Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualità
analitica riconosciuta.

4.1. Emoglobina (substrato per proteasi, sec. Anson).
4.2. Trietanolammina, C6H15N03, (99%.
4.3. Soluzione di trietanolammina al 5%.
Sciogliere 50 mL di trietanolammina (4.2.) in 500 mL di acqua in un
matraccio da 1000 mL e portare a volume con acqua. La soluzione
deve essere conservata in un contenitore a chiusura ennetica e
mantenuta a + 4°C.
4.4. Soluzione di trietanolammina al 2,5% a pH 9,2.
Sciogliere 25 mL di trietanolammina (4.2.) 500 mL di acqua in un
matraccio da 1000 mL e portare a volume con acqua. La soluzione
deve essere conservata in un contenitore a chiusura ermetica e
mantenuta a +4°C.
In alternativa, diluire al 50% (v/v) la soluzione di trietanolammina
al 5% (4.3.) con acqua deionizzata.
Portare quindi la soluzione a pH 9,2 con HCl 0,1M (4.6.).
4.5. Acido cloridrico, HCl, 36%.
4.6. Soluzione di acido cloridrico 0,1 M.
Diluire 83,33 mL di HCl 36% (4.5.) in un matraccio tarato da 1000 mL
con acqua fino a volume.

AVVERTENZE: alcuni reagenti usati in questa procedura sono
pericolosi; osservare particolare cura durante il loro utilizzo.
Evitare il contatto con la pelle ed occhi e l'inalazione dei vapori.
Si raccomanda all'operatore di osservare le indicazioni riportate
sull'etichetta del contenitore dei prodotti ed eventualmente
consultare le relative schede di sicurezza per le specifiche
informazioni sulla pericolosità dei reagenti usati e sulle modalità
di smaltimento.

5. Apparecchiatura

5.1. Spettrofotometro UV/VIS dotato di software per l'elaborazione
dei risultati (calcolo della derivata prima).
5.2. Agitatore magnetico con piastra riscaldante.
5.3. Termometro tarato fino a 100°C.
5.4. Piaccametro.
5.5. Filtri di carta tipo Whatman n. 42.
5.6. Stufa.

6. Procedimento

6.1. Preparazione dei campioni per l'analisi
I campioni solidi devono essere macinati e setacciati a 0,45 mm
secondo quanto previsto dal metodo "Preparazione del campione per
l'analisi" (D.M. 24 marzo 1986).
I campioni fluidi devono essere accuratamente agitati e
omogeneizzati prima di essere sottoposti ad analisi.
6.2. Estrazione dell'emoglobina
6.2.1. Concimi organici azotati "sangue secco" e "sangue fluido"
6.2.1.1. Campioni solidi
Pesare 0,125 g di campione, con una precisione di 0,1 mg, in un
matraccio da 100 mL, aggiungere 50 mL di soluzione di trietanolammina
al 5% (4.3.) e porre il matraccio sull'agitatore magnetico (5.2.)
preriscaldato a 85°C. Controllare la temperatura della sospensione e
quando ha raggiunto 85°C continuare l'agitazione per 30 minuti.
Raffreddare la sospensione a temperatura ambiente, aggiustare il pH a
9,2 mediante l'aggiunta di HCl 0,1 M (4.6.), portare a volume con
acqua deionizzata. Travasare quantitativamente in un matraccio tarato
da 500 mL (0,25 g L-1) e portare a volume con trietanolammina al 2,5%
a pH 9,2 (4.4.). Filtrare su filtro di carta (5.4.).
6.2.1.2 Campioni fluidi
Pesare 1 g di campione, con una precisione di 0,1 mg, in un
matraccio da 100 mL, aggiungere 50 mL di soluzione di trietanolammina
al 5% (4.3.) e porre il matraccio sull'agitatore magnetico (5.2.)
preriscaldato a 85°C. Procedere quindi come descritto al punto 6.2.1.
6.2.2. Miscela di concimi organici N e NP e concimi
organo-minerali contenenti "sangue secco" e/o "sangue fluido"
Pesare 1 g di campione di concime in un matraccio da 100 mL, con
una precisione di 0,1 mg, aggiungere 50 mL di soluzione di
trietanolammina al 5% (4.3.) e porre il matraccio sull'agitatore
magnetico (5.2.) preriscaldato a 85°C. Controllare la temperatura
della sospensione e quando ha raggiunto 85°C continuare l'agitazione
per 30 minuti. Raffreddare la sospensione a temperatura ambiente,
aggiustare il pH a 9,2 mediante l'aggiunta di HCl 0,1 M (4.6.),
portare a volume con acqua deionizzata, filtrare su filtro di carta
(5.4.).
6.3. Preparazione degli standard di emoglobina (da preparare solo
nel caso di campioni di concimi organici azotati "sangue secco" e
"sangue fluido")
Preparare delle soluzioni da 50, 100, 150, 200, 250, 300 e 350 mg
L-1 di emoglobina (4.1.) in trietanolammina al 25% a pH 9,2 (4.4.).
6.4. Misure allo spettrofotometro
6.4.1. Concimi organici azotati: "sangue secco" e "sangue fluido"
Utilizzando lo spettrofotometro UV/VIS (5.1.) procedere alla
misura dell'assorbanza degli standard di emoglobina (6.3.) e degli
estratti diluiti (6.2.1 e 6.2.2.) alla lunghezza d'onda (alfa) di
406,8 nm utilizzando celle con percorso ottico di 1 cm e leggendo
contro bianco preparato usando la soluzione di trietanolammina al
2,5% (4.4.) portata a pH 9,2 con HCl 0,1 M (4.6.).
6.4.2. Miscela di concimi organici N e NP e concimi
organo-minerali contenenti "sangue secco" e/o "sangue fluido".
Utilizzando lo spettrofotometro UV/VIS (5.1.) registrare uno
spettro di assorbimento dell'estratto nella regione di lunghezza
d'onda (alfa) compresa tra 340 e 500 nm utilizzando celle con
percorso ottico di 1 cm e leggendo contro un bianco preparato usando
la soluzione di trietanolammina al 2,5% a pH 9,2 (4.4.). Memorizzare
gli spettri d'assorbimento per il successivo calcolo della derivata
prima della funzione.

7. Espressione dei risultati

7.1. Concimi Organici azotati: "sangue secco" e "sangue fluido"
Utilizzare la curva di taratura costruita con lo standard di
emoglobina per determinarne la concentrazione negli estratti:

Emoglobina (mg g-1) = (a abs340 - m) / b . c

dove,

a = coefficiente angolare della retta di regressione lineare
ottenuta dall'interpolazione della curva di taratura dell'emoglobina
(concentrazioni dell'emoglobina in mg L-1), abs340 = assorbanza a
406,8 nm dell'estratto di concime,
m = intercetta della retta di regressione lineare ottenuta
dall'interpolazione della curva di taratura dell'emoglobina,
b = costante di cella dello spettrofotometro (1 cm),
c = concentrazione del campione nell'estratto analizzato (g L-1).
Da una serie di campioni di concimi analizzati nelle condizioni
sperimentali descritte in questo metodo, è stato possibile stabilire
che il valore medio di presenza di emoglobina nei concimi organici
azotati "sangue secco" e "sangue fluido" era pari all'81,4% con una
deviazione standard di 5,0 (dato espresso p/p sulla sostanza secca).
Si ritiene pertanto ragionevole stabilire che nei concimi organici
azotati "sangue secco" e "sangue fluido" la percentuale di emoglobina
nel campione analizzato debba essere &gt; 75% (dato espresso p/p sulla
sostanza secca).
7.2. Miscela di concimi organici N e NP e concimi organo-minerali
contenenti "sangue secco" e/o "sangue fluido".
In questi campioni, dove la presenza di "sangue" dichiarata può
essere dell'ordine del 5-10% (la legge 19 ottobre 1984 n. 748
consente la dichiarazione in etichetta delle matrici organiche solo
se presenti in quantità ( 5% in peso del concime), sì deve
procedere alla determinazione della derivata prima [f'(x)] dello
spettro di assorbimento del campione nell'intervallo compreso tra 340
e 500 nm (6.4.). La presenza di "sangue" è determinabile, nella
derivata prima [f'(x)] dello spettro di assorbimento, dalla presenza
di un picco caratteristico a 420 nm.

Estrazione e Caratterizzazione Elettroforetica del DNA Fungino
da Matrici Organiche

1. Oggetto

Il presente documento fissa un metodo per l'estrazione di DNA
genomico di funghi da matrici organiche. È stata sviluppata una
procedura veloce per estrarre DNA genomico da biomasse organiche in
meno di 30 minuti. Questo metodo, oltre ad essere notevolmente
rapido, evita l'utilizzo di solventi organici tossici come il fenolo
ed il cloroformio utilizzati nei metodi tradizionali (Van Burik et
al., 1998). Permette di ottenere circa 1-50 µg di DNA genomico di
dimensioni comprese tra le 6 e le 25 kilobasi (kb), a seconda del
tipo di suolo e del numero degli organismi presenti. Tale metodo è
stato adattato alla caratterizzazione di materiale genetico fungino
in biomasse organiche di diversa origine.

2. Campo di applicazione

Il metodo è utilizzabile per estrarre DNA genomico da miceli o
spore fungini in biomasse organiche di diversa origine.

Principio

Il sistema, grazie all'utilizzo di un micronizzatore (o
disgregatore) e ad una attenta scelta dei reagenti, è in grado di
lisare le cellule e stabilizzare il DNA con perdite minime di acidi
nucleici.

3. Reagenti

4.1. Tampone di fosfato di sodio
4.2. Tampone MT
4.3. Soluzione precipitante per proteine
4.4. Matrice ad elevata affinità per il DNA
4.5. Soluzione di lavaggio priva di DNAasi contenente etanolo e sali.
Aggiungere 100 mL di etanolo a 12 mL di soluzione madre (SEWS-M)
priva di DNAasi. Agitare e conservare a temperatura ambiente.
4.6. Soluzione di eluizione del DNA. H2O ultra-pura.
4.7. TAE 1X (Tris-EDTA-Acetato). Soluzione base (50X): disciogliere
242 g di Pris base e 57,1 g di acido acetico glaciale in 100 ml
di EDTA 0,5 M (pH 8): portare quindi a volume finale di 1 L con
H2O distillata.
4.8.Agarosio
4.9. Bromuro di etidio (EtBr): 3,8
diamino-5-etil-6-fenilfenantridiobromuro (????).
Soluzione base: aggiungere 10 mg di EtBr per ml di H2O distillata,
agitare e conservare a 4°C in bottiglia scura. Per ottenere la
concentrazione di lavoro diluire la soluzione madre fino ad
ottenere 0,5-1 µg/mL di EtBr.

4.10. Blu di bromofenolo (BBF). Aggiungere 0,25% di blu di
bromofenolo e 40% di saccarosio in H2O distillata; conservare a
4°C.
4.11. DNA plasmidico di riferimento

5. Apparecchiatura

5.1. Tubi di polietilene (forniti col kit), contenenti una miscela
di microsferette in ceramica e in silicio di due diverse dimensioni,
disegnate per lisare efficacemente qualsiasi tipo di microrganismo,
compresi quelli storicamente difficili da lisare come le spore
eubatteriche e le endospore, batteri gram-positivi, lieviti, alghe,
nematodi e funghi.
5.2. Filtri che assorbono il DNA (forniti col kit)
5.3. Tubi porta-filtro (forniti col kit)
5.4. Disgregatore FastPrep 120 Instruments, Q-Biogene (RESNOVA) o
analoghi, con rotore da 12 posti per tubi da 2 ml, in grado di
agitare i tubi in ogni direzione a velocità molto elevate.
5.5. Cella elettroforetica orizzontale con elettrodi di platino
5.6. Alimentatore elettrico (5-200V- 200 W max)
5.7. Fransilluminatore a raggi UV con sistema di acquisizione
fotografica dell'immagine
5.8. Micropipette: P100. P200. P1000

6. Procedimento

6.1. Estrazione del DNA
Porre il campione (100-500 mg se secco o 350-800 µL se liquido)
nei tubi di polietilene contenenti una miscela di microsferette in
ceramica e in silicio ed aggiungere 978 µL di tampone di fosfato di
sodio e 122 µL di tampone MT. A causa del vigoroso movimento
sviluppato dallo strumento, è stata osservata una pressione
significativa sul tubo. Il contenuto non dovrebbe superare i 7/8 del
volume totale del tubo. Lo spazio lasciato migliora notevolmente
l'omogeneizzazione del campione.
Inserire i tubi nel disgregatore (5.4.) e processare i campioni
per 20 secondi a velocità 6,5 dello strumento. Centrifugare
nuovamente i tubi per 5 minuti a 13.000 giri/minuto e trasferire i
surnatanti (circa 700-800 µL) in tubi nuovi. Aggiungere 250 µL di
soluzione che precipita le proteine (4.3.) e agitare ad inversione a
mano per 10 volte. Centrifugare quindi i tubi per 5 min ad una
velocità di 13.000 giri/minuto e trasferire i supernatanti in nuovi
tubi da 15 mL, in cui si aggiungeranno 500 µL di matrice con
affinità per il DNA (4.4., risospendere la soluzione, agitando bene
prima dell'uso). Agitare per inversione su un rotore, oppure a mano,
per 10 minuti per consentire al DNA di legarsi alla matrice ed
attendere 5 min affinchè precipiti la resina; togliere quindi, con
cautela, 500 µL del supernatante, senza toccare la resina, e buttarlo
via. Risospendere quindi la resina rimanente col surnatante rimasto,
e trasferirne circa 600 µL in un filtro che assorbe il DNA (5.2.)
inserito in un tubo porta-filtro (5.3.).
Centrifugare i campioni per 1 min a velocità 13.000 giri/minuto e
poi svuotare i tubi porta-filtro (5.3.); aggiungere quindi il
surnatante rimasto nel filtro che assorbe il DNA (5.2.). Centrifugare
ancora per 1 min a velocità 13.000 giri/minuto ed aggiungere 500 µL
di soluzione di lavaggio (4.5.) sul filtro. Centrifugare ancora per 1
min a 13.000 giri/minuto di velocità, svuotare i tubi porta filtro e
centrifugare ancora una volta per 2 mm a 13.000 giri/minuto per
asciugare bene la resina. Infine svuotare i tubi porta-filtro (5.3.),
trasferire i filtri che assorbono il DNA in nuovi tubi porta-filtro e
lasciare ad asciugare per 5 minuti con il tappo aperto a temperatura
ambiente. Aggiungere dunque 100 µL di soluzione di eluizione del DNA
(4.6.) ai filtri che assorbono il DNA e risospendere delicatamente la
resina con la punta della pipetta. Infine centrifugare per 2 min a
13.000 giri/minuto, aggiungere quindi altri 50 µL di soluzione di
eluizione del DNA (4.6.) al filtro e centrifugare per altri 2 min a
13.000 giri/minuto di velocità. Conservare quindi il supernatante
con il DNA eluito, che può essere analizzato.
6.2. Analisi del DNA
La presenza di acidi nucleici viene valutata sia
quantitativamente, tramite spettrofotometria all'ultravioletto (260
nm) o tramite lettura al fluorimetro, che qualitativamente tramite
elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8%. Con la prima tecnica è
anche possibile valutare il grado di purezza dei DNA estratto. La
seconda tecnica, oltre a consentire una valutazione approssimativa
della quantità del DNA estratto, è soprattutto indicata per la
determinazione della qualità del DNA, analizzando le dimensioni del
DNA estratto in modo da valutarne l'integrità.
6.2.1. Determinazione per spettrofotometria all'ultravioletto
Prelevare un'aliquota del DNA estratto (pochi µL) e portare a
volume di 1 mL con acqua distillata sterile. Quindi pone la soluzione
in una cuvetta di quarzo per rilevazioni spettrofotometriche all'UV e
procedere alla lettura allo spettrofotometro.
Accendere lo spettrofotometro circa 20 minuti prima
dell'effettuazione delle letture, in modo da consentire il
riscaldamento della lampada all'UV, precedentemente selezionata nel
vano portalampade dello strumento. Procedere quindi alla lettura dei
campioni. Le lunghezze d'onda alle quali vengono letti i campioni
sono: 240 nm, 260 nm, 280 nm.
Le letture alle lunghezze d'onda di 240 e 280 nm forniscono
informazioni sulla presenza di proteine, mentre la lettura a 260 nm
è specifica per le molecole di DNA.
Moltiplicare i dati ottenuti dalla lettura a 260 nm per un
coefficiente di 50 nel caso si voglia determinare la concentrazione
del DNA. Riportare le concentrazioni in mg/mL. Dal rapporto tra le
letture a 260 nm e 280 nm (260/280) si ottiene l'indice di purezza
del DNA estratto. Se il valore ditale rapporto risulta compreso tra
1,7 e 2,0 il DNA risulta sufficientemente puro.
6.2.2. Fluorescenza
Il metodo si basa sulla proprietà che ha una soluzione colorante
Hoechst 33258 di formare legami con l'adenina e la timina presenti
nella molecola di DNA e di emettere fluorescenza. In questo modo si
può determinare in maniera precisa la concentrazione del DNA
presente nella soluzione rilevando la fluorescenza emessa dal
quantitativo che ha interagito con il DNA. Per operare tali
determinazioni è necessario effettuare una retta di calibrazione
dello strumento utilizzando una soluzione madre di DNA preparata in
modo tale da essere sicuri che il DNA che si vuole analizzare abbia
la stessa percentuale di adenina e timina di quello utilizzato per La
calibrazione dello strumento. Al contrario della spettrofotometria
UV, le impurità che normalmente si possono ritrovare nel DNA
(proteine, oligonucleotidi e solventi organici) non causano la minima
influenza nella determinazione quantitativa del DNA.
In relazione alla preparazione del fluorimetro, si rimanda alla
documentazione del manuale allegata al tipo di strumento utilizzato.
6.2.3. Gel elettroforesi
Il metodo consiste nella risoluzione del DNA presente nei campioni
per elettroforesi su gel di agarosio, seguita da colorazione con
bromuro di etidio.
Preparazione del gel:
Porre 100 mL di Tris Acetato EDTA (lX) (4.7.) e 0,8 g di agarosio
(4.8.) in una beuta da 250 mL. Scaldare la beuta (utilizzando un
forno a microonde, un bunsen od una piastra riscaldante) fino ad
Ottenere una soluzione limpida, evitando di raggiungere la
temperatura di ebollizione. Quindi attendere che la temperatura
scenda al di sotto dei 60°C ed aggiungere 5 µL di soluzione di
bromuro di etidio (1 µg/ml) (4.9.). Allestire la slitta per la
preparazione del gel di agarosio, ponendola su un piano in bolla e
disponendo gli opportuni pettini nelle apposite fessure. Versare
delicatamente la soluzione preparata di agarosio nella slitta in
triodo che risulti spesso non più di 5 mm, evitando la formazione di
bolle d'aria ed attendendo che solidifichi (30-45 minuti a
temperatura ambiente). Versare una piccola quantità di tampone sul
gel e togliere quindi delicatamente i pettini.
Corsa elettroforetica
Allestire la cella elettroforetica versandovi un volume di tampone
(TAE lX) (4.7) sufficiente a riempirla per i 3/4 circa. Porre la
slitta contenente il gel all'interno della cella elettroforetica
(5.5.) in modo che il tampone ne ricopra la superficie (per circa 1
mm). Caricare 40 µL di DNA + 5 µL di blu di bromofenolo (4.10) nei
pozzetti del gel ed un DNA plasmidico di riferimento (4.11).
Collegare gli elettrodi della cella elettroforetica con
l'alimentatore (5.6.) ed impostare ad una tensione costante di 120 V
per tutta la corsa elettroforetica (per migliorare la risoluzione
delle bande è consigliabile utilizzare un basso voltaggio e
prolungare il più possibile la corsa). Trascorsi 45 minuti (è
meglio osservare il gel agli UV una volta dopo 15 minuti ed una
seconda dopo 45 minuti: se il DNA è molto frammentato e/o scarso si
rischia di non vederlo più dopo una corsa prolungata), interrompere
l'alimentazione e togliere la slitta contenente il gel dalla cella
elettroforetica.
Scansione del gel
Togliere delicatamente il gel dalla slitta e porlo sul
transilluminatore (5.7.). Accendere la lampada UV ed effettuare
l'acquisizione dell'immagine con un apposito sistema fotografico.
Analisi dei risultati
Su un gel di agarosio è possibile discriminare visivamente
frammenti di DNA di dimensioni &gt;10 ng:
La presenza di DNA genomico ad alto peso molecolare è quindi
facilmente verificabile con l'aiuto di un apposito DNA di
riferimento.

7. Note

Nel caso si voglia determinare la concentrazione dell'RNA con
metodo spettrofotometrico all'ultravioletto come descritto al punto
6.2.1., è necessario moltiplicare i dati ottenuti dalla lettura a
260 nm per il coefficiente 40, anzichè 50.
Alcuni reagenti usati in questo metodo sono tossici. In
particolare, il reagente 4.4. contiene tiocianato di guanidina
(CH5N3-HSCN), altamente tossico, mentre il reagente 4.9. è
costituito da EtBr, potente mutageno. Evitare quindi per entrambi il
contatto con la pelle ed occhi e l'inalazione dei vapori, utilizzando
guanti e maschera di protezione. Si raccomanda inoltre all'operatore
di osservare le indicazioni riportate sull'etichetta del contenitore
dei prodotti ed eventualmente consultare le relative schede di
sicurezza per le specifiche informazioni sulla pericolosità dei
reagenti usati e sulle modalità di smaltimento.
Il presente metodo ha fornito i migliori risultati estrattivi
utilizzando Kit specifici per miceli fungini esistenti in commercio.

Test di biodegradabilità per sostanze organiche alilatiche
di sintesi nei fertilizzanti

1. Oggetto

Il presente documento fissa un metodo convenzionale per la
determinazione della biodegradabilità delle sostanze organiche di
sintesi.

2. Campo di applicazione

Il metodo è applicabile a tutte le sostanze organiche alifatiche
sintetiche contenute nei prodotti fertilizzanti.

3. Principio

La determinazione della biodegradabilità viene effettuata in
ambiente acquoso aerobico misurando la quantità di anidride
carbonica che si sviluppa ad opera di ceppi batterici selezionati
(normalmente presenti nel terreno agrario) rapportandola alla
quantità che il fertilizzante avrebbe dovuto sviluppare in base al
contenuto di carbonio organico determinato con il metodo
Springer-Klee (D.M. 21 dicembre 2000 - Gazzetta Ufficiale della
Repubblica Italiana n. 21 del 26 gennaio 2001 - Serie generale).
Il procedimento viene mantenuto sotto controllo sottoponendo al
trattamento un opportuno standard di riferimento strutturalmente
simile al composto od ai composti organici di cui si desidera
valutare la biodegradabilità.

4. Reattivi

Nel corso dell'analisi utilizzare reagenti di qualità analitica
riconosciuta.
4.1. Acqua bidistillata, esente da sostanze tossiche (in
particolare da rame), a basso contenuto di carbonio (&lt; 2,0 mg/L TOC),
con resistività (18 megaohms/cm.
4.2. Soluzione madre contenente microelementi preparata a partire
da:

EDTA sale sodico 0,15 g
MgSO4 . 7H2O 3,0 g
MnSO4 . 2H2O 0,5 g
NaCl 1,0 g
FeSO4 . 7H2O 0,1 g
CoSO4 o CoCl2 0,1 g
CaCl2 . 2H2O 0,1 g
ZnSO4 0,1 g
CuSO4 . 5H2O 0,01 g
AlK(SO4)2 0,01 g
H3BO3 0,01 g
Na2MoO4 . 2H2O 0,01 g

Sciogliere e portare a 1000 mL con acqua (4.1.), pH 7,2 ± 0,2.

4.3. Soluzione madre vitaniinica preparata a partire da:
Biotina(vitaniina FI) 2,0 mg
Acido folico 2,0 mg
Piridossina cloridrato (B6) 10,0 mg
Tiamina cloridrato (B1) 5,0 mg
Riboflavina (B2) 5,0 mg
Acido nicotinico (PP) 5,0 mg
Pantenolo 5,0 mg
Vitamina B12 0,1 mg
Acido p-aminobenzoico 5,0 mg
Acido lipoico 5,0 mg
Sciogliere e portare a 1000 mL con acqua (4.1.).

4.4. Terreno di coltura preparato a partire da:
Soluzione madre 4.2. 10,0 ml
Soluzione madre 4.3. 10,0 ml
K2HPO4 0,3 g
(NH4)2SO4 1,0 g
Sciogliere e portare a 1000 mL con acqua(4.1.).

4.5. Substrato di laboratorio.
Per la selezione in purezza dei batteri usare Nutrient Broth (NB)
agarizzato costituito da:
Estratto di carne 2,0 g
Peptone batteriologico 5,0 g
Agar batteriologico 15,0 g
Portare a 1000 mL con acqua (4.1.), pH 6,8 ± 0,2.

4.6. Soluzione di NaOH 0,5N.
4.7. Soluzione di BaCl2 . 2H2O 1M.
4.8. Soluzione di HCl 1N.
4.9. Soluzione di fenolftaleina.

5. Apparecchiatura

Per ciascun prodotto da esaminare (il fertilizzante, la sostanza
di riferimento e il bianco) e in base al numero di replicati
necessari, l'apparecchiatura prevede l'impiego di 5 contenitori di
vetro collegati in serie ad una valvola regolatrice di flusso
elettronica o manuale che permette di regolare e mantenere un flusso
costante di aria, pari a 600 mL/h.
5.1. L'impianto si articola nelle seguenti parti (figura 1):

----&gt; vedere immagine a pag. 19 della G.U. &lt;----

5.1.1. Linea di decarbonatazione.

L'aria erogata da una bombola viene fatta passare in una linea di
decarbonatazione e deumidificazione costituita da colonne contenenti
calce sodata e gel di silice, seguite da una colonna di policarbonato
di altezza pari a due metri contenente acqua, avente lo scopo di
compensare eventuali sbalzi di pressione creatisi nel sistema.
5.1.2. Reattori per la degradazione.
Flaconi di vetro scuro della capacità di 500 mL, con tappo a vite
forato a tenuta, dotati di un tubo pescante in entrata da cui
gorgoglia l'aria decarbonatata. Una seconda apertura, chiusa con
tappo a tenuta, consente di misurare l'attività dell'inoculo, il pH
e la temperatura. I reattori vanno protetti dalla luce per impedire
la proliferazione di alghe e mantenuti sotto costante agitazione.
5.1.3. Polmoni di sicurezza. Ogni reattore è preceduto e seguito
da una beuta vuota, a tenuta, della capacità di 500 mL, per impedire
il ritorno della soluzione di NaOH o del terreno di coltura dalle
trappole al reattore e/o da quest'ultimo alle valvole regolatrici di
flusso.
5.1.4. Trappole per CO2.
Batteria di due assorbitori (drechsell) della capacità di 150 mL
collegate in serie, contenenti ciascuna 100 mL di NaOH 0,5 N.
5.2. Preparazione dell'inoculo.
L'obiettivo è quello di isolare dal terreno microrganismi in
grado di utilizzare il fertilizzante come substrato nutritivo. Si
consiglia di selezionare da 3 a 5 ceppi batterici scegliendo un
terreno agrario di tessitura equilibrata e di media fertilità.
A tale scopo, si aggiunge 1 g di terreno ad una beuta contenente
250 mL di terreno di coltura (4.4,) sterilizzato e addizionato di
fertilizzante, portato a pH 7 e messo ad incubare a 28°C per 5 giorni
in termostato, sotto costante agitazione. La procedura, in duplicato,
deve essere realizzata in contemporanea con un test privo del
prodotto in esame. Dopo sviluppo si lascia decantare brevemente e si
procede ad una semina su piastre contenenti il substrato di
laboratorio NB agarizzato (4.5.) riproducendo le diluizioni da 10-1 a
10-10 (usare per le diluizioni soluzione fisiologica sterile),
lasciando poi incubare a 28 °C in termostato per 3 giorni. Le colonie
batteriche evidenziatesi vanno isolate e riprodotte in purezza.
I ceppi batterici selezionati vanno infine inoculati in ragione
dell' 1-2% in 30 mL di NB liquido (4.5., privo di agar
batteriologico), contenuti in provette da 50 mL e fatti sviluppare in
terinostato sotto costante agitazione a 28°C per 3 giorni. La miscela
di microrganismi viene successivamente lavata con soluzione
fisiologica sterile e centrifugata a 6000 giri per 20 minuti. Tale
operazione deve essere ripetuta almeno 3 volte.
L'inoculo per la prova respirometrica si ottiene miscelando le
cellule batteriche provenienti dai lavaggi e soluzione fisiologica
sterile. Esso deve contenere 107 unità formanti colonie (UFC) per
mL, accertato mediante standard turbidimetrico e va impiegato lo
stesso giorno della preparazione.
5.3. Prova respirometrica.
La determinazione della biodegradabilità riguarderà il
fertilizzante in esame, lo standard di riferimento scelto e un bianco
e, per ciascuno di questi campioni, sarà effettuata in duplicato.
5.3.1. Preparazione dei campioni.
Il materiale da analizzare deve essere una soluzione vera o una
sospensione omogenea. Se non si verifica questa condizione occorre
diluire con acqua (4.1.).
La soluzione dello standard di riferimento deve avere un titolo in
C analogo alla soluzione o sospensione della sostanza da esaminare.
5.3.2. Esecuzione della prova.
Nei reattori di ciascuna linea di analisi si introducono 200 mL di
terreno di coltura (4.4.), a cui si aggiunge l'inoculo in ragione
dell'1% (V/V). Si manda quindi in pressione l'impianto e si lascia
aerare per 24 ore con aria decarbonatata, per eliminare la CO2
presente nel sistema. Al termine della ventilazione le due trappole
per la C02 vengono riempite ciascuna con 100 mL della soluzione di
NaOH 0,5N.
Nel reattore di ciascuna linea, eccettuati quelli per lo studio
del "bianco", viene quindi introdotto il substrato da analizzare in
quantità equivalenti a 40,91 mg di Corg, corrispondenti ad uno
sviluppo teorico di 150 mg di CO2.
La CO2 svolta nei reattori viene condotta dal flusso d'aria nelle
trappole, dove reagisce con la soluzione di NaOH, producendo Na2CO3.
La prova deve essere effettuata alla temperatura costante di 25°C.
5.3.3. Determinazione della CO2.
A date prestabilite, corrispondenti ai giorni 2, 4, 8, 16 e 25
dall'inizio della prova, viene staccato l'assorbitore di CO2 più
vicino al reattore. La quantità di CO2 svolta viene determinata
titolando il contenuto delle trappole con una soluzione di HCl 1N,
previa aggiunta di 20 mL di BaCl2 . 2H2O 1M in presenza di
fenolftaleina. Il secondo assorbitore viene avvicinato di un posto al
reattore stesso e all'estremità della serie si aggiunge un nuovo
assorbitore contenente 100 mL di soluzione fresca di NaOH 0,5N.
6. Calcolo della biodegradazione e conclusioni
La quantità di CO2 sviluppata viene calcolata nel seguente modo:

mg CO2 (B - V) N E

dove:

V = volume (mL) di acido per titolare la soda nei collettori di CO2
dei campioni trattati

B = volume (mL) di acido per titolare la soda nei collettori di CO2
dei campioni controllo

N = normalità dell'acido

E = PE co2 = 22

La biodegradazione del prodotto viene espressa percentualmente in
termini di CO2 sviluppata entro il 25° giorno di prova (B25°)
rispetto alla CO2 teoricamente sviluppabile in base al contenuto di
carbonio organico determinato con il metodo Springer-Klee (D.M. 21
dicembre 2000 - Gazzetta Ufficiate della Repubblica Italiana n. 21
del 26 gennaio 2001 - Serie generale).

mg CO2 sviluppata
B25°% =------------------------------- x 100
mg CO2 teorica

Sono ritenute biodegradabili le sostanze organiche alifatiche di
sintesi che mostrano entro 25 giorni un tasso di mineralizzazione non
inferiore al 50% rispetto al contenuto di C organico determinato
sperimentalmente.
I risultati della prova di degradazione si considerano validi se
sono soddisfatte le seguenti condizioni:
nella stessa serie di determinazioni, il prodotto di riferimento
deve dare una biodegradazione uguale o superiore all'80% entro 25
giorni. In caso contrario, l'intera serie deve essere scartata e la
prova ripetuta;
durante la prova, nelle bottiglie del "bianco" non deve
verificarsi uno sviluppo significativo di CO2, che non può superare
5 mg di CO2 per 200 mL di soluzione.
A titolo esemplificativo viene riportato il diagramma di
biodegradabilità di una sostanza organica alifatica di sintesi.

----&gt; vedere diagramma a pag. 22 della G.U. &lt;----

Determinazione del grado d'idrolisi nei fertilizzanti
a base di proteine idrolizzate

1. Oggetto

Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del
grado d'idrolisi nei fertilizzanti.

2. Campo di applicazione

Il metodo è applicabile ai concimi organici azotati ed agli
ammendanti a base di idrolizzati proteici.

3. Principio

Il grado di idrolisi qui proposto è calcolato sulla base del
rapporto tra il contenuto in azoto (-amminico (N() e l'azoto organico
(Norg) del fertilizzante. Il contenuto in N( è valutato per via
spettrofotometrica utilizzando l'o-ftaldialdeide (OPA) come agente
derivatizzante.

4. Reattivi

Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualità
analitica riconosciuta.

4.1. Sodio tetraborato decaidrato (Na2B4O7 . 10 H2O) = 99,5%.
4.2. Soluzione di sodio tetraborato (4.1) 0,1 mal L-1; pesare 38,14 g
di sodio tetraborato (4.1) in un pallone da 1000 mL contenente
500 mL di acqua, agitare fino alla completa dissoluzione e
portare a volume con acqua. Se correttamente conservata questa
soluzione ha una durata di alcuni mesi.
4.3. Sodio dodecil solfato (SDS) (C12H25NaO4S) = 99%.
4.4. Soluzione di SDS (4.3) al 20 % (p/p), pesare in un pallone
tarato da 50 mL 10 g di SDS (4.3), aggiungere acqua e dissolvere
sotto leggera agitazione, quindi portare a volume con acqua. Per
ottenere dei risultati più accurati si consiglia di filtrare la
soluzione su carta prima dell'uso. Se correttamente conservata
ha una durata di alcuni mesi.
4.5. O-ftaldialdeide (OPA) (C8H6O2) = 99%.
4.6. Metanolo (CHOH3) = 99,8%.
4.7. Soluzione di OPA (4.5), in una provetta di vetro con chiusura
ermetica pesare 200 mg di OPA (4.5), aggiungere 5 mL di metanolo
(4.6), chiudere ermeticamente ed agitare fino alla completa
dissoluzione dell'OPA. Questa soluzione deve essere preparata al
momento e deve essere mantenuta al buio.
4.8. 2-mercaptoetanolo (C2H6OS) = 99%.

AVVERTENZE: Alcuni reagenti usati in questa procedura sono
pericolosi; osservare particolare cura durante il loro utilizzo.
Evitare il contatto con la pelle ed occhi e l'inalazione dei vapori.
Si raccomanda all'operatore di osservare le indicazioni riportate
sull'etichetta del contenitore dei prodotti ed eventualmente
consultare le relative schede di sicurezza per le specifiche
informazioni sulla pericolosità dei reagenti usati e sulle modalità
di smaltimento.

5. Apparecchiatura

5.1. Siringhe da 1 mL tipo usa e getta.
5.2. Filtri da siringa da 1 mL con pori del diametro di 0,45 µm in
politetrafluoroetilene (PTFE).
5.3. Spettrofotometro dotato di lampada UV.
5.4. Cellette in quarzo da 1,5 mL con cammino ottico lungo 1 cm.

6. Procedimento

6.1. Preparazione del campione per l'analisi
Omogeneizzare accuratamente il campione, quindi pesare circa 50 mg
di campione all'interno di un matraccio tarato da 10 mL e annotare la
pesata (circa 5 g L-1), portare a volume con acqua e agitare fino
alla completa omogeneizzazione. Quindi filtrare un'aliquota del
campione, prima dell'analisi, con una siringa (5.1.) utilizzando
filtri da 0,45 µm (5.2.).
6.2. Preparazione del derivatizzante
Lavorando sotto cappa chimica, porre in un pallone tarato da 50 mL
nell'ordine: 25 mL di soluzione di sodio tetraborato (4.2.), 2,5 mL
di soluzione di SDS (4.4.), 1 mL di soluzione di OPA (4.7.), 100 µL
di 2-mercaptoetanolo (4.8.), portare a volume con acqua, agitare
dolcemente fino alla completa omogeneizzazione. Preparare, inoltre,
una soluzione contenente gli stessi reagenti sopra riportati con
l'esclusione dell'OPA. Questa soluzione serve per la misura del
background del campione. Queste soluzioni devono essere preparate al
momento dell'uso e conservate al buio, a +4°C (o sotto ghiaccio) per
tutta la durata dell'analisi.
6.3. Misure allo spettrofotometro
Accendere lo spettrofotometro (5.3.); selezionare la lunghezza
d'onda (?) di misura a 340 nm e attendere il tempo necessario per
scaldare la lampada. Quindi all'interno di una celletta di quarzo
(5.4.) mettere nell'ordine 10 µL di soluzione di campione preparato
(6.1.) e 990 µL di soluzione di derivatizzante (6.2.), agitare
brevemente per inversione, riporre la celletta nello spettrofotometro
a temperatura ambiente e dopo 2 minuti esatti registrare il valore di
assorbanza a 340 nm. Per la misura del background del campione
operare come sopra riportato, utilizzando al posto della soluzione
derivatizzante (6.2.) la soluzione senza l'OPA.
6.4. Determinazione dell'azoto organico
La determinazione dell'azoto organico deve essere effettuata
secondo i metodi ufficiali riportati nel Decreto Ministeriale 24
marzo 1986.

7. Espressione dei risultati

----&gt; vedere testo a pag. 25 della G.U. &lt;----

In teoria, un campione completamente idrolizzato dovrebbe avere
tutto l'azoto organico in forma a-amminica e quindi un grado
d'idrolisi prossimo a cento.
Nota: l'OPA, in ambiente alcalino e in presenza di
2-mercaptoetanolo, non reagisce con le ammine che presentano un
gruppo epsilon-amminico (ad es. la prolina e l'idrossiprolina).
Pertanto questo metodo tende a sottostimare il grado d'idrolisi reale
del fertilizzante che contenga apprezzabili quantità dei suddetti
amminoacidi.

Determinazione del potassio nei concimi mediante spettrofotometria
di assorbimento atomico

1. Oggetto

Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del
potassio solubile in acqua.

2. Campo di applicazione

Il metodo si applica per la determinazione del potassio solubile
in acqua in tutti i concimi nazionali aventi un titolo in ossido di
potassio inferiore o uguale al 30% p/p.

3. Principio

Il potassio contenuto nel concime viene solubilizzato con acqua e
determinato mediante spettrofotometria di assorbimento atomico con
atomizzazione di fiamma.

4. Reattivi

Nel corso dell'analisi utilizzare acqua distillata o
demineralizzata di purezza equivalente e reattivi di qualità
analitica riconosciuta.
4.1. Fosfato monopotassico purissimo (KH2PO4).
4.2. Acido cloridrico, soluzione 6M circa.
Diluire un voLume di HCl 37% (p = 1,186) con un volume d'acqua.
4.3. Cesio o in alternativa sodio, soluzione 10 g/L.
In un matraccio tarato da 1000 mL, sciogliere g 12,7 di CsCl o g
14,7 di CsNO3 oppure g 25,0 di NaCl in 150 mL di acqua; aggiungere
poi 85 mL di HCl (4.2.). Completare a volume con acqua ed
omogeneizzare.
4.4. Potassio, soluzione standard a 1000 mg/L.
Pesare g 3,4806 di KH2PO4 (4.1.), precedentemente essiccato a
120°C per 2 ore, e trasferirli quantitativamente in un matraccio
tarato da 1000 mL, lavando il pesafiltri con acqua. Sciogliere
completamente il sale e portare a volume con acqua.
4.5. Potassio, soluzioni standard di lavoro.
Dalla soluzione (4.4.) prelevare con buretta da 25 mL (5.4.)
0-5-10-15 mL da trasferire in altrettanti matracci da 500 mL.
Addizionare a ciascun matraccio 50 mL della soluzione di cesio o di
sodio (4.3.) e portare a volume con acqua. Le soluzioni contengono
rispettivamente 0-10-20-30 mg/L di K.

5. Apparecchiatura

5.1. Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di lampada a
catodo cavo per potassio e bruciatore con testa da 50 mm di cammino
ottico, alimentato con miscela acetilene-aria.
5.2. Matracci tarati da 500 e 1000 mL.
53. Pipette tarate a doppia tacca di classe AS da 5 mL.
5.4. Buretta graduata da 25 mL, divisione 0,05 mL.

6. Procedimento

6.1. Preparazione del campione per l'analisi
Preparare il campione secondo quanto previsto dal punto 6 del
Metodo 4.1 riportato nella Parte I della raccolta dei metodi
ufficiali di analisi.
6.2. Preparazione della soluzione
Procedere come descritto al punto 7.1 del Metodo 4.1
precedentemente menzionato, pesando g 10 (con l'approssimazione di
0,001 g) di campione e portando al volume finale di 1 litro (V1).
6.3. Preparazione della soluzione da sottoporre a
spettrofotometria di assorbimento atomico.
Dalla soluzione ottenuta come descritta a1 punto 6.2., prelevare,
con la pipetta (5.3.), 5 mL (V2) e trasferirli in un matraccio da 500
mL Addizionare 50 mL della soluzione di cesio o sodio (4.3.) e
portare a volume con acqua(V).
Il peso del campione ed i volumi V1 e V2 possono essere
opportunamente variati in funzione del contenuto in potassio del
campione da sottoporre ad analisi.
6.4. Curva di taratura
Preparare la curva di taratura allo spettrofotometro utilizzando
la lunghezza d'onda di 766,5 nm. Posizionare il bruciatore con testa
ruotata di 90° rispetto al cammino ottico. Predisporre sullo
strumento la lampada specifica per il potassio selezionando la
lunghezza d'onda sopra riportata. Azzerare lo spettrofotometro con la
soluzione standard priva di potassio. Rilevare di seguito le
assorbanze delle soluzioni standard di lavoro e costruire la curva di
taratura riportando su carta millimetrata, in ordinata le assorbanze
ed in ascissa le relative concentrazioni.
6.5. Dosaggio
Rilevare le assorbanze della soluzione in esame operando nelle
stesse condizioni descritte al punto 6.4.. Riportare i valori di
assorbanza sulla curva di taratura e leggere i corrispondenti valori
di concentrazione di potassio in mg/L.

7. Espressione del risultati

Il contenuto di potassio solubile in acqua si esprime come
percentuale di K2O che si ricava utilizzando la seguente espressione:

C . 1,204 . V .V1 . 100
K2O% = ---------------------------
V2 . P

dove:
C = concentrazione di K in mg/L riscontrata nella soluzione in
esame
1,204 = fattore di trasformazione da K a K2O
V = volume finale della soluzione in litri (nel caso attuale V =
0,5)
V1 = volume finale della prima diluizione
V2 = volume prelevato per la seconda diluizione
P = peso del campione analizzato espresso in mg.

Determinazione del cromo esavalente (CrVI) nei fertilizzanti
contenenti sostanza organica

1. Oggetto

Il presente documento fissa un metodo per la determinazione del
cromo esavalente nei fertilizzanti contenenti sostanza organica sotto
forma di cromati e/o bicromati in concentrazione superiore a 0,5
mg/kg come Cr(VI).

2. Campo di applicazione

Il metodo è applicabile ai fertilizzanti contenenti sostanza
organica.

3. Principio

Il cromo esavalente di un fertilizzante viene estratto in acqua e
successivamente determinato sulla soluzione filtrata mediante
reazione colorimetrica con s-difenilcarbazide per via
spettrofotometrica a 540 nm.

4. Reattivi

Nel corso dell'analisi utilizzare acqua deionizzata o
demineralizzata di purezza equivalente e reagenti di qualità
analitica riconosciuta.
4.1. s-difenilcarbazide [CO(NHNHC6H5)2] peso molecolare = 242,28.
4.2. Acido fosforico, H3PO4 85% (p = 1,7 g/mL).
4.3. Etanolo, CH3 CH2 OH 95%.
4.4. Bicromato di potassio, K2Cr2O7&gt; 99% (p/p).
4.5. Soluzione di s-difenilcarbazide.
4.5.1 Soluzione A - In un matraccio da 500 mL aggiungere 150 mL di
H3PO4 85% (4.2.) a 300 mL di acqua deionizzata, raffreddare e portare
a volume con acqua deionizzata.
4.5.2 Soluzione B - Pesare 200 mg di s-difenilcarbazide (4.1.) in
un matraccio tarato da 100 mL e aggiungere 80 mL di etanolo (4.3.),
agitare fino a completa dissoluzione e portare a volume con etanolo
(4.3.).
4.5.3 Soluzione C - Prelevare 400 mL della soluzione A (4.5.1.) e
travasare in bottiglia di vetro scuro, quindi aggiungere lentamente
la soluzione B (4.5.2.) agitando continuamente. La soluzione finale
ottenuta non deve presentare alcuna colorazione, altrimenti occorre
ripetere la preparazione delle soluzioni 4.5.1. (Sol. A) e 4.5.2.
(Sol. B). Questa soluzione deve essere conservata in frigorifero (4
°C) in bottiglia scura e per un periodo non superiore a 3-4 giorni.
4.6 Soluzione standard di Cr(VI).
4.6.1 Sale di K2Cr2O7 (4.4.): Essiccare in stufa a 105 °C il
bicromato di potassio (4.4.) fino a peso costante (2 ore possono
considerarsi sufficienti).
4.6.2 Soluzione madre di Cr(VI) (20 mg/L). Pesare 56,55 mg di
K2Cr2O7 essiccato (4.6.1.), porlo in matraccio tarato da 1000 mL,
aggiungere circa 800 mL di acqua deionizzata, sciogliere il sale e
quindi portare a volume con acqua deionizzata.
4.6.3 Soluzione madre diluita di Cr(VI) (2 mg/L). Diluire 1:10
(v/v) la soluzione madre di K2Cr2O7 (4.6.2.).

5. Apparecchiatura

Nel corso dell'analisi utilizzare corrente attrezzatura e vetreria
da laboratorio e in particolare:
5.1. Spettrofotometro per misure nei campo del visibile munito di
vaschette con cammino ottico da 1 cm, oppure colorimetro a filtri con
massimo di trasparenza ottica attorno a 540 nm, munito di vaschette
con cammino ottico da 1 cm.
5.2. Bilancia analitica.
5.3. Stufa per umidità (105 °C).
5.4. Filtri da 0,45 µm.
5.5. Pompa a vuoto.
5.6. Agitatore meccanico.
5.7. Tubi da centrifuga da 200 mL.

6. Procedimento

6.1. Curva di calibrazione del Cr(VI).
Si consiglia di preparare la curva di calibrazione con quantità
crescenti di Cr(VI) a partire dalla concentrazione di 20 µg di
Cr(V1)/L.
Preparare la curva di calibrazione con 1 - 2,5 - 5 - 10 - 15 e 20
µg di Cr(VI) per campione, corrispondenti a concentrazioni di 20, 50,
100, 200, 300 e 400 µg/L di Cr(VI);
Aggiungere 0,5; 1,25; 2,5; 5; 7, 5; 10, mL di soluzione madre
diluita di Cr esavalente (4.6.3.) in matracci da 50 mL, aggiungere
acqua deionizzata fino a circa 40 mL dove necessario, quindi
addizionare 5 mL di soluzione C (4.5.3.) contenente
s-difenilcarbazide, miscelare accuratamente, portare a volume con
acqua deionizzata e quindi miscelare nuovamente. Lasciare riposare
per circa 40 minuti e procedere alla lettura spettrofotometrica a
alfa = 540 nm utilizzando possibilmente cuvette da 1 cm di spessore
leggendo i campioni contro una soluzione di riferimento (bianco A).
Il bianco A deve essere preparato come segue: in un matraccio
tarato da 50 mL, aggiungere 40 mL di acqua deionizzata e addizionare
5 mL di soluzione C (4.5.3), miscelare accuratamente, portare a
volume con acqua deionizzata e omogeneizzare nuovamente.
6.2. Estrazione del Cr(VI).
Pesare 5 g di campione, preventivamente macinato e setacciato a
0,45 mm secondo quanto previsto dal metodo "Preparazione del campione
per l'analisi" (D.M. 24 marzo 1986), porlo in un tubo da centrifuga
da 200 mL e quindi addizionare 100 mL di acqua deionizzata (rapporto
campione:acqua 1:20). Agitare il campione per 2 ore a temperatura
ambiente e circa 100 oscillazione per minuto, quindi filtrare su
carta da filtro tipo Whatman n. 42, oppure centrifugare a 2500 rpm
per 20 minuti e filtrare a 0,45, µm per rimuovere eventuali
particelle in sospensione.
6.3. Determinazione del Cr(VI) negli estratti.
In matraccio tarato da 50 mL aggiungere 40 mL di estratto (6.2.),
quindi 5 mL di soluzione C (4.5.3.), miscelare accuratamente, portare
a volume con acqua deionizzata e omogeneizzare nuovamente. Lasciare
riposare per circa 30 minuti e procedere alla lettura
spettrofotometrica a alfa = 540 nm utilizzando possibilmente cuvette
da 1 cm di spessore leggendo i campioni contro una soluzione di
riferimento (bianco B).
Il bianco B: in un matraccio da 50 mL aggiungere 40 mL
dell'estratto del campione impiegato per la reazione colorimetrica e
portare a volume con acqua deionizzata,, omettendo così solo
l'aggiunta della s-difenilcarbazide (questo serve per eliminare le
possibili sovrastime determinate dalle sostanze colorate presenti
nell'estratto che assorbono a 540 nm).
La soluzione colorata così ottenuta è stabile per almeno 6 ore.

7. Espressione dei risultati

I risultati ottenuti si esprimono utilizzando la seguente
espressione:

µg di Cr(VI) dell'estratto x D
Cr(VI) (µg/g/mg/kg) = ----------------------------------
peso del campione (g)

dove: D = fattore di diluizione = volume dell'estraente/volume
prelevato per la determinazione (in questo caso: 100:40
2,5)